MorphoSys AG (

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΓΕΩΡΓΙΑ ΤΣΕΛΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ HUCAL ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗΝ SRPK1a ΜΕΛΕΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΕΞΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1 Αντισώµατα - δοµή και λειτουργία Τα αντισώµατα ή ανοσοσφαιρίνες είναι πρωτεΐνες που προσφέρουν ανοσία, άµυνα δηλαδή έναντι στις διάφορες λοιµώξεις, και εµφανίζουν τη χαρακτηριστική ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πρωτεϊνών του πλάσµατος. Παράγονται από µια οµάδα κυττάρων του αίµατος, τα Β-λεµφοκύτταρα, τα οποία ανήκουν στα λευκά αιµοσφαίρια. Ενα µόριο αντισώµατος αποτελείται από δύο πανοµοιότυπες βαριές αλυσίδες Η και δύο πανοµοιότυπες ελαφριές αλυσίδες L, µε κάθε αλυσίδα να περιέχει µία µεταβλητή (V) και µία ή περισσότερες σταθερές (C) περιοχές. Οι τέσσερις αλυσίδες συνδέονται έτσι ώστε να έχουν σχήµα Υ. Κάθε ελαφριά αλυσίδα συνδέεται µε µία βαριά αλυσίδα και οι δύο βαριές αλυσίδες συνδέονται µεταξύ τους, όλες µε δισουλφιδικούς δεσµούς. Η κάθε ελαφριά αλυσίδα αποτελείται από µία µεταβλητή και µία σταθερή περιοχή, ενώ η βαριά αλυσίδα έχει µία µεταβλητή και τρεις ή τέσσερις σταθερές περιοχές. Κάθε µεταβλητή περιοχή της βαριάς αλυσίδας που ονοµάζεται VΗ ή της ελαφριάς αλυσίδας που ονοµάζεται VL περιέχει τρείς υπερµεταβλητές περιοχές ή CDRs. Από τις τρεις αυτές περιοχές η µεγαλύτερη µεταβλητότητα συγκεντρώνεται στην CDR3 περιοχή η οποία βρίσκεται στο σηµείο σύνδεσης των C και V περιοχών. Το κλάσµα ενός αντισώµατος που περιέχει µια ολόκληρη ελαφριά αλυσίδα (µε µονήρεις περιοχές C και V) συνδεδεµένη µε την περιοχή V και τη πρώτη C περιοχή της βαριάς αλυσίδας είναι αυτό που απαιτείται για την αναγνώριση του αντιγόνου και ονοµάζεται Fab (fragment antigen binding, κλάσµα πρόσδεσης αντιγόνου). Οι υπόλοιπες περιοχές C αποτελούν την περιοχή Fc ή κρυσταλλικό κλάσµα (fragment crystaline) που ονοµάζεται έτσι επειδή τείνει να σχηµατίζει κρυστάλλους όταν βρίσκεται σε διάλυµα. 2

3 Σχήµα Α.1. Γενική δοµή των ανοσοσφαιρινών. VH: Μεταβλητή περιοχή βαριάς αλυσίδας, VL: Μεταβλητή περιοχή ελαφριάς αλυσίδας, CH: Σταθερή περιοχή βαριάς αλυσίδας, CL: Σταθερή περιοχή ελαφριάς αλυσίδας. Τα αντισώµατα βρίσκονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισµούς και εκτός από την ανοσία παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αλλεργιών, στην απόρριψη µοσχευµάτων και στη διάκριση εαυτού-ξένου που διαταράσσεται στα αυτοάνοσα νοσήµατα. Κάθε άτοµο έχει περίπου δύο εκατοµµύρια αντισώµατα στην κυκλοφορία του αίµατός του, που θωρακίζουν το ανοσοποιητικό του σύστηµα. Τα αντισώµατα παράγονται καθηµερινά ως απάντηση σε ξένα ως προς τον οργανισµό σωµατίδια που καλούνται αντιγόνα. Τα αντιγόνα µπορεί να είναι πρωτείνες, πολυσακχαρίτες, λιπίδια και µικροµοριακές χηµικές ενώσεις. Τα αντιγόνα µπορεί να εκφράζονται στις επιφάνειες των µικροοργανισµών (π.χ. αντιγόνα του καψιδίου ή του φακέλου των βακτηρίων) ή να βρίσκονται σε διαλυτή µορφή (π.χ. εκκρινόµενες τοξίνες). 3

4 Α.1.1 Βιοτεχνολογική παραγωγή αντισωµάτων Η δηµιουργία αντισωµάτων µε τη βοήθεια της βιοτεχνολογίας είναι σηµαντική και βρίσκει πολλές εφαρµογές στη θεραπεία ασθενειών. Οι Kohler και Milstein το 1975 δηµοσίευσαν την παραγωγή µονοκλωνικών αντισωµάτων από ποντίκια που είχαν προηγουµένως ανοσοποιηθεί µε το κατάλληλο αντιγόνο. Τα αντισώµατα αυτά δεν είχαν ευρεία εφαρµογή στους ανθρώπους γιατί δηµιουργούσαν ανοσοαντιδράσεις και η εφαρµογή τους περιορίστηκε σε συγκεκριµένες περιπτώσεις ανοσοκατεσταλµένων ασθενών. Στη συνέχεια µε τη βοήθεια της γενετικής µηχανικής τα αντισώµατα αυτά από τα ποντίκια µετατράπηκαν σε χιµαιρικά αντισώµατα ποντικιού-ανθρώπου, αλλά και σε ανθρώπινα µε τη χρησιµοποίηση φάγων. Τα τελευταία είχαν ευρεία εφαρµογή όπως για παράδειγµα η δηµιουργία του φαρµάκου Humira (Lorenz, 2002) για τη θεραπεία της ρευµατοειδούς αρθρίτιδας. Τα αντισώµατα που παράγονται µε τη βοήθεια των φάγων δηµιουργούνται συνήθως µε γενετική σύντηξη του γονιδίου ενδιαφέροντος, για παράδειγµα ενός τµήµατος αντισώµατος µε µία από τις πρωτείνες περιβλήµατος του φάγου, συνήθως το γονίδιο 3 του βακτηριοφάγου του E.coli fd ή M13. Η συσσώρευση του φάγου και το πακετάρισµα του γενετικού του υλικού πραγµατοποιείται στα E.coli. Τα αντισώµατα αυτά συγκροτούν βιβλιοθήκες οι οποίες είναι «ανοσογόνες», δηλαδή πρέπει πρώτα να ευαισθητοποιηθεί το πειραµατόζωο πχ το ποντίκι για την παραγωγή των αντισωµάτων. Επίσης τα αντισώµατα που δηµιουργούνται δεν είναι 100% ανθρώπινα, έτσι δεν αποφεύγονται οι αλλεργικές αντιδράσεις στην περίπτωση που χρησιµοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς. Τα παραπάνω έκαναν εµφανή την ανάγκη για τη δηµιουργία 100% ανθρώπινων αντισωµάτων. Με τη βοήθεια της βιοτεχνολογίας δηµιουργήθηκαν in vitro τα αντισώµατα Hucal (Human Combinational Antibody Library) και οι αντίστοιχες βιβλιοθήκες. Την πατέντα των αντισωµάτων εµπορεύεται η Γερµανική βιοτεχνολογική εταιρία MorphoSys AG ( 4

5 Σχήµα Α.2. Τύποι αντισωµάτων που δηµιουργούνται µε τη βοήθεια της βιοτεχνολογίας ( Α.1.2 Hucal Αντισώµατα- Hucal βιβλιοθήκες Η τεχνολογία Hucal είναι µια µοναδική και καινοτόµος µέθοδος για την παραγωγή in vitro πλήρως ανθρώπινων αντισωµάτων µε υψηλή εξειδίκευση. Στις βιβλιοθήκες Hucal η ποικιλοµορφία του ανθρώπινου ρεπερτορίου των αντισωµάτων αντιπροσωπεύεται από περιοχές γονιδίων που αντιστοιχούν σε επτά βαριές και επτά ελαφριές αλυσίδες. Ο συνδυασµός αυτών των γονιδίων δίνει 49 εναλλακτικούς συνδυασµούς στην κύρια βιβλιοθήκη. Επιπλέον, εκµεταλλευόµαστε τις περιοχές CDR. Με συνδυασµό των περιοχών CDR σε κάθε µια από τις βαριές και ελαφριές αλυσίδες πολλαπλασιάζουµε τους αρχικούς 49 συνδυασµούς µε τελικό αποτέλεσµα να αντιπροσωπεύεται το σύνολο του ανθρώπινου ρεπερτορίου των αντισωµάτων. Τα γονίδια τα οποία περιέχουν τα αντισώµατα Hucal παρασκευάζονται εξολοκλήρου µε χηµική σύνθεση. εν χρησιµοποιείται PCR σε κανένα στάδιο παρασκευής των αντισωµάτων ( Στην παρασκευή των αντισωµάτων Hucal και συγκεκριµένα στον τρόπο που γίνονται οι µεταλλάξεις προκειµένου να επιτευχθούν όλοι οι δυνατοί συνδυασµοί των CDR υπερµεταβλητών περιοχών χρησιµοποιείται η τεχνολογία TRIM (µετάλλαξη τρινουκλεοτιδίου), η οποία αποτελεί εξέλιξη της µετάλλαξης µονονουκλεοτιδίου (Virnekas et al., 1994). 5

6 Μετάλλαξη µονονουκλεοτιδίου: TRP Cys Stop CG Tyr...CAT TTT ACT HIS Phe Thr A Leu Μετάλλαξη τρινουκλεοτιδίου: TCG...CAT TAT ACT TTT Trp His Tyr Thr Phe Με τη µέθοδο αυτή αποφεύγονται τα κωδικόνια τερµατισµού καθώς και τα σπάνια κωδικόνια και τελικά παίρνουµε τα επιθυµητά αµινοξέα. Σχήµα Α.3. Η βασική αρχή των Hucal αντισωµάτων ( H πρώτη βιβλιοθήκη Hucal βασίστηκε στην παραγωγή αντισωµάτων scfv (Knappik et al., 2000). Τελευταία, δηµιουργήθηκε µια νέα έκδοση της βιβλιοθήκης Hucal η Hucal-Fab 1 (Rauchenberger et al., 2003), η οποία συνδυάζει όλα τα χαρακτηριστικά της τεχνολογιάς των Hucal µε τα χαρακτηριστικά των Fab αντισωµάτων. 6

7 Με τη βοήθεια της γενετικής µηχανικής µπορούµε να παρασκευάσουµε ολοκληρωµένα IgG αντισώµατα ή µέρη αυτών όπως τα αντισώµατα Fab (antigen binding fragment), Fv (variable domain fragment) και scfv (single chain variable domain fragment). Με τη βοήθεια του ανασυνδυασµένου DNA µπορεί να γίνει πολυµερισµός των παραπάνω τµηµάτων οπότε προκύπτουν τα Diabody (dimeric single chain variable domain fragment), Fab-dHLX Miniantibody (dimeric antigenbinding fragment), scfv-p53 Miniantibody (tetrameric single chain variable domain fragment) (Lu et al., 2002). Σχήµα Α.4. οµή αντισωµάτων ή πολυµερισµένων τµηµάτων αυτών όπως προκύπτουν µε τη χρήση βιοτεχνολογικών µεθόδων (Subramanian et al., 2004). Τα αντισώµατα Fab χρησιµοποιούνται ευρέως στις βιβλιοθήκες Hucal και πλεονεκτούν σε σχέση µε τα IgG αντισώµατα για τους εξής λόγους: -Αποφεύγονται οι αλληλεπιδράσεις µε την Fc περιοχή, όπως γίνεται στα πλήρη αντισώµατα. -Τα αντισώµατα Fab έχουν µικρότερο µοριακό βάρος σε σχέση µε την πλήρη µορφή των αντισωµάτων και έτσι πετυχαίνεται πιο εύκολη παρασκευή τους και αποτελεσµατικότερη διείσδυση ανάµεσα στους ιστούς. 7

8 -Ενώ τα IgG αντισώµατα παράγονται σε κυτταροκαλλιέργειες, τα Fab αντισώµατα µπορούν να παραχθούν σε µικροοργανισµούς, στοιχείο που µειώνει αρκετά το κόστος. Χαρακτηριστικά των βιβλιοθηκών Hucal: -Γρήγορη παραγωγή πλήρως ανθρώπινων αντισωµάτων. -Επιτυχία στην παραγωγή αντισωµάτων που είναι δύσκολο να παρασκευαστούν µε τις άλλες µεθόδους όπως είναι τα µη ανοσογόνα αντισώµατα ή τα αντισώµατα απέναντι σε τοξικές ουσίες. -Υψηλή συγγένεια των αντισωµάτων µε δυνατότητες βελτιστοποίησης. Εξέλιξη των παραπάνω βιβλιοθηκών αποτελεί η βιβλιοθήκη Gold η οποία δηµιουργήθηκε από τη Morphosys ( Η βιβλιοθήκη Gold συνδυάζει τα πλεονεκτήµατα της Hucal-fab βιβλιοθήκης µε την τεχνολογία CysDisplay η οποία αναπτύσσεται αναλυτικά παρακάτω. Και οι έξι υπερµεταβλητές περιοχές διαφοροποιούνται µε βάση την τεχνολογία TRIM. Πλεονεκτήµατα της βιβλιοθήκης Gold: -Πλήρως ανθρώπινα αντισώµατα στη Fab µορφή βασισµένα στο σχεδιασµό των Hucal αντισωµάτων. -Περίπου 1.6x10 10 διαφορετικά στελέχη. -Πάνω από 70% λειτουργικά στελέχη. - ιαφοροποίηση και των έξι περιοχών CDR γεγονός που δίνει µεγάλη ποικιλοµορφία στις περιοχές πρόσδεσης. -Τεχνολογία CysDisplay. -Αντισώµατα µε µεγάλη εξειδίκευση και συγγένεια ως προς τα αντίστοιχα αντιγόνα. -Γρήγορη συλλογή των αντισωµάτων. - υνατότητα για εύκολη τροποποίηση της δοµής και βελτιστοποίησης των αντισωµάτων. Η βιβλιοθήκη Gold είναι πολύ διαδεδοµένη και η χρησιµοποίηση των Fab αντισωµάτων έχει βρει ευρεία εφαρµογή για τη δηµιουργία αντισωµάτων για θεραπευτικούς σκοπούς. Τα αντισώµατα που προκύπτουν είναι σταθερά, εύκολα µετατρεπόµενα στην πλήρη µορφή της ανοσοσφαιρίνης χωρίς να χαθεί η 8

