ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΘΡΕΟΝΙΝΗΣ-14 ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ rps5 ΠΙΤΟΥ ΜΑΡΙΑ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΗ :ΚΑΘ. Θ. ΧΟΛΗ-ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΙΤΟΥ ΜΑΡΙΑ, ΧΗΜΙΚΟΣ Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΘΡΕΟΝΙΝΗΣ-14 ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ rps5 εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τομέα Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια ΘΕΟΔΩΡΑ ΧΟΛΗ- ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ- Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Αναπλ. Καθηγήτρια ΕΛΕΝΗ ΝΙΚΟΛΑΚΑΚΗ-Μέλος εξεταστικής επιτροπής Αναπλ. Καθηγητής ΠΑΝΤΕΛΕΗΜΩΝ ΑΡΖΟΓΛΟΥ- Μέλος εξεταστικής επιτροπής Η τριμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε σύμφωνα με τη Γ.Σ.Ε.Σ. 289/ , για τη κρίση της Διπλωματικής Εργασίας της Πίτου Μαρίας, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 22/03/2016, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της εργασίας με τίτλο Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΘΡΕΟΝΙΝΗΣ-14 ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ rps5 και την ενέκρινε με βαθμό 10 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 6 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 Α.1. Ριβόσωμα... 7 Α.1.1. Γενικά για το ριβόσωμα... 7 Α.1.2. Δομή των ριβοσωμάτων... 9 Α.2. Βιογένεση ριβοσωμάτων στους ευκαρυώτες...12 Α.2.1. Σύνθεση του πρόδρομου ριβοσωμικού rrna Α.2.2. Επεξεργασία του RNA Α.2.3. Συγκρότηση του ριβοσώματος Α Ωρίμανση των υπομονάδων Α.2.4. Μετακίνηση ριβοσωμάτων από το πυρηνόπλασμα στο κυτταρόπλασμα. 22 Α.2.5. Έλεγχος μηχανισμών Α.3. Ριβοσωμικές πρωτεΐνες...25 Α.3.1. Χαρακτηριστικά ριβοσωμικών πρωτεϊνών Α.3.2. Ρόλος των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Α.3.3. Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις Α Φωσφορυλίωση ριβοσωμικών πρωτεϊνών Α.3.4. Η S7 οικογένεια των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Α.3.5. Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη Α Ρόλος της S A Φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S Α.4. Ρόλος της Pin ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...38 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...39 Β.1. Υλικά...39 Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια

4 Β.1.2. Βιολογικό υλικό Β.1.3. Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών Β.1.3. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας B.2. Μέθοδοι Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας...40 Β.2.1. Καλλιέργεια κυττάρων Β Καλλιέργεια κυττάρων E.coli B Καλλιέργεια των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων HeLa B.2.2. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Β.2.3. Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με την τεχνική του σχεδιασμού megaprimer Β.2.4. Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με το Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Β.2.5. Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Β.2.6. Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (gel extraction) Β.2.7. Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR (PCR purification) Β.2.8. Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊνικών οξέων Β.2.9. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Β Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Β Αντίδραση λιγάσης (ligation) Β Προετοιμασία επιδεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό (competent cells) Β Εισαγωγή πλασμιδίου σε επιδεκτικά κύτταρα E. coli Μετασχηματισμός (transformation) Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (mini prep) Β Ανακαλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων Β Απόψυξη κυττάρων Β Κατάψυξη κυττάρων B Προσδιορισμός του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης

5 Β Παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων HeLa με πλασμιδιακό DNA (transient transfection) Β.3. Μικροσκοπικές Μέθοδοι...63 Β.3.1. Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες Laser. (Confocal Laser Scanning Microscope) Β.3.2. Μικροσκοπία συνεστίασης με μικροσκόπιο Nikon Eclipse 80i Β Προετοιμασία δείγματος Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...68 Γ.1. Μετάλλαξη της Τhr(14) σε Asp με την τεχνική του megaprimer...68 Γ.1.1. Θεωρητική προσέγγιση των αμινοξέων στόχων φωσφορυλίωσης της rps5 68 Γ.1.2. Σχεδιασμός και κλωνοποίηση της μετάλλαξης της Thr 14 της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp C Γ.2. Εισαγωγή της μετάλλαξης με Q5 site directed mutagenesis kit...72 Γ.3. Πειράματα ανοσοφθορισμού της πρωτεΐνης σύντηξης GFP rps5 T(14)mut...73 Γ.4. Μελέτες μοριακής προσομοίωσης...75 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...77 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...80 ABSTRACT...81 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...82 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙA

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει ως αντικείμενο την μελέτη της φωσφορυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 στην θρεονίνη 14. Από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου, βρέθηκε ότι η rps5 φωσφορυλιώνεται και σε άλλες θέσεις, οι οποίες επηρεάζουν την κυτταρική της διαμετακίνηση της. Οπότε κρίθηκε σκόπιμο να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της θρεονίνης στην κυτταρική εντόπιση της rps5. Η εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος, υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας κα. Θεοδώρας Χολή Παπαδοπούλου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου που με δέχτηκε στην επιστημονική της ομάδα και μου έδωσε την ευκαιρία να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριο της. Την ευχαριστώ για την στήριξη, τη βοήθεια αλλά και τις γνώσεις που μου μετέδωσε κατά την διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή κο. Γεώργιο Παπαδόπουλο για τις μελέτες μοριακής προσομοίωσης. Ευχαριστώ τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Ελένη Νικολακάκη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κο. Παντελεήμων Αρζόγλου, αλλά και τους υπόλοιπους πανεπιστημιακούς μου δασκάλους για την θετική τους συμβολή στις μεταπτυχιακές μου σπουδές. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτορα Στέλιο Καρούλια για την βοήθεια του και την άριστη συνεργασία κατά την διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Επιπλέον, να ευχαριστήσω και τις μεταδιδακτορικές ερευνήτριες Ελένη Παπαχρήστου και Φανή Τσιτουρούδη για την βοήθειά τους καθώς και όλα τα μέλη του εργαστηρίου για την συνεργασία. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην μητέρα μου, η οποία με υποστήριξε ηθικά και οικονομικά κατά τη διάρκεια των σπουδών μου και συνεχίζει να στηρίζει τις επιλογές μου. Πίτου Μαρία 6

7 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. Ριβόσωμα Α.1.1. Γενικά για το ριβόσωμα Το ριβόσωμα είναι ένα από τα ευμεγέθη κυτταρικά οργανίδια, με περίπλοκη δομή και ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο. Η βασικότερη κυτταρική λειτουργία στην οποία εμπλέκεται είναι η πρωτεϊνοσύνθεση. Πρώτη φορά παρατηρήθηκε από τον βιολόγο George Palade στα μέσα του Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο φαινόταν σαν πυκνά μόρια ή σωματίδια. Ο όρος όμως ριβόσωμα προτάθηκε το 1958 από τον από τον επιστήμονα Richard B. Roberts. Τα ριβοσώματα είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα με το μοριακό τους μέγεθος να κυμαίνεται μεταξύ ~2.4 MDa για τα προκαρυωτικά και ~4 MDa για τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το ριβοσωμικό RNA (ribosomal RNA, rrna) αποτελεί το ~65% σε βάρος του ριβοσώματος και τα 2/3 του ριβοσώματος ενώ το υπόλοιπο 1/3 είναι ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Ribosomal Proteins. RPs) (Bashan A., Yonath A., 2008). Το βακτηριακό rrna αποτελείται από ~4500 νουκλεοτίδια και στο ριβόσωμα εντοπίζονται 55 πρωτεΐνες ενώ το ευκαρυωτικό έχει περισσότερα από 5500 νουκλεοτίδια και ~89 πρωτεΐνες. Τα τρία μόρια RNA 5S, 16S και 23S είναι πολύ σημαντικά για την λειτουργική αρχιτεκτονική των ριβοσωμάτων. Στην ενεργή τους μορφή τα ριβοσώματα συγκροτούνται από δύο υπομονάδες. Έχουν διάμετρο ~20nm και εντοπίζονται με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Στα διάφορα είδη κυττάρων διατηρούν την ίδια βασική δομή το μέγεθος όμως ποικίλει. Τα ριβοσώματα βρίσκονται στα κύτταρα όλων των οργανισμών με εξαίρεση τα ώριμα ερυθροκύτταρα των θηλαστικών. Στα προκαρυωτικά κύτταρα εντοπίζονται ελεύθερα στο κυτταρόπλασμα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα εκτός από τα ελεύθερα ριβοσώματα υπάρχουν και δεσμευμένα στην πυρηνική μεμβράνη ή στην μεμβράνη του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου. Τα ελεύθερα και τα δεσμευμένα ριβοσώματα δεν παρουσιάζουν δομικές διαφορές και μπορούν να εναλλάσσονται μεταξύ τους με τις ριβοσωμικές υπομονάδες τους. Παραμένουν στο κυτταρόπλασμα μέχρι να ξαναχρησιμοποιηθούν. Τα ελεύθερα ριβοσώματα που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα μπορεί να είναι μόνα τους ή να σχηματίζουν ομάδες των 10 ή περισσότερων ριβοσωμάτων, τα οποία ονομάζονται πολυριβοσωμάτια. Τα ελεύθερα 7

8 ριβοσώματα σχετίζονται με την παραγωγή πρωτεϊνών που προορίζονται για το κυτταρόπλασμα. Τα συνδεδεμένα ριβοσώματα συνδέονται με την εξωτερική πλευρά της μεμβράνης του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου και προορίζονται για την σύνθεση εκκριτικών πρωτεϊνών με στόχο τα λυσοσωμάτια και την κυτταρική μεμβράνη. Ο αριθμός των ριβοσωμάτων, εξαρτάται από τις κυτταρικές ανάγκες, οπότε σε περίπτωση που απαιτείται η σύνθεση μεγαλύτερου αριθμού πρωτεϊνών αυξάνεται και ο αριθμός τους. Ο μικρότερος αριθμός ριβοσωμάτων παρατηρείται στα σπερματοκύτταρα, ενώ ο μεγαλύτερος στα εμβρυϊκά κύτταρα και στα κύτταρα που παράγουν πρωτεΐνες που εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον (Taylor J., 1998). Επίσης, ριβοσώματα υπάρχουν στους χλωροπλάστες και στα μιτοχόνδρια. Συγκεκριμένα, τα ριβοσώματα των μιτοχονδρίων συνθέτουν 13 απαραίτητες πρωτεΐνες των συμπλόκων της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που τα ριβοσώματα των προκαρυτικών κυττάρων είναι μικρότερα από αυτά των ευκαρυωτικών, τα ριβοσώματα των μιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών έχουν μέγεθος περίπου ίσο με αυτό των προκαρυωτικών. Το τελευταίο, αποτελεί μια πιθανή ένδειξη της καταγωγής των συγκεκριμένων ημιαυτόνομων οργανιδίων. Τα ριβοσώματα αποτελούν περίπου το ~30% της κυτταρικής μάζας του κυττάρου και ο αριθμός τους σε βακτήρια και θηλαστικά υπολογίζεται σε 10 5 και 10 6, αντίστοιχα (Bashan Α., Yonath Α., 2008). Ο μικρότερος αριθμός ριβοσωμάτων παρατηρείται στα σπεματοκύτταρα, ενώ ο μεγαλύτερος στα εμβρυακά και σε κύτταρα που παράγουν εκκριτικές εξωκυττάριες πρωτεΐνες. Σε αναπτυσσόμενα κύτταρα τα περισσότερα ριβοσώματα είναι ενεργά συνθέτοντας πολυπεπτιδικές αλυσίδες, ενσωματώνονται 20 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στην νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα στα βακτήρια και 5-9 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Πρόσφατα(Ιούλιος 2015), επιστήμονες του πανεπιστημίου του Illinois και του Northwestern κατάφεραν να κατασκευάσουν το πρώτο τεχνητό ριβόσωμα, που ονομάζεται Ribo-T. Σε αυτό, οι δύο υπομονάδες είναι συνδεδεμένες σαν μια χρησιμοποιώντας RNA ως συνδέτη. Ουσιαστικά κατασκεύασαν RNA το οποίο συρράφει το 16S και το 23S RNA της μικρής και της μεγάλης υπομονάδας, αντίστοιχα. Ο συνδέτης είναι εύκαμπτος επιτρέποντας έτσι την μεταξύ κίνηση των δύο υπομονάδων που απαιτείται κατά την μετάφραση. Το Ribo-T δουλεύει σχεδόν όπως το φυσιολογικό ριβόσωμα και είναι πλήρως ενεργό. Είναι ικανό να παράγει 8

9 αρκετές πρωτεΐνες σε δοκιμαστικό σωλήνα και επιτρέπει την κανονική βακτηριακή ανάπτυξη έπειτα από εισαγωγή του σε βακτηριακά κύτταρα. Όπως υποστηρίζουν οι επιστήμονες μπορεί να χειραγωγηθεί κατάλληλα ώστε να επιτελέσει λειτουργίες που ένα κανονικό ριβόσωμα δεν μπορεί. Για παράδειγμα, με τη βοήθεια του μπορούν να ενσωματωθούν «αφύσικα» αμινοξέα στις πρωτεΐνες και έτσι, μεταξύ άλλων, να παραχθούν φάρμακα (π.χ. αντιβιοτικά) με ασυνήθιστες θεραπευτικές ιδιότητες. Έτσι, ανοίγονται νέοι δρόμοι στην ανάπτυξη φαρμάκων, βιο-υλικών (πολυμερή βιολογικά και μη-)καθώς και στην κατανόηση της λειτουργίας του ριβοσώματος (Οrelle M. et al., 2015). Α.1.2. Δομή των ριβοσωμάτων Όπως προαναφέρθηκε τα ριβοσώματα στην ενεργή τους μορφή αποτελούνται από δύο υπομονάδες με διαφορετικό μέγεθος, την μικρή (Small SubUnit, SSU) και την μεγάλη (Large SubUnit, LSU). Τα ριβοσώματα χαρακτηρίζονται από το συντελεστή καθίζησης (S) που εκφράζεται σε μονάδες χρόνου,1 Svedberg ισούται με sec, (Theodor Svedberg, Nobel χημείας 1926). Το ριβόσωμα των βακτηρίων και των αρχαίων κυττάρων είναι γνωστό ως 70S ριβόσωμα, με τη 30S μικρή υπομονάδα και τη 50S μεγάλη υπομονάδα. Η μικρή υπομονάδα 30S περιέχει 21 διαφορετικές πρωτεΐνες (S1 έως S21) και ένα μόριο RNA, το 16S. Η μεγάλη υπομονάδα 50S περιέχει 34 διαφορετικές πρωτεΐνες (L1 έως L34) και δύο μόρια RNA, το 23S και το 5S. Στο προκαρυωτικό ριβόσωμα όλα τα συστατικά, εκτός από τις πρωτεΐνες L7 και L12, βρίσκονται με ένα αντίγραφο. Οι L7 και L12 δημιουργούν τετραμερές και αποτελούν την ακετυλιωμένη και τη μεθυλιωμένη μορφή αντίστοιχα της ίδιας πρωτεΐνης. Όσον αφορά τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα, έχουν σταθερά καθίζησης 80S και οι υπομονάδες τους 40S και 60S, είναι η μικρή και η μεγάλη αντίστοιχα. Η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από ένα μόριο 18S rrna και 33 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από τρία μόρια rrna, τα 28S rrna, 5S rrna και 5,8S rrna και 49 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Το ευκαρυωτικό ριβόσωμα επομένως περιέχει επιπλέον ένα μόριο rrna και ~20-30 περισσότερες πρωτεΐνες, από ότι το προκαρυωτικό ριβόσωμα. Στα διάφορα στάδια της μετάφρασης του mrna υπάρχουν αρκετοί πρωτεϊνικοί 9

10 παράγοντες που συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία συνδεόμενοι παροδικά με το ριβόσωμα. Οι υπομονάδες συνδέονται μεταξύ τους με γέφυρες από αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ή πρωτεϊνών-rrna. Στους ευκαρυώτες, υιοθετείται μια κατάσταση που ευνοεί την μεταξύ περιστροφή των υπομονάδων (Ben-Shem Α. et al., 2011). Κάθε ριβοσωμική υπομονάδα έχει μια χαρακτηριστική μορφολογία. Σχετικά με την μικρή υπομονάδα, το 16S rrna χωρίζεται σε τέσσερις τομείς οι οποίοι με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες αποτελούν τα βασικά δομικά χαρακτηριστικά της μικρής υπομονάδας. Αυτά είναι: i) οι 5 και 3 (h44) μικρότεροι τομείς με τις πρωτεΐνες S4, S5, S12, S16, S17, και S20 που απαρτίζουν το σώμα (body), ii) ο 3 μεγαλύτερος τομέας σχηματίζει την κεφαλή (head), που είναι πλούσια σε πρωτεΐνες και περιέχει τις S2, S3, S7, S9, S10, S13, S14 και S19, iii) ο κεντρικός τομέας που συνιστά την πλατφόρμα (platform) και αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες S1, S6, S8, S11, S15, και S18. Το rrna της μεγάλης υπομονάδας μπορεί να διαιρεθεί σε επτά τομείς (συμπεριλαμβανομένων του 5S rrna ως περιοχή VII), οι οποίοι είναι άρρηκτα συνδεδεμένοι με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες καθώς και μεταξύ τους. Δομικά χαρακτηριστικά της είναι η κεντρική προεξοχή (Central Protuberance, CP), η ευέλικτη L1 και οι προεξοχές L7/L12. Η μεγάλη υπομονάδα έχει τρία εξογκώματα στην ανώτερη περιοχή, με πιο χαρακτηριστικό το κεντρικό εξόγκωμα (Wolfe, 1993), όπου εντοπίζονται οι θέσεις σύνδεσης A, Ρ, Ε με το trna. Στην μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα εντοπίζεται το κανάλι που εκτείνεται από την ευρύτερη περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης στην οποία βρίσκονται οι θέσεις Α και P, μέχρι το σημείο εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Brandt F. et al., 2009). Η θέση αποκωδικοποίησης, δηλαδή η περιοχή αναγνώρισης των κωδικονίων του mrna από τα αντικωδικόνια του trna, βρίσκεται στη μικρή υπομονάδα στη βάση της ρωγμής που χωρίζει την κεφαλή από την πλατφόρμα. Σε αντίθεση με τα προκαρυωτικά, τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα είναι πολύ μεγαλύτερα και έχουν πιο περίπλοκη δομή. Βέβαια, τα κύρια δομικά χαρακτηριστικά παραμένουν ίδια. Περιέχουν πρόσθετα rrna με τη μορφή των λεγόμενων τμημάτων επέκτασης (Εxpansion Segments, ES) καθώς και πρόσθετες ριβοσωμικές πρωτεΐνες με επεκτάσεις. Πιο συγκεκριμένα, υπάρχουν 5 τμήματα επέκτασης και 5 μεταβλητές περιοχές στην μικρή υπομονάδα ενώ στην μεγάλη εντοπίζονται 16 τμήματα επέκτασης και 2 μεταβλητές περιοχές (Wilson D., Doudna Cate J., 2012). 10

11 Με την βοήθεια κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχει απεικονιστεί η δομή του ριβοσώματος σε βακτήρια και ευκάρυα. Στην παρακάτω εικόνα συγκρίνεται η δομή προκαρυωτικού και ευκαρυωτικού ριβοσώματος Εικόνα Α.1. Δομή ριβοσωμικών υπομονάδων σε βακτήρια και ευκάρυα. Στο επάνω μέρος δίνονται οι μικρές και κάτω οι μεγάλες υπομονάδες αντίστοιχα. Δίνονται τα βασικά δομικά μέρη(klinge S., 2012). Πάρα τις διαφορές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων, ο ριβοσωμικός πυρήνας είναι συντηρημένος σε όλους τους οργανισμούς (Doudna A., Rath L., 2002). Η αλληλουχία των βάσεων ενός δεδομένου τύπου rrna είναι παρόμοια σε στενά συγγενή είδη. Για το συγκεκριμένο rrna, υπάρχουν πολύ λίγες ομοιότητες στην αλληλουχία βάσεων μεταξύ φυλογενετικά απομακρυσμένων οργανισμών. Το ποσοστό ομοιότητας ενός συγκεκριμένου rrna μεταξύ δύο διαφορετικών ειδών αντανακλά την εξελικτική ιστορία και τη συγγένεια των συγκρινόμενων αυτών οργανισμών. Το 5S rrna είναι το πλέον εξελικτικά σταθερό από όλα τα είδη rrna. Επιπρόσθετα, οι θέσεις δέσμευσης του trna, A-, P- και E-, αποτελούνται κυρίως από rrna, το οποίο είναι διατηρημένο στα ριβοσώματα των 11

