«Η έκφραση της ακετυλοτρανσφεράσης Tip60 σε

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής Εργαστήριο Αιματολογίας Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες» Κατεύθυνση: Παθοβιοχημεία Διπλωματική Εργασία: «Η έκφραση της ακετυλοτρανσφεράσης Tip60 σε υποπληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων και ο ρόλος της στη μεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και του ιού HIV-1» Αγγελετοπούλου Ιωάννα Βιολόγος Πάτρα, 2014

2 Η Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Κ.Μουζάκη Αθανασία Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Κ. Μουζάκη Αθανασία Κ. Γώγος Χαράλαμπος Κ. Πάνος Γεώργιος Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 Ανάδοχος της υποτροφίας «Ανδρέας Μεντζελόπουλος» για μεταπτυχιακές σπουδές στο Πανεπιστήμιο Πατρών 3

4 Πρόλογος Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Αιματολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Με την ολοκλήρωσή της, θα ήθελα αρχικά να ευχαριστήσω την καθηγήτριά μου Μουζάκη Αθανασία για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου αυτή την εργασία. Η πολύτιμη καθοδήγησή της κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων, καθώς και η κατανόηση και η ενθάρρυνσή της όταν ανέκυπταν δυσκολίες ήταν καθοριστική. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω και τα δύο υπόλοιπα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον καθηγητή κ. Γώγο Χαράλαμπο και τον επίκουρο καθηγητή κ. Πάνο Γεώργιο που δέχτηκαν να είναι στην επιτροπή μου καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές τους κατά την ολοκλήρωση της διπλωματικής. Φυσικά, θα ήταν παράλειψη να μην εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλα τα παλαιότερα και νεότερα μέλη του εργαστηρίου Αιματολογίας για την άψογη συνεργασία μας και το ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν. Ένα μεγαλύτερο ευχαριστώ στον μεταδιδάκτορα, κ. Γεωργακόπουλο Τάσο για τις πολύτιμες συμβουλές του και τη βοήθειά του για την ολοκλήρωση της παρούσας διπλωματικής. Ιδιαίτερα επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον διδάκτορα Παναγούλια Γιάννη καθώς ήμουν πολύ τυχερή που βρέθηκα υπό την επίβλεψη του στο εργαστήριο καθώς και τους Αναστασοπούλου Ρούλα, Κοσμά Μαριάνθη, Καραγιάννη Φώτη και Αθανασόπουλο Μάριο για την πολύτιμη βοήθεια, τη στήριξη και το ευχάριστο κλίμα εντός και εκτός εργαστηρίου. Τέλος, ευχαριστώ από καρδιάς τους γονείς μου, τις αδερφές μου και την καλή μου φίλη Μαριαλένα για τη συνεχή συμπαράσταση και την κατανόηση που έδειξαν όλο αυτό τον καιρό. Σας ευχαριστώ 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 5

6 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Πρόλογος... 4 Περιεχόμενα...5 Περίληψη...9 Summary Εισαγωγή Το ανοσοποιητικό σύστημα Έμφυτη και ειδική ανοσία Στοιχεία του Ανοσοποιητικού Συστήματος Κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος Τ και Β λεμφοκύτταρα Διαβιβαστές: κυτταροκίνες και χημειοκίνες Ιντερλευκίνες Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV-1) HIV-1 Ο κύκλος ζωής Κοινός τρόπος ρύθμισης της μεταγραφής του ιού HIV1 και του γονιδίου της IL Δομικές και λειτουργικές συνέπειες της ακετυλίωσης των ιστονών Συσχέτιση ακετυλίωσης και μεταγραφικής ενεργοποίησης Γονίδιο Tip60 (HIV-1 Tat Interactive Protein) Δράση ακετυλοτρανσφεράσης Σύμπλοκο Tip Συμμετοχή στη μεταγραφή Η Tip60 ως συγκαταστολέας της μεταγραφής Συμμετοχή της Tip60 στο μονοπάτι P Γενικά Σκοπός Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων από ολικό αίμα Απομόνωση υποπληθυσμών κυττάρων Κυτταρομετρία ροής (FACS) Καλλιέργεια κυτταρικών σειρών

7 Συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας Μέτρηση της βιωσιµότητας των κυττάρων Ενεργοποίηση κυττάρων Απομόνωση RNA από κύτταρα Δημιουργία cdna, RT-PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Western blot Απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE Ανοσοαπoτύπωμα western Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA Κλωνοποίηση Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (Minipreps) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας (Maxipreps) Κατάτμηση πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού Αντίδραση συνδετάσης (Ligation) Μετασχηματισμός DH5A βακτηριακών δεκτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Διαμόλυνση (transfection) Jurkat κυττάρων CAT (Chloramphenicol Acetyltransferase) assay Ανοσοκατακρήμνιση Προετοιμασία σφαιριδίων Πρόσδεση αντισώματος στα σφαιρίδια Απομόνωση κυτταρικού εκχυλίσματος Επώαση κυτταρικού εκχυλίσματος με σφαιρίδια Ανοσοκατακρήµνιση χρωµατίνης (ChIP) Ανοσοφθορισμός Αποτελέσματα Έκφραση του παράγοντα Tip60 σε υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος Έκφραση του παράγοντα Tip60 σε Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα και σε Τ βοηθητικά μνημονικά λεμφοκύτταρα Έκφραση του παράγοντα Tip60 σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές

8 Έκφραση του παράγοντα Tip60 στην κυτταρική σειρά Jurkat Πρωτεϊνική έκφραση της ακετυλοτρανσφεράσης Τip60 στη κυτταρική σειρά Jurkat Εντοπισμός της πρωτεΐνης Tip60 σε κύτταρα Jurkat με ανοσοφθορισμό Δοσοεξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης της IL-2 μέσω της πρόσδεσης της Tip Δράση του παράγοντα Τip60 στη μεταγραφή του HIV Εξακρίβωση της υπερέκφρασης της Τip60 σε Jurkat Η υπερέκφραση της Tip60 οδηγεί σε αύξηση της μεταγραφής του HIV-LTR/CAT Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Tip60 με την πρωτεΐνη Ets Ο παράγοντας Tip60 προσδένεται στον υποκινητή της IL Συζήτηση Βιβλιογραφία

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 9

10 Περίληψη Η πρωτεΐνη Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kda) είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών MYST και αρχικά προσδιορίστηκε ως αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη με την HIV-1 ΤΑΤ πρωτεΐνη. Πολλά από τα μέλη της οικογένειας MYST μεταξύ αυτών και η Tip60, δρουν ως ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών, γεγονός που υποδηλώνει πιθανούς ρόλους στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην γονιδιακή ρύθμιση. Στη παρούσα διπλωματική, στόχος ήταν η μελέτη του προφίλ έκφρασης της ακετυλοτρανσφεράσης Τip60 σε πληθυσμούς Τ βοηθητικών παρθενικών (CD3+CD4+CD45RA+) και Τ βοηθητικών μνημονικών (CD3+CD4+CD45RO+) λεμφοκυττάρων καθώς και η δράση της στην μεταγραφή του HIV-1 και της IL-2. Οι λόγοι που μας οδήγησαν στην μελέτη της Τip60 προκύπτουν από πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν ότι υπάρχει μια πιθανή αλληλεπίδραση της Tip60 με τον παράγοντα Εts-2, ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση της μεταγραφής τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του HIV-1. Επιπλέον η IL-2 και ο HIV-1 παρουσιάζουν κοινή μεταγραφική ρύθμιση που ελέγχεται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων σε κοινά cis στοιχεία. Επίσης, το Tip60 είναι μια Τat-αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο Tat του HIV-1. Τέλος το γεγονός ότι ο HIV-1. παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση στα εν ηρεμία Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα καθώς και ότι ο παράγοντας Εts-2, που πιθανόν αλληλεπιδρά με την Tip60, συμμετέχει στη καταστολή της έκφρασης του ιού, υποδηλώνει μια πιθανή συμμετοχή της Tip60 σε αυτή τη διαδικασία. Αρχικά ελέγξαμε την έκφραση της Tip60 σε υποπληθυσμούς μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs). Η υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε στα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4+). Για να εξακριβώσουμε το αν και πώς εκφράζεται στους υποπληθυσμούς των Τ λεμφοκυττάρων, απομονώσαμε Τ βοηθητικά μνημονικά λεμφοκύτταρα (CD3+CD4+CD45RO+) από ολικό αίμα ενηλίκων και Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα (CD3+CD4+CD45RA+) από αίμα νεογνών (ομφαλίου λώρου). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε συνθήκες μη ενεργοποίησης η Τip60 εκφράζεται περισσότερο στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα (στα οποία η έκφραση του παράγοντα παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη). Μετά από την ενεργοποίηση των κυττάρων με PMA/IONO (P/I) η έκφραση της Tip60 αυξάνεται σημαντικά στα μνημονικά Th λεμφοκύτταρα ενώ στα παρθενικά Th παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη. Για να εντοπίσουμε μια λευχαιμική κυτταρική σειρά κατάλληλη για να χρησιμοποιηθεί για πειράματα διαμολύνσεων και ανοσοφθορισμού, ελέγξαμε την έκφραση της Tip60 σε εννέα λευχαιμικές κυτταρικές σειρές και είδαμε ότι η Τ λεμφοκυτταρική λευχαιμική σειρά Jurkat παρουσίαζε την υψηλότερη έκφραση της Τip60. Η κυτταρική σειρά Jurkat παρουσιάζει επίσης παρόμοιο μοτίβο έκφρασης σε επίπεδο mrna με τα Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα. Την έκφραση της Tip60 την ελέγξαμε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με τη μέθοδο Western blot σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα που απομονώσαμε από κύτταρα Jurkat. Για να ελέγξουμε 10

11 Περίληψη τον εντοπισμό της Τip60 στα Jurkat, προχωρήσαμε σε πειράματα ανοσοφθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM) και ύστερα από ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I) η Τip60 εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat. Επίσης η ποσότητα της πρωτεΐνης Τip60 δεν αλλάζει ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα, αποτέλεσμα που συμφωνεί με τα πειράματα Western blot. Προκειμένου να ελέγξουμε τη δράση της Τip60 στη μεταγραφική δραστηριότητα του HIV-1 και της IL-2 προχωρήσαμε σε πειράματα διαμόλυνσης Jurkat κυττάρων. Αρχικά διαμολύναμε τα κύτταρα με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου υπερέκφρασης της Τip60 (pcmx-tip60) και ελέγξαμε την έκφραση της IL-2 σε μεταγραφικό επίπεδο. Παρατηρήθηκε ότι αυξανομένης της ποσότητας του pcmx-tip60, αυξανόταν και η έκφραση του IL-2 mrna. Μέσω πειραμάτων CATassays σε κύτταρα Jurkat, τα οποία συνδιαμολύναμε με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου pcmx-tip60 και πλασμιδίου αναφοράς CAT, που βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του HIV-1-LTR, διαπιστώσαμε ότι η υπερέκφραση της Τip60 αυξάνει και τη μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή του HIV-1. Προκειμένου να διαπιστώσουμε εάν η Tip60 δρα απευθείας στον υποκινητή του HIV-1 και της IL-2 μέσω της πρόσδεσής της σε αυτόν είτε άμεσα, είτε έμμεσα μέσω συμπλόκου με άλλες πρωτεΐνες, προχωρήσαμε σε πειράματα ανοσοκρατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP assays) του υποκινητή της IL-2. Παράλληλα επειδή δεν υπάρχει γνωστή θέση πρόσδεσης της Tip60 απευθείας στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 αναζητήσαμε την πρωτεΐνη με την οποία θα μπορούσε να αλληλεπιδρά προκειμένου να προσδεθεί στα παραπάνω. Με πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης διαπιστώσαμε ότι υπάρχει αλληλεπίδραση ανάμεσα στην Tip60 και στον παράγοντα Ets-2, ο οποίος προσδένεται άμεσα στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 και έτσι επαληθεύσαμε τις αρχικές υποθέσεις για την αλληλεπίδραση τους. Τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε μας οδήγησαν στα παρακάτω συμπεράσματα: Υπάρχει διαφορική έκφραση της Tip60 ανάμεσα στα Τ βοηθητικά παρθενικά και μνημονικά λεμφοκύτταρα, αφού σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM) η έκφραση της Tip60 είναι μεγαλύτερη στα μνημονικά σε σχέση με τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα προκαλεί επαγωγή της έκφρασης της Tip60 στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα, ενώ στα παρθενικά δεν προκαλεί καμία ουσιαστική αλλαγή. Η πρωτεΐνη Tip60 δρα σαν συνενεργοποιητής της μεταγραφής του ιού HIV-1 και της IL-2 μιας και προκαλεί επαγωγή στην μεταγραφική τους δραστηριότητα. Η πρωτεΐνη Tip60 αλληλεπιδρά in vivo με τον παράγοντα Εts-2 και παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο πρόσδεσης με αυτόν, στον υποκινητή της IL-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat. 11

12 SUMMARY

13 Summary Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kda) is a member of the MYST protein family and was initially identified as an interacting protein with the HIV-1 TAT protein. Several members of MYST family, Tip60 among them, act as histone acetyltransferases, suggesting their possible roles in chromatin remodeling and gene regulation. We chose to study Tip60 because it is a Tat-interactive protein and Tat is encoded by the Tat gene of HIV-1. Recent results from our laboratory suggest that there is a possible interaction between Tip60 and Εts-2 proteins, which is involved in the regulation of the transcription of both IL-2 and HIV-1. In addition, the transcription of IL-2 and HIV-1 is regulated by common transcription factors that act through binding to common cis-trans elements. We also know that the HIV-1 virus is transcriptionally active in activated CD4 T cells, and inactive in naïve CD4 T cells and that HIV-1 expression is blocked in naive Th cells by the transcriptional factor Ets-2. So the possible interaction between Tip60 and Εts-2 protein led us to study the Tip60 protein. The main purpose of this study was to determine the expression profile of Tip60 acetyltransferase in naive T helper (CD3+CD4+CD45RA+) and memory T helper (CD3+CD4+CD45RO+) lymphocytes and its effect on the transcription of HIV-1 and IL- 2 (due to their common transcriptional regulation in T helper cells). The expression of Tip60 mrna was measured in subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the highest levels were observed in Th lymphocytes. We therefore isolated from human peripheral blood and cord blood, CD3+CD4+CD45RO+ and CD3+CD4+CD45RA+ Th lymphocytes and we examined the expression of Tip60 at the transcriptional level by RT-PCR. The results showed that Tip60 mrna expression levels were higher in CD3+CD4+CD45RO+ compared to CD3+CD4+CD45RA+ Th cells. Following cell activation with PMA/IONO (P/I), the transcriptional expression of Tip60 was increased in memory Th cells, whereas it remained unchanged in naive Th cells. To identify a suitable cell line for transfection and immunofluorescence experiments, we measured Tip60 expression in nine cell lines and we observed that the T lymphocytic leukemia Jurkat presented the highest expression of Tip60 mrna. Jurkat cells also presented a similar pattern of Tip60 mrna expression levels with naïve Th lymphocytes. In addition to determine the localization of Tip60 into the cells, we proceeded in immunofluorescence experiments. As a result, we observed that when cells were cultured in CM media +/- P/I, Tip60 was identified in the nucleus of Jurkat cells. The amount of Tip60 protein remained unchanged after cell activation (which was also determined by Western blot experiments). To study the effect of Tip60 in transcription of HIV-1 and IL-2 we transfected Jurkat cells with increasing amounts of a Tip60 overexpressing vector (pcmx-tip60) and measured the expression of IL-2 and HIV-1 at the transcriptional level. 13

14 Summary Overexpression of Tip60, induced the transcription of IL-2 and also increased the transcriptional activity of HIV-1. Co-transfection experiments in Jurkat cells with increasing amounts of PCMX-tip60, led to a gradual increase of HIV1-LTR-CAT Finally, we studied if Tip60 acts directly on the promoter of HIV-1 and IL-2 exercising its effect directly or through complexing with other proteins. According to the literature there is no Tip60 binding site in the promoter of HIV-1 and IL-2, so we searched for a protein that could interact with Tip60. We performed coimmunoprecipitation experiments that showed that there was an interaction between Tip60 and Ets-2, a factor that binds directly both on the LTR of HIV-1 and the IL-2 promoter. In this work we suggest that Tip60 is expressed differentially in naïve and memory helper T cells and participates in the transcriptional activation of both HIV-1 LTR and IL-2. Also Tip60 protein interacts in vivo with Ets-2 protein and Tip60 binding activity is similar with Ets-2 binding activity to the ARRE-2 element of the IL-2 promoter in Jurkat cell line. 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15

16 Εισαγωγή Το ανοσοποιητικό σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα σύστημα οργάνων υπεύθυνο για την άμυνα του οργανισμού ενάντια σε ξένους προς τον οργανισμό παράγοντες οι οποίοι ονομάζονται αντιγόνα (antigens). Η φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος έγκειται στην άμυνα του οργανισμού. Ως αντιγόνα μπορούν να δράσουν οι παθογόνοι μικροοργανισμοί (βακτήρια, μύκητες, ιοί) αλλά και μακρομόρια, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες. Το σύστημα αυτό αποτελείται από ένα σύνολο οργάνων και αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, τα οποία εξελίχθηκαν για να αναγνωρίζουν ορθά και ειδικά τα ξένα αντιγόνα που βρίσκονται στην επιφάνεια των μικροοργανισμών, οι οποίοι εισχωρούν στο σώμα. Τα τρία χαρακτηριστικά γνωρίσματά του είναι η εξειδίκευση, η προσαρμογή και η μνήμη. Για την επίτευξη του στόχου αυτού χρησιμοποιεί δύο διαφορετικές στρατηγικές. Τη χημική ανοσολογική απάντηση, κατά την οποία τα στοιχεία αναγνώρισης είναι ειδικές πρωτεΐνες, που ονομάζονται αντισώματα και παράγονται από τα πλασματοκύτταρα. Και την κυτταρική ανοσολογική απάντηση όπου τα Τ- λεμφοκύτταρα θανατώνουν κύτταρα που φέρουν ξένες ουσίες και διεγείρουν τη χημική απόκριση συνδράμοντας τα Β-λεμφοκύτταρα, δηλαδή τα πρόδρομα κύτταρα των πλασματοκυττάρων. Έμφυτη και ειδική ανοσία Η ανοσία διακρίνεται στη μη ειδική (ή φυσική ή έμφυτη) και στην ειδική (ή επίκτητη) ανοσία. Η φυσική ανοσία υπάρχει εκ γενετής και δεν εξελίσσεται. Αναπτύσσεται αμέσως μετά το αρχικό ερέθισμα. Οι φορείς της φυσικής ανοσίας δεν διακρίνουν το ξένο από το ίδιο αλλά αντιλαμβάνονται τις διαφορές που επιφέρει η παρουσία του ξένου παράγοντα μέσα στον οργανισμό. Περιλαμβάνει τους φυσιολογικούς φραγμούς του δέρματος και των βλεννογόνων (που αποτρέπουν την είσοδο λοιμογόνων παραγόντων στον οργανισμό), τα φυσικά φονικά κύτταρα, το σύστημα του συμπληρώματος, την φλεγμονώδη αντίδραση και τον πυρετό. Εν αντιθέσει, η ειδική ανοσία εμφανίζεται και εξελίσσεται μετά την επαφή με το βλαπτικό παράγοντα και αναπτύσσεται αργά, αρκετές ημέρες είτε εβδομάδες αργότερα. Μετά την εμφάνιση της ειδικής ανοσίας, η μη ειδική ανοσία, παίζει σημαντικό ρόλο στον περιορισμό του αρχικού βλαπτικού ερεθίσματος. Τα δύο είδη της ανοσίας αλληλεπιδρούν σημαντικά μεταξύ τους. Συνήθως, οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας προετοιμάζουν τις συνθήκες για την ανάπτυξη της ειδικής ανοσίας όταν παραμένει το αίτιο που προκαλεί την ανοσολογική απόκριση. 16

17 Εισαγωγή Εικόνα 1: Η έμφυτη ανοσία λειτουργεί ως πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στη μόλυνση. Περιλαμβάνει διαλυτούς παράγοντες, όπως οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος, τα κοκκιοκύτταρα (βασεόφιλα, ηωσινόφιλα και ουδετερόφιλα), τα μαστοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα και τα ΝΚ κύτταρα. Στην προσαρμοζόμενη ανοσία παρουσιάζεται καθυστέρηση στην ενεργοποίησή της και χαρακτηρίζεται από την μεγάλη διακριτική ικανότητα αναγνώρισης των αντιγόνων και την μνήμη. Σε αυτή συμμετέχουν τα αντισώματα, τα Β κύτταρα καθώς και τα βοηθητικά (CD4 + ) και κυτταροτοξικά (CD8 + ) T λεμφοκύτταρα. ( edu/lm/immunology_module) Η ειδική ανοσία παρουσιάζει τις κατωτέρω ιδιότητες: έχει ειδικότητα, δηλαδή στρέφεται κατά συγκεκριμένων αντιγόνων έχει μνήμη, δηλαδή αντιδρά ταχύτερα και πιο έντονα σε παράγοντες με τους οποίους ο οργανισμός έχει ξαναέρθει σε επαφή. Η λειτουργία της εξασφαλίζεται από ειδικά κύτταρα που ονομάζονται μνημονικά λεμφοκύτταρα δεν αντιδρά σε ότι ανήκει στον ίδιο τον οργανισμό Η τελευταία αυτή ιδιότητα καλείται ανοσολογική ανοχή. Η ανοσολογική ανοχή επιτυγχάνεται μετά την επονομαζόμενη «εκπαίδευση» των Τ- λεμφοκυττάρων στο θύμο αδένα. 17

