ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ sirnas ΠΟΥ ΣΤΟΧΕΥΟΥΝ ΤΙΣ SRPK1/SRPK1a ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ sirnas ΠΟΥ ΣΤΟΧΕΥΟΥΝ ΤΙΣ SRPK1/SRPK1a ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ. ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΔΑΝΙΗΛΙΔΟΥ ΜΑΚΡΙΝΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...1 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...2 Α.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs)...2 Α.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών - χαρακτηριστικά της δομής τους...2 Α.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης...9 Α.1.3. Εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς...10 Α.1.4. Υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης Α.1.5. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης...15 Α.1.6. SRPKs και παθογένεια...16 Α.2. Γονιδιακή καταστολή μεσολαβούμενη από μικρά δίκλωνα RNA μόρια...19 Α.2.1. Ιστορική αναδρομή Α.2.2. Γενωμική των mirnas...22 Α.2.3 Βιογένεση των mi/sirnas...23 Α.2.4. Καταστολή της μετάφρασης και αποικοδόμηση του mrna Α.2.5. Μεταγραφική καταστολή και RNAi Α.2.6. Βιογένεση των mirnas στα φυτά...37 Α.2.7. Βιολογικός ρόλος των mi/sirnas...38 Α.2.8. Διαφορές μεταξύ sirnas και mirnas...39 Α.2.9. pirnas...40 Α Τεχνολογία της RNA παρεμβολής...43 Α Εφαρμογές και στόχοι της RNA παρεμβολής...45 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...47 B.1. Υλικά...47 Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια Β.1.2. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας...47

3 Β.1.3. Βιολογικά υλικά B.2. Μέθοδοι...50 Β.2.1. Σχεδιασμός και έκφραση των sirnas που στοχεύουν στις SRPK1/SRPK1a...50 Β Υβριδισμός...52 Β Αντίδραση λιγάσης...53 Β.2.2. Ιστοκαλλιέργειες...53 Β.2.3. Παρασκευή εκχυλισμάτων από K562, 293T ή HeLa κύτταρα...54 Β.2.4. Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων Κ-562 με τη χρώση βενζιδίνης -Η 2 Ο...54 Β.2.5. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE)...55 Β.2.6. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS- PAGE)...56 Β.2.7. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R Β.2.8. Αυτοραδιογραφία Β.2.9. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης πρωτεϊνών με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους...59 Β Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western blot)...59 Β Ανοσοανίχνευση...60 Β Ανοσοκατακρήμνιση Β Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου...62 Β Ηλεκτροδιάχυση...64 Β Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με τη χρήση του kit της Roche X-tremeGENE Q2 Reagent...65 Β Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Β Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων ώστε να γίνουν επιδεκτικά για μετασχηματισμό (Competent Cells)...66 Β Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (Transformation)...67 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση...67 Β Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το kit QIAGEN-TIP Β Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης...69

4 Β Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων...70 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...Σφάλμα! Δεν έχει οριστεί σελιδοδείκτης. Γ.1. Αναστολή της έκφρασης των SRPK1/SRPK1a σε 293Τ κύτταρα...71 Γ.1.1. Μελέτη της αναστολής της έφρασης των SRPK1/SRPK1a με Western blot ανάλυση...72 Γ.1.2. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης σε εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 DNA...73 Γ.1.3. Ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 DNA και έλεγχος της δραστικότητας τους...73 Γ.1.4. Επίδραση της αναστολής της έκφρασης της SRPK1 στο πρότυπο φωσφορυλίωσης των SR παραγόντων ματίσματος...75 Γ.2. Αναστολή της έκφρασης των SRPK1/1a σε κύτταρα HeLa...76 Γ.3. Αναστολή της έκφρασης των SRPK1/SRPK1a σε Κ562 κύτταρα...77 Γ.3.1. Μελέτη της αναστολής της έφρασης των SRPK1/SRPK1a με Western blot ανάλυση...77 Γ.3.2. Ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα Κ562 κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 DNA και έλεγχος της δραστικότητας τους...78 Γ.3.3. Η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 προκαλεί μείωση του ρυθμού ανάπτυξης και διαφοροποίηση των κυττάρων Κ562 προς ερυθροκύτταρα...80 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...83 Δ.1. Αναστολή των SRPK1/SRPK1a στις κυτταρικές σειρές 293Τ και HeLa...83 Δ.2. Η αναστολή των SRPK1/SRPK1a σε κύτταρα χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας αναστέλλει το ρυθμό ανάπτυξης τους και επάγει την διαφοροποίησή τους...84 Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...86

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σκοπός της εργασίας ήταν η προσπάθεια μετα-μεταγραφικής αναστολής της έκφρασης των SRPK1 και SRPK1a κινασών με τη χρήση της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής (RNAi). Για την επίτευξη αυτού του στόχου σχεδιάστηκαν sirnas που στοχεύουν στην καταλυτική περιοχή των δύο κινασών. Η επίδραση της καταστολής των SRPK1 και SRPK1a μελετήθηκε σε τρεις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές: σε επιθηλιακά νεφρικά κύτταρα (293Τ), σε κύτταρα του τραχήλου της μήτρας (HeLa) και σε κύτταρα χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας (K562). Βρέθηκε ότι η έκφραση της SRPK1 μειώνεται δραματικά, ενώ αντίθετα η έκφραση της SRPK1a μειώνεται αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό από αυτόν της SRPK1. Επίσης, η εισαγωγή sirnas που στοχεύουν στις δύο κινάσες, σε ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, επάγει την διαφοροποίησή τους προς ερυθροκύτταρα με επακόλουθη μείωση του ρυθμού ανάπτυξής τους. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κάτω από την άμεση καθοδήγηση της επίκουρου καθηγήτριας κ. Ελένης Νικολακάκη, την οποία ευχαριστώ θερμά για την υπόδειξη του θέματος και για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε κατά την διάρκεια της εργασίας. Η συνεργασία μαζί της αποτέλεσε πηγή γνώσεων και σωστού τρόπου σκέψης και θεώρησης της επιστήμης της Βιοχημείας. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Θ. Χολή- Παπαδοπούλου και την επίκουρο καθηγήτρια κ. Αναστασία Πανταζάκη, μέλη της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής, για τις υποδείξεις και την εποικοδομητική κριτική της εργασίας. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Θωμά Γιαννακούρο για τη στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συμπαράσταση, καθώς και για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε κατά την πειραματική διαδικασία. Τέλος, ευχαριστίες οφείλω και σε όλο το προσωπικό και τους συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχημείας για την συνεργασία τους και τη δημιουργία του ευχάριστου συναδελφικού κλίματος μέσα στο εργαστήριο. 1

6 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs). Α.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών - χαρακτηριστικά της δομής τους. Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν μια σχετικά νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώματα τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες που αποτελούν μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθμιση του ματίσματος του mrna, η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταμίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης, η μεταφορά πολυαμινών μέσα στα κύτταρα και η ομοιόσταση ιόντων (Nikolakaki et al., 2001). Το πρώτο μέλος της οικογένειας το οποίο κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ήταν η ανθρώπινη μορφή της SRPK1, με βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τους παράγοντες ματίσματος που περιέχουν στο μόριο τους ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριμένων ακολουθιών παίζει καθοριστικό ρόλο στη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος του RNA (Gui et al., 1994a; Gui et al., 1994b). Μέχρι σήμερα τουλάχιστον δέκα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αγρινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισμούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες μορφές των SRPK1 (accession No: U09564), SRPK1a (accession No: AJ318054) και SRPK2 (accession No: U88666A) και στο ποντίκι οι μορφές των SRPK1 (accession No: AJ224115), SRPK2 (accession No: AB006036) και SRPK3 (accession No: ΝΜ_019684). Στη ζύμη οι Sky1 (accession No: S55098) (S. cerevisiae) και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το ομόλογο της SRPK1 (accession No: AF01149), στο C. elegans η SPK-1 (accession No: AF241656) και στα φυτά το αντίστοιχο ομόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana) (NCBI, Entrez Nucleotide). 2

7 Σχήμα Α.1.1. Σχηματική αναπαράσταση των SRPKs ποντικού. Τα τρία μέλη της οικογένειας εμφανίζουν μεγάλη ομολογία στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), αλλά διαφέρουν στο Ν- τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή (hinge region). Το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Τα ποσοστά δηλώνουν την ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία, ενώ δίνονται και οι αριθμοί των αμινοξέων (Nakagawa et al., 2005). Οι SRPKs των θηλαστικών έχουν το χαρακτηριστικό ότι παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομολογία στην πρωτοταγή τους δομή, στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), καθώς επίσης και στην εξειδίκευση τους ως προς τα διάφορα υποστρώματα. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των κινασών αυτών αποτελεί το γεγονός ότι οι περιοχές του μορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από μία ασυνήθιστα μεγάλη αλληλουχία αμινοξέων (Σχήμα Α.1.1.), γεγονός πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισμένο σε κινάσες τυροσίνης (Wang et al., 1998). Η μεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αμινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, όσο και στην υποκυτταρική τους κατανομή (Ding et al., 2006). Ακόμη ένα κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι περιέχουν στο μόριο τους δύο πιθανά σήματα για την εντόπιση στον πυρήνα (NLS nuclear localization signal), ένα στην αμινο-τελική περιοχή ( 11 R-K-K-R-T-K-A-K-K-D-K 21 ) και ένα στο κέντρο του μορίου ( 267 Κ-Κ-Κ- Κ-L-K-K-K-Q-K-R 277 ) (Gui et al., 1994a). 3

8 Σχήμα Α.1.2. Σχηματική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος της SRPK1a. (Α) Αναπαράσταση της δομής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τμήμα των 513 bp το οποίο δεν περιλαμβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a με την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τμήμα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος που βρίσκονται στα όρια μεταξύ των εξονίων 1a και 1b και του τμήματος των 513 bp (Nikolakaki et al., 2001). Οι διαφορές ανάμεσα στα μέλη της οικογένειας που απαντώνται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε μορίου στην πρωτοταγή του δομή. Στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού ματίσματος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η μόνη διαφορά έγκειται στην ύπαρξη μιας εμβόλιμης ακολουθίας από 171 αμινοξέα στο αμινο-τελικό 4

9 άκρο του μορίου αμέσως μετά τα τέσσερα πρώτα αμινοξέα, όπως φαίνεται στο Σχήμα Α.1.2. (Nikolakaki et al., 2001). Η εμβόλιμη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σημαντικό αριθμό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες με το μοτίβο L-X-X-L-L ( 148 L-A-P- L-L 152 και 158 L-G-R-L-L 162 ), το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών με πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης με διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσμευσης της με την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγματος SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1) (Nikolakaki et al., 2001). Στην περίπτωση του μορίου της SRPK2, η οποία αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε μικρές αλλαγές στην αμινοξική ακολουθία στη κεντρική και καρβοξυ-τελική τους περιοχή. Οι διαφορές αυτές δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα και την εξειδίκευση των δύο ενζύμων (πάνω από 90% ομολογία στις περιοχές κινάσης). Επιπλέον, το αμινο-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες και περιέχει την αμινοξική αλληλουχία P-P-L-P, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με SH 3 - και WW-περιοχές άλλων πρωτεϊνών (Wang et al., 1998). Κατ αναλογία με την πρόσθετη αλληλουχία της SRPK1a, η διαφορετική αυτή περιοχή της SRPK2 μπορεί να παίζει το ρόλο ενός σήματος για την αλληλεπίδραση της με διαφορετικά υποστρώματα ή άλλα ρυθμιστικά μόρια, σε σύγκριση με την SRPK1. Πρόσφατες κρυσταλλογραφικές μελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Sky1p της ζύμης S.cerevisiae υπέδειξαν τρία δομικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητα που παρουσιάζουν τα μέλη της οικογένειας των SRPKs. Για λόγους που ευνοούσαν την κρυστάλλωση του μορίου της Sky1p, δημιουργήθηκε μια μεταλλαγμένη της μορφή από την οποία είχαν αφαιρεθεί μία μη διατηρημένη αλληλουχία 137 αμινοξέων στο αμινοτελικό της άκρο, καθώς και η περιοχή που παρεμβάλλεται μεταξύ των δραστικών περιοχών της κινάσης. Η μεταλλαγμένη αυτή μορφή παραμένει ενεργή, παρουσιάζοντας παρόμοια δραστικότητα με τη φυσιολογική μορφή της κινάσης (Nolen et al., 2001). Η συνολική δομή του μορίου της Sky1p, όπως φαίνεται στο Σχήμα Α.1.3., είναι παρόμοια με αυτή που παρουσιάζουν και άλλες κινάσες πρωτεϊνών, έχοντας έναν μικρό λοβό ο οποίος αποτελείται κυρίως από β-ελάσματα και έναν μεγάλο λοβό αποτελούμενο κυρίως από α-έλικες. Στη φυσιολογική της μορφή η αλληλουχία που 5

10 παρεμβάλλεται μεταξύ των περιοχών της κινάσης τοποθετείται μεταξύ των ελασμάτων β7 και β8. Τα χαρακτηριστικά που διαφοροποιούν την Sky1p και γενικά όλες τις κινάσες της οικογένειας των SRPKs από άλλες κινάσες πρωτεϊνών και είναι πιθανώς υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητα που εμφανίζουν είναι τα εξής: i. Η έλικα αc, η οποία σε ορισμένες κινάσες πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για τον έλεγχο της δράσης τους, στην περίπτωση της Sky1p περιλαμβάνει μία επιπλέον αλληλουχία αμινοξέων (αc ) η οποία επεκτείνει τη δομή της αc κατά μία περιστροφή. Η επιπλέον αυτή περιοχή σταθεροποιεί την αc, φέρνοντας την σε επαφή με την έλικα αε του μεγάλου λοβού. Η Tyr283 της αε έλικας παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομής αλληλεπιδρώντας μέσω δεσμών υδρογόνου με τα αμινοξέα Asn210 και Asp213 της έλικας αc. ii. Οι SRPKs δεν απαιτούν τη φωσφορυλίωση του βρόχου ενεργοποίησης προκειμένου να καταστούν δραστικές. Στη θέση ενός χαρακτηριστικού αμινοξέος Arg που προηγείται του καταλυτικού Asp διαθέτουν μία Thr. Προκειμένου τα μόρια των SRPKs να καταστούν ενεργά, αντί της φωσφορυλίωσης του βρόχου ενεργοποίησης, ευνοείται η αλληλεπίδρασή του με περιοχές του μορίου εκτός της δραστικής περιοχής, οι οποίες σταθεροποιούν το βρόχο σε μία κατάσταση συνεχούς ενεργότητας. iii. Οι SRPKs διαθέτουν μία δομή στην περιοχή δέσμευσης του υποστρώματος, η οποία αναγνωρίζει φωσφοσερίνες που βρίσκονται σε P-2 θέση από τη σερίνη που πρόκειται να φωσφορυλιωθεί. Έτσι η μετατόπιση της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην περιοχή αυτή και δέσμευση της γειτονικής σερίνης στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου, προκαλεί τη διαδοχική φωσφορυλίωση των σερινών του υποστρώματος (Nolen et al., 2001). 6

11 Σχήμα Α.1.3. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της Sky1p. Παρουσιάζεται επίσης η δομική αναπαράσταση του μορίου της Sky1p ανεστραμμένη κατά 40 μοίρες όπου φαίνονται οι μη καταλυτικές περιοχές της κινάσης (Nolen et al., 2001). Σχήμα Α.1.4. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της SRPK1ΔNS1 (Ngo et al., 2005). Τα παραπάνω δομικά στοιχεία επιβεβαιώθηκαν μετά από την κρυσταλλογραφική μελέτη και της SRPK1, όπως φαίνεται στο Σχήμα Α.1.4. Για την καλύτερη κρυστάλλωση του μορίου της SRPK1, αφαιρέθηκαν από το μόριό της μία 7

12 περιοχή 40 αμινοξέων από το Ν-τελικό άκρο και 217 αμινοξέα από τη συνδετική αλληλουχία (aa ). Το μόριο που δημιουργήθηκε αναφέρεται ως SRPK1ΔNS1 (Ngo et al., 2005). Η SRPK1 παρουσιάζει υψηλή δομική ομολογία με την Sky1p. Παρόλα αυτά διαθέτει και δύο αξιοσημείωτες διαφορές. Το C-τελικό άκρο της Sky1p περιλαμβάνει μία αλληλουχία 40 αμινοξέων που περιελίσσεται γύρω από την καταλυτική περιοχή (kinase domain) του καρβοξυ-τελικού άκρου του μορίου, κάτι που δεν υπάρχει στην SRPK1ΔNS1. Επιπλέον, η συνδετική περιοχή της SRPK1ΔNS1 δημιουργεί δύο δομές α-έλικας, που συμβάλλουν (σχηματίζουν ένα ασυνεχές τείχος πλευρικά του ενζύμου, το οποίο συνεισφέρει) στη συνεχή ενεργή διαμόρφωση της κινάσης (Ngo et al., 2005). Το μοντέλο, σύμφωνα με το οποίο οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωμάτων τους, δεν εξηγεί τη φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώματος. Είναι πιθανό in vivo το υπόστρωμα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από μία άλλη κινάση πρωτεϊνών και ακολούθως οι SRPKs να το αναγνωρίζουν και να φωσφορυλιώνουν τις υπόλοιπες σερίνες, ακολουθώντας μία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPKs, αλλά με πολύ μικρότερη αποτελεσματικότητα. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η SRPK1 συνδέεται αρχικά με τα υποστρώματά της μέσω μίας αύλακας του μορίου της (docking groove), η οποία αναγνωρίζει το μοτίβο R-X-R/K-X-X-X-R (Ngo et al., 2005). Όταν η αρχική φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιτευχθεί, η SRPK συνεχίζει τη φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιδεικνύοντας υψηλότερη δραστικότητα (Nolen et al., 2001). Σε πειράματα φωσφορυλίωσης του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 από την SRPK1 βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση των σερινών της RS ακολουθίας γίνεται διαδοχικά. Όσο διαρκεί η διαδικασία αυτή, το υπόστρωμα παραμένει δεσμευμένο πάνω στο μόριο της κινάσης. Αποδείχτηκε ακόμη ότι από τις 20 σερίνες της RS ακολουθίας, μόνο οι μισές φωσφορυλιώνονται in vitro. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης μάλιστα είναι ανεξάρτητες της ποσότητας του ATP ή της ποσότητας της κινάσης (Aubol et al., 2003). 8

13 Α.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης. Η εξειδίκευση των SRPKs εντοπίζεται στην ύπαρξη μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα μόρια των υποστρωμάτων τους. Η μεταφορά της γ-φωσφορικής ομάδας του ΑΤΡ γίνεται στις σερίνες των ακολουθιών αυτών. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι SRPKs είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (-R-S-R-S-R-S-). Σε πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης χρησιμοποιώντας ως κινάση την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και υποστρώματα που περιείχαν μόνο δύο επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόμη έχει δειχτεί ότι η αντικατάσταση της σερίνης από θρεονίνη ή της αργινίνης από λυσίνη στις RS ακολουθίες, έχει ως αποτέλεσμα τη μη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων από την SRPK1 (Wang et al., 1998). Το Ν-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR Lamin B Receptor) περιέχει κατάλληλη περιοχή διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την SRPK1. Μεταλλάγματα της περιοχής αυτής, στα οποία είχαν εισαχθεί με σημειακές μεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών, έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν την δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίμηση από την πλευρά της κινάσης (Nikolakaki et al., 1996; Papoutsopoulou et al., 1999b). Ακόμη σε in vitro πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 με διάφορους παράγοντες ματίσματος του mrna που προέρχονται από διαφορετικούς οργανισμούς, έδειξαν ότι οι κινάσες αυτές προτιμούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που είναι τοποθετημένες ανάμεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αμινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al., 1998). Όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των SRPKs, οι μελέτες που έγιναν χρησιμοποιώντας ως πηγή δράσης την SRPK1 και ως υπόστρωμα τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 έδωσαν μια τιμή Κm 10 μμ για το ΑΤΡ, και μία πολύ μικρή τιμή Κm 0,07 μμ για το υπόστρωμα. Το γεγονός αυτό δείχνει την πολύ μεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώματά τους (Gui et al., 1994b). 9

