Γενετικά Τροποποιημένοι Οργανισμοί. Γενετικά Τροποποιημένα Φυτά Διαγονιδιακά Φυτά

Transcript

1 Γενετικά Τροποποιημένοι Οργανισμοί Γενετικά Τροποποιημένα Φυτά Διαγονιδιακά Φυτά

2 Wild Relative Crop Plant Wild Relative Crop Plant Conventional Breeding Genetic Engineering

3

4

5

6

7

8

9

10

11 Acceptance of GM food an experiment in six countries

12 Bιοτεχνολογικές εφαρμογές- Α ιαγονιδιακά Φυτά με βελτιωμένα αγρονομικά χαρακτηριστικά Ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα Ανθεκτικότητα σε έντομα Ανθεκτικότητα σε ασθένειες (βακτήρια, μύκητες, ιοί) Αντοχή σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις - Φυτοαπορρύπανση

13 Bιοτεχνολογικές εφαρμογές- Β Διαγονιδιακά φυτά με βελτιωμένα χαρακτηριστικά ποιότητας και απόδοσης προϊόντων (τροποποίηση μεταβολισμού) Μεταβολισμός λιπιδίων Μεταβολισμός υδατανθράκων Δευτερογενής μεταβολισμός Aποθηκευτικές πρωτεϊνες Σύσταση πρωτεϊνών Βιοσύνθεση αμινοξέων Φωτοσύνθεση

14 Golden Rice

15

16

17 Bιοτεχνολογικές εφαρμογές- Γ Διαγονιδιακά φυτά με τροποποιημένα αναπτυξιακά χαρακτηριστικά Μορφολογία Άνθηση Βλάστηση σπόρων Ανδροστειρότητα Φυτοχρώματα

18 + GA

19 Bιοτεχνολογικές εφαρμογές- Δ Διαγονιδιακά φυτά για παραγωγή προϊόντων (molecular farming/ μοριακή αγροκαλλιέργεια) Εμβόλια- Αντισώματα- άλλα Φαρμακευτικά προϊόντα Βιομηχανικά ένζυμα Bιοπλαστικά

20 Iστοκαλλιέργεια Κυτταροκαλλιέργεια φυτών Ολοδυνητικότητα (totipotency): Όλα τα φυτικά κύττρα διατηρούν το γενετικό τους δυναμικό και υπό τις κατάλληλες συνθήκες μπορούν να το εκφράσουν. Είναι δηλαδή δυνατόν να αποδιαφοροποιηθούν και να παράγουν όλους τους κυτταρικούς τύπους και άρα να αναπτυχθούν εκ νέου σε πλήρες φυτό.

21 Καλλιέργειες ακραίων βλαστικών μεριστωμάτων (οφθαλμών). Η κορυφαία κυριαρχία μπορεί να ξεπεραστεί παρουσία κατάλληλης συγκέντρωσης κυτοκινίνης και να σχηματιστεί σύμπλεγμα από αναπτυσσόμενους βλαστούς - η κύρια μέθοδος μικροπολλαπλασιασμού/ κλωνικής παραγωγής φυτών in vitro

22 Τύποι κυτταροκαλλιέργειας φυτών Κάλλος Καλλιέργειες κυτταρικών αιωρημάτων (Υγρές καλλιέργειες φυτικών κυττάρων) Καλλιέργειες πρωτοπλαστών Καλλιέργειες ριζών Καλλιέργειες βλαστών (μεριστωμάτων) Καλλιέργειες εμβρύων Καλλιέργειες μικροσπορίων (γύρης ή ανθήρων)

23 Kάλλος: μάζα μη οργανομένων, αδιαφοροποίητων κυττάρων με ικανότητα γρήγορης αύξησης και έντονης διαίρεσης

24 ημιουργία υγρής καλλιέργειας φυτικών κυττάρων Έκφυτο κοτυληδόνας Κάλλος 2 εβδομάδων Κάλλος 3 εβδομάδων Υγρή καλλιέργεια ετεροτροφικών κάλλων (MS, 3% σουκρόζη,0.5 mg/l 2,4D, 0.05 mg/l kinetin, ph 5.8 Υγρή καλλιέργεια φωτομιξοτροφικών κάλλων (MS, 3% σουκρόζη,5 mg/l ΙΒΑ, 0.5mg/l 2ip, ph 5.8

25 Πρωτοπλάστες: φυτικά κύτταρα χωρίς το κυτταρικό τοίχωμα, το οποίο αφαιρείται είτε με μηχανικό είτε κυρίως- με ενζυμικό τρόπο (κυτταρινάσες και πεκτινάσες) Σύντηξη πρωτοπλαστών: ημιουργία σωματικών ή κυτταροπλασματικών εμβρύων

