Διερεύνηση των Συνθηκών Σύνθεσης Ικριωμάτων Χαλκού: Επίδραση στη Βιοενεργότητα, το Πορώδες και τις Μηχανικές Ιδιότητες

Transcript

1 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Τμήμα Φυσικής Τομέας Φυσικής Στερεάς Κατάστασης Κατεύθυνση Φυσικής Υλικών Τεχνολογίας Διερεύνηση των Συνθηκών Σύνθεσης Ικριωμάτων Χαλκού: Επίδραση στη Βιοενεργότητα, το Πορώδες και τις Μηχανικές Ιδιότητες Βενετικίδου Μαρία Επιβλέπων Καθηγητής: Κ.Μ. Παρασκευόπουλος Θεσσαλονίκη 2015

2 Στη μητέρα μου 1

3 Περιεχόμενα Abstract... 4 Περίληψη... 6 Πρόλογος... 8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο : ΘΕΩΡΗΤΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Bιοϋλικά Βιοΰαλοι Ιδιότητες Μηχανισµοί Βιοενεργότητας Τεχνική κολλοειδούς γέλης (sol-gel) Πορώδη βιοκεραμικά υλικά Ικριώματα Ορισμός. Τι είναι τα ικριώματα; Ιδιότητες ικριωμάτων Κατηγορίες ικριωμάτων Τρόποι παρασκεύης ικριωμάτων Υγρά προσομοίωσης του πλάσματος του αιματος (SIMULATED BODY FLUIDS - SBF) Συμβατικό υγρό προσομοίωσης (c-sbf) Φασματοσκοπία Υπερύθρου FTIR Διαπερατότητας (Transmittance) Περίθλαση ακτινών Χ (XRD) Ηλεκτρονική Μικροσκόπια Σάρωσης SEM Υπολογισμός πορώδους με τη μέθοδο του Αρχιμήδη Μηχανικές ιδιότητες βιοκεραμικών υλικών Αντοχή σε θλιπτική τάση (Compressive strength) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Παρασκευή ικριωμάτων Παρασκευή βιοκεραμικού Μέθοδος παρασκευής υγρού προσομοίωσης σωματικών υγρών. (C-SBF) Προετοιμασία δειγμάτων και η εμβάπτισή τους στο SBF Επεξεργασία δειγμάτων και μεθοδολογία ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηρισμός υαλοκεραμικών ικριωμάτων

4 4.1.1 Αποτελέσματα FTIR (πριν την εμβάπτιση των δειγμάτων στο διάλυμα SBF) Αποτελέσματα SEM (πριν την εμβάπτιση των δειγμάτων στο διάλυμα SBF) Αποτελέσματα SEM (μετά την εμβάπτιση των δειγμάτων στο διάλυμα SBF) Αποτελέσματα XRD Έλεγχος βιομιμητικής συμπεριφοράς ικριωμάτων Mέτρηση πορώδους υαλοκεραμικών ικριωμάτων (Porosity) Έλεγχος μηχανικών ιδιοτήτων των ικριωμάτων υπό θλιπτικές τάσεις (Compression strength) Συζήτηση-Συμπεράσματα Βιβλιογραφία-Αναφορές

5 Abstract Bioactive glass based scaffolds are commonly used in Tissue Engineering in order to create proper conditions for 3D cell attachment, differentiation and proliferation [1]. Porosity and pore interconnectivity of scaffolds play a critical role in 3D bone ingrowth [2]. Moreover it is prerequisite that scaffolds exhibit mechanical properties similar to that of the host bone [2]. Sol-gel derived bioceramic scaffolds have been proposed as promising materials for bone tissue regeneration due to their increased surface area and apatite forming ability. One of their major advantages is that they can be fabricated with versatile properties, such as enhanced mechanical strength and porosity, by tailoring their synthesis methodology. In Addition, previous studies have shown that metallic ions, such as Cu2+ have high potential to enhance osteogenesis and angiogenesis of glass ceramic scaffolds [3]. The aim of this study was to determine in which way the number of sol-gel layered coatings affects porosity, mechanical strength and bioactivity of copper containing scaffolds. The scaffolds were fabricated using foam replica technique [4]. Archimedes method was applied to measure the porosity of samples [5] and the mechanical strength of the scaffolds was studied under compression load. FTIR transmittance spectra and SEM microphotographs, for the characterization of the produced scaffolds, were obtained using Perkin-Elmer Spectrometer Spectrum in MIR region cm -1 with resolution 4cm -1 and a JEOL JMS840A Oxford ISIS 300 Detector, respectively. The bioactivity test of glass-ceramics was conducted in SBF solution, with a ratio of 1.5 mg/ml for various immersion times (5, 10, 15, 20 and 25 days). The bioactive response of the samples before and after immersion in SBF solution was evaluated using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and X-Ray Diffractometry (XRD). FTIR spectra of the synthesized scaffolds before immersion in SBF showed that all scaffolds present the characteristic bands of silicate glasses. SEM microphotographs revealed very good pore size and pore interconnectivity and Archimedes method revealed high porosity for all scaffolds. Although mechanical strength was not 4

6 dramatically increased after adding more layers, variations in porosity could probably affect cells attachment and proliferation. In vitro bioactivity tests revealed that after 25 days of immersion the onset of apatite formation occurred as shown by FTIR spectra and XRD patterns. In addition cell biocompatibility experiments should be conducted in order to determine the cell proliferation rates of the synthesized scaffolds, in relation to the number of applied layers, in order to reveal the optimum conditions of bioceramic scaffolds synthesis for bone tissue regeneration. 5

7 Περίληψη Η ιστομηχανική αποτελεί έναν τομέα της βιοϊατρικής τεχνολογίας που αναπτύσσεται ταχύτατα και βρίσκει όλο και μεγαλύτερη απήχηση στους νέους ερευνητές και επιστήμονες. Τα προϊόντα που παράγονται από εφαρμογές της ιστομηχανικής είτε συμμετέχουν σε μια συνολική μέθοδο αντιμετώπισης μιας ασθένειας, είτε αποτελούν από μόνα τους ολοκληρωμένη θεραπεία. Συνήθως, χρησιμοποιούνται μοσχεύματα, αλλά και μεμβράνες και ικριώματα για την ανάπλαση ιστών και οργάνων. Συγκεκριμένα τα ικριώματα, που θα μελετήσουμε στην παρούσα εργασία, λειτουργούν ως οχήματα μεταφοράς και ανάπτυξης κυττάρων. Διακρίνονται σε διάφορες κατηγορίες με βάση τον ρυθμό απορρόφησης, τη σύνθεσή τους και τη δομή τους. Τα βιοκεραμικά ικριώματα χρησιμοποιούνται συνήθως στην ιστομηχανική προκειμένου να δημιουργηθούν οι κατάλληλες συνθήκες με στόχο την τρισδιάστατη κυτταρική προσκόλληση, διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό [1]. Οι ιδιότητες που πρέπει να χαρακτηρίζουν ένα ικρίωμα πρέπει να μελετώνται διεξοδικά πρίν από οποιαδήποτε εφαρμογή. Το πορώδες, το μέγεθος των πόρων καθώς και η διασυνδεσιμότητα των πόρων των ικριωμάτων παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του του ιστού [2]. Επιπλέον, τα ικριώματα απαιτείται να εμφανίζουν μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες με εκείνες του ιστού που θέλουμε να αναγεννήσουμε [2]. Τα βιοκεραμικά ικριώματα έχουν προταθεί ως πολλά υποσχόμενα υλικά για την αναγέννηση του ιστού των οστών, λόγω της αυξημένης επιφάνειας τους και της ικανότητας τους να σχηματίζουν απατίτη. Ένα από τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα τους είναι ότι μπορούν να κατασκευαστούν με ευέλικτες ιδιότητες, όπως βελτιωμένη μηχανική αντοχή και το πορώδες ανάλογα με την εφαρμογή για την οποία προορίζονται. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η προσθήκη μεταλλικών ιόντων στην σύνθεση βιοκεραμικών ικριωμάτων, όπως Cu 2 + είναι ικανά να ευνοήσουν και να ενισχύσουν την οστεογένεση και την αγγειογένεση. [3]. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί ο τρόπος με τον οποίο ο αριθμός των βιοκεραμικών επιστρώσεων sol-gel επηρεάζει το πορώδες, τη μηχανική αντοχή και τη βιομιμητική συμπεριφορά των ικριωμάτων. Τα ικριώματα 6

8 κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνική αντικατάστασης σπογγώδους μήτρας [4]. Η μέθοδος του Αρχιμήδη εφαρμόστηκε για τη μέτρηση του πορώδους των δειγμάτων [5] και η μηχανική αντοχή των ικριωμάτων μελετήθηκε υπό θλιπτική τάση. Τα FTIR φάσματα και μικροφωτογραφίες SEM, για τον χαρακτηρισμό των παραγόμενων ικριωμάτων, ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Perkin-Elmer Spectrum Φασματόμετρο στην περιοχή MIR cm -1 με ανάλυση 4 cm -1 και ένα JEOL JMS840A Oxford ISIS 300 Detector, αντίστοιχα. Ο έλεγχος βιοενεργής συμπεριφοράς των βιοκεραμικών ικριωμάτων διεξήχθη σε διάλυμα SBF, με αναλογία 1,5 mg / ml για διάφορους χρόνους εμβάπτισης (5, 10, 15, 20 και 25 ημέρες). Η βιοενεργή ή όχι απόκριση των δειγμάτων πριν και μετά την εμβάπτιση σε διάλυμα SBF αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία υπερύθρου (Transform Infrared Spectroscopy Fourier-FTIR) και περίθλαση ακτίνων Χ ( X-Ray Diffractometrion Analysis -XRD). 7

9 Πρόλογος Η παρούσα πτυχιακή εργασία με τίτλο Διερεύνηση των Συνθηκών Σύνθεσης Ικριωμάτων Χαλκού: Επίδραση στη Βιοενεργότητα, το Πορώδες και τις Μηχανικές Ιδιότητες πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φασματοσκοπίας Υπερύθρου του τομέα Στερεάς Κατάστασης στο τμήμα Φυσικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και παρουσιάστηκε στο 31 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Φυσικής Στερεάς Κατάστασης και Φυσικής των Υλικών με τον τίτλο: «Effect of synthesis through foam replica technique method on the porosity and mechanical strength of Cu containing scaffolds» Η εργασία είναι χωρισμένη σε τέσσερα κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο γίνεται μία θεωρητική εισαγωγή στην οποία περιγράφεται ο ρόλος των βιοϋλικών στις σύγχρονες βιοϊατρικές εφαρμογές και η ιδιαίτερη σημασία των βιοκεραμικών ικριωμάτων στον τομέα της ιστομηχανικής. Στο δεύτερο κεφάλαιο αναλύεται ο τρόπος λειτουργίας των τεχνικών χαρακτηρισμού που χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό βιοκεραμικών ικριωμάτων που παρασκευάστηκαν. Στο τρίτο κεφάλαιο παρατίθεται η πειραματική διαδικασία παρασκευής των ικριωμάτων, του υγρού προσομοίωσης των σωματικών υγρών, καθώς και ο τρόπος προετοιμασίας τους για την εμβάπτιση στο υγρό προσομοίωσης, τον έλεγχο της αντοχής τους σε θλιπτική τάση και τον έλεγχο του πορώδους. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα πειραματικά αποτελέσματα και γίνεται η αποτίμηση αυτών Για την εκπόνηση αυτής της εργασίας θέλω να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κύριο Παρασκευόπουλο Κωνσταντίνο για την ενθάρρυνση και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Την Επίκουρη Καθηγήτρια Οδοντιατρικής Σχολής κυρία Κοντονασάκη Ελεάννα η οποία μου μετέδωσε τις γνώσεις της πάνω στο αντικείμενο των βιοϋλικών και μου παρείχε απλόχερα την βοήθεια της όταν την χρειαζόμουν. Τον υποψήφιο Διδάκτορα της Σχολής Θετικών Επιστημών Γιώργο Θεοδώρου για την καθοδήγηση, τη στήριξή και την πάντα θετική του διάθεση η οποία με εμψύχωνε σε κάθε στάδιο της εργασίας αυτής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Γεωλογίας κύριο Καντηράνη 8

10 Νίκο και την Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Γεωλογίας κυρία Παπαδοπούλου Λαμπρινή, χωρίς τη συνδρομή των οποίων θα ήταν αδύνατο να ολοκληρώσω την εργασία. Επίσης τις κυρίες Ζορμπά Φιλιώ και Μαλλετζίδου Λαμπρινή για την στήριξη στη διάρκεια της διεκπεραίωση της παρούσας εργασίας. Τέλος, θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στις αγαπημένες μου φίλες Δέσσου Νικολία, Παπαμίχου Κλεοπάτρα και Λυκάρτση Ελένη για τον χρόνο, την υπομονή και την ανεκτίμητη βοήθεια που μου παρείχαν κάθε φορά που την είχα ανάγκη. 9

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο : ΘΕΩΡΗΤΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Bιοϋλικά Ως βιοϋλικό ορίζουμε κάθε ουσία, επιφάνεια ή κατασκευή που αλληλεπιδρά με βιολογικά συστήματα. Τα βιοϋλικά μπορεί να είναι φυσικά ή τεχνητά υλικά τα οποία χρησιµοποιούνται για να κατευθύνουν, να συµπληρώνουν ή να αντικαθιστούν τµήµατα ή λειτουργίες των ιστών του ανθρώπινου σώματος που έχουν υποστεί βλάβη [6]. Αυτά τα υλικά έχουν την ικανότητα να είναι σε επαφή με τα υγρά του σώματος, για μεγάλες χρονικές περιόδους, ενώ προκαλούν από ελάχιστες έως καθόλου παρενέργειες στον οργανισμό [7]. Οι πιο παλιές αναφορές στην χρήση των βιοϋλικών σχετίζονται με τους αρχαίους Φοίνικες, οι οποίοι χρησιμοποιούσαν σύρματα από χρυσό για να δέσουν ένα τεχνητό στη θέση του χαμένου,στην περίπτωση απώλειας κάποιου δοντιού. Στις αρχές του 20ου αιώνα εμφυτεύθηκαν με επιτυχία πλάκες οστών για να σταθεροποιήσουν τα κατάγματα των οστών και να επιταχύνουν τη θεραπεία τους. Κατά τη διάρκεια των δεκαετιών του 1950 και 1960 πραγματοποιήθηκε αντικατάσταση αιμοφόρων αγγείων σε κλινικές δοκιμές ενώ σε ανάπτυξη βρίσκονταν οι τεχνητές καρδιακές βαλβίδες. Σήμερα γίνονται μεγάλες επενδύσεις στον τομέα των βιοϋλικών στην ανάπτυξη των οποίων εμπλέκονται οι επιστήμες της ιατρικής, της βιολογίας, της χημείας καθώς και η επιστήμη των υλικών και η εμβιομηχανική. Σε ότι αναφορά τις εφαρμογές τους, τα βιοϋλικά μπορεί να συναντώνται σε απλές εφαρμογές τις οδοντιατρικής ή σε σύνθετα και επεξεργασμένα υλικά που χρησιμοποιούνται ως μοσχεύματα στο σώμα του ασθενούς. Λόγω της ιδιότητας τους να αλληλεπιδρούν με βιολογικά συστήματα, το κριτήριο που εξετάστηκε για τα βιοϋλικά είναι η βιοσυμβατότητα, η βιοενεργότητα και η διαθεσιμότητα του [8]. 10

12 Τα βιοϋλικά µπορούν να χωριστούν σε διάφορες κατηγορίες, βάση της χηµικής τους φύσης και των βιολογικών τους ιδιοτήτων αλλά και ανάλογα µε το τρόπο που αλληλεπιδρούν µε το σώµα. Βάση της χηµικής του φύσης χωρίζονται σε [9]: Μέταλλα και κράµατα αυτών: όπως ο ανοξείδωτος χάλυβας, τα µαγνητικά µέταλλα και τα µεταλλικά κράµατα Co-Cr, Ti. Τα μέταλλα χρησιμοποιούνται ως βιοϋλικά χάρη στην άριστη θερμική και ηλεκτρική αγωγιμότητά τους αλλά και στις εξαιρετικές μηχανικές τους ιδιότητες. Τα περισσότερα μέταλλα είναι ανεκτά από τον οργανισμό ωστόσο σε ελάχιστες ποσότητες. Το βασικότερο πρόβλημα των μεταλλικών εμφυτευμάτων είναι η εμφάνιση αλλεργικών αντιδράσεων. Επίσης η διάβρωση των εμφυτευμάτων και τα προϊόντα της στο in vivo περιβάλλον είναι δυνατόν να προκαλέσουν βλαβερή επίδραση σε ιστούς και όργανα. Κεραµικά: όπως η πορσελάνη, η ζιρκονία, η αλουµίνα και τα κεραµικά φωσφορικού ασβεστίου. Ως κεραμικά χαρακτηρίζονται όλα τα ανόργανα μη μεταλλικά υλικά που έχουν υποστεί θερμική κατεργασία σε υψηλές θερμοκρασίες. Βασικά πλεονεκτήματα των κεραμικών είναι η σχετικά χαμηλή πυκνότητα και η αυξημένη αντίσταση στην διάβρωση. Τα βασικά μειονεκτήματά τους είναι η ευθραυστότητα και η μικρή αντοχή στην κόπωση. Πολυµερή: Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται ως βιοϋλικά είναι είτε φυσικά είτε τεχνητά. Τα φυσικά πολυμερή παράγονται μέσα από βιολογικές διεργασίες και απαντώνται, κατά κύριο λόγο, στην εξωκυττάρια ουσία των συνδετικών ιστών, όπως επί παραδείγματι στους τένοντες, στο δέρμα, στα οστά, στα δόντια και στα αιμοφόρα αγγεία. Αντιπροσωπευτικά δείγματα είναι το κολλαγόνο, η ελαστίνη, το μετάξι, η κερατίνη, η ακτίνη και η μυοσίνη. Λειτουργικός τους ρόλος είναι η μηχανική στήριξη, η εξωτερική προστασία, η θερμική μόνωση, η συστολή και κινητικότητα, μπορεί όμως να έχουν και δομικό ρόλο. Η δομή και οι ιδιότητές αξιοποιούνται και στα τεχνητά εμφυτεύματα στην προσπάθεια μίμησης των φυσικών βιολογικών δομών. Η χρήση των τεχνητών πολυμερών ως βιοϋλικών είναι επίσης 11