12 αρχαίων και των ευκαρυωτών Και οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες είναι συντηρημένες. Στον Sacharomyces cereviseae, οι 35 έχουν ομόλογες στα βακτήρια/αρχαία και οι 32 έχουν μόνο ομόλογες στα αρχαία. Η πλειοψηφία των rrna και των ριβοσωμικών πρωτεϊνών που συνιστούν το βακτηριακό 70S ριβόσωμα είναι συντηρημένη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, και μπορούν συνεπώς να θεωρηθούν ότι αποτελούν τον πυρήνα του ευκαρυωτικού 80S ριβοσώματος. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα οι επιπλέον ειδικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχηματίζουν ένα δίκτυο με τα τμήματα ΕS και δημιουργείται ένα στρώμα RNA-πρωτεϊνών. Σε ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, όπως ο άνθρωπος, το στρώμα αυτό έχει μεγαλύτερο μέγεθος ενώ υπάρχουν και δύο άλλα στρώματα. Ένα άκαμπτο στρώμα που προκύπτει από τις πολλαπλές RNA-RNA τριτοταγής αλληλεπιδράσεις και ένα εύκαμπτο εξωτερικό στρώμα που δημιουργείται από τις ελικοειδής παρεμβολές και τις επεκτάσεις των ΕS. Η περίπλοκη αυτή αρχιτεκτονική ολοκληρώνεται και με την σύνδεση στο ριβόσωμα, των παραγόντων έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού μιας και είναι απαραίτητοι για την πρωτεϊνοσύνθεση. Η έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης στους ευκαρυώτες αρχίζει με την ενσωμάτωση των παραγόντων eif-2, eif-3, του trna Met και του GTP στην 40S υπομονάδα. Ως αποτέλεσμα δημιουργείται το σύμπλοκο 43S. Στην συνέχεια ο παράγοντας eif-4e στρατολογεί στο συγκροτημένο σωματίδιο 43S το mrna στόχο, με συνέπεια την δημιουργία 48S συμπλόκου. Η 60S υπομονάδα συνδέεται με το 48S σύμπλοκο για τον τελικό σχηματισμό του 80S συμπλόκου (Scheper G., Van der Knaap M., 2007). Για την επιμήκυνση είναι υπεύθυνος ο παράγοντας επιμήκυνσης EF-G, ο οποίος συνδέεται και με τον παράγοντα ανακύκλωσης του ριβοσώματος (Ribosome Recycling Factor, RRF) για την αποσυναρμολόγηση του ριβοσώματος στο τέλος της μετάφρασης. Τέλος, συνδέονται και οι παράγοντες τερματισμού erf1 και erf3. Ανάλογοι παράγοντες συνδέονται και στο προκαρυωτικό ριβόσωμα. Οπότε γίνεται κατανοητό ότι το ριβόσωμα είναι μια δυναμική μακρομοριακή μηχανή. Α.2. Βιογένεση ριβοσωμάτων στους ευκαρυώτες Η βιογένεση των ριβοσωμάτων αποτελεί μια εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία και μια από τις πιο ενεργειακά απαιτητικές κυτταρικές δραστηριότητες (Fromont- 12

13 Racine M. et al., 2003, Kressler D. et al., 2010). Είναι απαραίτητη για την κυτταρική προσαρμογή, ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό. Ξεκινά στον πυρηνίσκο και ολοκληρώνεται στο κυτταρόπλασμα. Απαιτεί την συγκέντρωση αρκετών μοριακών προϊόντων και παραγόντων συναρμολόγησης (Αssembly Factors, AFs) στον πυρηνίσκο. Πριν αναλυθεί η διαδικασία της βιογένεσης των ριβοσωμάτων θα περιγραφεί συνοπτικά ο πυρινίσκος μιας και αποτελεί σημαντικό υποπυρηνικό σωματίδιο. Ο πυρηνίσκος αποτελεί μια «δυναμική δομή» του πυρήνα χωρίς μεμβράνη, και συγκροτείται γύρω από δέσμες διαδοχικά επαναλαμβανόμενων ριβοσωμικών γονιδίων, (rdna γονιδίων), τα οποία μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση Ι. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται οργανωτές πυρηνίσκου, (Nucleolar Organiser Regions, NOR), και αποτελούν τη βάση της δομικής οργάνωσής του, προκειμένου να στρατολογηθούν όλα τα απαραίτητα συστατικά επεξεργασίας και συγκρότησης, που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση των ριβοσωμάτων. Ο πυρηνίσκος, μορφολογικά χωρίζεται σε τρεις διακριτές περιοχές i) το ινώδες κέντρο, (Fibrillar Center, FC), ii) το πυκνό ινώδες συστατικό, (Dense Fibrillar Component, DFC) και iii) το κοκκιώδες συστατικό, (Granular Component, GC). Η επικράτηση καθώς και η διευθέτηση των τριών αυτών περιοχών, εξαρτώνται από το είδος, τον τύπο καθώς και από τη φυσιολογική κατάσταση του κυττάρου. Εκτός από τον ρόλο του στην βιογένεση των ριβοσωμάτων φαίνεται να αποτελεί το σημείο ωρίμανσης ή βιογένεσης άλλων ριβονουκλεοπρωτεϊνικών μηχανών, όπως του σωματιδίου αναγνώρισης σήματος, (Signal Recognition Particle, SRP), του μικρού πυρηνικού ριβονουκλεοπρωτεϊνικού σωματιδίου ματίσματος και της τελομεράσης. Ο πυρηνίσκος είναι δυνατό να συμμετέχει στην επεξεργασία ή έξοδο κάποιων αγγελιοφόρων και μεταφορέων RNAs, ενώ μπορεί να ελέγχει τη δραστικότητα συγκεκριμένων ρυθμιστικών παραγόντων. Η πολυλειτουργικότητα του πυρηνίσκου φαίνεται χαρακτηριστικά και από τα ευρήματα της πρωτεϊνικής του ανάλυσης Στον πυρηνίσκο κυττάρων HeLa βρέθηκαν ~350 διαφορετικές πρωτεΐνες (Andersen J. et al., 2002, Scherl A. et al., 2002). Η βιογένεση περιλαμβάνει έξι σημαντικά στάδια: i) Σύνθεση των συστατικών (rrnas, RPs, AFs, snornas) 13

14 ii) Επεξεργασία των πρόδρομων rrnas iii) Ομοιοπολική τροποποίηση pre-rnas, RPs, AFs iv) Συγκρότηση v) Μεταφορά(πυρηνική εισαγωγή RPs, AFs, περιαγωγή των προ-ριβοσωμάτων μέσω του πυρινίσκου και του πυρήνα και έξοδος στο κυτταρόπλασμα) vi) Έλεγχος των μηχανισμών Όλα τα στάδια είναι συζευγμένα και η αναστολή του ενός επηρεάζει δραστικά τα υπόλοιπα. Τα μονοπάτια και τα μόρια που συμμετέχουν στην διαδικασία είναι διατηρημένα στους οργανισμούς Τα προαναφερθέντα στάδια καθώς και όλα τα μόρια που συμμετέχουν στην βιογένεση φαίνονται στην παρακάτω εικόνα. Ξεκίνα από τη μετάφραση των ριβοσωμικών γονιδίων στον πυρηνίσκο και καταλήγει στο ενεργό ριβόσωμα του κυτταροπλάσματος. Τα έξι προαναφερθέντα στάδια δίνονται σε κίτρινα πλαίσια (Lafontaine D., 2015). Εικόνα Α.2. Βιογένεση του ριβοσώματος. (Lafontaine, 2015) 14

15 Η ωρίμανση του rrna και η συναρμολόγηση του σε ριβοσωματικές υπομονάδες απαιτεί τουλάχιστον 170 βοηθητικές πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν ενδο- και εξωριβονουκλεάσες, ΑΤΡ-εξαρτώμενες RNA ελικάσες, μοριακούς συνοδούς, παράγοντες συναρμολόγησης (Venema J., Tollervey D., 1999, Kressler D. et al., 1999a) και μικρά ριβονουκλεοπρωτεΐνικά σωματίδια πυρηνίσκου(small nucleolar RiboNucleoProteins, snornps). Η βιογένεση του ριβοσώματος υπόκειται και σε αυστηρό έλεγχο. Έχουν εξελιχθεί μηχανισμοί για την παρακολούθηση των νεοσυντιθέμενων ριβοσωμάτων, ώστε να συναρμολογηθεί σωστά. Αυτός ο έλεγχος συνδέεται με την πυρηνική έξοδο των προrrnps και περιλαμβάνει τον έλεγχο των νεαρών κυτταροπλασματικών ριβοσωμάτων για την ορθή συναρμολόγηση, αμέσως πριν από τα τελευταία βήματα της κατασκευής των υπομονάδων. Επειδή η παραγωγή των ριβοσωμάτων είναι τόσο στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, απορρύθμιση κατά την συναρμολόγηση έχει σοβαρές συνέπειες για την υγεία των οργανισμών. Μεταλλάξεις με πλήρη απώλεια της λειτουργικότητας των παραγόντων συγκρότησης και των ριβοσωμικών πρωτεϊνών είναι θανατηφόρες για τους ανώτερους οργανισμούς. Βέβαια, πιο διαδεδομένη είναι η μερική απώλεια της λειτουργικότητας των ριβοσωμικών μορίων, η οποία στον άνθρωπο μπορεί να παρουσιασθεί με τη μορφή ποικίλων ασθενειών. Σε αυτές περιλαμβάνονται η νοητική καθυστέρηση, η ανεπάρκεια μυελού των οστών και η προδιάθεση για καρκίνο. Οπότε η πλήρης κατανόηση της βιογένεσης θα επιτρέψει και την κατανόηση της μοριακής βάσης των ασθενειών που προκαλούνται από ριβοσωμοπάθειες. Η συγκρότηση των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έχει μελετηθεί κυρίως στη ζύμη S. cerevisae, όπου έχει απομονωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρόδρομων ριβοσωμάτων και έχουν ταυτοποιηθεί τα συστατικά τους. Διάφορα πειράματα έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση ενός πρόδρομου ριβοσωμικού σωματιδίου του 90S στην ζύμη και στην ύπαρξη δύο πρόδρομων μορίων υπομονάδων (66S και 43S) πρόδρομες μορφές των 60S και 40S υπομονάδων, αντίστοιχα (Fatica A., Tollervey D., 2002). Στην όλη αυτή διαδικασία απαιτείται η ύπαρξη μιας πληθώρας μη ριβοσωμικών παραγόντων, οι οποίοι δρουν σε διάφορα στάδια της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων (Venema J., Tollervey D., 1999). 15

16 Α.2.1. Σύνθεση του πρόδρομου ριβοσωμικού rrna Η δημιουργία των λειτουργικών ριβοσωμάτων ξεκινά με την σύνθεση των πρόδρομων rrnas. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα 18S, 28S και 5.8S rrna βρίσκονται στον «οργανωτή» του πυρηνίσκου ως ένα πολυκιστρονικό μετάγραφο. Συμμεταγράφονται από την RNA πολυμεράση I μέσα στον πυρινίσκο. Το γονίδιο του 5S rrna βρίσκεται σε άλλη περιοχή του γονιδιώματος και η μεταγραφή του γίνεται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ έξω από τον πυρηνίσκο, στο πυρηνόπλασμα. Τα γονίδια που κωδικοποιούν 80 RPs και πάνω από 250 AFs μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ στο κυτταρόπλασμα. Πολλά μικρά RNA του πυρηνίσκoυ (snornas) προέρχονται από ιντρόνια του pre-mrna ενώ άλλα συντίθενται από δικούς τους υποκινήτες από την RNA πολυμεράση ΙΙ ή ΙΙΙ. Όλα τα συστατικά μεταφέρονται στον πυρηνίσκο όπου τελικά σχηματίζονται οι ενεργές ριβοσωμικές υπομονάδες. Και τα τέσσερα rrnas, κωδικοποιούνται από μια μονάδα ριβοσωμικού DNA, (rdna), μοριακού μεγέθους 9.1 kb, η οποία επαναλαμβάνεται φορές, και βρίσκεται στο χρωμόσωμα XII (Kressler D. et al., 1999). Το πρώτο ανιχνεύσιμο ενδιάμεσο προϊόν, (35S στη ζύμη), περιλαμβάνει τις 5' και 3' εξωτερικά μεταγραφόμενες περιοχές, (External Transcribed Spacers, ETS), τα ώριμα ριβοσωμικά RNAs, 18S, 5.8S και 25S rrna και δυο μη κωδικοποιούμενες περιοχές, ITS1 και ITS2 (Internal Transcribed Spacers, ITS). Το 35S πρόδρομο rrna της ζύμης είναι μία από τις βραχύτερες πρόδρομες μορφές, ενώ το 45S του ανθρώπου, μία από τις μεγαλύτερες και μόνο κύρια τμήματα της δομής είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς. Μόνο κύρια τμήματα της δομής είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς (Nazar R, 2004). Το 35S πρόδρομο rrna διασπάται στην 5' ETS στο σημείο Α 0, οπότε προκύπτει το 33S πρόδρομο rrna, στο σημείο Α 1 (5' άκρο του ώριμου 18S) και προκύπτει το 32S πρόδρομο rrna και στο σημείο Α 2 στην ITS1 και προκύπτουν τα 20 και 27SΑ 2 πρόδρομα rrnas. Η μετέπειτα επεξεργασία του 20S πρόδρομου rrna λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα, όπου μετά από διάσπαση στο σημείο D, προκύπτει το ώριμο πλέον 18S rrna ενώ η επεξεργασία του 27SA 2 συνεχίζεται στον πυρήνα, όπου τελικά προκύπτουν τα ώριμα 5.8S και 25S rrnas από δυο διαφορετικά μονοπάτια. 16

17 Έτσι, το 85% του 27SA 2 διασπάται στο σημείο Α 3, στο ITS1, ενώ το 15% διασπάται απευθείας στο σημείο Β 1L. Η διάσπαση στο σημείο Β2, στο 3' άκρο του 25S, λαμβάνει χώρα ταυτόχρονα με διάσπαση στο σημείο Β1. Οι δύο μορφές 27SB (27SBS και 27SBL) ωριμάζουν μετά από παρόμοιες οδούς που αφορούν την επεξεργασία σε περιοχές C2 C1 και 3' και 5' εξωνουκλεολυτικής πέψης στο σημείο Ε από το εξώσωμα (Fromont-Racine M., et al., 2003) Σε συνθήκες μετάλλαξης, έχει παρατηρηθεί πρώιμη διάσπαση του 35S pre-rrna στο σημείο Α 3, οπότε προκύπτει ένα μη ομαλό ενδιάμεσο, το 23S. Επίσης, έχει διαπιστωθεί συσσώρευση του 22S όταν πραγματοποιούνται διασπάσεις στα σημεία Α0 και Α3, απουσιάζουν όμως οι διασπάσεις στα Α 1 και Α 2 (Venema A., Tollervey D, 1999). Μεταλλάξεις, οι οποίες αναστέλλουν την επεξεργασία στα σημεία από το Α 0 στο Α 2, δεν έχουν κανένα αποτέλεσμα στη σύνθεση των 5.8S και 25S rrnas. Απουσία διάσπασης στο A 2, τα 40S σωμάτια δεν παράγονται πλέον, ενώ τα 60S σχηματίζονται από εναλλακτικές διασπάσεις (Woolford J., Baserga S., 2013). Εικόνα Α.3. Μονοπάτι επεξεργασίας πρόδρομου rrna στον S. cerevisiae(woolford J., Baserga S., 2013). 17

18 Α.2.2. Επεξεργασία του RNA Οι πιο κοινές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδίων του rrna είναι η ισομερείωση των ουριδινών σε σε ψευδοουριδίνες, (Ψs), καθώς και η μεθυλίωση των 2 -ΟΗ των ριβοζών. Περίπου 100 rrna θέσεις τροποποιούνται στον άνθρωπο και 50 στον S.cerevisiae. Τα τροποποιημένα νουκλεοτίδια ατομικά δεν είναι σημαντικά. Όμως, συνεργιστικά επηρεάζουν την διαμόρφωση και τη σταθεροποίηση του RNA και επίσης είναι συγκεντρωμένα σε λειτουργικές περιοχές (Nissen et al., 2000). Πιο γενικά, οι τροποποιήσεις δρουν ως μοριακοί σταθεροποιητές της διαμόρφωσης του RNA και δεν παρατηρούνται σε περιοχές που προσδένονται πρωτεΐνες (Decatur W, Fournier M, 2002). Τέλος, οι τροποποιήσεις αυτές είναι πιθανόν να προστατεύουν τμήματα του rrna από τη δράση νουκλεασών ή μπορεί να αποτελούν ειδικά σήματα επεξεργασίας για τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Οι rrna τροποποιήσεις στα προκαρυωτικά απαιτούν συγκεκριμένα ένζυμα ενώ στα ευκαρυωτικά κατευθύνονται από τα snornas. Τα τελευταία, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο γεγονός που αποδεικνύεται και από τον αριθμό τους ( στον S. cerevisiea). Κατευθύνουν τοποειδικές τροποποιήσεις ~200 νουκλεοτιδίων στο premrna. Τα snornas χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: σε αυτά που ανήκουν στο C/D κιβώτιο, στο Η/ACA κιβώτιο και στο RNA της MRP RNAάσης, το οποίο αποτελεί ειδική κατηγορία (Kressler D. et al, 1999). Αυτά τα RNAs βρίσκονται σε ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα με ειδικές πρωτεΐνες όπως: φιμπριλλαρίνη-nop1, Nop56, Nop58/Nop5, Snu13 για C/D κιβώτιο, Cbf5, Gar1, Nhp2, Nop10 στο Η/ACA κιβώτιο. Ο μηχανισμός επιλογής των θέσεων έχει εξαρτάται από την συμπληρωματικότητα των διατηρημένων περιοχών των snornas με αλληλουχίες rrna στην περιοχή του τροποποιημένου νουκλεοτιδίου. Το πλεονέκτημα του snorna είναι ότι η τροποποίηση μπορεί να λάβει χώρα πριν από την ολοκλήρωση της μεταγραφής του RNA, διευκολύνοντας έτσι την αναδίπλωση του προδρόμου RNA. Εκτεταμένη χρήση των τεχνολογιών κλωνοποίησης καθώς και νουκλεοτιδικής ανάλυσης, έχει επιτρέψει τη σύγκριση rdna γονιδίων από ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών οργανισμών. Έτσι, περιοχές στα ώριμα rrnas φαίνεται να είναι εξαιρετικά συντηρημένες, ενώ οι διαχωριστικές ακολουθίες φαίνεται να διαφέρουν τόσο σε σύσταση, όσο και σε μέγεθος. Οι περιοχές αυτές συνδέονται και με άλλα 18

19 στοιχεία. Στον S. cerevisiae μια αλληλουχία 10 νουκλεοτιδίων, που βρίσκεται 250 νουκλεοτίδια πριν την Α 1, είναι συμπληρωματική με το 5 'άκρο του U3 snorna και δρα ως θέση πρόσδεσης για ένα σύμπλοκο U3 snorna-πρωτεΐνης (snorp), το οποίο είναι απαραίτητο για την επεξεργασία του rrna και την βιογένεση των ριβοσωμάτων. Στην 3 ETS υπάρχει μια εκτεταμένη δομή φουρκέτας στην οποία προσδένεται ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο, η ριβοσωμική συνοδός συναρμολόγησης (Ribosome Assembly Chaperone, RAC). Παρουσία αυτού του συμπλόκου η αποτελεσματικότητα και η εξειδίκευση της πέψης με την νουκλεάση Pac1 αλλάζει δραματικά. Ο ρόλος των snornas επεκτείνεται και στην αναδίπλωση των προ-rna μιας και δρουν του ζευγαρώματος Watson- Crick και έχουν πολλαπλούς στόχους στα pre- rrνα, τα οποία βρίσκονται μακριά το ένα από το άλλο. Έρευνες έδειξαν, πως είναι δυνατόν να περιέχονται σημαντικοί cis-δραστικοί παράγοντες ακολουθίες των ώριμων rrnas. Αλλαγές σε ασταθείς ή εκτεταμένες περιοχές στο 18S και 25S, επηρεάζουν την επεξεργασία του rrna (Lalev A. et al., 2000). Εκτός από τα cis δραστικά στοιχεία υπάρχουν και πολλοί άλλοι trans δραστικοί παράγοντες που συμμετέχουν στην συγκρότηση του ριβοσώματος. Α.2.3. Συγκρότηση του ριβοσώματος Η συγκρότηση του ριβοσώματος έχει μελετηθεί καλύτερα στη ζύμη, όπου έχει απομονωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρόδρομων ριβοσωμάτων και έχουν ταυτοποιηθεί τα συστατικά τους. Η διαδικασία αυτή απαιτεί την ύπαρξη ενός μεγάλου αριθμού μη ριβοσωμικών συστατικών, τα οποία δρουν σε διάφορα επίπεδα της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων. Εκτός από τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχουν βρεθεί πάνω από 170 παράγοντες που εμπλέκονται στην διαδικασία. Ο χαρακτηρισμός διαφορετικών προ-ριβοσωμικών σωματιδίων έδειξε πως η σύσταση των αρχικών 90S συμπλόκων, διαφέρει σημαντικά από αυτή των 60S και 40S σωματιδίων. Ένα πολύ σημαντικό εύρημα, είναι ότι από το 90S προ-ριβόσωμα απουσιάζουν οι περισσότεροι παράγοντες που απαιτούνται για τη σύνθεση του 60S, όχι όμως και για τη σύνθεση του 40S (Grandi P. et al. 2002). Αυτό υποδηλώνει ότι οι παράγοντες που απαιτούνται για την σύνθεση 60S υπομονάδων δεσμεύονται αργότερα. Αυτό εξηγεί και το γεγονός ότι οι μεταλλάξεις που αναστέλλουν τα 19