18 Εισαγωγή Οι ανοσοαποκρίσεις διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με τη φύση τους: α) στην ανοσοαπόκριση με τη μεσολάβηση κυττάρων, οπότε η συγκεκριμένη γραμμή άμυνας χαρακτηρίζεται ως κυτταρική ανοσοαπόκριση (ή ανοσία) και β) στην ανοσοαπόκριση με τη μεσολάβηση εξειδικευμένων πρωτεϊνών, οπότε η συγκεκριμένη γραμμή άμυνας χαρακτηρίζεται ως χημική ανοσοαπόκριση (ή ανοσία). Στην πρώτη κατηγορία εξειδικευμένα κύτταρα του οργανισμού αντιδρούν με τα ξένα αντιγόνα που βρίσκονται στην επιφάνεια άλλων κυττάρων του οργανισμού και τα καταστρέφουν, ενώ στη δεύτερη κατηγορία οι ανοσοαποκρίσεις γίνονται με τη μεσολάβηση ειδικών πρωτεϊνών που αναγνωρίζουν τα αντιγόνα και κυκλοφορούν στο αίμα και σε άλλα υγρά και εκκρίματα του σώματος και ονομάζονται αντισώματα. Τα κύτταρα τα οποία σχετίζονται με την ανοσοαπόκριση είναι τα λεμφοκύτταρα (T και Β), τα μονοκύτταρα, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC) και τα πολυμορφοπύρηνα κοκκιοκύτταρα (ουδετερόφιλα, βασεόφιλα και ηωσινόφιλα). Όλα τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος προέρχονται από πολυδύναμα πρόδρομα κύτταρα μέσω δύο κλάδων διαφοροποίησης: α) του λεμφοκυτταρικού κλάδου, από τον οποίο παράγονται τα λεμφοκύτταρα και β) του μυελωματικού κλάδου από τον οποίο παράγονται τα φαγοκύτταρα και άλλα κύτταρα. Στοιχεία του Ανοσοποιητικού Συστήματος Τα όργανα του λεμφικού συστήματος είναι οργανωμένοι ιστοί όπου τα λεμφοκύτταρα συναντούν μη λεμφικά κύτταρα τα οποία είναι σημαντικά τόσο στην ωρίμανση των λεμφοκυττάρων όσο και στην έναρξη ειδικών ανοσολογικών απαντήσεων. Αυτά μπορούν αδρά να διακριθούν στα πρωτογενή ή κεντρικά λεμφικά όργανα όπου γίνεται η παραγωγή των λεμφοκυττάρων και στα δευτερογενή ή περιφερικά λεμφικά όργανα όπου αρχίζουν οι ειδικές ανοσολογικές απαντήσεις. Στα πρωτογενή λεμφικά όργανα περιλαμβάνεται ο μυελός των οστών και ο θύμος αδένας. Η κατανομή των λεμφικών ιστών στο ανθρώπινο σώμα παρουσιάζεται στην εικόνα 2. Τα λεμφοκύτταρα προέρχονται από τα αρχέγονα μητρικά κύτταρα του μυελού και διαφοροποιούνται στα κεντρικά λεμφικά όργανα (τα Β κύτταρα στο μυελό και τα Τ στο θύμο). Ακολούθως, τα λεμφοκύτταρα μεταναστεύουν από αυτά τα όργανα μέσω της κυκλοφορίας του αίματος στους περιφερικούς λεμφικούς ιστούς (λεμφαδένες, σπλήνας, λεμφικό σύστημα του γαστρεντερικού, αμυγδαλές, πλάκες του Payer και σκωληκοειδής απόφυση). Αυτές είναι περιοχές ενεργοποιήσεως λεμφοκυττάρων από αντιγόνα. Τα λεμφαγγεία συλλέγουν το εξωκυττάριο υγρό με τη μορφή λέμφου, δια μέσου των λεμφαδένων, μέσα στο θωρακικό πόρο, ο οποίος επιστρέφει τη λέμφο στην αιματική κυκλοφορία. Τα λεμφοκύτταρα που κυκλοφορούν στο αίμα εισέρχονται στα περιφερικά λεμφικά 18

19 Εισαγωγή όργανα και στην ουσία μεταφέρονται από τη λέμφο στον θωρακικό πόρο, απ όπου εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος. Εικόνα 2: Η κατανομή των λεμφικών ιστών του σώματος. Αναλυτικά οι πρωτογενείς και δευτερογενείς λεμφικοί ιστοί. Στους πρώτους ανήκουν ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών. Στους δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς ανήκουν μεταξύ άλλων ο σπλήνας, οι λεμφαδένες, οι αμυγδαλές και οι πλάκες του Payer ( Κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος Τ και Β λεμφοκύτταρα Τα λεμφοκύτταρα είναι τα κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά τα αντιγόνα, ανταποκρίνονται ενάντια σε αυτά και για αυτό το λόγο αποτελούν τους διαμεσολαβητές της χημικής και κυτταρικής ανοσίας. Αναγνωρίζουμε δύο τύπους λεμφοκυττάρων οι οποίοι διαφέρουν ως προς τον τρόπο που αναγνωρίζουν τα αντιγόνα καθώς και ως προς την λειτουργία τους. 19

20 Εισαγωγή Β ΚΥΤΤΑΡΑ Παράγονται και ωριμάζουν στο μυελό των οστών και ευθύνονται για την παραγωγή των αντισωμάτων (ανοσοσφαιρινών). Οφείλουν το όνομά τους στο γεγονός ότι στα πτηνά διαφοροποιούνται σε ένα όργανο που ονομάζεται θύλακας του Fabricious (Bursa of Fabricious). Στον άνθρωπο δεν υπάρχει αντίστοιχο όργανο, αλλά η διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων γίνεται στο μυελό των οστών. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Β λεμφοκυττάρων είναι μόρια ανοσοσφαιρινών συνδεδεμένα στη μεμβράνη τους. Η αλληλεπίδραση των αντιγόνων με τις μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες, οδηγεί στην ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων και τη διαφοροποίησή τους σε πλασματοκύτταρα, που εκκρίνουν διαλυτές ανοσοσφαιρίνες, τα αντισώματα. Στη διαδικασία αυτή συμμετέχουν και τα βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα, με κυτταροκίνες που εκκρίνουν, οι οποίες επάγουν τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των Β-λεμφοκυττάρων. Τ ΚΥΤΤΑΡΑ Παράγονται στο μυελό των οστών και στη συνέχεια μεταναστεύουν στο θύμο και ωριμάζουν. Στο ότι διαφοροποιούνται στο θύμο αδένα οφείλουν και το όνομά τους (Thymus). Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων (TCRs, T Cell Receptors), είναι ειδικά μεμβρανικά μόρια, διαφορετικά αλλά δομικά ανάλογα με τις ανοσοσφαιρίνες. Τα Τ λεμφοκύτταρα δεν αναγνωρίζουν διαλυτά αντιγόνα, αλλά μόνο αντιγονικά πεπτίδια που παρουσιάζονται στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, συνδεδεμένα με πρωτεΐνες του Μείζονος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (MHC). Η επαφή του Τ-λεμφοκυττάρου με το αντίστοιχο για αυτό αντιγόνο δίνει το έναυσμα για τον πολλαπλασιασμό του και την έκκριση ουσιών που ονομάζονται κυτταροκίνες. Από τον πολλαπλασιασμό του Τ- λεμφοκυττάρου προκύπτουν και τα αντίστοιχα κύτταρα μνήμης, που θα επιτρέψουν την ταχύτερη ανοσολογική απάντηση, σε μελλοντική έκθεση του οργανισμού στο ίδιο αντιγόνο. Αναγνωρίζονται δύο κατηγορίες T λεμφοκυττάρων, τα T βοηθητικά ή CD4 λεμφοκύτταρα (helper T cells) και τα T κυτταροτοξικά ή CD8 λεμφοκύτταρα (cytotoxic T cells). O διαχωρισμός αυτός οφείλεται σε λειτουργικές διαφορές μεταξύ των δύο αυτών ομάδων που θα αναλύσουμε παρακάτω. 20

21 Εισαγωγή Εικόνα 3: Τα CD8 και CD4 Τ κύτταρα εκφράζουν διαφορετικούς υποδοχείς (TCRs) ώστε να αναγνωρίσουν τα αντιγόνα που τους παρουσιάζονται από το MHCI και το MCHII αντίστοιχα ( Τα βοηθητικά T λεμφοκύτταρα, κατά κανόνα φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD4 και απαντούν στον αντιγονικό ερεθισμό με έκκριση κυτταροκινών που προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση τόσο των ίδιων των Τ λεμφοκυττάρων, όσο και των Β λεμφοκυττάρων και των μακροφάγων. Ο ρόλος των κυτταροτοξικών κυττάρων είναι η θανάτωση μολυσμένων κυττάρων που παράγουν αντιγόνα. Χαρακτηρίζονται από την παρουσία του μορίου CD8 στην επιφάνειά τους. Πρόσφατα έχει αναγνωριστεί άλλη μία ομάδα T κυττάρων τα οποία καλούνται ρυθμιστικά T λεμφοκύτταρα ο ρόλος των οποίων σχετίζεται με την αναστολή των ανοσοαποκρίσεων. ΒΟΗΘΗΤΙΚΑ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ (CD4 + ) Τα CD4 + Τ βοηθητικά κύτταρα παίζουν έναν αναπόσπαστο ρόλο στις αποκρίσεις της ειδικής ανοσίας. Όταν ανιχνεύεται ένα παθογόνο, οι πληροφορίες μεταδίδονται στα Τ κύτταρα μέσω της αντιγονοπαρουσίασης. Μετά την ενεργοποίηση, τα CD4 + Τ κύτταρα διαφοροποιούνται σε μία από τις διάφορες σειρές διαφοροποίησης των Τ βοηθητικών κυττάρων (Th1, Th2, Th9, Th17, ή Th22), ανάλογα με το είδος του αντιγόνου, την ισχύ του σήματος του TCR και των κυτταροκινών που υπάρχουν στο τριγύρω περιβάλλον. Αποτυχία στην ενεργοποίηση κατάλληλης απάντησης των Τ κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε χρόνια λοίμωξη, ενώ υπερβολικές αποκρίσεις των Τ κυττάρων μπορεί να 21

22 Εισαγωγή προκαλέσουν σημαντικές ιστικές βλάβες καθώς και να συνδεθούν με την εμφάνιση φλεγμονωδών και αυτοάνοσων ασθενειών. Τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο βασικές ομάδες κυττάρων, που διαφέρουν λειτουργικά με βάση την παραγωγή διαφορετικών κυτταροκινών. Τα βοηθητικά κύτταρα τύπου 1 (Th1) είναι μια ομάδα CD4 + Τ κυττάρων που προάγει κυτταρο-διαμεσολαβούμενες ανοσοαποκρίσεις και απαιτείται για την άμυνα του ξενιστή έναντι ενδοκυτταρικών ιογενών και βακτηριακών παθογόνων. Τα κύτταρα Th1 εκκρίνουν την ιντερλευκίνη-2 (IL-2), τον παράγοντα νέκρωσης όγκων β (TNF-β), την ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) και την ιντερλευκίνη 10 (IL-10). Αυτές οι κυτταροκίνες προάγουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων, την παραγωγή νιτρικού οξειδίου και τον πολλαπλασιασμό των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων, που οδηγεί στην καταστροφή και φαγοκυττάρωση των μικροβιακών παθογόνων. Εκτός από τις κυτταροκίνες που εκκρίνονται από τα Th1 κύτταρα, η έκφραση ειδικών υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας, συμπεριλαμβανομένων των IL-12 β2, IL-27α /WSX-1, IFN-γ 2, CCR5, και CXCR3 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση των Τh1 κυττάρων από τους άλλους υπότυπους των Τ κυττάρων. Αν και τα κύτταρα Th1 είναι πολύ σημαντικά για την εξάλειψη των ενδοκυτταρικών παθογόνων, έχουν βρεθεί Th1 αποκρίσεις να σχετίζονται με την εμφάνιση αυτοάνοσων ασθενειών (Bretscher et al., 2014). Τα βοηθητικά κύτταρα τύπου 2 (Th2) είναι μια ομάδα CD4 + Τ κυττάρων που εκκρίνoυν την ιντερλευκίνη 4 (IL-4), την ιντερλευκίνη5 (IL-5), την ιντερλευκίνη 9 (IL-9) και την ιντερλευκίνη 13 (IL-13). Τα κύτταρα αυτά απαιτούνται για την χυμική ανοσία και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον συντονισμό της ανοσοαπόκρισης σε μεγάλα εξωκυτταρικά παθογόνα. Άλλες κυτταροκίνες που παράγονται από τα κύτταρα Th2 διεγείρουν την ενεργοποίηση και την επιβίωση των ηωσινοφίλων (όπως η IL-5), ή προωθούν την ενεργοποίηση των μαστοκυττάρων ( όπως η IL-9). Εκτός από την παραγωγή ειδικών κυτταροκινών, τα Th2 κύτταρα χαρακτηρίζονται από την έκφραση υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας ST2/IL-1 R4, CXCR4, CCR3, CCR4, CCR8). Th2 τύπου ανοσοαποκρίσεις έχουν εμπλακεί στην ανάπτυξη της χρόνιας αλλεργικής φλεγμονής και του άσθματος. (Bretscher et al., 2014) Οι κυτταροκίνες των Τh1 λεμφοκυττάρων αναστέλλουν την δράση των Τh2 κυττάρων και αντιστρόφως. Έτσι μια ανοσολογική απόκριση τείνει να καταστεί είτε απόκριση τύπου Τh1 είτε απόκριση τύπου Τh2. Παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα Τα παρθενικά (naive) T λεμφοκύτταρα είναι λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν περάσει την διαδικασία ωρίμανσης στο θύμο αδένα, εξέρχονται από αυτόν στην 22

23 Εισαγωγή κυκλοφορία αλλά δεν έχουν ενεργοποιηθεί καθώς δεν έχουν «συναντηθεί» με κάποιο αντιγόνο. Όταν τα παρθενικά T λεμφοκύτταρα ενεργοποιηθούν από κάποιο αντιγόνο τότε διαφοροποιούνται σε λειτουργικά T βοηθητικά λεμφοκύτταρα. (Leitenberg et al., 1999) Το είδος αυτό των κυττάρων φέρει συγκεκριμένους δείκτες επιφανείας καθώς και διαφορετικό πρότυπο επανακυκλοφορίας από αυτό των ενεργοποιημένων κυττάρων. Τα περισσότερα ανθρώπινα naïve T λεμφοκύτταρα εκφράζουν μία ισομορφή ενός επιφανειακού μορίου 200kD το οποίο ονομάζεται CD45, που περιέχει ένα τμήμα που κωδικοποιείται από ένα εξόνιο που έχει χαρακτηριστεί με το γράμμα Α. Επειδή αυτά τα κύτταρα μπορούν να αναγνωριστούν αφού αντιδρούν με αντισώματα ειδικά για αυτό το τμήμα που κωδικοποιείται από το εξόνιο Α καλούνται CD45RA (RA-restricted A) κύτταρα. (Takada et al., 2009, De Rosa et al., 2001) Μνημονικά (memory) Τh λεμφοκύτταρα Τα μνημονικά (memory) T λεμφοκύτταρα είναι ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν αναγνωρίσει ένα αντιγόνο, έχουν ενεργοποιηθεί και παραμένουν στον οργανισμό και μετά το πέρας της μόλυνσης. Όταν ο οργανισμός συναντήσει το ίδιο αντιγόνο τότε τα μνημονικά κύτταρα δρουν πιο γρήγορα εναντίον του, από ότι τα παρθενικά T λεμφοκύτταρα. Όσον αφορά τους υποδοχείς τους, σε σύγκριση με τα naïve T λεμφοκύτταρα, τα μνημονικά (memory), εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα μορίων τα οποία σχετίζονται με την προσκόλληση, όπως ιντεγκρίνες και το μόριο CD44, τα οποία προωθούν την μετανάστευση των μνημονικών κυττάρων προς την περιοχή που έχει εμφανιστεί κάποια μόλυνση. Σε αντίθεση με τα naïve T λεμφοκύτταρα, τα memory T λεμφοκύτταρα εκφράζουν μία ισομορφή του CD45 μορίου 180kD αφού το m-rna του εξονίου Α έχει υποστεί διαφορετική ωρίμανση. Αυτά καλούνται CD45RO κύτταρα. (Sallusto et al., 2000) Διαβιβαστές: κυτταροκίνες και χημειοκίνες Οι κυτταροκίνες αποτελούν μικρού μοριακού βάρους (<30 kda) διαλυτές πρωτεΐνες, πεπτίδια ή γλυκοπρωτεΐνες, που εκκρίνονται από τα κύτταρα τα οποία συμμετέχουν στους μηχανισμούς της ανοσoαπόκρισης του οργανισμού. Ο τρόπος δράσης των κυτταροκινών διακρίνεται σε αυτοκρινή (autocrine) κατά τον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, σε παρακρινή (paracrine) όπου προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων-στόχων που βρίσκονται κοντά στο κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει και τέλος σε ενδοκρινή (endocrine) στον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων τα 23

24 Εισαγωγή οποία βρίσκονται μακριά από το κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει. Εξ αιτίας της απουσίας ενός ολοκληρωμένου συστήματος ταξινόμησης οι κυτταροκίνες αναγνωρίζονται με ποικίλους τρόπους, όπως από το κύτταρο προέλευσης, από την ιδιότητά τους (π.χ. παράγοντας νέκρωσης όγκου), από τη λειτουργία τους στην ανοσιακή απόκριση (π.χ. προφλεγμονώδη ή αντιφλεγμονώδη), και από τη δομική ταξινόμηση ανάλογα με τον υποδοχέα. Η λειτουργική ταξινόμηση των κυτταροκινών περιλαμβάνει τις εξής κατηγορίες: Ανοσορρυθμιστικές κυτταροκίνες που παράγονται από τα Τ βοηθητικά 1 (T helper 1, Th1) ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα, όπως η ιντερλευκίνη 12 (IL-12) και η ιντερφερόνη γ (IFN-γ). Κυτταροκίνες που παράγονται από τα Τ βοηθητικά κύτταρα 2 (Τ helper 2, Th2), όπως η ιντερλευκίνη 4 (IL-4), η ιντερλευκίνη 5 (IL-5), η ιντερλευκίνη 6 (IL-6), η ιντερλευκίνη 10 (IL-10) και η ιντερλευκίνη 13 (IL-13). Οι Th2 κυτταροκίνες αναστέλλουν τις Τh1, την αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα των μακροφάγων, ενώ επάγουν τον πολλαπλασιασμό των Β κυττάρων και την παραγωγή αντισωμάτων. Προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως η ιντερλευκίνη 1 (IL-1), ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (tumor necrosis factor-α, TNF-α), και η ιντερλευκίνη 6 (IL-6). Κυτταροκίνες που παράγονται από τα T βοηθητικά 17 (T helper 17, Τh17) κύτταρα και είναι σημαντικές για τη διαφοροποίησή τους. Αιμοποιητικές κυτταροκίνες (παράγοντες που διεγείρουν αποικίες αιμοποιητικών κυττάρων), όπως ο αυξητικός παράγοντας κοκκιοκυττάρωνμακροφάγων (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), αυξητικός παράγοντας κοκκιοκυττάρων (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), o αυξητικός παράγοντας μακροφάγων (macrophage colony stimulating factor, M-CSF) και η ερυθροποιητίνη. Παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης, όπως ο αυξητικός παράγοντας αιμοπεταλίων (platelet derived growth factor, PDGF), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (epidermal growth factor, EGF), ο αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (fibroblast growth factors, FGF) και ο αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης β (transforming growth factor beta, TGF-β). Οι κυτταροκίνες ελέγχουν την ένταση και τη διάρκεια της ανοσοαπόκρισης με τη διέγερση ή την αναστολή της ενεργοποίησης, του πολλαπλασιασμού ή και της διαφοροποίησης διαφόρων κυττάρων, καθώς επίσης και με το να ρυθμίζουν την 24

25 Εισαγωγή έκκριση αντισωμάτων ή άλλων κυτταροκινών. Οι κυτταροκίνες που εκκρίνονται από ένα λεμφοκύτταρο όταν αυτό ενεργοποιηθεί, μπορούν να επηρεάσουν και να ενεργοποιήσουν ένα ολόκληρο δίκτυο αλληλεπιδρώντων κυττάρων (Cellular and Molecular Immunology). Για να μεταναστεύσουν τα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος στο σημείο του οργανισμού που έχει υποστεί βλάβη, απαραίτητο ρόλο διαδραματίζουν οι χημειοκίνες. Οι χημειοκίνες είναι μικρά μόρια, που προσελκύουν κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος στην περιοχή όπου εντοπίζεται η φλεγμονή και για αυτό το λόγο είναι απαραίτητες για την προστασία του οργανισμού (Steinke et al., 2006, Fallahi et al., 2012) Εικόνα 4: Λειτουργική ταξινόμηση των κυτταροκινών Ιντερλευκίνες Μία κατηγορία κυτταροκινών είναι οι ιντερλευκίνες, οι οποίες συμβάλλουν στην επικοινωνία μεταξύ των λευκοκυττάρων. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 37 ιντερλευκίνες από τις οποίες οι IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 και IL-10 συμμετέχουν στην ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης (Akdis et al., 2011). ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-2 (IL-2) Η IL-2 είναι μια κυτταροκίνη η οποία εκκρίνεται κυρίως από τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, όταν αυτά ενεργοποιηθούν, καθώς και από τα μνημονικά (Ehlers et al., 1991). Η IL-2 είναι αναγκαία για την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων σε δραστικά Τ κύτταρα. Η IL-2 παράγεται κανονικά από τα κύτταρα Τ κατά τη διάρκεια ανοσοαπόκρισης. Όταν τα παρθενικά T λεμφοκύτταρα ενεργοποιηθούν, αφού συναντήσουν ένα αντιγόνο, τότε παρατηρείται έκφραση της IL-2 καθώς και του μεμβρανικού της υποδοχέα (IL-2 receptor, IL-2R). Τον υποδοχέα της IL-2 εκφράζουν και άλλα κύτταρα όπως τα CD4 + ή τα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα, τα Β λεμφοκύτταρα και τα ΝΚ κύτταρα. Η έκφραση της IL-2 έχει σαν αποτέλεσμα την έναρξη της διαφοροποίησης και του 25

26 Εισαγωγή πολλαπλασιασμού του T λεμφοκυττάρου που τον εκφράζει (αυτοκρινής τρόπος δράσης) καθώς και των άλλων κυττάρων που φέρουν τον υποδοχέα IL-2R (παρακρινής και ενδοκρινής τρόπος δράσης). Όταν η IL-2 δεθεί στον υποδοχέα της στα Β λεμφοκύτταρα τότε αυτά επάγονται για παραγωγή αντισωμάτων (Cantrell et al., 1984, Smith et al., 1988, Wei et al., 2013). Η IL-2 είναι επίσης απαραίτητη κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του Τ κυττάρου στο θύμο για την ωρίμανση ενός υποσυνόλου Τ κυττάρων που ονομάζονται ρυθμιστικά Τ κύτταρα (T-regs). Μετά την έξοδο από τον θύμο αδένα, η λειτουργία των Τ Regs είναι να εμποδίσουν άλλα Τ κύτταρα από το να αναγνωρίσουν και να αντιδράσουν εναντίον αντιγόνων του εαυτού, γεγονός το οποίο θα μπορούσε να οδηγήσει σε αυτοανοσία. Η IL-15 βρέθηκε να είναι παρόμοια με την IL-2. Και οι δυο κυτταροκίνες είναι σε θέση να προάγουν την παραγωγή των ανοσοσφαιρινών από τα Β κύτταρα και να επάγουν την διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των φυσικών φονικών κυττάρων. Οι βασικές διαφορές μεταξύ της IL-2 και της IL-15 εντοπίζονται στις αποκρίσεις της ειδικής ανοσίας. Για παράδειγμα, η IL-2 είναι απαραίτητη για την ειδική ανοσία σε ξένους παθογόνους παράγοντες, όπως είναι η βάση για την ανάπτυξη ανοσολογικής μνήμης. Από την άλλη, η IL-15 είναι απαραίτητη για τη διατήρηση εξαιρετικά ειδικών αποκρίσεων του Τ κυττάρου ενισχύοντας την επιβίωση των CD8 Τ κυττάρων μνήμης (Waldmann et al., 2006). Η έκφραση της IL-2 ελέγχεται κυρίως στο μεταγραφικό επίπεδο. Ο υποκινητής του γονιδίου της IL-2 φέρει πολλές θέσεις πρόσδεσης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες (ΑΡ-1, NF-kβ, NFAT) (Mouzaki et al., 1993). Η καταστολή ή ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 ελέγχεται από την πρόσδεση διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων (ΑΡ-1, NF-kβ, Oct-1, NFAT) σε μία μικρή περιοχή του υποκινητή 300 περίπου βάσεων που βρίσκεται πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου (Εικόνα 5) (Serfling et al., 1995) Εικόνα 5: Σχηματική αναπαράσταση των πιθανών θέσεων δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Pu-b p, Pu-b d : proximal and distal Purine Box, UPS : Upstream Promoter Site, TRE: TPA Response Element, TCE p TCE d : proximal, distal T Cell response Element, US1, US2/3: Upstream Site 1,2/3, ARRE-1/2: Antigen Receptor Response Element 1,2, Oct- 1/2: Octamer-1/2, CD28RE: CD28 Response Element, NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells (Serfling et al., 1995). 26