9 λειτουργική τους δράση. Τα αντισώµατα Fab τα οποία συλλέγουµε από τη βιβλιοθήκη Gold εκφράζονται επίσης πολύ καλά σε στελέχη E.coli. (Rothe et al., 2007). Α Τεχνολογία CysDisplay H τεχνολογία CysDisplay έχει ως σκοπό τη συλλογή αντισωµάτων από τις αντίστοιχες βιβλιοθήκες µε προσδέτες υψηλής συγγένειας µε τη χρησιµοποίηση νηµατοειδών φάγων. Η τεχνολογία αυτή συνδυάζει τα πλεονεκτήµατα της χρησιµοποίησης των φάγων για τη δηµιουργία αντισωµάτων µε τα πλεονεκτήµατα της τεχνολογίας Hucal. H προσθήκη δισουλφιδικών δεσµών επιτρέπει την αποτελεσµατική αποµόνωση των αντισωµάτων. Αυτό επιτυγχάνεται µε την ταυτόχρονη δηµιουργία καταλοίπων κυστείνης στην περιπλασµατική πρωτείνη του περιβλήµατος (p3) του φάγου και της βαριάς αλυσίδας του αντισώµατος. Στη συνέχεια δηµιουργείται δισουλφιδικός δεσµός µεταξύ των δύο αυτών κυστεϊνών, γίνεται ετεροδιµερισµός και ενσωµάτωση του µορίου στα µόρια του φάγου, και τέλος έκθεση του λειτουργικού αντισώµατος στην επιφάνεια του φάγου. Καθώς οι δισουλφιδικοί δεσµοί είναι ευαίσθητοι σε αναγωγικά µέσα, χρησιµοποιούνται αντίστοιχα διαλύµατα για αποτελεσµατική αποµάκρυνση του αντισώµατος. Σχήµα Α.5. Σύγκριση της τεχνολογίας CysDisplay που χρησιµοποιείται στη βιβλιοθήκη Gold µε την τεχνολογία Monovalent Phage Display που χρησιµοποείται στις βιβλιοθήκες Hucal-scFV και Hucal-Fab1 ( 9

10 Α Η βιβλιοθήκη Hucal Platinum Η Hucal Platinum αποτελεί µια εξέλιξη των προηγούµενων βιβλιοθηκών προσφέροντας σηµαντικές αλλαγές. Έχει τη δυνατότητα παραγωγής περίπου 45 δισεκατοµµυρίων πλήρως ανθρώπινων αντισωµάτων. Επιπλέον, µε την τεχνολογία Morphosys Trim έγινε δυνατό να παραχθεί η βαριά αλυσίδα της CDR περιοχής των αντισωµάτων (CDR3 περιοχή) η οποία είναι η πιο σηµαντική περιοχή για την αναγνώριση του αντιγόνου. Με τον τρόπο αυτό γίνονται περισσότεροι συνδυασµοί για την παραγωγή αντισωµάτων που σαν σύνολο αυξάνουν την βιβλιοθήκη σε µέγεθος τόσο ώστε να είναι τρεις φορές το µέγεθος της βιβλιοθήκης Gold. Α Βελτιστοποίηση των αντισωµάτων Hucal Η µοναδική δοµή των αντισωµάτων Hucal είναι η βάση για άµεση δηµιουργία ανθρώπινων αντισωµάτων µε βελτιωµένα χαρακτηριστικά. Σηµαντικό ρόλο παίζει η αρθρωτή δοµή τους. Έτσι, προκειµένου να βρεθεί ένα αντίσωµα για ένα συγκεκριµένο αντιγόνο γίνεται ένα αρχικό screening µε κάποια πιθανά αντισώµατα και στη συνέχεια γίνεται διαδοχική ανταλλαγή των περιοχών CDR όπως συµβαίνει και στο ανθρώπινο ρεπερτόριο. Οι περιοχές CDR αλλάζουν µορφή και διαφοροποιούνται µε βάση την τεχνολογία TRIM. Πάνω από 3000 δυνατοί συνδυασµοί µπορούν να πραγµατοποιηθούν και τελικά δηµιουργούνται αντισώµατα µε µεγάλη εξειδίκευση και ισχυρή συγγένεια ως προς τα επιθυµητά αντιγόνα. (Subramanian et al., 2004). Σχήµα Α.6. Βελτιστοποίηση των αντισωµάτων Hucal ( 10

11 A Αυτοµατοποίηση της παραγωγής των αντισωµάτων Hucal Ολες οι βιβλιοθήκες Hucal αυτοµατοποιούν την παραγωγή και επιλογή των αντισωµάτων µε τη διαδικασία επιλογής AutoPan και τη διαδικασία ελέγχου Autoscreen. Στάδια επιλογής AutoPan -Ο φάγος που είναι συνδεδεµένος µε το αντίσωµα προσδένεται στο ακίνητο αντιγόνο. -Αποµάκρυνση των φάγων που έχουν τα µη ειδικά αντισώµατα. -Ενίσχυση του φάγου που έχει τα ειδικά αντισώµατα. -Έκφραση των αντισωµάτων στην επιφάνεια του φάγου για το επόµενο στάδιο επιλογής. Στάδια screening Autoscreen - Οι βακτηριακές αποικίες που εκφράζουν τα γονίδια Hucal έχουν επιλεχθεί µε τη διαδικασία AutoPan. Οι αποικίες µεταφέρονται σε πιάτο ELISA. -Πρωταρχικό screening για το επιθυµητό αντιγόνο από χιλιάδες κλώνους σε ELISA µε 384 πηγαδάκια -DNA fingerprinting για ανίχνευση των επιθυµητών κλώνων. -Περαιτέρω αξιολόγηση των επιλεγµένων κλώνων (καλλιέργεια σε τρυβλία και επανάληψη της τεχνικής ELISA, ανάλυση της αλληλουχίας στους επιλεγµένους κλώνους). Α Σύστηµα AutoCal Το σύστηµα AutoCal είναι ένα υψηλά αυτοµατοποιηµένο σύστηµα λογισµικού που επιτρέπει την επιλογή των επιθυµητών αντισωµάτων από το σύνολο των αντισωµάτων της βιβλιοθήκης Hucal. Είναι αρθρωτό και επεκτεινόµενο. 11

12 Σχήµα Α.7. Η διαδικασία Autoscreen ( Α Τεχνολογία Hucal AgX Η τεχνολογία AgX (Antigen Expression System) προσφέρει ταχεία και υψηλού επιπέδου βακτηριακή έκφραση και εκχύλιση λειτουργικών περιοχών (domains) πρωτεϊνικών αντιγόνων από cdna ή από προϊόντα PCR. Αυτές οι πρωτεϊνικές περιοχές (100 ή 300 αµινοξέα) είναι ιδανικές για την παραγωγή µονοκλωνικών αντισωµάτων από τη βιβλιοθήκη Hucal Gold. Υψηλού βαθµού έκφραση AgX πολυπεπτιδίων επιτυγχάνεται µε σύντηξη του καρβοξυτελικού άκρου του αντιγόνου µε την Ν1-περιοχή της g3p του νηµατοειδούς φάγου Μ13 και έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε καλλιέργειες E.coli ως σωµατίδια εγκλεισµού (inclusion bodies). Η πρωτεΐνη παρασκευάζεται σε διαλυτή µορφή µε µία αποτελεσµατική διαδικασία αποδιάταξης. Αυτές οι 12

13 πρωτεΐνες χρησιµοποιούνται στη συνέχεια µε τη διαδικασία AutoPan AutoScreen για την παραγωγή των αντισωµάτων. και Ένας τρόπος για να διαπιστώσουµε την έκφραση της πρωτείνης AgX/cDNA καθώς και τη δράση των αντισωµάτων Hucal είναι η ανοσοϊστοχηµεία. Στην εικόνα που ακολουθεί φαίνονται εικόνες ανοσοϊστοχηµείας σε ιστούς από µάτι ποντικιού χρησιµοποιώντας αντισώµατα που δηµιουργήθηκαν από τη βιβλιοθήκη Gold. ( Σχήµα Α.8. Εικόνες ανοσοιστοχηµείας από µάτι ποντικού (µονιµοποίηση σε φορµόλη και σκήνωση του ιστού σε παραφίνη) Αριστερά: Χρήση αντισώµατος Fab-dHLX (dimeric Fab) το οποίο δεσµεύεται στις αντίστοιχες περιοχές. εξιά: Μάρτυρας ( Α Θεραπευτική χρήση των αντισωµάτων Hucal Η τεχνολογία Hucal χρησιµοποιείται για τη δηµιουργία αντισωµάτων για τη θεραπεία ενός ευρέος φάσµατος ασθενειών όπως φλεγµονές, λευχαιµία, καρκίνος του ήπατος και του καρδιαγγειακού συστήµατος, παθήσεις του 13

14 κεντρικού νευρικού συστήµατος. Τέτοια αντισώµατα είναι αυτά που στοχεύουν πρωτεΐνες συγκόλλησης, υποδοχείς κινάσης-τυροσίνης, µόρια του µείζονος συστήµατος ιστοσυµβατότητας (MHC), κιτοκίνες, πρωτεάσες, και αναστολείς πρωτεασών. Προκειµένου να παραχθούν τα αντισώµατα γίνεται πρώτα άµεση ανοσοκαθήλωση του αντίστοιχου αντιγόνου και στη συνέχεια επιλογή του αντισώµατος. Για διαλυτούς παράγοντες, όπως οι κυτοκίνες, µπορούµε να ακινητοποιήσουµε το αντιγόνο σε ένα διάλυµα. (Hawkins et al., Schier et al., 1996a,b). Για παράδειγµα, το αντιγόνο είναι βιοτινυλιωµένο και οι φάγοι που πρόκειται να προσδεθούν είναι καθηλωµένοι σε πιάτα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η βιοτινυλίωση του αντιγόνου να µην επηρεάζει τη λειτουργία του. Παραδείγµατα τέτοιων αντισωµάτων είναι τα εξής: - Αντισώµατα Hucal έναντι της πρωτεάσης MT-SP1. Η µεµβρανικού τύπου πρωτεάση σερίνης (ΜΤ-SP1) έχει υψηλή έκφραση σε ορισµένες καρκινικές σειρές κυττάρων και εµπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου και τη δηµιουργία µεταστάσεων. (Takeuchi et al., 2000, Hooper et al., 2001). Αντισώµατα έναντι αυτής της πρωτείνης χρησιµεύουν τόσο για τη διάγνωση αλλά κυρίως για τη θεραπεία και την πρόγνωση της νόσου. Αντισώµατα έναντι στην ανασυνδυασµένη MT-SP1 επιλέχθηκαν από τη βιβλιοθήκη Hucal-scFv. -Αντισώµατα Hucal έναντι στον αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (FGFR3) Ο ανθρώπινος FGFR3 ανήκει στην οικογένεια των πρωτεινών κινάσηςτυροσίνης, που παίζουν σηµαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Παθολογικές διαταραχές όπως ο νανισµός και η ογκογένεση σχετίζεται µε υπερέκφραση αυτού του παράγοντα. Αντισώµατα έναντι αυτού του παράγοντα επιλέχθηκαν από τη βιβλιοθήκη Hucal-Fab 1. -Αντισώµατα Hucal έναντι της πρωτείνης ICAM -1 O παράγοντας ICAM -1 είναι µία διαµεµβρανική πρωτείνη συγκόλλησης που ελέγχει αλληλεπιδράσεις µεταξύ των λευκοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων κατά τη διάρκεια µιας φλεγµονώδους διαδικασίας. Αποτελεί στόχο σε φλεγµονώδεις νόσους όπως η ψωρίαση και η ρευµατοειδής 14

15 αρθρίτιδα. Τέσσερα αντισώµατα έχουν χαρακτηριστεί από τις βιβλιοθήκες Hucal έναντι του παράγοντα αυτού. Α Εφαρµογή των αντισωµάτων Hucal για ερευνητικούς σκοπούς - Αντισώµατα έναντι των EST (expressed sequence tags). Τα EST είναι περιοχές γονιδίων που αντιπροσωπεύουν την πρώτη ένδειξη για την ύπαρξη και έκφραση ενός γονιδίου. (Adams et al., 1995). Τα αντισώµατα έναντι των πρωτεϊνών που εκφράζονται από τις περιοχές αυτές σε διάφορους ιστούς αποτελεί την µέθοδο εκλογής για τη διαπίστωση της λειτουργίας τους. Οι βιβλιοθήκες Hucal χρησιµεύουν για την παραγωγή αυτών των αντισωµάτων. - Αντισώµατα από τις βιβλιοθήκες Hucal χρησιµεύουν για ερευνητικές µεθόδους όπως ανοσοϊστοχηµεία, Western-blotting, ανοσοκαθήλωση, ELISA, microarrays, καθώς και για ορισµένους τύπους κυτταροµετρίας ροής. Για παράδειγµα, παραδοσιακά χρησιµοποιούνται τα αντισώµατα IGg για την ανοσοιστοχηµεία. Με τη µέθοδο των Hucal αντισωµάτων χρησιµοποιούνται αντισώµατα Fab-dHLX τα οποία παράγονται σε ικανοποιητικές ποσότητες και ταχύτατα σε καλλιέργειες E.coli. Στην παρούσα εργασία δοκιµάστηκαν αντισώµατα Hucal έναντι της κινάσης πρωτεινών σερίνης- αργινίνης SRPK1a. Α.2 Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs) Α.2.1 Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών - χαρακτηριστικά της δοµής τους Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν µια σχετικά νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώµατά τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες που αποτελούν µέρος µιας επαναλαµβανόµενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί 15