20 πρόωρα χάσματα Α 0 -Α 2 αναστέλλουν μόνο την σύνθεση 18S rrna και δεν έχουν καμία επίπτωση στην 60S υπομονάδα σύνθεση. Α Ωρίμανση των υπομονάδων Μόνο ένας μικρός αριθμός πρωτεϊνών έχει βρεθεί να παίζει ρόλο, τόσο στα αρχικά όσο και στα τελικά στάδια της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων. Μια πρωτεΐνη στην οποία έχει αποδοθεί ο ρόλος της γέφυρας μεταξύ του 90S και 40S, είναι η Enp1p. Το σύμπλοκο που προέκυψε έπειτα από καθαρισμό αγχιστείας με την Enp1p, περιέχει όχι μόνο το 35S πρόδρομο rrna, αλλά και το διμεθυλιωμένο 20S πρόδρομο rrna. Άλλες πρωτεΐνες που ανιχνεύονται και στο πρώιμο 90S σωματίδιο, είναι οι Dim1 και RRP12. Η Dim1, είναι μια μεθυλoτρανσφεράση, η οποία διμεθυλιώνει το 3' άκρο του 20S και εντοπίζονται μαζί με την RRP12 στον πυρηνίσκο, με ουσιαστική όμως παρουσία και στο κυτταρόπλασμα (Tschochner H, Hurt E., 2003). Επιπλέον η RRP12 εντοπίζεται και στο πρόδρομο 40S RNA. Και άλλες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με το πρόδρομο RNA. Ένα παράδειγμα είναι η πρωτεΐνη Rio2, που είναι ομόλογη της Rio1 και οι δυο πρωτεΐνες είναι μέλη μιας καινούριας οικογένειας κινασών σερίνης-θρεονίνης (Angermayr M. et al. 2002). Η πρωτεΐνη Rio2 θεωρείται μάρτυρας της κυτταροπλασματικής εντόπισης του 40S σωματιδίου των τελευταίων σταδίων και φαίνεται ότι δεσμεύεται στο 40S, μετά από τις διασπάσεις στα σημεία A 0 -A 2 ενώ δεν έχει βρεθεί στο 90S πρόδρομο σωματίδιο (Schafer T et al., 2003). Από έρευνες, προέκυψε και το αποτέλεσμα ότι και οι δύο πρωτεΐνες δεσμεύονται στο πρόδρομο 40S RNA στον πυρήνα και το συνοδεύουν στο κυτταρόπλασμα (Vanrobays E. et al., 2001) Μάρτυρα κυτταροπλασματικής εντόπισης αποτελεί και η πρωτεΐνη Nob1. Όσον αφορά την ωρίμανση της 60S υπομονάδας, απαιτεί πολλά ένζυμα επεξεργασίας και λαμβάνει χώρα σε διαφορετικά υποκυτταρικά διαμερίσματα. Έχουν βρεθεί περίπου 70 πρωτεΐνες, οι οποίες συμμετέχουν στα διαφορετικά στάδια ωρίμανσης της 60S υπομονάδας και αρκετές από τις πρωτεΐνες αυτές συνδέονται με κάποια ή τα περισσότερα από τα pre-60s σύμπλοκα. Ενώ τα παραδείγματα που δόθηκαν στην παραπάνω παράγραφο αποτελούν γέφυρα μεταξύ 40S και 90S, η πρωτεΐνη Nsa3 αποτελεί σύνδεσμο μεταξύ 90S και 60S πρόδρομου RNA (Nissan T. 20

21 et al., 2002). Με τα αρχικά 60S πρόδρομα RNA συνδέονται και οι πρωτεΐνες Ssf1 και RPf1. Κατά την μεταφορά του 60S πρόδρομου RNA από τον πυρήνα εμπλέκονται οι παράγοντες εξόδου Nmd3 και Mtr2, ενώ είναι πιθανό να εμπλέκεται και η πρωτεΐνη Arx1, η οποία εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα όσο και στο κυτταρόπλασμα και συνδέεται με του σ προαναφερθέντες παράγοντες. Επιπρόσθετα, και οι πρωτεΐνες Nog1, Nog2, Nug1 και Nug2 που είναι πιθανές GTPάσες ακολουθούν το 60S από τον πυρηνίσκο στο πυρηνόπλασμα μέχρι τους πυρηνικούς πόρους. Εκτός από πρωτεΐνες, και δυο πρωτεϊνικά σύμπλοκα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση και την ενδοπυρηνική μετακίνηση των πρόδρομων ριβοσωμάτων, τα Noc1-Noc2 και Νοc2-Noc3 (Milkereit P et al., 2001). Τo πρώτο σύμπλοκο συνδέεται με το 90S και το πρόδρομο 60S και εντοπίζεται στον πυρηνίσκο, ενώ το δεύτερο συνδέεται μόνο με το πρόδρομο 60S και εντοπίζεται στο πυρηνόπλασμα. Οι πρωτεΐνες Noc εμφανίζουν μια δυναμική ενδοπυρηνική εντόπιση και κινούνται μεταξύ πυρηνίσκου και πυρηνοπλάσματος. Συμπερασματικά, από τα παραπάνω γίνεται κατανοητό ότι η βιογένεση των ριβοσωμάτων είναι μια αρκετά πολύπλοκη κυτταρική διεργασία που απαιτεί την συμμετοχή αρκετών παραγόντων. Με την εξέλιξη των τεχνικών όπως η φασματομετρία μάζας ή μέθοδος διαδοχικού καθαρισμού συγγένειας (Tandem Affinity Purification. TAP) θα διαλευκανθούν οι πολύπλοκες δυναμικές της διαδικασίας ωρίμανσης, καθώς και να συσχετιστούν με άλλες βασικές κυτταρικές λειτουργίες (Fromont, Racine M. et al., 2003, Nazar R., 2004). Στην παρακάτω εικόνα δίνονται τα στάδια ωρίμανσης καθώς και η έξοδος από τον πυρηνίσκο στο κυτταρόπλασμα, των 40S και 60S ριβοσωμικών υπομονάδων. Επίσης, δίνονται και οι σημαντικότεροι παράγοντες που συμμετέχουν σε αυτές τις διεργασίες. 21

22 Εικόνα Α.4. Η ωρίμανση και η έξοδος των 40S και 60S ριβοσωμικών υπομονάδων (Tschochner H., Hurt E., 2003). Α.2.4. Μετακίνηση ριβοσωμάτων από το πυρηνόπλασμα στο κυτταρόπλασμα Όπως είναι γνωστό η σύνθεση του RNA και των πρωτεϊνών πραγματοποιείται σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα των ευκαρυωτικών κυττάρων οπότε είναι αναγκαία η διαμετακίνηση των μακρομορίων ανάμεσα στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Όλα τα μακρομόρια μεταφέρονται μέσω του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου (Nuclear Pore Complex, ΝPC), μια μεγάλης δομής που συγκροτείται από τις νουκλεοπορίνες, (Νucleoporins, Νups) και εντοπίζεται στον πυρηνικό φάκελο. Οι νουκλεοπορίνες βρίσκονται σε οκτώ αντίγραφα ή πολλαπλάσια του οκτώ για αυτό και δομικά έχει οκταγωνική συμμετρία. Αποτελείται από δύο ομόκεντρους δακτυλίους, 22

23 έναν στην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (προς το κυτταρόπλασμα) και έναν στην εσωτερική μεμβράνη (προς το πυρηνόπλασμα). Ανάμεσα στους δύο αυτούς δακτυλίους βρίσκεται ένας τρίτος δακτύλιος, που αποτελείται από οχτώ ακτινωτά διατεταγμένους κυλίνδρους, οι οποίοι σχηματίζουν τον κεντρικό δίαυλο του πυρηνικού πόρου. Πολλές νουκλεοπορίνες καθώς και άλλες πρωτεΐνες συστατικά του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου - περιέχουν αρνητικά φορτισμένες και μη διαμορφωμένες περιοχές (unstructured regions) με υδρόφοβες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες FG (αλληλουχίες Phe Gly) με τις οποίες αλληλεπιδρούν με τις καρυοφερίνες (Tran E., Wente S., 2006). Ο πυρηνικός πόρος έχει μέγεθος περίπου 40 ΜDa (Davis J. et al. 1995). Όσον αφορά τη μεταφορά μέσω του πυρηνικού πόρου, μικρά μόρια μεγέθους kda μετακινούνται με παθητική διάχυση ενώ μεγαλύτερα μόρια απαιτούν ενεργά σήματα και ενέργεια. Στην δεύτερη περίπτωση τα μόρια φέρουν σήματα πυρηνικής εντόπισης (Nuclear Localization Signal, NLS) τα οποία διαμεσολαβούν για την αλληλεπίδραση με υποδοχείς μεταφοράς στους πυρηνικούς πόρους. Τα σήματα αυτά αναγνωρίζονται από τις καρυοφερίνες (Karyopherins), οι οποίες είναι πρωτεΐνες που μεταφέρουν πρωτεΐνες και RNA από το κυτταρόπλασμα στο πυρήνα και αντίστροφα. Οι καρυοφερίνες αλληλεπιδρούν τόσο με το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου όσο και με άλλους ρυθμιστές (Rout M. et al., 2000) και διακρίνονται σε ιμπορτίνες(importins) και εξπορτίνες(exportins). Η ιμπορτίνη είναι ένα ετεροδιμερές, διαθέτει μια α και μια β υπομονάδα και μεταφέρει πρωτεΐνες στο εσωτερικό του πυρήνα. Η δέσμευση της εξπορτίνης στο υπόστρωμά της εξαρτάται από τη συναρμολόγηση συμπλόκου με την RanGTP. Δέσμευση της πρωτεΐνης Ran με το GTP ενισχύει την αλληλεπίδραση του συμπλόκου με την εξπορτίνη. Κατά την μετακίνηση προς το κυτταρόπλασμα, υδρολύεται το GTP από μία πρωτεΐνη, την GAP, και απελευθερώνεται το φορτίο. Η πιο γνωστή οικογένεια καρυοφερινών είναι αυτής της καρυοφερίνης β(κapβ). Υπάρχουν πάνω από 20 Kapβ στα ανθρώπινα κύτταρα και 14 στη ζύμη. Ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο έχει η καρυοφερίνη CRM1, η οποία εμπλέκεται στην μεταφορά των ριβοσωμάτων από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Η CRM1 αναγνωρίζει ένα σήμα πυρηνικής εξόδου (Nuclear Export Signal, NES), το οποίο είναι μια πρωτεϊνική αλληλουχία πλούσια σε λευκίνη. Εντούτοις βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν πως αυτές οι καρυοφερίνες μπορούν να μεταφέρουν και πρωτεΐνες 23

24 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα χωρίς να διαθέτουν οπωσδήποτε κάποιο σήμα εξόδου (Fornerod M. et al. 1997). Στον S.cerevisiea μόνο μια ριβοσωμική υπομονάδα μπορεί να περάσει μέσα από τον πυρηνικό πόρο την ίδια χρονική στιγμή λόγω του μεγέθους (ο πυρηνικός πόρος έχει μέγεθος 40 ΜDa (Davis J. et al, 1995). Η μακρομοριακή μεταφορά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα συνήθως είναι ενεργητική. Για την έξοδο της μεγάλης υπομονάδας απαιτούνται πολύ παράγοντες, τρείς υποδοχείς όμως είναι χαρακτηριστικοί. Σε αυτούς ανήκουν η CRM1, που στρατολογείται από τον προσδέτη Nmd3, το ετεροδιμερές Mex67/Μtr2 και τον υποδοχέα Arx1. Από αυτούς μόνο η CRM1 εξαρτάται από το Ran GTP. O Nmd3 έχει σήμα πυρηνικής εξόδου πλούσιο σε λευκίνες και προσδένεται στη 60S υπομονάδα. Στον Νmd3 στη συνέχεια προσδένεται και η CRM1. To ετεροδιμερές Mex67/Μtr2 αποτελεί τον κύριο παράγοντα εξόδου του mrna στη ζύμη και είναι απαραίτητο για την έξοδο της μεγάλης υπομονάδας. Αλληλεπιδρά με ποικίλες νουκλεοπορίνες και κυρίως με αυτές που φέρουν επαναλαμβανόμενες FG επαναλήψεις. Βέβαια, έχει βρεθεί να συνδέεται και με τη Nup84, η οποία δεν έχει FG επαναλήψεις. Όσον αφορά, την Arx1 προσδένεται στις νουκλεοπορίνες Nup24 και Nup100. Εκτός από τους παραπάνω και άλλοι παράγοντες έχουν βρεθεί να σχετίζονται χωρίς όμως να έχει διευκρινιστεί πλήρως ο ρόλος τους. Σε αυτούς περιλαμβάνονται ο Alb1, που προσδένεται στην Arx1, ο Tif6, o Rlp24, ο Nog1 και η Lsg1p. Σχετικά με την έξοδο της μικρής υπομονάδας, και για αυτή σπουδαίο ρόλο διαδραματίζει η CRM1. Από πειράματα με λεπτομυκίνη Β, οι πρωτεΐνες rps2 και rps3 αλλά και ο παράγοντας Ltv1 εμπλέκονται στην μεταφορά της. Και άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες όπως η rps6 και η rps15 φαίνεται να επηρεάζουν την μεταφορά της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη rps6 συμπλέκεται με άλλες πρωτεΐνες και rrna και μεταφέρεται διαμέσου του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου. Παρεμπόδιση της πυρηνικής μυοσίνης και της ακτίνης σε κύτταρα HeLa οδηγεί στη συσσώρευση της rps6 στο πυρηνόπλασμα. Οι παλινδρομικές κινήσεις της πυρηνικής μυοσίνης (NMI) και ακτίνης έχουν ως αποτέλεσμα την διευκόλυνση της εξόδου του ~10% της 40S υπομονάδων (Cisterna B. et al. 2006). 24

25 Α.2.5. Έλεγχος μηχανισμών Επειδή η συγκρότηση των ριβοσωμάτων απαιτεί πολύπλοκες λειτουργίες μπορούν να συμβούν λάθη, που τελικά θα επηρεάσουν τα κύτταρα. Για παράδειγμα, η ταχεία παραγωγή μεγάλου αριθμού ριβοσωμάτων απαιτεί αποτελεσματική ανακύκλωση των παραγόντων συναρμολόγησης. Ή η εσφαλμένη συναρμολόγηση θα μπορούσε να δημιουργήσει δυσλειτουργία των ριβοσωμικών υπομονάδων η παρουσία των οποίων δυσχεραίνει τη λειτουργία των φυσιολογικών. Στην πρώτη σημαντική ανακάλυψη των μηχανισμών για τον έλεγχο και την καταστροφή των λανθασμένα συγκροτημένων ριβοσωμάτων βρέθηκε ότι το εξωσωματίο δεν δρα μόνο στην επεξεργασία των pre-rrnas, αλλά επίσης και στην καταστροφή των μη φυσιολογικών ενδιάμεσων pre-rrna. Με το εξωσωμάτιο αλληλεπιδρά το σύμπλοκο TRAMP, που περιέχει πολυ (Α) πολυμεράση Trf4 Trf5, την RNA ελικάση Α.3. Ριβοσωμικές πρωτεΐνες Α.3.1. Χαρακτηριστικά ριβοσωμικών πρωτεϊνών Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες αν και σε μικρό ποσοστό, αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι του ριβοσώματος με σημαντικό ρόλο. Η πρόοδος στην δομική ανάλυση του ριβοσώματος συνέβαλε σημαντικά στον προσδιορισμό και την αλληλούχιση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Υπάρχουν περίπου 80 διαφορετικές που κατανέμονται στις δύο υπομονάδες. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες που βρίσκονται στην μικρή υπομονάδα χαρακτηρίζονται με το λατινικό γράμμα S (Small) και έναν αριθμό, ενώ αυτές που βρίσκονται στη μεγάλη υπομονάδα χαρακτηρίζονται με το λατινικό γράμμα L (Large) και έναν αριθμό. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από mrnas τα οποία συνθέτονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ στον πυρήνα και στη συνέχεια, τα mrnas μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται η μετάφραση και η πρωτεϊνοσύνθεση. Ακολούθως, διαπερνούν τους πυρηνικούς πόρους, οδηγούνται στον πυρήνα και τελικά στον πυρηνίσκο, όπου συνδέονται με τα νεοσυντιθέμενα rrnas, ώστε να λάβει χώρα η συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων (Warner 25

26 J., 2001). Η ταχύτητα διαμετακίνησης των ριβοσωμικών συστατικών και των ριβοσωμικών υπομονάδων είναι υψηλή. Έχει βρεθεί, πως σε ένα κύτταρο ζύμης το οποίο βρίσκεται σε φάση ανάπτυξης, εισέρχονται στον πυρήνα, δια μέσου των πυρηνικών πόρων, περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες σε ένα λεπτό, ενώ εξέρχονται, στον ίδιο χρόνο, περίπου ριβοσωμικές υπομονάδες. (Warner J., 1999). Έχουν εσωτερικά περιοχές με θετικό φορτίο έτσι ώστε να αλληλεπιδρούν με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες των νουκλεοτιδίων. Επίσης, έχουν τομέα δέσμευσης νουκλεοτιδίων ώστε να συνδέονται με αυτά κατά την βιογένεση και την μετάφραση. Κατά μέσο όρο, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, έχουν μοριακό μέγεθος Da, το οποίο κυμαίνεται από Da για την L4, έως Da για την L41 και ο αριθμός των αμινοξέων είναι κατά μέσο όρο 164, από 421 έως 25. Οι περισσότερες πρωτεΐνες είναι βασικές (πλούσιες σε λυσίνη και αργινίνη), με μέσο ισοηλεκτρικό σημείο το Όξινες είναι μόνο οι φωσφοπρωτεΐνες LP0, LP1Α και LP2, καθώς και η rpsa. Αν και οι δομή τους δεν έχει απεικονιστεί με τρισδιάστατες δομές όπως των προκαρυωτικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών, εμφανίζουν συγκεκριμένα δομικά χαρακτηριστικά. Εκτός από το σήμα πυρηνικής εντόπισης κάποιες εμφανίζουν αλληλουχίες 3-8 αμινοξέων, οι οποίες επαναλαμβάνονται δύο ή περισσότερες φορές. Επιπλέον χαρακτηριστικά αποτελούν οι δομές δακτύλου ψευδαργύρου, τα φερμουάρ λευκίνης (Wool I., 1995) και τα μοτίβα ΚΗ, στα οποία συνδέεται το RNA. Κοντά στο Ν-τελικό και στο C-τελικό άκρο, απαντώνται δέσμες 3 ή 4 βασικών αμινοξέων. Όσον αφορά την προέλευση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών υπάρχουν δυο πιθανές θεωρίες. Σύμφωνα με την πρώτη, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχεδιάστηκαν αποκλειστικά για το ριβόσωμα, ενώ η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι είχαν επιλεγεί ανάμεσα από ήδη υπάρχουσες πρωτεΐνες, οι οποίες είχαν καθορισμένες λειτουργίες. Οι δυο θεωρίες δεν είναι απόλυτες ούτε είναι πιθανό όλες οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες να είχαν προστεθεί στο ριβόσωμα την ίδια στιγμή. Είναι αρκετά συντηρημένες στα διάφορα είδη οργανισμών. Στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχει ένα λειτουργικό γονίδιο και ένας μεγάλος αριθμός ψευδογονιδίων για κάθε ριβοσωμική πρωτεΐνη. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παρουσιάζουν γενετικές ποικιλομορφίες. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S4 η οποία βρίσκεται στα χρωμοσώματα Χ 26

27 και Ψ και οι S3, S6, S17 και L17 εμφανίζονται να έχουν μια πολλαπλή ομολογία ποικιλομορφιών. Στην S. cerevisiea 59 από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από δύο αντίγραφα γονιδίων (Giaever G. et al., 2002). Α.3.2. Ρόλος των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παίζουν κύριο ρόλο στην επεξεργασία του pre-rrna, στην αναδίπλωση του rrna, στην μεταφορά πρόδρομων ριβοσωμάτων και στην σταθερότητα της δομής των ριβοσωμικών υπομονάδων, καθώς αλληλεπιδρούν με διάφορους παράγοντες τόσο στην διαδικασία της βιογένεσης όσο και της μετάφρασης (Blaha B., 2004). Nα αναφερθεί, ότι στο πρώτο στάδιο συνδέονται στα RNA 15 και 22 ριβοσωμικές πρωτεΐνες της μικρής και της μεγάλης υπομονάδας, αντίστοιχα. Κάποιες από αυτές συνδέονται πρωταρχικά και σε αυτές ανήκει και η rps7 (Korebeinikova A., et al., 2012) Εκτός από δομικά συστατικά του ριβοσώματος είναι απαραίτητες για τη σύνδεση του ριβοσώματος με το mrna και παράγοντες έναρξης και επιμήκυνσης. Επίσης, εμπλέκονται και σε λειτουργικές περιοχές των ριβοσωμάτων όπως το κανάλι εξόδου του mrna και το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Εκτός από την βιοσύνθεση των ριβοσωμάτων, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο και σε εξωριβοσωμικές κυτταρικές λειτουργίες (extraribosomal functions) τόσο των ευκαρυωτικών όσο και των προκαρυωτικών οργανισμών. Επίσης, έχουν συσχετισθεί και με ασθένειες, όπως ο καρκίνος. Η πολυλειτουργικότητά τους ενισχύεται από το γεγονός ότι παράγονται ριβοσωμικές πρωτεΐνες ακόμη και αν παρεμποδίζεται η σύνθεση του RNA και ότι σε καρκινικές σειρές παρατηρείται υπερπαραγωγή. Ταυτόχρονα, συσχετίζονται και με ογκοκαταστολείς. Στις εξωριβοσωμικές λειτουργίες των ευκαρυωτικών περιλαμβάνονται η αντιγραφή, η μεταγραφή, η επιδιόρθωση του DNA, το μάτισμα και η τροποποίηση του RNA. Επιπλέον, ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση ενώ όσο αφορά τον καρκίνο σχετίζονται με την πολλαπλασιασμό, την μετάσταση, την ρύθμιση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και πρωτοογκογονιδίων. Έχουν συσχετισθεί και με το σύνδρομο Turner, το σύνδρομο Noonan και τις ριβοσωμοπάθειες. 27

