ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ ΤΟΥ ALS ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ALS ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΠΟ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΥΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥΣ ΗΡΑΣ (Lolium rigidum) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Α. Π. Θ. ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ: ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ ΤΟΥ ALS ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ALS ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΠΟ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΥΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥΣ ΗΡΑΣ (Lolium rigidum) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Κ. ΤΣΙΩΝΗ Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επιβλέπων καθηγητής: Η. Γ. Ελευθεροχωρινός Θεσσαλονίκη 2012

2 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY Σελίδα Εισαγωγή Γενική Εισαγωγή Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Ανασκόπηση Βιβλιογραφίας Βιολογία του ζιζανίου ήρα (Lolium rigidum Gaudin.) Ορισμοί - Ορολογία Αντιμετώπιση του ζιζανίου ήρα Σουλφονυλουρίες (Sulfonylureas) Ιµιδαζολινόνες (Imidazolinones) Πυριµιδινυλ(θειο)βενζοϊκά οξέα (Pyrimidinyl(thio)benzoates) Τριαζολοπυριµιδίνες (Triazopyrimidines) Σουλφονυλαµινοκαρβονυλοτριαζολινόνες (Sulfonylaminocarbonyltriazolinones) Ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα Ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της βιοσύνθεσης των αμινοξέων με διακλαδισμένη αλυσίδα (ένζυμο ALS ή AHAS) Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων 28

3 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων στην Ελλάδα Δομή και δράση του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) - Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας Η γονιδιακή βάση του ενζύµου ALS Δομή του ενζύµου ALS Δράση του ενζύµου ALS Μοριακή βάση της σύνδεσης μεταξύ του ενζύµου ALS και των ζιζανιοκτόνων και αναστολή της ενζυμικής δράσης του Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράση του ενζύµου ALS Σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Ανθεκτικότητα ζιζανιοκτόνων λόγω μεταβολισμού Μονοξυγονάσες CytΡ Γλουταθειόνη-S-τρανσφεράσες Γλυκοζυλτρανσφεράσες ABC μεταφορείς Σκοπός της εργασίας Πειραματικές εργασίες Υλικά και Μέθοδοι Προέλευση σπόρων και παραγωγή φυτικού υλικού Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών ήρας Απομόνωση του γενωμικού DNA Ενίσχυση και αλληλούχηση τµήµατος του ALS γονιδίου Αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) από φυτά επτά ανθεκτικών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας Εκχύλιση του ενζύµου ALS Δοκιμή της δράσης του ενζύµου ALS 58

4 Αξιολόγηση της δράσης των μονοξυγονασών Ρ450 σε δύο ανθεκτικούς και έναν ευαίσθητο πληθυσμό ήρας Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα και Συζήτηση Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας οκτώ πληθυσμών ήρας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron Στοίχιση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων και ανάλυση των χρωµατογραφηµάτων αλληλούχησης Αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) από επτά ανθεκτικούς και έναν ευαίσθητο πληθυσμό ήρας Επίδραση του malathion στη δράση των ζιζανιοκτόνων chlorsulfurom και tribenuron εναντίον τριών πληθυσμών ήρας Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 78 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 90

5 4 ΠΙΝΑΚΕΣ ΕΙΚΟΝΕΣ - ΣΧΗΜΑΤΑ Σελίδα Πίνακας 1. Βοτανική κατάταξη του ζιζανίου ήρα η λεπτή (Lolium rigidum Gaudin) 18 Εικόνα 1. Ταξιανθία, ωτίδια και σπόροι του ζιζανίου ήρα. 19 Σχήμα 1. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron. 22 Σχήμα 2. Μεταβολισμός του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron εντός των φυτών (Christopher κ.ά., 1991). 23 Σχήμα 3. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου imazamox. 24 Σχήμα 4. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου pyrithiobac. 25 Σχήμα 5. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου florasulam. 26 Σχήμα 6. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου flucarbazone. 26 Σχήμα 7. Διαγραμματική απεικόνιση της πορείας ανάπτυξης ( ) ανθεκτικών ειδών (βιοτύπων) ζιζανίων σε διάφορες ομάδες ζιζανιοκτόνων. Το πλήθος των ανθεκτικών ειδών ζιζανίων για κάθε ομάδα ζιζανιοκτόνων αναφέρεται στην πρόσφατη επισκόπηση (Heap, 2012). 27 Σχήμα 8. Καταλυτική υποµονάδα του ενζύµου ALS. Οι α-, β- και γ-περιοχές της καταλυτικής υποµονάδας του ALS ενζύµου απεικονίζονται µε κίτρινο, πράσινο και γκρι χρώµα, αντίστοιχα (Duggleby κ.ά., 2008). 35 Σχήμα 9. Αντιδράσεις που καταλύονται από το ένζυµο ALS κατά τη βιοσύνθεση των αµινοξέων Leu, Val και Ile (Duggleby κ.ά., 2008). 36 Σχήμα 10. Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης-σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων (Α) chlorimuron (σουλφονυλουρία) και (Β) imazaquin (ιµιδαζολινόνη) στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώµατος προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου ALS. Τα ζιζανιοκτόνα απεικονίζονται µε τη µορφή ράβδων, ενώ τα αμινοξέα µε γκρι επιφάνεια (McCourt κ.ά., 2006). 37

6 5 Σχήµα 11. Σχηµατική απεικόνιση του σηµείου πρόσδεσης των ζιζανιοκτόνων στο ένζυµο ALS. Τα ζιζανιοκτόνα παρουσιάζονται µε γραµµές και σφαίρες, ενώ µε χρώµα γκρι παριστάνονται τα άτοµα του άνθρακα. Τα αµινοξέα παρουσιάζονται µε γραµµές, τα άτοµα του άνθρακα µε πράσινο χρώµα, τα άτοµα S µε κίτρινο χρώµα, τα άτοµα Ο µε κόκκινο χρώµα, τα άτοµα Ν µε µπλε χρώµα και τα άτοµα Cl µε πορτοκαλί χρώµα. Οι δεσµοί υδρογόνου παρουσιάζονται µε µπλε διακεκοµµένες γραµµές. (A) Σύνδεση του ζιζανιοκτόνου chlorimuron στο ένζυµο ALS. (B) Σύνδεση του ζιζανιοκτόνου imazaquin στο ένζυµo ALS. (Duggleby κ.ά., 2008). Ονοµατολογία αµινοξέων κατά IUPAC: Α, αλανίνη; C, κυστεΐνη; D, ασπαρτικό οξύ; Ε, γλουταµικό οξύ; F, φαινυλαλανίνη; G, γλυκίνη; Η, ιστιδίνη; Ι, ισολευκίνη; Κ, λυσίνη; L, λευκίνη; M, µεθειονίνη; Ν, ασπαραγίνη; P, προλίνη; Q, γλουταµίνη; R, αργινίνη; S, σερίνη; T, θρεονίνη; V, βαλίνη; W, τρυπτοφάνη; Υ, τυροσίνη. 39 Σχήμα 12. Σχηµατική απεικόνιση του ενζύµου ALS µε τα οκτώ αµινοξέα των οποίων η αντικατάσταση είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας των ζιζανίων. Το τµήµα στην αρχή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (CTP, Chloroplast Transit Peptide) είναι το πεπτίδιο µεταφοράς του ενζύµου από τον πυρήνα στους χλωροπλάστες (Tranel και Wright, 2002; Whaley κ.ά., 2007). 43 Σχήμα 13. Σχηματική αναπαράσταση των P450, GST, γλυκοσυλτρανσφεράση και ABC μεταφορέα. Το σχήμα περιγράφει τέσσερα στάδια μεταβολισμού ζιζανιοκτόνων α) δράση μονοξυγονασών P450, β) δράση GST (γλουταθειόνη-s-τρανσφεράση), γ) μεταφορά με χρήση ATP από τους ΑΒC μεταφορείς και δ) μεταβολισμός εντός του χυμοτοπίου. 48 Πίνακας 2. Ανθεκτικότητα λόγω μεταβολισμού μέσω των μονοξυγονασών (P450s), γλουταθειόνη-s-τρανσφερασών (GSTs) και γλυκοζυλτρανσφερασών (GTs) (Yuan, κ.ά. 2006). 49 Πίνακας 3. Πληθυσμοί (επτά ανθεκτικοί και ένας ευαίσθητος) του ζιζανίου ήρα λεπτή που αξιολογήθηκαν στα πειράματα ελέγχου της μοριακής βάσης της ανθεκτικότητας (αλληλούχηση ALS γονιδίου και δράση ALS 53

7 6 ενζύμου). Σχήμα 14. Περιοχές προέλευσης των επτά ανθεκτικών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού του ζιζανίου ήρα λεπτή. 54 Σχήμα 15. Προβλάστηση σπόρου από επτά ανθεκτικούς και ένα ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου ήρα λεπτή παρουσία 3,0 και 0,5 mg chlorsulfuron L -1. Οι σπόροι των ανθεκτικών πληθυσμών φυτρώνουν παρουσία 3,0 mg ζιζανιοκτόνου L-1 ενώ τα ευαίσθητα άτομα δεν φυτρώνουν παρουσία 0,5 mg chlorsulfuron L Σχήμα 16. Ανάπτυξη ανθεκτικών ή ευαίσθητων φυτών για την παραγωγή του απαραίτητου για τις πειραματικές εργασίες φυτικού υλικού. 55 Σχήμα 17. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας εκχύλισης-καταβύθισηςαφαλάτωσης και παραλαβής από φυτικό ιστό ήρας του κλάσματος των πρωτεϊνών µε δράση του ενζύµου ALS. 58 Πίνακας 4. Συγκεντρώσεις των ζιζανιοκτόνων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου ALS. 59 Σχήμα 18. Στοίχιση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων και των αντίστοιχων αμινοξέων για το τμήμα του ALS γονιδίου ενός ευαίσθητου και επτά ανθεκτικών πληθυσμών ήρας (ύπαρξη διαφορετικών σημειακών μεταλλάξεων στο κωδικόνιο 197). Οι θέσεις των κωδικονίων αναφέρονται στο ευαίσθητο αλληλόμορφο ALS γονίδιο του είδους A. thaliana (αριθμός πρόσβασης GenBank: X51514). Οι αλληλουχίες συγκρίθηκαν με την αντίστοιχη για το αλληλόμορφο ALS γονίδιο του φυσικού τύπου ήρας (αριθμός πρόσβασης GenBank: EF411170). Οι τελείες (.) δείχνουν ομοιότητα με την αλληλουχία του ευαίσθητου πληθυσμού P08. I.U.P.A.C. I.U.B κωδικοί για μεικτά νουκλεοτίδια: Y, T ή C; M, A ή C; S, G ή C; B, C ή G ή T; K, G ή T; H, A ή C ή G; N, οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο. 65 Σχήμα 19. Απεικόνιση τεσσάρων διαφορετικών περιπτώσεων χρωματογραφημάτων αλληλούχησης του κωδικόνιου 197 (CCG) του ALS γονιδίου. SS, καμία αντικατάσταση νουκλεοτιδίου (μονές κορυφές); RR, αντικατάσταση του ίδιου νουκλεοτιδίου και στα δύο αλληλόμορφα 66

8 7 γονίδια (μονές κορυφές); RS, αντικατάσταση νουκλεοτιδίου μόνο στο ένα αλληλόμορφο γονίδιο (διπλή κορυφή); R1R2, αντικατάσταση διαφορετικού νουκλεοτιδίου σε κάθε αλληλόμορφο γονίδιο (διπλές κορυφές). Μπλε κορυφή, κυτοσίνη (C); κόκκινη κορυφή, θυμίνη (T); πράσινη κορυφή, αδενίνη (A); μαύρη κορυφή,γουανίνη (G). Πίνακας 5. Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron στη δράση του ενζύµου ALS. 68 Πίνακας 6. Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του ζιζανιοκτόνου mesosulfuron στη δράση του ενζύµου ALS. 69 Πίνακας 7. Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του ζιζανιοκτόνου tribenuron στη δράση του ενζύµου ALS. 69 Πίνακας 8. Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του ζιζανιοκτόνου imazamox στη δράση του ενζύµου ALS. 70 Πίνακας 9. Τιμές Ι 50, 95% όρια εμπιστοσύνης (ΟΕ), τιμές b, υπολογισθείσες τιμές της έντασης της ανθεκτικότητας (R/S), άθροισμα τετραγώνων σφαλμάτων των προβλεφθεισών τιμών (ΑΤΣ) και η τιμή P για τον έλεγχο του Runs για το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron. 71 Πίνακας 10. Τιμές Ι 50, 95% όρια εμπιστοσύνης (ΟΕ), τιμές b, υπολογισθείσες τιμές της έντασης της ανθεκτικότητας (R/S), άθροισμα τετραγώνων σφαλμάτων των προβλεφθεισών τιμών (ΑΤΣ) και η τιμή P για τον έλεγχο του Runs για το ζιζανιοκτόνο mesosulfuron. 72 Πίνακας 11. Τιμές Ι 50, 95% όρια εμπιστοσύνης (ΟΕ), τιμές b, υπολογισθείσες τιμές της έντασης της ανθεκτικότητας (R/S), άθροισμα τετραγώνων σφαλμάτων των προβλεφθεισών τιμών (ΑΤΣ) και η τιμή P για τον έλεγχο του Runs για το ζιζανιοκτόνο tribenuron. 72 Πίνακας 12. Τιμές Ι 50, 95% όρια εμπιστοσύνης (ΟΕ), τιμές b, υπολογισθείσες τιμές της έντασης της ανθεκτικότητας (R/S), άθροισμα τετραγώνων σφαλμάτων των προβλεφθεισών τιμών (ΑΤΣ) και η τιμή P για τον έλεγχο του Runs για το ζιζανιοκτόνο imazamox. 72 Πίνακας 13. Τιμές I 50, όρια εμπιστοσύνης (ΟΕ), τιμές b, υπολογισθείσες τιμές 76

9 8 έντασης της ανθεκτικότητας (RF), άθροισμα τετραγώνων σφαλμάτων των προβλεφθεισών τιμών (ΑΤΣ) και συντελεστής συσχέτισης R2 για το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron. Πινάκας 14. Τιμές I 50, όρια εμπιστοσύνης (ΟΕ), τιμές b, υπολογισθείσες τιμές έντασης της ανθεκτικότητας (RF), άθροισμα τετραγώνων σφαλμάτων των προβλεφθεισών τιμών (ΑΤΣ) και συντελεστής συσχέτισης R2 για το ζιζανιοκτόνο tribenuron. 76

10 9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Επιθυμώ να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό, για την αμέριστη συμπαράσταση που έδειξε στην προσπάθειά μου να εκπονήσω τη μεταπτυχιακή μου διατριβή. Ειδικότερα, τον ευχαριστώ για την ανάθεση, το σχεδιασμό και την εποπτεία των πειραμάτων, τη βοήθειά του κατά την ερμηνεία των δεδομένων, καθώς επίσης και για τις πολύτιμες οδηγίες και υποδείξεις κατά τη διάρκεια της συγγραφής αυτής της εργασίας, οι οποίες ήταν καθοριστικές για την πληρότητά της ως προς το περιεχόμενο, τη δομή και την παρουσίασή της. Θερμές ευχαριστίες εκφράζονται επίσης και στους κ. κ. Χρήστο Δόρδα, επίκουρο καθηγητή του Α.Π.Θ. (Γεωπονική Σχολή) και Ιωάννη Τσιάλτα, Λέκτορα του Α.Π.Θ. (Γεωπονική Σχολή), μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Ευχαριστώ το διδάκτορα του Α.Π.Θ. κ. Νικόλαο Καλούμενο για τις πολύτιμες υποδείξεις και τη βοήθειά του κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων, αλλά και για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις του. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τη συνάδελφο γεωπόνο Ευγενία Νταλιάνη για την άριστη συνεργασία κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου και ιδιαίτερα τον σύζυγό μου για την ενθάρρυνση και αμέριστη συμπαράστασή τους καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής.

