ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Lolium rigidum ΒΙΟΤΥΠΩΝ ΣΕ ΥΟ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ Στέλλα Ε. Παπαβασιλείου Γεωπόνος Επιβλέπων καθηγητής Η. Γ. Ελευθεροχωρινός ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 2 Στους γονείς µου Βαγγέλη και Χρυσάνθη

3 3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες Σελίδα 1 Εισαγωγή Ανάπτυξη ανθεκτικότητας Ρυθµός ανάπτυξης ανθεκτικών βιοτύπων 20 2 Πειραµατικές εργασίες ιαχείριση φυτικού υλικού ιερεύνηση ανθεκτικότητας στο chlorsulfuron Υλικά και µέθοδοι Πειράµατα σε φυτοδοχεία Πειράµατα σε τριβλία petri Αποτελέσµατα Συζήτηση ιερεύνηση πολλαπλής ανθεκτικότητας στο tralkoxydim Υλικά και µέθοδοι Πειράµατα σε φυτοδοχεία Πειράµατα σε τριβλία τύπου petri Αποτελέσµατα Συζήτηση ιερεύνηση µηχανισµού ανάπτυξης ανθεκτικότητας στο chlorsulfuron Υλικά και µέθοδοι Αποτελέσµατα Συζήτηση ιερεύνηση βιολογίας των βιοτύπων 51

4 Υλικά και µέθοδοι Αποτελέσµατα Συζήτηση 66 3 Συµπεράσµατα 70 4 Περίληψη 71 Βιβλιογραφία 75 Παράρτηµα 88

5 5 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θερµές ευχαριστίες εκφράζονται στον καθηγητή του Α.Π.Θ. κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό για την ανάθεση του θέµατος, την εποπτεία των πειραµάτων, τη βοήθειά του στην ερµηνεία και τεκµηρίωση των αποτελεσµάτων, καθώς επίσης και για την πολύτιµη συµβολή του κατά τη διάρκεια της συγγραφής της εργασίας ως προς το περιεχόµενο, τη δοµή και την τελική παρουσίασή της. Θερµές ευχαριστίες εκφράζονται επίσης στην αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Ουρ. Μενκίσογλου και στο λέκτορα κ. Χρήστο όρδα, µέλη της τριµελούς εξεταστικής επιτροπής, για την κριτική ανάγνωση του κειµένου και τις χρήσιµες υποδείξεις τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες εκφράζονται στον κ. Νικόλαο Καλούµενο, υποψήφιο διδάκτορα του Α.Π.Θ. και στη µεταπτυχιακή συµφοιτήτριά µου Ανθή Βασιλείου, για την πολύτιµη βοήθειά τους κατά τη διεξαγωγή των πειραµάτων. Οφείλω ακόµα να ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους και φίλους που µε βοήθησαν µε οποιοδήποτε τρόπο, καθώς επίσης και τους φοιτητές που εργάστηκαν µε συνέπεια για την εκτέλεση ορισµένων πειραµάτων, τα οποία χρησιµοποιήθηκαν για την εκπλήρωση των υποχρεώσεων της πτυχιακής τους διατριβής.

6 6 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ζιζάνια αποτελούν ένα από τα σηµαντικότερα προβλήµατα των καλλιεργούµενων φυτών. Η αντιµετώπιση των ζιζανίων µε χηµικά µέσα (ζιζανιοκτόνα) αποτελεί ένα από τα µεγαλύτερα επιτεύγµατα στη βελτίωση των καλλιεργητικών φροντίδων κατά τη διαδικασία παραγωγής γεωργικών προϊόντων. Είναι γεγονός ότι στα περισσότερα µέρη του κόσµου τα ζιζανιοκτόνα έχουν αντικαταστήσει ήδη την αφαίρεση των ζιζανίων µε το χέρι, την αρχαιότερη αλλά και την απλούστερη µέθοδο καταπολέµησης. Τα ζιζανιοκτόνα έφεραν την επανάσταση στις αναπτυγµένες χώρες, ενώ ραγδαία είναι και η υιοθέτησή τους και από τις αναπτυσσόµενες χώρες. Αποτελούν την πιο αξιόπιστη, οικονοµική και λιγότερο χρονοβόρα µέθοδο για τον έλεγχο των ζιζανίων. Η χρήση τους έχει απλοποιήσει τις στρατηγικές καταπολέµησης σε πολλά καλλιεργητικά συστήµατα και µαζί µε τις υπόλοιπες φυτοπροστατευτικές ουσίες δίνουν τη δυνατότητα στον παραγωγό να επενδύσει στις πιο επικερδής καλλιέργειες, τη µία χρονιά µετά την άλλη, µέσα στο ίδιο χωράφι. Μια ανόργανη ένωση, ο θειικός χαλκός, ήταν η πρώτη ουσία που χρησιµοποιήθηκε ως ζιζανιοκτόνο στη Γαλλία το 1986 µε σκοπό την αντιµετώπιση ζιζανίων στα χειµερινά σιτηρά. Οι οργανικές ενώσεις, ως ζιζανιοκτόνα, έκαναν την εµφάνισή τους για πρώτη φορά το 1932 και πάλι στη Γαλλία, όπου µια φαινολική ένωση µε χηµικό όνοµα 2-µέθυλο-4,5- δινιτροφαινόλη, γνωστή ως DNOC, χρησιµοποιήθηκε για εκλεκτική καταπολέµηση ζιζανίων στα χειµερινά σιτηρά. Η ανάπτυξη όµως και η χρησιµοποίηση οργανικών ουσιών ως ζιζανιοκτόνα σε µεγάλη κλίµακα άρχισε

7 7 µετά το τέλος του δεύτερου παγκόσµιου πολέµου, αλλά γνώρισε τη µεγαλύτερη πρόοδο τα τελευταία είκοσι χρόνια. Η ανακάλυψη των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης της οξικογαλακτικής συνθετάσης (ALS) των φυτών ήταν ένα σηµαντικό επίτευγµα στην ιστορία της επιστήµης της Ζιζανιολογίας. Τα ζιζανιοκτόνα αυτά ανήκουν στην οµάδα των σουλφονυλουριών (Chaleff κ.α. 1984), καθώς και στις οµάδες των ιµιδαζολινών (IMIs) (Shaner κ.α., 1984), τριαζολοπυριµιδινών (TPs) (Gerwick κ.α., 1990) και πυριµιδινυλθειοβενζοικών (PTBs) (Takahashi κ.α., 1991), οι οποίες αναπτύχθηκαν και κυκλοφόρησαν ακολούθως στο εµπόριο µετά τις σουλφονυλουρίες. Χρησιµοποιούνται σε πολύ χαµηλές δόσεις εφαρµογής (g/στρ) και θεωρούνται ότι συνέβαλαν στη µείωση της συνολικής ποσότητας των δραστικών ουσιών των ζιζανιοκτόνων που εφαρµόζονταν στις καλλιέργειες κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1980 (Bellinder κ.α., 1994). Επιπλέον, κέρδισαν τις προτιµήσεις των αγροτών εδώ και 20 χρόνια λόγω της αντιµετώπισης ευρέος φάσµατος ζιζανίων, της µεγάλης υπολειµµατικής διάρκειας, της εκλεκτικότητας και της χαµηλής τοξικότητας στα θηλαστικά. Το πρώτο ζιζανιοκτόνο-αναστολέας της δράσης της οξικογαλακτικής συνθετάσης που εγκρίθηκε και κυκλοφόρησε το 1982 στις Η.Π.Α και στη Μ.Βρετανία για αντιµετώπιση πλατύφυλλων ζιζανίων στα σιτηρά, ήταν το chlorsulfuron, µια δραστική ουσία που ανήκει στην οµάδα των σουλφονυλουριών (Saari κ.α., 1994). Ο βασικός χηµικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οµάδας των σουλφονυλουριών αποτελείται από µια αρυλο-οµάδα, τη σουλφονυλουρική γέφυρα και από µια ετεροκυκλική αρωµατική οµάδα (Σχήµα 1.1). Χρησιµοποιούνται προφυτρωτικά ή µεταφυτρωτικά για αντιµετώπιση ετήσιων

8 8 και πολυετών ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες ή σε µη γεωργικές εκτάσεις. Όλα τα ζιζανιοκτόνα της κατηγορίας αυτής είναι δραστικά σε δόσεις φορές µικρότερες (1-2 g/στρ) από ό,τι τα περισσότερα από τα ήδη χρησιµοποιούµενα. Στο εδαφικό διάλυµα συµπεριφέρονται ως ασθενή οξέα γι αυτό και ο βαθµός έκπλυσης όλων των ζιζανιοκτόνων της οµάδας αυτής είναι µεγάλος αφού η προσρόφησή τους από τα κολλοειδή του εδάφους είναι ασθενής (Ελευθεροχωρινός, 2002). Σχήµα 1.1. Χηµικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οµάδας των σουλφονυλουριών H οξικογαλακτική συνθετάση (ALS ή AHAS), είναι το ένζυµο που αποτελεί στόχο δράσης των σουλφονυλουριών και των ζιζανιοκτόνων που ανήκουν στις οµάδες των ιµιδαζολινών, τριαζολοπυριµιδινών και πυριµιδινυλθειοβενζοικών. Το ένζυµο αυτό καταλύει δύο παράλληλες αντιδράσεις κατά τη βιοσύνθεση των αµινοξέων βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη (Umbarger, 1978). Τέσσερα ένζυµα στην πορεία της σύνθεσης των τριών προαναφερθέντων αµινοξέων είναι κοινά, αλλά το ALS είναι το πρώτο από αυτά. Συγκεκριµένα, το ALS καταλύει τη συµπύκνωση δύο µορίων πυρουβικού οξέος σε 2-ακέτυλο-γαλακτικό οξύ, το οποίο αποτελεί την πρόδροµη ουσία για το σχηµατισµό των αµινοξέων λευκίνη και βαλίνη, και την έκλυση CO 2. Το ίδιο ένζυµο καταλύει και την αντίδραση µεταξύ πυρουβικού

9 9 οξέος και 2-κετοβουτυρικού οξέος για την παραγωγή CO 2 και 2-ακετυλουδροξυ-βουτυρικού οξέος, το οποίο αποτελεί την πρόδροµη ένωση της ισολευκίνης (Devine κ.α., 1993). Η αναστολή του ALS οδηγεί σε έλλειψη των τριών αµινοξέων εντός του φυτού, η οποία θεωρείται ως ο πρωταρχικός µηχανισµός µέσω του οποίου τα ζιζανιοκτόνα αυτά προκαλούν το θάνατο των φυτών. Βέβαια, εκτός από την αναστολή του ALS, η σταδιακή αύξηση του 2- κετοβουτυρικού οξέος, η αναστολή στη σύνθεση των πρωτεϊνών και η αναστολή στη φωτοσυνθετική αλυσίδα εµπλέκονται στο µηχανισµό που οδηγεί στο θάνατο των φυτών (Shaner, 1991). Τα συµπτώµατα της αναστολής του ενζύµου εµφανίζονται λίγες µέρες µετά τη µετακίνηση της δραστικής ουσίας στους µεριστωµατικούς ιστούς, ενώ ο θάνατος των φυτών επέρχεται µετά από 1-4 εβδοµάδες (Ελευθεροχωρινός, 2002). Τα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της καρβοξυλάσης του ακέτυλοσυνένζυµου Α (ACCase) αποτελούν και αυτά µια άλλη σηµαντική οµάδα (από εµπορικής πλευράς), αφού είναι πολύ αποτελεσµατικά και εκλεκτικά µεταφυτρωτικά αγρωστοδοκτόνα. Είναι γνωστά και ως οµάδα ζιζανιοκτόνων Α, σύµφωνα µε την διεθνή κατάταξη του HRAC (Heap, 2007). Αυτά, από την εισαγωγή τους στα τέλη της δεκαετίας 1970 έως σήµερα, έχουν χρησιµοποιηθεί παγκοσµίως για τον έλεγχο πολλών αγρωστωδών ζιζανίων σε µεγάλες εκτάσεις (Devine και Shimabukuro, 1994). Τα αρυλοξυφαινοξυαλκανοικά οξέα και οι οξύµες (ή παράγωγα της κυκλοεξανδιόνης) είναι δύο οµάδες ζιζανιοκτόνων, των οποίων η δραστική ουσία έχει ως στόχο δράσης το ένζυµο καρβοξυλάση του ακέτυλο-συνένζυµου Α (ACCase). Τα ζιζανιοκτόνα αυτά χρησιµοποιούνται µεταφυτρωτικά για καταπολέµηση ετησίων και πολυετών αγρωστωδών ζιζανίων. Ορισµένα από

10 10 αυτά χρησιµοποιούνται σε πλατύφυλλες καλλιέργειες ενώ άλλα σε καλλιέργειες χειµερινών σιτηρών. Τα αρυλοξυφαινοξυαλκανοικά οξέα συµπεριφέρονται ως ασθενή οξέα, προσροφούνται σε ικανοποιητικό βαθµό από τα κολλοειδή του εδάφους γι αυτό και η έκπλυσή τους είναι περιορισµένη σε αντίθεση µε τις κυκλοεξανδιόνες που ανήκουν στις µη ιονιζόµενες χηµικές ενώσεις και δεν προσροφούνται ισχυρά από τα κολλοειδή του εδάφους (Ελευθεροχωρινός, 2002). Το ένζυµο καρβοξυλάση του ακέτυλο-συνένζυµου Α (ACCase) είναι απαραίτητο κατά τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Συγκεκριµένα, καταλύει τη συµπύκνωση του ακετυλο-coa µε το CO 2 µε αποτέλεσµα να παράγεται το µαλόνυλο-coa, το οποίο θεωρείται η πρόδροµη ουσία για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων µε άτοµα C. Το ACCase είναι ένα σύνθετο ένζυµο µε τρεις ενεργές περιοχές, δηλαδή την περιοχή του καρβοξυ-µεταφορέα της βιοτίνης, την ATP-εξαρτώµενη καρβοξυλάση της βιοτίνης και την καρβοξυτρανσφεράση (Nikolau κ.α., 2003). Το ένζυµο αυτό αρχικώς καρβοξυλιώνεται παρουσία του CO 2 και ATP. Έπειτα, το καρβοξυλιωµένο ένζυµο µεταφέρει την καρβοξυλική οµάδα στο ακέτυλο-coa για να σχηµατιστεί το µαλόνυλο-coa. Μεγάλες ποσότητες από µαλόνυλο-coa είναι απαραίτητες στα πλαστίδια των φυτών για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων αλλά και στο κυτόπλασµα για την πραγµατοποίηση πολλών άλλων αντιδράσεων, όπως την επιµήκυνση των µεγάλης αλυσίδας λιπαρών οξέων και τη βιοσύνθεση δευτερογενών µεταβολιτών (π.χ. φλαβονοειδή, ανθοκυάνες) (Harwood, 1988). Το γεγονός ότι η µεµβράνη των πλαστιδίων δεν είναι διαπερατή για το µαλόνυλο-coa, οδηγεί στην επιβεβαιωθείσα υπόθεση ότι υπάρχουν τουλάχιστον δύο ισοµορφές του ενζύµου ACCase, η

11 11 µία στα πλαστίδια και η άλλη το κυτόπλασµα. Η αναστολή λοιπόν της δράσης του ενζύµου ACCase και η ως εκ τούτου αναστολή της βιοσύνθεσης των λιπαρών οξέων µε άτοµα C οδηγεί σε αλλαγή της κυτταρικής µεµβράνης, απώλεια µεταβολιτών και ταχύ θάνατο του φυτού. Η δράση των ζιζανιοκτόνων που ανήκουν στις οµάδες αυτές εκδηλώνεται λίγες µέρες µετά την εφαρµογή τους ενώ ο θάνατος των φυτών επέρχεται µετά από δύο ή τρεις εβδοµάδες. 1.1 Ανάπτυξη ανθεκτικότητας H επιβίωση των ζιζανίων εντός µιας καλλιέργειας µετά από εφαρµογή ζιζανιοκτόνων οδηγεί συχνά σε σηµαντικές οικονοµικές απώλειες. Τα τελευταία χρόνια η καταγραφή µη αποτελεσµατικής αντιµετώπισης των ζιζανίων σε παγκόσµιο επίπεδο συνεχώς αυξάνει. Πιθανοί λόγοι για τη µη αποτελεσµατικότητα ορισµένων ζιζανιοκτόνων είναι η εσφαλµένη επιλογή του ζιζανιοκτόνου ή των βοηθητικών ουσιών, η δόση και ο χρόνος εφαρµογής, οι αντίξοες καιρικές συνθήκες καθώς επίσης και η παρουσία ανθεκτικών βιοτύπων. Ο όρος ανθεκτικότητα (resistance) αναφέρεται στην κληρονοµική ιδιότητα µερικών βιοτύπων ενός ζιζανίου να επιβιώνουν µετά την εφαρµογή, ακόµα και µεγαλύτερης από τη συνιστώµενη δόσης, κάποιου ζιζανιοκτόνου, στο οποίο ο αρχικός πληθυσµός του ήταν ευαίσθητος (LeBaron, 1982). Η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας σχετίζεται αναπόφευκτα µε την εισαγωγή διαφόρων οµάδων γεωργικών φαρµάκων και µε την πιο σηµαντική περίπτωση αυτή των εντοµοκτόνων. Είναι γεγονός ότι µέχρι σήµερα υπάρχουν ήδη περισσότερα από 400 γνωστά είδη εντόµων, τα οποία έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα σε ένα ή περισσότερα εντοµοκτόνα (Ware, 1994).