28 Για παράδειγμα, η rps3, που είναι συντηρημένη στα βακτήρια και τους ευκαρυώτες, συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA δρώντας ως ενδονουκλεάση, ενώ επάγει και την απόπτωση λόγω ενεργοποίησης της κασπάσης 8 και της κασπάσης 3. Αργότερα, βρέθηκε ότι δρα και ως DNA φωσφοδιεστεράση. Η rps3a, που είναι ειδική για τους ευκαρυώτες, αυξάνεται κατά την S- φάση της κυτταρικής ανάπτυξης και σε καρκινικές σειρές. Η υπερπαραγωγή της εμποδίζει την διαφοροποίηση ενώ χαμηλότερα επίπεδα ενισχύουν την διαφοροποίηση αλλά παρεμποδίζουν την κυτταρική ανάπτυξη. Επιπρόσθετα, αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες αλλά και με την αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και την PARP. Αλλαγές στα επίπεδα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχετίζονται με ανθρώπινες διαταραχές. Η rps4, που κωδικοποιείται από τα λειτουργικά γονίδια που βρίσκονται στα χρωμοσώματα Χ και Υ, επηρεάζει τον φαινότυπο του συνδρόμου Turner. Το λειτουργικό γονίδιο για την RPL6 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 12 σε μια περιοχή κρίσιμη για το σύνδρομο Noonan. Μεταλλάξεις σε αυτή την πρωτεΐνη εμπλέκονται στην εξέλιξη της ασθένειας. Μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την ριβοσωμική πρωτεΐνη RPS19 είναι υπεύθυνες για το 25% των περιπτώσεων σε ασθενείς που πάσχουν από την αναιμία DBA (Diamond Blackfan Anemia). Με την πάροδο των ετών όλο και περισσότερες μεταλλάξεις ριβοσωμικών πρωτεϊνών συνδέονται με αυτό το σύνδρομο. Σε αυτές περιλαμβάνονται μεταλλάξεις στo γονίδιo της S4, της S17 αλλά και της S10 και S26. Όπως προαναφέρθηκε, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχετίζονται και με τον καρκίνο. Η L5 και η L11 συνεργάζονται και ενεργοποιούν την p53. H p53 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που καταστέλλει τον όγκο και αποκρίνεται σε καταστάσεις κυτταρικού στρες με σκοπό να διακόψει τον κυτταρικό κύκλο και να επάγει την απόπτωση. Κύριος ρυθμιστής της p53 είναι μια λιγάση ουβικιτίνης στην οποία συνδέονται η L5, η L11 και η L23. Άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν απευθείας με την ογκοπρωτεΐνη MDM2, αναστέλλοντας τη δραστικότητα της E3 λιγάσης ουβικιτίνης, οδηγώντας σε σταθεροποίηση της p53 και του κυτταρικού κύκλου (Daftuar et al. 2013). Σε αυτές ανήκουν οι L23, S7, S14, S25 καθώς και οι S27, S27A και S27L. Θετικός ρυθμιστής της p53 είναι η ριβοσωμική πρωτεΐνη L26. 28

29 Α.3.3. Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες επιδέχονται και αρκετές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις που αφορούν κυρίως τις εξωριβοσωμικές λειτουργίες. Η πιο κοινή είναι η φωσφορυλίωση ενώ έχουν βρεθεί και η ακετυλίωση και η μεθυλίωση. Πιο σπάνιες είναι οι τροποποιήσεις στο ασπαραγινικό και το γλουταμινικό οξύ καθώς και η περικοπή του καρβοξυ- τελικού άκρου. Η ακετυλίωση και η μεθυλίωση του αμινο- τελικού άκρου είναι γνωστές από το Στον S. cerevisiea περισσότερες από 30 ριβοσωμικές πρωτεΐνες ακετυλιώνονται από Ν- ακετυλοτρανσφεράσες (N-AcetylTransferase, ΝΑΤ). Επίσης, τα ριβοσώματα έχουν μεθυλικές ομάδες οι 10 από τις οποίες μοιράζονται στις L23, L32 και L1. Πρόσφατες έρευνες, έχουν δείξει ότι αμινοξικά κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης υφίστανται O-συνδεδεμένη- β-d-n-ακετυλογλυκοζαμίνη (O-GlcNAc). Υπερέκφραση της O-GlcNAc τρανσφεράσης, του ενζύμου που εμπλέκεται σε αυτή την τροποποίηση, είχε ως αποτέλεσμα κορυφές στην 60S και 80S στο προφίλ των πολυσωμάτων. Συμπεραίνεται ότι αυτή η τροποποίηση ίσως είναι σημαντική για την βιογένεση των ριβοσωμάτων. Α Φωσφορυλίωση ριβοσωμικών πρωτεϊνών Η πιο καλά μελετημένη τροποποίηση είναι η φωσφορυλίωση. Η rps6 των θηλαστικών ήταν η πρώτη πρωτεΐνη που βρέθηκε ότι φωσφορυλιώθηκε. Κοντά στο C- τελικό άκρο η S6 έχει πέντε σερίνες (θέσεις 235, 236, 240, 244 και 247) που φωσφορυλιώνονται με ακριβή σειρά στην 40S υπομονάδα. Ο κινάσες που είναι υπεύθυνες για την φωσφορυλίωση είναι η S6K1 και η S6K2. Η S6 εμπλέκεται στην μεταφραστική ενεργοποίηση των ΤΟΡ mrnas. Ουσιαστικά, ενισχύεται η επιλεκτική μετάφραση μιας σειράς εξειδικευμένων mrnas τα οποία περιέχουν μια μικρή ακολουθία 5-15 πυριμιδινών στην 5 μη μεταφραστική περιοχή του mrna (UTR), ακριβώς μετά το mgtp κάλυμμα, (5 -TOP). H κατηγορία αυτή των mrnas αφορά ριβοσωμικές πρωτεΐνες, παράγοντες επιμήκυνσης (EEF1A1 και EEF2) και πολλές άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται είτε στα διάφορα στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων είτε στον έλεγχο της μετάφρασης. 29

30 Βέβαια, η μεταφραστική ρύθμιση των 5 -TOP mrnas, δεν εξαρτάται αποκλειστικά από τη φωσφορυλίωση της S6, αλλά και από άλλα αναπτυξιακά και μιτογόνα ερεθίσματα, αφού όπως έχει βρεθεί, στα MEL κύτταρα ή σε άλλα αιμοποιητικά κύτταρα, δεν παρατηρείται φωσφορυλιωμένη S6, παρόλα αυτά όμως, πραγματοποιείται σε κάποιο βαθμό η μετάφραση των 5 -TOP mrnas (Barth-Baus D. et al., 2002). Εκτός από την S6 και άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε φωσφορυλίωση. Η rps3 φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες ERK και PKC delta. Επιπλέον, έχει βρεθεί φωσφορυλιωμένη rps2 στα πολυσώματα και rps3a, RPL14, RPL19 και rps5 φωσφορυλιωμένες μόνον σε ελεύθερες ριβοσωμικές υπομονάδες. Α.3.4. Η S7 οικογένεια των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Γενικά, αυτή η οικογένεια περιλαμβάνει τις S7 ριβοσωμικές πρωτεΐνες των βακτηρίων, των φυκιών, των χλωροπλαστών, των κυανοβακτηρίων, των αρχαιοβακτηρίων, των μιτοχονδρίων, καθώς και τις S5 ριβοσωμικές πρωτεΐνες των φυτών και των θηλαστικών. Κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ένα συντηρημένο τμήμα αμινοξέων στο καρβόξυ- τελικό άκρο, το οποίο έχει την εξής ακολουθία: [DENSK]-x-[LIVMDET]-x(3)-[LIVMFTA](2)-x(6)-G-K-[KR]-x(5)-[LIVMF]- [LIVMFC]-x(2)-[STAC] ( prosite). Η rps7 στο E.coli αποτελείται από 179 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος Da. Όσον αφορά τη δομή της αποτελείται από έξι α-έλικες και μια β-φουρκέτα που βρίσκεται ανάμεσα στις έλικες 3 και 4. Οι έλικες 1-5 σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα το οποίο αποτελεί το σώμα της πρωτεΐνης. Η έλικα 6 αποτελεί γέφυρα για την σύνδεση του σώματος με την β- φουρκέτα και βοηθά στην απόκτηση του κατάλληλου προσανατολισμού της τελευταίας. Τα αμινο- και καρβοξυ- τελικά άκρα είναι εκτεθειμένα και χωρίς κάποια τάξη. Η rps7 βρίσκεται στην θέση εξόδου (Ε) του trna στην μικρή υπομονάδα και συμβάλλει στην διαμόρφωση του καναλιού εξόδου του mrna. Επίσης, αλληλεπιδρά με την ριβοσωμική πρωτεΐνη rps11, στην περιοχή πλατφόρμας της 30S υπομονάδας (Robert F. et al., 2003). Παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης με μεταλλάξεις είτε στη μια είτε στην άλλη πρωτεΐνη έχει σαν αποτέλεσμα το ριβόσωμα να είναι επιρρεπές σε 30

31 λάθη κατά τη μετάφραση στον οργανισμό E.coli. Η αλληλεπίδραση της rps7 με την rps11, δεν είναι συντηρημένη. Η S7 ριβοσωμική πρωτεΐνη των βακτηρίων, είναι μια από τις πρωτεΐνες που δρουν στα αρχικά στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων συμβάλλοντας στη σωστή αναδίπλωση του 3 κύριου τμήματος του 16S rrna, το οποίο τελικά σχηματίζει την κεφαλή της 30S υπομονάδας του ριβοσώματος (Nowotny V., Nierhaus K., 1988). Εντοπίζεται, στην κεφαλή της 30S υπομονάδας, προς το μέρος της πλευρικής προεξοχής, πάνω από τη σχισμή και τη θέση αποκωδικοποίησης. Συγκεκριμένα βρίσκεται πολύ κοντά στα σημεία Α-, P- και E, όπου δεσμεύεται το trna. Μάλιστα, είναι η μοναδική πρωτεΐνη της μικρής υπομονάδας που συνδέεται ομοιοπολικά με το trna στα σημεία Α- και Ρ-. Η ρύθμιση της διαμόρφωσης του 16S rrna, που προέρχεται από την rps7, είναι ένα απαραίτητο βήμα για την επακόλουθη δέσμευση στην κεφαλή της μικρής υπομονάδας άλλων ριβοσωμικών πρωτεϊνών, που αλληλεπιδρούν με rrna. Σε αυτές περιλαμβάνονται οι S3, S9, S10, S13, S14, S19 και λιγότερο η S2. Όσον αφορά την rps7 των αρχαιοβακτηρίων έχει μια προέκταση περίπου 60 αμινοξέων στο αμινο-τελικό της άκρο. Η προέκταση αυτή δεν υπάρχει στην ομόλογη πρωτεΐνη των βακτηρίων, ενώ υπάρχει σε αυτή των ευκαρυωτικών οργανισμών. Α.3.5. Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη Η ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών οργανισμών S5 ανήκει στην οικογένεια των προκαρυωτικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών S7. Οι πρωτεΐνες rps5 και rps7 είναι κατά 30% ταυτόσημες στο επίπεδο των αμινοξέων τους και φαίνεται να είναι συντηρημένες στην καρβοξυ τελική περιοχή, ενώ διαθέτουν μεταβλητό αμινο τελικό άκρο. Τα ακραία 16 αμινοξέα του καρβοξυ-τελικού άκρου είναι εξαιρετικά συντηρημένα στους οργανισμούς. Αυτό υποδηλώνει ότι αυτή η περιοχή στις rps5 και rps7 πρωτεΐνες εξυπηρετεί μια σημαντική λειτουργία. Στο αμινο- τελικό άκρο υπάρχει ομολογία μεταξύ των πρωτεϊνών των θηλαστικών και των αρχαιοβακτηρίων, οπότε και στα ευκαρυωτικά παρατηρείται η προέκταση στο αμινο-τελικό άκρο που εμφανίζουν τα αρχαιοβακτήρια. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S5 και στους τρεις οργανισμούς (άνθρωπο, ποντίκι και επίμυ) αποτελείται από 204 αμινοξέα και αυτή του ποντικού έχει μοριακό μέγεθος 31

32 Da και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο Eντοπίζεται στην κεφαλή της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος. Τα 30 καρβοξυ-τελικά αμινοξέα είναι εξαιρετικά διατηρημένα στα ευκαρυωτικά. Ψευδο ατομικά μοντέλα των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων προβλέπουν ότι τα τελευταία 18 αμινοξέα της rps5 φορές διπλώνονται σε μια άλφα- έλικα η οποία δεν έρχεται σε επαφή με το rrna της SSU. Η έλικα μάλλον απομακρύνεται από το κεφάλι της SSU προς την rps14, ένα συστατικό της πλατφόρμας SSU (Νeueder A. et al., 2010). Εικόνα Α.5. Θέση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 στην μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος(α). Δομή της rps5(b) (Νeueder A. et al., 2010) Το γονίδιο της πρωτεΐνης S5 στον οργανισμό S. cerevisiae βρίσκεται σε ένα μόνο αντίγραφο και παίζει σημαντικό ρόλο στη βιωσιμότητα του κυττάρου (Ignatovich O. et al. 1995). Επίσης, και στον επίμυ βρίσκεται σε ένα μόνο αντίγραφο σε αντίθεση με τον άνθρωπο και το ποντίκι όπου απαντάται σε 5 6 και σε 3 4 αντίγραφα, αντίστοιχα. Στον άνθρωπο το γονίδιό της βρίσκεται στο χρωμόσωμα 19 ενώ στο ποντίκι στο χρωμόσωμα 7 και είναι συντηρημένο. Στον επίμυ έχει βρεθεί μία πρωτεΐνη, η S5a, η οποία είναι μεν ταυτόσημη με την rps5, λείπουν όμως τα 5 πρώτα αμινοξέα. Και οι δυο αυτές μορφές της rps5 προέρχονται από το ίδιο cdna μεταγράφημα και πιθανώς η S5a προκύπτει από την S5, έπειτα από πρωτεόλυση (Kuwano Y., Wool I., 1992). 32

33 Α Ρόλος της S5 Ο υψηλός βαθμός ομοιότητας στην αλληλουχία μεταξύ rps5 και rps7 αλλά και η θέση τους, υποδηλώνουν ότι και ο λειτουργικός τους ρόλος είναι διατηρημένος. Πράγματι, οι μεταλλάξεις στις rps7/s5 είναι επιζήμιες για την κυτταρική λειτουργία. Μπορούν να διαταράξουν σημαντικά τη διαδικασία της μετάφρασης, οδηγώντας σε αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης αλλά και σε λάθη κατά την ανάγνωση. Επιπρόσθετα, εμπλέκεται στη διαδικασία ωρίμανσης του 18S rrna. In vivo μείωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 οδηγεί σε «εγκλωβισμό» στον πυρήνα και αποδόμηση της μικρής πρόδρομης ριβοσωμικής υπομονάδας, καθώς και καθυστέρηση της ωρίμανσης του πρώιμου 18S rrna (προ 18S rrna).tα 7 αμινοξέα του καρβοξυ τελικού άκρου απαιτούνται μαζί με άλλους παράγοντες όπως η πρωτεΐνη Nob1p για την τελική ωρίμανση του 3 άκρου του 18S RNA. Επιπλέον, η rps5 απαιτείται για τη συναρμολόγηση και άλλων πρωτεϊνών της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας. Απουσία αυτών των πρωτεϊνών, οι νεοσυντιθέμενες υπομονάδες φθάνουν στο κυτταρόπλασμα με σημαντικά αργή κινητικότητα (Neueder Α. et al. 2010). Ενδιαφέρον είναι το ότι τα 7 αμινοξέα του καρβοξυ- τελικού άκρου είναι απαραίτητα για την ενδονoυκλεολυτική διάσπαση στη θέση D, όπoυ το 20S pre rrna μετατρέπεται στο ώριμο 18S rrna. Εκτός όμως από τον λειτουργικό ρόλο είναι μια από τις πρωτεΐνες που ενεργοποιούνται σε ανθρώπινους όγκους και παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον καρκίνο. Τα γονίδια των πρωτεϊνών αυτών, επάγονται από μια κατηγορία μεταγραφικών παραγόντων, τα λεγόμενα myc ογκογονίδια. Αξιοσημείωτο είναι ότι, τα περισσότερα γονίδια των πρωτεϊνών που επάγονται από τα myc ογκογονίδια κατέχουν κυρίαρχο ρόλο στη συγκρότηση και τη δραστικότητα του ριβοσώματος. Η έκφραση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5, έχει μελετηθεί κατά τη διάρκεια της επαγόμενης διαφοροποίησης ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL (Murine ErythroLeukemia Cells) και βρέθηκε ότι το γονίδιο της σε επίπεδο mrna καταστέλλεται σταδιακά κατά τη διαφοροποίηση (Vizirianakis Ι. et al., 1999). Αντίθετα, το ίδιο γονίδιο έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του εντέρου, (Atlas Select Human Tumor Array Gene List, atlas.clontech.com). 33

34 Επίσης, για την rps5 έχει βρεθεί πως η αλληλεπίδρασή της με την IRES, (Internal Ribosome Entry Site), του ιού της ηπατίτιδας C, είναι καθοριστική για τη μετέπειτα αλληλεπίδραση μεταξύ της IRES περιοχής και της 40S υπομονάδας του ριβοσώματος, γεγονός που αποτελεί μοναδικό χαρακτηριστικό της μετάφρασης του ιού HCV. Είναι γνωστό πως οι πικο-rna-ιοί, αφού δεν διαθέτουν καλυμμένο το 5 - άκρο του mrna τους, προκειμένου να συνδεθεί ο παράγοντας έναρξης της επιμήκυνσης eif-4, συνδέονται με τη 40S υπομονάδα μέσω υψηλά δομημένων στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (rps5/rps14), όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.2 της παραγράφου Α.1.1, και το κανάλι εξόδου του mrna που διαμορφώνεται από την αλληλεπίδραση της rps5 με την rps14 είναι ανοιχτό κατά την απομόνωση σε ζύμη της 40S υπομονάδας (Passmore L. et al. 2007) περιοχών στο 5' της μη μεταφράσιμης περιοχής, (Non Translated Region, NTR), του mrna (Hellen C. et al., 2001). A Φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 Ένα ακόμη χαρακτηριστικό της rps5 της ζύμης είναι ότι υπόκειται σε φωσφορυλίωση (Ignatovich O. et al. 1995). Στον εγκεφαλικό φλοιό του επίμυ η S5 μαζί με άλλες πρωτεΐνες (S3a, L14 και L19) έχουν εντοπιστεί φωσφορυλιωμένες στα ελεύθερα ριβοσώματα (Francis T. et al. 1982). Όμως, η πρωτεΐνη S5 του ποντικιού, η οποία απομονώνεται απευθείας από ριβόσωμα είναι μια μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη. Ωστόσο, η ελεύθερη μορφή της υφίσταται φωσφορυλίωση (Matragkou C. et al., 2009). Όπως έχει βρεθεί σε προηγούμενες εργασίες, η rps5 αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης. Πιο συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση της θρεονίνης 133 (Thr 133) από την πρωτεϊνική κινάση C (Protein Kinase C, PKC) πυροδοτεί την φωσφορυλίωση της σερίνης 24 (Ser 24) από την κινάση καζεΐνης II (Casein Kinase II, CKII) ώστε να κινηθεί η πρωτεΐνη από το πυρηνόπλασμα στον πυρηνίσκο. Επιπρόσθετα, στόχο φωσφορυλίωσης αποτελεί και η θρεονίνη στη θέση 14, όπως θα εξηγηθεί καλύτερα στη συζήτηση. Η φωσφορυλίωση επηρεάζει την υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης. Γενικά, έχει βρεθεί πως η κινητικότητα της rps5 στον πυρηνίσκο και στο πυρηνόπλασμα είναι σημαντικά πιο αργή σε σχέση με άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε άλλα στάδια της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, όπως ο UBF(Upstream Binding Factor), η νουκλεολίνη, η φιμπριλλαρίνη, η πρωτεΐνη RPp29. 34