11 10 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σε πειράματα εργαστηρίου διερευνήθηκε ο μηχανισμός ανθεκτικότητας και η δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS από επτά (7) ανθεκτικούς πληθυσμούς και από ένα (1) ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin.) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron. Ειδικότερα, έγινε αλληλούχηση του ALS γονιδίου από τους προαναφερθέντες πληθυσμούς για την παρουσία ή μη σημειακών μεταλλάξεων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα και τη δράση του ενζύμου ALS. Η αλληλούχηση του ALS γονιδίου έδειξε σημειακές μεταλλάξεις σε τέσσερις μόνον από τους επτά ανθεκτικούς πληθυσμούς και συγκεκριμένα στο κωδικόνιο (CCG) του αμινοξέος προλίνη 197 (Pro197) [αρίθμηση με βάση το γένωμα του φυτικού είδους Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]. Ειδικότερα, για τους τέσσερις πληθυσμούς διαπιστώθηκαν μεταλλάξεις στην πρώτη, δεύτερη και δεύτερη και τρίτη βάση του κωδικονίου. Οι μεταλλάξεις αυτές είχαν ως συνέπεια την αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 από διαφορετικά αμινοξέα. Συγκεκριμένα, σε τέσσερα φυτά δύο πληθυσμών διαπιστώθηκε αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 από αλανίνη (Ala), ενώ σε δύο φυτά ενός πληθυσμού διαπιστώθηκε αντικατάσταση της Pro197 από λευκίνη (Leu). Σε δύο φυτά ενός πληθυσμού διαπιστώθηκαν δύο ταυτόχρονες μεταλλάξεις όπου στην πρώτη περίπτωση οδήγησε στην αντικατάσταση της Pro197 από λευκίνη (Leu), ενώ στην δεύτερη περίπτωση δεν επέτρεψε τον ακριβή προσδιορισμό του αμινοξέος αντικατάστασης [πιθανολογείται αντικατάσταση της Pro197 από ιστιδίνη (His) ή την γλυκίνη (Gln)]. Οι μεταλλάξεις διαπιστώθηκαν στο ένα μόνο αλληλόμορφο (R/S ετεροζυγωτία) κάποιων φυτών ή και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια (R/R ομοζυγωτία, R1/R2 ετεροζυγωτία). Η καταλυτική δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS επτά ανθεκτικών πληθυσμών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας αξιολογήθηκε παρουσία έξι (6) συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron, tribenuron και imazamox. Για το σκοπό αυτό, εκχυλίστηκαν οι πρωτεΐνες από φυτά των προαναφερθέντων πληθυσμών και ακολούθως έγινε ποσοτικός προσδιορισμός φασµατοφωτοµετρικά µε μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 520 nm (A520nm). Τα δεδομένα, πριν την ανάλυση, εκφράστηκαν ως ποσοστό της απορρόφησης των πρωτεϊνών των φυτών του μάρτυρα (αντίδραση απουσία ζιζανιοκτόνου). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με σκοπό την εξεύρεση της εξίσωσης που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ συγκέντρωσης του

12 11 ζιζανιοκτόνου και της δράσης του ενζύμου ALS, ενώ στη συνέχεια υπολογίστηκε για κάθε πληθυσμό η συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου που προκαλεί μείωση της δράσης του ενζύμου ALS κατά 50% (τιμή I 50 ). Ακολούθως, υπολογίστηκε η ένταση ανθεκτικότητας (R/S) ως το κλάσμα της I 50 τιμής των ανθεκτικών πληθυσμών ως προς την αντίστοιχη I 50 τιμή του ευαίσθητου πληθυσμού. H μεγαλύτερη ένταση ανθεκτικότητας (R/S) των πληθυσμών με σημειακή μετάλλαξη καταγράφηκε για τα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron (R/S = 51->320) και tribenuron (R/S = 3->110), ενώ οι μικρότερες τιμές υπολογίσθηκαν για το mesosulfuron (R/S = 6-9) και imazamox (R/S = 0,7-2). Για τους ανθεκτικούς πληθυσμούς χωρίς μετάλλαξη, οι αντίστοιχες τιμές R/S ήταν κοντά στη μονάδα για τα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron, ενώ μικρότερες ήταν για το tribenuron (R/S = 0,3-0,6) και το imazamox (R/S = 0,3-0,5). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 από Ala, Leu, Gln ή His είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS (σταυρανθεκτικότητα) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, tribenuron και mesosulfuron, ενώ οι ίδιες αντικαταστάσεις δεν επηρέασαν την ευαισθησία του ALS ενζύμου στο ζιζανιοκτόνο imazamox. Αυτό σημαίνει ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία των πληθυσμών της ήρας στις σουλφονυλουρίες (chlorsulfuron και mesosulfuron) αλλά όχι στις ιμιδαζολινόνες (imazamox). Αντιθέτως, η παρόμοια ευαισθησία του ALS ενζύμου των τριών ανθεκτικών πληθυσμών χωρίς σημειακή μετάλλαξη σε σύγκριση με εκείνη του ευαίσθητου πληθυσμού ήταν αναμενόμενη λόγω της απουσίας μετάλλαξης (ευαίσθητο ένζυμο ALS). Ο μηχανισμός ανθεκτικότητας των προαναφερθέντων ανθεκτικών βιοτύπων χωρίς σημειακή μετάλλαξη μελετήθηκε μέσω βιοδοκιμής σπόρων σε τριβλία Petri όπου αξιολογήθηκαν τρεις πληθυσμοί ήρας (ένας ανθεκτικός πληθυσμός με διαπιστωμένη μετάλλαξη της Pro197 από αλανίνη, ένας ανθεκτικός πληθυσμός χωρίς σημειακή μετάλλαξη και ένας ευαίσθητος πληθυσμός) για πιθανότητα ύπαρξης μηχανισμού ανθεκτικότητας λόγω καταλυτικής δράσης των CytΡ450 μονοξυγονασών. Ειδικότερα, σπόροι των τριών πληθυσμών τοποθετηθήκαν σε αιωρήματα των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron ή tribenuron με ή χωρίς malathion και ακολούθως μετρήθηκε το μήκος των ριζών των σποροφύτων σε κάθε τριβλίο και, πριν την ανάλυση των δεδομένων, αυτό εκφράστηκε ως % του μάρτυρα. Ακολούθως υπολογίστηκε για κάθε πληθυσμό η συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου, παρουσία ή απουσία του malathion, που προκαλεί μείωση του μήκους της ρίζας του ζιζανίου κατά

13 12 50% (τιμή I 50 ). Οι τιμές αυτές στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της έντασης ανθεκτικότητας κάθε πληθυσμού (R/S1 = I 50 τιμή του ανθεκτικού πληθυσμού προς την αντίστοιχη I 50 τιμή του ευαίσθητου πληθυσμού και R/S2 = I 50 τιμή του πληθυσμού απουσία malathion ως προς την αντίστοιχη τιμή I 50 παρουσία malathion). Η παρουσία του malathion μείωσε σημαντικά τις τιμές I 50 των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron και tribenuron για τον ευαίσθητο και τον ανθεκτικό πληθυσμό χωρίς σημειακή μετάλλαξη. Ειδικότερα, για το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron και για τον ευαίσθητο και ανθεκτικό πληθυσμό χωρίς σημειακή μετάλλαξη, οι τιμές I 50 παρουσία malathion ήταν 1,8 και 11,8 φορές μικρότερες από τις αντίστοιχες τιμές απουσία του malathion, ενώ οι αντίστοιχες τιμές I 50 για το ζιζανιοκτόνο tribenuron ήταν 4,1 και 6,7 φορές μικρότερες από τις αντίστοιχες τιμές απουσία του malathion. Αντιθέτως, για τον πληθυσμό με σημειακή μετάλλαξη, οι τιμές I 50 για chlorsulfuron και tribenuron με malathion ήταν 1,1 και 1,8 φορές μικρότερες από τις αντίστοιχες τιμές απουσία του malathion. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η ανθεκτικότητα του πληθυσμού χωρίς σημειακή μετάλλαξη οφείλεται στην παρουσία μηχανισμού μεταβολισμού του συγκεκριμένου ζιζανιοκτόνου από ένζυμα CytP450 μονοξυγονάσες. Επίσης, τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η προσθήκη του εντομοκτόνου malathion κατά την εφαρμογή των δύο ζιζανιοκτόνων αυξάνει την αποτελεσματικότητά τους εναντίον των ευαίσθητων πληθυσμών της ήρας.

14 13 SUMMARY Laboratory experiments were conducted to study one susceptible (S) and seven resistant (R) rigid ryegrass (Lolium rigidum Gaudin.) populations for possible existence of point mutations in their ALS gene (DNA sequencing), which are responsible for ALS resistance to herbicides chlorsulfuron and mesosulfuron. The ALS sequencing showed mutations only in four R populations and particularly in the codon (CCG) 197 (Pro197) [numbering based on Arabidopsis thaliana (L.) Heynh sequence]. More specifically, mutations were found at the first, second, and second and third base of this codon, and these mutations resulted in the substitution of Pro by one of four different amino acids. In particular, four plants of two R populations had substitution of the Pro197 by alanine (Ala), whereas two plants of the third R population had substitution at the same amino acid by leucine (Leu). However, two plants of the fourth R population had two mutations simultaneously. Regarding the later, in the first case one plant had substitution by leucine (Leu), whereas in the second case it was impossible to determine accurately the amino acid substitution but it is possible that Pro197 was substituted by histidine (His) or glycine (Gln). The previously mentioned mutations were found either in one allele (R/S heterozygosity) or in both alleles (R/R homozygosity, R1/R2 heterozygosity). ALS in vitro experiments were also conducted to study the activity of the ALS enzyme (protein fraction showing ALS activity) extracted from one S and seven R rigid ryegrass populations in the presence of six (6) concentrations of chlorsulfuron, mesosulfuron, tribenuron or imazamox. The extracted protein fraction with ALS activity was used to catalyze the condensation of two pyruvate molecules to form acetolactate. The data obtained (absorption at Α520 nm) from the conducted tests were expressed as percentage (%) of the absorption recorded for the control samples (absorption in samples without herbicide). Then, the obtained data were used for regression analysis (herbicide concentration vs ALS activity) and the concentration of each herbicide that causes 50% reduction of the ALS activity (I 50 value) was estimated for each population. The estimated I 50 values were used to calculate the resistance factor (R/S) as the ratio of the I 50 value of the R population divided by the respective I 50 value of the S population. The highest resistance factor was estimated for the herbicide chlorsulfuron (R/S = 51->320) and tribenuron (R/S = 3->110), the moderate for mesosulfuron (R/S = 6-9) and the lowest was estimated for imazamox (R/S = 0,7-

15 14 2). These data indicated that the Pro197 substitution by Ala, Leu, Gln, Arg or His resulted in reduced ALS sensitivity to the herbicides chlorsulfuron, tribenuron and mesosulfuron, but it did not affect the ALS sensitivity to herbicide imazamox. Therefore, these results clearly suggest that the detected in four populations amino acid substitution at the codon 197 (Pro197) was related with high ALS resistance to sulfonylurea (chlorsulfuron, tribenuron and mesosulfuron) but not to imidazolinone (imazamox) herbicides. However, the similar ALS sensitivity recorded in three R populations as compared with that of the S population could be attributed to the confirmed absence of ALS mutation. Petri dishes bioassay tests including one R rigid ryegrass population with Pro197- Ala substitution, one partially R population (with no point mutation) and one S population were conducted to investigate the possible existence of the CytP450-based metabolism herbicide resistance. Seeds were placed in suspensions of chlorsulfuron or tribenuron in the absence and presence of the insecticide malathion. The root length of the seedlings was measured and the data obtained (expressed as percentage (%) of the control sample) were used for regression (herbicide concentration vs root lentgh) analysis. Then, the concentration of each herbicide that causes 50% reduction of root length for each population was estimated, and these I 50 values were used to calculate the resistance factor (R/S, the I 50 value of the R population was divided by the respective I 50 value of the S population) in the presence or absence of malathion. The results indicated that the presence of malathion in the partially R (no point mutation) population resulted in 11.8 and 6.7 times lower resistant factor (R/S) for chlorsulfuron and tribenuron than their respective values in the absence of malathion. These findings suggest that the resistance of this population is due to herbicide metabolism by the CytP450 monooxygenases.

16 15 1. Εισαγωγή 1.1. Γενική εισαγωγή Η ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin.) είναι ετήσιο ζιζάνιο που απαντάται με μεγάλη συχνότητα κυρίως στις καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών και δευτερευόντως σε άλλες χειμερινές και πρώιμες ανοιξιάτικες καλλιέργειες (Ελευθεροχωρινός και Γιαννοπολίτης, 2009). Η προσαρμοστικότητά της σε μεγάλο εύρος οικολογικών συνθηκών αλλά και η γενετική της παραλλακτικότητα την καθιστούν ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα ζιζάνια παγκοσμίως (Delye κ.ά., 2009). Η αντιμετώπιση αυτού του ζιζανίου είναι απαραίτητη επειδή σε μεγάλες πυκνότητες προκαλεί μείωση της απόδοσης των καλλιεργειών μέχρι και 50% (Beckie, 2006; Preston και Powles, 2002; Wu κ.ά., 1998). Η αντιμετώπιση της ήρας εντός των χειμερινών σιτηρών βασίζεται αποκλειστικά στη χρήση ζιζανιοκτόνων επειδή αυτά είναι πιο αποτελεσματικά αλλά και πιο οικονομικά σε σύγκριση με άλλες μεθόδους αντιμετώπισης των ζιζανίων (Wilson κ.ά., 1995). Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιούνται ευρέως για την αντιμετώπιση πλατύφυλλων, αλλά και αγρωστωδών ζιζανίων και ειδικότερα της ήρας στα χειμερινά σιτηρά είναι αυτά που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση [AcetoLactate Synthase (ALS), EC ]. Η ομάδα των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS αναπτύχθηκε το 1977, ενώ η πρώτη δραστική ουσία (chlorsulfuron) πήρε έγκριση κυκλοφορίας για χρήση το Η ανάπτυξη αυτών των ζιζανιοκτόνων θεωρείται ως ένα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα στην ιστορία της ζιζανιολογίας, αφού συνέβαλε καθοριστικά στην αποτελεσματική αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε πολλές καλλιέργειες και μάλιστα με τη μικρότερη επιβάρυνση στον άνθρωπο και στο περιβάλλον (Tranel και Wright, 2002). Ο εφησυχασμός των περισσότερων παραγωγών εξαιτίας της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης των ζιζανίων με τη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων και κυρίως η εμμονή τους για συνεχή και μη εναλλασσόμενη (με ζιζανιοκτόνα διαφορετικού μηχανισμού δράσης) χρήση τους αύξησε την πιθανότητα ανάπτυξης βιοτύπων-πληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Tranel και Wright, 2002). Έτσι, οι πρώτοι βιότυποι-πληθυσμοί ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ενζύμου ALS καταγράφηκαν στις Η.Π.Α. πέντε χρόνια μετά τη συνεχή χρήση τους (Preston και Mallory-Smith, 2001).

17 16 Ακολούθως, η ανάπτυξη νέων ανθεκτικών βιότυπων-πληθυσμών ήταν ταχύτατη με αποτέλεσμα να έχουν καταγραφεί παγκοσμίως μέχρι σήμερα 345 περιπτώσεις ανθεκτικότητας σε 116 είδη ζιζανίων, τα οποία υπερβαίνουν σε αριθμό το 50% όλων των ειδών (201) που ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα (Heap, 2012). Η ταχύτατη αύξηση των ανθεκτικών βιοτύπων-πληθυσμών στα ζιζανιοκτόνααναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS είχε ως συνέπεια την αύξηση του ενδιαφέροντος και κυρίως της ανησυχίας της παγκόσμιας ζιζανιολογικής κοινότητας. Αυτό ήταν αναμενόμενο αφού η ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων περιορίζει σημαντικά τη δυνατότητα επιλογής των ζιζανιοκτόνων και δημιουργεί ως εκ τούτου προϋποθέσεις για μείωση των αποδόσεων και υποβάθμιση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων (Ελευθεροχωρινός, 2008; Tranel και Wright, 2002). Η πρώτη αναφορά ανάπτυξης ανθεκτικότητας ζιζανίου στην Ελλάδα έγινε το 1986 και αφορούσε την αδυναμία αντιμετώπισης πληθυσμών του ζιζανίου μουχρίτσα [Echinochloa crus-galli (L.) Beauv] με το ζιζανιοκτόνο propanil (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ) (Heap, 2012). Έκτοτε, έχουν αναφερθεί άλλοι 78 βιότυποι-πληθυσμοί (ανήκουν σε εννέα είδη) ζιζανίων με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ, της δράσης του ενζύμου καρβοξυλάση του ακέτυλο-coa (ACCase), της δράσης του ενζύμου ALS ή της δράσης του ενζύμου EPSPS (Βασιλείου κ.ά., 2006; Γιαννοπολίτης κ.ά., 2008; Ελευθεροχωρινός και Παπαμιχαήλ, 2002; Eleftherohorinos κ.ά., 2000; Ευθυμιάδης κ.ά., 2008; Giannopolitis και Vassiliou, 1989; Heap, 2012; Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2009; Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2008; Kotoula-Syka κ.ά., 2000; Παπαπαναγιώτου κ.ά., 2008; Vasilakoglou κ.ά., 2000) Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Η αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος προέκυψε κατά την καλλιεργητική περίοδο του 2004 και ειδικότερα μετά από παράπονα παραγωγών για μειωμένη αποτελεσματικότητα του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron εναντίον της ήρας. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε επίσκεψη στις σιτοπαραγωγικές περιοχές των νομών Σερρών, Θεσσαλονίκης και Κιλκίς όπου παρατηρήθηκε το πρόβλημα και αποφασίστηκε κατά την θερινή περίοδο του ίδιου έτους και πριν από την συγκομιδή των χειμερινών σιτηρών να γίνει συλλογή σπόρου ήρας από αγρούς όπου η εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου δεν ήταν αποτελεσματική. Εκτεταμένος έλεγχος για την ανάπτυξη

18 17 ανθεκτικότητας με πειράματα φυτοδοχείων, αλλά και με βιοδοκιμές έδειξε ότι πέντε πληθυσμοί ήρας ήταν ανθεκτικοί στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron και ισάριθμοι πληθυσμοί στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim. Όλοι οι ανθεκτικοί πληθυσμοί προέρχονταν από σιτοπαραγωγικές περιοχές του νομού Θεσσαλονίκης (Βασιλείου κ.ά., 2006). Η μελέτη για ανάπτυξη σταυρανθεκτικότητας και πολλαπλής ανθεκτικότητας οδήγησε στο συμπέρασμα ότι τρεις πληθυσμοί ήταν σταυρανθεκτικοί στο μίγμα mesosulfuron + iodosulfuron, έξι είχαν αναπτύξει πολλαπλή ανθεκτικότητα στο clodinafop-propargyl και ένας στο diclofop-methyl (Ευθυμιάδης κ.ά., 2008). Κατά την θερινή περίοδο του 2008 πραγματοποιήθηκε νέα δειγματοληψία από σιτοπαραγωγικές περιοχές του νομού Χαλκιδικής και συγκεκριμένα από αγρούς όπου διαπιστώθηκε μειωμένη αποτελεσματικότητα του chlorsulfuron ή του μίγματος mesosulfuron + iodosulfuron. Ο προκαταρτικός έλεγχος με πειράματα φυτοδοχείων έδειξε ότι οι έξι νέοι πληθυσμοί ήταν σταυρανθεκτικοί στο chlorsulfuron και στο μίγμα mesosulfuron + iodosulfuron (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Τα όσα προαναφέρθηκαν κατέστησαν αναγκαία τη διεξαγωγή της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής όπου διερευνήθηκε ο μηχανισμός ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών του ζιζανίου ήρα στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS. Ειδικότερα, έγιναν πειράματα αλληλούχησης τμήματος του ALS γονιδίου με σκοπό τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων που οδηγούν σε αντικαταστάσεις αμινοξέων στο ένζυμο ALS, οι οποίες είναι υπεύθυνες για μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του. Επίσης, αξιολογήθηκε η δράση του ενζύμου ALS από τέσσερις (4) ανθεκτικούς (με σημειακή μετάλλαξη) και τρεις (3) μετρίως ανθεκτικούς πληθυσμούς (χωρίς σημειακή μετάλλαξη) στο chlorsulfuron από το νομό Θεσσαλονίκης καθώς και από έναν (1) ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου (από το αγρόκτημα του Α.Π.Θ.) παρουσία των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron, tribenuron (σουλφονυλουρίες) και imazamox (ιμιδαζολινόνη). Τέλος, για τη διερεύνηση πιθανής ύπαρξης μηχανισμού ανθεκτικότητας λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων, μελετήθηκε η επίδραση του εντομοκτόνου malathion (ισχυρού αναστολέα των CytP450 μονοξυγονασών υπεύθυνων για τον μεταβολισμό του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron) στην ένταση ανθεκτικότητας ενός ανθεκτικού πληθυσμού [με διαπιστωμένη μετάλλαξηαντικατάσταση της προλίνης 197 (Pro 197 ) από αλανίνη (Ala) του ενζύμου ALS], ενός μετρίως ανθεκτικού πληθυσμού (χωρίς μετάλλαξη στο γονίδιο ALS) και του ευαίσθητου πληθυσμού από το αγρόκτημα του A.Π.Θ.