14 Α.1.3. Εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς. Φθορισμομετρικός in situ υβριδισμός (FISH) σε ανθρώπινα σωματικά κύτταρα έδειξε ότι το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται τοποθετημένο στο χρωμόσωμα 6 (θέση 6p21.2-p21.3), ενώ αντίστοιχα το γονίδιο της SRPK2 στο χρωμόσωμα 7 (θέση 7q22-q31.1). Στο ποντίκι, η χαρτογράφηση των χρωμοσωμάτων έδειξε ότι τα γονίδια των SRPK1 και SRPK2 βρίσκονται στα χρωμοσώματα 17 (θέση 17 A3.3) και 5 (θέση cm) αντίστοιχα (NCBI, Entrez Gene; Wang et al., 1999). Στο ποντίκι ακόμη, όπου δεν εκφράζεται η ανθρώπινη ισομορφή SRPK1a, εκφράζεται η Stk23/SRPK3 (Nakagawa et al., 2005), το γονίδιο της οποίας βρίσκεται στο χρωμόσωμα Χ (θέση X A7.3). Ομόλογη της συγκεκριμένης χρωμοσωμικής περιοχής έχει βρεθεί και στον άνθρωπο, στο χρωμόσωμα Χ (θέση Xq28) (NCBI, Entrez Gene), δεν έχει όμως βρεθεί ακόμη η αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η κατανομή των μελών της οικογένειας των SRPKs πρωτεϊνικών κινασών στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σημαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασης τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των SRPKs, χρησιμοποιώντας υβριδισμό κατά Northern με ιχνηλάτες ραδιενεργά επισημασμένα τμήματα των γονιδίων τους, έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στους όρχεις, έχοντας μικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύμος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός μυς (Papoutsopoulou et al., 1999a). Παρόμοια εικόνα έδειξε και η μελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όμως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασής της στους διάφορους ιστούς ήταν σημαντικά μικρότερα (Nikolakaki et al., 2001). Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα, αφού εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, μέτρια στην καρδιά και το σκελετικό μυ, ενώ παρουσιάζει χαμηλά επίπεδα έκφρασης στον πνεύμονα, το ήπαρ και το νεφρό (Wang et al., 1998). Τέλος, η SRPK3 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό μυ του ποντικού (Nakagawa et al., 2005). Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών στους ιστούς των οργανισμών, συμβάλλουν στη ρύθμιση των λειτουργιών τους κατά ένα εξειδικευμένο τρόπο στο επίπεδο του κάθε ιστού ξεχωριστά (tissue specific regulation). 10

15 Α.1.4. Υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης. Παράγοντες ματίσματος του RNA (SR splicing factors) Τα πιο καλά μελετημένα υποστρώματα της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης αποτελούν οι παράγοντες ματίσματος, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (SR splicing factors), με πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα τον ASF/SF2. Άλλα μέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ο SC35, ο 9G8 και πέντε ακόμη πολυπεπτίδια με μοριακές μάζες 20, 35, 40, 55 και 75 kda, όπως φαίνονται στο Σχήμα Α.1.5. Άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη διαδικασία ματίσματος του RNA και περιέχουν το χαρακτηριστικό μοτίβο των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιμοποιείται για τις επτά προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται με τις μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεϊνες (snrnps small nuclear RiboNucleoProteins) όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο αμινο-τελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης και δέσμευσης του RNA, RBDs (RNA Binding Domains), ενώ το καρβοξυ-τελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (Manley and Tacke, 1996). Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με άλλους παράγοντες ματίσματος και εκτός από την συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος, θεωρούνται σημαντικές και στην περίπτωση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος των mrnas ρυθμίζοντας την επιλογή της θέσης όπου θα γίνει το μάτισμα (Manley and Tacke, 1996; Valcarcel and Green, 1996). 11

16 Σχήμα Α.1.5. Σχηματική αναπαράσταση των δομικών περιοχών των SR παραγόντων ματίσματος. Διακρίνονται στο αμινο-τελικό άκρο τους μία ή δύο περιοχές δέσμευσης με το RNA (RBD - κόκκινο ή μπλε) και στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο οι περιοχές των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS - πράσινο). Μία συνδετική αλληλουχία πλούσια σε γλυκίνη και σε ορισμένους παράγοντες εκτός της γλυκίνης πλούσια και σε προλίνη ή αργινίνη, φαίνεται με πορτοκαλί. Ακόμη ο παράγοντας 9G8 με μοριακή μάζα 35 kda περιέχει μία θέση δέσμευσης ψευδαργύρου (γκρι) (Manley and Tacke, 1996). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης των παραγόντων ματίσματος είναι η αποσύνδεσή τους από τις θέσεις αποθήκευσης στον πυρήνα (IGCs - Interchromatin Granule Clusters), όπου βρίσκονται συγκεντρωμένοι σε μεγάλα ανενεργά σύμπλοκα. Έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική μορφή τους, είναι δυνατή η μεταφορά τους σε ενεργές περιοχές μεταγραφής στο πυρηνόπλασμα (PFs - Perichromatin Fibrils), όπου και συμμετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριμου mrna (Gui et al., 1994a; Kuroyanagi et al., 1998; Yeakley et al., 1999). Επίσης, η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από την οικογένεια των SR πρωτεϊνικών κινασών, επάγει τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να 12

17 συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύμπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας ματίσματος του mrna (Gui et al., 1994a; Yue et al., 2000). Στην ικανότητα των SR πρωτεϊνικών κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συμπλόκου, συνηγορούν και δεδομένα τα οποία δείχνουν ότι με μη φωσφορυλιωμένους παράγοντες ματίσματος ή με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύμπλοκο δεν συγκροτείται και το μάτισμα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (Cao et al., 1997). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιμη με προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος. Αφού όμως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συμπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος ώστε το σωματίδιο ματίσματος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία. Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι η παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, μετά την συγκρότηση του συμπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του ματίσματος του mrna (Cao et al., 1997). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει την λειτουργικότητα του συμπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι ένα ακόμη σημείο που καταδεικνύει την σημασία της ρυθμιζόμενης δραστικότητας των SR πρωτεϊνικών κινασών. Η δράση τους είναι απαραίτητη μόνο κατά τα αρχικά της στάδια του ματίσματος, αφού παρατεταμένη φωσφορυλίωση οδηγεί σε αναστολή της καταλυτικής διαδικασίας (Cao et al., 1997; Valcarcel et al., 1996; Wang et al., 1998; Xiao and Manley, 1997). Άλλο ένα αποτέλεσμα που συνηγορεί στην παραπάνω θεώρηση, είναι η ανώμαλη φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος και η ανικανότητα δημιουργίας λειτουργικού συμπλόκου ματίσματος κατά την αλληλεπίδραση της SRPK1 με την πρωτεΐνη ICP27 του HSV-1 (Herpes Simplex Virus) (Sciabica et al., 2003). Τέλος, η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από το κυτταροπλασματικό κλάσμα των SR πρωτεϊνικών κινασών επάγει τη μεταφορά τους από το κυτταρόπλασμα, όπου συντίθενται, στον πυρήνα. Ταυτόχρονα ρυθμίζεται και η ενδοπυρηνική τους εντόπιση στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές του πυρήνα (Yeakley et al., 1999). Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειωθεί ότι στη ζύμη S. cerevisiae, η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εμπλέκεται στη δέσμευση και μεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθμίζεται η είσοδος της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p με τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (Gilbert et al., 2001). 13

18 Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR - Lamin B Receptor) Ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR, p58), είναι μία πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης του πυρηνικού φακέλου. Ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του έδειξε ότι αποτελείται από 8 υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές που διαπερνούν την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, καθώς και δύο υδρόφιλες περιοχές στο αμινο-τελικό και καρβοξυ-τελικό του άκρο αντίστοιχα, τα οποία εκτείνονται προς το πυρηνόπλασμα (Worman et al., 1990; Ye and Worman, 1994). Αν και δεν έχει γίνει συστηματική μελέτη των διαμεμβρανικών τμημάτων της πρωτεΐνης και του καρβοξυτελικού της άκρου, οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά του αμινο-τελικού της άκρου έχουν μελετηθεί διεξοδικά. Το αμινο-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β αποτελείται από μία ακολουθία 208 αμινοξέων και έχει σφαιρικό (globular) σχήμα. Στο τμήμα αυτό περιέχονται το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της πρωτεΐνης (NLS), ακολουθίες αμινοξέων οι οποίες είναι ικανές να φωσφορυλιωθούν από την πρωτεϊνική κινάση Α και την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, μία περιοχή επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS domain), καθώς και πιθανές περιοχές δέσμευσης του DNA (Appelbaum et al., 1990; Nikolakaki et al., 1997; Nikolakaki et al., 1996; Simos and Georgatos, 1992; Soullam and Worman, 1993). Ακόμη το αμινο-τελικό άκρο του LBR είναι ικανό να δεσμεύσει την λαμίνη τύπου Β, γεγονός που εξηγεί και την ονομασία της πρωτεΐνης (Simos and Georgatos, 1992; Worman et al., 1988; Ye and Worman, 1994). Η RS ακολουθία του αμινο-τελικού άκρου του LBR περιλαμβάνει πέντε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης ( 75 RSRSRSRSRS 84 ) και όλες οι σερίνες της φωσφορυλιώνονται από την SRPK1 (Mylonis et al., 2004; Nikolakaki et al., 1996). Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση του LBR με άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα όπως η πρωτεΐνη p32/p34, οι ιστόνες Η3 και Η4 (Polioudaki et al., 2001) και η πρωταμίνη 1 (Mylonis et al., 2004). Ακόμη έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του LBR από την SRPK1 επάγει τη δέσμευση χρωματίνης στον LBR (Takano et al., 2004). Πρωταμίνη P1 Ένα άλλο υπόστρωμα των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελεί η πρωταμίνη P1. Οι πρωταμίνες Ρ1 είναι πολύ βασικά, χαμηλού μοριακού βάρους πολυπεπτίδια με ισοηλεκτρικό σημείο μεγαλύτερο του 11 (τα μισά τους αμινοξέα 14

19 αποτελούνται από αργινίνες). Είναι πρωτεΐνες πολύ συντηρημένες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και διαιρούνται σε δύο κατηγορίες αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες και συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα μαρσιποφόρα, και αυτές των θηλαστικών με πλακούντα που περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς που σταθεροποιούν τη δομή τους (Oliva and Dixon, 1991; Retief et al., 1993). Και οι δύο κατηγορίες των Ρ1 πρωταμινών περιλαμβάνουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από τις SRPKs (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ο ρόλος των πρωταμινών είναι η αντικατάσταση των ιστονών κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης με αποτέλεσμα να προκύπτει χρωματίνη με πολύ υψηλό βαθμό συμπύκνωσης (Oliva and Dixon, 1991). Κατά τα αρχικά στάδια της σπερματογένεσης οι πρωταμίνες φωσφορυλιώνονται στοιχειομετρικά, ενώ αργότερα στα ώριμα σπερματοζωάρια αποφωσφορυλιώνονται στο μεγαλύτερο μέρος τους (Chirat et al., 1993; Oliva and Dixon, 1991). Παλαιότερα είχε προταθεί ότι ο ρόλος της φωσφορυλίωσης διευκολύνει τη σωστή σύνδεση των πρωταμινών με το DNA, ενώ η αποφωσφορυλίωση τους κατά τα τελικά στάδια της σπερματογένεσης οδηγεί πιθανότατα σε μία περαιτέρω συμπύκνωση της χρωματίνης (Chirat et al., 1993). Στη συνέχεια διατυπώθηκε η άποψη ότι επειδή υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση πρωταμινών και άλλων βασικών πρωτεϊνών γύρω από το DNA, η φωσφορυλίωση σε συγκεκριμένες θέσεις στο μόριο των P1 πρωταμινών μειώνει τις δυνάμεις απώθησης μεταξύ γειτονικών θετικών φορτίων (Papoutsopoulou et al., 1999a). Πρόσφατα όμως αποτελέσματα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της με τον πυρηνικό φάκελο (Mylonis et al., 2004). Δεδομένου δε ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες γίνεται στην πυρηνική περιφέρεια, η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης και η συνεπακόλουθη εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, μάλλον συνεισφέρουν στη διαδικασία αντικατάστασης. Α.1.5. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης. Η ομόλογη της SRPK1 στη ζύμη S. cerevisiae, η Sky1p, εμπλέκεται στη ρύθμιση της μεταφοράς πολυαμινών στο κύτταρο καθώς και στην ομοιόσταση ιόντων 15

20 (Erez and Kahana, 2001). Μεταλλαγμένα κύτταρα ζύμης, όπου έγινε απενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν μεγάλη ανθεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερμίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο που κωδικοποιεί την Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο με επιμόλυνσή τους με ένα μεταλλαγμένο γονίδιο που εκφράζει μια μη λειτουργική μορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξημένη ευαισθησία στην σπερμίνη. Η απενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύμης προκάλεσε ακόμη μειωμένη πρόσληψη σπερμιδίνης και πουτρεσκίνης. Η ίδια μεταλλαγμένη μορφή των κυττάρων έδειξε και μία μεγάλη ανεκτικότητα στα ιόντα λιθίου και νατρίου (Erez and Kahana, 2001). Ένα άλλο μέλος της οικογένειας αυτής των κινασών, η SPK-1 στο C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων. Η SPK-1 δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνη CeSF2 in vitro. Η κινάση αυτή και το υπόστρωμα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηματοειδούς και παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την διάρκεια του εμβρυϊκού σταδίου του C. elegans (Kuroyanagi et al., 2000). Τέλος, η SRPK1 έχει απομονωθεί ως σύμπλοκο με την τοποϊσομεράση ΙΙa, δύο ATPάσες/ελικάσες (RNA helicase A και RHII/Gu), δύο παράγοντες ματίσματος του RNA (PRP8 και hnrnp C) και μια HMG πρωτεΐνη (SSRP1) (Lee et al., 2004). Το σύμπλοκο αυτό, το οποίο ονομάστηκε τοποσωμάτιο (toposome), φαίνεται να συγκροτείται κυρίως κατά τη G2/M φάση ενώ κατά τη G1/S φάση, οι συστατικές του πρωτεΐνες εμφανίζουν πολύ χαμηλή αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Το τοποσωμάτιο θεωρείται μερικώς υπεύθυνο για το διαχωρισμό των αδελφών χρωματίδων. Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι το συγκεκριμένο σύμπλοκο είναι δυναμικό και ότι ο σχηματισμός ή/και η ενεργοποίησή του εξαρτώνται άμεσα από τον κυτταρικό κύκλο (Lee et al., 2004). Α.1.6. SRPKs και παθογένεια. Αύξηση των επιπέδων της SRPK1 έχει δειχτεί σε διάφορες λευχαιμίες, όπως η οξεία ATL (Adult T-cell leukemia) (Hishizawa et al., 2005) και η χρόνια CML (Salesse et al., 2004) αλλά και σε καρκίνους του στήθους, του εντέρου και του παγκρέατος (Hayes et al., 2006; Hayes et al., 2007). Μείωση της έκφρασης της 16

21 SRPK1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του στήθους και του εντέρου, με χρήση sirna (small interference RNA), προκάλεσε αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που οδηγούνται σε απόπτωση και αύξηση του κυτταρικού θανάτου μετά από έκθεση σε χημειοθεραπευτικά αντιδραστήρια. Ενδελεχής μελέτη της επίδρασης της SRPK1 στην ενεργοποίηση των μονοπατιών μεταφοράς σήματος των κινασών MAPK και Akt, έδειξε ότι μετά από μείωση των επιπέδων της SRPK1, δεν παρατηρούνται αλλαγές σε επίπεδο πρωτεΐνης στις MAPK3, MAPK2 και Akt κινάσες. Εντούτοις υπάρχει μείωση στη φωσφορυλίωσή τους και αλλαγή στην αναλογία έκφρασης των ισομορφών της MAPK2, ίσως λόγω επίδρασης στο μηχανισμό ματίσματος του RNA (Hayes et al., 2007). Η επίδραση της SRPK1 στη δραστικότητα διαφόρων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, αποτελεί πεδίο αντιπαράθεσης, αφού η αύξηση των επιπέδων του συγκεκριμένου ενζύμου έχει συνδυαστεί τόσο με την αντίσταση, όσο και με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων απέναντι σε παράγωγα πλατίνης. Σε καρκίνους των όρχεων και των ωοθηκών, η ελάττωση της έκφρασης της SRPK1 προκαλεί αντίσταση των καρκινικών κυττάρων απέναντι στη cis-πλατίνη (Schenk et al., 2001; Schenk et al., 2004). Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση της SRPK1 προκαλεί αντίσταση των ΗΤ29 (Human colon adenocarcinoma grade II cell line) κυττάρων στην οξαλιπλατίνη (Plasencia et al., 2006), ενώ η μείωση της έκφρασής της αυξάνει την ευαισθησία καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος στην cis-πλατίνη και τη γεμσιταμπίνη (Hayes et al., 2006). Οι αντίθετες αυτές δράσεις της SRPK1 απέναντι στα διάφορα κυτταροτοξικά αντιδραστήρια έχουν αποδοθεί ότι οφείλονται στην έκφραση διαφορετκών πρωτεϊνών σε κάθε κυτταρική σειρά (Hayes et al., 2007). Αύξηση της έκφρασης της SRPK1 παρατηρείται και κατά τη χρωμοσωμική μετατόπιση t(6;17)(p21.31;q11.2), η οποία είναι υπεύθυνη για μια πληθώρα ανωμαλιών (Mansouri et al., 2006). Ακόμα, η εγκεφαλική ισχαιμία σε ποντίκι έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της SRPK1 στα βασικά γάγγλια και μετατόπισή της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Erdo et al., 2004). Η διαφοροποίηση των λευχαιμικών κυττάρων HL-60 από το ρετινοϊκό οξύ, τη βρωμοδεοξυουριδίνη και το μεσαίο Τ αντιγόνο του μεταλλαγμένου ιού του πολυόματος (Delta 205 mutant polyoma middle T antigen), προκαλούν αύξηση των επιπέδων έκφρασης της SRPK2 (Yen et al., 2004). Ακόμα, τόσο η SRPK2 όσο και η SRPK1 έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν την κεντρική πρωτεΐνη του ιού της 17

22 ηπατίτιδας Β και να αναστέλλουν την αντιγραφή του ιού, μέσω μιας οδού η οποία φαίνεται να είναι ανεξάρτητη της φωσφορυλίωσης (Zheng et al., 2005). Η SRPK3 βρίσκεται υπό τον έλεγχο του μεταγραφικού παράγοντα MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), ο οποίος παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη των μυών. Ποντίκια, από τα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της SRPK3, παρουσιάζουν μία καινούργια μορφή μυοπάθειας, ενώ διαγονιδιακά ποντίκια που την υπερεκφράζουν, εμφανίζουν σοβαρό εκφυλισμό των μυϊκών ινών και πεθαίνουν στην F0 ή F1 γενιά (Nakagawa et al., 2005). 18

23 Α.2. Γονιδιακή καταστολή που προκαλείται από μικρά δίκλωνα RNA μόρια. Α.2.1. Ιστορική αναδρομή. Η πρώτη αναφορά για τη διαδικασία της γονιδιακής αποσιώπησης μέσω των microrna μορίων έγινε το 1993, από τον Victor Ambros και τους συνεργάτες του Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum, οι οποίοι ανακάλυψαν ότι το lin-4, ένα γονίδιο που ελέγχει χρονικά την ανάπτυξη της λάρβας στον C. elegans, δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, αλλά παράγει δύο μικρά τμήματα RNA (Lee et al., 1993). Το μήκος τους είναι 22 nt και 61 nt αντίστοιχα, με το μεγαλύτερο να σχηματίζει φουρκέτα και να αποτελεί το πρόδρομο μόριο του μικρότερου. Παρατηρήθηκε ότι το lin-4 RNA ήταν μερικώς συμπληρωματικό σε 7 θέσεις της 3 μη μεταφράσιμης περιοχής του γονιδίου lin-14 (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993) (Σχήμα Α.2.1.). Το lin-14 κωδικοποιεί μια πυρηνική πρωτεΐνη, η αρνητική ρύθμιση της οποίας στο τέλος του πρώτου σταδίου της λάρβας επιφέρει την αναπτυξιακή μετάβαση στο δεύτερο στάδιο της λάρβας (Lee et al., 1993; Ruvkun et al., 1989). Η καταστολή της σύνθεσης της πρωτεΐνης του lin-14 προϋποθέτει ανέπαφη 3 μη μεταφράσιμη περιοχή του mrna (Wightman et al., 1991) και ταυτόχρονα λειτουργικό lin-4 γονίδιο. Το εργαστήριο του Ruvkun διερεύνησε περαιτέρω την ρύθμιση του lin-14 γονιδίου από το lin-4 RNA, δείχνοντας ότι αυτή η ρύθμιση μειώνει δραματικά την πρωτεΐνη που παράγεται από το lin-14 χωρίς να μεταβάλλονται τα επίπεδα του mrna του. Με βάση τα παραπάνω ευρήματα προτάθηκε ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο το lin-4 RNA σχηματίζει ζεύγη βάσεων με την 3 μη μεταφράσιμη περιοχή του γονιδίου lin-14 και οδηγεί στην καταστολή της μετάφρασης του lin-14 μηνύματος, ως μέρος του ρυθμιστικού μονοπατιού που καθορίζει τη μετάβαση από το πρώτο στο δεύτερο στάδιο της λάρβας του C. elegans (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). 19