12 12 Παρόµοια κατάσταση επικρατεί και µε τα παθογόνα µικρόβια του ανθρώπου ή των ζώων που ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά. Παρά το γεγονός ότι κάτι τέτοιο είχε προβλεφθεί και για τα ζιζανιοκτόνα, η ανθεκτικότητα εδώ αναπτύχθηκε µετά από µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα από ό,τι στα άλλα γεωργικά φάρµακα. Για παράδειγµα, ενώ τα ζιζανιοκτόνα της οµάδας των χλωροτριαζινών άρχισαν να χρησιµοποιούνται στο τέλος της δεκαετίας του 1950, η πρώτη περίπτωση ανθεκτικότητας αναφέρθηκε γύρω στο Ειδικότερα, ένας βιότυπος Senecio vulgaris, ανθεκτικός σε χλωροτριαζίνες (atrazine, simazine) αποµονώθηκε από έναν αγρό στην Ουάσινγκτον, όπου το ζιζανιοκτόνο simazine χρησιµοποιήθηκε συνεχώς για πολλά χρόνια (Ryan, 1970). Από τότε, ο αριθµός των ανθεκτικών ζιζανίων έχει δραµατικά αυξηθεί. Παγκοσµίως υπάρχουν 183 ανθεκτικά είδη ζιζανίων (Heap, 2007), ενώ στην Ελλάδα ανθεκτικότητα διαπιστώθηκε στα ζιζάνια, Amaranthus retroflexus και Chenopodium album σε ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του φωτοσυστήµατος II (Eleftherohorinos κ.ά., 2000), Echinochloa crus-galli στα αµίδια φυλλώµατος (Giannopolitis και Vassiliou, 1989; Vasilakoglou κ.ά., 2000), Papaver rhoeas σε ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της ALS (Kotoula-Syka, 1998) και Lolium rigidum σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της ACCase (Kotoula-Syka κ.ά., 2000). Τα διεθνή δεδοµένα δείχνουν ότι υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις µηχανισµοί µέσω των οποίων τα φυτά γίνονται ανθεκτικά σε ένα ζιζανιοκτόνο. Οι δύο πιο κοινοί µηχανισµοί των φυτών είναι η ικανότητα να µεταβολίζουν το ζιζανιοκτόνο και η ανθεκτικότητα της πρωτεϊνης ή του ενζύµου στόχου του ζιζανιοκτόνου (Gressel 2002, Hatzios 2001). Οι δύο µηχανισµοί προϋπάρχουν στους αρχικούς πληθυσµούς των ζιζανίων και επιλέγονται από τα ζιζανιοκτόνα. Η ικανότητα µεταβολισµού των ζιζανιοκτόνων από τα ζιζάνια

13 13 είναι λιγότερο συχνός µηχανισµός ανθεκτικότητας από ό,τι η ανθεκτικότητα λόγω τροποποίησης της πρωτεϊνης ή του ενζύµου στόχου των ζιζανιοκτόνων. Η ανθεκτικότητα της δεύτερης περίπτωσης είναι αποτέλεσµα της αδυναµίας σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων µε την πρωτεϊνη ή ένζυµο στόχο και ως εκ τούτου αδυναµία αναστολής των φυσιολογικών ή των µεταβολικών διεργασιών εντός των ζιζανίων. Οι άλλοι δύο µηχανισµοί ανθεκτικότητας περιλαµβάνουν µείωση στο ρυθµό απορρόφησης ή µετακίνησης του ζιζανιοκτόνου εντός των ζιζανίων ή αλλαγή στον τρόπο κατανοµής του ζιζανιοκτόνου εντός των ζιζανίων. Η έναρξη εµφάνισης της ανθεκτικότητας σε ένα πληθυσµό ζιζανίων εξαρτάται από τη συχνότητα των γονιδίων ανθεκτικότητας, την προσαρµοστικότητα και την ανταγωνιστική ικανότητα των ανθεκτικών ατόµων, την αρχική πυκνότητα των ζιζανίων και από την ένταση και τη διάρκεια της πίεσης επιλογής που ασκείται από τα ζιζανιοκτόνα (Maxwell και Mortimer, 1994). Ειδικότερα, σηµαντική επίδραση στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας έχει η συχνότητα µε την οποία εµφανίζονται οι ανθεκτικοί βιότυποι στον αρχικό πληθυσµό, η επαναλαµβανόµενη χρήση του ίδιου ζιζανιοκτόνου σε ευρεία περιοχή, η µη χρήση ζιζανιοκτόνων µε διαφορετικό µηχανισµό-τρόπο δράσης και η χρήση πολύ δραστικών ζιζανιοκτόνων (υψηλή ένταση επιλογής) και ζιζανιοκτόνων µε µεγάλη υπολειµµατική διάρκεια (µε διάρκεια επιλογής). Τα διεθνή δεδοµένα δείχνουν ότι τα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ALS ξεπέρασαν όλες τις άλλες κατηγορίες ζιζανιοκτόνων στον αριθµό των ζιζανίων µε ανθεκτικούς βιότυπους. Αυτό συνέβη επειδή η χρήση τους µόνο για πέντε χρόνια ήταν αρκετή για επιλογή βιοτύπων µε ανθεκτικό ALS ένζυµο. Ειδικότερα, το 1987 στις ΗΠΑ και µετά από πέντε χρόνια συνεχούς

14 14 χρήσης του chlorsulfuron (πρώτη σουλφονυλουρία) παρατηρήθηκαν ανθεκτικοί βιότυποι των ζιζανίων Lactuca serriola (Mallory-Smith κ.α., 1990) και Kochia scoparia (Priminiani κ.α., 1990). Η ανθεκτικότητα σε κάποια είδη δεν περιορίζεται µόνο σε µερικούς βιότυπους αλλά είναι τόσο εξαπλωµένη και κοινή ώστε να αποτελεί πραγµατική απειλή στη συνεχιζόµενη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων του ενζύµου ALS. Για παράδειγµα, σε ορισµένες πολιτείες των ΗΠΑ και ειδικότερα στα είδη Amaranthus rudis και Amaranthus tuberculatus, η ανθεκτικότητα είναι τόσο εξαπλωµένη που τα ζιζανιοκτόνα αυτά δεν συνιστώνται πλέον για αντιµετώπιση αυτών των ζιζανίων (Hager κ.α., 1997). Οµοίως η παρουσία ανθεκτικών βιοτύπων Kochia spp. στο σιτάρι (Triticum aestivum) που καλλιεργείται στις ΗΠΑ και στον Καναδά έχει περιορίσει σηµαντικά τη χρήση του chlorsulfuron (Guttieri κ.α., 1995). Η ανθεκτικότητα των περισσότερων βιοτύπων είναι αποτέλεσµα της µειωµένης ευαισθησίας του ενζύµου-στόχου ALS, ενώ ο αυξηµένος µεταβολισµός του ζιζανιοκτόνου εντός των ζιζανίων έχει µικρότερη συχνότητα εµφάνισης. Ο µηχανισµός αυτός (µεταβολισµός του ζιζανιοκτόνου) έχει οδηγήσει σε µικρού µεγέθους ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα µε διαφορετικό τρόπο δράσης (Hall κ.α., 1994). Τα δύο πιο σηµαντικά ζιζάνια που έχουν αναπτύξει πολλούς µηχανισµούς ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα (λόγω ικανότητας µεταβολισµού) µε διαφορετικούς µηχανισµούς-τρόπους δράσης είναι το Lolium rigidum (Christopher κ.α., 1991, Cotterman και Saari 1992, Holtum κ.α., 1991) και το Alopecurus myosuroides (Kemp κ.α., 1990, Moss και Cussans 1991). Το σηµαντικό είναι ότι οι βιότυποι αυτοί είναι ανθεκτικοί και στις σουλφονυλουρίες παρά το γεγονός της µη χρήσης τους. Στο είδος

15 15 Lolium rigidum ο αυξηµένος µεταβολισµός επιλέχθηκε από ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ACCase (Christopher κ.α., 1991) και στο Alopecurus myosuroides από ζιζανιοκτόνα αναστολείς του φωτοσυστήµατος IΙ (Κemp κ.α., 1990). Το ένζυµο ALS, αν και δρα στα πλαστίδια, είναι ένα γονίδιο του πυρήνα και ακολουθεί τη µενδελική κληρονοµικότητα. Τα ανθεκτικά (R) ALS αλληλόµορφα κληρονοµούνται (µεταφέρονται) µέσω της γύρης και του ως εκ τούτο παραγόµενου σπόρου. Αυτό έρχεται σε αντίθεση µε τις χλωροτριαζίνες, όπου η ανθεκτικότητα κληρονοµείται µόνο από τον σπόρο αφού το γονίδιο που κωδικοποιεί τη θέση στόχο είναι πλαστιδικό (Souza-Machado κ.α., 1978). Αυτό σηµαίνει ότι τα ανθεκτικά ALS (R) αλληλόµορφα είναι κυρίαρχα στα ευαίσθητα (S) αλληλόµορφα. Ο βαθµός κυριαρχίας των R γονιδίων, αν και ποικίλει µεταξύ των φυτών ή των αλληλοµόρφων, επιλέγεται ακόµη και στην ετερόζυγη µορφή (Foes κ.α., 1999, Hart κ.α., 1993, Sebastian κ.α., 1989). Εποµένως, το γεγονός ότι η ανθεκτικότητα λόγω ανθεκτικού ενζύµου οφείλεται σε ένα κυρίαρχο γονίδιο που κωδικοποιείται στον πυρήνα, αυτό συµβάλλει στη µεγάλη συχνότητα εµφάνισης της ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ενζύµου ALS. Η πίεση επιλογής οδηγεί στην εξέλιξη της ανθεκτικότητας, αλλά η γενετική παραλλακτικότητα είναι αυτή που θεωρείται απαραίτητη για να γίνει επιλογή. Εποµένως, η παραλλακτικότητα του ενζύµου ALS µεταξύ των ζιζανίων ατόµων καθορίζει και την πιθανότητα επιλογής των ανθεκτικών βιοτύπων από τα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ALS. Η παραλλακτικότητα µεταξύ των αλληλοµόρφων προκαλείται από τυχαίες µεταλλάξεις. Ο υψηλός ρυθµός µεταλλάξεων στο γονίδιο έκφρασης του ALS

16 16 σε σχέση µε άλλα γονίδια στόχους θα µπορούσε να συµβάλει ή να θεωρηθεί υπαίτιος για τη µεγάλη συχνότητα ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ALS. Μέχρι στιγµής έχουν αναγνωριστεί πολλές αντικαταστάσεις αµινοξέων που είναι ικανές να καταστήσουν το ένζυµο ALS από ευαίσθητο σε ανθεκτικό. Η ανθεκτικότητα στις περισσότερες περιπτώσεις οφείλεται σε αντικατάσταση ενός ή δύο εκ των τριών S αµινοξέων που βρίσκονται κοντά στην αµινική άκρη (ala 122, pro 197, ala 205) και άλλων δύο (trp 574, ser 653) που βρίσκονται κοντά στην καρβοξυλική άκρη. Οι περισσότερες µεταλλάξεις στο ένζυµο ALS απεικονίζονται σε βιοτύπους της Κochia, οι οποίοι είναι ανθεκτικοί στο chlorsulfuron λόγω αντικατάστασης της pro 197 (Guttieri κ.α., 1995) ή της trp 574 από λευκίνη (Foes κ.α., 1999). Μέχρι σήµερα, έχουν παρατηρηθεί 27 µεταλλάξεις του ενζύµου στο αµινοξύ προλίνη (Pro 197 ) σε 15 είδη ζιζανίων που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (Heap, 2007). Τα διεθνή ερευνητικά δεδοµένα από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 δείχνουν ότι η αλλαγή στην ευαισθησία του ενζύµου ACCase αποτελεί µηχανισµό ανθεκτικότητας και για τα ζιζανιοκτόνα της οµάδας των αρυλοξυφαινοξυαλκανοικών οξέων και των παραγώγων της κυκλοεξανδιόνης. Ειδικότερα, το ζιζάνιο Alopecurus myosuroides είναι αυτό που έχει µελετηθεί περισσότερο σε βιοχηµικό και µοριακό επίπεδο και για το οποίο έχει βρεθεί ο µεγαλύτερος αριθµός µεταλλάξεων στο ένζυµο ACCase (Delye κ.α. 2002a, 2002b; Moss κ.α., 2003). Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων που σχετίζεται µε το ένζυµο αυτό βρέθηκε ότι οφείλεται ή στην αδυναµία σύνδεσής του (ανθεκτικό ένζυµο) µε τα προαναφερθέντα ζιζανιοκτόνα ή σε αυξηµένη δράση της ευαίσθητης µορφής του ACCase ενζύµου.

