Διερεύνηση σταυρανθεκτικότητας και πολλαπλής ανθεκτικότητας Lolium rigidum πληθυσμών σε ζιζανιοκτόνα

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ Διερεύνηση σταυρανθεκτικότητας και πολλαπλής ανθεκτικότητας Lolium rigidum πληθυσμών σε ζιζανιοκτόνα Θεόδωρος Α. Ευθυμιάδης Γεωπόνος ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επιβλέπων καθηγητής: Η. Γ. Ελευθεροχωρινός ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 21

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες... IV 1. Εισαγωγή Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας Ανθεκτικότητα Ανάπτυξη Ανθεκτικότητας Μηχανισμοί Ανθεκτικότητας Παράγοντες που Επηρεάζουν την Ανάπτυξη Ανθεκτικότητας Ανάπτυξη Ανθεκτικότητας σε Ζιζανιοκτόνα Αναστολείς της Δράσης του Ενζύμου ALS Ανάπτυξη Ανθεκτικότητας σε Ζιζανιοκτόνα Αναστολείς της Δράσης του ACCase Ενζύμου Ανάπτυξη Ανθεκτικότητας σε Ζιζανιοκτόνα Αναστολείς της Δράσης του EPSPS Ενζύμου Σκοπός της Εργασίας Πειραματικές Εργασίες Διαχείριση Φυτικού Υλικού Πειράματα Φυτοδοχείων Υλικά και Μέθοδοι Αποτελέσματα Συζήτηση Πειράματα Βιοδοκιμών Υλικά και Μέθοδοι Αποτελέσματα Συζήτηση Συμπεράσματα Περίληψη II

3 6. Summary Βιβλιογραφία Παράρτημα III

4 Ευχαριστίες Θερμές ευχαριστίες εκφράζονται στον καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό για την ανάθεση του θέματος, την εποπτεία των πειραμάτων, τη βοήθειά του στην ερμηνεία και τεκμηρίωση των αποτελεσμάτων, καθώς επίσης και για την πολύτιμη συμβολή του κατά τη διάρκεια της συγγραφής της εργασίας ως προς το περιεχόμενο, τη δομή και την τελική παρουσίασή της. Θερμές ευχαριστίες εκφράζονται επίσης και στους κ.κ. Χρήστο Δόρδα, επίκουρο καθηγητή του ΑΠΘ (Γεωπονική Σχολή) και Ιωάννη Τσιάλτα, Εντεταλμένο Ερευνητή του ΕΘΙΑΓΕ (εκλεχθείς λέκτορας στο Εργαστήριο Γεωργίας), μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες εκφράζονται στον διδάκτορα του ΑΠΘ κ. Νικόλαο Καλούμενο, και στη μεταπτυχιακή συμφοιτήτριά μου Βασιλική Αδαμούλη, για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Επίσης, ευχαριστίες εκφράζονται στους πτυχιούχους πλέον Γεωπονίας Ορέστη Τζιώλα και Ιωάννη Χρόνη για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Οφείλω ακόμα να ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους και φίλους που με βοήθησαν με οποιοδήποτε τρόπο, καθώς επίσης και τους φοιτητές που εργάστηκαν με συνέπεια για την εκτέλεση ορισμένων πειραμάτων, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την εκπλήρωση των υποχρεώσεων της πτυχιακής τους διατριβής. IV

5 Εισαγωγή 1. Εισαγωγή Η αντιμετώπιση των ζιζανίων αποτελεί ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα στη σύγχρονη γεωργία, αφού αυτά (ζιζάνια) προκαλούν σημαντική μείωση της παραγωγής και υποβάθμιση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων. Επομένως, η αντιμετώπιση των ζιζανίων θα πρέπει να είναι αποτελεσματική προκειμένου να αποφευχθούν οι προαναφερθείσες ανεπιθύμητες επιδράσεις. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση των ζιζανίων κατατάσσονται σε μεθόδους 1) άμεσης αντιμετώπισης των ήδη εγκαταστημένων ζιζανίων εντός της καλλιέργειας (βοτάνισμα, μηχανική κατεργασία, κοπή ζιζανίων, κάψιμο ζιζανίων, βιολογική μέθοδος, χημική μέθοδος), 2) μεθόδους που εφαρμόζονται πριν από την εγκατάσταση της καλλιέργειας και μειώνουν την εμφάνιση των ζιζανίων (μέτρα μείωσης της εισαγωγής νέων σπόρων ζιζανίων, αμειψισπορά, αλλαγή της εποχής σποράς με σκοπό την αποφυγή εμφάνισης κάποιων ζιζανίων, κάλυψη του εδάφους με αλληλοπαθητικά φυτά και ενσωμάτωσή τους στο έδαφος πριν τη σπορά, κατεργασία του εδάφους πριν τη σπορά σε χρόνο όπου έχουν φυτρώσει τα περισσότερα ζιζάνια, ηλιοαπολύμανση εδάφους) αλλά και 3) μέτρα, μεθόδους ή πρακτικές που μειώνουν τον ανταγωνισμό των ζιζανίων (επιλογή ανταγωνιστικών καλλιεργούμενων φυτών, επιλογή ανταγωνιστικών ή/και αλληλοπαθητικών ποικιλιών, μικτή καλλιέργεια, αύξηση πυκνότητας σποράς, ορθή χρήση λιπασμάτων, ορθή χρήση νερού, αποτελεσματική αντιμετώπιση εχθρών και ασθενειών) (Ελευθεροχωρινός, 28). Τα ζιζανιοκτόνα αναμφίβολα αποτελούν την αποτελεσματικότερη μέθοδο αντιμετώπισης των ζιζανίων αφού είναι ευρέως αποδεκτό ότι η συμβολή τους στη βελτίωση των καλλιεργητικών φροντίδων και κυρίως στη μείωση του κόστους παραγωγής ήταν και είναι σημαντική. Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση των ζιζανίων ανήκουν στα χημικώς συντιθέμενα ζιζανιοκτόνα, στα φυσικά ζιζανιοκτόνα ή στα ζιζανιοκτόνα παράγωγα φυσικών τοξινών. Οι πρώτες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν ως ζιζανιοκτόνα ήταν ανόργανες ενώσεις. Συγκεκριμένα, ο θειικός χαλκός εφαρμόστηκε για πρώτη φορά το 1896 στη Γαλλία, για να αντιμετωπίσει ζιζάνια στα χειμερινά σιτηρά. Οι οργανικές ενώσεις χρησιμοποιήθηκαν πρώτη φορά το 1932 και πάλι στη Γαλλία, όπου μια φαινολική ένωση με χημικό όνομα 2-μέθυλο-4,5- δινιτροφαινόλη, γνωστή ως DNOC, χρησιμοποιήθηκε για εκλεκτική καταπολέμηση ζιζανίων στα χειμερινά σιτηρά. Η ανάπτυξη όμως και η χρησιμοποίηση οργανικών 1

6 Εισαγωγή ουσιών ως ζιζανιοκτόνα σε μεγάλη κλίμακα άρχισε μετά το τέλος του Β παγκόσμιου πολέμου, αλλά γνώρισε τη μεγαλύτερη πρόοδο τα τελευταία 2 χρόνια. Ο εφησυχασμός των περισσότερων παραγωγών εξαιτίας της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης των ζιζανίων με τη χρήση ζιζανιοκτόνων και κυρίως, η εμμονή τους για συνεχή και μη εναλλασσόμενη (με ζιζανιοκτόνα διαφορετικού μηχανισμού δράσης) χρήση των αποτελεσματικών ζιζανιοκτόνων αύξησε την πιθανότητα ανάπτυξης βιοτύπων-πληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Tranel και Wright, 22). Η ανάπτυξη βιοτύπων-πληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα θεωρείται πλέον ένα από τα σοβαρότερα ζιζανιολογικά προβλήματα, αφού οι ανθεκτικοί βιότυποι-πληθυσμοί περιορίζουν τη δυνατότητα επιλογής ζιζανιοκτόνων για χημική αντιμετώπισή τους. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, η απώλεια ενός ζιζανιοκτόνου εξαιτίας της ανάπτυξης ανθεκτικών βιοτύπων-πληθυσμών ζιζανίων και η ως εκ τούτου αναγκαστική επιλογή κάποιου άλλου ζιζανιοκτόνου ή λιγότερο αποτελεσματικών μεθόδων από τα ήδη χρησιμοποιούμενα ζιζανιοκτόνα μπορεί να έχει αρνητικές οικονομικές και περιβαλλοντικές επιπτώσεις (Monaco κ.ά., 22; Ελευθεροχωρινός, 28). Η αιτία διεξαγωγής αυτής της εργασίας ήταν η αναφορά την άνοιξη του 23, παραγωγών της Βορείου Ελλάδος μειωμένης αποτελεσματικότητας αντιμετώπισης του ζιζανίου ήρα (Lolium rigidum) σε καλλιέργειες χειμερινών σιτηρών μετά από εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron (σουλφονυλουρία) ή/και tralkoxydim (κυκλοεξανδιόνη). Αξίζει να αναφερθεί ότι το chlorsulfuron είχε χρησιμοποιηθεί χωρίς προβλήματα για 1-15 συνεχή έτη. Η μη ύπαρξη δεδομένων για πιθανή ανθεκτικότητα αυτού του ζιζανίου στις περιοχές αυτές, δεν επέτρεπε εύκολα την εξαγωγή συμπερασμάτων για το πρόβλημα που διαπιστώθηκε. Η ανάγκη λοιπόν, για άμεση λύση του προβλήματος και αναζήτηση ζιζανιοκτόνων για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του ζιζανίου οδήγησαν στην πραγματοποίηση αυτής της εργασίας, στην οποία και μελετήθηκε εάν η μη επιτυχής αντιμετώπιση της ήρας (Lolium rigidum) οφείλεται σε ανάπτυξη ανθεκτικών βιοτύπων και προσδιορίστηκε το είδος της ανθεκτικότητας (απλή ανθεκτικότητα, σταυρανθεκτικότητα ή πολλαπλή ανθεκτικότητα) και η ένταση της ανθεκτικότητας (σχέση ευαισθησίας ανθεκτικού/ευαίσθητου βιοτύπου στα ζιζανιοκτόνα). Τα ζιζανιοκτόνα που αξιολογήθηκαν σε πειράματα φυτοδοχείων (φυτά) 2