19 18 2. Ανασκόπηση Βιβλιογραφίας 2.1. Βιολογία του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin) Το Lolium rigidum Gaudin (ήρα λεπτή) είναι ένα από τα οκτώ αναγνωρισμένα είδη του γένους Lolium που ανήκει στα 339 περίπου γένη της οικογένειας Poaceae. Το γένος Lolium είναι γηγενές της Ευρώπης, της Βόρειας Αφρικής και της Ασίας, αλλά πληθυσμοί του βρίσκονται σε όλες τις εύκρατες περιοχές του πλανήτη. Είναι διπλοειδές με χρωμοσωμικό αριθμό 2n=14 (Bennett, 1997). Πίνακας 1. Βοτανική Κατάταξη του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin) ΒΑΣΙΛΕΙΟ ΥΠΟΒΑΣΙΛΕΙΟ Phylum ΔΙΑΙΡΕΣΗ ΚΛΑΣΗ ΥΠΟΚΛΑΣΗ ΤΑΞΗ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΓΕΝΟΣ ΕΙΔΟΣ Plantae Tracheobionta Spermatophyta Magnoliophyta Liliopsida Commelinidae Cyperales Poaceae Lolium Lolium rigidum Gaudin Τα πιο κοινά είδη του γένους Lolium στην Ευρώπη είναι το πολυετές Lolium perenne L. και τα μονοετή Lolium rigidum Gaudin. και Lolium multiflorum Lam.. Όλα τα είδη και τα υβρίδιά τους είναι σταυρογονιμοποιούμενα και έχουν μεγάλη μορφολογική παραλλακτικότητα. Επιπλέον, τα είδη Lolium διασταυρώνονται με είδη από τα συγγενικά τους γένη Festuca και Vulpia (Delye κ.ά., 2009). Το Lolium rigidum Gaudin. (ήρα λεπτή) είναι ετήσιο, χειμερινό, αγρωστώδες (μονοκοτυλήδονο) είδος με ευρεία προσαρμοστικότητα. Φυτρώνει ως ζιζάνιο από το φθινόπωρο μέχρι την άνοιξη σε χειμερινά καλλιεργούμενα φυτά και σε μη καλλιεργούμενες περιοχές. Τα φυτά που εμφανίζονται νωρίς στην καλλιεργητική περίοδο ανταγωνίζονται έντονα την καλλιέργεια και προκαλούν μεγάλη μείωση της παραγωγής, και συγκεκριμένα η παρουσία 200 φυτών ήρας ανά m 2 μπορεί να προκαλέσει 50% μείωση της απόδοσης σε καλλιέργεια σιταριού (Wu et al., 1998). Η

20 19 άριστη θερμοκρασία φυτρώματος των σπόρων είναι 11 ο C (Cook κ.ά., 2005), ενώ η φυτρωτική ικανότητα των σπόρων που βρίσκονται σε βάθος μεγαλύτερο των 2 cm είναι μικρή. Βέβαια, η φυτρωτική τους μειώνεται σημαντικά αν παραμείνουν σε βάθος cm για περισσότερο από δύο χρόνια (Cheam και Lee, 2005). Εικόνα 1. Ταξιανθία, ωτίδια και σπόροι του ζιζανίου ήρα. Τα φυτά της ήρας έχουν συνήθως πολλά αδέλφια και το ύψος τους, σε πλήρη ανάπτυξη, υπερβαίνει τα 90 cm. Ο βλαστός τους είναι κυλινδρικός, τραχύς με ημιπλάγια-όρθια έκφυση. Ο κολεός των φύλλων είναι ωχρο-κίτρινος, τραχύς και χωρίς τρίχες. Τα ωτίδια είναι στενά, μεγάλα και περιβάλλουν τον κολεό. Το γλωσσίδιο είναι βραχύ, μεμβρανώδες και τριγωνικό. Το έλασμα των φύλλων είναι τραχύ στην κάτω επιφάνεια και γυαλιστερό στην άνω (χαρακτηριστικό μακροσκοπικής αναγνώρισης της ήρας). Τα φύλλα των νεαρών φυτών είναι στενά και όρθια. Η ταξιανθία είναι επιμήκης στάχυς, στενός και λεπτός. Τα σταχύδια είναι πολυανθή (4-8 ανθίδια), επιμήκη, λογχοειδή και τοποθετημένα στη ράχη του στάχεος αραιά και με τη στενή πλευρά. Ο χιτώνας των ανθιδίων δεν καταλήγει σε άγανο (Ελευθεροχωρινός και Γιαννοπολίτης, 2009) (Εικόνα 1). Τα φυτά ανθίζουν από Απρίλιο μέχρι Ιούνιο και η άνθιση δεν επηρεάζεται

21 20 σημαντικά από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Κάθε φυτό ήρας μπορεί να παράγει μέχρι 1000 σπόρους, οι οποίοι αρχικά είναι προσκολλημένοι στην ταξιανθία. Οι σπόροι όταν αποκολληθούν από την ταξιανθία, λόγω του μικρού τους βάρους, μετακινούνται πολύ εύκολα με τον άνεμο, το νερό και τα ζώα (Stanton κ.ά., 2002). Οι σπόροι, μετά την ωρίμανσή τους, παραμένουν σε λήθαργο για 8-9 εβδομάδες. Το 70% των σπόρων στο έδαφος φυτρώνει μετά τον λήθαργο και το υπόλοιπο μέσα σε τρία χρόνια (Stanton, 2007). Οι περιβαλλοντικές συνθήκες κατά την ωρίμανση των σπόρων επηρεάζουν σημαντικά τη διάρκεια του ληθάργου. Οι υψηλές θερμοκρασίες και η υδατική καταπόνηση κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των σπόρων έχουν ως αποτέλεσμα μικρότερο αριθμό σπόρων με μικρότερο βάρος και μικρότερη διάρκεια ληθάργου. Επίσης, η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε ορισμένα ζιζανιοκτόνα μπορεί να επηρεάσει το λήθαργο. Ορισμένοι μηχανισμοί ανθεκτικότητας των φυτών, όπως η τροποποίηση της θέσης δράσης στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων, οδηγούν σε αύξηση του ληθάργου των σπόρων και μείωση της φυτρωτικής τους ικανότητας (Vila-Aiub κ.ά., 2005). Η ήρα λεπτή απαντάται στο 69% χειμερινών σιτηρών στην Αυστραλία και είναι το ζιζάνιο που προκαλεί τη μεγαλύτερη οικονομική ζημία (Delye κ.ά., 2009; Lemerle κ.ά., 1996; Preston και Powles, 2002; Yu κ.ά., 2008). Επίσης, αυτό το είδος αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στις καλλιέργειες ελαιοκράμβης (Brassica napus L.), αφού απαντάται στο 86% περίπου των αγρών (Lemerle κ.ά., 1999). Επίσης, η ήρα αποτελεί ξενιστή παθογόνων όπως του βακτηρίου Rathayibacter toxicus, του μύκητα Ergot fungus και του μύκητα Rhizoctonia fungus (Stanton, 2007). Αναπτύσσεται σε όλες τις περιοχές του κόσμου με μεσογειακό κλίμα, ενώ στην Ελλάδα αποτελεί το δεύτερο, μετά την αγριοβρώμη, σημαντικό πρόβλημα στις καλλιέργειες των χειμερινών σιτηρών. Η αντιμετώπισή της στη χώρα μας γίνεται με δυσκολία λόγω της ανάπτυξης ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα με πολλαπλούς μηχανισμούς δράσης (Kotoula-Syka κ.ά., 2000) Ορισμοί-Ορολογία Η ανθεκτικότητα ορίζεται ως η επιλεγμένη κληρονομούμενη ικανότητα μερικών βιοτύπων ενός ζιζανίου να επιβιώνουν και να αναπαράγονται μετά από εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης ενός ζιζανιοκτόνου, στο οποίο ο αρχικός πληθυσμός του ζιζανίου ήταν ευαίσθητος (De Prado και Franco, 2004; Ελευθεροχωρινός, 2008). Γενικώς, οι

22 21 ανθεκτικοί βιότυποι ενός ζιζανίου προϋπάρχουν στους αρχικούς πληθυσμούς και εμφανίζονται όταν υπάρξει υψηλή και συνεχής πίεση επιλογής (Holt κ.ά., 1993). Η πρώτη επίσημη αναφορά τεκμηριωμένης ανθεκτικότητας παγκοσμίως έγινε το 1968 στην Ουάσιγκτον των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής και αφορούσε πληθυσμούς του ζιζανίου Senecio vulgaris L. ανθεκτικούς στις τριαζίνες (Tranel και Wright, 2002). Ο όρος αντοχή αναφέρεται στην αρχική διαβαθμισμένη ή κλιμακούμενη (λόγω παραλλακτικότητας) µη ευαισθησία ενός ζιζανίου στη συνιστώμενη δόση ενός ζιζανιοκτόνου (Devine κ.ά., 1993; Ελευθεροχωρινός, 2008; Holt, 1993). Η σταυρανθεκτικότητα (διασταυρωτή ανθεκτικότητα) ορίζεται ως η ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε περισσότερα από ένα ζιζανιοκτόνα που ανήκουν στην ίδια ή σε διαφορετικές οικογένειες (χημικές ομάδες) µε ίδιο μηχανισμό δράσης ή μεταβολισμού. Η ανθεκτικότητα αυτής της μορφής ελέγχεται από ένα γονίδιο (Ελευθεροχωρινός, 2008; Rubin, 1997). Η πολλαπλή ανθεκτικότητα ορίζεται ως η ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε περισσότερα από ένα ζιζανιοκτόνα που ανήκουν σε οικογένειες με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης ή μεταβολισμού (Ελευθεροχωρινός, 2008) Αντιμετώπιση του ζιζανίου ήρα Η καταπολέμηση του ζιζανίου ήρα επιτυγχάνεται με τη χρήση καλλιεργητικών μεθόδων, βιολογικών μέσων ή/και ζιζανιοκτόνων. Τα καλλιεργητικά μέτρα περιλαμβάνουν την επιλογή ανταγωνιστικών καλλιεργειών, την κατεργασία του εδάφους και την πυκνότερη σπορά των καλλιεργούμενων φυτών. Οι πιο ανταγωνιστικές καλλιέργειες στην ανάπτυξη της ήρας είναι το κριθάρι, το σιτάρι και η ελαιοκράμβη, ενώ λιγότερο ανταγωνιστικά είναι τα ψυχανθή. Η κατεργασία του εδάφους αυξάνει τον αριθμό των ζιζανίων που φυτρώνουν και επιτρέπει την καταπολέμησή τους όταν βρίσκονται σε μικρό στάδιο ανάπτυξης. Όμως, ορισμένα είδη έχοντας προσαρμόσει το χρόνο ληθάργου τους και τα χαρακτηριστικά του ριζικού τους συστήματος δεν επηρεάζονται από την κατεργασία του εδάφους (Nalewaja, 1999). Η αύξηση της πυκνότητας των καλλιεργούμενων φυτών είναι το αποτελεσματικότερο καλλιεργητικό μέτρο, επειδή αυξάνει την ανταγωνιστικότητά τους εναντίον των ζιζανίων και αυξάνει ως εκ τούτου την απόδοση της καλλιέργειας (Beckie, 2006).

23 22 Η εμφάνιση των ζιζανιοκτόνων ως μέσων αντιμετώπισης των ζιζανίων είχε ως συνέπεια την εξ ολοκλήρου στροφή των παραγωγών στη χρήση τους επειδή αποδείχθηκαν ως η αποτελεσματικότερη και οικονομικότερη μέθοδος. Η χημική καταπολέμηση της ήρας γίνεται με δινιτροανιλίνες (trifularin), αρυλοξυφαινοξυαλκανοικά (diclofop methyl, clodinafop-propargyl), κυκλοεξανδιόνες (tralkoxydim), φαινυλοπυροζολίνες (pinoxaden), τριαζολοπυριμιδίνες (pyroxsulam) σουλφονυλουρίες (chlorsulfuron, triasulfuron, mesosulfuron), ιμιδαζολινόνες (imazamox), τριαζίνες, γλυκίνες (glyphosate) και διπυριδίλια (paraquat). Οι σουλφονυλουρίες, καθώς και όλα τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (AcetoLactate Synthase, ALS) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρύτατα στην καταπολέμηση της ήρας. Ειδικότερα, στην ομάδα αυτών των ζιζανιοκτόνων, εκτός από τις σουλφονυλουρίες, ανήκουν οι ιμιδαζολινόνες, τα πυριµιδινυλθειοβενζοϊκά, οι τριαζολοπυριμιδίνες και οι σουλφονυλαμινοκαρβονυλτριαζολινόνες. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά και οι ιδιότητες των ζιζανιοκτόνων που ανήκουν στις πέντε προαναφερθείσες οικογένειες αναφέρονται παρακάτω Σουλφονυλουρίες (Sulfonylureas) Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής συνίσταται από µία αρυλοµάδα, τη σουλφονυλουρική γέφυρα και µία ετεροκυκλική ομάδα (Σχήμα 1). Σχήμα 1. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron. Η πρώτη δραστική ουσία των σουλφονυλουριών ήταν το chlorsulfuron που ανακαλύφθηκε το Το ζιζανιοκτόνο αυτό έλαβε έγκριση κυκλοφορίας για χρήση στις ΗΠΑ και στη Μ. Βρετανία το 1982, ενώ στην Ελλάδα εγκρίθηκε το Βέβαια, δέκα χρόνια μετά την ανακάλυψη του chlorsulfuron, η οικογένεια των σουλφονυλουριών περιελάμβανε 230 δραστικές ουσίες, πολλές από τις οποίες έχουν

24 23 ήδη έγκριση για χρήση ως ζιζανιοκτόνα σε διάφορες χώρες, ενώ άλλες βρίσκονται στα τελευταία στάδια ανάπτυξής τους ως ζιζανιοκτόνα. Τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής εφαρμόζονται στο έδαφος (προφυτρωτικά) ή/και στο φύλλωμα για την αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες. Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των φυτών και μετακινούνται στους μεριστωματικούς ιστούς µέσω του αποπλάστη και του συµπλάστη και είναι δραστικά σε δόσεις φορές μικρότερες από τις αντίστοιχες άλλων ομάδων ζιζανιοκτόνων (Ελευθεροχωρινός, 2008). Ο χρόνος παραμονής μερικών ζιζανιοκτόνων των σουλφονυλουριών (chlorsulfuron, metsulfuron, triasulfuron) στο έδαφος, αν και εφαρμόζονται σε πολύ χαμηλές δόσεις (1 έως 2 g δ.ο./στρ) είναι συχνά μεγαλύτερος από 12 μήνες. Αυτό έχει ως συνέπεια την αδυναμία ασφαλούς εγκατάστασης (χωρίς προβλήματα φυτοτοξικότητας) άλλων καλλιεργειών, εκτός από χειμερινά σιτηρά (όπου συνιστάται η χρήση τους), την επόμενη καλλιεργητική περίοδο. Η βάση της εκλεκτικότητας αυτών των ζιζανιοκτόνων ως προς τα καλλιεργούμενα φυτά σιτάρι, ρύζι και καλαμπόκι είναι ο μεταβολισμός τους μέσα σε αυτά. Ο μεταβολισμός επιτυγχάνεται μέσω υδροξυλίωσης και σχηματισμού συμπλόκου με γλυκόζη. Οι αντιδράσεις μεταβολισμού καταλύονται από μονοξυγονάσες του κυτοχρώματος P450 (Corbett και Tardif, 2006) (Σχήμα 2). Σχήμα 2. Μεταβολισμός του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron εντός των φυτών (Christopher κ.ά., 1991).