13 εκτεταμένη, κυρίως χάρη στην ικανότητά τους να μορφοποιούνται εύκολα και να αποκτούν διάφορες μορφές, όπως νήματα, ράβδοι, ιξώδη υγρά και υμένα. Η απορρόφησή τους από τον οργανισμό γίνεται αρκετά αργά, ενώ μπορούν να προκληθούν αλλεργικές αντιδράσεις από τη διάσπαση και απορρόφησή τους. Σύνθετα υλικά: Στην κατηγορία των σύνθετων υλικών εντάσσονται τα υλικά που αποτελούνται από δύο ή περισσότερα συστατικά, τα οποία συνδυάζονται για να επιτευχθούν ειδικές ιδιότητες και χαρακτηριστικά, που καθένα από τα συμμετέχοντα συστατικά δεν μπορεί από μόνο του να επιτύχει. Τα σύνθετα υλικά βρίσκουν ευρεία εφαρμογή στην Ορθοπεδική και στην Οδοντιατρική αξιοποιώντας ταυτόχρονα τον υδροξυαπατίτη με στόχο τη μίμηση της δομής και των ιδιοτήτων των φυσιολογικών οστών. Είναι επιστημονικά αποδεδειγμένο ότι ένα υλικό το οποίο δεν έχει παραχθεί από τον ίδιο τον οργανισμό δεν είναι πλήρως συμβατό. Οι μόνες ουσίες που προσαρμόζονται και γίνονται πλήρως αποδεκτές από τον οργανισμό είναι αυτές που παράγει ο ίδιος. Οποιαδήποτε άλλη ουσία, η οποία αναγνωρίζεται από τον οργανισμό ως ξένη προκαλεί αντιδράσεις. Όταν ένα συνθετικό υλικό εισάγεται στον ανθρώπινο οργανισμό, ο ιστός αντιδρά με ποικίλους τρόπους οι οποίοι εξαρτώνται από τον τύπο του υλικού. Ο μηχανισμός με τον οποίο αντιδρά ο ιστός εξαρτάται από την αντίδραση του ιστού στην επιφάνεια του εμφυτεύματος. Γενικά, υπάρχουν τρεις κατηγορίες στις οποίες μπορεί να κατανεμηθεί ένα βιοϋλικό ανάλογα με την αλληλεπίδρασή του με τους ιστούς [10]: Αδρανή βιοϋλικά. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα βιοϋλικά, τα οποία μετά την εισαγωγή τους στον οργανισμό προκαλούν από ελάχιστη έως καθόλου αλληλεπίδραση με τους περιβάλλοντες ιστούς. Βιοενεργά υλικά, τα οποία, αφού εισαχθούν στον οργανισμό αλληλεπιδρούν με τον περιβάλλοντα οστίτη ιστό και σε μερικές περιπτώσεις ακόμα και με μαλακούς ιστούς. Αυτό συμβαίνει μέσα σε ένα χρονικό διάστημα, κατά το οποίο, η ανταλλαγή ιόντων μεταξύ του βιοενεργού υλικού και των γύρω σωματικών υγρών έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας στρώσης βιολογικού απατίτη (HCAp) στη διεπιφάνεια επαφής. 12

14 Βιοαπορροφήσιμα/ βιοαποικοδομήσιμαυλικά, τα οποία, μετά την εισαγωγή τους στον ανθρώπινο οργανισμό αρχίζουν με αργούς ρυθμούς να διαλύονται και να απορροφώνται από τον οργανισμό έως ότου αντικατασταθούν από τους νέο-αναπτυσσόμενους. Στα αδρανή βιοϋλικά ανήκουν το ανοξείδωτο ατσάλι, το τιτάνιο, η αλουμίνα, η μερικώς σταθεροποιημένη ζιρκονία και το πολυαιθυλένιο εξαιρετικά υψηλού μοριακού βάρους. Τα βιοενεργά υλικά µε τη σειρά τους διακρίνονται σε 2 κατηγορίες, στα βιοενεργά υλικά τάξης Α και Β. Τα υλικά τάξης Α, στα οποία ανήκουν οι βιοΰαλοι, έχουν την δυνατότητα πέρα από το να συνδέονται µε το οστό και να προάγουν την ανάπτυξη νέου οστού κατά µήκος της επιφάνειάς τους, να παράγουν και νέο οστό, µακριά από τη διεπιφάνεια υλικού/οστού, το οποίο συνδέεται και µε τους µαλακούς ιστούς, όπως είναι τα ούλα και ο χόνδρος. Τα υλικά τάξης Β στα οποία ανήκει και ο συνθετικός υδροξυαπατίτης συνδέονται µε το σκληρό ιστό (οστό) και προάγουν την ανάπτυξή του νέου οστού στην επιφάνειάς τους [11]. 1.2 Βιοΰαλοι Ιδιότητες Κεραµικά ονομάζονται τα κρυσταλλικά, µερικώς κρυσταλλικά ή άµορφα υαλώδη υλικά που προκύπτουν από τη θερµική κατεργασία ανόργανων, µη µεταλλικών ουσιών [12]. Υποκατηγορία των κεραµικών υλικών αποτελούν οι ύαλοι. Βιοκεραµικό χαρακτηρίζεται ένα οποιοδήποτε κεραµικό υλικό όταν αυτό παρουσιάζει κάποιου είδους βιοσυµβατότητα [13]. Τα βιοκεραµικά πρωτοεµφανίστηκαν στις αρχές της δεκαετίας του 70 έπειτα από τη συστηµατική αποτυχία των προκατόχων τους βιοϋλικών που ως τότε ήταν κυρίως το ατσάλι, τα κράµατα κοβαλτίου και διάφορα πολυµερή. Έτσι το ενδιαφέρον στράφηκε στα κεραµικά υλικά με στόχο να βρεθεί ένα νέο υλικό που να παρουσιάζει όσο το δυνατόν καλύτερα χαρακτηριστικά για την τελική ενσωμάτωση του στο οστό. Έτσι ανακαλύφθηκαν οι βιοΰαλοι. Οι βιοΰαλοι ουσιαστικά είναι ύαλοι µε βιοενεργές ιδιότητες οι οποίες επιτρέπουν την εμφύτευση τους στο ανθρώπινο σώμα για την αποκατάσταση ή την αντικατάσταση τών κατεστραμμένων ιστών [14]. 13

15 Από τη µελέτη διαφόρων συστάσεων στο σύστηµα του Ηench προέκυψε η πλέον γνωστή βιοενεργή ύαλος µε κατά βάρος χηµική σύσταση: 45%SiO2, 24.5%Na2O, 24.5%CaO και 6%P2O5, η οποία είναι γνωστή ως 45S5 ή bioglass [15]. Η επιτυχία της συγκεκριµένης σύστασης έναντι των πολλών άλλων που μελετήθηκαν στην πορεία οφείλεται σε 3 βασικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι υπεύθυνα για την εξαφάνιση βιοενεργότητας. Τα χαρακτηριστικά αυτά είναι: 1. το ποσοστό του SiO 2 (<60%), 2. η υψηλή περιεκτικότητα σε Na 2 O και CaO και 3. ο µεγάλος λόγος ασβεστίου προς φωσφόρο στο σύστηµα [16] Μηχανισµοί Βιοενεργότητας Η βιοενεργότητα των υάλων σχετίζεται άµεσα µε την ατοµική δοµή. Είναι γνωστό ότι οι ύαλοι δηµιουργούνται µε ενώσεις που αποκαλούνται υαλοσχηµατιστές (σχηµατιστές πλέγµατος) και υαλο-µορφοποιητές (µορφοποιητές πλέγµατος) [14]. Επιπλέον, οι αναλογίες και τα είδη των υαλοσχηµατιστών και των υαλοτροποποιητών είναι καθοριστικές όσον αφορά την τελική µορφή της δοµής του υάλου. Συνοπτικά, οι σχηµατιστές πλέγµατος είναι κυρίως οξείδια όπως P2O5, B2O5, Bi2O3 και SiO2. Ο σκοπός των υαλοσχηµατιστών είναι να σχηµατίζουν δεσµούς της µορφής π.χ. Si-O-Si, όπου το πυρίτιο σχηματίζει τετράεδρα µε το οξυγόνο ενώ ανά δύο τα πυρίτια µοιράζονται ένα κοινό οξυγόνο που ονοµάζεται γεφυρωτικό ή bridgingoxygens. Οι µορφοποιητές πλέγµατος είναι κυρίως στοιχεία από τα αλκάλια ή τις αλκαλικές γαίες. Συνήθως χρησιμοποιούνται τα στοιχεία K, Na, Li, Ca και Mg και στόχο έχουν να σπάνε τους δεσµούς του οξυγόνου που ενώνουν τα τετράεδρα µεταξύ τους (δηλαδή ταγεφυρωτικά) και να γίνονται τερµατικά (αγεφύρωτα οξυγόνα ή non-bridging oxygens) αυξάνοντας έτσι την αταξία της δοµής του γυαλιού. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τη µείωση της θεοκρασίας τήξης του γυαλιού καθώς και τη µείωση του ιξώδους του κάνοντας έτσι την διαδικασία παρασκευής των υάλων πιο εύκολη. Η χαρακτηριστική αυτή δοµή των υλικών που περιγράφτηκε παραπάνω ευνοεί την έντονη δραστηριότητα των υάλων µέσα σε υδατικό περιβάλλον και αυτή ακριβώς η δραστηριότητα είναι και το µεγαλύτερο πλεονέκτηµα των βιοενεργών υάλων κατά την χρήση τους στην ιατρική. Τα προϊόντα της αντίδρασης της υάλου µε 14

16 τα υγρά του σώµατος οδηγούν στον σχηµατισµό µιας κρυσταλλικής φάσης απατίτη όµοιου µε το ανόργανο συστατικό των οστών. Τα στάδια αυτά µαζί µε τα στάδια επιφανειακών αντιδράσεων σχηµατισµού δεσµού µεταξύ του βιολογικού ιστού και της βιοενεργής υάλου προέκυψαν από τη µελέτη τουτετραφασικού συστήµατος του Hench και παρατίθενται παρακάτω. Εικόνα 1.1: Αναπαράσταση σχηματισμού απατίτη σε βιοενεργές επιφάνειες Στάδιο 1: Πραγματοποιείται έκπλυση της επιφάνειας της υάλου και ταχεία ανταλλαγή ιόντων Na + ή K + της επιφάνειας µε Η + ή Η 3 Ο + από το διάλυµα προς σχηµατισµό σιλανολών. Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται η διάχυση των ιόντων από το κυρίως διάλυµα στην επιφάνεια του υλικού σύµφωνα µε την αντίδραση : Si-Ο-Νa + + Η + + ΟΗ - Si-ΟΗ - + Νa + (aq)+ ΟΗ - Το ph του διαλύµατος αυξάνεται ως αποτέλεσµα της αντικατάστασης των ιόντων Η + µε κατιόντα. 15

17 Στάδιο 2: Λόγω της απώλειας των ιόντωνna + από την επιφάνεια της υάλου καταστρέφονται οι γέφυρες οξυγόνου του πυριτικού πλέγµατος (Si-O-Si) και σχηµατίζονται και πάλι σιλανόλες ενώ ταυτόχρονα απελευθερώνονται στο διάλυµα οµάδες Si(OH) 4 όταν κάποιο άτοµο πυριτίου χάσει όλες τις γέφυρές του σύµφωνα µε την αντίδραση: Si-O-Si + H 2 O Si-OH + HO-Si Η επιφάνεια αποκτά ζελατινώδη υφή (silicagel) και υψηλό πορώδες µε ειδική επιφάνεια της τάξης των 100m 2 και διάµετρο πόρων της τάξης των 30-50Å. Στάδιο 3:Ακολουθεί συµπύκνωση και πολυµερισµός των σιλανολικών οµάδων που έχουν δηµιουργήσει ένα στρώµα υψηλής συγκέντρωσης πυριτικών µονάδων και χαµηλής συγκέντρωσης αλκαλίων στην επιφάνεια της υάλου σύµφωνα µε την αντίδραση: Στάδιο 4:Πραγµατοποιείται προσρόφηση ιόντωνca 2+, PO 3-4 καιco 2-3 από το διάλυµα στο επιφανειακό στρώµα της πυριτίας, στο οποίο αναπτύσσεται ένα άµορφο υµένιο CaO-P 2 O 5 µε την παρουσία και άλλων ιόντων όπως CO 2-3. Στάδιο 5:Τέλος στο στάδιο αυτό παρατηρείται κρυστάλλωση του άµορφου στρώµατος CaO-P 2 O 5 µέσο της επίδρασης των ιόντων OH - 2- και CO 3 στο διάλυµα. Τελικό αποτέλεσµα ο σχηµατισµός ενός στρώµατος κρυσταλλικού υδροξυαπατίτη, το οποίο αποτελεί φυσικό δοµικό συστατικό των οστών όπως έχουµε αναφέρει και παραπάνω. Η βιοενεργότητα, λοιπόν, συνδέεται άμεσα με την κρυστάλλωση του ένυδρου στρώµατος CaO-P 2 O 5 και για το λόγο αυτό ο σχηµατισµός ενός βιολογικά 16

18 ενεργού στρώµατος ανθρακικού υδροξυαπατίτη είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την σύνδεση της υάλου ή του υαλο-κεραµικού στους ιστούς. Τα 5 παραπάνω σταδία μπορούν να παρατηρηθούν φασματοσκοπικά σε in vitro μελέτες με διαλύμα SBF (διάλυμα προσομοίωσης των σωματικών υγρών). Μετά από αυτά τα στάδια, δηλαδή μετά το σχηματισμό του απατίτη, ακολουθούν στάδια που αφορούν την αλληλεπίδραση της βιοϋάλου με τον βιολογικό ιστό προς σχηματισμό δεσμού. Τα στάδια αυτά μπορούν να μελετηθούν μονό με in vivo μελέτες και κυτταροκαλλιέργειες [17]. Εποµένως, η βιοενεργότητα που παρατηρείται σε κάποιες βιουάλους έγκειται στην ικανότητά να σχηµατίζουν στην επιφάνειά τους ένα βιολογικά ενεργό στρώµα φωσφορικού ασβεστίου όταν αυτές βρεθούν σε κάποιο βιολογικό ή προσοµοιωµένο υγρό κατά τα in vitro πειράµατα [18]. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την διάλυση της υάλου στο SBF καθώς και το πάχος του υδροξυαπατίτη που θα σχηματιστεί είναι: σύσταση της υάλου, η υφή και η δομή της υάλου που μπορεί να καθοριστεί κατά την παρασκευή της (μέσω τήγματος sol-gel) [19]. Τέλος ο χρόνος (t 0.5bb ) που απαιτείται για να συνδεθεί περισσότερο από το 50% της διεπιφάνειας με οστό έχει άμεση σύνδεση με το επίπεδο της βιοενεργότητας, όπως φαίνεται στην παρακάτω σχέση. I B = 100 t 0.5bb (1.1) Τα υλικά που παρουσιάζουν τιμή I B >8, π.χ. το 45S5 Bioglass, µπορούν να αλληλεπιδρούν και µε µαλακό και µε σκληρό ιστό ενώ τα υλικά µε τιµή του 0<I B <8, π.χ. ο συνθετικός υδροξυαπατίτης, αλληλεπιδρούν µόνο µε σκληρό ιστό Τεχνική κολλοειδούς γέλης (sol-gel) Όπως προαναφέρθηκε ο όρος Bioglass δόθηκε στο πρώτο υλικό που σχημάτισε ισχυρό δεσμό με το οστό από τον Larry Hench όταν ο ίδιος και οι συνεργάτες το εφεύραν στο University of Florida το Η πρώτη καλά μελετημένη 17