7 Εισαγωγή και σε πειράματα τριβλίων Petri (σπορόφυτα) ήταν chlorsulfuron (σουλφονυλουρία), mesosulfuron+ iodosulfuron (σουλφονυλουρίες), diclofop (αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά), clodinafop (αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά), tralkoxydim (κυκλοεξανδιόνη), prosulfocarb (θεικαρβαμιδικά) και glyphosate (γλυκίνες). 3

8 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας 2. Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας 2.1. Ανθεκτικότητα Ανάπτυξη ανθεκτικότητας Η επιβίωση των ζιζανίων εντός μιας καλλιέργειας μετά από εφαρμογή ζιζανιοκτόνων οδηγεί συχνά σε σημαντικές οικονομικές απώλειες. Τα τελευταία χρόνια, η καταγραφή μη αποτελεσματικής αντιμετώπισης των ζιζανίων σε παγκόσμιο επίπεδο συνεχώς αυξάνει. Οι πιθανοί λόγοι για τη μη αποτελεσματικότητα ορισμένων ζιζανιοκτόνων είναι η εσφαλμένη επιλογή του ζιζανιοκτόνου ή των βοηθητικών ουσιών, η δόση και ο χρόνος εφαρμογής, οι αντίξοες καιρικές συνθήκες καθώς επίσης και η παρουσία ανθεκτικών βιότυπων-πληθυσμών. Ο όρος ανθεκτικότητα (resistance) αναφέρεται στην κληρονομική ιδιότητα μερικών βιότυπων ενός ζιζανίου να επιβιώνουν μετά την εφαρμογή, ακόμα και μεγαλύτερης από τη συνιστώμενη δόσης, κάποιου ζιζανιοκτόνου, στο οποίο ο αρχικός πληθυσμός του ήταν ευαίσθητος (LeBaron, 1982). Η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας σχετίζεται αναπόφευκτα με την εισαγωγή διαφόρων οικογενειών φυτοπροστατευτικών προϊόντων και με την πιο σημαντική περίπτωση αυτή των εντομοκτόνων. Είναι γεγονός ότι μέχρι σήμερα υπάρχουν ήδη περισσότερα από 4 γνωστά είδη εντόμων, τα οποία έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα σε ένα ή περισσότερα εντομοκτόνα (Ware, 1994). Παρόμοια κατάσταση επικρατεί και με τα παθογόνα μικρόβια του ανθρώπου ή των ζώων που ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά. Η ανθεκτικότητα ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναπτύχθηκε μετά από μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από ότι συνέβη με τα άλλα φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Για παράδειγμα, ενώ τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας των χλωροτριαζινών άρχισαν να χρησιμοποιούνται στο τέλος της δεκαετίας του 195, η πρώτη περίπτωση ανθεκτικότητας αναφέρθηκε γύρω στο 197. Ειδικότερα, ένας πληθυσμός Senecio vulgaris, ανθεκτικός σε χλωροτριαζίνες (atrazine, simazine) απομονώθηκε από έναν αγρό στην Ουάσινγκτον, όπου το ζιζανιοκτόνο simazine χρησιμοποιήθηκε συνεχώς για πολλά χρόνια (Ryan, 197). Βέβαια, ο αριθμός των ανθεκτικών ζιζανίων έχει αυξηθεί δραματικά, αφού έχουν καταγραφεί παγκοσμίως 194 ανθεκτικά είδη ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα (Heap, 21). 4

9 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας Μηχανισμοί ανθεκτικότητας Τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις μηχανισμοί μέσω των οποίων τα φυτά γίνονται ανθεκτικά σε ένα ζιζανιοκτόνο. Οι δύο πιο κοινοί μηχανισμοί των φυτών είναι η ικανότητα να μεταβολίζουν το ζιζανιοκτόνο και η γενετική τροποποίηση (ανθεκτικότητα) της πρωτεΐνης ή του ενζύμου-στόχου του ζιζανιοκτόνου (Gressel, 22; Hatzios, 21). Οι δύο αυτοί μηχανισμοί προϋπάρχουν στους αρχικούς πληθυσμούς των ζιζανίων και επιλέγονται από τα ζιζανιοκτόνα. Η ικανότητα μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων από τα ζιζάνια είναι λιγότερο συχνός μηχανισμός ανθεκτικότητας από ότι η ανθεκτικότητα λόγω γενετικής τροποποίησης της πρωτεΐνης ή του ενζύμου-στόχου των ζιζανιοκτόνων. Η ανθεκτικότητα της δεύτερης περίπτωσης είναι αποτέλεσμα της αδυναμίας σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων με την πρωτεΐνη ή το ένζυμο-στόχο και ως εκ τούτου αδυναμία αναστολής των φυσιολογικών ή των μεταβολικών διεργασιών εντός των ζιζανίων. Οι άλλοι δύο φυσιολογικοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας περιλαμβάνουν μείωση στο ρυθμό απορρόφησης ή μετακίνησης του ζιζανιοκτόνου εντός των ζιζανίων ή αλλαγή στον τρόπο κατανομής του ζιζανιοκτόνου εντός των ζιζανίων Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας Το είδος της ανθεκτικότητας (απλή, σταυρανθεκτικότητα, πολλαπλή ανθεκτικότητα) και ο ρυθμός ανάπτυξής της επηρεάζονται από παράγοντες του ζιζανίου, του ζιζανιοκτόνου και της εφαρμοζόμενης γεωργικής πρακτικής (Gasquez, 1997; Naylor, 22; Ελευθεροχωρινός, 28). Οι παράγοντες που έχουν σχέση με το ζιζάνιο και επηρεάζουν σημαντικά την ανάπτυξη ανθεκτικών βιοτύπων στα ζιζανιοκτόνα είναι 1) η συχνότητα των γονιδίων ανθεκτικότητας στο φυσικό πληθυσμό, 2) ο αριθμός των γονιδίων που ελέγχουν την ανθεκτικότητα, 3) ο βαθμός κυριαρχίας των γονιδίων ανθεκτικότητας, 4) ο τρόπος κληρονόμησης των γονιδίων ανθεκτικότητας, 5) ο τρόπος επικονίασης των ζιζανίων, 6) η ικανότητα των ζιζανίων για παραγωγή οργάνων αναπαραγωγής, 7) η προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών έναντι των ευαίσθητων βιοτύπων των ζιζανίων, 8) το απόθεμα οργάνων αναπαραγωγής του ζιζανίου στο έδαφος (seed bank). 5