26 Οργανογένεση: παραγωγή φυτικών οργάνων απευθείας από το έκφυτο ή από τον κάλλο. Εναλλακτικά επιγενείς οφθαλμοί, οι οποίοι αναπτύσσονται σε καλλιέργειες βλαστών και ακραίων ή μασχαλιαίων οφθαλμών, επίσης μπορούν να οδηγήσουν στην αναγέννηση ολόκληρων φυτών Ρυμθίζεται από τα συστατικά του θρεπτικού μέσου και κυρίως της αναλογίας αυξίνης: κυτοκινίνης Biology of Plants, Raven et. al., Freeman Worth Publishing, 1999

27 Επαγωγή κάλλου σε ιστό κοτυληδόνων Επαγωγή βλαστογένεσης Επαγωγή βλαστογένεσης Καλλιέργεια αναγεννημένων φυτών

28 Σωματική εμβρυογένεση (αφυλετική ή επιγενής): διαδικασία σχηματισμού εμβρύων* από ένα μόνο ή μικρή ομάδα σωματικών κυττάρων παραγωγή φυτικών οργάνων μέσω της παραγωγής σωματικών εμβρύων με διαδικασία ανάλογη με τη βλάστηση των ζυγωτικών εμβρύων Τεχνητά σπέρματα *διπολικές μορφές που φέρουν μεριστώματα στον άξονα βλαστού-ρίζας από όπου εκπύσσεται ένα φυτάριο

29 Θρεπτικά μέσα κυτταροκαλλιέργειας φυτών Βασικά συστατικά [1] απαραίτητα στοιχεία ή μεταλλικά ιόντα (συνήθως με τη μορφή σύμπλοκων μειγμάτων αλάτων) Μακροστοιχεία (άζωτο, κάλιο, μαγνήσιο, φωσφορος, aσβέστιο, θείο,χλώριο) Ιχνοστοιχεία (μαγγάνιο, ιώδιο, χαλκός, μολυβδένιο, ψευδάργυρος, σίδηρος) [2] οργανικά συμπληρώματα/ αυξητικοί παράγοντες (βιταμίνεςθειαμίνη, ινοσιτόλη, αμινοξέα, πεπτόνες, ορμόνες, ΙΑΑ, ΙΝΑ) [3] πηγή άνθρακα (συνήθως σουκρόζη αλλά και γλυκόζη, μαλτόζη, σορβιτόλη, γαλακτόζη)

30 Κύριες Φυτοορμόνες αυξίνες κυτοκινίνες ομικά όμοιες με αδενίνη Παραγωγή κυρίως σε ακραία μεριστώματα Παραγωγή κυρίως σε αυξανόμενους φυτικούς ιστούς, ρίζες, έμβρυα, καρποί αυξίνη < ΚΥΤΟΚΙΝΙΝΗ βλαστοί AΥΞΙΝΗ > κυτοκινίνη ρίζες αυξίνη = κυτοκινίνη απο-διαφοροποίηση

31 ΦΥΤΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΣΤΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ

32 Arabidopsis thaliana

33

34 Arabidopsis thaliana δικοτυλήδονο, σταυρανθές μικρό μέγεθος μικρός βιολογικός κύκλος (5 εβδομάδες) μεγάλη παραγωγή σπόρων μικρό γονιδίωμα (~ 125Μb) εύκολο πρωτόκολλο γενετικής μεταμόρφωσης Arabidopsis Genome Sequencing Initiative

35 Slater, Scott, Fowler, Plant Biotechnology

36 Oryza sative L. ssp indica μονοκοτυλήδονο γονιδίωμα 4Χ του Arabidopsis γενετικοί χάρτες synteny (συντήρηση στη σειρά και στο περιεχόμενο των γονιδίωνομοιολογία) πρωτόκολλο γενετικής μεταμόρφωσης Ιnternational Rice Genome Sequencing Project

37 Φυτά μοντέλα στα ψυχανθή Medicago truncatula Lotus japonicus

38 Αλληλούχιση γονιδιωμάτων φυτών Mb Αrabidopsis thaliana 120 (5) Arabidopsis Genome Initiative Arabidopsis lyrata 200 (5) DOE Joint Genome Institute Capsella rubella 230 (8) Brassica oleracea (18) TIGR Brassica rapa pekinensis 500 (10) Carica papaya 250 Hawaii Papaya Genome Project Citrus sinensis 380 U.S. Citrus Genomics Poncirus trifoliata 385 Eucalyptus globulus 600 (11) Internat. Eucalyptus Genomic Consortium Glycine max 1115 (40) Purdue Univ. Lotus japonicus 470 (6) Kazusa Lycopersicon esculentum 950 (12) Solanaceae Genome Project Medicago truncatula 500 (5) Mt Consortium Mimulus gutatus 430 DOE Joint Genome Institute Musa acuminata Global Musa Genomics Oryza sativa (japonica 400 (12) Internat. Rice Sequencing Project & indica) Beijing Genomics Institute Physcomitrella patens 511(27) DOE Joint Genome Institute Populus trichocarpa 480 DOE Joint Genome Institute Selaginella moellendorfii 100 DOE Joint Genome Institute Solanum tuberosum 840 (12) Potato Genome Sequencing Initiative Sorgum bicolor 760 (10) DOE Joint Genome Institute Triticum aestivum (42) Intern. Wheat Genome Seq. Consortium Triphysaria versicolor 1200 DOE Joint Genome Institute Vitis vinifera 500 (19) Internat. Grape Genome Consortium Zea mays 2500 Maize Genome Organ. 12:

39 Agrobacterium tumefaciens Gram-αρνητικό βακτήριο της ριζόσφαιρας παθογόνο: υπεύθυνο για την ασθένεια του κορωνοτού κάλλου, η οποία εξαρτάται από την παρουσία του Ti (tumour-inducing) πλασμιδίου στο Α. tumefaciens,

40 Ηβιολογία του A. tumefaciens Το A. tumefaciens τρέφεται με εκκρινόμενες ουσίες της ρίζας του φυτού μολύνει μέσω τραυματισμένων ιστών του φυτού: το φυτό παράγει στις θέσεις τραυματισμού ενώσεις (μόριασινιάλα), όπως η ακετοσυριγγόνη Το βακτηριακό Τi πλασμίδιο παράγει και υποδοχείς για αυτές τις ενώσεις και το βακτήριο κινείται χημειοτακτικά προς αυτές www-genvagar.slu.se/teknik/ djup/plasm.htm

41 Το Ti πλασμίδιο T-DNA περιοχή LB αυξίνη κυτοκινίνη οπίνες RB γονίδια επαγωγής όγκου Περιοχή τοξικότητας -Vir θέση έναρξης της αντιγραφής καταβολισμός οπινών

42 ιαδικασία μεταφοράς και ενσωμάτωσης του Τ-DNA Χημειοτακτική αναγνώριση θέσεων τραυματισμού του φυτού από όπου εκκρίνονται μόρια-σινιάλα. Προσκόληση και αποικισμός με τη μεσολάβηση των attr (πολυσακχαρίτης), chva & B,chvB (κυκλικές β-1,2-γλυκάνες, psca (σουκινογλυκάνη) χρωμοσωμικών γονιδιακών τόπων Eπαγωγή της περιοχής τοξικότητας vir: Η vira πρωτεϊνη (μεμβρανική κινάσηυποδοχέας) αυτοφωσφορυλιώνεται και ενεργοποιεί την virg και η τελευταία όλα τα υπόλοιπα γονίδια του ρεγουλονίου ημιουργία- παραγωγή του T-DNA συμπλόκου: αποκοπή από το Ti πλασμίδιο μονόκλωνης αλυσίδας (Τ-DNA strand) στα συνοριακά (LB & RB) από τις D1/D2, σύνδεση με D2/Ε2 Μεταφορά του Τ-DNA/D2 και της vire2 στο κύτταρο ξενιστή μέσω ειδικού μεμβρανικού συστήματος έκκρισης Μεταφορά του Τ-DNA strand/d2 στον πυρήνα (σινιάλο πυρηνικού εντοπισμού D2, E2). Eνσωμάτωση στην χρωματίνη (VirE2 σε συνεργασία με VIP1 & 2 του φυτού και importins, cyclophilins) με ανορθόδοξο ανασυνδυασμό (illegitimate recombination)

43

44

45 Mεταμόρφωση φυτών μέσω του Agrobacterium Σταθερός μετασχηματισμός φυτών Κλωνοποίηση του γονιδίου (ή τμήματός του) στη πολυδύναμη θέση κλωνοποίησης του κατάλληλου φορέα Εισαγωγή του γονιδίου σε ένα κατάλληλο στέλεχος Agrobacterium tumefaciens Συν-καλλιέργεια του τροποποιημένου γενετικά A. tumefaciens με τα κατάλληλα έκφυτα φυτών από τα οποία μπορεί να προέλθουν ολόκληρα φυτά Καλλιέργεια έκφυτου, αρχικώς στην παρουσία κάποιου βακτηριοστατικου παράγοντα που παρεμποδίζει την ανάπτυξη του Agrobacterium αλλά όχι των φυτικών κυττάρων (π.χ. cefotaxime) και σε παράγοντα επιλογής για την επιλογή των μεταμορφωμένων φυτικών κυττάρων/ τμημάτων Επιλογή των αναγεννημένων φυτών για την έκφραση των δεικτών επιλογής ή αναφοράς Ανάπτυξη των απογόνων των μεταμορφωμένων φυτών και καθορισμός της κληρονομικότητας του εισαχθέντος γονιδίου

46 Building the Transgenes ON/OFF Switch Makes Protein stop sign PROMOTER INTRON CODING SEQUENCE poly A signal Plant Transgene Plant Selectable Marker Gene bacterial genes antibiotic marker replication origin Plasmid DNA Construct