19 σύνθεση είναι 45S5 Bioglass, η οποία περιέχει 45% SiO 2, 24,5% Na 2 O, 24,5% CaO και 6% P 2 0 5, σε ποσοστό κατά βάρος. Το Bioglass αποδείχτηκε πολύ επιτυχές υλικό σε κλινικές εφαρμογές, για παράδειγμα, για τη θεραπεία της περιοδοντική νόσου (PerioGlas) και ως οστικό μόσχευμα (NovaBone). Εμφυτεύματα Bioglass έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την αντικατάσταση κατεστραμμένων οστών του αυτιού, αποκαθιστώντας έτσι τις ακουστικές ικανότητες των ασθενών. Μέχρι τη δεκαετία του 90, βιοενεργοί ύαλοι παρασκευάζονται παραδοσιακά με τη χρήση συμβατικών τεχνολογιών κατασκευής γυαλιών. Οι διαδικασίες αυτές όμως παρουσιάζουν αρκετά μειονεκτήματα όπως είναι τα χαμηλά επίπεδα καθαρότητας, λόγω των υψηλών θερμοκρασιών που συνδέονται με την τήξη και ομογενοποίηση, αλλά και η χαμηλή περιεκτικότητα πυριτίου και υψηλή περιεκτικότητα αλκαλίων που χαρακτηρίζουν τις βιοενεργές ύαλους οι οποίες παρασκευάζονται με τις συμβατικές αυτές τεχνικές. Το ενδιαφέρον για την επεξεργασία sol-gel ξεκίνησε στα μέσα της δεκαετίας του 1980 με την παρατήρηση ότι η υδρόλυση του tetraethyl orthosilicate (TEOS), σε όξινες συνθήκες, οδήγησε στον σχηματισμό του SiO 2, με τη μορφή ινών και μονολίθων. Οι Li, Clarck και Hench, ήταν οι πρώτοι που εφάρμοσαν την διαδικασία sol-gel, προκειμένου να παρασκευάσουν βιοενεργές υάλους των διαφόρων συνθέσεων, αξιοποιώντας πλήρως τα οφέλη της τεχνικής, όπως η μεγάλη ειδική επιφάνεια καθώς και το πλούσιο στρώμα οξειδίου του πυριτίου τα οποία είναι απαραίτητα χαρακτηριστικά για την δημιουργία σύνδεσης υάλου με τον βιολογικό ιστό αυτά μέσω του υδροξυανθρακικού στρώμα συγκόλλησης [20]. Στην παρούσα εργασία η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των δειγμάτων είναι η sol-gel η οποία περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω. Η µέθοδος sol-gel χρησιμοποιείται ως μια εναλλακτική μέθοδος παρασκευής προϊόντων και σε αρκετές περιπτώσεις αντικαθιστά παραδοσιακές τεχνικές δίνοντας τη δυνατότητα παρασκευής συστάσεων που δεν ήταν δυνατές με άλλες μεθόδους. Τα τελικά προϊόντα χαρακτηρίζονται από μεγάλο βαθμό ομοιογένειας και καθαρότητας. Ο όρος «sol-gel» αποδίδεται σε όλες τις διεργασίες κατά τις οποίες ένα διάλυμα ή αλλιώς sol μετατρέπεται σε μία άκαμπτη πορώδη μάζα, δηλαδή μία γέλη 18

20 ή αλλιώς πήκτωμα (gel). Δηλαδή είναι μία διαδικασία κατά την οποία σχηματίζονται μεγάλα ανόργανα πολυμερή. Η τεχνική αυτή η οποία βασίζεται στην υδρόλυση και την συμπύκνωση αλκοξειδίων μετάλλων αποτελεί έναν χηµικό τρόπο χαµηλής θερµοκρασιακής σύνθεσης κεραµικών και υάλων που περιέχουν ένα ή περισσότερα χηµικά στοιχεία. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η διάλυση των πρόδροµων ενώσεων σε κατάλληλο διαλύτη και στη συνέχεια προσθήκη καταλύτη, συµπλοκοποιητή και νερού. Έτσι δηµιουργείται ένα κολλοειδές διάλυµα (sol) το οποίο µε τη πάροδο του χρόνου µετατρέπεται σε πήκτωµα (gel). Ο όρος κολλοειδής (sol) αναφέρεται στη διασπορά κολλοειδών σωµατιδίων σε κάποιο ρευστό µέσο. Τα κολλοειδή σωµατίδια είναι στερεά σωµατίδια µεγέθους nm και στη θερµοκρασία δωµατίου είναι διασκορπισµένα λόγω της διαρκούς θερµικής τους κίνησης µέσα σε ένα µέσο, το οποίο µπορεί να είναι είτε αέρας, είτε κάποιο οργανικό υγρό, είτε νερό µε αποτέλεσµα να σχηµατίζονται αερολύµατα, οργανικά λύµατα και υδρολύµατα αντίστοιχα. Με τον όρο γέλη-πήκτωµα (gel) ορίζεται ένα τριών διαστάσεων δίκτυο στερεής φάσης, στενά συνδεδεμένης µε µία ακίνητη συνεχή υγρή φάση, η οποία είναι εγκλωβισμένη µέσα στη στερεά [21]. Το gel περιέχει πόρους, οι οποίοι έχουν διαστάσεις µικρότερες του µικροµέτρου καθώς και αλυσίδες πολυµερούς των οποίων το µέγεθος κατά µέσο όρο είναι λίγο µεγαλύτερο του µικροµέτρου. Ο όρος gel περιλαµβάνει µια µεγάλη ποικιλία υλικών διαφόρων συνδυασµών τα οποία µπορούν να ταξινοµηθούν σε τέσσερις κατηγορίες: α. καλά οργανωµένα παχύρευστα υλικά, β. οµοιόµορφα δίκτυα πολυµερών, που βρίσκονται σε πλήρη αταξία, γ. δίκτυα πολυµερών τα οποία έχουν σχηµατιστεί µε φυσική συσσώρευση και στα οποία επικρατεί αταξία και δ. συγκεκριµένες δοµές σε αταξία. 19

21 Γενικά οι βιοΰαλοι που παρασκευάζονται με αυτή τη μέθοδο εμφανίζουν ενισχυμένη βιοενεργή συμπεριφορά σε σύγκριση με τις βιοϋάλους που παρασκευάζονται με τη μέθοδο ταχείας ψύξης. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι βιοΰαλοι που παρασκευάζονται με τη μέθοδο κολλοειδούς γέλης, μπορούν να θεωρούνται βιοενεργές ακόμη και σε περιεκτικότητα μέχρι και 80 mol% σε πυρίτιο. Η ύπαρξη του πορώδους και της αυξημένης επιφάνειας που εμφανίζουν τα υλικά κολλοειδούς γέλης είναι τα χαρακτηριστικά που ευθύνονται για την καλύτερη βιοενεργή συμπεριφορά. Συγκεκριμένα για τις πυριτικές υάλους, μπορούν να παρασκευαστούν με δύο τρόπους, είτε μέσω πολυμερισμού κολλοειδών σωματιδίων πυριτίου σε υδάτινο περιβάλλον, είτε μέσω των αντιδράσεων συμπύκνωσης και πολυμερισμού. Οποιαδήποτε μέθοδος παρασκευής γέλης και αν ακολουθείται, το άμορφο δίκτυο το οποίο θα μετατραπεί σε γυαλί, είναι σε διαρκή επαφή με κάποια υγρή φάση που γεμίζει το πορώδες του (οι ύαλοι οι οποίες λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο παρουσιάζουν πορώδες το οποίο δεν παρουσιάζεται με τις άλλες μεθόδους παρασκευής υάλων). Η διαδικασία sol-gel µπορεί να διαχωριστεί στα ακόλουθα στάδια [22]: 1. Μηχανική ανάδευση: Τα συστατικά αναμειγνύονται σε νερό και/ή αλκοόλη µε σκοπό την δηµιουργία αιωρηµάτων. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιούνται αντιδράσεις υδρόλυσης και πολυσυµπύκνωσης των αλκοξειδίων και σχηματίζονται κολλοειδή σωµατίδια τα οποία διασκορπίζονται στο διάλυµα και δηµιουργούν το sol, ακολουθώντας παρακάτω αντιδράσεις: Υδρόλυση: Μ(OR) n + nh 2 O M(OH) n + nroh Συμπύκνωση: M-OR + M-OH M-OH + M-O-M + R-OH και M-OH + M-OH M-O-M + H-OH 2. Χύτευση: το διάλυμα sol χυτεύεται σε κατάλληλο καλούπι για την µορφοποίηση του προϊόντος ανάλογα µε τη συγκεκριµένη εφαρµογή για την 20

22 οποία προορίζεται. Το χαµηλό ιξώδες του αρχικού διαλύματος (sol) ευνοεί την μορφοποίηση του. 3. Σχηµατισµός Gel (ζελατινοποίηση): οι αντιδράσεις υδρόλυσης και πολυσυµπύκνωσης συνεχίζονται και μέσω της διασύνδεσης των µέχρι πρότινος απομονωμένων κολλοειδών δηµιουργείται ένα τρισδιάστατο πλέγµα που έχει ως αποτέλεσµα και την προοδευτική αύξηση του ιξώδους του διαλύµατος. Το sol βρισκόμενο µέσα στο καλούπι και σε θερµοκρασία περιβάλλοντος αρχίζει και λαμβάνει τελικά το σχήµα του καλουπιού λόγω της αύξησης του ιξώδους και της πυκνότητας του διαλύματος. 4. Γήρανση: Το στάδιο µπορεί να απαιτεί ώρες ή και µέρες. Η πολυσυμπύκνωση συνεχίζεται ενώ παρατηρείται μείωση του πορώδους και περαιτέρω μείωση του ιξώδους. Η γήρανση συμβάλλει στην αύξηση της ισχύος του gel, κάτι που είναι πολύ σημαντικό για να αποφευχθεί η διάσπασή του κατά την ξήρανση. Έτσι δημιουργείται gel µε µεγαλύτερη συνοχή και µηχανική αντοχή. 5. Ξήρανση: Είναι το στάδιο στο οποίο αποµακρύνονται τα υγρά που έχουν παραµείνει στο δίκτυό του και είναι το πιο κρίσιµο στάδιο όσον αφορά το αν επιθυµείται να ληφθεί σκόνη ή συµπαγές υλικό. Χαρακτηριστικό του σταδίου αυτού είναι η ανάπτυξη µεγάλων τριχοειδών τάσεων κατά τη διάρκειά του, όταν το µέγεθος των πόρων είναι µικρό (<20nm) γεγονός που µπορεί να επιφέρει καταστροφή του gel, αν δεν ελεγχθεί η επιφανειακή τάση του υγρού, η οποία µπορεί να µειωθεί µε την προσθήκη κατάλληλων ενώσεων. 6. Χημική Σταθεροποίηση: Πραγματοποιείται µε τη θέρμανση του υλικού σε διάφορες θεοκρασίες και έχει ως αποτέλεσµα την απομάκρυνση των δεσµών Μi-OH από την επιφάνεια του υλικού, κάτι που οδηγεί σε ένα χηµικά σταθερότερο υλικό. 7. Αύξηση της πυκνότητας: Αποτελεί ένα στάδιο προαιρετικό ανάλογα με το επιθυμητό αποτέλεσμα. Η πραγματοποίησή του πάντως οδηγεί σε ένα υλικό τόσο πυκνό όσο ο τηγμένος χαλαζίας με απαλοιφή του πορώδους. 21

23 Εικόνα 1.2 : Σχηματική αναπαράσταση διαδικασίας παρασκευής βιοϋάλου με την μέθοδο sol-gel Τις τελευταίες δεκαετίες η µέθοδος sol-gel προκαλέσει µεγάλο επιστηµονικό και τεχνολογικό ενδιαφέρον όσον αφορά τη σύνθεση βιοενεργών υλικών και ιδιαίτερα βιοενεργών υάλων και υαλοκεραµικών λόγω πλεονεκτηµάτων που παρουσιάζει των συμβατικών µεθόδων σύνθεσης τέτοιων υλικών. Τα πλεονεκτήµατα αυτά συνοψίζονται παρακάτω [22]: Επιτρέπει το σχηµατισµό υάλων σε θερμοκρασίες αρκετά χαµηλότερες από τις συνηθισµένες με άμεσο αποτέλεσµα την εξοικονόµηση ενέργειας. Η ικανότητα παραγωγής µεγάλων ποσοτήτων προϊόντων και µε βελτιωμένη οµοιογένεια. Μεγαλύτερη ευελιξία µιας και επιτρέπει την παρασκευή υάλων σε διάφορα επιθυµητά σχήµατα ανάλογα με την εφαρμογή για την οποία προορίζονται. Η επίτευξη προϊόντων εξαιρετικής καθαρότητας (µέχρι και 99.99%). Τα προϊόντα της µεθόδου αυτής είναι πορώδη με υψηλότερη βιοενεργότητα. Καλύτερος έλεγχος της βιονεργότητας αλλάζοντας την σύνθεση των συστατικών ή τη µικροδοµή Πορώδη βιοκεραμικά υλικά Τα πορώδη υλικά είναι µία ειδική κατηγορία σύνθετων υλικών που εµφανίζονται σε πληθώρα διεργασιών µε µεγάλο τεχνολογικό και επιστηµονικό 22

24 ενδιαφέρον [23]. Είναι ετερογενή, πολυφασικά υλικά τα οποία συνήθως διαθέτουν πόρους και συνεπώς διαθέτουν και µεγάλη επιφάνεια. Έτσι για παράδειγµα επιτρέπουν τη ροή, τη µεταφορά µάζας, την αλλαγή φάσης και την προσρόφηση ρευστών µέσα στη δοµή τους. Τα δίκτυα των πόρων σε ένα πορώδες στερεό παρουσιάζουν µεγάλη ποικιλία ως προς το µέγεθος και το σχήµα των πόρων που το συνιστούν, των οποίων η µορφή και το πλήθος εξαρτάται από τη µέθοδο παρασκευής του υλικού. Ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα των πορωδών υλικών ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για την αξιοποίηση τους σε διάφορες διεργασίες είναι το µέγεθος των πόρων. Επιπλέον, τα πορώδη υλικά µπορούν να διακριθούν σε φυσικά και συνθετικά. Τα φυσικά πορώδη υλικά µπορεί να είναι γεωλογικά ή βιολογικά ανάλογα µε την προέλευση τους. Τα φυσικά πορώδη συνήθως παρουσιάζουν µεγαλύτερο µέγεθος πόρων από ότι τα συνθετικά. Το πρώτα φυσικό πορώδες που περιγράφηκε ποτέ είναι ο φυσικός ζεόλιθος στιλβίτης που καταγράφηκε από το Σουηδό µεταλλειολόγο. Ιδιαίτερα για ιατρικές εφαρμογές έχουν αναπτυχθεί τα βιοκεραμικά, τα οποία χρησιμοποιούνται για την αντικατάσταση δοντιών έως και την αντικατάσταση οστών στο ανθρώπινο σώμα. Τα βιοκεραμικά ανήκουν στην κατηγορία των τεχνικών κεραμικών. Τα κεραμικά αυτά μπορούν να είναι μονοκρύσταλλοι, (σαπφειρίνης), πολυκρυσταλλικά υλικά (αλούμινα ή υδραξυαπατίτητης), γυαλιά (Bioglass), υαλοκεραμικά, (Ceravital ή A/W υαλοκεραμικό), ή σύνθετα υλικά (βιοϋάλωμα με ίνες από πολυαιθυλένιουδροξυαπατίτη).το πορώδες, η επικοινωνία των πόρων καθώς και το μέγεθος τους είναι πολύ βασικά χαρακτηριστικά των βιοκεραμικών μιας και αποτελούν απαραίτητες προϋποθέσεις για την προσκόληση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσα στα υλικά αυτά όταν χρησιμοποιούνται στην ιστομηχανική. 23

25 1.2 Ικριώματα Κάθε μέρα χιλιάδες χειρουργικές επεμβάσεις εκτελούνται για να αντικατασταθεί ή να επισκευαστεί ιστός που έχει υποστεί βλάβη εξαιτίας μιας ασθένειας ή ενός τραύματος. Η ανάπτυξη στον τομέα της μηχανικής των ιστών (Tissue Engineering) έχει ως στόχο την κατανόηση των ιδιοτήτων και λειτουργιών του βιολογικού συστήματος των κυττάρων, αλλά και την ανάπτυξη βιολογικών υποκατάστατων για την επαναφορά, τη διατήρηση ή και τη βελτίωση της λειτουργίας ενός ιστού συνδυάζοντας κύτταρα από το σώμα με εξαιρετικά πορώδη βιοενεργά ικρίωματα, τα οποία μπορούν να δρουν ως μήτρες για την αναγέννηση των ιστών. Παρακάτω θα περιγράψουμε τα είδη και τις ιδιότητες των υλικών που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των ικριωμάτων καθώς και τις αντίστοιχες εφαρμογές τους στην ταχέως εξελισσόμενη επιστήμη της ιστομηχανικής Ορισμός. Τι είναι τα ικριώματα; Ικριώματα (scaffolds) ονομάζονται οι τεχνητές κατασκευές που παρέχουν ένα δίκτυο (σκελετό) το οποίο καθοδηγεί την τρισδιάστατη ανάπτυξη κυττάρων με στόχο την δημιουργία/αναγέννηση νέου ιστού [24]. Το ικρίωμα είναι αυτό που δίνει το κατάλληλο σχήμα και δομή ανάλογα με τον ιστό τον οποίο επιθυμούμε να κατασκευάσουμε και υποστηρίζει την κατασκευή μέχρι να αποκτήσει σταθερότητα. Ουσιαστικά αποτελεί την μήτρα που χρησιμοποιείται στην ιστομηχανική για την καλλιέργεια/πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση και την ανάπτυξη των κυττάρων που θα σχηματίσουν τον ιστό. Το μέγεθός τους καθώς και η εσωτερική αρχιτεκτονική θα πρέπει να επιτρέπουν και να ευνοούν την προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Για να εκπληρώνουν το ρόλο τους και να προάγουν την ιστική ανάπλαση χρειάζεται να είναι βιοαποικοδομήσιμα, βιοσυμβατά και βιοενεργά υλικά 24