25 Ιµιδαζολινόνες (Imidazolinones) Η οικογένεια αυτή των ζιζανιοκτόνων αναπτύχθηκε μετά το Το πρώτο ζιζανιοκτόνο ήταν το imazamethabenz-methyl (1971) και ακολούθησαν τα imazapyr, imazaquin, imazethapyr, imazamox και imazapic. Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής αποτελείται από έναν αρωματικό δακτύλιο (συνήθως πυριδίνη) µε την καρβοξυλική ομάδα και τον ιµιδαζολινικό δακτύλιο (Σχήμα 3). Οι ιµιδαζολινόνες, όπως και οι σουλφονυλουρίες, εφαρμόζονται στο έδαφος ή/και στο φύλλωμα των ζιζανίων. Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των φυτών και μετακινούνται στους μεριστωµατικούς ιστούς µέσω του αποπλάστη και του συµπλάστη (Ελευθεροχωρινός, 2008). Σχήμα 3. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου imazamox Τα ανθεκτικά καλλιεργούμενα φυτά δεν εμφανίζουν συμπτώματα φυτοτοξικότητας, όπως τα ευαίσθητα φυτά, επειδή έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν ταχύτατα τα ζιζανιοκτόνα αυτά σε µη τοξικές ουσίες ή να απορροφούν μικρότερες ποσότητες ή να έχουν ένζυμο ALS ή AHAS µε μειωμένη ευαισθησία στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Shaner και Mallipudi, 1991). Συγκεκριμένα για το imazamethabenz, ο μεταβολισµός από τα ανθεκτικά φυτά του σιταριού γίνεται µέσω υδροξυλίωσης και ακολούθως σχηματισμού συμπλόκου µε γλυκόζη (Ελευθεροχωρινός, 2008; Lee κ.ά., 1991). Βέβαια, οι πρόσφατες ποικιλίες σιταριού και ρυζιού (Oryza sativa L.) (ποικιλίες τύπου Clearfield ), οι οποίες δημιουργήθηκαν µέσω της επιλογής ιστοκαλλιεργειών, είναι ανθεκτικές στο ζιζανιοκτόνο imazamox επειδή έχουν γονίδιο που κωδικοποιεί εντός των φυτών ανθεκτικό στο imazamox ένζυμο ALS (Zhang κ.ά., 2006).

26 Πυριµιδινυλ(θειο)βενζοϊκά οξέα (Pyrimidinyl(thio)benzoates) Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής (bispyribac, pyrithiobac, pyriminobac, pyribenzoxim, pyrifthalid) αποτελείται από έναν πυριμιδινικό δακτύλιο ενωμένο µε βενζοϊκό οξύ µέσω S ή Ο (Σχήμα 4). Το bispyribac εφαρμόζεται κυρίως στο φύλλωμα για την αντιμετώπιση κυρίως διαφόρων ειδών του ζιζανίου μουχρίτσα (Echinochloa spp) στην καλλιέργεια του ρυζιού, ενώ το pyrithiobac εφαρμόζεται στο φύλλωμα και στο έδαφος για την αντιμετώπιση ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων στην καλλιέργεια του βαμβακιού (Gossypium hirsutum L.) (Kaloumenos κ.ά., 2005; Velentza κ.ά., 2005). Σχήμα 4. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου pyrithiobac Τριαζολοπυριµιδίνες (Triazopyrimidines) Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής (cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, pyroxsulam) αποτελείται από ένα τριαζολοπυριμιδινικό δακτύλιο, τη σουλφαμιδική γέφυρα και ένα φαινυλικό δακτύλιο (Σχήμα 5). Τα περισσότερα από αυτά τα ζιζανιοκτόνα δρουν από εδάφους και φυλλώματος. Είναι αποτελεσματικά κυρίως εναντίον των ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων, χωρίς όμως να αποκλείονται από το φάσμα δράσης τους και ορισμένα ετήσια αγρωστώδη ζιζάνια (penoxsulam) ή/και ορισμένα είδη ζιζανίων που ανήκουν στα κυπεροειδή (penoxsulam, diclosulam). Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των ζιζανίων και μετακινούνται µέσω του συµπλάστη και του αποπλάστη αντιστοίχως. Τα ζιζανιοκτόνα αυτά είναι δραστικά σε πολύ μικρές δόσεις από ό,τι τα περισσότερα από τα ήδη χρησιμοποιούµενα. Η εκλεκτικότητά τους οφείλεται στο μεταβολισµό τους από τα καλλιεργούμενα φυτά σε ουσίες µη τοξικές (Ελευθεροχωρινός, 2008).

27 26 Σχήμα 5. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου florasulam Σουλφονυλαµινοκαρβονυλοτριαζολινόνες (Sulfonylaminocarbonyltriazolinones) Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει τα δύο ζιζανιοκτόνα φυλλώματος flucarbazone (Σχήμα 6) και propaxycarbazone. Είναι αποτελεσματικά κυρίως εναντίον των ετήσιων αγρωστωδών ζιζανίων, χωρίς όμως να αποκλείονται από το φάσμα δράσης τους και ορισμένα ετήσια πλατύφυλλα ζιζάνια. Απορροφώνται εύκολα από τα φύλλα και τις ρίζες και μετακινούνται εντός των φυτών µέσω του συµπλάστη και του αποπλάστη, αντιστοίχως (WSSA, 2007). Σχήμα 6. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου flucarbazone 2.4. Ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα Η πρώτη επίσημη αναφορά τεκμηριωμένης ανάπτυξης ανθεκτικότητας έγινε το 1968 στην Ουάσιγκτον των Η.Π.Α. όπου ένας βιότυπος του ζιζανίου μαρτιάκος (Senecio vulgaris L.) δεν αντιμετωπιζόταν αποτελεσματικά από το ζιζανιοκτόνο simazine. Τη δεκαετία που ακολούθησε, βιότυποι του ίδιου ζιζανίου αλλά και άλλων ζιζανίων απέκτησαν ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα της ίδιας οικογένειας αλλά και

28 27 άλλων οικογενειών (Holt κ.ά., 1993). Σήμερα οι αναφορές ανθεκτικότητας αφορούν 372 βιότυπους/πληθυσμούς ζιζανίων που ανήκουν σε 201 είδη (85 μονοκοτυλήδονα, 116 δικοτυλήδονα) και έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα σε 21 ομάδες ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό τρόπο δράσης. Το μεγαλύτερο ποσοστό των βιοτύπων/πληθυσμών (116 είδη) έχει αναπτύξει ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS). Ακολουθούν τα ζιζανιοκτόνα των τριαζινών που αναστέλλουν τη ροή ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ (69 είδη), τα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου καρβοξυλάση του ακετυλο συνένζυμο Α (ACCase) (41 είδη), τα ζιζανιοκτόνα µε δράση αυξίνης (29 είδη) και αυτά που αναστέλλουν τη ροή των ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα Ι (25 είδη). Στα παράγωγα ουρίας και αμίδια φυλλώματος (αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ), στις γλυκίνες (αναστολείς της βιοσύνθεσης των αρωματικών αμινοξέων) και στις δινιτροανιλίνες (αναστολείς της μίτωσης) ανέπτυξαν ανθεκτικότητα 22, 21 και 11 είδη ζιζανίων αντίστοιχα (Heap, 2012) (Σχήμα 7). Ανθεκτικά είδη ζιζανίων Αναστολείς ACCase Αναστολείς ALS Δινιτροανιλίνες - σωληνίνη Τριαζίνες - PS II Παράγωγα ουρίας - PS II Αναστολείς του PS I Δράση αυξίνης Γλυκίνες - EPSPS 116-ALS 69-PS II 41-ACCase 29-Αυξίνη 25-PS I 22-PS II 21-EPSPS 11-Σωληνίνη Έτος Σχήμα 7. Διαγραμματική απεικόνιση της πορείας ανάπτυξης ( ) ανθεκτικών ειδών (βιοτύπων) ζιζανίων σε διάφορες ομάδες ζιζανιοκτόνων. Το πλήθος των ανθεκτικών ειδών ζιζανίων για κάθε ομάδα ζιζανιοκτόνων αναφέρεται στην πρόσφατη επισκόπηση (Heap, 2012).

29 Ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της βιοσύνθεσης των αμινοξέων με διακλαδισμένη αλυσίδα (ένζυμο ALS ή AHAS) Οι πρώτοι βιότυποι ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα ALSαναστολείς καταγράφηκαν λίγα χρόνια μετά την πρώτη χρήση τους. Συγκεκριμένα, το 1987, πέντε μόλις χρόνια από την χρήση του chlorsulfuron, εντοπίσθηκαν βιότυποι των ζιζανίων αγριομάρουλο (Lactuca serriola L.) και κόχια [Kochia scoparia (L.) Shard] με ανθεκτικότητα στο chlorsulfuron (Mallory-Smith κ.ά., 1990; Primiani κ.ά., 1990). Η ανάπτυξη νέων βιοτύπων ζιζανίων ανθεκτικών στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύμου ALS ήταν ραγδαία τα χρόνια που ακολούθησαν. Έτσι, το 1996, 14 χρόνια από τη χρήση των ζιζανιοκτόνων αυτής της ομάδας και εννέα από την καταγραφή των πρώτων ανθεκτικών βιότυπων, τα είδη ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS υπερέβησαν σε αριθμό τα είδη των ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους στις υπόλοιπες ομάδες των ζιζανιοκτόνων (Σχήμα 7) (Heap, 2012; Tranel και Wright, 2002). Η πρόσφατη επισκόπηση έδειξε ότι έχουν καταγραφεί συνολικά 382 περιπτώσεις ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής σε 116 είδη ζιζανίων σε πολλές χώρες του κόσμου (Heap, 2012). Σε μερικές περιπτώσεις μάλιστα η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας δεν περιορίζεται σε μερικούς μεμονωμένους βιότυπους, αλλά είναι αρκετά εκτεταμένη ώστε να αποτελεί απειλή για τη συνέχιση της χρήσης των ζιζανιοκτόνων αυτών (Guttieri κ.ά., 1995; Heap, 2012; Patzoldt κ.ά., 2002; Tranel και Wright, 2002). Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας πολλών ειδών ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αυτής της ομάδας οφείλεται στην επαναλαμβανόμενη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων και σε ορισμένες περιπτώσεις σε μεγάλες δόσεις (ισχυρή πίεση επιλογής), στη μη χρήση ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό μηχανισμό δράσης, στη μεγάλη δραστικότητα (ισχυρή πίεση επιλογής) εναντίον των ευαίσθητων ατόμων του πληθυσμού και στη μεγάλη υπολειμματική δράση ορισμένων από αυτά τα ζιζανιοκτόνα (διαρκής πίεση επιλογής) (Christoffers, 1999; Ελευθεροχωρινός, 2008; Jasieniuk κ.ά., 1996; Tranel και Wright, 2002) Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ζιζανίων με

30 29 ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα είναι η συχνότητα εμφάνισης του γονιδίου ανθεκτικότητας, ο βαθμός κυριαρχίας του γονιδίου ανθεκτικότητας, ο τρόπος κληρονόμησής του και η προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών. Αναλυτικότερα, η ανάπτυξη ανθεκτικού βιοτύπου προϋποθέτει πίεση επιλογής σε έναν πληθυσμό και κυρίως γενετική παραλλακτικότητα. Όσον αφορά το ALS γονίδιο (κωδικοποιεί το ALS ένζυμο), τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι το γονίδιο αυτό (ALS) χαρακτηρίζεται από μεγάλη ποικιλία μεταλλάξεων και κατά συνέπεια από μεγάλη αρχική συχνότητα εμφάνισης αλληλόμορφων που κωδικοποιούν ανθεκτικό ALS ένζυμο στα ζιζανιοκτόνα (Jasieniuk κ.ά., 1996; Tranel και Wright, 2002). Αυτό όμως που θα πρέπει να τονιστεί ιδιαιτέρως είναι ότι η παραλλακτικότητα ως προς το ALS γονίδιο δεν είναι παρόμοια σε όλα τα είδη ζιζανίων (Jiang και Tranel, 2002; Tranel και Wright, 2002), γεγονός που σημαίνει ότι η γενετική παραλλακτικότητα ως προς το ALS γονίδιο δεν είναι η μοναδική αιτία της αλματώδους ανάπτυξης βιοτύπωνπληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς (Tranel και Wright, 2002). Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας ευνοείται όταν το αλληλόμορφο γονίδιο-υπεύθυνο για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας είναι κυρίαρχο σε σχέση με το ευαίσθητο αλληλόμορφο του αρχικού πληθυσμού. Επομένως, ένας ετερόζυγος γενότυπος ως προς το αλληλόμορφο της ανθεκτικότητας μπορεί να εμφανίσει ανθεκτικό φαινότυπο και κατά συνέπεια να αντιδράσει θετικά στην πίεση επιλογής που ασκείται από το ζιζανιοκτόνο όταν το ανθεκτικό αλληλόμορφο είναι κυρίαρχο (ή μερικώς κυρίαρχο) ως προς το ευαίσθητο (Christoffers, 1999; Jasieniuk κ.ά., 1996). Τα διεθνή δεδομένα ανθεκτικότητας ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς δείχνουν ότι τα ανθεκτικά ALS αλληλόμορφα είναι κυρίαρχα των ευαίσθητων έστω και με κυμαινόμενο βαθμό κυριαρχίας μεταξύ των ειδών (Tranel και Wright, 2002). Το ένζυμο ALS, αν και παρουσιάζει καταλυτική δραστηριότητα στα πλαστίδια (χλωροπλάστες), κωδικοποιείται από το ALS γονίδιο που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου και η κληρονόμησή του ακολουθεί τους νόμους του Mendel. Αυτό σημαίνει ότι τα αλληλόμορφα της ανθεκτικότητας μεταφέρονται μέσω της γύρης με αποτέλεσμα να αυξάνεται με ταχύ ρυθμό εντός του αγρού ή των γειτονικών αγρών ο αριθμός των σταυρογονιμοποιούμενων φυτών με ανθεκτικότητα (Jasieniuk κ.ά., 1996; Tranel και Wright, 2002). Αντίθετα, στην περίπτωση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στις τριαζίνες (αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων στο PSII), επειδή το υπεύθυνο για την ανθεκτικότητα γονίδιο βρίσκεται στα πλαστίδια, τα ανθεκτικά

31 30 αλληλόμορφα δεν μεταφέρονται μέσω της γύρης και για αυτό ο ρυθμός ανάπτυξης της ανθεκτικότητας είναι βραδύτερος (Ελευθεροχωρινός, 2008; Suza-Machado κ.ά, 1978). Η επίδραση του χαρακτηριστικού της ανθεκτικότητας στην προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών επηρεάζει σημαντικά την αρχική συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών ατόμων στον πληθυσμό απουσία της πίεσης επιλογής από την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου. Έτσι, όταν το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας μειώνει την προσαρμοστική ικανότητα των φυτών κατά 25%, τα ανθεκτικά άτομα εμφανίζονται με συχνότητα 100 φορές μικρότερη μεταξύ των ευαίσθητων σε σύγκριση με την περίπτωση που το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας δεν επηρεάζει την προσαρμοστικότητα (Christoffers, 1999; Jasieniuk κ.ά., 1996). Αξίζει να αναφερθεί ότι η τροποποίηση της πρωτεΐνης D1 του φωτοσυστήματος ΙΙ, η οποία είναι υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα των τριαζινών, σχετίζεται άμεσα με τη μειωμένη ροή ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα και την ως εκ τούτου μειωμένη προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών ατόμων. Αντίθετα, στην περίπτωση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς, τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι η τροποποίηση του ενζύμου ALS (ανθεκτικό στα ζιζανιοκτόνα) δεν επηρεάζει σημαντικά την προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών ατόμων (Tranel και Wright, 2002). Η έντονη πίεση επιλογής που ασκείται στους πληθυσμούς ζιζανίων από τα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς εξαιτίας της εκτεταμένης χρήσης και των ιδιοτήτων τους, ο τρόπος κληρονόμησης της ανθεκτικότητας (ένα κυρίαρχο γονίδιο του πυρήνα) και η ελάχιστη επίδραση του χαρακτηριστικού της ανθεκτικότητας στην προσαρμοστικότητα των νεοεμφανιζόμενων ανθεκτικών ατόμων είναι οι κυριότερες αιτίες για την ταχύτατη ανάπτυξη και τη μεγάλη έκταση της ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής (Heap, 2012; Tranel και Wright, 2002) Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα οφείλεται σε φυσιολογικούς ή/και βιοχημικούς μηχανισμούς των φυτών. Οι κυριότεροι φυσιολογικοί μηχανισμοί των ζιζανίων που συμβάλλουν στην ανθεκτικότητά τους στα ζιζανιοκτόνα είναι 1) η μείωση του ρυθμού απορρόφησης του ζιζανιοκτόνου, 2) η μείωση του ρυθμού