10 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας Οι σημαντικότεροι παράγοντες που έχουν σχέση με το ζιζανιοκτόνο και επηρεάζουν την ανάπτυξη ανθεκτικών βιοτύπων ζιζανίων είναι 1) η ένταση της δράσης του, 3) η υπολειμματική του διάρκεια, και 3) ο μηχανισμός δράσης του. Οι παράγοντες που σχετίζονται με την εφαρμοζόμενη γεωργική πρακτική και επηρεάζουν σημαντικά την ανάπτυξη ανθεκτικότητας των ζιζανίων είναι 1) η δόση εφαρμογής του ζιζανιοκτόνου, 2) η συχνότητα εφαρμογής του, 3) η χρήση μιγμάτων ζιζανιοκτόνων, 4) η εναλλαγή ζιζανιοκτόνων στον ίδιο αγρό, 5) η συνδυασμένη χρήση εναλλακτικών μεθόδων αντιμετώπισης, 6) το εφαρμοζόμενο σύστημα αμειψισποράς των καλλιεργειών, και 7) ο τρόπος κατεργασίας του εδάφους. Η έναρξη εμφάνισης της ανθεκτικότητας σε ένα πληθυσμό ζιζανίων εξαρτάται κυρίως από τη συχνότητα των γονιδίων ανθεκτικότητας, την προσαρμοστικότητα και την ανταγωνιστική ικανότητα των ανθεκτικών ατόμων, την αρχική πυκνότητα των ζιζανίων και από την ένταση και τη διάρκεια της πίεσης επιλογής που ασκείται από τα ζιζανιοκτόνα (Maxwell και Mortimer, 1994). Ειδικότερα, σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας έχει η συχνότητα με την οποία εμφανίζονται οι ανθεκτικοί βιότυποι στον αρχικό πληθυσμό, η επαναλαμβανόμενη χρήση του ίδιου ζιζανιοκτόνου σε ευρεία περιοχή, η μη χρήση ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό μηχανισμό-τρόπο δράσης και η χρήση πολύ δραστικών ζιζανιοκτόνων (υψηλή ένταση επιλογής) και ζιζανιοκτόνων με μεγάλη υπολειμματική διάρκεια (με διάρκεια επιλογής) Ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS Ένα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα στην ιστορία της επιστήμης της Ζιζανιολογίας ήταν η ανακάλυψη των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης της οξικογαλακτικής συνθάσης (ALS ή AHAS), αφού αυτά συνέβαλαν καθοριστικά στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε πολλές καλλιέργειες και μάλιστα με την μικρότερη επιβάρυνση στον άνθρωπο και στο περιβάλλον (Tranel και Wright, 22; Καλούμενος, 29). Το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση αποτελεί τη θέση δράσης των σουλφονυλουριών (Chaleff και Mauvais, 1984), των ιμιδαζολινόνων (IMIs) (Shaner κ.ά., 1984), των τριαζολοπυριμιδινών (TPs) (Gerwick κ.ά., 199), των πυριμιδινυλoθειοβενζοϊκών (PTBs) (Stidham, 1991) και των σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινονών (Ελευθεροχωρινός, 28). Συγκεκριμένα, το 6

11 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας ένζυμο αυτό καταλύει δύο παράλληλες αντιδράσεις κατά τη βιοσύνθεση των αμινοξέων (με διακλαδισμένη αλυσίδα άνθρακα) βαλίνη, λευκίνη και ισολευκίνη (Umbarger, 1978). Πιο αναλυτικά, το ALS καταλύει την συμπύκνωση δύο μορίων πυροσταφυλικού οξέος σε ακέτυλο-γαλακτικό οξύ, το οποίο αποτελεί την πρόδρομη ουσία για το σχηματισμό των αμινοξέων λευκίνη και βαλίνη, και την έκλυση CO 2. Επίσης, καταλύει και την αντίδραση μεταξύ πυροσταφυλικού οξέος και κετοβουτυρικού οξέος από όπου παράγεται η πρόδρομος ένωση για τη βιοσύνθεση της ισολευκίνης (Devine κ.ά., 1993). Η αναστολή της βιοσύνθεσης των τριών παραπάνω αμινοξέων έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταροδιαίρεσης εντός ολίγων ημερών από την απορρόφηση των ζιζανιοκτόνων από τα φυτά. Τα συμπτώματα της αναστολής του ALS εμφανίζονται λίγες μέρες μετά την μετακίνηση της δραστικής ουσίας στους μεριστωματικούς ιστούς, ενώ ο θάνατος των φυτών επέρχεται μετά από 1-4 βδομάδες (Ελευθεροχωρινός, 28). Αυτά τα ζιζανιοκτόνα χρησιμοποιούνται σε πολύ χαμηλές δόσεις (g/στρέμμα) και μάλιστα συνέβαλαν σημαντικά στη μείωση της ποσότητας των ζιζανιοκτόνων που χρησιμοποιούνται παγκοσμίως (Bellinder κ.ά., 1994). Η σημαντικότερη οικογένεια αυτής της ομάδας ζιζανιοκτόνων είναι οι σουλφονυλουρίες. Ο βασικός χημικός τύπος της οικογένειας αυτής αποτελείται από μια αρυλο-ομάδα, τη σουλφονυλουρική γέφυρα και μια ετεροκυκλική αρωματική ομάδα (Σχήμα 2.1). Η πρώτη δραστική ουσία της ομάδας των σουλφονυλουριών ανακαλύφθηκε στα εργαστήρια της Du Pont το Δέκα χρόνια αργότερα, η ομάδα αυτήν των ζιζανιοκτόνων περιελάμβανε 23 δραστικές ουσίες, από τις οποίες οι 169 (74%) είχαν αναπτυχθεί στα εργαστήρια της Du Pont. Το chlorsulfuron ήταν το πρώτο ζιζανιοκτόνο της ομάδας αυτής που πήρε έγκριση κυκλοφορίας στις ΗΠΑ και στη Μ. Βρετανία το 1982, ενώ στη χώρα μας εγκρίθηκε το 1985 (Ελευθεροχωρινός, 28). Οι αγρότες εδώ και 25 χρόνια προτιμούν αυτήν την ομάδα καθώς είναι αποτελεσματική εναντίον πολλών πλατύφυλλων αλλά και ορισμένων αγρωστωδών ζιζανίων, αλλά και λόγω της χαμηλής δόσης εφαρμογής, της μεγάλης υπολειμματικής διάρκειας, της εκλεκτικότητας και της χαμηλής τοξικότητας στα φυτά (Saari κ.ά., 1994, Mazur and Falco, 1989). Αυτά τα ζιζανιοκτόνα εφαρμόζονται σε δόσεις 1-1 φορές μικρότερες από ότι τα περισσότερα από τα ήδη χρησιμοποιούμενα. Βέβαια, ο χρόνος παραμονής μερικών σουλφονυλουριών (chlorsulfuron, metsulfuron, triasulfuron) στο 7

12 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας έδαφος, αν και οι συνιστώμενες δόσεις τους είναι πολύ χαμηλές (1-2 g δ.ο/στρ.), είναι συχνά μεγαλύτερος από 12 μήνες (Ελευθεροχωρινός, 28). Σχήμα 2.1. Χημικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας των σουλφονυλουριών. Ο εφησυχασμός των περισσοτέρων παραγωγών εξαιτίας της αποτελεσματικής αντιμετώπισης των ζιζανίων με τη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων και ιδιαίτερα η εμμονή τους για συνεχή και μη εναλλασσόμενη (με ζιζανιοκτόνα διαφορετικού μηχανισμού δράσης) χρήση τους αύξησε την πιθανότητα ανάπτυξης βιοτύπωνπληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Tranel και Wright, 22; Καλούμενος, 29). Έτσι, η πρώτη καταγραφή ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ενζύμου ALS έγινε στις ΗΠΑ πέντε χρόνια μετά τη χρήση τους (Preston και Mallory-Smith, 21; Καλούμενος, 29). Ακολούθως, η ανάπτυξη νέων ανθεκτικών βιοτύπων-πληθυσμών ήταν ταχύτατη με αποτέλεσμα να έχουν καταγραφεί παγκοσμίως μέχρι σήμερα 334 περιπτώσεις ανθεκτικότητας σε 17 είδη ζιζανίων, τα οποία υπερβαίνουν σε αριθμό το 5% όλων των ειδών (194) που ανέπτυξαν ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα (Heap, 21). Τα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύμου ALS, σύμφωνα με τα διεθνή δεδομένα, ξεπέρασαν όλες τις άλλες κατηγορίες ζιζανιοκτόνων στον αριθμό ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους-πληθυσμούς. Αυτό συνέβη επειδή η χρήση τους για 5 μόνο χρόνια ήταν αρκετή για επιλογή βιότυπων-πληθυσμών με ανθεκτικό ALS ένζυμο. Ειδικότερα, μετά από πεντάχρονη, συνεχή χρήση του chlorsulfuran καταγράφηκαν ανθεκτικοί βιότυποι-πληθυσμοί των ζιζανίων Lactuca serriola (Mallory-Smith κ.ά., 199) και Kochia scoparia (Priminiani κ.ά., 199). Η ανάπτυξη νέων βιοτύπωνπληθυσμών ζιζανίων ανθεκτικών σε ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ALS ενζύμου ήταν 8

