ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΟKΤΩ (8) ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΗΡΑΣ ΛΕΠΤΗΣ (Lolium rigidum) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Α. Π. Θ. ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ: ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΟKΤΩ (8) ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΗΡΑΣ ΛΕΠΤΗΣ (Lolium rigidum) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΕΥΓΕΝΙΑ Γ. ΝΤΑΛΙΑΝΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επιβλέπων καθηγητής: Η. Γ. Ελευθεροχωρινός Θεσσαλονίκη 2011

2 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5 SUMMARY 7 1. Εισαγωγή Γενική Εισαγωγή Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Ανασκόπηση Βιβλιογραφίας Βιολογία του ζιζανίου ήρα (Lolium rigidum Gaudin.) Ορισμοί - Ορολογία Αντιμετώπιση του ζιζανίου ήρα Σουλφονυλουρίες (Sulfonylureas) Ιµιδαζολινόνες (Imidazolinones) Πυριµιδινυλοβενζοϊκά οξέα (Pyrimidinylbenzoates) Τριαζολοπυριµιδίνες (Triazopyrimidines) Σουλφονυλαµινοκαρβονυλοτριαζολινόνες (Sulfonylaminocarbonyltriazolinones) Ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα Ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της βιοσύνθεσης των αμινοξέων με διακλαδισμένη αλυσίδα (ένζυμο ALS ή AHAS) Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων 22

3 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων στην Ελλάδα Δομή και δράση του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) - Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας Η γονιδιακή βάση του ενζύµου ALS Δομή του ενζύµου ALS Δράση του ενζύµου ALS Μοριακή βάση της σύνδεσης μεταξύ του ενζύµου ALS και των ζιζανιοκτόνων και αναστολή της ενζυμικής δράσης του Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράση του ενζύµου ALS Σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Mετουσιωτική υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (DHPLC) Ενίσχυση αλληλοµόρφων γονιδίων µε αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction Amplification of Specific Alleles, PCR) Πολυµορφισµός μήκους θραύσματος DNA με ένζυμα περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) Ανάλυση καμπυλών τήξεως (HRM) υψηλής διακριτικής ικανότητας Πειραματικές εργασίες Υλικά και Μέθοδοι Προέλευση σπόρων και παραγωγή φυτικού υλικού Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών ήρας Απομόνωση του γενωμικού DNA Ενίσχυση και αλληλούχηση τµήµατος του ALS γονιδίου 48

4 Αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) από φυτά επτά ανθεκτικών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας Εκχύλιση του ενζύµου ALS Δοκιμή της δράσης του ενζύµου ALS Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα και Συζήτηση Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας οκτώ πληθυσμών ήρας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron Στοίχιση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων και ανάλυση των χρωµατογραφηµάτων αλληλούχησης Αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) από επτά ανθεκτικούς και έναν ευαίσθητο πληθυσμό ήρας Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, imazamox και mesosulfuron στη δράση του ενζύµου ALS Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 66 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 76

5 4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Επιθυμώ να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό, για την αμέριστη συμπαράσταση που έδειξε στην προσπάθειά μου να εκπονήσω τη μεταπτυχιακή μου διατριβή. Ειδικότερα, τον ευχαριστώ για την ανάθεση, το σχεδιασμό και την εποπτεία των πειραμάτων, τη βοήθειά του κατά την ερμηνεία των δεδομένων, καθώς επίσης και για τις πολύτιμες οδηγίες και υποδείξεις κατά τη διάρκεια της συγγραφής αυτής της εργασίας, οι οποίες ήταν καθοριστικές για την πληρότητά της ως προς το περιεχόμενο, τη δομή και την παρουσίασή της. Θερμές ευχαριστίες εκφράζονται επίσης στους κ.κ. Χρήστο Δόρδα, επίκουρο καθηγητή του Α.Π.Θ. (Γεωπονική Σχολή) και Ιωάννη Τσιάλτα, Λέκτορα του Α.Π.Θ. (Γεωπονική Σχολή), μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Ευχαριστώ το διδάκτορα του Α.Π.Θ. κ. Νικόλαο Καλούμενο για τις πολύτιμες υποδείξεις και τη βοήθειά του κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων, αλλά και για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις του. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Βασιλική Τσιώνη για την άριστη συνεργασία κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους γονείς μου για την αμέριστη συμπαράστασή τους καθ όλη τη διαρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής, αλλά και για τη συνεχή οικονομική υποστήριξη που μου παρείχαν. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά το σύντροφό μου για την αμέριστη συμπαράστασή του και τη συνεχή βοήθεια και ενθάρρυνση που μου παρείχε κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών.

6 5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σε πειράματα διερεύνησης του μηχανισμού ανθεκτικότητας του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin.) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron, αξιολογήθηκαν επτά (7) ανθεκτικοί πληθυσμοί και ένας (1) ευαίσθητος πληθυσμός του ζιζανίου ως προς την ύπαρξη υπεύθυνων για την ανθεκτικότητα μεταλλάξεων στο ALS γονίδιο (αλληλούχηση του ALS γονιδίου) καθώς και τη δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS. Η αλληλούχηση του ALS γονιδίου έδειξε μεταλλάξεις υπεύθυνες για ανθεκτικότητα και συγκεκριμένα στο κωδικόνιο του αμινοξέος προλίνη 197 (Pro 197 ) (CCG) [αρίθμηση με βάση το γένωμα του φυτικού είδους Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]. Ειδικότερα, μεταλλάξεις διαπιστώθηκαν στην πρώτη, δεύτερη και δεύτερη και τρίτη βάση του κωδικονίου. Επίσης, οι μεταλλάξεις διαπιστώθηκαν στο ένα μόνο αλληλόμορφο (R/S ετεροζυγωτία) ή και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια (R/R ομοζυγωτία, R 1 /R 2 ετεροζυγωτία). Οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις είχαν ως συνέπεια την αντικατάσταση της Pro 197 με ένα από πέντε διαφορετικά αμινοξέα. Συγκεκριμένα, σε εννέα άτομα (φυτά) πέντε πληθυσμών διαπιστώθηκε αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 από αλανίνη (Ala), ενώ σε δύο άτομα ενός πληθυσμού διαπιστώθηκε αντικατάσταση της Pro 197 από λευκίνη (Leu) και σε δύο άτομα ενός άλλου πληθυσμού αντικατάστασή της από αργινίνη (Arg). Σε ένα άτομο διαπιστώθηκε αντικατάσταση του ίδιου αμινιξέος από γλουταμίνη (Gln), ενώ σε δύο άτομα ενός πληθυσμού του ζιζανίου παρατηρήθηκε ταυτόχρονη παρουσία δύο μεταλλάξεων, η οποία δεν επέτρεψε τον ακριβή προσδιορισμό του αμινοξέος αντικατάστασης. Στις περιπτώσεις αυτές, η αντικατάσταση της Pro 197 από την ιστιδίνη (His) ήταν πιθανή. Η καταλυτική δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS επτά ανθεκτικών πληθυσμών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας αξιολογήθηκε παρουσία έξι (6) συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron και imazamox. Για το σκοπό αυτό, εκχυλίστηκαν οι πρωτεΐνες από φυτά των προαναφερθέντων πληθυσμών. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε φασµατοφωτοµετρικά µε μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 520 nm (A 520nm ), ενώ όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ακολούθως ως ποσοστό της απορρόφησης του μάρτυρα (αντίδραση απουσία ζιζανιοκτόνου). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με σκοπό την εξεύρεση της εξίσωσης που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου και δράσης του ενζύμου ALS, ενώ στη συνέχεια υπολογίστηκε, για κάθε πληθυσμό, η συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου

7 6 που προκαλεί μείωση της δράσης του ενζύμου ALS κατά 50% (τιμή I 50 ). Ακολούθως, υπολογίστηκε η ένταση ανθεκτικότητας (R/S) ως το κλάσμα της I 50 τιμής των ανθεκτικών πληθυσμών ως προς την αντίστοιχη I 50 τιμή του ευαίσθητου πληθυσμού. H μεγαλύτερη ένταση ανθεκτικότητας (R/S) των πληθυσμών διαπιστώθηκε για το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron (R/S = 4,2 >320), ενώ μικρότερες τιμές υπολογίσθηκαν για το mesosulfuron (R/S = 4 49,9) και imazamox (R/S = 0,5 1). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 από Ala, Leu, Gln, Arg, ή His είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS (σταυρανθεκτικότητα) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron, ενώ οι ίδιες αντικαταστάσεις δεν επηρέασαν την ευαισθησία του ALS ενζύμου στο ζιζανιοκτόνο imazamox. Αυτό σημαίνει ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία των πληθυσμών της ήρας στις σουλφονυλουρίες (chlorsulfuron και mesosulfuron) αλλά όχι στις ιμιδαζολινόνες (imazamox).

8 7 SUMMARY Experiments were conducted to investigate one (1) sensitive and seven (7) resistant rigid ryegrass (Lolium rigidum Gaudin.) populations for possible existence of mutations in their ALS gene (DNA sequencing), which are responsible for ALS resistance to herbicides chlorsulfuron and mesosulfuron. The ALS sequencing showed mutations on the codon 197 (Pro 197 ) (CCG) [numbering based on Arabidopsis thaliana (L.) Heynh sequence]. In particular, mutations were found at the first, second, and second and third base of this codon, whereas these mutations were found either in one allele (R/S heterozygosity) or in both alleles (R/R homozygosity, R 1 /R 2 heterozygosity). These mutations resulted in the substitution of Pro by five different amino acids. More specifically, nine plants of five resistant populations had substitution of the Pro 197 by alanine (Ala), whereas two plants of one population had substitution at the same amino by leucine (Leu) and two plants of another population by arginine (Arg). However, one plant had substitution by glutamine (Gln) and two plants of another population had two mutations simultaneously. Regarding the later, it was impossible to determine accurately the amino acid substitution but it is possible that Pro 197 was substituted by histidine (His). ALS in vitro experiments were also conducted to study the activity of the ALS enzyme (protein fraction showing ALS activity) extracted from one sensitive and seven resistant rigid ryegrass populations in the presence of six (6) concentrations of chlorsulfuron, mesosulfuron and imazamox. The extracted protein fraction with ALS activity was used to catalyze the condensation of two pyruvate molecules to form acetolactate. The data obtained from the conducted tests (absorption at Α 520 nm) were expressed as percentage (%) of the absorption recorded in the control samples (reaction absence herbicide). Also, the concentration of herbicide that causes 50% reduction of ALS activity (I 50 value) was estimated for every population. The estimated I 50 values were used to calculate the resistance factor (R/S) as the I 50 value of the resistant population divided by the respective I 50 value of the sensitive population. The highest resistance factor was estimated for the herbicide chlorsulfuron (R/S = 4,2 >320), the moderate for mesosulfuron (R/S = 4 49,9) and the lowest was estimated for imazamox (R/S = 0,5 1). These data indicated that the Pro 197 substitution by Ala, Leu, Gln, Arg or His resulted in reduced ALS sensitivity to the herbicides chlorsulfuron and mesosulfuron, whereas the Pro 197 substitution did not

9 8 affect the ALS sensitivity to herbicide imazamox. Therefore, these results clearly suggest that amino acid substitution at the codon 197 (Pro 197 ) was related with high ALS resistance to sulfonylureas (chlorsulfuron and mesosulfuron) but not to imidazolinones (imazamox).

10 9 1. Εισαγωγή 1.1. Γενική εισαγωγή Η ήρα η λεπτή (Lolium rigidum Gaudin.) είναι ετήσιο ζιζάνιο που απαντάται με μεγάλη συχνότητα κυρίως στις καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών και δευτερευόντως σε άλλες χειμερινές και πρώιμες ανοιξιάτικες καλλιέργειες (Ελευθεροχωρινός και Γιαννοπολίτης, 2009). Η προσαρμοστικότητά της σε μεγάλο εύρος οικολογικών συνθηκών αλλά και η γενετική της παραλλακτικότητα την καθιστούν ένα από τα πιο εξαπλωμένα ζιζάνια παγκοσμίως (Délye κ.ά., 2009). Η καταπολέμηση αυτού του ζιζανίου είναι απαραίτητη επειδή σε μεγάλες πυκνότητες προκαλεί μείωση της απόδοσης των καλλιεργειών έως και 50% (Beckie, 2006; Preston και Powles, 2002; Wu κ.ά., 1998). Η αντιμετώπιση της ήρας, εντός των χειμερινών σιτηρών, βασίζεται αποκλειστικά στη χρήση ζιζανιοκτόνων επειδή αυτά είναι πιο αποτελεσματικά αλλά και πιο οικονομικά σε σύγκριση με άλλες μεθόδους αντιμετώπισης των ζιζανίων (Wilson κ.ά., 1995). Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιούνται ευρέως για την αντιμετώπιση πλατύφυλλων αλλά και αγρωστωδών ζιζανίων και ειδικότερα της ήρας στα χειμερινά σιτηρά είναι αυτά που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση [AcetoLactate Synthase (ALS), EC ]. Η ομάδα των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS αναπτύχθηκε το 1977, ενώ η πρώτη δραστική ουσία (chlorsulfuron) πήρε έγκριση κυκλοφορίας για χρήση το Η ανάπτυξη αυτών των ζιζανιοκτόνων θεωρείται ως ένα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα στην ιστορία της ζιζανιολογίας, αφού συνέβαλε καθοριστικά στην αποτελεσματική αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε πολλές καλλιέργειες και μάλιστα με τη μικρότερη επιβάρυνση στον άνθρωπο και στο περιβάλλον (Tranel και Wright, 2002). Ο εφησυχασμός των περισσότερων γεωργών εξαιτίας της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης των ζιζανίων με τη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων και κυρίως η εμμονή τους για συνεχή και μη εναλλασσόμενη (με ζιζανιοκτόνα διαφορετικού μηχανισμού δράσης) χρήση τους αύξησε την πιθανότητα ανάπτυξης βιοτύπωνπληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Tranel και Wright, 2002). Έτσι, οι πρώτοι βιότυποι-πληθυσμοί ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ενζύμου ALS καταγράφηκαν στις Η.Π.Α. πέντε χρόνια μετά τη συνεχή χρήση τους (Preston και Mallory-Smith, 2001). Ακολούθως, η

11 10 ανάπτυξη νέων ανθεκτικών βιότυπων-πληθυσμών ήταν ταχύτατη με αποτέλεσμα να έχουν καταγραφεί παγκοσμίως μέχρι σήμερα 345 περιπτώσεις ανθεκτικότητας σε 107 είδη ζιζανίων, τα οποία υπερβαίνουν σε αριθμό το 50% όλων των ειδών (195) που ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα (Heap, 2011). Η ταχύτατη αύξηση των ανθεκτικών βιοτύπων-πληθυσμών στα ζιζανιοκτόνααναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS είχε ως συνέπεια την αύξηση του ενδιαφέροντος και κυρίως της ανησυχίας της παγκόσμιας ζιζανιολογικής κοινότητας. Αυτό ήταν αναμενόμενο αφού η ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων περιορίζει σημαντικά τη δυνατότητα επιλογής των ζιζανιοκτόνων και δημιουργεί ως εκ τούτου προϋποθέσεις για μείωση των αποδόσεων και υποβάθμιση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων (Ελευθεροχωρινός, 2008; Tranel και Wright, 2002). Η πρώτη αναφορά ανάπτυξης ανθεκτικότητας ζιζανίου στην Ελλάδα έγινε το 1986 και αφορούσε την αδυναμία αντιμετώπισης πληθυσμών του ζιζανίου μουχρίτσα [Echinochloa crus-galli (L.) Beauv] με το ζιζανιοκτόνο propanil (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ) (Heap, 2011). Έκτοτε, έχουν αναφερθεί άλλοι 78 βιότυποι-πληθυσμοί (ανήκουν σε εννέα είδη) ζιζανίων με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ, της δράσης του ενζύμου καρβοξυλάση του ακέτυλο-coa (ACCase), της δράσης του ενζύμου ALS ή της δράσης του ενζύμου EPSPS (Βασιλείου κ.ά., 2006; Γιαννοπολίτης κ.ά., 2008; Ελευθεροχωρινός και Παπαμιχαήλ, 2002; Eleftherohorinos κ.ά., 2000; Ευθυμιάδης κ.ά., 2008; Giannopolitis και Vassiliou, 1989; Heap, 2011; Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2009; Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2008; Kotoula-Syka κ.ά., 2000; Παπαπαναγιώτου κ.ά., 2008; Vasilakoglou κ.ά., 2000) Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Η αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος προέκυψε κατά την καλλιεργητική περίοδο του 2004 και ειδικότερα μετά από παράπονα παραγωγών για μειωμένη αποτελεσματικότητα του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron εναντίον της ήρας. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε επίσκεψη στις σιτοπαραγωγικές περιοχές των νομών Σερρών, Θεσσαλονίκης και Κιλκίς όπου παρατηρήθηκε το πρόβλημα και αποφασίστηκε κατά την θερινή περίοδο του ίδιου έτους και πριν από την συγκομιδή των χειμερινών σιτηρών να γίνει συλλογή σπόρου ήρας από αγρούς όπου η εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου δεν ήταν αποτελεσματική. Εκτεταμένος έλεγχος για την ανάπτυξη

12 11 ανθεκτικότητας με πειράματα φυτοδοχείων αλλά και με βιοδοκιμές έδειξε ότι πέντε πληθυσμοί ήρας ήταν ανθεκτικοί στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron και ισάριθμοι πληθυσμοί στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim. Όλοι οι ανθεκτικοί πληθυσμοί προέρχονταν από σιτοπαραγωγικές περιοχές του νομού Θεσσαλονίκης (Βασιλείου κ.ά., 2006). Η μελέτη για την ανάπτυξη σταυρανθεκτικότητας και πολλαπλής ανθεκτικότητας των ανθεκτικών πληθυσμών οδήγησε στο συμπέρασμα ότι τρεις ήταν σταυρανθεκτικοί στο μίγμα ζιζανιοκτόνων mesosulfuron + iodosulfuron, έξι είχαν αναπτύξει πολλαπλή ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο clodinafop propargyl και ένας στο ζιζανιοκτόνο diclofop (Ευθυμιάδης κ.ά., 2008). Κατά την θερινή περίοδο του 2008 πραγματοποιήθηκε νέα δειγματοληψία από σιτοπαραγωγικές περιοχές του νομού Χαλκιδικής και συγκεκριμένα από αγρούς όπου διαπιστώθηκε μειωμένη αποτελεσματικότητα του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron ή του μίγματος mesosulfuron + iodosulfuron. Ο προκαταρτικός έλεγχος με πειράματα φυτοδοχείων για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα συγκεκριμένα ζιζανιοκτόνα έδειξε ότι οι έξι νέοι πληθυσμοί ήταν σταυρανθεκτικοί στο chlorsulfuron και στο μίγμα mesosulfuron + iodosulfuron (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Τα όσα προαναφέρθηκαν κατέστησαν αναγκαία τη διεξαγωγή της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής όπου διερευνήθηκε ο μηχανισμός ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών του ζιζανίου ήρα στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS. Ειδικότερα, για το σκοπό αυτό, έγιναν πειράματα εργαστηρίου όπου αξιολογήθηκε η δράση του ενζύμου ALS από επτά (7) ανθεκτικούς πληθυσμούς στο chlorsulfuron (έξι από το νομό Χαλκιδικής και ένας από το νομό Θεσσαλονίκης) και έναν (1) ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου (από το αγρόκτημα του Α.Π.Θ.) παρουσία των ζιζανικτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron (σουλφονυλουρίες) και imazamox (ιμιδαζολινόνη). Στη συνέχεια, αλληλουχήθηκε τμήμα του ALS γονιδίου με σκοπό τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων που οδηγούν σε αντικαταστάσεις αμινοξέων στο ένζυμο ALS, οι οποίες είναι υπεύθυνες για μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του.