47 Φορείς μεταμόρφωσης φυτών μέσω Agrobacterium Συν-εισερχόμενοι φορείς (σύστημα cis)- Co-integrative vectors Τα νέα γονίδια βρίσκονται σε ένα μικρότερο πλασμίδιο του E.coli. Εισάγονται στο Ti πλασμίδιο με ανασυνδυασμό σε μία ομόλογη τεχνητή περιοχή του T- DNA υαδικό σύστημα (σύστημα trans)- Binary vectors To γονίδιο προς μεταφορά στο φυτικό γονιδίωμα και τα vir γονίδια βρίσκονται σε διαφορετικά πλασμίδια, τα οποία συνυπάρχουν ανεξάρτητα και αυτόνομα μέσα στο Agrobacterium To Ti-πλασμίδιο περιέχει τα vir γονίδια. Ο φορέας μεταφοράς περιέχει τους δείκτες επιλογής και τα ξένα γονίδια Είναι πολύ απλούστεροι στην κατασκευή τους και στο χειρισμό τους

48

49

50 Φορείς μεταμόρφωσης φυτών μέσω Agrobacterium Τριαδικό σύστημα (σύστημα trans)- Τύπος διαδικού φορέα Υπάρχει ένα επιπλέον βοηθητικό πλασμίδιο, το οποίο περιέχει ένα γονίδιο για την αντιγραφή και επιβίωση του δυαδικού φορέα (του πλασμιδίου μεταφοράς) Π.χ. pgreen και psoup To psoup εισάγεται μαζί με τον pgreen φορέα στο Agrobacterium ή μπορεί να προϋπάρχει σε ικανά κύτταρα

51 Συστατικοί Προαγωγείς Ρυθμιζόμενοι κατά συνθήκη

52 Συστατικοί προαγωγείς στα διαγονιδιακά φυτά προκαθορίζουν την έκφραση του γονιδίου σε όλους σχεδόν τους ιστούς σε παραπλήσια επίπεδα ανεξάρτητα από αναπτυξιακούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες Παραδείγματα 35S από CaMV (ιός του μωσαϊκού του καπνού): ιδανικός για την έκφραση των γονιδίων επιλογής και αναφοράς nos (συνθάση της νοπαλίνης), ocs (συνθάση της οκτοπίνης), mas από Agrobacterium ubiquitin I (καλαμπόκι) / actin (ρύζι) για μονοκότυλα

53 Ρυμθιζόμενοι κατά συνθήκη προαγωγείς Ιστοειδικοί Επαγώμενοι Αναπτυξιακοί πλειοτροπικά αποτελέσματα λόγω της έντονης τροποποίησης της φυσιολογίας του οργανισμού

54 Ιστοειδικοί Καθορίζουν την έκφραση των γονιδίων σε συγκεκριμένα φυτικά κύτταρα, ιστούς και όργανα του φυτού -περιορίζουν τα καταστρεπτικά αποτελέσματα της έκφρασης σε υψηλά επίπεδα και σε όλους τους ιστούς -διευκολύνουν τη συσσώρευση άρα και συγκομιδή των προϊόντων ή μεταβολιτών των εκραζομένων γονιδίων Ριζοειδικοί (mas2, putrescine N methyltransferase, cyamine 6b hydroxylase, patatin, Sus4) φωτοσυνθετικοί ιστοι (rbcs, CAB) seed specific ( Amy1a, BluB1)

55 Επαγώμενοι η δράση τους μεταβάλλεται ανάλογα με τις συνθήκες επαγωγής επιτρέπουν την έκφραση γονιδίων σε περιορισμένη χρονική περίοδο ιακρίνονται 2 κατηγορίες (1) συστήματα που δεν προέρχονται από φυτά (ανεξάρτητα από τις φυσιολογικές διαδικασίες στο φυτό) π.χ. προαγωγέας απόκρισης σε τετρακυκλίνη (Ο TetR αναστολέας δεσμεύεται στον tet διαχειριστή (operator) και αποενεργοποιείται στην παρουσία τετρακυκλίνης- Ο TetR εκφράζεται συνεχώς από τον 35S και καταστέλλει την έκφραση του ξένου γονιδίου) προαγωγέας απόκρισης σε αιθανόλη (Ο ΑlcR παράγοντας (aπό τον Aspergillus nidulans) δεσμεύεται στις θέσεις αναγνώρισης που έχουν συμπεριληφθεί στην περιοχή του προαγωγέα παρουσία αιθανόλης και επάγει την έκφραση του ξένου γονιδίου)

56 (1) συστήματα που δεν προέρχονται από φυτά (ανεξάρτητα από τις φυσιολογικές διαδικασίες στο φυτό) π.χ. προαγωγέας απόκρισης σε στεροειδή (χρησιμοποιούνται παράγοντες μεταγραφής με απόκριση σε γλουκοκορτικοστεροειδήσυνθετικό ανάλογο: δεξαμεθαζόνη-, οιστρογόνα και εκδυσόνη, θεσεις αναγνώρισης των οποίων έχουν συμπεριληφθεί στην περιοχή του προαγωγέα) ΑΛΛΑ και απόκριση σε μηστεροειδή ανταγωνιστή εκδυσόνης RH5992 (tebufenozide): ευρέως χρησιμοποιούμενο αγροχημικό προαγωγέας απόκρισης σε χαλκό (ρυθμιστικό σύστημα μεταλλοθειονίνης ζυμών)

