Transcript

1

2

3

4

5 i ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη μιας δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την ακολουθία αργινίνης/σερίνης που περιέχεται στο αμινο-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β. Ειδικότερα, στόχος ήταν ο χαρακτηρισμός της δραστικότητας αυτής από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου, η πιθανή ρύθμιση της από άλλες κινάσες πρωτεϊνών, καθώς και ο ρόλος της στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο σύμπλοκο που σχηματίζει ο εν λόγω υποδοχέας. Στην πορεία της προσπάθειας αυτής βρέθηκε ότι η εν λόγω δραστικότητα οφείλεται στην κινάση πρωτεϊνών SRPK1, ένα μέλος της οικογένειας των κινασών πρωτεϊνών αργινίνης/σερίνης (SRPKs), ήδη γνωστής για την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αργινίνης/σερίνης διαφόρων παραγόντων ματίσματος. Ο χαρακτηρισμός του υπεύθυνου ενζύμου για την τροποποίηση του αμινο-τελικού άκρου του υποδοχέα λαμίνης Β μέσω φωσφορυλίωσης υπήρξε το έναυσμα για τη συστηματικότερη μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ του LBR και της πρωτεΐνης p32 καθώς και του ρόλου της φωσφορυλίωσης στη ρύθμιση της αλληλεπίδρασης αυτής. Επίσης, από τη στιγμή που χαρακτηρίστηκε η κινάση πρωτεϊνών, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσίαζε και η πιθανότητα να ρυθμίζεται η δραστικότητα της και η υποκυτταρική της κατανομή από άλλες κινάσες πρωτεϊνών. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κάτω από την άμεση καθοδήγηση του επίκουρου καθηγητή κ. Θ. Γιαννακούρου, τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την υπόδειξη του θέματος και για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εργασίας. Η συνεργασία μαζί του αποτέλεσε μία πηγή γνώσεων και σωστού τρόπου σκέψης και θεώρησης της επιστήμης της Βιοχημείας. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή κ. Δ. Κυριακίδη και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Τ. Γιουψάνη, μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για το ενδιαφέρον τους, την άψογη συνεργασία, καθώς και τις πολύτιμες υποδείξεις τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τους καθηγητές κ. Σ. Γεωργάτο και κ. Ζ. Σκούρα, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Π. Αρζόγλου και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Δ. Χολή-Παπαδοπούλου μέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις χρήσιμες παρατηρήσεις τους και το χρόνο που διέθεσαν διορθώνοντας τα κείμενα μου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τη λέκτορα κ. Ε. Νικολακάκη για τη στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συμπαράσταση, καθώς και για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που μου

6 ii προσέφερε κατά την πειραματική διαδικασία. Η συμβολή της για την πραγματοποίηση των μεταλλάξεων στο γονίδιο της SRPK1 υπήρξε καθοριστική. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την επίκουρη καθηγήτρια κ. Θ. Παπαμαρκάκη για την εκτέλεση των πειραμάτων ανοσοφθορισμού κατά τη διερεύνηση της υποκυτταρικής κατανομής της SRPK1 και του μεταλλάγματος της. Ευχαριστώ ακόμη το διευθυντή ερευνών του CNRS κ. P. Sassone-Corsi (IGBMC, Strasbourg, France) για την ευκαιρία που μου έδωσε να επισκεφθώ και να εκτελέσω πειράματα στο εργαστήριο του, καθώς και τον Dr. Stefano Brancorsini για τη βοήθεια που μου προσέφερε κατά την παραμονή μου στο εργαστήριο. Η συμβολή τους υπήρξε πολύτιμη και ουσιαστική μεταφέροντας μου την εμπειρία τους και τις γνώσεις τους πάνω σε θέματα σπερματογένεσης. Ευχαριστίες οφείλω και σ όλο το προσωπικό και συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχημείας για τη συνεργασία τους και τη δημιουργία του ευχάριστου συναδελφικού κλίματος μέσα στο εργαστήριο. Τέλος, τις περισσότερες ευχαριστίες οφείλω στους γονείς μου και τον αδελφό μου, γιατί με την ενθάρρυνση και την αμέριστη υλική και ηθική τους συμπαράσταση όλα αυτά τα χρόνια μπόρεσα να ολοκληρώσω τις σπουδές μου.

7 iii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΕΛΙΔΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΦΑΚΕΛΟΣ 13 Α.1.1. Πυρηνική λάμινα Λαμίνες 14 Α.1.2. Αποπολυμερισμός και επανασυγκρότηση του πυρηνικού 15 φακέλου κατά τη μίτωση Α.1.3. Ο Υποδοχέας της Λαμίνης Β (LBR) 17 Α.1.4. Το σύμπλοκο του υποδοχέα της λαμίνης Β (the LBR 19 complex) Α.2. ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 21 Α.2.1. Ταξινόμηση των κινασών πρωτεϊνών 22 Α.2.2. Ομολογία μεταξύ των «ευκαρυωτικών» κινασών πρωτεϊνών 23 Α Φυλογενετικό δέντρο και ταξινόμηση των ευκαρυωτικών κινασών πρωτεϊνών A.3. ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ (SERIΝΕ / 27 ARGININE PROTEIN KINASES, SRPK s) Α.3.1. Μέλη της οικογένειας-χαρακτηριστικά δομής 27 A.3.2. Eξειδίκευση των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης 33 Α.3.3. Εντόπιση των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης 34 A.3.4. Υποστρώματα των SRPK s-πιθανός ρόλος της 36 φωσφορυλίωσης Α.3.5. Άλλοι ρόλοι της οικογένειας των κινασών σερίνης/αργινίνης 41 A Φωσφορυλίωση επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης / σερίνης από άλλες κινάσες πρωτεϊνών Α Φωσφορυλίωση των RS παραγόντων ματίσματος από την 42 κινάση πρωτεϊνών CLK1 (CLK/STY) A Η DNA τοποϊσομεράση Ι των θηλαστικών φωσφορυλιώνει 43 την RS περιοχή των παραγόντων ματίσματος A.4. ΚΙΝΑΣΕΣ ΚΑΖΕΪΝΗΣ ΤΥΠΟΥ 2 (CK2) A.4.1. Δομή της κινάσης καζεΐνης

8 iv Α.4.2. Εξειδίκευση του ενζύμου 50 Α.4.3. Κινητικά χαρακτηριστικά της CK2 51 Α.4.4. Κατανομή της κινάσης καζεΐνης 2 στους ιστούς 52 Α.4.5. Υποκυτταρική κατανομή της CK2 53 Α.4.6. Υποστρώματα της CK2-Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης 56 A.5. ΣΠΕΡΜΑΤΟΓΕΝΕΣΗ 60 Α.5.1. Σπερματοφόρος σωληνίσκος 61 Α.5.2. Διαφοροποίηση γεννητικών κυττάρων 62 Α.5.3. Τα Sertoli κύτταρα (Sertoli cells) 63 Α.5.4. Ο κύκλος του σπερματοφόρου επιθηλίου 64 Α.5.5. Περαιτέρω ωρίμανση 65 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 66 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Βιολογικό υλικό 68 B.2. Χημικά αντιδραστήρια 68 B.3. Υλικά χρωματογραφίας 68 B.4. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας 68 B.5. Κλασμάτωση εκχυλισμάτων όρχεων αρουραίου ή ποντικού 69 B.6. Προσδιορισμός πρωτεΐνης 70 B.6.1 Φασματοφωτομετρική μέθοδος 70 B.6.2. Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford τροποποιημένη από τον Bearden 70 B.7. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (T.L.C.) 71 B.8. Χρωματογραφία ιονικής ανταλλαγής 71 B.9. Χρωματογραφία αγχιστείας 72 B.10. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης πρωτεϊνών ή δράσης κινάσης καζεΐνης 2 με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους B.11. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) B Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) 76 B.13. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R B.14. Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO3) 78 B.15. Αυτοραδιογραφία 78

9 v Β.16. In situ επαναφορά ενζυμικής δράσης μετά από SDS-PAGE 79 B.17. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη 80 B.18. Υπερδιήθηση-Λυοφίλιση 80 B.19. Παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων απέναντι στις SRPK1 και SRPK1a 81 B.20. Ανοσοανίχνευση 81 B.21. Ανοσοκατακρήμνηση-Ανοσοαπομάκρυνση 83 B.22. Πειράματα συγκατακρίμνησης (pulldown assays) 84 B.23. Ανάλυση φωσφοαμινοξέων 86 B.24. Ανάλυση φωσφοπεπτιδίων 87 B.25. Απευθείας τρυψινόλυση 88 B.26. Δισδιάστατος διαχωρισμός φωσφοπεπτιδίων 88 B.27. Αναστολή δράσης από την ηπαρίνη 89 B.28. Διερεύνηση της ρύθμισης στη δράση της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση με την κινάση καζεΐνης 2 90 B.29. Ηλεκτροφόρηση και απομόνωση DNA σε πηκτή αγαρόζης 90 B.30. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς 92 B.31. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων επιδεκτικών για μετασχηματισμό (Competent Cells) 94 B.32. Μετασχηματισμός κυττάρων Ε. coli 95 B.33. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση 95 B.34. Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το kit Qiagen-tip B.35. Εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του DNA 97 B.36. Παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων 98 B.37. Σημειακή in vitro ολιγονουκλεοτιδίου-κατευθυνόμενη μετάλλαξη B Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 103 B.39. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με 6 Ιστιδίνες 104 B.40. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων 106 Β.41. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού 108 Β.42. In situ υβριδισμός σε τομές όρχεων ποντικού 109 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

10 vi Γ.1. Καθαρισμός και χαρακτηρισμός της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) Γ Έκφραση του αμινοτελικού τμήματος του υποδοχέα της λαμίνης Β ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt) καθώς και του μεταλλάγματος από το οποίο έχουν αφαιρεθεί οι επαναλαμβανόμενες ακολουθίες αργινίνης/σερίνης (GSTΔRS) Γ Κατανομή της δραστικότητας κινάσης απέναντι στην RS ακολουθία του αμινοτελικού άκρου του LBR σε ιστούς αρουραίου 113 Γ.1.3. Αρχική μελέτη της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στο GST-wtNt σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα από όρχεις αρουραίου 114 Γ.1.4. Καθαρισμός της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στο αμινο-τελικό άκρο του LBR από κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου 116 Γ Χρωματογραφία ιονικής ανταλλαγής 116 Γ Χρωματογραφία αγχιστείας 118 Γ.1.5. Πίνακας καθαρισμού 120 Γ.1.6. Χρώση με νιτρικό άργυρο (AgNO3) 120 Γ.1.7. Έκφραση της SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST 122 Γ.1.8. Έκφραση της SRPK1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα ως πρωτεΐνη σύντηξης με την ακολουθία FLAG Γ Παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος απέναντι στην SRPK1 122 Γ Ανοσοανίχνευση των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας με το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1 124