27 Εισαγωγή Κομβικό ρόλο στην μεταγωγή σήματος από την επιφάνεια του κυττάρου στον πυρήνα παίζει η ενδοκυτταρική αύξηση ιόντων Ca + που οδηγεί σε αύξηση της ενεργότητας της φωσφατάσης καλσινευρίνης (Loh et al., 1996). Η καλσινευρίνη με την σειρά της αποφωσφορυλιώνει κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-2 στον NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells). Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την μετακίνηση του NFAT από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και την μεταγραφή του γονιδίου της IL-2. Μέχρι τώρα αναγνωρίζουμε ότι η αρνητική ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 εμφανίζεται σε δύο στάδια. Το πρώτο είναι όταν τα Τ κύτταρα είναι αδρανή, πριν την έναρξη σηματοδότησης μέσω του TCR υποδοχέα και το δεύτερο που πραγματοποιείται μετά την πρόσδεση του αντιγόνου στον TCR υποδοχέα, όπου πραγματοποιείται αναστολή της ενεργοποίησης ώστε να παύσει η έκφραση του γονιδίου της IL-2 και να σταματήσει η διαδικασία ενεργοποίησης του Τ κυττάρου. Πρόσφατα αποτελέσματα στο εργαστήριο μας δείχνουν την ύπαρξη ενός παράγοντα, ο οποίος προσδένεται στον υποκινητή της IL-2 και δρα κατασταλτικά στην έκφραση της IL-2 σε συνθήκες μη ενεργοποίησης, ενώ η κατασταλτική του δράση εξαφανίζεται μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών (Διδακτορική διατριβή Παναγούλιας Ιωάννης). Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV-1) To AIDS είναι μια ασθένεια του ανοσοποιητικού συστήματος. Η ονομασία προέρχεται από τα αρχικά των λέξεων Aquired Immune Deficiency Syndrome, δηλαδή σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας. Έχουν βρεθεί 2 τύποι του ιού (HIV-1 και HIV-2) οι οποίοι διαφέρουν ως προς τη δομή του γονιδιώματος και την αντιγονικότητα. Ο HIV τύπου 1 εμφανίζεται με μεγαλύτερη συχνότητα από αυτόν του τύπου 2. Ο HIV είναι ένας δίκλωνος RNA-ιός (ρετροιός) με διάμετρο nm και όπως όλοι οι ιοί, αντιγράφεται μέσα στα ζωντανά κύτταρα του ξενιστή. Ένα ιοσωμάτιο εμφανίζει εικοσαεδρική, σχεδόν σφαιρική διαμόρφωση και είναι περίπου 60 Εικόνα 5: Ο ιός HIV-1 ( 27

28 Εισαγωγή φορές μικρότερο από ένα ερυθρό αιμοσφαίριο (Fisher et al., 2007). Ο ιικός φάκελος, άμεσα προερχόμενος από την πλασματική μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή, φέρει τη δομή λιπιδικής διπλοστοιβάδας και στο περίβλημά του είναι προσκολλημένες γλυκοζυλιωμένες ιικές πρωτεΐνες που προεκβάλλουν στην εξωτερική του επιφάνεια. Κάθε τέτοια προεκβολή σχηματίζεται από τη σύνδεση 2 κύριων γλυκοπρωτεϊνών, της εξωκυτταρικής gp120 και της διαμεμβρανικής gp41. Στο εσωτερικό του ιικού φακέλου βρίσκεται το στρώμα (matrix), το οποίο περιβάλλει το καψίδιο και την ιική πρωτεάση, ένα απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό του ιού ένζυμο. Το κωνικό καψίδιο περικλείει με τη σειρά του το νουκλεϊνικό καψίδιο, το οποίο περιέχει δύο αντίγραφα μονόκλωνου RNA που αποτελούν το γενετικό υλικό του ιού, καθώς και τα ένζυμα αντίστροφη μεταγραφάση και ιντεγκράση που εξυπηρετούν βασικές ιικές λειτουργίες (Weiss et al., 2001). Το προϊικό γονιδίωμα του HIV (περίπου 9,2 Κbp) φέρει 9 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs). Τρία εξ αυτών κωδικοποιούν τρία κοινά σε όλους τους ρετροϊούς πρόδρομα γλυκοπολυπρωτεϊνικά προϊόντα (gag, pol και env), τα οποία σχεδόν αμέσως μετά τη σύνθεσή τους πρωτεολύονται σε ανεξάρτητες πρωτεΐνες. Οι 4 gag (matrix, capsid, nucleocapsid, p6) και οι 2 env πρωτεΐνες, η επιφανειακή gp120 και η διαμεμβρανική gp41 αποτελούν τα δομικά συστατικά του ιικού πυρήνα και του εξωτερικού μεμβρανικού φακέλου του ιοσωματίου αντίστοιχα (Oberlin et al., 1996) Εικόνα 6: Σχηματική αναπαράσταση του ιού HIV-1 ( 28

29 Εισαγωγή Οι 3 pol πρωτεΐνες (πρωτεάση, αντίστροφη μεταγραφάση και ιντεγκράση) περιέχονται στο εσωτερικό του ιικού καψιδίου και καταλύουν ζωτικές για τον ιό ενζυμικές αντιδράσεις. Το γονιδίωμα του HIV, όπως συμβαίνει με όλους τους σύνθετους ρετροϊούς, κωδικοποιεί επιπλέον πολλές συνοδευτικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες (tat, nef, rev, vif, vpr και vpu), κάθε μία εκ των οποίων είτε διαδραματίζει το δικό της ρόλο είτε δρα συνεργατικά στο βιολογικό κύκλο του ιού. Εικόνα 7: Βασική γoνιδιακή δομή του ιού του HIV-1. HIV-1 Ο κύκλος ζωής Ο κύκλος ζωής του ενός HIV-1 ιοσωματίου μπορεί να συνοψιστεί στα ακόλουθα διαδοχικά στάδια: Μόλυνση του κυττάρου Παραγωγή DNA του ιού και ενσωμάτωσή του στο γονιδίωμα του ξενιστή Έκφραση των γονιδίων του ιού και παραγωγή των ιικών σωματίων Ο HIV μολύνει τα κύτταρα μέσω της σύνδεσης της κύριας γλυκοπρωτεΐνης του περιβλήματος, δηλαδή της gp120 (μοριακού βάρους 120 kda) με τους CD4 υποδοχείς και με ορισμένους υποδοχείς χημειοκινών, (CCR5 και CXCR4) των ανθρώπινων κυττάρων (Feng et al., 2008, Hladik et al., 2008). 29

30 Εισαγωγή Εικόνα 8: Ο ιός HIV-1 και ο κύκλος ζωής του ( Αρχικά η gp120 προσδένεται στο CD4 των Τ λεμφοκυττάρων και το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την έκθεση ή τη δημιουργία μιας θέσης συνυποδοχέα στην V3 περιοχή της γλυκοπρωτεΐνης. Η αλληλεπίδραση της gp120 με τους CD4 υποδοχείς, η αναδίπλωση της gp41 καθώς και η σύζευξη της gp120 με τους υποδοχείς των χημειοκινών αποτελούν τρεις διακριτές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την είσοδο του HIV-1 σε υγιή κύτταρα. Η αναστολή οποιασδήποτε εκ των τριών διεργασιών οδηγεί στην παρεμπόδιση της μόλυνσης από τον HIV-1. Εκτός από τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα, δευτερευόντως μπορούν να προσβληθούν τα μακροφάγα και τα δενδριτικά (Kaul et al., 2001). Οι διάφοροι τύποι κυττάρων χρησιμοποιούν 30

31 Εισαγωγή διαφορετικούς υποδοχείς χημειοκινών για να συνδεθούν με ελαφρώς διαφορετικά στελέχη του ιού. Η πρόσδεση της gp120 του ιού στους κυτταρικούς υποδοχείς επάγει διαμορφωτικές αλλαγές στη διαμεμβρανική πρωτεΐνη gp41, η οποία προάγει τη σύντηξη της ιικής μεμβράνης με αυτή του κυττάρου-ξενιστή. Ο ιός εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα, όπου αποβάλλει το περίβλημά του μέσω της ιικής πρωτεάσης και απελευθερώνεται έτσι το ιικό RNA. Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση του ιού δημιουργεί ένα αντίγραφο DNA του ιικού RNA και το DNA ενσωματώνεται στο DNA του κυττάρου-ξενιστή με τη δράση του ενζύμου ιντεγκράση. Το ενσωματωμένο ιικό DNA ονομάζεται προϊός. Αν το μολυσμένο κύτταρο ενεργοποιηθεί από κάποιο εξωγενές ερέθισμα, τότε απαντά με την έναρξη της μεταγραφής πολλών γονιδίων του και συχνά με την παραγωγή κυτταροκινών. Μια ατυχής συνέπεια της φυσιολογικής αυτής απάντησης είναι ότι οι κυτταροκίνες, καθώς και η ίδια η διαδικασία της κυτταρικής ενεργοποίησης, μπορούν να ενεργοποιήσουν και τον προϊό. Η ιική μεταγραφή επιτυγχάνεται από την κυτταρική RNA πολυμεράση ΙΙ με την παραγωγή ιικών RNA μεταγράφων. Ο ιός είναι πλέον έτοιμος να σχηματίσει ένα πλήρες ιοσωμάτιο το οποίο μεταναστεύει προς την κυτταρική μεμβράνη και αποκτά ένα λιπιδικό περίβλημα από τον ξενιστή. Η εκβλάστηση των ανώριμων ιικών τμημάτων στην κυτταρική μεμβράνη ακολουθείται από μία μορφολογική αλλαγή του ιοσωματίου, γνωστή ως ωρίμανση, η οποία απαιτεί την πρωτεολυτική δράση της ιικής πρωτεάσης. To ώριμο πλέον ιοσωμάτιο αποβάλλεται και είναι ικανό να μολύνει άλλα κύτταρα. Κοινός τρόπος ρύθμισης της μεταγραφής του ιού HIV1 και του γονιδίου της IL-2 Στα Τ λεμφοκύτταρα παρόλο που ιός μολύνει τόσο τα μνημονικά όσο και τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, τα εν ηρεμία παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, που όπως αναφέραμε εκφράζουν το δείκτη CD45RA, δεν είναι τόσο δεκτικά στην έκφραση και πολλαπλασιασμό του ιού όσο τα μνημονικά CD45RO Τ λεμφοκύτταρα (Robichaud et al., 2002, Spina et al., 1997). Η έκφραση του ιού συνδέεται σημαντικά με την ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων τα οποία έχουν μολυνθεί. Η ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων του HIV-1 ελέγχεται όπως έχουμε ήδη αναφέρει από την LTR περιοχή. Η 5 LTR αλληλουχία δρα για την επαγωγή της μεταγραφής του προϊικού γονιδιώματος ενώ η 3 LTR απαιτείται για την πολυαδενυλίωση των μετάγραφων που προκύπτουν (Cullen et al., 1991). Η 5 LTR αλληλουχία χωρίζεται σε λειτουργικές περιοχές. Αυτές είναι η περιοχή TAR (transactivation response element), η βασική περιοχή (core region), η περιοχή του 31

32 Εισαγωγή ενισχυτή (enhancer region) και η περιοχή των ρυθμιστικών στοιχείων (modulatory region) (Li et al., 2012). HIV-1 5 LTR Εικόνα 9: Διαγραμματική απεικόνιση της 5 -LTR αλληλουχίας του ιού HIV-1. Ο υποκινητής του ιού (LTR περιοχή), μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις περιοχές, τη U3, την R και την U5. H περιοχή U3 διαχωρίζεται με την σειρά της σε τρείς χαρακτηριστικές περιοχές την ρυθμιστική περιοχή (Modulatory region), την περιοχή του ενισχυτή (Enhancer region) και την βασική περιοχή (Core region). Μετά την ενσωμάτωση του ιού, η LTR παρουσιάζει θέσεις υπερευαισθησίας της DNase I (HS2, HS3 και HS4) ως αποτέλεσμα της σωστής τοποθέτησης των δύο νουκλεοσωμάτων. Αυτή η δομή έχει ως αποτελέσματα την έκθεση τμημάτων του DNA, κατά τη μεταγραφή του HIV-1, πλούσια σε θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων που περιλαμβάνουν διαφορετικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες. Οι παράγοντες αυτοί ανταποκρίνονται σε διάφορα εξωκυτταρικά και ενδοκυτταρικά ερεθίσματα, με αποτέλεσμα την θετική ρύθμιση ή αρνητική ρύθμιση των ειδικών μεταγραφικών παραγόντων που δρουν μέσω της σύνδεσης με τις αντίστοιχες θέσεις πρόσδεσής τους στην LTR (Li et al., 2012). Η μεταγραφή των γονιδίων του ιού ελέγχεται από την αλληλεπίδραση ιικών και κυτταρικών μεταγραφικών παραγόντων που δένουν στην περιοχή LTR του ιικού γονιδιώματος. Στην ΤΑR περιοχή προσδένεται ο ιικός trans-ενεργοποιητής tat ενώ η βασική περιοχή περιλαμβάνει τον εκκινητή (initiator-inr), την TATA αλληλουχία (TATA box promoter sequence) και τρεις περιοχές πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Στην περιοχή του ενισχυτή προσδένονται ο NF-κΒ και ο NFAT ενώ η ρυθμιστική περιοχή φέρει θέσεις για την πρόσδεση μιας σειράς κυτταρικών μεταγραφικών παραγόντων όπως του NF-IL-6 (Nuclear Factor-Interleukin-6), του μεταγραφικου παράγοντα CREB (camp response element binding protein), μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας ets και πυρηνικών υποδοχέων ορμονών (Pereira et al., 2000). Η έναρξη της μεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων του HIV σχετίζονται με την φυσιολογική ενεργοποίηση των T λεμφοκυττάρων από κάποιο αντιγόνο ή από κυτταροκίνες. Η συνάντηση του μολυσμένου Τ 32

33 Εισαγωγή λεμφοκυττάρου με κάποιο αντιγόνο προκαλεί την έξοδο του ιού από την φάση καταστολής και την έναρξη της παραγωγής των ιοειδών. Στην LTR αλληλουχία εκτός από περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν την έκφραση του ιού, όπως ο NFAT και NF-kΒ, έχουν αναγνωριστεί και περιοχές στις οποίες προσδένονται άλλες πρωτεΐνες του κυττάρου ξενιστή που οδηγούν στην καταστολή της έκφρασης αυτού. Κάποιοι από αυτούς τους μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι καταστέλλουν την έκφραση του ιού που έχουν αναγνωριστεί είναι ο CBF-1 (Tyagi et al. 2007), STAT5 (Crotti et al., 2007), MBP-1, FOXP3 (Selliah et al., 2008) και πιο πρόσφατα ο ZBRK1 (Nishitsuji et al., 2012). Η απόκριση του ιού HIV-1 στην ενεργοποίηση του κυττάρου μοιάζει αρκετά με αυτή του γονιδίου της IL-2. Στην Τ λευχαιμική σειρά Jurkat αυτή η απόκριση ελέγχεται από την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα NFAT στην περιοχή του LTR του HIV-1 που καλείται PRRE (Purine Rich Respond Element). Η περιοχή αυτή, που εκτείνεται από το -279 έως -250, περιλαμβάνεται στην NRE (Negative Response Element) αλληλουχία της LTR αλληλουχίας του HIV-1 που εκτείνεται από το -340 έως το -185bp από το σημείο έναρξης της μεταγραφής. Έλλειμμα της PRRE περιοχής από τον LTR έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της μεταγραφής του HIV-1 στην Jurkat κυτταρική σειρά (Lu et al., 1992), ενώ ένθεση ενός αντιγράφου του PRRE στο πλαίσιο ενός υβριδικού υποκινητή είχε ως αποτέλεσμα την μείωση του ρυθμού μεταγραφής δείχνοντας έτσι ότι το στοιχείο PRRE έχει κατασταλτικό ρόλο στην έκφραση του ιού. Η PRRE αλληλουχία του HIV-1-LTR παρουσιάζει μία ομολογία με την περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 (Sikder Et al., 1994). Αυτή η κοινή περιοχή του υποκινητή της IL-2 και του HIV-1-LTR, αργότερα ονομάστηκε RATS (Repressor Activator Target Sequence) (Mouzaki et al., 2000).. Η περιοχή αυτή του LTR από το νουκλεοτίδιο στη θέση 279 έως 250 βρέθηκε ότι παρουσιάζει ομολογία με την αλληλουχία ARRE-2 (-292 με 273) του υποκινητή της IL-2, η περιοχή αυτή ονομάστηκε PRRE (Purine Rich Response Elements). HIV 1 PRRE -279 AGGCCAATGAAGGAGAGAACAACAGCTTGT -250 IL-2 ARRE -292 AAGAAAGGAGGAAAAACT-GT -273 Εικόνα 10: Η PRRE αλληλουχία είναι κοινή στον HIV 1-LTR και στον υποκινητή του γονιδίου της IL-2. Με έντονο χρώμα υποδηλώνεται η θέση πρόσδεσης του καταστολέα (AAGGAG). 33

34 Εισαγωγή Δομικές και λειτουργικές συνέπειες της ακετυλίωσης των ιστονών Η ακετυλίωση των Ν-τελικών ουρών των ιστονών αφορά τη μεταφορά της ακετυλομάδας από το ακετυλο-συνένζυμο Α (acetyl-coa) στην ε-αμινομάδα συγκεκριμένων καταλοίπων λυσίνης. Καταλύεται από τα ένζυμα ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών (Histone acetyltransferases, ΗΑΤ) που διακρίνονται σε δύο τύπους. Οι ΗΑΤ τύπου-β καταλύουν την ακετυλίωση των ελεύθερων ιστονών στο κυταρρόπλασμα, η οποία είναι απαραίτητη για την μετέπειτα συγκρότησή τους σε νουκλεοσώματα στον πυρήνα. Οι ΗΑΤ τύπου-α ακετυλιώνουν τις ουρές των ιστονών πάνω στην οργανωμένη δομή της χρωματίνης και συνδέονται με τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων (Grunstein et al., 1997). Ο μηχανισμός με τον οποίο η ακετυλίωση των ιστονών ενεργοποιεί τη μεταγραφή δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί, το πιθανότερο όμως είναι ότι επηρεάζει μια σειρά γεγονότων που σε συνδυασμό οδηγούν στην αυξημένη πρόσβαση των μεταγραφικών παραγόντων στη χρωματίνη. Έτσι έχει προταθεί ότι η μεταφορά της αρνητικά φορτισμένης ακετυλομάδας στην ουρά των ιστονών μειώνει το θετικό φορτίο τους και αυτό προκαλεί μια γενική χαλάρωση στη δομή του νουκλεοσώματος λόγω ασθενέστερης αλληλεπίδρασης του DNA με τις ιστόνες. Πιο σημαντικές συνέπειες της ακετυλίωσης έχουν παρατηρηθεί στο επίπεδο των ινιδίων της χρωματίνης. Συγκεκριμένα, η ακετυλίωση των ιστονών σε ανασυγκροτημένες σειρές νουκλεοσωμάτων in vitro δρα παρεμποδιστικά στην ικανότητα αυτών των σειρών να αναδιπλώνονται στις υψηλής-τάξης δομές (Avvakumov et a., 2007). Λόγω των παραπάνω αλλαγών στη δομή της χρωματίνης η ακετυλίωση μπορεί να διευκολύνει τη πρόσβαση των διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων, μέσω έκθεσης στοιχείων αναγνώρισης στο DNA που πριν δεν ήταν προσβάσιμα σε αυτούς (Mahgoub et al., 2014). Εναλλακτικά η ακετυλίωση μπορεί να εξουδετερώνει την παρεμποδιστική δράση άλλων συμπλόκων, καθώς σε αρκετές περιπτώσεις φαίνεται ότι η ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων γίνεται μέσω του ανταγωνισμού συμπλόκων απακετυλασών και ακετυλο-τρανσφερασών της χρωματίνης (Pazin et al., 1997). Επίσης μπορεί να σηματοδοτεί αλληλεπιδράσεις με άλλα σύμπλοκα ή να επάγει τη δράση αυτών. Συσχέτιση ακετυλίωσης και μεταγραφικής ενεργοποίησης Η άμεση συσχέτιση της ακετυλίωσης των ιστονών με τη μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων δείχθηκε πρώτη φορά με τον καθαρισμό και προσδιορισμό της αμινοξικής αλληλουχίας τμήματος ενός πολυπεπτιδίου με ενεργότητα ΗΑΤ τύπου-α από τη Tetrahymena thermophila (Brownell et al., 1996). Η 34

35 Εισαγωγή αποκάλυψη ότι αυτό ήταν ομόλογο με την πρωτεΐνη Gcn5 του Saccharomyces cerevisiae που είχε αρχικά χαρακτηριστεί, ως συν-ενεργοποιητής της μεταγραφής συνέδεε τα δύο γεγονότα. (Georgakopoulos et al., 1992).Η διαπίστωση ότι η ενεργότητα ΗΑΤ όλων αυτών των παραγόντων είναι απαραίτητη για την in vivo δράση των συμπλόκων που ανήκουν, οδήγησε στην υπόθεση ότι δρουν ως συνενεργοποιητές της μεταγραφής λόγω της ικανότητάς τους να τροποποιούν τις ουρές των ιστονών και να προκαλούν αλλαγές στη δομή της χρωματίνης. Εικόνα 11: Μια γενική άποψη της μεταγραφικής ρύθμισης των γονιδίων. Η ακετυλίωση των Ν-τελικών ουρών των ιστονών από ένα σύμπλοκο ΗΑΤ οδηγεί σε τοπικές μεταβολές των επαφών του DNA με τα νουκλεοσώματα που επιτρέπουν τη δέσμευση του ΤΒΡ στο στοιχείο ΤΑΤΑ και την έναρξη της μεταγραφής. Η στρατολόγηση αυτών των παραγόντων γίνεται από τον μεταγραφικό ενεργοποιητή του γονιδίου ( Η ομάδα ακετυλοτρανσφερασών που μας ενδιαφέρει στη μελέτη μας είναι η ΜΥST. Η οµάδα αυτή περιλαμβάνει γνωστές ή δυνητικές ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών και ονοµάστηκε έτσι από τα από τα αρχικά των πρώτων µελών της που ταυτοποίηθηκαν, δηλαδή των πρωτεϊνών MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2, Tip60 ενώ αργότερα προστέθηκαν σε αυτή και η Esa1 της ζύµης, η MOF της Drosophila και οι HBO1 και MORF του ανθρώπου. Οι παραπάνω πρωτεΐνες παρόλο που ανήκουν στην ίδια οικογένεια εξαιτίας της υψηλής οµολογίας των αλληλουχιών τους και της παρουσίας σε όλες µίας ξεχωριστής περιοχής κατάλυσης, έχει βρεθεί πως συµµετέχουν σε ένα ευρύ φάσµα ρυθµιστικών λειτουργιών στους διάφορους οργανισµούς (Sterner et al., 2000). 35