57 (2) συστήματα που προέρχονται από φυτά ως αντίδραση σε περιβαλλοντικές συνθήκες Χειμαιρικοί (συνήθως με το βασικό προαγωγέα του 35S και αλληλουχίες δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων που αποκρίνονται σε συγκεκριμένα περιβαλλοντικά σήματα) ή ολόκληροι προαγωγείς Π.χ. προαγωγείς απόκρισης σε τραυματισμό (wound inducible) (αναστολών πρωτεινασών -proteinase inhibitors-παράγοντες που μιμούνται την αντίδραση σε τραυματισμό (μεθυλ-ιασμονικό οξύ) επισης χρησιμοποιούνται) προαγωγείς απόκρισης σε θερμικό shock (θερμοεπαγώμενοι) (στοιχεία θερμικού σοκ-heat-shock elements, HSEs hsp81.1 ) προαγωγείς απόκρισης σε παθογόνα (pathogenesis-related PR1,

58 Αναπτυξιακοί συστήματα που προέρχονται από φυτά και στηρίζονται στον αναπτυξιακό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης (σε συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια του φυτού) Χειμαιρικοί ή ολόκληροι προαγωγείς π.χ. προαγωγέας έκφρασης κατά τη γήρανση (senescence-specific) (Senescence associated genes- SAG12 και SAG130) προαγωγέας aπόκρισης στο απσιζικό οξύ (ΑΒΑ) (στοιχεία αλληλουχίας σε χειμαιρικούς προαγωγείς με 35S) προαγωγέας aπόκρισης σε αυξίνη (στοιχεία αλληλουχίας aπόκρισης σε αυξίνη- αuxin response elements AuxREs- σε χειμαιρικούς προαγωγείς με 35S)

59 είκτες (γονίδια) επιλογής η έκφρασή τους παρέχει σαφή φαινοτυπική μεταμορφωμένα και μη κύτταρα διάκριση ανάμεσα στα η έκφρασή τους δεν τροποποιεί τη φυσιολογία του κυττάρου η χημική ουσία που χρησιμοποιείται για επιλογή επηρεάζει ελάχιστα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αναγέννηση και ανάπτυξη πλήρους φυτού Παραδείγματα nptii ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη [αντιβιοτικά] (bleomycin,spectinomycin, hygromycin) bar - ανθεκτικότητα στο phospinothricin (basta) [ζιζανιοκτόνα] glyphosate bialaphos chlorsurlfuron

60 είκτες (γονίδια) αναφοράς Επιλογή μεταμορφωμένων φυτών με την αποτίμηση της έκφρασής τους σε βιοχημικό επίπεδο ποσοτική, τοπική και χρονική έκφραση γονιδίων/ υποκυτταρική θέση πρωτεϊνών το προϊόν τους δεν συντίθεται από το κύτταρο το προϊόν τους ή/και το προϊόν της ενζυμικής δραστικότητας δεν είναι τοξικό για το κύτταρο το προϊόν τους έχει υψηλό βαθμό ενζυμικής δραστικότητας, η οποία δεν αναστέλλεται από τις κυτταρικές χημικές ενώσεις το προϊόν τους είναι σταθερό η ενζυμική ανάλυση είναι απλή και ακριβής, μη δαπανηρή και ευαίσθητη είναι δυνατή η σύντηξη του ενζύμου αναφοράς με πολυπεπτίδια χωρίς να χάνεται η ενζυμική δραστικότητα

61 είκτες (γονίδια) αναφοράς Παραδείγματα uida ή gus β-glucuronidase από E. coli: ποσοτικός προσδιορισμός με μετρήσεις του φθορίζοντος υποστρώματος 4-MUG (4- methylumbelliferryl-β-glucuronide) ποιοτικός προσδιορισμός/ιστοχημικός εντοπισμός σε ιστούς και κύτταρα με κατακρήμνιση του χρωμογόνου υποστρώματος Χ-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-glucuronide) καταστρεπτική μέθοδος, γρήγορη, εύκολη gfp Green Fluorescent Protein από Aequorea victoria κυρίως ποιοτική (απαραίτητη σε περιπτώσεις όπως σάρωση πρώτων μεταμορφωμένων φυτών, πειράματα time-course, ανάλυση μικρών φυταρίων) μη καταστρεπτική, γρήγορη και εύκολη αλλά απαιτεί την ύπαρξη απαραίτητου εξοπλισμού luc και luxa/ luxb luciferasesαπό Photinus pyralis και Vibrio harveyi οξείδωση D-luciferin παρουσία ATP με σύγχρονη και ταχύτατη εκπομπή φωτονίων ποιοτική και ποσοτική, μη καταστρεπτική, πολύ ακριβής και ευαίσθητη αλλά απαιτεί την ύπαρξη φωτοπολλαπλασιατών (photomultipliers, luminometers, film exposure) cat chloramphenicol acetyltransferase από E. coli ημιποσοτική, πολύ ευαίσθητη αλλά απαιτεί τη χρήση ραδιενέργειας