32 31 μετακίνησης και 3) η τροποποίηση στην ενδοκυτταρική κατανομή του ζιζανιοκτόνου. Οι βιοχημικοί μηχανισμοί των ζιζανίων που εξηγούν την ανθεκτικότητά τους στα ζιζανιοκτόνα σχετίζονται με 1) την ικανότητά τους να μεταβολίζουν το ζιζανιοκτόνο 2) την υπερπαραγωγή του ενζύμου που αποτελεί θέση δράσης του ζιζανιοκτόνου ή του ενζύμου που μεταβολίζει το ζιζανιοκτόνο, 3) την τροποποίηση της θέσης δράσης (ανθεκτικό ή μη ευαίσθητο ένζυμο, τροποποιημένη πρωτεΐνη D1) του ζιζανιοκτόνου και 4) την απουσία βιοχημικού μηχανισμού μεταβολισμού ενός προζιζανιοκτόνου (χωρίς δράση) σε ζιζανιοκτόνο (Ελευθεροχωρινός, 2008). Ειδικότερα για την ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS, οι κυριότεροι μηχανισμοί ανθεκτικότητας είναι η μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS και η ως εκ τούτου αδυναμία σύνδεσής του με τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής (Tranel και Wright, 2002) και ο μεταβολισμός αυτών με την δράση των ενζύμων μονοξυγονασών του κυτοχρώματος P450 (Powles και Yu, 2011). Η αλληλούχηση του ALS γονιδίου έδειξε ότι τα περισσότερα ανθεκτικά ζιζάνια έχουν σημειακή μετάλλαξη στο ALS γονίδιο, η οποία είναι υπεύθυνη για την αντικατάσταση ενός αμινοξέος σε μία συντηρημένη περιοχή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του ενζύμου ALS (Duggleby και Pang, 2000). Το αποτέλεσμα της αντικατάστασης αυτής είναι η αδυναμία σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων με το ένζυμο ALS και η ως εκ τούτου μη αναστολή της δράσης του (Boutsalis κ.ά., 1999; Duggleby κ.ά., 2008; Tranel και Wright, 2002). Η ανθεκτικότητα ορισμένων βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων δεν οφείλεται στην τροποποίηση του ενζύμου ALS, αλλά στην ικανότητα των φυτών για μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων μέσω υδροξυλίωσης [καταλύεται από το ένζυμο μονοξυγονάση (CytP450)] και στο μετέπειτα σχηματισμό συμπλόκου με γλυκόζη (Ελευθεροχωρινός, 2008; Preston, 2004) Ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων στην Ελλάδα Οι μέχρι σήμερα αναφορές δείχνουν ότι στην Ελλάδα έχουν καταγραφεί 79 ανθεκτικοί βιότυποι/πληθυσμοί ζιζανίων που ανήκουν σε εννέα είδη ζιζανίων. Η ανθεκτικότητα αυτών των ζιζανίων είναι σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς α) της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ, β) της δράσης του ενζύµου ALS, γ) της δράσης του ενζύµου ACCase και δ) της δράσης του ενζύµου EPSPS. Αναλυτικότερα, η πρώτη καταγραφή ανθεκτικότητας ζιζανίου σε ζιζανιοκτόνα στην Ελλάδα έγινε το

33 και αφορούσε την ανθεκτικότητα πληθυσμών του ζιζανίου μουχρίτσα [Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.] στο ζιζανιοκτόνο propanil (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ) (Heap, 2012). Ανθεκτικότητα του ίδιου ζιζανίου στο συγκεκριμένο ζιζανιοκτόνο παρατηρήθηκε και 10 χρόνια αργότερα από τους Vasilakoglou κ.ά. (2000) σε καλλιέργειες ρυζιού του νομού Θεσσαλονίκης. Το 1996, σε καλλιέργειες πατάτας (Solanum tuberosum L.) της περιοχής Νευροκοπίου Δράµας καταγράφηκαν βιότυποι των ζιζανίων βλήτο τραχύ (Amaranthus retroflexus L.) και λουβουδιά (Chenopodium album L.) με ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο metribuzin (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ) (Eleftherohorinos κ.ά., 2000). Το ίδιο έτος, οι Kotoula-Syka κ.ά. (2000) βρήκαν ότι ο µη ικανοποιητικός έλεγχος του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin) μετά από εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου diclofop (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ACCase) ήταν αποτέλεσμα ανάπτυξης ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο αυτό, σταυρανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα clodinafop, fluazifop, tralkoxydim και sethoxydim και πολλαπλής ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ALS). Το 2004, μεταξύ 14 πληθυσμών του ίδιου ζιζανίου (ήρα) που προέρχονταν από καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών της κεντρικής Μακεδονίας (Νομοί Θεσσαλονίκης και Κιλκίς), βρέθηκαν τέσσερις πληθυσμοί που είχαν αναπτύξει ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron. Οι τρεις από τους προαναφερθέντες πληθυσμούς του ζιζανίου βρέθηκαν σταυρανθεκτικοί στο μίγμα ζιζανιοκτόνων mesosulfuron + iodosulfuron (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS), ενώ ένας πληθυσμός βρέθηκε να έχει αναπτύξει πολλαπλή ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ACCase) και ένας στο clodinafop (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ACCase) (Βασιλείου κ.ά., 2006; Ευθυμιάδης κ.ά., 2008). Επίσης, σε καλλιέργεια χειμερινών σιτηρών, το 1998 βρέθηκε πληθυσμός του ζιζανίου παπαρούνα ανθεκτικός στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, thifensulfuron, triasulfuron και tribenuron (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS) (Heap, 2012). Το 2002, σε καλλιέργεια βαμβακιού της περιοχής Λάρισας, βρέθηκε από τους Ελευθεροχωρινό και Παπαµιχαήλ (2002) βιότυπος του ζιζανίου αγριοτοµατιά (Solanum nigrum L.) µε ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο prometryn (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ). Το 2006, σε καλλιέργεια βαμβακιού της περιοχής Δράμας, οι Kaloumenos και Eleftherohorinos (2009) βρήκαν ότι τα φυτά από ριζώματα ενός βιοτύπου του ζιζανίου βέλιουρας [Sorghum halepense (L.) Pers.] ήταν 164 και 370 φορές πιο ανθεκτικά στα ζιζανιοκτόνα quizalofop και

34 33 propaquizafop (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ACCase) από ό,τι τα αντίστοιχα φυτά από τον ευαίσθητο βιότυπο, ενώ η αντίστοιχη ανθεκτικότητα των σποροφύτων του ήταν 17,2 και 32,4 φορές ανθεκτικότερα από τον ευαίσθητο βιότυπο. Πρόσφατα, οι Γιαννοπολίτης κ.ά. (2008) διαπίστωσαν ότι κάποιοι βιότυποι του ζιζανίου κόνυζα (Conyza spp.) από τις περιοχές Σκάλα Λακωνίας και Άργος ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο glyphosate (αναστολέας της δράσης του ενζύµου EPSPS). Μετά από εκτεταμένη επισκόπηση, συλλογή και αξιολόγηση 125 βιότυπων του ζιζανίου αγριοβρώμη (Avena sterilis L.) από καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών των περιοχών κεντρικής Μακεδονίας και Θεσσαλίας, διαπιστώθηκε ότι 12 βιότυποι ήταν ανθεκτικοί στο ζιζανιοκτόνο clodinafop, πέντε βιότυποι στο fenoxaprop και 18 βιότυποι ήταν σταυρανθεκτικοί και στα δύο ζιζανιοκτόνα (αναστολείς της δράσεις του ενζύµου ACCase) (Papapanagiotou κ.ά. 2012, in press). Τέλος, η εκτεταμένη δειγματοληψία του ζιζανίου παπαρούνα από σιτοπαραγωγικούς αγρούς της κεντρικής Μακεδονίας έφερε στο φως 28 πληθυσμούς του ζιζανίου με ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο tribenuron, και σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, triasulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron, και σε μικρότερο βαθμό στα ζιζανιοκτόνα pyrithiobac, imazamox και florasulam (Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2008; Kaloumenos κ.ά., 2011). Η ανθεκτικότητα των 28 ανθεκτικών πληθυσμών που αξιολογήθηκαν οφείλεται σε μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS λόγω σημειακών μεταλλάξεων στο ALS γονίδιο που αντίστοιχα οδηγούν σε αντικαταστάσεις του αμινοξέος προλίνη 197 (Kaloumenos κ.ά., 2009) Δομή και Δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση - Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας Η γονιδιακή βάση του ενζύμου ALS Το ένζυμο ALS κωδικοποιείται από το ALS γονίδιο του πυρήνα και μεταφέρεται ακολούθως μέσω ενός πεπτιδίου μεταφορέα στους χλωροπλάστες (Corbett και Tardif, 2006). Ο αριθμός των ALS γονιδιακών θέσεων στο γένωμα των διαφόρων φυτών ποικίλει ανάλογα µε το βαθμό πλοειδίας (Scarabel κ.ά., 2004; Stidham, 1991). Ο τετραπλοειδής καπνός (Nicotiana tabacum L.) και το πολυπλοειδές καλαμπόκι (Zea mays L.) έχουν ALS γονίδια σε δύο ασύνδετες θέσεις (Keeler κ.ά., 1993; Fang κ.ά., 1992), ενώ η ελαιοκράμβη (Brassica napus L.), η οποία είναι αµφιδιπλοειδές είδος, έχει πέντε ALS γονιδιακές θέσεις (Ouellet κ.ά., 1992). Τέλος, τα διπλοειδή είδη

35 34 παπαρούνα και Arabidopsis thaliana (L.) Heynh έχουν ένα ALS γονίδιο (Mazur κ.ά, 1987; Scarabel κ.ά., 2004) Δομή του ενζύμου ALS Τα φυτά και οι μικροοργανισμοί, σε αντίθεση µε τους ζωικούς οργανισμούς, διαθέτουν το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS) και ως εκ τούτου είναι ικανά να βιοσυνθέτουν τα αμινοξέα µε διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile) (Coruzzi και Last, 2000; Duggleby κ.ά., 2008). Το ένζυμο ALS των φυτών, αν και κωδικοποιείται από γονίδιο του πυρήνα, μεταφέρεται µε τη βοήθεια ενός πεπτιδίου μεταφορέα (CTP, Chloroplast Transit Peptide) εντός των πλαστιδίων του κυττάρου όπου και δρα (Corbett και Tardif, 2006; McCourt και Duggleby, 2006; Scarabel κ.ά., 2004). Το ένζυμο αυτό αποτελείται από την «καταλυτική υποµονάδα» και «ρυθμιστική υποµονάδα». Η «καταλυτική υποµονάδα», η οποία δρα καταλυτικά από μόνη της, περιλαμβάνει το ενεργό κέντρο και τη διφωσφορική θειαµίνη (ThDP) ως προσθετική ομάδα (απαραίτητη για την καταλυτική δράση του ενζύµου). Η «ρυθμιστική υποµονάδα» δεν δρα καταλυτικά, αλλά συμβάλλει στην αύξηση της δράσης της καταλυτικής υποµονάδας. Η παρουσία της είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση µε οπισθοτροφοδότηση της δράσης της καταλυτικής υποµονάδας από τα τελικά προϊόντα της μεταβολικής οδού (αμινοξέα µε διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα) γι αυτό και αναφέρεται ως «ρυθμιστική υποµονάδα» (Duggleby κ.ά., 2008). Η καταλυτική υποµονάδα του ALS ενζύµου, σύμφωνα µε την κρυσταλλογραφική ανάλυση του ενζύµου ALS από το φυτικό είδος A. thaliana, αποτελείται από τρεις περιοχές (Σχήμα 8). Η α-περιοχή περιέχει τα αμινοξέα 86 έως 280, η β-περιοχή τα αμινοξέα 281 έως 451 και η γ-περιοχή τα αμινοξέα 463 έως 639. Τα αμινοξέα 1 έως 85 αποτελούν το πεπτίδιο-μεταφορέας του ενζύµου ALS από τον πυρήνα στους χλωροπλάστες.

36 35 Σχήμα 8. Καταλυτική υποµονάδα του ενζύµου ALS. Οι α-, β- και γ-περιοχές (domains) της καταλυτικής υποµονάδας του ενζύµου απεικονίζονται µε κίτρινο, πράσινο και γκρι χρώµα, αντίστοιχα (Duggleby κ.ά., 2008) Δράση του ενζύμου ALS Το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS), όπως έχει προαναφερθεί, είναι το ένζυμο κλειδί κατά τη βιοσύνθεση των αμινοξέων βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile) (Coruzzi και Last, 2000; Duggleby κ.ά., 2008). Συγκεκριμένα, το ένζυμο αυτό είναι υπεύθυνο για τις παράλληλες αντιδράσεις συμπύκνωσης δύο µορίων πυροσταφυλικού οξέος για τη βιοσύνθεση οξικογαλακτικού οξέος ή της συµπύκνωσης του πυροσταφυλικού οξέος µε το 2- κετοβουτυρικό οξύ για τη βιοσύνθεση του 2-οξικο-2-υδροξυβουτυρικού οξέος (Σχήμα 9). Η βιοσύνθεση οξικογαλακτικού οξέος είναι το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης των αµινοξέων Val και Leu, ενώ η βιοσύνθεση του 2-οξικο-2- υδροξυβουτυρικού οξέος είναι το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης του αµινοξέος Ile (Chipman κ.ά., 1998; Corbett και Tardif, 2006; Duggleby κ.ά., 2008). Το πρώτο στάδιο των δύο αντιδράσεων συμπύκνωσης είναι η διάσπαση ενός δεσμού C C που βρίσκεται κοντά σε µία καρβονυλομάδα. Τα ένζυμα που καταλύουν τέτοιου είδους αντιδράσεις διάσπασης, όπως και το ένζυμο ALS, απαιτούν την παρουσία του συµπαράγοντα ThDP, που αντιδρά µε το πυροσταφυλικό οξύ και σχηματίζει το συνδεδεμένο στο ένζυμο σύμπλοκο υδροξυαιθυλο-thdp ως ενδιάμεσο προϊόν αφού απομακρυνθεί ένα άτομο άνθρακα µε τη μορφή CO 2. Το ενδιάμεσο προϊόν στη συνέχεια αντιδρά µε το 2-κετοβουτυρικό οξύ ή το πυροσταφυλικό οξύ για το σχηματισμό του 2-οξικο-2-υδροξυβουτυρικού οξέος ή οξικογαλακτικού οξέος αντίστοιχα.

37 36 Σχήμα 9. Αντιδράσεις που καταλύονται από το ένζυµο ALS κατά τη βιοσύνθεση των αµινοξέων Leu, Val και Ile (Duggleby κ.ά., 2008). Τα τελικά προϊόντα της μεταβολικής οδού ρυθμίζουν τη δράση του ενζύµου ALS. Ειδικότερα, η παρουσία ενός εκ των τριών προαναφερθέντων αμινοξέων στην αναγκαία για το φυτό ποσότητα αναστέλλει τη δράση του ενζύµου ALS. Βέβαια, το αμινοξύ Leu εικάζεται ότι δρα και συνεργιστικά µε τα αμινοξέα Val και Ile ως προς την αναστολή της δράσης του ενζύµου ALS (Lee και Duggleby, 2001). Σε αντίθεση µε τα φυτά, η δράση του ενζύµου ALS στους μύκητες ή στα βακτήρια αναστέλλεται μόνον από το αμινοξύ Val. Η παρουσία ως συµπαράγοντα ενός κατάλληλου δισθενούς μεταλλικού ιόντος (Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Cd 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+, Al 3+, Ba 2+ ή Ni 2+ ), εκτός από τη ThDP, είναι απαραίτητη για τη δράση του ενζύµου ALS. Ειδικότερα, η δράση του ενζύµου ALS μειώνεται κατά 50% και αυξάνεται κατά 133% όταν ο συµπαράγοντας είναι Ni 2+ ή Mn 2+ αντίστοιχα αντί για Mg 2+. Η δράση του ενζύµου ALS, παρουσία των υπολοίπων μεταλλικών ιόντων, είναι εντός του προαναφερθέντος εύρους τιμών (Tse και Schloss, 1993). Ο ρόλος του δισθενούς ιόντος στο ένζυμο ALS είναι η ακινητοποίηση της ThDP, γεγονός που συμβαίνει σε όλα τα ThDP-εξαρτώμενα ένζυμα (Duggleby, 2006). Το ένζυμο ALS, σε αντίθεση µε τα άλλα ένζυμα που έχουν παρόμοια λειτουργία, για να δράσει απαιτεί το φλαβινοαδενινο-δινουκλεοτίδιο (FAD) ως τρίτο συµπαράγοντα. Σύμφωνα µε τον Duggleby (2006), η παρουσία του FAD ως συµπαράγοντα αποτελεί εξελικτικό κατάλοιπο της υποομάδας των ThDPεξαρτώμενων ενζύµων από την οποία προέρχεται και το ένζυµο ALS. Η

38 37 κρυσταλλογραφική ανάλυση έδειξε ότι το FAD είναι συνδεδεμένο µε το ένζυμο στην επιφάνειά του και συγκεκριμένα στην β-περιοχή (Duggleby κ.ά., 2008) Μοριακή βάση της σύνδεσης μεταξύ ενζύμου ALS και ζιζανιοκτόνων και αναστολή της ενζυμικής δράσης του Τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύµου ALS ανήκουν στις οικογένειες των σουλφονυλουριών, ιµιδαζολινονών, πυριµιδινυλβενζοϊκών, τριαζολοπυριµιδινών και σουλφονυλαµινοκαρβονυλοτριαζολινονών. Ο μηχανισμός αναστολής της δράσης του ενζύµου ALS είναι πολύπλοκος επειδή τα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς δεν δρουν ως απλοί υποκαταστάτες ή ως ανταγωνιστικές ουσίες των υποστρωμάτων ή των συμπαραγόντων του ενζύµου (Duggleby και Pang, 2000). Ειδικότερα, οι σουλφονυλουρίες και οι ιµιδαζολινόνες προσδένονται σε θέσεις του ενζύµου που εμποδίζουν την είσοδο του υποστρώματος εντός του ενεργού κέντρου με αποτέλεσμα την αναστολή της δράσης του (McCourt κ.ά., 2005; McCourt κ.ά., 2006; Pang κ.ά., 2002). Η σουλφονυλοµάδα των σουλφονυλουριών και ο αρωματικός δακτύλιος λαμβάνουν θέση στην είσοδο της διόδου προς το ενεργό κέντρο, ενώ το υπόλοιπο µόριο λαμβάνει θέση εντός της διόδου (Σχήμα 10Α). Το µόριο των ιµιδαζολινονών είναι τοποθετημένο εντός της διόδου του υποστρώματος µε τέτοιο τρόπο ώστε ο διυδροϊµιδαζολινονικός δακτύλιος να προσανατολίζεται προς τη διφωσφορική θειαµίνη (ThDP) (συµπαράγοντας του ενζύµου απαραίτητος για την καταλυτική δράση), ενώ ο κινολινικός δακτύλιος να βρίσκεται προς την επιφάνεια του ενζύµου (McCourt κ.ά., 2006). Σχήμα 10. Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης-σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων (Α) chlorimuron (σουλφονυλουρία) και (Β) imazaquin (ιµιδαζολινόνη) στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώµατος προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου ALS. Τα ζιζανιοκτόνα απεικονίζονται µε τη µορφή ράβδων, ενώ τα αμινοξέα µε γκρι επιφάνεια (McCourt κ.ά., 2006).