24 Σχήμα Α.2.1. Τα μοριακά χαρακτηριστικά του lin-4, του πρώτου microrna που ανακαλύφθηκε. (a) Η πρόδρομη και ώριμη δομή της αλληλουχία του lin-4. (b) Συμπληρωματικότητα βάσεων μεταξύ του lin-4 (κόκκινο) και της 3 μη μεταφράσιμης περιοχής του lin-14 mrna (μπλε). Το lin-4 είναι μερικώς συμπληρωματικό σε 7 θέσεις στην 3 μη μεταφράσιμη περιοχή του lin-14. Η δέσμευση σ αυτές τις θέσεις προκαλεί καταστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το lin-14. RISC, RNA-induced silencing complex. Με ανάλογο μηχανισμό, το lin-4, ρυθμίζει επίσης αρνητικά τη μετάφραση του γονιδίου lin-28, που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που φέρει μια περιοχή ψυχρού σοκ (cold shock domain). Η καταστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης του συγκεκριμένου γονιδίου έχει ως αποτέλεσμα την αναπτυξιακή μετάβαση από το δεύτερο στο τρίτο στάδιο της λάρβας του νηματοειδούς γαιοσκώληκα (Moss et al., 1997). Συγκριτικά με το lin-14, το lin-28 έχει λιγότερες θέσεις δέσμευσης για το lin-4, γεγονός που μπορεί να ερμηνεύσει την καθυστερημένη μεταφραστική καταστολή (Pasquinelli and Ruvkun, 2002; Moss et al., 1997). Το 2000, επτά χρόνια αργότερα ανακαλύφθηκε ένα ακόμη γονίδιο του C. elegans, το let-7, που κωδικοποιεί ένα μόριο RNA μήκους 22 bp και ρυθμίζει αρνητικά το let-41 γονίδιο, με ανάλογο μηχανισμό, επάγοντας τη μετάβαση από το τελευταίο στάδιο της λάρβας στο ενήλικο άτομο (Reinhart et al., 2000; Slack et al., 20

25 2000). Επίσης, ομόλογα γονίδια του let-7 ανακαλύφθηκαν στο γένωμα του ανθρώπου και της μύγας, ενώ το let-7 RNA εντοπίστηκε στον άνθρωπο, στη Drosophila και σε άλλα έντεκα αμφιπλευροσυμμετρικά ζώα (Pasquinelli et al., 2000). Εξαιτίας του κοινού ρόλου που διαδραματίζουν στον χρονικό έλεγχο της μετάβασης ανάμεσα στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια, τα lin-4 και let-7 χαρακτηρίστηκαν ως small temporal RNAs (strnas), με την ελπίδα ότι θα ανακαλύπτονταν κι άλλα ρυθμιστικά RNAs αυτού του είδους (Pasquinelli et al., 2000). Πραγματικά, ένα χρόνο αργότερα, δημοσιεύθηκαν πάνω από 100 γονίδια που κωδικοποιούν μικρά μη μεταφραζόμενα μόρια RNAs, περίπου 20 στη Drosophila, 30 στον άνθρωπο και 60 στους σκώληκες (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001). Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών μοιάζουν με τα lin-4 και let-7 RNAs στο γεγονός ότι είναι ενδογενή μόρια μήκους 22 νουκλεοτιδίων που προέρχονται από τον ένα βραχίονα ενός πρόδρομου τμήματος RNA σχήματος φουρκέτας και είναι εξελικτικά συντηρημένα. Αντίθετα, διαφέρουν στο γεγονός ότι πολλά από αυτά δεν εκφράζονται σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια, αλλά σε διακριτούς κυτταρικούς τύπους. Συνεπώς χρησιμοποιήθηκε ο όρος micrornas που συμπεριλαμβάνει τα strnas και όλα τα μικρά RNAs με παρόμοια χαρακτηριστικά αλλά άγνωστες μέχρι τότε λειτουργίες (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001). Παράλληλα με την ανακάλυψη του let-7, μικρά RNAs ταυτοποιήθηκαν ως συστατικά μιας φαινομενικά διακριτής βιολογικής διαδικασίας, της RNA παρεμβολής (RNA interference). Η RNA παρεμβολή είναι ένας εξελικτικά συντηρημένος μηχανισμός, που προκαλεί εξειδικευμένη γονιδιακή καταστολή, η οποία επάγεται με την έκθεση σε δίκλωνο RNA (Elbashir et al., 2001). Σε πολλά συστήματα, συμπεριλαμβανομένων των φυτών, σκωλήκων και μυγών το ερέθισμα που χρησιμοποιήθηκε για την RNA παρεμβολή ήταν η εισαγωγή δίκλωνου RNA 500 bp. Οι Fire, Mello και συνεργάτες χρησιμοποίησαν αντινοηματικό RNA για να καταστείλουν τη γονιδιακή έκφραση. Η επαναστατική τους ανακάλυψη ήταν ότι προσπαθώντας να διερευνήσουν τη συνέργεια του νοηματικού RNA με το αντινοηματικό, ανακάλυψαν ότι το μίγμα με το δίκλωνο RNA ήταν τουλάχιστον δέκα φορές ισχυρότερο ως κατασταλτικό ερέθισμα σε σχέση με τη δράση των αντιστοίχων RNA από μόνα τους. Ταυτόχρονα ο Baulcombe και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ότι μια μορφή μικρών RNAs (21-25 nt) υπήρχε σε φυτά τα οποία υποβάλλονταν σε γονιδιακή καταστολή μέσω του RNA (Hamilton and Baulcombe, 1999), που στην 21

26 πορεία ονομάστηκαν μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (small interfering RNAs - sirnas) (Elbashir et al., 2001). A.2.2. Γενωμική των mirnas. Τα περισσότερα mirna γονίδια εντοπίζονται σε διακριτές περιοχές του γενώματος και αποτελούν ανεξάρτητες μεταγραφικές μονάδες (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros 2001). Ωστόσο, ένα μέρος βρίσκεται στα ιντρόνια των πρόδρομων mrnas. Έχουν ως επί το πλείστον, τον ίδιο προσανατολισμό με τα mrnas από τα οποία προέρχονται, υποδηλώνοντας ότι τα περισσότερα από αυτά δεν μεταγράφονται από δικούς τους προαγωγούς αλλά προέρχονται από ιντρόνια (Aravin et al., 2003; Lagos-Quintana et al., 2003; Lai et al., 2003; Lim et al., 2003a). Η διάταξη αυτή παρέχει έναν ευνοϊκό μηχανισμό για τη συντονισμένη έκφραση ενός mirna και της πρωτεΐνης που ρυθμίζει, γεγονός που εξηγεί την συντηρημένη εξελικτική σχέση που υπάρχει ανάμεσα στα mirnas και τα πρόδρομα mrnas που τα εμπεριέχουν (Aravin et al., 2003). Άλλα mirna γονίδια διατάσσονται ομαδικά στο γένωμα και εμφανίζουν πρότυπα έκφρασης πολυκιστρονικών πρωτογενών μεταγράφων (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001). Παρόλο που τα περισσότερα mirna γονίδια του ανθρώπου και του σκώληκα είναι μεμονωμένα (Lim et al., 2003a, 2003b), πάνω από τα μισά mirnas της Drosophila διατάσσονται ομαδικά (Aravin et al., 2003). Τα mirnas που εντοπίζονται ομαδοποιημένα στο γένωμα συχνά, αλλά όχι πάντα, σχετίζονται μεταξύ τους και αντίστοιχα σχετιζόμενα mirnas είναι μερικές φορές ομαδοποιημένα (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001). Σχεδόν όλα τα mirna γονίδια είναι συντηρημένα σε συγγενή ζώα, όπως ο άνθρωπος και το ποντίκι, ή ο C. elegans και ο C. briggsae (Lagos-Quintana et al., 2003; Lim et al., 2003a, 2003b). Πολλά είναι επίσης συντηρημένα σε φυλογενετικά απομακρυσμένα είδη (Ambros et al., 2003b; Aravin et al., 2003; Lagos-Quintana et al., 2003; Lim et al., 2003a). Για παράδειγμα, άνω του ένα τρίτου των mirna γονιδίων του C. Elegans έχουν εντοπιστεί στον άνθρωπο ως ομόλογα γονίδια. 22

27 A.2.3. Βιογένεση των mi/sirnas. Στάδιο έναρξης Δύο διαδοχικά γεγονότα οδηγούν στο σχηματισμό ώριμων mirnas στα ζώα. Στο πρώτο, τα πρωτογενή mirna μετάγραφα (pri-mirnas) καταλήγουν σε πρόδρομα μόρια mirna (pre-mirnas) μήκους ~70 νουκλεοτιδίων και στο δεύτερο τα pre-mirnas υφίστανται νουκλεόλυση παράγοντας ώριμα mirnas μήκους ~21-25 νουκλεοτιδίων (Lee et al., 2002). Τα υπεύθυνα ένζυμα για τις δύο διαδοχικές τμήσεις είναι η Drosha και η Dicer αντίστοιχα (Σχήμα Α.2.2.) (Lee et al., 2003; Hutvagner et al., 2001). Και τα δύο αυτά ένζυμα ανήκουν στις ενδονουκλεάσες τύπου RNase III και εξειδικεύονται στην ενδονουκλεόλυση δίκλωνου RNA παράγοντας στη θέση της τμήσης, 3 προεξέχοντα άκρα μήκους 2 νουκλεοτιδίων. Η Drosha εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και περιέχει 2 περιοχές RNase III, μια περιοχή δέσμευσης dsrna και ένα αμινο-τελικό τμήμα άγνωστης λειτουργίας (Lee et al., 2003). Καταλύει την νουκλεόλυση των pri-mirnas σε pre-mirnas μήκους ~70 νουκλεοτιδίων που σχηματίζουν δομή ατελούς φουρκέτας (Σχήμα Α.2.2.) (Lee et al., 2003). Παρόλο που ο ακριβής μηχανισμός που χρησιμοποιεί η Drosha για να διακρίνει τα pri-mirnas παραμένει άγνωστος, διάφορες εργασίες καταδεικνύουν τα χαρακτηριστικά των primirnas που επάγουν την τμήση από την Drosha in vivo και in vitro (Lee et al. 2003; Zeng and Cullen, 2003). Η ικανότητα κατάλυσης της Drosha εξαρτάται από το μέγεθος και το σχήμα της φουρκέτας και την αλληλουχία στο σημείο της νουκλεόλυσης. Βράχυνση της φουρκέτας, διαταραχή της συμπληρωματικότητας στο εσωτερικό της και αφαίρεση ή μετάλλαξη της αλληλουχίας νουκλεόλυσης από την Drosha, μειώνουν σημαντικά αν όχι εξαφανίζουν την νουκλεόλυση των pri-mirnas από την Drosha. Μετά την νουκλεόλυση από τη Drosha, τα πρόδρομα mirnas βγαίνουν από τον πυρήνα με τη βοήθεια της Exportin 5, μιας Ran-GTP πρωτεΐνης-μεταφορέα που βρίσκεται στο σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου (Lund et al., 2004). Στο κυτταρόπλασμα, η βιογένεση των mirnas και των sirnas ακολουθεί κοινή πορεία. Τα πρόδρομα mirnas και τα δίκλωνα RNAs από τα οποία θα προκύψουν τα sirnas, νουκλεολύονται από το ένζυμο Dicer, καταλήγοντας σε δίκλωνα τμήματα μήκους ~21 νουκλεοτιδίων, που έχουν 5 φωσφορυλιωμένα άκρα και 3 προεξέχοντα άκρα μήκους 2 νουκλεοτιδίων. 23

28 Σχήμα Α.2.2. Μηχανισμός μετα-μεταγραφικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης από τα μικρά RNAs. Τα πρωτογενή mirna μετάγραφα νουκλεολύονται από το ένζυμο Drosha σε πρόδρομα mirnas. Η έξοδός τους στο κυτταρόπλασμα γίνεται με τη δράση του μεταφορέα exportin 5. Τα πρόδρομα mirnas επεξεργάζονται περαιτέρω από την Dicer προς σχηματισμό μικρότερων δίκλωνων μορίων. Αυτά στη συνέχεια ξεδιπλώνονται καθώς συμπλοκοποιούνται στο σύμπλοκο RISC. Τα ώριμα mirnas δεσμεύονται με τις πρωτεΐνες Ago, οι οποίες καταλύουν την καταστολή της μετάφρασης ή την αποικοδόμηση του mrna στόχου. Όπως και τα πρωτογενή mirnas, έτσι και τα δίκλωνα μόρια που προέρχονται από άλλες πηγές, διασπώνται από την Dicer σε δίκλωνα ενδιάμεσα μήκους nt. Με τη βοήθεια της ελικάσης Armitage και της πρωτεΐνης R2D2, δημιουργείται το σύμπλοκο RISC που περιέχει μονόκλωνο sirna. Η σταθερότητα των dsrnas και η αναγνώρισή τους από την Dicer ρυθμίζεται από εξειδικευμένες ADARs (Adenosine Deaminases Acting on RNAs) και την εξωνουκλεάση ERI-1 (Meister and Tuschl, 2004). 24

29 Αρχικά, η Dicer αναγνωρίζει το δίκλωνο τμήμα του πρόδρομου mirna, έχοντας μεγάλη αγχιστεία για την 5 -φωσφορική ομάδα και τα 2 νουκλεοτίδια που προεξέχουν στο 3 άκρο στη βάση της θηλιάς του πρόδρομου mirna. Στη συνέχεια, καταλύει την τμήση και των δυο κλώνων στο σημείο που βρίσκεται δυο στροφές έλικας μακριά από την θηλιά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση της θηλιάς και το σχηματισμό ενός ατελούς δίκλωνου μορίου mirna μήκους ~21 νουκλεοτιδίων που φέρει τη φωσφορική ομάδα στο 5 άκρο και έχει 3 προεξέχοντα άκρα μήκους 2 νουκλεοτιδίων (Σχήμα Α.2.3., βήμα 4). Το δίκλωνο mirna που δημιουργείται από τη δράση της Dicer αποτελείται από το ώριμο mirna και το συμπληρωματικό του, mirna*. Έχει βρεθεί σε βιβλιοθήκες κλωνοποιημένων mirnas ότι οι αλληλουχίες των mirnas* υπάρχουν συνήθως σε πολύ μικρότερη συχνότητα (περίπου 100 φορές λιγότερο) σε σχέση με τα mirna (Lagos Quintana et al., 2002; Aravin et al., 2003; Lim et al.,2003a). Αυτή η αναλογία υποδεικνύει ότι το mirna* έχει πολύ μικρό χρόνο ημιζωής πιθανώς λόγω αποικοδόμησης. Η Dicer αποτελείται από μια περιοχή ελικάσης/atpase, μια περιοχή άγνωστης λειτουργίας, DUF283, μια περιοχή PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille), δύο περιοχές RNase III και μια περιοχή δέσμευσης δίκλωνου RNA (dsrdb) (Σχήματα Α.2.4., Α.2.5.). Η περιοχή PAZ αναγνωρίζει τα 3 προεξέχοντα άκρα που δημιουργούνται με τη δράση της Drosha. Κατά την επεξεργασία των dsrnas από την Dicer οι δύο περιοχές RNase III σχηματίζουν ένα ενδομοριακό διμερές που αποτελεί το καταλυτικό κέντρο του ενζύμου για τη νουκλεόλυση του dsrna. 25

30 Σχήμα A.2.3. Η βιογένεση των mirnas και sirnas. (Α) Η βιογένεση ενός φυτικού mirna. (B) Η βιογένεση ενός mirna μεταζώου. (Γ) Η βιογένεση ενός ζωικού sirna. Σχήμα A.2.4. Κρυσταλλική δομή της Dicer. 26

31 Η Dicer ανακαλύφθηκε αρχικά στη Drosophila (Bernstein et al., 2001) κι έπειτα σε μια πληθώρα ευκαρυωτικών οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων του ανθρώπου, των μυκήτων και των φυτών. Κάποιοι οργανισμοί έχουν μια Dicer (Verdel et al., 2004; Volpe et al., 2002; Zhang et al., 2002, 2004; Billy et al., 2001; Provost et al., 2002a, 2002b; Tabara et al., 2002), ενώ άλλοι πολλές. Στη Drosophila υπάρχουν 2 ομόλογες Dicer, η DCR1 και η DCR2. Η DCR1 είναι υπεύθυνη για την επεξεργασία των mirnas, ενώ η DCR2 για τα sirnas (Lee et al., 2004; Okamura et al., 2004; Liu et al., 2003). Η πρωτεΐνη R2D2 της μύγας, που έχει 2 περιοχές πρόσδεσης dsrna, σχηματίζει διμερές με την DCR2 και παίζει κυρίαρχο ρόλο στη σύνδεση του σταδίου έναρξης με το στάδιο αποτελέσματος (Liu et al., 2003; Tomari et al., 2004). Αναστολή τόσο της DCR2 όσο και της R2D2, οδηγεί στην απώλεια του μηχανισμού της RNA παρεμβολής. Η επεξεργασία των dsrna από το διμερές DCR2/R2D2 είναι AΤΡ εξαρτώμενη (Lee et al.,2004; Liu et al., 2003; Nykanen et al., 2001). Στο C. elegans υπάρχει μόνο η DCR-1, η οποία απαιτείται για την επεξεργασία των mi/sirnas. Το ένζυμο αυτό αλληλεπιδρά με την RDE-4, μια πρωτεΐνη που δεσμεύεται σε δίκλωνα μόρια RNA, ομόλογη της R2D2, με μια πρωτεΐνη της οικογένειας Argonaute, την RDE-1 και μια DExH-box RNA ελικάση, την DRH-1. Η αλληλεπίδραση των παραπάνω πρωτεϊνών επάγει την έναρξη της RNA παρεμβολής στο σκουλήκι (Dudley et al., 2002; Elbashir et al., 2001). Τα θηλαστικά έχουν επίσης ένα γονίδιο της Dicer, γεγονός που σημαίνει ότι υπάρχουν άλλες πρωτεΐνες που έχουν περιοχές δέσμευσης dsrna που δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί κι επιτρέπουν την αναγνώριση από την Dicer dsrnas από διαφορετικές πηγές. Στάδιο αποτελέσματος (Effector step) Τα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια (RNPs) που περιέχουν τα δίκλωνα sirnas και mirnas μεταβαίνουν στο στάδιο του αποτελέσματος που έχει ως κύριο συστατικό το σύμπλοκο αποτελέσματος RISC (RNA Induced Silencing Complex) (Hammond et al., 2000). Η εξειδίκευση στόχου και πιθανώς η αποτελεσματική λειτουργία του mirna απαιτεί την ενσωμάτωση μόνο του ώριμου mirna στο σύμπλοκο RISC. Καθώς η Dicer επεξεργάζεται το πρόδρομο mirna προς σχηματισμό του δίκλωνου mirna:mirna*, η σταθερότητα των 5 άκρων του είναι συνήθως διαφορετική. Παρόλο που τα ώριμα mirnas μπορεί να προέρχονται από οποιονδήποτε κλώνο, σχεδόν πάντα παράγονται από τον κλώνο με το λιγότερο 27

32 σταθερό 5 άκρο (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Αυτή η επιλεκτικότητα πιθανώς αντανακλά την ευκολία με την οποία ξετυλίγεται το δίκλωνο μόριο από το ασταθές του άκρο (Σχήμα A.2.3.). Συνεπώς, οι θερμοδυναμικές ιδιότητες του πρόδρομου mirna, καθορίζουν την ασύμμετρη σύνδεση στο σύμπλοκο RISC και κατ επέκταση την εξειδίκευση στόχου για μετα-μεταγραφική αποσιώπηση. Ωστόσο, σε σπάνιες περιπτώσεις κατά τις οποίες το mirna και το mirna* έχουν παρόμοια 5 σταθερότητα, το καθένα έχει ίσες πιθανότητες να ενσωματωθεί στο RISC. Αυτό το θερμοδυναμικό μοντέλο ισχύει και για τα sirnas με ανάλογο τρόπο (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Έχουν ανακαλυφθεί πολλά σύμπλοκα RISC που διαφέρουν στο μέγεθος και στη σύστασή τους και πιθανώς αυτό αντανακλά διαφορές στη δραστικότητά τους και ίσως στη λειτουργία τους. Η εκτιμώμενη φαινόμενη μοριακή μάζα τους ποικίλει από 130 εως 160 kda κατά την απομόνωσή τους από ανθρώπινα κύτταρα παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων (Martinez et al. 2002; Martinez and Tuschl, 2004) και από 500 kda ως 80S σε κυτταρικά εκχυλίσματα D. melanogaster (Nykanen et al., 2001; Hammond et al., 2001; Hutvagner and Zamore 2002). Η συγκρότηση του συμπλόκου RISC είναι ATP εξαρτώμενη (Nykanen et al., 2001), κάτι που πιθανώς αντανακλά τις ενεργειακές απαιτήσεις κατά το ξεδίπλωμα του δίκλωνου sirna/mirna και/ή άλλες αλλαγές στη διαμόρφωση ή σύσταση του ριβοπρωτεϊνικού συμπλόκου ώστε να αποκτήσει την τελική του μορφή. Οι πιθανοί παράγοντες που επάγουν αυτές τις ενεργειακά εξαρτώμενες αλλαγές είναι οι DEAD box RNA ελικάσες. Αρκετές ATPases έχουν εμπλακεί στην RNA παρεμβολή, αλλά μόνο μια έχει χαρακτηριστεί λεπτομερώς. Στη D. Melanogaster, η DEAD box RNA ελικάση Armitage, απαιτείται για τη συγκρότηση του συμπλόκου RISC, μετά την επεξεργασία του πρόδρομου dsrna από την Dicer (Tomari et al., 2004b; Cook et al., 2004). Βασικά συστατικά όλων των συμπλόκων RISC είναι μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Argonaute (Ago). Κάθε σύμπλοκο RISC φέρει μια Ago πρωτεΐνη, η οποία είναι πολύ στενά συνδεδεμένη με το μονόκλωνο sirna/mirna (Martinez and Tuschl, 2004). Η πρωτεΐνη Ago έχει μοριακή μάζα ~100 kda και αποτελείται από δυο συντηρημένες περιοχές: την PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille) και την PIWI (Carmell et al., 2002) (Σχήμα Α.2.5.). Η περιοχή PIWI φαίνεται να αλληλεπιδρά με την Dicer (Tahbaz et al., 2004). Κρυσταλλογραφικά δεδομένα μιας πρωτεΐνης Ago από αρχαιοβακτήριο αποκάλυψαν εξαιρετική ομοιότητα της περιοχής PIWI με την 28