11 vii Γ Δέσμευση της SRPK1 στο αμινοτελικό άκρο του LBR 125 Γ Φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων του αμινο-τελικού άκρου του LBR από την SRPK1 και το δραστικό κλάσμα της στήλης αγχιστείας 126 Γ Ανάλυση φωσφοπεπτιδίων του αμινοτελικού άκρου του LBR μετά από φωσφορυλίωση με GST-SRPK1 και το δραστικό κλάσμα της στήλης αγχιστείας 129 Γ Φωσφορυλίωση του αμινοτελικού άκρου του LBR από την SRPK1 σε σχέση με άλλες κινάσες πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνουν RS αλληλουχίες διπεπτιδίων Γ Μελέτη της δέσμευσης της πρωτεΐνης p32 στο αμινοτελικό άκρο του LBR 132 Γ.2.1. Έκφραση της πρωτεΐνης p32 ως πρωτεΐνη σύντηξης με 6 ιστιδίνες Γ.2.2. Αλληλεπίδραση της p32 με την RS περιοχή του υποδοχέα της λαμίνης Β Γ Η δέσμευση της p32 στο αμινοτελικό άκρο του LBR παρεμποδίζει τη δέσμευση και φωσφορυλίωση του από την SRPK1 κινάση πρωτεϊνών Γ Συγκατακρίμνηση της πρωτεΐνης p32 από πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων ποντικού με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt Γ.3. Εντοπισμός των πρωτεϊνών SRPK1, LBR και p32 κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης Γ Διερεύνηση του εντοπισμού της κινάσης πρωτεϊνών SRPK1 στα διάφορα στάδια της σπερματογένεσης με ανοσοανίχνευση 138

12 viii Γ.3.2. Εντοπισμός της SRPK1 με in situ υβριδισμό σε τομές όρχεων ποντικού Γ Υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και p32 σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρων σωληνίσκων ποντικού Γ Καθαρισμός και μελέτη της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνική κινάση SRPK1 Γ Η SRPK1 φωσφορυλιώνεται από κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου και από εκχυλίσματα ευκαρυωτικών κυττάρων HeLa Γ Καθαρισμός της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την SRPK1 143 Γ Στήλη φωσφοκυτταρίνης 143 Γ Στήλη αγχιστείας 146 Γ Πίνακας καθαρισμού 148 Γ Χρώση με νιτρικό άργυρο (AgNO3) 148 Γ.4.3. Ανοσοανίχνευση της CK2 στα κλάσματα της στήλης αγχιστείας Γ.4.4. Γ Αναστολή του συμπυκνώματος των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας από την ηπαρίνη 150 Ανοσοαπομάκρυνση της κινάσης καζεΐνης 2 από 152 κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου Γ.4.6. Ανάλυση φωσφοπεπτιδίων 153 Γ.4.7. Κινητική μελέτη της φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την 154 κινάση καζεΐνης 2 Γ.4.8. Ανάλυση φωσφοαμινοξέων της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση της από την CK2 155

13 ix Γ.4.9. Εύρεση των θέσεων φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την 156 CK2 Γ Πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 156 Γ Σημειακή μετάλλαξη των πιθανών θέσεων φωσφορυλίωσης στο μόριο της SRPK1 από την CK2 157 Γ Έκφραση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B 160 Γ Φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 από την CK2 Γ Ρύθμιση της δράσης της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση από την CK2 Γ Έκφραση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε ευκαρυωτικά 164 κύτταρα Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού της SRPK1 και του 165 μεταλλάγματος της SRPK1Α51 σε ευκαρυωτικά κύτταρα Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 167 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 180 SUMMARY 182 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 184

14 x ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ ADP :Αδενοσινοδιφωσφορικό οξύ Ala :Αλανίνη AMP :Αδενοσινομονοφωσφορικό οξύ Arg :Αργινίνη Asn :Ασπαραγίνη Asp :Ασπαραγινικό οξύ ATP :Αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ Α280,Α590 :Απορρόφηση στα 280,590 nm αντίστοιχα BCIP :5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-φωσφορικό β-msh :β-μερκαπταιθανόλη BSA :Αλβουμίνη ορού βοδιού camp :3, 5 -κυκλικό αδενυλικό οξύ CaMK :Κινάση πρωτεϊνών που εξαρτάται από Ca++/καλμοδουλίνη CBB :Coomassie Brilliant Blue CDK :Κινάση πρωτεϊνών που εξαρτάται από τις κυκλίνες cdna :Συμπληρωματικό DNA CFA :Πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund CK2 :Κινάση καζεΐνης 2 cpm :Κρούσεις ανά λεπτό DAPI :4, 6-διαμιδινο-2-φενυλινδόλιο ddntp :Τριφωσφορικός εστέρας διδεοξυριβονουκλεοζίτη DNA :Δεοξυριβονουκλεϊνικό οξύ dntp :Τριφωσφορικός εστέρας δεοξυριβονουκλεοζίτη DTT :Διθειοθρεϊτόλη EDTA :Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ GDP :Γουανοσινοδιφωσφορικό οξύ Glu :Γλουταμινικό οξύ Gly :Γλυκίνη GSK :Κινάση της συνθετάσης του γλυκογόνου GST :Τρανσφεράση της γλουταθειόνης GTP :Γουανοσινοτριφωσφορικό οξύ HEPES :Ν-2-υδροξυαιθυλ-πιπεραζιν-Ν -2-αιθανοσουλφονικό οξύ

15 xi HIV :Ιός της ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας HSV :Ιός έρπητα IFA :Μη πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund IgG :Ανοσοσφαιρίνη G IPTG :Ισοπροπυλ-1-θειο-β-D-γαλακτοπυρανοζίδιο LAP :Πολυπεπτίδια σχετιζόμενα με την πυρηνική λάμινα LBR :Υποδοχέας της Λαμίνης Β Lys :Λυσίνη MAPK :Κινάση πρωτεϊνών που ενεργοποιείται από μιτογόνα MOPS :2-(Ν-μορφολινο)προπανοσουλφονικό οξύ mrna :Μεταφέρον ριβονουκλεϊνικό οξύ NBT :Κυανούν του νιτροτετραζολίου NDP :Διφωσφορικός εστέρας νουκλεοζίτη NLS :Σήμα εντοπισμού στον πυρήνα NPC :Συμπλέγματα πυρηνικών πόρων NTP :Τριφωσφορικός εστέρας νουκλεοζίτη PAF :Παραφορμαλδεΰδη PAGE :Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου PAS-H :Periodic Acid - Schiff Heamatoxylin PKA :Κινάση πρωτεϊνών Α PKC :Κινάση πρωτεϊνών C PKG :Κινάση πρωτεϊνών G Pro :Προλίνη PTK :Κινάση πρωτεϊνών τυροσίνης PVDF :Πολυ-βινυλιδινο-διφθορίδιο PVP-40 :Πολυβινυλ-πυρρολιδόνη RNA :Ριβονουκλεϊνικό οξύ RRM :Περιοχές αναγνώρισης του RNA SDS :Άλας με νάτριο του θειικού δωδεκυλίου Ser :Σερίνη SF2/ASF :Παράγοντας ματίσματος 2/Παράγοντας εναλλακτικού ματίσματος snrnp :Μικρές πυρηνικές νουκλεοπρωτεΐνες SRPK :Κινάση πρωτεϊνών αργινίνης/σερίνης ssdna :Μονόκλωνο DNA

16 xii TEMED :Ν,Ν,Ν,Ν-τετραμεθυλο-αιθυλενο-διαμίνη TLC :Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Tris :Τρις-υδροξυμεθυλ-αμινομεθάνιο Tyr :Τυροσίνη

17 13 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΦΑΚΕΛΟΣ Κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής ενός ευκαρυωτικού κυττάρου, εκτός της μίτωσης, ο πυρήνας καλύπτεται από ένα μεμβρανικό περίβλημα, τον πυρηνικό φάκελο (nuclear envelope), ο οποίος διαμερισματοποιεί τον πυρήνα από το υπόλοιπο του κυττάρου. Ο πυρηνικός φάκελος αποτελείται από δύο διακριτές μεμβράνες, την εξωτερική και εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, οι οποίες διαχωρίζονται από τον περιπυρηνικό χώρο (perinuclear cisternal space). Οι δύο μεμβράνες σε ορισμένα σημεία τους συντήκονται και σχηματίζουν πόρους με λειτουργική διάμετρο 9 nm. Μέσω των πυρηνικών πόρων είναι δυνατή η πυρηνοκυτταροπλασματική κυκλοφορία. Οι πυρηνικοί πόροι επιτρέπουν την ελεύθερη διάχυση ιόντων και μικρών μορίων, ενώ είναι υπεύθυνοι για την ενεργή μεταφορά πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων από και προς τον πυρήνα. Μελέτες τα τελευταία χρόνια έδειξαν ότι οι πόροι επενδύονται από μακρομοριακά συγκροτήματα που ονομάζονται συμπλέγματα των πυρηνικών πόρων (NPC, nuclear pore complexes). Τα παραπάνω αποτελούνται από περίπου 100 διαφορετικές πρωτεΐνες, τις νουκλεοπορίνες, που σχηματίζουν γιγαντιαίου μεγέθους μοριακές μηχανές (125 MDa) (1). Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη έχει την ίδια βιοχημική και λειτουργική σύσταση με αυτή του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου ώστε να θεωρείται ουσιαστικά η συνέχεια του, αποτελώντας ένα εξειδικευμένο υποσύνολο του. Στο μεγαλύτερο μέρος στην επιφάνεια της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, βρίσκονται προσκολλημένα ριβοσώματα όπου και μπορεί να γίνει πρωτεϊνική σύνθεση. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη έχει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και περιέχει εξειδικευμένες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που δημιουργούν θέσεις δέσμευσης πάνω στη μεμβράνη για την ετεροχρωματίνη και την πυρηνική λάμινα. Τέτοιες πρωτεΐνες είναι ο Υποδοχέας της Λαμίνης Β (LBR, Lamin B Receptor) (2), μία οικογένεια πρωτεϊνών που αναφέρονται ως LAP (Lamina Associated Polypeptides) και διαχωρίζεται σε δύο ομάδες τις LAP1 και LAP2 (3), καθώς και η εμερίνη. Κάτω από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη βρίσκεται ένα πλέγμα, το πυρηνικό έλασμα ή αλλιώς λάμινα που προκύπτει από τον πολυμερισμό των πυρηνικών λαμινών. Τόσο η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη όσο και η πυρηνική λάμινα βρίσκονται σε στενή επαφή με την περιφερική ετεροχρωματίνη και μπορεί