16 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθµιση του µατίσµατος του mrna, η µεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταµίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερµιογένεσης, η µεταφορά πολυαµινών µέσα στα κύτταρα και η οµοιόσταση ιόντων (Nikolakaki et al., 2001). Το πρώτο µέλος της οικογένειας το οποίο κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ήταν η ανθρώπινη µορφή της SRPK1, µε βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τους παράγοντες µατίσµατος που περιέχουν στο µόριο τους ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριµένων ακολουθιών παίζει καθοριστικό ρόλο στη συγκρότηση του σωµατιδίου µατίσµατος του RNA (Gui et al., 1994a; Gui et al., 1994b). Μέχρι σήµερα τουλάχιστον δέκα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισµούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες µορφές των SRPK1 (accession No: U09564), SRPK1a (accession No: AJ318054) και SRPK2 (accession No: U88666A) και στο ποντίκι οι µορφές των SRPK1 (accession No: AJ224115), SRPK2 (accession No: AB006036) και SRPK3 (accession No: ΝΜ_019684). Στη ζύµη οι Sky1 (accession No: S55098) (S. cerevisiae) και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το οµόλογο της SRPK1 (accession No: AF01149), στο νηµατοειδές C. elegans η SPK-1 (accession No: AF241656) και στα φυτά το αντίστοιχο οµόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana) (NCBI, Entrez Nucleotide). 16

17 Σχήµα Α.9. Σχηµατική αναπαράσταση των SRPK ποντικού. Τα τρία µέλη της οικογένειας εµφανίζουν µεγάλη οµολογία στις περιοχές µε δράση κινάσης (kinase domain), αλλά διαφέρουν στο Ν-τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή (hinge region). Το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Τα ποσοστά δηλώνουν την οµολογία στην αµινοξική αλληλουχία, ενώ δίνονται και οι αριθµοί των αµινοξέων (Nakagawa et al., 2005). Οι SRPKs των θηλαστικών έχουν το χαρακτηριστικό ότι παρουσιάζουν πολύ µεγάλη οµολογία στην πρωτοταγή τους δοµή, στις περιοχές µε δράση κινάσης (kinase domain), καθώς επίσης και στην εξειδίκευση τους ως προς τα διάφορα υποστρώµατα. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των κινασών αυτών αποτελεί το γεγονός ότι οι περιοχές του µορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από µία ασυνήθιστα µεγάλη αλληλουχία αµινοξέων (Σχήµα Α.9), χαρακτηριστικό πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισµένο σε κινάσες τυροσίνης (Wang et al., 1998). Η µεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αµινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο τόσο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, όσο και στην υποκυτταρική τους κατανοµή (Ding et al., 2006). Ακόµη ένα κοινό χαρακτηριστικό 17

18 τους είναι ότι περιέχουν στο µόριο τους δύο πιθανά σήµατα για την εντόπιση στον πυρήνα (NLS nuclear localization signal), ένα στην αµινοτελική περιοχή ( 11 R-K-K-R-T-K-A-K-K-D-K 21 ) και ένα στο κέντρο του µορίου ( 267 Κ-Κ-Κ-Κ-L-K-K- K-Q-K-R 277 ) (Gui et al., 1994a). Σχήµα Α.10. Σχηµατική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου µατίσµατος της SRPK1a. (Α) Αναπαράσταση της δοµής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 18

19 καθώς και από το τµήµα των 513 bp το οποίο δεν περιλαµβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αµινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a µε την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τµήµα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις µατίσµατος που βρίσκονται στα όρια µεταξύ των εξονίων 1a και 1b και του τµήµατος των 513 bp (Nikolakaki et al., 2001). Οι διαφορές ανάµεσα στα µέλη της οικογένειας που απαντώνται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισµένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε µορίου στην πρωτοταγή του δοµή. Στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού µατίσµατος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η µόνη διαφορά έγκειται στην ύπαρξη µιας εµβόλιµης ακολουθίας από 171 αµινοξέα στο αµινοτελικό άκρο του µορίου αµέσως µετά τα τέσσερα πρώτα αµινοξέα, όπως φαίνεται στο σχήµα Α.2 (Nikolakaki et al., 2001). Η εµβόλιµη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σηµαντικό αριθµό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες µε το µοτίβο L-X-X-L-L ( 148 L-A-P-L-L 152 και 158 L-G-R-L-L 162 ), το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών µε πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης µε διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσµευσης της µε την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγµατος SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1) (Nikolakaki et al., 2001). Στην περίπτωση του µορίου της SRPK2, η οποία αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε µικρές αλλαγές στην αµινοξική ακολουθία στη κεντρική και καρβοξυτελική τους περιοχή. Οι διαφορές αυτές δεν παίζουν σηµαντικό ρόλο στη δραστικότητα και την εξειδίκευση των δύο ενζύµων (πάνω από 90% οµολογία στις περιοχές κινάσης). Επιπλέον, το αµινοτελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες και περιέχει την αµινοξική αλληλουχία P-P-L-P, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισµα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε SH 3 - και WW-περιοχές άλλων πρωτεϊνών (Wang et al., 1998). Κατ αναλογία µε την πρόσθετη αλληλουχία της SRPK1a, η διαφορετική αυτή περιοχή της SRPK2 µπορεί να παίζει το ρόλο ενός 19

20 σήµατος για την αλληλεπίδραση της µε διαφορετικά υποστρώµατα ή άλλα ρυθµιστικά µόρια, σε σύγκριση µε την SRPK1. Πρόσφατες κρυσταλλογραφικές µελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Sky1p της ζύµης S. cerevisiae υπέδειξαν τρία δοµικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητα που παρουσιάζουν τα µέλη της οικογένειας των SRPKs. Για λόγους που ευνοούσαν την κρυστάλλωση του µορίου της Sky1p, δηµιουργήθηκε µια µεταλλαγµένη της µορφή από την οποία είχαν αφαιρεθεί µία µη διατηρηµένη αλληλουχία 137 αµινοξέων στο αµινοτελικό της άκρο, καθώς και η περιοχή που παρεµβάλλεται µεταξύ των δραστικών περιοχών της κινάσης. Η µεταλλαγµένη αυτή µορφή παραµένει ενεργή, παρουσιάζοντας παρόµοια δραστικότητα µε τη φυσιολογική µορφή της κινάσης (Nolen et al., 2001). Η συνολική δοµή του µορίου της Sky1p, όπως φαίνεται στο σχήµα Α.3, είναι παρόµοια µε αυτή που παρουσιάζουν και άλλες κινάσες πρωτεϊνών, έχοντας έναν µικρό λοβό ο οποίος αποτελείται κυρίως από β-ελάσµατα και έναν µεγάλο λοβό αποτελούµενο κυρίως από α-έλικες. Στη φυσιολογική της µορφή η αλληλουχία που παρεµβάλλεται µεταξύ των περιοχών της κινάσης τοποθετείται µεταξύ των ελασµάτων β7 και β8. Τα χαρακτηριστικά που διαφοροποιούν την Sky1p και γενικά όλες τις κινάσες της οικογένειας των SRPK από άλλες κινάσες πρωτεϊνών και είναι πιθανά υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητά που εµφανίζουν είναι τα εξής: i. Η έλικα αc, η οποία σε ορισµένες κινάσες πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για τον έλεγχο της δράσης τους, στην περίπτωση της Sky1p περιλαµβάνει µία επιπλέον αλληλουχία αµινοξέων (αc ) η οποία επεκτείνει τη δοµή της αc κατά µία περιστροφή. Η επιπλέον αυτή περιοχή σταθεροποιεί την αc, φέρνοντας την σε επαφή µε την έλικα αε του µεγάλου λοβού. Η Tyr283 της αε έλικας παίζει σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της δοµής αλληλεπιδρώντας µέσω δεσµών υδρογόνου µε τα αµινοξέα Asn210 και Asp213 της έλικας αc. ii. Οι SRPKs δεν απαιτούν τη φωσφορυλίωση του βρόχου ενεργοποίησης προκειµένου να καταστούν δραστικές. Στη θέση ενός χαρακτηριστικού αµινοξέος Arg που προηγείται του καταλυτικού Asp διαθέτουν µία Thr. 20

21 iii. Προκειµένου τα µόρια των SRPKs να καταστούν ενεργά, αντί της φωσφορυλίωσης του βρόχου ενεργοποίησης, ευνοείται η αλληλεπίδρασή του µε περιοχές του µορίου εκτός της δραστικής περιοχής, οι οποίες σταθεροποιούν το βρόχο σε µία κατάσταση συνεχούς ενεργότητας. Οι SRPKs διαθέτουν µία δοµή στην περιοχή δέσµευσης του υποστρώµατος, η οποία αναγνωρίζει φωσφοσερίνες που βρίσκονται σε P-2 θέση από τη σερίνη που πρόκειται να φωσφορυλιωθεί. Έτσι η µετατόπιση της φωσφορυλιωµένης σερίνης στην περιοχή αυτή και δέσµευση της γειτονικής σερίνης στην καταλυτική περιοχή του ενζύµου, προκαλεί τη διαδοχική φωσφορυλίωση των σερινών του υποστρώµατος (Nolen et al., 2001). Τα παραπάνω δοµικά στοιχεία επιβεβαιώθηκαν µετά από την κρυσταλλογραφική µελέτη και της SRPK1, όπως φαίνεται στο σχήµα Α.4. Για την καλύτερη κρυστάλλωση του µορίου της SRPK1, αφαιρέθηκαν από το µόριό της µία περιοχή 40 αµινοξέων από το Ν-τελικό άκρο και 217 αµινοξέα από τη συνδετική αλληλουχία (aa ). Το µόριο που δηµιουργήθηκε αναφέρεται ως SRPK1 NS1 (Ngo et al., 2005). Η SRPK1 παρουσιάζει υψηλή δοµική οµολογία µε την Sky1p. Παρόλα αυτά διαθέτει και δύο αξιοσηµείωτες διαφορές. Το C-τελικό άκρο της Sky1p περιλαµβάνει µία αλληλουχία 40 αµινοξέων που περιελίσσεται γύρω από την καταλυτική περιοχή (kinase domain) του καρβοξυτελικού άκρου του µορίου, κάτι που δεν υπάρχει στην SRPK1 NS1. Επιπλέον, η συνδετική περιοχή της SRPK1 NS1 δηµιουργεί δύο δοµές α-έλικας, που συµβάλλουν (σχηµατίζουν ένα ασυνεχές τοίχος πλευρικά του ενζύµου, στο οποίο οφείλεται) στη συνεχή ενεργή διαµόρφωση της κινάσης (Ngo et al., 2005). 21

22 Σχήµα Α.11. Κρυσταλλική δοµή τύπου κορδέλας του µορίου της Sky1p. Παρουσιάζεται επίσης η δοµική αναπαράσταση του µορίου της Sky1p ανεστραµµένη κατά 40 µοίρες όπου φαίνονται οι µη καταλυτικές περιοχές της κινάσης (Nolen et al., 2001). Σχήµα Α.12. Κρυσταλλική δοµή τύπου κορδέλας του µορίου της SRPK1 NS1 (Ngo et al., 2005). 22

23 A.2.2 Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Η εξειδίκευση των SRPKs εντοπίζεται στην ύπαρξη µιας επαναλαµβανόµενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα µόρια των υποστρωµάτων τους. Η µεταφορά της γ-φωσφορικής οµάδας του ΑΤΡ γίνεται στις σερίνες των ακολουθιών αυτών. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι SRPKs είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (-R-S-R-S-R-S-). Σε πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης χρησιµοποιώντας ως κινάση την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και υποστρώµατα που περιείχαν µόνο δύο επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόµη έχει δειχτεί ότι η αντικατάσταση της σερίνης από θρεονίνη ή της αργινίνης από λυσίνη στις RS ακολουθίες, έχει ως αποτέλεσµα τη µη φωσφορυλίωση των υποστρωµάτων από την SRPK1 (Wang et al., 1998). Το Ν-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαµίνης Β (LBR Lamin B Receptor) περιέχει κατάλληλη περιοχή διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την SRPK1. Μεταλλάγµατα της περιοχής αυτής, στα οποία είχαν εισαχθεί µε σηµειακές µεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών, έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν την δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίµηση από την πλευρά της κινάσης (Nikolakaki et al., 1996; Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόµη σε in vitro πειράµατα που έγιναν χρησιµοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 µε διάφορους παράγοντες µατίσµατος του mrna που προέρχονται από διαφορετικούς οργανισµούς, έδειξαν ότι οι κινάσες αυτές προτιµούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που είναι τοποθετηµένες ανάµεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αµινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al., 1998). Το µοντέλο ότι οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωµάτων τους, δεν εξηγεί τη φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώµατος. Είναι πιθανό in vivo το υπόστρωµα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από µία άλλη κινάση πρωτεϊνών και 23