13 12 2. Ανασκόπηση Βιβλιογραφίας 2.1. Βιολογία του ζιζανίου ήρα (Lolium rigidum Gaudin) Η ήρα η λεπτή είναι ένα από τα οκτώ αναγνωρισμένα είδη του γένους Lolium, το οποίο είναι ένα από τα 339 περίπου γένη της οικογένειας Poaceae (Πίνακας 2.1). Το γένος Lolium είναι γηγενές της Ευρώπης, της Βόρειας Αφρικής και της Ασίας, αλλά πληθυσμοί του βρίσκονται σε όλες τις εύκρατες περιοχές του πλανήτη. Είναι διπλοειδές με χρωμοσωμικό αριθμό 2n=14 (Bennett, 1997). Πίνακας 2.1. Βοτανική κατάταξη του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin) ΒΑΣΙΛΕΙΟ Plantae ΥΠΟΒΑΣΙΛΕΙΟ Tracheobionta ΥΠΕΡΔΙΑΙΡΕΣΗ Spermatophyta ΔΙΑΙΡΕΣΗ Magnoliophyta ΚΛΑΣΗ Liliopsida ΥΠΟΚΛΑΣΗ Commelinidae ΤΑΞΗ Cyperales ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ Poaceae ΓΕΝΟΣ Lolium ΕΙΔΟΣ Lolium rigidum Gaudin Τα πιο κοινά είδη του γένους Lolium στην Ευρώπη είναι το πολυετές Lolium perenne L. και τα μονοετή Lolium rigidum Gaudin. και Lolium multiflorum Lam. Όλα τα είδη και τα υβρίδιά τους είναι σταυρογονιμοποιούμενα και έχουν μεγάλη μορφολογική παραλλακτικότητα. Επιπλέον, τα είδη Lolium διασταυρώνονται με είδη από τα συγγενικά τους γένη Festuca και Vulpia (Délye κ.ά., 2009). Το Lolium rigidum Gaudin. (ήρα η λεπτή) είναι ετήσιο, χειμερινό, μονοκοτυλήδονο είδος με ευρεία προσαρμοστικότητα. Φυτρώνει ως ζιζάνιο από το φθινόπωρο μέχρι την άνοιξη σε καλλιεργούμενες και μη περιοχές, ενώ δεν απαιτεί γόνιμα εδάφη για την ανάπτυξή του. Τα φυτά που εμφανίζονται νωρίς στην καλλιεργητική περίοδο ανταγωνίζονται έντονα την καλλιέργεια και προκαλούν μεγάλη μείωση της παραγωγής. Η άριστη θερμοκρασία φύτρωματος των σπόρων είναι 11 ο C (Cook κ.ά., 2005), ενώ η φυτρωτική ικανότητα των σπόρων που βρίσκονται σε βάθος μεγαλύτερο των 2 cm είναι μικρή. Βέβαια, η φυτρωτική τους

14 13 ικανότητα χάνεται μόνο αν παραμείνουν σε βάθος cm για δύο χρόνια (Cheam και Lee, 2005). Εικόνα 2.1. Ταξιανθία, ωτίδια και σπόροι του ζιζανίου ήρα. Τα φυτά της ήρας, σε πλήρη ανάπτυξη, φθάνουν μέχρι το ύψος των 90 cm. Ο βλαστός τους είναι κυλινδρικός, τραχύς, ημιπλάγιος-όρθιος με πολλά αδέλφια. Ο κολεός των φύλλων είναι ωχρο-κίτρινος, τραχύς και χωρίς τρίχες. Τα ωτίδια είναι στενά, μεγάλα και περιβάλλουν τον κολεό. Το γλωσσίδιο είναι βραχύ, μεμβρανώδες και τριγωνικό. Το έλασμα των φύλλων είναι τραχύ στην κάτω επιφάνεια και γυαλιστερό στην άνω (χαρακτηριστικό μακροσκοπικής αναγνώρισης της ήρας). Τα φύλλα των νεαρών φυτών είναι στενά και όρθια. Η ταξιανθία είναι επιμήκης στάχυς, στενός και λεπτός. Τα σταχύδια είναι πολυανθή (4-8 ανθίδια), επιμήκη, λογχοειδή και τοποθετημένα στη ράχη του σταχυού αραιά και με τη στενή πλευρά. Ο χιτώνας των ανθιδίων δεν καταλήγει σε άγανο (Ελευθεροχωρινός και Γιαννοπολίτης, 2009) (Εικόνα 2.1). Αυτό ανθοφορεί από τον Απρίλιο μέχρι τον Ιούνιο και η άνθισή του δεν επηρεάζεται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Κάθε φυτό ήρας μπορεί να παράγει μέχρι 1000 σπόρους, οι οποίοι αρχικά είναι προσκολλημένοι στην ταξιανθία. Οι σπόροι όταν αποκολληθούν από την ταξιανθία, λόγω του μικρού τους βάρους,

15 14 μετακινούνται πολύ εύκολα με τον άνεμο, το νερό και τα ζώα (Stanton κ.ά., 2002). Οι σπόροι μετά την ωρίμανση τους παραμένουν σε λήθαργο για οκτώ με εννέα εβδομάδες. Οι περιβαλλοντικές συνθήκες κατά την ωρίμανση των σπόρων επηρεάζουν άμεσα τη διάρκεια του ληθάργου. Οι υψηλές θερμοκρασίες και η υδατική καταπόνηση κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των σπόρων έχουν ως αποτέλεσμα μικρότερο αριθμό σπόρων, με μικρότερο βάρος και μικρότερη διάρκεια ληθάργου. Επίσης, η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε ορισμένα ζιζανιοκτόνα μπορεί να επηρεάσει το λήθαργο. Ορισμένοι μηχανισμοί ανθεκτικότητας των φυτών, όπως η τροποποίηση της θέσης δράσης στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων, οδηγούν σε αύξηση του ληθάργου των σπόρων και μείωση εμφάνισης των σποροφύτων (Vila-Aiub κ.ά., 2005). Η ήρα η λεπτή είναι το ζιζάνιο που προκαλεί τη μεγαλύτερη οικονομική ζημία στις καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών στην Αυστραλία (Délye κ.ά., 2009; Yu κ.ά., 2008; Preston και Powles, 2002). Επίσης, αυτό το είδος αποτελεί πρόβλημα στις καλλιέργειες ελαιοκράμβης (Brassica napus L.), αφού απαντάται στο 86% περίπου των αγρών (Lemerle κ.ά., 1999). Αναπτύσσεται σε όλες τις περιοχές του κόσμου με μεσογειακό κλίμα, ενώ στην Ελλάδα αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στις καλλιέργειες των χειμερινών σιτηρών. Η αντιμετώπισή της, στη χώρα μας, γίνεται με δυσκολία λόγω της ανάπτυξης ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα με πολλαπλούς μηχανισμούς δράσης (Kotoula-Syka κ.ά., 2000) Ορισμοί-Ορολογία Η ανθεκτικότητα ορίζεται ως η επιλεγμένη κληρονομική ικανότητα μερικών βιοτύπων ενός ζιζανίου να επιβιώνουν μετά από εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης ενός ζιζανιοκτόνου, στο οποίο ο αρχικός πληθυσμός του ζιζανίου ήταν ευαίσθητος (Ελευθεροχωρινός, 2008; De Prado και Franco, 2004). Γενικώς, οι ανθεκτικοί βιότυποι ενός ζιζανίου προϋπάρχουν στους αρχικούς πληθυσμούς και εμφανίζονται όταν υπάρξει υψηλή και συνεχής πίεση επιλογής (Holt κ.ά., 1993). Η πρώτη αναφορά ανθεκτικότητας παγκοσμίως έγινε το 1968 στις ΗΠΑ και αφορούσε πληθυσμούς του ζιζανίου Senecio vulgaris L. ανθεκτικούς στις τριαζίνες (Tranel και Wright, 2002). Ο όρος αντοχή αναφέρεται στην αρχική διαβαθμισμένη ή κλιμακούμενη (λόγω παραλλακτικότητας) µη ευαισθησία ενός ζιζανίου στη συνιστώμενη δόση ενός ζιζανιοκτόνου (Ελευθεροχωρινός, 2008; Devine κ.ά., 1993; Holt, 1993).

16 15 Η σταυρανθεκτικότητα (διασταυρωτή ανθεκτικότητα) ορίζεται ως η ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε περισσότερα από ένα ζιζανιοκτόνα που ανήκουν στην ίδια ή σε διαφορετικές οικογένειες (χημικές ομάδες) µε ίδιο μηχανισμό δράσης ή μεταβολισμού. Η ανθεκτικότητα αυτής της μορφής ελέγχεται από ένα γονίδιο (Ελευθεροχωρινός, 2008; Rubin, 1997). Η πολλαπλή ανθεκτικότητα ορίζεται ως η ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε περισσότερα από ένα ζιζανιοκτόνα που ανήκουν σε οικογένειες με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης ή μεταβολισμού (Ελευθεροχωρινός, 2008) Αντιμετώπιση του ζιζανίου ήρα Η καταπολέμηση του ζιζανίου ήρα επιτυγχάνεται με τη χρήση καλλιεργητικών μεθόδων, βιολογικών μέσων ή/και ζιζανιοκτόνων. Τα καλλιεργητικά μέτρα περιλαμβάνουν την επιλογή ανταγωνιστικών καλλιεργειών, την κατεργασία του εδάφους και την πυκνότερη σπορά των καλλιεργούμενων φυτών. Οι πιο ανταγωνιστικές καλλιέργειες στην ανάπτυξη της ήρας είναι το σιτάρι, το κριθάρι και η ελαιοκράμβη, ενώ λιγότερο ανταγωνιστικά είναι τα ψυχανθή. Η κατεργασία του εδάφους αυξάνει τον αριθμό των ζιζανίων που φυτρώνουν και επιτρέπει την καταπολέμησή τους όταν βρίσκονται σε μικρό στάδιο ανάπτυξης. Όμως, ορισμένα είδη έχοντας προσαρμόσει το χρόνο ληθάργου τους και τα χαρακτηριστικά του ριζικού τους συστήματος δεν επηρεάζονται από την κατεργασία του εδάφους (Nalewaja, 1999). Η αύξηση της πυκνότητας των καλλιεργούμενων φυτών είναι το πιο αποτελεσματικό καλλιεργητικό μέτρο, επειδή αυξάνει την ανταγωνιστικότητά τους εναντίον των ζιζανίων και αυξάνει ως εκ τούτου την απόδοση της καλλιέργειας (Beckie, 2006). Η μερική καταπολέμηση της ήρας μπορεί να γίνει με το μύκητα Pyrenophora seminiperda, ο οποίος μολύνει το σπόρο και μειώνει τελικώς τη φυτρωτική του ικανότητα και τη ζωηρότητα όσων σποροφύτων αναπτυχθούν (Campell κ.ά., 1996). Η εμφάνιση των ζιζανιοκτόνων ως μέσων αντιμετώπισης των ζιζανίων είχε ως συνέπεια την στροφή των παραγωγών εξ ολοκλήρου στη χρήση τους επειδή αποδείχθηκαν ως η αποτελεσματικότερη και οικονομικότερη μέθοδος. Η χημική καταπολέμηση της ήρας γίνεται με δινιτροανιλίνες (π.χ. trifluralin), αρυλοξυφαινοξυαλκανοικά (diclofop methyl, clodinafop), κυκλοεξανδιόνες (tralkoxydim), σουλφονυλουρίες (chlorsulfuron, triasulfuron, mesosulfuron),

17 16 ιμιδαζολινόνες (imazamox), τριαζίνες, γλυκίνες (glyphosate) και διπυριδίλια (paraquat). Οι σουλφονυλουρίες, καθώς και όλα τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (AcetoLactate Synthase, ALS) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρύτατα στην καταπολέμηση της ήρας. Ειδικότερα, στην ομάδα αυτών των ζιζανιοκτόνων, εκτός από τις σουλφονυλουρίες, ανήκουν οι ιμιδαζολινόνες, τα πυριµιδινυλθειοβενζοϊκά, οι τριαζολοπυριμιδίνες και οι σουλφονυλαμινοκαρβονυλτριαζολινόνες. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά και οι ιδιότητες των ζιζανιοκτόνων που ανήκουν στις πέντε προαναφερθείσες οικογένειες αναφέρονται παρακάτω Σουλφονυλουρίες (Sulfonylureas) Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής συνίσταται από µία αρυλοµάδα, τη σουλφονυλουρική γέφυρα και µία ετεροκυκλική ομάδα (Σχήμα 2.1). Σχήμα 2.1. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron. Η πρώτη δραστική ουσία των σουλφονυλουριών ήταν το chlorsulfuron που ανακαλύφθηκε το Το ζιζανιοκτόνο αυτό έλαβε έγκριση κυκλοφορίας για χρήση στις ΗΠΑ και στη Μ. Βρετανία το 1982, ενώ στην Ελλάδα εγκρίθηκε το Βέβαια, δέκα χρόνια μετά την ανακάλυψη του chlorsulfuron, η οικογένεια των σουλφονυλουριών περιελάμβανε 230 δραστικές ουσίες πολλές από τις οποίες ήδη έχουν έγκριση για χρήση ως ζιζανιοκτόνα σε διάφορες χώρες, ενώ άλλες βρίσκονται στα τελευταία στάδια ανάπτυξής τους ως ζιζανιοκτόνα. Τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής εφαρμόζονται στο έδαφος (προφυτρωτικά) ή/και στο φύλλωμα για την αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες. Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των φυτών και μετακινούνται στους μεριστωµατικούς ιστούς µέσω του αποπλάστη και του συµπλάστη και είναι δραστικά σε δόσεις φορές μικρότερες από τις αντίστοιχες άλλων ομάδων ζιζανιοκτόνων

18 17 (Ελευθεροχωρινός, 2008). Ο χρόνος παραμονής μερικών ζιζανιοκτόνων των σουλφονυλουριών (chlorsulfuron, metsulfuron, triasulfuron) στο έδαφος, αν και εφαρμόζονται σε πολύ χαμηλές δόσεις (1 έως 2 g δ.ο./στρ) είναι συχνά μεγαλύτερος από 12 μήνες. Αυτό έχει ως συνέπεια την αδυναμία ασφαλούς εγκατάστασης (χωρίς προβλήματα φυτοτοξικότητας) άλλων καλλιεργειών, εκτός από χειμερινά σιτηρά (όπου συνιστάται η χρήση τους), την επόμενη καλλιεργητική περίοδο. Η βάση της εκλεκτικότητας αυτών των ζιζανιοκτόνων ως προς τα καλλιεργούμενα φυτά σιτάρι, ρύζι και καλαμπόκι είναι ο μεταβολισμός τους μέσα σε αυτά. Ο μεταβολισμός επιτυγχάνεται μέσω υδροξυλίωσης και σχηματισμού συμπλόκου με τη γλυκόζη. Οι αντιδράσεις μεταβολισμού καταλύονται από οξειδάσες, όπως η μονοξυγονάση του κυτοχρώματος P450 (Corbett και Tardif, 2006α) (Σχήμα 2.2). Σχήμα 2.2. Ο μεταβολισμός του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron μέσα σε ένα φυτό σιταριού και σε ένα δικοτυλήδονο φυτό (Christopher κ.ά., 1991).