18 14 να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην οργάνωση του γονιδιώματος (4). Στην αλληλεπίδραση αυτή συνηγορούν βιοχημικά πειράματα, που δείχνουν ότι τόσο οι πυρηνικές λαμίνες, όσο και ορισμένες πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης (LBR, LAP2B), έχουν την ικανότητα δέσμευσης με χρωμοσώματα ή νουκλεοσώματα in vitro (5-8). Ωστόσο, ενώ η ανοσοαφαίρεση του LBR μειώνει δραματικά την ικανότητα σύνδεσης του πυρηνικού φακέλου στη χρωματίνη, η αφαίρεση της LAP2B ή των λαμινών, την επηρεάζει ελάχιστα, με συνέπεια να θεωρείται ο LBR ο κυριότερος παράγοντας για την αλληλεπίδραση μεταξύ της χρωματίνης και του πυρηνικού φακέλου (8, 9). Σχήμα Α.1. Σχηματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Α.1.1. Πυρηνική λάμινα Λαμίνες Ο πυρηνικός φάκελος υποστηρίζεται από την πυρηνική λάμινα, ένα ετεροπολυμερές πλέγμα ενδιαμέσων ινιδίων (intermediate filaments) το οποίο προσκολλάται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη (10). Η ετεροπολυμερής δομή της αποτελείται από πρωτεϊνικές υπομονάδες που καλούνται λαμίνες τύπου Α και λαμίνες τύπου Β. Το ετεροπολυμερές αυτό

19 15 σύμπλοκο των λαμινών καλύπτει όλη την επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, αλλά διακόπτεται στην περιοχή των πυρηνικών πόρων (11). Οι λαμίνες τύπου Β έχουν τη δυνατότητα απευθείας αλληλεπίδρασης με τη στοιβάδα λιποειδών της μεμβράνης διαμέσου μιας ομοιοπολικά συνδεδεμένης ισοπρενυλικής αλυσίδας (12). Η ισοπρενυλική αλυσίδα δεσμεύεται με θειοαιθερικό δεσμό σε μία κυστεΐνη, που συμπεριλαμβάνεται στο μοτίβο CAAX (Κυστεΐνη-Αλειφατικό αμινοξύ-αλειφατικό αμινοξύτυχαίο αμινοξύ), στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης και είναι απαραίτητη για τη δέσμευση των λαμινών τύπου Β στην πυρηνική μεμβράνη (13). Οι λαμίνες τύπου Α διαχωρίζονται στις λαμίνες Α και C οι οποίες αποτελούν προϊόντα διαφορετικού ματίσματος του ίδιου γονιδίου. Έχουν την ίδια αμινοξική ακολουθία και η μόνη τους διαφορά εντοπίζεται σε ένα τμήμα 90 αμινοξέων προς το καρβοξυτελικό άκρο της λαμίνης Α (14). Οι λαμίνες τύπου Α στην πρόδρομη μορφή τους φέρουν την αλυσίδα του φαρνεσυλίου και μέσω αυτής συνδέονται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Ο πολυμερισμός τους όμως με τις λαμίνες τύπου Β είναι αυτός που εξασφαλίζει τη συμμετοχή τους στο πυρηνικό έλασμα και την προσκόλληση τους στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Αυτό συμβαίνει διότι μετά τον πολυμερισμό τους μία μεμβρανική πρωτεάση αποκόπτει το τμήμα από το καρβοξυτελικό τους άκρο που περιλαμβάνει την αλυσίδα του φαρνεσυλίου (15). Καθοριστικής, επίσης, σημασίας παράγοντας για τη δέσμευση των λαμινών στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη αποτελεί η ύπαρξη ορισμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών που συμπεριφέρονται, λιγότερο ή περισσότερο, ως εξειδικευμένοι υποδοχείς. Ο σημαντικότερος εκπρόσωπος των υποδοχέων αυτών, είναι ο Υποδοχέας της Λαμίνης Β (2), ενώ άλλα μέλη των υποδοχέων θεωρούνται οι LAP πρωτεΐνες, οι οποίες υποδιαιρούνται σε δύο υποκατηγορίες τις LAP1 (με τρεις γνωστές μορφές, LAP1A, B, C) και LAP2 (με επτά διαφορετικά μέλη, LAP2A-H) (3). Α.1.2. Αποπολυμερισμός και επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου κατά τη μίτωση Σ όλη τη διάρκεια της μεσόφασης ο πυρηνικός φάκελος έχει τη μορφή ενός λεπτού μεμβρανικού καλύμματος που περιβάλλει τον πυρήνα. Με την εισαγωγή του κυττάρου στη μίτωση το περίβλημα του πυρηνικού φακέλου αρχίζει να αποικοδομείται (16-18). Η διαδικασία της αποικοδόμησης του πυρηνικού φακέλου ξεκινά με την αποκόλληση της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης από τα χρωμοσώματα και την παραμόρφωση της

20 16 επιφάνειας του πυρήνα (πρόφαση). Ακολούθως, οι πυρηνικές μεμβράνες τεμαχίζονται σε μικρότερα τμήματα και το πυρηνικό έλασμα αποπολυμερίζεται με το διαχωρισμό των λαμινών τύπου Α και τύπου Β (προμετάφαση-μετάφαση) (19). Για να είναι δυνατός ο αποπολυμερισμός των πυρηνικών λαμινών είναι απαραίτητη η υπερφωσφορυλίωση τους από την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2 η οποία ενεργοποιείται κατά το αρχικό στάδιο της μίτωσης. Η χημική τροποποίηση που επιφέρει η φωσφορυλίωση στη δομή των λαμινών, έχει ως αποτέλεσμα την εξασθένιση των δεσμών που αναπτύσσονται μεταξύ τους, αποσταθεροποιεί το πολυμερές με επακόλουθο το διαχωρισμό των συστατικών του. Μετά την επίτευξη του αποπολυμερισμού οι λαμίνες τύπου Α διαχέονται στο κυτταρόπλασμα, όπου και παραμένουν διαλυτές κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Αντιθέτως οι λαμίνες τύπου Β κατά τη διάρκεια της μίτωσης βρίσκονται, με τη μορφή ολιγομερών, συνδεδεμένες με θραύσματα του πυρηνικού φακέλου που φέρουν επίσης στην επιφάνεια τους και την πρωτεΐνη LAP1C και αγκυροβολούν πρόσκαιρα στη μιτωτική άτρακτο (11). Άλλα προϊόντα διάσπασης του πυρηνικού φακέλου αποτελούν κυστίδια που φέρουν LAP2B που διαχέονται σε όλο το κύτταρο (20). Ο υποδοχέας της λαμίνης Β κατανέμεται σε μεμβρανικές δεξαμενές που είτε προέρχονται από το ενδοπλασματικό δίκτυο (21), είτε αποτελούν θραύσματα της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης (22). Κατά την εξέλιξη του φαινομένου της μίτωσης τα μεμβρανικά θραύσματα του πυρηνικού φακέλου αρχίζουν να επαναδιοργανώνονται, με αποτέλεσμα την επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου γύρω από τους θυγατρικούς πυρήνες με τρόπο αντίστροφο της αποικοδόμησης κατά την αρχή της μίτωσης. Αρχικά λαμβάνει χώρα η σύνδεση των μεμβρανικών στοιχείων στην επιφάνεια της χρωματίνης (όψιμη ανάφαση). Ακολούθως, η κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2 απενεργοποιείται, και είναι δυνατή η αποφωσφορυλίωση των πυρηνικών λαμινών από διάφορες φωσφατάσες (τελόφαση) (23). Έτσι είναι δυνατή η δημιουργία νέου πολυμερούς πλέγματος και οι λαμίνες πολυμερίζονται πάνω στην επιφάνεια των χρωμοσωμάτων. Η σύντηξη των πυρηνικών θραυσμάτων, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία της διπλής μεμβράνης και τελικά γίνεται ο σχηματισμός των πυρηνικών πόρων (όψιμη τελόφαση/πρώιμη G1), μέσω των οποίων γίνεται η εισαγωγή των πυρηνοπλασματικών πρωτεϊνών και άλλων παραγόντων που εξυπηρετούν το μεταβολισμό του πυρήνα (24).