35 Ένας τρόπος μελέτης της φωσφορυλίωσης μιας σερίνης (Ser) ή θρεονίνης (Thr) αποτελεί η αντικατάστασή της από ασπαραγινικό (Asp) ή γλουταμινικό οξύ (Glu) με εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης. Στην περίπτωση αυτή, παρατηρείται το φαινόμενο της ψευδοφωσφορυλίωσης ή της φωσφο-μιμητικής. Δηλαδή, το Asp ή το Glu μιμείται την φωσφρυλιωμένη Ser ή Thr Συνήθως, για στερεοχημικούς λόγους η Ser αντικαθίσταται από Asp και η Thr από Glu. χωρίς αυτό να είναι απόλυτο. Λόγω του αρνητικού φορτίου που φέρουν τα όξινα αμινοξέα μιμούνται το αρνητικό φορτισμένο φωσφορυλιωμένο αμινοξύ. Το τελευταίο αποδεικνύει ότι και το αρνητικό φορτίο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην περαιτέρω κυτταρική σηματοδότηση. Έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την μελέτη της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών Tau, που εμπλέκονται στη νόσο Alzheimer και γενικότερα για την επίδραση της φωσφορυλίωσης στην κυτταρική σηματοδότηση. Με την μέθοδο μπορεί να εξαχθεί και το συμπέρασμα αν το συγκεκριμένο αμινοξύ αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης. Αν η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη παρουσιάζει την ίδια συμπεριφορά με την wild type πρωτεΐνη τότε το συγκεκριμένο αμινοξύ φωσφορυλιώνεται και μάλιστα η φωσφορυλίωση είναι απαραίτητη για την λειτουργία της πρωτεΐνης. Α.4. Ρόλος της Pin1 Η σημασία της φωσφορυλιωμένης Thr έγκειται στην αλληλεπίδραση της με πρωτεΐνες μοριακούς-συνοδούς. Ειδικότερα όταν μια Ser ή Τhr ακολουθείται από μια προλίνη (Pro) αποτελεί βασικό ρυθμιστικό μοτίβο φωσφορυλίωσης στα κύτταρα. Να σημειωθεί ότι στις θέσεις της rps5 υπάρχει Thr-Pro. Τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τέτοιου είδους φωσφορυλίωση ανήκουν στην υπεροικογένεια των Proκατευθυνόμενων πρωτεϊνικών κινασών. Σε αυτή συμπεριλαμβάνονται οι κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες, οι εξωκυττάριες σηματο-ρυθμιζόμενες πρωτεϊνικές κινάσες, οι p38 κινάσες και οι κινάσες που επάγονται από το στρες. Αυτές έχουν κρίσιμο ρόλο σε ποικίλες κυτταρικές διεργασίες όπως η ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, η απάντηση στο στρες, η νευρωνική επιβίωση και σε ασθένειες όπως ο καρκίνος και το Alzheimer. Η μοναδική στερεοχημεία της Pro σημαίνει ότι μπορεί να υιοθετήσει δύο εντελώς διαφορετικές καταστάσεις διαμόρφωσης. Σε αυτή την ιδιότητα στηρίζεται και η σημασία της Pro-κατευθυνόμενης φωσφορυλίωσης. 35

36 Σε αυτό το μοτίβο εμπλέκεται ένα ένζυμο, η Pin1. Ανήκει στην οικογένεια των παρβουλινών (parvulin) και είναι μια ανθρώπινη πεπτιδυλο-προπυλο-cis-transισομεράση (PeptidylProlyl Isomerase, PPIase). Οι συγκεκριμένες ισομεράσες είναι συντηρημένες εξελικτικά και καταλύουν την cis/trans ισομερείωση πεπτιδυλ-προπυλ πεπτιδικών δεσμών. Η Pin1 αναγνωρίζει το συγκεκριμένο μοτίβο του υποστρώματος της, μια φωσφορυλιωμένη Ser/Thr-Pro και καταλύει την ισομερίωση. Είναι ιδιαίτερα σημαντική γιατί οι Pro- κατευθυνόμενες κινάσες και φωσφατάσες εξαρτώνται από την διαμόρφωση και δρουν μονό στην trans διαμόρφωση. H φωσφορυλίωση μειώνει δραματικά το ρυθμό της ισομερείωσης και καθιστά τον φωσφοπεπτιδικό δεσμό πιο ανθεκτικό. Επιπρόσθετα, η Pro-κατευθυνόμενη φωσφορυλίωση επάγει τοπικές δομικές αλλαγές που καθιστούν την πρωτεΐνη προσιτή σε περαιτέρω τροποποιήσεις. Όσον αφορά τη δομή της, αποτελείται από ένα Ν-τελικό WW τομέα και ένα C- τελικό τομέα με δράση PPIase. Ο WW τομέας συνδέεται με το μοτίβο με τα αμινοξέα Ser16, Arg17 και Tyr23 και μπορεί να αυξήσει ή να αναστείλει τη δράση της ισομεράσης ανάλογα αν το πεπτίδιο είναι φωσφορυλιωμένο σε μια θέση ή σε πολλές (Lu K., Zhou X., 2007) Εικόνα Α.6. Δομή της Pin1. Στο κάτω μέρος απεικονίζεται ο τρόπος σύνδεσης με το μοτίβο και η κατάλυση της ισομερείωσης.(lu K., Zhou X.,.2007) 36

37 Η ισομερίωση από τη Pin1 ρυθμίζει περαιτέρω ένα ευρύ φάσμα από κυτταρικές δραστηριότητες. Σε αυτές περιλαμβάνονται η αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες, η μεταγραφική και η ενζυμική δραστικότητα και η πρωτεϊνική σταθερότητα. Εκτός από τις παραπάνω ρυθμίζει και την υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών. Διαθέτει NLS -3 βασικά αμινοξέα που παρεμβάλλονται από 5 αμινοξέα- και αλληλεπιδρά με την ιμπορτίνη α5. Είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη η οποία μπορεί να ρυθμίσει την είσοδο των κυττάρων σε μίτωση και των οποίων η δραστηριότητα ΡΡΙάσης απαιτείται για την κανονική εξέλιξη μέσω της μίτωσης σε ζυμομύκητες και κύτταρα θηλαστικών (Lu et al 1996, Fujimori et al, 1999). Πράγματι, η διαγραφή της δραστηριότητας Pin1 σε κύτταρα HeLa προκαλεί μιτωτική παύση και απόπτωση (Lu et al. 1996). Ρυθμίζει επίσης, τη συναρμολόγηση, αναδίπλωση, τη δραστηριότητα και τη μεταφορά των βασικών κυτταρικών πρωτεϊνών. Έχει συσχετισθεί με την παθογένεια ανθρώπινων ασθενειών όπως το άσθμα, ο καρκίνος και η νόσος Alzheimer. 37

38 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι η περαιτέρω διαλεύκανση της ενδοκυτταρικής διαμετακίνησης της ευκαρυωτικής ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 προκειμένου να επιτελέσει το έργο της κατά την διάρκεια της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, της πρωτεϊνικής σύνθεσης και των μη-ριβοσωμικών λειτουργιών στις οποίες εμπλέκεται. Σε προηγούμενες διδακτορικές διατριβές (Διδακτορική διατριβή Δρ. Ε. Παπαχρήστου και Δρ. Χ. Ματράγκου) είχαν μελετηθεί θεμελιώδεις μεταφραστικές τροποποιήσεις - όπως φωσφορυλίωση σε αρκετές θέσεις της πρωτεΐνης- in vitro λαμβάνοντας υπόψη τις «υποδείξεις» / προβλέψεις που προέκυψαν από την χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής. Πιο συγκεκριμένα για την φωσφορυλίωση των θέσεων θρεονίνη 8 (Thr-8) και θρεονίνη 14 (Thr-14) υπήρχαν θεωρητικές ενδείξεις ότι οι δύο αυτές θρεονίνες ήταν πολύ πιθανόν στόχοι της κινάσης p38mapk. Πειράματα μικροσκοπίας συνεστίασης σε αγρίου τύπου μορφές της rps5 ή μεταλλάγματα που προέκυψαν μετά από εισαγωγή γλυκινών στις θέσεις των προαναφερθέντων θρεονινών, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται στους πυρηνίσκους ή στο κυτταρόπλασμα, αντίστοιχα. Στην προκείμενη εργασία κρίθηκε απαραίτητο να μελετηθεί η σπουδαιότητα των συγκεκριμένων αμινοξέων για την παραμονή της πρωτεΐνης στους πυρηνίσκους μετά από φωσφορυλίωση. 38

39 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1. Υλικά Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany), Serva (Heidelberg, Germany) και Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Β.1.2. Βιολογικό υλικό Για το πολλαπλασιασμό και την απομόνωση των πλασμιδίων χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη Escherichia coli TOP10 (Invitrogen Life Technologies). Για την επιμόλυνση με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα HeLa. Β.1.3. Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών Για τις κυτταρικές καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα υλικά και αντιδραστήρια: i) Υλικό καλλιέργειας DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) 1Χ (Gibco BRL, USA) ii) Μίγμα αντιβιοτικών πενικιλίνης, στρεπτομυκίνης (PS, PenStrep Gibco BRL, USA) iii) Βόειος εμβρυϊκός ορός (FBS, Fetal Bovine Serum-E.U. approved Gibco BRL) iv) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS 10X ph=7.2, Gibco BRL). Όλα τα αναλώσιμα των κυτταρικών καλλιεργειών (τρυβλία καλλιέργειας, φλάσκες, τρυβλία πολλαπλών πηγαδιών, σωλήνες φυγοκέντρησης, σιφώνια, αντικειμενοφόρες πλάκες κ.α.), προμηθεύτηκαν από την εταιρία Corning (Inc, N.Y, U.S.A) 39

40 Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories (Detroit, USA). Β.1.3. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είχαν προμηθευτεί από την εταιρεία Takara Bio- Inc (Bio. Otsu, Shiga). H πολυμεράση High Fidelity ήταν της εταιρείας Kapa Biosystems. To Q5 site directed mutagenesis kit ήταν της εταιρείας BioLabs(New England). Ο πλασμιδιακός φορέας pegfp C1, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την GFP (Green Fluorescence Protein) ήταν της εταιρείας Novagen. Το γονίδιο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 κλωνοποιημένο στον ευκαρυωτικό φορέα pegfp C1 παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Dr Huang και Dr Danyang. Για την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa χρησιμοποιήθηκε το Xfect Transfection Reagent της εταιρείας Clontech Laboratories Inc. (USA). B.2. Μέθοδοι Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας Β.2.1. Καλλιέργεια κυττάρων Β Καλλιέργεια κυττάρων E.coli. Τα στελέχη TOP10F του βακτηρίου E.coli αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα LB, (Luria Bertani)(Sambrook et al.,1989) το οποίο έχει την ακόλουθη σύσταση: Θρεπτικό υλικό LB Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl 0.5 % w/v 1.0 %w/v 1.0 % w/v Το ph του θρεπτικού υλικού ρυθμίζεται στο 7 με την προσθήκη NaOH. Προστίθενται 100 μl ΝaOH 1M για κάθε 100 ml θρεπτικού υλικού, ώστε να έχει 40

41 τελική συγκέντρωση 100 mm. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 C, υπό πίεση 1 atm για 30 λεπτά. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 C για ώρες, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας σε κάθε περίπτωση το κατάλληλο αντιβιοτικό. Για την ανάπτυξη των κυττάρων σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε LB στο οποία προστέθηκε ο πολυσακχαρίτης άγαρ που αποτελεί πηκτικό παράγοντα και είχε την εξής σύσταση: Θρεπτικό υλικό LB+άγαρ Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl Άγαρ 0.5 % w/v 1.0 %w/v 1.0 % w/v 4.0 % w/v Και σε αυτή την περίπτωση το ph του θρεπτικού υλικού ρυθμίζεται στο 7 με την προσθήκη NaOH, όπως αναφέρθηκε παραπάνω και ακολουθεί αποστείρωση του στους 120 C, υπό πίεση 1 atm για 30 λεπτά. B Καλλιέργεια των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων HeLa Η κυτταρική σειρά ΗeLa αποτελεί την πρώτη ανθρώπινη κυτταρική σειρά που καλλιεργήθηκε στο εργαστήριο και έκτοτε χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα. Tα κύτταρα HeLa απομονώθηκαν για πρώτη φορά από καρκίνο του τραχήλου της μήτρας από μια 31-χρονη γυναίκα αμερικανο-αφρικανικής καταγωγής, την Henrietta Lacks. Η γυναίκα απεβίωσε από επιθετικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Αυτά τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται πολύ γρήγορα, ακόμη και σε σύγκριση με άλλα καρκινικά κύτταρα. Όπως και άλλα καρκινικά κύτταρα τα HeLa έχουν ενεργό εκδοχή της τελομεράσης κατά την διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, η οποία εμποδίζει την αυξητική βράχυνση των τελομερών. Με τον τρόπο αυτό, τα κύτταρα παρακάμψουν το όριο Hayflick, για τον περιορισμένο αριθμός των κυτταρικών διαιρέσεων που περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα μπορούν να υποστούν, πριν γεράσουν. 41

42 Χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για την παραγωγή εμβολίου κατά του ιού της πολιομυελίτιδας.επιπλέον, διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο μεταξύ του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, καθώς και του ρόλου της τελομεράσης στην πρόληψη αποικοδόμησης του χρωμοσώματος. Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και σε τεχνικές όπως η μικροσυστοιχία (microarray) βασισμένη στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης και η έρευνα της συμπεριφοράς των κυττάρων σε περιβαλλοντικές και γενετικές διαταραχές. Μέχρι πριν λίγα χρόνια, δεν υπήρχε γενωμική αναφορά για αυτή την κυτταρική σειρά και τα πειράματα έχουν στηριχθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα ως γονιδίωμα αναφοράς. Το πλήρες γονιδίωμα των κυττάρων HeLa αλληλουχήθηκε και δημοσιεύθηκε στις 11 Μαρτίου το Οι Landry et al. δημοσίευσαν πρότυπα έκφρασης σε οδούς όπως η επιδιόρθωση και ο κυτταρικός κύκλος και συμπέραναν ότι διαφέρουν από τα αντίστοιχα των φυσιολογικών ανθρώπινων ιστών(landry J. et al, 2013). Τα κύτταρα HeLa αναπτύσσονται σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM. Για την παρασκευή του αρχικά προστίθεται 5 ml αντιβιοτικού(ps), μέσα στο μπουκάλι DMEM των 500 ml. Mετά από ήπια ανάδευση, αφαιρούνται 50 ml από το µίγµα, σε ένα μικρό αποστειρωμένο σωληνάριο (falcon) των 15 ml και προσθέτονται 50 ml oρού FBS στο μπουκάλι που περιέχει το DMEM+αντιβιοτικό. B.2.2. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) είναι μια in vitro μέθοδος για τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας. Επιτυγχάνεται ο πολλαπλασιασμός ενός τμήματος εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Έτσι, ακόμη και ένα μόνο αντίγραφο γονιδίου μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέσα σε λίγες ώρες σε εκατομμύρια αντίτυπα με τη μέθοδο αυτή. Επίσης, χρησιμοποιείται για την εισαγωγή μεταλλάξεων, καθώς και για την ραδιοεπισήμανση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειμένου να πραγματοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση (sequencing). Η τεχνική αυτή μπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, αφού η παράγονται συμπληρωματικοί κλώνοι από κάποιον ήδη υπάρχοντα 42

43 κλώνο. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοανθεκτικής και επομένως ενεργής πολυμεράσης που απομονώνεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus, η οποία χρησιμοποιεί ως εκμαγείο μονόκλωνο DNA, ώστε να συνθέσει ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού δίκλωνου τμήματος. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία και καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας που επιθυμούμε να πολλαπλασιάσουμε. Η πολυμεράση ξεκινά τον πολυμερισμό από το 3 υδροξύλιο του εκκινητή, πολυμερίζοντας πάντα προς 5 3 κατεύθυνση. Κάθε κύκλος της PCR αποτελείται από τα ακόλουθα τρία βήματα: Βήμα 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του αποδιατάσσεται με επώαση σε υψηλή θερμοκρασία, 90 C- 95 C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Βήμα 2 ο :Υβριδισμός Οι εκκινητές υβριδίζονται, λόγω συμπληρωματικότητας, στις κατάλληλες περιοχές του γονιδίου-στόχου. Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους 50 ο και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Βήμα 3 ο : Πολυμερισμός Στο στάδιο αυτό η πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη -ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να 43

44 περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Τα παραπάνω στάδια, που αποτελούν έναν κύκλο της αντίδρασης, επαναλαμβάνονται φορές. Με αυτό τον τρόπο, παράγονται 2n μόρια DNA, όπου n είναι ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα παραμένει στους 72 C για 5 λεπτά. Τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης φαίνονται στον παρακάτω πίνακα: DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός(sense) Εκκινητής αντινοηματικός(antisense) Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntp s) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10X Πολυμεράση(Taq) H 2 Ο ng 20 pmol 20 pmol 3,5 mm 5 μl 1 μl Έως 50 μl Σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, χρησιμοποιείται MgCl 2. Στην προκείμενη εργασία πολλαπλασιάστηκε ολόκληρο το γονίδιο της S5. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, τα ένζυμα περιορισμού και ο πλασμιδιακός φορέας στον οποίο έγινε η κλωνοποίηση αναφέρονται στον πίνακα B.2. Εκκινητής Ένζυμο περιορισμού Πλασμιδιακός φορέας 5 -CGG GGT ACC GAG TGG GAA GCA GCC ACA-3 (νοηματικός) KpnI pegfp-c1 5 -CGC GGA TCC TCA GCG GTT AGA CTT GCG-3 (αντινοηματικός) BamHI pegfp-c1 Πίνακας Β.1.. Η ακολουθία των εκκινητών, τα ένζυμα περιορισμού και ο πλασμιδιακός φορέας που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR. 44

45 Β.2.3. Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με την τεχνική του σχεδιασμού megaprimer. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Β.2.4., η PCR χρησιμοποιείται και για την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων σε ένα τμήμα DNA. Στην περίπτωση αυτή, απαιτείται ο σχεδιασμός και η χρήση τριών συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων. Το πλεονέκτημα της συγκεκριμένης τεχνικής έγκειται στο ότι επιτρέπει τη γρήγορη και αποτελεσματική εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης, χωρίς να είναι απαραίτητος ο καθαρισμός των ενδιάμεσων προϊόντων (Picard, ErsdalBadju et al. 1994). Τα τρία ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), που απαιτούνται είναι: ο 5'-εκκινητής (συμπληρωματικός ως προς το 5'άκρο του εκμαγείου), ο 3'-εκκινητής (συμπληρωματικός ως προς το 3'άκρο του εκμαγείου) και ο megaprimer (συμπληρωματικός μιας ακολουθίας περίπου 10 κωδικονίων της περιοχής του γονιδίου στην οποία πρόκειται να εισαχθεί η μετάλλαξη, που περιέχει όμως αλλαγμένη τη βάση ή τις βάσεις). Η PCR γίνεται σε τρεις φάσεις, όπως περιγράφονται παρακάτω. Φάση 1 η : Το μίγμα της αντίδρασης αποτελείται από τα συστατικά που φαίνονται στον παρακάτω πίνακα DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός(sense) Εκκινητής megaprimer Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntp s) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10x Πολυμεράση High Fidelity H 2 O ng 10 pmol 10 pmol 3,5 mm 5 μl 1 μl Έως 50 μl Γίνονται 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, (αποδιάταξη, υβριδισμός, πολυμερισμός). 45

46 Φάση 2 η : Όταν τελειώσουν οι 10 κύκλοι της 1 ης φάσης, προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης ο 3' εκκινητής κι επαναλαμβάνονται άλλοι 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Φάση 3 η : Μετά το τέλος της 2 ης φάσης, προστίθεται πάλι ο 5' εκκινητής και εφαρμόζονται άλλοι 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Στο τέλος, έχει πλέον συντεθεί το τμήμα του με την επιθυμητή μετάλλαξη. Η διαδοχική προσθήκη των εκκινητών, γίνεται προκειμένου να αυξηθεί το ποσοστό παρασκευής της μεταλλαγμένης ακολουθίας, σε σχέση με την αρχική (Picard, ErsdalBadju et al. 1994). Παρακάτω δίνονται η ακολουθία του εκκινητή και οι συνθήκες για την πραγματοποίηση της PCR. Εκκινητής 5 GAG CTT GAT GTC AGG GTC CTC TGC CAC CGC 3 Μετάλλαξη Τ(14)D Πίνακας Β.2. Ακολουθία εκκινητή για την εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης. Αρχική αποδιάταξη 95 C 3 min 25 κύκλοι 98 C 20 sec 57 C 15 sec 72 C sec/kb Τελική επιμήκυνση 72 C 1 min/kb Διατήρηση 4-10 C Πίνακας Β.3. Οι συνθήκες PCR 46