26 Μετά το πέρας της διαδικασίας αυτής το ικρίωμα μπορεί να παραμένει μαζί με τον ιστό ως παθητικό υλικό, μπορεί να απομακρύνεται με φυσικές ή μηχανικές μεθόδους και μπορεί να είναι και βιοδιασπώμενο, οπότε απομακρύνεται σταδιακά Ιδιότητες ικριωμάτων Με στόχο την αναγέννηση διαφόρων ιστών οι επιστήμονες της ιστομηχανικής κατασκευάζουν μεγάλο αριθμό ικριωμάτων χρησιμοποιώντας μια αξιόλογη ποικιλία βιοϋλικών και πληθώρα τεχνικών παρασκευής. Ανεξάρτητα από τον τύπο του ιστού του οποίου η αναγέννηση είναι επιθυμητή, υπάρχουν σημαντικοί παράγοντες που καθορίζουν την καταλληλότητα ενός ικριώματος για χρήση στην μηχανική των ιστών. Oι παράγοντες αυτοί αναλύονται παρακάτω. Βιοσυμβατότητα (Biocompatibility) είναι πρώτη και κύρια προϋπόθεση ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί το ικρίωμα στην ιστομηχανική. Γενικά με τον βιοσυμβατότητα εννοούμε την ικανότητά ενός ικριώματος να υποστηρίζει την κανονική κυτταρική δραστηριότητα [25]. Βιοσυμβατό ικρίωμα δεν είναι τοξικό και δεν προκαλεί αξιόλογες κλινικές και βιοχημικές αντιδράσεις. Σε γενικές γραμμές, όσο καλύτερα το υλικό μιμείται τον πραγματικό ιστό, τόσο πιο βιοσυμβατό θα είναι. Πρόσθετα, η βιοενεργότητα των ικριωμάτων είναι ένας ακόμη παράγοντας που χρήζει ελέγχου μιας και συνδέεται άμεσα με την ανάπτυξη του νέου ιστού στην θέση του ικριώματος. Ο όρος βιοενεργό αποδίδεται σε υλικά το οποία μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τους γύρω ιστούς με τελικό αποτέλεσμα την ανάπτυξη υδροξυκαρβονικού απατήτη ο οποίος ευνοεί την προσκόλληση οστεοβλαστων και την ανάπτυξη οστίτη ιστού. Το μικροπεριβάλλον των κυττάρων είναι γενικά ιδιαίτερο και μπορεί να είναι δύσκολο να βρεθούν υλικά που να μπορούν να αντέξουν σε αυτό. Το ph στον οργανισμό μπορεί να κυμαίνεται από ιδιαίτερα όξινο μέχρι ελαφρώς βασικό. Επίσης μπορεί τοπικά να εμφανίζονται πολύ υψηλές τάσεις. Τα παραπάνω βάζουν σε δοκιμασία τα περισσότερα υλικά που δεν αρκεί απλώς να αντέξουν 25

27 σε αυτές τις συνθήκες, αλλά θα πρέπει να αποδίδουν και σε συγκεκριμένες λειτουργίες. Βιοδιάσπαση ή Βιοαποικοδόμηση (biodegradable): H βιοαποικοδόμηση είναι ένας σημαντικός παράγοντας επειδή τα ικριώματα προτιμάται να απορροφούνται από τους γειτονικούς ιστούς και όχι να αφαιρούνται με χειρουργική επέμβαση [26]. Βιοαποικοδομήσιμο είναι το υλικό το οποίο μπορεί να διασπαστεί/αποσυντεθεί από ζωντανούς οργανισμούς (όχι απαραίτητα από τον άνθρωπο). Παραδείγματα βιοαποικοδομήσιμων υλικών είναι το πολύ (γαλακτικό οξύ) το οποίο μπορεί να αποικοδομηθεί και από τον άνθρωπο και η κυτταρίνη η οποία αποικοδομείται ενζυμικά από μικροοργανισμούς. Ο ρυθμός απορρόφησης πρέπει να συμπίπτει όσο το δυνατόν με τον ρυθμό ανάπτυξης του ιστού. Με αυτήν την προϋπόθεση τα ικριώματα παρέχουν σταθερό σκελετό και δομική ακεραιότητα στα κύτταρα που φτιάχνουν το δικό τους φυσικό καλούπι γύρω από τα ικριώματα. Στο τέλος αυτής της διαδικασίας τα ικριώματα αποσυντίθενται αφήνοντας το νέο ιστό να καταλάβει ολόκληρο τον χώρο [27]. Αξίζει να σημειωθεί ότι ένα βιοενεργό υλικό δεν είναι απαραίτητα και βιοσυμβατό και αντίστροφα. Τα υλικά, όμως που χρησιμοποιούνται για ιστική ανάπλαση πρέπει να χαρακτηρίζονται και από τις δύο ιδιότητες. Η βιοαποικοδομησιμότητα στην πλειονότητα των περιπτώσεων είναι επιθυμητή αλλά όχι απαραίτητη. Εφόσον το ικρίωμα είναι βιοσυμβατό μπορεί να παραμείνει (χωρίς να αποικοδομηθεί) στον οργανισμό μετά την ανάπλαση ιστού, ή να αφαιρεθεί. Μικροδομή των ικριωμάτων: Η μικροδομή των ικριωμάτων που χρησιμοποιούνται στην ιστομηχανική παίζει εξαιρετικά κρίσιμο ρόλο στην πορεία της δημιουργίας νέου ιστού. Σε κάθε περίπτωση η ύπαρξη ενός διασυνδεδεμένου δικτύου πόρων καθώς και το υψηλό πορώδες (porosity) είναι 26

28 απαραίτητο για να εξασφαλιστεί η κυτταρική διείσδυση, η επαρκής διάχυση θρεπτικών συστατικών στα κύτταρα εντός του ικριώματος καθώς και η απομάκρυνση των απόβλητων έξω από αυτό [28,29]. Ένα ακόμη βασικό στοιχείο είναι το μέγεθος των πόρων. Το μέγεθος του πόρου θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 100 μm σε διάμετρο, για την επιτυχή διάχυση των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου που είναι απαραίτητα για την κυτταρική επιβίωσης. Ωστόσο για τον οστίτη ιστό σε ανάπτυξης το μέγεθος των πόρων στο εύρος από 200 έως 350 μm βρέθηκε να είναι βέλτιστο [30]. Δυστυχώς, το πορώδες μειώνει τις μηχανικές ιδιότητες όπως αντοχή σε θλίψη. Σύμφωνα με τις έρευνες που έχουν γίνει η αντοχή των πυκνών βιοκεραμικών υλικών είναι παρόμοια με αυτήν του φλοιώδους οστού, και των διάφορων πολυμερών με εκείνη του σπογγώδους οστού. Από την άλλη η αντοχή ενός σύνθετου ικριώματος κεραμικού-πολυμερούς είναι συνήθως ασθενέστερη από ότι των οστών. Πορώδη μεταλλικά ικριώματα πληρούν τις μηχανικές απαιτήσεις του οστού ωστόσο δημιουργούν ανησυχία σε σχέση με διαχωρισμό των μεταλλικών ιόντων [31]. Μηχανικές ιδιότητες: Eίναι πολύ σημαντικό οι μηχανικές ιδιότητες του ιστού που θα κατασκευαστεί με μεθόδους ιστομηχανικής να είναι ίδιες με αυτές του πραγματικού ιστού. Για τον λόγω αυτό είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε τις μηχανικές ιδιότητες των ιστών. Αυτό γενικά δεν είναι πολύ εύκολο και η μοντελοποίηση των ιστών με βάση γνωστά μη βιολογικά υλικά δεν είναι πάντα ακριβής. Για παράδειγμα οι μηχανικές ιδιότητες των οστών ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό από το σπογγώδες οστό στο φλοιώδες. Συγκεκριμένα το μέτρο ελαστικότητας του Young για το φλοιώδες οστό κυμαίνεται μεταξύ 15 και 20 GPa και για το σπογγώδες οστό είναι μεταξύ 0,1 και 2 GPa. Η αντοχή σε θλίψη κυμαίνεται μεταξύ 100 και 200 MPa για το φλοιώδες οστό, και μεταξύ 2 και 20 MPa για σπογγώδες οστό. Η μεγάλη διακύμανση των μηχανικών ιδιοτήτων και 27

29 της γεωμετρίας των οστών καθιστά δύσκολη την κατασκευή ένός ιδανικού ικριώματος για την αναγέννηση του οστίτη ιστού [1,33] Για την κατασκευή του ικριώματος θα πρέπει λοιπόν να γνωρίζουμε αν ο πραγματικός ιστός έχει ιδιότητες ελαστικές ή και πλαστικές. Επίσης θα πρέπει να προσδιορίσουμε αν το υλικό έχει «μνήμη» στη φόρτιση, δηλαδή αν εμφανίζει ιξωδοελαστικές ή και ιξωδοπλαστικές ιδιότητες. Επίσης, θα πρέπει να γνωρίζουμε αν το υλικό είναι ισότροπο ή ανισότροπο οπότε θα πρέπει να προσδιοριστούν διαγράμματα τάσης-παραμόρφωσης για όλες τις πιθανές διευθύνσεις φόρτισης. Γενικά τα βιολογικά υλικά έχει αποδειχθεί ότι είναι πολύ δύσκολο να μελετηθούν και να μοντελοποιηθούν με βάση την κλασική μηχανική ενώ πολλές ιδιότητές τους είναι μη γραμμικές. Στην ιδανική περίπτωση λοιπόν τα ικριώματα θα πρέπει να έχουν μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες και ανάλογες με την ανατομική θέση στην οποία πρόκειται να εμφυτευθεί και θα πρέπει να είναι αρκετά ανθεκτικά για να επιτρέψει τον χειρουργικό χειρισμό κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης. Ενώ αυτό είναι σημαντικό σε όλους τους ιστούς, οι προκλήσεις για καρδιαγγειακές και ορθοπεδικές εφαρμογές είναι ιδιαίτερα μεγάλες. Παραγωγή ικριωμάτων με καλές μηχανικές ιδιότητες είναι μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην προσπάθεια να κατασκευάσει οστών ή χόνδρου. Για αυτούς τους ιστούς, το εμφυτευμένο ικρίωμα πρέπει να διαθέτει επαρκή μηχανική ακεραιότητα για να λειτουργήσει από τον χρόνο της εμφύτευσης μέχρι την ολοκλήρωση της διαδικασία της αναγέννησης [32]. Μια άλλη πρόκληση είναι ότι τα ποσοστά αποκατάστασης ποικίλλουν ανάλογα με την ηλικία, κάτι που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά το σχεδιασμό ικριωμάτων για ορθοπεδικές εφαρμογές. Αξιοσημείωτο είναι και το γεγονός ότι κατά καιρούς έχουν παραχθεί ικριώματα με πολύ καλές μηχανικές ιδιότητες οι οποίες όμως λειτουργούν σε βάρος του επιθυμητού πορώδους με αποτέλεσμα τελικά τα ικριώματα αυτά να αποτυγχάνουν σε in vivo εφαρμογές λόγω της ανεπαρκούς χωρητικότητας για αγγείωση. Είναι σαφές, λοιπόν ότι η ισορροπία μεταξύ των μηχανικών ιδιοτήτων και της πορώδους δομής που θα 28

30 επιτρέπει τη διείσδυση των κυττάρων και αγγείωση είναι και το σημείο κλειδί για την επιτυχία οποιουδήποτε ικριώματος Κατηγορίες ικριωμάτων Τα ικριώματα διακρίνονται σε κατηγορίες σύμφωνα με: 1. τον ρυθμός αποδόμησής τους, 2. τη δομή τους και 3. τη σύνθεση. Πιο συγκεκριμένα με βάση τον ρυθμό αποδόμησής τους χωρίζονται σε μόνιμα και σε προσωρινά. Τα μόνιμα ικριώματα διατηρούν το σχήμα και την αντοχή τους κατά τη διάρκεια της αναγέννησης του ιστού, ενώ τα προσωρινά ικριώματα διασπώνται σε απλούστερες δομές ή απορροφώνται. Επίσης, με βάση τη δομή τους διακρίνονται στα ικριώματα στερεάς κατάστασης και στις υδροπηκτές. Επιπλέον, σύμφωνα με το κριτήριο της δομής τα ικριώματα στερεάς κατάστασης μπορούν διακρίνονται με την σειρά τους σε δύο τύπους: τα πορώδη και τα ινώδη ικριώματα Και οι δύο τύποι ικριωμάτων είναι πορώδη υλικά, εμφανίζουν μικροκενά στο εσωτερικό τους. Στα ινώδη υλικά ένα πλέγμα ινών οδηγεί σε σχηματισμό πόρων. Οι δομές ινωδών και πορωδών ικριωμάτων παρουσιάζονται στις παρακάτω φωτογραφίες (Εικόνα 1.3) από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM). Τα ινώδη ικριώματα συνήθως χρησιμοποιούνται για την ανάπλαση μαλακού ιστού (ίνες κολλαγόνου) όπως δέρματος ενώ σε εφαρμογές ανάπλασης οστίτη ιστού χρησιμοποιούνται κυρίως πορώδη ικριώματα. Μία ακόμη ξεχωριστή κατηγορία ικριωμάτων αποτελούν τα υδροπηκτώματα (hydrogels). Τα υδροπηκτώματα που χρησιμοποιούνται σε εφαρμογές ιστομηχανικής και είναι κολλοειδείς διασπορές πολυμερών σε νερό. 29

31 Εικόνα 1.3 : α) Πορώδες ικρίωμα κυτταρίνης, β) ινώδες ικρίωμα οξικής κυτταρίνης Με βάση τη σύνθεσή τους διακρίνονται σε βιοκεραμικά ικριώματα, πολυμερικά ικριώματα και σύνθετα ικριώματα. Βιοκεραμικά ικριώματα: Από την ανακάλυψη και την ανάπτυξη του απορροφήσιμου 45S5 Bioglass μέχρι και σήμερα, πολλές διαφορετικές συνθέσεις έχουν διερευνηθεί στην διάρκεια των περασμένων χρόνων [34]. Τα in vitro πειράματα, όπου χρησιμοποιήθηκε 3D βιοΰαλος-ικρίωμα με 70% πορώδες και 300 έως 400 μm μέγεθος πόρου έδειξαν σχηματισμό στρώματος ανθρακικού υδροξυαπατίτη (HCA) στην επιφάνεια του ικριώματος, κάτι που ενίσχυσε σημαντικά την δραστικότητα των οστεοβλαστών [35]. Επίσης το στρώμα HCA παρατηρήθηκε προσρόφηση πρωτεϊνών και αυξητικών παραγόντων που διευκόλυναν τον in νiνο σχηματισμό του νέου οστού [36]. Τα βιοκεραμικά ικριώματα που συντίθενται από το συνδυασμό Ca/P, περιλαμβάνουν κατά κύριο λόγο β-τριφωσφορικό ασβέστιο (β-tcp) και υδροξυαπατίτη (ΗΑ) και είναι κατάλληλα για την αναγέννηση της οδοντίνης εξαιτίας της ομοιότητας των δομών τους με τη φυσική δομή του ιστού, της βιοσυμβατότητάς τους με αυτόν και της ικανότητάς τους για οστεοενσωμάτωση. Πολλές ομάδες ερευνητών έχουν χρησιμοποιήσει τέτοιου είδους ικριώματα. Οι Ζhang χρησιμοποίησαν σκόνη ΗΑ/β-TCP για την εμφύτευση ανθρώπινων DPSCs, με αποτέλεσμα την αναγέννηση μικρής ποσότητας ιστών που προσομοίαζαν στο οδοντινοπολφικό σύμπλεγμα. Μια πρόσφατη in vivo έρευνα, στην οποία συμπλέγματα DPSCs και 30

32 HA/TCP εμφυτεύθηκαν σε αποκαλυμμένους πολφούς γομφίων γουρουνιών, πέτυχε τη σύνθεση ενασβεστιωμένου ιστού που προσομοίαζε την οδοντίνη [37]. Πολυμερή ικριώματα: Τα ολυμερή μπορεί να είναι τόσο βιοδραστικά όσο και βιοαποικοδομήσιμα [37]. Συνήθως χρησιμοποιούνται φυσικά πολυμερή στην μηχανική οστίτη ιστού όπως το κολλαγόνο, μετάξι, υαλουρονικό οξύ, χιτοζάνη και άλλα [38]. Στα πλεονεκτήματα των φυσικών πολυμερών συγκαταλέγονται η χημική τους ομοιότητα με μακρομόρια του περιβάλλοντος όπου εμφυτεύονται, το γεγονός ότι δεν προκαλούν φλεγμονές τοξικές αντιδράσεις και η ικανότητα αποικοδόμησής τους με φυσικό μεταβολικό τρόπο από τον οργανισμό. Τροχοπέδη στην αξιοποίησή τους αποτελούν η ανοσολογική αντίδραση του οργανισμού εναντίον τους, με εξαίρεση το κολλαγόνο, η διαφοροποίησή τους από ιστό σε ιστό και η απώλεια της δραστικότητάς τους σε θερμοκρασίες πολύ χαμηλότερες από το σημείο τήξεως. Τα τεχνητά πολυμερή χρησιμοποιούνται εκτενώς στα εμφυτεύματα λόγω της ευκολίας μορφοποίησής τους. Κύριες είναι οι εφαρμογές τους στις προσθετο-συνθετικές αρθρώσεις, στη γναθοπροσωπική προσθετική για την αποκατάσταση οστικών ελλειμμάτων, στην οδοντιατρική και στα αρτηριακά μοσχεύματα. Ορισμένα πολυμερή όπως πολύ (φουμαρικό προπυλένιο) (PPF) παρουσιάζουν υψηλή αντοχή σε θλίψη η οποία είναι συγκρίσιμη με εκείνη του φλοιώδους οστού και ο χρόνος διάσπασής τους μπορεί να ελέγχεται κατα ένα μεγάλο ποσοστό [39]. Ωστόσο, η χρήση των πολυμερών ικριωμάτων μειονεκτεί εξαιτίας της απουσίας των εξειδικευμένων για τον εκάστοτε κυτταρικό τύπο χημικών πληροφοριών που συμπεριλαμβάνονται στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM), καθώς και της πιθανής έλλειψης βιοσυμβατότητας, στην περίπτωση απελευθέρωσης παραπροϊόντων από την από σύνθεση του ικριώματος [40]. Σύνθετα ικριώματα: Σύνθετα τα ικριώματα που παρασκευάζονται από δύο ή περισσότερα ευδιάκριτα διαφορετικά υλικά όπως κεραμικά και πολυμερή. Η 31