17 17 Το ένζυµο αυτό (ACCase) έχει την προκαρυωτική µορφή του (πολλαπλή υποµονάδα που κωδικοποιείται από 3 γονίδια) στα πλαστίδια των δικότυλων φυτών (πλατύφυλλα), η οποία είναι ανθεκτική στη δράση των προαναφερθέντων ζιζανιοκτόνων. Αντίθετα, στα πλαστίδια των µονοκότυλων φυτών (αγρωστώδη), υπάρχει η ευκαρυωτική µορφή της ACCase (µία πρωτεΐνη µε 3 λειτουργικά µέρη), η οποία είναι ευαίσθητη στη δράση αυτών των ζιζανιοκτόνων. Αξίζει να αναφερθεί ότι τα µονοκότυλα δεν φέρουν την προκαρυωτική µορφή του ενζύµου λόγω απουσίας του accd γονιδίου στο γένωµα του χλωροπλάστη. Το γονίδιο που κωδικοποιεί το πλαστιδιακό ACCase ένζυµο είναι γονίδιο του πυρήνα, πράγµα που σηµαίνει ότι µπορεί να διαδοθεί µέσω του σπόρου αλλά και µέσω της γύρης. Η ανθεκτικότητα λόγω ανθεκτικού ACCase βρέθηκε ότι είναι κυρίαρχο γνώρισµα στα ζιζάνια Avena sp. (Kibite κ.α., 1995), Alopecurus myosuroides (Letouze και Gasqyez, 2001) και Setaria italica (Wang και Darmency, 1998). Άλλες έρευνες έδειξαν ότι η ανθεκτικότητα του ACCase οφείλεται σε µερικώς κυρίαρχο γονίδιο για τα ζιζάνια Lolium rigidum (Tal κ.α. 2004, Tardif κ.α., 1996), Avena fatua (Murray κ.α., 1995), Lolium multiflorum (Betts κ.α., 1992) και Setaria faberi (Volenberg κ.α, 2002b). Αυτό όµως που έχει σηµασία είναι ότι όλα τα φυτά, οµόζυγα και ετερόζυγα για την ACCase ανθεκτικότητα, επιβιώνουν µετά από εφαρµογή των συνιστώµενων δόσεων των ζιζανιοκτόνων. Ο µεταβολισµός των ζιζανιοκτόνων µπορεί να περιγραφεί ως διαδικασία τριών φάσεων (Kreuz κ.α.,1996, Van Eerd κ.α., 2003). Η πρώτη φάση περιλαµβάνει αποδόµηση-µετατροπή του ζιζανιοκτόνου συνήθως σε λιγότερο τοξικό µόριο µέσω ενζυµικής οξείδωσης, υδρόλυσης ή αναγωγής. Η

18 18 δεύτερη φάση περιλαµβάνει σχηµατισµό συµπλόκου του ζιζανιοκτόνου ή των µεταβολιτών του µε το τριπεπτίδιο γλουταθειόνη (περαιτέρω µείωση της τοξικότητας των αρχικών µορίων), ενώ η τρίτη φάση περιλαµβάνει την εναπόθεση των συµπλόκων στα χυµοτόπια ή στα κυτταρικά τοιχώµατα. Μεταξύ των οξειδωτικών ενζύµων που διευκολύνουν το µεταβολισµό των ζιζανιοκτόνων αναστολέων του ενζύµου ALS είναι και τα ισοένζυµα των µονοοξυγενασών του κυτοχρώµατος Ρ 450. Ο αριθµός των προς µελέτη κλωνοποιηµένων γονιδίων που κωδικοποιούν τα ένζυµα αυτά έχει αυξηθεί πολύ τα τελευταία χρόνια (Gressel 2002). Τα ένζυµα αυτά αποτελούν το επίκεντρο σήµερα πολλών ερευνών επειδή εµπλέκονται σε πολλές περιπτώσεις ανθεκτικότητας. Συγκεκριµένα, οι Kreuz κ.α (1992) διαπίστωσαν ότι η εφαρµογή του οργανοφωσφορικού εντοµοκτόνου malathion ανέστειλε τη δράση των µονοοξυγενασών του κυτοχρώµατος P 450 στο καλαµπόκι (Zea mays) µε αποτέλεσµα την εκδήλωση τοξικότητας στο ζιζανιοκτόνο primisulfuron. Οµοίως, οι Christopher κ.α. (1994) και οι Preston κ.α.(1996) αναφέρουν ότι η εφαρµογή του εντοµοκτόνου malathion σε ένα ανθεκτικό βιότυπο Lolium rigidum, λόγω µεταβολισµού στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron, ανέστειλε την καταλυτική δράση των µονοοξυγενασών του κυτοχρώµατος P 450 µε αποτέλεσµα την νέκρωση του ανθεκτικού βιοτύπου. Τέλος, ο Baerg κ.α. (1996) µελετώντας την επίδραση εντοµοκτόνων στην ενεργότητα των µονοοξυγονασών P 450 στο καλαµπόκι βρήκε ότι το οργανοφωσφορικό εντοµοκτόνο terbufos αναστέλλει τη δράση αυτών των µονοξυγενασών που µεταβολίζουν τις σουλφονυλουρίες. Η ανθεκτικότητα των φυτών συχνά οφείλεται και στην αυξηµένη δράση των ενζύµων µεταβολισµού (ταχύς ρυθµός µεταβολισµού) των ζιζανιοκτόνων.

19 19 Συγκεκριµένα, ένας ανθεκτικός βιότυπος Lolium rigidum βρέθηκε ότι µεταβολίζει το ζιζανιόκτονο chlorsulfuron µε διπλάσιο ρυθµό από ό,τι ένας άλλος ευαίσθητος βιότυπος (Christopher κ.α., 1991). Ειδικότερα, ενώ έξι ώρες ήταν αρκετές για τον ανθεκτικό βιότυπο να µεταβολίσει το 50% του chlorsulfuron, ο ευαίσθητος χρειάστηκε δώδεκα ώρες. Με τον ίδιο ακριβώς µηχανισµό και το σιτάρι είναι ανεκτικό στο chlorsulfuron, αφού για να µεταβολίσει το 50% του chlorsulfuron αρκούν δύο µόνον ώρες. Ο Christopher και οι συνεργάτες του (1991) µάλιστα διαπίστωσαν ότι η ανθεκτικότητα του ζιζανίου Lolium rigidum στο chlorsulfuron οφείλεται σε µεταβολισµό παρόµοιο µε εκείνο του σιταριού. Ο µεταβολισµός των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της ACCase στα ανθεκτικά φυτά συµπεριλαµβάνει αρχικά οξείδωση και ακολούθως σχηµατισµό συµπλόκων. Βέβαια, σε ορισµένες περιπτώσεις η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε κυκλοεξανδιόνες οφείλεται και σε αυξηµένη δράση των ενζύµων µεταβολισµού τους. Η δράση των αρυλοξυφαινοξυαλκανοικών ζιζανιοκτόνων κατά των αγρωστωδών ζιζανίων βασίζεται στην ταχύτερη υδρόλυση του εστέρα σε οξύ (ενεργός µορφή) (Cummins και Edwards 2004; Hill κ.α., 1978; Jeffcoat και Harries, 1973) αλλά µη ακολουθούµενη από περαιτέρω µεταβολισµό, ενώ η εκλεκτικότητά τους στα σιτηρά οφείλεται στον ταχύτερο µεταβολισµό της ενεργού µορφής του ζιζανιοκτόνου (Shimabukuro κ.α.,1979). Βέβαια, η έρευνα στον τοµέα αυτό αναφέρει ότι ο µεταβολισµός του tralkoxydim σε ανθεκτικούς βιοτύπους ζιζανίων περιλαµβάνει µη προσδιορισµένους µεταβολίτες. Στο σιτάρι όµως και στο καλαµπόκι έχει βρεθεί ότι υδροξυµεθυλοφαινυλιωµένα µόρια του ζιζανιοκτόνου tralkoxydim είναι τα

20 20 αρχικά προϊόντα του µεταβολισµού και µοιάζουν µε τα προϊόντα µεταβολισµού που προέρχονται µετά από δράση των ισοενζύµων των µονοξυγενασών του κυτοχρώµατος Ρ 450. Αυτοί οι µεταβολίτες δεν είναι φυτοτοξικοί, αλλά αυτό χρήζει περαιτέρω διερεύνησης (Ηadfield κ.α.,1994). Τα ένζυµα CytP 450 έδειξαν ότι εµπλέκονται στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων λόγω µεταβολισµού και άλλων ζιζανιοκτόνων αναστολέων της ACCase. Βέβαια, µεταξύ των ενζύµων που λαµβάνουν µέρος στη δεύτερη φάση µεταβολισµού των αναστολέων της ACCase είναι οι γλυκοζυλτρανσφεράσες (GST), οι οποίες καταλύουν την Ο-γλυκοζυλίωση των CytP 450 υδροξυλιωµένων µορίων. 1.2 Ρυθµός ανάπτυξης ανθεκτικών βιοτύπων Πολλοί ερευνητές θεωρούν την ικανότητα επιβίωσης και αναπαραγωγής των φυτών (fitness) ως τα σηµαντικότερα στοιχεία για την εξέλιξη της ανθεκτικότητας (Gressel και Segel 1978, 1982, Maxwell κ.α., 1990). Βέβαια, για να οριστεί το δυναµικό ενός πληθυσµού ζιζανίων για πιθανή ανάπτυξη ανθεκτικότητας είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν τα στοιχεία αυτά τόσο στους ευαίσθητους βιότυπους όσο και στους ανθεκτικούς, απουσία πίεσης επιλογής από το ζιζανιοκτόνο (Maxwell κ.α., 1990). Η επιτυχία επιβίωσης καθορίζεται από τον αριθµό των σπόρων και των φυτών που επιζούν, ενώ η ικανότητα παραγωγής µεγάλου αριθµού σπόρων και ο βαθµός ανταγωνιστικότητας καθορίζουν την επιτυχία αναπαραγωγής των φυτών. Οι µελέτες για την εξέλιξη της ανθεκτικότητας υπό συνθήκες έλλειψης πίεσης επιλογής από κάποιο ζιζανιοκτόνο άρχισαν από τη στιγµή που

21 21 αναγνωρίστηκαν βιότυποι φυτών µε ανθεκτική D1 πρωτείνη στις χλωροτριαζίνες (Holt και Τhill 1994, Jasieniuk κ.α., 1996). Αυτό έγινε επειδή τέτοιου είδους πληροφορίες παρέχουν τη δυνατότητα σχεδιασµού νέων στρατηγικών για την αντιµετώπιση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων. Είναι γεγονός, ότι απουσία πίεσης επιλογής, η µειωµένη ικανότητα επιβίωσης, αναπαραγωγής και ανταγωνισµού των ανθεκτικών φυτών µειώνει την πιθανότητα ή και το ρυθµό ανάπτυξης ενός πληθυσµού µε µεγάλο βαθµό ανθεκτικότητας. Έχει βρεθεί ότι, εάν τα ανθεκτικά φυτά ενός πληθυσµού είναι κατά 99% εξίσου ικανά και ανταγωνιστικά µε τα ευαίσθητα φυτά, η συχνότητα των ανθεκτικών φυτών µετά από τυχαία διασταύρωση εντός του πληθυσµού και κατά συνέπεια η συχνότητα δηµιουργίας ανθεκτικών βιοτύπων είναι 100 φορές ή και ακόµα µεγαλύτερη από τη συχνότητα των ανθεκτικών φυτών που θα προέκυπταν εάν τα αρχικά ανθεκτικά φυτά του πληθυσµού, πριν τη διασταύρωση, ήταν κατά 75% ικανά σε επιβίωση, αναπαραγωγή και ανταγωνιστικότητα µε τα ευαίσθητα (Jasieniuk κ.α., 1996). Γενικά, οι ανθεκτικοί βιότυποι πολλών ζιζανίων και οι καλλιέργειες µε αντοχή στις χλωροτριαζίνες έδειξαν να έχουν βραδεία ανάπτυξη των σποροφύτων, µικρότερο ύψος και µικρότερη φωτοσυνθετική ικανότητα (Holt κ.α., 1993, Marriage και Warwick, 1980, Moss και Rubin, 1993, Parks κ.α., 1996). Αντίθετα, δε βρέθηκαν σηµαντικές διαφορές ως προς την επιβίωση µεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της οξικογαλακτικής συνθετάσης (Saari κ.α., 1994). Οι Holt και Τhill (1994) κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η ανθεκτικότητα που οφείλεται σε τροποποιήσεις του γονιδίου ALS έχει ποικίλες επιδράσεις στην αύξηση και ανάπτυξη των φυτών, αλλά δεν επηρεάζει την ικανότητα

22 22 επιβίωσης, αναπαραγωγής και ανταγωνιστικότητας των φυτών. Για παράδειγµα, συγκρίσεις µεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων βιοτύπων Kochia δεν έδειξαν διαφορές στην παραγωγή βιοµάζας, στην ανταγωνιστικότητα και στην παραγωγή σπόρου (Christoffoleti κ.α., 1997, Τhompson κ.α., 1994b). Αντίθετα, ο Αlcocer-Ruthling κ.α. (1992) αναφέρει ότι ένας Lactuca serriola βιότυπος, ευαίσθητος σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της οξικογαλακτικής συνθετάσης, παρήγαγε 31% περισσότερο βιοµάζα από τον ανθεκτικό βιότυπο, παρά το γεγονός ότι και οι δύο βιότυποι ήταν εξίσου ανταγωνιστικοί. Τα αντίστοιχα ερευνητικά δεδοµένα από ανθεκτικά και ευαίσθητα φυτά σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ακετυλο-συνένζυµου Α είναι πολύ λιγότερα. Πρόσφατες εργασίες έδειξαν ότι οι ανθεκτικοί βιότυποι των ζιζανίων δεν µειονεκτούν σε σχέση µε τους ευαίσθητους, όταν αναπτύσσονται απουσία πίεσης επιλογής από κάποιο ζιζανιοκτόνο. Ειδικότερα, οι συγκρίσεις που έγιναν µεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων βιοτύπων Setaria faberi και Digitaria sanguinalis δεν έδειξαν διαφορές στην αύξηση και στην παραγωγή σπόρων (Wiederholt και Stoltenberg 1996b, 1996a). Μια άλλη µελέτη όπου συγκρίθηκε η φυτρωτική ικανότητα σπόρων Lolium rigidum από ευαίσθητα φυτά και ανθεκτικά έδειξε ότι οι σπόροι των ανθεκτικών φυτών απαιτούσαν φως και υψηλότερες θερµοκρασίες για να φυτρώσουν (Vila-Αiub κ.α., 2005). Η ήρα (Lolium rigidum) είναι ένα από τα πιο κοινά ετήσια χειµερινά αγρωστώδη ζιζάνια που απαντάται σε καλλιεργούµενες και ακαλλιέργητες εκτάσεις όλης της χώρας. Είναι φυτό σταυρογονιµοποιούµενο και σύµφωνα µε τα προαναφερθέντα έχει µεγάλη πιθανότητα αναπτυξης ανθεκτικών βιοτύπων σε συνθήκες υψηλής έντασης και µεγάλης διάρκειας πίεσης επιλογής. Αυτό άλλωστε επιβεβαιώνουν τα διεθνή δεδοµένα που δείχνουν ότι