62

63

64

65 οκιμές (Συστήματα) παροδικής έκφρασης γονιδίων Λειτουργία γονιδίου Ανάλυση προαγωγέων Συμπληρωματικότητα διαγονιδίων Παραγωγή πρωτεϊνών Πλεονεκτήματα σε σχέση με σταθερό μετασχηματισμό ταχύτατη προσέγγιση του ζητήματος υπό μελέτη επιτρέπει την ανάλυση έκφρασης γονιδίων με επιβλαβείς επιδράσεις στην ανάπτυξη και αύξηση του φυτού ταυτόχρονη ανάλυση ανεξάρτητων μετασχηματισμένων κυττάρων χωρίς σωματοκλωνική ποικιλότητα εξασφαλίζει επαρκη ποσότητα ιστού για αναλυση RNA και πρωτεϊνών εξασφαλίζει σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου Μειονεκτήματα Αποτελεσματική μόνο σε ορισμένα είδη φυτών μελέτη γονιδίων με «μετρήσιμο» φαινότυπο σε σύντομο χρονικό διάστημα

66 Agroinoculation - Agroinfiltration ( vacuum- infiltration ) ιείσδυση βακτηρίων Agrobacterium, μετασχηματισμένα με καταλληλο πλασμιδιακό φορέα, με ένεση στο υπεργειο τμήμα του φυτού (συνήθως φύλλα)

67 Agrobacterium rhizogenes: φαινόμενο hairy roots

68

69

70 Βομβαρδισμός σωματιδίων (βιολιστική, βομβαρδισμός προεξοχών, επιταχυντής σωματιδίων, γονιδιακό όπλο, όπλο σωματιδίων) Χρήση επιταχυνόμενων με μεγάλη ταχύτητα σωματιδίων προεξοχών (απο χρυσό ή βολφράμιο) στα οποία συνδέεται το DNA προς μεταφορά έτσι ώστε να διαπερνώνται οι εξωτερικές κυτταρικές στοιβάδες ή τα κυτταρικά τοιχώματα και να εισέρχεται το DNA στο κύτταρο

71 Πλεονεκτήματα Βομβαρδισμός σωματιδίων Αποτελεσματική και για σταθερό μετασχηματισμό (μεταμόρφωση) κυττάρων- ιστών οργάνων αλλά και οργανιδίων (χλωροπλάστες) Αποτελεσματική σε περιπτώσεις όπου οι άλλες προσεγγίσεις αποτυγχάνουν π.χ. μεταμόρφωση μονοκοτυλήδονων φυτών in planta μετασχηματισμός βλαστών ή άνθεων με βομβαρδισμό μεριστωμάτων Μειονεκτήματα πολλαπλότητα των ενθέσεων ανακατατάξεις των εισαχθέντων γονιδίων Ένθεση ως single copy event, plasmid concatamers, interspersed clusters

72 Χημική μεταφορά γονιδίων εισαγωγή DNA σε πρωτοπλάστες με χρήση πολυαιθυλενικής γλυκόλης PEG- παρουσία δισθενών ιόντων H PEG προκαλεί: ελάττωση απώσεως ομοιως φορτισμένων μορίων (μεμβρανη κυτταρου-dna) καθίζηση DNA πάνω στις μεμβράνες του κυττάρου ερεθισμός του πρωτοπλάστη για φαγοκύτωση μεγαλομορίων παράμετροι που λαμβάνονται υπόψη μοριακό βάρος και συγκεντρωση PEG συγκέντρωση και φυσική κατάσταση του DNA παρουσία και συγκέντρωση του «συνοδού DNA αριθμός πρωτοπλαστών μέσο και ph επώασης (συγκεντρώσεις ιόντων Ca / Mg) χρόνος επώασης θερμοκρασία τρόπος επώασης (π.χ. ανάδευση)

73 Πλεονεκτήματα Χημική μεταφορά γονιδίων Αποτελεσματική για πολύ μεγάλο αριθμό φυτών Μειονεκτήματα Εφαρμόζεται μόνο σε πρωτοπλάστες Ανακατατάξεις των εισαχθέντων γονιδίων

74 Ηλεκτροπόρωση (ηλεκτροέγχυση, ηλεκτροδιαμόλυνση, ηλεκτρική μικροέγχυση) Φαινόμενο κατά το οποίοι η μεμβράνη του κυττάρου (πρωτοπλάστες) εκτίθεται σε μικρούς χρονικά παλμούς υψηλού ηλεκτρικού πεδίου με αποτέλεσμα την παροδική αποσταθεροποίησή της και τη δημιουργία μεμβρανικών πόρων, οι οποίοι στη συνέχεια κλείνουν με κατάλληλη περαιτέρω επεξεργασία παράμετροι που λαμβάνονται υπόψη φυσιολογική κατάσταση πρωτοπλαστών συγκέντρωση και καθαρότητα του DNA πυκνότητα των κυττάρων μέσο της ηλεκτροπόρωσης (ιοντική και ωσμωτική ισχύς του διαλύματος) ένταση του ρεύματος χρόνος επώασης θερμοκρασία