33 ανάπτυξη ενός διασυνδεδεμένου CaP-πολυμερoύς ικριώματος θα έχει σαν συνέπεια την υιοθέτηση των πλεονεκτημάτων και των δύο συστατικών,cap και πολυμερούς, ώστε να καλυφθούν μηχανικές και φυσιολογικές απαιτήσεις του ιστού ξενιστή [41]. Το πολυμερές σε ικριώματα CaP αυξάνει τη σκληρότητα και την αντοχή σε θλίψη ώστε να είναι παρόμοια με αυτήν των οστών. Παρομοίως, η μηχανική ακεραιότητα και βιοδραστικότητα των πολυμερών μπορεί να βελτιωθεί με την προσθήκη CaP. Μεταλλικά ικριώματα: Τα μέταλλα έχουν υψηλή αντοχή σε θλίψη και εξαιρετική αντοχή στην κόπωση. Πορώδη μεταλλικά ικριώματα, κυρίως από τιτάνιο (Ti) και τανταλίου (Ta), έχουν μελετηθεί ως υλικά αντικατάστασης οστού [42]. Ωστόσο, σε αντίθεση με CaP ή πολυμερή ικριώματα, τα βιομόρια δεν μπορούν να ενσωματωθούν σε αυτά τα ικριώματα και δεν είναι βιοαποικοδομήσιμα. Επιπλέον, υπάρχουν ανησυχίες σχετικά με την απελευθέρωση μεταλλικών ιόντων. Οι τεχνικές τροποποίησης επιφάνειας χρησιμοποιούνται συχνά για τη βελτίωση της βιοδραστικότητας Ti ικριωμάτων [43]. Οι πρόσφατες εξελίξεις στην βιοδραστικών μετάλλων αναφέρουν ορθοπεδικό βιοδιασπώμενο υποκατάστατο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ειδικές εφαρμογές.[44,45] Τρόποι παρασκεύης ικριωμάτων Για να κατασκευαστούν τα ικριώματα και να αποτελέσουν τη μήτρα για την ανάπλαση των ιστών μπορεί κανείς να ακολουθήσει διαφορετικές μεθοδολογίες. Η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου παρασκευής εξαρτάται από τον ιστό του οποίου την αναγέννηση επιθυμούμε ώστε σε κάθε περίπτωση το τελικό ικρίωμα να διευκολύνει τη διανομή των κυττάρων, την καθοδήγηση και την ανάπτυξη τους σε τρισδιάστατο χώρο [47]. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι μέθοδοι παραγωγής που βασίζονται στην αντιγραφή ενός πολυμερικού αφρού εμποτίζοντάς τον με βιοκεραμικό διάλυμα, ώστε 32

34 να καλύψει την επιφάνεια του πολυμερούς. Στην συνέχεια, το πολυμερές εξαχνώνεται με θέρμανση και το κεραμικό υφίσταται πυροσυσσωμάτωση (sintering). Παρόλο που η διαδικασία αυτή οδηγεί σε πολύ ανοικτούς και δικτυωτούς αφρούς, η εξάχνωση του πολυμερούς αφήνει κοίλες και φθαρμένες επιφάνειες οι οποίες μπορεί να μειώσουν σημαντικά τις μηχανικές ιδιότητες του τελικού αφρού. Παρά το γεγονός αυτό, οι αφροί αυτοί κατασκευάζονται σε μεγάλες ποσότητες και χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία, συχνά ως φίλτρα για λιωμένα μέταλλα. Στην δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι μέθοδοι παραγωγής που χρησιμοποιούν πρόσθετα θυσιαζόμενα υλικά για τον σχηματισμό του κελιού, τα οποία κατόπιν απομακρύνονται. Ανάλογα με το σχήμα του κελιού που επιδιώκεται να επιτευχθεί, δύναται να χρησιμοποιηθούν διάφορα πρόσθετα υλικά τα οποία στις κατάλληλες ποσότητες δίνουν αφρούς ανοικτού ή κλειστού κελιού. Στην τρίτη και τελευταία κατηγορία, ανήκουν οι μέθοδοι παραγωγής που βασίζονται στην απευθείας αφροποίηση ενός διαλύματος κολλοειδούς γέλης μέσω μηχανικής διαταραχής (συνήθως ανάδευσης) ή μέσω αυτενεργούς απελευθέρωσης αερίων. Με αυτές τις μεθόδους παράγεται ένα ευρύ φάσμα πορωδών δομών και ως εκ τούτου ένα ευρύ φάσμα ιδιοτήτων. Οι δομές αυτές είναι γενικά λιγότερο ανοικτές από αυτές που εμφανίζονται στις μεθόδους αντιγραφής πολυμερικών αφρών. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι μέθοδοι παραγωγής που βασίζονται στην αντιγραφή ενός πολυμερικού αφρού εμποτίζοντάς τον με το διάλυμα της κολοειδούς γέλης (slurry), ώστε να καλύψει την επιφάνεια του πολυμερούς. Στην συνέχεια, το πολυμερές εξαχνώνεται με θέρμανση και το κεραμικό υφίσταται πυροσυσσωμάτωση (sintering). Παρόλο που η διαδικασία αυτή οδηγεί σε πολύ ανοικτούς και δικτυωτούς αφρούς, η εξάχνωση του πολυμερούς αφήνει κοίλες και φθαρμένες επιφάνειες οι οποίες μπορεί να μειώσουν σημαντικά τις μηχανικές ιδιότητες του τελικού αφρού. Παρά το γεγονός αυτό, οι αφροί αυτοί κατασκευάζονται σε μεγάλες ποσότητες και χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία, συχνά ως φίλτρα για λιωμένα μέταλλα. 33

35 Εικόνα 1.4 : Σχηματική απεικόνιση των κύριων μεθόδων παραγωγής κεραμικών αφρών Μέθοδος αντιγραφής σπογγώδους μήτρας (Foam replica technique) Η Foam replica technique είναι μια διαδεδομένη διαδικασία που αρχικά αναπτύχθηκε για την παραγωγή κεραμικών αφρών το Η προσαρμογή της διαδικασίας για την κατασκευή Bioglass ικριωμάτων παρουσιάζεται σχηματικά στο σχήμα

36 Σχήμα 1.1: Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τη μέθοδο αντιγραφής αφρού για την κατασκευή Bioglass ικριωμάτων που χρησιμοποιούνται στην ιστομηχανική Η διαδικασία ξεκινά με την κάλυψη του πολυμερικού αφρού με σωματίδια βιοδραστικής υάλου (Bioglass ) που είναι υπό μορφή πολτού [47]. Ο αφρός πολυμερούς, έχοντας ήδη την επιθυμητή μακροδομή, χρησιμεύει ως προσωρινός σκελετός για την βιοδραστική επίστρωση γυαλιού. Το πρότυπο πολυμερές βυθίζεται στον πολτό, (π.χ. διάλυμα κολοειδούς γέλης (sol-gel)), που διεισδύει στη δομή και έχει ως αποτέλεσμα μια ομοιογενή επίστρωση των σωματιδίων Bioglass στην επιφάνεια του υποστρώματος του πολυμερούς. Μετά την ξήρανση, το πολυμερές υφίσταται θερμική κατεργασία σε υψηλή θερμοκρασία (> 450 C) προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η ζημιά στην μικροδομή (δηλαδή microcracking) των πόρων της επίστρωσης Bioglass. Μόλις έχει αφαιρεθεί το πολυμερές, το γυαλί μέσω όπτησης αποκτά την επιθυμητή πυκνότητα. Η διαδικασία αναπαράγει/αντιγράφει την μακροπορώδη δομή του αφρού του πολυμερούς, και οδηγεί σε μια διακριτή μικροδομή, όπως φαίνεται στο Σχήμα.Η τεχνική αντίγραφης αφρού παρουσιάζει πλεονεκτήματα έναντι άλλων τεχνικών κατασκευής ικριωμάτων. Ένα από αυτά είναι η 35

37 δυνατότητα να παράγουμε ικριώματα με εξαιρετικά πορώδη δομή και με ρυθμιζόμενες διαστάσεις πόρων. Επιπλέον μπορούν να παρασκευαστούν ικριώματα ακανόνιστων σχημάτων για να ταιριάζουν με το μέγεθος και το σχήμα τους σε οποιοδήποτε ελάττωμα παρουσιάζει κάποιος ιστός. Επιπλέον, η τεχνική αυτή δεν περιλαμβάνει τη χρήση τοξικών χημικών ουσιών και είναι σχετικά γρήγορη και αποδοτική σε σύγκριση με άλλες τυποποιημένες τεχνικές επεξεργασίας.το πορώδες των ικριωμάτων είναι σε γενικές γραμμές μεγαλύτερο από 90%, με το μέγεθος των πόρων να κυμαίνεται από 500 έως 700 μm. Τα ικριώματα, τα οποία έχουν υποστεί θερμική κατεργασία σε θερμοκρασία πάνω από 1000 C, έχουν δείξει μεγαλύτερες αντοχές σε θλίψη και κάμψη. Αυτή η βελτιωμένη μηχανική αντοχή αποδόθηκε στα κρυσταλλικά σωματίδια (Na 2 Ca 2 Si 3 O 9 ) που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια πυροσυσσωμάτωσης και οδηγούν σε μια τυπική υαλοκεραμική μικροδομή του αφρού. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η μηχανικά ανθεκτική κρυσταλλική δομή είναι σε θέση να μετασχηματιστεί σε άμορφη και τελικά σε βιοαποικοδομήσιμο φωσφορικο ασβέστιο σε ένα βιολογικό περιβάλλον [],[]. In vitro έρευνες έχουν δείξει ότι τα Bioglass κεραμικά ικριώματα έχουν εξαιρετική ικανότητα υποστήριξης των οστεοβλαστών. Τα κύτταρα διεισδύουν αποτελεσματικά μέσα στην πορώδη δομή και πολλαπλασιάζονται στην κεντρική περιοχή των εξαιρετικά πορώδων ικριωμάτων. 1.4 Υγρά προσομοίωσης του πλάσματος του αιματος (SIMULATED BODY FLUIDS - SBF) Τα υλικά που παρουσιάζουν βιοενεργότητα, όπως έχει ήδη αναφερθεί σε προηγούμενη παράγραφο, δημιουργούν το δεσμό με τις επιφάνειες στις οποίες τοποθετούνται, μέσω ενός στρώματος απατίτη που αναπτύσσουν στην επιφάνειά τους. Η δυνατότητα σύνδεσης ενός βιοϋλικού με οργανικό ιστό, αποδεικνύεται, τόσο in vitro όσο και in vivo, με την ανάπτυξη επιφανειακού στρώματος υδροξυαπατίτη. Οι έλεγχοι που πραγματοποιούνται επικεντρώνονται στη μελέτη των φυσικών, χημικών και μηχανικών ιδιοτήτων των υλικών ώστε να διαπιστωθεί η καταλληλότητα ή μη της 36

38 χρήσης τους σε ιατρικές εφαρμογές. Στις τεχνικές in vitro, το υλικό τοποθετείται σε διάφορα υγρά που προσομοιώνουν το ανόργανο τμήμα του πλάσματος αίματος με παρουσία η μη καλλιέργειας κυττάρων. Οι παράμετροι του διαλύματος, όπως το αρχικό ph, η συγκέντρωση ιόντων και η θερμοκρασία έχουν σημαντική επίδραση στη διάλυση των βιοϋλικών και ακόμη και στον τύπο των ανθρακικών φωσφορικών αλάτων που θα κατακαθίσουν. Η συγκέντρωση ιόντων και επομένως και το ph, προφανώς αλλάζουν με την πάροδο του χρόνου, καθώς εξελίσσεται η διάλυση, και το γεγονός αυτό θα επηρεάσει τελικά το λόγο διάλυσης. Αν το ph ανέβει πάνω από μία κρίσιμη τιμή θα επέλθει κυτταροτοξικότητα [48]. Τα κυριότερα διαλύματα που έχουν χρησιμοποιηθεί για in vitro μελέτες είναι: Το tris buffer που αποτελεί ένα απλό αποστειρωμένο διάλυμα. Το c-sbf το οποίο είναι ένα tris buffer διάλυμα αλλά με ιοντική συγκέντρωση παρεμφερή αυτής του πλάσματος αίματος, και Tα a-mem και D-MEM τα οποία περιλαμβάνουν οργανικά αλλά και βιολογικά συστατικά του πλάσματος αίματος [49] Συμβατικό υγρό προσομοίωσης (c-sbf) Το c-sbf αποτελεί το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο προσομοιωμένο υγρό της ανόργανης φάσης του πλάσματος του αίματος [50]. Η τοποθέτηση ενός υλικού στο SBF αλλά και κάθε υγρού προσομοίωσης - γίνεται με σκοπό τη μελέτη της αλληλεπίδρασης της επιφάνειας του με τα ιόντα του υγρού. Στην περίπτωση των βιοϋάλων μελετάται η ανάπτυξη ή μη απατίτη, ο χρόνος έναρξης δημιουργίας του, ο ρυθμός ανάπτυξής του (βαθμός βιοενεργότητας), καθώς και ο ρυθμός βιοαποικοδόμησής του. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο SBF είναι το συμβατικό SBF (conventional SBF, c-sbf). Συγκρίνοντας τα SBF s με το πλάσμα του αίματος, η διαφορά που παρατηρείται κατά κύριο λόγο, βρίσκεται στις ποσότητες των ιόντων Cl - και HCO - 3. Όπως φαίνεται για το c-sbf τα ιόντα Cl - είναι περισσότερα και τα ιόντα HCO - 3 λιγότερα από αυτά του πλάσματος αίματος. Εφόσον ο απατίτης περιέχει ανθρακικά ιόντα, οι 37

39 διαφοροποιήσεις στη σύσταση του SBF επηρεάζουν τις διεργασίες ανάπτυξης απατίτη, το χρόνο που απαιτείται για να επιτευχθεί η ανάπτυξή του, το πάχος του και την κρυσταλλικότητα του αναπτυσσόμενου στρώματος. Πίνακας 1.1: Συγκέντρωση των ιόντων του c- SBF και του πλάσματος αίματος Ιόν SBF Πλάσµα Na K qmg Ca Cl HCO HPO 4-2 SO Μια ακόμη σημαντική παράμετρος που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τα in vitro πειράματα είναι και ο λόγος επιφάνειας υλικού προς όγκο του διαλύματος (SA/V). Όσο υψηλότερος είναι ο λόγος SA/V, τόσο μεγαλύτερος είναι ο ρυθμός σχηματισμού του απατίτη στην επιφάνεια του υλικού και τόσο υψηλότερο θα είναι το τελικό ph του διαλύματος, συγκριτικά με μικρότερους λόγους SA/V [51]. Για την παρασκευής του c- SBF εκτός από δις-απεσταγμένο νερό είναι απαραίτητα τα παρακάτω συστατικά Πίνακας NaCl 2. NaHCO 3 3. KCl 4. K 2 HPO 4. 3H 2 O 5. MgCl 2.6H 2 O 6. 1N-HCl (aq) 7. CaCl 2.2H 2 O 8. Na 2 SO 4 9. Tris(hydroxymety aminomethane NH 2 C(CH 2 OH) 3 38

40 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΥ Υπάρχουν πολλές τεχνικές που µπορούν να εφαρµοσθούν για τον χαρακτηρισµό των µεσοπορωδών υλικών και παράλληλα των βιοένεργων υάλων. Συνήθως χρησιµοποιούνται συνδυαστικά ώστε να γίνει δυνατός ο προσδιορισµός της δοµής τους.μερικές από τις πιο βασικές τεχνικές τις οποίες χρησιμοποιήσαμε και θα περιγράψουμε αναλυτικά παρακάτω είναι Φασματοσκοπια Υπερύθρου FTIR, η Περίθλαση ακτίνων-χ XRD (Χ Ray Difraction) και η Ηλεκτρονική Μικροσκόπια Σάρωσης SEM (Scanning Electron Microscopy). 2.1 Φασματοσκοπία Υπερύθρου FTIR Μία από τις βασικότερες τεχνικές ελέγχου και στοιχειομετρικής ανάλυσης σε μοριακό επίπεδο διαφόρων άμορφων και κρυσταλλικών σε βιοϊατρικές αλλά και γενικότερες τεχνολογικές εφαρμογές, είναι οι τεχνικές οπτικής φασματοσκοπίας υπέρυθρου (FTIR). Η IR φασματοσκοπία μελετά την αλληλεπίδραση του υπέρυθρου φωτός με τα μόρια και πρόκειται για μια από τις πιο σημαντικές τεχνικές στην ταυτοποίηση μορίων. Επιπλέον, είναι αξιοσημείωτο οτι σχεδόν όλα τα είδη της ύλης απορροφούν IR ακτινοβολία γεγονός που καθιστά τηντεχνική αυτή εξαιρετικά χρήσιμη. Η περιοχή του Υπερύθρου στο φάσμα της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας εκτείνεται από τα μέχρι τα 10 cm -1 και διαιρείται σε τρία τμήματα, το κοντινό υπέρυθρο (NIR), το μεσαίο υπέρυθρο (MIR) και το μακρινό υπέρυθρο (FIR). Η περιοχή του MIR ( cm-1) είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη για τον χαρακτηρισμό των υλικών. Κατά την πρόσπτωση υπέρυθρης ακτινοβολίας στο μόριο, το μόριο μπορεί να δονείται μεταξύ των ατόμων ή των δεσμών. Ο αριθμός των τρόπων δόνησης, σχετίζεται με τον αριθμό των ατόμων και του δεσμού εντός του μορίου. Οι δονήσεις που πραγματοποιούνται στα μόρια, κατά την πτώση του υπέρυθρου φωτός, διακρίνονται σε δονήσεις έκτασης και δονήσεις κάμψης [54,55]. 39