36 Εισαγωγή Γονίδιο Tip60 (HIV-1 Tat Interactive Protein) H Tip60 (Tat-interactive protein, 60kDa) μια από τις πιο χαρακτηριστικές MYST πρωτεΐνες, αρχικά προσδιορίστηκε ως αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη με την HIV-1 ΤΑΤ πρωτεΐνη (Kamine et al., 1996). Το γονίδιο Tip60 που κωδικοποιεί την Tip60 βρίσκεται στο 11q13.1 και αποτελείται από 14 εξόνια. Εναλλακτικά ονόματα για την Tip60 είναι: KAT5, ESA, HTATIP, HTATIP1, PLIP, TIP και cpla2. Αποτελέσματα από εναλλακτικό μάτισμα δίνουν τέσσερις ισομορφές για την Tip60, την Tip60 ισομορφή 1 (αυτή η ισομορφή έχει επιλεγεί ως η «κανονική» αλληλουχία),την 2, την 3 και την Tip60 ισομορφή 4. H πιο χαρακτηριστική ισομορφή της Tip60 είναι η ισομορφή 2 η οποία εναλλακτικά ονομάζεται και PLIP. Η ισομορφή 1 προκύπτει από τη μετάφραση του ιντρονίου 1 και κωδικοποιεί μια νέα πρωτεΐνη με δυνητικά διακριτές λειτουργίες (Legube et al., 2003). H ισομορφή 3 προκύπτει από τον αποκλεισμό του εξονίου 5 το οποίο κωδικοποιεί μια περιοχή πλούσια σε προλίνη και φαίνεται να έχει παρόμοιες ιδιότητες με την ισομορφή 1 (Nordentoft et al., 2003). Οι ισομορφές της Tip60 εκφράζονται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα σε μια ευρεία ποικιλία ιστών και κυττάρων και παρουσιάζουν συγκεκριμένες λειτουργίες (Hlubek et al., 2001). Ομόλογα του γονιδίου Tip60 έχουν εντοπιστεί σε διάφορους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένου και των G. gallus, Μ. musculus και D. melanogaster, οι οποίοι κωδικοποιούν πρωτεΐνες που μοιράζονται σημαντικές ομοιότητες με την ανθρώπινη πρωτεΐνη Tip60 (57-99%) (McAllister et al., 2002). Η ισομορφή 2 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 513 αμινοξέων (58kDa), η οποία περιέχει μια Ν-τερματική chromodomain και μια συντηρημένη C-τελική περιοχή ΜΥST. Τα chromodomains είναι παρόντα σε πολλές ρυθμιστικές πρωτεΐνες και μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις με τις μεθυλιωμένες ιστόνες ή με μόρια RNA, παρόλο που για την περίπτωση της Tip60 το chromodomain έχει άγνωστες λειτουργίες. Η περιοχή MYST αποτελεί την καταλυτική περιοχή και περιέχει μια μικρή αλληλουχία ( συντηρημένη ΗΑΤ περιοχή) η οποία δεσμεύεται στο ακέτυλο Co-A και στο υπόστρωμα. Η περιοχή MYST επιπλέον περιέχει ένα Cys-Cys- His-Cys zing finger μοτίβο το οποίο είναι απαραίτητο για την δράση ακετυλοτρανσφεράσης και απαιτείται για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών (Nordentoft et al., 2003). Στο C-τελικό άκρο της Tip60 βρίσκεται το (NR)- interaction box. 36

37 Εισαγωγή Εικόνα 12: Σχηματικό διάγραμμα των πρωτεϊνικών περιοχών της Tip60 Η ισομορφή 2 είναι η πιο καλά χαρακτηρισμένη ισομορφή. Η ισομορφή 1 κωδικοποιεί επιπλέον 33 αμινοξέα στο Ν τερματικό άκρο, ενώ στην ισομορφή 3 έχουν αποκλειστεί 52 αμινοξέα μεταξύ της περιοχής της χρωματίνης και της περιοχής MYST (Sapountzi et al., 2008). Δράση ακετυλοτρανσφεράσης Λίγο μετά την ανακάλυψή του έγινε εμφανές ότι η Tip60 διαθέτει δραστηριότητα ακετυλοτρανσφεράσης (ΗΑΤ). Ανασυνδυασμένη Tip60 ακετυλιώνει τις βασικές ιστόνες H2A (Lys5), H3 (Lys14) και H4 (Lys5, Lys8, Lys12, Lys16) in vitro. Σε ένα σταθερό σύμπλοκο πολυπρωτεϊνών, η Tip60 μπορεί επίσης να τροποποιήσει in vitro ιστόνες σε νουκλεοσώματα. Σε αυτή τη περίπτωση η Tip60 στοχεύει επιλεκτικά στις H2A και H4 ιστόνες (Kimura et al., 1998, Yang et al., 2012). Πρόσφατα στοιχεία από την D. Melanogaster δείχνουν ότι η Tip60 μπορεί να ακετυλιώσει τροποποιημένες ιστόνες. Εκτός από τις ιστόνες, κυτταρική Tip60 μπορεί να ακετυλιώσει μεταγραφικούς παράγοντες, όπως τον υποδοχέα των ανδρογόνων (AR), τον UBF και τον c-myc (Gavaravarapu et al., 2000). Σύμπλοκο Tip60 Ανάλογα με την κυτταρική διαδικασία στην οποία συμμετέχει, η Tip60 σχηματίζει παροδικά διακριτά σύμπλοκα με τις κατάλληλες περιοχές δέσμευσης. Ωστόσο, η πλειοψηφία της κυτταρικής Tip60 υπάρχει σε ένα σταθερό πυρηνικό σύμπλοκο πολυπρωτεϊνών που αποτελείται από τουλάχιστον 18 υπομονάδες και εκτελεί λειτουργίες που σχετίζονται με τη μεταγραφή και με τις βλάβες στο DNA. Κεντρικό στοιχείο του συμπλόκου Tip60 είναι η πρωτεΐνη ικρίωμα που σχετίζεται με τον μετασχηματισμό και τη μεταγραφή(trrap) (Ikura et al., 2003), η οποία είναι παρούσα σε άλλα συμπλέγματα π.χ. p300/cbp. Μια άλλη βασική συνιστώσα του συμπλόκου είναι η p400/domino, μια ΑΤΡάση η οποία έχει δράση 37

38 Εισαγωγή αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης (Ikura et al., 2003). Η BAF53 και η ακτίνη είναι επίσης παρούσες στο σύμπλοκο του Tip60. Η BAF53 περιέχει μια περιοχή που σχετίζεται με την ακτίνη και μπορεί να έχει δραστηριότητα συνοδού ιστονών. Το σύμπλοκο στο οποίο συμμετέχει η Tip60 επίσης διαθέτει δραστηριότητα ελικάσης (Ikura et al., 2003). Το σύμπλοκο Tip60 περιλαμβάνει δύο ακόμη πρωτεΐνες με chromodomains την Mrg15 και την MrgX. Αυτές οι πρωτεΐνες, καθώς και η Gas41 εμπλέκονται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, στη βιωσιμότητα και στη γήρανση των κυττάρων. Η πρωτεΐνη MrgBP αποτελεί επίσης υπομονάδα του συμλόκου. Άλλα στοιχεία του συμπλόκου είναι ο EPC1 και ο EPC1-like (Cai et al., 2003), που εμπλέκονται στην μεταγραφή. Παρόμοιες σύμπλοκα με της Tip60 έχουν εντοπιστεί σε άλλους οργανισμούς, όπως στη D. melanogaster και ενδεχομένως, στον C. Elegans (Ceol et al., 2004). Συμμετοχή στη μεταγραφή Η Tip60 ως συγκαταστολέας της μεταγραφής Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, η Tip60 αναφέρεται ότι ενεργοποιεί την γονιδιακή έκφραση. Ωστόσο, η παρουσία της Tip60 δεν συσχετίζεται πάντα με μεταγραφική συνενεργοποίηση. Ενίοτε, η Tip60 ενεργοποιεί την έκφραση ορισμένων γονιδίων και ταυτόχρονα καταστέλλει την έκφραση άλλων, γεγονός που υποστηρίζει έναν ειδικό ρόλο ρύθμισης της μεταγραφής από την Tip60. Η Tip60 προκαλεί συνήθως καταστολή ενός γονιδίου μέσω στρατολόγησης άλλων συμπλόκων. Ο CREB είναι ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής που διεγείρεται από ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες που η φωσφορυλίωση τους εξαρτάται από την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA). Η Tip60 συγκαταστέλλει τον CREB μέσω άμεσης δέσμευσης σε αυτόν και καταστολή της διέγερσης αυτού από την PKA ( Green et al.,1990). 38

39 Εισαγωγή Εικόνα 13: Απλοποιημένο μοντέλο της συμμετοχής της Tip60 στην μεταγραφή των γονιδίων. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι μεταγραφικοί παράγοντες επάγουν την μεταγραφική ενεργοποίηση (Α), η οποία ενισχύεται από την Tip60 στο (Β) στην οποία και δρα ως συνενεργοποιητής. Η Tip60 μπορεί επίσης να καταστείλει την μεταγραφή των γονιδίων, με την επιλεκτική καταστολή μεταγραφικών παραγόντων (C) ή δρώντας κατασταλτικά στους μεταγραφικούς ενεργοποιητές (D). Αυτός ο διττός ρόλος της Tip60 επιτρέπει στο κύτταρο να επηρεάσει την ενεργοποίηση διακριτών γονιδίων. Σε αυτό το σημείο, δεν είναι ξεκάθαρο εάν η Tip60 πρέπει να τροποποιηθεί από μια μέταμεταφραστική τροποποίηση ή άλλου είδους ρύθμιση προκειμένου να έχει ένα συνενεργοποιητικό ή συγκατασταλτικό ρόλο (Gupta et al., 2013). Συμμετοχή της Tip60 στο μονοπάτι P53 Ενδείξεις ότι η Tip60 εμπλέκεται στην οδό του p53 αρχικά προέκυψαν από το γεγονός ότι η Tip60 και το p53 μοιράζονται κάποιες λειτουργικές ομοιότητες: και οι δύο πρωτεΐνες ρυθμίζονται από το ανθρώπινο ομόλογο του Mdm2 που καταλύει την ουβικιτινιλίωσή τους και την πρωτεοσωμική τους αποικοδόμηση. Επιπλέον, τα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών συσσωρεύονται μετά από βλάβη του DNA και τέλος και οι δύο μοιράζονται περιοχές δέσμευσης, όπως την PIRH2. Το σύμπλοκο της Tip60 περιλαμβάνει επίσης το ογκοκατασταλτικό γοωίδιο ING3, ένα στοιχείο του μονοπατιού p53 (Cai et al., 2003, Doyon et al., 2004) Από screening που πραγματοποιήθηκε με πολλά RNAis, ταυτοποιήθηκε η Tip60 ως ένα συστατικό του p53 μονοπατιού, το όποιο είναι απαραίτητο για την διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο στάδιο G1/S, ως απόκριση στην βλάβη του DNA. Επιπλέον, το μεταγραφικό σύμπλοκο της Tip60 ήταν σε θέση να ρυθμίσει και να αυξήσει, τα p53 γονίδια συμπεριλαμβανομένου του p21, τα ΜDM2 και την δραστηριότητα ακετυλοτρανσφεράσης της Tip60 που απαιτείται για την συνενεργοποίηση του p53 39

40 Εισαγωγή σε απάντηση στις βλάβες του DNA. Ο ING3 πιθανόν εμπλέκεται στην συνενεργοποίηση του p53 μέσω της Tip60.(Doyon et al., 2004) Απουσία ενός στρεσσογόνου ερεθίσματος, δείχθηκε ότι η Tip60 ρυθμίζει τη σταθερότητα του p53 παρεμβαίνοντας με το Mdm2 στην αποικοδόμηση του p53, διατηρώντας έτσι ένα καλό ποσοστό του p53 έτοιμο να ανταποκριθεί στις βλάβες του DNA (Legube et al., 2004). Η PIRH2 είναι ένα p53 γονίδιο που πολυουβικιτιλιώνει το p53 και πιστεύεται ότι συμμετέχει στην αρνητική ανατροφοδότηση που ελέγχει την σταθερότητα του p53. Η PIRH2 αλληλεπιδρά επίσης με την Tip60, και έτσι προστατεύεται από την ουβικιτινιλίωση και την πρωτεοσωμική αποικοδόμηση Δεν είναι ακόμη σαφές το πώς η ένωση της Tip60 και της PIRH2 επηρεάζει τη ρύθμιση του p53, αλλά είναι εύλογο ότι η Tip60 ελέγχει τη λειτουργία του p53 μέσω διακριτών και ενδεχομένως αντιτιθέμενων μηχανισμών. Ρύθμιση της πρωτεΐνης Tip60 Η Tip60 είναι ένας σημαντικός συμπαράγοντας πολλών πυρηνικών κατά κύριο λόγο διεργασιών. Αυτό σημαίνει ότι η έκφραση της Tip60, η σταθερότητα, η δραστηριότητα και ο εντοπισμός αυτής θα πρέπει να ρυθμίζονται αυστηρά στο κύτταρο με διάφορους τρόπους. Μέχρι στιγμής, η ρύθμιση της Tip60 από πρωτεΐνες δέσμευσης και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις έχει τεκμηριωθεί. Ο σχηματισμός συμπλόκων τροποποιεί τη λειτουργία της Tip60 και την δραστηριότητα ακετυλοτρανσφεράσης και μόνο στα πλαίσια των πυρηνικών συμπλόκων η Tip60 βρίσκεται σε θέση να τροποποιήσει ιστόνες νουκλεοσωμάτων. Επιπλέον, η ένωση με την Tat μειώνει την δράση ακετυλοτρανσφεράσης της Tip60 μια διαδικασία που πιστεύεται ότι χρησιμοποιείται από την πρωτεΐνη του ιού Tat προκειμένου να εμποδίσει την έκφραση των κυτταρικών γονιδίων (Creaven et al., 1999). Η Tip60 είναι μια ασταθής πρωτεΐνη με ένα σύντομο χρόνο ημίσειας ζωής από λεπτά, ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο (Legube et al., 2003). Σε περίπτωση απουσίας των ερεθισμάτων, τα χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνών στο κύτταρο διατηρούνται μέσω πρωτεοσωμικής αποικοδόμησης. Γενικά Η Tip60 είναι μια πρωτεΐνη με πολλαπλούς ρόλους, που επηρεάζουν τις λειτουργίες ενός ευρέος φάσματος στόχων, συμπεριλαμβανομένου των μεταγραφικών ρυθμιστών, των μηχανισμών του κυτταρικού κύκλου, των σημείων ελέγχου αυτού καθώς και των ρυθμιστών που επιδιορθώνουν το DNA. Η Tip60 εμπλέκεται στη ρύθμιση πολλών σηματοδοτικών μονοπατιών όπως του NF-κB και 40

41 Εισαγωγή του myc (Kim et al., 2012, Zhang et al., 2012). Εμπλέκεται σε ασθένειες όπως στον καρκίνο του προστάτη, αλλά και στην επιδιόρθωση του DNA (Coffey et al., 2012). Η συμμετοχή της λοιπόν σε πολλές και διαφορετικού είδους διεργασίες απαιτεί, η μελλοντική έρευνα να επικεντρωθεί στην κατανόηση του τρόπου με τον οποίο αυτή η πολύπλευρη πρωτεΐνη ρυθμίζεται, έτσι ώστε να εξακριβωθεί ο ακριβής μηχανισμός λειτουργίας, δεδομένου μάλιστα ότι έχει αποδειχθεί ότι έχει τόσο θετικές όσο και αρνητικές επιπτώσεις στα ίδια μονοπάτια. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς εμπλέκεται όχι μόνο στις φυσιολογικές κυτταρικές διεργασίες, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως σε ιογενείς λοιμώξεις, νευροεκφυλιστικές παθήσεις και καρκίνο. Η εμπλοκή της σε πολλαπλά μονοπάτια που ρυθμίζουν αρνητικά τον καρκίνο, όπως εκείνες των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών, Myc, E2F, p53 θα μπορούσε να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος (Fisher et al., 2012, Gao et al., 2014). Εικόνα 14: Συνοπτικά οι κύριες λειτουργίες τηςtip60 (Mattera et al., 2009) 41

42 Εισαγωγή Σκοπός Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του προφίλ έκφρασης της ακετυλοτρανσφεράσης Τip60 σε πληθυσμούς Τ βοηθητικών παρθενικών (CD3 + CD4 + CD45RA + ) και Τ βοηθητικών μνημονικών (CD3 + CD4 + CD45RO + ) λεμφοκύτταρων καθώς και η δράση της στην μεταγραφή του HIV-1 και της IL-2 Οι λόγοι που μας οδήγησαν στην μελέτη της Τip60 προκύπτουν από πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν ότι υπάρχει μια πιθανή αλληλεπίδραση της Tip60 με τον παράγοντα Εts-2, ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση της μεταγραφής τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του HIV-1. Επιπλέον η IL-2 και ο HIV-1 παρουσιάζουν κοινή μεταγραφική ρύθμιση που ελεγχέται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων σε κοινα cis στοιχεία. Επίσης, το Tip60 είναι μια Τat-αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο Tat του HIV-1. Τέλος το γεγονός ότι ο HIV-1. παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση στα εν ηρεμία Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα καθώς και ότι ο παράγοντας Εts-2, που πιθανόν αλληλεπιδρά με την Tip60, συμμετέχει στη καταστολή της έκφρασης υποδηλώνει μια πιθανή συμμετοχή της Tip60 σε αυτή τη διαδικασία. του ιού, 42

43 Εισαγωγή ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 43

44 Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων από ολικό αίμα Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δυο είδη δειγμάτων αίματος: Ηπαρινισμένο ολικό αίμα από υγιείς εθελοντές αιμοδότες, το οποίο συλλέχθηκε από το Κέντρο Αιμοδοσίας του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών Ηπαρινισμένο ολικό αίμα από ομφάλιο λώρο νεογνών, πηγή πλούσια σε παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα, το οποίο συλλέχθηκε στο 409 Γενικό Νοσοκομείο Πατρών Στη συνέχεια, τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος απομονώθηκαν με την βοήθεια φυγοκέντρησης βαθμίδωσης φικόλης (LSM-Lymphocyte separation medium). Η διαδικασία έχει ως εξής: Αραίωση του αίματος 1:1 με RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) το οποίο βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου (RT) Σε αποστειρωμένο Falcon προσθέτουμε φικόλη σε όγκο ίσο με το 1/3 του συνολικού όγκου Προσθέτουμε το αίμα με προσοχή, σιγά σιγά ώστε να μην αναμιχθεί με την φικόλη Φυγοκεντρούμε στις 2500 στροφές για 35 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), χωρίς φρένο Ύστερα από τον διαχωρισμό, προκύπτουν τρεις στιβάδες, στην πάνω στιβάδα είναι ο ορός του δείγματος, στην ενδιάμεση περιέχονται τα λευκοκύτταρα, στην τελευταία η φικόλη και τα ερυθροκύτταρα Λαμβάνουμε προσεκτικά τα κύτταρα τις ενδιάμεσης στιβάδας με πιπέτα Γεμίζουμε το διάλυμα των λευκοκυττάρων με φυσιολογικό ορό μέχρι τα 50ml Κάνουμε 2 πλύσεις, προσθέτοντας ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (σκέτο RPMI ή PBS 1x) Φυγοκεντρούμε στις 1800 στροφές για 10 λεπτά στους 4 ο C (2 φορές) Υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων με την χρήση κυτταρομετρητή Εικόνα 15: Αριστερά Αραιωμένο ομφαλοπλακουντικό αίμα (Β) πάνω από το στρώμα της φικόλης (F). Δεξιά Μετά από φυγοκέντρηση από κάτω προς τα πάνω, ερυθρά αιμοσφαίρια και φικόλη (R), λευκά αιμοσφαίρια (W) και ο ορός (Ρ) 44

45 Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση υποπληθυσμών κυττάρων Οι υποπληθυσμοί των Τ λεμφοκυττάρων θα απομονωθούν με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στη χρήση ειδικού αντισώματος το οποίο αναγνωρίζει τα προς ανίχνευση κύτταρα και προσδένεται με αυτά. Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Στα κύτταρα προστίθεται ειδικό αντίσωμα για τον υποπληθυσμό που πρόκειται να απομονωθεί. Ακολουθεί επώαση κυττάρων-αντισώματος για 10 στους 4 ο C, υπό ανάδευση. Πραγματοποιείται πλύση των μαγνητικών σφαιριδίων με ρυθμιστικό διάλυμα (isolation buffer). Στην συνέχεια ακολουθεί πλύση των κυττάρων προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος. Στα κύτταρα αυτά θα προστεθούν τα μαγνητικά σφαιρίδια και θα πραγματοποιηθεί επώαση για 15 στους 4 ο C, υπό ανάδευση. Τα μαγνητικά σφαιρίδια θα δεσμευτούν με τα κύτταρα στόχο. Με τη χρήση μαγνητικού στατό θα απομονωθεί το υπερκείμενο το οποίο αντιπροσωπεύει τον αρνητικό πληθυσμό των κυττάρων. Στη συνέχεια προστίθεται κατάλληλο διάλυμα (release buffer) και πραγματοποιείται επώαση των κυττάρων, σφαιριδίων και διαλύματος για 10 στους 4 ο C, υπό ανάδευση. Το διάλυμα αυτό προκαλεί αποδέσμευση των κυττάρων από τα μαγνητικά σφαιρίδια. Με τη βοήθεια μαγνητικού στατό συλλέγονται τα απομονωμένα κύτταρα. Εικόνα 16: Διαδικασία απομόνωσης κυττάρων με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων ( Στη συγκεκριμένη περίπτωση αφού θέλουμε να απομονώσουμε υποπληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων θα χρησιμοποιήσουμε μαγνητικά σφαιρίδια Human CD4 για την απομόνωση των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων, μαγνητικά 45

46 Υλικά και Μέθοδοι σφαιρίδια Human CD45RO για την απομόνωση των Τ βοηθητικών μνημονικών λεμφοκυττάρων και Human CD45RΑ για την απομόνωση των Τ βοηθητικών παρθενικών λεμφοκυττάρων. Η απομόνωση στηρίζεται στο ότι τα μαγνητικά σφαιρίδια είναι επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη και το διάλυμα που αποδεσμεύει τα σφαιρίδια από τα κύτταρα (release buffer) περιέχει βιοτίνη. Έτσι η βιοτίνη του διαλύματος αντικαθιστά τη βιοτίνη του αντισώματος και έτσι τα κύτταρα απελευθερώνονται από τα μαγνητικά σφαιρίδια. Είναι πολύ σημαντικό η διαδικασία της απομόνωσης να πραγματοποιείται σε cold room ή στον πάγο προκειμένου να αποφευχθεί η ενεργοποίηση των κυττάρων. Κυτταρομετρία ροής (FACS) Μετά την απομόνωσή τους οι κυτταρικοί πληθυσμοί, θα φαινοτυπηθούν με την χρήση κυτταρομετρίας ροής προκειμένου να διαπιστωθεί η καθαρότητα των δειγμάτων. Η κυτταρομετρία ροής είναι μέθοδος μέτρησης φυσικών και χημικών (ή φθοριζουσών) ιδιοτήτων των κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα συνεχόμενης ροής. Εν συντομία η διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής βήματα: Σε σωληνάρια βάζουμε τους εξής συνδυασμούς μονοκλωνικών αντισωμάτων Αριθμός σωληναρίου 1 2 Αντίσωμα σημασμένο με φθοροσκείνη (FITC) Beckman Coulter CD4 (2μl) CD4 (2μl) Αντίσωμα σημασμένο με φυκοερυθρίνη (PE) BD Biosciences/Pharmingen CD45RA (5μl) CD45RO (5μl) Σε καθένα από τα σωληνάρια προστίθενται περίπου 10 5 κύτταρα Επωάζονται με τα αντισώματα για 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου Αναλύεται η καθαρότητα των δειγμάτων σε κυτταρομετρητή ροής Beckman Coulter Epics-XL-MCL Κατά την ανάλυση των δειγμάτων αφήνουμε να περάσουν τουλάχιστον κύτταρα 46