13 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας ραγδαία τα χρόνια που ακολούθησαν την εφαρμογή τους. Έτσι, το 1996, 14 χρόνια από τη χρήση των ζιζανιοκτόνων αυτής της ομάδας και εννέα από την καταγραφή των πρώτων ανθεκτικών βιοτύπων, τα είδη ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους-πληθυσμούς στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της δράσης του ALS ενζύμου υπερέβησαν σε αριθμό τα είδη των ζιζανίων με ανθεκτικούς βιότυπους στις υπόλοιπες ομάδες των ζιζανιοκτόνων (Tranel και Wright, 22; Καλούμενος, 29; Heap, 21). Η ανάπτυξη των ανθεκτικών βιότυπων-πληθυσμών οφείλεται κυρίως στην τροποποίηση της θέσης δράσης (ALS) και δευτερευόντως στην παρουσία ενζύμων μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων. Γενικώς, ο μεταβολισμός του ζιζανιοκτόνου χαρακτηρίζεται από μικρού μεγέθους ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα με διαφορετικό τρόπο δράσης (Hall κ.ά., 1994). Παράδειγμα εμφάνισης ανθεκτικών βιoτύπων λόγω μεταβολισμού του ζιζανιοκτόνου αποτελεί το ζιζάνιο Lolium rigidum, όπου ο αυξημένος μεταβολισμός επιλέχθηκε από ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ACCasse ενζύμου (Christopher κ.ά., 1991; Cotterman και Saari, 1992; Holtum κ.ά., 1991). Επίσης, ένα ακόμη σημαντικό παράδειγμα, με διαφορετικό μηχανισμό-τρόπο δράσης, είναι το ζιζάνιο Alopecurus myosuroides, όπου ο αυξημένος μεταβολισμός επιλέχθηκε από ζιζανιοκτόνα αναστολείς του φωτοσυστήματος ΙΙ (Kemp κ.ά., 199; Moss και Cussans, 1991). Αξίζει να αναφερθεί ότι οι βιότυποι αυτοί είναι ανθεκτικοί και στις σουλφονυλουρίες παρά το γεγονός ότι αυτά τα ζιζανιοκτόνα δεν είχαν χρησιμοποιηθεί στην περιοχή αυτή. Τα όσα προαναφέρθηκαν δείχνουν ότι η μειωμένη ευαισθησία του ενζύμουστόχου ALS λόγω τροποποίησης του γονιδίου χαρακτηρίζει την ανθεκτικότητα των περισσοτέρων βιοτύπων-πληθυσμών. Το ένζυμο ALS, αν και δρα στα πλαστίδια, εκφράζεται από γονίδιο του πυρήνα που ακολουθεί τη μενδελική κληρονομικότητα. Τα ανθεκτικά (R) ALS αλληλόμορφα κληρονομούνται (μεταφέρονται) μέσω της γύρης και του ως εκ τούτου παραγόμενου σπόρου. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις χλωροτριαζίνες, όπου η ανθεκτικότητα κληρονομείται μόνο από το σπόρο αφού το γονίδιο που κωδικοποιεί τη θέση-στόχο (D1 πρωτεΐνη) είναι πλαστιδικό (Souza- Machado κ.ά., 1978). Το γεγονός ότι η ανθεκτικότητα λόγω ανθεκτικού ενζύμου οφείλεται σε κυρίαρχο γονίδιο που κωδικοποιείται στον πυρήνα, αυτό έχει ως συνέπεια τον ταχύ ρυθμό ανάπτυξης ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ενζύμου ALS και τη μεγάλη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών βιοτύπων-πληθυσμών αφού τα ομοζύγωτα και τα ετεροζύγωτα ως προς το κυρίαρχο γονίδιο είναι ανθεκτικά και 9

14 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας επιλέγονται από τα ζιζανιοκτόνα (Foes κ.ά., 1999; Hart κ.ά., 1993; Sebastian κ.ά., 1989). Οι σημειακές γονιδιακές μεταλλάξεις (νουκλεοτίδια) που τροποποιούν τη δομή του ενζύμου (τροποποίηση στην αλληλουχία των αμινοξέων) είναι η αιτία για τη μικρότερη ευαισθησία (μεγαλύτερη ανθεκτικότητα) του ενζύμου μετά την εφαρμογή ζιζανιοκτόνων που αναστέλλουν τη δράση του (Saari κ.ά., 1994; Devine και Eberlein, 1997). Οι περισσότερες σημειακές μεταλλάξεις του ενζύμου ALS έγιναν στο αμινοξύ προλίνη (Pro197) και προσδίδουν υψηλό ποσοστό ανθεκτικότητας στις σουλφονυλουρίες. Μέχρι τώρα, έχουν καταγραφεί 27 μεταλλάξεις του ALS ενζύμου στο αμινοξύ προλίνη σε 15 είδη ζιζανίων που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (Heap, 21). H αντικατάσταση της προλίνης 197 από το αμινοξύ θρεονίνη έδωσε ανθεκτικότητα σε δύο βιότυπους Lactuca serriola στις σουλφονυλουρίες στη Βόρεια Αυστραλία, χωρίς να μειώσει την ενζυμική δράση του ALS ενζύμου (Preston κ.ά., 25). Το αμινοξύ προλίνη 197 αντικαταστάθηκε και από τα αμινοξέα ιστιδίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, γλουταμίνη και σερίνη, προσδίδοντας σε βιοτύπους-πληθυσμούς υψηλή ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες. Αξίζει να αναφερθεί ότι η αντικατάσταση της αλανίνης 25 από ασπαρτικό οξύ και της τρυπτοφάνης 574 από λευκίνη προσέδωσαν επίσης υψηλή ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες (Devine και Shukla, 2). Η ανθεκτικότητα των φυτών συχνά οφείλεται και στην αυξημένη δράση των ενζύμων μεταβολισμού (ταχύς ρυθμός μεταβολισμού) των ζιζανιοκτόνων. Συγκεκριμένα, η ανθεκτικότητα του καλαμποκιού (Zea mays) στο rimsulfuron οφείλεται στην ικανότητα των ενζύμων του καλαμποκιού να μεταβολίσουν το rimsulfuron ταχέως (διάρκεια ημιζωής μικρότερης της 1 ώρας), ενώ τα ευαίσθητα Sorghum halepense, Amaranthus retroflexus και Digitaria sanguinalis μεταβολίζουν το rimsulfuron με βραδύτερο ρυθμό (διάρκεια ημιζωής 38, 48 και 27 ώρες, αντίστοιχα) (Koeppe κ.ά., 1999). Επίσης, ο ανθεκτικός βιότυπος Lolium rigidum βρέθηκε ότι μεταβολίζει το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron με διπλάσιο ρυθμό από ότι ένας άλλος ευαίσθητος βιότυπος (Christopher κ.ά., 1991). Αναλυτικότερα, 6 ώρες ήταν αρκετές για τον ανθεκτικό βιότυπο να μεταβολίσει το 5% του chlorsulfuran, ενώ ο ευαίσθητος βιότυπος χρειάστηκε 12 ώρες. Το ίδιο συνέβη και με το σιτάρι, που είναι ανεκτικό στο 1

15 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας chlorsulfuron, αφού για να μεταβολίσει το 5% του συγκεκριμένου ζιζανιοκτόνου ήταν αρκετές μόνο 2 ώρες. Τα ένζυμα που καταλύουν αντιδράσεις μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνωναναστολέων του ALS ενζύμου είναι και οι μονοοξυγονάσες (Cyt P45). Η δράση αυτών των ενζύμων αναστέλλεται από ορισμένα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα. Ειδικότερα, η εφαρμογή του εντομοκτόνου malathion σε ένα ανθεκτικό βιότυπο Lolium rigidum, λόγω μεταβολισμού του ζιζανιοκτόνου chlorsulfuron, ανέστειλε την καταλυτική δράση των μονοοξυγενασών P45 με αποτέλεσμα την νέκρωση του ανθεκτικού βιότυπου (Christopher κ.ά., 1994; Preston κ.ά., 1996). Επίσης, το οργανοφωσφορικό εντομοκτόνο terbufos ανέστειλε τη δράση των μονοοξυγενασών στα φυτά του αραβοσίτου με αποτέλεσμα την εκδήλωση τοξικότητας μετά την εφαρμογή των σουλφονυλουριών (Baerg κ.ά., 1996) Ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ACCase ενζύμου Τα ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύμου καρβοξυλάση του ακέτυλο-συνένζυμου Α (ACCase) αποτελούν και αυτά μια άλλη σημαντική ομάδα (από εμπορικής πλευράς), αφού είναι πολύ αποτελεσματικά και εκλεκτικά μεταφυτρωτικά αγρωστωδοκτόνα. Τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν το ένζυμο αυτό ανήκουν στα αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά οξέα (-fops), στις κυκλοεξανδιόνες (-dims) και στις φαινυλοπυραζολίνες (-denς) (Ελευθεροχωρινός, 28). Αναλυτικότερα, το ACCase ένζυμο καταλύει τη συμπύκνωση του ακέτυλο-coa με το CO 2 και παράγεται το μηλόνυλο-coa, ουσία πρόδρομη για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων με άτομα C. Το ACCase είναι ένα σύνθετο ένζυμο με τρεις ενεργές περιοχές, δηλαδή την περιοχή του καρβοξυμεταφορέα της βιοτίνης, την ATP-εξαρτώμενη καρβοξυλάση της βιοτίνης και την καρβοξυτρανσφεράση. Το ένζυμο αυτό αφού καρβοξυλιωθεί (παρουσία CO 2 και ATP) μεταφέρει την καρβοξυλική ομάδα στο ακετυλο-coa για να σχηματιστεί το μηλόνυλο- CoA. Μεγάλες ποσότητες από μηλόνυλο-coa είναι απαραίτητες στα πλαστίδια των φυτών για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων αλλά και στο κυτόπλασμα για την πραγματοποίηση πολλών άλλων αντιδράσεων, όπως τη βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών (π.χ. φλαβονοειδή, ανθοκυάνες) και την επιμήκυνση της μεγάλης αλυσίδας λιπαρών οξέων (Ηarwood, 1988). 11