19 Ιµιδαζολινόνες (Imidazolinones) Η οικογένεια αυτή των ζιζανιοκτόνων αναπτύχθηκε μετά το Το πρώτο ζιζανιοκτόνο ήταν το imazamethabenz-methyl (1971) και ακολούθησαν τα imazapyr, imazaquin, imazethapyr, imazamox και imazapic. Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής αποτελείται από έναν αρωματικό δακτύλιο (συνήθως πυριδίνη) µε την καρβοξυλική ομάδα και τον ιµιδαζολινικό δακτύλιο (Σχήμα 2.3). Οι ιµιδαζολινόνες, όπως και οι σουλφονυλουρίες, εφαρμόζονται στο έδαφος ή/και στο φύλλωμα των ζιζανίων. Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των φυτών και μετακινούνται στους μεριστωµατικούς ιστούς µέσω του αποπλάστη και του συµπλάστη (Ελευθεροχωρινός, 2008). Σχήμα 2.3. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου imazamox. Τα ανθεκτικά, καλλιεργούμενα φυτά δεν εμφανίζουν συμπτώματα φυτοτοξικότητας όπως τα ευαίσθητα επειδή έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν ταχύτατα τα ζιζανιοκτόνα αυτά σε µη τοξικές ουσίες ή να απορροφούν μικρότερες ποσότητές τους ή να έχουν ένζυμο ALS ή AHAS µε μειωμένη ευαισθησία στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Shaner και Mallipudi, 1991). Συγκεκριμένα, για το imazamethabenz, ο μεταβολισµός από τα ανθεκτικά φυτά του σιταριού γίνεται µέσω υδροξυλίωσης και ακολούθως σχηματισμού συμπλόκου µε γλυκόζη (Ελευθεροχωρινός, 2008; Lee κ.ά., 1991). Βέβαια, οι πρόσφατες ποικιλίες σιταριού και ρυζιού (Oryza sativa L.) (ποικιλίες τύπου Clearfield), οι οποίες δημιουργήθηκαν µέσω της επιλογής ιστοκαλλιεργειών, είναι ανθεκτικές στο ζιζανιοκτόνο imazamox επειδή έχουν γονίδιο που κωδικοποιεί εντός των φυτών ανθεκτικό στο imazamox ένζυμο ALS (Zhang κ.ά., 2006).

20 Πυριµιδινυλoβενζοϊκά οξέα (Pyrimidinylbenzoates) Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής (bispyribac, pyrithiobac, pyriminobac, pyribenzoxim, pyrifthalid) αποτελείται από έναν πυριμιδινικό δακτύλιο ενωμένο µε βενζοϊκό οξύ µέσω S ή Ο (Σχήμα 2.4). Το bispyribac εφαρμόζεται κυρίως στο φύλλωμα για την αντιμετώπιση κυρίως διαφόρων ειδών του ζιζανίου μουχρίτσα (Echinochloa spp) στην καλλιέργεια του ρυζιού, ενώ το pyrithiobac εφαρμόζεται στο φύλλωμα και στο έδαφος για την αντιμετώπιση ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων στην καλλιέργεια του βαμβακιού (Gossypium hirsutum L.) (Kaloumenos κ.ά., 2005; Velentza κ.ά., 2005). Σχήμα 2.4. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου pyrithiobac Τριαζολοπυριµιδίνες (Triazopyrimidines) Η βασική χημική δομή των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής (cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, pyroxsulam) αποτελείται από ένα τριαζολοπυριμιδινικό δακτύλιο, τη σουλφαμιδική γέφυρα και ένα φαινυλικό δακτύλιο (Σχήμα 2.5). Τα περισσότερα από αυτά τα ζιζανιοκτόνα δρουν από εδάφους και φυλλώματος. Είναι αποτελεσματικά κυρίως εναντίον των ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων, χωρίς όμως να αποκλείονται από το φάσμα δράσης τους και ορισμένα ετήσια αγρωστώδη ζιζάνια (penoxsulam) ή/και ορισμένα είδη ζιζανίων που ανήκουν στα κυπεροειδή (penoxsulam, diclosulam). Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των ζιζανίων και μετακινούνται µέσω του συµπλάστη και του αποπλάστη, αντιστοίχως. Τα ζιζανιοκτόνα αυτά είναι δραστικά σε πολύ μικρές δόσεις από ό,τι τα περισσότερα από τα ήδη χρησιμοποιούµενα. Η εκλεκτικότητά τους οφείλεται στο μεταβολισµό τους από τα καλλιεργούμενα φυτά σε ουσίες µη τοξικές (Ελευθεροχωρινός, 2008).

21 20 Σχήμα 2.5. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου florasulam Σουλφονυλαµινοκαρβονυλοτριαζολινόνες (Sulfonylaminocarbonyltriazolinones) Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει τα δύο ζιζανιοκτόνα φυλλώματος flucarbazone (Σχήμα 2.6) και propaxycarbazone. Είναι αποτελεσματικά κυρίως εναντίον των ετήσιων αγρωστωδών ζιζανίων, χωρίς όμως να αποκλείονται από το φάσμα δράσης τους και ορισμένα ετήσια πλατύφυλλα ζιζάνια. Απορροφώνται εύκολα από τα φύλλα και τις ρίζες και μετακινούνται εντός των φυτών µέσω του συµπλάστη και του αποπλάστη, αντιστοίχως (WSSA, 2007). Σχήμα 2.6. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου flucarbazone 2.4. Ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα Η πρώτη αναφορά ανάπτυξης ανθεκτικότητας έγινε το 1968 στην Ουάσιγκτον των Η.Π.Α. όπου ένας βιότυπος του ζιζανίου μαρτιάκος (Senecio vulgaris L.) δεν αντιμετωπιζόταν αποτελεσματικά από το ζιζανιοκτόνο simazine. Τη δεκαετία που ακολούθησε, βιότυποι του ίδιου ζιζανίου αλλά και άλλων ζιζανίων απέκτησαν ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα της ίδιας οικογένειας αλλά και άλλων οικογενειών (Holt κ.ά., 1993).

22 21 Σήμερα, οι αναφορές ανθεκτικότητας αφορούν 348 βιότυπους/πληθυσμούς ζιζανίων που ανήκουν σε 195 είδη (81 μονοκοτυλήδονα, 114 δικοτυλήδονα) και έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα σε 19 ομάδες ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό τρόπο δράσης. Το μεγαλύτερο ποσοστό των βιοτύπων/πληθυσμών (107) έχει αναπτύξει ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS). Ακολουθούν τα ζιζανιοκτόνα των τριαζινών που αναστέλλουν τη ροή ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ (68 είδη), τα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ακετυλο-συνένζυμο Α καρβοξυλάση (ACCase) (39 είδη), τα ζιζανιοκτόνα µε δράση αυξίνης (28 είδη) και αυτά που αναστέλλουν τη ροή των ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα Ι (25 είδη). Στα παράγωγα ουρίας και αμίδια φυλλώματος (αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ), στις γλυκίνες (αναστολείς της βιοσύνθεσης των αρωματικών αμινοξέων) και στις δινιτροανιλίνες (αναστολείς της μίτωσης) ανέπτυξαν ανθεκτικότητα 21, 21 και 10 είδη ζιζανίων, αντίστοιχα (Heap, 2011) (Σχήμα 2.7). Ανθεκτικά είδη ζιζανίων Αναστολείς ACCase Αναστολείς ALS Δινιτροανιλίνες - σωληνίνη Τριαζίνες - PS II Παράγωγα ουρίας - PS II Αναστολείς του PS I Δράση αυξίνης Γλυκίνες - EPSPS 107-ALS 68-PS II 39-ACCase 28-Αυξίνη 25-PS I 21-PS II 21-EPSPS 10-Σωληνίνη Έτος Σχήμα 2.7. Διαγραμματική απεικόνιση της πορείας ανάπτυξης ( ) ανθεκτικών ειδών (βιοτύπων) ζιζανίων σε διάφορες ομάδες ζιζανιοκτόνων. Το πλήθος των ανθεκτικών ειδών ζιζανίων για κάθε ομάδα ζιζανιοκτόνων αναφέρεται στην πρόσφατη επισκόπηση (Heap, 2011).

23 Ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της βιοσύνθεσης των αμινοξέων με διακλαδισμένη αλυσίδα (ένζυμο ALS ή AHAS) Οι πρώτοι βιότυποι ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα ALSαναστολείς καταγράφηκαν λίγα χρόνια μετά την πρώτη χρήση τους. Συγκεκριμένα, το 1987, πέντε μόλις χρόνια από την χρήση του chlorsulfuron, εντοπίσθηκαν βιότυποι των ζιζανίων αγριομάρουλο (Lactuca serriola L.) και κόχια [Kochia scoparia (L.) Shard] με ανθεκτικότητα στο chlorsulfuron (Mallory-Smith κ.ά., 1990; Primiani κ.ά., 1990). Η ανάπτυξη νέων βιοτύπων ζιζανίων ανθεκτικών στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύμου ALS ήταν ραγδαία τα χρόνια που ακολούθησαν. Έτσι, το 1996, 14 χρόνια από τη χρήση των ζιζανιοκτόνων αυτής της ομάδας και εννέα από την καταγραφή των πρώτων ανθεκτικών βιότυπων, τα είδη ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS υπερέβησαν σε αριθμό τα είδη των ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους στις υπόλοιπες ομάδες των ζιζανιοκτόνων (Σχήμα 2.7) (Heap, 2011; Tranel και Wright, 2002). Πρόσφατη επισκόπηση έδειξε ότι έχουν καταγραφεί συνολικά 347 περιπτώσεις ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής σε 107 είδη ζιζανίων σε πολλές χώρες του κόσμου (Heap, 2011). Σε μερικές περιπτώσεις, μάλιστα, η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας δεν περιορίζεται σε μερικούς μεμονωμένους βιότυπους, αλλά είναι αρκετά εκτεταμένη ώστε να αποτελεί απειλή για τη συνέχιση της χρήσης των ζιζανιοκτόνων αυτών (Patzoldt κ.ά., 2002; Tranel και Wright, 2002; Guttieri κ.ά., 1995; Heap, 2011). Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας πολλών ειδών ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αυτής της ομάδας οφείλεται στην επαναλαμβανόμενη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων και σε ορισμένες περιπτώσεις σε μεγάλες δόσεις (ισχυρή πίεση επιλογής), στη μη χρήση ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό μηχανισμό δράσης, στη μεγάλη δραστικότητα (ισχυρή πίεση επιλογής) εναντίον των ευαίσθητων ατόμων του πληθυσμού και στη μεγάλη υπολειμματική δράση ορισμένων από αυτά τα ζιζανιοκτόνα (διαρκής πίεση επιλογής) (Tranel και Wright, 2002; Christoffers, 1999; Jasieniuk κ.ά., 1996; Ελευθεροχωρινός, 2008) Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ζιζανίων με

24 23 ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα είναι η συχνότητα εμφάνισης του γονιδίου ανθεκτικότητας, ο βαθμός κυριαρχίας του γονιδίου ανθεκτικότητας, ο τρόπος κληρονόμησης του γονιδίου ανθεκτικότητας και η προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών. Αναλυτικότερα, η ανάπτυξη ανθεκτικού βιοτύπου προϋποθέτει πίεση επιλογής σε έναν πληθυσμό και κυρίως γενετική παραλλακτικότητα. Όσον αφορά το ALS γονίδιο (κωδικοποιεί το ALS ένζυμο), τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι το γονίδιο αυτό (ALS) χαρακτηρίζεται από μεγάλη ποικιλία μεταλλάξεων και κατά συνέπεια από μεγάλη αρχική συχνότητα εμφάνισης αλληλόμορφων που κωδικοποιούν ανθεκτικό ALS ένζυμο στα ζιζανιοκτόνα (Tranel και Wright, 2002; Jasieniuk κ.ά., 1996). Αυτό όμως που θα πρέπει να τονιστεί ιδιαιτέρως είναι ότι η παραλλακτικότητα ως προς το ALS γονίδιο δεν είναι παρόμοια σε όλα τα είδη ζιζανίων (Jiang και Tranel, 2002; Tranel και Wright, 2002), γεγονός που σημαίνει ότι η γενετική παραλλακτικότητα ως προς το ALS γονίδιο δεν είναι η μοναδική αιτία της αλματώδους ανάπτυξης βιοτύπων-πληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς (Tranel και Wright, 2002). Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας ευνοείται όταν το αλληλόμορφο γονίδιο-υπεύθυνο για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας είναι κυρίαρχο σε σχέση με το ευαίσθητο αλληλόμορφο του αρχικού πληθυσμού. Επομένως, ένας ετερόζυγος γενότυπος ως προς το αλληλόμορφο της ανθεκτικότητας μπορεί να εμφανίσει ανθεκτικό φαινότυπο και επομένως να αντιδράσει θετικά στην πίεση επιλογής που ασκείται από το ζιζανιοκτόνο όταν το ανθεκτικό αλληλόμορφο είναι κυρίαρχο (ή μερικώς κυρίαρχο) ως προς το ευαίσθητο (Christoffers, 1999; Jasieniuk κ.ά., 1996). Τα διεθνή δεδομένα ανθεκτικότητας ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς δείχνουν ότι τα ανθεκτικά ALS αλληλόμορφα είναι κυρίαρχα των ευαίσθητων έστω και με κυμαινόμενο βαθμό κυριαρχίας μεταξύ των ειδών (Tranel και Wright, 2002). Το ένζυμο ALS, αν και παρουσιάζει καταλυτική δραστηριότητα στα πλαστίδια (χλωροπλάστες), κωδικοποιείται από το ALS γονίδιο που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου και η κληρονόμησή του ακολουθεί τους νόμους του Mendel. Αυτό σημαίνει ότι τα αλληλόμορφα της ανθεκτικότητας μεταφέρονται μέσω της γύρης με αποτέλεσμα να αυξάνεται με ταχύ ρυθμό εντός του αγρού ή των γειτονικών αγρών ο αριθμός των σταυρογονιμοποιούμενων φυτών με ανθεκτικότητα (Tranel και Wright, 2002; Jasieniuk κ.ά., 1996). Αντίθετα, στην περίπτωση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στις τριαζίνες (αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων στο PSII), επειδή το υπεύθυνο για την ανθεκτικότητα γονίδιο βρίσκεται στα πλαστίδια, τα ανθεκτικά

25 24 αλληλόμορφα δεν μεταφέρονται μέσω της γύρης και γι αυτό ο ρυθμός ανάπτυξης της ανθεκτικότητας είναι βραδύτερος σε σύγκριση με τα φυτά που μεταφέρεται μέσω της γύρης (Suza-Machado κ.ά, 1978; Ελευθεροχωρινός, 2008). Η επίδραση του χαρακτηριστικού της ανθεκτικότητας στην προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών επηρεάζει σημαντικά την αρχική συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών ατόμων στον πληθυσμό απουσία της πίεσης επιλογής από την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου. Έτσι, όταν το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας μειώνει την προσαρμοστική ικανότητα των φυτών κατά 25%, τα ανθεκτικά άτομα εμφανίζονται με συχνότητα 100 φορές μικρότερη μεταξύ των ευαίσθητων σε σύγκριση με την περίπτωση που το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας δεν επηρεάζει την προσαρμοστικότητα (Christoffers, 1999; Jasieniuk κ.ά., 1996). Αξίζει να αναφερθεί ότι η τροποποίηση της D1 πρωτεΐνης του φωτοσυστήματος ΙΙ, η οποία είναι υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα των τριαζινών, σχετίζεται άμεσα με τη μειωμένη ροή ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα και την ως εκ τούτου μειωμένη προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών ατόμων. Αντίθετα, στην περίπτωση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς, τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι η τροποποίηση του ενζύμου ALS (ανθεκτικό στα ζιζανιοκτόνα) δεν επηρεάζει σημαντικά την προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών ατόμων (Tranel και Wright, 2002). Η έντονη πίεση επιλογής που ασκείται στους πληθυσμούς ζιζανίων από τα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς εξαιτίας της εκτεταμένης χρήσης και των ιδιοτήτων τους, ο τρόπος κληρονόμησης της ανθεκτικότητας (ένα κυρίαρχο γονίδιο του πυρήνα) και η ελάχιστη επίδραση του χαρακτηριστικού της ανθεκτικότητας στην προσαρμοστικότητα των νεοεμφανιζόμενων ανθεκτικών ατόμων είναι οι κυριότερες αιτίες για την ταχύτατη ανάπτυξη και τη μεγάλη έκταση της ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής (Tranel και Wright, 2002) Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα οφείλεται σε φυσιολογικούς ή/και βιοχημικούς μηχανισμούς των φυτών. Οι κυριότεροι φυσιολογικοί μηχανισμοί των ζιζανίων που συμβάλλουν στην ανθεκτικότητά τους στα ζιζανιοκτόνα είναι 1) η μείωση του ρυθμού απορρόφησης του ζιζανιοκτόνου, 2) η μείωση του ρυθμού

26 25 μετακίνησης και 3) η τροποποίηση στην ενδοκυτταρική κατανομή του ζιζανιοκτόνου. Οι βιοχημικοί μηχανισμοί των ζιζανίων που εξηγούν την ανθεκτικότητά τους στα ζιζανιοκτόνα σχετίζονται με 1) την ικανότητά τους να μεταβολίζουν το ζιζανιοκτόνο 2) την υπερπαραγωγή του ενζύμου που αποτελεί θέση δράσης του ζιζανιοκτόνου, 3) την τροποποίηση της θέσης δράσης (ανθεκτικό ή μη ευαίσθητο ένζυμο, τροποποιημένη D1 πρωτεΐνη) του ζιζανιοκτόνου και 4) την απουσία βιοχημικού μηχανισμού μεταβολισμού ενός προζιζανιοκτόνου (χωρίς δράση) σε ζιζανιοκτόνο (Ελευθεροχωρινός, 2008). Ειδικότερα, για την ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS, ο κυριότερος μηχανισμός ανθεκτικότητας είναι η μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS και η ως εκ τούτου αδυναμία σύνδεσής του με τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής (Tranel και Wright, 2002). Η αλληλούχηση του ALS γονιδίου έδειξε ότι τα περισσότερα ανθεκτικά ζιζάνια έχουν σημειακή μετάλλαξη στο ALS γονίδιο, η οποία είναι υπεύθυνη για την αντικατάσταση ενός αμινοξέος σε μία συντηρημένη περιοχή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του ενζύμου ALS (Duggleby και Pang, 2000). Το αποτέλεσμα της αντικατάστασης αυτής είναι η αδυναμία σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων με το ένζυμο ALS και η, ως εκ τούτου, μη αναστολή της δράσης του (Duggleby κ.ά., 2008; Tranel και Wright, 2002; Boutsalis κ.ά., 1999). Η ανθεκτικότητα ορισμένων βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων δεν οφείλεται στην τροποποίηση του ενζύμου ALS, αλλά στην ικανότητα των φυτών για μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων μέσω υδροξυλίωσης [καταλύεται από το ένζυμο μονοξυγονάση (CytP 450 )] και στο μετέπειτα σχηματισμό συμπλόκου με γλυκόζη (Ελευθεροχωρινός, 2008; Preston, 2004). Ο μηχανισμός αυτός οδηγεί σε μικρής μέχρι μέτριας έντασης ανθεκτικότητα (10 φορές) σε ζιζανιοκτόνα (Hall κ.ά., 1994; Preston, 2004). Στις περιπτώσεις ανθεκτικότητας ζιζανίων εξαιτίας μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων ALS-αναστολέων ανήκει ένας βιότυπος-πληθυσμός του ζιζανίου ήρα (Lolium rigidum Gaudin.) και ένας βιότυπος-πληθυσμός του ζιζανίου αλεπονουρά (Alopecurus myosuroides Huds.) (Tranel και Wright, 2002; Christopher κ.ά., 1992). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η ανθεκτικότητα των προαναφερθέντων βιοτύπωνπληθυσμών στα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς δεν επιλέχθηκε μετά από την εφαρμογή τους στον αγρό, αλλά για την περίπτωση του ζιζανίου ήρα αυτή επελέγη μετά από εφαρμογή ζιζανιοκτόνων αναστολέων της δράσης του ενζύμου ACCase και για την περίπτωση της αλεπονουράς μετά από εφαρμογή ζιζανιοκτόνων αναστολέων