47 Β.2.4. Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με το Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Το Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit επιτρέπει την ταχεία, τοπο-ειδική μετάλλαξη του δίκλωνου πλασμιδιακού DNA σε λιγότερο από 2 ώρες Το kit Χρησιμοποιεί την υψηλής πιστότητας DNA πολυμεράση, Q5 Hot Start, μαζί με μεταλλαγμένους εκκινητές για να εισάγει, διαγράψει ή αντικαταστήσει αζωτούχες βάσεις σε μια ποικιλία από πλασμίδια. Μετά την PCR, το ενισχυμένο υλικό προστίθεται κατευθείαν σε ένα μοναδικό μείγμα ενζύμων κινάσης-λιγάσης-dpni (KLD) για την ταχεία (5 λεπτά), κυκλοποίηση σε θερμοκρασία δωματίου και την απομάκρυνση του DNA εκμαγείου. Η κινάση φωσφορυλίωνει τα γραμμικά τμήματα DNA που προέκυψαν. Η λιγάση ενώνει τα συμπληρωματικά άκρα και η DpnI αναγνωρίζει και καταστρέφει το μεθυλιωμένο DNA. H μεθυλίωση του DNA είναι ένας τρόπος προστασίας του γενετικού υλικού των βακτηρίων. Ως αποτέλεσμα, το DNA εκμαγείο-που είναι μεθυλιωμένο αφού έχει απομονωθεί από Ε.coliκαταστρέφεται. Οι εκκινητές σχεδιάζονται με τη βοήθεια του προγράμματος NEBchanger. Η ακολουθία τους καθώς και οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν δίνονται παρακάτω. DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός(sense) Εκκινητής αντινοηματικός(antisense) Μίγμα Q5 Hot Start High-Fidelity 2X H 2 Ο 1-25 ng 0,5 μμ 0,5 μμ 25 μl Έως 50 μl Εκκινητής 5 -GGT GGC AGA GGA CCC TGA CAT CAA GC-3 (νοηματικός) 5 -GCT GGT GTG GCT GCT TCC-3 (αντινοηματικός) Πλασμιδιακός φορέας pegfp-c1 pegfp-c1 Πίνακας Β.4. Ακολουθία εκκινητών σύμφωνα με το πρόγραμμα NEBchanger για την εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης. 47

48 Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή της μετάλλαξης είναι οι παρακάτω: Αρχική αποδιάταξη 98 C 30 sec 25 κύκλοι 98 C 10 sec 67 C sec 72 C sec/kb Τελική επιμήκυνση 72 C 2 min Διατήρηση 4-10 C Πίνακας Β.5. Οι συνθήκες PCR Στην συνέχεια, το προϊόν της PCR επωάζεται αναμιγνύεται καλά με τα ένζυμα και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Προϊόν PCR Ρυθμιστικό διάλυμα KLD 2x KLD 10x H 2 Ο 1 μl 5 μl 1 μl Έως 10 μl Β.2.5. Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης στηρίζεται στην μετακίνηση των αρνητικά φορτισμένων τμημάτων προς την άνοδο. Βέβαια, η ταχύτητα με την οποία θα κινηθούν τα μόρια εξαρτάται από το μέγεθός τους, τη διαμόρφωσή τους (γραμμικό, κυκλικό ή υπερελικωμένο κινούνται διαφορετικά), το δυναμικό που εφαρμόζεται, την σύσταση της αγαρόζης και του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιούνται. Η πηκτή παρασκευάζεται με τήξη της αγαρόζης, η οποία είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού μοριακού βάρους. Είναι ένα γραμμικό πολυμερές με βασική 48

49 μονάδα την D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται με θέρμανση, παρουσία κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος. Στην συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης 1%w/w και τα εξής διαλύματα: Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ Tris H 3 BO 3 EDTA ph mm 0.89 M 2 mm Διάλυμα δειγμάτων 6X Γλυκερόλη Κυανούν του ξυλενίου Κυανούν της βρωμοφαινόλης 30 %w/w 0.25 %w/w 0.25 %w/w Αρχικά, η αγαρόζη διαλύεται στο ρυθμιστικό διάλυμα με θέρμανση στους 100 C, ακολουθεί ελάττωση της θερμοκρασίας (μέχρι τους 60 C περίπου), προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου (ΕtBr), σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml και απόχυση στην ειδική συσκευή. Tο διάλυμα ηλεκτροφόρησης είναι το ΤΒΕ. Η εμφάνιση των ζωνών των μορίων του DNA στην αγαρόζη επιτυγχάνεται με την προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου στο διάλυμα της πηκτής και στο διάλυμα των ηλεκτροδίων. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 nm και 366 nm και να επανεκπέμπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσματος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA. Η ένταση φθορισμού του ελεύθερου βρωμιούχου αιθιδίου είναι πολύ μικρότερη από αυτή του συμπλόκου EtBr-DNA και επομένως είναι δυνατή η ανίχνευση μικρών ποσοτήτων DNA (Sambrook et al., 1989, Sharp et al., 1973). 49

50 Β.2.6. Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (gel extraction) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον καθαρισμό τμημάτων DNA έπειτα από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού ή έπειτα από τον πολλαπλασιασμό τους με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε το Qiaquick Gel Extraction Kit της εταιρείας Qiagen. Η αρχή του συστήματος αυτού στηρίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται σε μικρές στήλες που περιέχουν πηκτές πυριτίου (silica gel) παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων και στην διέλευση των προσμίξεων από τις στήλες χωρίς να συγκρατούνται. Το επιθυμητό τμήμα του DNA αποκόπτεται από την πηκτή και τοποθετείται σε σωλήνα επιτραπέζιας μικροφυγοκέντρου (eppendorf). Κατόπιν, προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης, QG, σε αναλογία 300 μl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση στους 50 C για 10 λεπτά με περιοδική ανάδευση, προκειμένου να διαλυτοποιηθεί η αγαρόζη. Στη συνέχεια, γίνεται προσθήκη ισοπροπανόλης για την κατακρήμνιση του DNA και το μίγμα αυτό διαβιβάζεται σε στήλη Qiaquick και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε xg. Το DNA συγκρατείται στη στήλη και ξεπλένεται από τις προσμίξεις με τη διαβίβαση του αιθανολικού διαλύματος, PE. Η έκλουση του DNA γίνεται με μl αποστειρωμένου δις απεσταγμένου νερού ή με TE (10mM Tris HCl, 1mM EDTA ph 8). Κατόπιν, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DNA, προκειμένου να ελεγχθεί για την καθαρότητά του και για να διαπιστωθεί κατ εκτίμηση η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). Β.2.7. Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR (PCR purification) Τα τμήματα DNA που προκύπτουν από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), ή μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν σε άλλες αντιδράσεις, θα πρέπει να διαχωριστούν από τους εκκινητές, το εκμαγείο, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια, τα άλατα και την πολυμεράση ή τα αντίστοιχα ένζυμα. Ο καθαρισμός των τμημάτων αυτών DNA γίνεται με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της εταιρείας Qiagen και περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια. Στο 50

51 μίγμα της αντίδρασης προστίθενται 5 όγκοι διαλύματος PB, το οποίο περιέχει ένα χαοτροπικό παράγοντα. Ακολουθεί ανάμιξη και διαβίβαση στη στήλη Qiaquick. Έπειτα, γίνεται φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε xg. Το DNA δεσμεύεται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα συστατικά απομακρύνονται με τη φυγοκέντρηση. Ακολουθεί πλύσιμο της στήλης με το διάλυμα αιθανόλης, PE, και τελικά γίνεται έκλουση του DNA με μl αποστειρωμένου δις απεσταγμένου νερού. Μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DNA ηλεκτροφορείται, προκειμένου να ελεγχθεί για την καθαρότητά του. Β.2.8. Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊνικών οξέων Η αρχή του φωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος. Έτσι, τα διαλύματα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA μια μικρή ποσότητα του δείγματος (1-2 μl) που πρόκειται να αναλυθεί αραιώνεται με αποστειρωμένο νερό και στη συνέχεια μετρείται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Λαμβάνοντας υπόψη ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm (1 OD 260 ) αντιστοιχεί με 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίζουμε την ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊκού οξέος στο άγνωστο δείγμα (Sambrook, Fritsch et al., 1989). O βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων εκτιμάται από τον λόγο των οπτικών τους πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm (OD 260 /OD 280 ). Τα δείγματα υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων έχουν λόγο περίπου 2. Β.2.9. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Κατά την κλωνοποίηση, γίνεται εισαγωγή ενός τμήματος DNA στο γονιδίωμα ενός αυτόνομα πολλαπλασιαζόμενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασμιδίου. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι μικρά κυκλικά μόρια δίκλωνου DNA, που μπορούν να αναπτύσσονται ημι αυτόνομα σε 51

52 βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασμιδιακός φορέας όσο και το ξένο τμήμα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν επωάζονται με τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισμού και, στη συνέχεια, επανακυκλοποιούνται συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, αντίδραση που καταλύεται από μια DNA λιγάση (Sambrook et al., 1989). Ο πλασμιδιακός φορέας που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία είναι ο pegfp C1. Ο πλασμιδιακός φορέας pegfp C1 έχει μέγεθος 4700 ζεύγη βάσεων και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο αμινοτελικό τους άκρο με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη(green Fluorescent Protein, GFP). Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με το κλωνοποιημένο τμήμα DNA. Η μεταγραφή των τμημάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus (CMV) και παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό καναμυκίνη. Προκειμένου να γίνει εισαγωγή του τμήματος DNA που μας ενδιαφέρει στο πλασμίδιο αυτό, γίνεται πέψη και του πλασμιδιακού φορέα και του τμήματος DNA που θα κλωνοποιήσουμε με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού KpnI και BamHI. Ο χάρτης του πάσμιδιακού φορέα δίνεται στο παράρτημα. Β Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Προκειμένου να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει: το DNA, (που μπορεί να είναι γενωμικό DNA, πλασμιδιακός φορέας ή το τμήμα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, στο οποίο τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση, τα ένζυμα περιορισμού και, σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουμίνη. Ο συνολικός όγκος του μίγματος κυμαίνεται από 20 έως 50 μl. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως στους 37 C, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύμων που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δυο με τρείς 52

53 ώρες. Όμως, μερικές φορές, για τα τμήματα του DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ κοντά στα άκρα, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η πέψη. Στον πλασμιδιακό φορέα pegfp C1 κλωνοποιήθηκε η μεταλλάγμένη μορφή της S5-T(14)D, και οι συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η πέψη δίνονται στη συνέχεια. KpnI (10U/μl) pegfp C1/τμήμα DNA Ρυθμιστικό διάλυμα 10X BSA 10X H 2 O 20 U 10/20 μg 2/5 μl 2/5 μl Έως 20/50 μl Επώαση στους 37 C για 1 2 ώρες. Το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται είναι αυτό που συνοδεύει την KpnI και η σύστασή του είναι η εξής: 100 mm Tris-HCl (ph 7,5) 100 mm MgCl 2 10 mm Dithiothreitol Στη συνέχεια, το πλασμίδιο ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Το τμήμα του DNA καθαρίζεται όπως περιγράφηκε στην παράγραφο B.2.6. Κατόπιν, γίνεται επώαση τόσο του πλασμιδίου όσο και του DNA με το δεύτερο ένζυμο περιορισμού, την BamHI. BamHI (20U/μl) pegfp C1/τμήμα DNA Ρυθμιστικό διάλυμα 10X BSA 10X H 2 O 20 U 10 / 20 μg 2 / 5 μl 2 / 5 μl Έως 20 / 50 μl 53

54 Επωάζονται στους 37 C για περίπου 30 λεπτά. Το ρυθμιστικό διάλυμα είναι αυτό που συνοδεύει την BamHI και η σύστασή του είναι η εξής: 200 mm Tris-HCl (ph 8,5) 100 mm MgCl 2 10 mm Dithiothreitol 1000 mm KCl Όταν πρόκειται για πέψη πλασμιδίων, γίνεται επώαση πρώτα με το ένα ένζυμο, ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή αγαρόζης και μετά επώαση με το δεύτερο ένζυμο. Ο λόγος που γίνεται η διαδοχική πέψη είναι προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι, μετά την πέψη με το πρώτο ένζυμο το πλασμίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραμμικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο μορφές του πλασμιδίου. Διαδοχική επώαση με τα δυο ένζυμα γίνεται όταν αυτά δεν είναι συμβατά για να γίνει ταυτόχρονη επώαση Β Αντίδραση λιγάσης (ligation) Προκειμένου να γίνει η ενσωμάτωση του τμήματος του DNA που μας ενδιαφέρει στον αντίστοιχο πλασμιδιακό φορέα, χρησιμοποιείται η Τ4 DNA λιγάση. Ουσιαστικά, το ένζυμο δημιουργεί φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και συνδέει τα άκρα. Η αναλογία των δυο αντιδρώντων είναι συνήθως 1 προς 6, δηλαδή 10 ng πλασμιδίου προς 60 ng γονιδίου. Μερικές φορές, η αναλογία μπορεί να είναι και 1:4. Οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: DNA πλασμιδιακού φορέα DNA τμήματος που θα ενσωματωθεί Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης DNA 10X (DNA dilution buffer) T4 DNA λιγάση (5units/μl) H 2 O 10 ng 60 ng 2 μl 2 μl 1 μl Έως 20 μl Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης μετά από την προσθήκη της λιγάσης θα πρέπει να είναι 20 μl. Η επώαση πραγματοποιείται στους 15 C για περίπου 16 ώρες. 54

55 Β Προετοιμασία επιδεκτικών κυττάρων (competent cells) για μετασχηματισμό Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα TFB I ph 7 CH 3 COOK MnCl 2 KCl CaCl 2 Γλυκερόλη 30 mm 50 mm 100 mm 10 mm 15% v/v Διάλυμα TFB II ph 7 MOPS CaCl 2 KCl Γλυκερόλη 10 mm 75 mm 100 mm 15% v/v Και τα δύο διαλύματα φιλτράρονται ώστε να αποστειρωθούν και φυλάσσονται σε αποστειρωμένα δοχεία στην κατάψυξη. 3 ml θρεπτικού υλικού LB εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού. Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της μεταφέρονται σε 3 ml LB, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2 3 ώρες στους 37 C. Ένα ml από την νέα καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού LB και ακολουθεί επώαση αυτής στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή Στη συνέχεια, η καλλιέργεια ψύχεται στον πάγο για 10 λεπτά και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 4000 xg για 20 λεπτά, στους 4 C. Το υπερκείμενο αποχύνεται και τα κύτταρα αιωρούνται σε 25 ml, που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας, ρυθμιστικού διαλύματος TFB I και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 4000 xg και τα κύτταρα αιωρούνται τελικά σε 1 ml διαλύματος TFB II. Το αιώρημα που προκύπτει, χωρίζεται σε 55

56 σωλήνες μικροφυγοκέντρου (eppendorf) σε κλάσματα των μl και αυτά εμβαπτίζονται για μικρό χρονικό διάστημα σε λουτρό, στο οποίο έχει προστεθεί ξηρός πάγος/αιθανόλη. Με τη διαδικασία αυτή, επιτυγχάνεται η άμεση ψύξη των κλασμάτων, τα οποία μπορούν κατόπιν να διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα στους 80 C. Β Εισαγωγή πλασμιδίου σε επιδεκτικά κύτταρα E. coli Μετασχηματισμός (transformation) Ένα τμήμα DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί σε ένα φορέα πλασμίδιo και στην συνέχεια να εισαχθεί σε κύτταρα E.coli, ώστε να παραχθούν μέσα σε λίγες ώρες υψηλές ποσότητες του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου, από το οποίο εύκολα μπορεί να απομονωθεί το κομμάτι DNA, καθώς και η υπερπαραγώμενη πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό το DNA. Τα επιδεκτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασμιδιακού DNA (καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Στο αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων ( μl) προστίθενται ng πλασμιδιακού DNA ή 10 μl του μίγματος της αντίδρασης της λιγάσης και ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά στον πάγο. Στη συνέχεια, το μίγμα των κυττάρων με το DNA υπόκειται σε θερμικό σοκ στους 42 C για 1,5 λεπτό και αμέσως, μετά, ψύχεται για 1 λεπτό στον πάγο. Στο μίγμα προστίθενται 800 μl LB και γίνεται επώαση με συνεχή ανάδευση για 1 ώρα στους 37 C, προκειμένου να αρχίσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Κατόπιν, το μίγμα της επώασης φυγοκεντρείται σε 6000 xg για 2 λεπτά και απομακρύνεται το υπερκείμενο (~800 μl), ενώ τα κύτταρα αιωρούνται στα εναπομείναντα μl του LB. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB άγαρ, το οποίο περιέχει και το αντίστοιχο αντιβιοτικό (αυτό στο οποίο προσδίδει αντίσταση το πλασμιδιακό DNA που έχουμε εισαγάγει). Με τον τρόπο αυτό γίνεται η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έναντι των βακτηρίων που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο (Sambrook et al. 1989). Τα τρυβλία τοποθετούνται στους 37 C για 12 έως 16 ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τρυβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και 56

57 αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αντιβιοτικού, ώστε να χρησιμοποιηθούν είτε για απομόνωση του πλασμιδιακού DNA είτε για την υπερπαραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (mini prep) Σε 3 ml θρεπτικού υλικού LB, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, αιωρείται μια αποικία κυττάρων και η καλλιέργεια αναπτύσσεται υπό συνεχή ανάδευση στους 37 C για ώρες. Ποσότητα 1,5 ml της πλήρους ανεπτυγμένης καλλιέργειας, μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου (eppendorf) και φυγοκεντρείται στις xg για 3 λεπτά. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειμένου και αιώρηση των κυττάρων σε 250 μl διαλύματος επαναιώρησης Α1. Στη συνέχεια, γίνεται προσθήκη 250 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης των κυττάρων Α2 και ήπια ανάδευση 6-8 φορές. Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης περιέχει NaOH και αποδιατακτικό SDS. Έπειτα από παραμονή 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου, προστίθενται 300 μl διαλύματος οξικού καλίου Α3(«σπάσιμο» μεμβρανών) και έπειτα από εντονότερη ανάδευση 6-8 φορές, γίνεται φυγοκέντρηση σε xg για 5 7 λεπτά, για το διαχωρισμό του χρωμοσωμικού από το πλασμιδιακό DNA των βακτηρίων. Το υπερκείμενο διαβιβάζεται στη στήλη NucleoSpin Plasmid/Plasmid(NoLid) Column και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε xg. Το DNA συγκρατείται στη στήλη, ενώ οι πρωτεΐνες διέρχονται. Για την απομάκρυνση τυχόν προσμίξεων γίνεται πλύση με αιθανολικό διάλυμα A4. Το διάλυμα απομακρύνεται με διπλή φυγοκέντρηση σε xg για 1 λεπτό. Η έκλουση του πλασμιδιακού DNA από τη στήλη γίνεται με 30 μl αποστειρωμένου δις απεσταγμένου νερού. Τα δείγματα ελέγχονται σε πηκτή αγαρόζης. Β Ανακαλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισμός του βαθμού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά τα οποία είναι προσκολλημένα στο δάπεδο του τρυβλίου. Πραγματοποιείται η μεταφορά του τρυβλίου με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. Αναρρόφηση υπό κενό του 57

58 θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας και ξέπλυμα των κυττάρων δύο φορές με PBS 1x. Με την διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. Στην συνέχεια, προστίθενται 1-2 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο 100 mm. Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη. Κατά τη διάρκεια της επώασης με την τρυψίνη γίνεται προσθήκη 10 ml πλήρους θρεπτικού υλικού /ανά τρυβλίο (τουλάχιστον δυο νέα τρυβλία) στο οποίο αναγράφονται ο κυτταρικός τύπος, ο κλώνος και η ημερομηνία της ανακαλλιέργειας και τοποθετούνται στον επωαστήρα. Αφού παρατηρήσουμε στο μικροσκόπιο ότι αποκολλήθηκαν τα κύτταρα μεταφέρεται το εναιώρημα σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15ml. Στο τρυβλίο προστίθεται PBS 1Χ ώστε να συλλεχθούν τα κύτταρα που έχουν απομείνει. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στους 25 C σε 1100 στροφές. Με προσοχή απομάκρυνση το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο, και προστίθεται νέου πλήρες θρεπτικό και επαναιωρούνται τα κύτταρα με την βοήθεια πιπέτας. Λαμβάνεται μικρή ποσότητα από το εναιώρημα και μεταφέρεται στα τρυβλία που ετοιμάστηκαν προηγουμένως. Β Απόψυξη κυττάρων Κατά τη διαδικασία αυτή κύτταρα τα οποία έχουν παραμείνει παγωμένα ακόμα και για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατό να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία γίνεται και αυτή υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου τα κύτταρα να μην εκτεθούν στο DMSO, το οποίο πιθανώς να δράσει τοξικά. Η διαδικασία που ακολουθείται ήταν η εξής: Σε αποστειρωμένο σωληνάκι των 15 ml προστίθενται 10 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Τα κύτταρα αφαιρούνται από το υγρό άζωτο και κρυοφιαλίδιο (cryovial), µε τα κύτταρα+dmso, μεταφέρεται στο θάλαμο νηματικής ροής. Το περιεχόμενο του κρυοφιαλιδίου (µε τη βοήθεια πιπέτας και λίγου θρεπτικού μέσου), χύνεται µέσα σε σωλήνα των 15ml και αναμιγνύεται µε γρήγορες κινήσεις. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο οποίο βρίσκονται τα κύτταρα, που σε θερμοκρασία δωματίου είναι πολύ τοξικό για αυτά. Έπεται, φυγοκέντρηση για 3 λεπτά σε 25 C σε 850 g. Αφαιρείται το υπερκείμενου και το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Τέλος, τα κύτταρα μεταφέρονται σε τρυβλίο καλλιέργειας. και παρατηρούνται 58