75 Πλεονεκτήματα Ηλεκτροπόρωση Μεγαλύτερη αποδοτικότητα ως προς τη μεταφορά μορίων ανεξαρτήτου μεγέθους- από τις υπόλοιπες μεθόδους Μη διεισδυτική Μη χημική, μη τοξική εν επηρεάζει τις βιολογικές δομές ή λειτουργίες των κυττάρωνστόχων Μειονεκτήματα Εφαρμόζεται κυρίως σε πρωτοπλάστες φυτών Χρησιμοποιείται για μελέτες παροδικής έκφρασης Απαιτείται μεγάλος αριθμός κυττάρων ανά πείραμα Η έκβαση των αποτελεσμάτων επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες

76 Ιικοί φορείς Στρατηγική full-virus Φορείς οι οποίοι μεταφέρουν και εκφράζουν ένα γονίδιο-υπο-μελέτη μέσα στα φυτικά κύτταρα αλλά συμπεριφέρονται όπως οι ιοί άγριου τύπου π.χ. TMV, PVX, AMV Mόλυνση των ξενιστών με ολόκληρα ιικά σωμάτια π.χ.σύντηξη με πρωτείνη καψιδίου Πλεονεκτήματα Ταχύτατη έκφραση Μεγάλη απόδοση έκφρασης ιασυστηματική μεταφορά (?) Μειονεκτήματα Μεταφορά μόνο μικρού μεγέους ένθετων Μη έκφραση σε πολλούς επιθυμητούς ιστούς π.χ. άνθη, ώριμα, πρώτα φύλλα Αυξημένη επικινδυνότητα Γονιδιακή Σίγηση Eιδοεξειδίκευση

77 Στρατηγική deconstructed virus Φορείς οι οποίοι φέρουν ορισμένα μόνο στοιχεία του ιικού μηχανισμού (in vitrο transcription για τους RNA ιούς) Αντιγραφα του ιικου φορέα εισάγονται είτε με απευθείας εφαρμογή στα φυτά ή εισάγονται πρώτα σε Τ-DNA φορείς και μεταφέρονται μέσω Agrobacterium (agroinfection) ανασυνδυασμένοι ιοί προκύπτουν με μεταγραφή από έναν ισχυρό προαγωγέα Ή αντίγραφα προκύπτουν από το φυτικό χρωμόσωμα (και υπό ρύθμιση)

78 Κάποιες ιδιότητες του ιικού μηχανισμού προσφέρονται in trans από δεύτερο φορέα και από το φυτό (π.χ. πολυμεράση, πρωτεϊνη μεταφοράς από κύτταρο-σε-κύτταρο, πρωτεϊνη του καψιδίου) - Αποτελεσματικότερη μόλυνση αλλά και πάλι λίγα κύτταρα μολύνονται - H διασυστηματική μεταφορά δεν είναι πάντα επαρκής και απαιτεί τη δημιουργία ενεργών ιών - Η παραγωγή RNA αντιγράφων ιών με agroinfection είναι πολύ περιορισμένη για εφαρμογής μεγάλης κλίμακας (αλλά δες Μagnifection, Marillonet et al, Nature Biotechnology, 2005, 23: 718)

79 Χρήση των ιικών φορέων για γονιδιακή σίγηση στα φυτά

80

81 ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών Mε PCR, με εκκινητές εξειδικευμένους για τα γονίδια προς ένθεση για τα συνοριακά για περιοχές δίπλα στa συνοριακά (για εξακρίβωση ενσωμάτωσης DNA του φορέα) Ανάστροφη PCR (IPCR) Mε Southern ανάλυση για την αναγνώριση μοναδιαίου αντίγραφου του ένθετου γονιδίου στο φυτικό γονιδίωμα FISH

82 Τ-DNA fingerprinting

83 Ι-PCR

84 Παραγωγή διαγονιδιακών φυτών ελεύθερων από γονίδια επιλογής -clean gene technology Χρήση κατάλληλων πλασμιδιακών φορέων, οι οποίοι 1. φέρουν γονιδια επιλογής χωρίς επικίνδυνες βιολογικές δραστικότητες π.χ. gfp, ipt 2. επιτρέπουν την ένθεση του ξένου γονιδίου και του γονιδίου επιλογής σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος του φυτού, μη συνδεδεμένες μεταξύ τους Γενετική ανάλυση των απογόνων για την αναγνώριση των επιθυμητών φυτών 3. αυξάνουν τη συχνότητα των ανασυνδυασμών με αποτέλεσμα την εξαγωγή του γονιδίου επιλογής 4. επιτρέπουν την εξαγωγή του γονιδίου επιλογής από το φυτικό γονιδίωμα με χρήση συστημάτων ρεκομπινάσης με εξειδίκευση θέσης