27 26 του φωτοσυστήματος II (Tranel και Wright, 2002; Christopher κ.ά., 1992) Ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων στην Ελλάδα Οι μέχρι σήμερα αναφορές δείχνουν ότι στην Ελλάδα έχουν καταγραφεί 79 ανθεκτικοί βιότυποι/πληθυσμοί ζιζανίων που ανήκουν σε εννέα είδη ζιζανίων. Η ανθεκτικότητα αυτών των ζιζανίων είναι σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς α) της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ, β) της δράσης του ενζύµου ALS, γ) της δράσης του ενζύµου ACCase και δ) της δράσης του ενζύµου EPSPS. Αναλυτικότερα, η πρώτη καταγραφή ανθεκτικότητας ζιζανίου σε ζιζανιοκτόνα στην Ελλάδα έγινε το 1986 και αφορούσε την ανθεκτικότητα πληθυσμών του ζιζανίου μουχρίτσα [Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.] στο ζιζανιοκτόνο propanil (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ) (Heap, 2011). Ανθεκτικότητα του ίδιου ζιζανίου στο συγκεκριμένο ζιζανιοκτόνο παρατηρήθηκε και 10 χρόνια αργότερα από τους Vasilakoglou κ.ά. (2000) σε καλλιέργειες ρυζιού του νομού Θεσσαλονίκης. Το 1996, σε καλλιέργειες πατάτας (Solanum tuberosum L.) της περιοχής Νευροκοπίου Δράµας καταγράφηκαν βιότυποι των ζιζανίων βλήτο τραχύ (Amaranthus retroflexus L.) και λουβουδιά (Chenopodium album L.) με ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο metribuzin (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ) (Eleftherohorinos κ.ά., 2000). Το ίδιο έτος, οι Kotoula-Syka κ.ά. (2000) βρήκαν ότι ο µη ικανοποιητικός έλεγχος του ζιζανίου ήρα (Lolium rigidum Gaudin) μετά από εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου diclofop (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ACCase) ήταν αποτέλεσμα ανάπτυξης ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο αυτό, σταυρανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα clodinafop, fluazifop, tralkoxydim και sethoxydim και πολλαπλής ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ALS). Το 2004, μεταξύ 14 πληθυσμών του ίδιου ζιζανίου (ήρα) που προέρχονταν από καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών της κεντρικής Μακεδονίας (Νομοί Θεσσαλονίκης και Κιλκίς), βρέθηκαν τέσσερις πληθυσμοί που είχαν αναπτύξει ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron (αναστολέας της δράσης του ενζύµου ALS). Οι τρεις από τους προαναφερθέντες πληθυσμούς του ζιζανίου βρέθηκαν σταυρανθεκτικοί στο μίγμα ζιζανιοκτόνων mesosulfuron + iodosulfuron (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS), ενώ ένας πληθυσμός βρέθηκε να έχει αναπτύξει πολλαπλή ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim και ένας στο clodinafop (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ACCase) (Ευθυμιάδης κ.ά., 2008; Βασιλείου κ.ά., 2006).

28 27 Επίσης, σε καλλιέργεια χειμερινών σιτηρών, το 1998 βρέθηκε πληθυσμός του ζιζανίου παπαρούνα (Papaver rhoeas L.) ανθεκτικός στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, thifensulfuron, triasulfuron και tribenuron (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS) (Heap, 2011). Το 2002, σε καλλιέργεια βαμβακιού της περιοχής Λάρισας, βρέθηκε από τους Ελευθεροχωρινό και Παπαµιχαήλ (2002), βιότυπος του ζιζανίου αγριοτοµατιά (Solanum nigrum L.) µε ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο prometryn (αναστολέας της ροής ηλεκτρονίων στο φωτοσύστηµα ΙΙ). Το 2006, σε καλλιέργεια βαμβακιού της περιοχής Δράμας, οι Kaloumenos και Eleftherohorinos (2009) βρήκαν ότι τα φυτά από ριζώματα ενός βιοτύπου του ζιζανίου βέλιουρας [Sorghum halepense (L.) Pers.] ήταν 164 και 370 φορές πιο ανθεκτικά στα ζιζανιοκτόνα quizalofop και propaquizafop (αναστολείς της δράσης του ενζύµου ACCase) από ό,τι τα αντίστοιχα φυτά από τον ευαίσθητο βιότυπο, ενώ η αντίστοιχη ανθεκτικότητα των σποροφύτων του ήταν 17,2 και 32,4 φορές ανθεκτικότερα από τον ευαίσθητο βιότυπο. Πρόσφατα, οι Γιαννοπολίτης κ.ά. (2008) διαπίστωσαν ότι κάποιοι βιότυποι του ζιζανίου κόνυζα (Conyza spp.), από τις περιοχές Σκάλα Λακωνίας και Άργος, ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο glyphosate (αναστολέας της δράσης του ενζύµου EPSPS). Μετά από εκτεταμένη επισκόπηση, συλλογή και αξιολόγηση 114 βιότυπων του ζιζανίου αγριοβρώμη (Avena sterilis L.) από καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών των περιοχών κεντρικής Μακεδονίας και Θεσσαλίας, διαπιστώθηκε ότι 12 βιότυποι ήταν ανθεκτικοί στο ζιζανιοκτόνο clodinafop, πέντε βιότυποι στο fenoxaprop και 18 βιότυποι ήταν σταυρανθεκτικοί και στα δύο ζιζανιοκτόνα (αναστολείς της δράσεις του ενζύµου ACCase) (Παπαπαναγιώτου κ.ά., 2008). Τέλος, η εκτεταμένη δειγματοληψία του ζιζανίου παπαρούνα από σιτοπαραγωγικούς αγρούς της κεντρικής Μακεδονίας έφερε στο φως 28 πληθυσμούς του ζιζανίου με ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο tribenuron, και σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, triasulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron, και σε μικρότερο βαθμό στα ζιζανιοκτόνα pyrithiobac, imazamox και florasulam (Kaloumenos κ.ά., 2011; Kaloumenos and Eleftherohorinos, 2008). Η ανθεκτικότητα των 28 ανθεκτικών πληθυσμών που αξιολογήθηκαν οφείλεται σε μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS λόγω σημειακών μεταλλάξεων στο ALS γονίδιο που αντίστοιχα οδηγούν σε αντικαταστάσεις του αμινοξέος προλίνη 197 (Kaloumenos κ.ά., 2009).

29 Δομή και Δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση - Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας Η γονιδιακή βάση του ενζύμου ALS Το ένζυμο ALS κωδικοποιείται από το ALS γονίδιο στον πυρήνα, παράγεται στα ριβοσωμάτια του κυτοπλάσματος και μεταφέρεται μέσω ενός πεπτιδίου μεταφορέα στους χλωροπλάστες (Corbett και Tardif, 2006β). Ο αριθμός των ALS γονιδιακών θέσεων στο γένωμα των διαφόρων φυτών ποικίλει ανάλογα µε το βαθμό πλοειδίας (Scarabel κ.ά., 2004; Stidham, 1991). Ο τετραπλοειδής καπνός (Nicotiana tabacum L.) και το πολυπλοειδές καλαμπόκι (Zea mays L.) έχουν ALS γονίδια σε δύο ασύνδετες θέσεις (Keeler κ.ά., 1993; Fang κ.ά., 1992), ενώ η ελαιοκράμβη (Brassica napus L.), η οποία είναι αµφιδιπλοειδές είδος, έχει πέντε ALS γονιδιακές θέσεις (Ouellet κ.ά., 1992). Τέλος, τα διπλοειδή είδη παπαρούνα και Arabidopsis thaliana (L.) Heynh έχουν ένα ALS γονίδιο (Scarabel κ.ά., 2004; Mazur κ.ά, 1987) Δομή του ενζύμου ALS Τα φυτά και οι μικροοργανισμοί, σε αντίθεση µε τους ζωικούς οργανισμούς, διαθέτουν το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS) και ως εκ τούτου είναι ικανά να βιοσυνθέτουν τα αμινοξέα µε διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile) (Duggleby κ.ά., 2008; Coruzzi και Last, 2000). Το ένζυμο ALS των φυτών, αν και κωδικοποιείται από γονίδιο του πυρήνα, μεταφέρεται μετά τη βιοσύνθεσή του στα ριβοσωμάτια µε τη βοήθεια ενός πεπτιδίου μεταφορέα (CTP, Chloroplast Transit Peptide) εντός των πλαστιδίων του κυττάρου όπου και δρα (Corbett και Tardif, 2006β; McCourt και Duggleby, 2006; Scarabel κ.ά., 2004). Το ένζυμο αυτό αποτελείται από την «καταλυτική υποµονάδα» και «ρυθμιστική υποµονάδα». Η «καταλυτική υποµονάδα», η οποία δρα καταλυτικά από μόνη της, περιλαμβάνει το ενεργό κέντρο και τη διφωσφορική θειαµίνη (ThDP) ως προσθετική ομάδα (απαραίτητη για την καταλυτική δράση του ενζύµου). Η «ρυθμιστική υποµονάδα» δε δρα καταλυτικά, αλλά συμβάλλει στην αύξηση της δράσης της καταλυτικής υποµονάδας. Η παρουσία της είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση µε οπισθοτροφοδότηση της δράσης της καταλυτικής υποµονάδας από τα τελικά προϊόντα της μεταβολικής οδού (αμινοξέα µε διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα) για αυτό και αναφέρεται ως «ρυθμιστική υποµονάδα» (Duggleby κ.ά.,

30 ). Η καταλυτική υποµονάδα του ALS ενζύµου, σύμφωνα µε την κρυσταλλογραφική ανάλυση του ενζύµου ALS από το φυτικό είδος A. thaliana, αποτελείται από τρεις περιοχές (domains) (Σχήμα 2.8). Η α-περιοχή περιέχει τα αμινοξέα 86 έως 280, η β-περιοχή τα αμινοξέα 281 έως 451 και η γ-περιοχή τα αμινοξέα 463 έως 639. Τα αμινοξέα 1 έως 85 αποτελούν το πεπτίδιο-μεταφορέας του ενζύµου ALS από τα ριβοσώματα στους χλωροπλάστες. Σχήμα 2.8. Καταλυτική υποµονάδα του ενζύµου ALS. Οι α-, β- και γ-περιοχές (domains) της καταλυτικής υποµονάδας του ενζύµου απεικονίζονται µε κίτρινο, πράσινο και γκρι χρώµα, αντίστοιχα (Duggleby κ.ά., 2008) Δράση του ενζύμου ALS Το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS), όπως έχει προαναφερθεί, είναι το ένζυμο κλειδί κατά τη βιοσύνθεση των αμινοξέων βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile) (Duggleby κ.ά., 2008; Coruzzi και Last, 2000). Συγκεκριμένα, το ένζυμο αυτό είναι υπεύθυνο για τις παράλληλες αντιδράσεις συμπύκνωσης δύο µορίων πυροσταφυλικού οξέος για τη βιοσύνθεση οξικογαλακτικού οξέος ή της συµπύκνωσης του πυροσταφυλικού οξέος µε το 2- κετοβουτυρικό οξύ για τη βιοσύνθεση του 2-οξικο-2-υδροξυβουτυρικού οξέος (Σχήμα 2.9). Η βιοσύνθεση οξικογαλακτικού οξέος είναι το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης των αµινοξέων Val και Leu, ενώ η βιοσύνθεση του 2-οξικο-2- υδροξυβουτυρικού οξέος είναι το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης του αµινοξέος Ile (Duggleby κ.ά., 2008; Corbett και Tardif, 2006β; Chipman κ.ά., 1998). Το πρώτο στάδιο των δύο αντιδράσεων συμπύκνωσης είναι η διάσπαση ενός

31 30 δεσμού C C που βρίσκεται κοντά σε µία καρβονυλομάδα. Τα ένζυμα που καταλύουν τέτοιου είδους αντιδράσεις διάσπασης, όπως και το ένζυμο ALS, απαιτούν την παρουσία του συµπαράγοντα ThDP, που αντιδρά µε το πυροσταφυλικό οξύ και σχηματίζει το συνδεδεμένο στο ένζυμο σύμπλοκο υδροξυαιθυλο-thdp ως ενδιάμεσο προϊόν αφού απομακρυνθεί ένα άτομο άνθρακα µε τη μορφή CO 2. Το ενδιάμεσο προϊόν στη συνέχεια αντιδρά µε το 2-κετοβουτυρικό οξύ ή το πυροσταφυλικό οξύ για το σχηματισμό του 2-οξικο-2-υδροξυβουτυρικού οξέος ή οξικογαλακτικού οξέος αντίστοιχα. Σχήμα 2.9. Αντιδράσεις που καταλύονται από το ένζυµο ALS κατά τη βιοσύνθεση των αµινοξέων Leu, Val και Ile (Duggleby κ.ά., 2008). Τα τελικά προϊόντα της μεταβολικής οδού ρυθμίζουν τη δράση του ενζύµου ALS. Ειδικότερα, η παρουσία ενός εκ των τριών προαναφερθέντων αμινοξέων στην αναγκαία για το φυτό ποσότητα αναστέλλει τη δράση του ενζύµου ALS. Βέβαια, το αμινοξύ Leu εικάζεται ότι δρα και συνεργιστικά µε τα αμινοξέα Val και Ile ως προς την αναστολή της δράσης του ενζύµου ALS (Lee και Duggleby, 2001). Σε αντίθεση µε τα φυτά, η δράση του ενζύµου ALS στους μύκητες ή στα βακτήρια αναστέλλεται μόνον από το αμινοξύ Val. Η παρουσία ως συµπαράγοντα ενός κατάλληλου δισθενούς μεταλλικού ιόντος (Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Cd 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+, Al 3+, Ba 2+ ή Ni 2+ ), εκτός από τη ThDP, είναι απαραίτητη για τη δράση του ενζύµου ALS. Ειδικότερα, η δράση του ενζύµου ALS μειώνεται κατά 50% και αυξάνεται κατά 133% όταν ο συµπαράγοντας είναι

32 31 Ni 2+ ή Mn 2+, αντίστοιχα, αντί για Mg 2+. Η δράση του ενζύµου ALS, παρουσία των υπολοίπων μεταλλικών ιόντων, είναι εντός του προαναφερθέντος εύρους τιμών (Tse και Schloss, 1993). Ο ρόλος του δισθενούς ιόντος στο ένζυμο ALS είναι η ακινητοποίηση της ThDP, γεγονός που συμβαίνει σε όλα τα ThDP-εξαρτώμενα ένζυμα (Duggleby, 2006). Το ένζυμο ALS, σε αντίθεση µε τα άλλα ένζυμα που έχουν παρόμοια λειτουργία, για να δράσει απαιτεί το φλαβινοαδενινο-δινουκλεοτίδιο (FAD) ως τρίτο συµπαράγοντα. Σύμφωνα µε τον Duggleby (2006), η παρουσία του FAD ως συµπαράγοντα αποτελεί εξελικτικό κατάλοιπο της υποομάδας των ThDPεξαρτώμενων ενζύµων από την οποία προέρχεται και το ένζυµο ALS. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση έδειξε ότι το FAD είναι συνδεδεμένο µε το ένζυμο στην επιφάνειά του και συγκεκριμένα στην β-περιοχή (Duggleby κ.ά., 2008) Μοριακή βάση της σύνδεσης μεταξύ ενζύμου ALS και ζιζανιοκτόνων και αναστολή της ενζυμικής δράσης του Τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύµου ALS ανήκουν στις οικογένειες των σουλφονυλουριών, ιµιδαζολινονών, πυριµιδινυλβενζοϊκών, τριαζολοπυριµιδινών και σουλφονυλαµινοκαρβονυλοτριαζολινονών. Ο μηχανισμός αναστολής της δράσης του ενζύµου ALS είναι πολύπλοκος επειδή τα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς δεν δρουν ως απλοί υποκαταστάτες ή ως ανταγωνιστικές ουσίες των υποστρωμάτων ή των συμπαραγόντων του ενζύµου (Duggleby και Pang, 2000). Ειδικότερα, οι σουλφονυλουρίες και οι ιµιδαζολινόνες προσδένονται σε θέσεις του ενζύµου που εμποδίζουν την είσοδο του υποστρώματος εντός του ενεργού κέντρου με αποτέλεσμα την αναστολή της δράσης του (McCourt κ.ά., 2005; McCourt κ.ά., 2006; Pang κ.ά., 2002). Η σουλφονυλοµάδα των σουλφονυλουριών και ο αρωματικός δακτύλιος λαμβάνουν θέση στην είσοδο της διόδου προς το ενεργό κέντρο, ενώ το υπόλοιπο µόριο λαμβάνει θέση εντός της διόδου (Σχήμα 2.10Α). Το µόριο των ιµιδαζολινονών είναι τοποθετημένο εντός της διόδου του υποστρώματος µε τέτοιο τρόπο ώστε ο διυδροϊµιδαζολινονικός δακτύλιος να προσανατολίζεται προς τη διφωσφορική θειαµίνη (ThDP) (συµπαράγοντας του ενζύµου απαραίτητος για την καταλυτική δράση), ενώ ο κινολινικός δακτύλιος να βρίσκεται προς την επιφάνεια του ενζύµου (McCourt κ.ά., 2006).