24 ακολούθως οι SRPKs να το αναγνωρίζουν και να φωσφορυλιώνουν τις υπόλοιπες σερίνες, ακολουθώντας µία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωµάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPKs, αλλά µε πολύ µικρότερη αποτελεσµατικότητα. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η SRPK1 συνδέεται αρχικά µε τα υποστρώµατά της µέσω µίας αύλακας του µορίου της (docking groove), η οποία αναγνωρίζει το µοτίβο R-X-R/K-X-X-X-R (Ngo et al., 2005). Όταν η αρχική φωσφορυλίωση του υποστρώµατος επιτευχθεί, η SRPK1 συνεχίζει τη φωσφορυλίωση του υποστρώµατος επιδεικνύοντας υψηλότερη δραστικότητα (Nolen et al., 2001). Σε πειράµατα φωσφορυλίωσης του παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2 από την SRPK1 βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση των σερινών της RS ακολουθίας γίνεται διαδοχικά. Όσο διαρκεί η διαδικασία αυτή, το υπόστρωµα παραµένει δεσµευµένο πάνω στο µόριο της κινάσης. Αποδείχτηκε ακόµη ότι από τις 20 σερίνες της RS ακολουθίας, µόνο οι µισές φωσφορυλιώνονται in vitro. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης µάλιστα είναι ανεξάρτητες της ποσότητας του ATP ή της ποσότητας της κινάσης (Aubol et al., 2003). Όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των SRPKs, οι µελέτες που έγιναν χρησιµοποιώντας ως πηγή δράσης την SRPK1 και ως υπόστρωµα τον παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2 έδωσαν µια τιµή Κm 10 µμ για το ΑΤΡ, και µία πολύ µικρή τιµή Κm 0,07 µμ για το υπόστρωµα. Το γεγονός αυτό δείχνει την πολύ µεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώµατά τους (Gui et al., 1994b). A.2.3 Εντοπισµός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς Φθορισµοµετρικός in situ υβριδισµός (FISH) σε ανθρώπινα σωµατικά κύτταρα έδειξε ότι το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται τοποθετηµένο στο χρωµόσωµα 6 (θέση 6p21.2-p21.3), ενώ αντίστοιχα το γονίδιο της SRPK2 στο χρωµόσωµα 7 (θέση 7q22-q31.1). Στο ποντίκι, η χαρτογράφηση των χρωµοσωµάτων έδειξε ότι τα γονίδια των SRPK1 και SRPK2 24

25 βρίσκονται στα χρωµοσώµατα 17 (θέση 17 A3.3) και 5 (θέση cm) αντίστοιχα (NCBI, Entrez Gene; Wang et al., 1999). Στο ποντίκι ακόµη, όπου δεν εκφράζεται η ανθρώπινη ισοµορφή SRPK1a, εκφράζεται η Stk23/SRPK3 (Nakagawa et al., 2005), το γονίδιο της οποίας βρίσκεται στο χρωµόσωµα Χ (θέση X A7.3). Οµόλογη της συγκεκριµένης χρωµοσωµικής περιοχής έχει βρεθεί και στον άνθρωπο, στο χρωµόσωµα Χ (θέση Xq28) (NCBI, Entrez Gene), δεν έχει όµως βρεθεί ακόµη η αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η κατανοµή των µελών της οικογένειας των SRPKs πρωτεϊνικών κινασών στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σηµαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασής τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των SRPKs, χρησιµοποιώντας υβριδισµό κατά Northern µε ιχνηλάτες ραδιενεργά επισηµασµένα τµήµατα των γονιδίων τους, έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται σε µεγαλύτερο βαθµό στους όρχεις, έχοντας µικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύµος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός µυς (Papoutsopoulou et al., 1999b). Παρόµοια εικόνα έδειξε και η µελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όµως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασής της στους διάφορους ιστούς ήταν σηµαντικά µικρότερα (Nikolakaki et al., 2001). Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα, αφού εκφράζεται σε µεγάλο βαθµό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, µέτρια στην καρδιά και το σκελετικό µυ, ενώ παρουσιάζει χαµηλά επίπεδα έκφρασης στον πνεύµονα, το ήπαρ και το νεφρό (Wang et al., 1998). Τέλος, η SRPK3 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό µυ του ποντικού (Nakagawa et al., 2005). Τα παραπάνω αποτελέσµατα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών στους ιστούς των οργανισµών, συµβάλουν στη ρύθµιση των λειτουργιών τους κατά ένα εξειδικευµένο τρόπο στο επίπεδο του κάθε ιστού ξεχωριστά (tissue specific regulation). A.2.4 Υποκυτταρική κατανοµή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνηςαργινίνης 25

26 Η υποκυτταρική κατανοµή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης παρουσιάζει µια αινιγµατική συµπεριφορά. Αν και όλα τα, µέχρι τώρα, γνωστά υποστρώµατα τους είναι πυρηνικές πρωτεΐνες, πειράµατα ανοσοφθορισµού σε καθηλωµένα κύτταρα έδειξαν ότι οι SRPKs παρουσιάζουν µία κυρίαρχη κυτταροπλασµατική εντόπιση, έχοντας ταυτόχρονα ένα πολύ αδύνατο πυρηνικό σήµα (Nikolakaki et al., 2001; Wang et al., 1998). Σε αντίστοιχους φθορισµούς που έγιναν χρησιµοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 ως πρωτεΐνες σύντηξης µε την GFP, το αποτέλεσµα ήταν ανάλογο, αλλά αυτή τη φορά το πυρηνικό σήµα ήταν ξεκάθαρα ορατό (Wang et al., 1998). Μελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Dsk1 της ζύµης S. pompe αποκάλυψαν ότι σε κύτταρα συγχρονισµένα στη µεσόφαση η κυτταροπλασµατική εντόπιση της κινάσης είναι κυρίαρχη. Αντίθετα σε κύτταρα λίγο πριν την είσοδο τους στη µίτωση, το σήµα ανοσοφθορισµού της κινάσης εµφανίζεται έντονα στον πυρήνα, υπονοώντας ότι η διαφορετική κυτταρική εντόπιση των κινασών αυτών κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων του κυτταρικού κύκλου είναι σηµαντική για τις λειτουργίες του κυττάρου (Takeuchi and Yanagida, 1993). Στην περίπτωση της κινάσης πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Sky1p της ζύµης S. cerevisiae, βρέθηκε ότι η µεγάλη ενδιάµεση ακολουθία που χωρίζει τις δραστικές περιοχές της κινάσης παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της υποκυτταρικής της εντόπισης. Χρησιµοποιώντας τόσο τη φυσιολογική, όσο και τη µορφή της κινάσης από την οποία είχε αφαιρεθεί η εν λόγω ακολουθία, βρέθηκε ότι στα κύτταρα που έφεραν τη φυσιολογική µορφή, το κυτταροπλασµατικό σήµα είναι έντονο, σε αντίθεση µε τη µεταλλαγµένη της µορφή η οποία εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρήνα. Μία αρχική υπόθεση για το ρόλο αυτού του εµβόλιµου τµήµατος είναι ότι περιέχει κάποιο σήµα εξόδου από τον πυρήνα (NES-Nuclear Export Signal) (Siebel et al., 1999). Άλλωστε η αντίστοιχη ενδιάµεση ακολουθία της Dsk1 περιέχει ένα αντίστοιχο σήµα που µπορεί να δράσει ως NES και το οποίο εξαρτάται από τον αναστολέα της εξόδου από τον πυρήνα, λεπτοµυκίνη Β (Fukuda et al., 1997). 26

27 Σχήµα Α.13. Υποκυτταρική εντόπιση των ενδογενών (Α) SRPK1 και (Β) SC35 σε µεσοφασικά HeLa κύτταρα, (C) Μίξη των δύο εικόνων (merge). Ο ανοσοφθορισµός έγινε µε τη χρήση µονοκλωνικού αντισώµατος για την SRPK1 από ποντίκι και πολυκλωνικού αντισώµατος για τον παράγοντα µατίσµατος SC35 από κουνέλι (Ding et al., 2006). Σχήµα Α.14. Ο ρόλος της συνδετικής αλληλουχίας και της ενεργής διαµόρφωσης στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1. (Α) SRPK1, (D) ανενεργή SRPK1(K109M), (G) SRPK1- S, που δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία, (J) SRPK1- S(K109M), που είναι και ανενεργή και δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία (Β, E, H, K) παράγοντας µατίσµατος 27

28 SC35 και (C, F, I, L) µίξη των αντίστοιχων εικόνων (merge) (Ding et al., 2006). Πρόσφατες έρευνες από την ερευνητική οµάδα του Dr. X-D Fu έδειξαν αντίστοιχη συµπεριφορά για τις πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/αργινίνης των θηλαστικών. Η ενδογενής SRPK1, σε κύτταρα HeLa, εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασµα, µε ένα κλάσµα της να έχει µία ξεκάθαρη πυρηνική εντόπιση. Το σήµα στον πυρήνα, όπως φαίνεται στο σχήµα Α.5, συνεντοπίζεται µερικά µε τον παράγοντα µατίσµατος SC35. Ακόµη δείχτηκε ότι η SRPK1, σε κύτταρα HeLa, αποκρίνεται στα µονοπάτια µεταφοράς σήµατος κατά τον κυτταρικό κύκλο και εισέρχεται στον πυρήνα, λίγο πριν αυτά εισέλθουν στη φάση Μ (Ding et al., 2006). Η αφαίρεση της συνδετικής αλληλουχίας έχει ως αποτέλεσµα τον εντοπισµό της SRPK1 εξ ολοκλήρου στον πυρήνα. Ακριβώς το ίδιο αποτέλεσµα έχουµε και στην περίπτωση της SRPK2. Σε αντίθεση µε την υπόθεση ότι η περιοχή αυτή περιέχει κάποιο σήµα εξόδου από τον πυρήνα, µελέτες από την ίδια ερευνητική οµάδα έδειξαν ότι η υποκυτταρική εντόπιση εξαρτάται από τη δραστικότητα της κινάσης. Ανενεργή SRPK1, που φέρει τη σηµειακή µετάλλαξη Κ109Μ στην περιοχή δέσµευσης του ΑΤΡ, διατηρεί την κυτταροπλασµατική της εντόπιση, ενώ η ίδια µετάλλαξη, σε SRPK1 που της έχει αφαιρεθεί η συνδετική αλληλουχία, επηρεάζει την κατανοµή και οδηγεί την κινάση τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασµα (σχήµα Α.6). Επιπλέον αποδείχτηκε ότι η υποκυτταρική κατανοµή της SRPK1 είναι ανεξάρτητη της δράσης της λεπτοµυκίνης Β (Ding et al., 2006). Τα παραπάνω δεδοµένα ενισχύουν την άποψη ότι στις SRPKs η συνδετική αλληλουχία λειτουργεί περισσότερο ως «κυτταροπλασµατική άγκυρα» και η έκθεσή της ανάλογα µε τη διαµόρφωση (ενεργή ή ανενεργή) του ενζύµου, είναι αυτή που επηρεάζει την είσοδο στον πυρήνα. Η διαφορετική συµπεριφορά της Dsk1, όπου φαίνεται ότι η αντίστοιχη συνδετική αλληλουχία περιέχει σήµα εξόδου από τον πυρήνα, ίσως οφείλεται στο γεγονός ότι η συγκεκριµένη περιοχή 28

29 των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης δεν είναι αρκετά συντηρηµένη κατά την εξέλιξη (Ding et al., 2006). Οι SRPKs διαθέτουν µια περιοχή οµόλογη της MAPK, όπου δεσµεύονται ορισµένα από τα υποστρώµατά τους, όπως ο ASF/SF2 παράγοντας µατίσµατος (Ngo et al., 2005). Το γεγονός αυτό σε συνδυασµό µε την αλληλεπίδραση των φωσφορυλιωµένων παραγόντων µατίσµατος µε υποδοχείς εισόδου στον πυρήνα, όπως οι TRN-SR1 και 2 (transportin-sr1 και 2) (Lai et al., 2000; Yun et al., 2003), οδήγησε στην υπόθεση ότι η είσοδος των SRPKs στον πυρήνα γίνεται µέσω ενός τριαδικού συµπλόκου, που περιλαµβάνει την κινάση, τους παράγοντες µατίσµατος και τους πυρηνικούς υποδοχείς. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι η υπερέκφραση του ASF/SF2 αυξάνει την πυρηνική εντόπιση της SRPK1 (Ngo et al., 2005). Αντίστοιχα η έξοδος των SRPKs από τον πυρήνα θεωρείται πως γίνεται µέσω των υποφωσφορυλιωµένων παραγόντων µατίσµατος, οι οποίοι συνδέονται µε το mrna (Huang et al., 2004). Η δραστικότητα των SRPKs είναι απαραίτητη κατά την είσοδό τους στον πυρήνα, αλλά όχι και κατά την έξοδο, όπου ίσως αποτελούν συστατικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συµπλόκων, τα οποία εξάγονται στο κυτταρόπλασµα (Ding et al., 2006). A.2.5 Υποστρώµατα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης Παράγοντες µατίσµατος του RNA (SR splicing factors) Τα πιο καλά µελετηµένα υποστρώµατα της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης αποτελούν οι παράγοντες µατίσµατος, οι οποίοι περιέχουν στο µόριο τους επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (SR splicing factors), µε πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγµα τον ASF/SF2. Άλλα µέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ο SC35, ο 9G8 και τέσσερα ακόµα πολυπεπτίδια µε µοριακές µάζες 20, 30, 40, 55 και 75 kda, όπως φαίνονται στο σχήµα Α.7. Άλλες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στη διαδικασία µατίσµατος του RNA και περιέχουν το χαρακτηριστικό µοτίβο των επαναλαµβανόµενων 29

30 διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιµοποιείται για τις έξι προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται µε τις µικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεϊνες (snrnps small nuclear RiboNucleoProteins) όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο αµινοτελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης και δέσµευσης του RNA, RBDs (RNA Binding Domains), ενώ το καρβοξυτελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (Manley and Tacke, 1996). Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εµπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις µε άλλους παράγοντες µατίσµατος και εκτός από την συγκρότηση του σωµατιδίου µατίσµατος, θεωρούνται σηµαντικές και στην περίπτωση του εναλλακτικού τρόπου µατίσµατος των mrnas ρυθµίζοντας την επιλογή της θέσης όπου θα γίνει το µάτισµα (Manley and Tacke, 1996; Valcarcel and Green, 1996). 30