33 οικογένεια RNase H (Song et al., 2004). Καθώς η RNase H νουκλεολύει RNA/DNA υβρίδια, προτάθηκε ότι οι πρωτεΐνες Ago κόβουν τα υβρίδια mrna στόχος/sirna. Η PAZ είναι μια περιοχή δέσμευσης RNA (RNA Binding Domain), που αναγνωρίζει ειδικά τα άκρα του δίκλωνου mirna/sirna συμπεριλαμβανομένων και των 3 προεξεχόντων άκρων. (Lingel et al., 2004). Αυτή η αλληλεπίδραση εξασφαλίζει την σωστή μετάβαση των μικρών RNAs στο σύμπλοκο RISC, ελαχιστοποιώντας την πιθανότητα λανθασμένης επεξεργασίας του RNA κατά το στάδιο του αποτελέσματος. Ο τρόπος με τον οποίο μονόκλωνα sirnas/mirnas δεσμεύονται στην πρωτεΐνη Ago μετά το ξεδίπλωμα των δίκλωνων RNA δεν είναι πλήρως κατανοητός γιατί η έκφραση ανασυνδυασμένης Ago πλήρους μεγέθους είναι πολύ δύσκολη. Σχήμα A.2.5. Δομικές και λειτουργικές περιοχές πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επεξεργασία των si/mirnas. Οι πρωτεΐνες Dicer και Ago φέρουν PAZ περιοχές. Οι Ago περιέχουν μια επιπλέον περιοχή, την PIWI. Οι Armitage και Dicer περιέχουν περιοχές RNA ελικάσης. Οι Dicer και Drosha περιέχουν περιοχές RNase III (RIIIa, RIIIb). Περιοχές αλληλεπίδρασης με δίκλωνο RNA υπάρχουν στις Dicer, Drosha, και R2D2. Η DCR-1 της Drosophila και η ανθρώπινη Dicer φέρουν μια παρόμοια περιοχή άγνωστης λειτουργίας (DUF283). Διαφορετικοί οργανισμοί έχουν αριθμό πρωτεϊνών Ago που ποικίλει από 1 στον Schizosaccharomyces pombe, εως 20 στο νηματώδη γαιοσκώληκα (Carmell et al., 2002). Στο φυτό A. thaliana έχουν ταυτοποιηθεί 10 μέλη (Hunter et al., 2003), 5 στη D. Melanogaster (Williams et al., 2002) και 8 στον άνθρωπο (Sasaki et al., 2003). 29

34 Στα είδη που εκφράζουν άνω των μια Dicer πρωτεϊνών, η εξειδίκευση με την οποία συμπλοκοποιούνται τα μικρά μόρια RNA στο σύμπλοκο RISC, ελέγχεται πιθανώς από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών Dicer και Ago. Στα είδη που έχουν μια μόνο Dicer, είναι άγνωστο κατά πόσο η σύνδεση των dsrna που προέρχονται από διαφορετικές πηγές στο σύμπλοκο RISC ελέγχεται από τα μέλη των Ago πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες Ago μπορεί να έχουν αναπτύξει κάποια εσωτερική αλληλουχία που καθορίζει την επιλεκτική σύνδεση RNA μορίων συγκεκριμένης αλληλουχίας και προέλευσης (Meister and Tuschl, 2004). Μια μελέτη στη D. melanogaster αποκάλυψε ότι η AGO1 απαιτείται για τη συσσωμάτωση των mirnas ενώ η AGO2 χρειάζεται για την αποικοδόμηση του mrna στόχου μέσω των sirnas (Okamura et al., 2004). Επιπλέον άλλες δύο μελέτες σε ανθρώπινα κύτταρα έδειξαν ότι οι AGO1-AGO4 σχετίζονται με τα mirnas/sirnas, αλλά μόνο η AGO2 (παρουσιάζει) επηρεάζει τη δραστηριότητα του συμπλόκου RISC (Meister et al., 2004; Liu et al., 2004). Ωστόσο, η εξακρίβωση της λειτουργίας καθεμιάς από τις πρωτεΐνες Ago παραμένει μια πρόκληση στο πεδίο της RNA παρεμβολής και των micrornas. Εκτός από τις πρωτεΐνες Ago και τα μικρά μόρια RNA που συγκροτούν μέρος του συμπλόκου RISC, έχουν ταυτοποιηθεί κι άλλες πρωτεΐνες από απομονωμένα σύμπλοκα RISC. Στη D. melanogaster, έχουν ανακαλυφθεί 3 συστατικά: το προϊόν του Vasa Intronic Gene (VIG), η πρωτεΐνη που σχετίζεται με το εύθραυστο Χ (dfxr) και η πρωτεΐνη που φέρει την περιοχή Tudor Staphylococcal Nuclease (Tudor SN) (Σχήμα Α.2.6.) (Caudy et al., 2002; Caudy et al., 2003). Σε ανθρώπινα συστήματα, παρατηρήθηκαν αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης AGO2 με την πρωτεΐνη eif2c2 (Eukaryotic translation Initiation Factor 2C2) και με την πρωτεΐνη FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein), που είναι ομόλογη της dfxr. (Jin et al., 2004). Επίσης σε ανθρώπινα κύτταρα εντοπίστηκαν και οι ελικάσες Gemin3 και Gemin4 ως μέρη του συμπλόκου RISC που επεξεργάζεται mirnas (Mourelatos et al., 2002). Η ακριβής λειτουργία όλων αυτών των πρωτεϊνών στην μετα-μεταγραφική αποσιώπηση παραμένει ασαφής. 30

35 Σχήμα Α.2.6. Μηχανισμός συγκρότησης του συμπλόκου RISC. 31

36 Α.2.4. Καταστολή της μετάφρασης και αποικοδόμηση του mrna. Το μονόκλωνο sirna/mirna του συμπλόκου RISC οδηγεί στην αποικοδόμηση του mrna στόχου όταν υπάρχει τέλεια ή σχεδόν τέλεια συμπληρωματικότητα βάσεων (Martinez et al., 2002; Martinez and Tuschl, 2004). Αντίθετα, σε περίπτωση ατελούς συμπληρωματικότητας, επάγεται η καταστολή της μετάφρασης. Στη συντριπτική τους πλειοψηφία, τα mirnas παρουσιάζουν ατελή συμπληρωματικότητα και συνεπώς καθοδηγούν καταστολή της μετάφρασης του στόχου, ενώ αντίθετα τα sirnas εμφανίζουν τέλεια συμπληρωματικότητα και προκαλούν την αποικοδόμηση του RNA στόχου. Καταστολή της μετάφρασης Α. Μηχανισμοί καταστολής μετά την έναρξη της μετάφρασης: i. Καταστολή της επιμήκυνσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Πρόσφατες μελέτες σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών έδειξαν ότι τα mirnas παρεμποδίζουν την πρωτεϊνική σύνθεση μετά την έναρξη της μετάφρασης (Seggerson et al., 2002; Maroney et al., 2006; Nottrott et al., 2006; Peterson et al., 2006). Κοινή παρατήρησής τους ήταν το γεγονός ότι κατά το διαχωρισμό σε διαβαθμίσεις σουκρόζης τα mirnas και οι στόχοι τους συνδέονταν με πολυσώματα, τα οποία μετέφραζαν ενεργώς τους mrna στόχους. Μάλιστα, τα πολυσώματα ήταν ευαίσθητα σε μια σειρά από συνθήκες που καταστέλλουν τη μετάφραση (Σχήμα Α.2.7.Α.). ii. Συμμεταφραστική πρωτεϊνική αποικοδόμηση. Η παράδοξη παρατήρηση ότι τα πολυσώματα μεταφράζουν και ωστόσο δεν ανιχνεύεται το πρωτεϊνικό προϊόν, οδήγησε στην πρόταση ότι η πολυπεπτιδική αλυσίδα μπορεί να αποικοδομείται συμμεταφραστικά (Σχήμα Α.2.7.Β) (Nottrott et. al, 2006). Η πρόταση αυτή όμως μειονεκτεί γιατί στηρίζεται σε έμμεσες ενδείξεις. Η πιθανή πρωτεάση δεν έχει ταυτοποιηθεί, ενώ αναστολείς του πρωτεασώματος δεν προκαλούν αποκατάσταση της αποσιώπησης. iii. Πρώιμος τερματισμός της μετάφρασης με απομάκρυνση των ριβοσωμάτων (ribosome drop off). Ο Peterson και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι κατά την καταστολή της μετάφρασης προκαλούμενη από sirnas, παρατηρείται ταχεία αποσύνδεση των ριβοσωμάτων. 32

37 Σχήμα A.2.7. Μηχανισμοί γονιδιακής καταστολής μέσω των mirnas. (Α) Μηχανισμοί καταστολής μετά την έναρξη της μετάφρασης. Τα micrornas (κόκκινα) καταστέλλουν την μετάφραση των mrna στόχων, εμποδίζοντας το στάδιο επιμήκυνσης της πεπτιδικής αλυσίδας ή επάγοντας πρώιμη αποδιάταξη των ριβοσωμάτων. (Β) Συμμεταφραστική πρωτεϊνική αποικοδόμηση. Σύμφωνα μ αυτό το μηχανισμό, η σχηματιζόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα αποικοδομείται συμμεταφραστικά. Η πιθανή πρωτεάση είναι άγνωστη. (C-E) Μηχανισμοί αποσιώπησης κατά την έναρξη. (C) Οι πρωτεΐνες Ago συναγωνίζονται με τον παράγοντα eif4e για τη σύνδεση στη δομή cap. (D) Οι πρωτεΐνες Ago στρατολογούν τον παράγοντα eif6, ο οποίος δεν επιτρέπει τη σύζευξη της μεγάλης με τη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα. (Ε) Οι πρωτεΐνες Ago παρεμποδίζουν το σχηματισμό δομής θηλιάς του mrna, μ έναν μηχανισμό που δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως αλλά περιλαμβάνει αποαδενυλιώσεις. (F) Αποικοδόμηση του mrna. Τα micrornas επάγουν την αποαδενυλίωση και την απομάκρυνση της cap δομής από το mrna στόχο. Οι πρωτεΐνες CAF1, CCR4 και το σύμπλοκο ΝΟΤ ανήκουν στο κύριο σύμπλεγμα αποαδενυλασών, ενώ η πρωτεΐνη DCP2, είναι ένα ένζυμο που απομακρύνει τη δομή cap. 33

38 Β. Μηχανισμοί καταστολής της έναρξης της μετάφρασης. i. Συναγωνισμός της πρωτεΐνης Ago με τον παράγοντα eif4e για την πρόσδεση στην δομή cap. Η Kiriakidou και οι συνεργάτες της (2007) παρατήρησαν ότι η κεντρική περιοχή των πρωτεϊνών Ago, παρουσιάζει ομοιότητα στην αλληλουχία με τον κυτταροπλασματικό παράγοντα, eif4e (eukaryotic translation initiation factor 4E) που δεσμεύεται στην cap δομή και είναι απαραίτητος στην εξαρτώμενη από τη δομή cap, έναρξη της μετάφρασης. Ο παράγοντας eif4e δεσμεύεται στην m 7 Gppp-cap δομή μέσω δύο τρυπτοφανών. Στην αντίστοιχη θέση των 2 τρυπτοφανών, οι Ago φέρουν δυο φαινυλαλαλίνες. Μετάλλαξη μιας από τις δύο φαινυλαλαλίνες σε βαλίνη έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της δράσης των mirnas. Αυτά τα αποτελέσματα στηρίζουν την άποψη ότι τα mirnas εμποδίζουν τη μετάφραση στο στάδιο της αναγνώρισης της δομής cap, εκτοπίζοντας τον παράγοντα eif4e από τη δομή cap (Σχήμα Α.2.7.C.). ii. Παρεμπόδιση του σχηματισμού συμπλόκου μεταξύ των δυο ριβοσωμικών υπομονάδων. Σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη AGO2 στρατολογεί τον παράγοντα eif6, ο οποίος δεσμεύεται στην μεγάλη ριβοσωμική μονάδα, μην επιτρέποντας την πρόσδεση των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων (Σχήμα Α.2.7.D.) (Chendrimada et al., 2007). Αποικοδόμηση του mrna Τα sirnas καθοδηγούν την αποικοδόμηση του mrna στόχου τους με την ενδονουκλεολυτική δράση των πρωτεϊνών Argonaute. Αντίθετα, τα mirnas, προκαλούν αποικοδόμηση του στόχου τους, κατευθύνοντάς τον στο γενικό μηχανισμό αποικοδόμησης mrna (με εξαίρεση τα mirnas που έχουν τέλεια συμπληρωματικότητα βάσεων με το mrna). Τα συστατικά που εμπλέκονται στο μηχανισμό αυτό είναι οι πρωτεΐνες Ago, η πρωτεΐνη GW182 που εντοπίζεται στα σωμάτια Ρ, το σύμπλοκο αποαδενυλάσης CAF1-CCR4-NOT, το ένζυμο DCP2 που απομακρύνει τη δομή cap και άλλες βοηθητικές πρωτεΐνες, όπως οι DCP1, Ge-1, EDC3 και RCK/p54 (Εικόνες Α.2.7.F., Α.2.8.) (Behm-Ansmant et al., 2006, Eulalio et al., 2007). Σύμφωνα με το κυρίαρχο μοντέλο στην απλή του μορφή, η πρωτεΐνη GW182 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Argonaute, στρατολογώντας το σύμπλοκο RISC με το mrna στόχο στα σωμάτια Ρ. Εκεί το mrna αποαδενυλιώνεται από τις τοπικές αποαδενυλάσες και είτε αφαιρείται η cap δομή του και αποικοδομείται ή 34

39 παραμένει αποθηκευμένο (απομονωμένο από το μηχανισμό της μετάφρασης). Ωστόσο παραμένει ανοικτό το ερώτημα κατά πόσο η στρατολόγηση στα σωμάτια Ρ είναι το αίτιο ή το αποτέλεσμα της καταστολής (Eulalio et al., 2008). Σχήμα Α.2.8. Μηχανισμοί γονιδιακής καταστολής μέσω των mirnas. Α.2.5. Μεταγραφική καταστολή και RNAi. Στα φυτά, τα sirnas μπορεί να κατευθύνουν τη μεθυλίωση ομολόγων τμημάτων DNA. Όταν η μεθυλίωση αυτή αφορά προαγωγούς γονιδίων, τότε επάγεται η καταστολή γονιδίου σε επίπεδο μεταγραφής. Ακόμη, η μεταγραφική καταστολή στα φυτά μέσω των sirnas σχετίζεται με τροποποίηση της χρωματίνης και συγκεκριμένα μεθυλίωση της λυσίνης 9 της ιστόνης 3 (Σχήμα Α.2.9.) (Zilberman et al., 2003). Η ίδια τροποποίηση λαμβάνει χώρα και στη ζύμη και έχει ως αποτέλεσμα τη δέσμευση της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης 1 και της πρωτεΐνης Swi6 και ακολούθως τη μεταγραφική καταστολή (Volpe et al., 2002). Αυτή η καταστολή απαιτεί τη 35

40 συμμετοχή των πρωτεϊνών Dicer, Ago1 και RdRP (RNA dependent RNA Polymerase) (Volpe et al., 2002). Μέχρι πρόσφατα δεν υπήρχαν στοιχεία για τη λειτουργία παρόμοιων μονοπατιών στα θηλαστικά. Ο Kawasaki και οι συνεργάτες του (Kawasaki and Taira, 2004) συνέθεσαν ορισμένα sirnas, που στόχευαν ειδικά εναντίον της πλούσια σε GC περιοχής του πρωαγωγού του γονιδίου της Ε-cadherin. Μετά από επιμόλυνση κυττάρων με ομόλογα sirnas οι κυτοσίνες της περιοχής στόχου είχαν μεθυλιωθεί ειδικά, με αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων mrna του γονιδίου της Ε-cadherin. Επίσης ο Morris και οι συνεργάτες του (Morris et al., 2004), παρουσίασαν την καταστολή ενός ενσωματωμένου διαγονιδίου μετά από επιμόλυνση με ένα sirna που είχε ομολογία με μέρος της αλληλουχίας του υποκινητή του. Ωστόσο, η εμπλοκή των sirnas σε επίπεδο μεταγραφής στα θηλαστικά απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Σχήμα Α.2.9. Μοντέλα τροποποίησης της χρωματίνης που προκαλείται από τα sirnas. Η μεθυλοτρανσφεράση ιστονών (ΗΜΤ) ή DNA (DMT) στρατολογείται στην περιοχή-στόχο από ένα σύμπλοκο που περιλαμβάνει μια πρωτεΐνη Argonaute κι ένα sirna. Δύο είναι οι πιθανοί μηχανισμοί για την αναγνώριση στόχου: (a) Το sirna δεσμεύεται στο DNA στόχο και (b) Το sirna δεσμεύεται στο σχηματιζόμενο μετάγραφο του DNA με την βοήθεια της RNA pol II. 36

41 Α.2.6. Βιογένεση των mirnas στα φυτά. Παρά το γεγονός ότι τα φυτικά mirnas, φαίνεται ότι παράγονται από επιμήκη πρωτογενή μετάγραφα, η ωρίμανσή τους διαφέρει από την ωρίμανση των ζωικών mirnas, καθώς δεν έχει βρεθεί ομόλογη της Drosha στα φυτά. Ωστόσο, η οικογένεια πρωτεϊνών Dicer στο Arabidopsis thaliana, έχει ένα επίπεδο πολυπλοκότητας που δεν έχει μελετηθεί σε κανέναν άλλο οργανισμό ως τώρα (Σχήμα Α.2.10.). Υπάρχουν τέσσερις ομόλογες της Dicer πρωτεΐνες στο A. thaliana, οι DC1, DCL2, DCL3, DCL4, δύο εκ των οποίων (DCL1, DCL4) περιέχουν σήμα πυρηνικής εντόπισης (NLS). Συνεπώς, είναι πιθανό η λειτουργία της Drosha στα φυτά, να εκτελείται από ένα ή περισσότερα ένζυμα Dicer. H πρωτεΐνη DCL1, φέρει δυο σήματα πυρηνικής εντόπισης και εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στον πυρήνα όταν εκφράζεται ως πρωτεΐνη σύντηξης με GFP σε μελέτες παροδικής επιμόλυνσης (Papp et al., 2003). Στα φυτά που δεν εκφράζουν λειτουργική DCL1, η παραγωγή όλων των ώριμων mirnas μειώνεται, ενώ δεν παρατηρείται και συσσώρευση των αντίστοιχων πρόδρομων mirnas (Papp et al., 2003; Park et al., 2002). Τα πειράματα αυτά υποδεικνύουν ένα διττό ρόλο της DCL1, που περιλαμβάνει νουκλεολυτική κατάλυση όμοια της Drosha και της Dicer, εντός του πυρήνα. Συνεπώς, σύμφωνα με το μοντέλο αυτό τα ώριμα mirnas στα φυτά σχηματίζονται στον πυρήνα. Έκφραση στον πυρήνα της ιικής πρωτεΐνης Ρ19, που καταστέλλει την συσσώρευση των sirnas και mirnas, οδηγεί σε σημαντική μείωση των επιπέδων των ώριμων mirnas. Αντίθετα όταν η Ρ19 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα δεν έχει τέτοιες επιδράσεις (Papp et al., 2003). Η έξοδος του mirna/mirna* από τον πυρήνα υποβοηθάται πιθανώς από την πρωτεΐνη HASTY (Bollman et al., 2003, Yi et al., 2003; Lund et al., 2004 (Σχήμα Α.2.3.Α.). Η παρουσία πολλών Dicer μπορεί να εξηγεί την πολυπλοκότητα που παρουσιάζουν τα sirnas στα φυτά. Σε αντίθεση με τα sirnas των ζώων, που έχουν μήκος νουκλεοτίδια, τα φυτά παράγουν δυο τάξεις sirnas: και ~25 bp sirnas (Timmons et al., 2004). Εκτός από την DCL1 που είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση των mirnas, η DCL2 επεξεργάζεται τα sirnas που προέρχονται από ιούς των φυτών και η DCL3, απαιτείται για την δημιουργία των rasirnas. 37