21 17 Σχήμα Α.2. Διάσπαση και ανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Α.1.3. Ο Υποδοχέας της Λαμίνης Β (LBR) Ο Υποδοχέας της Λαμίνης Β (LBR, p58), είναι μία πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης του πυρηνικού φακέλου. Ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του αποκάλυψε ότι αποτελείται από 8 υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές που διαπερνούν την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, καθώς και δύο υδρόφιλες περιοχές στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό του άκρο τα οποία εκτείνονται προς το πυρηνόπλασμα (25, 26). Η πρωτεΐνη αυτή συντίθεται στα ριβοσώματα του ενδοπλασματικού δικτύου και μεταφέρεται μέσω

22 18 «πλάγιας διάχυσης» στην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη και ακολούθως στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη όπου και καθηλώνεται μέσω των αλληλεπιδράσεων της με άλλα στοιχεία του πυρήνα. Η μετακίνηση της πρωτεΐνης είναι δυνατή λόγω της συνέχειας που παρουσιάζουν οι μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου με την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη και αυτή εν συνεχεία με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη (21). Αν και δεν έχει γίνει συστηματική μελέτη των διαμεμβρανικών τμημάτων της πρωτεΐνης και του καρβοξυτελικού της άκρου, οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά του αμινοτελικού της άκρου έχουν μελετηθεί διεξοδικά. Το αμινοτελικό του Υποδοχέα της Λαμίνης Β αποτελείται από μία ακολουθία 208 αμινοξέων και έχει σφαιρικό (globular) σχήμα. Στο τμήμα αυτό περιέχονται το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της πρωτεΐνης (NLS), ακολουθίες αμινοξέων οι οποίες είναι ικανές να φωσφορυλιωθούν από την πρωτεϊνική κινάση Α και την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, μία περιοχή επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS domain), καθώς και πιθανές περιοχές δέσμευσης του DNA (27-31). Ακόμη το αμινοτελικό άκρο του LBR είναι ικανό να δεσμεύσει τη λαμίνη τύπου Β, γεγονός που εξηγεί και την ονομασία της πρωτεΐνης (2, 26, 29). Σε μελέτες που έχουν γίνει κατά το παρελθόν έχει δειχθεί ότι το αμινοτελικό άκρο του LBR φωσφορυλιώνεται in vivo από την πρωτεϊνική κινάση Α. Η μη φωσφορυλιωμένη του μορφή παρουσιάζει δραστικά μειωμένη ικανότητα δέσμευσης με τη λαμίνη Β, γεγονός που καταδεικνύει το σημαντικό ρόλο της φωσφορυλίωσης αυτής στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ πυρηνικής μεμβράνης και λάμινας (27). Ακόμη κατά τη διάρκεια της μίτωσης φωσφορυλιώνεται από την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, η οποία τροποποιεί κατά κύριο λόγο τη σερίνη που βρίσκεται στη θέση 71 (Ser71) (31). Ένα ακόμη σημαντικό χαρακτηριστικό του αμινοτελικού άκρου του LBR αποτελεί και η ύπαρξη μιας ακολουθίας επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (75RSRSRSRSRS84) η οποία υπόκειται σε φωσφορυλίωση των σερινών της από μία εξειδικευμένη δράση κινάσης πρωτεϊνών (RS κινάση) (30, 31). Τέτοιες χαρακτηριστικές ακολουθίες διπεπτιδίων έχουν βρεθεί να υπάρχουν και στους παράγοντες ματίσματος του RNA και να φωσφορυλιώνονται από τα μέλη της οικογένειας κινασών πρωτεϊνών αργινίνης/σερίνης (SRPKs). Ο λειτουργικός ρόλος των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων στους παράγοντες ματίσματος, όπως έχει δειχτεί, είναι η επαγωγή των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών (protein-protein interactions), με τη φωσφορυλίωση να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των αλληλεπιδράσεων (32, 33).

23 19 Το αμινοτελικό άκρο επίσης συμμετέχει και σε αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα όπως η πρωτεΐνη p32/p34, οι ιστόνες Η3 και Η4 (34) και η πρωταμίνη 1 (35). Ο μεγάλος αριθμός αλληλεπιδράσεων του αμινοτελικού άκρου του LBR με πρωτεΐνες του πυρήνα του προσδίδουν σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης με την πυρηνική λάμινα καθώς και με τη χρωματίνη. Η ισχυρή δε αλληλεπίδραση ορισμένων πυρηνικών πρωτεϊνών με το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β έχει οδηγήσει στην απομόνωση κατά το παρελθόν του συμπλόκου του LBR. Α.1.4. Το σύμπλοκο του υποδοχέα της λαμίνης Β (the LBR complex) Κατά την απομόνωση του υποδοχέα της λαμίνης Β από ερυθροκύτταρα γαλοπούλας (τα οποία διατηρούν τον πυρήνα κατά τη διαφοροποίηση τους), βρέθηκε ότι αυτός σχηματίζει ένα σύμπλοκο το οποίο απαρτίζεται από πολλές πρωτεΐνες του πυρήνα (2). Το σύμπλοκο αυτό περιλαμβάνει εκτός του υποδοχέα, τις λαμίνες τύπου Α και Β, μία εξειδικευμένη δράση κινάσης απέναντι στην ακολουθία αργινίνης/σερίνης του LBR, και άλλες τρεις πρωτεΐνες με μοριακές μάζες 18, 34 και 150 kda αντίστοιχα (29). Από τις πρωτεΐνες αυτές η λαμίνη Β αλληλεπιδρά με το αμινοτελικό άκρο του LBR σχηματίζοντας έτσι μία δομή πάνω στην οποία μπορεί και προσκολλάται και η λαμίνη Α, εξηγώντας έτσι τη συγκατακρίμνηση τους με τον υποδοχέα. Η πρωτεΐνη p18 αποτελεί ένα νέο μέλος των πρωτεϊνών του πυρηνικού φακέλου και εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στους πυρήνες των ερυθροκυττάρων των πτηνών. Η πρωτεΐνη p34 αποτελεί την ανάλογη μορφή στα πτηνά, της ανθρώπινης πρωτεΐνης p32. Η κρυσταλλική δομή της p32 μελετήθηκε πρόσφατα και αποκάλυψε ότι αυτή σχηματίζει ομοτριμερή σε σχήμα δακτυλίου (36). Η πρωτεΐνη αυτή μπορεί να θεωρηθεί ως μέλος μιας νέας οικογένειας πρωτεϊνών που χαρακτηρίζονται ως πολυλειτουργικές και εντοπίζονται σε πολλαπλά διαμερίσματα του κυττάρου (37). Η πρωτεΐνη p32 αρχικά συντίθεται με την πρόδρομη μορφή της (pre-p32) η οποία μεταφέρεται στα μιτοχόνδρια καθώς περιέχει στο αμινοτελικό της άκρο μια ακολουθία αμινοξέων που επιτρέπει την είσοδο της στο μιτοχόνδριο. Με την πρωτεολυτική αφαίρεση της ακολουθίας αυτής παραλαμβάνεται η ώριμη μορφή της πρωτεΐνης, η οποία πιστεύεται ότι συμμετέχει στην αναπνευστική αλυσίδα (38). Η ώριμη μορφή της πρωτεΐνης συναντάται όμως και στον πυρήνα αλλά και σε άλλα διαμερίσματα του κυττάρου (37-39). Δεν είναι γνωστό αν η εντόπιση αυτή οφείλεται σε κάποιο άγνωστο ακόμα μηχανισμό εξόδου από το μιτοχόνδριο ή στο ότι γίνεται αποκοπή του

24 20 σήματος μιτοχονδριακής εντόπισης στο κυτταρόπλασμα, πριν η πρόδρομη μορφή της πρωτεΐνης εισέλθει στο μιτοχόνδριο. Οι πυρηνικές πρωτεΐνες εκτός του υποδοχέα της λαμίνης Β (40) με τις οποίες αλληλεπιδρά, είναι ο παράγοντας ματίσματος του RNA, SF2/ASF, παρεμποδίζοντας με τον τρόπο αυτό τη φωσφορυλίωση του από την κινάση πρωτεϊνών SRPK1, (41) και ο παράγοντας μεταγραφής TFIIB (42). Ακόμη η p32 αλληλεπιδρά με μεγάλο αριθμό ιϊκών πρωτεϊνών που εντοπίζονται στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων μετά από επιμόλυνση τους από τον αντίστοιχο ιό, όπως οι πρωτεΐνες Rev και Tat του HIV-1 (42,43), η πρωτεΐνη EBNA-1 ιού Epstein-Barr (44), η ORF-P του ιού HSV (45), καθώς και η πρωτεΐνηv του αδενοϊού (39). Σχήμα Α.3. Σχηματική αναπαράσταση του συμπλόκου του Υποδοχέα της Λαμίνης Β. H αλληλεπίδραση της p32 με τον υποδοχέα της λαμίνης Β και με τον παράγοντα ASF/SF2, γίνεται με την ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που περιέχουν στο μόριο τους οι δύο αυτές πρωτεΐνες (30, 41), ενώ δεν έχει διευκρινιστεί η μοριακή βάση της αλληλεπίδρασης με

25 21 τον παράγοντα TFIIB καθώς και με τις ιϊκές πρωτεΐνες. Υπάρχουν ακόμη αναφορές στη βιβλιογραφία που τοποθετούν την πρωτεΐνη p32 ως υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου (46), ενώ πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η p32 αλληλεπιδρά με την πρωτεϊνική κινάση C επηρεάζοντας τόσο τη δραστικότητα όσο και την εντόπιση της (47). Όσον αφορά τη δράση κινάσης που απομονώνεται ως μέρος του συμπλόκου, αυτή αποτελεί μέλος μιάς νέας οικογένειας κινασών πρωτεϊνών που τροποποιούν εξειδικευμένα, μία ή περισσότερες σερίνες, από επαναλαμβανόμενες ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (31). Η παρουσία του χαρακτηριστικού αυτού μοτίβου, που συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών, στο αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα, σε συνδυασμό με την εμφάνιση της φωσφορυλιωτικής δράσης, παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αλληλεπιδράσεων μεταξύ του LBR και πρωτεϊνών που γειτονεύουν με τον LBR (30), αλλά πιθανά και στην καθήλωση διαφόρων πυρηνικών πρωτεϊνών στην πυρηνική περιφέρεια με την ταυτόχρονη απομάκρυνση τους από το πυρηνόπλασμα (35). Κάτι ανάλογο προκύπτει από την ύπαρξη της ακολουθίας των διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης και σε άλλες πρωτεΐνες, εκτός του LBR, όπως ο παράγοντας ματίσματος του RNA SF2/ASF, ο οποίος φωσφορυλιώνεται από την κινάση πρωτεϊνών SRPK1 στη συγκεκριμένη ακολουθία. Η φωσφορυλίωση αυτή παίζει καθοριστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση του με άλλους παράγοντες ματίσματος του RNA επάγοντας τη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος (spliceosome) του RNA (32, 33). Α.2. ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ως κινάσες πρωτεϊνών ορίζονται τα ένζυμα που καταλύουν την αντίδραση φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών, ενώ την αντίθετη αντίδραση καταλύουν ένζυμα τα οποία καλούνται φωσφατάσες φωσφοπρωτεϊνών. Το γενικό σχήμα των αντιδράσεων που καταλύονται από τα ένζυμα αυτά έχει ως εξής:

26 22 Ο τριφωσφορικός νουκλεοζίτης που χρησιμοποιείται κυριότερα στις αντιδράσεις φωσφορυλίωσης ως δότης της γ-φωσφορικής ομάδας είναι το ATP, ενώ είναι σπανιότερες είναι οι περιπτώσεις εκείνες, όπου οι κινάσες χρησιμοποιούν εξίσου καλά και το GTP ως δότη φωσφορικών (48). Α.2.1. Ταξινόμηση των κινασών πρωτεϊνών Η ταξινόμηση των κινασών πρωτεϊνών γίνεται με βάση το αμινοξύ του υποστρώματος στο οποίο μεταφέρουν τη γ-φωσφορική ομάδα του νουκλεοτιδίου. Οι ομάδες που προκύπτουν σύμφωνα με την ταξινόμηση αυτή είναι οι εξής: 1. Κινάσες σερίνης/θρεονίνης, όταν χρησιμοποιείται ως δέκτης η αλκοολική ομάδα μιας σερίνης ή θρεονίνης. 2. Κινάσες τυροσίνης, όταν ο δέκτης είναι η φαινολική ομάδα της τυροσίνης. 3. Κινάσες διπλής εξειδίκευσης (dual specificity), όπου ο δέκτης μπορεί να είναι είτε σερίνη/θρεονίνη είτε τυροσίνη. 4. Κινάσες που φωσφορυλιώνουν ασπαραγινικό οξύ με ενδιάμεση φωσφορυλίωση μιας ιστιδίνης. Τα δύο αμινοξέα μπορούν να ανήκουν σε διαφορετικές πρωτεΐνες ή διαφορετικές περιοχές του ίδιου πολυπεπτιδίου. Αρχικά θεωρήθηκε ότι τέτοιες κινάσες υπάρχουν μόνο στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, αλλά πρόσφατα βρέθηκαν και στο φυτό Arabidopsis Thaliana (49) και στη ζύμη Saccharomyces cerevisiae (50). 5. «Πραγματικές» κινάσες ιστιδίνης. Τέτοιες κινάσες καθαρίστηκαν από τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae αν και παραμένει άγνωστο εάν σχετίζονται με την οικογένεια των ευκαρυωτικών κινασών πρωτεϊνών (51). Οι τρεις πρώτες ομάδες κινασών πρωτεϊνών αποτελούν τη συντριπτική πλειοψηφία κινασών στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και συχνά χαρακτηρίζονται ως «ευκαρυωτική» οικογένεια κινασών πρωτεϊνών. Μοναδική εξαίρεση παρουσίας κινασών πρωτεϊνών αυτής της οικογένειας στους προκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελούν, οκτώ γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών στο γένωμα του βακτηριδίου Μ. xanthous (52). Το χαρακτηριστικό του βακτηριδίου αυτού είναι ότι εισάγεται σε έναν πολύπλοκο κύκλο ανάπτυξης σε περιπτώσεις έλλειψης θρεπτικών ουσιών και εικάζεται ότι η παρουσία κινασών

27 23 πρωτεϊνών παρόμοιων με αυτές των ευκαρυωτικών οργανισμών μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού του κύκλου. Α.2.2. Ομολογία μεταξύ των «ευκαρυωτικών» κινασών πρωτεϊνών (53) Ο συνολικός αριθμός αλληλουχιών κινασών πρωτεϊνών που έχει διευκρινισθεί πλησιάζει τις 400. Στις ακολουθίες αυτές υπάρχουν περιοχές στην πρωτοταγή τους δομή που παρουσιάζουν υψηλή ομολογία μετά από σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών τους. Οι περιοχές αυτές υψηλής ομολογίας σχετίζονται με τις περιοχές που χαρακτηρίζουν την ενζυμική τους δραστικότητα ως κινάσες. Τρεις διακριτοί ρόλοι μπορούν να αποδοθούν στις περιοχές αυτές. (α) Περιοχή δέσμευσης και προσανατολισμού του ATP (GTP) ως σύμπλοκο με ένα δισθενές κατιόν (συνήθως Mg2+ ή Mn2+). (β) Περιοχή δέσμευσης και προσανατολισμού του πρωτεϊνικού (ή πεπτιδικού) υποστρώματος. (γ) Περιοχή μεταφοράς της γ-φωσφορικής ομάδας του νουκλεοτιδίου στο αμινοξύ του πρωτεϊνικού δέκτη. Οι τρεις αυτές περιοχές διαιρούνται περαιτέρω σε 12 μικρότερες υποπεριοχές (συμβολιζόμενες με ρωμαϊκούς αριθμούς), οριζόμενες σαν τμήματα που δεν διαχωρίζονται μεταξύ τους από μεγάλες αμινοξικές ακολουθίες και που περιέχουν χαρακτηριστικές συντηρημένες ακολουθίες αμινοξέων. Οι δώδεκα αυτές περιοχές παρουσιάζουν ελάχιστες μεταβολές σε όλη την οικογένεια των «ευκαρυωτικών» κινασών πρωτεϊνών (με ομολογία που αγγίζει το 95%) και έτσι θεωρούνται ότι παίζουν σημαντικότατο ρόλο στην ενζυμική δραστικότητα. Με βάση τη φύση των ομολογιών μεταξύ των περιοχών των κινασών μπορούμε να θεωρήσουμε ότι όλες αναδιπλώνονται σε τοπολογικά παρόμοιες τρισδιάστατες δομές και πραγματοποιούν τη μεταφορά των φωσφορικών ομάδων σύμφωνα με έναν κοινό μηχανισμό. Α.2.3. Φυλογενετικό δέντρο και ταξινόμηση των ευκαρυωτικών κινασών πρωτεϊνών (53) Η ταξινόμηση των ευκαρυωτικών κινασών πρωτεϊνών στα «κλαδιά» ενός φυλογενετικού δέντρου έγινε συσχετίζοντας τις λειτουργικές τους ιδιότητες και την ομολογία που παρουσιάζουν στις καταλυτικές τους περιοχές. Η ανάλυση των χαρακτηριστικών αυτών επέτρεψε την κατηγοριοποίηση τους σε πέντε μεγάλες οικογένειες κινασών πρωτεϊνών, όπου η κάθε μία παρουσιάζει ομοιότητες στο μοντέλο ρύθμισης της δράσης τους, καθώς και στην

28 24 εξειδίκευση και την ομολογία των πρωτοταγών τους δομών. Οι πέντε μεγάλες οικογένειες κινασών πρωτεϊνών είναι οι εξής: Σχήμα Α.4. Φυλογενετικό δέντρο κινασών πρωτεϊνών. Οικογένεια AGC Η οικογένεια αυτή κινασών πρωτεϊνών περιλαμβάνει τις κινάσες που η δράση τους ρυθμίζεται από κυκλικά νουκλεοτίδια (camp, cgmp) καθώς και από κινάσες που φωσφορυλιώνουν τη ριβοσωμική πρωτεΐνη S6. Το όνομα της ομάδας «AGC» προέρχεται από τις συντμήσεις των ονομάτων των μελών της PKA, PKG, PKC. Γενικά οι κινάσες αυτής της κατηγορίας φαίνεται να ευνοούνται από το βασικό περιβάλλον των υποστρωμάτων τους, φωσφορυλιώνοντας έτσι σερίνες ή θρεονίνες που βρίσκονται σε γειτονικές θέσεις με βασικά αμινοξέα όπως η λυσίνη και η αργινίνη. Κατά προτίμηση φωσφορυλιώνονται υποστρώματα που έχουν τη βασική τους περιοχή να βρίσκεται τοποθετημένη στη Ν-περιοχή σε σχέση με τη σερίνη ή τη θρεονίνη. Ειδικότερα η PKA φωσφορυλιώνει σερίνη ή θρεονίνη που βρίσκονται γειτονικά σε ζεύγη βασικών αμινοξέων όπως στην ακολουθία Arg-Arg-Xxx-Ser (54).

29 25 Οικογένεια CaMK Η οικογένεια αυτή κινασών προτιμά να φωσφορυλιώνει υποστρώματα με υψηλή περιεκτικότητα σε βασικά αμινοξέα κοντά στο δέκτη της φωσφορικής ομάδας και από αυτή τη σκοπιά είναι αξιοσημείωτο ότι βρίσκεται κοντά στο φυλογενετικό δέντρο με την οικογένεια AGC. Πολλά μέλη της ομάδας όπως η CaMKII προτιμούν τα βασικά αμινοξέα να βρίσκονται τοποθετημένα στη Ν-περιοχή σε σχέση με τη σερίνη ή θρεονίνη των υποστρωμάτων τους, ενώ άλλα μέλη όπως οι EF2K προτιμούν θέσεις φωσφορυλίωσης που περιβάλλονται και από τις δυο πλευρές με βασικά αμινοξέα. Τα μέλη της οικογένειας αυτής ενεργοποιούνται από την παρουσία καλμοδουλίνης και Ca2+ που δεσμεύονται σε μια μικρή περιοχή κοντά στο καρβοξυτελικό τους άκρο. Εξαίρεση αποτελεί μια μικρή υποομάδα κινασών που εντοπίζεται στα φυτά, με κύριο αντιπρόσωπο τη CDPK, που περιλαμβάνουν στο μόριο τους μια μικρή ακολουθία που ομοιάζει με την καλμοδουλίνη και δεν απαιτεί την παρουσία Ca2+ (53). Άλλα μέλη της οικογένειας αντιπροσωπεύονται από την Snf1/AMPK υποομάδα η οποία εκτός από την απαίτηση για την παρουσία μια μικρής βασικής περιοχής στο Ν-άκρο της θέσης φωσφορυλίωσης, απαιτεί και την ύπαρξη υδρόφοβων αμινοξέων στη γειτονική περιοχή (55, 56). Οικογένεια CMGC Η οικογένεια αυτή πρωτεϊνικών κινασών διαιρείται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες: την ομάδα των κινασών που η δράση τους εξαρτάται από τις κυκλίνες (CDK, Cyclin-Dependent protein Kinases), τις MAP κινάσες (Mitogen Activated Protein kinases), τις κινάσες της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK3), και τις κινάσες καζεΐνης 2 (CK2, Casein Kinase 2). Οι κινάσες της πρώτης κατηγορίας εξαρτώνται από την παρουσία στο μόριο τους της κυκλίνης ως βοηθητικής υπομονάδας. Η σύνθεση και αποικοδόμηση των κυκλινών αποτελούν το βασικό τρόπο ρύθμισης των κινασών αυτών. Ακόμη κύκλοι φωσφορυλίωσηςαποφωσφορυλίωσης παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση τους. Ως υποστρώματα τους προτιμούν σερίνες ή θρεονίνες οι οποίες ακολουθούνται από προλίνες στις αμέσως γειτονικές θέσεις. Τα μέλη της CDK οικογένειας παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ρυθμίζοντας τα σημεία ελέγχου από τη φάση G1 στην S και από τη φάση G2 στην M (57).