47 Υλικά και Μέθοδοι Στο πρώτο παράθυρο διαχωρίζονται οι πληθυσμοί των λεμφοκυττάρων με βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασμό Επιλέγεται σαν πληθυσμός ανάλυσης (gate) τα λεμφοκύτταρα Για καθένα από τα δύο φθοροχρώματα (FITC, PE) που χρησιμοποιούμε, για να ορίσουμε τον αρνητικό φθορισμό, χρησιμοποιούμε και τους αντίστοιχους ισοτυπικούς μάρτυρες (IgG-1-FITC, IgG-1- PE). Εικόνα 17: Στικτόγραμμα κατανομής πληθυσμών με βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασμό και ιστογράμματα ισοτυπικών μαρτύρων. Πάνω για τα CD4/CD45RO και κάτω για τα CD4CD45RA. Για καθένα από τα σωληνάρια που περιέχουν δύο διαφορετικά αντισώματα, όπως φαίνεται στον παραπάνω πίνακα εμφανίζονται αντίστοιχα ιστογράμματα και στικτογράμματα της κατανομής τους στο πληθυσμό των λεμφοκυττάρων. 47

48 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 18: Στικτόγραμμα και ιστόγραμμα κατανομής των CD4 θετικών κυττάρων. Πάνω για τα CD4/CD45RO και κάτω για τα CD4CD45RA Επίσης εμφανίζεται ένα επιπλέον στικτόγραμμα που περιγράφει τη συνέκφραση των δύο αντιγόνων CD4 και CD45RO/CD45RA. Καλλιέργεια κυτταρικών σειρών Οι κυτταρικές σειρές οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι: η IM9 και RPMI1788 (EBV-transformed B lymphoblastoid cells), HS-Sultan και Raji 48

49 Υλικά και Μέθοδοι (Burkitt s lymphoma), U266 (plasmacytoma), Jurkat (T-cell acute lymphoblastic leukemia), THP-1 (acute monocytic leukemia), U937 (histiocytic lymphoma), και MM που προέρχονται από κύτταρα πολλαπλού μυελώματος από ασθενή με ΜΜ IgG τύπου και IIIA σταδίου. Οι κυτταρικές σειρές, διατηρήθηκαν για µεγάλα χρονικά διαστήµατα κατεψυγµένες σε δοχεία που περιείχαν υγρό άζωτο (-196 ο C). H διαδικασία κατάψυξης, που ακολουθήθηκε, ήταν η παρακάτω: Κύτταρα στην εκθετική φάση ανάπτυξής τους συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν Ακολούθησε επαναιώρηση και φυγοκέντρηση όπως και προηγουµένως Το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε στο διάλυµα κατάψυξης, που αποτελείται από 90% εµβρυϊκό ορό βοδινού (FΒS) και 10% διµεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) Ένα ml του παραπάνω διαλύματος µεταφέρθηκε σε ειδικά σωληνάρια κατάψυξης, τα οποία ψύχθηκαν σταδιακά Αρχικά τοποθετήθηκαν σε δοχείο µε πάγο για 10 περίπου λεπτά, στη συνέχεια σε καταψύκτη στους C για 48 ώρες, ενώ αργότερα τοποθετήθηκαν στο δοχείο υγρού αζώτου, όπου και διατηρήθηκαν Η απόψυξή τους έγινε γρήγορα µε τη µεταφορά του σωληνάριου κατάψυξης στους 37 0 C. Το περιεχόμενο του σωληνάριου µεταφέρθηκε σε φυγοκεντρικό σωλήνα µε 50ml πλήρους καλλιεργητικού υλικού και φυγοκεντρήθηκε Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 10 ml πλήρους καλλιεργητικού υλικού και καλλιεργήθηκαν στις συνήθεις συνθήκες καλλιέργειας για 24 ώρες Συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σαν εναιώρηµα σε RPMI-1640 το οποίο περιείχε 10% εµβρυϊκό ορό µόσχου (FΒS), 100 U/ml πενικιλίνη και 100 µg/ml στρεπτοµυκίνη και μερκαπταιθανόλη Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε επωαστικό κλίβανο, στον οποίο η θερµοκρασία διατηρούνταν σταθερή στους 37 0 C, ενώ επικρατούσαν συνθήκες υγρασίας και η ατµόσφαιρα ήταν εµπλουτισµένη µε 5% CO 2 Μέτρηση της βιωσιµότητας των κυττάρων Η µέτρηση της βιωσιµότητας έγινε µε τη µέθοδο του αποκλεισµού της χρωστικής κυανούν του τροπανίου (trypan blue dye exclusion) από τα ζωντανά κύτταρα. Σε ένα µέρος εναιωρήµατος κυττάρων προστέθηκε ένα µέρος διαλύµατος της χρωστικής, το µίγµα µεταφέρθηκε σε αιµοτοκυτταρόµετρο τύπου Neubauer και παρατηρήθηκε στο µικροσκόπιο. Τα ζωντανά κύτταρα φαίνοταν φωτεινά και 49

50 Υλικά και Μέθοδοι διάφανα ενώ τα νεκρά εµφανίζοταν βαθύ µπλε. Η βιωσιµότητα είναι το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων στο σύνολο αυτών που µετρήθηκαν. Ενεργοποίηση κυττάρων Από κυτταρική σειρά Jurkat λαμβάνονται 30ml και τα τοποθετούνται σε sixwell plate έτσι ώστε να υπάρχουν 5ml στο κάθε πηγάδι με συγκέντρωση 10 6 /ml (δηλαδή 5*10 6 σε κάθε πηγάδι) Το sixwell plate ονομάζεται ως εξής: o 1: CM o 2: 6h P/I o 3: 12h P/I Προστίθενται στα πηγαδάκια 2,3 από το διάλυμα PMA-ιονομυκίνης (Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε απουσία και παρουσία εστέρα φορβόλης (1mg/ml) 10ng/ml (PMA, Phorbol Myristate Acetate, Sigma, Buchs, Switzerland) και ιονομυκίνης (ιονοφόρο Ca2+, ionomycin-1mg/ml) 1-2μΜ) Χρειάστηκαν 6 ώρες χρόνο για το πηγαδάκι 2 και 12 ώρες για το πηγαδάκι 3 Μαζεύονται τα κύτταρα σε falcon 15ml και φυγοκεντρούνται στις 1800 στροφές για 10 στους 4 ο C Απορρίπτεται το υπερκείμενο και επαναδιαλύετε η πελέτα σε 1ml RPMI Μεταφέρεται σε eppendorf και φυγοκεντρείται για 10 στις στροφές στους 4 ο C Αφαιρείται το υπερκείμενο και τοποθετούνται τα κύτταρα στην κατάψυξη Απομόνωση RNA από κύτταρα Η απομόνωση του RNA από τα κύτταρα γίνεται με την προσθήκη τριζόλης (1ml) (Trizole GibcoBRL) για 5-10x10 6 κύτταρα περίπου. Η τριζόλη προκαλεί διάρρηξη των μεμβρανών των κυττάρων και εκχείλιση των κυτταροπλασματικών υλικών (και του RNA). Ο διαχωρισμός του RNA από τα άλλα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά υλικά (DNA, πρωτεΐνες κ.ά.) γίνεται με τη χρήση διαλύματος χλωροφορμίουισοαμηλικής αλκοόλης (49:1) και επώασης σε συνθήκες RT Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων σε 12000rpm για 15min στους 4 0 C Σχηματίζονται τρεις στιβάδες στα δείγματα κάτω από την επίδραση της φυγόκεντρου δύναμης 50

51 Υλικά και Μέθοδοι Στην υπερκείμενη υδάτινη φάση περιέχεται το RNA των κυττάρων, στην ενδιάμεση φάση βρίσκονται οι πρωτεΐνες ενώ στην υποκείμενη οργανική φάση οι πρωτεΐνες οι οποίες έχουν συνδεθεί με CHCl3 και φαινόλη της τριζόλης Εικόνα 20: Eppendorf στο οποίο παρατηρούνται η υδάτινη φάση (που μας ενδιαφέρει), η ενδιάμεση φάση και η οργανική φάση ( Λαμβάνεται προσεκτικά η υδάτινη φάση Προστίθεται ισοπροπυλική αλκοόλη (500μl ανά ml τριζόλης) Το δείγμα αποθηκεύεται στους 80 0 C για 15min Στους 80 0 C το RNA κρυσταλλοποιείται και καθιζάνει λόγω της αλκοόλης και του άλατος Στην συνέχεια, γίνεται φυγοκέντρηση στις 10000rpm, για 30min, στους 4 0 C για την πλήρη καθίζηση του RNA Απομακρύνεται προσεκτικά το υπερκείμενο και το RNA το λαμβάνεται σε μορφή ιζήματος Προστίθεται 75% παγωμένη αιθανόλη Φυγοκεντρείται στις 10000rpm για 10min στους 4 0 C. Το ίζημα κρατείται, απομακρύνοντας το υπερκείμενο, και στεγνώνεται υπό κενό. Τέλος, το ίζημα διαλύεται σε depc, το οποίο δεν περιέχει RNAάσες ώστε να καταστραφεί το δείγμα. Αποθηκεύεται στους C 51

52 Υλικά και Μέθοδοι Δημιουργία cdna, RT-PCR Η κατασκευή του cdna από το ολικό RNA των δειγμάτων, έγινε με χρήση του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase). Οι ποσότητες τις οποίες προσθέτουμε σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Invitrogen - M-MLV Reverse Transcriptase είναι: 1λ Random Primers 1ng-5ng ολικού RNA 1λ dntps mix (10mM each) H 2 O μέχρι τελικό όγκο 10λ Θέρμανση στους 70 0 C για 10 λεπτά και μεταφέρεται γρήγορα σε πάγο Στην συνέχεια προστίθεται: 1λ MLV Reverse Transcriptase Buffer 1λ MLV Reverse Transcriptase 0,5λ RNase OUT H 2 O μέχρι τελικό όγκο 20λ Επώαση στους 25 0 C για 10 λεπτά Επώαση στους 37 0 C για 50 λεπτά Απενεργοποίηση της αντίδρασης με θέρμανση στους 90 0 C για 10 λεπτά Αποθήκευση του cdna στους C. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, polymerase chain reaction) είναι μία εναλλακτική μέθοδος κλωνοποίησης για την παραγωγή μεγάλης ποσότητας μιας επιθυμητής νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Η αντίδραση αυτή βασίζεται στον ενζυμικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA-στόχου, το οποίο βρίσκεται μεταξύ δύο ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (primers). Οι εκκινητές αυτοί είναι σχεδιασμένοι κατά τέτοιο τρόπο έτσι ώστε ο ένας να είναι συμπληρωματικός με τη μία άκρη της αλληλουχίας-στόχου στη μία αλυσίδα και ο άλλος με την άλλη άκρη της αλληλουχίας-στόχου στην συμπληρωματική αλυσίδα του DNA. Στη 52

53 Υλικά και Μέθοδοι συνέχεια, χρησιμοποιείται η πολυμεράση του DNA η οποία συνθέτει δύο νέες αλυσίδες DNA έχοντας ως εκμαγείο την αλληλουχία μεταξύ των δύο εκκινητών. Η επανάληψη των κύκλων θερμικής αποδιάταξης, υβριδοποίησης των εκκινητών και ενζυμικής σύνθεσης DNA, έχει ως αποτέλεσμα την εκθετική αύξηση της αρχικής αλληλουχίας στόχου του DNA. Τελικά παράγεται ένας τεράστιος αριθμός αντιγράφων του τμήματος DNA μεταξύ των εκκινητών, έως ότου καταναλωθούν τα υποστρώματα (εκκινητές, δεοξυριβονου-κλεοτίδια). Η αντίδραση της PCR συνήθως επαναλαμβάνεται για κύκλους, καθένας από τους οποίους περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα: Αποδιάταξη (denaturation) στους 95 C: Σε αυτή τη θερμοκρασία τα δίκλωνα μόρια DNA αποχωρίζονται πλήρως με αποτέλεσμα να παράγονται μονόκλωνες αλυσίδες που στη συνέχεια θα χρησιμοποιηθούν ως μήτρες για τους εκκινητές και την DNA πολυμεράση. Επανασύνδεση (annealing): Η θερμοκρασία μειώνεται έτσι ώστε οι εκκινητές να προσδεθούν με τις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στα μονόκλωνα μόρια του DNA. Η θερμοκρασία εξειδίκευσης της αντίδρασης της PCR καθορίζεται από την σχέση Tm=2(A+T)+4(C+G). Σύνθεση (extension): Στο βήμα αυτό η θερμοκρασία αυξάνεται στους 72 C, που είναι η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της θερμοανθεκτικής Taq (η οποία απομονώθηκε από το θερμοανθεκτικό βακτήριο Thermus aquaticus) DNA πολυμεράσης, ώστε να εκτελέσει τη σύνθεση των συμπληρωματικών αλυσίδων. Ο χρόνος επώασης στους 72 C ποικίλει ανάλογα με το μέγεθος του DNA στόχου που πρόκειται να ενισχυθεί. Οι συνθήκες των αντιδράσεων PCR που πραγματοποιήσαμε είναι οι παρακάτω: Για την Tip60: Primers: sense 5 -ctcaatgttcttcatccggg-3 antisense 5 -gggaagatggcggaggtgg-3 53

54 Υλικά και Μέθοδοι Για την β2μ: Primers: sense 5 -cccccactgaaaaagatgag-3 antisense 5 -tcatccaatccaaatgcggc-3 Για την IL-2: Primers: sense 5 -gcaactcctgtcttgcattg-3 antisense 5 -aatgtgagcatcctggtgag-3 54

55 Υλικά και Μέθοδοι Για την Cat: Primers: sense 5 -ggaaatcgtcgtggtattcac-3 antisense 5 -catttcagtcagttgctcaatg-3 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Τα αποτελέσματα της PCR, αξιολογήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Με την μέθοδο της ηλεκτροφόρησης, επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός του cdna με βάση το μοριακό βάρος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το φορτίο των δειγμάτων είναι αρνητικό οπότε ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το μέγεθός τους υπό την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου. Τα μεγαλύτερα τμήματα του DNA κινούνται πιο αργά μέσα στο πήκτωμα ενώ τα μικρότερα πλησιάζουν τον θετικό πόλο πολύ γρηγορότερα. Πριν από τα δείγματα, στο πήκτωμα αγαρόζης «φορτώθηκε» μάρτυρας γνωστής συγκέντρωσης βάσεων ladder, ο οποίος σχημάτιζε ζώνες που ταυτοποιούσαν το μέγεθος του προϊόντος της PCR. Ενδεικτικά για πήκτωμα με συγκέντρωση αγαρόζης 1% προστίθεται σε κωνική φιάλη με διάλυμα όγκου 100 ml (20 ml TBE 5X και 80 ml H2O), 1 gr αγαρόζης ζυγισμένο σε ζυγό. Το διάλυμα ζεσταίνεται και κατόπιν προστίθεται EtBr σε τελική συγκέντρωση 0,25 μg\ml προκειμένου να οπτικοποιήσουμε τα αποτελέσματα. Το EtBr έχει την ιδιότητα να συνδέεται με τις βάσεις του DNA και να φωσφορίζει όταν εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία σηματοδοτώντας με αυτό τον τρόπο τα δείγματα σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. 55

56 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 21: Αριστερά Συσκευή ηλεκτροφόρησης Δεξιά Τζελ αγαρόζης στο οποίο φθορίζουν οι μπάντες υπό την υπεριώδη ακτινοβολία Για το loading buffer αντίστοιχα φτιάχνεται διάλυμα με τελική συγκέντρωση TBE 1X. Η πυκνότητα του πηκτώματος εξαρτάται από το μόριο το οποίο θέλουμε να παρατηρήσουμε. Η σχετική ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων από την PCR ανάλυση έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος image j. Με τη χρήση του προγράμματος αυτού, έγινε αξιολόγηση της σχετικής ποσοτικής μέτρησης της οπτικής πυκνότητας των ζωνών της ηλεκτροφόρησης, με γονίδιο αναφοράς για κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων, την οπτική πυκνότητα της ζώνης της β2- μικρογλοβουλίνης (β2m). Western blot Με την ανάλυση κατά Western μπορούμε να ανιχνεύσουμε μία συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε ένα μείγμα πρωτεϊνών ενώ ταυτόχρονα μπορούμε να πάρουμε κάποια στοιχεία για αυτή την πρωτεΐνη όπως το μέγεθός της και την περιεκτικότητά της στο μείγμα. Η ακρίβεια της μεθόδου εξαρτάται από την χρήση υψηλής ευαισθησίας αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Ο διαχωρισμός του μείγματος των πρωτεϊνών γίνεται σε gel SDSpolyacrylamide με βάση το μέγεθός τους. Το SDS είναι απορρυπαντικό και προσδίδει στις πρωτεΐνες αρνητικό φορτίο. 56

57 Υλικά και Μέθοδοι Διαδικασία: Απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Στην πελέτα των κυττάρων προστίθεται διάλυμα λύσης (ripa buffer) Τοποθετούνται τα eppendorf στον πάγο για 15 και ανα 5 πραγματοποιείται ανάδευση σε vortex Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 15, στα 14000g, στους 4 o C Tο υπερκείμενο μεταφέρεται σε νέο eppendorf Προστίθεται διάλυμα 2Χ Sample buffer και μερκαπταιθανόλης Ακολουθεί βρασμός των δειγμάτων στους 95 o C για 5 λεπτά Τα δείγματα φυλάσσονται στους -20 o C Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE Αρχικά πραγματοποιείται η παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού των πρωτεϊνών το οποίο φορτώνεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης καλύπτοντας περίπου τα 3:4 αυτής (separating gel) Ακολουθεί η παρασκευή του διαλύματος πακεταρίσματος (stucking gel). Στη συνέχεια φορτώνεται πάνω στο πήκτωμα διαχωρισμού το διάλυμα του πηκτώματος πακεταρίσματος, ενώ αμέσως τοποθετείται στη συσκευή το χτενάκι για τη δημιουργία των θέσεων φόρτωσης των δειγμάτων Τα δείγματα που πρόκειται να αναλυθούν βράζονται στους 95 ο C για 5 λεπτά και έπειτα φυγοκεντρούνται στις rpm για 5 λεπτά Όταν πήξει το πήκτωμα, αφαιρείται το χτενάκι και η συσκευή τοποθετείται μέσα στο δοχείο της ηλεκτροφόρησης που περιέχει το running buffer Τα δείγματα φορτώνονται στις θέσεις που έχουν σχηματιστεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται αρχικά στα 24mA μέχρι η χρωστική να εισέλθει στο πήκτωμα διαχωρισμού οπότε αυξάνεται η ένταση στα 48mA. Ανοσοαπoτύπωμα western Αρχικά τα δείγματα αναλύονται με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η μεταφορά των αναλυμένων δειγμάτων σε μεμβράνη 57

58 Υλικά και Μέθοδοι νιτροκυτταρίνης, σε ρυθμιστικό διάλυμα (transfer buffer) με 10% μεθανόλη, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου έντασης 300mA, για 2 ώρες Μετά το πέρας της μεταφοράς, η νιτροκυτταρίνη πλένεται με dh2o και βάφεται με τη χρωστική Ponceau S για 15 λεπτά. Η απομάκρυνση της χρωστικής επιτυγχάνεται με χρήση του διαλύματος PBS (1x), 0,1% Tween (PBS Tween) Η κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος στη μεμβράνη πραγματοποιείται με διάλυμα 5% γάλακτος σε PBS (1x), 0,1% Tween (PBS- Tween) (διάλυμα blocking), για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου Ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης με το πρώτο αντίσωμα υπό κίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες ή Ο/Ν. Το αντίσωμα διαλύεται σε διάλυμα blocking στο οποίο προστίθεται επιπλέον 0,02% NaN3 Η μεμβράνη ξεπλένεται 2 φορές γρήγορα με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Ακολουθούν μια 15λεπτη και τρεις 5λεπτες πλύσεις με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) Ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης με το κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα, υπό ανάδευση για μια ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου Η περίσσεια του δεύτερου αντισώματος απομακρύνεται με 2 γρήγορες πλύσεις, καθώς και μια 15λεπτη και τρεις 5λεπτες με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS- Tween) Στο άκρο του το δεύτερο αντίσωμα φέρει την HRP (Horse Radish Peroxidase) που προκαλεί φωταύγεια στο κατάλληλο υπόστρωμα Το σήμα ανιχνεύεται με τη χρήση του αντιδραστηρίου ECL και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό φιλμ, σε σκοτεινό δωμάτιο Το western που πραγματοποιήσαμε ήταν για την ανίχνευση της πρωτεΐνης Tip60 (τα δείγματα τα ηλεκτροφορήσαμε σε gel ακρυλαμιδίου 10%) σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων Jurkat. Ως πρώτο αντίσωμα χρησιμοποιήσαμε το μονοκλωνικό αντίσωμα Tip60 (συγκέντρωσης 1:1000), με 5% γάλα σε διάλυμα 1xTBS. Το δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-mouse (συγκέντρωσης 1:2000) με 5% γάλα σε διάλυμα 1x TBS. Για να δούμε ότι έχουμε ίσες ποσότητες του δείγματος στη συσκευή ηλεκτροφόρισης ως μάρτυρα χρησιμοποιήσαμε την πολυμεράση 2 (polii). Για την ανίχνευσή της ως πρώτο αντίσωμα χρησιμοποιήσαμε το αντίσωμα PolII (1:1000) και δεύτερο αντίσωμα anti-rabbit (1:2000) με 5% γάλα σε 1x TBS. Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA Κλωνοποίηση Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Η διαδικασία ηλεκτροφόρησης δειγμάτων DNA σε πήκτωμα αγαρόζης πραγματοποιείται όπως προείπαμε. 58