39 38 Οι σουλφονυλουρίες έχουν καλύτερη συνάφεια (affinity) με το ένζυμο ALS από ό,τι οι ιµιδαζολινόνες. Αυτό τεκμηριώνεται από τη μεγαλύτερη τιμή της φαινομενολογικής σταθεράς αναστολής (apparent inhibition constant) K i(app) = I 50 - [E o ]/2, όπου Ι 50 η συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου-αναστολέα που προκαλεί 50% μείωση της δράσης του ενζύµου και [E o ] η συγκέντρωση του ενζύµου. Ειδικότερα, η τιμή K i(app) για το imazaquin και το ένζυμο ALS του A. thaliana είναι 3,0 µm, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για το tribenuron και το chlorimuron είναι 253 και 10,8 nm (Chang και Duggleby, 1998). Αυτό οφείλεται στο μεγάλο πλήθος υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (~50) και στους έξι δεσμούς υδρογόνου που μπορούν να σχηματιστούν μεταξύ των διαφόρων σουλφονυλουριών και της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του ALS, σε αντίθεση µε το μικρότερο πλήθος υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (~28) και ένα δεσμό υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των ιµιδαζολινονών και του ALS ενζύµου. Επιπλέον, οι σουλφονυλουρίες προσδένονται πιο κοντά στο ενεργό κέντρο τoυ ενζύµου και πιο κοντά στη ThDP από ό,τι οι ιµιδαζολινόνες, οι οποίες προσδένονται πιο κοντά στην επιφάνεια του ενζύµου (McCourt κ.ά., 2006).

40 39 Σχήµα 11. Τµηµατική απεικόνιση του σηµείου πρόσδεσης των ζιζανιοκτόνων στο ένζυµο ALS. Τα ζιζανιοκτόνα παρουσιάζονται µε γραµµές και σφαίρες, ενώ µε χρώµα γκρι παριστάνονται τα άτοµα του άνθρακα. Τα αµινοξέα παρουσιάζονται µε γραµµές, τα άτοµα του άνθρακα µε πράσινο χρώµα, τα άτοµα S µε κίτρινο χρώµα, τα άτοµα Ο µε κόκκινο χρώµα, τα άτοµα Ν µε µπλε χρώµα και τα άτοµα Cl µε πορτοκαλί χρώµα. Οι δεσµοί υδρογόνου παρουσιάζονται µε µπλε διακεκοµµένες γραµµές. (A) Σύνδεση του ζιζανιοκτόνου chlorimuron στο ένζυµο ALS. (B) Σύνδεση του ζιζανιοκτόνου imazaquin στο ένζυµo ALS. (Duggleby κ.ά., 2008). Ονοµατολογία αµινοξέων κατά IUPAC: Α, αλανίνη; C, κυστεΐνη; D, ασπαρτικό οξύ; Ε, γλουταµικό οξύ; F, φαινυλαλανίνη; G, γλυκίνη; Η, ιστιδίνη; Ι, ισολευκίνη; Κ, λυσίνη; L, λευκίνη; M, µεθειονίνη; Ν, ασπαραγίνη; P, προλίνη; Q, γλουταµίνη; R, αργινίνη; S, σερίνη; T, θρεονίνη; V, βαλίνη; W, τρυπτοφάνη; Υ, τυροσίνη.

41 40 Όλες σχεδόν οι σουλφονυλουρίες (αν και η θέση του αρωματικού δακτυλίου σε σχέση µε τη σουλφονυλουρική γέφυρα διαφοροποιείται ανάλογα µε το µόριο) κατά την πρόσδεσή τους µε το ένζυμο ALS από ζύμες ή φυτά λαμβάνουν παρόμοια θέση µε αυτή που λαμβάνει το ζιζανιοκτόνο chlorimuron στο ένζυµο ALS του είδους A. Thaliana (Σχήμα 11Α). Το γεγονός ότι τα ζιζανιοκτόνα αυτής της οικογένειας είναι ισχυροί αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στο ότι όλα τα µόρια των σουλφονυλουριών δημιουργούν πληθώρα επαφών με τα γειτονικά αμινοξέα του ενζύµου. Για παράδειγμα, τα αμινοξέα βαλίνη 196 (Val 196 ), προλίνη 197 (Pro 197 ), μεθειονίνη 200 (Met 200 ), αλανίνη 205 (Ala 205 ) και ασπαρτικό οξύ (Asp 376 ) συμμετέχουν στη σύνδεση του αρωματικού δακτυλίου των σουλφονυλουριών µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (hydrophobic interactions), ενώ το αμινοξύ αργινίνη 377 (Arg 377 ) δημιουργεί δεσμό υδρογόνου µε ένα τουλάχιστον οξυγόνο της σουλφονυλουρικής γέφυρας ή ένα άτομο αζώτου του ετεροκυκλικού δακτυλίου και του μεθοξυ-υποκαταστάτη του. Πιθανώς, το αμινοξύ τρυπτοφάνη 574 (Trp 574 ) είναι το πιο σημαντικό στην πρόσδεση των σουλφονυλουριών, αφού ο δακτύλιος του αμινοξέος αυτού έρχεται σε στενή επαφή (περίπου 3,5 A) µε τον ετεροκυκλικό δακτύλιο των ζιζανιοκτόνων της συγκεκριμένης οικογένειας (Σχήμα 11Α). Η μελέτη των κρυσταλλογραφικών δομών του ενζύµου και ο εκτενής χαρακτηρισμός 79 σουλφονυλουριών έδειξε ότι κάποια χαρακτηριστικά της χημικής δομής των ζιζανιοκτόνων αυτής της οικογένειας ευνοούν τη σύνδεσή τους µε το ένζυμο ALS και αναστέλλουν ως εκ τούτου τη δράση του (Wang κ.ά., 2005). Γενικώς, οι καλύτεροι αναστολείς του ενζύµου ALS των φυτών είναι οι σουλφονυλουρίες που φέρουν μεγάλους όρθο-υποκαταστάτες [όπως καρβόξυ μέθυλο (carboxy methyl) και αίθυλο εστέρας (ethyl esters)] στον αρωματικό δακτύλιο σε συνδυασμό µε την κλασική σουλφονυλουρική γέφυρα ή ζιζανιοκτόνα µε γέφυρα ελαφρώς μακρύτερη (όπως των ζιζανιοκτόνων bensulfuron και ethoxysulfuron) και ετεροκυκλικό δακτύλιο που φέρει μικρό υποκαταστάτη και στις δύο (ή τουλάχιστον σε µία) μέτα-θέσεις. Τα µόρια που συνδυάζουν τα παραπάνω δομικά χαρακτηριστικά λαμβάνουν ιδανική θέση στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο και δημιουργούν ισχυρές αλληλεπιδράσεις µε τα γειτονικά αμινοξέα. Οι σουλφονυλουρίες, εκτός από τις πολυάριθμες (~50) υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που σχηματίζουν µε τα αμινοξέα του ενζύµου ALS, σχηματίζουν και μέχρι έξι δεσμούς υδρογόνου µε τα αμινοξέα Lys 256, Arg 377 και Ser 653. Βέβαια, οι πιο σημαντικοί δεσμοί

42 41 είναι αυτοί που σχηματίζονται μεταξύ των ατόμων της σουλφονυλουρικής γέφυρας και ειδικότερα μεταξύ του αµινοξέος Arg 377, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στην καταλυτική δράση του ενζύµου (Σχήμα 11Α) (Duggleby κ.ά., 2008; Engel κ.ά., 2004; McCourt και Duggleby, 2006). Οι Preston και Mallory-Smith (2001), σε συνέχεια των προαναφερθέντων, υποστηρίζουν ότι η πρόσδεση των σουλφονυλουριών µε το ένζυμο ALS γίνεται µέσω υδρόφοβου δεσμού µε το αμινοξύ Trp 574 και µέσω δεσμού υδρογόνου µε το αμινοξύ Pro 197. Το ζιζανιοκτόνο imazaquin συνδέεται µε το ένζυμο ALS και αναστέλλει ως εκ τούτου τη δράση του µέσω κυρίως υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων µε 12 αμινοξέα (McCourt κ.ά., 2006). Τα αμινοξέα αυτά, εκτός από δύο [γλυκίνη 654 (Gly 654 ) και αργινίνη 199 (Arg 199 )], συμμετέχουν και στη σύνδεση του ενζύµου µε ζιζανιοκτόνα των σουλφονυλουριών. Η καρβοξυλική ομάδα του µορίου του ζιζανιοκτόνου (κοινό χαρακτηριστικό όλων των ιµιδαζολινονών) σχηματίζει δεσμό µε την πλευρική αλυσίδα του αμινοξέος Arg 377 (Σχήμα 11Β). Οι μέθυλο και ισοπρόπυλο υποκαταστάστες του διυδροϊµιδαζολινονικού δακτυλίου, οι οποίοι είναι απαραίτητοι για την εκδήλωση της ζιζανιοκτόνου δράσης (Stidham και Singh, 1991), συνδέονται στο ένζυμο µε τα αμινοξέα αλανίνη 122 (Ala 122 ), φαινυλαλανίνη 206 (Phe 206 ), γλουταµίνη 207 (Gln 207 ), λυσίνη 256 (Lys 256 ) και τρυπτοφάνη 574 (Trp 574 ). Ο διυδροϊµιδαζολινονικός δακτύλιος έρχεται σε επαφή µε τα αμινοξέα Lys 256 και Trp 574. Το υπόλοιπο µόριο του ζιζανιοκτόνου imazaquin είναι τοποθετημένο µε τέτοιο τρόπο στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώματος ώστε ο μεγάλος δακτύλιος της κινολίνης να προεξέχει από την είσοδο της διόδου πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο (Σχήμα 11Β) (Duggleby κ.ά., 2008). Βέβαια, σε αντίθεση µε τα όσα αναφέρονται από τους Duggleby κ.ά. (2008) και McCourt κ.ά. (2006), οι Preston και Mallory-Smith (2001) υποστηρίζουν ότι η πρόσδεση των ιµιδαζολινονών, και ειδικότερα του ζιζανιοκτόνου imazaquin, µε το ένζυμο ALS των φυτών γίνεται κυρίως µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων µε το αµινοξύ Trp 574 ή µε το αµινοξύ Ala 122 και µέσω δεσμού υδρογόνου µε το αµινοξύ Ser 653. Οι McCourt κ.ά. (2006) αναφέρουν ότι οι σουλφονυλουρίες και οι ιµιδαζολινόνες έχουν αλληλοεπικαλυπτόμενο σημείο σύνδεσης στο ένζυμο ALS των φυτών και 10 από τα 24 αμινοξέα είναι κοινά για τις δύο οικογένειες και συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις τους με το ένζυμο (Σχήμα 11). Η σύγκριση όμως των αμινοξέων κατά την πρόσδεση των ζιζανιοκτόνων chlorimuron και imazaquin έδειξε ότι πέντε αμινοξέα λαμβάνουν διαφορετική διαμόρφωση στο χώρο ανάλογα µε το

43 42 ζιζανιοκτόνο-αναστολέα. Αναλυτικότερα, τα αμινοξέα Asp 376 και Arg 377 σχηματίζουν δεσμό κατά την πρόσδεση των σουλφονυλουριών (ειδικότερα του ζιζανιοκτόνου chlorimuron), ενώ κατά την πρόσδεση των ιµιδαζολινονών (ειδικότερα του ζιζανιοκτόνου imazaquin) ο κινολινικός δακτύλιος αναγκάζει το αµινοξύ Arg 377 να απομακρυνθεί από το Asp 376 και να σχηματίσει δεσμό µε την καρβοξυλική ομάδα του ζιζανιοκτόνου (McCourt κ.ά., 2006). Τέλος, το αμνοξύ Trp 574 κατά την πρόσδεση του ζιζανιοκτόνου imazaquin τροποποιείται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να καταλαμβάνει το χώρο που καταλαμβάνει ο ετεροκυκλικός δακτύλιος του ζιζανιοκτόνου chlorimuron όταν το τελευταίο συνδέεται στο ένζυμο ALS (Duggleby κ.ά., 2008). Οι δόσεις εφαρμογής των σουλφονυλουριών στον αγρό αν και είναι παρόμοιες µε εκείνες των ιµιδαζολινονών, οι σουλφονυλουρίες είναι πιο αποτελεσματικοί αναστολείς του ενζύµου ALS (Duggleby και Pang, 2000). Αυτό πιθανώς οφείλεται στο ότι το σχήμα και το μέγεθος των µορίων των σουλφονυλουριών επιτρέπουν την καλύτερη προσαρμογή τους στο εσωτερικό της διόδου πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου, µε αποτέλεσμα να σχηματίζουν περισσότερους δεσμούς με το ένζυμο από ό,τι τα ζιζανιοκτόνα των ιµιδαζολινονών (Duggleby κ.ά., 2008) Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS οφείλεται στις περισσότερες περιπτώσεις σε μεταλλάξεις του ALS γονιδίου. Αυτές οι μεταλλάξεις είναι σημειακές και οδηγούν σε αντικατάσταση ενός αμινοξέος (Corbett και Tardif, 2006; Delye κ.ά., 2009; Tranel και Wright, 2002) με αποτέλεσμα την αδυναμία σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων µε το ένζυμο ALS και την ως εκ τούτου µη αναστολή της δράσης του (Boutsalis κ.ά., 1999; Duggleby κ.ά., 2008; Tranel και Wright, 2002). Τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι έχουν καταγραφεί 22 διαφορετικές μεταλλάξεις του ALS γονιδίου που οδηγούν σε αντικαταστάσεις αμινοξέων υπεύθυνες για ανθεκτικότητα σε ζύμες, βακτήρια, πράσινα φύκη, φυτά μετά από in vitro επιλογή και σε φυσικούς πληθυσμούς ζιζανίων (Duggleby κ.ά., 2008; Duggleby και Pang, 2000; Heap, 2012; Tranel και Wright, 2002). Όλα σχεδόν τα αμινοξέα που περιβάλλουν τα µόρια των ζιζανιοκτόνων και συμμετέχουν στη σύνδεσή τους µε το ένζυμο ALS

44 43 εμπλέκονται στις περιπτώσεις ανθεκτικότητας που έχουν καταγραφεί παγκοσμίως. Οκτώ μόνο από τις πολλές σημειακές μεταλλάξεις που έχουν καταγραφεί σε πληθυσμούς ζιζανίων (επιλογή μετά από εφαρμογές στον αγρό ζιζανιοκτόνου που αναστέλλει τη δράση του ALS ενζύμου) είναι οι σπουδαιότερες για την πρόκληση ανθεκτικότητας. Ειδικότερα, οι μεταλλάξεις αυτές αφορούν την αντικατάσταση ενός από τα αμινοξέα Ala 122, Pro 197 και Ala 205 κοντά στο -ΝΗ +3 άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, του αµινοξέος Asp 376 και Arg 377 περίπου στο μέσο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και των αμινοξέων Trp 574 Ser 653 και Gly 654 στο COO - άκρο (Σχήμα 12) (Delye κ.ά., 2009; Heap, 2012; Laplante κ.ά. 2009; Massa et al. 2011; Tranel και Wright, 2002; Tranel κ.ά., 2012; Whaley κ.ά., 2007). Ala 122 Pro 197 Ala 205 Asp 376 Trp 574 Ser 653 NH +3 - CTP Arg 377 Gly 654 -COO - Σχήμα 12. Σχηµατική απεικόνιση του ενζύµου ALS µε τα οκτώ αµινοξέα των οποίων η αντικατάσταση είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας των ζιζανίων. Το τµήµα στην αρχή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (CTP, Chloroplast Transit Peptide) είναι το πεπτίδιο µεταφοράς του ενζύµου από τον πυρήνα στους χλωροπλάστες (Tranel και Wright, 2002; Whaley κ.ά., 2007). Οι Tranel κ.ά. (2012) αναφέρουν ότι η αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 από Leu οδηγεί σε ανθεκτικότητα σε όλες τις οικογένειες των ζιζανιοκτόνων αναστολέων της δράσης του ενζύµου ALS. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το αµινοξύ Trp 574 συμμετέχει σε πληθώρα αλληλεπιδράσεων (υδρόφοβοι δεσμοί) μεταξύ του ενζύμου και των ζιζανιοκτόνων µε αποτέλεσμα η αντικατάστασή του από Leu να οδηγεί σε απώλεια πολλών σημείων επαφής µε όλα σχεδόν τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής. Αντίθετα, η αντικατάσταση του αµινοξέος Ala 122 από το αµινοξύ Thr οδηγεί σε ανάπτυξη πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις ιµιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες και στις άλλες οικογένειες ζιζανιοκτόνων (Tranel κ.ά., 2012). Η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 από τη Thr, την Ala, τη Leu, τη Ser, την Arg, τη Gln ή την His οδηγεί σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (σε ορισμένες περιπτώσεις και σταυρανθεκτικότητα σε τριαζολοπυριµιδίνες και πυριµιδινυλβενζοϊκά) και όχι στις ιµιδαζολινόνες (Tranel κ.ά., 2012). Βέβαια, εξαίρεση αποτελούν έξι (6) από τις 42