33 32 Σχήμα Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης-σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων (Α) chlorimuron (σουλφονυλουρία) και (Β) imazaquin (ιµιδαζολινόνη) στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώµατος προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου ALS. Τα ζιζανιοκτόνα απεικονίζονται µε τη µορφή ράβδων, ενώ τα αμινοξέα µε γκρι επιφάνεια (McCourt κ.ά., 2006). Οι σουλφονυλουρίες έχουν καλύτερη συνάφεια (affinity) με το ένζυμο ALS από ό,τι οι ιµιδαζολινόνες. Αυτό τεκμηριώνεται από τη μεγαλύτερη τιμή της φαινομενολογικής σταθεράς αναστολής (apparent inhibition constant) K i(app) = I 50 - [E o ]/2, όπου Ι 50 η συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου-αναστολέα που προκαλεί 50% μείωση της δράσης του ενζύµου και [E o ] η συγκέντρωση του ενζύµου. Ειδικότερα, η τιμή K i(app) για το imazaquin και το ένζυμο ALS του A. thaliana είναι 3,0 µm, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για το tribenuron και το chlorimuron είναι 253 και 10,8 nm (Chang και Duggleby, 1998). Αυτό οφείλεται στο μεγάλο πλήθος υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (~50) και στους έξι δεσμούς υδρογόνου που μπορούν να σχηματιστούν μεταξύ των διαφόρων σουλφονυλουριών και της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του ALS, σε αντίθεση µε το μικρότερο πλήθος υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (~28) και ένα δεσμό υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των ιµιδαζολινονών και του ALS ενζύµου. Επιπλέον, οι σουλφονυλουρίες προσδένονται πιο κοντά στο ενεργό κέντρο τoυ ενζύµου και πιο κοντά στη ThDP από ό,τι οι ιµιδαζολινόνες, οι οποίες προσδένονται πιο κοντά στην επιφάνεια του ενζύµου (McCourt κ.ά., 2006).

34 33 Σχήµα Τµηµατική απεικόνιση του σηµείου πρόσδεσης των ζιζανιοκτόνων στο ένζυµο ALS. Τα ζιζανιοκτόνα παρουσιάζονται µε γραµµές και σφαίρες, ενώ µε χρώµα γκρι παριστάνονται τα άτοµα του άνθρακα. Τα αµινοξέα παρουσιάζονται µε γραµµές, τα άτοµα του άνθρακα µε πράσινο χρώµα, τα άτοµα S µε κίτρινο χρώµα, τα άτοµα Ο µε κόκκινο χρώµα, τα άτοµα Ν µε µπλε χρώµα και τα άτοµα Cl µε πορτοκαλί χρώµα. Οι δεσµοί υδρογόνου παρουσιάζονται µε µπλε διακεκοµµένες γραµµές. (A) Σύνδεση του ζιζανιοκτόνου chlorimuron στο ένζυµο ALS. (B) Σύνδεση του ζιζανιοκτόνου imazaquin στο ένζυµo ALS. (Duggleby κ.ά., 2008). Ονοµατολογία αµινοξέων κατά IUPAC: Α, αλανίνη; C, κυστεΐνη; D, ασπαρτικό οξύ; Ε, γλουταµικό οξύ; F, φαινυλαλανίνη; G, γλυκίνη; Η, ιστιδίνη; Ι, ισολευκίνη; Κ, λυσίνη; L, λευκίνη; M, µεθειονίνη; Ν, ασπαραγίνη; P, προλίνη; Q, γλουταµίνη; R, αργινίνη; S, σερίνη; T, θρεονίνη; V, βαλίνη; W, τρυπτοφάνη; Υ, τυροσίνη.

35 34 Όλες σχεδόν οι σουλφονυλουρίες (αν και η θέση του αρωματικού δακτυλίου σε σχέση µε τη σουλφονυλουρική γέφυρα διαφοροποιείται ανάλογα µε το µόριο) κατά την πρόσδεσή τους µε το ένζυμο ALS από ζύμες ή φυτά λαμβάνουν παρόμοια θέση µε αυτή που λαμβάνει το ζιζανιοκτόνο chlorimuron στο ένζυµο ALS του είδους A. thaliana (Σχήμα 2.11Α). Το γεγονός ότι τα ζιζανιοκτόνα αυτής της οικογένειας είναι ισχυροί αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στο ότι όλα τα µόρια των σουλφονυλουριών δημιουργούν πληθώρα επαφών με τα γειτονικά αμινοξέα του ενζύµου. Για παράδειγμα, τα αμινοξέα βαλίνη (Val 196 ), προλίνη 197 (Pro 197 ), μεθειονίνη 200 (Met 200 ), αλανίνη 205 (Ala 205 ) και ασπαρτικό οξύ (Asp 376 ) συμμετέχουν στη σύνδεση του αρωματικού δακτυλίου των σουλφονυλουριών µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (hydrophobic interactions), ενώ το αμινοξύ αργινίνη 377 (Arg 377 ) δημιουργεί δεσμό υδρογόνου µε ένα τουλάχιστον οξυγόνο της σουλφονυλουρικής γέφυρας ή ένα άτομο αζώτου του ετεροκυκλικού δακτυλίου και του μεθοξυ-υποκαταστάτη του. Πιθανώς, το αμινοξύ τρυπτοφάνη 574 (Trp 574 ) είναι το πιο σημαντικό στην πρόσδεση των σουλφονυλουριών, αφού ο δακτύλιος του αμινοξέος αυτού έρχεται σε στενή επαφή (περίπου 3,5 A) µε τον ετεροκυκλικό δακτύλιο των ζιζανιοκτόνων της συγκεκριμένης οικογένειας (Σχήμα 2.11Α). Η μελέτη των κρυσταλλογραφικών δομών του ενζύµου και ο εκτενής χαρακτηρισμός 79 σουλφονυλουριών έδειξε ότι κάποια χαρακτηριστικά της χημικής δομής των ζιζανιοκτόνων αυτής της οικογένειας ευνοούν τη σύνδεσή τους µε το ένζυμο ALS και αναστέλλουν ως εκ τούτου τη δράση του (Wang κ.ά., 2005). Γενικώς, οι καλύτεροι αναστολείς του ενζύµου ALS των φυτών είναι οι σουλφονυλουρίες που φέρουν μεγάλους όρθο-υποκαταστάτες [όπως καρβόξυ μέθυλο (carboxy methyl) και αίθυλο εστέρας (ethyl esters)] στον αρωματικό δακτύλιο σε συνδυασμό µε την κλασική σουλφονυλουρική γέφυρα ή ζιζανιοκτόνα µε γέφυρα ελαφρώς μακρύτερη (όπως των ζιζανιοκτόνων bensulfuron και ethoxysulfuron) και ετεροκυκλικό δακτύλιο που φέρει μικρό υποκαταστάτη και στις δύο (ή τουλάχιστον σε µία) μέτα-θέσεις. Τα µόρια που συνδυάζουν τα παραπάνω δομικά χαρακτηριστικά λαμβάνουν ιδανική θέση στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο και δημιουργούν ισχυρές αλληλεπιδράσεις µε τα γειτονικά αμινοξέα. Οι σουλφονυλουρίες, εκτός από τις πολυάριθμες (~50) υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που σχηματίζουν µε τα αμινοξέα του ενζύµου ALS, σχηματίζουν και μέχρι έξι δεσμούς υδρογόνου µε τα αμινοξέα Lys 256, Arg 377 και Ser 653. Βέβαια, οι πιο σημαντικοί δεσμοί

36 35 είναι αυτοί που σχηματίζονται μεταξύ των ατόμων της σουλφονυλουρικής γέφυρας και ειδικότερα μεταξύ του αµινοξέος Arg 377, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στην καταλυτική δράση του ενζύµου (Σχήμα 2.11Α) (McCourt και Duggleby, 2006; Engel κ.ά., 2004; Duggleby κ.ά., 2008). Οι Preston και Mallory-Smith (2001), σε συνέχεια των προαναφερθέντων, υποστηρίζουν ότι η πρόσδεση των σουλφονυλουριών µε το ένζυμο ALS γίνεται µέσω υδρόφοβου δεσμού µε το αμινοξύ Trp 574 και µέσω δεσμού υδρογόνου µε το αμινοξύ Pro 197. Το ζιζανιοκτόνο imazaquin συνδέεται µε το ένζυμο ALS και αναστέλλει ως εκ τούτου τη δράση του µέσω κυρίως υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων µε 12 αμινοξέα (McCourt κ.ά., 2006). Τα αμινοξέα αυτά, εκτός από δύο [γλυκίνη 654 (Gly 654 ) και αργινίνη 199 (Arg 199 )], συμμετέχουν και στη σύνδεση του ενζύµου µε ζιζανιοκτόνα των σουλφονυλουριών. Η καρβοξυλική ομάδα του µορίου του ζιζανιοκτόνου (κοινό χαρακτηριστικό όλων των ιµιδαζολινονών) σχηματίζει δεσμό µε την πλευρική αλυσίδα του αμινοξέος Arg 377 (Σχήμα 2.11Β). Οι μέθυλο- και ισοπρόπυλουποκαταστάστες του διυδροϊµιδαζολινονικού δακτυλίου, οι οποίοι είναι απαραίτητοι για την εκδήλωση της ζιζανιοκτόνου δράσης (Stidham και Singh, 1991), συνδέονται στο ένζυμο µε τα αμινοξέα αλανίνη 122 (Ala 122 ), φαινυλαλανίνη 206 (Phe 206 ), γλουταµίνη 207 (Gln 207 ), λυσίνη 256 (Lys 256 ) και τρυπτοφάνη 574 (Trp 574 ). Ο διυδροϊµιδαζολινονικός δακτύλιος έρχεται σε επαφή µε τα αμινοξέα Lys 256 και Trp 574. Το υπόλοιπο µόριο του ζιζανιοκτόνου imazaquin είναι τοποθετημένο µε τέτοιο τρόπο στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώματος ώστε ο μεγάλος δακτύλιος της κινολίνης να προεξέχει από την είσοδο της διόδου πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο (Σχήμα 2.11Β) (Duggleby κ.ά., 2008). Βέβαια, σε αντίθεση µε τα όσα αναφέρονται από τους Duggleby κ.ά. (2008) και McCourt κ.ά. (2006), οι Preston και Mallory-Smith (2001) υποστηρίζουν ότι η πρόσδεση των ιµιδαζολινονών, και ειδικότερα του ζιζανιοκτόνου imazaquin, µε το ένζυμο ALS των φυτών γίνεται κυρίως µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων µε το αµινοξύ Trp 574 ή µε το αµινοξύ Ala 122 και µέσω δεσμού υδρογόνου µε το αµινοξύ Ser 653. Οι McCourt κ.ά. (2006) αναφέρουν ότι οι σουλφονυλουρίες και οι ιµιδαζολινόνες έχουν αλληλοεπικαλυπτόμενο σημείο σύνδεσης στο ένζυμο ALS των φυτών και 10 από τα 24 αμινοξέα είναι κοινά για τις δύο οικογένειες και συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις τους με το ένζυμο (Σχήμα 2.11). Η σύγκριση όμως των αμινοξέων κατά την πρόσδεση των ζιζανιοκτόνων chlorimuron και imazaquin έδειξε ότι πέντε αμινοξέα λαμβάνουν διαφορετική διαμόρφωση στο χώρο ανάλογα µε το

37 36 ζιζανιοκτόνο-αναστολέα. Αναλυτικότερα, τα αμινοξέα Asp 376 και Arg 377 σχηματίζουν δεσμό κατά την πρόσδεση των σουλφονυλουριών (ειδικότερα του ζιζανιοκτόνου chlorimuron), ενώ κατά την πρόσδεση των ιµιδαζολινονών (ειδικότερα του ζιζανιοκτόνου imazaquin), ο κινολινικός δακτύλιος αναγκάζει το αµινοξύ Arg 377 να απομακρυνθεί από το Asp 376 και να σχηματίσει δεσμό µε την καρβοξυλική ομάδα του ζιζανιοκτόνου (McCourt κ.ά., 2006). Τέλος, το αμνοξύ Trp 574 κατά την πρόσδεση του ζιζανιοκτόνου imazaquin τροποποιείται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να καταλαμβάνει το χώρο που καταλαμβάνει ο ετεροκυκλικός δακτύλιος του ζιζανιοκτόνου chlorimuron όταν το τελευταίο συνδέεται στο ένζυμο ALS (Duggleby κ.ά., 2008). Οι δόσεις εφαρμογής των σουλφονυλουριών στον αγρό αν και είναι παρόμοιες µε εκείνες των ιµιδαζολινονών, οι σουλφονυλουρίες είναι πιο αποτελεσματικοί αναστολείς του ενζύµου ALS (Duggleby και Pang, 2000). Αυτό πιθανώς οφείλεται στο ότι το σχήμα και το μέγεθος των µορίων των σουλφονυλουριών επιτρέπουν την καλύτερη προσαρμογή τους στο εσωτερικό της διόδου πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου, µε αποτέλεσμα να σχηματίζουν περισσότερους δεσμούς με το ένζυμο από ό,τι τα ζιζανιοκτόνα των ιµιδαζολινονών (Duggleby κ.ά., 2008) Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS οφείλεται στις περισσότερες περιπτώσεις σε μεταλλάξεις του ALS γονιδίου. Αυτές οι μεταλλάξεις είναι σημειακές και οδηγούν σε αντικατάσταση ενός αμινοξέος (Délye κ.ά., 2009; Corbett και Tardif, 2006α; Tranel και Wright, 2002) με αποτέλεσμα την αδυναμία σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων µε το ένζυμο ALS και την ως εκ τούτου µη αναστολή της δράσης του (Duggleby κ.ά., 2008; Tranel και Wright, 2002; Boutsalis κ.ά., 1999). Τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι έχουν καταγραφεί 22 διαφορετικές μεταλλάξεις του ALS γονιδίου που οδηγούν σε αντικαταστάσεις αμινοξέων υπεύθυνες για ανθεκτικότητα σε ζύμες, βακτήρια, πράσινα φύκη, φυτά μετά από in vitro επιλογή και σε φυσικούς πληθυσμούς ζιζανίων (Heap, 2011; Duggleby κ.ά., 2008; Tranel και Wright, 2002; Duggleby και Pang, 2000). Όλα σχεδόν τα αμινοξέα που περιβάλλουν τα µόρια των ζιζανιοκτόνων και συμμετέχουν στη σύνδεσή τους µε το ένζυμο ALS

38 37 εμπλέκονται στις περιπτώσεις ανθεκτικότητας που έχουν καταγραφεί παγκοσμίως. Επτά μόνο από τις πολλές σημειακές μεταλλάξεις που έχουν καταγραφεί σε πληθυσμούς ζιζανίων (επιλογή μετά από εφαρμογές στον αγρό ζιζανιοκτόνου που αναστέλλει τη δράση του ALS ενζύμου) είναι οι σπουδαιότερες για την πρόκληση ανθεκτικότητας. Ειδικότερα, οι μεταλλάξεις αυτές αφορούν την αντικατάσταση ενός από τα αμινοξέα Ala 122, Pro 197 και Ala 205 κοντά στο -ΝΗ +3 άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, του αµινοξέος Asp 376 περίπου στο μέσο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και των αμινοξέων Trp 574 Ser 653 και Gly 654 στο COO - άκρο (Σχήμα 2.12) (Heap, 2011; Tranel κ.ά., 2011; Délye κ.ά., 2009; Laplante κ.ά. 2009; Whaley κ.ά., 2007; Tranel και Wright, 2002). Σχήμα Σχηµατική απεικόνιση του ενζύµου ALS µε τα έξι αµινοξέα των οποίων η αντικατάσταση είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας των ζιζανίων. Το τµήµα στην αρχή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (CTP, Chloroplast Transit Peptide) είναι το πεπτίδιο µεταφοράς του ενζύµου από τον πυρήνα στους χλωροπλάστες (Tranel και Wright, 2002; Whaley κ.ά., 2007). Οι Tranel κ.ά., (2011) αναφέρουν ότι η αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 από Leu οδηγεί σε ανθεκτικότητα σε όλες τις οικογένειες των ζιζανιοκτόνων αναστολέων της δράσης του ενζύµου ALS. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το αµινοξύ Trp 574 συμμετέχει σε πληθώρα αλληλεπιδράσεων (υδρόφοβοι δεσμοί) μεταξύ του ενζύμου και των ζιζανιοκτόνων µε αποτέλεσμα, η αντικατάστασή του από Leu να οδηγεί σε απώλεια πολλών σημείων επαφής µε όλα σχεδόν τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής. Αντίθετα, η αντικατάσταση του αµινοξέος Ala 122 από το αµινοξύ Thr οδηγεί σε ανάπτυξη πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις ιµιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες και στις άλλες οικογένειες ζιζανιοκτόνων (Tranel κ.ά., 2011). Η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 από τη Thr, την Ala, τη Leu, τη Ser, την Arg, τη Gln ή την His οδηγεί σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (σε ορισμένες περιπτώσεις και σταυρανθεκτικότητα σε τριαζολοπυριµιδίνες και πυριµιδινυλβενζοϊκά) και όχι στις ιµιδαζολινόνες (Tranel κ.ά., 2011). Βέβαια, εξαίρεση αποτελούν έξι (6) από τις 42 περιπτώσεις όπου η αντικατάσταση του αµινοξέος Pro 197 από τη Thr (δύο), τη Leu