59 Υλικά και Μέθοδοι Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης Για τον καθαρισμό του DNA από πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε το Macherey Nagel Nucleo-Spin Gel and Pcr Clean up kit, σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (Minipreps) Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας πραγματοποιήθηκε με το kit Nucleospin Plasmid της εταιρίας Macherey Nagel, σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας (Maxipreps) Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας πραγματοποιήθηκε με το kit Nucleo Bond Xtra Maxi EF της εταιρίας Macherey Nagel, σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας. Κατάτμηση πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού Η αντίδραση κατάτμησης πραγματοποιείται σε eppendorfs σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Συγκέντρωση stock διαλύματος Αντίδραση στα 20 μl DNA - 1 μg Ρυθμιστικό διάλυμα 10x 2 μl ενζύμων Ένζυμο 1 20 U/μl 0,5 μl Ένζυμο 2 20 U/μl 0,5 μl Η2Ο - Μέχρι τελικό όγκο 20 μl Σημειώνεται ότι η αντίδραση στα 20μl πραγματοποιείται με επώαση στους 37 o C για 2 ώρες. Αντίδραση συνδετάσης (Ligation) Για τις αντιδράσεις συνδετάσης χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο T4 λιγάση της εταιρίας Minotech. Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν δύο τμήματα DNA: ο πλασμιδιακός φορέας και το ένθεμα σε αναλογία 1:4. Το DNA αναμειγνύεται με διάλυμας Τ4 συνδετάσης συγκέντρωσης και ΑΤΡ. Η αντίδραση πραγματοποιείται 59

60 Υλικά και Μέθοδοι στους 16 ο C για 45. Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση για 10 στους 65 o C προκειμένου να απενεργοποιηθεί η λιγάση. Μετασχηματισμός DH5A βακτηριακών δεκτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Ο μετασχηματισμός των DH5A βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA πραγματοποιείται ως εξής: Τα κύτταρα τοποθετούνται σε πάγο και αφήνονται να ξεπαγώσουν. Για κάθε αντίδραση μετασχηματισμού χρησιμοποιούνται 50μl κυττάρων. Σε αυτά προστίθενται 30-50ng πλασμιδιακού DNA. Ακολουθεί επώαση στον πάγο για 40 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα υφίστανται θερμικό σοκ στους 42 o C για 90 δευτερόλεπτα. Αμέσως μετά το θερμικό σοκ, τα κύτταρα τοποθετούνται στον πάγο για 2 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη θρεπτικού μέσου LB και επώαση των κυττάρων στους 37 o C για 1 ώρα. Μετά το πέρας της μιας ώρας, 200μl κυττάρων επιστρώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό μέσο LB-άγαρ με το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής. Τα τρυβλία με τα κύτταρα επωάζονται στους 37 o C για Ο/Ν Εικόνα 22: Διαδικασία κλωνοποίησης σε πλασμιδιακό φορέα ( 60

61 Υλικά και Μέθοδοι Διαμόλυνση (transfection) Jurkat κυττάρων Μετρούνται τα κύτταρα Χρησιμοποιούυνται 2 Χ 10 6 κύτταρα. Τα κύτταρα προστίθενται σε 2ml καλλιεργητικού (FBS) Σε eppendorf προστίθεται 100λ Optim-MEM Προστίθεται η ανάλογη ποσότητα DNA σε κάθε δείγμα και πραγματοποιείται ανάδευση Προστίθεται 1λ Plus reagent για 1γ πλασμιδιακού DNA Ανάδευση και για 5min σε RT Προστίθεται 5λ Lipofectamine και ανάδευση RT για 30min Προστίθεται το mix στην καλλιέργεια των κυττάρων Παραμένει για ώρες Εικόνα 23: Διαμόλυνση κυττάρων με τη χρήση λιποσωμάτων ( CAT (Chloramphenicol Acetyltransferase) assay Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην χρήση του ενζύμου CAT. Το CAT προέρχεται από την πλήρη ονομασία του βακτηριακού ενζύμου chloramphenicol acetyl transferase το οποίο αδρανοποιεί την chloramphenicol ακετυλιώνοντάς την. Η 61

62 Υλικά και Μέθοδοι μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται συνήθως για τον έλεγχο της λειτουργίας ενός υποκινητή. Το γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί το ένζυμο CAT συνδέεται με τον υποκινητή ενός άλλου γονιδίου του οποίου θέλουμε να εξετάσουμε την έκφραση. Με τα ανασυνδυασμένα αυτά γονίδια επιμολύνουμε (transfenction) τα κύτταρά μας. Η ποσότητα του CAT ενζύμου που παράγεται, υποδηλώνει την μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή σε σχέση με άλλους υποκινητές που χρησιμοποιούνται ως control. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε συνοπτικά η εξής: Γίνεται θραύση της μεμβράνης των κυττάρων για την απομόνωση των υπερεκφρασμένων πρωτεϊνών με υπερήχους (sοnicator) Στην συνέχεια τρέχουμε το δείγμα των πρωτεϊνών σε πιάτα TLC (thin-layer chromatographic), πραγματοποιώντας μία χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, παρουσία χλωροφορμίου:μεθανόλης (19:1) Τα συστατικά μας (acetyl CoA, ραδιενεργή chloramphenicol και CAT) θα τρέξουν στο TLC πιάτο σύμφωνα με την ικανότητα που έχουν να αλληλεπιδρούν με την επιφάνεια του gel TLC Εικόνα 24: Αριστερά TLC πιάτο Δεξιά Διάλυμα χλωροφορμίου-μεθανόλης στο οποίο τοποθετείται το πιάτο και τρέχουν οι πρωτεΐνες Μετά το τέλος της χρωματογραφίας το gel εκτίθεται στους C Ακολουθεί η έκθεσή του σε φιλμ (X-ray film) και η εμφάνιση μέσω ειδικής συσκευής που βρίσκεται στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Ρίου (Ακτινολογικό τμήμα) Επειδή το μόνο ραδιενεργό μόριο που έχουμε είναι η chloramphenicol, το μόνο μόριο το οποίο είναι εμφανές πάνω στο φιλμ είναι η chloramphenicol και οι ακετυλιωμένες μορφές της. 62

63 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 25: Αποτελέσματα της ανάλυσης CAT. Στην εικόνα βλέπουμε ένα γράφημα όπου στην πρώτη κάθετη σειρά παρουσιάζεται η εικόνα ενός υποκινητή 1, στην 2 η ένας δεύτερος υποκινητής 2, στην 3 η ένα αρνητικό control και στην 4 η ένα θετικό ( Ανοσοκατακρήμνιση Η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης περιλαμβάνει την προετοιμασία των σφαιριδίων, την πρόσδεση του αντισώματος στα σφαιρίδια και την επώαση του κυτταρικού εκχυλίσματος με τα σφαιρίδια. Προετοιμασία σφαιριδίων Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιούμε 100μl διαλύματος 50% σφαιριδίων. Αρχικά το διάλυμα με τα σφαιρίδια τοποθετείται σε μαγνητικό στατό για 5 λεπτά Στη συνέχεια το υπερκείμενο αφαιρείται και τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε 1 ml διαλύματος λύσης, ανακινούνται για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και τοποθετούνται στο μαγνήτη για 5 λεπτά Ακολουθούν ακόμα 2 πλύσεις των σφαιριδίων με διάλυμα λύσης Τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε διάλυμα λύσης έτσι ώστε ο συνολικός τους όγκος να είναι ίσος με τον αρχικό όγκο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν 63

64 Υλικά και Μέθοδοι Πρόσδεση αντισώματος στα σφαιρίδια Για κάθε αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης (100μl διαλύματος 50% σφαιριδίων) χρησιμοποιήθηκαν 5μg αντισώματος anti-tip60(mouse, Santa cruz), anti-ets2 (rabbit, Santa cruz), anti-tubulin (mouse, Millipore) Κατάλληλη ποσότητα αντισώματος προστίθεται στο διάλυμα με τα σφαιρίδια. Ακολουθεί επώαση υπό ανακίνηση, για 2 ώρες στους 4 o C Στη συνέχεια πραγματοποιούνται 3 πλύσεις των σφαιριδίων με διάλυμα λύσης, με στόχο να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος που δεν έχει προσδεθεί σε αυτά Για κάθε πλύση, 1 ml διαλύματος λύσης προστίθεται στα σφαιρίδια. Ακολουθεί ανακίνηση για 5 λεπτά, μαγνήτης για 5 λεπτά στους 4 o C και απόρριψη του υπερκειμένου Μετά την ολοκλήρωση της τρίτης πλύσης, τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε διάλυμα λύσης έτσι ώστε ο συνολικός τους όγκος να είναι ίσος με τον αρχικό όγκο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν (100μl/αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης) Απομόνωση κυτταρικού εκχυλίσματος Επώαση κυτταρικού εκχυλίσματος με σφαιρίδια Για κάθε αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιήθηκαν 10 7 κύτταρα. Η διαδικασία προετοιμασίας των κυττάρων και της επώασής τους με τα σφαιρίδια είναι η ακόλουθη: Τα κύτταρα τοποθετούνται σε πάγο. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και πραγματοποιούνται 2 πλύσεις των κυττάρων με κρύο διάλυμα PBS (1x) Ακολουθεί προσθήκη 1000μl διαλύματος λύσης σε κάθε eppendorf. Τα eppendorf παραμένουν πάνω στον πάγο για 10 λεπτά Το κυτταρικό εκχύλισμα φυγοκεντρείται στις 13000rpm για 10 λεπτά. Από το υπερκείμενο φυλάσσεται ένα τμήμα (50μl) ως δείγμα ολικού κυτταρικού εκχυλίσματος. Σε αυτό προστίθενται 50μl 1xFSB+DTT, βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C Το υπόλοιπο υπερκείμενο τοποθετείται στο eppendorf με τα σφαιρίδια στα οποία είναι προσδεδεμένο το αντίσωμα. Η επώαση πραγματοποιείται για 3 ώρες στους 4 o C, υπό ανακίνηση Μετά το πέρας των 3 ωρών, τοποθετούνται τα eppendorf στο μαγνήτη για 5 λεπτά. Από το υπερκείμενο φυλάσσεται ένα τμήμα (50μl) ως δείγμα πρωτεϊνών που δεν προσδέθηκαν στα σφαιρίδια. Σε αυτό προστίθενται 50μl 2xFSB+DTT, βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C. Το υπόλοιπο υπερκείμενο απορρίπτεται 64

65 Υλικά και Μέθοδοι Ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων. Κάθε πλύση πραγματοποιείται με 1 ml διαλύματος λύσης, για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση Στη συνέχεια το δείγμα τοποθετείται στο μαγνήτη για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία ακόμα 2 φορές Στα σφαιρίδια προστίθενται 50μl διαλύματος 1xFSB+DTT. Το δείγμα βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C. Εικόνα 26: Διαγραμματικά η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης ( nature.com) Ανοσοκατακρήµνιση χρωµατίνης (ChIP) Η µέθοδος της ανοσοκατακρήµνισης της χρωµατίνης (ChIP, Chromatin immunoprecipitation) αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για την ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων συγκεκριµένων πρωτεϊνών µε ειδικές γενωµικές αλληλουχίες in vivo. Στην τεχνική αυτή, τα ζωντανά κύτταρα κατεργάζονται µε φορµαλδεΰδη για τη δηµιουργία σταυροσυνδέσεων µεταξύ μορίων (πρωτεΐνες-πρωτεΐνες και DNAπρωτεΐνες) που βρίσκονται in vivo σε εγγύτητα µε τη χρωµατίνη. Η φορµαλδεΰδη (ΗCHO) είναι ένα δίπολο μόριο του οποίου το άτοµο του άνθρακα αποτελεί ένα πυρηνόφιλο κέντρο. Οι άµινο και ίµινο οµάδες των πρωτεϊνών (π.χ. οι πλευρικές αλυσίδες της λυσίνης και της αργινίνης) και των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. κυτοσίνη) αντιδρούν µε τη φορµαλδεϋδη οδηγώντας στο σχηµατισµό µιας βάσης του Schiff. Αυτό το ενδιάµεσο προϊόν αντιδρά µε µια δεύτερη άµινο οµάδα με αποτέλεσµα τη δηµιουργία των σταυροσυνδέσεων. Από τα κύτταρα που έχουν κατεργαστεί µε φορµαλδεΰδη παρασκευάζονται πυρηνικά εκχυλίσµατα τα οποία στη συνέχεια κατεργάζονται µε υπερήχους για να γίνει διαχωρισµός της χρωµατίνης σε 65

66 Υλικά και Μέθοδοι θραύσµατα µεγέθους ~500 βάσεων. Ακολουθεί ανοσοκατακρήμνιση µε ένα αντίσωµα που αναγνωρίζει την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος. Με τον τρόπο αυτό οι DNA ακολουθίες που σταυροσυνδέονται άµεσα ή έµµεσα µε τη συγκεκριµένη πρωτεΐνη εµπλουτίζουν το ανοσοκατακρημνισμένο δείγµα. Εποµένως, η µέθοδος αυτή δεν περιορίζεται σε πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν εξειδικευµένα µια συγκεκριµένη ακολουθία του DNA. Η ποσότητα των ειδικών DNA αλληλουχιών στο δείγµα µάρτυρα και στο ανοσοκατακρηµνισµένο δείγµα προσδιορίζεται µε τη µέθοδο PCR και την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πήκτωμα αγαρόζης σε µη αποδιατακτικές συνθήκες. (Ausubel et al., 2006) Εικόνα 27 : Διαγραμματικά η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης ( Η διαδικασία περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω. Μετά την καλλιέργεια των κυττάρων πραγματοποιείται η επαγωγή σχηματισμού ομοιοπολικών δεσμών (crosslinking) μεταξύ των πρωτεϊνών και του DNA με την προσθήκη στην καλλιέργεια φορμαλδεΰδης σε τελικό όγκο στην καλλιέργεια 1,1% Με το πέρας 10min προστίθενται στην καλλιέργεια γλυκίνη σε τελική συγκέντρωση 0,125mM, ώστε να ανασταλεί η δράση της φορμαλδεΰδης, και παραμένει για 10min σε RT υπό ελαφριά ανάδευση 66

67 Υλικά και Μέθοδοι Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων σε 2500rpm για 10min στους 4 0 C και 2x πλύσεις με 1xPBS σε falcon των 50ml Το επόμενο βήμα είναι η θραύση της μεμβράνης των κυττάρων η οποία επιτυγχάνεται με την προσθήκη του Lysis Buffer (5mM HEPES ph 8, 85mM KCl, 0,5% NP-40) η δράση του οποίου στηρίζεται στην ύπαρξη στο διάλυμα κατάλληλων απορρυπαντικών (NP-40) καθώς και αναστολέων πρωτεασών, για την αποφυγή διάσπασης των πρωτεϊνών Ακολουθεί επώαση για 10min στον πάγο και φυγοκέντρηση 3500rpm για 10min σε παγωμένη φυγόκεντρο Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης και την απομάκρυνση του υπερκειμένου στο ίζημα έχουμε τους πυρήνες των κυττάρων οι οποίοι διαρρηγνύονται με την χρήση του Nuclei Lysis buffer (10m EDTA, 1% SDS, 50mM Tris-HCl ph 8,1) προκαλώντας αύξηση της ωσμωτικής πίεσης στο εσωτερικό τους με την χρήση ανάλογων διαλυμάτων σε συνδυασμό με την χρήση του απορρυπαντικού SDS Μετά από φυγοκέντρηση των δειγμάτων απομονώθηκε η χρωματίνη και το επόμενο βήμα είναι η θραύση αυτής σε μικρότερα κομμάτια (~500bp) με την χρήση υπερήχων, στο διάλυμα Nuclei Lysis buffer Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε στο μηχάνημα Sonicator- Bioblock Scientific, σε πάγο, σε 20 κύκλους περίπου ανά δείγμα (amplitude 30%). Κάθε κύκλος διαρκεί 45sec-1min ανά δείγμα (15sec off/15sec on) Για να εξεταστεί αν όντως η χρωματίνη έχει σπάσει σε μικρά κομμάτια πήραμε ποσότητα χρωματίνης την οποία βράσαμε σε eppedorf 1,5ml με 400mM ΝaCl στους 90 0 C για 10min Ακολουθεί επώαση στους 37 0 C σε υδατόλουτρο για 45min με RNase A και καθαρισμοί με phenol:clorophorm:isoamilyc alcohol (25:24:1) Το δείγμα στην συνέχεια ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα αγαρόζης 1% Χαρακτηριστική εικόνα που λαμβάνουμε μετά από την θραύση της χρωματίνης με την χρήση υπερήχων φαίνεται παρακάτω:. Εικόνα 28 : Χαρακτηριστική εικόνα εμφάνισης της χρωματίνης μετά από θραύση της με sonication για 20 κύκλους. Η μεγάλη ένταση αντιστοιχεί ~500bp. 67

68 Υλικά και Μέθοδοι Μετά την θραύση της χρωματίνης ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 14000rpm για 10min στους 4 0 C, απομόνωση του υπερκειμένου και αποθήκευση στους C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Για την ανοσοκατακρήμνιση χρησιμοποιήθηκαν 25μg χρωματίνης για κάθε συνθήκη. Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το anti-tip60(c-2), ενώ η κατακρήμνιση έγινε με μαγνητικά σφαιρίδια (magnetic beads A/3beads/μl αντισώματος). Το σύμπλεγμα μαγνητικά σφαιρίδια/αντισώματος/dna/πρωτεΐνης επωάστηκε Ο/Ν σε ρότορα και την επόμενη μέρα ακολούθησαν πλύσεις του συμπλέγματος με τα διαλύματα: o 2 φορές με Low salt buffer (0,1% SDS, 1,1% Triton X-100, 2mM EDTA ph 8, 20mM Tris-HCl ph 8,1, 150mM NaCl) o 2 φορές με high salt buffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl ph 8,1, 500mM NaCl) o 2 φορές με LiCl buffer (10mM Tris-HCl ph 8, 250mM LiCl, 1% NP-40) και 2 φορές με TE buffer (10 mm Tris-HCl ph 7.5, 1 mm EDTA) Οι πλύσεις έγιναν σε μαγνητικό σταστό. Η απελευθέρωση του συμπλόκου από τα μαγνητικά σφαιρίδια έγινε με την προσθήκη διαλύματος IP elution buffer (1% SDS, 50 mm NaHCO3) και δυνατό vortex για 15min. Ακολούθησε επώαση με RNase A για 45min στους 37 0 C, με πρωτεϊνάση Α στους 55 0 C (για αναστροφή του crosslinking) και καθαρισμός της με phenol:clorophorm:isoamilyc alcohol (25:24:1). Το επόμενο βήμα είναι PCR για την αλληλουχία που αναμένεται ότι προσδένεται ο παράγοντας που μελετούμε. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήσαμε ήταν: Για το Ets-2 binding site 5 -cttgctgttgtccaccac-3 και 5 -tggatgtaggtgaaatccc-3, που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 201bp, για το IL2 TATA box 5 - tctttgggggtttaaagaaattc-3 και 5 -aggagttgaggttactgtgag-3 που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 217bp και για τον υποκινητή της β2-m: 5 - cgccgatgtacagacagcaaa-3 και 5 -tgctgtcagcttcaggaatg-3, που οδηγούν στην σύνθεση ενός PCR προϊόντος 229bp. Οι συνθήκες του PCR ήταν 95 C για 5 min, 35 κύκλοι με 95 C για 1min, 50 C για 1min και 72 C για 1min. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% παρουσία EtBr (Sigma-Aldrich). 68

69 Υλικά και Μέθοδοι Ανοσοφθορισμός Ο ανοσοφθορισμός πραγματοποιείται σε κύτταρα που αναπτύσσονται πάνω σε αντικειμενοφόρες πλάκες επιστρωμένες με poly-d-λυσίνη ως εξής: Στις αντικειμενοφόρες τοποθετούνται περίπου 10 5 κύτταρα και επωάζονται στους 37 ο C για 40 Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και γίνεται γρήγορη πλύση με κρύο διάλυμα PBS (1x) Η μονιμοποίηση των κυττάρων πραγματοποιείται με χρήση του διαλύματος 4% PFA (παραφορμαλδεΰδη), για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου Ακολουθούν δύο πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x) Έπειτα οι αντικειμενοφόρες με τα κύτταρα επωάζονται για 4 λεπτά με διάλυμα 0,3% Triton σε PBS (1x), σε θερμοκρασία δωματίου Ακολουθούν τρεις 5 λεπτες πλύσεις με διάλυμα PBS (1x) Στη συνέχεια πραγματοποιείται κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος με διάλυμα (blocking) 3% BSA, 10% FBS σε PBS (1x), για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου Μετά την πάροδο της μιας ώρας, προστίθεται το πρώτο αντίσωμα διαλυμένο σε διάλυμα blocking προστίθενται σε κάθε αντικειμενοφόρο. Οι αντικειμενοφόρες επωάζονται με το πρωτογενές αντίσωμα για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη ημέρα πραγματοποιούνται τρεις πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόρες επωάζονται με το δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι διαλυμένο σε διάλυμα διαλυμένο σε διάλυμα blocking. Η επώαση διαρκεί 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου και σε σκοτεινό μέρος Ακολουθούν τρεις πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) Οι αντικειμενοφόρες με τα κύτταρα επωάζονται με τη χρωστική DAPI (1μg/ml) σε διάλυμα PBS (1x), η οποία προσδένεται στο DNA. Η επώαση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά. Η περίσσεια της χρωστικής απομακρύνεται με πλύση σε διάλυμα PBS (1x) για 3. Έπειτα οι αντικειμενοφόρες ξεπλένονται γρήγορα με dh 2 O Στις αντικειμενοφόρες προστίθεται mowiοl και τοποθετούνται καλυπτρίδες Η παρατήρησή τους πραγματοποιείται σε μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse TE 2000U, Nikon) 69

70 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 70

71 Relative Tip60 mrna gene expression Αποτελέσματα Έκφραση του παράγοντα Tip60 σε υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος Αρχικά, καθορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης της Tip60, σε επίπεδο mrna, με PCR, σε υποπληθυσμούς κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMC) υγιών δοτών. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε απομόνωση πληθυσμών κυττάρων περιφερικού αίματος καθώς και απομόνωση ex vivo υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων. Όπως φαίνεται στο γράφημα 2, όλοι οι υποπληθυσμοί εκφράζουν Tip60 mrna αλλά σε διαφορετικές ποσότητες. 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 PBMCs CD3 CD4 CD8 CD25 CD14 Γράφημα 1: Σύνθεση της Tip60 mrna σε υποπληθυσμούς μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος. Τα CD3, CD4, CD14, CD8 και CD25 κύτταρα απομονώθηκαν με την χρήση μαγνητικών σφαιριδίων με αρνητική επιλογή. Το ολικό RNA και η κατασκευή του cdna έγινε αμέσως μετά την απομόνωση των κυττάρων (ex vivo). Έκφραση της Tip60 mrna σε PBMCs, CD3 Τ κύτταρα και υποπληθυσμών αυτών [CD4 Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, CD8 κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, ρυθμιστικά CD4 + CD25 + T κύτταρα (CD25) και μονοκύτταρα (CD14). Η β2m χρησιμοποιήθηκε σαν εσωτερικός μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η μεγαλύτερη έκφραση της Tip60 παρατηρήθηκε στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα CD3 + CD4 + CD25 -. Τα μονοκύτταρα CD14 παρουσίασαν την μικρότερη 71