41 Για να απορροφηθεί IR ακτινοβολία από ένα μόριο πρέπει να υπάρχει μεταβολή στη διπολική του ροπή. Έτσι μόρια όπως το H2, Cl2, F2, He, Ne, Ar κλπ είναι διαφανή στην υπέρυθρη ακτινοβολία, καθώς έχουν μηδενική διπολική ροπή. Με εξαίρεση τα παραπάνω, όλα τα μόρια όπως, HCl, NaCl κλπ. που μεταβάλλουν την διπολική τους ροπή κατά την δόνηση ή την περιστροφή τους, απορροφούν σε συγκεκριμένες συχνότητες στο υπέρυθρο, που είναι χαρακτηριστικές των ατόμων του μορίου και του τρόπου δόνησής τους. Συγκεκριμένα, κατά τις δονήσεις έκτασης σημειώνεται αλλαγή της μεσοατομικής απόστασης, κατά μήκος του άξονα του δεσμού. Αντίστοιχα στις δονήσεις κάμψης μεταβάλλεται η γωνία μεταξύ δύο δεσμών. Τα είδη των ταλαντώσεων παριστάνονται στο παρακάτω σχήμα Δονήσεις έκτασης και κάμψης Συμμετρική έκταση Ασύμμετρη έκταση Συμμετρική κάμψη σε επίπεδο (scissor) Ασύμμετρη κάμψη σε επίπεδο (rock) Συμμετρική κάμψη εκτός επιπέδου (twist) Ασύμμετρη κάμψη εκτός επιπέδου (twist) Σχήμα 2.1 : Δυνατές ταλαντώσεις ατόμων ή δεσμών σε ένα μόριο. 40

42 Για να απορροφηθεί IR ακτινοβολία από ένα μόριο πρέπει να υπάρχει μεταβολή στη διπολική του ροπή. Έτσι μόρια όπως το H 2, Cl 2, F 2, He, Ne, Ar κλπ είναι διαφανή στην υπέρυθρη ακτινοβολία, καθώς έχουν μηδενική διπολική ροπή. Με εξαίρεση τα παραπάνω, όλα τα μόρια όπως, HCl, NaCl κλπ. που μεταβάλλουν την διπολική τους ροπή κατά την δόνηση ή την περιστροφή τους, απορροφούν σε συγκεκριμένες συχνότητες στο υπέρυθρο, που είναι χαρακτηριστικές των ατόμων του μορίου και του τρόπου δόνησής τους. Συγκεκριμένα, κατά τις δονήσεις έκτασης σημειώνεται αλλαγή της μεσοατομικής απόστασης, κατά μήκος του άξονα του δεσμού. Αντίστοιχα στις δονήσεις κάμψης μεταβάλλεται η γωνία μεταξύ δύο δεσμών. Τα είδη των ταλαντώσεων παριστάνονται στο παραπάνω σχήμα 1.4. Η φασματοσκοπία υπερύθρου FTIR είναι μια ταχύτατη μη καταστροφική μέθοδος χαρακτηρισμού ευρέως φάσματος υλικών (λίγα δευτερόλεπτα διαρκεί μια πλήρης σάρωση). Η φασματοσκοπία FTIR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να ανιχνεύσει και να χαρακτηρίσει τόσο υλικά όγκου όσο και υπέρλεπτα υμένια. Επιπλέον ο λόγος του σήματος προς τον θόρυβο είναι μεγάλος, παρουσιάζει μεγάλη σταθερότητα μήκους κύματος, ισχυρό σήμα εξόδου, μεγάλη ανάλυση (<0.1 cm -1 ), ενώ δεν παρουσιάζεται δέσμη διασποράς. Στη φασματοσκοπία υπερύθρου η απορρόφηση της ακτινοβολίας μετράται και παριστάνεται γραφικά ως συνάρτηση του κυματάριθμου (1/λ) σε cm -1. Η συχνότητα στην οποία εμφανίζονται οι κορυφές μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην κατανόηση των χαρακτηριστικών του δεσμού (ποιοτική μελέτη). Τέλος, το μέγεθος των κορυφών ενός φάσματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον υπολογισμό της ποσότητας ενός συστατικού που υπάρχει (νόμος του Beer, ποσοτική μελέτη). Η Φασματοσκοπία Υπερύθρου (FTIR) εμφανίζεται στη βιβλιογραφία σαν μια από τις βασικότερες μεθόδους μελέτης και ταυτοποίησης της ανάπτυξης στρώματος HCAp σε βιοενεργά υλικά. Ένας σημαντικός λόγος εκτός του ότι η μέθοδος είναι μη καταστροφική και ταχύτατη είναι ότι το φάσμα IR του υδροξυαπατίτη είναι αρκετά 41

43 μελετημένο και παρουσιάζει χαρακτηριστικές κορυφές σε μία ευρεία περιοχή του μεσαίου υπερύθρου (MIR). Η λήψη των φασμάτων υπερύθρου για τα αντίστοιχα υλικά γίνεται με τις τεχνικές διαπερατότητας και ανακλαστικότητας Διαπερατότητας (Transmittance) Μετράται η διερχόμενη από το δείγμα ακτινοβολία και τα αποτελέσματα εκφράζονται σαν Transmittance ή Absorbance (A=-logT). Στην περίπτωση αυτή, προκειμένου να μετρηθεί η διερχόμενη ακτινοβολία ή το δείγμα πρέπει να είναι πολύ λεπτό ή ελάχιστη ποσότητα του υλικού να αναμιχθεί με κάποια μη απορροφούσα στη φασματική περιοχή που μας ενδιαφέρει ουσία πχ. KBr, CsΙ. 2.2 Περίθλαση ακτινών Χ (XRD) Η Περίθλαση ακτίνων-χ (XRD) αποτελεί μια αποτελεσματική αναλυτική τεχνική, η οποία χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό άγνωστων κρυσταλλικών υλικών. Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στην παρατήρηση της έντασης της ελαστικά σκεδαζόμενης ακτινοβολίας μιας δέσμης ακτίνων-χ που προσπίπτει σε ένα δείγμα σα συνάρτηση της γωνίας σκέδασης, της πόλωσης και του μήκους κύματος. Αρχικά οι ακτίνες-χ αλληλεπιδρούν με τα ηλεκτρόνια στα άτομα. 42

44 Εικόνα 2.1: Διάταξη οργάνου XRD Όταν τα φωτόνια των ακτίνων-χ συγκρούονται με τα ηλεκτρόνια, κάποια φωτόνια της προσπίπτουσας δέσμης εκτρέπονται από την αρχική τους διεύθυνση. Αν το μήκος κύματος των σκεδαζόμενων ακτίνων-χ δεν αλλάξει, δηλαδή αν δεν αλλάξουν ενέργεια παρά μόνο ορμή, τότε η σκέδαση αυτή ονομάζεται ελαστική (σκέδαση Thompson). Η ελαστικά σκεδαζόμενη ακτινοβολία μεταφέρει πληροφορίες για την κατανομή των ηλεκτρονίων σε ένα υλικό και είναι αυτή που μετράται στα πειράματα περίθλασης. Η πιο ευρέως διαδεδομένη τεχνική χαρακτηρισμού υλικών με περίθλαση ακτίνων-χ είναι η Powder XRD. Το δείγμα είναι συνήθως σε μορφή σκόνης, αποτελούμενο από λεπτούς κόκκους ενός μονοκρυσταλλικού υλικού. Ο όρος σκόνη σημαίνει ότι οι κόκκοι είναι τυχαία προσανατολισμένοι στο δείγμα, με αποτέλεσμα τα περιθλώμενα κύματα να δημιουργούν ένα μέγιστο (κορυφή) συμβολής, συμμετρικό της κατανομής των ατόμων. Οι θέσεις και οι εντάσεις των μεγίστων χρησιμοποιούνται στην αναγνώριση της δομής (ή φάσης) του υλικού. Για παράδειγμα, οι γραμμές πρίθλασης του γραφίτη θα είναι διαφορετικές από αυτές του διαμαντιού, παρόλο που και τα δύο αποτελούνται από άτομα άνθρακα. Η µονοχρωµατική ακτινοβολία ακτίνων-χ προσπίπτει στην επιφάνεια στερεών δειγµάτων, που είναι τοποθετηµένα σε δειγµατοφορείς σε µορφή σκόνης. Τα δείγµατα 43

45 είναι σε µορφή σκόνης για να έχουµε τυχαία κατανοµή όλων των κρυσταλλογραφικών διευθύνσεων του υπό µελέτη δείγµατος, και περιθλάται από τα διάφορα σετ των κρυσταλλογραφικών επιπέδων που υπάρχουν στη δοµή του υλικού µε βάση την εξίσωση του Bragg : 2d hkl sinθ=nλ όπου n είναι ακέραιος αριθµός, λ το µήκος κύµατος των ακτίνων Χ, d hkl η απόσταση µεταξύ δύο κρυσταλλογραφικών επιπέδων και θ η γωνία µεταξύ του επιπέδου του δείγµατος και της προσπίπτουσας δέσµης. Σε όλες τις άλλες γωνίες θα πρέπει να µην λαµβάνεται ακτινοβολία. Ο νόµος του Bragg µπορεί να αναπαρασταθεί γραφικά όπως φαίνεται και στο σχήμα 2.2. Σχήμα 2.2 : Σχηματική αναπαράσταση του νόμου Bragg Η τεχνική αυτή είναι µη καταστροφική και απαιτεί µικρή προετοιµασία του δείγµατος. Με την περίθλαση ακτίνων Χ µπορούµε να µελετήσουµε στερεά οποιασδήποτε χηµικής φύσης όπως χηµικές ενώσεις, κράµατα µετάλλων, ορυκτά και άλλα σύνθετα υλικά είτε κρυσταλλικά είτε άµορφα. Η περίθλαση ακτίνων Χ επιτρέπει τον προσδιορισµό της δοµής, της σύστασης του δείγµατος όπως και βοηθά στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση της περιεκτικότητας αυτού. Επιπλέον μας παρέχει άμεσα πληροφορίες για τη γεωμετρία των πόρων και τη διάταξη της δομής των 44

46 μεσοπορωδών υλικών. Παράλληλα η προετοιμασία των δειγμάτων είναι εύκολη και η βιβλιοθήκη των γνωστών κρυσταλλικών υλικών πολύ πλούσια Ηλεκτρονική Μικροσκόπια Σάρωσης SEM Η ηλεκτρονική µικροσκοπία σάρωσης (SEM) είναι µια αρκετά διαδεδοµένη τεχνική για τη µορφολογική µελέτη των υλικών µε αρκετά υψηλή ανάλυση (~10 nm). Το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο σάρωσης χρησιµοποιεί δέσµη ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας αντί για φως για να εξετάσει αντικείµενα σε λεπτοµερή κλίµακα. Η δέσµη ηλεκτρονίων σαρώνει την επιφάνεια του δείγµατος µε το οποίο αλληλεπιδρά. Από την αλληλεπίδραση αυτή προκύπτουν πληροφορίες σε σχέση µε τα άτοµα των στοιχείων που απαρτίζουν το εξεταζόµενο δείγµα. Σχήμα 2.3 : σχηματική αναπαράσταση ηλεκτρονικού µμικροσκοπίου σάρωσης Σε ένα τυπικό SEM, τα ηλεκτρόνια εκπέμπονται με θερμιονική εκπομπή από νήμα βολφραμίου. Η δέσμη των ηλεκτρονίων, η οποία έχει τυπικά ένα έυρος ενεργειών από μερικές εκατοντάδες ev έως 100 kev, συγκεντρώνεται από έναν ή δύο συμπυκνωτές φακούς σε μια πολύ λεπτή δέσμη της τάξεως των νανομέτρων. Η δέσμη 45

47 διαπερνάει δυο αντικειμενικούς φακούς, οι οποίοι αποκλίνουν τη δέσμη οριζόντια και κάθετα, έτσι ώστε να σαρώσει μια μεγάλη ορθογώνια περιοχή του δείγματος. Όταν η αρχική δέσμη ηλεκτρονίων αλληλεπιδρά με το δείγμα, τα ηλεκτρόνια χάνουν ενέργια από την επαναλαμβανόμενη σκέδαση και απορρόφηση μέσα στον όγκο αλληλεπίδρασης του δείγματος, ο οποίος εκτείνεται από λίγότερο από 100nm μέχρι περίπου 5μm μέσα στην επιφάνεια. Η ανταλλαγή ενέργειας μεταξύ της δέσμης των ηλεκτρονίων και του δείγματος έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή ηλεκτρονίων και ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, η οποία μπορεί να ανιχνεύεται από έναν ανιχνευτή και να μεταφράζεται σε εικόνα [56]. Εικόνα 2.1: Φωτογραφία ηλεκτρονικού µικροσκοπίου σάρωσης µεσοπορώδους υλικού που αποτελείται από νανοσωµατίδια διοξειδίου του πυριτίου Εκτός από την εκπομπή δευτερογενών και οπισθοσκεδαζόμενων ηλεκτρονίων κατά την πρόσπτωση της δέσμης στο δείγμα έχουμε και εκπομπή ακτίνων-χ, οι οποίες οφείλονται στη σκέδαση των ηλεκτρονίων της δέσμης από τα ηλεκτρόνια των ατόμων του δείγματος. Οι ακτίνες-χ, οι οποίες είναι χαρακτηριστικές των στοιχείων του δείγματος, συλλέγονται από τους κρυστάλλους της Φασματοσκοπίας Ενεργειακής Διασποράς. 46

48 To ηλεκτρονιό αυτό μικροσκοπίου είναι ικανό να παράγει υψηλής διακριτικής ικανότητας εικόνες της επιφάνειας ενός δείγματος. Λόγω του τρόπου δημιουργίας της εικόνας, οι εικόνες SEM έχουν μια χαρακτηριστική τρισδιάστατη εμφάνιση και είναι χρήσιμες στην αναγνώριση της επιφανειακής δομής ενός δείγματος. Έτσι το SEM δίνει πληροφορίες για την µορφολογία, όπως φαίνεται χαρακτηριστικά και στην εικόνα όπου διακρίνεται η µεσοπορώδης δοµή νανοσωµατιδίων διοξειδίου του πυριτίου, και την σύσταση της επιφανείας του δείγµατος που εξετάζουµε. Εφαρµόζοντας ένα σύστηµα ανίχνευσης της διασποράς των ενεργειών των ακτίνων-χ που δηµιουργούνται στην επιφάνεια από την προσπίπτουσα δέσµη, µπορεί να γίνει ηµιποσοτική στοιχειακή ανάλυση του υλικού Ακόµα είναι δυνατός ο ποιοτικός προσδιορισµός των επιφανειών του υλικού όσον αφορά τις ανωµαλίες και την συνέχεια της διευθέτησης των πόρων σε όλες τις διαστάσεις. Εποµένως, το SEM χρησιµοποιείται για την εξέταση µικροδοµής στερεών δειγµάτων και για να δίνει εικόνες υψηλού βαθµού διείσδυσης. 2.4 Υπολογισμός πορώδους με τη μέθοδο του Αρχιμήδη Ας θεωρήσουμε ένα δοκίμιο κάποιου στερεού υλικού το οποίο έχει σχήμα π.χ. ορθογωνίου παραλληλεπιπέδου μήκους l, πλάτους w και ύψους h. Εάν προσδιοριστεί η μάζα του υλικού m με κάποια ζύγιση τότε η ολική του πυκνότητα (ρ t ) θα δίνεται από τη σχέση: (2.4) Η πυκνότητα που υπολογίζεται με αυτόν τον τρόπο είναι η ολική πυκνότητα. Ο όγκος που υπολογίζεται γεωμετρικά περιλαμβάνει και τον όγκο των πόρων που ενδεχομένως να βρίσκονται στο υλικό. Εάν το δοκίμιο είναι συμπαγές και δεν έχει πόρους τότε η πυκνότητα που υπολογίζεται θα είναι ίση με την πυκνότητα της στερεάς φάσης (ρsol). 47

49 Εικόνα 2.2: Δοκίμιο κανονικού γεωμετρικού σχήματος του οποίου ο όγκος υπολογίζεται από τις διαστάσεις του. Προσδιορισμός πυκνότητας με εμβάπτιση σε υγρό. Η πλειοψηφία των δοκιμίων δεν έχουν κανονικό γεωμετρικό σχήμα και δεν μπορεί να γίνει υπολογισμός του όγκου τους. Σε αυτές τις περιπτώσεις ο όγκος υπολογίζεται με εμβάπτιση σε κάποιο υγρό (εικόνα 2.3). Είναι προφανές ότι ο όγκος υγρού που εκτοπίζεται ισούται με τον όγκο του υγρού που βυθίζεται. Έχοντας και τη μάζα (m) του δοκιμίου μετά από κάποια ζύγιση, η πυκνότητα του δοκιμίου υπολογίζεται από την εξίσωση (2.4). Ο υπολογισμός του όγκου με εμβάπτιση σε υγρό θεωρείται ακριβέστερη μέθοδος από το γεωμετρικό προσδιορισμό και συχνά εφαρμόζεται H ερμηνεία της πυκνότητας που υπολογίζεται με αυτόν τον τρόπο χρειάζεται κάποια προσοχή. Εικόνα 2.3 : Προσδιορισμός του όγκου με εμβάπτιση σε υγρό 48