30 26 Οι ΜΑΡ κινάσες ευνοούνται και αυτές από την παρουσία γειτονικών προλινών στις θέσεις φωσφορυλίωσης των υποστρωμάτων τους και είναι σημαντικές γιατί παίζουν ρόλο στην ανταπόκριση των κυττάρων από διάφορους αυξητικούς παράγοντες. Η δραστικότητα τους επηρεάζεται από τη φωσφορυλίωση τους σε τυροσίνες από τις κινάσες των ΜΑΡ κινασών (ΜΕΚ) (53). Η απαίτηση για την οικογένεια των GSK3 κινασών πρωτεϊνών είναι πιο πολύπλοκη αλλά φαίνεται ότι η φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους ευνοείται όταν βρίσκονται ανάμεσα σε περιβάλλον πλούσιο σε προλίνες, καθώς και από την παρουσία κάποιου φωσφοαμινοξέως στην Ρ+4 θέση από το αμινοξύ που πρόκειται να φωσφορυλιώσουν οι ίδιες (53). Οι κινάσες καζεΐνης 2 φωσφορυλιώνουν σερίνες ή θρεονίνες που ακολουθούνται από όξινα αμινοξέα (γλουταμινικά ή ασπαραγινικά). Συνήθως είναι αρκετή η παρουσία ενός όξινου αμινοξέος στην Ρ+3 θέση (S/T-X-X-E/D) (58). Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός υποστρωμάτων τους που έχει αναγνωριστεί, αλλά δεν είναι έχει ακόμη διευκρινισθεί πλήρως ο ρόλος τους στις λειτουργίες του κυττάρου (περισσότερες λεπτομέρειες δίνονται παρακάτω). Οικογένεια ΡΤΚ (53) Η οικογένεια αυτή κινασών πρωτεϊνών περιλαμβάνει, τις κινάσες εκείνες που φωσφορυλιώνουν τα υποστρώματα τους μόνο σε τυροσίνες και οι χαρακτηριστικές περιοχές κινάσης είναι πολύ συντηρημένες κάνοντας έτσι το διαχωρισμό από τις κινάσες διπλής εξειδίκευσης. Τα μέλη της οικογένειας αυτής παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταφορά σημάτων ανάπτυξης και διαφοροποίησης. Στην οικογένεια αυτή συμπεριλαμβάνονται επίσης και μεμβρανικοί υποδοχείς οι οποίοι παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες στη δραστικότητα και τη δομή τους. Τα χαρακτηριστικά της εξειδίκευσης που παρουσιάζουν δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως, αν και η παρουσία γλουταμινικού οξέος στην Ν- ή C-περιοχή από τη θέση φωσφορυλίωσης συχνά είναι επιθυμητή. Λοιπές κινάσες πρωτεϊνών (53) Στην οικογένεια αυτή περιλαμβάνονται κινάσες που δεν μπορούν να συμπεριληφθούν σε καμία από τις παραπάνω κατηγορίες και είναι δύσκολο να περιγραφούν γενικά τα λειτουργικά τους ή δομικά τους γνωρίσματα.

31 27 Μέλη της οικογένειας περιλαμβάνουν τις κινάσες καζεΐνης I (CK1) οι οποίες κατά κανόνα φωσφορυλιώνουν θέσεις που βρίσκονται στην C-περιοχή φωσφοαμινοξέων αν και η παρουσία όξινων αμινοξέων στις ίδιες θέσεις μπορεί να είναι εξίσου αποτελεσματική. Επίσης γνωστά μέλη της οικογένειας αυτής αποτελούν οι κινάσες των ΜΑΡ κινασών (ΜΕΚ) που είναι κινάσες διπλής εξειδίκευσης και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταφορά μηνυμάτων στο κύτταρο. Τέλος γνωστά μέλη αποτελούν κινάσες που εμπλέκονται στον έλεγχο της μετάφρασης όπως οι HRI, PKR/Tik και GCN2 που προτιμούν να φωσφορυλιώνουν αμινοξέα που βρίσκονται σε βασικές περιοχές των υποστρωμάτων. A.3. ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ (SERIΝΕ/ARGININE PROTEIN KINASES, SRPKs) Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν μια νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώματα τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες, οι οποίες αποτελούν μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθμιση του ματίσματος του mrna, η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η ανάπτυξη βλαστικών κυττάρων, η μεταφορά πολυαμινών μέσα στα κύτταρα και η ομοιόσταση ιόντων (59). Α.3.1. Μέλη της οικογένειας-χαρακτηριστικά δομής Το πρώτο μέλος της οικογένειας το οποίο κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ήταν η ανθρώπινη μορφή της SRPK1, με βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τους παράγοντες ματίσματος που περιέχουν στο μόριο τους ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριμένων ακολουθιών παίζει καθοριστικό ρόλο στη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος του RNA (32, 33). Μέχρι σήμερα τουλάχιστον εννέα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αγρινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισμούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες μορφές των SRPK1 (accession No:U09564), SRPK1a (accession No:AJ318054), SRPK2 (accession No:U88666A) και στο ποντίκι οι μορφές των SRPK1 (accession No:AJ224115) και SRPK2 (accession No:AB006036). Στη ζύμη οι Sky1 (accession No:

32 28 S55098) (S. cerevisiae) και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το ομόλογο της SRPK1 (accession No:AF01149), στο νηματοειδές C. elegans η SPK-1 (accession No:AF241656), και στα φυτά το αντίστοιχο ομόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana). Οι πρωτεϊνικές κινάσες της οικογένειας αυτής στα θηλαστικά, έχουν το χαρακτηριστικό ότι παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομολογία στη πρωτοταγή τους δομή, στη δραστικότητα τους ως κινάσες, καθώς και στην εξειδίκευση τους ως προς τα υποστρώματα. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που παρουσιάζεται σ όλα τα μέλη της οικογένειας των κινασών στα θηλαστικά είναι ότι οι περιοχές του μορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από μία ασυνήθιστα μεγάλη αλληλουχία αμινοξέων, γεγονός πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισμένο σε κινάσες τυροσίνης (60). Η μεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αμινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, αλλά κυρίως στην υποκυτταρική τους κατανομή (αναλύεται στην παράγραφο Α.3.3.3). Ακόμη ένα κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι περιέχουν στο μόριο τους δύο πιθανά σήματα για την εντόπιση στον πυρήνα (NLS), ένα στην αμινοτελική περιοχή (11R-K-K-R-T-K-A-K-K-D-K21) και ένα στο κέντρο του μορίου (267Κ-Κ-Κ-Κ-L-K-K-K-Q-K-R277) (33). Οι διαφορές ανάμεσα στα μέλη της οικογένειας που βρίσκονται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε μορίου στην πρωτοταγή του δομή. Έτσι στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού ματίσματος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η μόνη διαφορά έγκειται στην ύπαρξη μιας εμβόλιμης ακολουθίας από 171 αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο του μορίου αμέσως μετά τα τέσσερα πρώτα αμινοξέα (59). Η εμβόλιμη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σημαντικό αριθμό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες με το μοτίβο L-X-X-L-L (148L-A-P-L-L152 και 158L-G-RL-L162) το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών με πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης με διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσμευσης της με την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγματος (nuclear matrix) SAF-B (59). Αποτέλεσμα της δέσμευσης αυτής είναι η εκλεκτική φωσφορυλίωση πέντε πρωτεϊνών με μοριακές μάζες 29, 36, 50, 80 και 190 kda που συν-ανοσοκατακριμνήζονται με την πρωτεΐνη SAF-B (59), γεγονός που μας οδηγεί στην υπόθεση ότι η πρόσθετη αλληλουχία των 171 αμινοξέων της SRPK1a οδηγεί στην «αγκυροβόληση» της κινάσης στο πυρηνικό πλέγμα και τη φωσφορυλίωση υποστρωμάτων που συνδέονται ή γειτονεύουν με αυτό.

33 29 Σχήμα Α.5. Νουκλεοτιδική και η αντίστοιχη αμινοξική ακολουθία της SRPK1a (59). Διακρίνεται υπογραμμισμένο το τμήμα που κωδικοποιείται από την εμβόλιμη ακολουθία των 513 bp, καθώς και σκιασμένες οι δύο δραστικές περιοχές κινάσης πρωτεϊνών. Μια μεγάλη ακολουθία αμινοξέων διαχωρίζει τις δύο αυτές περιοχές.

34 30 Σχήμα Α.6. Σχηματική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος της SRPK1a (59). (Α) Αναπαράσταση της δομής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τμήμα των 513 bp το οποίο δεν περιλαμβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a με την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τμήμα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος που βρίσκονται στα όρια μεταξύ των εξονίων 1a και 1b και του τμήματος των 513 bp.