42 Σχήμα Α Το φυλογενετικό δέντρο της οικογένειας πρωτεϊνών Dicer. Α.2.7. Βιολογικός ρόλος των mi/sirnas. Τα mirnas και sirnas στοχεύουν σε συγκεκριμένες λειτουργίες του κυττάρου. Πολλά mirnas είναι γενετικά προγραμματισμένα να ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων και γι αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικά για την ανάπτυξη και εξέλιξη ενός οργανισμού (Rhoades et al. 2002). Αντίθετα, τα sirnas σχηματίζονται από σχετικά μεγάλα μόρια δίκλωνου RNA, τα οποία συνθέτονται in vitro ή in vivo από ιούς ή επαναληπτικές αλληλουχίες και βρίσκουν ιδιαίτερη χρήση στη γενετική μηχανική. Τα μόρια δίκλωνου RNA μπορούν να σχηματιστούν και από ενδογενώς ενεργοποιημένα μεταθετά στοιχεία. Έτσι, τα sirnas φαίνεται να βρίσκουν χρήση στην: α) άμυνα εναντίων των ιών (Pfeffer et al., 2004), β) αποσιώπηση mrnas, τα οποία έχουν υπερεκφραστεί ή έχει διακοπεί η μεταγραφή τους, γ) προστασία του γονιδιώματος από διάσπαση μέσω των μεταθετών στοιχείων (Mello and Conte, 2004; Hannon, 2002). Τα mirnas που έχουν ανακαλυφθεί ως τώρα προβλέπεται να ρυθμίζουν αρκετές χιλιάδες mrna στόχους, τα οποία μπορεί να ξεπερνούν το 30% όλων των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Xie et al., 2005; Lewis et al., 2005; John et al., 2004). Η αλλαγή της έκφρασης των mirnas συνεισφέρει επίσης στην ανάπτυξη του καρκίνου. Άνω του 50% των mirnas εδράζονται σε γενωμικές περιοχές που σχετίζονται με τον καρκίνο (Calin et al., 2004). Η έκφραση των mir-15a και mir-16, που βρίσκονται ως πολυκιστρονική μονάδα στο χρωμόσωμα 13q14 μειώνεται ή 38

43 λείπει τελείως στις περισσότερες περιπτώσεις (~68%) ασθενών με χρόνια λυμφοκυτταρική λευχαιμία Β κυττάρων (B-CLL) (Calin et al., 2002). Ακόμα, ορισμένα μέλη της οικογένειας Argonaute σχετίζονται με άλλους καρκίνους. Η περιοχή του χρωμοσώματος 1p όπου εδράζονται τρία μέλη των πρωτεϊνών Argonaute (EIF2C1, hago3, hago4), εμφανίζει αλλαγές σε όγκους τύπου Wilms, νευροεκτοδέρματος και πολλούς άλλους. Μια άλλη Argonaute πρωτεΐνη, η Hiwi, εδράζεται στο 12q24 και σχετίζεται με όγκους των όρχεων (Carmell et al., 2002). Συμπερασματικά, η κατανόηση του μηχανισμού δράσης και των λειτουργιών της γονιδιακής καταστολής μέσω των RNA μορίων, μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση πολλών ασθενειών αλλά και στη χρήση των mirnas ως εργαλείων για τη διάγνωσή τους. Α.2.8. Διαφορές μεταξύ sirnas και mirnas. Τα sirnas και mirnas έχουν κοινό βιοσυνθετικό μονοπάτι και όμοιες λειτουργίες και γι αυτό δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν βάσει της χημικής τους σύστασης ή του μηχανισμού δράσης τους. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές διακρίσεις όσον αφορά τη μοριακή τους προέλευση, την εξελικτική τους συντήρηση και το είδος των γονιδίων που καταστέλλουν (Σχήμα Α.2.3.) (Bartel, 2004). Τα mirnas προέρχονται από γενωμικές περιοχές ανεξάρτητες των υπολοίπων γνωστών γονιδίων, ενώ τα sirnas δημιουργούνται από mrnas, μεταθετόνια, ιικό RNA ή ετεροχρωματινικό DNA. Τα mirnas προκύπτουν από μετάγραφα που σχηματίζουν τοπικά θηλιές, ενώ τα sirnas σχηματίζονται από επιμήκη δίκλωνα μόρια RNA. Από ένα πρόδρομο μόριο mirna δημιουργείται ένα ζεύγος mirna:mirna*, που έχει συγκεκριμένη αλληλουχία και δομή, εξαρτώμενη πιθανώς από το πρόδρομο mirna και το μηχανισμό εντός του πυρήνα που το επεξεργάζεται. Αντίθετα μια πληθώρα δίκλωνων sirnas προκύπτει με τυχαίο τρόπο από το πρόδρομο μόριο τους, οδηγώντας στη δημιουργία πολλών sirnas και από τους δύο κλώνους του. Τα mirnas είναι συνήθως εξελικτικά συντηρημένα σε συγγενείς οργανισμούς ενώ τα sirnas σπάνια διατηρούνται στην εξέλιξη. 39

44 Σε πολλές περιπτώσεις, τα mirnas συνδέονται με την 3 μη μεταφράσιμη περιοχή του στόχου τους μέσω ατελούς συμπληρωματικότητας σε διάφορες θέσεις, με αποτέλεσμα να καταστέλλουν την έκφραση του γονιδίου στόχου τους σε επίπεδο μετάφρασης. Αντίθετα, τα sirnas συνήθως συνδέονται με το στόχο τους σε μια θέση μέσω τέλειας συμπληρωματικότητας ζευγών βάσεων, επάγοντας έτσι την νουκλεόλυση του mrna στόχου. Τα ενδογενή sirnas συνήθως επάγουν την αυτο-αποσιώπηση, δηλαδή καταστέλλουν ίδιες ή παρόμοιες γενωμικές περιοχές με αυτές από τις οποίες προέρχονται, ενώ τα mirnas επάγουν την ετερο-αποσιώπηση, δηλαδή παράγονται από γονίδια διαφορετικά από εκείνα που καταστέλλουν. Α.2.9. pirnas. Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ένα νέο είδος μικρών RNAs μήκους nt, που παράγονται με έναν ανεξάρτητο της Dicer μηχανισμό και αλληλεπιδρούν με μια υποκατηγορία των Argonaute πρωτεϊνών, τις Piwi (Aravin et al., 2006; Brennecke et al., 2007; Girard et al., 2006; Grivna et al., 2006a; Gunawardane et al., 2007; Houwing et al., 2007; Lau et al., 2006; Saito et al., 2006; Vagin et al., 2006; Watanabe et al., 2006), οι οποίες είναι απαραίτητες για τη γονιμότητα θηλυκών και αρσενικών ατόμων στη Drosophila (Lin and Spradling et al., 1997). Αυτή η νέα τάξη μικρών RNAs, που αλληλεπιδρά με τις Piwi ονομάστηκαν pirnas. Σε ορισμένα συστήματα τα pirnas προέρχονται από μεταθετόνια και άλλες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Saito et al., 2006), γι αυτό και ονομάζονται εναλλακτικά rasirnas (μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs σχετιζόμενα με επαναλαμβανόμενες ακολουθίες- repeat associated small interfering RNAs) (Aravin et al., 2003). Είναι πλέον γεγονός ότι τα pirnas μπορεί να προέλθουν από επαναλαμβανόμενες ή μη DNA αλληλουχίες (Aravin et al., 2007; Brennecke et al., 2007; Houwing et al., 2007) και ότι τα rasirnas είναι μια υποκατηγορία των pirnas. Μελέτες γενετικής στο ποντίκι, τη Drosophila και το χρυσόψαρο (zebrafish) έδειξαν ότι τα pirnas είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη της σπερματικής σειράς (Σχήμα Α.2.11.) (Carmell et al., 2007; Chen et al., 2007; Cook et al., 2004; Cox et al., 1998; Cox et al., 2000; Deng and Lin, 2002; Gillespie and Berg, 1995; Houwing et al., 2007; Kuramochi-Miyagawa et al., 2004; Pane et al., 2007; 40

45 Schupbach and Wieschaus, 1991). Ωστόσο, οι πρωτεΐνες που μετέχουν στο μονοπάτι παραγωγής των pirnas, εμπλέκονται στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης και στα σωματικά κύτταρα (Grimaud et al., 2006; Pal-Bhadra et al., 2002; Pal-Bhadra et al., 2004) καθώς και στους μηχανισμούς μάθησης και μνήμης (Ashraf et al., 2006), υπονοώντας ότι τα pirnas μπορεί να επηρεάζουν ευρύτερες βιολογικές διεργασίες. Σχήμα Α Μηχανισμοί βιογένεσης των τριών κατηγοριών μικρών παρεμβαλλόμενων RNA. Στις ωοθήκες της Drosophila, η πλειοψηφία των pirnas φαίνεται να προέρχεται από έναν περιορισμένο αριθμό περικεντρομερικών και τελομερικών περιοχών πλούσιων σε αλληλουχίες ρετρομεταθετονίων (Brennecke et al., 2007). Η πλειονότητα των pirnas παράγεται από τον αντινοηματικό κλώνο των ρετρομεταθετονίων και αλληλεπιδρά ειδικά με τις πρωτεΐνες της οικογένειας Argonaute, Piwi και Aubergine (Aub). Αντίθετα, τα pirnas των νοηματικών κλώνων, αλληλεπιδρούν επιλεκτικά με την Argonaute 3 (Ago 3) (Brennecke et al., 41

46 2007; Gunawardane et al., 2007). Οι πρωτεΐνες Piwi, Aub Ago3 σε συνδυασμό με τα pirnas, προκαλούν τμήση των RNA στόχων (Gunawardane et al., 2007; Saito et al., 2006). Δυο ερευνητικές ομάδες πρότειναν ταυτόχρονα το μοντέλο ping-pong για τη βιογένεση των pirnas. Σύμφωνα μ αυτό, η πρωτεΐνη Ago3 συνδεόμενη με το νοηματικό pirna, καταλύει τη διάσπαση του αντινοηματικού πρόδρομου pirna, δημιουργώντας έτσι το 5 άκρο του (Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007). Στη συνέχεια, το 5 άκρο του αντινοηματικού κλώνου αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες Aub και Piwi, οι οποίες με νουκλεόλυση παράγουν το 3 άκρο του. Με αυτήν τη διαδικασία σχηματίζεται το ώριμο πλέον αντινοηματικό pirna, μήκους νουκλεοτιδίων. Έπειτα, τα ώριμα pirnas σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες Aub και Piwi, δεσμεύουν και καταστέλλουν τους RNA στόχους τους, επάγουν την αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης και παράγουν το 5 των νοηματικών pirnas. Τέλος, η επεξεργασία του 3 άκρου, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία του ώριμου νοηματικού pirna, κλείνοντας έτσι τον κύκλο (Σχήμα Α.2.12.). Αυτό το μοντέλο στηρίζεται σε μελέτες στη Drosophila, αλλά πρόσφατα ευρήματα υποδεικνύουν ότι μπορεί να λειτουργεί και στο ποντίκι (Aravin et al., 2007). Τρεις πρωτεΐνες έχουν συσχετιστεί ισχυρά με το μηχανισμό βιογένεσης των pirnas. Οι δύο από αυτές Zucchini και Squash, πιστεύεται ότι επεξεργάζονται το 3 άκρο, παράγοντας ώριμα pirnas (Pane et al., 2007). Η τρίτη Hen1, μια RNA μεθυλοτρανσφεράση, είναι απαραίτητη για τη μεθυλίωση που υφίσταται το ώριμο 3 άκρο των pirnas. Η μεθυλίωση σταθεροποιεί τα 3 άκρα και περιορίζει την έκτασή τους (Horwich et al., 2007). Επίσης, μπορεί να επηρεάζει αλληλεπιδράσεις μεταξύ των pirnas και συστατικών του pirna μονοπατιού. 42

47 Σχήμα Α Μηχανισμός ping-pong βιογένεσης των pirnas. (A) H πρωτεΐνη Ago3 δεσμεύεται στο pirna νοηματικού κλώνου (μπλε) και καθοδηγεί τη διάσπαση αντινοηματικών πρωτογενών μεταγράφων (κόκκινο), παράγοντας το 5 άκρο των pirnas αντινοηματικών κλώνων. (Β) Οι πρωτεΐνες Aub και Piwi δεσμεύονται στο σχηματιζόμενο πρόδρομο pirna, το οποίο νουκλεολύεται στην τελική του μορφή. Οι πιθανές νουκλεάσες είναι οι Squasch και Zucchini. (C) Η πρωτεΐνη Hen της Drosophila μεθυλιώνει τα 3 άκρα των pirnas. (D) Το σύμπλοκο Aubαντινοηματικό pirna καταλύει την τμήση των νοηματικών μεταγράφων, παράγοντας το 5 άκρο του νοηματικού pirna. (E) Η Ago3 δεσμεύεται στο εναπομείναν νοηματικό πρόδρομο pirna, που νουκλεολύεται και (F) μεθυλιώνεται ομοίως με το αντινοηματικό pirna. (Brennecke et al., 2007). Α Τεχνολογία της RNA παρεμβολής. Τα sirnas μπορούν να παραχθούν με διάφορους τρόπους όπως: Mε χημική σύνθεση Με in vitro μεταγραφή Με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιώντας κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA έχει τα περισσότερα πλεονεκτήματα. Συγκεκριμένα: Η χρήση πλασμιδιακών φορέων για την έκφραση των μικρών παρεμβαλλόμενων RNA παρουσιάζει μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα ως προς την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης σε σχέση με τη χημική τους σύνθεση ή την in vitro μετάφραση. 43

48 Μεγαλύτερη σταθερότητα και ευκολία στη χρήση: Τα συνθετικά sirnas παρουσιάζουν μεγαλύτερη ευαισθησία και πρέπει να προστατευτούν κατά τη μεταφορά και να απο-προστατευτούν κατά τη χρήση. Αντίθετα οι πλασμιδιακοί φορείς που εκφράζουν sirnas είναι DNA μόρια τα οποία είναι πολύ σταθερά και μπορούν να εισαχθούν με την τεχνική της επιμόλυνσης σε ευκαρυωτικά κύτταρα σχετικά εύκολα. Δυνατότητα δημιουργίας μόνιμων κυτταρικών σειρών που εκφράζουν τα μικρά μόρια sirna. Το γεγονός αυτό επιτρέπει την παρατήρηση της επίδρασής τους σε μακρά χρονικά διαστήματα (Brummelkamp et al., 2002) Δυνατότητα δημιουργίας (εγκαθίδρυσης) επαγόμενων συστημάτων. Δυνατότητα δημιουργίας διαγονιδιακών ζώων στα οποία έχει γίνει απαλοιφή κάποιου γονιδίου. Δυνατότητα παρατήρησης της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης με τεχνικές φθορισμού. Απεριόριστη παροχή sirnas και μικρό κόστος. Μειονέκτημα της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA είναι ότι απαιτεί περισσότερο χρόνο για το σχεδιασμό και την κατασκευή των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Ο μηχανισμός δράσης των sirnas με τη βοήθεια της τεχνολογίας του ανασυδυασμένου DNA είναι αντίστοιχος με αυτόν των μεγάλων μορίων δίκλωνου RNA (Σχήμα Α.2.13.). Στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA γίνεται κλωνοποίηση σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα μιας ακολουθίας περίπου νουκλεοτιδίων που περιέχει την περιοχή-στόχο για την αποσιώπηση ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Συνήθως κατασκευάζονται περισσότερα του ενός πλασμίδια με διαφορετικούς στόχους (τουλάχιστον δύο). Στη συνέχεια γίνεται εισαγωγή σε ευκαρυωτικά κύτταρα των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που κατασκευάστηκαν με τη μέθοδο της επιμόλυνσης. Σαν αποτέλεσμα εκφράζεται ένα αρχικό μικρό μόριο δίκλωνου RNA που έχει σχήμα φουρκέτας και ονομάζεται shrna (short hairpin RNA). Το συγκεκριμένο μόριο RNA υφίσταται επεξεργασία από την κυτταρική μηχανή και συγκεκριμένα από την Dicer και μετατρέπεται σε μικρό δίκλωνο RNA (sirna) μεγέθους νουκλεοτιδίων. Ακολουθεί η ίδια διαδικασία που περιγράφηκε για το μηχανισμό βιογένεσης των sirnas και οδηγεί στη αποικοδόμηση των ομόλογων mrnas και την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης (Dykxhoorn, et al. 2003; Arenz and Schepers, 2003; Brummelkamp et al., 2002). 44

49 Α Εφαρμογές και στόχοι της RNA παρεμβολής. Η τεχνολογία της RNA παρεμβολής εξελίχθηκε σε ένα ισχυρό εργαλείο για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και για πολλές άλλες εφαρμογές όπως: Τη δημιουργία και τη μελέτη του φαινοτύπου μόνιμων κυτταρικών σειρών στις οποίες έγινε απαλοιφή κάποιου γονιδίου (knock out) (Brummelkamp et al., 2002). Τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων στα οποία έγινε απαλοιφή κάποιου γονιδίου (knock out) (Rubinson et al., 2003). Την εισαγωγή sirnas σε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης με κατάλληλους υποκινητές με σκοπό την επαγόμενη καταστολή της έκφρασης γονιδίων και τη μελέτη των επιδράσεών της (Mittal, 2004). Την εισαγωγή sirnas σε ευκαρυωτικά κύτταρα με τη βοήθεια κατάλληλων ιικών φορέων με σκοπό τη γονιδιακή θεραπεία (Barton et al., 2002; Shen et al., 2004). Την απομίμηση της δομής και της λειτουργίας των sirnas με σκοπό την κατασκευή συνθετικών χημικών ουσιών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στο σχεδιασμό και την παραγωγή νέων φαρμάκων (Jacque et al., 2002). 45

50 Σχήμα A Μηχανισμός δράσης της RNA παρεμβολής. (Α) Κλασσικό μονοπάτι παραγωγής sirnas. (B) Παραγωγή sirnas με την τεχνική του ανασυνδυασμένου DNA. 46

51 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Υλικά Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια. Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, MI, USA), Serva (Heidelberg, Germany) και Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Τo ισότοπo γ- 32 Ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Τα ακτινογραφικά φιλμ που χρησιμοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες ήταν του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ ήταν αντίστοιχα τα X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρίας. Β.1.3. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας. Tα ένζυμα μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν των εταιριών New England BioLabs Inc. (Beverly, MA, USA) και Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). H ριβονουκλεάση Α (1000 U/ml) ήταν της εταιρίας Sigma-Aldrich. Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Τα θρεπτικά υγρά RPMI-1640 (Rooswell Park Memorial Institute-1640), DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium), ο ορός εμβρύου μοσχαριού (fetal calf serum, FCS) και το μίγμα αντιβιοτικών που χρησιμοποιήθηκαν στις ιστοκαλλιέργειες ήταν προϊόντα της GIBCO, Life Technologies Inc. (Scotland). Ο κλώνος του LBR παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Howard Worman και Günter Blobel (Worman et al., 1990) ενώ η έκφραση ενός μικρού τμήματος του αμινο-τελικού του άκρου που περιέχει την επαναλαμβανόμενη ακολουθία των διπεπτιδίων σερίνης/αργινίνης (αα 62-92) ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST, έγινε 47

52 από την επίκουρο καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη και τη διδάκτορα Βικτωρία Δρόσου. Τα μονοκλωνικά αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το anti-srpk1 (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY), το mab104 (παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Jamal Tazi, Institut de Génétique Moléculaire, UMR 5535, C.N.R.S., Montpellier, France) και το anti-actin (παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Γεώργιο Μόσιαλο, Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ). Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν τα πολυκλωνικά αντισώματα anti-srpk1 (αναπτύχθηκε απέναντι σε GST-SRPK1, αναγνωρίζει και τις δύο ισομορφές SRPK1a και SRPK1 σε Western blot ανάλυση και επίσης τις ανοσοκατακρημνίζει) και anti-srpk1a (αναπτύχθηκε απέναντι στην εμβόλιμη ακολουθία των 171 αμινοξέων στο Ν-τελικό άκρο της SRPK1a, δεν αναγνωρίζει την SRPK1a σε Western blot ανάλυση αλλά την ανοσοκατακρημνίζει εξειδικευμένα ενώ δεν ανοσοκατακρημνίζει την SRPK1). Τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για Western blot ανάλυση ήταν rabbit anti-mouse και goat anti-rabbit της εταιρείας Chemicon International Inc. (Temecula, CA USA). Τα αντισώματα αυτά ήταν συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση, ώστε να δίνουν τη χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση. Β.1.4. Βιολογικά υλικά. Η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε κυρίως κατά τη διάρκεια των πειραμάτων είναι τα Κ562 κύτταρα τα οποία χορηγήθηκαν ευγενικά από τον καθηγητή Αστέριο Τσιφτσόγλου. Τα κύτταρα αυτά προέρχονται από ασθενή με χρόνια μυελογενή λευχαιμία και είναι θετικά ως προς το χρωμόσωμα της Φιλαδέλφειας. Ακόμη χρησιμοποιήθηκαν τα 293Τ/17 κύτταρα της εταιρίας ΑΤCC τα οποία προέρχονται από την κυτταρική σειρά 293Τ (293tsA1609neo). Τα 293Τ κύτταρα δείχνουν μεγάλη επιδεκτικότητα σε επιμόλυνση με πλασμιδιακό DNA αφού προέρχονται από την κυτταρική σειρά 293 (επιθηλιακά κύτταρα νεφρού ανθρώπινου εμβρύου), στην οποία έχει εισαχθεί το θερμοευαίσθητο γονίδιο που κωδικοποιεί το SV40 T-αντιγόνο. Τα 293Τ κύτταρα κλωνοποιήθηκαν και συνεπιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια pbnd και pzap λαμβάνοντας έτσι αντίσταση στο αντιβιοτικό G418 (Pear et al., 1993). Αυτά τα κύτταρα δομικά εκφράζουν το μεγάλο Τ-αντιγόνο του ιού SV40 48