50 Όπως και προηγούμενα, εάν το δοκίμιο είναι συμπαγές και δεν έχει πόρους τότε η πυκνότητα που υπολογίζεται θα είναι ίση με την πυκνότητα της στερεάς φάσης (ρ sol ). Εάν το δοκίμιο έχει εσωτερικό πορώδες, δηλαδή είτε μεμονωμένους είτε δίκτυο πόρων που δεν έχει όμως πρόσβαση στην εξωτερική επιφάνεια, τότε η πυκνότητα που υπολογίζεται είναι η ολική πυκνότητα του υλικού. Ο όγκος που προσδιορίζεται συμπεριλαμβάνει και τον όγκο των πόρων. Εάν το δοκίμιο έχει πορώδες το οποίο έχει πρόσβαση στην επιφάνεια τότε η κατάσταση είναι λίγο πιο περίπλοκη. Εάν το υγρό διεισδύει σταδιακά στους πόρους και γεμίσει ένα μέρος του πορώδους τότε η μέθοδος οδηγεί σε λάθος εκτίμηση της ολικής πυκνότητας. Σε αυτήν την περίπτωση θα μετρήσουμε V< Vt και θα εκτιμήσουμε ένα ρ> ρt. To πόσο μεγάλη θα είναι η απόκλιση και το λάθος εξαρτάται από το τι ποσοστό του πορώδους όγκου πληρώθηκε με υγρό. Στην ακραία περίπτωση που σταδιακά το υγρό γεμίσει όλο τον όγκο των πόρων τότε θα είναι V = V sol και ρ = ρ sol. Στην άλλη ακραία περίπτωση που το υγρό λόγω της μεγάλης διεπιφανειακής του τάσης δεν διαβρέχει και δεν διεισδύει πουθενά μέσα στο στερεό τότε V = Vt και ρ = ρ t. Ένα τέτοιο υγρό είναι ο υδράργυρος και η εμβάπτιση σε υδράργυρο χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ολικής πυκνότητας στερεών με πόρους οι οποίοι έχουν πρόσβαση στην εξωτερική επιφάνεια. Η Αρχή του Αρχιμήδη Η μέτρηση του όγκου με εμβάπτιση, όπως αναφέρθηκε και προηγούμενα, είναι ακριβέστερη από τον γεωμετρικό προσδιορισμό του όγκου, όπου αυτό είναι δυνατό. Η ακρίβεια μέτρησης του όγκου είναι συνήθως αυτή που υπαγορεύεται από τις συνήθεις εργαστηριακές ογκομετρικές συσκευές ~0.1 ml. Για μεγαλύτερη ακρίβεια στον προσδιορισμό του όγκου εφαρμόζεται μια τεχνική η οποία αναγάγει τον προσδιορισμό του όγκου σε μέτρηση μάζας (η οποία μπορεί σε ζυγούς ακριβείας να πραγματοποιηθεί με μεγάλη ακρίβεια). Η τεχνική βασίζεται στην αρχή του Αρχιμήδη σύμφωνα με την οποία: Κάθε σώμα που βυθίζεται σε ένα υγρό χάνει τόσο βάρος όσο είναι το βάρος του υγρού που εκτοπίζει. Σύμφωνα με την αρχή αυτή η διαφορά δύο ζυγίσεων του δείγματος, μια στον αέρα (w air ) και μια στο νερό (w liquid ), διαιρούμενη με την πυκνότητα 49

51 του υγρού (ρ liquid ) θα ισούται με τον όγκο του εκτοπιζόμενου υγρού δηλαδή με τον όγκο του στερεού δείγματος. Δηλαδή: V δείγματος = W air W liquid ρ liquid 2.5 Μηχανικές ιδιότητες βιοκεραμικών υλικών Οι μηχανικές ιδιότητες περιγράφουν τον τρόπο που ένα υλικό ανταποκρίνεται στις δυνάμεις, τα φορτία και τις επιπτώσεις. Γενικά, η συμπεριφορά των υλικών κάτω από την επίδραση εξωτερικών φορτίων μπορεί να χαρακτηριστεί σαν όλκιµη (ductile) ή σαν ψαθυρή (brittle), ανάλογα µε το αν το υλικό εµφανίζει τη δυνατότητα να υποστεί πλαστική παραμόρφωση ή όχι. Τα υλικά που παρουσιάζουν σημαντικές παραμορφώσεις μέχρι τη θραύση, ονομάζονται όλκιμα. Από την άλλη οι ύαλοι και τα κεραμικά υλικά θεωρούνται ψαθυρά και κύριος περιορισμός τους είναι η ευθραυστότητα τους, δηλαδή, η τάση να αποτυγχάνουν ξαφνικά με μικρή πλαστική παραμόρφωση. Τα ψαθυρά υλικά παρουσιάζουν πολύ μικρές παραμορφώσεις μέχρι τη θραύση αν τις συγκρίνουμε με τις παραμορφώσεις των χαρακτηρισθέντων ήδη σαν όλκιμων υλικών. Παρόλα αυτά τα κεραμικά είναι συνήθως ισχυρά, σκληρά υλικά τα οποία είναι επίσης και ανθεκτικά στη διάβρωση. Αυτές οι ιδιότητες, μαζί με τις χαμηλές πυκνότητες τους και τα υψηλά σημεία τήξεως καθιστούν τα κεραμικά άξια ιδιαίτερης προσοχής. Οι υπολογισμοί αυτοί είναι ουσιαστικά εφαρμογές της Αντοχής των Υλικών. προϋποθέτουν: τη σωστή εκτίμηση της καταπόνησης που υφίσταται το εξάρτημα κατά τη λειτουργία του (ως προς το είδος και το μέγεθος). τη γνώση των τεχνικών χαρακτηριστικών του υλικού. Συνηθισμένες καταπονήσεις είναι [58]: Ο Εφελκυσμός 50

52 Η Θλίψη Η Τμήση Διάτμηση Η Κάμψη Η Στρέψη Σχήμα 2.4 : δοκίμιο σε εφελκυσμό Σχήμα 2.5 : δοκίμιο σε θλίψη Σε εύθραυστα υλικά, η θραύση ή αστοχία λαμβάνει χώρα σε αρκετά χαμηλότερες τιμές τάσεων εφελκυσμού σε σύγκριση με αντίστοιχες τιμές για θλιπτικές τάσεις. Η αντοχή στη θραύση μίας υάλου και ενός κεραμικού υλικού, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες της επιφάνειας. Παρουσία μικροσκοπικών ρωγμών στην επιφάνεια είναι ικανές να οδηγήσουν σε αποδυνάμωση του υλικού και στην τελική αστοχία από ψαθυρή θραύση (brittle fracture). Οι ύαλοι και τα κεραμικά υλικά εξασθενούν με το χρόνο, καθώς υπόκεινται στην εφαρμογή της κυκλικής κόπωσης (fatigue). Οι μηχανικές ιδιότητες των υαλοκεραμικών, ανάλογα με την εφαρμογή, αξιολογούνται χρησιμοποιώντας μια πειραματική διάταξη δοκιμής της αντοχής είτε σε θλίψη είτε σε εφελκυσμό. Από την πειραματική διάταξη αυτή μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα για τη συμπεριφορά των υαλοκεραμικών υλικών στην κάμψη και την αντοχή τους στη θραύση. Το μηχάνημα παραμορφώνει ένα δείγμα μέχρι να σπάσει, καταγράφοντας τη εφαρμοζόμενη δύναμη που απαιτείται για τη θραύση και την παραμόρφωση κατά την οποία συνέβη η θραύση. Στις περισσότερες εφαρμογές των βιοκεραμικών απαιτείται η χρήση τους σε τέτοιες δομές, ώστε να έχουν υψηλή αντοχή σε θραύση, ιδιαίτερα όταν χρησιμοποιούνται ως υποκατάστατα υλικά των οστών ή σε οδοντικές αποκαταστάσεις. 51

53 Έτσι, οι μηχανικές ιδιότητες που θεωρείται πως έχουν άμεση σημασία για την κλινική χρήση των βιοκεραμικών περιλαμβάνουν την αντοχή στη θραύση (strength), την ανθεκτικότητα (toughness) και τη σκληρότητα (hardness) Αντοχή σε θλιπτική τάση (Compressive strength) Η αντοχή σε μονοαξονική θλίψη είναι το φορτίο ανά μονάδα επιφανείας που μπορεί να προκαλέσει παραμόρφωση ή θραύση του πετρώματος υπό διατμητική τάση [58]. Η αντοχή σε μονοαξονική θλίψη υπολογίζεται με βάση το μετρούμενο φορτίο θραύσης του δοκιμίου, σε επίπεδο κάθετο ή/και παράλληλο στο επίπεδο της στρώσης /ανισοτροπίας του πετρώματος, κατά περίπτωση, σύμφωνα με τα οριζόμενα στην προδιαγραφή ΕΛΟΤ ΕΝ 1926 και εκφράζεται σε Megapascal - ΜPa (1 MPa = 1 Ν/mm 2 = 10,197 Κp/cm 2 ). Σε μια τυπική δοκιμασία θλίψης προσδιορίζουμε το διάγραμμα συμβατικών τάσεων συμβατικών παραμορφώσεων του εξεταζόμενου υλικού. Τα συνηθισμένα εργαστηριακά πειράματα γίνονται με τη βοήθεια είτε υδραυλικών (όπως και στη δική μας περίπτωση) είτε ηλεκτρικών μηχανών με τις οποίες μπορούμε να επιβάλουμε μέγιστο θλιπτικό φορτίο. Για την εργασία αυτή στην διάρκεια της πειραματικής εργασίας χρησιμοποήθηκε ηλεκτρονικό σύστημα το Instron

54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 3.1. Παρασκευή ικριωμάτων Προετοιμασία μήτρας πολυουρεθάνης (PU foam) Για την παρασκευή ικριώματων χρησιμοποιήσαμε μήτρα από αφρό πολυουρεθάνης. Αρχικά, χρησιμοποιώντας ένα κοπίδι τεμαχίσαμε το φύλλο του αφρού σε 200 ίσα δοκίμια 1cm x 1cm, όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα 3.1. Εικόνα 3.1 : Το χαραγμένο φύλλο πολυουρεθάνης. Στην συνέχεια ακολουθήσαμε διαδικασίες για τον καθαρισμό και την αποστείρωση των δοκιμίων αφρού. Κατά το πρώτο στάδιο καθαρισμού χρησιμοποιήσαμε ένα ποτήρι ζέσεως το οποίο γεμίσαμε με αιθανόλη. Τα 200 δοκίμια αφρού τοποθετήθηκαν μέσα στο ποτήρι ζέσεως, ακολούθησε ανάδευση και τελικά στύψιμο (Εικόνα 3.2 και Εικόνα3.3). 53

55 Εικόνα 3.2 : Μήτρες πολυουρεθάνης μέσα σε αιθανόλη. Εικόνα3.3: Μήτρες πολυουρεθάνης μετά το στράγγισμα. Το δεύτερο στάδιο (ultrasonic bath). καθαρισμού των δοκιμίων ήταν το λουτρό υπερήχων Ο καθαρισμός με υπερήχους, αποτελεί στις μέρες μας την πιο μοντέρνα και λεπτομερή μέθοδο καθαρισμού. Κατά την διαδικασία αυτή παράγει εκατομμύρια κενές φυσαλίδες, οι οποίες καταρρέουν (σκάνε) πάνω στην επιφάνεια των εργαλείων, χάρη στη διαφορά πίεσης, εξαιτίας την υπερηχητικής δραστηριότητας. Έτσι, παράγονται 54

56 υψηλής ενέργειας υγροί πίδακες, που αφαιρούν ακαθαρσίες από επιφάνειες, ακόμα κι από τις μικρότερες οπές και εσοχές. Για την επίτευξη ικανοποιητικού βαθμού καθαρισμού, πρέπει το υγρό που χρησιμοποιείται, να περιέχει κάποιο χημικό καθαριστικό κατάλληλο για χρήση σε λουτρό υπερήχων. Ο Καθαρισμός με υπερήχους έγινε σε δύο φάσεις. Κατά την πρώτη φάση χρησιμοποιήθηκε καθαριστικό διάλυμα με σύσταση που περιείχε 400 ml νερό και 10 ml SDS (Sodium dodecylsulfate ) 2,5% w/w. Το SDS είναι μια οργανική ένωση με τον τύπο CH 3 (CH 2 ) 11 SO 4 Na και αποτελεί ένα ανιονικό επιφανειοδραστικό που χρησιμοποιείται σε πολλά προϊόντα καθαρισμού και υγιεινής. Εικόνα 3.4: Μήτρες πολυουρεθάνης σε καθαριστικό διάλυμα μέσα σε λουτρό υπερήχων Μετά την πάροδο των 15 λεπτών τα δείγματα στραγγίστηκαν. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε δύο ακόμη φορές των 15 λεπτών με την διαφορά ότι ως διάλυμα χρησιμοποιήθηκε πλέον καθαρό δισ-απεσταγμένο νερό. Κατά τη δεύτερη φάση καθαρισμού των δοκιμίων με υπερήχους το διάλυμα καθαρισμού που χρησιμοποιήθηκε περιείχε 20gr Labkem Cleane Soap (υποκατάστατο του Extran Solution) 5%wt στα 400ml νερού. Η διαδικασία αυτή είχε διάρκεια 15 55

57 λεπτών και στη συνέχεια επαναλήφθηκε δύο ακόμη φορές με καθαρό δισαποσταγμένο νερό. Τέλος ακολούθησε στέγνωμα των δειγμάτων. 3.2 Παρασκευή βιοκεραμικού Η διαδικασία παρασκευής της βιοϋάλου κολλοειδούς γέλης έγινε όπως περιγράφεται στην υπάρχουσα βιβλιογραφία [59,60], με τη διαφορά ότι χρησιμοποιήσαμε ένα επιπλέον συστατικό, τον χαλκό Cu λόγω της ιδιαιτερότητάς του να ευνοεί την οστεογενεση όπως προαναφέρθηκε. Συγκεκριμένα, TEOS, δις-απεσταγμένο νερό και 2NHNO 3, αναμίχθηκαν σε αναλογία γραμμομορίων (mol): TEOS/H2O/HNO3 = 1:8:0.16 και αφέθηκαν να αναδεύονται στον μαγνητικό αναδευτήρα στα 400rpm έως ότου το διάλυμα να γίνει διαυγές (περίπου 30 λεπτά). Εικόνα 3.5: οι μετρήσεις των συστατικών για την παρασκευή διαλύματος sol-gel 56

58 Εικόνα 3.6: Προσθήκη του χαλκού στο διάλυμα sol-gel και η μηχανική ανάδευση του τελικού διαλύματος Στη συνέχεια προστέθηκαν στο διάλυμα το Mg(NO3)2 6H2O και Ca(NO3)2 4H2O και Cu(NO 3 ) 2 2,5H 2.O σε αναλογία mol: TEOS/Mg(NO3)2 6H2O/Ca(NO3)2 4H2O = 2:1:2, και τα αντιδραστήρια αφέθηκαν να αναδεύονται για λίγα λεπτά ακόμη θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα ο αναδευτήρας μαζί να το διάλυμα τοποθετήθηκαν σε κλίβανο στους 60 ο C για 50 περίπου λεπτά. Εικόνα 3.7 : Ο αναδευτήρας με το διάλυμα sol-gel μέσα στον κλίβανο. 57

59 Οι ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι παρακάτω: Πίνακας 3.1: Ποσότητες Αντιδραστηρίων Αντιδραστήριo H 2 O HNO 3 TEOS Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O Mg(NO 3 ) 2 6H 2 O Cu(NO 3 ) 2 2,5 H 2.O Ποσότητα 58,1ml 9,7ml 60ml 15,864gr 4,306gr 1,302gr Προετοιμασία εναπόθεσης επιστρώσεων βιοκεραμικού υλικού Πρώτο στάδιο αποτέλεσε η εμβάπτιση των δειγμάτων μας, που στο εξής θα αποκαλούμε ικριώματα, στο διάλυμα κολλοειδούς γέλης που παρασκευάστηκε με τον τρόπο που περιγράψαμε παραπάνω. Έπειτα στραγγίξαμε τα δείγματα και τα αφήσαμε να στεγνώνουν για μια μέρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στο δεύτερο στάδιο ακολούθησε η εναπόθεση των πρόσθετων βιοκεραμικών επικαλύψεων στα δείγματα μας (μια επικάλυψη ανά μέρα). Κατα την διαδικασία αυτή με την χρήση μιας πιπέτας εμποτίζαμε τα δοκίμια μας με διάλυμα βιοκεραμικού υλικου σε μορφή σταγόνων. Ακολουθούσε το στάδιο της φυγοκέντρησης (σε 500 στροφές για 5 λεπτά) με στόχο να απομακρυνθεί η περιττή ποσότητα του διαλύματος από τους πόρους των ικριωμάτων ώστε να παραμείνει διαθέσιμο το διασυνδεδεμένο δίκτυό τους. Τέλος τα ικριώματα στέγνωναν σε θερμοκρασία δωματίου 58

60 Εικόνα 3.8: Εναπόθεση βιοκεραμικών επικαλύψεων στις μήτρες πολυουρεθάνης Εικόνα 3.9 : Προετοιμασία των δειγμάτων για την Φυγόκεντρο. Εικόνα 3.10 : Η Φυγόκεντρος 59

61 Μετά από τον επιθυμητό αριθμό επιστρώσεων τα δείγματα υποβλήθηκαν σε θερμική κατεργασία. Ακολουλούν τα στάδια της πυροσυσσωμάτωση (sintering). 1) Θέρμανση από 20 C μέχρι 400 C για 3 ώρες και 8 λεπτά με ρυθμό ανόδου θερμοκρασίας 10 C/min 2) Παραμονή στους 400 C για 1 ώρα 3) Τα δείγματα αφήνονται να ψυχθούν μέχρι τη θερμοκρασία δωματίου 4) Θέρμανση από 20 Cμέχρι 866 C για 85 λεπτά με ρυθμό ανόδου θερμοκρασίας 10 C/min 5) Παραμονή στους 866 C για 2ώρες 6) Τα δείγματα αφήνονται να ψυχθούν μέχρι τη θερμοκρασία δωματίου. Εικόνα 3.11: Ο φούρνος στον οποίο έγινε η πυροσυσσωμάτωση (sintering) 60