31 Σχήµα Α.15. Σχηµατική αναπαράσταση των δοµικών περιοχών των SR παραγόντων µατίσµατος. ιακρίνονται στο αµινοτελικό άκρο τους µία ή δύο περιοχές δέσµευσης µε το RNA (RBD - κόκκινο ή µπλε) και στο καρβοξυτελικό τους άκρο οι περιοχές των επαναλαµβανόµενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS - πράσινο). Μία συνδετική αλληλουχία πλούσια σε γλυκίνη και σε ορισµένους παράγοντες εκτός της γλυκίνης πλούσια και σε προλίνη ή αργινίνη, φαίνεται µε πορτοκαλί. Ακόµη ο παράγοντας 9G8 µε µοριακή µάζα 35 kda περιέχει µία θέση δέσµευσης ψευδαργύρου (γκρι) (Manley and Tacke, 1996). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης των παραγόντων µατίσµατος είναι η αποσύνδεσή τους από τις θέσεις αποθήκευσης στον πυρήνα (IGCs - Interchromatin Granule Clusters), όπου βρίσκονται συγκεντρωµένοι σε µεγάλα ανενεργά σύµπλοκα. Έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική µορφή τους, είναι δυνατή η µεταφορά τους σε ενεργές περιοχές µεταγραφής στο νουκλεόπλασµα (PFs - Perichromatin Fibrils), όπου και συµµετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριµου mrna (Gui et al., 1994a; Kuroyanagi et al., 1998; Yeakley et al., 1999). Επίσης, η φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος από την οικογένεια των SR πρωτεϊνικών κινασών, επάγει τις µεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύµπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας µατίσµατος του mrna (Gui et al., 1994a; Yue et al., 2000). Στην ικανότητα των SR πρωτεϊνικών κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συµπλόκου, συνηγορούν και δεδοµένα τα οποία δείχνουν ότι µε µη φωσφορυλιωµένους παράγοντες µατίσµατος ή µε την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύµπλοκο δεν συγκροτείται και το µάτισµα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (Cao et al., 1997). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιµη µε προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων µατίσµατος. Αφού όµως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συµπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος ώστε το σωµατίδιο µατίσµατος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία. Αυτό 31

32 προκύπτει από το γεγονός ότι η παρουσία µεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, µετά την συγκρότηση του συµπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του µατίσµατος του mrna (Cao et al., 1997). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει την λειτουργικότητα του συµπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι ένα ακόµη σηµείο που καταδεικνύει την σηµασία της ρυθµιζόµενης δραστικότητας των SR πρωτεϊνικών κινασών. Η δράση τους είναι απαραίτητη µόνο κατά τα αρχικά της στάδια του µατίσµατος, αφού παρατεταµένη φωσφορυλίωση οδηγεί σε αναστολή της καταλυτικής διαδικασίας (Cao et al., 1997; Valcarcel et al., 1996; Wang et al., 1998; Xiao and Manley, 1997). Άλλο ένα αποτέλεσµα που συνηγορεί την παραπάνω θεώρηση, είναι η ανώµαλη φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος και η ανικανότητα δηµιουργίας λειτουργικού συµπλόκου µατίσµατος κατά την αλληλεπίδραση της SRPK1 µε την πρωτεΐνη ICP27 του HSV-1 (Herpes Simplex Virus) (Sciabica et al., 2003). Τέλος, η φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος από το κυτταροπλασµατικό κλάσµα των SR πρωτεϊνικών κινασών επάγει τη µεταφορά τους από το κυτταρόπλασµα, όπου συντίθενται, στον πυρήνα. Ταυτόχρονα ρυθµίζεται και η ενδοπυρηνική τους εντόπιση στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές του πυρήνα (Yeakley et al., 1999). Στο σηµείο αυτό πρέπει να σηµειωθεί ότι στη ζύµη S. cerevisiae, η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εµπλέκεται στη δέσµευση και µεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθµίζεται η είσοδος της συγκεκριµένης πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p µε τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (Gilbert et al., 2001). Υποδοχέας της λαµίνης Β (LBR - Lamin B Receptor) Ο υποδοχέας της λαµίνης Β (LBR, p58), είναι µία πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής µεµβράνης του πυρηνικού φακέλου. Ανάλυση της πρωτοταγούς δοµής του έδειξε ότι αποτελείται από 8 υδρόφοβες διαµεµβρανικές περιοχές που διαπερνούν την εσωτερική πυρηνική µεµβράνη, καθώς και δύο 32

33 υδρόφιλες περιοχές στο αµινοτελικό και καρβοξυτελικό του άκρο αντίστοιχα, τα οποία εκτείνονται προς το πυρηνόπλασµα (Worman et al., 1990, Ye and Worman, 1994). Αν και δεν έχει γίνει συστηµατική µελέτη των διαµεµβρανικών τµηµάτων της πρωτεΐνης και του καρβοξυτελικού της άκρου, οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά του αµινοτελικού της άκρου έχουν µελετηθεί διεξοδικά. Το αµινοτελικό του υποδοχέα της λαµίνης Β αποτελείται από µία ακολουθία 208 αµινοξέων και έχει σφαιρικό (globular) σχήµα. Στο τµήµα αυτό περιέχονται το σήµα πυρηνικού εντοπισµού της πρωτεΐνης (NLS), ακολουθίες αµινοξέων οι οποίες είναι ικανές να φωσφορυλιωθούν από την πρωτεϊνική κινάση Α και την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, µία περιοχή επαναλαµβανόµενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS domain), καθώς και πιθανές περιοχές δέσµευσης του DNA (Appelbaum et al., 1990, Nikolakaki et al., 1997, Nikolakaki et al., 1996, Simos and Georgatos, 1992, Soullam and Worman, 1993). Ακόµη το αµινοτελικό άκρο του LBR είναι ικανό να δεσµεύσει την λαµίνη τύπου Β, γεγονός που εξηγεί και την ονοµασία της πρωτεΐνης (Simos and Georgatos, 1992, Worman et al., 1988, Ye and Worman, 1994). Η RS ακολουθία του αµινοτελικού άκρου του LBR περιλαµβάνει πέντε επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης ( 75 RSRSRSRSRS 84 ) και όλες οι σερίνες της φωσφορυλιώνονται από την SRPK1 (Mylonis et al., 2004, Nikolakaki et al., 1996). Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση του LBR µε άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα όπως η πρωτεΐνη p32/p34, οι ιστόνες Η3 και Η4 (Polioudaki et al., 2001) και η πρωταµίνη 1 (Mylonis et al., 2004). Ακόµη έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του LBR από την SRPK1 επάγει τη δέσµευση χρωµατίνης στον LBR (Takano et al., 2004). Πρωταµίνη P1 Ένα άλλο υπόστρωµα των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελεί η πρωταµίνη P1. Οι πρωταµίνες Ρ1 είναι πολύ βασικά, χαµηλού µοριακού βάρους πολυπεπτίδια µε ισοηλεκτρικό σηµείο µεγαλύτερο του 11 (τα µισά τους αµινοξέα αποτελούνται από αργινίνες). Είναι πρωτεΐνες πολύ 33

34 συντηρηµένες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και διαιρούνται σε δύο κατηγορίες αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες και συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα µαρσιποφόρα, και αυτές των θηλαστικών µε πλακούντα που περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηµατίζουν ενδοµοριακούς δισουλφιδικούς δεσµούς που σταθεροποιούν τη δοµή τους (Oliva and Dixon, 1991). Και οι δύο κατηγορίες των Ρ1 πρωταµινών περιλαµβάνουν στο µόριο τους επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από τις SRPKs (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ο ρόλος των πρωταµινών είναι η αντικατάσταση των ιστονών κατά τη διάρκεια της σπερµατογένεσης µε αποτέλεσµα να προκύπτει χρωµατίνη µε πολύ υψηλό βαθµό συµπύκνωσης (Oliva and Dixon, 1991). Κατά τα αρχικά στάδια της σπερµατογένεσης οι πρωταµίνες φωσφορυλιώνονται στοιχειοµετρικά, ενώ αργότερα στα ώριµα σπερµατοζωάρια αποφωσφορυλιώνονται στο µεγαλύτερο µέρος τους (Chirat et al., 1993; Oliva and Dixon, 1991). Παλιότερα είχε προταθεί ότι ο ρόλος της φωσφορυλίωσης διευκολύνει τη σωστή σύνδεση των πρωταµινών µε το DNA, ενώ η αποφωσφορυλίωση τους κατά τα τελικά στάδια της σπερµατογένεσης οδηγεί πιθανότατα σε µία περαιτέρω συµπύκνωση της χρωµατίνης (Chirat et al., 1993). Στη συνέχεια διατυπώθηκε η άποψη ότι επειδή υπάρχει µεγάλη συγκέντρωση πρωταµινών και άλλων βασικών πρωτεϊνών γύρω από το DNA, η φωσφορυλίωση σε συγκεκριµένες θέσεις στο µόριο των P1 πρωταµινών µειώνει τις δυνάµεις απώθησης µεταξύ γειτονικών θετικών φορτίων (Papoutsopoulou et al., 1999a). Πρόσφατα όµως αποτελέσµατα µας οδηγούν στο συµπέρασµα ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταµίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της µε τον πυρηνικό φάκελο (Mylonis et al., 2004). εδοµένου δε ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταµίνες γίνεται στην πυρηνική περιφέρεια, η φωσφορυλίωση της P1 πρωταµίνης και η συνεπακόλουθη εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, µάλλον συνεισφέρει στη διαδικασία αντικατάστασης. Α.2.6 Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης 34

35 Η οµόλογη της SRPK1 στη ζύµη S. cerevisiae, η Sky1p, εµπλέκεται στη ρύθµιση της µεταφοράς πολυαµινών στο κύτταρο καθώς και στην οµοιόσταση ιόντων (Erez and Kahana, 2001). Μεταλλαγµένα κύτταρα ζύµης, όπου έγινε ανενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν µεγάλη ανθεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερµίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε µετά από επιµόλυνση των κυττάρων µε το γονίδιο που κωδικοποιεί την Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο µε επιµόλυνσή τους µε ένα µεταλλαγµένο γονίδιο που εκφράζει µια µη λειτουργική µορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξηµένη ευαισθησία στην σπερµίνη. Η ανενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύµης προκάλεσε ακόµη µειωµένη πρόσληψη σπερµιδίνης και πουτρεσκίνης. Η ίδια µεταλλαγµένη µορφή των κυττάρων έδειξε και µία µεγάλη ανεκτικότητα στα ιόντα λιθίου και νατρίου (Erez and Kahana, 2001). Ένα άλλο µέλος της οικογένειας αυτής των κινασών, η SPK-1 στο νηµατοειδές C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων. Η SPK-1 δεσµεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνη CeSF2 in vitro. Η κινάση αυτή και το υπόστρωµα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηµατοειδούς και παίζουν σηµαντικό ρόλο κατά την διάρκεια του εµβρυϊκού σταδίου του C. elegans (Kuroyanagi et al., 2000). Τέλος, η SRPK1 έχει αποµονωθεί ως σύµπλοκο µε την τοποϊσοµεράση ΙΙa, δύο ATPάσες/ελικάσες (RNA helicase A και RHII/Gu), δύο παράγοντες µατίσµατος του RNA (PRP8 και hnrnp C) και µια HMG πρωτεΐνη (SSRP1) (Lee et al., 2004). Το σύµπλοκο αυτό, το οποίο ονοµάστηκε τοποσωµάτιο (toposome), φαίνεται να συγκροτείται κυρίως κατά τη G2/M φάση ενώ κατά τη G1/S φάση, οι συστατικές του πρωτεΐνες εµφανίζουν πολύ χαµηλή αλληλεπίδραση µεταξύ τους. Το τοποσωµάτιο θεωρείται µερικώς υπεύθυνο για το διαχωρισµό των αδελφών χρωµατίδων. Τα παραπάνω δεδοµένα δείχνουν ότι το συγκεκριµένο σύµπλοκο είναι δυναµικό και ότι ο σχηµατισµός ή/και η ενεργοποίησή του εξαρτώνται άµεσα από τον κυτταρικό κύκλο (Lee et al., 2004). 35

36 B. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ B.1 Υλικά B.1.1 Ένζυµα και υλικά µοριακής βιολογίας Tα ένζυµα µοριακής βιολογίας που χρησιµοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας New England BioLabs Inc. (Beverly, MA, USA) και της Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) σε βακτήρια χρησιµοποιήθηκαν ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρίας Amersham-Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Tα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τα ακόλουθα: τα Hucal αντισώµατα της εταιρείας AbD serotec, το πολυκλωνικό αντίσωµα anti-srpk1a (αναπτύχθηκε απέναντι στην εµβόλιµη ακολουθία των 171 αµινοξέων στο Ν-τελικό άκρο της SRPK1a, ανοσοκατακρηµνίζει εξειδικευµένα την SRPK1a και όχι την SRPK1, δεν είναι λειτουργικό όµως σε Western blot ανάλυση) και το µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στο επίτοπο FLAG (anti-flag, M5, Sigma-Aldrich). Τα δεύτερα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν rabbit anti-mouse και goat anti-rabbit της εταιρείας Chemicon International Inc. (Temecula, CA USA), καθώς και goat anti-human της εταιρείας AbD serotec, όλα συζευγµένα µε αλκαλική φωσφατάση. Η κλωνοποίηση των SRPK1/SRPK1a στον πλασµιδιακό φορέα pflag- CMV-2 καθώς και η κλωνοποίηση των SRPK1 και του αµινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαµίνης Β (LBRNt) στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t είχε γίνει παλιότερα από την Επίκουρο Καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη (Papoutsopoulou et al., 1999α, Nikolakaki et al., 1996, Nikolakaki et al., 2001). Β.1.2 Βιολογικά υλικά Για τα πειράµατα χρησιµοποιήθηκαν η κυτταρική καρκινική σειρά 293T, που είναι επιθηλιακά κύτταρα νεφρού ανθρώπινου εµβρύου, στα οποία έχει 36