39 38 (δύο), την His (μία) και την ισολευκίνη (Ile) (μία) οδήγησε στην ανάπτυξη βιότυπωνπληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες αλλά και στις ιµιδαζολινόνες. Αξίζει να αναφερθεί ότι το αμινοξύ Pro 197 βρίσκεται στο τέλος α- έλικα και μάλιστα στην είσοδο της διόδου πρόσβασης προς το ενεργό κέντρο του ενζύµου. Αυτό έχει ως συνέπεια το αμινοξύ αυτό να είναι πάντοτε σε επαφή µε τον αρωματικό δακτύλιο των σουλφονυλουριών, αλλά να μην επηρεάζει τις ιµιδαζολινόνες. Επομένως, η αντικατάστασή του δεν επιτρέπει την είσοδο των σουλφονυλουριών στη δίοδο πρόσβασης προς το ενεργό κέντρο, αλλά δεν επηρεάζει την είσοδο των περισσότερων ιµιδαζολινονών (McCourt, κ.ά., 2006). Η αντικατάσταση του αμινοξέος Ala 205 από τη Val οδήγησε στις τρεις από τις τέσσερις περιπτώσεις σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες αλλά και στις ιµιδαζολινόνες (Tranel κ.ά., 2011). Επίσης, σύμφωνα µε τις ίδιες πηγές, η αντικατάσταση του αμινοξέος Asp 376 από το γλουταµικό οξύ (Glu) οδήγησε στις δύο από τις τρεις περιπτώσεις σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα σε όλες τις οικογένειες των ζιζανιοκτόνων (παρόμοια µε την αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 ). Η αντικατάσταση του αµινοξέος Ser 653 από τη Thr ή την Asn οδήγησε στις τέσσερεις από τις πέντε περιπτώσεις σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στις ιµιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες (Tranel κ.ά., 2011). Τέλος, η αντικατάσταση της Gly 654 από το Asp ήταν υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα ενός πληθυσμού του ζιζανίου σετάρια πράσινη [Setaria viridis (L.) P. Beauv.)] στο ζιζανιοκτόνο imazethapyr. Η συγκεκριμένη αντικατάσταση οδήγησε σε περιορισμένη σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα nicosulfuron και fluocarbazone (RF < 10), αλλά όχι στο pyrithiobac (Tranel κ.ά., 2011; Laplante κ.ά., 2009). Οι Sales κ.ά. (2008) και οι Rajaguru κ.ά. (2005) αναφέρουν ότι, εκτός από τις έξι προαναφερθείσες σημαντικές αντικαταστάσεις αμινοξέων, η αντικατάσταση των αμινοξέων Ser 186, Lys 416, Gly 654, Leu 662 ή Val 669 του ενζύµου ALS από τα αντίστοιχα αμινοξέα Pro, Glu, Glu, Pro ή Met οδηγεί σε ανάπτυξη βιότυπων-πληθυσμών του ζιζανίου κόκκινο ρύζι µε ανθεκτικότητα στις ιµιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες. Το 3,5% των πληθυσμών των ζιζανίων µε ανθεκτικότητα (εξαιτίας τροποποίησης του ενζύµου ALS) στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ALS που έχουν καταγραφεί σε µοριακό επίπεδο (αλληλούχηση ALS γονιδίου) διεθνώς μέχρι το 2010 οφείλεται σε αντικατάσταση του αµινοξέος Asp 376 από το Glu. Η αντικατάσταση του αµινοξέος

40 39 Ala 205 από Val εμφανίζεται στο 4,7% των περιπτώσεων ανθεκτικότητας, ενώ η αντικατάσταση του ίδιου αµινοξέος στη θέση 122 από Thr είναι υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα του 5,8% των περιπτώσεων. Η αντικατάσταση του αµινοξέος Ser 653 από τα αμινοξέα Thr, Asn ή Ile αφορά το 9,4% των περιπτώσεων ανθεκτικότητας, ενώ για το 22,4% των περιπτώσεων, η ανθεκτικότητα οφείλεται στην αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 από Leu. Τέλος, για το 52,9% των περιπτώσεων ανθεκτικότητας η αιτία ανάπτυξης ανθεκτικότητας είναι η αντικατάσταση του αµινοξέος Pro 197. Συγκεκριμένα, για το αμινοξύ αυτό, το 16,5% των περιπτώσεων αφορά την αντικατάστασή του από Ser, το 7,1% από Thr, το 7,1% από Leu, το 5,9% από Ala, το 5,8% από His, το 5,8% από Gln και το 4,7% από Arg ή Ile (Tranel κ.ά. 2011; Heap, 2011). Βέβαια, οι αντικαταστάσεις αυτές, αν και προκαλούν ανάπτυξη ανθεκτικότητας, δεν επηρεάζουν την καταλυτική δράση του ενζύµου. Αυτό σημαίνει ότι οι αντικαταστάσεις αυτές είναι πέραν του ενεργού κέντρου του ενζύµου ή ότι το ενεργό κέντρο του ενζύµου δεν αποτελεί σημείο σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων αναστολέων της δράσης του (Duggleby κ.ά., 2008; Pang κ.ά., 2002; Tranel και Wright, 2002). Ελάχιστες μεταλλάξεις υπεύθυνες για ανθεκτικότητα ζιζανίων, σε αντίθεση µε την πληθώρα των καταγεγραμμένων μεταλλάξεων του ALS γονιδίου, έχουν καταγραφεί για γονίδια που κωδικοποιούν θέσεις-στόχους άλλων ζιζανιοκτόνων µε διαφορετικό τρόπο δράσης. Για παράδειγμα, στο psba γονίδιο-υπεύθυνο για την έκφραση της D1 πρωτεΐνης, έχουν εντοπιστεί µόνο δύο μεταλλάξεις (αλλαγή του αµινοξέος Ser 264 από Gly και της Val 219 από Ile) σε φυσικούς πληθυσμούς ζιζανίων που εξηγούν την ανθεκτικότητά τους στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του PS II (Mengistu κ.ά., 2000; Gronwald, 1994). Επίσης, αν και έχουν παρατηρηθεί 79 πληθυσμοί (σε 20 διαφορετικά είδη ζιζανίων) ανθεκτικοί στις γλυκίνες [ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου συνθάση του 5-ενολοπυροσταφυλοσικιµικού-3-φωσφορικού (EPSPS)], µόνο σε δύο περιπτώσεις των ζιζανίων Eleusine indica (L.) Gaertn. και Conyza canadensis (L.) Cronq. έχει διαπιστωθεί ότι η ανθεκτικότητα οφείλεται σε μετάλλαξη του EPSPS γονιδίου (Heap, 2011; Tranel και Wright, 2002). Οι Tranel και Wright (2002) αναφέρουν ότι η μεγαλύτερη παραλλακτικότητα των αλληλοµόρφων ALS γονιδίων που προσδίδουν ανθεκτικότητα στα ζιζάνια εξηγούν τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών πληθυσμών.

41 Σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS Οι περιπτώσεις σταυρανθεκτικότητας που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα των ιμιδαζολινονών χωρίς ταυτόχρονη σταυρανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες και στις άλλες οικογένειες αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS (οφείλεται σε αντικαταστάσεις της Ala 122 ). Η δεύτερη ομάδα σταυρανθεκτικότητας αναφέρεται στην ισχυρή ανθεκτικότητα στις ιμιδαζολινόνες, αλλά περιορισμένη ή όχι ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (οφείλεται σε αντικαταστάσεις των αμινοξέων Ser 653 και Gly 654 ). Η τρίτη ομάδα αφορά την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στις σουλφονυλουρίες χωρίς ταυτόχρονη ανάπτυξη σταυρανθεκτικότητας στις ιµιδαζολινόνες ή στους υπόλοιπους αναστολείς του ALS (οφείλεται σε αντικαταστάσεις των αμινοξέων Pro 197 και Ala 205 ). Τέλος, η τέταρτη ομάδα σταυρανθεκτικότητας περιλαμβάνει σταυρανθεκτικότητα σε όλες τις ομάδες ζιζανιοκτόνων µε δράση αναστολέα του ALS (οφείλεται σε αντικαταστάσεις των αμινοξέων Trp 574 και Asp 376 ) (Tranel κ.ά., 2011; Tranel και Wright, 2002) Τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ALS Η ραγδαία εμφάνιση νέων πληθυσμών ζιζανίων µε ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS αποτέλεσε σημαντικό κίνητρο για την ανάπτυξη αξιόπιστων και ταχέων διαγνωστικών μεθόδων που βασίζονται στην αλληλούχηση του DNA των γονιδίων που κωδικοποιούν το ένζυµο ALS (ευαίσθητο ή ανθεκτικό) που είναι στόχος των πέντε οικογενειών ζιζανιοκτόνων που αναστέλλουν το συγκεκριμένο ένζυμο. Αξίζει να αναφερθεί ότι και οι τεχνικές διάγνωσης που βασίζονται σε πειράματα ολόκληρου φυτού (πειράματα σε φυτοδοχεία, βιοδοκιμές, τρυβλία) ή σε in vitro αξιολόγηση της ενζυμικής δράσης παρέχουν επίσης αξιόπιστα αποτελέσματα, αλλά η διεξαγωγή αυτών των πειραμάτων είναι συνήθως επίπονη, χρονοβόρα και απαιτεί χώρο στις εργαστηριακές εγκαταστάσεις. Επίσης, τα πειράματα ολόκληρου φυτού παρέχουν δεδομένα ανθεκτικότητας ζιζανίων που οφείλεται σε ανθεκτικό ένζυμο ALS αλλά και σε άλλους μηχανισμούς ανθεκτικότητας. Αντίθετα, οι βασισμένες στο DNA τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας, αν και είναι ταχείες και παρέχουν αξιόπιστο

42 41 προσδιορισμό των υπεύθυνων για την ανθεκτικότητα μεταλλάξεων, αδυνατούν να διαγνώσουν ανθεκτικότητα που οφείλεται σε μηχανισμούς διαφορετικούς από την τροποποίηση του ενζύµου ALS. Βέβαια, λαμβάνοντας υπόψη ότι η πλειοψηφία των περιπτώσεων ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS οφείλεται σε τροποποίησή του, η αδυναμία των βασισμένων στο DNA µοριακών μεθόδων να διαγνώσουν ανθεκτικότητα που οφείλεται σε άλλα αίτια πλην της τροποποίησης του ενζύµου ALS στόχου, πρακτικά δεν αποτελεί μειονέκτημα. Οι τρεις μέθοδοι διάγνωσης ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα που βασίζονται στην τεχνολογία του DNA είναι α) η μετουσιωτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης [Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC)], β) η ενίσχυση αλληλομόρφων γονιδίων µε αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction amplification of specific alleles (PCR)] και γ) ο πολυμορφισµός μήκους θραύσματος DNA µε ένζυμα περιορισμού [Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)] (Corbett και Tardif, 2006α) Μετουσιωτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (DHPLC) Η μέθοδος αυτή (DHPLC) βασίζεται στο διαφορετικό χρόνο έκλουσης των ετερόδιπλων τμημάτων DNA σε στήλη υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Η περιοχή που πιθανώς περιέχει την υπεύθυνη μετάλλαξη για ανθεκτικότητα ( bp) ενισχύεται µε αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) και μετουσιώνεται. Το DNA από τα φυτά των ζιζανίων με πιθανή ανάπτυξη ανθεκτικότητας αναμιγνύεται µε το DNA των ευαίσθητων φυτών ώστε τα ανθεκτικά αλληλόµορφα (R) να υβριδιστούν µε τα ευαίσθητα (S) και να δημιουργηθούν δύο οµόδιπλα (R-R και S-S) και δύο ετερόδιπλα (R-S και S-R) DNA τμήματα. Τα τμήματα αυτά (DNA) μπορούν να διαχωριστούν σε στήλη αλκυλιωµένου υλικού πλήρωσης. Ο χρόνος έκλουσης του DNA που φέρει το R αλληλόµορφο διαφοροποιείται από τον αντίστοιχο που φέρει µόνο το S αλληλόµορφο µε αποτέλεσμα, το DNA µε το R αλληλόµορφο να εμφανίζεται ως δύο κορυφές στο χρωματογράφημα και το DNA χωρίς το R αλληλόµορφο ως µία κορυφή (Corbett και Tardif, 2006α). Οι Siminszky κ.ά. (2005) χρησιμοποίησαν την DHPLC μέθοδο και ανίχνευσαν µε επιτυχία μεταλλάξεις DNA (αντικαταστάσεις των αμινοξέων Ala 122, Trp 574 και Ser 653 ) σε ανθεκτικά άτομα των ζιζανίων Amaranthus powellii Wats. και βλήτο τραχύ (A. retroflexus L.).

43 Ενίσχυση αλληλοµόρφων γονιδίων µε αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction Amplification of Specific Alleles, PCR) Η συγκεκριμένη τεχνική βασίζεται στη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (PCR) για την ενίσχυση της περιοχής του γονιδίου όπου εικάζεται ότι περιέχονται μεταλλάξεις υπεύθυνες για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας. Στη συνέχεια, γίνεται η αλληλούχηση αυτών των ενισχυμένων τμημάτων του γονιδίου και ακολουθεί η ανίχνευση των μεταλλάξεων µέσω στοίχισης και σύγκρισης των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων από τα πιθανώς ανθεκτικά άτομα του ζιζανίου µε τις αντίστοιχες αλληλουχίες ευαίσθητων ατόμων (Corbett και Tardif, 2006α). Η συγκεκριμένη τεχνική διάγνωσης της ανθεκτικότητας έχει υιοθετηθεί από πολλούς ερευνητές για τον προσδιορισμό του μηχανισμού ανθεκτικότητας ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS. Για παράδειγμα, οι McNaughton κ.ά. (2005) µε την τεχνική αυτή (στοίχιση και σύγκριση αλληλουχιών DNA από ευαίσθητα και ανθεκτικά άτομα των ζιζανίων Amaranthus powellii Wats. και βλήτο τραχύ) προσδιόρισαν τέσσερεις μεταλλάξεις (αντικατάσταση των αμινοξέων Ala 122, Ala 205, Trp 574 και Ser 653 από τα αμινοξέα Thr, Val, Leu και Thr, αντίστοιχα) που εξηγούν την ανθεκτικότητα των προαναφερθέντων ζιζανίων. Η αλληλούχηση του ALS γονιδίου, αν και ως μέθοδος διάγνωσης της ανθεκτικότητας είναι πολύ ακριβής και αξιόπιστη, χαρακτηρίζεται από ορισμένα μειονεκτήματα. Ειδικότερα, τα μειονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι α) ο περιορισμένος αριθμός διαδοχικών νουκλεοτιδίων που μπορεί να αλληλουχηθεί µε την έως σήμερα διαθέσιμη τεχνολογία, β) ο μεγάλος όγκος δεδομένων που παρέχει και η δυσκολία διαχείρισης και ελέγχου τους, και γ) οι μεγάλες απαιτήσεις σε χρόνο εκτέλεσης και σε γνώσεις σε σύγκριση µε άλλες µοριακές τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας (Corbett και Tardif, 2006α) Πολυµορφισµός μήκους θραύσματος DNA µε ένζυμα περιορισμού (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) Η γενετική ποικιλομορφία σε έναν πληθυσμό λέγεται πολυμορφισμός, ενώ η διάσπαση του DNA σε διαφορετικές θέσεις από τις ενδονουκλεάσες λέγεται πολυμορφισμός μήκους περιοριστικών θραυσμάτων ή πολυμορφισμός των τμημάτων περιορισμένου μήκους ή πολυμορφισμός μήκους θραύσματος µε ένζυμα περιορισμού

44 43 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). Η μέθοδος αυτή βρίσκει εφαρμογές στην παρακολούθηση της κληρονομικότητας συγκεκριμένων γονιδίων, στην ανίχνευση μεταλλάξεων που εξηγούν γενετικές ασθένειες και ειδικότερα στη ζιζανιολογία στην ανίχνευση μεταλλάξεων που εξηγούν ανθεκτικότητα ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα. Οι τεχνικές αυτές βασίζονται στον πολυμορφισμό τμημάτων γονιδιακού υλικού που βρίσκονται κοντά στα γονίδια που διερευνώνται και συχνά αποτελούνται από διαφορετική σειρά βάσεων DNA (αναλόγως του ατόμου). Η χρήση ειδικών ενζύµων, τα οποία κόβουν την αλυσίδα DNA σε σημεία µε χαρακτηριστική ακολουθία βάσεων, παρέχει τμήματα DNA διαφορετικού μήκους. Το μήκος των τμημάτων αυτών, συγκρινόμενο µε αντίστοιχα τμήματα του γονιδιώµατος γνωστών ακολουθιών βάσεων DNA, συμβάλλει στην αναγνώριση των ατόμων που φέρουν το μεταλλαγμένο γονίδιο και μάλιστα διευκρινίζει αν αυτό βρίσκεται σε ομόζυγο ή ετερόζυγο κατάσταση. Η μέθοδος αυτή βρήκε εφαρμογή και στην ανίχνευση μεταλλάξεων που εξηγούν ανθεκτικότητα ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύµου ALS. Ειδικότερα, τμήματα του ALS γονιδίου ενισχύονται µε τη χρήση PCR κατά την τεχνική RFLP και ακολούθως υπόκεινται σε πέψη περιορισμού µε τη χρήση μίας ή περισσότερων ενδονουκλεασών περιορισμού. Τα ένζυμα αυτά, όπως προαναφέρθηκε, αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη μικρή αλληλουχία νουκλεοτιδίων (θέση περιορισμού) και κόβουν το DNA στη θέση αυτή. Επομένως, τμήματα του DNA που φέρουν τις θέσεις περιορισμού κόβονται στις συγκεκριμένες θέσεις κατά τη διαδικασία της πέψης και τα νέα τμήματα που προκύπτουν γίνονται ορατά σε διαφορετικές θέσεις σε πηκτή αγαρόζης. Τμήματα του DNA που δεν φέρουν θέσεις περιορισμού δεν κόβονται και γίνονται ορατά σε θέση όμοια µε το τμήμα που δεν έχει υποστεί πέψη σε πηκτή αγαρόζης. Οι σημειακές μεταλλάξεις που οδηγούν σε ανάπτυξη ανθεκτικότητας έχουν ως συνέπεια τη δημιουργία νέων ή την απώλεια ήδη υπαρχουσών θέσεων περιορισμού για συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού. Στην περίπτωση αυτή το DNA που δεν φέρει σημειακές μεταλλάξεις έχει διαφορετική συμπεριφορά κατά την πέψη περιορισμού από ότι το DNA που φέρει τις σημειακές μεταλλάξεις µε αποτέλεσμα να επιτρέπεται η διάγνωση της ανθεκτικότητας. Αξίζει να αναφερθεί ότι η μέθοδος αυτή αδυνατεί να εφαρμοστεί στην περίπτωση που η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων δεν παρουσιάζει αλλαγή σε θέση περιορισμού που συνδέεται άμεσα µε την ανθεκτικότητα (Corbett και