35 31 Στην περίπτωση του μορίου της SRPK2 που αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε μικρές αλλαγές στην αμινοξική ακολουθία στην κεντρική και καρβοξυτελική τους περιοχή οι οποίες δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα και εξειδίκευση των δύο ενζύμων (πάνω από 90% ομολογία στις περιοχές κινάσης), ενώ αντίθετα το αμινοτελικό άκρο της SRPK2 περιέχει μία ακολουθία αμινοξέων πλούσια σε προλίνες. Το πλούσιο σε προλίνες αμινοτελικό άκρο της SRPK2 περιέχει την αμινοξική αλληλουχία P-P-L-P το οποίο και αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα πρωτεϊνών οι οποίες αλληλεπιδρούν με SH3- και WW-περιοχές άλλων πρωτεϊνών (60). Κατ αναλογία με την πρόσθετη αλληλουχία της SRPK1a, η διαφορετική αυτή περιοχή της SRPK2, μπορεί να παίζει το ρόλο ενός σήματος για την αλληλεπίδραση της, με συγκεκριμένα υποστρώματα ή άλλα ρυθμιστικά μόρια, σε σχέση με την SRPK1. Πρόσφατες κρυσταλλογραφικές μελέτες στην κινάση πρωτεϊνών Sky1p της ζύμης S. cerevisiae υπέδειξαν τρία δομικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητα που παρουσιάζουν τα μέλη της οικογένειας των SRPK. Για λόγους που ευνοούσαν την κρυστάλλωση του μορίου της Sky1p δημιουργήθηκε μια μεταλλαγμένη της μορφή από την οποία είχαν αφαιρεθεί μία μη διατηρημένη αλληλουχία 137 αμινοξέων στο αμινοτελικό της άκρο, καθώς και η περιοχή που παρεμβάλλεται μεταξύ των δραστικών περιοχών της κινάσης (61). Η μεταλλαγμένη αυτή μορφή παρέμενε ενεργή, παρουσιάζοντας παρόμοια δραστικότητα με τη φυσιολογική μορφή της κινάσης. Η συνολική δομή του μορίου ήταν παρόμοια με αυτή που παρουσιάζουν και άλλες κινάσες πρωτεϊνών έχοντας έναν μικρό λοβό ο οποίος αποτελείται κυρίως από β-ελάσματα και έναν μεγάλο λοβό αποτελούμενο κυρίως από α-έλικες. Στη φυσιολογική της μορφή η αλληλουχία που παρεμβάλλεται μεταξύ των περιοχών της κινάσης τοποθετείται μεταξύ των ελασμάτων β7 και β8. Τα χαρακτηριστικά τα οποία τη διαφοροποιούν από άλλες κινάσες πρωτεϊνών και είναι υπεύθυνα για τη δραστικότητα της είναι τα εξής. Η έλικα αc, η οποία σε ορισμένες κινάσες πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για τον έλεγχο της δράσης τους, στην περίπτωση της Sky1p περιλαμβάνει μία επιπλέον αλληλουχία αμινοξέων (αc ) η οποία επεκτείνει τη δομή της αc κατά μία περιστροφή. Η επιπλέον αυτή περιοχή σταθεροποιεί την αc, φέρνοντας την σε επαφή με την έλικα αε του μεγάλου λοβού (61). Η Tyr283 της αε έλικας παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομής αλληλεπιδρώντας μέσω δεσμών υδρογόνου με τα αμινοξέα Asn210 και Asp213 της έλικας αc. Ένα άλλο χαρακτηριστικό που διακρίνει τις κινάσες της οικογένειας

36 32 Σχήμα Α.7. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της Sky1p. (A) Η συνολική δομή του μορίου της Sky1p δείχνει ομοιότητα με άλλες πρωτεϊνικές κινάσες. Η Sky1p περιέχει στο μόριο της ένα μικρό λοβό ο οποίος αποτελείται κυρίως από β-ελάσματα και ένα μεγάλο ο οποίος αποτελείται από α-έλικες. (Β) Δομική αναπαράσταση του μορίου της Sky1p ανεστραμμένη κατά 40 μοίρες όπου παρουσιάζονται οι μη καταλυτικές περιοχές της κινάσης. αυτής σε σχέση με κινάσες πρωτεϊνών που ενεργοποιούνται από φωσφορυλίωση, είναι ότι οι SRPK δεν απαιτούν τη φωσφορυλίωση του βρόχου ενεργοποίησης προκειμένου να καταστούν δραστικές και ότι στη θέση ενός χαρακτηριστικού αμινοξέος Arg που προηγείται του καταλυτικού Asp διαθέτουν μία Thr. Προκειμένου τα μόρια των SRPK κινασών πρωτεϊνών να καταστούν ενεργά, αντί της φωσφορυλίωσης του βρόχου ενεργοποίησης, ευνοούν την αλληλεπίδραση του με περιοχές του μορίου εκτός της δραστικής περιοχής, οι οποίες σταθεροποιούν το βρόχο σε μία κατάσταση συνεχούς ενεργότητας. Το χαρακτηριστικό ότι οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωμάτων τους, επιβεβαιώνεται από την ύπαρξη μίας δομής στην περιοχή δέσμευσης του υποστρώματος η οποία αναγνωρίζει φωσφοσερίνες οι οποίες βρίσκονται σε P2 θέση από τη σερίνη που πρόκειται να φωσφορυλιωθεί. Έτσι η μετατόπιση της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην περιοχή αυτή και δέσμευση της γειτονικής σερίνης στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου, προκαλεί τη διαδοχική φωσφορυλίωση των σερινών του υποστρώματος. Το μοντέλο όμως αυτό δεν εξηγεί την φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώματος. Είναι πιθανό ότι in vivo το υπόστρωμα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από μία άλλη κινάση πρωτεϊνών και ακολούθως οι SRPK να το αναγνωρίζουν και να

37 33 φωσφορυλιώνουν και τις υπόλοιπες σερίνες, έχοντας έτσι μία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPK, αλλά με πολύ μικρότερη αποτελεσματικότητα. Όταν η αρχική αυτή φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιτευχθεί, η κινάση συνεχίζει τη φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιδεικνύοντας υψηλότερη δραστικότητα (61). A.3.2. Εξειδίκευση των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Όσον αφορά την εξειδίκευση των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης, αυτή εντοπίζεται στην ύπαρξη μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα μόρια των υποστρωμάτων τους, μεταφέροντας τη γ-φωσφορική ομάδα του ΑΤΡ στις σερίνες. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι κινάσες αυτές είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (62). Σε πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 με πρωτεΐνες που περιείχαν μόνο δύο επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση τους (62). Ακόμη έχει αναφερθεί ότι η αντικατάσταση της αργινίνης στα υποστρώματα από ένα άλλο βασικό αμινοξύ τη λυσίνη έχει ως αποτέλεσμα τη μη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων από την SRPK1 δείχνοντας έτσι ότι η ύπαρξη των αργινινών στις ακολουθίες διπεπτιδίων είναι απαραίτητη (60). Επίσης, έγιναν πειράματα χρησιμοποιώντας ως ένζυμο την ανοσοκατακρημνισμένη SRPK1 που είχε υπερεκφραστεί σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα 293Τ με το επίτοπο FLAG στο Ν-τελικό της άκρο και ως υποστρώματα, το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β που όπως ήδη αναφέρθηκε περιέχει την κατάλληλη περιοχή διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης τα οποία λειτουργούν ως στόχος φωσφορυλίωσης, καθώς και μεταλλάγματα του στα οποία είχαν εισαχθεί με σημειακές μεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν τη δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίμηση στην φωσφορυλίωση κάποιας σερίνης από την πλευρά της κινάσης. Επίσης in vitro πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 με διάφορους παράγοντες ματίσματος του mrna που προέρχονται από διαφορετικούς οργανισμούς, έδειξαν ότι οι κινάσες προτιμούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης, όταν οι ακολουθίες αυτές είναι τοποθετημένες ανάμεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αμινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (60).

38 34 Τέλος, όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των κινασών αυτών, οι μελέτες που έγιναν χρησιμοποιώντας ως πηγή δράσης την SRPK1 και ως υπόστρωμα τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 έδωσαν μια τιμή Κm 10 μμ για το ΑΤΡ, και μία πολύ μικρή τιμή Κm 0,07 μμ για τη φωσφορυλίωση του υποστρώματος, η οποία δείχνει την πολύ μεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώματα τους (32). Α.3.3. Εντόπιση των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Μελέτες που έγιναν για τον εντοπισμό των γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν τα μέλη της οικογένειας των SRPK στα χρωμοσώματα των οργανισμών του ανθρώπου και του ποντικού απεκάλυψαν τα εξής. Μετά από φθορισμομετρικό in situ υβριδισμό σε σωματικά κύτταρα βρέθηκε ότι το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται στον άνθρωπο τοποθετημένο στο χρωμόσωμα 6p21.2-p21.3, ενώ αντίστοιχα το γονίδιο της SRPK2 στο χρωμόσωμα 7q22-q31.1 (63). Οι περιοχές των γονιδίων που εντοπίστηκαν στα ανθρώπινα χρωμοσώματα αντιστοιχούν σε περιοχές στα χρωμοσώματα 17 και 5 του ποντικού. Πράγματι χαρτογράφηση του χρωμοσώματος του ποντικού χρησιμοποιώντας ιχνηλάτες της SRPK1 και της SRPK2 απεκάλυψαν ότι το γονίδιο της SRPK1 εντοπίζεται στα χρωμοσώματα 17 και Χ του ποντικού ενώ αυτό της SRPK2 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5. Το σήμα στο χρωμόσωμα Χ αντιστοιχεί πιθανότατα σε ένα ψευδογονίδιο της SRPK1. Επιπρόσθετα, στα ανθρώπινα χρωμοσώματα εντοπίστηκαν πολλαπλά σήματα σχετιζόμενα με τις SRPK, ένα από τα οποία φαίνεται να αντιστοιχεί σε ένα ψευδογονίδιο της SRPK2 στο χρωμόσωμα 8 (63). Η υποκυτταρική κατανομή των μελών της οικογένειας αυτής παρουσιάζει μια αινιγματική συμπεριφορά. Αν και όλα τα, μέχρι τώρα, γνωστά υποστρώματα τους είναι πυρηνικές πρωτεΐνες, οι SRPKs μετά από μελέτες ανοσοφθορισμού σε καθηλωμένα κύτταρα παρουσιάζουν μία κυρίαρχη κυτταροπλασματική εντόπιση, δίνοντας ταυτόχρονα ένα πολύ αδύνατο πυρηνικό σήμα (59, 60). Σε πειράματα που έγιναν σε ζωντανά κύτταρα χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP το αποτέλεσμα ήταν ανάλογο, αλλά αυτή τη φορά το πυρηνικό σήμα ήταν ξεκάθαρα ορατό (60). Σε μελέτες που ακολούθησαν χρησιμοποιώντας την κινάση πρωτεϊνών Dsk1 της ζύμης S. pompe, αυτές αποκάλυψαν ότι σε κύτταρα συγχρονισμένα στη μεσόφαση η κυτταροπλασματική εντόπιση της κινάσης ήταν κυρίαρχη. Αντίθετα σε κύτταρα λίγο πριν την είσοδο τους στη μίτωση, το σήμα ανοσοφθορισμού της κινάσης εμφανίζεται έντονα στον πυρήνα, υπονοώντας ότι η