72 Αποτελέσματα έκφραση, ενώ ακολουθούσαν τα κυτταροτοξικά CD3+CD8+CD25- και τα ρυθμιστικά CD4 + CD25 + Tregs. Έκφραση του παράγοντα Tip60 σε Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα και σε Τ βοηθητικά μνημονικά λεμφοκύτταρα Όπως είπαμε και στην εισαγωγή τα T βοηθητικά παρθενικά (naïve) λεμφοκύτταρα είναι λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν περάσει την διαδικασία ωρίμανσης στο θύμο, εξέρχονται από αυτόν στην κυκλοφορία αλλά δεν έχουν ενεργοποιηθεί καθώς δεν έχουν «συναντηθεί» με κάποιο αντιγόνο. Ο λόγος που τα κύτταρα αυτά έχουν τόσο μεγάλη σημασία είναι ότι «δεν τα προτιμά» ο ιός του HIV- 1. Για το λόγο αυτό ελέγθηκε η έκφραση της Tip60 σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Για το συγκεκριμένο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν T λεμφοκύτταρα τα οποία προέρχονταν από αίμα ομφάλιου λώρου υγιών νεογνών (cord blood). Στο αίμα αυτό περιέχονται ως επί των πλείστων παρθένα Τ λεμφοκύτταρα τα οποία απομονώθηκαν με αρνητική επιλογή. Στη συνέχεια, απομονώθηκαν από ολικό αίμα Τ μνημονικά λεμφοκύτταρα. Η υποκατηγορία των κυττάρων που μας ενδιέφερε λοιπόν είναι τα CD4 + λεμφοκύτταρα και ειδικότερα η υποκατηγορία αυτών, τα CD3 + CD4 + CD45RO + κύτταρα, καθώς ο ιός του HIV-1 προσδένεται και εισέρχεται σε κύτταρα τα οποία φέρουν τον υποδοχέα CD4, όπως έχουμε αναφέρει και στην εισαγωγή. Τα μνημονικά (memory) T λεμφοκύτταρα, είναι ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν αναγνωρίσει ένα αντιγόνο, έχουν ενεργοποιηθεί και παραμένουν στον οργανισμό και μετά το πέρας της μόλυνσης. Η καθαρότητα των πληθυσμών των λεμφοκυττάρων εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS) και είχαμε καθαρότητα σε ποσοστό 97,5%. Εικόνα 29 : Εικόνα από κυτταρομετρία ροής στην οποία φαίνεται η καθαρότητα των δειγμάτων μας 72

73 Relative Tip60 mrna gene expression Αποτελέσματα Τόσο τα Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα όσο και τα Τ μνημονικά λεμφοκύτταρα χωρίστηκαν σε 3 ομάδες, αυτά που παρέμειναν στο καλλιεργητικό υλικό χωρίς καμία άλλη διεργασία (CM), σε αυτά που ενεργοποιήθηκαν με PMA/Ionomicyn και απομονώθηκαν τέσσερις ώρες μετά την ενεργοποίησή τους, αυτά που απομονώθηκαν δώδεκα ώρες μετά την ενεργοποίηση. 1 CM 2 4h P/I 3 12h P/I Τα δείγματα εξετάστηκαν για την έκφραση της Tip60 καθώς και της β2m. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο γράφημα CM 4h P/I 12h P/I CM 4h P/I 12h P/I CD3 + CD4 + CD45RA + CD3 + CD4 + CD45RO + Γράφημα 2: Έκφραση της Tip60 σε T βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα και σε Τ βοηθητικά μνημονικά λεμφοκύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης του Tip60 mrna μετρήθηκαν με την χρήση PCR σε παρθενικά CD4+CD45RA+, που απομονώθηκαν από αίμα από ομφάλιο λώρο, και σε μνημονικά CD4+CD45RO+ Τh κύτταρα που απομονώθηκαν από ολικό αίμα υγιών ενήλικων εθελοντών. Τα κύτταρα αυτά καλλιεργήθηκαν και πραγματοποιήθηκε ενεργοποίηση (ή μη) με μιτογόνα (P/I) για 4h και 12h. Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Στο γράφημα 2 βλέπουμε στην πρώτη στήλη την έκφραση της Tip60 στα παρθενικά λεμφοκύτταρα που παρέμειναν στο καλλιεργητικό υλικό χωρίς ενεργοποίηση (CM). Στη δεύτερη στήλη φαίνεται η έκφραση της Tip60 ύστερα από ενεργοποίηση τεσσάρων ωρών, με μιτογόνα (Ρ/Ι). Η έκφραση της Tip60 όπως βλέπουμε φαίνεται να μην επηρεάζεται από την εν λόγω ενεργοποίηση. Στη συνέχεια, η έκφραση της Tip60 εξακολουθεί να παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη ύστερα από την δωδεκάωρη ενεργοποίηση όπως φαίνεται στη τρίτη στήλη. 73

74 Αποτελέσματα Στη συνέχεια παρατηρούμε την έκφραση της Tip60 στα μνημονικά λεμφοκύτταρα. Αρχικά παρατηρούμε από το γράφημα ότι η έκφραση της Tip60 είναι μεγαλύτερη στα Τ μνημονικά λεμφοκύτταρα σε συνθήκες καλλιεργητικού (CM) υλικού σε σχέση με τα παρθενικά λεμφοκύτταρα. Ύστερα από την πρώτη ενεργοποίηση στις τέσσερις ώρες η έκφραση της Tip60 αυξάνεται κατά πολύ. Η αύξηση εξακολουθεί να είναι φανερή και ύστερα από τις δώδεκα ώρες ενεργοποίησης σε σχέση με το CM, παρόλο που παρατηρείτε μια μικρή μείωση σε σχέση με τις τέσσερις ώρες ενεργοποίησης. Συνεπώς βλέπουμε ότι η Tip60 εκφράζεται περισσότερο στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM). Στα παρθενικά ωστόσο, η έκφραση της Tip60 παραμένει σταθερή ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων, ενώ στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα η έκφραση του παράγοντα αυξάνεται ραγδαία ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων. Έκφραση του παράγοντα Tip60 σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Για την συνέχεια των πειραμάτων μας και ιδιαίτερα για την πραγματοποίηση πειραμάτων διαμολύνσεων ώστε να διευκρινίσουμε τον ρόλο της Tip60 στην έκφραση του γονιδίου της IL-2 και του HIV-1, χρειαζόμασταν ένα σύστημα κυττάρων τα οποία να συμπεριφέρονται όπως τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα και να μπορούν να απομονωθούν σε μεγάλο αριθμό. Χρήσιμο εργαλείο για την μελέτη αυτή είναι οι αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές. Ελέγχθηκαν εννέα κυτταρικές σειρές, μια σειρά Τ λεμφοκυττάρων, 2 σειρές μονοκυττάρων και έξι σειρές Β λεμφοκυττάρων. Αναλυτικότερα χρησιμοποιήθηκαν, η Τ λευχαιμική κυτταρική σειρά Jurkat που όπως θα δούμε στη πορεία, ήταν πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη μας. Οι σειρές THP-1, η οποία είναι μονοκυτταρική λευχαιμική σειρά και προέρχεταιι από οξεία μονοκυτταρική λευχαιμία και η U937 προερχόμενη από ιστιοκυτταρικό λέμφωμα. Όσον αφορά τις Β κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκε η ΜΜ (Multiple Myeloma) η οποία προέρχεται από πολλαπλό μυέλωμα, η U266 από πλασματοκύτωμα, η HS-Sultan και η Raji από λέμφωμα Burkitt και τέλος η IM9 και η RPMI από ασθενή μολυσμένο με τον ιο EBV. Ύστερα λοιπόν από καλλιέργεια των κυτταρικών σειρών, απομόνωση του RNA των κυττάρων αυτών και δημιουργία cdna, ελέγθηκε η έκφραση της Tip60. Τα αποτελέσματα από τις PCR φαίνονται στο γράφημα 3. 74

75 Αποτελέσματα Γράφημα 3: Έκφραση του Tip60 mrna σε ποικίλες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιήθηκαν μια Τ λευχαιμική κυτταρική σειρά, έξι Β λευχαιμικές κυτταρικές σειρές και δυο μονοκυτταρικές λευχαιμικές σειρές. Η β2m χρησιμοποιήθηκε σαν εσωτερικός μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Στο γράφημα 3 βλέπουμε ότι το mrna της Tip60 εκφράζεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν. Φαίνεται να υπάρχει μια διαφορική έκφραση ανάμεσα στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αναλυτικά βλέπουμε ότι στις Β λευχαιμικές σειρές φαίνεται η Tip60 να έχει την μικρότερη έκφραση σε σχέση με τις υπόλοιπες. Στη συνέχεια ακολουθούν οι δυο μονοκυτταρικές σειρές στις οποίες εκφράζεται σε ικανοποιητικό επίπεδο και τέλος στη Τ λευχαιμική σειρά Jurkat, όπου η Tip60 φαίνεται να εμφανίζει την μεγαλύτερη έκφραση. Έκφραση του παράγοντα Tip60 στην κυτταρική σειρά Jurkat Η κυτταρική σειρά Jurkat επιλέχθηκε επειδή σε αυτήν παρουσιάστηκε η μεγαλύτερη έκφραση της Tip60. Στην κυτταρική αυτή σειρά ακολουθήθηκε η ίδια πειραματική διαδικασία όπως και παρθενικά και στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά χωρίστηκαν όπως και προηγουμένως σε 3 ομάδες. Σε αυτά που παρέμειναν σε καλλιεργητικό υλικό, σε αυτά που ενεργοποιήθηκαν με PMA/ionomicyn και απομονώθηκαν από το καλλιεργητικό μέσο τέσσερις ώρες μετά την ενεργοποίησή τους και σε αυτά που απομονώθηκαν δώδεκα ώρες μετά την ενεργοποίηση τους. 75

76 Relative Tip60 mrna gene expression Relative Tip60 mrna gene expression Αποτελέσματα 1 CM 2 4h P/I 3 12h P/I Τα δείγματα εξετάστηκαν για την έκφραση της Tip60 καθώς και της β2m. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο γράφημα 4. 1,2 Jurkat 1,2 CD3 + CD4 + CD45RA ,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 CM 4h P/I 12h P/I 0 CM 4h P/I 12h P/I Γράφημα 4: Έκφραση της Tip60 στη κυτταρική σειρά Jurkat.(αριστερά) Τα Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM -P/I, για χρονική περίοδο 4h-12h. Τα επίπεδα του Tip60 mrna ανιχνεύθηκαν με την χρήση PCR και η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας. Σύγκριση της έκφρασης μεταξύ T βοηθητικών παρθενικών κυττάρων και κυττάρων Jurkat πριν και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα. Παρόμοιο μοτίβο έκφρασης σε CD3 + CD4 + CD45RA + και σε Jurkat κύτταρα Στο γράφημα 4 βλέπουμε ότι η έκφραση της Tip60 σε κύτταρα Jurkat δεν παρουσιάζει σημαντική διαφορά ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ωστόσο η ομοιότητα στην αλλαγή της έκφρασης της Tip60 στα Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα και στην κυτταρική σειρά Jurkat. Τόσο στα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα όσο και στα κύτταρα Jurkat η έκφραση 76

77 Αποτελέσματα της Tip60 είναι παρόμοια και στις συνθήκες CM και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Άρα η κυτταρική σειρά Jurkat προσομοιάζει τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα. Πρωτεϊνική έκφραση της ακετυλοτρανσφεράσης Τip60 στη κυτταρική σειρά Jurkat Θέλοντας να επιβεβαιώσουμε τα δεδομένα που συλλέξαμε ύστερα από την πραγματοποίηση των PCR και προκειμένου να δούμε αν η διαφοροποίηση στην έκφραση της Tip60 συνάδει με αντίστοιχη αλλαγή της πρωτεΐνης Tip60 εξετάσαμε την έκφρασή του στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κυτταρική σειρά Jurkat, πριν την ενεργοποίηση των κυττάρων (CM, σε καλλιεργητικό υλικό) και μετά από έξι και δώδεκα ώρες ενεργοποίησης. 1 CM 2 6h P/I 3 12h P/I Οι πρωτεΐνες αυτές επεξεργάστηκαν καταλλήλως και ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου. Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-tip60 σε συγκέντρωση 1:1000 το οποίο προέρχεται από ποντίκι και το δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-mouse σε συγκέντρωση 1:2000. Επίσης ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα πολυμεράση 2 (Ροlll) σε συγκέντρωση 1:1000 και το δεύτερο αντίσωμα για αυτήν ήταν το anti-rabbit σε συγκέντρωση 1:2000. Η πρωτεΐνη Tip60 έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πολυακριλαμίδιο χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-tip60 δίνει τέσσερις διαφορετικές ζώνες. 77

78 Relative Tip60 protein expression Relative Tip60 mrna gene expression Αποτελέσματα Εμείς στην παρούσα μελέτη μετρήσαμε την μπάντα με μέγεθος 60 KDa, που απεικονίζεται στην παρακάτω εικόνα: Tip60 60 KDa Τα αποτελέσματα που πήραμε από την παραπάνω σειρά πειραμάτων παρουσιάζονται στην εικόνα 30 και στο γραφήμα 5. Tip60 POLII CM 6hP/I 12hP/I Εικόνα 30: Western blot ανάλυση των επιπέδων της Τip60 πρωτεΐνης στη Jurkat κυτταρική σειρά. Τα Jurkat κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό CM±P/I, για χρονική περίοδο 6h-12h. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της πολυμεράσης ΙΙ (Ροlll) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. 1,2 Jurkat 1,2 Jurkat 1 0,8 0,6 0,4 0,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 CM 6h P/I 12h P/I 0 CM 4h P/I 12h P/I Γράφημα 5: Έκφραση της πρωτεΐνης Τip60 σε κυτταρική σειρά Jurkat πριν και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα(αριστερά) Σύγκριση της έκφρασης μεταξύ κυττάρων Jurkat σε επίπεδο mrna και σε επίπεδο πρωτεΐνης 78

79 Αποτελέσματα Παρόμοιο μοτίβο έκφρασης σε Jurkat κύτταρα σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο αντίστοιχα Στο γράφημα 5 αριστερά, απεικονίζεται η έκφραση της πρωτεΐνης Tip60 στη κυτταρική σειρά Jurkat. Και στο επίπεδο της πρωτεΐνης βλέπουμε ότι οι αλλαγές στην έκφραση της Tip60 είναι τόσο μικρές, που ουσιαστικά θεωρούμε ότι η έκφραση της Tip60 παραμένει αμετάβλητη. Αντίστοιχο μοτίβο έκφρασης είχαμε πάρει και από τα κύτταρα Jurkat και από τα παρθενικά κύτταρα σε μεταγραφικό επίπεδο. Εντοπισμός της πρωτεΐνης Tip60 σε κύτταρα Jurkat με ανοσοφθορισμό Στη συνέχεια θελήσαμε να απαντήσουμε σε ένα ακόμα ερώτημα, το οποίο αφορούσε τη θέση της πρωτεΐνης Tip60 μέσα στο κύτταρο. Μελέτες έχουν δείξει ότι η θέση της Tip60 διαφέρει ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου στο οποίο εκφράζεται. Συνήθως βρίσκεται στον πυρήνα, ωστόσο έχει εντοπιστεί στο κυτταρόπλασμα καθώς και γύρω από τον πυρήνα. Πραγματοποιήθηκαν λοιπόν πειράματα ανοσοφθορισμού προκειμένου να εντοπίσουμε τη θέση της Tip60 στα κύτταρα Jurkat. Αρχικά 10 5 κύτταρα Jurkat αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer, ακολούθησε επώαση με anti-tip60 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλε) για 10min. Η πρωτεΐνη Tip60 φαίνεται να εντοπίζεται στο πυρήνα σε συνθήκες καλλιέργειας (CM). Στη συνέχεια κύτταρα Jurkat ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα PMA/Ionomicyn και απομονώθηκαν έξι ώρες μετά την ενεργοποίησή τους και δώδεκα ώρες μετά την ενεργοποίηση τους. 1 CM 2 6h P/I 3 12h P/I 79

80 Αποτελέσματα Τα κύτταρα αμέσως μετά το πέρας την ενεργοποίησης συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine. Ακολούθησε ανοσοφθορισμός και για αυτά τα κύτταρα με το αντίσωμα anti- Tip60. Ακολούθησε ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων σε μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse TE 2000U, Nikon). Τα αποτελέσματα φαίνονται στην εικόνα 31. Εικόνα 31: Εντοπισμός της πρωτεΐνης Τip60 στη κυτταρική σειρά Jurkat με την χρήση της τεχνικής του ανοσοφθορισμού κύτταρα Jurkat αφέθηκαν να προσκολληθούν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με poly-l-lysine και μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεύδη 4%. Μετά από πλύσεις (1xPBS) και επώαση με blocking buffer, ακολουθεί επώαση με anti-ets-2 ab και δεύτερο αντίσωμα anti-mouse Alexa 488 (πράσινο). Η χρώση των πυρήνων έγινε με διάλυμα DAPI (μπλε) για 10min. Η ανάλυση και παρατήρηση των εικόνων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse TE 2000U, Nikon). 80

81 Αποτελέσματα Από την παραπάνω εικόνα μπορούμε να εξάγουμε δυο συμπεράσματα. Αρχικά παρατηρούμε ότι η πρωτεΐνη Τip60 εντοπίζεται στο πυρήνα στα κύτταρα Jurkat τόσο στη συνθήκη CM όσο και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Συνεπώς η ενεργοποίηση των κυττάρων δεν προκαλεί κάποια μετακίνηση της πρωτεΐνης Τip60 εντός του κυττάρου. Επίσης παρατηρούμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Τip60 παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη μιας και δεν παρατηρείται κάποια αξιοσημείωτη διαφορά στην έκφρασή της. Το αποτέλεσμα αυτό συμφωνεί και με τα πειράματα Western Blot που πραγματοποιήθηκαν στη κυτταρική σειρά Jurkat, αφού και εκεί η ενεργοποίηση των κυττάρων δεν φαίνεται να επηρέασε την έκφραση της Τip60 σημαντικά. Δοσοεξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης της IL-2 μέσω της πρόσδεσης της Tip60 Για να ελέγξουμε τη λειτουργική σημασία της Τip60 στην έκφραση στοιχείων που προέρχονται από τον υποκινητή της IL-2 προχωρήσαμε σε πειράματα συνδυαμόλυνσης. Έτσι συνδυαμολύναμε κύτταρα Jurkat με αυξανόμενες ποσότητες του φορέα υπερέκφρασης pcmx-tip60. Γράφημα 6: Η Tip60 αυξάνει την έκφραση της IL-2 μέσω του στοιχείου πρόσδεσής του. Έκφραση του γονιδίου της IL-2 σε κύτταρα Jurkat τα οποία έχουν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο υπερέκφρασης pcmx-tip60 και τον pcmx-vector. Η έκφραση της β2-m χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. 81

82 Αποτελέσματα Όσον αφορά την έκφραση της IL-2 όπως μπορούμε να δούμε στο γράφημα 6 αυξανόμενα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Tip60 οδηγούν σε σταδιακή αύξηση της έκφρασης της IL-2 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Συγκεκριμένα στην πρώτη στήλη όπου τα κύτταρα είναι σε συνθήκες CM (κύτταρα εν ηρεμία) η έκφραση της il-2 είναι πολύ χαμηλή. Ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων παρατηρούμε ότι η έκφραση της IL-2 αυξάνεται, όπως αυτό αναμενόταν. Στη συνέχεια η προσθήκη αυξανομένων ποσοτήτων εξωγενώς Tip60 έχει ως αποτέλεσμα την περαιτέρω αύξηση στην έκφραση της IL-2. Δράση του παράγοντα Τip60 στη μεταγραφή του HIV-1 Για να ελέγξουμε τη λειτουργική σημασία του παράγοντα Τip60 στην έκφραση στοιχείων που προέρχονται από την LTR αλληλουχία του HIV-1 προχωρήσαμε σε πειράματα συνδυαμόλυνσης. Συγκεκριμένα, εξετάσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης της Τip60 στην έκφραση της LTR περιοχής του HIV-1. Για το σκοπό αυτό συνδιαμολύναμε Jurkat κύτταρα με διαφορετικές ποσότητες υπερεκφρασμένου Τip60 παρουσία του γονιδίου CAT που έφερε ολόκληρη την LTR- HIV-1 αλληλουχία. Το πρώτο πράγμα που εξετάστηκε είναι εάν η διαμόλυνση στα κύτταρα είχε γίνει σωστά. Έτσι δημιουργήσαμε μια ομάδα δειγμάτων χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο Pucbenn. Το πλασμίδιο αυτό περιέχει ολόκληρη την αλληλουχία LTR, η οποία και αποτελεί την LTR του ΗΙV-1, συνδεόμενη με την αλληλουχία CAT. Χρησιμοποιήσαμε επίσης το γονίδιο Tip60 το οποίο έχει ενσωματωθεί στο πλασμίδιο PCMX-Tip60, σε διαφορετικές ποσότητες. Τέλος προσθέσαμε και σκέτο το φορέα PCMX. Παραθέτεται αναλυτικά η ομάδα των δειγμάτων με τα οποία δουλέψαμε. Pucbenn (1γ) + PCMX-vector(1γ) CM Pucbenn(1γ) + PCMX-vector(1γ) P/I Pucbenn (1γ) + Tip60 (250ng)+ PCMX-vector(750ng) P/I Pucbenn (1γ) + Tip60 (250ng)+ PCMX-vector(750ng) P/I Pucbenn(1γ)+ Tip60(1γ) P/I Όλα τα δείγματα είχαν τελική συγκέντρωση πλασμιδίου 2γ 82

83 Relative Tip60 mrna gene expression Αποτελέσματα Εξακρίβωση της υπερέκφρασης της Τip60 σε Jurkat Αρχικά, από τα παραπάνω δείγματα αφού απομονώσαμε DNA κάναμε PCR για το γονίδιο Tip60 προκειμένου να εξακριβώσουμε εάν είχε πραγματοποιηθεί το transfection και είχαμε υπερέκφραση της Tip60. Τα αποτελέσματά μας φαίνονται στο γράφημα puc-cat (500ng) + PCMX-vector (500ng) CM puc-cat (500ng) + PCMX-vector (500ng)P/I puc-cat (500ng) + tip60 (150ng) + PCMX-vector (350ng) P/I puc-cat (500ng) + tip60(300ng) + PCMX-vector (200ng) P/I Γράφημα 7: Έκφραση του γονιδίου Tip60 σε κύτταρα Jurkat τα οποία έχουμε διαμολύνει με το πλασμίδιο Pucbenn-cat, το pcmx-tip60 και τον pcmx-vector. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασης της β2m. Από το γράφημα 8 βλέπουμε ότι η έκφραση της Tip60 στην πρώτη και στην δεύτερη στήλη όπου υπάρχει μόνο ενδογενές Tip60 είναι παραπλήσια και αρκετά χαμηλή, αποτέλεσμα που συμφωνεί με τα πειράματα γονιαδιακής έκφρασης όπου η ενεργοποίηση στα κύτταρα Jurkat δεν προκαλούσε αλλαγή στην έκφραση της Tip60. Αντίθετα, στα δείγματα στα οποία έχουμε προσθέσει εξωγενές Tip60, παρατηρούμε απότομη αύξηση στην έκφραση του γονιδίου μας (υπερέκφραση). Από το γράφημα παρατηρούμε ότι όσο αυξάνεται η ποσότητα του εξωγενούς Tip60, αυξάνεται και η έκφρασή του. 83