59 στο μικροσκόπιο. Κάθε 2 ημέρες, ανανεώνεται το θρεπτικό µέσο μέχρι να φτάσουν σε ένα βαθμό 80-90% κάλυψης του τρυβλίου. Β Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευση τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασία -180 C. Για την επιτυχή διατήρηση τους είναι απαραίτητο να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό κατά γενικό κανόνα η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Επιπλέον, η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται βαθμιαία (περίπου 10 C ανά ώρα) μέχρι η θερμοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιμο σημείο, προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού. Επίσης, για να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό των κυττάρων, καταψύχονται παρουσία διμέθυλου-σουλφοξύδιου (DMSO) ή γλυκερόλης. Για την κατάψυξη αρχικά τα κύτταρα αποκολλώνται από την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται, όπως περιγράφτηκε στην Β Φυγοκεντρούνται για 3 λεπτά στους 25 C και στα 1100 xg. Ενώ πραγματοποιείται η φυγοκέντρηση, προστίθενται σε ένα κρυοφιαλίδιο 100 µl DMSO και σημειώνεται ο κυτταρικός τύπος, η ημερομηνία ψύξης, ο αριθμός των κυττάρων καθώς και η γενιά τους από τη στιγμή που ξεπαγώνουν. Μετά το πέρας τη φυγοκέντρησης, αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό µέσο και γίνεται ανασύσταση του ιζήματος των κυττάρων σε DMEM+DMSO 10%. Περίπου 1 ml από το εναιώρημα αυτό μεταφέρεται σε κάθε κρυοφιαλίδιο. Τα κρυοφιαλίδια τοποθετούνται σε δοχείου ψύξης κυττάρων που περιέχει παγωμένη ισοπροπανόλη και βρίσκεται στους -80 C για ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας των κυττάρων (περίπου 1 C ανά ώρα), με αποτέλεσμα την μεγαλύτερη βιωσιμότητά τους. Μετά την πάροδο του χρόνου αυτού, τα κρυοφιαλίδια τοποθετούνται και φυλάσσονται σε συγκεκριμένη θέση στο δοχείο του υγρού αζώτου. 59

60 B Προσδιορισμός του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης Πριν την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων, τα τελευταία θα πρέπει να έχουν μετρηθεί ώστε να χρησιμοποιηθεί ο κατάλληλος αριθμός. Οπότε προσδιορίζεται ο αριθμός τους ανά μονάδα όγκου, με αιμοκυτταρόμετρο με τη μέθοδο Neubauer. Χρησιμοποιείται το αιμοκυτταρόμετρο, που είναι μια αντικειμενοφόρος πλάκα με αυλακώσεις. Στο επάνω μέρος υπάρχει μια καλυπτρίδα, η οποία δεν εφάπτεται αλλά βρίσκεται σε συγκεκριμένο ύψος από το δείγμα. Κάθε πλάκα φέρει δύο εσοχές όπου τοποθετούνται ~12 μl δείγματος. Στη συνέχεια, το αιμακυτταρόμετρο τοποθετείται στο μικροσκόπιο 100X (American Optical Corp., U.S.A.) και μετρώνται. Παρατηρώντας στο μικροσκόπιο, παίρνουμε μια εικόνα όπως η παρακάτω. Η περιοχή με τις γραμμώσεις στο αιμοκυτταρόμετρο διαιρείται σε 9 μεγάλα τετράγωνα με πλευρά 1 mm το καθένα Το κεντρικό μεγάλο τετράγωνο υποδιαιρείται σε άλλα 25 τετράγωνα και το καθένα από αυτά υποδιαιρείται σε άλλα 16 μικρά τετράγωνα. Τα τέσσερα μεγάλα γωνιακά τετράγωνα, δηλαδή τα 1, 2, 3, 4 όπως φαίνεται στο σχήμα, τα οποία υποδιαιρούνται σε 16 μικρότερα τετράγωνα μεγέθους 0.25 mm είναι αυτά που προτιμώνται για την μέτρηση των κυττάρων. Μετρώνται μόνο τα κύτταρα που είναι εντός των τετραγώνων και όχι αυτά που βρίσκονται στις οριακές γραμμώσεις. Αφού μετρηθούν τα κύτταρα και στα τέσσερα τετράγωνα, υπολογίζεται ο μέσος όρος και πολλαπλασιάζεται επί Αν έχει γίνει και αραίωση, τότε το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί τον συντελεστή αραίωσης. Ο αριθμός αυτός δίνει τον αριθμό των κυττάρων σε κάθε κυβικό χιλιοστόμετρο της καλλιέργειας. 60

61 Εικόνα Β.1. Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Β Παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων HeLa με πλασμιδιακό DNA (transient transfection) Η παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA πραγματοποιήθηκε με βάση το πρωτόκολλο Xfect Transfection Reagent Protocol at a Glance της εταιρείας Clontech Laboratories Inc. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση ήταν της ίδιας εταιρείας. Η αρχή λειτουργίας της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση των θετικά φορτισμένων υδατοδιαλυτών πολυμερών. Το πολυμερές αλληλεπιδρά με το DNA, προάγει την πρόσδεση στα κύτταρα και την πρόσληψη μέσω της ενδοκυττάρωσης (endocytosis). Με αυτό τον τρόπο, το DNA μαζί με τα θετικά φορτισμένα πολυμερή δημιουργούν το θετικά φορτισμένο ενδοσωμάτιο, το οποίο εισέρχεται στο κύτταρο καθώς αντιδρά με τις αρνητικά φορτισμένες πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας. Οι πρωτεογλυκάνες (proteoglycans, PGs) αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό τμήμα και από μια μακριά μη διακλαδισμένη αλυσίδα πολυσακχαριτών, τις γλυκοζαμινογλυκάνες (glycosaminoglycans, GAGs) (Prydz and Dalen 2000). Οι 61

62 πρωτεογλυκάνες «αγκυροβολούν» στη βασική μεμβράνη, δημιουργώντας συσσωματώματα αρνητικά φορτισμένων ομάδων. Η πειραματική διαδικασία έχει ως εξής: τα προσκολλημένα κύτταρα HeLa, μια ημέρα πριν την επιμόλυνση μετρώνται όπως περιγράφηκε στην Β Σε τρυβλίο καλλιέργειας τοποθετείται με 1 ml DMEM+10% FBS+1% PS, που περιέχει 7x10 4 κύτταρα, ώστε τη στιγμή της επιμόλυνσης να έχουν αναπτυχθεί 50 80%. Το τρυβλίο καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία ήταν 24 well plate. Την επόμενη ημέρα, προετοιμάζονται τα αντιδραστήρια για την επιμόλυνση. Απαιτούνται, το λιπίδιο πολυμερές και το ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης. Για κάθε δείγμα επιμόλυνσης προετοιμάζονται δυο σωλήνες μικροφυγοκέντρου. Στους σωλήνες μικροφυγοκέντρου προσθέτουμε τόση ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος, ώστε ο συνολικός όγκος, ανάλογα με την ποσότητα του πλασμιδιακού DNA ή του πολυμερούς, να είναι 25 μl. Ανάλογα με το τρυβλίο πολυκαλλιέργειας χρησιμοποιούνται και οι αντίστοιχες ποσότητες. Για το 24 well plate: Σωλήνας (1) Σωλήνας (2) μl (1 μg) πλασμιδιακό DNA 0.3 μl πολυμερούς μl ρυθμιστικό διάλυμα 24.7 μl ρυθμιστικό διάλυμα 25 μl συνολικός όγκος 25 μl συνολικός όγκος Ακολουθεί καλή ανάμιξη του κάθε δείγματος(ανάμιξη σωλήνα 1 και 2) σε μέτρια ταχύτητα για 10 δευτερόλεπτα. Επώαση για 10 λεπτά στον επωαστήρα, προκειμένου να σχηματιστούν τα σύμπλοκα των νανοσωματιδίων. Πριν την προσθήκη των συμπλόκων των νανοσωματιδίων, αφαιρείται το θρεπτικό υλικό και προστίθεται 250 μl DMEM+1% PS, χωρίς όμως FBS. Στην συνέχεια, πραγματοποιείται των συμπλόκων. Η προσθήκη γίνεται στάγδην και ανακινείται ήπια το δοχείο καλλιέργειας. Επώαση στους 37 C σε ατμόσφαιρα κορεσμένη με υδρατμούς και με συνεχή παροχή 5% CO 2 για 4 ώρες. Μετά τις 4 ώρες αφαιρείται το θρεπτικό μέσο με τα νανοσωματίδια και προστίθεται 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Τέλος, γίνεται επώαση στους 37 C σε ατμόσφαιρα κορεσμένη με υδρατμούς και με συνεχή παροχή 5% CO 2 για 48 ώρες. 62

63 Β.3. Μικροσκοπικές Μέθοδοι Β.3.1. Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες Laser. (Confocal Laser Scanning Microscope) Η συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης αν και βρίσκεται σε πολύ γρήγορη εξέλιξη τα τελευταία χρόνια, η αρχή της λειτουργίας της περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Minski το Αντίθετα με το κλασσικό τρόπο φωτισμού και παρατήρησης που γίνεται στο κοινό μικροσκόπιο, η συνεστιακή μικροσκοπία στηρίζεται στο γεγονός ότι και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος. Αυτό επιτυγχάνεται με τη τοποθέτηση ενός πολύ μικρού διαφράγματος, που μπορεί να είναι μικρότερο από 10 μm, στους οπτικούς άξονες του αντικειμενικού και του συγκεντρωτή φακού. Η εικόνα σχηματίζεται με σάρωση όλων των σημείων του πεδίου του μικροσκοπίου. Αρχικά το παρασκεύασμα παρατηρείται με φως ορατού μήκους κύματος ή με υπεριώδες και στη συνέχεια επιλέγεται η ακτίνα Laser αργού (με πιο χρήσιμα peaks στα 488 και 514 nm που συμπίπτουν με το μήκος κύματος που διεγείρει στο μέγιστο τη φθοραμίνη και τη ροδαμίνη) ή ηλίου-νέου (με peak στα 633 nm για άλλα φθοριοχρώματα) ή και με τα δυο συγχρόνως. Οι εικόνες δεν είναι άμεσα ορατές (real time), αλλά η παρατήρηση γίνεται στην οθόνη του μικροϋπολογιστή του μικροσκοπίου και φυσικά μπορούν να ψηφιοποιηθούν για αποθήκευση ή εκτύπωση. Το σημαντικότερο πλεονεκτήματα του συνεστιακού μικροσκοπίου είναι ότι σε αυτό ελαττώνονται κατά πολύ τα μηνύματα από τα μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος με αποτέλεσμα να ενισχύεται η αντίθεση (contrast) του παρασκευάσματος. Αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει τη σάρωση του παρασκευάσματος όχι μόνο ως προς τους άξονες x και y αλλά και ως προς τον z (βάθος) με αποτέλεσμα να παίρνουμε καλά εστιασμένες τρισδιάστατες εικόνες που όμως δεν παρατηρούνται άμεσα, αλλά μέσω μικροϋπολογιστή με ειδικά προγράμματα που κάνουν ψηφιοποίηση και ανακατασκευή της εικόνας. Αυτού του είδους η μικροσκοπία μπορεί να συνδυαστεί και με το φθορισμό. Είναι γνωστό ότι είναι αδύνατον να παρατηρηθούν φθορίζοντα παρασκευάσματα πάχους μεγαλύτερου των 10 μm λόγω του δυνατού θορύβου από τα μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος. Δίνει τρισδιάστατες καλά εστιασμένες εικόνες που συγκρίνονται 63

64 με εκείνες του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης αλλά που να μας δείχνουν συγχρόνως και τη κατανομή των φθοριοχρωμάτων. Εδώ πρέπει να σημειωθεί ότι η βασική σχεδίαση ενός οπτικού μικροσκοπίου είναι η ίδια για όλα τα οπτικά μικροσκόπια που περιγράφτηκαν. Έτσι είναι δυνατόν σε ένα όργανο να υπάρχουν όλοι οι τύποι μικροσκοπίας που αναφέρονται πιο πάνω. Η μετατροπή από τον ένα τύπο στον άλλο είναι συνήθως πολύ εύκολη και γίνεται με την αντικατάσταση ορισμένων φακών. Οι μετρήσεις που έγιναν κατά την διάρκεια αυτής της διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκαν με μικροσκόπιο Nikon Eclipse 80i. Β.3.2. Μικροσκοπία συνεστίασης με μικροσκόπιο Nikon Eclipse 80i Στην παρακάτω εικόνα Β.2. απεικονίζονται τα βασικά μέρη από τα οποία αποτελείται ένα συνεστιακό μικροσκόπιο και τα οποία είναι: Εικόνα Β.2. Βασικά μέρη του συνεστιακού μικροσκοπίου i) Ο αντικειμενικός φακός: το οπτικό στοιχείο που εστιάζει την διεγείρουσα δέσμη στο δείγμα, ενώ συλλέγει και την φθορίζουσα ακτινοβολία που εκπέμπεται από το δείγμα. Σε ένα σύνηθες μικροσκόπιο υπάρχουν 3-6 αντικειμενικοί φακοί προσφέροντας μεγέθυνση από 4Χ έως 100Χ. 64

65 ii) Το διχρωϊκό κάτοπτρο: να ανακλά την ακτινοβολία κάτω από ένα μήκος κύματος, ενώ ταυτόχρονα επιτρέπει την διέλευση ακτινοβολίας με μεγαλύτερο μήκος κύματος. Τα χαρακτηριστικά του διχρωϊκού κατόπτρου μπορούν να επιλεγούν με βάση το χαρακτηριστικό φάσμα του φθορισμοφόρου που πρόκειται να μελετηθεί, και άρα τα χαρακτηριστικά μήκη κύματος της δέσμης διέγερσης και του φθορισμού. iii) Το διάφραγμα: σκοπός του είναι η αποκοπή μέρους της ακτινοβολίας φθορισμού που προέρχεται από τις εκτός εστιακού επιπέδου περιοχές του δείγματος. Τα χαρακτηριστικά του διαφράγματος μπορούν να καθοριστούν μέσω Η/Υ. Εάν η ίριδα του διαφράγματος μεγαλώσει, τότε ανιχνεύεται πληροφορία από μεγαλύτερο όγκο γύρω από το εστιακό επίπεδο του δείγματος. Το ζητούμενο στην συνεστιακή μικροσκοπία είναι η ελαχιστοποίηση του μεγέθους της ίριδας, ενώ ταυτόχρονα να συλλέγονται αρκετά φωτόνια ώστε να γίνει μέτρηση σήματος. iv) Ο φωτοπολλαπλασιαστής: λαμβάνει την πληροφορία που προέρχεται από το δείγμα με την μορφή φωτονίων, και την ενισχύει μετατρέποντας την σε ηλεκτρόνια μέσω ενός συστήματος διόδων Η ύπαρξη του διαφράγματος σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο έχει σαν αποτέλεσμα μεγάλη μείωση στον αριθμό των συλλεγόμενων φωτονίων και συνεπώς ασθενές σήμα. Για να αντισταθμιστεί αυτή η μείωση χρησιμοποιείται δέσμη LASER ως πηγή διεγείρουσας ακτινοβολίας αυξάνοντας την ροή των φωτονίων, αλλά και φωτοπολλαπλασιαστής για την λήψη του σήματος. Ο. Είναι επίσης δυνατόν να κοπεί ο οπτικός θόρυβος από το λαμβανόμενο σήμα καθορίζοντας ένα κατώφλι ανίχνευσης σήματος. Στην συνεστιακή μικροσκοπία η μικρού μήκους κύματος διεγείρουσα δέσμη (συνήθως δέσμη laser), ανακλάται στο διχρωϊκό κάτοπτρο το οποίο ανακλά το φως μικρού μήκους κύματος της διεγείρουσας ακτινοβολίας, ενώ αφήνει να διέλθει το φως μεγάλου μήκους κύματος, του φθορισμού. Στην συνέχεια, η ανακλώμενη δέσμη εστιάζεται μέσω του αντικειμενικού φακού σε μια περιοχή του δείγματος. Η ελάχιστη διάμετρος της περιοχής αυτής εξαρτάται από τα όρια που τίθενται από τον νόμο της περίθλασης. Με αυτό τον τρόπο, η ένταση της ακτινοβολίας πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο μειώνεται απότομα, αφού η προσπίπτουσα δέσμη συγκλίνει ή αποκλίνει αντίστοιχα. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση του σήματος από τις περιοχές που βρίσκονται πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο. 65

66 Η προσπίπτουσα ακτινοβολία στο δείγμα διεγείρει το φθορισμοφόρο, το οποίο στη συνέχεια αποδιεγείρεται είτε εκπέμποντας φωτόνια μικρότερης ενέργειας από την ενέργεια της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, είτε μέσω μη-ακτινοβολουσών διεργασιών. Ο ίδιος αντικειμενικός φακός συλλέγει την δευτερογενή φθορίζουσα, ακτινοβολία που προέρχεται από όλο το πάχος του δείγματος. Η φθορίζουσα ακτινοβολία αφού διέλθει από το διχρωϊκό κάτοπτρο προσπίπτει σε διάφραγμα το οποίο βρίσκεται σε συζευγμένο εστιακό επίπεδο με το δείγμα. Το γεγονός πως το διάφραγμα βρίσκεται στο επίπεδο σχηματισμού του ειδώλου από το εστιακό επίπεδο του δείγματος, εμποδίζει όσα φωτόνια προέρχονται από περιοχές του δείγματος που βρίσκονται εκτός του εστιακού επιπέδου να περάσουν από το διάφραγμα και να συνεισφέρουν στο ανιχνευόμενο σήμα. Όσα φωτόνια διέρχονται από το διάφραγμα ανιχνεύονται μέσω φωτοπολλαπλασιαστή και η εικόνα του δείγματος δημιουργείται σε Η/Υ. Αυτή η ιδιαιτερότητα που δίνει την δυνατότητα αποκοπής της εκτός εστιακού επιπέδου ακτινοβολίας είναι που δίνει τον όρο "συνεστιακή" στην συγκεκριμένη μικροσκοπία. Το εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού σε μια περιοχή του δείγματος δημιουργεί το είδωλο στην θέση που βρίσκεται το διάφραγμα. Δηλαδή το δείγμα και η εικόνα είναι συνεστιακά. Απορρίπτοντας την εκτός εστιακού επιπέδου ακτινοβολία μέσω του διαφράγματος, και με την βοήθεια του Η/Υ, μετά από την σάρωση του δείγματος κατά τις x, y και z διευθύνσεις, δημιουργείται τη τρισδιάστατη απεικόνιση του δείγματος από τις πληροφορίες που προέρχονται από διαδοχική σάρωση σε διαφορετικού βάθους εστιακά επίπεδα στο δείγμα. Στο μικροσκόπιο που είχε κατασκευάσει ο Minsky η σάρωση του δείγματος γινόταν με μετακίνηση της τράπεζας πάνω στην οποία βρισκόταν το δείγμα. Αυτό είχε σαν αποτέλεσμα στην εικόνα του δείγματος να δημιουργούνται ψευδό-υφές. Στα σύγχρονα συνεστιακά μικροσκόπια η σάρωση γίνεται με μετακίνηση της δέσμης μέσω συστήματος κατόπτρων. 66

67 Β Προετοιμασία δείγματος Όσον αφορά την προετοιμασία του δείγματος, πρέπει να ληφθεί υπόψη η ακινητοποίηση των κυττάρων(fixation), η σωστή επιλογή του χρωμοφόρου, η επιλογή του μέσου καθήλωσης στην αντικειμενοφόρο πλάκα και η προετοιμασία δειγμάτων ελέγχου. Ως χρωμοφόρα, χρησιμοποιούνται αντισώματα που φέρουν ένωση που φθορίζει ή φθορίζουσες πρωτεΐνες. Η ακινητοποίηση έχει ως σκοπό την προστασία των κυττάρων και την διατήρησή τους και εφαρμόζεται στις περιπτώσεις που χρησιμοποιούνται αντισώματα. Στα πειράματα μας, δεν πραγματοποιήθηκε καθήλωση των κυττάρων πριν την παρακολούθηση στο μικροσκόπιο, αφού η rps5 εκφράζεται ως πρωτεΐνη σύντηξης μαζί με την φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP Οπότε, τα κύτταρα HeLa συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες, πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS 1X, και στερεώθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες με 90 %v/v γλυκερόλη. Δεν χρησιμοποιήθηκε καμία μέθοδος χρώσης του πυρήνα ή του κυτταροπλάσματος, απλά παρακολουθήθηκε η υποκυτταρική κατανομή της λόγω φθρισμού της GFP. Κατά τον χειρισμό των δειγμάτων, θα πρέπει να αποφεύγεται η έκθεση σε φως μιας και η GFP είναι φωτοευαίσθητη πρωτεΐνη και είναι πιθανό να μειωθεί η ένταση του φθορισμού. Οι εικόνες συλλέχθηκαν στο συνεστιακό μικροσκόπιο Nikon με χρήση του λογισμικού EZ C στο εργαστήριο Ανατομίας και Ιστολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. 67