62 Εικόνα 3.12: Ικριώματα μετα τα 3 πρώτα στάδια θερμικής κατεργασίας Εικόνα 3.13: Ικριώματα μετα τα 3 πρώτα στάδια θερμικής κατεργασίας Εικόνα 3.14: Ικριώματα μετά τα 3 τελευταία στάδια θερμικής κατεργασίας Τέλος τα δείγματα μας χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες των η ομάδα: περιλαμβάνει 50 ικριώματα με 5 επιστρώσεις βιοκεραμικού τα οποία είχαν υποστεί όλες τις θερμικές κατεργασίες που περιγράψαμε πιο πάνω(1-6). Για συντομία την ομάδα αύτη θα την αποκαλούμε (5 coatings). 2 η ομάδα: περιλαμβάνει 50 ικριώματα με 5+1 επιστρώσεις βιοκεραμικού. Συγκεκριμένα μετά από τις 5 επιστρώσεις τα δείγματα είχαν υποβληθεί στα τρία πρώτα βήματα της θερμικής κατεργασίας και έπειτα μία επιπλέον επίστρωση βιοκεραμικού είχε προστεθεί σε αυτά. Στην συνέχεια τα δείγματα υποβλήθηκαν στα 3 τελευταία βήματα της πυροσυσσωμάτωσης (4-6). (5+1 coatings) 61

63 3 η ομάδα: περιλαμβάνει 50 ικριώματα με 8 επιστρώσεις βιοκεραμικού τα οποία είχαν υποστεί όλες τις θερμικές κατεργασίες που περιγράψαμε πιο πάνω(1-6). (8 coatings) 4 η ομάδα: περιλαμβάνει 50 ικριώματα με 8+1 επιστρώσεις βιοκεραμικού. Συγκεκριμένα μετά από τις 8 επιστρώσεις τα δείγματα είχαν υποβληθεί στα τρία πρώτα βήματα της θερμικής κατεργασίας και έπειτα μία επιπλέον επίστρωση βιοκεραμικού είχε προστεθεί σε αυτά. Στην συνέχεια τα δείγματα υποβλήθηκαν στα 3 τελευταία βήματα της πυροσυσσωμάτωσης (4-6). (8+1 coatings) Προετοιμασία των δειγμάτων για τον έλεγχο αντοχής των ικριωμάτων σε θλιπτικές τάσεις. Για τον έλεγχο αντοχής των ικριωμάτων στη θλίψη επιλέχθησαν τέσσερεις ομάδες 10 ικριωμάτων, με τα χαρακτηριστικά που ορίστηκαν πιο πάνω για την καθεμία. Η διάταξη που χρησιμοποιήθηκε για τον συγκεκριμένο έλεγχο είναι το Instron 3344 με ταχύτητα κεφαλής 0.5mm/min που φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Εικόνα 3.15 : Διάταξη για τον έλεγχο αντοχής στην θλίψη- Instron

64 Εικόνα 3.16 : Οι κεφαλές της διάταξης εξασκούν φορτίο θλίψης στο ικρίωμα. Προετοιμασία δειγμάτων για τον υπολογισμό πορώδους. Η έλεγχος του πορώδους πραγματοποιήθηκε σε τέσσερεις ομάδες 10 ικριωμάτων, όπως τις περιγράψαμε παραπάνω. Αρχικά ζυγίσαμε τα δείγματα με την βοήθεια ενός ζυγού ακριβείας και μετρήσαμε τις ακριβείς τους διαστάσεις με το παχύμετρο καταγράφωντας τα αποτελέσματα σε έναν πίνακα. Έπειτα τοποθετήσαμε τα ικριώματα σε γυάλινα δοχεία με δισ-απεσταγμένο νερό (ένα ικρίωμα σε κάθε δοχείο). Τα δοχεία εισήχθησαν σε αντλία χαμηλού κενού και παρέμειναν εκεί μέχρι να απομακρυνθεί ο αέρας που βρισκόταν στους πόρους των ικριωμάτων. Μετά την απομάκρυνση των δειγμάτων από την αντλία οι πόροι των ικριωμάτων είχαν γεμίσει με νερό με αποτέλεσμα να αλλάξουν οι μάζες τους τις οποίες και τις καταγράψαμε εκ νέου. 63

65 Εικόνα 3.17 : Μέτρηση των διαστάσεων των ικριωμάτων με παχύμετρο. Εικόνα 3.18: Γυάλινα δοχεία με τα ικριώματα σε δισ-απεσταγμένο νερό 64

66 Εικόνα 3.19 : Αντλία χαμηλού κενού Στην συνέχεια ακολούθησε ο υπολογισμός του πορώδους επί τοις εκατό με βάση την Αρχή του Αρχιμήδη. Τα βήματα που ακολουθήσαμε είναι τα εξής: 1. Γνωρίζουμε ότι η πυκνότητα του νερού είναι : p H2O =1000kg/m 3 =0.001g/mm 3 2. Η Διαφορά μάζας τελικών ικριωμάτων από τα αρχικά ισούται με την μάζα του νερού: m H2O =m sat -m dry 3. O όγκος του νερού προκύπτει από την κλασσική σχέση: V H2O = m H2O / p H2O 4. Ο συντελεστής πορώδους επί τοις εκατό υπολογίζεται από τη σχέση φ= (V H2O /V s ) 100, όπου V s είναι ο όγκος του κάθε ικριώματος. 65

67 3.2 Μέθοδος παρασκευής υγρού προσομοίωσης σωματικών υγρών. (C-SBF) Η παρασκευή του υγρού προσομοίωσης σωματικών υγρών (c-sbf) έγινε σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [44]. Για την παρασκευή 2L διαλύματος SBF, χρειάστηκαν τα παρακάτω όργανα: Ζυγός ακριβείας (4 δεκαδικά ψηφία του γραμμαρίου) Μαγνητικός αναδευτήρας (stirrer) Κωνική Φιάλη 2L Πεχάμετρο με ενσωματωμένο θερμόμετρο Ποτήρια Ζέσεως Πιπέτα Τα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν, καθαρίστηκαν αρχικά με διάλυμα HCl, 1N, ακολούθως με ακετόνη και τελικά με δις-απεσταγμένο νερό. Το c-sbf που χρησιμοποιήθηκε παρασκευάστηκε ακολουθώντας την παρακάτω σειρά: 1. Δις-απεσταγμένο νερό σε θερμοκρασία δωματίου χύθηκε σε ογκομετρική φιάλη 2L, στην οποία πραγματοποιήθηκε η διάλυση των αλάτων και των στοιχείων του ρυθμιστικού διαλύματος. 2. Η ογκομετρική φιάλη τοποθετήθηκε σε μαγνητικό αναδευτήρα και ξεκίνησε η συνεχής ανάδευση του διαλύματος. Τα αντιδραστήρια προστέθηκαν στη φιάλη μέχρι την πλήρη διάλυσή τους, με τη σειρά που παρουσιάζονται στον Πίνακα ώστε να μη δημιουργήσουν ίζημα. Ο πίνακας αναφέρεται σε παρασκευή διαλύματος c-sbf 1L οι ποσότητες διπλασιάστηκαν για την παρασκευή 2L διαλύματος. Κατά τη διάρκεια της αναμίξεως το διάλυμα διατηρήθηκε διαυγές. 66

68 Πίνακας 3.1: Ποσότητα των αντιδραστηρίων για προετοιμασία 1L c-sbf. Αντιδραστήρια Ποσότητα(gr) 1 NaCl gr 2 NaHCO gr 3 KCl gr 4 K 2 HPO 4. 3H 2 O gr 5 MgCl 2. 6H 2 O gr M-HCl 3 ml 7 CaCl gr 8 Na 2 SO gr 9 (CH 2 OH) 3 CNH 2 (TRIS) a gr a TRIS: tris(hydroxymethyl)aminomethane 3. Το διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι τους 37 ο C. Το ph του ρυθμίστηκε στο 7,4 με προσθήκη σταγόνων διαλύματος HCl, 1Ν (μια διαδικασία η οποία γίνεται όταν κρίνεται απαραίτητο). 4. Τέλος μόλις το διάλυμα βρέθηκε στους 20 ο C, το SBF συμπληρώθηκε με διςαπεσταγμένο νερό μέχρι τη γραμμή των 2L. 3.3 Προετοιμασία δειγμάτων και η εμβάπτισή τους στο SBF Τα βιοκεραμικά ικριώματα, που παρήχθησαν με τη διαδικασία που αναφέρεται παραπάνω, ζυγίστηκαν σε ζυγό ακριβείας και στη συνέχεια εμβαπτίστηκαν στο διάλυμα SBF με λόγο αναλογίας της μάζας του ικριώματος προς την ποσότητα του διαλύματος 1,5 mg/ml. Πιο συγκεκριμένα, για 1 ικρίωμα gr χρειάστηκαν 34 ml διαλύματος SBF. Τα ικριώματα τοποθετήθηκαν σε γυάλινα αποστειρωμένα δοχεία. Αποστειρώθηκαν επίσης, και όλα τα μέσα που χρησιμοποιήθηκαν για την εμβάπτιση των δειγμάτων στο c-sbf (δοχεία, πιπέτες, λαβίδες). Σε αυτό το πείραμα, όπως και στα προηγούμενα, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ομάδες ικριωμάτων η εμβάπτιση των 67

69 οποίων έγινε για 5, 10, 15, 20 και 25 ημέρες κατά τις οποίες τα δείγματα παρέμειναν σους 37 ο C σε επωαστήρα με πρώτη ανανέωση SBF μετά από 6 ώρες και στη συνέχεια κάθε δύο μέρες. Μετά το πέρας των 5, 10, 15, 20 και 25 ημερών τα αντίστοιχα δείγματα υποβάλλονταν σε ξήρανση στον φούρνο ώστε να έχουμε τα τελικά προς μελέτη δείγματα. Εικόνα 3.20 : Εμβάπτιση των δειγμάτων στο C-SBF. 3.4 Επεξεργασία δειγμάτων και μεθοδολογία Ο χαρακτηρισμός των βιοκεραμικών ικριωμάτων, πριν και μετά την εμβάπτιση στο υγρό προσομοίωσης έγινε χρησιμοποιώντας τις τεχνικές FTIR, XRD, SEM-EDS. Για την λήψη των φασμάτων διαπερατότητας FTIR των υλικών παρασκευάστηκε δισκίο από βρωμιούχο κάλιο (KBr), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως υπόβαθρο στο φασματοσκόπιο. Στη συνέχεια, λήφθηκε ποσότητα 20mg σε μορφή σκόνης από τα ικριώματα και, αφού ομογενοποιήθηκε με 0,2 gr KBr σε ιγδίο από αχάτη, τοποθετήθηκε σε υδραυλική πρέσσα κενού σε πίεση έως 7 tons για τη δημιουργία δισκίου διαμέτρου 13mm. Το δισκίο που παρασκευάσθηκε τοποθετήθηκε στο φασματοσκόπιο και λήφθηκε το φάσμα διαπερατότητας του υλικού. Όλες οι φασματοσκοπικές μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο φασματοσκοπίας, που βρίσκεται στον τομέα Φυσικής Στερεάς Κατάστασης στο τμήμα Φυσικής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). 68

70 Εικόνα 3.21 : Εργαλεία για την Παρασκευή δισκίων για χρήση στο FTIR Τα φάσματα διαπερατότητας λήφθηκαν με το FTIR φασματοσκόπιο Spectrum 1000 της Perkin Elmer στην περιοχή του μεσαίου υπερύθρου,μιr ( cm-1), με διακριτική ικανότητα (resolution) 4cm -1 και 32 σαρώσεις (scans), ενώ τα φάσματα ανακλαστικότητας με το FTIR φασματοσκόπιο, IFS 113v, Bruker στην περιοχή MIR, με διακριτική ικανότητα (resolution) 2 cm -1. Οι μετρήσεις XRD πραγματοποιήθηκαν στο τμήμα Γεωλογίας του ΑΠΘ με χρήση περιθλασίμετρου τύπου PHILIPS (PW1710), εξοπλισμένο με λυχνία Cu και φίλτρο Νi για τη λήψη CuKα ακτινοβολίας, ενώ η περιοχή σάρωσης γωνίας 2θ ήταν 5-60, το βήμα 0,05 ο και η ταχύτητα σάρωσης 0,01 o 2θ/sec. Τα δείγματα που μετρήθηκαν με την περίθλαση ακτίνων-χ μελετήθηκαν υπό μορφή σκόνης. Οι μετρήσεις της αντοχής των ικριωμάτων στην θλίψη πραγματοποιήθηκαν στο τμήμα Χημείας του ΑΠΘ, χρησιμοποιώντας τη διάταξη Instron 3344 με ταχύτητα της κεφαλής 0.5mm/min. Στην παρούσα πτυχιακή εργασία, η τοπογραφική αποτίμηση και η επιφανειακή στοιχειομετρική σύσταση των δειγμάτων, πριν και μετά την εμβάπτισή τους στο διάλυμα SBF, πραγματοποιήθηκε με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) Philips XL40, το οποίο είναι εξοπλισμένο με αναλυτή EDS. 69

71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1 Χαρακτηρισμός υαλοκεραμικών ικριωμάτων Αποτελέσματα FTIR (πριν την εμβάπτιση των δειγμάτων στο διάλυμα SBF) Παρακάτω παρουσιάζονται τα FTIR φάσματα για τα δείγματά μας πριν την εμβαπτισή τους στο διάλυμα SBF. Διάγραμμα 4.1: Φάσμα FTIR των βιοκεραμικών ικριωμάτων πριν την εμβάπτιση στο διάλυμα SBF Aπό τα φάσματα FTIR για τις τέσσερις ομάδες ικριωμάτων πριν την εμβάπτιση τους στο διάλυμα SBF φαίνονται οι χαρακτηριστικές κορυφές πυριτικών υάλων. Συγκεκριμένα πρόκειται για μία ευρεία κορυφή στα cm -1 και μια κορυφή στα 70

72 496cm -1. Οι κορυφές αυτές αποδίδονται στην ασύμμετρη δόνηση έκτασης του δεσμού Si-O-Si και στην δονητική κάμψη των δεσμών Si-O-Si αντίστοιχα. Επιπλεον η αυξημένη παρουσία της κορυφής στα ~800 cm -1. μειώνει την ικανότητα εμφάνισης βιοενεργής συμπεριφοράς των δειγμάτων μας επειδή σχετίζεται με την παρουσία γεφυρωτικών οξυγόνων (bridging oxygens) Αποτελέσματα SEM (πριν την εμβάπτιση των δειγμάτων στο διάλυμα SBF) Οι παρακάτω μικροφωτογραφίες SEM παρουσιάζουν την μικροδομή των ικριωμάτων. 5 coatings 5+1 coatings 8 coatings 8+1 coatings Εικόνα 4.2 : Μικροφωτογραφία SEM βιοκεραμικών ικριωμάτων με διαφορετικό αριθμό επιστρώσεων πριν την εμβάπτιση στο διάλυμα SBF 71

73 Από τις παραπάνω μικροφωτογραφίες Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (Εικόνα 4.1) διαπιστώνουμε ότι για κάθε ομάδα ικριωμάτων παρατηρείται πως διατηρείται η δομή της μήτρας πολυουρεθάνης. Δηλαδή το διασυνδεδεμένο δίκτυο πόρων διατηρείται παρά την εμφανή διακοπή του δικτύου επιφάνειακά λόγω της ψαθυρότητας του βιοκεραμικού υλικού. Ταυτόχρονα παρατηρείται πως το μέγεθος των πόρων κυμαίνεται μεταξυ μm με καλή διασυνδεσιμότητα μεταξύ του. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν δύο από τις προϋποθέσεις για τη δημιουργία των ικριωμάτων Αποτελέσματα SEM (μετά την εμβάπτιση των δειγμάτων στο διάλυμα SBF) Παρακάτω παρουσιάζονται οι εικόνες που λάβαμε από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σαρωσης για τα δείγματα μετα την παραμονή τους στο διάλυμα SBF. Εικόνα 4.3: Ενδεικτική Μικροφωτογραφία SEM βιοκεραμικού ικριώματος μετά την εμβάπτιση του στο διάλυμα SBF 72

74 Εικόνα 4.4: Εναρξη σχηματισμού απατίτη σε βιοκεραμικό ικρίωματ μετά την εμβάπτιση του στο διάλυμα SBF Στην Εικόνα 4.4 φαίνεται να υπάρχει μία περιοχή οπού μπορούμε να παρατηρήσουμε μικρά σφαιρίδια η μορφολογία των οποίων μοιάζει με αυτήν του απατίτη. Ωστόσο η ύπαρξη του απατίτη δεν επιβεβαιώνεται από την στοιχειομετρική ανάλυση EDS μιας και τα ποσοστά ασβεστίου και φωσφόρου που ανιχνεύθηκαν δεν είναι τα επιθυμητά. Ο δύσκολος εντοπισμός του απατίτη με το Σαρωτικό Μικροσκόπιο οφείλεται στην αδυναμία της τεχνικής αυτής να διεισδύσουμε σε κατώτερα στρώματα του ικριώματος όπου πιθανά να έχει σχηματιστεί ο απατίτης, καθώς το βάθος διείσδυσης δεν ξεπερνά το 1μm. 73