84 Αποτελέσματα Η υπερέκφραση της Tip60 οδηγεί σε αύξηση της μεταγραφής του HIV-LTR/CAT Προκειμένου να ελέγξουμε τη λειτουργική σημασία του παράγοντα Tip60 στην έκφραση του HIV-1 προχωρήσαμε σε πειράματα CAT assay. Στα πειράματα συνδυαμόλυνσης χρησιμοποιήθηκε ένα εύρος συγκεντρώσεων του πλασμιδίου Tip60, το πλασμίδιο PUCBENN-CAT που φέρει ολόκληρη την LTR αλληλουχία του ιού HIV-1 και ο φορέας pcmx-vector. Ως μάρτυρα χρησιμοποιήσαμε ένα διαφορετικό πλασμίδιο-στόχο το οποίο ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου της ακετυλάσης της χλωραμφενικόλης (CAT) μέσω του υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού CMV. Στην εικόνα και στο γράφημα παρακάτω βλέπουμε τα αποτελέσματα του CAT assay, μετά από κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων. HIV-1 LTR CAT *** *** *** ** ** *** *** *** Γράφημα 9: Ενεργότητα CAT % οδηγούμενη από το στοιχείο Pucbenn που αντιπροσωπεύει τον υποκινητή του ιού HIV-1 όταν συνδιαμολύνεται με διαφορετικές ποσότητες πλασμιδίου που φέρει τη Tip60. Ο παράγοντας Tip60 αυξάνει την έκφραση του HIV1-LTR. Τα CAT assays πραγματοποιήθηκαν με εκχυλίσματα από κύτταρα Jurkat που έχουν διαμολυνθεί με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου pcmx-tip60 και σταθερή ποσότητα από τα πλασμίδια αναφοράς. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM) πριν την διαμόλυνση. Μετά την διαμόλυνση παρέμειναν για άλλες 6h σε CM για να ανακάμψουν και στην συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία P/I για άλλες 6h. Τα αποτελέσματα περιγράφονται ως ποσοστό επί της % της ενεργότητας του ενζύμου CAT από τρία ανεξάρτητα πειράματα, με την μέγιστη ενεργότητα του CAT ενζύμου (100%) σε κάθε πείραμα να αποτελεί βάση σύγκρισης. 84

85 Αποτελέσματα Εικόνα 32: Απεικόνιση του CAT assay σε Χ-ray film.. Το περιεχόμενο του κάθε δείγματος παρουσιάζεται στο παρακάτω γράφημα Όπως βλέπουμε στο γράφημα 9, μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων η αύξηση στην ενεργότητα του ενζύμου CAT αυξάνεται σημαντικά (από 24% που ήταν στις συνθήκες CM, έφτασε στο 49% μετά το Ρ/Ι). Συνεπώς, καταλαβαίνουμε ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων αυξάνει την έκφραση του ενζύμου και συνεπώς τη μεταγραφική δραστηριότητα της LTR περιοχής του γονιδιώματος του ιού. Στη συνέχεια, με την προσθήκη του παράγοντα Tip60 παρατηρείται μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση της ενεργότητας της ακετυλάσης της χλωραμφενικόλης αυξανομένης της συγκέντρωσης του γονιδίου που κωδικοποιεί τον παράγοντα Tip60 στα κύτταρα. Μπορούμε να παρατηρήσουμε ότι απουσία του παράγοντα η μεταγραφική δραστηριότητα της LTR βρίσκεται περίπου στο 49%, με την προσθήκη 250ng Tip60 στα κύτταρα παρατηρείται μία αύξηση περίπου στο 59%. Αυξάνοντας την ποσότητα της Tip60 η αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας αυξάνεται ακόμα περισσότερο, αφού σε προσθήκη 500ng του γονιδίου Tip60 η αύξηση της ενεργότητας του ενζύμου CAT, και κατά συνέπεια του υποκινητή του HIV-1, αυξάνει στο 68% περίπου. Έπειτα, από προσθήκη 1γ Tip60 η ενεργότητα του ενζύμου αυξάνεται ακόμα περισσότερο και φτάνει στη μέγιστη τιμή (100% σχετική ενεργότητα). Συνεπώς, βλέπουμε ότι η προσθήκη του παράγοντα Tip60, στον υποκινητή του ΗΙV-1 αυξάνει την ενεργότητα του ενζύμου CAT και συνεπώς αυξάνει την μεταγραφική δραστηριότητα της LTR του ιού HIV-1. Για να εξακριβώσουμε ότι η Tip60 επηρεάζει ειδικά την παραπάνω περιοχή και δεν είναι γενικό φαινόμενο η αλλαγή στην έκφραση, πραγματοποιήσαμε ακόμα ένα πείραμα συνδυαμόλυνσης αυτή την φορά χρησιμοποιώντας το γονίδιο αναφοράς CMV-CAT που την μεταφέραμε σε Jurkat κύτταρα παρουσία των ίδιων ποσοτήτων Tip60 που χρησιμοποιήσαμε και στα προηγούμενα πειράματα. Τα 85

86 CATactivity % Αποτελέσματα αποτελέσματα έδειξαν διαφορετική εικόνα από αυτά που παρατηρήσαμε πιο πάνω. Εδώ βλέπουμε ότι παρουσία του παράγοντα Tip60 δεν επηρεάζει την ενεργότητα του ενζύμου. Αυτό σημαίνει ότι ο παράγοντας Tip60 παρουσιάζει ειδικότητα ως προς τις περιοχές που δένει και προκαλεί την μεταγραφική ενεργότητα. Στο γράφημα 10 και στην εικόνα 33 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα που πήραμε. 100% 80% 60% 40% 20% 0% CMV(1γ) + PCMXvector(1γ) CM CMV(1γ) + PCMXvector(1γ) P/I CMV(1γ) + Tip60 (250ng)+ PCMXvector(750ng) P/I CMV(1γ) + Tip60 (500ng)+ PCMXvector(500ng) P/I CMV(1γ) + Tip60(1γ) P/I Γράφημα 10: Πείραμα συνδυαμόλυνσης με πλασμίδιο αναφοράς CMV-CAT που δείχνουν την ειδικότητα της Tip60 στην LTR του ιού HIV-1. Εικόνα 33: Απεικόνιση του Cat assay σε Χ-ray film. Όλες οι παραπάνω μετρήσεις εκφράζονται σαν μέση τιμή τριών μετρήσεων οι οποίες συλλέχθηκαν από την πραγματοποίηση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων 86

87 Αποτελέσματα Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Tip60 με την πρωτεΐνη Ets-2 Πρόσφατη μελέτη στο εργαστήριο μας έδειξε ότι ο παράγοντας Ets-2 είναι καταστολέας της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1-LTR στα CD4 + CD45RA + παρθενικά Τh κύτταρα, μέσω της πρόσδεσής του στην κοινή τους αλληλουχία. Η κατασταλτική αυτή δράση του παράγοντα Ets-2 παύει να υπάρχει στα μνημονικά Th κύτταρα ή όταν τα παρθενικά Th κύτταρα ενεργοποιηθούν. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρουσιάζουν ότι ο παράγοντας Tip60 επηρεάζει και αυτός την έκφραση της IL-2 και του HIV-1-LTR αλλά με διαφορετικό τρόπο. Φαίνεται λοιπόν να δρά σαν ενεργοποιητής σε αντίθεση με το παράγοντα Ets-2 ο οποίος δρα σαν καταστολέας. Ενδιαφέρον λοιπόν είναι να ελέγξουμε εάν αυτοί οι δυο παράγοντες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, είτε άμεσα είτε έμμεσα. Σύμφωνα λοιπόν με την υπόθεσή μας ότι οι δυο παράγοντες αλληλεπιδρούν, αν ένα αντίσωμα έναντι του παράγοντα Tip60 αναγνωρίσει την πρωτεΐνη αυτή μέσα σ ένα πρωτεϊνικό εκχύλισμα, η τελευταία θα συμπαρασύρει προς την περιοχή του αντισώματος και όλες εκείνες τις πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρά είτε άμεσα είτε έμμεσα μέσω άλλων πρωτεϊνών. Αν το ανοσοσύμπλοκο αυτό στη συνέχεια αποδιαταχθεί με σκοπό να διαταραχθούν οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, μια επακόλουθη ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με τη χρήση Western blot ανάλυση, θα μας δώσει πληροφορίες σχετικά με το ποιες πρωτεΐνες συμπαρασύρθηκαν μαζί με την πρωτεΐνη στόχο. Αν εφαρμόσουμε λοιπόν ένα αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Ets-2 στο ανοσοσύμπλοκο αυτό, η διαπίστωση της πρωτεΐνης Tip60 στο πρωτεϊνικό αυτό ικρίωμα θα αποτελούσε απόδειξη της συνεργικής δράσης των δύο αυτών παραγόντων. Για το συγκεκριμένο πείραμα, απομονώθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από την κυτταρική σειρά Jurkat. Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της Tip60 πρωτεΐνης, της τουμπουλίνης η οποία χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας και κρατήθηκαν και πρωτεϊνικά εκχυλίσματα χωρίς να προστεθεί κανένα αντίσωμα (ωστόσο η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης έγινε κανονικά). Έπειτα τα ανοσοκατακρημνίσματα που προέκυψαν καθώς και τα ολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα κατά western χρησιμοποιώντας αντίσωμα ειδικό έναντι της πρωτεΐνης Ets-2. Όπως φαίνεται στην εικόνα, στα ανοσοκατακρημνίσματα της Tip60 πρωτεΐνης, διαπιστώθηκε ενδογενής πρωτεΐνη Ets-2 καθώς και στα ολικά εκχυλίσματα. Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε συγκατακρήμνιση στα υπόλοιπα δείγματα. - 87

88 Αποτελέσματα Εικόνα 34 : Η ενδογενής πρωτεΐνη Τip60 αλληλεπιδρά με την ενδογενή πρωτεΐνη Ets-2. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από την κυτταρική σειρά Jurkat επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Τip60. Τα ανοσοκατακρημνίσματα και τα ολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western με χρήση αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Ets-2. Στη συνέχεια προκειμένου να επιβεβαιώσουμε την αλληλεπίδραση αυτή προχωρήσαμε σε ένα ακόμα πείραμα ανοσοκατακρήμνισης. Αυτή τη φορά πραγματοποιήσαμε το ίδιο πείραμα αλλά κάναμε την κατακρήμνιση με την πρωτεΐνη Ets-2 και την ανίχνευση με την πρωτεΐνη Τip60. Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από την κυτταρική σειρά Jurkat. Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της Ets-2 πρωτεΐνης, της τουμπουλίνης και κρατήθηκαν και πρωτεϊνικά εκχυλίσματα χωρίς να προστεθεί κανένα αντίσωμα όπως προηγουμένως. Έπειτα τα ανοσοκατακρημνίσματα που προέκυψαν καθώς και τα ολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Τip60. Όπως φαίνεται στην εικόνα, στα ανοσοκατακρημνίσματα της Ets-2 πρωτεΐνης, διαπιστώθηκε ενδογενής πρωτεΐνη Tip60. Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε συγκατακρήμνιση στα υπόλοιπα δείγματα όπως και προηγουμένως παραμόνο στα ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα. 88

89 Αποτελέσματα Εικόνα 35 : Η ενδογενής πρωτεΐνη Ets-2 αλληλεπιδρά με την ενδογενή πρωτεΐνη Τip60. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από την κυτταρική σειρά Jurkat επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Ets-2. Τα ανοσοκατακρημνίσματα και τα ολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western με χρήση αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Τip60. Η σειρά των πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης επιβεβαιώνει την αλληλεπίδραση των δύο αυτών παραγόντων, Τip60 και Ets-2, αφού η ανοσοκατακρήμνιση με το αντίσωμα έναντι της Τip60, οδήγησε στην συνκατακρήμνιση και της πρωτεΐνης Ets-2 μιας και η παρουσία της απεδείχθη με επακόλουθη western blot ανάλυση. Το αντίσωμα anti- Τip60 ανοσοκατακρήμνισε την πρωτεΐνη Τip60 και όταν κατά την ανάλυση του ανοσοιζήματος με western blot εφαρμόστηκε το ίδιο αντίσωμα ελήφθη η επιθυμητή ζώνη (Τip60). 89

90 Αποτελέσματα Ο παράγοντας Tip60 προσδένεται στον υποκινητή της IL-2 Εφόσον αποδείξαμε ότι ο παράγοντας Tip60 αλληλεπιδρά με τον παράγοντα Ets-2 θελήσαμε να ελέγξουμε εάν η Tip60, προσδένεται στον υποκινητή της IL-2 (όπως συμβαίνει με τον παράγοντα Ets-2). Προκειμένου λοιπόν να αποδείξουμε ότι ο παράγοντας Tip60 επάγει την έκφραση της IL-2 μέσω της πρόσδεσής του στην αλληλουχία IL-2 TATA box του υποκινητή της IL-2 πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP). Για το πείραμα ατό απομονώσαμε χρωματίνη από κύτταρα Jurkat, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε CM παρουσία και αμουσία μιτογόνων. Η χρωματίνη που βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες κατακρημνίστηκε με τη χρήση αντισωμάτων για τις πρωτεΐνες Tip60 και PolII και στη πορεία ακολούθησε PCR προκειμένου να ανιχνευθεί η περιοχή πρόσδεσης της Tip60 στο DNA. Έτσι μελετήσαμε την ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Tip60 στην περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 (περιλαμβάνει και την περιοχή πρόσδεσης του παράγοντα ets-2) και στο IL-2 TATA box. Σαν περιοχή μάρτυρα χρησιμοποιήσαμε περιοχή του υποκινητή της β2-m (β2-m TATA box). Αρχικά ελέγξαμε την ικανότητα πρόσδεσης της Tip60 στην αλληλουχία ARRE- 2, δηλαδή στην περιοχή όπου προσδένεται και ο Ets-2 παράγοντας. Στη συνθήκη CM παρατηρούμε ότι η Tip60 προσδένεται στην αλληλουχία (εικόνα 36) γεγονός που συμφωνεί με τα αποτελέσματα από την ανοσοκατακρήμνιση, δηλαδή ότι η πρωτεΐνη Tip60 και η πρωτεΐνη Ets-2 αλληλεπιδρούν σε συνθήκη CM, οπότε βρίσκονται σε σύμπλοκο στην περιοχή ARRE-2). Αντίθετα η ενεργοποίηση των κυττάρων με P/I οδήγησε στην αποχώρηση της Tip60 από την ARRE-2 αλληλουχία και την πρόσδεσή του στην IL-2 TATA περιοχή, γεγονός που συνάδει με την ενεργοποίηση της IL-2 στα Jurkat κύτταρα (εικόνα 36). Επίσης γνωρίζουμε από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου ότι ο παράγοντας Ets-2 ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων αποχωρεί και αυτός από την αλληλουχία ARRE-2, γεγονός που μας αποδεικνύει ακόμα μια φορά ότι οι δυο παράγοντες δρουν σαν σύμπλοκο. Όσον αφορά την πρόσδεση στην αλληλουχία IL-2 TATA, φαίνεται η Tip60 να προσδένεται στη περιοχή αυτή μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Φαίνεται λοιπόν να βρίσκεται στην αλληλουχία ARRE-2 όταν τα κύτταρα είναι εν ηρεμία και στην πορεία η ενεργοποίηση των κυττάρων να μετακινεί τον παράγοντα Tip60 στην περιοχή IL-2 TATA και να επάγει την μεταγραφή της IL-2, όπως και ο Ets- 2. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης πολυμεράσης ΙΙ (PolII), στο σύμπλοκο χρωματίνης/πρωτεΐνης που είχαμε. Στην συνθήκη CM η PolII φαίνεται να είναι προσδεδεμένη στην ARRE-2 περιοχή ενώ μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με P/I, πρόσδεση της PolII εμφανίζεται στην IL-2 90

91 Αποτελέσματα TATA περιοχή. Η παρουσία της PolII στην ARRE-2 περιοχή σε εν ηρεμία κατάσταση των κυττάρων, μπορεί να αντανακλά την συσχέτιση της πρωτεΐνης αυτής με άλλους παράγοντες που προσδένονται στην περιοχή αυτή και βρίσκονται σε μία κατάσταση «ετοιμότητας» να δράσουν κάτω από το κατάλληλο ερέθισμα. Από την άλλη η μεταφορά της PolII στην IL-2 TATA περιοχή μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων συμφωνεί με την ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-2. Για να επιβεβαιώσουμε την ειδικότητα της πρόσδεσης του παράγοντα Tip60 στις περιοχές αυτές χρησιμοποιήσαμε σαν control την περιοχή του υποκινητή της β2-m. Κατακρήμνιση χρωματίνης με την χρήση Tip60 αντισώματος δεν ανέδειξε καμία ικανότητα πρόσδεσης της πρωτεΐνης αυτής στην περιοχή του υποκινητή της β2-m σε καμία από τις συνθήκες που εξετάστηκαν. Εικόνα 36 : Πρόσδεση του παράγοντα Tip60 στον του υποκινητή της ΙL-2 μέσω ανάλυσης ChIP. Για την ChIP ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν Jurkat κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CM±P/I. Η ChIP ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την χρήση των αντισωμάτων anti- Tip60 και anti-polii. Η crosslinked χρωματίνη από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε CM, πριν από την διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης, χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας σε κάθε διαδικασία πολλαπλασιασμού των περιοχών με PCR, με τους ανάλογους εκκινητές, ώστε να επαληθεύσουμε ότι όλες οι αντιδράσεις εμπεριέχουν την ίδια συγκέντρωση χρωματίνης για την ανοσοκατακρήμνιση (INPUT). Σαν αρνητικό μάρτυρα πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις χωρίς την προσθήκη χρωματίνης (-ch). Σαν εσωτερικό μάρτυρα για την επιβεβαίωση της ακρίβειας της ChIP ανάλυσης (αντισωμάτων και πολλαπλασιασμένων περιοχών), πραγματοποιήθηκε PCR για την ανίχνευση της TATA box περιοχής του υποκινητή της β2-μικρογλοβουλίνης (β2-m TATA). Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία EthBr. 91

92 ΣΥΖΗΤΗΣΗ

93 Συζήτηση Η μετάβαση των κυττάρων από την παρθενική στην ενεργοποιημένη μορφή συνδέεται άμεσα με την έξοδο του HIV-1 από την λανθάνουσα κατάσταση στην οποία βρίσκεται στα μολυσμένα κύτταρα. Τα παρθενικά κύτταρα αποτελούν την βασική αποθήκη ιικού αποθέματος στους ασθενείς που πάσχουν από HIV-1 (Schrager et al., 1998) μιας και τα κύτταρα αυτά είναι μεν δεκτικά στην μόλυνση από τον ιό, ωστόσο δεν είναι δεκτικά στον πολλαπλασιασμό του ιού (Stevenson et al., 2003, Pan et al., 2013). Από την άλλη, η ενεργοποίηση των βοηθητικών Τ κυττάρων είναι ένα πολύ σημαντικό γεγονός για την παραγωγή νέων ιικών σωματίων από τα κύτταρα αυτά (Zack et al., 1990). Η ύπαρξη πολλών αλληλουχιών αναγνώρισης μεταγραφικών παραγόντων του ξενιστή στην LTR αλληλουχία του ιού και συγκεκριμένα παραγόντων που συμμετέχουν και στην ενεργοποίηση ή την καταστολή της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων, μπορεί να αποτελεί το κλειδί στην διερεύνηση της λανθάνουσας κατάστασης του ιού στα κύτταρα αυτά. Η φάση της μετάβασης του ιού από την λανθάνουσα κατάσταση στην «ενεργοποιημένη» μπορεί να διαμεσολαβείτε από ένα ή περισσότερους παράγοντες που ενώ διατηρεί/ούν τον ιό σε καταστολή στα εν ηρεμία και παρθενικά Τ κύτταρα εξαφανίζεται ή δρα σαν ενεργοποιητής μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Στην παρούσα ερευνητική εργασία σκοπός μας ήταν να μελετήσουμε τον τρόπο δράσης του γονιδίου Tip60 στην μεταγραφή του ιού HIV-1 και του γονιδίου της IL-2. Η Tip60 είναι μια από τις πιο χαρακτηριστικές MYST πρωτεΐνες και αρχικά προσδιορίστηκε ως αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη με την HIV-1 ΤΑΤ πρωτεΐνη (Kamine et al., 1996). Το μόριο αυτό ανήκει στην οικογένεια των ακετυλοτρανσφερασών αφού περιέχει την ΗΑΤ (Ηistone Αcetyltransferase) περιοχή. Το ανασυνδιασµένο Tip60 ακετυλιώνει τις ιστόνες Η2Α και Η4 (Yang et al., 2012). Στην πλειονότητα των περιπτώσεων η Tip60 ενισχύει τη μεταγραφική δραστηριότητα των διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων δρώντας ως συνενεργοποιητής. Ωστόσο, μπορεί επίσης να καταστείλει την μεταγραφή των γονιδίων, με την επιλεκτική καταστολή μεταγραφικών παραγόντων. Οι λόγοι που μας οδήγησαν στην μελέτη της Τip60 προκύπτουν από πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν ότι υπάρχει μια πιθανή αλληλεπίδραση της Tip60 με τον παράγοντα Εts-2, ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση της μεταγραφής τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του HIV-1. Επιπλέον η IL-2 και ο HIV-1 παρουσιάζουν κοινή μεταγραφική ρύθμιση που ελεγχέται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων σε κοινα cis στοιχεία (Mouzaki et al., 2000). Επίσης, το Tip60 είναι μια Τat-αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο Tat του HIV-1 (Creaven et al., 1999). Τέλος το γεγονός ότι ο HIV-1. παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση στα εν ηρεμία Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα καθώς και ότι ο παράγοντας Εts-2, που πιθανόν αλληλεπιδρά με την Tip60, συμμετέχει στη καταστολή της έκφρασης του ιού, υποδηλώνει μια πιθανή συμμετοχή της Tip60 σε αυτή τη διαδικασία.

94 TIP60 Relative mrna gene expression TIP60 mrna gene expression Συζήτηση Αναλύοντας τα αποτελέσματά μας λοιπόν μπορούμε να αντιληφθούμε την επαγωγική δράση της πρωτεΐνης Tip60 στην έκφραση τόσο της IL-2 όσο και του γονιδιώματος του ιού HIV-1. Φαίνεται ότι η Tip60 όταν εκφράζεται στα κύτταρα, ίσως με την συνεργασία και αλληλεπίδραση με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, επιτρέπει στην RNA πολυμεράση II να προσδεθεί στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 ώστε να ξεκινήσει η διαδικασία της μεταγραφής. Η παράλληλη μελέτη των αποτελεσμάτων που πήραμε από τα πειράματα RT-PCR, Western blot και CAT assays μπορεί να μας δώσει μία αρκετά κατανοητή εικόνα δράσης του παράγοντα Tip60. Αρχικά στα πειράματα μας ελέγξαμε την έκφραση του παράγοντα Tip60 σε διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων, και συγκεκριμένα σε Τ μνημονικά λεμφοκύτταρα (CD3 + CD4 + CD45RO + ) και σε Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα (CD3 + CD4 + CD45RA + ). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο παράγοντας Tip60 εκφράζεται περισσότερο στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα. 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 CM (CD3+CD4+CD45RA+) CM (CD3+CD4+CD45RO+) Επιπλέον δείξαμε ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων στα Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα δεν επηρεάζει ουσιαστικά την έκφραση του παράγοντα Tip60 ενώ στα μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα προκαλεί σημαντική αύξηση. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 CM P/I CM P/I CD3+CD4+CD45RA+ CD3+CD4+CD45RO+ 94