45 44 Tardif, 2006α). Η πρώτη χρήση ενζύµων περιορισμού για τη διάγνωση ανθεκτικότητας έγινε από τους Guttieri κ.ά. (1992), οι οποίοι µε τη χρήση του ενζύµου Sac II εντόπισαν μεταλλάξεις (αντικατάσταση του αµινοξέος Pro 197 ) σε ανθεκτικά άτομα των ζιζανίων Kochia scoparia (L.) Schrad., Lactuca serriola L. και Salsola iberica Sanner & Pau. Επίσης, για επιτυχή εντοπισμό μεταλλάξεων (αντικατάσταση του ίδιου αµινοξέος Pro 197 ) σε ανθεκτικά άτομα του ζιζανίου Raphanus raphanistrum L. χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο περιορισμού Nla IV (Tan και Medd, 2002). Το ένζυμο περιορισμού Mfe I χρησιμοποιήθηκε µε επιτυχία για τον εντοπισμό μεταλλάξεων (αντικατάσταση του αµινοξέος Trp 574 από τη Leu) σε άτομα ανθεκτικών πληθυσμών των ζιζανίων K. scoparia (L.) και R. raphanistrum (Foes κ.ά., 1999). Για τον εντοπισμό μεταλλάξεων (αντικατάσταση των αμινοξέων Ala 122 και Ala 205 ) σε ανθεκτικά άτομα των ζιζανίων Amaranthus powellii Wats. και βλήτο τραχύ χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο περιορισμού SfaN I (Corbett και Tardif, 2006β). Τέλος, η ενδονουκλεάση Bfa Ι χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση μεταλλάξεων (αντικατάσταση του αµινοξέος Ser 653 ) σε ανθεκτικά άτομα του ζιζανίου A. powellii, ενώ μεταλλάξεις (αντικατάσταση του αµινοξέος Asp 376 ) σε ανθεκτικά άτομα του ίδιου ζιζανίου ανιχνεύθηκαν µε επιτυχία χρησιμοποιώντας το ένζυμο περιορισμού Mbo I (Corbett και Tardif, 2006α) Ανάλυση καμπυλών τήξεως (HRM) υψηλής διακριτικής ικανότητας Η υψηλής διακριτικής ικανότητας ανάλυση καμπυλών τήξης (HRM, High Resolution Melt Analysis) επεκτείνει τις δυνατότητες της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (qpcr) ως προς την ανίχνευση μεταλλάξεων (Wilhelm και Pingoud, 2003). Το βασικό πεδίο εφαρμογής της ανάλυσης είναι ο γρήγορος και αξιόπιστος προσδιορισμός πολυμορφισμών ενός νουκλεοτιδίου (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) (Reed και Wittwer, 2004). Η HRM μπορεί να θεωρηθεί ως εξέλιξη της τεχνολογίας qpcr, όπου οι χρωστικές ουσίες φθορισμού χρησιμοποιούνται για να ανιχνεύσουν την ποσότητα του δίκλωνου DNA που παράγεται κατά την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης. Η ανίχνευση ύπαρξης µη εξειδικευμένων προϊόντων καθώς και διαφορετικών προϊόντων που παράγονται κατά την ενίσχυση της αλληλουχίας-στόχου μπορούν να ανιχνευθούν µε τη μέτρηση της σταδιακής μείωσης του μειούμενου φθορισμού κατά την τήξη του δίκλωνου DNA. Οι διαφορές στις καμπύλες μείωσης του φθορισμού και της θερμοκρασίας

46 45 τήξης του δίκλωνου DNA εξαιτίας της ύπαρξης SNPs επιτρέπουν τον εντοπισμό των τελευταίων. Αν και η συγκεκριμένη μέθοδος θα μπορούσε να εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό μεταλλάξεων υπεύθυνων για την ανθεκτικότητα των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα, δεν υπάρχουν παραδείγματα στη διεθνή βιβλιογραφία εφαρμογής της συγκεκριμένης μεθόδου για το συγκεκριμένο σκοπό (Wilhelm και Pingoud, 2003).

47 46 3. Πειραματικές εργασίες 3.1. Υλικά και Μέθοδοι Προέλευση σπόρων και παραγωγή φυτικού υλικού Σπόρος από επτά ανθεκτικούς (ένας από το νομό Θεσσαλονίκης και έξι από το νομό Χαλκιδικής) και από έναν ευαίσθητο πληθυσμό (Αγρόκτημα Α.Π.Θ.) του ζιζανίου ήρα η λεπτή χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του φυτικού υλικού που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα διερεύνησης της μοριακής βάσης της ανθεκτικότητας και αξιολόγησης της ενζυμικής δράσης παρουσία ζιζανιοκτόνων αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS (Πίνακας 3.1, Σχήμα 3.1). Πίνακας 3.1. Πληθυσμοί (επτά ανθεκτικοί και ένας ευαίσθητος) του ζιζανίου ήρα η λεπτή που αξιολογήθηκαν στα πειράματα ελέγχου της μοριακής βάσης της ανθεκτικότητας (αλληλούχηση ALS γονιδίου και δράση του ALS ενζύμου). Πληθυσμός Περιοχή Νομός Χαρακτηρισμός Ρ01 Δουμπιά (Μ. Όχθος) Χαλκιδικής Ανθεκτικός Ρ02 Δουμπιά (Πετρούσα) Χαλκιδικής Ανθεκτικός Ρ03 Δουμπιά (Γέφυρα 1) Χαλκιδικής Ανθεκτικός Ρ04 Δουμπιά (Γέφυρα 2) Χαλκιδικής Ανθεκτικός Ρ05 Παλαιοχώρα 1 Χαλκιδικής Ανθεκτικός Ρ06 Παλαιοχώρα 2 Χαλκιδικής Ανθεκτικός Ρ07 Ζαγκλιβέρι Θεσσαλονίκης Ανθεκτικός Ρ08 Αγρόκτημα Α.Π.Θ. Θεσσαλονίκης Ευαίσθητος Σπόροι του ζιζανίου τοποθετήθηκαν σε διηθητικό χαρτί εμποτισμένο με 5 ml αιωρήματος chlorsulfuron συγκέντρωσης 3, 0,5 και 0 mg δ.ο. L -1. Οι σπόροι των ανθεκτικών φυτών βλάστησαν παρουσία της μεγάλης συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου, ενώ τα ευαίσθητα άτομα δεν βλάστησαν παρουσία 0,5 mg chlorsulfuron/l (Βασιλείου κ.ά. 2006). Η προβλάστηση των σπόρων σε διάλυμα του ζιζανιοκτόνου πραγματοποιήθηκε για την επιλογή ανθεκτικών ατόμων που θα χρησιμοποιούνταν στον πειραματισμό. Επίσης, πραγματοποιήθηκε για την επιβεβαίωση της ανθεκτικότητας των χαρακτηρισμένων ως ανθεκτικών (R) πληθυσμών και της ευαισθησίας των χαρακτηρισμένων ως ευαίσθητων (S) πληθυσμών (Σχήμα 3.2).

48 47 Σχήμα 3.1. Περιοχές προέλευσης των επτά ανθεκτικών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού του ζιζανίου ήρα λεπτή. Σχήμα 3.2. Προβλάστηση σπόρου από τους επτά ανθεκτικούς και τον ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου ήρα λεπτή παρουσία 3,0 και 0,5 mg chlorsulfuron L -1. Οι σπόροι των ανθεκτικών πληθυσμών βλαστάνουν παρουσία 3,0 mg ζιζανιοκτόνου L -1 ενώ τα ευαίσθητα άτομα δεν βλαστάνουν παρουσία 0,5 mg chlorsulfuron L -1. Τα σπορόφυτα που βλάστησαν ικανοποιητικά (μήκος ρίζας ίσο με το αντίστοιχο του μάρτυρα) παρουσία 3 mg chlorsulfuron/l μεταφυτεύθηκαν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 8 x 7 x 7 cm (0,392 L) γεμισμένα με μείγμα τύρφης και εδάφους (1:1 v/v). Συνολικά, μεταφυτεύτηκαν δέκα φυτά από κάθε πληθυσμό. Από τον ευαίσθητο πληθυσμό επιλέχθηκαν για μεταφορά σε φυτοδοχεία φυτά που βλάστησαν απουσία ζιζανιοκτόνου (μάρτυρας). Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκε ένα φυτό. Στο στάδιο των 3-5 αδελφιών τα φυτά μεταφυτεύθηκαν σε μεγαλύτερα φυτοδοχεία για καλύτερη

49 48 ανάπτυξή τους (Σχήμα 3.3). Κατά τη διάρκεια της αύξησης των φυτών λήφθηκε μέριμνα για τακτική άρδευση και λίπανση σύμφωνα με της ανάγκες των φυτών για ομαλή ανάπτυξη. Τα αναπτυχθέντα μεμονωμένα φυτά χρησιμοποιήθηκαν για την παραλαβή του απαραίτητου φυτικού υλικού στις πειραματικές εργασίες αξιολόγησης της δράσης του ενζύμου ALS και της μοριακής βάσης (αλληλούχηση ALS γονιδίου) της ανθεκτικότητας. Σχήμα 3.3. Ανάπτυξη μεμονομένων ανθεκτικών ή ευαίσθητων φυτών για την παραγωγή του απαραίτητου για τις πειραματικές εργασίες φυτικού υλικού Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας επτά πληθυσμών ήρας Απομόνωση του γενωμικού DNA Δείγματα 100 mg ιστού συλλέχτηκαν από τα ελάσματα των φύλλων 3-5 μεμονωμένων φυτών από κάθε ανθεκτικό πληθυσμό και των φύλλων τριών φυτών του ευαίσθητου πληθυσμού. Τα δείγματα ιστού τοποθετήθηκαν σε μικροσωλήνες φυγοκέντρησης όγκου 1,5 ml, αφυδατώθηκαν υπό ψύχος για 72 h και αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου έως την εκχύλιση του γενωμικού DNA. Η απομόνωση του γενωµικού DNA από τα φυτά κάθε πληθυσμού (ανθεκτικού ή ευαίσθητου) έγινε µε χρήση εµπορικά διαθέσιµου συνόλου αντιδραστηρίων και υλικών µε καθορισμένο τρόπο και χρονική σειρά χρήσης2 ακολουθώντας τη CTAB μεθοδολογία όπως περιγράφεται στις οδηγίες του παρασκευαστή. Από τη διαδικασία εκχύλισης παραλήφθηκαν 100 μl διαλύματος γενωμικού DNA το οποίο διατηρήθηκε στους -20 oc έως την χρήση του ως εκμαγείο στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Ενίσχυση και αλληλούχηση τμήματος του ALS γονιδίου Το γενωμικό DNA των ανθεκτικών και του ευαίσθητου πληθυσμού ήρας χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την ενίσχυση τμήματος του ALS γονιδίου (413 bp)

50 49 με χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Συγκεκριμένα, η ενίσχυση του συγκεκριμένου τμήματος πραγματοποιήθηκε µε χρήση του πάνω εκκινητή GCCACCAACCTCGTCTCC (Up) και του κάτω εκκινητή CCACCGCCAACATARAGAAT (R=A/G) (Down). Το μείγµα για την PCR περιείχε 0,25 µμ από κάθε εκκινητή, 200 µμ από κάθε dntp, 1,5 mm MgCl 2, 5% DMSO, 1 Μονάδα (U) Thermus aquaticus (Taq) πολυµεράση 3 και 4 µl από το 10Χ συνοδευτικό ρυθμιστικό διάλυμα της πολυµεράσης σε συνολικό όγκο αντίδρασης 120 µl (40 µl Χ 3 PCR). Το πρόγραμμα του θερµοκυκλοποιητή 4 περιελάμβανε ένα αρχικό στάδιο τήξης του DNA εκμαγείου στους 95 C για 5 min και στη συνέχεια 35 κύκλους µε τα εξής στάδια: τήξη του DNΑ εκμαγείου στους 95 C για 30 sec, υβριδίωση των εκκινητών στους 57 C για 30 sec και επέκταση των εκκινητών στους 72 C για 50 sec. Μετά το πέρας του 35ου κύκλου, συμπεριλήφθηκε ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 C για 5 min. Τα προϊόντα των αντιδράσεων για κάθε πληθυσμό αποθηκεύτηκαν στους -20 C. Το προϊόν κάθε αλυσιδωτής αντίδρασης διαχωρίστηκε σε πηκτή αγαρόζης (1,3%) από όπου η ζώνη που αντιστοιχούσε στο τμήμα του ALS γονιδίου (413 bp) εντοπίστηκε και αποκόπηκε. Η παραλαβή του τμήματος του ALS γονιδίου από την πηκτή αγαρόζης πραγματοποιήθηκε µε χρήση εμπορικά διαθέσιμου συνόλου αντιδραστηρίων και υλικών µε προδιαγεγραμμένο τρόπο και χρονική σειρά χρήσης 5 σύμφωνα µε τη μεθοδολογία που περιγράφεται στις οδηγίες χρήσης του παρασκευαστή. Το καθαρό προϊόν αποστάλθηκε αμέσως για αλληλούχηση σε εξειδικευμένο εργαστήριο του εξωτερικού 6. Κάθε προϊόν αλληλουχήθηκε µία φορά µε τον εκκινητή Up και µία φορά µε τον εκκινητή Down. Η οπτικοποίηση και επεξεργασία των χρωµατογραφηµάτων αλληλούχησης έγινε µε χρήση του λογισμικού BioEdit 7 7. Οι αλληλουχίες του DNA στοιχήθηκαν και συγκρίθηκαν µε χρήση του λογισμικού ClustalX 8. Το ίδιο λογισμικό χρησιμοποιήθηκε και για τη μετάφραση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων σε αντίστοιχη αλληλουχία αµινοξέων.

51 Αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) από φυτά επτά ανθεκτικών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας Εκχύλιση του ενζύµου ALS Η εκχύλιση του ενζύμου ALS και στη συνέχεια η αξιολόγηση της δράσης του έγινε βάσει της μεθοδολογίας των Osuna και De Prado (2003) µε κάποιες τροποποιήσεις (Σχήμα 3.4). Αναλυτικότερα, η ALS παραλήφθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης (3 ml/g ιστού) µε σύνθλιψη του φυτικού ιστού (3 g ιστού) σε κεραμικό γουδί παρουσία 0,75 g πολυβινυλοπυρρολιδόνης (PVPP). Το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης περιείχε 0,1 Μ φωσφορικών (ΚΗ 2 ΡΟ 4 /Κ 2 ΗΡΟ 4 ) για ρύθμιση του ph στο 7,5. Επίσης, περιείχε 1 mm πυροσταφυλικού νατρίου (C 3 H 3 NaO 3 ), 0,5 mm χλωριούχου μαγνησίου (MgCl 2 ), 0,5 mm διφωσφορική θειαμίνη (ThDP) (C 12 H 19 N 4 O 7 P 2 S), 10 µμ FAD (C 27 H 33 N 9 O 15 P 2 ), 12 mm διθειοθρεϊτόλης (DTT) και 1:9 ο/ο γλυκερόλη [C 3 H 5 (ΟΗ) 3 ]/συνολικό ρυθμιστικό διάλυμα. Τέλος, προστέθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης μίγμα αναστολέων πρωτεασών 9 (36 µl/g φυτικού ιστού) για τον περιορισμό της δράσης των πρωτεολυτικών ενζύμων. Το ομογενοποιημένο μείγμα φυτικού ιστού και ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης φιλτραρίστηκε με γάζα σε χωνί για 15 min και φυγοκεντρήθηκε (27000 g για 45 min) για απομάκρυνση των φυτικών υπολειμμάτων και παραλαβή του υπερκείμενου υγρού. Το πρωτεϊνικό κλάσμα που περιείχε το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση καταβυθίστηκε από το υπερκείμενο υγρό µε προσθήκη θειικού αμμωνίου [(ΝΗ 4 ) 2 SO 4 ] (50% της συγκέντρωσης κορεσμού) και παραλήφθηκε ως ίζημα μετά από φυγοκέντρηση (7500 g για 10 min). Το ίζημα επαναδιαλυτοποιήθηκε σε 500 µl ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης και στη συνέχεια αφαλατώθηκε σε κυλινδρική στήλη ύψους 150 mm και διαμέτρου 10 mm η οποία περιείχε 700 mg Sephadex G-25 S- fine 10 διογκωμένο για 3 h στους 60 ºC στο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης [0,1 Μ φωσφορικών (ΚΗ 2 ΡΟ 4 /Κ 2 ΗΡΟ 4 ) για ρύθμιση του ph στο 7,5, 20 mm πυροσταφυλικού νατρίου και 0,5 Μ χλωριούχου μαγνησίου]. Η προσθήκη του επαναδιαλυτοποιημένου ιζήματος στη στήλη πραγματοποιήθηκε αφού το προς πλήρωση υλικό εξισορροπήθηκε µε το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης και σταθεροποιήθηκε ο ρυθμός έκλουσης. Όλα τα στάδια εκχύλισης πραγματοποιήθηκαν στους 4 C. Το αφαλατωμένο πρωτεϊνικό εκχύλισμα αποθηκεύτηκε στους -20 ο C για μέγιστο χρονικό διάστημα δύο ημερών εντός του οποίου χρησιμοποιήθηκε στη