16 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας Τα ζιζανιοκτόνα αυτής της ομάδας απορροφούνται κυρίως από τα φύλλα και μετακινούνται ταχύτατα δια μέσου του συμπλάστη και του αποπλάστη στους υπέργειους και υπόγειους μεριστωματικούς ιστούς των φυτών. Οι κυκλοεξανδιόνες και τα αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά οξέα συμπεριφέρονται στο έδαφος ως ασθενή οξέα. Η προσρόφησή τους στα κολλοειδή του εδάφους δεν είναι ισχυρή και γι αυτό η πιθανότητα έκπλυσής τους είναι μεγάλη. Αντίθετα, οι φαινυλοπυραζολίνες (pinoxaden) συμπεριφέρονται στο έδαφος ως μη ιονιζόμενα μόρια. Η δράση τους εκδηλώνεται λίγες μέρες μετά την εφαρμογή τους, ενώ ο θάνατος των φυτών επέρχεται μετά από 2-3 βδομάδες (Ελευθεροχωρινός, 28). Η ανάπτυξη ανθεκτικών βιοτύπων σε ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν το ένζυμο καρβοξυλάση του ακέτυλο-συνενζύμου Α (ACCase) οφείλεται κυρίως στην τροποποίηση της θέσης δράσης (ACCase) και δευτερευόντως στο μεταβολισμό του ζιζανιοκτόνου. Ειδικότερα, το ζιζάνιο Alopecurus myosuroides είναι αυτό που έχει μελετηθεί περισσότερο σε βιοχημικό και μοριακό επίπεδο και για το οποίο έχει βρεθεί ο μεγαλύτερος αριθμός μεταλλάξεων στο ACCase ένζυμο (Delye κ.ά., 22a, 22b; Moss κ.ά., 23). Η ανθεκτικότητα των βιοτύπων που σχετίζεται με το ένζυμο αυτό βρέθηκε ότι οφείλεται ή στην αυξημένη δράση της ευαίσθητης μορφής του ενζύμου ACCase ή στην αδυναμία σύνδεσής του (ανθεκτικό ένζυμο) με τα προαναφερθέντα ζιζανιοκτόνα. Ειδικότερα, η ανθεκτικότητα ενός βιότυπου Eleusine indica σε ζιζανιοκτόνα-αναστολείς του ενζύμου ACCase οφειλόταν σε τροποποίηση-μετάλλαξη της θέσης δράσης (Leach κ.ά., 1995). Επίσης, ένας βιότυπος Setaria viridis στον Καναδά (Marles κ.ά., 1993) και ένας βιότυπος Setaria faberi (Shukla κ.ά., 1997) ήταν ανθεκτικοί στις κυκλοεξανδιόνες λόγω ανθεκτικού ACCase. Η προκαρυωτική μορφή του ενζύμου ACCase βρίσκεται στα πλαστίδια των δικότυλων φυτών (πλατύφυλλα) και είναι ανθεκτική στη δράση των προαναφερθέντων ζιζανιοκτόνων. Αντίθετα, η ευκαρυωτική μορφή της ACCase βρίσκεται στα πλαστίδια των μονοκότυλων φυτών (αγρωστώδη) και είναι ευαίσθητη στη δράση αυτών των ζιζανιοκτόνων. Το γονίδιο που κωδικοποεί το πλαστιδιακό ACCase ένζυμο είναι γονίδιο πυρήνα και μεταφέρεται ως εκ τούτου μέσω της γύρης και του σπόρου. Αξίζει να αναφερθεί ότι η ανθεκτικότητα των ζιζανίων Avena spp. (Kibite κ.ά., 1995), Alopecurus myosuroides (Letouze και Gasquez, 21), Setaria italica (Wang και Darmency, 1998), Lolium rigidum (Tal και Rubin, 24; Tardif κ.ά., 1996), Avena fatua 12

17 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας (Murray κ.ά., 1995), Lolium multiflorum (Betts κ.ά., 1992) και Setaria faberi (Volenberg και Stoltenberg, 22) οφείλεται σε ανθεκτικό ACCase. Βέβαια, θα πρέπει να τονιστεί ιδιαιτέρως ότι η ανθεκτικότητα του ACCase ενζύμου οφείλεται σε μερικώς κυρίαρχο γονίδιο με αποτέλεσμα όλα τα ομόζυγα και ετερόζυγα φυτά για την ACCase ανθεκτικότητα να επιβιώνουν μετά από εφαρμογή των συνιστώμενων δόσεων των ζιζανιοκτόνων. Ο μεταβολισμός των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων του ACCase ενζύμου στα ανθεκτικά φυτά συμπεριλαμβάνει αρχικά οξείδωση και ακολούθως σχηματισμό συμπλόκων. Βέβαια, στις κυκλοεξανδιόνες υπάρχουν περιπτώσεις ανάπτυξης ανθεκτικότητας που οφείλεται σε αυξημένη δράση των ενζύμων μεταβολισμού τους. Αξίζει να αναφερθεί ότι η δράση των αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκών ζιζανιοκτόνων εναντίον των αγρωστωδών ζιζανίων οφείλεται στην ταχύτερη υδρόλυση του εστέρα σε οξύ (ενεργός μορφή) (Cummins και Edwards, 24; Hill κ.ά., 1978; Jeffcoat και Harries, 1973), η οποία όμως δεν ακολουθείται από περαιτέρω μεταβολισμό (Shimabukuro κ.ά., 1979). Τα ένζυμα μονοοξυγονάσες CytP45 έδειξαν ότι εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων λόγω μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων αναστολέων του ACCase ενζύμου. Αξίζει να αναφέρουμε ότι και τα ένζυμα γλυκοζυλτρανσφεράσες (GT) βρίσκονται μεταξύ των ενζύμων που λαμβάνουν μέρος στη δεύτερη φάση μεταβολισμού των αναστολέων της ACCase και είναι αυτές που καταλύουν την Ο- γλυκοζυλίωση των υδροξυλιωμένων μορίων από τη δράση των CytP45. Η ήρα (Lolium rigidum) θεωρείται ως ένα από τα πιο κοινά, ετήσια, χειμερινά αγρωστώδη ζιζάνια που απαντώνται σε καλλιεργούμενες και ακαλλιέργητες εκτάσεις σε όλη τη χώρα. Είναι φυτό σταυρογονιμοποιούμενο και, σύμφωνα με τα προαναφερθέντα, έχει μεγάλη πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικών βιοτύπων σε συνθήκες υψηλής έντασης και μεγάλης διάρκειας πίεσης επιλογής. Ειδικότερα, ανθεκτικοί Lolium rigidum βιότυποι-πληθυσμοί στις σουλφονυλουρίες (ζιζανιοκτόνα με υψηλή ένταση και μεγάλη διάρκεια πίεση επιλογής) έχουν καταγραφεί στην Αυστραλία, ενώ ανθεκτικοί βιότυποι στις κυκλοεξανδιόνες στην Αυστραλία, στη Σαουδική Αραβία, Βόρεια Αφρική και στη Χιλή (Heap, 21). 13