68 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όπως προαναφέρθηκε στην εισαγωγή, Α σελ. 28, προκειμένου να επαληθευτούν οι υποθέσεις φωσφορυλίωσης μιας Ser ή Thr τα αμινοξέα αυτά αντικαθίστανται από Asp ή Glu, με εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης. Στην περίπτωση αυτή, παρατηρείται το φαινόμενο της ψευδοφωσφορυλίωσης. Δηλαδή, το Asp ή το Glu μιμείται την φωσφρυλιωμένη Ser ή Thr. Συνήθως, για στερεοχημικούς λόγους η Ser αντικαθίσταται από Asp και η Thr από Glu χωρίς αυτό να είναι απόλυτο. Λόγω του αρνητικού φορτίου που φέρουν τα όξινα αμινοξέα μιμούνται το αρνητικό φορτισμένο φωσφορυλιωμένο αμινοξύ. Το τελευταίο αποδεικνύει ότι και το αρνητικό φορτίο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην περαιτέρω κυτταρική σηματοδότηση. Γ.1. Μετάλλαξη της Τhr(14) σε Asp με την τεχνική του megaprimer Το γονίδιο της rps5 ήταν κλωνοποιημένο σε σύντηξη με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 (Διδακτορικές διατριβές, Δρ. Ε. Παπαχρήστου, Δρ. Χ. Ματράγκου.). Γ.1.1. Θεωρητική προσέγγιση των αμινοξέων στόχων φωσφορυλίωσης της rps5 Στην εικόνα Γ.1. δίνεται η αμινοξική ακολουθία και οι πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης της rps5 συγκεκριμένης πρωτεΐνης όπως προέκυψε από το πρόγραμμα NetPhos. Συγκεκριμένα στην αμινοτελική περιοχή της rps5, αμινοξέα 1-37, υπάρχουν τρεις πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση καζεΐνης ΙΙ (CKII), η Τhr(2), η Ser(24) και η Ser(34). (Διδακτορικές διατριβές, Δρ. Ε. Παπαχρήστου, Δρ. Χ. Ματράγκου). Στην ίδια περιοχή υπάρχουν και άλλες δυο πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης, η Thr(8), από την p38mapk και η Τhr(14). Στην καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης, η Thr(133) είναι πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από την κινάση PKC. Στα πλαίσια προηγούμενων διδακτορικών διατριβών πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις των αμινοξέων Ser(24), Ser(34), Τhr(14), Thr(133) σε γλυκίνη καθώς και απάλειψη 68

69 της Thr(2) ώστε να εξεταστεί η δυνατότητα φωσφορυλίωσης της μεταλλαγμένης rps5 καθώς και η κυτταρική της εντόπιση. Στην προκείμενη εργασία κρίθηκε απαραίτητο να μελετηθεί η σπουδαιότητα των συγκεκριμένων αμινοξέων για την παραμονή της πρωτεΐνης στους πυρηνίσκους μετά από φωσφορυλίωση και πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε περαιτέρω η φωσφορυλίωση της Thr(14). Στην εικόνα Γ.1 φαίνεται η αμινοξική ακολουθία της rps5 με τη χρήση του προγράμματος NetPhos. Εικόνα Γ.1. Αμινοξική ακολουθία της rps5 με τη χρήση του προγράμματος NetPhos, Με τα διάφορα χρώματα επισημαίνονται οι πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης και πιο συγκεκριμένα: TEWE, STDD, SLQD: πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση καζεινης ΙΙ CKII. ATPAV: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από την p38mapk κινάση. ETPDI: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από άγνωστη κινάση. TVR : πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από την PKC κινάση. Με μαύρα βέλη επισημαίνονται η Thr(8) και η Thr(14). 69

70 Γ.1.2. Σχεδιασμός και κλωνοποίηση της μετάλλαξης της Thr 14 της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp C1 Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η μετάλλαξη της Thr(14) σε Asp, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του magaprimer. Σχεδιάστηκε αρχικά ο κατάλληλος εκκινητής ο οποίος έφερε τη μετάλλαξη. Με τη χρήση του megaprimer και των κατάλληλων 5 και 3 εκκινητών πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Ο 5 εκκινητής περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού KpnI και ο 3 εκκινητής για το ένζυμο BamHI. Η ακολουθία του κάθε εκκινητή, καθώς και οι συνθήκες της κάθε αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.2.-Β.2.3. Με την αντίδρασης πολυμεράσης αναμένεται να πολλαπλασιαστεί το γονίδιο με τη μετάλλαξη. Μετά το τέλος της κάθε αντίδρασης, το μίγμα ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης 1 %w/v. Αναμένεται να εμφανιστεί ζώνη στα 620 bp. Στην εικόνα Γ.3. φαίνονται τα κύρια προϊόντα που προέκυψαν. Στην πρώτη διαδρομή είναι DNA μάρτυρες και στη δεύτερη το προϊόν της PCR. Οι μάρτυρες έχουν μοριακό μέγεθος 1 kb Είναι φανερό ότι το γονίδιο έχει ενισχυθεί. Εικόνα Γ.2. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%v/v του προϊόντος της PCR για το γονίδιο της rps5 Τ(14)mut. Διαδρομή Μ: μάρτυρες, Διαδρομή 1: Προϊόν PCR. Το τμήμα DNA εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και, στη συνέχεια, ακολούθησε καθαρισμός με το Gel Extraction Kit, όπως αναφέρεται στην B

71 Τόσο το τμήμα DNA που απομονώθηκε όσο και o πλασμιδιακός φορέας pegfp C1, επωάστηκαν αρχικά με το ένζυμο περιορισμού KpnI. To τμήμα DNA καθαρίστηκε με το PCR Purification Kit (παράγραφοs B.2.7.) ενώ ο πλασμιδιακός φορέας ηλεκτροφορήθηκε και εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης με Gel Extraction Kit. Προκειμένου να είναι ορατή η διαφορά, σε διπλανή διαδρομή στην πηκτή τρέχουμε και άκοπο πλασμίδιο. Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκε πέψη με το ένζυμο BamΗΙ και το τμήμα DNA και ο πλασμιδιακός φορέας καθαρίστηκαν όπως και προηγουμένως. Ακολούθησε η αντίδραση της DNA λιγάσης ( Β.2.11.) και μετά το πέρας της, πραγματοποιήθηκε εισαγωγή του ανασυνδυασμένου φορέα pegfp C1 σε επιδεκτικά κύτταρα TOP10F των E.coli, όπως περιγράφεται στην B Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη. Από τις αποικίες που προέκυψαν, προκειμένου να βρεθούν οι θετικές που φέρουν τον αναμενόμενο ανασυνδυασμένο φορέα, έγινε καλλιέργεια σε 5 ml LB και την επόμενη ημέρα απομόνωση πλασμιδιακού DNA με το miniprep kit της Qiagen (παράγραφος B.2.15.). Το πλασμιδιακό DNA που απομονώθηκε από κάθε αποικία, επωάσθηκε με τα ένζυμα περιορισμού KpnI και BamHI προκειμένου να διαπιστωθούν οι θετικοί κλώνοι από την ύπαρξη του αναμενόμενου τμήματος DNA στα 620 περίπου ζεύγη βάσεων Εικόνα Γ.3. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%v/v του προϊόντος της πέψης με τα ένζυμα περιορισμού KpnI και BamHI. Διαδρομή Μ: μάρτυρες, Διαδρομή 1: Προϊόν πέψης του pegfp-c1- rps5 Τ(14)mut. 71

72 Ο ανασυνδυασμένος πλασμιδιακός φορέας στάλθηκε για νουκλεοτιδική ανάλυση αλλά δεν κατέστη δυνατή η επιβεβαίωση της μετάλλαξης, οπότε έγινε και εισαγωγή μετάλλαξη με το Q5 site directed mutagenesis kit. Γ.2. Εισαγωγή της μετάλλαξης με Q5 site directed mutagenesis kit Στην περίπτωση αυτή ακολουθήθηκε η διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.4. Προέκυψαν 4 θετικές αποικίες, πραγματοποιήθηκε απομόνωση πλασμιδίου και τα ανασυνδυασμένα στάλθηκαν για ανάλυση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας. Η αντικατάσταση της Thr(14) από Asp επαληθεύτηκε για 2 δείγματα. Στην ακόλουθη εικόνα δίνεται η αντιστοίχιση της rps5 αγρίου τύπου με την rps5mut. Εικόνα Γ.4. Αντιστοίχιση του κλώνου rps5 αγρίου τύπου-επάνω σειρά-με την rps5 Τ(14)mut.-κάτω σειρά. Η μετάλλαξη δίνεται με μαύρο πλαίσιο. Στην επάνω σειρά δίνεται η νουκλεοτιδική ακολουθία της rps5 αγρίου τύπου ενώ στην κάτω της rps5mut. Με μαύρα βέλη σημειώνεται η αρχή και το τέλος του γονιδίου. Παρατηρείται ότι το κωδικόνιο που κωδικοποιεί την Thr-GAC, κόκκινο 72

73 πλαίσιο-, έχει αντικατασταθεί από το κωδικόνιο που κωδικοποεί το Asp ΑCC, μαύρο πλαίσιο. Φαίνεται ότι έχουν γίνει και άλλες σημειακές μεταλλάξεις -σημειώνονται με κόκκινο και αστερίσκο-, οι οποίες όμως είναι σιωπηλές, δηλαδή κωδικοποιούν το ίδιο αμινοξύ. Γ.3. Πειράματα ανοσοφθορισμού της πρωτεΐνης σύντηξης GFP rps5 T(14)mut Προκειμένου να μελετηθεί η υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε παραδική επιμόλυνση κυττάρων HeLa με τον ανασυνδυασμένο φορέα pegfp C1 rps5 Τ(14)mut. Για την επίτευξη της επιμόλυνσης χρησιμοποιήθηκε το Χfect Transfection Reagent της εταιρείας Clontech, σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β Στην παρακάτω εικόνα φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από παροδική επιμόλυνση των κυττάρων με τον πλασμιδιακό φορέα στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί η GFF (A), η rps5 αγρίου τύπου (Β) και η rps5 T(14)G (Γ). Η τελευταία πραγματιποιήθηκε στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής της Δρ. Ε. Παπαχρήστου και της μεταπτυχιακής εργασίας της Δρ. Φ. Τσιτουρούδη. 73

74 Εικόνα Γ.5. Έμμεσος φθορισμός της μεταλλαγμένης rps5 με μικροσκοπία συνεστίασης(confocal microscopy). Α: GFP, Β: GFP--rpS5 wild type control, Γ: GFPrpS5 T(14)G μετά από 24 h, GFP-rpS5 T(14)G μετά από 48 h.(διδακτορική διατριβή Δρ. Ε. Παπαχρήστου, Μεταπτυχιακή εργασία Δρ. Φ. Τσιτουρούδη) Παρατηρείται ότι GFP (A) είναι διάχυτη στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η μετάλλαξη της Τhr με το ουδέτερο αμινοξύ Gly παρουσιάζει διαφορετική συμπεριφορά από την αγρίου τύπου. Συγκεκριμένα, 24 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση εντοπίζεται τόσο στο πυρήνα και τους πυρηνίσκους όσο και στο κυτταρόπλασμα. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση η rps5mut εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, αφήνοντας άδειο τον πυρήνα και τους πυρηνίσκους. Η υπόθεση της in vivo φωσφορυλίωσης και της επίδρασής της στην ενδοκυτταρική μετακίνηση της rps5 επαληθεύτηκε με τα παρακάτω πειράματα. Έπειτα από επιτυχή κλωνοποιηση του γονιδίου rps5 Τ(14)D στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-ci, πραγματοποιήθηκε παροδική επιμόλυνση κυττάρων HeLa και μετά από 74

75 48 ώρες παρατηρήθηκαν στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Το αποτέλεσμα φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Εικόνα Γ.6. Έμμεσος φθορισμός της μεταλλαγμένης rps5 με μικροσκοπία συνεστίασης (confocal microscopy). Α: GFP-rpS5 T(14)D. Όπως φαίνεται στην εικόνα Γ.7. η αντικατάσταση με το Asp δίνει ίδιο φαινότυπο με την rps5 αγρίου τύπου. Η rps5mut T(14)D εντοπίζεται στον πυρήνα και σε μεγαλύτερο ποσοστό στους πυρηνίσκους. Γ.4. Μελέτες μοριακής προσομοίωσης Με πρόγραμμα βιοπληροφορικής, πραγματοποιήθηκε μοριακή προσομοίωση της τρισδιάστατης δομής της rps5 αγρίου τύπου, της rps5-t(14)g και της rps5-t(14)d. Αριστερά δίνεται η μοριακή προσομοίωση της rps5 αγρίου τύπου και της rps5- T(14)D. Με μωβ χρώμα είναι η διαμόρφωση της rps5wt, ενώ με μπλέ της rps5- Τ(14)D. Δεξιά δίνεται η μοριακή προσομοίωση της rps5 αγρίου τύπου, της rps5- T(14)G και της rps5-t(14)d. Με πράσινο χρώμα είναι η rps5-t(14)d, με πορτοκαλί η rps5-t(14)g και με γκρί η rps5wt. Να σημειωθεί ότι η δεξιά μοριακή προσομοίωση, πραγματοποιήθηκε για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. 75

76 Εικόνα Γ.7. Μοριακή προσομοίωση της δομής της rps5wt με την rps5mut (αριστερά) και μοριακή προσομοίωση της rps5wt, rps5-τ(14)g και rps5-t(14)d (δεξιά) Παρατηρείται ότι με την μετάλλαξη σε Gly, αλλάζει η διαμόρφωση της πρωτεΐνης. Ουσιαστικά, προκαλείται σε εκείνο το σημείο κάμψη της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. H rps5wt και η rps5-t(14)d έχουν την ίδια διαμόρφωση και μάλιστα έχει σχηματιστεί και η α-έλικα. Αντίθετα, με την μετάλλαξη σε Gly, δεν σχηματίζεται η α- έλικα στο αμινο-τελικό άκρο. 76

77 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το ριβόσωμα αποτελεί το υποκυτταρικό οργανίδιο που επιτελεί μια από τις σημαντικότερες κυτταρικές διεργασίες, αυτής της σύνθεσης των πρωτεϊνών. Ο σημαντικός ρόλος του τονίζεται και από την πολύπλοκη και συντηρημένη διαδικασία της βιογένεσης και του ελέγχου της. Η βιογένεση ξεκινά στους πυρηνίσκους με τη σύνθεση του 5S και 35S pre-rrna από συγκεκριμένες RNA πολυμεράσες και απαιτεί την είσοδο ριβοσωμικών πρωτεϊνών από το κυτταρόπλασμα. Η ακόλουθη ωρίμανση των rrna και η ενσωμάτωσή τους στις αντίστοιχες ριβοσωμικές υπομονάδες συμπεριλαμβάνει τουλάχιστον 200 πρωτεΐνες, ενδο- και εξω-ριβονουκλεάσες, ATPεξαρτώμενες ελικάσες, μοριακές συνοδούς ή παράγοντες ενσωμάτωσης (Venema J., Tollervey D., 1999 και Kressler D. et al., 1999a) και αρκετά snornps. Η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα, 40S, ωριμάζει στο κυτταρόπλασμα, ενώ η μεγάλη, 60S, ωριμάζει στον πυρήνα και έπειτα εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Όπως προαναφέρθηκε, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μετά την σύνθεσή τους στο κυτταρόπλασμα εισέρχονται στον πυρήνα-πυρηνίσκο προκειμένου να συγκροτηθούν οι πρώιμες μορφές των αντίστοιχων υπομονάδων. Στην εργασία μελετήθηκε η ριβοσωμική πρωτεΐνη S5 και πιο συγκεκριμένα ο τρόπος που επηρεάζει η φωσφορυλίωση την υποκυτταρική της εντόπιση. Σύμφωνα με πειράματα μικροσκοπίας συνεστίασης, η rps5 περνάει στον πυρήνα, πιθανόν, μέσω της δομικής περιοχής aa, χωρίς να υπάρχει κάποιο γνωστό σήμα εισόδου (NLS), όπως άλλες πρωτεΐνες. Υπάρχουν πολλά παραδείγματα ριβοσωμικών πρωτεϊνών (L7a, S7, S19, L25, S6) που εισέρχονται στον πυρήνα και κατ επέκταση στους πυρηνίσκους με διαφορετικές αλληλουχίες στόχους (Annilo et al.,1998, Da Costa et al., 2003). Ένα χαρακτηριστικό τέτοιο παράδειγμα είναι η ανθρώπινη ριβοσωμική πρωτεΐνη L7a η οποία έχει τρεις κυρίαρχες περιοχές (domains) όπου η καθεμία έχει τουλάχιστον ένα σήμα πυρηνικής εισόδου. Για την είσοδο της rps5 στον πυρήνα είναι απαραίτητη η περιοχή 38 Tyr... Tyr 50 η οποία, σύμφωνα πάντα με θεωρητικές προσεγγίσεις, δεν περιέχει α έλικα αλλά είναι ευέλικτη (flexible) και οργανωμένη σε μορφή βρόγχου και ενδέχεται να περιέχει δομικά στοιχεία Όσον αφορά την είσοδό της στους πυρηνίσκους, πιθανόν να «συνεργάζονται» η αμινοτελική και καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, η 77

78 φωσφορυλίωση της θρεονίνης 133 (Thr 133) από την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) πυροδοτεί την φωσφορυλίωση της σερίνης 24 (Ser 24) από την κινάση καζεΐνης II (CKII) και με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται η μετακίνηση της rps5 από τον πυρήνα στους πυρηνίσκους (Matragkou C, Papachristou E. et al. 2009). Πιο συγκεκριμένα, κρίθηκε σκόπιμο να εξακριβωθεί αν το αμινοξύ θρεονίνη που βρίσκεται στη θέση 14 αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης και συμβάλει στην υποκυτταρική εντόπιση της rps5. Σε προηγούμενες εργασίες, επετεύχθη μετάλλαξη της θρεονίνης σε ένα ουδέτερο αμινοξύ τη γλυκίνη. Έπειτα από έλεγχο σε συνεστιακό μικροσκόπιο, φάνηκε ότι η πρωτεΐνη μετά από 24 ώρες βρίσκεται διάχυτη στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα ενώ μετά από 48 ώρες εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Οπότε συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη εισέρχεται στον πυρήνα και στους πηρηνίσκους αλλά δεν μπορεί να παραμείνει. Για να μελετηθεί περαιτέρω ο ρόλος της Thr(14) πραγματοποιήθηκε μετάλλαξη της τελευταίας σε Asp. Μετάλλαξη της Thr σε Asp έχει ως αποτέλεσμα η πρωτεΐνη να εντοπίζεται στον πυρήνα και περισσότερο στους πυρηνίσκους. Στην περίπτωση αυτή υφίσταται το φαινόμενο της ψευδοφωσφορυλίωσης και επειδή η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη παρουσιάζει την ίδια εικόνα με την αγρίου τύπου, εξάγεται το συμπέρασμα ότι όντως η Thr στη θέση 14 φωσφορυλιώνεται. Η iv vivo φωσφορυλίωση είναι απαραίτητη για την παραμονή της πρωτεΐνης στον πυρήνα και στους πυρηνίσκους. Πιθανόνν να γίνεται και αυτή στον πυρήνα. Επιπρόσθετα, από πειράματα βιοπληροφορικής προκύπτει ότι η φωσφορυλίωση της θρεονίνης προκαλεί μια κάμψη στη δομή, σε σχέση με την αγρίου τύπου rps5. Όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή φωσφορυλιωμένη θρεονίνη που ακολουθείται από προλίνη αποτελεί υπόστρωμα για την μοριακή συνοδό Pin1. Εν κατακλείδι, συμπεραίνεται ότι η Thr στη θέση 14 φωσφορυλιώνεται και αυτή η φωσφορυλίωση είναι απαραίτητη για την παραμονή της rps5 στον πυρήνα και τους πυρηνίσκους ώστε να συμμετέχει στη βιογένεση του ριβοσώματος Πιθανόν, στην φωσφορυλίωσή της να εμπλέκεται και η πυρηνική πρωτεΐνη Pin1, η οποία αλληλεπιδρά με κινάσες. Η κυτταρική διαμετακίνηση της rps5 φαίνεται σχηματικά στην παρακάτω εικόνα 78

79 πυρηνίσκος πυρήνας CKII PKC rps5 κυτταρόπλασμα Εικόνα Δ.1. Σχηματική αναπαράσταση της κυτταρικής διαμετακίνησης της rps5. 79