53 και από αυτά έχει επιλεχθεί ο κλώνος 17 λόγω της μεγάλης επιδεκτικότητάς του σε επιμόλυνση με πλασμιδιακό DNA (Sena-Esteves et al., 1999). Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική καρκινική σειρά του τραχήλου της μήτρας, HeLa. 49

54 B.2. Μέθοδοι Β.2.1. Σχεδιασμός και έκφραση των sirnas που στοχεύουν στις SRPK1/SRPK1α. Η in vivo έκφραση των sirnas έναντι στις SRPK1/SRPK1a σε ανθρώπινα κύτταρα, έγινε με το kit της εταιρείας Promega (Promega Corporation, Madison, WI USA), sistrike TM U6 Cloning Systems. Αυτό το σύστημα αποτελείται από DNA πλασμιδιακούς φορείς που εμπεριέχουν τον προαγωγό της U6 RNA πολυμεράσης, το ένθεμα με την επιθυμητή DNA αλληλουχία και μια αλληλουχία τερματισμού της μεταγραφής. Τα sirnas μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ μέσω του U6 προαγωγού και εκφράζονται ως δομές ανάστροφων φουρκετών. Τα sirnas και οι αλληλουχίες τερματισμού της μεταγραφής εμπεριέχονται σε δυο συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια, που σχηματίζουν δίκλωνες δομές και ενσωματώνονται στους ευθύγραμμους psistrike φορείς, βάσει του κανόνα της συμπληρωματικότητας. Επιτυχημένη ενσωμάτωση επιφέρει τη δημιουργία μιας δεύτερης θέσης πέψης με το ένζυμο περιορισμού PstI, σε συνδυασμό με μια ήδη υπάρχουσα θέση στο φορέα (Σχήμα Β.1.). Συνεπώς, η παρουσία του ενθέματος μπορεί να επιβεβαιωθεί με πέψη με το ένζυμο PstI. Οι κλώνοι που φέρουν το ένθεμα παράγουν δυο ζώνες DNA στην πηκτή αγαρόζης. Η επιλογή τους γίνεται με βάση την ανθεκτικότητά τους στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη. 50

55 Σχήμα Β.1. Σχηματική απεικόνιση του πλασμιδιακού φορέα sistrike. Τα ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας, και περιέχουν τα εξής στοιχεία: Ολιγονουκλεοτίδιο Α Προεξέχοντα άκρα (ACCG) που είναι συμπληρωματικά με την αλληλουχία του φορέα Αλληλουχία δομής φουρκέτας που περιλαμβάνει: o Αλληλουχία στόχο o Αλληλουχία που υποβοηθά το σχηματισμό φουρκέτας o Ανάστροφη αλληλουχία στόχο Βάση κυτοσίνης για το σχηματισμό δεύτερης θέσης πέψης με PstI Ολιγονουκλεοτίδιο Β Συμπληρωματικές αλληλουχίες του ολιγολουκλεοτιδίου Α με επιπρόσθετη την αλληλουχία GACGT για αποτελεσματική ενσωμάτωση στον φορέα Βάσει των παραπάνω, σχεδιάστηκαν δύο ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων, τα sh4 και sh1 που στοχεύουν στην καταλυτική περιοχή, η οποία είναι κοινή για τις SRPK1 και SRPK1a. Επιπρόσθετα σχεδιάστηκε και το scramble που αποτελείται από ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων που φέρουν αλλαγές στην αλληλουχία των βάσεων τέτοιες ώστε 51

56 να μην είναι δυνατή η συμπληρωματικότητα ως προς το mrna των SRPKs και συνεπώς και η αναστολή τους. Συνεπώς το scramble αποτελεί το ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων ελέγχου. Παρακάτω δίνονται οι αλληλουχίες βάσεων των τριών ζευγών ολιγονουκλεοτιδίων που σχεδιάστηκαν: sh4 Νοηματικός κλώνος 5 ACCGGATCATCAAATCCAATTACTTCCTGTCATAATTGGATTTGATGATC CTTTTTC 3 Αντινοηματικός κλώνος 5 TGCAGAAAAAGGATCATCAAATCCAATTATGACAGGAAGTAATTGGATT TGATGATC 3 sh1 Νοηματικός κλώνος 5 ACCGGTGCAGCAGAAATTAATTCTTCCTGTCAAATTAATTTCTGCT- GCACCTTTTTC 3 Αντινοηματικός κλώνος 5 TGCAGAAAAAGGTGCAGCAGAAATTAATTTGACAGGAAGAATTAATTTC TGCTGCAC 3 scramble Νοηματικός κλώνος 5 ACCGATCTACATGCATCAATAACTTTCCTGTCATTATTGATCCATGTAGA TCTTTTT 3 Αντινοηματικός κλώνος 5 TGCAGAAAAAGATCTACATGCATCAATAATGACAGGAAGTTATTGATGC ATGTAGAT 3 Β Υβριδισμός. `Αρχικά έγινε αιώρηση των ολιγονουκλεοτιδίων Α και Β ώστε να έχουν συγκέντρωση 1 μg/μl. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 2 μl από το κάθε ολιγονουκλεοτίδιο και 46 μl από το διάλυμα υβριδισμού της εταιρείας Promega. Τα ολιγονουκλεοτίδια είχαν τελική συγκέντρωση 40 ng/μl. Ακολούθησε θέρμανση στους 90 ο C για 3 λεπτά και έπειτα επώαση στους 37 ο C για 15 λεπτά. 52

57 Β Αντίδραση λιγάσης. Τα υβριδισμένα ολιγονουκλεοτίδια Α και Β αραιώθηκαν με ddη 2 Ο ελεύθερο νουκλεασών, σε αναλογία 1/10 το καθένα. Για την αντίδραση λιγάσης προστέθηκαν 1 μl από το κάθε ολιγονουκλεοτίδιο, 1 μl από τον πλασμιδιακό φορέα sistrike, 5 μl από το 2Χ διάλυμα αντίδρασης λιγάσης της εταιρείας, 1 μl Τ4 DNA λιγάσης και 2 μl ddη 2 Ο. Η αντίδραση επωάστηκε για 16 ώρες στους 4 ο C. Ακολούθησε μετασχηματισμός σε βακτηριακά κύτταρα E. coli JM109. Β.2.2. Ιστοκαλλιέργειες. Τα κύτταρα Κ-562 αναπτύχθηκαν σε εν αιωρήσει κυτταροκαλλιέργειες (suspension cultures) σε θρεπτικό υγρό (RPMI-1640) που περιείχε 10% ορό εμβρύου μοσχαριού (fetal calf serum, FCS) καθώς και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Η ανάπτυξη έγινε σε επωαστήρα στους 37 ο C, με ατμόσφαιρα 5% CO 2 και κορεσμένη σε υγρασία (95%). Τα κύτταρα διατηρούνται σε συγκεντρώσεις 5x10 4-1x10 7 κύτταρα/ml και προκειμένου να βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, αραιώνονται κάθε 72 ώρες με φρέσκο θρεπτικό υλικό. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη μέθοδο του αιματοκυτταρόμετρου (Neübauer) κάτω από μικροσκόπιο (10x) (American Optical Corp., USA) και έτσι προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. Οι κυτταρικές σειρές 293Τ και HeLa διατηρήθηκαν στην αναπτυξιακή τους φάση σε θρεπτικό υγρό DMEM, που περιέχει 10% ορό εμβρύου μοσχαριού (FΒS) και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Έτσι αναπτύχθηκαν σε τριβλία πολυστυρενίου σαν μονοστιβάδα (monolayer cultures), σε επωαστήρα στους 37 o C, με ατμόσφαιρα 5% CO 2 και κορεσμένη σε υγρασία (95%). Οι κυτταροκαλλιέργειες αραιώνονταν σε τακτά χρονικά διαστήματα 3-4 ημερών, υπό ασηπτικές συνθήκες, έτσι ώστε να διατηρούνται οι πληθυσμοί σε εκθετική φάση ανάπτυξης. Πριν από τη διαδικασία της αραίωσης των κυττάρων, οι καλλιέργειες επωάζονται για 15 λεπτά με 0,5% τρυψίνη και 0,02% (τετρανατριούχο) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) για την αποκόλλησή τους. Στη συνέχεια αραιώνονται έτσι ώστε η συγκέντρωσή τους να διατηρείται μεταξύ 5x10 4-8x

58 κύτταρα/ml θρεπτικού υγρού. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται όπως και για τα κύτταρα Κ-562. Β.2.3. Παρασκευή εκχυλισμάτων από K562, 293T ή HeLa κύτταρα. Tα Κ562 κύτταρα συλλέχθηκαν αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης, μετά από φυγοκέντρηση στις 1200 στροφές/λεπτό. Έπειτα, ακολούθησε ένα πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα PBS, ph 7.4 (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O). Τα 293Τ και HeLa κύτταρα συλλέχθηκαν αντίστοιχα μετά από αφαίρεση του θρεπτικού υγρού από τα τριβλία και αιώρηση των κυττάρων σε 1 ml διαλύματος PBS, με τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter). Στο ίζημα των κυττάρων που λήφθηκε μετά από φυγοκέντρηση, προστέθηκε μία ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (1% Triton X-100, 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 150 mm NaCl και 1 mm PMSF). Συγκεκριμένα, για τη διατήρηση της αναλογίας του αριθμού των κυττάρων σε κάθε εκχύλισμα, όσον αφορά τα Κ562 και HeLa κύτταρα έγινε χρήση 100 μl διαλύματος λύσης για 23.4 x 10 5 κύτταρα, ενώ για τα 293Τ κύτταρα έγινε χρήση 200 μl διαλύματος λύσης για 10 7 κύτταρα. Τα αιωρημένα κύτταρα παρέμειναν για 10 λεπτά στον πάγο, στο διάλυμα λύσης και κατόπιν διαβιβάστηκαν μέσα από σύριγγα ινσουλίνης (1 ml), ώστε να σπάσει κατά το δυνατόν το μακρομοριακό DNA. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα x g, για 15 λεπτά στους 4 C και συλλογή του υπερκειμένου. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυλάσσεται στους -80 C. Β.2.4. Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων Κ-562 με τη χρώση βενζιδίνης - Η 2 Ο 2. Η μέθοδος βασίζεται στην ιστοχημική αντίδραση και χρώση των κυττάρων Κ562 με διάλυμα βενζιδίνης και Η 2 Ο 2, έτσι ώστε τα κύτταρα που περιέχουν αιμοσφαιρίνη (διαφοροποιημένα) βάφονται κυανά, ενώ τα αδιαφοροποίητα δεν χρωματίζονται (Orkin et al., 1975). Για τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω διαλύματα: Διάλυμα Α: Υδροχλωρική βενζιδίνη 0,1 g (Παγόμορφο) CH 3 COOH 1,5 ml H 2 O μέχρι 50 ml 54

59 Το διάλυμα αυτό διατηρήθηκε σε σκοτεινόχρωμο φιαλίδιο, στους 4 ο C για 1-2 μήνες. Διάλυμα Β: Η 2 Ο 2 30% 20 μl Η 2 Ο 30 ml Το διάλυμα αυτό παρασκευάζεται πριν από κάθε προσδιορισμό. Για τη χρώση των κυττάρων προστέθηκε σε κατάλληλη υποδοχή (96 well plate) μια σταγόνα καλλιέργειας κυττάρων (~1x10 6 κύτταρα/ml), μια σταγόνα διαλύματος Α και στη συνέχεια μια σταγόνα διαλύματος Β. Μετά την ανακίνηση, το αιώρημα (διάλυμα) αφέθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 5 min. Κατόπιν, απομακρύνθηκε μικρή ποσότητα κυττάρων, τοποθετήθηκε στο αιματοκυτταρόμετρο (Neübauer) και μετρήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο (10x), τόσο ο συνολικός αριθμός των κυττάρων (τουλάχιστον κύτταρα), όσο και ο αριθμός των κυττάρων που χρωματίστηκαν κυανά. Θεωρώντας ότι τα κυανά κύτταρα αντιστοιχούν σε εκείνα που περιέχουν αιμοσφαιρίνη, δηλαδή τα διαφοροποιημένα, υπολογίστηκε το επί τις εκατό ποσοστό των διαφοροποιημένων κυττάρων στην καλλιέργεια. Β.2.5. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE). Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός δείγματος πραγματοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα εξαρτάται από την διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύμφωνα με την εξίσωση: v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από την μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του Ν,Ν μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bisακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH-CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα που διαθέτει πόρους που το μέγεθος τους εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού ανάλογα και με την συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη του υπερθειϊκού 55

60 αμμωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8 για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για την διάδοση του. Το σχήμα των πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα με τη συσκευή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στην συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, το πήκτωμα επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για την συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωμα διαχωρισμού που είναι υπεύθυνο για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώματα είναι διαφορετικά ως προς το ph και την σύσταση τους. Επίσης το ρυθμιστικό διάλυμα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούμενα (Andrews, 1981). Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS. Απουσία τέτοιων παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Β.2.6. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS- PAGE). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσει τις πρωτεΐνες δεσμεύεται πάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους (Laemmli, 1970). 56

61 Το σύστημα που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων κατά την διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωμα διαχωρισμού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωμα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωμα διαχωρισμού και οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με την βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιμέρους στοιχείων του συστήματος είναι οι εξής: Διάλυμα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris ph M γλυκίνη 0.1% SDS Πήκτωμα επιστοίβαξης: για τον πολυμερισμό 5% ακρυλαμίδιο 0.25% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS Μ Tris-Cl ph % APS 0.04% TEMED Πήκτωμα διαχωρισμού: 12% ακρυλαμίδιο 0.62% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS Μ Tris-Cl ph 8.9 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων το οποίο αποτελείται από: Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανού της βρωμοφαινόλης 57

62 Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 μl του διαλύματος αυτού σε 25 μl του μίγματος επώασης. Τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDSπρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη που χρησιμοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υπομονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος 25 ma έως τη στιγμή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. Β.2.7. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. Για να βαφούν οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα που περιέχει 0.25% Coomasie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% μεθανόλη, όπου και ανακινείται για διάστημα 1 ώρας. Στο διάλυμα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται με ανακίνηση σε διάλυμα 10% οξικό οξύ, 10% μεθανόλη. Β.2.8. Αυτοραδιογραφία. Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την β-ακτινοβολία που εκπέμπει το ισοτόπο 32 Ρ, το οποίο χρησιμοποιείται για την επισήμανση διάφορων πρωτεϊνικών μορίων (Garrison, 1983). Στην περίπτωση των πηκτωμάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωμα ανακινείται για 30 λεπτά σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται πάνω σε χαρτί Whatman 3MM για 1 ώρα υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους. Μία πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger series 900 (Mini Instruments, Essex, UK). Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα. 58

63 Β.2.9. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης πρωτεϊνών με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους. Η ανίχνευση της ύπαρξης δράσης SRPK στηρίζεται στην επώαση μικρών ποσοτήτων των κυτταρικών εκχυλισμάτων με ένα κατάλληλο υπόστρωμα. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα το τμήμα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) που περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 62 και 92, εκφρασμένο, ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST, στα Ε. coli (GST-LBRRS). Το τμήμα αυτό περιέχει στο μόριο του έξι επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια, οι σερίνες των οποίων φωσφορυλιώνονται από τις SRPK1/SRPK1a. Ως δότης φωσφορικών χρησιμοποιήθηκε το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Το μίγμα επώασης επίσης περιλαμβάνει 12 mm Hepes ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 0.6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ και 25 μμ ψυχρό ΑΤΡ. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 μl και ρυθμίζεται με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη 2 Ο. Τα δείγματα επωάζονται για 30 min σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 50 mm DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων που χρησιμοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται. Ακολουθεί βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και αποχρωματισμός της. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής, αυτοραδιογραφία και κοπή των ζωνών της πηκτής που αντιστοιχούν στο μοριακό βάρος του υποστρώματος σε συμφωνία και με τις ζώνες που εμφανίζονται στο film της αυτοραδιογραφίας. Ακολουθεί η μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή 1500 TR (Packard) κατά Cherenkov. Κατ αυτό τον τρόπο ανιχνεύεται η επιθυμητή δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών καθώς και η έκταση της ενσωμάτωσης της ραδιενέργειας από το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ στα αντίστοιχα υποστρώματα. Β Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western blot). Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, από την πηκτή προς την μεμβράνη λόγω της εφαρμογής διαφοράς δυναμικού και στην καθήλωσή τους στο πλέγμα της μεμβράνης (Gershoni and Palade, 1983). 59

64 Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η μεμβράνη και η πηκτή μεταφέρονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) του οποίου η σύνθεση εξαρτάται από τη συσκευή και τις συνθήκες της ηλεκτρομεταφοράς. Η τοποθέτηση τους στην συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε έξι χαρτιά Whatman 3MM με την μεμβράνη προσανατολισμένη στον θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων που παρεμποδίζουν την διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Οι συσκευές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το Semi-Dry Blotter της εταιρίας Scie-Plas και το Mini Trans-Blot της εταιρίας Bio-Rad. Στην περίπτωση του Semi-Dry Blotter, το Transfer Buffer αποτελείται από 12.5 mm Tris- Βορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT. Η μεταφορά, στην περίπτωση αυτή, γίνεται για 1 ώρα κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος (55-70 ma ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής και των πρωτεϊνών που πρόκειται να μεταφερθούν). Όσον αφορά τη συσκευή της Bio-Rad, το Transfer Buffer αποτελείται από 25 mm Tris, ph 8.3, 192 mm γλυκίνη, 20% μεθανόλη και 0,1% SDS και η μεταφορά γίνεται για 2 ώρες κάτω από σταθερή τάση 100 V και θερμοκρασία 4 o C. Β Ανοσοανίχνευση. Η ανοσοανίχνευση είναι μια τεχνική που επιτρέπει τον εντοπισμό μιας καθηλωμένης σε μεμβράνη πρωτεΐνης με την βοήθεια αντισώματος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσμευθεί με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμοδείκτη το οποίο αντιδρώντας με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση, καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου (Harlow and Lane, 1988). Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρμόσθηκε για την εντόπιση των ενδογενών κινασών πρωτεϊνών SRPK1 και SRPK1a σε εκχυλίσματα κυττάρων Κ562, 293Τ και HeLa που είχαν επιμολυνθεί με τον πλασμιδιακό φορέα sistrike-sh4 και sistrike-scramble. Για τον σκοπό αυτό η ανίχνευση των SRPK1/1a στα διάφορα εκχυλίσματα έγινε με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην SRPK1 (αναγνωρίζει και τις δύο ισομορφές). Δεν χρησιμοποιήθηκε το εξειδικευμένο πολυκλωνικό 60

65 αντίσωμα απέναντι στην SRPK1a, γιατί το συγκεκριμένο αντίσωμα δίνει πολύ αδύνατη εικόνα σε ανοσοανίχνευση μετά από Western blot. Η διαδικασία που εφαρμόζεται έχει ως εξής: Αρχικά η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς εμβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 ώρα σε διάλυμα κορεσμού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), ώστε να κορεστεί από την ζελατίνη και να αποφύγουμε τις μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις της μεμβράνης με το αντίσωμα. Κατόπιν η μεμβράνη επωάζεται με το αντίστοιχο αντίσωμα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C. Η αραίωση στην οποία χρησιμοποιήθηκε το anti-srpk1 είναι 1:1000. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 λεπτών στη μεμβράνη με διάλυμα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της μεμβράνης για 1 ώρα, υπό ανάδευση, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1:2000) σε διάλυμα κορεσμού. Αφού γίνουν δύο πλύσεις της μεμβράνης των 10 λεπτών με PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση, έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromo-chloro-indolyl phosphate) και 30 μl NBT (Nitro blue tetrazolium) σε 10 ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-HCl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3. Β Ανοσοκατακρήμνιση. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης Α (Protein A) του μικροοργανισμού staphylococcus aureus να δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες. Χρησιμοποιώντας την ιδιότητα αυτή, τα αντισώματα που έχουν δεσμεύσει το αντιγόνο τους από ένα πρωτεϊνικό εκχύλισμα δεσμεύονται στη συνέχεια στην πρωτεΐνη Α η οποία είναι καθηλωμένη σε ένα αδρανές υλικό. Σύμφωνα με την τεχνική, η επώαση πρωτεϊνικού εκχυλίσματος με συγκεκριμένο αντίσωμα σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει σαν αποτέλεσμα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα και την συμπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του παραπάνω μίγματος σε στήλη σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, εξισορροπημένης στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει ως αποτέλεσμα την δέσμευση του συμπλόκου 61