23 23 ανθεκτικοί Lolium rigidum βιότυποι στις σουλφονυλουρίες (ζιζανιοκτόνα µε υψηλή ένταση και µεγάλη διάρκεια πίεσης επιλογής) έχουν παρατηρηθεί στην Αυστραλία, ενώ ανθεκτικοί βιότυποι στις κυκλοεξανδιόνες στην Αυστραλία, στη Σαουδική Αραβία, στη Βόρεια Αφρική και στη Χιλή (Heap 2007). Σκοπός της εργασίας Η ιδέα για τη διεξαγωγή αυτής της εργασίας ξεκίνησε την άνοιξη του 2003, όταν παραγωγοί της Βορείου Ελλάδος παραπονέθηκαν για µειωµένη αντιµετώπιση της ήρας (Lolium rigidum) σε καλλιέργειες χειµερινών σιτηρών µετά από εφαρµογή των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron (σουλφονυλουρία) ή/και tralkoxydim (κυκλοεξανδιόνη). Αξίζει να αναφερθεί ότι τo chlorsulfuron είχε χρησιµοποιηθεί χωρίς προβλήµατα για συνεχή έτη. Η µη ύπαρξη δεδοµένων για πιθανή ανθεκτικότητα αυτού του ζιζανίου στις περιοχές αυτές, δεν επέτρεπε εύκολα την διεξαγωγή συµπερασµάτων για το πρόβληµα που διαπιστώθηκε. Η ανάγκη λοιπόν, για άµεση λύση του προβλήµατος και αναζήτηση ζιζανιοκτόνων για την αποτελεσµατική αντιµετώπιση του ζιζανίου οδήγησαν στην πραγµατοποίηση αυτής της εργασίας, στην οποία και 1) µελετήθηκε εάν η µη επιτυχής αντιµετώπιση της ήρας οφείλεται σε ανάπτυξη ανθεκτικών βιοτύπων, 2) προσδιορίστηκε η ένταση της ανθεκτικότητας (σχέση ευαισθησίας ανθεκτικού/ευαίσθητου βιοτύπου στα ζιζανιοκτόνα) 3) διερευνήθηκε ο µηχανισµός ανθεκτικότητας των βιοτύπων στις σουλφονυλουρίες (µειωµένη ευαισθησία του ενζύµου-θέση δράσης ή/και µεταβολισµός του ζιζανιοκτόνου) και η πιθανότητα ανάπτυξης πολλαπλής ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim (κυκλοεξανδιόνη) και, 4) µελετήθηκαν ορισµένα βιολογικά και µορφολογικά χαρακτηριστικά των

24 24 ανθεκτικών και ευαίσθητων βιοτύπων σε συνθήκες αγρού και απουσίας ανταγωνισµού. 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ 2.1 ιαχείριση φυτικού υλικού Την άνοιξη του 2003 έγινε επιτόπια επίσκεψη σε περιοχές µε καλλιεργούµενα σιτηρά όπου είχαν αναφερθεί αποτυχίες αντιµετώπισης της ήρας (Lolium rigidum) µε τα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron ή tralkoxydim. Αξίζει να αναφερθεί ότι οι καλλιέργειες των σιτηρών της περιοχής Φιλαδέλφι είχαν δεχτεί κυρίως µεταφυτρωτική εφαρµογή tralkoxydim ενώ οι καλλιέργειες των σιτηρών της περιοχής Ζαγκλιβέρι και Καλαµωτό είχαν δεχτεί προφυτρωτική εφαρµογή chlorsulfuron για 10 περίπου έτη, αλλά κατά τα τελευταία τρία έτη είχαν δεχτεί προφυτρωτική εφαρµογή chlorsulfuron και µεταφυτρωτική εφαρµογή µε tralkoxydim (Πίνακας 2.1). Οι άλλοι αγροί είχαν δεχτεί διάφορα ζιζανιοκτόνα για την αντιµετώπιση του ζιζανίου. Πίνακας 2.1 Προέλευση αξιολογηθέντων βιοτύπων ήρας Περιοχή Χωριό-αγρός Θεσσαλονίκη Ζαγκλιβέρι 2 Ζαγκλιβέρι 3 Καλαµωτό 2 Φιλαδέλφι 2 Φιλαδέλφι 3 Αγρόκτηµα ΑΠΘ (ευαίσθητος) Σέρρες Ροδολίβος 1 όµηρος Αγγίστα

25 25 Η επιτόπια επίσκεψη αποσκοπούσε στον εντοπισµό αγρών µε φυτά ήρας (βιότυπος) που είχαν επιζήσει ακόµη και µετά από εφαρµογή διπλάσιων από τις συνιστώµενες δόσεις των παραπάνω ζιζανιοκτόνων. Τον Ιούνιο του ιδίου έτους (2003) και πριν τη συγκοµιδή των σιτηρών, σπόροι από φυτά των προαναφερθέντων βιοτύπων Lolium rigidum συλλέχθηκαν από οκτώ αγρούς σκληρού σιταριού (Triticum durum) της Βόρειας Ελλάδος (Πίνακας 2.1). Σπόρος ευαίσθητου βιοτύπου ήρας (µάρτυρας) συλλέχθηκε από περιοχές του Αγροκτήµατος του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, όπου δεν είχε γίνει εφαρµογή ζιζανιοκτόνων-αναστολέων των ενζύµων ALS και/ή ACCase. Οι σπόροι όλων των βιοτύπων τοποθετήθηκαν σε χάρτινες σακούλες και αποθηκεύτηκαν σε συνθήκες δωµατίου µέχρι να χρησιµοποιηθούν στις διάφορες πειραµατικές εργασίες. 2.2 ιερεύνηση ανθεκτικότητας στο chlorsulfuron Υλικά και µέθοδοι Πείραµα φυτοδοχείων Πραγµατοποιήθηκαν δύο παρόµοια πειράµατα στο Αγρόκτηµα του Πανεπιστηµίου για τη διερεύνηση εννέα βιοτύπων ήρας ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron. Τα δύο πειράµατα έγιναν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 11x17x16 cm που γεµίστηκαν µε µίγµα έδαφος:άµµος 2:1. Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκαν 20 σπόροι ήρας στην επιφάνεια του εδαφικού µίγµατος και ακολούθως καλύφθηκαν µε το ίδιο µίγµα ύψους 1 cm. Όλα τα φυτοδοχεία τοποθετήθηκαν σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήµατος για το πρώτο πείραµα, ενώ για το δεύτερο πείραµα εντός του θερµοκηπίου του Αγροκτήµατος. Η σπορά των δύο πειραµάτων έγινε στις

26 26 28/9/04 και στις 29/11/04, ενώ στις 30/9/04 και 29/11/04 έγινε η προφυτρωτική εφαρµογή δύο επεµβάσεων του chlorsulfuron (Glean 75 WG) (1.5 και 6.0 g δ.ο./στρ) και µίας επέµβασης µε prosulfocarb (Boxer 800 EC) (320 g δ.ο./στρ). Και στα δύο πειράµατα χρησιµοποιήθηκε αψέκαστος µάρτυρας. Η κάθε επέµβαση είχε τρεις επαναλήψεις. Η εφαρµογή των ζιζανιοκτόνων έγινε µε φορητό ψεκαστήρα ακρίβειας ΑΖΟ ( ράµπα µήκους 2,4 m των 6 (8002) µπεκ) και πίεση 250 kpa. Ο όγκος του ψεκαστικού υγρού ήταν 30 lt/στρ. Τα φυτοδοχεία αρδεύονταν όποτε ήταν αναγκαίο, ενώ κάθε εβδοµάδα γινόταν διαφυλλική εφαρµογή λιπάσµατος [Bayfolan (11-8-6)]. Επτά εβδοµάδες από την εφαρµογή των επεµβάσεων (20/11/04 και 17/01/05, αντίστοιχα, για τα δύο πειράµατα), έγινε µακροσκοπική αξιολόγηση της αποτελεσµατικότητας των επεµβάσεων (µείωση ανάπτυξης των φυτών σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα) και προσδιορισµός του χλωρού βάρους των φυτών που επιβίωσαν (µείωση χλωρού βάρους % του αψέκαστου µάρτυρα). Χρησιµοποιήθηκε το τελείως τυχαιοποιηµένο 9 x 4 παραγοντικό σχέδιο (9 βιότυποι ήρας x 4 επεµβάσεις ζιζανιοκτόνων). Ο κάθε συνδυασµένος παράγοντας (βιότυπος x επεµβάσεις) είχε 3 επαναλήψεις. Η ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA) έγινε χωριστά για κάθε πείραµα, λόγω των διαφορετικών συνθηκών ανάπτυξης των φυτών. Για την ανάλυση των δεδοµένων χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραµµα MSTAT Πείραµα τριβλίων petri Πραγµατοποιήθηκαν δύο παρόµοια πειράµατα (1/12/04 και 17/03/05) στο εργαστήριο Γεωργίας του Αγροκτήµατος του Πανεπιστηµίου για τη

27 27 διερεύνηση εννέα βιοτύπων ήρας ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron. Είκοσι σπόροι από κάθε βιότυπο τοποθετήθηκαν σε τριβλία petri όπου είχε τοποθετηθεί διπλή στρώση διηθητικού χαρτιού. Στη συνέχεια παρασκευάστηκε αρχικό αιώρηµα µε 2 g του σκευάσµατος Glean 75 WG (75% chlorsulfuron) και ακολούθως µε διαδοχικές αραιώσεις έγιναν οι επεµβάσεις-συγκεντρώσεις (0.0, 0.1, 10, 100, και 1000 mg chlorsulfuron/lt) του πειράµατος. Στη συνέχεια, έγινε προσθήκη 5 ml αιωρήµατος από κάθε συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου σε κάθε τριβλίο. Ακολούθως όλα τα τριβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαµο ανάπτυξης φυτών ( C) για δέκα ηµέρες. Μετά το πέρας αυτού του διαστήµατος έγινε µέτρηση του µήκους των ριζών των φυτρωµένων σπόρων σε κάθε τριβλίο και εκφράστηκε ως % ανάπτυξη σε σύγκριση µε το µάρτυρα (απουσία δραστικής ουσίας). Χρησιµοποιήθηκε το τελείως τυχαιοποιηµένο 9 x 4 παραγοντικό σχέδιο (9 βιότυποι ήρας x 4 επεµβάσεις ζιζανιοκτόνου). Ο κάθε συνδυασµένος παράγοντας (βιότυπος x επεµβάσεις) είχε 4 επαναλήψεις. Επειδή η συνδυασµένη ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA) των δύο πειραµάτων έδειξε ότι υπήρχε αλληλεπίδραση µεταξύ των επεµβάσεων και του χρόνου διεξαγωγής των πειραµάτων, αποφασίστηκε να χρησιµοποιηθούν οι µέσοι όροι των επεµβάσεων κάθε πειράµατος για την εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής, η οποία περιγράφει καλύτερα (υψηλότερος συντελεστής προσδιορισµού, R 2 ) τη σχέση µεταξύ µήκους ρίζας και συγκέντρωσης ζιζανιοκτόνου. Επειδή η σύγκριση των δύο γραµµών συµµεταβολής κάθε βιοτύπου έδειξε ότι η κοινή γραµµή περιέγραφε καλύτερα τη σχέση παρά οι δύο γραµµές (ήταν παράλληλες) αποφασίστηκε να

28 28 χρησιµοποιηθούν οι µέσοι όροι των επεµβάσεων των δύο πειραµάτων. Τα δεδοµένα πριν τη χρήση τους για την εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής µετατράπηκαν σε λογάριθµο [log(x+1), όπου x = δόση ζιζανιοκτόνου και log(y+1), όπου y = µήκος ρίζας % του µήκους ρίζας του µάρτυρα]. Στη συνέχεια µε τη βοήθεια των εξισώσεων συµµεταβολής υπολογίστηκε η τιµή GI 50 (συγκέντρωση ζιζανιοκτόνου που απαιτείται για να µειώσει κατά 50% το µήκος ρίζας της ήρας) για κάθε βιότυπο και ακολούθως ο συντελεστής ανθεκτικότητας ως το πηλίκο µεταξύ της GI 50 τιµής κάθε βιοτύπου προς την GI 50 τιµή του πληθυσµού Αγρόκτηµα (ευαίσθητος). Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του στατιστικού προγράµµατος MSTAT, ενώ η εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής µε το EXCEL Αποτελέσµατα Η ανάλυση των δεδοµένων του χλωρού βάρους έδειξε σηµαντική αλληλεπίδραση µεταξύ βιοτύπων και επεµβάσεων. Ειδικότερα, βρέθηκε ότι η συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron (1.5 g δ.ο./στρ) µείωσε το χλωρό βάρος των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 κατά 3, 15 και 3% για το πρώτο πείραµα και κατά 0, 0 και 27% για το δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα (Σχήµα 2.1). Αντίθετα, το χλωρό βάρος των βιοτύπων Αγρόκτηµα, Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3, Ροδολίβος 1, όµηρος και Αγγίστα µειώθηκε από την εφαρµογή της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron (1.5 g δ.ο./στρ) κατά 92, 75, 70, 84, 87, 90% για το πρώτο πείραµα και κατά 100, 84, 88, 91, 97 και 99% για το δεύτερο, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε το χλωρό βάρος του αψέκαστου µάρτυρα (Σχήµα 2.1).

29 29 Η εφαρµογή της τετραπλάσιας από τη συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron (6.0 g δ.ο./στρ) µείωσε το χλωρό βάρος των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 κατά 0, 16, 50% για το πρώτο πείραµα και κατά 19, 12 και 50% για το δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα. Όλοι οι υπόλοιποι βιότυποι παρουσίασαν µείωση στο χλωρό βάρος που κυµάνθηκε από 84 έως 100% σε σύγκριση µε το χλωρό βάρος του αψέκαστου µάρτυρα, και για τα δύο πειράµατα (Σχήµα 2.1). Η εφαρµογή του prosulfocarb (320 g δ.ο./στρ) µείωσε το χλωρό βάρος των φυτών όλων των βιοτύπων κατά 100% (Σχήµα 2.1). Σχήµα 2.1. Μείωση του χλωρού βάρους εννέα Lolium rigidum βιοτύπων στις επτά εβδοµάδες από την προφυτρωτική εφαρµογή των επεµβάσεων.

30 30 Η ανάλυση των δεδοµένων της µακροσκοπικής αξιολόγησης έδειξε παρόµοια αποτελέσµατα µε εκείνα του χλωρού βάρους και για τα δύο πειράµατα (Σχήµα 2.2). Ειδικότερα, η συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron (1.5 g δ.ο./στρ) δεν επηρέασε την ανάπτυξη των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 (µείωση κατά 3, 3, 0% για το πρώτο πείραµα και 0, 0 και 20% για το δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα) (Σχήµα 2.2). Η ανάπτυξη των βιοτύπων Αγρόκτηµα, Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3, Ροδολίβος 1, όµηρος και Αγγίστα µειώθηκε από την εφαρµογή της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron (1.5 g δ.ο./στρ) κατά 97, 70, 67, 92, 95 και 96% για το πρώτο πείραµα και κατά 100, 80, 92, 95, 97 και 100% για το δεύτερο, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα (Σχήµα 2.2). Σχήµα 2.2. Μείωση ανάπτυξης των φυτών (αναστολή) εννέα Lolium rigidum βιοτύπων στις επτά εβδοµάδες από την προφυτρωτική εφαρµογή των επεµβάσεων.