18 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας Ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του EPSPS ενζύμου Το glyphosate (άλας με ισοπροπυλαμίνη) και το sulfosate (γνωστό και ως glyphosate trimesium, είναι το άλας του glyphosate με τριμεθυλσουλφώνιο) είναι τα δύο ζιζανιοκτόνα που ανήκουν στην οικογένεια των γλυκινών (παράγωγα του φωσφονικού οξέος) και αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου EPSPS. Ειδικότερα, ο μηχανισμός δράσης του glyphosate σχετίζεται με την αναστολή της δράσης του ενζύμου συνθάση του 5-ενολοπυροσταφυλικού-σικιμικού-3-φωσφορικού (EPSPS, 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase). Το ένζυμο EPSPS κωδικοποιείται εντός του πυρήνα των κυττάρων και στη συνέχεια μεταφέρεται, με τη βοήθεια ενός πεπτιδίου-μεταφορέα (CTP, chloroplast transit peptide), εντός των χλωροπλαστών όπου συμμετέχει στη βιοσύνθεση των τριών αρωματικών αμινοξέων τυροσίνης, τρυπτοφάνης και φαινυλαλανίνης (Devine κ.ά., 1993). Ειδικότερα, το EPSPS ένζυμο καταλύει την αντίδραση συμπύκνωσης μεταξύ των μορίων σικιμικό-3-φωσφορικό οξύ (S-3-P) και φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ (PEP) με τελικό προϊόν το ενολοπυροσταφυλικοσικιμικό-3-φωσφορικό οξύ (EPSP) και ανόργανο φώσφορο. Η χρήση του glyphosate για περισσότερο από 35 έτη συνέβαλε στην ανάπτυξη 99 ανθεκτικών βιοτύπων που ανήκουν σε 19 είδη αγρωστωδών και πλατύφυλλων ζιζανίων. Ο μηχανισμός ανθεκτικότητας των περισσότερων ανθεκτικών βιοτύπων δεν έχει προσδιοριστεί επακριβώς ακόμη (Heap, 21). Βέβαια, η μελέτη όμως ενός βιότυπου ελευσίνης (Eleusine indica) από τη Μαλαισία έδειξε ότι η ανθεκτικότητά του στο glyphosate οφείλεται σε ανθεκτικό EPSPS ένζυμο (συνθάση του 5- ενολοπυροσταφυλοσικιμικού-3-φωσφορικού), το οποίο εκφράζεται εντός του πυρήνα και μεταφέρεται μέσω ενός πεπτιδίου-μεταφορέα εντός των χλωροπλαστών όπου δρα. Υπενθυμίζεται ότι το EPSPS είναι το ένζυμο κλειδί κατά τη βιοσύνθεση των αρωματικών αμινοξέων τυροσίνη, τρυπτοφάνη και φαινυλαλανίνη (Preston και Mallory-Smith, 21; Ng κ.ά., 24; Pline-Srnic, 26; Powles και Preston, 26). Η πρωτεϊνική εξέταση αυτού του βιότυπου έδειξε ότι η ανθεκτικότητα του EPSPS ενζύμου οφειλόταν σε αντικατάσταση του αμινοξέος προλίνη (Pro) στη θέση 16 από σερίνη (Ser) (Pro16-Ser). Η πρωτεϊνική εξέταση ενός άλλου ανθεκτικού στο glyphosate βιότυπου ελευσίνης (Eleusine indica) από τη Μαλαισία έδειξε ότι το αμινοξύ προλίνη (Pro) στη θέση 16 του EPSPS ενζύμου είχε αντικατασταθεί από 14

19 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας θρεονίνη (Thr) (Pro16-Thr) (Ng κ.ά., 24; Pline-Srnic, 26). Επίσης, η έρευνα των Wakelin και Preston (26) έδειξε ότι η ανθεκτικότητα στο glyphosate κάποιου βιότυπου ήρας λεπτής (Lolium rigidum) από την Αυστραλία οφειλόταν σε ανθεκτικό EPSPS ένζυμο και μάλιστα στην ίδια αντικατάσταση αμινοξέος (Pro16-Thr). Η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro16 από Ser ή Thr, σύμφωνα με τις ίδιες πηγές, δεν επιτρέπει τη σύνδεση-πρόσδεση του ενζύμου EPSPS με το glyphosate και ως εκ τούτου παρέχει στους βιότυπους αυτού του ζιζανίου 3-1πλάσια ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο ζιζανιοκτόνο. Μελέτες κληρονόμησης της ανθεκτικότητας των βιοτύπων ελευσίνης (Eleusine indica) στο glyphosate έδειξαν ότι η ανθεκτικότητα του (λόγω ανθεκτικού ενζύμου EPSPS) ελέγχεται από ένα κυρίαρχο αλληλόμορφο γονίδιο (Ng κ.ά., 24; Pline-Srnic, 26). Η έρευνα των Simarmata και Penner (28) έδειξε ότι η ανθεκτικότητα στο glyphosate ενός βιότυπου ήρας λεπτής (Lolium rigidum) από την Καλιφόρνια οφειλόταν, επίσης, σε ανθεκτικό ένζυμο EPSPS και μάλιστα στην αντικατάσταση του 31 νουκλεοτιδίου [C (κυτοσίνη) σε T (θυμίνη)] και αλλαγή του αμινοξέος Pro σε Ser. Βέβαια, η αντικατάσταση αυτή, σε αντίθεση με τις προηγούμενες αντικαταστάσεις αμινοξέων, παρείχε στο βιότυπο αυτό 91πλάσια ανθεκτικότητα στο glyphosate. Ο προαναφερθείς αριθμός των 19 ανθεκτικών ειδών (99 ανθεκτικοί βιότυποι) στο glyphosate δεν είναι μεγάλος αν ληφθεί υπόψη η μακρόχρονη και ευρεία χρήση του, αλλά και το γεγονός ότι ο μηχανισμός δράσης του είναι απλός και ελέγχεται από ένα γονίδιο υπεύθυνο κωδικοποίησης του ενζύμου EPSPS (Heap, 21; Yu κ.ά., 21). Αυτό βέβαια οφείλεται στη μη επαναλαμβανόμενη και μη συνεχή χρήση του (χαμηλή ένταση επιλογής) λόγω υψηλού κόστους, αλλά και στην απουσία υπολειμματικής διάρκειας (βραχύχρονη διάρκεια πίεσης επιλογής) στο έδαφος. Αξίζει όμως να τονιστεί ιδιαιτέρως ότι οι 94 από τους 99 ανθεκτικούς βιότυπους των 18 ανθεκτικών ειδών ζιζανίων αναπτύχθηκαν μετά το 2, δηλαδή από τότε που άρχισε η καλλιέργεια των γενετικώς τροποποιημένων φυτών με ανθεκτικότητα στο glyphosate σε ευρεία κλίμακα (Heap, 21). Αυτό ήταν αναμενόμενο αφού η καλλιέργεια αυτών των φυτών αύξησε τη χρήση του glyphosate (συχνά διπλή εφαρμογή) και την ως εκ τούτου ένταση και διάρκεια της επιλογής ανθεκτικών βιοτύπων των ζιζανίων (Powles και Preston, 26). Βέβαια, η αυξημένη χρήση του glyphosate στα γενετικώς τροποποιημένα φυτά είχε ως συνέπεια και την αλλαγή της ζιζανιοχλωρίδας, η οποία προέκυψε ως αποτέλεσμα της 15

20 Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας μείωσης των πληθυσμών των ευαίσθητων ζιζανίων (λόγω αντιμετώπισης) και της αύξησης των πληθυσμών των λιγότερο ευαίσθητων ζιζανίων (λόγω μη αποτελεσματικής αντιμετώπισης) (Culpepper, 26) Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη των αιτίων της μη επιτυχούς αντιμετώπισης διαφόρων πληθυσμών της ήρας (Lolium rigidum) και ειδικότερα η διερεύνηση, με πειράματα φυτοδοχείων (φυτά) και πειράματα τριβλίων Petri (σπορόφυτα), της πιθανότητας ανάπτυξης ανθεκτικότητας (απλή ανθεκτικότητα, σταυρανθεκτικότητα ή πολλαπλή ανθεκτικότητα) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron (σουλφονυλουρία), mesosulfuron + iodosulfuron (σουλφονυλουρίες), diclofop (αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά), clodinafop (αρυλοξυφαινοξυαλκανοϊκά), tralkoxydim (κυκλοεξανδιόνη), prosulfocarb (θειοκαρβαμιδικά) και glyphosate (γλυκίνες). 16

21 Πειραματικές Εργασίες 3. Πειραματικές εργασίες 3.1 Διαχείριση φυτικού υλικού Την άνοιξη του 23 έγινε επιτόπια επίσκεψη σε περιοχές με καλλιεργούμενα σιτηρά όπου είχαν αναφερθεί αποτυχίες αντιμετώπισης της ήρας (Lolium rigidum) με τα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron ή tralkoxydim. Ειδικότερα, οι καλλιέργειες των σιτηρών της περιοχής Φιλαδέλφι είχαν δεχτεί κυρίως μεταφυτρωτική εφαρμογή tralkoxydim, ενώ οι καλλιέργειες των σιτηρών της περιοχής Ζαγκλιβέρι και Καλαμωτό είχαν δεχτεί προφυτρωτική εφαρμογή chlorsulfuron για 1 περίπου έτη, αλλά κατά τα τελευταία τρία έτη είχαν δεχτεί προφυτρωτική εφαρμογή chlorsulfuron και μεταφυτρωτική εφαρμογή με tralkoxydim (Πίνακας 3.1.1). Οι άλλοι αγροί είχαν δεχτεί διάφορα ζιζανιοκτόνα για την αντιμετώπιση του ζιζανίου αυτού. Πίνακας Προέλευση αξιολογηθέντων πληθυσμών ήρας του νομού Θεσσαλονίκης. Χωριό Αγρός Ζαγκλιβέρι 1 Ζαγκλιβέρι 2 Καλαμωτό 1 Καλαμωτό 2 Φιλαδέλφι 2 Φιλαδέλφι 3 Φιλαδέλφι 4 Αγρόκτημα ΑΠΘ (ευαίσθητος) Η επιτόπια επίσκεψη αποσκοπούσε στον εντοπισμό αγρών με φυτά ήρας (πληθυσμός) που είχαν επιζήσει ακόμη και μετά από εφαρμογή διπλάσιων από τις συνιστώμενες δόσεις των παραπάνω ζιζανιοκτόνων. Τον Ιούνιο του ιδίου έτους (23) και πριν τη συγκομιδή των σιτηρών, σπόροι από φυτά των προαναφερθέντων βιοτύπων Lolium rigidum συλλέχθηκαν από οκτώ αγρούς σκληρού σιταριού (Triticum turgidum) του νομού Θεσσαλονίκης (Πίνακας 3.1.1). Σπόρος ευαίσθητου πληθυσμού ήρας (μάρτυρας) συλλέχθηκε από περιοχές του Αγροκτήματος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, όπου δεν είχε γίνει εφαρμογή ζιζανιοκτόνων-αναστολέων των ενζύμων ALS ή/και ACCase. Οι σπόροι 17