66 αντισώματος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α και την παραλαβή του από το εκχύλισμα. Έτσι με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνουμε τον εξειδικευμένο διαχωρισμό/καθαρισμό της φυσιολογικής μορφής μιας πρωτεΐνης μέσα από ένα μίγμα πρωτεϊνών. Επίσης είναι δυνατόν κάτω από κατάλληλα διαμορφωμένες συνθήκες εφαρμογής της τεχνικής, να συγκαθαριστούν και πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται ισχυρά πάνω στην πρωτεΐνη-στόχο (υποστρώματα, ρυθμιστές, κ.α.), προσφέροντας μια γενική εικόνα των αλληλεπιδράσεων στο φυσιολογικό περιβάλλον της πρωτεΐνης (Harlow and Lane, 1988). Κατά την διάρκεια της εργασίας χρησιμοποιήθηκαν τα πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στις GST-SRPK1 και GST-SRPK1a (N-terminal domain). Τα σφαιρίδια (25 μl) εξισορροπούνται με 3 πλύσεις των 10 λεπτών η καθεμία, σε ρυθμιστικό διάλυμα lysis buffer (50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 1% Triton X-100, 0.1 M NaCl) και παραλαμβάνονται μετά από σύντομη φυγοκέντρηση, με απομάκρυνση του ρυθμιστικού διαλύματος. Στη συνέχεια επωάζονται με 7 μl αντιορού, παρουσία 750 μl lysis buffer, υπό ανακίνηση για χρονικό διάστημα 3 ωρών στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν το αντίσωμα και η πρωτεΐνη Α. Μετά το πέρας της διαδικασίας, κατάλληλος όγκος από τα κυτταρικά εκχυλίσματα (15-20 μl ανάλογα με το πείραμα), παρουσία 750 μl lysis buffer, προστίθεται στους σωλήνες με την καθηλωμένη στα σφαιρίδια πρωτείνη-α και τα αντίστοιχα αντισώματα. Η επώαση αυτή διαρκεί ώρες και ακολουθούν 3 πλύσεις των 10 λεπτών με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε να αποφευχθούν οι τυχόν ασθενείς αλληλεπιδράσεις με πρωτείνες των εκχυλισμάτων. Στα σφαιρίδια με τις ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες γίνονται πειράματα ελέγχου της δραστικότητας της κινάσης με την προσθήκη του υποστρώματος της και ραδιενεργού [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Πριν τα δείγματα αναλυθούν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και ακολούθως θερμαίνονται στους 100 C για 3 λεπτά ώστε να διασπαστούν τα σύμπλοκα αντιγόνουαντισώματος. Β Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων 62

67 ως πρωτεϊνών σύντηξης με χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιμες. Η παροδική επιμόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή μίξη του πλασμιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυμα CaCl 2 με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσμα της ανάμιξης είναι η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Τα ιζήματα αυτά DNA/φωσφορικού ασβεστίου διαπερνούν την κυτταροπλασματική μεμβράνη πιθανώς με ενδοκύττωση. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις μεταβολές του ph (βέλτιστο ph ) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εμπορικά kit καθαρισμού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρμογή της μεθόδου). Ο κλωνοποιημένος πλασμιδιακός φορέας εντοπίζεται εκτός του γενώματος των κυττάρων, ενώ η ανίχνευση της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το κλωνοποιημένο γονίδιο είναι δυνατή για χρονικό διάστημα 1-4 ημερών. Επίσης σε κάθε κυτταρική διαίρεση μόνο τα μισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασμιδιακού DNA που εισήχθη με την επιμόλυνση των κυττάρων (Chen and Okayama, 1987). Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα 293Τ κύτταρα, τα οποία επιμολύνθηκαν παροδικά με τους πλασμιδιακούς φορείς με τα sh4 και scramble DNAs έναντι στις SRPK1/SRPK1a. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιμόλυνση πρέπει να καταλαμβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλίου. Το διάλυμα του DNA με το CaCl 2 (250 mm CaCl 2, 20 μg/ml πλασμιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 μg/ml περιλαμβάνουν το κλάσμα του DNA που φέρει το κλωνοποιημένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος HEPESφωσφορικών (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na 2 HPO 4 ph 7.1). Το μίγμα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως απομακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1 ml του αιωρήματος DNA-φωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τριβλίο της καλλιέργειας. Τα τριβλία αφήνονται στον επωαστήρα για 20 λεπτά με παροδική ανακίνηση. Στη συνέχεια σε κάθε τριβλίο προστίθενται 4 ml DMEM /10% v/v FBS, 5 μl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυμα που διασπούν το DNA, καθώς και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Τα τριβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία CO 2. Μετά από τέσσερις ώρες αφαιρούνται τα 5 ml του υγρού που έγινε η επιμόλυνση και προστίθενται εκ νέου 10 ml θρεπτικού μέσου και 1 μg/ml του αντιβιοτικού πουρομυκίνη. Με τον τρόπο αυτό 63

68 επιβιώνουν μόνο τα κύτταρα που έχουν επιμολυνθεί εξαιτίας της παρουσίας γονιδίου ανθεκτικότητας στην πουρομυκίνη στον πλασμιδιακό φορέα. Η καλλιέργεια αφήνεται στον επωαστήρα στους 37 C σε ατμόσφαιρα CO 2 και ακολουθεί αλλαγή του θρεπτικού μέσου κάθε 1-2 ημέρες. Με το πέρας 96 ωρών από την στιγμή της επιμόλυνσης τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης και ακολουθεί η λύση τους. Β Ηλεκτροδιάχυση. Ηλεκτροδιάχυση είναι η διαδικασία κατά την οποία αυξάνει η διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου με την εφαρμογή εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην κυτταρική σειρά K562 για την επιμόλυνση της με τον πλασμιδιακό φορέα sistrike, που περιείχε τα sh4 και scramble DNAs. Η συσκευή ηλεκτροδιάχυσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Gene Pulser Xcell TM Electroporation System της εταιρίας BIO-RAD (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA USA). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Δύο ημέρες πριν την ηλεκτροδιάχυση τα κύτταρα μεταφέρονται σε φλάσκα των 75 cm 2 με θρεπτικό μέσο RPMI έτσι ώστε να βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης (0.5 4 x 10 6 κύτταρα/ml) την ημέρα της ηλεκτροδιάχυσης. Τότε τα κύτταρα φυγοκεντρούνται σε 400 x g για 5-7 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και αφαιρείται το θρεπτικό υγρό. Τα κύτταρα επαναιωρούνται σε διάλυμα ηλεκτροδιάχυσης (Opti-MEM), έτσι ώστε η συγκέντρωσή τους να είναι περίπου 10 6 κύτταρα/200μl. Στη συνέχεια, 200 μl αιωρήματος κυττάρων μαζί με το DNA μεταφέρoνται σε κυψελίδα ηλεκτροδιάχυσης. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροδιάχυσης για τα Κ562 κύτταρα είναι 155 V και 1050 μf. Αμέσως μετά την ηλεκτροδιάχυση τα κύτταρα μεταφέρονται σε οπή πιάτου 6 οπών που περιέχει 2 ml RPMI με 10% FBS. Την επόμενη ημέρα προστίθενται 1.5 μg/ml του αντιβιοτικού πουρομυκίνη ώστε να γίνει η επιλογή των κυττάρων που έχουν επιμολυνθεί. Τα κύτταρα μαζεύνται μετά από 96 ώρες. 64

69 Β Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με τη χρήση του kit X- tremegene Q2 Reagent της εταιρείας Roche. Για την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa χρησιμοποιήθηκε το kit X- tremegene Q2 Reagent της εταιρείας Roche (Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, N.J. USA). Το kit αυτό είναι λιπιδιακής φύσεως και επάγει υψηλά επίπεδα επιμόλυνσης στο συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο. Μια ημέρα πριν την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων, αυτά μετρήθηκαν ώστε να έχουν συγκέντρωση 10 5 κύτταρα/0.5 ml θρεπτικού υγρού DMEM με 10% FBS, έτσι ώστε την ημέρα της επιμόλυνσης να καταλαμβάνουν το 50-60% της επιφάνειας της οπής, σε τριβλίο 24 οπών. Την ημέρα αυτή το θρεπτικό υγρό αντικαθίσταται από 0.5 ml DMEM απουσία FBS. Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 C με 5% CO 2, όσο προετοιμάζεται το σύμπλοκο επιμόλυνσης (transfection complex). Αρχικά, φτιάχνεται το αντιδραστήριο επιμόλυνσης (transfection reagent), με την ανάμιξη του λιπιδίου με θρεπτικό υγρό απουσία ορού, σε αναλογία όγκου 1/12.5. Στη συνέχεια, αραιώνεται το DNA με το ειδικό διάλυμα της Roche (DNA dilution buffer) σε αναλογία 1 μg DNA/25 μl buffer και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min. Ακολουθεί ήπια ανάδευση ίσου όγκου αντιδραστηρίου επιμόλυνσης και αραιωμένου DNA και επώαση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου προς σχηματισμό του συμπλόκου επιμόλυνσης. Η αναλογία μg DNA/μl λιπιδίου παραμένει πάντα σταθερή (1:2). Με το πέρας των 5 min προστίθεται σε κάθε οπή που περιέχει 10 5 κύτταρα, συγκεκριμένος όγκος του συμπλόκου ανάλογος με την συγκέντρωση του DNA με την οποία θέλουμε να επιμολύνουμε τα κύτταρα. Ύστερα από 4 ώρες προστίθεται 0.5 ml θρεπτικού υγρού DMEM που περιέχει 20% FBS και πουρομυκίνη για να γίνει η επιλογή των κυττάρων που επιμολύνθηκαν. Τα κύτταρα επωάζονται για 96 ώρες, με αλλαγή θρεπτικού υλικού και προσθήκη πουρομυκίνης κάθε 24 ώρες, και έπειτα συλλέγονται προς λύση. Β Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων. Τα στελέχη E. Coli JM109, αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό SOC του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: 65

70 Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl KCl Γλυκόζη MgSO % w/v 2.0 % w/v 0.01 M 2.5 mm 0.02 Μ 2 M Η ρύθμιση της οξύτητας γίνεται με τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση 1 atm, για 45 min. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. Β Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων ώστε να γίνουν επιδεκτικά για μετασχηματισμό (Competent Cells). Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων ώστε να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασμένα με διαλύματα CaCl 2 στους 4 ο C και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές (Sambrook et al., 1989). Πολλές παραλλαγές της βασικής τεχνικής έχουν περιγραφεί και μία από αυτές χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Σύμφωνα με αυτή, 2 ml θρεπτικού υλικού εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται για ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml θρεπτικού μέσου, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. Ένα ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 10 λεπτά στους 4 C και στη συνέχεια αιωρούνται σε 25 ml (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος, που αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaCl 2, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικό κάλιο ph 7.5. Τα κύτταρα παραμένουν στον πάγο για 10 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 3000 x g. Το ίζημα των 66

71 κυττάρων επαναιωρείται σε 2 ml διαλύματος που αποτελείται από 10 mm MOPS, 75 mm CaCl 2, 10 mm KCl και 20% γλυκερόλη (1/25 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρημα που προκύπτει μοιράζεται σε κλάσματα των 200 μl και εμβαπτίζεται σε λουτρό που αποτελείται από ξηρό πάγο/αιθανόλη για μικρό χρονικό διάστημα. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα. Β Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (Transformation). Ο μετασχηματισμός επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων (200 μl) λίγων μl από το πλασμιδιακό DNA που θέλουμε να εισάγουμε και παραμονή των κυττάρων στον πάγο για 30 min. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υπόκεινται σε θερμικό σοκ για 2 min στους 42 C. Ακολουθεί η προσθήκη 500 μl υγρού θρεπτικού υλικού και επώαση στους 37 C για 20 min. Μετά από φυγοκέντρηση για 1 min στα 5000 x g, αφαιρείται το μεγαλύτερο μέρος του υπερκειμένου και γίνεται αιώρηση του ιζήματος των κυττάρων με το υπερκείμενο που εναπομένει. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ, το οποίο περιέχει και το αντίστοιχο αντιβιοτικό (αυτό στο οποίο προσδίδει αντίσταση το πλασμιδιακό DNA που έχουμε εισαγάγει). Με τον τρόπο αυτό γίνεται η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έναντι των βακτηρίων που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο (Sambrook et al., 1989). Τα τριβλία επωάζονται στους 37 C για ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τρυβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αντιβιοτικού, ώστε είτε να απομονωθεί το πλασμιδιακό DNA είτε να γίνει έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση. Μία αποικία των μετασχηματισμένων βακτηρίων χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3 ml θρεπτικού υλικού παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού και αναπτύσσεται για περίπου 12 ώρες στους 37 ο C. Στη συνέχεια, 1.5 ml της καλλιέργειας μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 1 67

72 λεπτό. Στο ίζημα αρχικά προστίθενται 50 μl διαλύματος GTE (50 mm Tris-ΗCl ph 8.0, 10 mm EDTA, 20% γλυκόζη) και τα κύτταρα αναδεύονται έντονα ώστε να αιωρηθεί πλήρως το ίζημα. Στην συνέχεια, προστίθεται διπλάσιος όγκος διαλύματος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 80 μl ψυχρού διαλύματος 3 Μ οξικού καλίου και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε x g. Στο υπερκείμενο που παραλαμβάνεται γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 0.7 όγκου ισοπροπανόλης και παραμονή στους -20 C για 30 λεπτά. Το ίζημα που προκύπτει μετά από φυγοκέντρηση σε x g για 5 λεπτά, αιωρείται σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) παρουσία RNase A (20 μg/ml) και το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 20 λεπτά. Το DNA εκχυλίζεται με την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορμίου. Στην υδατική στοιβάδα που απομονώνεται μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε x g, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 2.5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αμμωνίου. Το DNA διαλύεται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου ddh 2 O και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του. Β Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το kit QIAGEN-TIP 500. Για την απομόνωση και καθαρισμό πλασμιδιακού DNA με το kit Qiagen-tip 500 ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο: Βακτηριακή καλλιέργεια 500 ml LB στο κατάλληλο αντιβιοτικό αναπτύσσεται για 16 h στους 37 C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 5000 x g για 10 min. Το ίζημα που απομένει μετά από την απόχυση του υπερκειμένου αιωρείται σε 10 ml διαλύματος Ρ1 (50 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) στο οποίο έχουμε προσθέσει 100 μg/ml RNase A και στη συνέχεια προστίθεται 10 ml διαλύματος Ρ2 (200 mm NaOH, 1% SDS) με απαλή ανάδευση ώστε να καταστεί ομογενές. Μετά από παραμονή 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος προστίθενται 10 ml ψυχρού διαλύματος P3 (3 M οξικό κάλιο ph 5.5) και μετά από απαλή ανακίνηση αφήνεται για 20 min στους 4 C. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30 min στα x g, ενώ συγχρόνως γίνεται και η εξισορρόπηση της στήλης tip 500 με 10 ml διαλύματος QBT (750 mm NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, 0.15% Triton X-100, ph 7.0). Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης αφού απομακρυνθεί με προσοχή από το σωλήνα φυγοκέντρησης, 68

73 ώστε να μην παραληφθεί συγχρόνως και το κολλώδες ίζημα, διαβιβάζεται από τη στήλη tip 500. Μετά τη διέλευση του υπερκειμένου από τη στήλη, γίνεται πλύση της στήλης, δύο φορές, με 30 ml διαλύματος QC (1.0 M NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, ph 7.0), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν προσμίξεις από την προηγούμενη κατεργασία. Η έκλουση του DNA γίνεται με τη διέλευση διαλύματος QF (1.25 Μ NaCl, 50 mm Tris-ΗCl, 15% αιθανόλη, ph 8.5). Αφού συλλεχθεί το σύνολο του παραπάνω διαλύματος γίνεται κατακρήμνιση του DNA προσθέτοντας 0.7 όγκους ισοπροπανόλης και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα x g για 30 min. Μετά από προσεκτική απόχυση του υπερκειμένου γίνεται μια σύντομη πλύση με 5 ml 70% αιθανόλη και το ίζημα που παραλαμβάνεται μετά από νέα φυγοκέντρηση στα x g διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0). Η περιεκτικότητα του διαλύματος σε DNA προσδιορίζεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm και το παρασκεύασμα φυλάσσεται στους -20 C. Β Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση συγκεκριμένων τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης και η απομόνωση τους απ αυτές αποτελεί έναν απλό και αποδοτικό τρόπο διαχωρισμού και καθαρισμού τους. Η μέθοδος βασίζεται στην παρασκευή πηκτών αγαρόζης με τήξη της αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα έως ότου σχηματιστεί ένα διαυγές διάλυμα. Με τη ψύξη του διαλύματος σχηματίζεται ένα πλέγμα που η πυκνότητα του εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τα τμήματα του DNA, που είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο ph, μετακινούνται προς την άνοδο (Sambrook et al., 1989; Sharp et al., 1973). Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από ορισμένους παράγοντες: 1. Το μέγεθος των τμημάτων του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. 2. Η συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. 69

74 3. Η διαμόρφωση των τμημάτων DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA, ίδιου μοριακού βάρους, κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. 4. Το δυναμικό που εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. 5. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται πηκτές με συγκέντρωση 1% αγαρόζης, σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE (0.04 M Tris-οξικό, M EDTA ph 8.0), παρουσία και βρωμιούχου αιθιδίου σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA. Η ιδιότητα του να απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία και να την επανεκπέμπει στο κόκκινο ορατό φάσμα χρησιμοποιείται για να ανιχνευθούν τα τμήματα του DNA πάνω στην πηκτή. Το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων αποτελείται από 5% γλυκερόλη, 0.42% μπλε της βρωμοφαινόλης και 0.42% κυανούν του ξυλενίου, ενώ η χρησιμοποιούμενη συσκευή ηλεκτροφόρησης είναι της εταιρείας International Biotechnologies, Inc. Β Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων. Η αρχή του φωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος. Έτσι, τα διαλύματα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA μια μικρή ποσότητα του προς ανάλυση δείγματος (3 μl) αραιώνεται (600 μl) και στην συνέχεια μετρείται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Με βάση το γεγονός ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm αντιστοιχεί με 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίστηκε η ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊκού οξέος στο άγνωστο δείγμα (Sambrook et al., 1989). Ο βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων εκτιμήθηκε από τον λόγο των οπτικών τους πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm, αφού τα δείγματα υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων έχουν λόγο OD 260 /OD 280 περίπου 2. 70

75 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Αναστολή της έκφρασης των SRPK1/SRPK1a σε 293Τ κύτταρα. Γ.1.1. Μελέτη της αναστολής της έφρασης των SRPK1/SRPK1a με Western blot ανάλυση. Οι κινάσες πρωτεϊνών SRPK1/SRPK1a έχουν μελετηθεί κυρίως ως προς το ρόλο τους στη διαδικασία του ματίσματος με βάση το γεγονός ότι φωσφορυλιώνουν τους SR παράγοντες ματίσματος που περιέχουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια σερίνης/αργινίνης. Ωστόσο, τους έχουν αποδοθεί κι άλλοι βιολογικοί ρόλοι όπως η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταμίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης, η μεταφορά πολυαμινών μέσα στα κύτταρα και η ομοιόσταση ιόντων. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο βιολογικός ρόλος των SRPK1 και SRPK1a έγινε προσπάθεια για την αναστολή της έκφρασής τους σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Αυτό κατέστη δυνατό με την εισαγωγή του πλασμιδιακού φορέα sistrike που φέρει αλληλουχίες μικρών δίκλωνων μορίων RNA (sirnas) τα οποία στοχεύουν στα ώριμα mrnas των δύο κινασών. Σχεδιάστηκαν 2 sirnas, που στοχεύουν στην καταλυτική περιοχή των δύο ισομορφών, τα sh1 και sh4. Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκε το sh4 γιατί για κάποιο λόγο, το sh1 δεν ήταν λειτουργικό. Ο μοριακός μηχανισμός δράσης των sirnas περιγράφεται στις παραγράφους Α και Α (Σχήμα Α.2.13.), ενώ λεπτομέρειες για τον σχεδιασμό και την έκφραση των sirnas περιγράφονται στην παράγραφο Β.2.1. Το πρώτο σύστημα στο οποίο μελετήθηκε η μετα-μεταγραφική αποσιώπηση των SRPK1/SRPK1a ήταν η κυτταρική σειρά 293Τ εξαιτίας της μεγάλης επιδεκτικότητας της στην επιμόλυνση με ανασυνδυασμένο DNA. Έτσι, έγινε παροδική επιμόλυνση των κυττάρων αυτών με τον φορέα sistrike, ο οποίος είχε ενσωματωμένο είτε το ολιγονουκλεοτίδιο sh4 (short hairpin 4) που στοχεύει στις κινάσες, είτε το ολιγονουκλεοτίδιο ελέγχου scramble, που δεν πρέπει να έχει καμία επίδραση στις κινάσες. Η μέθοδος παροδικής επιμόλυνσης που χρησιμοποιήθηκε περιγράφεται λεπτομερώς στην παράγραφο Β