31 31 Η εφαρµογή της τετραπλάσιας από τη συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron (6.0 g δ.ο./στρ) µείωσε την ανάπτυξη των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 κατά 6, 1, 50% για το πρώτο πείραµα και κατά 22, 13 και 50% για το δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα. Αντίθετα, η ίδια επέµβαση µείωσε την ανάπτυξη των υπόλοιπων βιότυπων κατά 92 έως 100% σε σύγκριση µε τα φυτά του αψέκαστου µάρτυρα, και για τα δύο πειράµατα (Σχήµα 2.2). Η εφαρµογή του prosulfocarb (320 g δ.ο./στρ) µείωσε κατά 100% την ανάπτυξη όλων των βιοτύπων (Σχήµα 2.2). Η ανάλυση των δεδοµένων του µήκους ρίζας των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε τριβλία Petri έδειξε ότι το µήκος της ρίζας όλων των βιοτύπων µειώθηκε µε την αύξηση της συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου. Βέβαια, η µικρότερη µείωση παρατηρήθηκε στους βιότυπους Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 και µάλιστα στις συγκεντρώσεις 0,1, 10, και 100 mg chlorsulfuron/lit (Σχήµα 2.3).

32 32 Σχήµα 2.3. Επίδραση του chlorsulfuron στο µήκος ρίζας (% του µάρτυρα) των φυτών εννέα Lolium rigidum βιοτύπων (πειράµατα µε τριβλία Petri).. Η προσπάθεια συσχέτισης του µήκους της ρίζας (% του µάρτυρα) µε τη συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου στο υδατικό διάλυµα και εξεύρεσης της καλύτερης γραµµής συµµεταβολής έδειξε ότι η εξίσωση που περιγράφει καλύτερα τη σχέση αυτή, αλλά µετά από λογαριθµική µετατροπή των δεδοµένων [y = log(µήκος ρίζας % του µάρτυρα +1) και x = log(δόση ζιζανιοκτόνου +1)], είναι η δευτεροβάθµιος εξίσωση y = a + bx + cx 2 (Πίνακας 2.2). Οι GI 50 τιµές (mg ζιζανιοκτόνου/lt για µείωση του µήκους της ρίζας κατά 50% ) που προσδιορίστηκαν βάση της εξίσωσης αυτής για τους βιότυπους Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3, και Καλαµωτό 2 ήταν 14.8, 7.6, και 1.7, ενώ για τον βιότυπο Αγρόκτηµα 0.4 mg/lt. Οι GI 50 τιµές των βιότυπων Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3, Ροδολίβος 1, όµηρος και Αγγίστα ήταν µικρότερες από

33 33 εκείνη του Αγροκτήµατος (0.3, 0.3, 0.24, 0.2, και 0.1 mg/lt, αντίστοιχα) (Πίνακας 2.2). Πίνακας 2.2: Εξισώσεις συµµεταβολής, συντελεστές προσδιορισµού (r 2 ), GΙ 50 τιµές και τιµές συντελεστού ανθεκτικότητας (GI 50 R/GI 50 S) µε βάση το µήκος ρίζας των βιοτύπων σε σχέση µε τη συγκέντρωση του chlorsulfuron. Βιότυπος Εξίσωση συµµεταβολής Συντελεστής προσδιορισµού (r 2 ) Τιµή GI 50 (mg/lit) Συντελεστής ανθεκτικότητας Αγρόκτηµα Y= x x Ζαγκλιβέρι 2 Y= x x Ζαγκλιβέρι 3 Y= x x Καλαµωτό 2 Y= x x Φιλαδέλφι 2 Y= x x Φιλαδέλφι 3 Y= x x Ροδολίβος 1 Y= x x όµηρος Y= x x Αγγίστα Y= x x Ο συντελεστής ανθεκτικότητας (ο λόγος GI 50 κάθε βιοτύπου/gi 50 βιοτύπου Αγρόκτηµα ) εµφάνισε τις υψηλότερες τιµές για τους βιότυπους Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτο 2 (37, 19 και 4 αντίστοιχα), Αντίθετα, η τιµή αυτή στους υπόλοιπους βιότυπους ήταν µικρότερη από εκείνη του ευαίσθητου βιότυπου (Πίνακας 2.2) Συζήτηση Η µη µείωση της ανάπτυξης των φυτών των βιοτύπων ήρας Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 από την τετραπλάσια δόση του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron θα πρέπει να οφείλεται σε πιθανή ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Η συνεχής εφαρµογή κατά τα τελευταία έτη του chlorsulfuron (κατά δήλωση των αγροτών παραγωγών) στους αγρούς όπου

34 34 συλλέχτηκαν οι σπόροι των συγκεκριµένων βιοτύπων θα πρέπει να είναι το αίτιο που προκάλεσε την ανάπτυξη των ανθεκτικών βιοτύπων. Στο ίδιο συµπέρασµα κατέληξαν και οι Tayor και Coats (1996), οι οποίοι βρήκαν ότι η συνεχής χρήση του ζιζανιοκτόνου sulfometuron οδήγησε στην επιλογή ανθεκτικών βιοτύπων του ζιζανίου Lolium multiflorum. Οµοίως, 36 από 78 βιοτύπους Raphanus raphanistrum ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στο chlorsulfuron µετά από πέντε συνεχείς εφαρµογές του (Hashem κ.α., 2001). Οι Neve κ.α. (2004) αναφέρουν ότι ένας βιότυπος Lolium rigidum ανθεκτικός στο glyphosate (WALR 50) ήταν (σε πειράµατα φυτοδοχείων) ανθεκτικός και στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron, αφού επιβίωσε ακόµη και µετά από την εφαρµογή του σε δόσεις 30 φορές µεγαλύτερες από τη συνιστώµενη. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν και µε πειράµατα βιοδοκιµών, τα οποία έδειξαν ότι ο βιότυπος αυτός ήταν 295 φορές πιο ανθεκτικός στο chlorsulfuron και 463 φορές πιο ανθεκτικός στο ζιζανιοκτόνο sulfometuron. Επίσης, οι Burnet κ.α. (1994) βρήκαν ότι ένας βιότυπος Lolium rigidum (VLR69) ήταν 20 φορές πιο ανθεκτικός στο chlorsulfuron σε σχέση µε τον ευαίσθητο βιότυπο. Οι υπολογισθείσες µεγάλες τιµές GI 50 των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 και οι ως εκ τούτου υψηλές τιµές του συντελεστή ανθεκτικότητας επιβεβαιώνουν τα αποτελέσµατα των προηγούµενων πειραµάτων, αλλά και συµφωνούν µε τα αποτελέσµατα των Tal κ.ά. (2000), οι οποίοι βρήκαν ότι κάποιοι βιότυποι Lolium rigidum, Phalaris minor και Alopecurus myosuroides είχαν συντελεστή ανθεκτικότητας 9.3, 3.5 και 3.0, αντίστοιχα, σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ACCase. Παρόµοια αποτελέσµατα έδειξαν και οι βιοδοκιµές των Burnet κ.α. (1994b) και

35 35 Kuk κ.α. (2000), οι οποίες χρησιµοποιήθηκαν για τη µελέτη ανθεκτικών και ευαίσθητων βιοτύπων Lolium rigidum στο sulfometuron και Lolium spp. στο diclofop, αντίστοιχα. Τέλος, οι Neve κ.α. (2004) βρήκαν ότι οι βιοδοκιµές ήταν αξιόπιστες µέθοδοι για διερεύνηση ανθεκτικότητας στο glyphosate σε ένα βιότυπο (WALR 50) Lolium rigidum. Η σηµαντική µείωση της ανάπτυξης των φυτών των υπολοίπων βιοτύπων από την εφαρµογή του chlorsulfuron καθώς και οι πολύ µικρές GI 50 τιµές (µικρότερες ακόµα και από αυτή του βιοτύπου Αγρόκτηµα ) δείχνει ότι δεν υπάρχει πρόβληµα ανθεκτικότητας µε τους βιοτύπους αυτούς. Αυτό σηµαίνει ότι στις περιοχές της Βορείου Ελλάδος όπου δεν διαπιστώθηκε ανθεκτικότητα βιοτύπων, η µη επιτυχής καταπολέµηση του ζιζανίου ήρα πιθανόν να οφείλεται σε άλλους λόγους, όπως είναι οι µη ευνοϊκές καιρικές συνθήκες, η µη ορθή εφαρµογή του ζιζανιοκτόνου ή εφαρµογή του σε λάθος στάδιο ανάπτυξης του φυτού. Η µεγάλη ευαισθησία όλων των βιοτύπων της ήρας (ακόµη και των ανθεκτικών στο chlorsulfuron) στο προφυτρωτικό ζιζανιοκτόνο prosulfocarb (320 g δ.ο./στρ) καθιστά το ζιζανιοκτόνο αυτό ως ένα από τα πιο αποτελεσµατικά εναλλακτικά µέσα αποτελεσµατικής χηµικής αντιµετώπισης της ήρας στα χειµερινά σιτηρά της Βόρειας Ελλάδος, όπου η χρήση του chlorsulfuron δεν αποτελεί πλέον ικανοποιητικό µέσο αντιµετώπισης.

36 ιερεύνηση πολλαπλής ανθεκτικότητας στο tralkoxydim Υλικά και µέθοδοι Πείραµα φυτοδοχείων Πραγµατοποιήθηκαν δύο παρόµοια πειράµατα στο Αγρόκτηµα του Πανεπιστηµίου για τη διερεύνηση εννέα βιοτύπων της ήρας ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης πολλαπλής ανθεκτικότητας και στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim. Τα δύο πειράµατα έγιναν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 11x17x16 cm που γεµίστηκαν µε µίγµα έδαφος:άµµος 2:1. Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκαν 20 σπόροι του ζιζανίου ήρα στην επιφάνεια του εδάφους και καλύφτηκαν µε το ίδιο µίγµα σε βάθος 1 cm. Τα φυτοδοχεία του πρώτου πειράµατος τοποθετήθηκαν σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήµατος (φυσικές κλιµατολογικές χειµερινές συνθήκες), ενώ τα φυτοδοχεία του δευτέρου πειράµατος εντός του θερµοκηπίου του Αγροκτήµατος. Η σπορά των δύο πειραµάτων έγινε στις 28/09/04 και στις 29/11/04, ενώ η µεταφυτρωτική εφαρµογή (φυτά µε 4-6 φύλλα, έναρξη του αδελφώµατος) των δύο επεµβάσεων του tralkoxydim (Grasp 25 SC) (η συνιστώµενη των 32.5 και η τετραπλάσια των 130 g δ.ο/στρ) έγινε στις 25/10/04 και 20/12/04. Και στα δύο πειράµατα χρησιµοποιήθηκε αψέκαστος µάρτυρας. Η κάθε επέµβαση είχε τρεις επαναλήψεις. Η εφαρµογή των ζιζανιοκτόνων έγινε µε φορητό ψεκαστήρα ακριβείας ΑΖΟ [ ράµπα µήκους 2,4 m των 6 (8002) µπεκ] και πίεση ψεκασµού 250 kpa. Ο όγκος του ψεκαστικού υγρού ήταν 30 lt/στρ. Τα φυτοδοχεία αρδεύονταν όποτε ήταν αναγκαίο, ενώ κάθε εβδοµάδα γινόταν διαφυλλική εφαρµογή λιπάσµατος [Bayfolan (11-8-6)]. Τέσσερις εβδοµάδες από την εφαρµογή των επεµβάσεων (20/11/04 και 17/01/05, αντίστοιχα, για τα δύο πειράµατα), έγινε µακροσκοπική αξιολόγηση της αποτελεσµατικότητας

37 37 των επεµβάσεων (µείωση ανάπτυξης των φυτών σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα) και προσδιορισµός του χλωρού βάρους των φυτών που επιβίωσαν (% του αψέκαστου µάρτυρα). Το τελείως τυχαιοποιηµένο 9 x 3 παραγοντικό σχέδιο (9 βιότυποι ήρας x 3 επεµβάσεις ζιζανιοκτόνου) χρησιµοποιήθηκε µε τον κάθε συνδυασµένο παράγοντα (βιότυπος x επεµβάσεις) να έχει 3 επαναλήψεις. Η ανάλυση των δεδοµένων (ANOVA) έγινε χωριστά για κάθε πείραµα λόγω των διαφορετικών συνθηκών ανάπτυξης των φυτών. Για την ανάλυση των δεδοµένων χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραµµα MSTAT Πείραµα τριβλίων Petri Πραγµατοποιήθηκαν δύο παρόµοια πειράµατα (14/09/05 και 15/10/05) στο εργαστήριο Γεωργίας του Αγροκτήµατος του Πανεπιστηµίου για τη διερεύνηση τεσσάρων βιοτύπων ήρας ( Αγρόκτηµα Πανεπιστηµίου, Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Φιλαδέλφι 3 ) ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim. Είκοσι σπόροι από κάθε βιότυπο τοποθετήθηκαν σε τριβλία petri όπου είχε τοποθετηθεί διπλή στρώση διηθητικού χαρτιού. Στη συνέχεια παρασκευάστηκε αρχικό αιώρηµα του σκευάσµατος µε 10 ml Grasp 25 SC (25% tralkoxydim) και ακολούθως µε διαδοχικές αραιώσεις έγιναν οι επεµβάσεις-συγκεντρώσεις (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, και 10 mg tralkoxydim/lt) του πειράµατος. Στη συνέχεια, έγινε προσθήκη 5 ml αιωρήµατος από κάθε συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου σε κάθε τριβλίο. Ακολούθως, όλα τα τριβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαµο ανάπτυξης φυτών ( C) για δέκα ηµέρες. Μετά το πέρας αυτού του διαστήµατος έγινε µέτρηση του µήκους των βλαστών των φυτρωµένων

38 38 σπόρων σε κάθε τριβλίο και εκφράστηκε ως % ανάπτυξη σε σύγκριση µε το µάρτυρα (απουσία δραστικής ουσίας). Χρησιµοποιήθηκε το τελείως τυχαιοποιηµένο 4 x 8 παραγοντικό σχέδιο (4 βιότυποι ήρας x 8 επεµβάσεις ζιζανιοκτόνου), όπου ο κάθε συνδυασµένος παράγοντας (βιότυπος x επεµβάσεις) είχε 4 επαναλήψεις. Η συνδυασµένη ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA) των δύο πειραµάτων έδειξε ότι δεν υπήρχε αλληλεπίδραση µεταξύ των επεµβάσεων και του χρόνου διεξαγωγής των πειραµάτων, γι αυτό αποφασίστηκε να χρησιµοποιηθούν οι µέσοι όροι των επεµβάσεων κάθε πειράµατος για την εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής, η οποία περιγράφει καλύτερα (υψηλότερος συντελεστής προσδιορισµού, R 2 ) τη σχέση µεταξύ µήκους βλαστού και συγκέντρωσης ζιζανιοκτόνου. Τα δεδοµένα πριν τη χρήση τους για την εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής µετατράπηκαν σε λογάριθµο [log(x+1), όπου x = συγκέντρωση του ζιζανιοκτόνου και log(y+1), όπου y = µήκος βλαστού % του µήκους βλαστού του µάρτυρα]. Στη συνέχεια, µε τη βοήθεια της εξίσωσης συµµεταβολής υπολογίστηκε η GΙ 50 τιµή (συγκέντρωση ζιζανιοκτόνου που απαιτείται για να µειώσει κατά 50% το µήκος βλαστού της ήρας). Ο συντελεστής ανθεκτικότητας υπολογίσθηκε από το πηλίκο µεταξύ της GΙ 50 τιµής του κάθε βιοτύπου προς την GΙ 50 τιµή του βιοτύπου Αγρόκτηµα (ευαίσθητος). Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του στατιστικού προγράµµατος MSTAT, ενώ η εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής µε το EXCEL.