52 51 δοκιμή της ενζυμικής δράσης. Σχήμα 3.4. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας εκχύλισης-καταβύθισης-αφαλάτωσης και παραλαβής από φυτικό ιστό ήρας του κλάσματος των πρωτεϊνών µε δράση του ενζύµου ALS Δοκιμή της δράσης του ενζύµου ALS Η δράση του ενζύμου ALS αξιολογήθηκε µε τον ποσοτικό προσδιορισμό της παραγόμενης ακετοΐνης από την αποκαρβοξυλίωση του οξικογαλακτικού οξέος ως προϊόν της αντίδρασης συμπύκνωσης δύο µορίων πυροσταφυλικού οξέος. Η έναρξη της αντίδρασης πραγματοποιήθηκε µε την προσθήκη 10 µl πρωτεϊνικού εκχυλίσματος σε 52,5 µl πρόσφατα παρασκευασμένου ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος, το οποίο περιείχε 0,08 Μ φωσφορικών (ΚΗ 2 ΡΟ 4 /Κ 2 ΗΡΟ 4 ) για ρύθμιση του ph στο 7,0, 51,4 mm πυροσταφυλικού νατρίου, 0,5 mm χλωριούχου μαγνησίου, 0,34 mm ThDP και 54,8 µμ FAD. Για την αξιολόγηση της επίδρασης των ζιζανιοκτόνων ALS-αναστολέων στη δράση του ενζύμου ALS, η αντίδραση

53 52 συμπύκνωσης έλαβε χώρα παρουσία έξι συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων, chlorsulfuron 11, mesosulfuron 12 και imazamox 13 (Πίνακας 3.2). Πίνακας 3.2. Συγκεντρώσεις των ζιζανιοκτόνων ALS-αναστολέων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την αξιολόγηση της δράσης του ενζύµου ALS. Mesosulfuron Chlorsulfuron Imazamox nm Η αντίδραση του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος που πραγματοποιήθηκε απουσία ζιζανιοκτόνου ALS-αναστολέα χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες 96 πηγαδιών επίπεδου πυθμένα και όγκου 250 µl, ενώ το μείγμα (αμέσως μετά την προσθήκη του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος) επωάστηκε για 1 h στους 37 C. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης, η αντίδραση τερματίστηκε µε προσθήκη 12,5 µl θειικού οξέος 3Μ. Το μείγμα επωάστηκε για 15 min στους 60 C για να διευκολυνθεί η αποκαρβοξυλίωση του οξικογαλακτικού οξέος προς ακετοΐνη. Για τη δημιουργία έγχρωμου συμπλόκου και τον ποσοτικό προσδιορισμό της παραγόμενης ακετοΐνης προστέθηκαν στο μίγμα 62,5 µl διαλύματος κρεατινίνης (5 g/l) και 62,5 µl διαλύματος α-ναφθόλης (5 g/l σε ΝaΟΗ 2,5 Μ) και ακολούθησε επώαση για 15 min σε θερμοκρασία 60 C. Ο ποσοτικός προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε φασµατοφωτοµετρικά 14 µε μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 520 nm (A 520nm ) (Westerfield, 1945). Η απορρόφηση του τυφλού δείγματος [πηγάδια στα οποία η αντίδραση τερματίστηκε πριν λάβει χώρα µε προσθήκη 12,5 µl θειϊκού οξέος (3 Μ) πριν την προσθήκη του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος] αφαιρέθηκε από την τιμή απορρόφησης των υπόλοιπων αντιδράσεων. Οι τελικές τιμές απορρόφησης εκφράστηκαν ως ποσοστό (%) της απορρόφησης των δειγμάτων του μάρτυρα (αντίδραση απουσία αναστολέα). Για κάθε πληθυσμό του ζιζανίου χρησιμοποιήθηκε φυτικό υλικό από δύο φυτοδοχεία και για το φυτικό υλικό κάθε φυτοδοχείου πραγματοποιήθηκαν δύο αντιδράσεις αξιολόγησης της ενζυμικής

54 53 δράσης (4 επαναλήψεις συνολικά). Το πείραμα έγινε δύο φορές. Πριν από την αξιολόγηση της ενζυμικής δράσης ελέγχθηκε η γραμμικότητα της αντίδρασης συμπύκνωσης ως προς τη συγκέντρωση του ενζύμου και ως προς το χρόνο και δεν διαπιστώθηκε παραβίαση της γραμμικότητας για το χρόνο πραγματοποίησης της αντίδρασης (60 min) και τη συγκέντρωση του ενζύμου (10 μl/αντίδραση) που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις αναλύσεις Στατιστική ανάλυση Τα δεδομένα της δράσης του ενζύµου ALS (απορρόφηση σε Α 520nm ως % του μάρτυρα) αναλύθηκαν (ανάλυση παραλλακτικότητας) συνδυασμένα ως προς τις δύο επαναλήψεις του πειράματος στο χρόνο χρησιμοποιώντας την παραγοντική προσέγγιση 6 x 8 x 4 (6 συγκεντρώσεις ζιζανιοκτόνων x 8 πληθυσμοί ήρας x 4 αντιδράσεις) για κάθε ζιζανιοκτόνο ALS-αναστολέα χωριστά. Το πειραματικό σχέδιο που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παραλλακτικότητας ήταν το πλήρως τυχαιοποιημένο. Επειδή οι αναλύσεις παραλλακτικότητας δεν έδειξαν διαφορές ως προς το χρόνο αλλά µόνο σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ των συγκεντρώσεων κάθε ζιζανιοκτόνου ALS αναστολέα και των πληθυσμών του ζιζανίου, οι μέσοι όροι της αλληλεπίδρασης των δύο παραγόντων παρουσιάζονται και συγκρίνονται σε επίπεδο σημαντικότητας 5% µε τη μέθοδο της Ελάχιστης Σημαντικής Διαφοράς (ΕΣΔ 0,05 ). Οι προαναφερθέντες μέσοι όροι της δράσης του ενζύµου ALS (Α 520nm % του μάρτυρα) των συγκεντρώσεων για κάθε ζιζανιοκτόνο ALS-αναστολέα και κάθε πληθυσμό χρησιμοποιήθηκαν για την εξεύρεση της γραμμής (εξίσωσης) συμμεταβολής που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ της δράσης του ενζύµου ALS και της συγκέντρωσης κάθε ζιζανιοκτόνου. Μεταξύ των εξισώσεων συµµεταβολής αξιολογήθηκε και η λογαριθμική-λογιστική (log-logistic) εξίσωση 3.1 των Seefeldt κ.ά. (1995) που παρουσιάζεται παρακάτω. y = C + D C x 1+ I 50 b Εξίσωση 3.1 Όπου C = το πάνω όριο, D = το κάτω όριο, b = η κλίση της καμπύλης στη

55 54 συγκέντρωση Ι 50, και Ι 50 = η συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου ALS-αναστολέα που απαιτείται για 50% μείωση της δράσης του ενζύµου ALS. Στη συγκεκριμένη εξίσωση συµµεταβολής, η συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου ALS-αναστολέα (nμ ή pμ) είναι η ανεξάρτητη μεταβλητή (x) και η ενζυµική δράση (Α 520nm % του μάρτυρα) είναι η εξαρτημένη μεταβλητή (y). Η εξίσωση συµµεταβολής που περιέγραψε καλύτερα τη σχέση μεταξύ δράσης του ενζύµου ALS και συγκέντρωσης ζιζανιοκτόνου χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης (nm) των chlorsulfuron, imazamox, και mesosulfuron που προκαλεί 50% μείωση της δράσης του ενζύµου ALS κάθε πληθυσμού (τιμή I 50 ). Η τυχαία κατανομή των σφαλμάτων των προβλεπόμενων από τη μαθηματική εξίσωση τιμών εξετάστηκε κάνοντας χρήση του ελέγχου του Runs. Η ένταση της ανθεκτικότητας (τιμή R/S) του ενζύµου ALS για κάθε πληθυσμό ήρας (ανθεκτικό ή ευαίσθητο) και για κάθε ALS-αναστολέα προσδιορίστηκε ως λόγος ανθεκτικότητας, όπου R = αριθμητής, η τιμή Ι 50 του πληθυσμού και S = παρονομαστής, η αντίστοιχη τιμή Ι 50 για τον ευαίσθητο πληθυσμό Ρ08 του αγροκτήματος του Α.Π.Θ.

56 Αποτελέσματα και Συζήτηση Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας οκτώ πληθυσμών ήρας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron Στοίχιση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων και ανάλυση των χρωµατογραφηµάτων αλληλούχησης Το τμήμα 413 bp του ALS γονιδίου που αλληλουχήθηκε από όλους τους πληθυσμούς της ήρας στοιχήθηκε κάτω ακριβώς από την αλληλουχία του ALS ευαίσθητου αλληλοµόρφου γονιδίου της ήρας και του είδους A. thaliana (αλληλουχίες από τη δικτυακή βάση δεδομένων GenBank). Το χρωµατογράφημα DNA αλληλούχησης του ευαίσθητου πληθυσμού-μάρτυρα Ρ08 έδειξε ύπαρξη του αµινοξέος Pro (CCG) στη θέση 197 για όλα τα φυτά που αναλύθηκαν. Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν από τους Yu κ.ά. (2008), οι οποίοι βρήκαν ότι όλα τα άτομα των ευαίσθητων πληθυσμών ήρας είχαν την ίδια αλληλουχία νουκλεοτιδίων στο κωδικόνιο 197. Αντίθετα, από τη σύγκριση των αλληλουχιών DNA για τα άτομα των επτά ανθεκτικών πληθυσμών του ζιζανίου διαπιστώθηκε η ύπαρξη πέντε διαφορετικών σημειακών μεταλλάξεων στην πρώτη κυτοσίνη (C), στη δεύτερη κυτοσίνη (C) και στη γουανίνη (G) του ίδιου κωδικόνιου (Pro 197 ). Επιπλέον, για ορισμένα άτομα, διαπιστώθηκε η ταυτόχρονη ύπαρξη δύο μεταλλάξεων στη δεύτερη και τρίτη βάση του κωδικονίου. Οι μεταλλάξεις που διαπιστώθηκαν ήταν στο ένα μόνο αλληλόμορφο (ετεροζυγωτία R/S) ή και στα δύο αλληλόμορφα (ομοζυγωτία R/R ή ετεροζυγωτία R 1 /R 2 ). Ειδικότερα, σε εννέα άτομα πέντε πληθυσμών διαπιστώθηκε μετάλλαξη στην πρώτη βάση του κωδικονίου 197 και συγκεκριμένα αλλαγή της πρώτης κυτοσίνης από γουανίνη. Η μετάλλαξη αυτή οδήγησε σε αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 από Ala. Σε τέσσερα φυτά, η προαναφερθείσα αντικατάσταση ήταν σε ομόζυγη κατάσταση και σε πέντε φυτά σε ετερόζυγη. Σε δύο φυτά του πληθυσμού P02 διαπιστώθηκαν δύο ταυτόχρονες μεταλλάξεις. Συγκεκριμένα, η μετάλλαξη της δεύτερης κυτοσίνης σε γουανίνη και η μετάλλαξη της γουανίνης (τρίτη βάση) σε κυτοσίνη. Στην τελευταία περίπτωση, η μετάλλαξη στη τρίτη βάση δεν έχει επίδραση στο αμινοξύ αντικατάστασης με αποτέλεσμα οι μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 197, στα συγκεκριμένα φυτά, να οδηγούν σε αντικατάσταση της Pro 197 από Arg. Και τα δύο άτομα βρέθηκαν ετερόζυγα (R/S).

57 56 Τέλος, σε ένα άτομο του πληθυσμού P06, διαπιστώθηκε μετάλλαξη της δεύτερης κυτοσίνης του κωδικονίου 197 σε αδενίνη. Η μετάλλαξη ήταν σε ένα εκ των δύο αλληλομόρφων γονιδίων και οδήγησε σε αντικατάσταση της Pro 197 από Gln. Σε δύο άτομα του πληθυσμού Ρ03, η ταυτόχρονη ύπαρξη δύο μεταλλάξεων, δεν επέτρεψε τον ακριβή προσδιορισμό του αμινοξέος αντικατάστασης. Στις περιπτώσεις αυτές, η Pro 197 πιθανώς αντικαταστάθηκε από Gln ή His. Για τον ακριβή προσδιορισμό του αμινοξέος αντικατάστασης στις συγκεκριμένες περιπτώσεις, τα δεδομένα της αλληλούχησης δεν είναι επαρκή, γεγονός που συνεπάγεται περαιτέρω ανάλυση με χρήση διαφορετικών μεθόδων όπως η ανάλυση με τη χρήση ενζύμων περιορισμού (μέδοδος CAPS ή dcaps) (Yu κ.ά. 2008). Στα φυτά των πληθυσμών P01, Ρ04, Ρ05 και P07 διαπιστώθηκε μόνο η ύπαρξη μετάλλαξης υπεύθυνης για αντικατάσταση της Pro 197 από Ala.

58 57 Πληθυσμός- Δείγμα Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Αμινοξύ στη θέση 197 P08-01 C A G G T C C C G C G C C G C A T G A T C G G C A C G G A C G C C Pro P Pro P G Ala P S Ala/Pro P S S Arg/Pro P S S Arg/Pro P W S P W S Leu/His ή Leu/Gln Leu/His ή Leu/Gln P S Ala/Pro P G Ala P G Ala P S Ala/Pro P M Gln/Pro P S Ala/Pro P G Ala P S Ala/Pro Φυσικός τύπος ALS Pro A. thaliana.. A..... T.. T.. T..... T.. T.. A.. T.. G Pro Συναινετική ακολουθία C A A G T A S N B A G G A G G A T G A T T G G T A C T G A T G C A Σχήμα 3.5. Η στοίχιση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων και των αντίστοιχων αμινοξέων για το τμήμα του ALS γονιδίου ενός ευαίσθητου και επτά ανθεκτικών πληθυσμών ήρας, φανερώνει την ύπαρξη διαφορετικών σημειακών μεταλλάξεων στο κωδικόνιο 197. Οι θέσεις των κωδικονίων αναφέρονται στο ευαίσθητο αλληλόμορφο ALS γονίδιο του είδους A. thaliana (αριθμός πρόσβασης GenBank: X51514). Οι αλληλουχίες συγκρίθηκαν με την αντίστοιχη για το αλληλόμορφο ALS γονίδιο του φυσικού τύπου ήρας (αριθμός πρόσβασης GenBank: EF411170) και παρατηρείται στις τελευταίες γραμμές του Σχήματος. Οι τελείες (.) δείχνουν ομοιότητα με την αλληλουχία του ευαίσθητου πληθυσμού P08. I.U.P.A.C. I.U.B κωδικοί για μικτά νουκλεοτίδια: Y, T ή C; M, A ή C; S, G ή C; B, C ή G ή T; K, G ή T; H, A ή C ή G; N, οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο.

59 58 Ομοζυγωτία Ετεροζυγωτία Σχήμα 3.6. Απεικόνιση τεσσάρων διαφορετικών περιπτώσεων χρωματογραφημάτων αλληλούχησης του κωδικόνιου 197 (CCG) του ALS γονιδίου. SS, καμία αντικατάσταση νουκλεοτιδίου (μονές κορυφές); RR, αντικατάσταση του ίδιου νουκλεοτιδίου και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια (μονές κορυφές); RS, αντικατάσταση νουκλεοτιδίου μόνο στο ένα αλληλόμορφο γονίδιο (διπλή κορυφή); R 1 R 2, αντικατάσταση διαφορετικού νουκλεοτιδίου σε κάθε αλληλόμορφο γονίδιο (διπλές κορυφές). Μπλε κορυφή, κυτοσίνη (C); κόκκινη κορυφή, θυμίνη (T); πράσινη κορυφή, αδενίνη (A); μαύρη κορυφή,γουανίνη (G). Τα δεδομένα της αλληλούχησης από τον ευαίσθητο και τους επτά ανθεκτικούς πληθυσμούς συμφωνούν με τα δεδομένα των Yu κ.ά. (2008). Οι συγκεκριμένοι ερευνητές μελετώντας το μηχανισμό ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα sulfometuron (σουλφονυλουρία) και imazapyr (ιμιδαζολινόνη), σε μεγάλο πλήθος φυτών τεσσάρων πληθυσμών του ζιζανίου ήρα, διαπίστωσαν ότι η ανθεκτικότητα στο sulfometuron ήταν λόγω της αντικατάστασης του αμινοξέος Pro 197 από Gln, Arg, Ala, Ser και Leu. Βέβαια, όλες οι αντικαταστάσεις του αµινοξέος Pro 197 που παρατηρήθηκαν στην παρούσα εργασία έχουν αναφερθεί ως αιτία ανθεκτικότητας σε άλλα είδη ζιζανίων (Tranel κ.ά., 2011; Beckie κ.ά., 2007; Uchino κ.ά., 2007; Kolkman κ.ά., 2004; Yu κ.ά., 2003; Sibony κ.ά., 2001; Boutsalis κ.ά., 1999; Guttieri κ.ά., 1995). Συγκεκριμένα στην Ελλάδα, μεταλλάξεις υπεύθυνες για αντικατάσταση του αμινοξέος Pro 197 από