22 Πειραματικές Εργασίες όλων των πληθυσμών τοποθετήθηκαν σε χάρτινες σακούλες και αποθηκεύτηκαν στο ψυγείο μέχρι να χρησιμοποιηθούν στις διάφορες πειραματικές εργασίες. 3.2 Πειράματα φυτοδοχείων Υλικά και μέθοδοι Πραγματοποιήθηκαν δύο παρόμοια πειράματα στο Αγρόκτημα του Πανεπιστημίου για τη διερεύνηση οκτώ πληθυσμών ήρας ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης σταυροανθεκτικότητας και πολλαπλής ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα mesosulfuron + iodosulfuron, diclofop, clodinafop και glyphosate. Τα δύο πειράματα έγιναν σε φυτοδοχεία όγκου 3 dm που γεμίστηκαν με μίγμα έδαφος:άμμος 1:1. Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκαν 1 σπόροι ήρας στην επιφάνεια του εδαφικού μίγματος και ακολούθως καλύφθηκαν με το ίδιο μίγμα πάχους 1 cm. Όλα τα φυτοδοχεία τοποθετήθηκαν σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήματος. Η σπορά των δύο πειραμάτων έγινε στις 19/1/7 και στις 9/2/7, ενώ στις 2/1/7 και 13/2/7 έγινε η προφυτρωτική εφαρμογή μίας επέμβασης με chlorsulfuron (Glean 75 WG) (1,5 g δ.ο./στρ) και μίας επέμβασης με prosulfocarb (Boxer 8 EC) (32 g δ.ο./στρ) (Πίνακας 3.2.1). Στις 22/3/7 και στις 1/4/7 έγινε και η μεταφυτρωτική εφαρμογή (φυτά με 4-6 φύλλα, έναρξη του αδελφώματος) μίας επέμβασης με tralkoxydim (Grasp 25 SC) (37,5 g δ.ο./στρ), τριών επεμβάσεων του mesosulfuron + iodosulfuron (Hussar maxx WG) (η συνιστώμενη των,75 g δ.ο./στρ, η τετραπλάσια των 3 g δ.ο./στρ και η οκταπλάσια των 6 g δ.ο./στρ), τριών επεμβάσεων του diclofop (Illoxan 28 EC) (η συνιστώμενη των 71 g δ.ο./στρ, η τετραπλάσια των 284 g δ.ο./στρ και η οκταπλάσια των 568 g δ.ο./στρ), τριών επεμβάσεων του clodinafop (Topik 24 EC) (η συνιστώμενη των 6,5 g δ.ο./στρ, η τετραπλάσια των 26 g δ.ο./στρ και η οκταπλάσια των 52 g δ.ο./στρ) και τριών επεμβάσεων του glyphosate (Touchdown Premium 36 SL) (η συνιστώμενη των 63 g δ.ο./στρ, η τετραπλάσια των 252 g δ.ο./στρ και η οκταπλάσια των 54 g δ.ο./στρ). Και στα δύο πειράματα υπήρχε επέμβαση με αψέκαστο μάρτυρα (Πίνακας 3.2.1). Η κάθε επέμβαση είχε τρεις επαναλήψεις (φυτοδοχεία). Η εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων έγινε με φορητό ψεκαστήρα ακρίβειας ΑΖΟ ( ράμπα μήκους 2,4 m των 6 (82) μπεκ) και πίεση 25 kpa. Ο όγκος του ψεκαστικού υγρού ήταν 3 lt/στρ. Τα φυτοδοχεία αρδεύονταν όποτε ήταν αναγκαίο, ενώ δύο φορές την εβδομάδα γινόταν διαφυλλική εφαρμογή λιπάσματος (Bayfolan, ). Τέσσερις εβδομάδες από την 18

23 Πειραματικές Εργασίες εφαρμογή των μεταφυτρωτικών επεμβάσεων (18/4/7 και 1/5/7, αντίστοιχα, για τα δύο πειράματα), έγινε η πρώτη μακροσκοπική αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των επεμβάσεων (ανάπτυξη των φυτών σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα), ενώ μία με δύο βδομάδες μετά (3/5/7 και 18/5/7) έγινε και η δεύτερη μακροσκοπική αξιολόγηση, ενώ μία με δύο μέρες μετά (5/5/7 και 19/5/7, αντίστοιχα, για τα δύο πειράματα) έγινε προσδιορισμός του χλωρού βάρους των φυτών που επιβίωσαν και εκφράστηκε ως % των φυτών του αψέκαστου μάρτυρα. Πίνακας Υπό εξέταση ζιζανιοκτόνα και εφαρμοζόμενες δοσολογίες δραστικής ουσίας. Ζιζανιοκτόνο Δραστική ουσία Δόση Δραστική ουσία (g δ.ο./στρ) Μάρτυρας Glean 75 WG Chlorsulfuron 75% 1x 1,5 Boxer 8 EC Prosulfocarb 8% 1x 32, Grasp 25 SC Tralkoxydim 25% 1x 37,5 Hussar Maxx WG 1x,75 Iodosulfuron-methyl 3% + 4x 3, mesosulfuron-methyl 3% 8x 6, 1x 71, Illoxan 28 EC Diclofop-methyl 28,4% 4x 284, 8x 568, 1x 6,5 Topik 24 EC Clodinafop-propargyl 24% 4x 26, 8x 52, 1x 63, Touchdown Glyphosate 36% 4x 252, Premium 36 SL 8x 54, Χρησιμοποιήθηκε το πλήρως τυχαιοποιημένο 8 x 16 παραγοντικό σχέδιο (8 πληθυσμοί ήρας x 16 επεμβάσεις ζιζανιοκτόνων). Ο κάθε συνδυασμένος παράγοντας (πληθυσμός x επεμβάσεις) είχε 3 επαναλήψεις. Για την ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα MSTAT. 19

24 Πειραματικές Εργασίες Αποτελέσματα Μακροσκοπική αξιολόγηση Η ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι η συνιστώμενη δόση του chlorsulfuron (1,5 g δ.ο./στρ) δεν επηρέασε την ανάπτυξη των πληθυσμών Ζαγκλιβέρι 1, Ζαγκλιβέρι 2, Καλαμωτό 1, Καλαμωτό 2, Φιλαδέλφι 3 και Φιλαδέλφι 4 στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση, αφού η μείωση στην ανάπτυξη των φυτών κυμάνθηκε από έως 28% για το πρώτο πείραμα και από μέχρι 22% για το δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.1). Επίσης, στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση η μείωση κυμάνθηκε από έως 22% και από έως 37% για το πρώτο και το δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα (Σχήμα 3.2.2). Αντίθετα, η ανάπτυξη του πληθυσμού Αγρόκτημα μειώθηκε πάνω από 85% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.1, 3.2.2). Τέλος, ο πληθυσμός Φιλαδέλφι 2 παρουσίασε μέση μείωση στην ανάπτυξη των φυτών που κυμάνθηκε από 22 έως 85% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις (Σχήματα 3.2.1, 3.2.2). Χημικοί μάρτυρες (A.1) chlorsulfuron (x1) prosulfocarb (x1) tralkoxydim (x1) ΕΣΔ,5 = 6 Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγ κ. 1 Ζαγ κ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φιλ. 2 Φιλ. 3 Φιλ. 4 Χημικοί μάρτυρες (B.1) chlorsulfuron (x1) prosulfocarb (x1) tralkoxydim (x1) Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγ κ. 1 Ζαγ κ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φιλ. 2 Φιλ. 3 Φιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum (1η μακροσκοπική παρατήρηση, 19/4/7 και 1/5/7) 2