39 Αποτελέσµατα Η ανάλυση των δεδοµένων του χλωρού βάρους έδειξε σηµαντική αλληλεπίδραση µεταξύ βιοτύπων και επεµβάσεων. Ειδικότερα, η συνιστώµενη δόση του tralkoxydim (32,5 g δ.ο./στρ) δεν επηρέασε το χλωρό βάρος του βιοτύπου Ζαγκλιβέρι 2 (µείωση κατά 3% για το πρώτο πείραµα και 0% για το δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα) (Σχήµα 2.4), αλλά µείωσε το χλωρό βάρος των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 3, Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3 στα δύο πειράµατα, κατά 45, 53 και 55% και 59, 59 και 63%, αντίστοιχα. Τέλος, ή ίδια δόση του tralkoxydim (32,5 g δ.ο./στρ) µείωσε το χλωρό βάρος των φυτών των βιοτύπων Αγρόκτηµα, Καλαµωτό 2, Ροδολίβος 1, όµηρος και Αγγίστα κατά 91, 75, 76, 93 και 82% στο πρώτο πείραµα και κατά 98, 76, 93, 100, και 100% στο δεύτερο, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε το χλωρό βάρος των φυτών του αψέκαστου µάρτυρα (Σχήµα 2.4). Η εφαρµογή της τετραπλάσιας από τη συνιστώµενη δόσης του tralkoxydim (130 g δ.ο./στρ) µείωσε το χλωρό βάρος του βιοτύπου Ζαγκλιβέρι 2 κατά 32% στο πρώτο πείραµα και κατά 38% στο δεύτερο, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε το χλωρό βάρος του αψέκαστου µάρτυρα. Η ίδια δόση προκάλεσε µείωση στο χλωρό βάρος των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 3, Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3 και στα δύο πειράµατα, κατά 76, 64 και 98% και 95, 95 και 100%, αντίστοιχα. Τέλος, η ίδια δόση µείωσε το χλωρό βάρος των υπόλοιπων βιοτύπων κατά % σε σύγκριση µε το χλωρό βάρος του αψέκαστου µάρτυρα και στα δύο πειράµατα (Σχήµα 2.4).

40 40 Σχήµα 2.4: Μείωση χλωρού βάρους των εννέα Lolium rigidum βιοτύπων στις τέσσερις εβδοµάδες από τη µεταφυτρωτική εφαρµογή των επεµβάσεων. Η ανάλυση των δεδοµένων της µακροσκοπικής αξιολόγησης έδειξε παρόµοια αποτελέσµατα µε εκείνα του χλωρού βάρους και για τα δύο πειράµατα (Σχήµα 2.5). Ειδικότερα, η συνιστώµενη δόση του tralkoxydim (32,5 g δ.ο./στρ) µείωσε την ανάπτυξη του βιοτύπου Ζαγκλιβέρι 2 κατά 8% στο πρώτο πείραµα και κατά 10% στο δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα) (Σχήµα 2.5). Η ίδια δόση προκάλεσε µεγαλύτερη µείωση στην ανάπτυξη των φυτών των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 3, Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3, η οποία κυµάνθηκε από 40 µέχρι 52% και 58 µέχρι 62% στα δύο πειράµατα αντίστοιχα, σε σχέση µε τον αψέκαστο µάρτυρα. Αντίθετα, η ίδια δόση µείωσε την ανάπτυξη των φυτών των βιοτύπων Αγρόκτηµα, Καλαµωτό 2, Ροδολίβος 1, όµηρος και Αγγίστα

41 41 κατά 96, 97, 89, 98 και 93% στο πρώτο πείραµα και κατά 100, 72, 95, 100 και 100% στο δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα (Σχήµα 2.5). Σχήµα 2.5: Αποτελεσµατικότητα (µείωση ανάπτυξης των φυτών) του tralkoxydim εναντίον εννέα Lolium rigidum βιοτύπων (τέσσερις εβδοµάδες από τη µεταφυτρωτική εφαρµογή των επεµβάσεων). Η εφαρµογή της τετραπλάσιας από τη συνιστώµενη δόσης του tralkoxydim (130 g δ.ο./στρ) µείωσε την ανάπτυξη των φυτών του βιοτύπου Ζαγκλιβέρι 2 κατά 35% στο πρώτο πείραµα και κατά 43% στο δεύτερο πείραµα αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα. Αντίθετα, η ίδια δόση προκάλεσε µείωση στην ανάπτυξη των φυτών των υπόλοιπων βιοτύπων που κυµάνθηκε από 85 έως 100% σε σύγκριση µε τα φυτά του αψέκαστου µάρτυρα και των δύο πειραµάτων (Σχήµα 2.5).

42 42 Η ανάλυση των δεδοµένων του µήκους βλαστού των σπορόφυτων που αναπτύχθηκαν στα τριβλία έδειξε ότι το µήκος του βλαστού όλων των βιοτύπων µειώθηκε µε την αύξηση της συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου, αλλά η µικρότερη µείωση παρατηρήθηκε στους βιοτύπους Ζαγκλιβέρι 2 και Ζαγκλιβέρι 3 (Σχήµα 2.6). Σχήµα 2.6 Επίδραση της συγκέντρωσης του tralkoxydim στο µήκος βλαστού (% του µάρτυρα) των σποροφύτων τεσσάρων βιοτύπων ήρας (πειράµατα µε τριβλία Petri). Η ανάλυση των δεδοµένων του µήκους βλαστού για την εξεύρεση της καλύτερης γραµµής συµµεταβολής µεταξύ του µήκους του βλαστού (% του µάρτυρα) και της συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου (στο νερό) έδειξε ότι η δευτεροβάθµιος εξίσωση y = a + bx + cx 2 περιγράφει καλύτερα τη σχέση αυτή, αλλά µετά από µετατροπή των δεδοµένων [y = log (µήκος βλαστού % του µάρτυρα +1) και x = log (δόση ζιζανιοκτόνου + 1)] (Σχήµα 2.6). Η υπολογισθείσα από την εξίσωση συµµεταβολής GI 50 τιµή (mg ζιζανιοκτόνου/lt

43 43 για µείωση του µήκους βλαστού κατά 50%) για τους βιότυπους Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Φιλαδέλφι 3 ήταν 1.1, 0.4 και 0.34 mg/lt, ενώ για το βιότυπο Αγρόκτηµα 0.06 mg/lt. Ο λόγος GI 50 κάθε βιοτύπου/gi 50 βιοτύπου Αγρόκτηµα (ευαίσθητος), γνωστός και ως συντελεστής ανθεκτικότητας, έδειξε ότι είχε τις τιµές 18, 7 και 6 για τους βιότυπους Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Φιλαδέλφι 3 αντίστοιχα (Πίνακας 2.3). Πίνακας 2.3: Εξισώσεις συµµεταβολής, συντελεστές προσδιορισµού (r 2 ), GΙ 50 τιµές και τιµές συντελεστού ανθεκτικότητας (GI 50 R/GI 50 S) µε βάση το µήκος βλαστού των βιοτύπων σε σχέση µε τη συγκέντρωση του tralkoxydim. Βιότυπος Εξίσωση συµµεταβολής Συντελεστής προσδιορισµού (r 2 ) Τιµή GI 50 (mg/lit) Συντελεστής ανθεκτικότητας Αγρόκτηµα Y= x x Ζαγκλιβέρι 2 Y= x x Ζαγκλιβέρι 3 Y= x x ,4 7 Φιλαδέλφι 3 Y= x x 2 0,99 0, Συζήτηση Η µη µείωση της ανάπτυξης (χλωρό βάρος, µακροσκοπική παρατήρηση) των φυτών του βιότυπου Ζαγκλιβέρι 2 από την τετραπλάσια δόση του ζιζανιοκτόνου tralkoxydim δείχνει ότι ο βιότυπος αυτός ανέπτυξε, εκτός από ανθεκτικότητα στο chlorsulfuron, και πολλαπλή ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο tralkoxydim. Επίσης, η µη αποδεκτή µείωση στην ανάπτυξη των φυτών των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 3, Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3 από την εφαρµογή της συνιστώµενης δόσης του tralkoxydim δείχνει, εκτός από την προαναφερθείσα ανθεκτικότητα στο chlorsulfuron, αναπτυσσόµενη ανθεκτικότητα στο tralkoxydim. Τέλος η µείωση της ανάπτυξης των φυτών για

44 44 τους υπόλοιπους βιότυπους, δείχνει ότι, όπως και για το chlorsulfuron έτσι και για το tralkoxydim, οι βιότυποι αυτοί δεν ανέπτυξαν ανθεκτικότητα. Η αξιοπιστία των πειραµάτων σε φυτοδοχεία και τριβλία (βιοδοκιµές) για τη µελέτη ανάπτυξης ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της ACCase επιβεβαιώνεται και από τους Clarke και Moss (1991) και Μoss κ.α. (1998), οι οποίοι χρησιµοποίησαν φυτοδοχεία για τη διερεύνηση πιθανής ανάπτυξης ανθεκτικότητας του ζιζανίου Alopecurus myosuroides στα ζιζανιοκτόνα fenoxaprop και clodinafop (αναστολείς της ACCase), αντίστοιχα, καθώς επίσης και από τον Moss (2000), ο οποίος χρησιµοποίησε τριβλία (βιοδοκιµές) για τη µελέτη πιθανής ανάπτυξης ανθεκτικών βιότυπων Alopecurus myosuroides στο fenoxaprop και sethoxydim και ανθεκτικών βιότυπων Avena spp. και Lolium multiflorum στο diclofop και στο fenoxaprop. Τέλος, οι Tardif κ.α. (1993) χρησιµοποίησαν τριβλία (βιοδοκιµές) για τη µελέτη της ανθεκτικότητας του ζιζανίου Lolium rigidum σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της ACCase. Τα αποτελέσµατα της εργασίας αυτής συµφωνούν µε εκείνα των Llewellyn και Powles (2001), οι οποίοι βρήκαν ότι το 37% από ένα δείγµα 264 βιοτύπων Lolium rigidum εµφάνισε πολλαπλή ανθεκτικότητα σε chlorsulfuron (αναστολέας ALS) και diclofop-methyl (αναστολέας ACCase). Επίσης, οι Neve κ.α. (2004) βρήκαν ότι ο πρώτος ανθεκτικός βιότυπος (WALR 50) Lolium rigidum στο glyphosate είχε ταυτόχρονα και πολλαπλή ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύµου ALS και ACCase. Οι υπολογισθείσες µεγάλες GI 50 τιµές των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Φιλαδέλφι 3 και οι ως εκ τούτου υψηλές τιµές του συντελεστή ανθεκτικότητας επιβεβαιώνουν τα αποτελέσµατα των πειραµάτων

45 45 µε τα φυτοδοχεία. Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν µε εκείνα των Tardif κ.ά. (1997), Burnet κ.ά. (1994) και Heap (2007), οι οποίοι αναφέρουν ότι ένας βιότυπος του ζιζανίου Lolium rigidum από την Αυστραλία έχει ήδη αναπτύξει πολλαπλή ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα των οµάδων PS II-φαινυλουρίεςτριαζίνες, ALS-σουλφονυλουρίες-ιµιδαζολινόνες, ACCase-κυκλοεξανδιόνεςαρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά και VLCFA-χλωροακεταµίδια. Το ενδιαφέρον µε την εργασία αυτή είναι ότι ο βιότυπος αυτός προήλθε από έναν αγρό όπου είχαν εφαρµοστεί τα ζιζανιοκτόνα diuron (παράγωγο ουρίας), chlorsulfuron (σουλφονυλουρίες), atrazine (τριαζίνες), paraquat (διπυριδύλια) και diclofop methyl (αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά) για 17, 6, 5, 3 και 2 χρόνια, αντίστοιχα. Τα δεδοµένα αυτά δείχνουν ότι ορισµένοι ανθεκτικοί στο chlorsulfuron βιότυποι ζιζανίων Lolium rigidum (όπως και στην παρούσα εργασία) µπορούν να αναπτύξουν µη αναµενόµενη πολλαπλή ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα που χρησιµοποιήθηκαν για δύο µόνο χρόνια (diclofop methyl, έχει τον ίδιο µηχανισµό δράσης µε το tralkoxydim) ή ακόµη σε ζιζανιοκτόνα που δεν είχαν χρησιµοποιηθεί προηγουµένως (χλωροακεταµίδια). Αυτό, σύµφωνα µε τις ίδιες πηγές, µπορεί να γίνει αν οι µηχανισµοί ανθεκτικότητας αυτών των βιοτύπων (π.χ. ALS-chlorsulfuron, ACCase-tralkoxydim) επιλεγούν από την πίεση επιλογής άλλων ζιζανιοκτόνων ή αν τα γονίδια έκφρασης αυτών των µηχανισµών ανθεκτικότητας είναι συνδεδεµένα µε το επιλεχθέν γονίδιο έκφρασης του µηχανισµού ανθεκτικότητας του βιοτύπου σε άλλα ζιζανιοκτόνα. Η άποψη αυτή εξηγεί και την πολλαπλή ανθεκτικότητα των βιοτύπων της περιοχής Ζαγκλιβέρι αφού η προαναφερθείσα τριετής µεταφυτρωτική εφαρµογή του tralkoxydim, σε συνδυασµό µε την προφυτρωτική εφαρµογή του chlorsulfuron, δεν δικαιολογεί τη δηµιουργία βιοτύπων µε πολλαπλή

46 46 ανθεκτικότητα στις περιοχές αυτές ως αποτέλεσµα της πίεσης επιλογής του ζιζανιοκτόνου tralkoxydim. 2.4 ιερεύνηση µηχανισµού ανθεκτικότητας στο chlorsulfuron Υλικά και µέθοδοι Πραγµατοποιήθηκαν δύο παρόµοια πειράµατα στο αγρόκτηµα του Πανεπιστηµίου για τη διερεύνηση έξι βιοτύπων της ήρας (τρείς ανθεκτικοί και τρείς ευαίσθητοι) ως προς τον µηχανισµό ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron. Τα δύο πειράµατα έγιναν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 11x17x16 cm που γεµίστηκαν µε µίγµα έδαφος:άµµος 2:1. Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκαν 20 σπόροι ήρας στην επιφάνεια του εδαφικού µίγµατος και ακολούθως καλύφθηκαν µε το ίδιο µίγµα ύψους 1 cm. Όλα τα φυτοδοχεία τοποθετήθηκαν εντός του θερµοκηπίου του Αγροκτήµατος για το πρώτο πείραµα, ενώ για το δεύτερο πείραµα σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήµατος. Η σπορά των δύο πειραµάτων έγινε στις 29/11/04 και στις 7/4/05, ενώ η προφυτρωτική εφαρµογή µίας επέµβασης του chlorsulfuron (Glean 75 WG) (1,5 g δ.ο/στρ) και µίας συνδυασµένης επέµβασης chlorsulfuron (Glean 75 WG) (1,5 g δ.ο./στρ) και 300 g/στρ οργανοφωσφορικού εντοµοκτόνου terbufos (Counter 5 G) έγινε στις 29/11/04 και 7/4/05. Και στα δύο πειράµατα χρησιµοποιήθηκε αψέκαστος µάρτυρας. Η κάθε επέµβαση είχε τρεις επαναλήψεις. Η εφαρµογή των επεµβάσεων έγινε µε φορητό ψεκαστήρα ακρίβειας ΑΖΟ ( ράµπα µήκους 2,4 m των 6 (8002) µπεκ) και πίεση ψεκασµού 250 kpa. Ο όγκος του ψεκαστικού υγρού ήταν 30 lt/στρ. Τα φυτοδοχεία αρδεύονταν όποτε ήταν αναγκαίο, ενώ κάθε εβδοµάδα γινόταν διαφυλλική εφαρµογή λιπάσµατος [Bayfolan (11-8-6)]. Επτά και δέκα