45 44 περιπτώσεις όπου η αντικατάσταση του αµινοξέος Pro 197 από τη Thr (δύο), τη Leu (δύο), την His (μία) και την ισολευκίνη (Ile) (μία) οδήγησε στην ανάπτυξη βιότυπωνπληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες αλλά και στις ιµιδαζολινόνες. Αξίζει να αναφερθεί ότι το αμινοξύ Pro 197 βρίσκεται στο τέλος α- έλικα και μάλιστα στην είσοδο της διόδου πρόσβασης προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου. Αυτό έχει ως συνέπεια το αμινοξύ αυτό να είναι πάντοτε σε επαφή µε τον αρωματικό δακτύλιο των σουλφονυλουριών, αλλά να μην επηρεάζει τις ιµιδαζολινόνες. Επομένως, η αντικατάστασή του δεν επιτρέπει την είσοδο των σουλφονυλουριών στη δίοδο πρόσβασης προς το ενεργό κέντρο, αλλά δεν επηρεάζει την είσοδο των περισσότερων ιµιδαζολινονών (McCourt κ.ά., 2006). Η αντικατάσταση του αμινοξέος Ala 205 από τη Val οδήγησε στις τρεις από τις τέσσερις περιπτώσεις σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες αλλά και στις ιµιδαζολινόνες (Tranel κ.ά., 2012). Επίσης, σύμφωνα µε τις ίδιες πηγές, η αντικατάσταση του αμινοξέος Asp 376 από το γλουταµικό οξύ (Glu) οδήγησε στις δύο από τις τρεις περιπτώσεις σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα σε όλες τις οικογένειες των ζιζανιοκτόνων (παρόμοια µε την αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 ). Η αντικατάσταση του αµινοξέος Ser 653 από τη Thr ή την Asn οδήγησε στις τέσσερεις από τις πέντε περιπτώσεις σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις ιµιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες (Tranel κ.ά., 2012). Τέλος, η αντικατάσταση της Gly 654 από το Asp ήταν υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα ενός πληθυσμού του ζιζανίου σετάρια πράσινη [Setaria viridis (L.) P. Beauv.)] στο ζιζανιοκτόνο imazethapyr. Η συγκεκριμένη αντικατάσταση οδήγησε σε περιορισμένη σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα nicosulfuron και fluocarbazone (RF < 10), αλλά όχι στο pyrithiobac (Laplante κ.ά., 2009; Tranel κ.ά., 2012). Οι Rajaguru κ.ά. (2005) και οι Sales κ.ά. (2008) αναφέρουν ότι, εκτός από τις έξι προαναφερθείσες σημαντικές αντικαταστάσεις αμινοξέων, η αντικατάσταση των αμινοξέων Ser 186, Lys 416, Gly 654, Leu 662 ή Val 669 του ενζύµου ALS από τα αντίστοιχα αμινοξέα Pro, Glu, Glu, Pro ή Met οδηγεί σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών του ζιζανίου κόκκινο ρύζι µε ανθεκτικότητα στις ιµιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες. Το 3,5% των πληθυσμών των ζιζανίων µε ανθεκτικότητα (εξαιτίας τροποποίησης του ενζύµου ALS) στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ALS που έχουν καταγραφεί σε µοριακό επίπεδο (αλληλούχηση ALS γονιδίου) διεθνώς μέχρι το 2011 οφείλεται σε

46 45 αντικατάσταση του αµινοξέος Asp 376 από το Glu. Η αντικατάσταση του αµινοξέος Ala 205 από Val εμφανίζεται στο 4,7% των περιπτώσεων ανθεκτικότητας, ενώ η αντικατάσταση του ίδιου αµινοξέος στη θέση 122 από Thr είναι υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα του 5,8% των περιπτώσεων. Η αντικατάσταση του αµινοξέος Ser 653 από τα αμινοξέα Thr, Asn ή Ile αφορά το 9,4% των περιπτώσεων ανθεκτικότητας, ενώ για το 22,4% των περιπτώσεων, η ανθεκτικότητα οφείλεται στην αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 από Leu. Τέλος, για το 52,9% των περιπτώσεων ανθεκτικότητας η αιτία ανάπτυξης ανθεκτικότητας είναι η αντικατάσταση του αµινοξέος Pro 197. Συγκεκριμένα για το αμινοξύ αυτό, το 16,5% των περιπτώσεων αφορά την αντικατάστασή του από Ser, το 7,1% από Thr, το 7,1% από Leu, το 5,9% από Ala, το 5,8% από His, το 5,8% από Gln και το 4,7% από Arg ή Ile (Heap, 2012; Tranel κ.ά. 2012). Βέβαια, οι αντικαταστάσεις αυτές, αν και προκαλούν ανάπτυξη ανθεκτικότητας, δεν επηρεάζουν την καταλυτική δράση του ενζύµου. Αυτό σημαίνει ότι οι αντικαταστάσεις αυτές είναι πέραν του ενεργού κέντρου του ενζύµου ή ότι το ενεργό κέντρο του ενζύµου δεν αποτελεί σημείο σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων αναστολέων της δράσης του (Duggleby κ.ά., 2008; Pang κ.ά., 2002; Tranel και Wright, 2002). Ελάχιστες μεταλλάξεις υπεύθυνες για ανθεκτικότητα ζιζανίων, σε αντίθεση µε την πληθώρα των καταγεγραμμένων μεταλλάξεων του ALS γονιδίου, έχουν καταγραφεί για γονίδια που κωδικοποιούν θέσεις-στόχους άλλων ζιζανιοκτόνων µε διαφορετικό τρόπο δράσης. Για παράδειγμα, στο psba γονίδιο-υπεύθυνο για την έκφραση της D1 πρωτεΐνης, έχουν εντοπιστεί µόνο δύο μεταλλάξεις (αλλαγή του αµινοξέος Ser 264 από Gly και της Val 219 από Ile) σε φυσικούς πληθυσμούς ζιζανίων που εξηγούν την ανθεκτικότητά τους στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του PS II (Gronwald, 1994; Mengistu κ.ά., 2000). Επίσης, αν και έχουν παρατηρηθεί 79 πληθυσμοί (σε 20 διαφορετικά είδη ζιζανίων) ανθεκτικοί στις γλυκίνες [ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου συνθάση του 5-ενολοπυροσταφυλοσικιµικού-3-φωσφορικού (EPSPS)], µόνο σε δύο περιπτώσεις των ζιζανίων Eleusine indica (L.) Gaertn. και Conyza canadensis (L.) Cronq. έχει διαπιστωθεί ότι η ανθεκτικότητα οφείλεται σε μετάλλαξη του EPSPS γονιδίου (Heap, 2012; Tranel και Wright, 2002). Οι Tranel και Wright (2002) αναφέρουν ότι η μεγαλύτερη παραλλακτικότητα των αλληλοµόρφων ALS γονιδίων που προσδίδουν ανθεκτικότητα στα ζιζάνια εξηγούν τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών πληθυσμών.

47 Σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Οι περιπτώσεις σταυρανθεκτικότητας που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα των ιμιδαζολινονών χωρίς ταυτόχρονη σταυρανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες και στις άλλες οικογένειες αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS (οφείλεται σε αντικαταστάσεις της Ala 122 ). Η δεύτερη ομάδα σταυρανθεκτικότητας αναφέρεται στην ισχυρή ανθεκτικότητα στις ιμιδαζολινόνες, αλλά περιορισμένη ή όχι ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (οφείλεται σε αντικαταστάσεις των αμινοξέων Ser 653 και Gly 654 ). Η τρίτη ομάδα αφορά την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στις σουλφονυλουρίες χωρίς ταυτόχρονη ανάπτυξη σταυρανθεκτικότητας στις ιµιδαζολινόνες ή στους υπόλοιπους αναστολείς του ALS (οφείλεται σε αντικαταστάσεις των αμινοξέων Pro 197 και Ala 205 ). Τέλος, η τέταρτη ομάδα σταυρανθεκτικότητας περιλαμβάνει σταυρανθεκτικότητα σε όλες τις ομάδες ζιζανιοκτόνων µε δράση αναστολέα του ALS (οφείλεται σε αντικαταστάσεις των αμινοξέων Trp 574 και Asp 376 ) (Tranel και Wright, 2002; Tranel κ.ά., 2012) Ανθεκτικότητα λόγω μεταβολισμού Τα ζιζανιοκτόνα είναι χημικές ουσίες οι οποίες δεν αποτελούν τα φυσικά υποστρώματα των ενζύμων ή των μεταφορέων μορίων που εμπλέκονται στο φαινόμενο της ανθεκτικότητας στους φυτικούς οργανισμούς. Παρόλα αυτά, για να μπορέσουν να αποκριθούν στο διαρκώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον τα φυτά έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς μεταβολισμού τοξικών για αυτά χημικών ουσιών (Shimabukuro κ.ά., 1971; Yuan, κ.ά. 2006). Η ανθεκτικότητα μη τροποποίησης θέσης δράσης στα ζιζανιοκτόνα (non-target-site resistance) ακολουθεί σε γενικές γραμμές τέσσερα στάδια μεταβολισμού (Bartholomew κ.ά., 2002; Martinoia κ.ά., 1993; Sandermann, 2004; Yuan, κ.ά. 2006). Το πρώτο στάδιο είναι η μετατροπή-αποδόμηση του μορίου. Σε αυτό το στάδιο τα μόρια του ζιζανιοκτόνου ενεργοποιούνται και προετοιμάζονται για τα ένζυμα του δευτέρου σταδίου του μεταβολισμού τους. Η οξείδωση είναι μία τυπική αντίδραση μετατροπής-αποδόμησης του μορίου κατά την πρώτη φάση του μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων και καταλύεται κυρίως από τις μονοξυγονάσες P450 ή από μονοξυγονάσες μικτής δράσης

48 47 (Schuler και Werek-Reichhart, 2003; Werek-Reichhart κ.ά., 2000; Yun κ.ά., 2005; Yuan κ.ά., 2006). Η δεύτερη φάση του μεταβολισμού περιλαμβάνει την ένωση (σχηματισμό συμπλόκου) μεταξύ των προαναφερθέντων αποδομηθέντων μορίων και σακχάρων (γλυκόζη) ή γλουταθειόνης. Οι αντιδράσεις αυτές καταλύονταο από τη δράση των αντίστοιχων τρανσφερασών (Anderson και Gronwald, 1991; Bowles, 2005; Reade κ.ά., 2004; Yuan κ.ά., 2006). Η τρίτη φάση αφορά στην μεταφορά των προαναφερθέντων συμπλόκων (μορίων του ζιζανιοκτόνου με τις πρόσθετες ομάδες) στο χυμοτόπιο ή σε εξωκυτταρικούς χώρους. Η μεταφορά αυτή γίνεται με την κατανάλωση ενέργειας και υλοποιείται από τους ABC μεταφορείς (ATP-binding cassette transporters) (Bartholomew κ.ά., 2002; Klein κ.ά., 2006; Yuan κ.ά., 2006). Η τέταρτη φάση μεταβολισμού αφορά στην αποδόμηση των σύμπλοκων μορίων στο χυμοτόπιο και τους εξωκυτταρικούς χώρους. Στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων συμμετέχουν τέσσερις ομάδες γονιδίων που εκφράζουν τα ένζυμα CytP450 μονοoξυγονάσες, γλουταθειόνη-s-τρανσφεράσες, γλυκοσυλοτρανσφεράσες και τους ABC μεταφορείς (Yuan κ.ά., 2006) Μονοξυγονάσες CytP450 Η ομάδα των CytP450 γονιδίων κωδικοποιεί τις πιο ευπροσάρμοστες ομάδες ενζύμων οι οποίες εμπλέκονται στην πρώτη φάση της διαδικασίας μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων. Συγκεκριμένα, κωδικοποιούν ένζυμα τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες καταλύουν NADPH εξαρτώμενες αντιδράσεις ενσωμάτωσης ενός ατόμου οξυγόνου (Σχήμα 13). Ηλεκτρόνια από το NADPH μεταφέρονται στις P450 μονοξυγονάσες από την CytP450 αναγωγάση-ρεδουκτάση του κυτοχρώματος. Το αποτέλεσμα των αντιδράσεων που καταλύουν οι CytP450 μονοξυγονάσες είναι οξυγονωμένα μόρια (μόρια ζιζανιοκτόνων) τα οποία είναι πιο διαλυτά και ως εκ τούτου πιο ενεργά ως προς την συμμετοχή τους σε αντιδράσεις σχηματισμού συμπλόκων (τα αποδομημένα μόρια να είναι πιο ευάλωτα σε περαιτέρω αντιδράσεις μεταβολισμού) (Inui και Ohkawa, 2005; Schuler και Werek-Reichhart, 2003; Yuan κ.ά., 2006).

49 48 Σχήμα 13. Σχηματική αναπαράσταση των P450, GST, γλυκοσυλτρανσφεράση και ABC μεταφορέα. Το σχήμα περιγράφει τέσσερα στάδια μεταβολισμού ζιζανιοκτόνων α) την δράση των μονοξυγονασών P450 β) την δράση της GST (γλουταθειόνη-s-τρανσφεράση) γ) την ενεργό μεταφορά με ΑΒC μεταφορείς και δ) τον μεταβολισμό στο χυμοτόπιο (Βιβλιογραφία). Τα φυτά υπερέχουν σε αριθμό και παραλλακτικότητα P450 γονιδίων σε σχέση με τους ζωικούς οργανισμούς. Το γεγονός αυτό εικάζεται ότι οφείλεται στην ανάγκη των φυτών να είναι πιο ευπροσάρμοστα λόγω της αδυναμίας τους να αλλάξουν ενδιαίτημα (Yuan κ.ά., 2006). Συγκεκριμένα, το είδος Arabidopsis thaliana έχει 246 P450 γονίδια και 26 ψευδογονίδια τα οποία ομαδοποιούνται σε 44 υποοικογένειες γονιδίων. Παρόμοιες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι και άλλα φυτικά είδη έχουν εξίσου μεγάλο αριθμό P450 γονιδίων (Nelson κ.ά., 2004). Η μεγάλη παραλλακτικότητα των P450 γονιδίων στα φυτά επιτρέπει τον μεταβολισμό μεγάλου εύρους χημικών ουσιών, γεγονός το οποίο πρέπει να ληφθεί υπόψη σε ότι αφορά την εμπλοκή των συγκεκριμένων γονιδίων στην ανθεκτικότητα των φυτών στα ζιζανιοκτόνα (Yuan κ.ά., 2006). Επίσης, η δυνατότητα των συγκεκριμένων γονιδίων να διπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται αποτελούν απόδειξη της δυναμικής εξέλιξης των P450 γονιδίων. Τέλος, το μεγάλο εύρος των υποστρωμάτων που μπορεί να καταλύει ένα P450 ένζυμο πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη κατά τη μελέτη της ανθεκτικότητας λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων (Yuan κ.ά., 2006). Ο ρόλος των P450 μονοξυγονασών στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα κατανοήθηκε από αρκετές εργασίες. Συγκεκριμένα, ο ρόλος των P450 ενζύμων στην ανθεκτικότητα της αλεπονουράς (Alopecurus myosuroides) στο chlorotoluron επιβεβαιώθηκε μετά από την εφαρμογή αναστολέων της δράσης των εν λόγω ενζύμων καθώς και από τον προσδιορισμό των μεταβολιτών του ζιζανιοκτόνου μετά την εφαρμογή του τελευταίου (Yuan κ.ά., 2006). Με παρόμοιο τρόπο έχει διαπιστωθεί ο ρόλος των P450 μονοξυγονασών σχετικά με την ανθεκτικότητα διαφόρων ειδών ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα του Πίνακα 2. Επίσης, υπάρχουν δεδομένα σχετικά με την ευρεία σταυρανθεκτικότητα που προσδίδουν τα εν λόγω