85 Παραγωγή διαγονιδιακών φυτών ελεύθερων από γονίδια επιλογής -clean gene technology Χρήση κατάλληλων πλασμιδιακών φορέων, οι οποίοι 1. φέρουν γονιδια επιλογής χωρίς επικίνδυνες βιολογικές δραστικότητες π.χ. gfp, ipt 2. επιτρέπουν την ένθεση του ξένου γονιδίου και του γονιδίου επιλογής σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος του φυτού, μη συνδεδεμένες μεταξύ τους Γενετική ανάλυση των απογόνων για την αναγνώριση των επιθυμητών φυτών 3. αυξάνουν τη συχνότητα των ανασυνδυασμών με αποτέλεσμα την εξαγωγή του γονιδίου επιλογής 4. επιτρέπουν την εξαγωγή του γονιδίου επιλογής από το φυτικό γονιδίωμα με χρήση συστημάτων ρεκομπινάσης με εξειδίκευση θέσης

86 Genetic use restriction technologies (GURTs) T-GURTs (trait-gurts) and VGURTs (varietal-gurts) (

87

88 Tεχνολογία «εξολοθρευτή» - terminator

89

90 Συστήματα ελεγχόμενης θνησιμότητας (systems of conditional lethality)

91 Συστήματα ρεκομπινάσης με εξειδίκευση θέσης CRE-lox από τον φάγο P1 FLP-frt από Saccharomyces cerevisiae R-RS από Zygosaccharomyces rouxii Το γονίδιο επιλογης τοποθετείται ανάμεσα σε θέσεις αναγνώρισης μιας ρεκομπινάσης (lox, frt, RS) o o o Η ρεκομπινάση (CRE, FLP, R) παράγεται είτε από έναν φορέα με παροδική έκφρασή της είτε με καποιο σύστημα επαγωγής της έκφρασής της (επαγώμενος προαγωγέας) είτε με διασταύρωση των φυτών με φυτά που παράγουν ρεκομπινάση

92

93 γονίδιο Χ loxp γονίδιο επιλογής loxp CRE γονίδιο Χ loxp γονίδιο επιλογής loxp loxp

94 Μεταμόρφωση χλωροπλαστών Γονιδίωμα πλαστιδίων (plastome- ptdna) o Στα ανώτερα φυτά πολύ συντηρημένο, με μικρή ποικιλομορφία στην οργάνωση και τη o γονίδια ανήκουν σε δύο κατηγορίες: γονίδια του γενετικού συστήματος (rrnas, trnas, ριβοσωμικές υπομονάδες, RNA πολυμεράση) γονίδια φωτοσύνθεσης o Γονίδια οργανωμένα σε οπερόνια και έκφρασή τους σε πολυκιστρονικά mrnas Μέθοδοι μεταμόρφωσης Βομβαρδισμός σωματιδίων και χημική μεταφορά με PEG (φορείς που επιτρέπουν ομόλογο ανασυνδυασμό με το ptdna)

95 Πλεονεκτήματα γενετικής μεταμορφωσης πλαστιδίων o Υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών (μέχρι και 46% της ολικής διαλυτής πρωτείνης) λόγω της μεγάλης πολυπλοειδίας του ptdna (π.χ νουκλεοειδή ανά χλωροπλάστη, μέχρι και 100 χλωροπλάστες ανά κύτταρο) o Απουσία επιγενετικών επιδράσεων (γονιδιακή σίγηση, επίδρασης θέσης) o Τοποθέτηση πολλαπλών γονιδίων σε οπερόνια o Κληρονόμηση πλαστιδίων από το θηλυκό γονέα και όχι από τη γύρη

96 Μειονεκτήματα- Προβλήματα περιορισμένος αριθμός ειδών είναι επιδεκτικός σε μεταμόρφωση χλωροπλαστών (καπνός, τομάτα, πατάτα, Βrassica napus, Oryza sativa με πολλά προβλήματα γονιμότητας και ετεροπλασμίας) απαιτούνται πολλές γενεές σε κυτταροκαλλιέργεια πριν την απόκτηση γενετικά σταθερών διαγονιδιακών φυτών

97 Hager et al, 1999 Απαλοιφή των γονιδιωμάτων άγριου-τύπου και εγκαθίδρυση γενετικής τροποποίησης σε κάθε αντίγραφο του χλωροπλαστικού γονιδιώματος σε κάθε φυτικό κύτταρο : Ομοιοπλασμία (homoplasmy) Bock & Khan, 2004

98

99 Ένθεση γονιδίου επιλογής aada (aminoglycoside adenyltransferase) (ανθεκτικότητα στην σπεκτινομυκίνη) στο γονιδίωμα χλωροπλάστη με ομόλογο ανασυνδυασμό Xλωροπλαστικό DNA badh (betaine aldehyde dehydrogenase) για μεταμόρφωση χλωροπλαστών χωρίς γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Mεταμορφωμένο Xλωροπλαστικό DNA

100