47 47 εβδοµάδες από την εφαρµογή των επεµβάσεων (17/1/05 και 16/6/05, αντίστοιχα, για τα δύο πειράµατα), έγινε µακροσκοπική αξιολόγηση της αποτελεσµατικότητας των επεµβάσεων (µείωση ανάπτυξης των φυτών σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα) και προσδιορισµός του χλωρού βάρους των φυτών που επιβίωσαν (% του αψέκαστου µάρτυρα). Χρησιµοποιήθηκε το τελείως τυχαιοποιηµένο 6 x 3 παραγοντικό σχέδιο (6 βιότυποι ήρας x 3 επεµβάσεις ζιζανιοκτόνου). Ο κάθε συνδυασµένος παράγοντας (βιότυπος x επεµβάσεις) είχε 3 επαναλήψεις. Η ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA) έγινε χωριστά για κάθε πείραµα λόγω των διαφορετικών συνθηκών ανάπτυξης των φυτών. Για την ανάλυση των δεδοµένων χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραµµα MSTAT Αποτελέσµατα Η ανάλυση των δεδοµένων του χλωρού βάρους έδειξε σηµαντική αλληλεπίδραση µεταξύ βιοτύπων και επεµβάσεων. Ειδικότερα, η συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron (1,5 g δ.ο./στρ) µείωσε το χλωρό βάρος των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 κατά 0, 0 και 21% στο πρώτο πείραµα και κατά 0, 0 και 0% στο δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα. Επίσης, η συνδυασµένη επέµβαση της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron και του εντοµοκτόνου terbufos µείωσε το χλωρό βάρος των παραπάνω βιότυπων κατά 5, 0, 13% στο πρώτο πείραµα και κατά 0, 4 και 2% στο δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα (Σχήµα 2.7). Αντίθετα, η συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron µείωσε το χλωρό βάρος του πληθυσµού Αγρόκτηµα, Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3 κατά 100 και 98%, 90 και 83% και 92 και 83%

48 48 για τα δύο πειράµατα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα, ενώ η συνδυασµένη επέµβαση της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron και του εντοµοκτόνου terbufos προκάλεσε 100% µείωση στο χλωρό βάρος των φυτών των βιοτύπων Αγρόκτηµα και Φιλαδέλφι 2 και για τα δύο πειράµατα καθώς και 93 και 91% αντίστοιχα µείωση στο χλωρό βάρος του βιότυπου Φιλαδέλφι 3 (Σχήµα 2.7). Σχήµα 2.7: Μείωση χλωρού βάρους έξι Lolium rigidum βιοτύπων στις επτά και δέκα εβδοµάδες από την εφαρµογή των επεµβάσεων. Η ανάλυση των δεδοµένων της µακροσκοπικής αξιολόγησης έδειξε παρόµοια αποτελέσµατα µε εκείνα του χλωρού βάρους και για τα δύο πειράµατα (Σχήµα 2.8). Ειδικότερα, η συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron µείωσε την ανάπτυξη των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και

49 49 Καλαµωτό 2 κατά 0, 0 και 20% στο πρώτο πείραµα και κατά 0, 2 και 5% στο δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα (Σχήµα 2.8). Επίσης, η συνδυασµένη επέµβαση της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron και του εντοµοκτόνου terbufos δεν επηρέασε την ανάπτυξη των παραπάνω βιότυπων στο πρώτο πείραµα και µείωσε κατά 0, 0 και 8% στο δεύτερο πείραµα, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα (Σχήµα 2.8). Αντίθετα, η συνιστώµενη δόση του chlorsulfuron µείωσε την ανάπτυξη του βιότυπου Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3 κατά 87 και 92% και 83 και 82% στα δύο πειράµατα αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τον αψέκαστο µάρτυρα, ενώ η συνδυασµένη επέµβαση της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron και του εντοµοκτόνου terbufos µείωσε την ανάπτυξη των φυτών κατά 100 και 97% και 100 και 90% αντίστοιχα για τα δυο πειράµατα (Σχήµα 2.8). Σχήµα 2.8: Αποτελεσµατικότητα (µείωση ανάπτυξης των φυτών) διαφόρων επεµβάσεων του chlorsulfuron εναντίον έξι Lolium rigidum βιοτύπων (επτά και δέκα εβδοµάδες από εφαρµογή των επεµβάσεων).

50 Συζήτηση Η µη διαφοροποίηση της ανάπτυξης των φυτών των βιοτύπων Ζαγκλιβέρι 2, Ζαγκλιβέρι 3 και Καλαµωτό 2 στη συνδυασµένη εφαρµογή του chlorsulfuron µε το οργανοφωσφορικό εντοµοκτόνο terbufos δείχνει ότι η ανθεκτικότητα αυτών των βιοτύπων δεν οφείλεται στην ικανότητα των φυτών να µεταβολίζει το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron αλλά οφείλεται σε ανθεκτικό ένζυµο ALS. Παρόµοια πειράµατα που πραγµατοποίησαν οι Christopher κ.α. (1994) και οι Preston κ.α. (1996) βρήκαν, σε αντίθεση µε την εργασία αυτή, ότι η ταυτόχρονη εφαρµογή του οργανοφωσφορικού εντοµοκτόνου malathion µε το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron σε ένα ανθεκτικό βιότυπο Lolium rigidum στο chlorsulfuron, ανέστειλε την καταλυτική δράση των µονοοξυγενασών του κυτοχρώµατος P 450 µε αποτέλεσµα την νέκρωση του ανθεκτικού βιοτύπου. Πίνακας 2.4: Μηχανισµός ανθεκτικότητας τεσσάρων ανθεκτικών βιοτύπων της ήρας στο chlorsulfuron. Βιότυπος Χαρακτηρισµός Μηχανισµός ανθεκτικότητας Αγρόκτηµα Ευαίσθητος _ Ζαγκλιβέρι 2 Ανθεκτικός Τροποποίηση θέσης δράσης Ζαγκλιβέρι 3 Ανθεκτικός Τροποποίηση θέσης δράσης Καλαµωτό 2 Ανθεκτικός Τροποποίηση θέσης δράσης

51 ιερεύνηση βιολογίας και µορφολογίας εννέα βιοτύπων Υλικά και µέθοδοι Πραγµατοποιήθηκε ένα πείραµα αγρού στο Αγρόκτηµα του Πανεπιστηµίου για τη διερεύνηση βιολογικών και µορφολογικών χαρακτηριστικών εννέα βιοτύπων ήρας. Αρχικά, τα φυτά αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 6 x 7 x 7 cm, τα οποία γεµίστηκαν µε µίγµα εδάφους:άµµου 2:1, τοποθετήθηκαν 5 σπόροι κάθε βιοτύπου στην επιφάνεια του εδάφους κάθε φυτοδοχείου και ακολούθως καλύφθηκαν µε το ίδιο µίγµα ύψους 1 cm. Όλα τα φυτοδοχεία τοποθετήθηκαν σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήµατος, όπου αρδεύονταν και γινόταν διαφυλλική εφαρµογή λιπάσµατος [Bayfolan (11-8-6)] όποτε ήταν αναγκαίο. Η σπορά έγινε στις 5/12/04 και αµέσως µετά τη σπορά έγινε προφυτρωτική εφαρµογή της συνιστώµενης δόσης του chlorsulfuron στα φυτοδοχεία των ανθεκτικών βιοτύπων (νέκρωση τυχόν ευαίσθητων φυτών). Στις τέσσερις εβδοµάδες από τη σπορά έγινε αραίωµα των φυτών (δύο φυτά/φυτοδοχείο) και µία εβδοµάδα αργότερα έγινε η µεταφύτευσή τους στον αγρό (όπου τα τελευταία χρόνια δεν είχε γίνει εφαρµογή ζιζανιοκτόνου). Τα φυτά κατά την µεταφύτευσή τους ήταν στο στάδιο 2-3 φύλλων και δεν είχε αρχίσει το αδέλφωµα. Η µεταφύτευση έγινε κατά όρχους (θέσεις) εξαγώνων, οι οποίοι απείχαν µεταξύ τους 60 cm. Σε κάθε όρχο µεταφυτεύτηκαν τα δύο φυτά του κάθε φυτοδοχείου, ενώ σε κάθε επανάληψη του βιοτύπου υπήρχαν 25 όρχοι. Το πειραµατικό σχέδιο που χρησιµοποιήθηκε ήταν οι πλήρεις οµάδες σε τυχαία διάταξη µε τέσσερις επαναλήψεις (οµάδες). Η απόσταση µεταξύ των οµάδων ήταν 2 m. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε συνθήκες απουσίας ανταγωνισµού µε άλλα ζιζάνια, αφού κάθε εβδοµάδα τα ζιζάνια αποµακρύνονταν µε τσάπισµα ή βοτάνισµα.

52 52 Η αξιολόγηση περιλάµβανε επτά δειγµατοληψίες. Η πρώτη δειγµατοληψία έγινε 8 εβδοµάδες από τη µεταφύτευση (ΕΑΜ) και η τελευταία στις 22 εβδοµάδες. Η κάθε δειγµατοληψία περιλάµβανε συγκοµιδή (κοπή υπέργειου τµήµατος) έξι φυτών από τρεις τυχαίως επιλεγέντες όρχους από κάθε επανάληψη κάθε βιοτύπου. Ακολούθως, σε κάθε δείγµα-φυτό γίνονταν µετρήσεις χλωρού βάρους, αριθµού αδελφιών, αριθµού ταξιανθιών και ύψους (7, 6, 4 και 7 δειγµατοληψίες, αντίστοιχα). Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε βάση το 9 x (7, 6, 4 ή 7) split plot σχέδιο, όπου οι εννέα βιότυποι ήταν τα κύρια τεµάχια (main plots) και οι δειγµατοληψίες τα υποτεµάχια (sub plot). Για την ανάλυση των δεδοµένων όλων των µετρήσεων χρησιµοποιήθηκε ο µέσος όρος των έξι φυτών για κάθε βιότυπο. Τα δεδοµένα επίσης χρησιµοποιήθηκαν για την εξεύρεση της γραµµής συµµεταβολής µεταξύ των διαφόρων παραµέτρων και του χρόνου, αλλά πριν από τη χρήση τους µετατράπηκαν σε λογάριθµο [log(y), όπου y = χλωρό βάρος, αριθµός αδελφιών, ύψος φυτών, αριθµός ταξιανθιών+1]. Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του στατιστικού προγράµµατος MSTAT, ενώ η εξεύρεση της καµπύλης συµµεταβολής µε το EXCEL. Στις 25 ΕΑΜ έγινε και µια τελευταία δειγµατοληψία, η οποία περιλάµβανε επιπρόσθετη συγκοµιδή τεσσάρων φυτών (δύο όρχοι) από κάθε επανάληψη/βιότυπο, όπου έγιναν µετρήσεις του µήκους της ταξιανθίας, του αριθµού των σταχυδίων και του αριθµού των σπόρων ανά σταχύδιο. Η µέτρηση του µήκους της ταξιανθίας και του αριθµού των σταχυδίων/ταξιανθία έγινε σε 10 τυχαίως επιλεγείσες ταξιανθίες από κάθε επανάληψη/βιότυπο, ενώ η µέτρηση του αριθµού των σπόρων/σταχύδιο έγινε σε 10 τυχαίως επιλεγέντα σταχύδια από κάθε επανάληψη/βιότυπο. Για την ανάλυση των δεδοµένων

53 53 χρησιµοποιήθηκε το πειραµατικό σχέδιο των πλήρως τυχαιοποιηµένων οµάδων. Για όλες τις µετρήσεις, στην ανάλυση και παρουσίαση των δεδοµένων, χρησιµοποιήθηκε ο µέσος όρος των ταξιανθιών/φυτό, σταχυδίων/ταξιανθία και σπόρων/σταχύδιο, αντίστοιχα, για κάθε βιότυπο. Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του στατιστικού προγράµµατος MSTAT. Στις 25 ΕΑΜ, τέσσερα φυτά (από δύο όρχους) από κάθε επανάληψη/βιότυπο συγκοµίστηκαν και στη συνέχεια έγινε αλωνισµός των ταξιανθιών τους (τρίψιµο µε τα χέρια) και συλλογή των σπόρων (µετά από επιµελή αποµάκρυνση των ξένων υλών). Οι σπόροι, αφού ζυγίστηκαν, τοποθετήθηκαν σε χάρτινες σακούλες και αποθηκεύτηκαν στη συνέχεια σε χώρο του Εργαστηρίου του Αγροκτήµατος (συνθήκες δωµατίου) προκειµένου να χρησιµοποιηθούν περαιτέρω για προσδιορισµό της φυτρωτικής τους ικανότητας. Για την ανάλυση των δεδοµένων του βάρους των σπόρων/φυτό χρησιµοποιήθηκε το πειραµατικό σχέδιο των πλήρως τυχαιοποιηµένων οµάδων. Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του στατιστικού προγράµµατος MSTAT. Τέλος, οι βιότυποι κατατάχθηκαν µε βάση το γενικό µέσο όρο, όπως αυτός υπολογίστηκε από την επιµέρους σειρά κατάταξής τους ανά χαρακτηριστικό (τιµή τελευταίας δειγµατοληψίας). Η φυτρωτική ικανότητα των συγκοµισθέντων σπόρων προσδιορίστηκε µε πείραµα τριβλίων Petri. Ειδικότερα, 20 σπόροι από κάθε επανάληψη/βιοτύπου τοποθετήθηκαν σε τριβλία όπου προηγουµένως είχε τοποθετηθεί διπλή στρώση διηθητικού χαρτιού. Στη συνέχεια, έγινε προσθήκη 5 ml πόσιµου νερού σε κάθε τριβλίο και ακολούθως όλα τα τριβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαµο ανάπτυξης φυτών ( C) για δύο εβδοµάδες.