37 εισαχθεί το θερµοευαίσθητο γονίδιο που κωδικοποιεί το SV40 T αντιγόνο. Τα 293Τ κύτταρα αναπτύσσονται δηµιουργώντας µία µονοστοιβάδα στην επιφάνεια του τριβλίου. Ο πολλαπλασιασµός του πλασµιδιακού DNA έγινε µε τη χρήση των στελεχών E. coli TOP-10 και TOP-10F (Invitrogen Life Technologies). Για την υπερέκφραση βακτηριακών πρωτεϊνών χρησιµοποιήθηκαν τα E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies). Β.2 Χηµικά αντιδραστήρια - Υλικά χρωµατογραφίας Όλα τα χηµικά αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προµηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, MI, USA), Serva (Heidelberg, Germany) και Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι µεµβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Το ισότοπο γ- 32 Ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol, ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Τα ακτινογραφικά φιλµ που χρησιµοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες ήταν του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εµφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλµ ήταν αντίστοιχα: X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρείας. Για τον καθαρισµό των πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST), χρησιµοποιήθηκε υλικό χρωµατογραφίας αγχιστείας (σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης), της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd. (Buckinghamshire, UK), ενώ για τις ανοσοκατακρηµνίσεις protein A σεφαρόζη της ίδιας εταιρίας. Β.3 Μέθοδοι Β.3.1 Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων 37

38 Τα στελέχη E. coli BL21(DE3), TOP-10 και TOP-10F αναπτύσσονται σε θρεπτικό υπόστρωµα L.B., (Luria- Bertani) (Sambrook et al., 1989), του οποίου η σύσταση περιγράφεται στον παρακάτω πίνακα. Η ρύθµιση της οξύτητας γίνεται µε τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση µιας Atm, για 30 min. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, µε έντονη ανάδευση, χρησιµοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων TOP-10 και TOP-10F γίνεται σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση φαίνεται επίσης στον πίνακα που ακολουθεί. Θρεπτικό υλικό LB Θρεπτικό υλικό TYM Εκχύλισµα ζύµης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 1.0 % w/v NaCl 1.0 % w/v Εκχύλισµα ζύµης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 2.0 % w/v NaCl 0.1 M MgSO 4 10 mm Πίνακας Β.1. Σύσταση των θρεπτικών υλικών LB και TYM. Β.3.2 Ιστοκαλλιέργειες Τα κύτταρα 293Τ διατηρήθηκαν στην αναπτυξιακή τους φάση σε θρεπτικό υγρό DMEM, που περιέχει 10% ορό εµβρύου µοσχαριού (FΒS) και µίγµα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη µυκήτων και µικροβίων. Έτσι αναπτύχθηκαν σε τριβλία πολυστυρενίου σαν µονοστιβάδα (monolayer cultures), σε επωαστήρα στους 37 o C, µε ατµόσφαιρα 5% CO 2 και κορεσµένη σε υγρασία (95%). Οι κυτταροκαλλιέργειες αραιώνονταν σε τακτά χρονικά διαστήµατα

39 ηµερών, υπό ασηπτικές συνθήκες, έτσι ώστε να διατηρούνται οι πληθυσµοί σε εκθετική φάση ανάπτυξης. Πριν από τη διαδικασία της αραίωσης των κυττάρων, οι καλλιέργειες επωάζονται για 15 λεπτά µε 0,5% τρυψίνη και 0,02% (τετρανατριούχο) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) για την αποκόλλησή τους. Στη συνέχεια αραιώνονται έτσι ώστε η συγκέντρωσή τους να διατηρείται µεταξύ 5x10 4-8x10 5 κύτταρα/ml θρεπτικού υγρού. Η µέτρηση του αριθµού των κυττάρων γίνεται µε τη µέθοδο του αιµατοκυτταρόµετρου (Neübauer) κάτω από µικροσκόπιο (100x) (American Optical Corp., USA) και έτσι προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. Β.3.3 Έκφραση και καθαρισµός πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα µε υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισµό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισµα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασµιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο µόριο τους κατάλληλους προαγωγούς που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης µ αυτήν. Ο καθαρισµός της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται µε στήλη αγχιστείας που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωµένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισµός της πρωτεΐνης από το εκχύλισµα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST µε τη γλουταθειόνη, µε αποτέλεσµα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται µε την προσθήκη διαλύµατος γλουταθειόνης σε περίσσεια. Η διαδικασία αυτή έκλουσης εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτηµα να γίνεται σε πολύ ήπιες συνθήκες χωρίς να υπάρχει κίνδυνος αλλαγών στη δοµή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης. Συγκεκριµένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν µε τον τρόπο αυτό είναι το τµήµα της SRPK1a που περιέχει τα αµινοξέα (GST-SRPK1a(1-171)), που 39

40 δεν περιέχονται στο µόριο της SRPK1, και το αµινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαµίνης Β (LBRNt). Σε όλες τις περιπτώσεις χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα BL21(DE3) που έχουν µεταµορφωθεί µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα απλώνονται σε τριβλία µε θρεπτικό υλικό L.B./άγαρ που περιέχει 100 µg/ml αµπικιλλίνη και επωάζονται για 16 h στους 37 C. Με επιλογή µιας αποικίας από το τριβλίο, εµβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού L.B. (100 µg/ml αµπικιλλίνη) και το αιώρηµα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 h στους 37 C. Από την καλλιέργεια που προκύπτει αφαιρούνται 10 ml µε τα οποία εµβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού L.B. που περιέχουν 100 µg/ml αµπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C µέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήµατος των κυττάρων γίνει ίση µε Α 590 = Τη δεδοµένη χρονική στιγµή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG που ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση µε τις άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες, καθώς και ελάττωση της θερµοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις πρωτεολυτικών ενζύµων. Η επώαση συνεχίζεται για 2-3 h και τα κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση στα 4000xg για 15 min. Μετά την απόχυση του υπερκειµένου το ίζηµα των κυττάρων αιωρείται σε 8 ml διαλύµατος PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, 1% Triton X-100, 0.1% β-µερκαπτοαιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρηµα σε υπέρηχους (UP5OH sonicator) για 5 χρονικά διαστήµατα των 20 δευτερολέπτων, µεσολαβώντας κάθε φορά, µία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρµανση. Το αιώρηµα φυγοκεντρείται για 20 min στα 8500xg και λαµβάνεται το υπερκείµενο πρωτεϊνικό εκχύλισµα. Το εκχύλισµα αυτό αναµιγνύεται µε το αιώρηµα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 min σε θερµοκρασία 4 C, ώστε να δεσµευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 min στα 3000xg και αφού αποµακρυνθεί το υπερκείµενο, η στήλη πλένεται 3 φορές µε διάλυµα PBST για 10 min στους 4 C υπό ανάδευση. 40

41 Στους κόκκους της στήλης που λαµβάνονται µετά από φυγοκέντρηση στα 3000xg για 2 min, γίνονται 2 συνεχόµενες εκλούσεις των 5 min η κάθε µία µε διάλυµα που περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris-Cl ph 8.0. Τα εκλούσµατα που περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης λαµβάνονται µε φυγοκέντρηση στα 3000xg για 2 min και στη συνέχεια φυλάσσονται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης µετά από κάθε χρήση αναγεννάται µε τρείς διαδοχικές πλύσεις (30 min η κάθε πλύση) σε όξινο (0.1 M CH 3 COONa, 0.5 M NaCl, ph 4.5) και βασικό (0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-Cl, ph 8.5) διάλυµα, στους 4 C. Στη συνέχεια η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυµα PBST. Β.3.4 Παροδική επιµόλυνση κυττάρων Η µέθοδος αυτή χρησιµοποιείται για την εισαγωγή πλασµιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων ως πρωτεϊνών σύντηξης µε χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιµες. Η παροδική επιµόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή µίξη του πλασµιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυµα CaCl 2 µε ρυθµιστικό διάλυµα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσµα της ανάµιξης είναι η κατακρήµνιση του DNA µε το φωσφορικό ασβέστιο. Τα ιζήµατα αυτά DNA/φωσφορικού ασβεστίου διαπερνούν την κυτταροπλασµατική µεµβράνη πιθανώς µε ενδοκύττωση. Η µέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις µεταβολές του ph (βέλτιστο ph ) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εµπορικά kit καθαρισµού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρµογή της µεθόδου). Ο κλωνοποιηµένος πλασµιδιακός φορέας εντοπίζεται εκτός του γενώµατος των κυττάρων, ενώ η ανίχνευση της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το κλωνοποιηµένο γονίδιο είναι δυνατή για χρονικό διάστηµα 1-4 ηµερών. Επίσης σε κάθε κυτταρική διαίρεση µόνο τα µισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασµιδιακού DNA που εισήχθη µε την επιµόλυνση των κυττάρων (Chen and Okayama, 1987). 41

42 Σχήµα Β.1. Σχηµατική αναπαράσταση της παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων µε τη µέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν ανθρώπινα 293Τ κύτταρα, τα οποία επιµολύνθηκαν παροδικά µε τα γονίδια της SRPK1 και της SRPK1a κλωνοποιηµένα στον πλασµιδιακό φορέα pflag-cmv-2. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιµόλυνση πρέπει να καταλαµβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλίου. Το διάλυµα του DNA µε το CaCl 2 (250 mm CaCl 2, 20 µg/ml πλασµιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 µg/ml περιλαµβάνουν το κλάσµα του DNA που φέρει το κλωνοποιηµένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθµιστικού διαλύµατος HEPES-φωσφορικών (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na 2 HPO 4 ph 7.1). Το µίγµα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήµνιση του DNA µε το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως αποµακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1 ml του αιωρήµατος DNA-φωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τριβλίο της καλλιέργειας. Τα τριβλία αφήνονται στον επωαστήρα για 20 λεπτά µε παροδική ανακίνηση. Στη συνέχεια σε κάθε τριβλίο προστίθενται 4 ml DMEM /10% v/v FBS, 5 µl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυµα που διασπούν το DNA, καθώς και µίγµα αντιβιοτικών που 42

43 αναστέλλει την ανάπτυξη µυκήτων και µικροβίων. Τα τριβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία CO 2. Μετά από τέσσερις ώρες αφαιρούνται τα 5 ml του υγρού που έγινε η επιµόλυνση και προστίθενται εκ νέου 10 ml θρεπτικού µέσου. Η καλλιέργεια αφήνεται στον επωαστήρα στους 37 C σε ατµόσφαιρα CO 2 για 24 ώρες και ακολουθεί αλλαγή του θρεπτικού µέσου και επώαση για άλλες 24 ώρες. Με την συµπλήρωση συνολικά 48 ωρών από την στιγµή της επιµόλυνσης τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό µέσο ανάπτυξης και ακολουθεί η λύση τους. Β.3.5 Παρασκευή εκχυλισµάτων από 293T κύτταρα Tα Κ562 κύτταρα συλλέχθηκαν αφαιρώντας αρχικά το υγρό µέσο ανάπτυξης, µετά από φυγοκέντρηση στις 1200 στροφές/λεπτό. Έπειτα, ακολούθησε ένα πλύσιµο µε ρυθµιστικό διάλυµα PBS, ph 7,4 (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O). Τα 293Τ κύτταρα συλλέχθηκαν µετά από αφαίρεση του θρεπτικού υγρού από τα τριβλία και αιώρηση των κυττάρων σε 1 ml διαλύµατος PBS, µε τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter). Στο ίζηµα των κυττάρων που λήφθηκε µετά από φυγοκέντρηση, προστέθηκε µία ποσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης (1% Triton X-100, 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 150 mm NaCl και 1 mm PMSF). Συγκεκριµένα, για τη διατήρηση της αναλογίας του αριθµού των κυττάρων σε κάθε εκχύλισµα προστέθηκαν 200 µl διαλύµατος λύσης για 10 7 κύτταρα. Τα αιωρηµένα κύτταρα παρέµειναν για 10 λεπτά στον πάγο, στο διάλυµα λύσης και κατόπιν διαβιβάστηκαν µέσα από σύριγγα ινσουλίνης (1 ml), ώστε να σπάσει κατά το δυνατόν το µακροµοριακό DNA. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα x g, για 15 λεπτά στους 4 C και συλλογή του υπερκείµενου. Το κυτταρικό εκχύλισµα φυλάσσεται στους 70 C. Β.3.6 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου (PAGE) Ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών ενός δείγµατος πραγµατοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισµένα µόρια, κινούνται διαµέσου των πόρων ενός 43

44 πηκτώµατος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωµα εξαρτάται από τη διαφορά δυναµικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύµφωνα µε την εξίσωση: v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από τη µάζα και το σχήµα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώµατος µέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηµατισµός των πηκτών πολυακρυλαµιδίου βασίζεται στον πολυµερισµό του ακρυλαµιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του Ν,Ν µεθυλενοδισακρυλαµιδίου ή bis-ακρυλαµιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO- CH-CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δηµιουργείται ένα πολυµερές πλέγµα που διαθέτει πόρους που το µέγεθος τους εξαρτάται από το βαθµό πολυµερισµού ανάλογα και µε τη συγκέντρωση των µονοµερών στο διάλυµα. Η δηµιουργία του πλέγµατος γίνεται µέσω του µηχανισµού των ελευθέρων ριζών µε την προσθήκη του υπερθειϊκού αµµωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8 για την έναρξη του µηχανισµού και του φωτοχηµικού καταλύτη τετραµεθυλοαιθυλενοδιαµίνη (TEMED) για τη διάδοση του. Το σχήµα των πηκτωµάτων πολυακρυλαµιδίου µπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα µε τη συσκευή στην οποία θα πραγµατοποιηθεί ο πολυµερισµός. Η ηλεκτροφόρηση µπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στη συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιµοποιείται το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιµοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώµατα, το πήκτωµα επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για τη συµπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγµατος σε µια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωµα διαχωρισµού που είναι υπεύθυνο για το διαχωρισµό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους µέσα σ αυτό. Τα διαλύµατα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώµατα είναι διαφορετικά ως προς το ph και τη σύσταση τους. Επίσης το ρυθµιστικό διάλυµα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούµενα. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου µπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το 44