76 Ύστερα από Western Blot ανάλυση που έγινε με το μονοκλωνικό αντίσωμα της SRPK1 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των επιπέδων της κινάσης. Πιο συγκεκριμένα, όπως απεικονίζεται και στο Σχήμα Γ.1., η επιμόλυνση των 293Τ κυττάρων με το sh4 DNA είχε ως αποτέλεσμα μια σταδιακή μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης αυξανομένης της συγκέντρωσης του sh4 σε σύγκριση με το scramble DNA. Ταυτόχρονα διενεργήθηκε Western Blot ανάλυση των ίδιων εκχυλισμάτων, χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα της ακτίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.2. δεν παρατηρείται μείωση των επιπέδων της ακτίνης στα εκχυλίσματα των κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 σε σχέση με εκείνα είχαν επιμολυνθεί με scramble. Σχήμα Γ.1. Western Blot ανάλυση των εκχυλισμάτων 293Τ κυττάρων ως προς SRPK1 ύστερα από επιμόλυνση των κυττάρων με scramble και sh4 sirnas. Αρχικά έγινε ανάλυση 300 μg από κάθε κυτταρικό εκχύλισμα σε SDS-PAGE και στη συνέχεια Western blot ανάλυση με το μονοκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Σχήμα Γ.2. Western Blot ανάλυση των εκχυλισμάτων 293Τ κυττάρων ως προς ακτίνη ύστερα από επιμόλυνση των κυττάρων με scramble και sh4 sirnas. Τα ίδια κυτταρικά εκχυλίσματα του Σχήματος Γ.1. αναλύθηκαν σε SDS-PAGE και στη συνέχεια έγινε Western blot ανάλυση χρησιμοποιώνας το μονοκλωνικό αντίσωμα της ακτίνης. 72

77 Γ.1.2. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης σε εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 DNA. Προκειμένου να διερευνηθεί αν αυτή η μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης είχε και ανάλογο αντίκτυπο στη δραστικότητά της, έγινε δοκιμή δράσης RS κινάσης χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το αμινο-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR), όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.9. Παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση της δράσης κινάσης που ακολουθούσε το ίδιο πρότυπο με την μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης (Σχήμα Γ.3.). Σχήμα Γ.3. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης σε εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων ύστερα από επιμόλυνση τους με scramble sirna και διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις sh4. Τα εκχυλίσματα των 293Τ που επιμολύνθηκαν με το scramble sirna και διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις του sh4 ελέγχθηκαν για δράση κινάσης. Τα δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και αυτοραδιογραφία. Γ.1.3. Ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 DNA και έλεγχος της δραστικότητας τους. Το γεγονός ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα της SRPK1 αναγνωρίζει τόσο την SRPK1 όσο και την SRPK1a, δεν επιτρέπει την εξαγωγή συμπερασμάτων όσον αφορά το ποσοστό αναστολής της έκφρασης της κάθε ισομορφής από το sirna. Προκειμένου να προσεγγίσουμε αυτό το πρόβλημα, έγινε ανοσοκατακρήμνιση των εκχυλισμάτων 293Τ κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το scramble sirna είτε το sh4 RNA (σε συγκεντρώσεις 7.5 και 10 μg) με τα πολυκλωνικά αντισώματα των SRPK1 και SRPK1a αντίστοιχα. Το anti-srpk1a δεσμεύει εξειδικευμένα την επιπλέον αμινο-τελική αλληλουχία του μορίου της SRPK1a, αλλά δεν είναι λειτουργικό σε Western Blot ανάλυση. Στα σφαιρίδια με τις ανοσοκατακρημνισμένες κινάσες ακολούθησε δοκιμασία φωσφορυλίωσης, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το αμινο- 73

78 τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης, GSTLBR(62-92), όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.9. Από την αυτοραδιογραφία προέκυψαν σαφείς διαφορές ως προς την αναστολή της δραστικότητας των δύο ισομορφών. Πιο συγκεκριμένα, η δραστικότητα της SRPK1a μειώνεται αλλά σε μικρότερο βαθμό συγκριτικά με τη δραστικότητα της SRPK1 (Σχήμα Γ.4.). Αυτό φαίνεται καλύτερα ύστερα από τη κοπή και μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή κατά Cherenkov, όπου σε συγκεντρώσεις 7.5 μg του sh4 η δραστικότητα της SRPK1a μειώνεται στο 47.1% σε σχέση με το scramble, ενώ η δραστικότητα της SRPK1 στο 32.9% αντίστοιχα. Ακόμη, η μεταβολή στη δραστικότητα των δύο ισομορφών γίνεται ακόμα πιο εμφανής σε συγκεντρώσεις 10 μg του sh4, όπου η παρατηρούμενη δραστικότητα της SRPK1 είναι 26.9% σε σχέση με το scramble, ενώ της SRPK1a είναι 61.3% (Σχήμα Γ.5). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το πρότυπο μείωσης της δραστικότητας της SRPK1 μοιάζει με αυτό των επιπέδων της πρωτεΐνης ύστερα από Western Blot ανάλυση (Σχήμα Γ.1), ενώ αντίθετα η δραστικότητα της SRPK1a παρουσιάζει πολύ μικρότερη μείωση (αύξηση) καθώς μεγαλώνει η συγκέντρωση του sirna. Σχήμα Γ.4. Ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων ύστερα από επιμόλυνση τους με scramble και sh4 sirnas και έλεγχος της δραστικότητας τους. Α. Ανοσοκατακρήμνιση των εκχυλισμάτων με το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Β. Ανοσοκατακρήμνιση των εκχυλισμάτων με το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1a. Οι καθηλωμένες στα σφαιρίδια κινάσες επωάστηκαν στους 30 ο C για 30 min με προσθήκη 12 mm Hepes ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 0.6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, 25 μμ ψυχρού ΑΤΡ και GSTLBR(62-92). Τα δείγματα αναλύθηκαν στη συνέχεια με SDS-PAGE και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. 74

79 % Activity scramble 10 μg DNA sh4 7.5 μg DNA sh4 10 μg DNA 20 0 a-srpk1 a-srpk1a Σχήμα Γ.5. Ποσοτικοποίηση της δραστικότητας ανοσοκατακρημνισμένων SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν προηγουμένως επιμολυνθεί με scramble και sh4 sirnas. Οι ραδιενεργές ζώνες που προέκυψαν μετά την αυτοραδιογραφία του Σχήματος Γ.4. κόπηκαν και μετρήθηκαν σε σπινθηριστή κατά Cherenkov. Ως επί τοις εκατό δραστικότητα ορίζεται σε κάθε περίπτωση η δραστικότητα των ανοσοκατακρημνισμένων κινασών από εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με scramble sirna. Γ.1.4. Επίδραση της αναστολής της έκφρασης της SRPK1 στο πρότυπο φωσφορυλίωσης των SR παραγόντων ματίσματος. Οι SRPKs έχουν μελετηθεί εκτενώς για το ρόλο τους στη διαδικασία του ματίσματος του πρόδρομου mrna, δεδομένου ότι φωσφορυλιώνουν τους SR παράγοντες ματίσματος (Gui et al., 1994a; Wang et al., 1998). Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της αναστολής της έκφρασης των SRPK1/SRPK1a στο πρότυπο φωσφορυλίωσης των παραγόντων ματίσματος, 300 μg εκχυλισμάτων 293Τ που επιμολύνθηκαν με το scramble και διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις του sh4, αναλύθηκαν σε πηκτή SDS πολυακρυλαμιδίου. Έπειτα, έγινε ανάλυση κατά Western με το μονοκλωνικό αντίσωμα mab104, το οποίο δεσμεύεται εξειδικευμένα σε φωσφορυλιωμένα RS διπεπτίδια. 75

80 Σχήμα Γ.6. Western Blot ανάλυση των εκχυλισμάτων 293Τ κυττάρων ως προς φωσφορυλιωμένες SR πρωτεΐνες ύστερα από επιμόλυνση των κυττάρων με scramble και sh4 sirnas. Αρχικά έγινε ανάλυση 300 μg από κάθε κυτταρικό εκχύλισμα σε SDS-PAGE και στη συνέχεια Western blot ανάλυση με το μονοκλωνικό αντίσωμα mab104. Αριστερά δίνονται πρωτεϊνικοί μάρτυρες μοριακών βαρών σε kda. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.6. δεν υπάρχει ουσιαστική διαφοροποίηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των παραγόντων ματίσματος στα διάφορα εκχυλίσματα. Μόνο σε συγκεντρώσεις sh4 DNA 7.5 και 10 μg παρατηρείται κάποια αναστολή, κυρίως στις ζώνες με μοριακά βάρη kda. Γ.2. Αναστολή της έκφρασης των SRPK1/1a σε κύτταρα HeLa. Το επόμενο σύστημα που μελετήθηκε για να διαπιστωθεί αν το φαινόμενο αναστολής της έκφρασης των κινασών SRPK1/1a που παρατηρείται στα 293Τ κύτταρα δεν είναι μεμονωμένο αλλά συμβαίνει και αλλού, ήταν τα κύτταρα HeLa. Τα συγκεκριμένα κύτταρα παρουσιάζουν γενικά χαμηλά επίπεδα επιμόλυνσης και γι αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα kit επιμόλυνσης των HeLa, της εταιρίας Roche. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β Στα κύτταρα έγινε εισαγωγή του ανασυνδυασμένου sistrike φορέα τόσο με το ολιγονουκλεοτίδιο scramble σε συγκεντρώσεις 1.06, 1.27 και 1.48 μg όσο και με το ολιγονουκλεοτίδιο sh4 σε αντίστοιχες συγκεντρώσεις. Ύστερα από επώαση 96 76

81 ωρών παρουσία πουρομυκίνης, έγινε λύση των κυττάρων. Ακολούθησε διαχωρισμός 300 μg από κάθε εκχύλισμα σε πηκτή SDS πολυακρυλαμιδίου και ανάλυση κατά Western με το μονοκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Σχήμα Γ.7. Western Blot ανάλυση των εκχυλισμάτων HeLa κυττάρων ως προς SRPK1 ύστερα από επιμόλυνση των κυττάρων με scramble (Α) και sh4 (Β) sirnas. Αρχικά έγινε ανάλυση 300 μg από κάθε κυτταρικό εκχύλισμα σε SDS-PAGE και στη συνέχεια Western blot ανάλυση με το μονοκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Το αποτέλεσμα του πειράματος έδειξε σημαντική αναστολή των SRPK1/SRPK1a στα κύτταρα που έκφραζαν το sh4, σε σχέση με αυτά που επιμολύνθηκαν με το scramble. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση των επιπέδων της κινάσης καθώς αυξανόταν η συγκέντρωση του ανασυνδυασμένου DNA. (Σχήμα Γ.7). Γ.3. Αναστολή της έκφρασης των SRPK1/SRPK1a σε Κ562 κύτταρα. Γ.3.1. Μελέτη της αναστολής της έφρασης των SRPK1/SRPK1a με Western blot ανάλυση. Η κυτταρική σειρά Κ562 συνίσταται από καρκινικά κύτταρα χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας που φέρουν το χρωμόσωμα της Φιλαδέλφειας. Έχει βρεθεί ότι εκφράζουν μεγάλα ποσά της SRPK1 συγκριτικά με άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σανίδας Ι., 2008). Γι αυτόν το λόγο επιλέχθηκαν τα Κ562 να είναι το επόμενο σύστημα στο οποίο διερευνήθηκε η επίδραση της μετα-μεταγραφικής καταστολής της κινάσης. 77

82 Τα κύτταρα Κ562 επιμολύνθηκαν παροδικά με τη μέθοδο της ηλεκτροδιάχυσης όπως περιγράφεται λεπτομερώς στην παράγραφο Β Έγινε εισαγωγή του πλασμιδιακού φορέα sistrike με το scramble DNA, το οποίο εκφράζεται ως μη λειτουργικό sirna και με το sh4 DNA, το οποίο οδηγεί στη σύνθεση sirna που υβριδίζεται με το mrna της κινάσης και την καταστέλλει. Οι συγκεντρώσεις των δυο ανασυνδυασμένων φορέων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την επιμόλυνση ήταν 5, 10, 15 και 20 μg. Με το πέρας 96 ωρών έγινε λύση των κυττάρων και τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με Western blot για την ανίχνευση των επιπέδων των SRPK1 και SRPK1a. Σχήμα Γ.8. Western Blot ανάλυση των εκχυλισμάτων Κ562 κυττάρων ως προς SRPK1 ύστερα από επιμόλυνση των κυττάρων με scramble και sh4 sirnas. Αρχικά έγινε ανάλυση 300 μg από κάθε κυτταρικό εκχύλισμα σε SDS-PAGE και στη συνέχεια Western blot ανάλυση με το μονοκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Όπως φαίνεται κι από το σχήμα Γ.8, υπάρχει σημαντική μείωση των επιπέδων της κινάσης στα εκχυλίσματα που έκφραζαν το sh4 sirna, σε σχέση με αυτά που επιμολύνθηκαν με το scramble sirna. Γ.3.2. Ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα Κ562 κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4 DNA και έλεγχος της δραστικότητας τους. Σε μια προσπάθεια να διαπιστωθεί ο βαθμός αναστολής της δραστικότητας κάθε κινάσης, έγινε ανοσοκατακρήμνιση των εκχυλισμάτων Κ562 κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 15 μg scramble είτε με 15 μg sh4 DNA με τα πολυκλωνικά αντισώματα των SRPK1 και SRPK1a αντίστοιχα. Στα σφαιρίδια με τις ανοσοκατακρημνισμένες κινάσες ακολούθησε δοκιμασία φωσφορυλίωσης, 78

83 χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το αμινο-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης, GSTLBR(62-92), όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.9. Το αποτέλεσμα του πειράματος έδειξε σημαντική διαφορά στην αναστολή της δραστικότητας των δύο ισομορφών (Σχήμα Γ.9.). Πιο συγκεκριμένα, η δραστικότητα της SRPK1a παραμένει σαφώς πιο ανεπηρέαστη από τη δραστικότητα της SRPK1. Τα αποτέλεσμα αυτό αντικατοπτρίζεται καλύτερα με μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή κατά Cherenkov, κατά την οποία προκύπτει ότι η εναπομείνουσα δραστικότητα της SRPK1a είναι περίπου τριπλάσια αυτής της SRPK1 (Σχήμα Γ.10.). Σχήμα Γ.9. Ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα Κ562 κυττάρων ύστερα από επιμόλυνση τους με scramble και sh4 sirnas και έλεγχος της δραστικότητας τους. Α. Ανοσοκατακρήμνιση των εκχυλισμάτων με το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Β. Ανοσοκατακρήμνιση των εκχυλισμάτων με το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1a. Οι καθηλωμένες στα σφαιρίδια κινάσες επωάστηκαν στους 30 ο C για 30 min με προσθήκη 12 mm Hepes ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 0.6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, 25 μμ ψυχρού ΑΤΡ και GSTLBR(62-92). Τα δείγματα αναλύθηκαν στη συνέχεια με SDS-PAGE και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. 120 % Activity scramble sh a-srpk1 a-srpk1a Σχήμα Γ.10. Ποσοτικοποίηση της δραστικότητας ανοσοκατακρημνισμένων SRPK1 και SRPK1a από εκχυλίσματα Κ562 κυττάρων που είχαν προηγουμένως επιμολυνθεί με scramble και sh4 sirnas. Οι ραδιενεργές ζώνες που προέκυψαν μετά την αυτοραδιογραφία του Σχήματος Γ.9. κόπηκαν και μετρήθηκαν σε σπινθηριστή κατά Cherenkov. Ως επί τοις εκατό δραστικότητα ορίζεται η δραστικότητα των ανοσοκατακρημνισμένων κινασών που είχαν επιμολυνθεί με scramble sirna. 79

84 Γ.3.3. Η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 προκαλεί μείωση του ρυθμού ανάπτυξης και διαφοροποίηση των κυττάρων Κ562 προς ερυθροκύτταρα. Αφού διαπιστώθηκε ότι το sh4 προκαλεί σημαντική μείωση των επιπέδων της SRPK1, το επόμενο βήμα ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της αναστολής της έκφρασης της κινάσης στο ρυθμό ανάπτυξης και στο φαινότυπο των κυττάρων. Αρχικά έγινε επιμόλυνση κυττάρων που βρίσκονταν σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης με 15 μg scramble και sh4 DNA αντίστοιχα. Οι δύο καλλιέργειες είχαν αρχικά 10 6 κύτταρα/ml. Ακολούθησε μέτρηση των κυττάρων από την 3 η ημέρα και κάθε 24 ώρες έως και την 5 η ημέρα. Οι μετρήσεις επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Έτσι κατασκευάστηκε η καμπύλη ανάπτυξης των δύο καλλιεργειών του σχήματος Γ.11. Από την καμπύλη είναι σαφές ότι τα κύτταρα που έκφραζαν το sh4 sirna είχαν χαμηλότερο ρυθμό ανάπτυξης συγκριτικά με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το scramble. Πιο συγκεκριμένα, η καλλιέργεια που είχε επιμολυνθεί με το sh4, την 3 η ημέρα αριθμούσε περίπου 3 x 10 5 κύτταρα/ml, και την 4 η και 5 η ημέρα περίπου 4 x Αντίθετα η καλλιέργεια που είχε επιμολυνθεί με το scramble, αριθμούσε την 3 η ημέρα μετά την επιμόλυνση περίπου 4 x 10 5 κύτταρα/ml, ενώ την 4 η και 5 η ημέρα 6 x 10 5 κύτταρα/ml. Συνεπώς, η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 είχε ως αποτέλεσμα την μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων συγκριτικά με την καλλιέργεια ελέγχου scramble sh4 Cells x Days Σχήμα Γ.11. Καμπύλη ρυθμού ανάπτυξης Κ562 κυττάρων που επιμολύνθηκαν με scramble και sh4 sirna. Ο αρχικός αριθμός κυττάρων και στις δύο καλλιέργειες ήταν 10 6 κύτταρα/ml. Ακολούθησαν μετρήσεις των κυττάρων την 3 η, 4 η και 5 η ημέρα μετά την επιμόλυνση. Οι τιμές του σχήματος προκύπτουν από τον μέσο όρο τριων μετρήσεων. 80

85 Παράλληλα με τη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων που είχαν μειωμένη έκφραση της SRPK1 παρατηρήθηκε και αλλαγή στο φαινότυπο τους. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα είχαν εμφανή ελάττωση του μεγέθους τους, ενώ το ίζημά τους ήταν χρώματος ερυθρού. Δεδομένου ότι η κυτταρική σειρά Κ562 μπορεί να διαφοροποιηθεί σε ερυθροκύτταρα έγινε έλεγχος της διαφοροποίησης με χρώση βενζιδίνης όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.4. Οι μετρήσεις έγιναν την 3 η, 4 η και 5 η ημέρα μετά την επιμόλυνση. Πραγματικά διαπιστώθηκε και με τη χρώση βενζιδίνης ότι τα κύτταρα που έκφραζαν το sh4 sirna είχαν διαφοροποιηθεί σ ένα μεγάλο ποσοστό σε ερυθροκύτταρα (Σχήμα Γ.12). Ειδικότερα, κατά την 3 η ημέρα μετά την επιμόλυνση η διαφοροποίηση και στις δύο καλλιέργειες ήταν μικρή, 2.45% σ αυτήν που είχε επιμολυνθεί με το scramble και 7.7% σ αυτή που είχε επιμολυνθεί με το sh4. Ωστόσο, την 4 η ημέρα παρατηρήθηκε μια ξαφνική αύξηση της διαφοροποίησης των κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με sh4, που άγγιζε το 53% ενώ η καλλιέργεια με το scramble είχε μόλις 4.4%. Την 5 η διαφοροποίησης παρέμειναν περίπου ως είχαν και την 4 η ημέρα τα επίπεδα ημέρα. Συνεπώς, η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 προκάλεσε την διαφοροποίηση των Κ562 κυττάρων. 60 % differentiation scramble sh Days Σχήμα Γ.12. Διαφοροποίηση κυττάρων Κ562 προς ερυθροκύτταρα, ύστερα από την επιμόλυνσή τους με scramble και sh4 sirna αντίστοιχα. Το ποσοστό των κυττάρων που διαφοροποιήθηκαν προσδιορίστηκε με χρώση βενζιδίνης, η οποία χρωματίζει τα ερυθροκύτταρα μπλε. Οι μετρήσεις έγιναν την 3 η, 4 η και 5 η ημέρα της επιμόλυνσης. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Μια ακόμη απόδειξη της διαφοροποίησης των Κ562 κυττάρων είναι η παρουσία αυξημένης ποσότητας αιμοσφαιρίνης. Για το σκοπό αυτό, κύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με 15 μg sh4 και scramble, λύθηκαν 4 ημέρες μετά την εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν σε πηκτή SDS- 81

86 πολυκρυλαμιδίου και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με βαφή Coomassie Brilliant Blue R-250. Σχήμα Γ.13. Έκφραση γ-σφαιρίνης στα Κ562 κύτταρα που εκφράζουν το sh4 sirna. 100 μg συνολικής πρωτεΐνης από Κ562 κύτταρα που επιμολύνθηκαν με sh4 και scramble DNA αναλύθηκαν σε 12% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue R Το βέλος δείχνει τη θέση της γ-σφαιρίνης. Αριστερά δίνονται πρωτεϊνικοί μάρτυρες μοριακών βαρών σε kda. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.13, τα κύτταρα που έχουν επιμολυνθεί με το sh4 εκφράζουν σημαντικές ποσότητες αιμοσφαιρίνης. Συνεπώς και με το πείραμα αυτό επιβεβαιώνεται ότι η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 επάγει την διαφοροποίηση των Κ562 κυττάρων προς ερυθροκύτταρα. 82