50 49 ένζυμα σε ζιζανιοκτόνα. Το γεγονός αυτό καθιστά δύσκολη την διαχείριση και την καταπολέμηση πληθυσμών ή βιοτύπων ζιζανίων με ανθεκτικότητα λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων (Cocker κ.ά., 2001; Letouze και Gasquez, 2003; Yun κ.ά., 2005). Πίνακας 2: Ανθεκτικότητα λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων μέσω των μονοοξυγονασών (P450s), γλουταθειόνη-s-τρανσφερασών (GSTs) και γλυκοζυλτρανσφερασών (Yuan, κ.ά. 2006). ΓΟΝΙΔΙΑ ΖΙΖΑΝΙΟ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ P450 Alopecurus myosuroides Chlorotoluron P450 Stellaria media Mecaprop P450 Lolium rigidum Diclofop-methyl P450 Lolium rigidum Diuron, atrazine, simazine P450 Lolium rigidum Chlorsulfuron P450 Alopecurus myosuroides Chlorotoluron P450 Avena sterilis Diclofop-methyl P450 Phalaris minor Isoproturon P450 Sinapis arvensis Ethametsulfuron-methyl P450 Digitaria sanguinalis Fluazifop-P-butyl P450 Alopecurus myosuroides Flenoxaprop-p-ethyl P450 Lolium spp. Diclofop-methyl P450 P450 Lolium multiflorum Alopecurus myosuroides Diclofop-methyl, fluazifop-p-butil, tralkoxydim, isoproturon, cycloxydim Aryloxyphenoxypropionates (fops), flupyrsulfuron, fenoxaprop-p, ureas, haloxyfop, clodinafop P450 Echinochloa phyllopogon Bispyribac-sodium, fenoxaprop-ethyl, thiobencard GST Abutilon theophrasti Atrazine GST GST Alopecurus myosuroides Lolium multiflorum Fenoxaprop-ethyl και μέτρια ανθεκτικό στα chlorotoluron, diclofop-methyl, fluazifop- P-butil, tralkoxydim Diclofop-methyl, fluazifop-p-butil, tralkoxydim, isoproturon, cycloxydim GST Alopecurus myosuroides Aryloxyphenoxypropionates (fops), flupyrsulfuron, fenoxaprop-p, ureas, haloxyfop, clodinafop Glycosyltransferase Alopecurus myosuroides Διάφορα ζιζανιοκτόνα Επιπλέον δεδομένα σχετικά με την συμμετοχή των P450 μονοξυγονασών στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα προκύπτουν από την παράλληλη εφαρμογή των τελευταίων με προστατευτικές ουσίες (safeners). Για παράδειγμα, η εφαρμογή προστατευτικών ουσιών στον αραβόσιτο μπορεί να επάγει την έκφραση

51 50 ορισμένων P450 γονιδίων καθώς και άλλων γονιδίων που εκφράζουν GS τρανσφεράσες και ABC μεταφορείς (Yuan κ.ά., 2006) Γλουταθειόνη-S-τρανσφεράση Η ομάδα των γονιδίων της γουταθειόνης-s-τρανσφεράσης (GST) έχει διαπιστωθεί να εμπλέκεται, όπως και τα P450 γονίδια, σε ανθεκτικότητα ζιζανίων λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων. Τα φυτικά ένζυμα GST είναι πολυλειτουργικά ένζυμα και καταλύουν την ένωση της γουταθειόνης (γ-glutamylcysteinyl-glycine) ή της ομογλουταθειόνης στα ψυχανθή με διάφορα υποστρώματα (R-Χ) με αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση S-γλουταθειολυμένων πολικών προϊόντων (R- SG). Επειδή τα R-Χ υποστρώματα είναι συνήθως υδρόφοβες τοξικές ενώσεις, τα GST ένζυμα παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την φάση ΙΙ του μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων. Επίσης, είναι σε θέση να καταλύσουν αντιδράσεις ενσωμάτωσης της γλουταθειόνης απευθείας σε μόρια ζιζανιοκτόνων (Yuan κ.ά., 2006). Τα προϊόντα των αντιδράσεων που καταλύουν τα ένζυμα GST μεταφέρονται στο χυμοτόπιο κατά τη φάση ΙΙΙ του μεταβολισμού από ABC μεταφορείς (Reade κ.ά. 2004; Yuan κ.ά., 2006). Τα ένζυμα GST, όπως και οι P450 μονοξυγονάσες, χαρακτηρίζονται από μεγάλη παραλλακτικότητα και προσαρμοστικότητα με αποτέλεσμα να είναι σε θέση να καταλύουν τον μεταβολισμό μεγάλου εύρους χημικών ουσιών καθώς και να συμμετέχουν στην βιοσύνθεση μεγάλου εύρους δευτερογενών μεταβολιτών (Yuan, κ.ά. 2006). Τα GST ένζυμα αναφέρθηκαν ως αιτία ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα το Συγκεκριμένα, βρέθηκαν υπεύθυνα για την ανθεκτικότητα αγρωστωδών ζιζανίων στο ζιζανιοκτόνο ατραζίνη (Jeansen κ.ά., 1977; Yuan κ.ά., 2006). Επίσης, σε έναν βιότυπο αγριοβαμβακιάς διαπιστώθηκε ότι η ανθεκτικότητα στο ίδιο ζιζανιοκτόνο οφειλόταν σε αυξημένη δράση των ενζύμων GST σε σχέση με τον ευαίσθητο βιότυπο του ζιζανίου (Anderson κ.ά., 1991). Αυτό που χρήζει ιδιαίτερης μνείας είναι ότι η ανθεκτικότητα λόγω δράσης των ενζύμων GST μπορεί να οδηγήσει σε ευρεία σταυρανθεκτικότητα ή πολλαπλή ανθεκτικότητα και μάλιστα σε ορισμένες περιπτώσεις ευρύτερη από την αντίστοιχη ανθεκτικότητα λόγω της δράσης των μονοξυγονασών P450 (Cocker κ.ά., 2001; Cummins κ.ά., 1999; Hall κ.ά., 1997; Letouze και Gasquez, 2003; Yuan κ.ά., 2006). Η αιτία της αυξημένης δράσης αυτών των ενζύμων είναι η υπερέκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τα ένζυμα GST (Cummins κ.ά., 1997; Cummins κ.ά., 1999).

52 Γλυκοζυλτρανσφεράσες Οι γλυκοζυλτρανσφεράσες αποτελούν διαφορετική ομάδα ενζύμων που δρουν επίσης κατά τη φάση ΙΙ του μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων εντός του φυτού. Τα ένζυμα αυτά κωδικοποιούνται από μεγάλη οικογένεια γονιδίων και καταλύουν την ένωση ενός μορίου γλυκόζης σε μεγάλο εύρος λιπόφιλων μορίων όπως είναι οι φυτικές ορμόνες, οι δευτερογενείς μεταβολίτες και ξενοβιοτικές ουσίες όπως είναι τα ζιζανιοκτόνα (Bowles κ.ά., 2005). Η προσθήκη γλυκόζης επιτρέπει στο κύτταρο να διαφοροποιήσει τους δευτερογενείς μεταβολίτες, να διατηρήσει την ομοιόσταση του κυττάρου ελέγχοντας τα επίπεδα των φυτικών ορμονών και επιπλέον να συμβάλλει στο μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων (Yuan, κ.ά. 2006). Τα ένζυμα αυτά καταλύουν την προσθήκη ενός μορίου γλυκόζης σε ομάδες -OH, -COOH, -NH2, and SH του μορίου δέκτη και, ανάλογα με την ομάδα στην οποία προσθέτουν το μόριο, χαρακτηρίζονται ως Ο-γλυκοζυλοτρανσφεράσες ή Ν-γλυκοζυλοτρανσφεράσες (Bowles κ.ά., 2006). Οι δύο κατηγορίες γλυκοζυλοτρανσφερασών έχουν βρεθεί να εμπλέκονται σε αντιδράσεις μεταβολισμού ζιζανιοκτόνων στο φυτικό κύτταρο (Bowles κ.ά., 2006; Brazier κ.ά., 2002). Συγκεκριμένα, η πρώτη περίπτωση ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα λόγω δράσης των γλυκοζυλτρανσφερασών αναφέρθηκε στο ζιζάνιο αλεπονουρά (Alopecurus myosuroides) κατά το 2002 (Brazier κ.ά., 2002) ΑΒC μεταφορείς Οι ΑΒC μεταφορείς προσδίδουν ανθεκτικότητα στα ζιζάνια μέσω της μετακίνησης των ζιζανιοκτόνων και των μεταβολιτών τους εντός των χυμοτοπίων (Φάση ΙΙΙ, Σχήμα 2Χ) (Yuan κ.ά., 2006). Ειδικότερα, οι ΑΒC μεταφορείς κωδικοποιούνται εντός των φυτών από περισσότερες σε αριθμό και με μεγαλύτερη παραλλακτικότητα οικογένειες γονιδίων από ό,τι εντός των άλλων οργανισμών. Το γεγονός αυτό καθιστά τους συγκεκριμένους μεταφορείς ικανούς να μεταφέρουν μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων. Οι ΑΒC μεταφορείς βρίσκονται στις μεμβράνες και διαθέτουν μία ή δύο θέσης πρόσδεσης ΑΤP. Η υδρόλυση του ΑΤP παρέχει την απαραίτητη ενέργεια για την μεταφορά (Yuan κ.ά., 2006). Στα ανώτερα φυτά οι εν λόγω μεταφορείς έχουν χαρακτηριστεί για ένα μεγάλο εύρος λειτουργιών. Συγκεκριμένα, η απέκκριση τοξικών μορίων, η απομάκρυνση δευτερογενών μεταβολιτών, η μεταφορά λιπαρών οξέων και φωσφολιπιδίων, η μεταφορά των

53 52 καταβολιτών της χλωροφύλλης, της αυξίνης καθώς και βαρέων μετάλλων είναι μερικές από τις λειτουργίες που στις οποίες δραστηριοποιούνται οι συγκεκριμένοι μεταφορείς ώστε να επιτευχθεί η ομοιόσταση του κυττάρου (Schulz και Kolukisaglu, 2006; Yuan κ.ά., 2006). 2.7 Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής ήταν η διερεύνηση του μηχανισμού ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών του ζιζανίου ήρα λεπτή στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS. Ειδικότερα, έγιναν πειράματα αλληλούχησης τμήματος του ALS γονιδίου με σκοπό τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων που οδηγούν σε αντικαταστάσεις αμινοξέων στο ένζυμο ALS, οι οποίες είναι υπεύθυνες για μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του. Επίσης, αξιολογήθηκε η δράση του ενζύμου ALS από τέσσερις (4) ανθεκτικούς και τρεις (3) μετρίως ανθεκτικούς πληθυσμούς στο chlorsulfuron από το νομό Θεσσαλονίκης καθώς και από έναν (1) ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου (από το αγρόκτημα του Α.Π.Θ.) παρουσία των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron, tribenuron (σουλφονυλουρίες) και imazamox (ιμιδαζολινόνη). Τέλος, για τη διερεύνηση πιθανής ύπαρξης μηχανισμού ανθεκτικότητας λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων, μελετήθηκε η επίδραση του εντομοκτόνου malathion (ισχυρού αναστολέα των CytP450 μονοξυγονασών υπεύθυνων για τον μεταβολισμό του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron) στην ένταση ανθεκτικότητας ενός ανθεκτικού πληθυσμού [με μετάλλαξη στο γονίδιο ALSαντικατάσταση προλίνης 197 (Pro 197 ) από αλανίνη (Ala) στο ένζυμο ALS], ενός μετρίως ανθεκτικού πληθυσμού (χωρίς μετάλλαξη στο γονίδιο ALS) και του ευαίσθητου πληθυσμού από το αγρόκτημα του A.Π.Θ.

54 53 3. Πειραματικές εργασίες 3.1. Υλικά και Μέθοδοι Προέλευση σπόρων και παραγωγή φυτικού υλικού Σπόρος από τέσσερις ανθεκτικούς, τρεις μετρίως ανθεκτικούς και από έναν ευαίσθητο πληθυσμό (Αγρόκτημα Α.Π.Θ.) του ζιζανίου ήρα λεπτή χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του φυτικού υλικού των πειραμάτων διερεύνησης της μοριακής (αλληλούχηση DNA) και της ενζυμικής (δράση ενζύμου ALS) βάσης της ανθεκτικότητας των προαναφερθέντων πληθυσμών (Πίνακας 3, Σχήμα 14). Πίνακας 3. Πληθυσμοί (επτά ανθεκτικοί και ένας ευαίσθητος) του ζιζανίου ήρα λεπτή που αξιολογήθηκαν στα πειράματα ελέγχου της μοριακής (αλληλούχηση DNA) και της ενζυμικής (δράση ενζύμου ALS) βάσης της ανθεκτικότητας. Πληθυσμός Περιοχή Νομός Χαρακτηρισμός Ρ01 Ζαγκλιβέρι Θεσσαλονίκης Ανθεκτικός Ρ02 Ζαγκλιβέρι Θεσσαλονίκης Ανθεκτικός Ρ03 Καλαμωτό Θεσσαλονίκης Ανθεκτικός Ρ04 Καλαμωτό Θεσσαλονίκης Ανθεκτικός Ρ05 Φιλαδέλφι Θεσσαλονίκης Μετρίως ανθεκτικός Ρ06 Φιλαδέλφι Θεσσαλονίκης Μετρίως ανθεκτικός Ρ07 Φιλαδέλφι Θεσσαλονίκης Μετρίως ανθεκτικός Ρ08 Αγρόκτημα Α.Π.Θ. Θεσσαλονίκης Ευαίσθητος Σπόροι του ζιζανίου τοποθετήθηκαν σε διηθητικό χαρτί εμποτισμένο με 5 ml αιωρήματος chlorsulfuron συγκέντρωσης 3, 0,5 και 0 mg δ.ο. L -1. Οι σπόροι των ανθεκτικών φυτών φύτρωσαν και ακολούθως τα φυτά αναπτύχθηκαν κανονικά παρουσία της μεγάλης συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου, ενώ τα ευαίσθητα φυτά δεν αναπτύχθηκαν παρουσία 0,5 mg chlorsulfuron L -1 (Βασιλείου κ.ά., 2006). Η προβλάστηση των σπόρων σε αιώρημα του ζιζανιοκτόνου πραγματοποιήθηκε για την επιλογή ανθεκτικών φυτών που θα χρησιμοποιούνταν στις πειραματικές εργασίες, αλλά και για την επιβεβαίωση της ανθεκτικότητας των χαρακτηρισμένων ως ανθεκτικών (R) πληθυσμών και της ευαισθησίας των χαρακτηρισμένων ως ευαίσθητων (S) πληθυσμών (Σχήμα 15).

55 54 Σχήμα 14. Περιοχές προέλευσης των επτά ανθεκτικών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού του ζιζανίου ήρα λεπτή. Σχήμα 15. Προβλάστηση σπόρου από τους επτά ανθεκτικούς και τον ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου ήρα λεπτή παρουσία 3,0 και 0,5 mg chlorsulfuron L -1. Οι σπόροι των ανθεκτικών πληθυσμών φυτρώνουν και αναπτύσσονται παρουσία 3,0 mg ζιζανιοκτόνου L -, ενώ τα ευαίσθητα άτομα φυτρώνουν αλλά δεν αναπτύσσονται παρουσία 0,5 mg chlorsulfuron L -1. Τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν ικανοποιητικά (μήκος ρίζας ίσο με το αντίστοιχο του μάρτυρα) παρουσία 3 mg chlorsulfuron L -1 μεταφυτεύθηκαν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 8 x 7 x 7 cm γεμισμένα με μείγμα τύρφης και εδάφους (1:1 v/v). Συνολικά μεταφυτεύτηκαν δέκα φυτά από κάθε πληθυσμό. Από τον ευαίσθητο πληθυσμό επιλέχθηκαν για μεταφορά σε φυτοδοχεία φυτά που βλάστησαν απουσία ζιζανιοκτόνου (μάρτυρας). Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκε ένα φυτό. Στο στάδιο των 3-5 αδελφιών τα φυτά μεταφυτεύθηκαν σε μεγαλύτερα φυτοδοχεία για καλύτερη

56 55 ανάπτυξή τους (Σχήμα 16). Κατά τη διάρκεια της αύξησης των φυτών ελήφθη μέριμνα για τακτική άρδευση και λίπανση σύμφωνα με τις ανάγκες των φυτών για ομαλή ανάπτυξη. Τα αναπτυχθέντα μεμονωμένα φυτά χρησιμοποιήθηκαν για την παραλαβή του απαραίτητου φυτικού υλικού στις πειραματικές εργασίες αξιολόγησης της δράσης του ενζύμου ALS και της μοριακής βάσης (αλληλούχηση ALS γονιδίου) της ανθεκτικότητας. Σχήμα 16. Ανάπτυξη ανθεκτικών ή ευαίσθητων φυτών για την παραγωγή του απαραίτητου για τις πειραματικές εργασίες φυτικού υλικού Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών ήρας Απομόνωση του γενωμικού DNA Δείγματα 100 mg ιστού συλλέχτηκαν από τα ελάσματα των φύλλων 3-5 μεμονωμένων φυτών από κάθε ανθεκτικό πληθυσμό και των φύλλων τριών φυτών του ευαίσθητου πληθυσμού. Τα δείγματα ιστού τοποθετήθηκαν σε μικροσωλήνες φυγοκέντρησης όγκου 1,5 ml, αφυδατώθηκαν υπό ψύχος για 72 ώρες και αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου έως την εκχύλιση του γενωμικού DNA. Η απομόνωση του γενωµικού DNA από τα φυτά κάθε πληθυσμού (ανθεκτικού ή ευαίσθητου) έγινε µε χρήση εµπορικά διαθέσιµου συνόλου αντιδραστηρίων και υλικών µε προδιαγεγραμμένο τρόπο και χρονική σειρά χρήσης ακολουθώντας τη CTAB μεθοδολογία όπως περιγράφεται στις οδηγίες του παρασκευαστή. Από τη διαδικασία εκχύλισης παραλήφθηκαν 100 μl διαλύματος γενωμικού DNA το οποίο διατηρήθηκε στους -20 o C έως την χρήση του ως εκμαγείο στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Ενίσχυση και αλληλούχηση τμήματος του ALS γονιδίου Το γενωμικό DNA των ανθεκτικών και του ευαίσθητου πληθυσμού ήρας χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την ενίσχυση τμήματος του ALS γονιδίου (413 bp)