45 απορρυπαντικό SDS (µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου). Απουσία τέτοιων παραγόντων (µη µετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαµορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαµβάνουν τυχαία διαµόρφωση. Β.3.7 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπό µετουσιωτικές συνθήκες (SDS- PAGE) Σύµφωνα µε την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών µε βάση το µοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιµοποιείται ως αποδιατακτικό µέσο το µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσει τις πρωτεΐνες δεσµεύεται πάνω σ αυτές µέσω υδρόφοβων δεσµών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισµένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύµπλοκα που σχηµατίζονται από την αλληλεπίδραση µε το SDS είναι επιµήκη, µε σαφή και καθορισµένη δοµή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά µονάδα µάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναµικές ιδιότητες είναι συνάρτηση µόνο του µοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι µοναδική συνάρτηση του µοριακού βάρους. Το σύστηµα που χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων κατά τη διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωµα διαχωρισµού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωµα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωµα διαχωρισµού. Οι θέσεις εισαγωγής του δείγµατος δηµιουργούνται µε τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής µήτρας η οποία αφαιρείται µετά τον πολυµερισµό του πηκτώµατος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιµέρους στοιχείων του συστήµατος είναι οι εξής: ιάλυµα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris 0.19 M γλυκίνη 0.1% SDS ph

46 Πήκτωµα επιστοίβαξης: για τον πολυµερισµό 5% ακρυλαµίδιο 0.25% bis-ακρυλαµίδιο 0.5% SDS Μ Tris-Cl ph % APS 0.04% TEMED Πήκτωµα διαχωρισµού: 12% ακρυλαµίδιο 0.62% bis-ακρυλαµίδιο 0.5% SDS Μ Tris-Cl ph 8.9 για τον πολυµερισµό 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγµατα πριν εισαχθούν στο πήκτωµα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων το οποίο αποτελείται από: Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανούν της βρωµοφαινόλης Το παραπάνω διάλυµα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 µl του διαλύµατος αυτού σε 25 µl του µίγµατος επώασης. Τα δείγµατα θερµαίνονται για 3 min στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δηµιουργία συµπλόκων SDSπρωτεΐνης. Η β-µερκαπτοαιθανόλη που χρησιµοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσµούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υποµονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύµατος 30 ma έως τη στιγµή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. 46

47 Β.3.8 Βαφή µε Coomassie Brilliant Blue R-250 Για να βαφούν οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή εµβαπτίζεται σε διάλυµα που περιέχει 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% µεθανόλη, όπου και ανακινείται για διάστηµα 1 h. Στο διάλυµα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωµατισµός της πηκτής γίνεται µε ανακίνηση σε διάλυµα 10% οξικό οξύ, 10% µεθανόλη. Β.3.9 Αυτοραδιογραφία Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεµπόµενη ακτινοβολία του ισοτόπου που χρησιµοποιείται για την επισήµανση των διάφορων µορίων. Στην περίπτωση των πηκτωµάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωµα ανακινείται για 30 min σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3MM (Whatman International Ltd. Kent, England) υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάµους. Μία πρώτη εκτίµηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται µας δίνει η µέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger series 900 (Mini Instruments, Essex, UK). Η εµφάνιση και στερέωση του film γίνεται µε εµβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα. Β.3.10 Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε µεµβράνη (Western Blot) Η ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαµιδίου σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη µορφή συµπλόκου µε το SDS και είναι αρνητικά φορτισµένες, 47

48 από την πηκτή προς τη µεµβράνη κατά την εφαρµογή διαφοράς δυναµικού και στον εγκλωβισµό τους στο πλέγµα της µεµβράνης. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η µεµβράνη και η πηκτή µεταφέρονται σε ρυθµιστικό διάλυµα µεταφοράς (Transfer Buffer) το οποίο αποτελείται από: 12.5 mm Tris-Βορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT. Η τοποθέτηση της στη συσκευή ηλεκτροµεταφοράς γίνεται ανάµεσα σε τρία χαρτιά Whatman 3MM µε τη µεµβράνη προσανατολισµένη στο θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή µεταξύ της πηκτής και της µεµβράνης πρέπει να είναι άµεση και χωρίς την παρεµβολή φυσαλίδων που παρεµποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύµατος. Η συσκευή που χρησιµοποιήθηκε ήταν το µοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter της εταιρίας Hoeffer. Η µεταφορά γίνεται για h κάτω από σταθερή ένταση ρεύµατος ( ma ανάλογα µε το µέγεθος της πηκτής και των πρωτεϊνών που πρόκειται να µεταφερθούν). Β.3.11 Ανοσοανίχνευση Η ανοσοανίχνευση είναι µια τεχνική που επιτρέπει τον εντοπισµό µιας καθηλωµένης σε µεµβράνη πρωτεΐνης µε τη βοήθεια αντισώµατος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωµένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει µε το αντίσωµα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται µε τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώµατος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσµευθεί µε τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο µόριο του συζευγµένο κάποιο ένζυµο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας µε εξωγενώς προστιθέµενο υπόστρωµα δίνει χαρακτηριστική χρωµοαντίδραση καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου. Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρµόσθηκε για την ταυτοποίηση του επιπλέον τµήµατος της SRPK1α (είτε ως πεπτίδιο που είχε συντεθεί από την εταιρεία AbD serotec, είτε ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST) καθώς και των ολόκληρων SRPK1α και SRPK1, όταν εκφράστηκαν σε 293Τ κύτταρα φέροντας στο αµινο-τελικό τους άκρο το επίτοπο FLAG. Χρησιµοποιήθηκαν τα Hucal αντισώµατα, το πολυκλωνικό αντίσωµα anti- 48

49 SRPK1a, καθώς και το µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στο επίτοπο FLAG. Τα δεύτερα αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε ήταν τα rabbit anti-mouse και goat antirabbit της εταιρείας Chemicon International Inc., που είναι συζευγµένα µε αλκαλική φωσφατάση, καθώς και το goat anti-human της εταιρείας AbD serotec που είναι επίσης συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση. Η διαδικασία που εφαρµόζεται, είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Αρχικά η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης µετά το τέλος της ηλεκτροµεταφοράς εµβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 h σε διάλυµα κορεσµού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), ώστε να κορεστεί η µεµβράνη από τη ζελατίνη και να αποφύγουµε τις µη εξειδικευµένες αλληλεπιδράσεις της µεµβράνης µε το αντίσωµα. Κατόπιν η µεµβράνη επωάζεται µε το αντίστοιχο αντίσωµα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύµατος κορεσµού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 h στους 4 C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 min στη µεµβράνη µε διάλυµα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της µεµβράνης για 1 h υπό ανάδευση σε θερµοκρασία περιβάλλοντος µε το δεύτερο αντίσωµα (αραίωση 1 : 2000) σε διάλυµα κορεσµού. Αφού η µεµβράνη υποστεί 2 πλύσεις των 10 min µε PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωµοαντίδραση µε την αλκαλική φωσφατάση έως ότου εµφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωµοαντίδραση επιτυγχάνεται µε την προσθήκη 30 µl BCIP (Bromochloroindolyl phosphate) και 30 µl NBT (Nitro Blue Tetrazolium) σε 10ml διαλύµατος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-Cl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Η µεµβράνη αφού πλυθεί 2 φορές µε ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο µέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3. Β.3.12 Ανοσοκατακρήµνιση Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης Α (Protein A) του µικροοργανισµού staphylococcus aureus να δεσµεύεται στις ανοσοσφαιρίνες. Σύµφωνα µε την τεχνική, η επώαση πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος µε συγκεκριµένο αντίσωµα σε κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα, θα έχει ως 49

50 αποτέλεσµα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωµα και τη συµπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του παραπάνω µίγµατος σε στήλη σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, εξισορροπηµένης στο ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα, θα έχει ως αποτέλεσµα τη δέσµευση του συµπλόκου αντισώµατος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α και την παραλαβή του από το εκχύλισµα. Έτσι µε τον τρόπο αυτό επιτυγχάνουµε τον εξειδικευµένο διαχωρισµό-καθαρισµό της φυσιολογικής µορφής µιας πρωτεΐνης µέσα από ένα µίγµα πρωτεϊνών. Επίσης είναι δυνατόν κάτω από κατάλληλα διαµορφωµένες συνθήκες εφαρµογής της τεχνικής, να συγκαθαριστούν και πρωτεΐνες οι οποίες δεσµεύονται ισχυρά πάνω στην πρωτεΐνη-στόχο (υποστρώµατα, ρυθµιστές, κ.α.), προσφέροντας µια γενική εικόνα των αλληλεπιδράσεων στο φυσιολογικό περιβάλλον της πρωτεΐνης. Τα σφαιρίδια εξισορροπούνται, µε 3 πλύσεις των 10 min η καθεµία, σε ρυθµιστικό διάλυµα 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 1% Triton X-100, 0.1 M NaCl και παραλαµβάνονται µετά από σύντοµη φυγοκέντρηση, µε αποµάκρυνση του ρυθµιστικού διαλύµατος. Παράλληλα κατάλληλος όγκος από τα κυτταρικά εκχυλίσµατα (ανάλογα µε το πείραµα) επωάζονται µε ~2 µg αντισώµατος, υπό ανακίνηση για χρονικό διάστηµα 3 h στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν τα αντισώµατα µε τις αντίστοιχες πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν. Μετά το πέρας της διαδικασίας µεταφέρονται σε πλαστικά σωληνάκια µε την καθηλωµένη πρωτεΐνη- Α στα σφαιρίδια. Η δέσµευση του αντισώµατος στα σφαιρίδια διαρκεί h και ακολουθούν 3 πλύσεις των 10 min µε το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα, ώστε να αποφευχθούν οι τυχόν ασθενείς αλληλεπιδράσεις µε πρωτεΐνες των εκχυλισµάτων. Στα σφαιρίδια µε τις ανοσοκατακρηµνισµένες πρωτεΐνες έγινε ανοσοανίχνευση για να ανιχνεύσουµε τις πρωτεΐνες που κατακρηµνίστηκαν. Πριν τα δείγµατα αναλυθούν σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου προστίθεται διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων και ακολούθως θερµαίνονται στους 100 C για 3 min ώστε να διασπαστούν τα σύµπλοκα αντιγόνου-αντισώµατος. Οι ανοσοκατακρηµνισµένες κινάσες µελετήθηκαν επίσης ως προς τη δραστικότητά τους χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα το ανασυνδυασµένο αµινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαµίνης Β (GST-LBRNt). Το µίγµα επώασης 50

51 περιλαµβάνει 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 25 µμ ψυχρό ATP και 0.6 µci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ και ~2 µg υποστρώµατος. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 µl και ρυθµίζεται µε την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη 2 Ο. Τα δείγµατα επωάζονται για 30 min σε θερµοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται DTT και διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων και στη συνέχεια τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται. Ακολουθεί βαφή της πηκτής µε τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και αποχρωµατισµός της. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. Β.3.13 Τεχνική Elisa Για την µελέτη της δραστικότητας των καθαρισµένων Hucal αντισωµάτων της εταιρείας AbD serotec χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Συνοπτικά, η αρχή της µεθόδου είναι η ακόλουθη: Tο αντιγόνο, ειδικό για το αντίσωµα προς ανίχνευση, προσροφάται στην πλαστική επιφάνεια οπών. Το ελεύθερο αντιγόνο αποµακρύνεται µε πλύση. Ακολουθεί προσθήκη του αντισώµατος, το οποίο συνδέεται µε το αντιγόνο και διαδοχικές πλύσεις για αποµάκρυνση του αντισώµατος που δεν προσδέθηκε. Η ανίχνευση γίνεται µε την δέσµευση ενός δεύτερου αντισώµατος που έχει καθηλωµένο επάνω του ένα ένζυµο (π.χ. αλκαλική φωσφατάση) το οποίο δίνει κατάλληλη χρωµοαντίδραση όταν προστεθεί το ανάλογο υπόστρωµα. Το ποσό του υποστρώµατος που υδρολύεται είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του δεύτερου αντισώµατος και κατά συνέπεια και του πρώτου αντισώµατος. Η υδρόλυση µετράται ποσοτικά σε micro ELISA reader. Ως αντιγόνο χρησιµοποιήθηκε το τµήµα που περιλαµβάνει τα 171 επιπλέον αµινοξέα της SRPK1a και το οποίο συντέθηκε από την εταιρεία AbD serotec. Συγκεκριµένα, σε πιάτο 384 οπών κατάλληλο για ELISA προστέθηκαν 20 µl/οπή από ένα διάλυµα 5 µg/ml του τµήµατος των 171 αµινοξέων σε PBS [8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0, 2gr/l KH 2 PO 4 ] και αφέθηκαν στους 4 ο C για 16 ώρες έτσι ώστε να γίνει η προσρόφηση στην πλαστική επιφάνεια των οπών. Ακολούθησαν 2 πλυσίµατα µε διάλυµα PBSΤ (PBS µε 51