54 54 Για κάθε επανάληψη/βιότυπο χρησιµοποιήθηκαν 2 τριβλία. Μετά το πέρας αυτού του διαστήµατος έγινε µέτρηση του αριθµού των φυτρωµένων σπόρων σε κάθε τριβλίο και εκφράστηκε ως % φυτρωτική ικανότητα. Το πείραµα της µέτρησης της φυτρωτικής ικανότητας έγινε ένα, δύο και τρεις µήνες από τη συγκοµιδή του σπόρου. Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε βάση το 9 x 3 split plot σχέδιο, όπου οι εννέα βιότυποι ήταν τα κύρια τεµάχια (main plots) και οι τρεις χρόνοι µέτρησης της φυτρωτικής ικανότητας τα υποτεµάχια (sub plot) Αποτελέσµατα Η ανάλυση των δεδοµένων έδειξε ότι το χλωρό βάρος όλων των βιοτύπων αυξήθηκε µε το χρόνο και υπήρχαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βιοτύπων. Ειδικότερα, οι βιότυποι Αγρόκτηµα και Ζαγκλιβέρι 2 εµφάνισαν το µέγιστο χλωρό βάρος στις 18 ΕΑΜ, ενώ οι υπόλοιποι βιότυποι το εµφάνισαν στις 22 ΕΑΜ. Αντίθετα, οι βιότυποι Αγρόκτηµα και Ζαγκλιβέρι 2 στην τελευταία δειγµατοληψία είχαν το µικρότερο χλωρό βάρος, ενώ ο βιότυπος Φιλαδέλφι 2 εµφάνισε τελικά το µεγαλύτερο χλωρό βάρος (Σχήµα 2.9). Η εξίσωση (γραµµή συµµεταβολής) που περιέγραψε καλύτερα τη σχέση µεταξύ του χλωρού βάρους ανά φυτό και του χρόνου από τη µεταφύτευση ήταν η εκθετική (y = a x b ) αλλά µετά από λογαριθµική µετατροπή των δεδοµένων [y = log (χλωρό βάρος ανά φυτό)] (Πίνακας 2.5). Η σύγκριση των τιµών b (ρυθµός αύξησης χλωρού βάρους) δείχνει ότι οι βιότυποι όµηρος (ευαίσθητος), Ζαγκλιβέρι 2 (πολλαπλή ανθεκτικότητα) και Φιλαδέλφι 3 (εξελισσόµενη ανθεκτικότητα στο tralkoxydim) είχαν τις

55 55 µεγαλύτερες τιµές (0,75, 0,70 και 0,68, αντίστοιχα), ενώ ο βίοτυπος Αγρόκτηµα (ευαίσθητος) είχε 0,49 (Πίνακας 2.5). Οι τιµές b των υπολοίπων βιοτύπων κυµάνθηκαν από 0,55 µέχρι 0,62. Ειδικότερα, η φθίνουσα σειρά των διαφόρων βιοτύπων µε βάση την τιµή b είναι όµηρος > Ζαγκλιβέρι 2 > Φιλαδέλφι 3 > Ροδολίβος 1 > Φιλαδέλφι 2 > Καλαµωτό 2 > Αγγίστα > Ζαγκλιβέρι 3 > Αγρόκτηµα (Πίνακας 2.5). Σχήµα 2.9:Ρυθµός αύξησης του χλωρού βάρους των εννέα βιοτύπων ήρας.

56 56 Πίνακας 2.5: Συντελεστές προσδιορισµού (r 2 ), τιµές a και b των εξισώσεων συµµεταβολής µεταξύ χλωρού βάρους (g) ανά φυτό (y) και χρόνου από τη µεταφύτευση (x = 1 + 0, 1, 2, 3, 4, 6, 10 εβδοµάδες από την πρώτη δειγµατοληψία). Βιότυπος Εξίσωση συµµεταβολής Συντελεστής προσδιορισµού (r 2 ) Αγρόκτηµα 0,6588x 0,4944 0,92 0,6588 0,4944 Ζαγκλιβέρι 2 0,4705x 0,6957 0,92 0,4705 0,6957 Ζαγκλιβέρι 3 0,6553x 0,5482 0,95 0,6553 0,5482 Καλαµωτό 2 0,5893x 0,5944 0,96 0,5893 0,5944 Φιλαδέλφι 2 0,5912x 0,5997 0,97 0,5912 0,5997 Φιλαδέλφι 3 0,4898x 0,6844 0,95 0,4898 0,6844 Ροδολίβος 1 0,5628x 0,6199 0,95 0,5628 0,6199 όµηρος 0,4215x 0,7520 0,93 0,4215 0,7520 Αγγίστα 0,5965x 0,5727 0,96 0,5965 0,5727 a b Η ανάλυση των δεδοµένων του αριθµού των αδελφιών ανά φυτό έδειξε ότι ο αριθµός των αδελφιών αυξήθηκε µε το χρόνο και ότι υπάρχουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βιοτύπων. Όλοι οι βιότυποι εµφάνισαν το µέγιστο αριθµό των αδελφιών στις 18 ΕΑΜ. Ο βιότυπος Αγρόκτηµα εµφάνισε στο τέλος το µικρότερο αριθµό αδελφιών, ενώ οι βιότυποι Καλαµωτό 2 και Ροδολίβος 1 είχαν τελικά το µέγιστο αριθµό αδελφιών ανά φυτό (Σχήµα 2.10). Η εξίσωση (γραµµή συµµεταβολής) που περιέγραψε καλύτερα τη σχέση µεταξύ του αριθµού αδελφιών ανά φυτό και του χρόνου από τη µεταφύτευση ήταν η εκθετική (y = a x b ) αλλά µετά από λογαριθµική µετατροπή των δεδοµένων [y = log (αδέλφια ανά φυτό)] (Πίνακας 2.6). Οι βιότυποι Καλαµωτό 2 ( ανθεκτικός στο chlorsulfuron) και Φιλαδέλφι 3 (εξελισσόµενη ανθεκτικότητα στο tralkoxydim) εµφάνισαν τη µεγαλύτερη τιµή b (0.464 και 0.463, αντίστοιχα), ενώ τις µικρότερες τιµές εµφάνισαν οι βιότυποι

57 57 Αγρόκτηµα (ευαίσθητος) και όµηρος (ευαίσθητος) (0,389 και 0,385, αντίστοιχα) (Πίνακας 2.6). Οι τιµές b των υπολοίπων βιοτύπων κυµάνθηκαν από 0,42 µέχρι 0,458. Ειδικότερα, η φθίνουσα σειρά των διαφόρων βιοτύπων µε βάση την τιµή b είναι Καλαµωτό 2 > Φιλαδέλφι 3 > Φιλαδέλφι 2 > Ζαγκλιβέρι 3 > Ροδολίβος 1 > Ζαγκλιβέρι 2 > Αγγίστα > Αγρόκτηµα > όµηρος (Πίνακας 2.6)., Σχήµα 2.10: Ρυθµός αύξησης του αριθµού των αδελφιών των εννέα βιοτύπων ήρας.

58 58 Πίνακας 2.6: Συντελεστές προσδιορισµού (r 2 ), τιµές a και b των εξισώσεων συµµεταβολής µεταξύ του αριθµού αδελφιών ανά φυτό (y) και χρόνου από τη µεταφύτευση (x = 1 + 0, 2, 4, 6, 8, 10 εβδοµάδες από την πρώτη δειγµατοληψια). Βιότυπος Εξίσωση συµµεταβολής Συντελεστής προσδιορισµού (r 2 ) Αγρόκτηµα 0,6282x ,98 0, Ζαγκλιβέρι 2 0,5914x ,99 0, Ζαγκλιβέρι 3 0,5767x ,99 0, Καλαµωτό 2 0,5976x ,99 0, Φιλαδέλφι 2 0,5690x ,98 0, Φιλαδέλφι 3 0,5691x ,97 0, Ροδολίβος 1 0,5970x ,99 0, όµηρος 0,6451x ,98 0, Αγγίστα 0,6217x ,98 0, a b Ο αριθµός των ταξιανθιών έδειξε σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βιοτύπων αλλά αυξήθηκε, όπως αναµενόταν, µε το χρόνο. Όλοι οι βιότυποι εµφάνισαν το µέγιστο αριθµό ταξιανθιών στις 22 ΕΑΜ. Ο πληθυσµός Αγρόκτηµα είχε στην τελευταία δειγµατοληψία το µικρότερο αριθµό ταξιανθιών, ενώ ο βιότυπος Ροδολίβος 1 εµφάνισε το µέγιστο αριθµό ταξιανθιών (Σχήµα 2.11). Η εξίσωση (γραµµή συµµεταβολής) που περιέγραψε καλύτερα τη σχέση µεταξύ του αριθµού ταξιανθιών ανά φυτό και του χρόνου από τη µεταφύτευση ήταν η εκθετική (y = a x b ) αλλά µετά από λογαριθµική µετατροπή των δεδοµένων [y = log (ταξιανθίες ανά φυτό+1)] (Πίνακας 2.7). Ο βιότυπος Ροδολίβος 1 (ευαίσθητος) εµφάνισε τη µεγαλύτερη τιµή b (0,996) ), ενώ ο βιότυπος Αγρόκτηµα (ευαίσθητος) τη µικρότερη τιµή (0,37) (Πίνακας 2.7). Οι τιµές b των υπολοίπων βιοτύπων κυµάνθηκαν από 0,91 µέχρι 0,987. Ειδικότερα, η φθίνουσα σειρά των διαφόρων βιοτύπων µε βάση την τιµή b

59 59 είναι Ροδολίβος 1 > Φιλαδέλφι 2 > όµηρος > Φιλαδέλφι 3 > Καλαµωτό 2 > Αγγίστα > Ζαγκλιβέρι 3 > Ζαγκλιβέρι 2 > Αγρόκτηµα. Η σύγκριση των τιµών a (εµφάνιση ταξιανθιών) δείχνει ότι βιότυπος Άγρόκτηµα είχε τη µεγαλύτερη τιµή (Πίνακας 2.7). Σχήµα 2.11:Ρυθµός εµφάνισης ταξιανθιών των εννέα βιοτύπων της ήρας.

60 60 Πίνακας 2.7: Συντελεστές προσδιορισµού (r 2 ), τιµές a και b των εξισώσεων συµµεταβολής µεταξύ του αριθµού ταξιανθιών ανά φυτό (y) και χρόνου από τη µεταφύτευση (x = 1 + 0, 1, 3, 7 εβδοµάδες από την πρώτη δειγµατοληψία). Βιότυπος Εξίσωση συµµεταβολής Συντελεστής προσδιορισµού (r 2 ) Αγρόκτηµα 0,9846x , Ζαγκλιβέρι 2 0,3539x , Ζαγκλιβέρι 3 0,3630x , Καλαµωτό 2 0,3443x , Φιλαδέλφι 2 0,3186x , Φιλαδέλφι 3 0,3151x , Ροδολίβος 1 0,3416x , όµηρος 0,3177x , Αγγίστα 0,3493x , a b Η ανάλυση των δεδοµένων έδειξε ότι όλοι οι βιότυποι αύξησαν το ύψος τους µε το χρόνο καθώς επίσης ότι υπάρχουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βιοτύπων. Συγκεκριµένα, o βιότυπος Αγρόκτηµα εµφάνισε το µέγιστο ύψος στις 18 ΕΑΜ, ενώ οι υπόλοιποι βιότυποι στις 22 ΕΑΜ. Με βάση την τελευταία δειγµατοληψία, το µεγαλύτερο ύψος εµφάνισαν οι βιότυποι Φιλαδέλφι 2 και Φιλαδέλφι 3 (Σχήµα 2.12). Η εξίσωση (γραµµή συµµεταβολής) που περιέγραψε καλύτερα τη σχέση µεταξύ του ύψους και του χρόνου από τη µεταφύτευση ήταν η εκθετική εξίσωση (y = a x b ) αλλά µετά από λογαριθµική µετατροπή των δεδοµένων [y = log (ύψος)]. Η µεγαλύτερη τιµή b παρατηρήθηκε στο βιότυπο Φιλαδέλφι 3 (εξελισσόµενη ανθεκτικότητα στο tralkoxydim) (0,25), ενώ η µικρότερη στο βιότυπο όµηρο (ευαίσθητος) (0,206) (Πίνακας 2.8). Οι τιµές b των υπολοίπων βιοτύπων κυµάνθηκαν από 0,23 µέχρι Ειδικότερα, η φθίνουσα σειρά των διαφόρων βιοτύπων µε βάση την τιµή b είναι Φιλαδέλφι

61 61 3 > Ζαγκλιβέρι 3 > Φιλαδέλφι 2 > Αγγίστα > Αγρόκτηµα > Ζαγκλιβέρι 2 > Ροδολίβος 1 > Καλαµωτό 2 > όµηρος. Βέβαια, ο βιότυπος Άγρόκτηµα είχε τη µεγαλύτερη τιµή a σε σχέση µε τους υπόλοιπους βιότυπους (Πίνακας 2.8). Σχήµα 2.12:Ρυθµός αύξησης του ύψους των εννέα βιοτύπων της ήρας.

62 62 Πίνακας 2.8: Συντελεστές προσδιορισµού (r 2 ), τιµές a και b των εξισώσεων συµµεταβολής µεταξύ του ύψους ανά φυτό (cm) (y) και χρόνου από τη µεταφύτευση (x = 1 + 0, 1, 2, 3, 4, 6, 10 εβδοµάδες από την πρώτη δειγµατοληψία). Βιότυπος Εξίσωση συµµεταβολής Συντελεστής προσδιορισµού (r 2 ) Αγρόκτηµα 1,0350x , Ζαγκλιβέρι 2 0,9209x , Ζαγκλιβέρι 3 0,9249x , Καλαµωτό 2 0,9391x , Φιλαδέλφι 2 0,9411x , Φιλαδέλφι 3 0,8612x , Ροδολίβος 1 0,9359x , όµηρος 0,9479x , Αγγίστα 0,9084x , a b Όλοι οι βιότυποι αύξησαν τη διάµετρο της ροζέτας τους µε το χρόνο και εµφάνισαν το µέγιστο πλάτος στις 22 ΕΑΜ, αλλά µεταξύ τους δεν υπήρχαν σηµαντικές διαφορές ως προς το χαρακτηριστικό αυτό (Σχήµα 2.13).

63 63 Σχήµα 2.13: Ρυθµός αύξησης της διαµέτρου της ροζέτας των εννέα βιοτύπων της ήρας. Η ανάλυση των δεδοµένων του µήκους της ταξιανθίας και του αριθµού των σπόρων ανά σταχύδιο έδειξε ότι δεν υπήρχαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βιοτύπων (Σχήµα 2.14). Αντίθετα, η ανάλυση των δεδοµένων του αριθµού των σταχυδίων ανά ταξιανθία έδειξε διαφορές µεταξύ των βιοτύπων. Συγκεκριµένα, τα περισσότερα σταχύδια ανά ταξιανθία εµφάνισαν οι βιότυποι Ζαγκλιβέρι 2 (ανθεκτικός), Καλάµωτό 2 (ανθεκτικός) και Ζαγκλιβέρι 3 (ανθεκτικός) (18.4, 18.3 και 16.8 αντίστοιχα), ενώ ο βιότυπος Αγρόκτηµα (ευαίσθητος) είχε το µικρότερο αριθµό σταχυδίων (14.1) (Σχήµα 2.14).

64 64 Η ανάλυση των δεδοµένων του βάρους των σπόρων ανά φυτό έδειξε σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βιοτύπων. Ειδικότερα, οι βιότυποι Φιλαδέλφι 2 (εξελισσόµενη ανθεκτικότητα), Καλαµωτό 2 (ανθεκτικός), Ζαγκλιβέρι 3 (ανθεκτικός) και Ζαγκλιβέρι 2 (ανθεκτικός) είχαν το µεγαλύτερο βάρος σπόρου ανά φυτό (7.4, 6,9, 6.0 και 5.6, αντίστοιχα). Το βάρος σπόρων για τους υπόλοιπους βιοτύπους κυµάνθηκε από 3.9 µέχρι 5.0, µε το βιότυπο Αγρόκτηµα (ευαίσθητος) να εµφανίζει την µικρότερη τιµή (Σχήµα 2.14). Σχήµα 2.14: Μήκος ταξιανθίας, αριθµός σταχυδίων ανά ταξιανθία, αριθµός σπόρων ανά σταχύδιο και βάρος σπόρου ανά φυτό στις εικοσιπέντε εβδοµάδες από τη µεταφύτευση.