25 Πειραματικές Εργασίες Η εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης του tralkoxydim (37,5 g δ.ο./στρ) επηρέασε την ανάπτυξη των φυτών μόνο του πληθυσμού Αγρόκτημα, καθώς προκάλεσε μείωση μεγαλύτερη από 83% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.1, 3.2.2). Αντίθετα, η ίδια επέμβαση προκάλεσε μείωση στην ανάπτυξη των φυτών των άλλων πληθυσμών μέχρι 35% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις, σε σχέση με τον αψέκαστο μάρτυρα. Χημικοί μάρτυρες (A.2) chlorsulfuron (x1) prosulfocarb (x1) tralkoxydim (x1) ΕΣΔ,5 = 6 Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγ κ. 1 Ζαγ κ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φιλ. 2 Φιλ. 3 Φιλ. 4 Χημικοί μάρτυρες (B.2) chlorsulfuron (x1) prosulfocarb (x1) tralkoxydim (x1) Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγ κ. 1 Ζαγ κ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φιλ. 2 Φιλ. 3 Φιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum (2η μακροσκοπική παρατήρηση, 3/5/7 και 18/5/7). Η συνιστώμενη δόση του prosulfocarb (32 g δ.ο./στρ) μείωσε την ανάπτυξη όλων των πληθυσμών πάνω από 92% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.1, 3.2.2). Η συνιστώμενη δόση του mesosulfuron + iodosulfuron (,75 g δ.ο./στρ) δεν επηρέασε την ανάπτυξη των φυτών των πληθυσμών Ζαγκλιβέρι 2, Καλαμωτό 1 και Καλαμωτό 2, αφού η ανάπτυξη των φυτών στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση μειώθηκε κατά 17, 8 και 7% στο πρώτο πείραμα και κατά 28, 12 και 5% στο δεύτερο 21

26 Πειραματικές Εργασίες πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.3). Επίσης, στη δεύτερη μακροσκοπική, η μείωση στην ανάπτυξη των φυτών κυμάνθηκε από 3 έως 15% στο πρώτο πείραμα και από 2 έως 12% στο δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.4). Αντίθετα, η μείωση στην ανάπτυξη των φυτών των πληθυσμών Αγρόκτημα, Ζαγκλιβέρι 1, Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3 και Φιλαδέλφι 4 κυμάνθηκε από 78 έως 1% και για τα δύο πειράματα κατά την πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση και πάνω από 92% και για τα δύο πειράματα κατά τη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.3, 3.2.4). mesosulfuron + iodosulfuron (A.1) ΕΣΔ,5 = 6 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 mesosulfuron + iodosulfuron (B.1) 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum από την εφαρμογή του mesosulfuron + iodosulfuron (1η μακροσκοπική παρατήρηση, 19/4/7 και 1/5/7) 22

27 Πειραματικές Εργασίες mesosulfuron + iodosulfuron (A.2) ΕΣΔ,5 = 6 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 mesosulfuron + iodosulfuron (B.2) 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum από την εφαρμογή του mesosulfuron + iodosulfuron (2η μακροσκοπική παρατήρηση, 3/5/7 και 18/5/7) Η εφαρμογή της τετραπλάσιας από τη συνιστώμενη δόση του mesosulfuron + iodosulfuron (3 g δ.ο./στρ) μείωσε την ανάπτυξη των φυτών των πληθυσμών Ζαγκλιβέρι 2, Καλαμωτό 1 και Καλαμωτό 2 στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση κατά 72, 8 και 62% στο πρώτο πείραμα και κατά 77, 77 και 65% στο δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.3). Επίσης, στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση η ανάπτυξη των φυτών μειώθηκε κατά 85, 83 και 78% στο πρώτο πείραμα και κατά 8, 8 και 7% στο δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.4). Η ανάπτυξη των πληθυσμών Αγρόκτημα, Ζαγκλιβέρι 1, Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3 και Φιλαδέλφι 4 μειώθηκε και στα δύο πειράματα πάνω από 9% στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση και πάνω από 97% στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.3, 3.2.4). Η εφαρμογή της οκταπλάσιας από τη συνιστώμενη δόση του mesosulfuron + iodosulfuron (6 g δ.ο./στρ) μείωσε την ανάπτυξη των φυτών των επτά πληθυσμών πάνω 23

28 Πειραματικές Εργασίες από 95% και στα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.3, 3.2.4). Αντίθετα, στον πληθυσμό Καλαμωτό 2 και στο δεύτερο πείραμα, η ανάπτυξη των φυτών του μειώθηκε κατά 85% στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση και κατά 78% στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση (Σχήματα 3.2.3, 3.2.4). H συνιστώμενη δόση του diclofop (71 g δ.ο./στρ) μείωσε την ανάπτυξη των φυτών του πληθυσμού Ζαγκλιβέρι 1 στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση κατά 4 και 42% για το πρώτο και δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα (Σχήμα 3.2.5). Η ίδια επέμβαση στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση μείωσε την ανάπτυξη των φυτών κατά 38% στο πρώτο πείραμα και κατά 53% στο δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.6). Αντίθετα, η μείωση της ανάπτυξης των φυτών των πληθυσμών Αγρόκτημα, Ζαγκλιβέρι 2, Καλαμωτό 1, Καλαμωτό 2, Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3 και Φιλαδέλφι 4 κυμάνθηκε από 8 έως 1% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.5, 3.2.6). diclofop (A.1) 1x 4x 8x ΕΣΔ,5 = 6 Ανάπτυξη (% του μάρτυρα Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 diclofop (B.1) 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum από την εφαρμογή του diclofop (1η μακροσκοπική παρατήρηση, 19/4/7 και 1/5/7). 24

29 Πειραματικές Εργασίες Η εφαρμογή της τετραπλάσιας (284 g δ.ο./στρ) και της οκταπλάσιας (568 g δ.ο./στρ) δόσης από τη συνιστώμενη του diclofop μείωσε την ανάπτυξη του πληθυσμού Ζαγκλιβέρι 1 κατά 83 και 93%, αντιστοίχως, αλλά και την ανάπτυξη των φυτών υπόλοιπων πληθυσμών από 95 έως 1% και για τα δύο πειράματα και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.5, 3.2.6). diclofop (A.2) ΕΣΔ,5 = 6 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 diclofop (B.2) 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum από την εφαρμογή του diclofop (2η μακροσκοπική παρατήρηση, 3/5/7 και 18/5/7) Η συνιστώμενη δόση του clodinafop (6,5 g δ.ο./στρ) δεν επηρέασε την ανάπτυξη των πληθυσμών Ζαγκλιβέρι 1 και Ζαγκλιβέρι 2, αφού η μείωση στην ανάπτυξη των φυτών τους και στις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις και για τα δύο πειράματα κυμάνθηκε από 2 έως 32%, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα. Αντίθετα, οι πληθυσμοί Αγρόκτημα, Καλαμωτό 1, Καλαμωτό 2, Φιλαδέλφι 2, Φιλαδέλφι 3 και Φιλαδέλφι 4 παρουσίασαν μείωση της ανάπτυξης των φυτών τους σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα που κυμάνθηκε από 57 έως 97% και για τα δύο πειράματα και για τις δύο μακροσκοπικές παρατηρήσεις (Σχήμα 3.2.7, 3.2.8). 25

30 Πειραματικές Εργασίες clodinafop (A.1) 1x 4x 8x ΕΣΔ,5 = 6 Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 clodinafop (B.1) 1x 4x 8x Ανάπτυξη (% του μάρτυρα) Αγρ. Ζαγκ. 1 Ζαγκ. 2 Καλ. 1 Καλ. 2 Φ ιλ. 2 Φ ιλ. 3 Φ ιλ. 4 Σχήμα Μείωση ανάπτυξης των φυτών οκτώ πληθυσμών Lolium rigidum από την εφαρμογή του clodinafop (1η μακροσκοπική παρατήρηση, 19/4/7 και 1/5/7) Η εφαρμογή της τετραπλάσιας δόσης του clodinafop (26 g δ.ο./στρ) μείωσε την ανάπτυξη των φυτών των πληθυσμών Ζαγκλιβέρι 1 και Ζαγκλιβέρι 2 στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση κατά 73 και 22% στο πρώτο πείραμα και κατά 62 και 8% στο δεύτερο πείραμα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήμα 3.2.7). Αντίθετα, στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση, η μείωση στην ανάπτυξη των φυτών τους κυμάνθηκε από 65 έως 88% και για τα δύο πειράματα για τον πληθυσμό Ζαγκλιβέρι 1 και από 17 έως 2% για τον πληθυσμό Ζαγκλιβέρι 2, αντίστοιχα (Σχήμα 3.2.8). Η μείωση στην ανάπτυξη των φυτών των υπολοίπων πληθυσμών κυμάνθηκε στην πρώτη μακροσκοπική παρατήρηση και στα δύο πειράματα από 73 έως 97%, ενώ στη δεύτερη μακροσκοπική παρατήρηση από 9 έως 1%, σε σύγκριση με τον αψέκαστο μάρτυρα (Σχήματα 3.2.7, 3.2.8). 26