52 προσθήκη 0.05% Tween20), επώαση για 2 ώρες σε θερµοκρασία περιβάλλοντος µε διάλυµα κορεσµού (PBST που περιέχει και 1% αλβουµίνη), 3 πλύσεις µε PBST και προσθήκη των αντισωµάτων (20 µl αντισώµατος/οπή από ένα διάλυµα 2 µg/ml σε PBST). Τα αντισώµατα επωάστηκαν µε το αντιγόνο για 1 ώρα σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και στη συνέχεια ακολούθησαν 5 πλύσεις µε PBST και επώαση για 1ώρα µε το δεύτερο αντίσωµα το οποίο είναι συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση (anti-fab-ap conjugate, AbD Serotec # ), σε αραίωση 1:5000 (σε PBST που περιέχει και 1% αλβουµίνη). Αφού έγιναν 5 πλύσεις µε PBST ακολούθησε η ανίχνευση της αντίδρασης της αλκαλικής φωσφατάσης µε χρωµοαντίδραση που προέκυψε ύστερα από προσθήκη 20 µl/ οπή AttoPhos (Roche# , αραιωµένο 1:10 σε νερό) για 1 ώρα σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Η µέτρηση της οπτικής πυκνότητας έγινε σε micro ELISA reader στα 440 nm. 52

53 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ Γ.1 Μέτρηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε τεχνική Elisa χρησιµοποιώντας ως αντιγόνο το συνθετικό τµήµα των 171 αµινοξέων Σε πρώτη φάση για την µελέτη της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων έγινε καθήλωση του συνθετικού τµήµατος των 171 αµινοξέων στην πλαστική επιφάνεια οπών ενός κατάλληλου πιάτου. Ακολούθησε προσθήκη των αντισωµάτων, πρόσδεση µε το αντιγόνο και διαδοχικές πλύσεις για την αποµάκρυνση του αντισώµατος που δεν προσδέθηκε. Η ανίχνευση έγινε µε την δέσµευση του δεύτερου αντισώµατος που είχε καθηλωµένη επάνω του αλκαλική φωσφατάση και η οποία έδωσε κατάλληλη χρωµοαντίδραση µε την προσθήκη του ανάλογου υποστρώµατος. Η υδρόλυση µετρήθηκε ποσοτικά σε micro ELISA reader. Η όλη τεχνική περιγράφεται αναλυτικά στην παραγραφο Β Σχήµα Γ.1. Μέτρηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων χρησιµοποιώντας ως αντιγόνο το συνθετικό τµήµα των 171 αµινοξέων (SRPK1a-N1), GST και BSA. 53

54 Όπως φαίνεται στο Σχήµα Γ.1 όλα τα Hucal αντισώµατα εµφανίζουν δραστικότητα απέναντι στο συνθετικό τµήµα των 171 αµινοξέων (SRPK1a-N1), ενώ εµφανίζουν σχεδόν µηδενική δραστικότητα απέναντι σε GST και BSA. Γ.2 Εκτίµηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε τεχνική Western blotting χρησιµοποιώντας ως αντιγόνο το συνθετικό τµήµα των 171 αµινοξέων Στη συνέχεια έγινε εκτίµηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε Western blotting. Για το σκοπό αυτό ηλεκτροφορήθηκαν 2 µg από το συνθετικό τµήµα των 171 αµινοξέων και στη συνέχεια ακολούθησε ηλεκτροµεταφορά σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και Western blot (όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.11). Η ανίχνευση του πεπτιδίου έγινε κάθε φορά µε το αντίστοιχο Hucal αντίσωµα. Σχήµα Γ.2. Εκτίµηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε Western blotting χρησιµοποιώντας ως αντιγόνο το τµήµα SRPK1a-N1. 54

55 Όπως φαίνεται στο Σχήµα Γ.2 όλα τα αντισώµατα δίνουν µία ζώνη περίπου στα 34 kda (εκτός ίσως του 9912, πιθανά όµως στην περίπτωση αυτή η µεµβράνη να µην κόπηκε σωστά έτσι ώστε να µην περιλαµβάνεται η αντίστοιχη ζώνη). Γ.3 Ανάλυση του συνθετικού τµήµατος των 171 αµινοξέων µε SDS-PAGE και βαφή µε Coomassie Brilliant Blue Ένα ερώτηµα που προέκυψε αφορά το µέγεθος της ζώνης που ανοσοανιχνεύθηκε µε τα Hucal αντισώµατα. Το συνθετικό τµήµα των 171 αµινοξέων έχει ένα θεωρητικό µοριακό βάρος περίπου kda, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις ανιχνεύθηκε µια ζώνη στα 34 kda. Προσπαθώντας να δώσουµε µια απάντηση σε αυτό το παράδοξο έγινε ανάλυση του συνθετικού τµήµατος των 171 αµινοξέων µε SDS-PAGE και βαφή µε Coomassie Brilliant Blue. Σχήµα Γ.3. Ανάλυση του συνθετικού τµήµατος των 171 αµινοξέων µε SDS-PAGE και βαφή µε Coomassie Brilliant Blue. Στην αριστερή εικόνα στο πεπτίδιο προστέθηκαν 140 mm DTT. Στη δεξιά εικόνα, στην πρώτη διαδροµή προστέθηκαν 140 mm DTT και ακολούθησε θέρµανση για 10 min στους 100 o C ενώ στη δεύτερη διαδροµή προστέθηκε επιπλέον και 6 Μ ουρία. 55

56 Όπως φαίνεται στο Σχήµα Γ.3 (αριστερή εικόνα) το συνθετικό αυτό πεπτίδιο αναλύεται σε τρεις ζώνες µετά από SDS-PAGE και βαφή µε Coomassie Brilliant Blue. Η µικρότερη από τις τρεις αυτές ζώνες αντιστοιχεί στο θεωρητικό µοριακό βάρος, ενώ η δεύτερη ζώνη, περίπου στα 34 kda, είναι αυτή που ανοσοανιχνεύεται από τα Hucal αντισώµατα. Για να διαπιστώσουµε αν οι πάνω δύο ζώνες είναι προϊόν κάποιου είδους πολυµερισµού του πεπτιδίου, αυτό είτε θερµάνθηκε για 10 min στους 100 o C πριν αναλυθεί στην πηκτή ακρυλαµιδίου, είτε προστέθηκε και 6 Μ ουρία πριν την θέρµανση (δεξιά εικόνα). Και στις δύο όµως περιπτώσεις η εικόνα ουσιαστικά δεν άλλαξε, οπότε προς το παρόν δεν έχουµε µια ικανοποιητική εξήγηση για την φύση των τριων αυτών µορφών του συνθετικού πεπτιδίου όπως αυτές αναλύονται µετά από SDS-PAGE. Γ.4 Εκτίµηση της δραστικότητας του a-srpk1a πολυκλωνικού αντισώµατος µε τεχνική Western blotting χρησιµοποιώντας ως αντιγόνο το συνθετικό πεπτίδιο SRPK1a-N1 Πριν από µερικά χρόνια είχε παρασκευαστεί στο Εργαστήριο Βιοχηµείας ένα πολυκλωνικό αντίσωµα απέναντι στο επιπλέον τµήµα των 171 αµινοξέων της SRPK1a (a-srpk1a). Το συγκεκριµένο αντίσωµα είχε αναπτυχθεί σε κουνέλια στα οποία είχε ενεθεί ως αντιγόνο το τµήµα αυτό των 171 αµινοξέων εκφρασµένο σε βακτήρια ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST. To πολυκλωνικό αντίσωµα a- SRPK1a είναι δραστικό σε ανοσοκατακρήµνιση ενώ δεν αναγνωρίζει καµµία ζώνη σε Western blot. Για να επιβεβαιώσουµε τη λειτουργικότητα αυτού του αντισώµατος, τουλάχιστον απέναντι στο τµήµα των 171 αµινοξέων, το a-srpk1a αντίσωµα δοκιµάστηκε απέναντι στο τµήµα των 171 αµινοξέων που συντέθηκε από την εταιρεία από την εταιρεία AbD serotec (SRPK1a-N1). Για το σκοπό αυτό ηλεκτροφορήθηκαν 2 µg από το SRPK1a-N1 και στη συνέχεια ακολούθησε ηλεκτροµεταφορά σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, Western blot (όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.11) και ανίχνευση του πεπτιδίου µε το a- SRPK1a αντίσωµα. 56

57 Σχήµα Γ.4. Εκτίµηση της δραστικότητας του a-srpk1a πολυκλωνικού αντισώµατος µε Western blotting χρησιµοποιώντας ως αντιγόνο το τµήµα SRPK1a-N1. Γ.5 Εκτίµηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε τεχνική Western blotting απέναντι σε εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την SRPK1a Σε ένα επόµενο βήµα θελήσαµε να δοκιµάσουµε τη δραστικότητα των Hucal αντισωµάτων απέναντι σε εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων στα οποία είχαµε υπερεκφράσει την SRPK1a. Σχήµα Γ.5. Ανοσοανίχνευση των FGAG-SRPK1a και FLAG-SRPK1 από εκχυλίσµατα 293Τ ευκαρυωτικών κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε τους αντίστοιχους πλασµιδιακούς φορείς µε το a-flag µονοκλωνικό αντίσωµα (Α), καθώς και µε το Hucal αντίσωµα 9908 (Β). 57

58 Για το σκοπό αυτό 293Τ κύτταρα επιµολύνθηκαν παροδικά, µε τη µέθοδο του CaCl 2, µε τα γονίδια της SRPK1a και της SRPK1 (ως control) κλωνοποιηµένα στον πλασµιδιακό φορέα pflag-cmv-2 (βλ. παράγραφο Β.3.4). Τα κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.5 και 150 µg από κάθε εκχύλισµα αναλύθηκαν σε SDS-PAGE. Aκολούθησε ηλεκτροµεταφορά σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, Western blot και ανίχνευση των FLAG-SRPK1a και FLAG-SRPK1 είτε µε κατάλληλο µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στο πεπτίδιο FLAG, είτε µε τα Hucal αντισώµατα. Όπως φαίνεται στο Σχήµα Γ.5, το a-flag µονοκλωνικό αντίσωµα αναγνωρίζει κανονικά και τις δύο υπερεκφρασµένες κινάσες, ενώ το Hucal αντίσωµα 9908 δεν φαίνεται να αναγνωρίζει εξειδικευµένα την SRPK1a. Αντίθετα, δίνει µια ασθενική ζώνη και µε τις δύο υπερεκφρασµένες κινάσες (µετά από πολύ ώρα ανάπτυξης της χρωµοαντίδρασης µε την αλκαλική φωσφατάση). Παρόµοια εικόνα έδωσαν και τα υπόλοιπα Hucal αντισώµατα, γεγονός που υποδηλώνει ότι παρότι είναι σε θέση να ανιχνεύσουν το καθαρό συνθετικό πεπτίδιο SRPK1a-N1 (βλ. Σχήµα Γ.2), αδυνατούν να αλληλεπιδράσουν µε το τµήµα αυτό στο ολόκληρο µόριο της SRPK1a όταν η κινάση εκφράζεται σε 293Τ κύτταρα. Γ.6 Εκτίµηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε ανοσοκατακρήµνιση εκχυλισµάτων ευκαρυωτικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την SRPK1a Η ανοσοκατακατακρήµνιση της SRPK1a έγινε από εκχυλίσµατα 293Τ κυττάρων, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.12, χρησιµοποιώντας κάθε φορά 2 µg από το αντίστοιχο Hucal αντίσωµα. Ως control έγινε ανασοκατακρήµνιση µε σκέτα σφαιρίδια protein A σεφαρόζης χωρίς την προσθήκη αντισώµατος. Στα σφαιρίδια µε τις ανοσοκατακρηµνισµένες πρωτεΐνες έγιναν πειράµατα ελέγχου της δραστικότητας της κινα σης µε την προσθήκη κατάλληλου υποστρώµατος και ραδιενεργού [γ- 32 P]ATP (όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.12). Στα πειράµατά µας χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα 58

59 το Ν-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαµίνης Β (LBR), εκφρασµένο ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST, στα E.coli (GST-LBRNt). Τα δείγµατα επωάστηκαν για 30 min σε θερµοκρασία 30 ο C. Μετά το τέλος της επώασης προστέθηκε DTT και διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων και στη συνέχεια τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν. Ακολούθησε βαφή της πηκτής µε τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250, αποχρωµατισµός της και ξήρανση υπό κενό. Σε φωτοπολλαπλασιαστικό θάλαµο τοποθετήθηκε πάνω στο ξηρό gel ακτινογραφικό film ευαίσθητο στην ακτινοβολία που εκπέµπει ο 32 Ρ και ακολούθησε έκθεση. Σχήµα Γ.6. Εκτίµηση της δραστικότητας των Hucal αντισωµάτων µε ανοσοκατακρήµνιση εκχυλισµάτων 293Τ κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε το παλσµίδιο pcmv-2-flag-srpk1α. Στην πρώτη διαδροµή η ανοσοκατακρήµνιση έγινε µόνο µε σφαιρίδια protein A σεφαρόζης, ενώ στις υπόλοιπες διαδροµές η ανοσοκατακρήµνιση έγινε µε 2 µg από το αντίστοιχο Hucal αντίσωµα. Σε κάθε περίπτωση, η ανοσοκατακρηµνισµένη SRPK1a επωάστηκε µε βακτηριακά εκφρασµένο GST-LBRNt, σε συνθήκες in vitro φωσφορυλίωσης. Το ραδιενεργά σηµασµένο υπόστρωµα ανιχνεύθηκε µε SDS ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία. Όπως φαίνεται στο Σχήµα Γ.6, δεν υπάρχει ουσιαστική διαφορά ανάµεσα στην δραστικότητα κινάσης που κατακρηµνίζεται µε σκέτα σφαιρίδια και στην δραστικότητα κινάσης που κατακρηµνίζουν τα αντισώµατα. Η δραστικότητα αυτή είναι πάρα πολύ µικρή (θα µπορούσε να χαρακτηριστεί ως background) δεδοµένου ότι για να εµφανιστεί η αντίστοιχη ζώνη στην αυτοραδιογραφία 59