39 35 διαφορετική κυτταρική εντόπιση των κινασών αυτών κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων του κυτταρικού κύκλου είναι σημαντική για τις λειτουργίες του κυττάρου (64). Παράλληλα στην περίπτωση της κινάσης πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Sky1p της ζύμης S. cerevisiae βρέθηκε ότι η μεγάλη ενδιάμεση ακολουθία που χωρίζει τις δραστικές περιοχές της κινάσης παίζει σημαντικό ρόλο ρυθμίζοντας την υποκυτταρική εντόπιση της. Χρησιμοποιώντας τόσο τη φυσιολογική, όσο και τη μορφή της κινάσης που της είχε αφαιρεθεί η εν λόγω ακολουθία βρέθηκε ότι στα κύτταρα που έφεραν τη φυσιολογική μορφή το κυτταροπλασματικό σήμα είναι έντονο σε αντίθεση με τη μεταλλαγμένη της μορφή η οποία εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρήνα. Έτσι φαίνεται ότι η παρουσία του ενδιάμεσου τμήματος στο μόριο των κινασών αυτών παίζει ρυθμιστικό ρόλο στην υποκυτταρική κατανομή τους. Μία υπόθεση είναι ότι το εμβόλιμο αυτό τμήμα παίζει το ρόλο μιας «κυτταροπλασματικής άγκυρας» για τις κινάσες σερίνης/αργινίνης (65). Με τον τρόπο αυτό μόνο ένα συγκεκριμένο κλάσμα από κάθε κινάση θα εισέρχεται στον πυρήνα, όπου θα παρουσιάζει δραστικότητα σε συγκεκριμένες περιοχές του (59, 65). Η κατανομή των μελών της οικογένειας αυτής κινασών πρωτεϊνών στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σημαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασης τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων τους, χρησιμοποιώντας υβριδισμό κατά Northern με ιχνηλάτες ραδιενεργά επισημασμένα τμήματα των γονιδίων τους, έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στους όρχεις, έχοντας μικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύμος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός μυς (62). Παρόμοια εικόνα έδειξε και η μελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όμως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασης της στους διάφορους ιστούς ήταν σημαντικά μικρότερα (59). Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα εκφραζόμενη σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, μέτρια στην καρδιά και το σκελετικό μυ, ενώ παρουσιάζει χαμηλά επίπεδα έκφρασης στον πνεύμονα, το ήπαρ και το νεφρό (60). Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών στους ιστούς των οργανισμών, συμβάλουν στη ρύθμιση των λειτουργιών τους κατά έναν εξειδικευμένο τρόπο στο επίπεδο του κάθε ιστού ξεχωριστά (tissue specific regulation).

40 36 A.3.4. Υποστρώματα των SRPKs-Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης Όπως έχει αναφερθεί όλα τα υποστρώματα της οικογένειας κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης περιέχουν στο μόριο τους τη χαρακτηριστική αλληλουχία επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών αργινίνης/σερίνης και τροποποιούνται από τις κινάσες με φωσφορυλίωση στις σερίνες. Παράγοντες ματίσματος του mrna (SR splicing factor) Τα πιο καλά μελετημένα υποστρώματα της οικογένειας των κινασών αυτών αποτελούν οι παράγοντες ματίσματος που περιέχουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (SR splicing factors), με πιό αντιπροσωπευτικό παράδειγμα τον ASF/SF2. Άλλα μέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ο SC35 και τέσσερα ακόμα πολυπεπτίδια με μοριακές μάζες 20, 40, 55 και 75 kda. Άλλες πρωτεΐνες που περιέχουν το χαρακτηριστικό μοτίβο των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιμοποιείται για τις έξι προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται με τις μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεϊνες (snrnps) όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο αμινοτελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης του RNA (RNA Recognition Motifs, RRMs), ενώ το καρβοξυτελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (66). Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με άλλους παράγοντες ματίσματος και εκτός από τη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος θεωρούνται σημαντικές και στην περίπτωση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος των mrnas ρυθμίζοντας την επιλογή της θέσης που θα γίνει το μάτισμα (66, 67). Η κλωνοποίηση και ο χαρακτηρισμός της SRPK1 έγινε το 1994 από το εργαστήριο του Dr. X-D. Fu (Division of Cellular and Molecular Medicine, University of California, California) με βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 σε πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης στα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (32, 33). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης αυτής αναφέρεται ότι είναι και η αποσύνδεση των παραγόντων ματίσματος από τις θέσεις αποθήκευσης τους στον πυρήνα (nuclear speckles), όπου βρίσκονται συγκεντρωμένοι σε μεγάλα ανενεργά σύμπλοκα. Έτσι έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική μορφή τους, είναι δυνατή η μεταφορά τους σε ενεργές περιοχές μεταγραφής στο νουκλεόπλασμα, όπου και συμμετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριμου mrna (33, 68, 69). Επίσης, η φωσφορυλίωση των

41 37 παραγόντων ματίσματος από την οικογένεια των SR κινασών πρωτεϊνών, επάγει τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύμπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας ματίσματος του mrna (33, 70). Σ αυτή την ικανότητα των κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συμπλόκου, συνηγορούν και δεδομένα τα οποία δείχνουν, ότι με μη φωσφορυλιωμένους παράγοντες ματίσματος ή με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύμπλοκο δεν συγκροτείται και το μάτισμα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (71). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιμη με προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος. Αφού όμως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συμπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος ώστε το σωματίδιο ματίσματος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία (71). Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι η παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, μετά τη συγκρότηση του συμπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του ματίσματος του mrna (71). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει τη λειτουργικότητα του συμπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι ένα ακόμη σημείο που καταδεικνύει τη σημασία της ρυθμιζόμενης δραστικότητας των SR κινασών πρωτεϊνών καθότι η δράση τους είναι απαραίτητη μόνο κατά τα αρχικά της στάδια του ματίσματος, ενώ για την ολοκλήρωση της διαδικασίας η δράση τους είναι ανεπιθύμητη καθώς οδηγεί σε αναστολή (60, 71-73).

42 38 Σχήμα Α.8. Σχηματική αναπαράσταση των δομικών περιοχών των SR παραγόντων ματίσματος. Διακρίνονται στο αμινοτελικό άκρο τους μία ή δύο περιοχές δέσμευσης με το RNA, στο καρβοξυτελικό τους άκρο οι περιοχές των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης, καθώς και σε ορισμένους από αυτούς μια περιοχή πλούσια σε γλυκίνη που συνδέει τις δύο περιοχές.

43 39 Σχήμα Α.9. Σχηματική αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των RS περιοχών των παραγόντων ματίσματος κατά τη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος. (a) Ο παράγοντας ASF/SF2 αναγνωρίζει τη θέση ματίσματος στο 5 άκρο και η αλληλεπίδραση της RS περιοχής του με την RS περιοχή της πρωτεΐνης U1 70K διευκολύνει τη δέσμευση του U1 snrnp στο 5 άκρο (b) Ένα δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ των RS περιοχών των παραγόντων ματίσματος συγκεντρώνει τα δομικά στοιχεία του συμπλόκου κατά τη διάρκεια της συγκρότησης του (c) Αλληλεπιδράσεις των παραγόντων ματίσματος με στοιχεία του 3 άκρου. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των RS περιοχών τους σταθεροποιούν τη δέσμευση τους στο mrna και προάγουν τη χρήση του 3 άκρου. Πρόσφατες αναφορές προσθέτουν ακόμη ένα ρόλο στη φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από τις κινάσες αυτές, όσον αφορά τη μεταφορά τους από το κυτταρόπλασμα, όπου συνθέτονται, στον πυρήνα. Με τον τρόπο αυτό η φωσφορυλίωση τους από το κυτταροπλασματικό κλάσμα των κινασών, βοηθά σημαντικά στη μετακίνηση τους

44 40 στον πυρήνα αλλά και την ενδοπυρηνική εντόπιση τους στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές του πυρήνα (69). Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειωθεί ότι στη ζύμη η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εμπλέκεται στη δέσμευση και μεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθμίζεται η είσοδος της πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p με τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (74). Σχήμα Α.10. Σχηματική αναπαράσταση της επίδρασης που έχει η φωσφορυλίωση στην κατανομή των SR παραγόντων ματίσματος. Διακρίνονται η μεταφορά τους στον πυρήνα από το κυτταρόπλασμα, η αποσύνδεση τους από τις περιοχές αποθήκευσης τους στον πυρήνα (nuclear speckles), καθώς και η συγκρότηση συμπλόκου. Η αποφωσφορυλίωση έχει ως αποτέλεσμα την καταλυτική δραστικότητα του συμπλόκου που οδηγεί στο μάτισμα του mrnα και την επαναφορά τους στις περιοχές αποθήκευσης. Πρωταμίνη P1 Ένα άλλο υπόστρωμα των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελεί η πρωταμίνη P1. Οι πρωταμίνες Ρ1 είναι πολύ βασικά, χαμηλού μοριακού βάρους πολυπεπτίδια με ισοηλεκτρικό σημείο μεγαλύτερο του 11 και τα μισά τους αμινοξέα αποτελούνται από αργινίνες. Είναι πρωτεΐνες πολύ συντηρημένες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και διαιρούνται σε δύο κατηγορίες αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες και συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα μαρσιποφόρα, και αυτές των θηλαστικών με πλακούντα που περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς που

45 41 σταθεροποιούν τη δομή τους (75, 76). Όμως και στις δύο κατηγορίες των Ρ1 πρωταμινών περιέχονται επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης τα οποία μπορούν να αποτελέσουν στόχο φωσφορυλίωσης από τις SRPKs (62). Ο ρόλος των πρωταμινών είναι η αντικατάσταση των ιστονών κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης με αποτέλεσμα να προκύπτει χρωματίνη με πολύ υψηλό βαθμό συμπύκνωσης (75). Κατά τα αρχικά στάδια της σπερματογένεσης οι πρωταμίνες φωσφορυλιώνονται στοιχειομετρικά, ενώ αργότερα στα ώριμα σπερματοζωάρια αποφωσφορυλιώνονται στο μεγαλύτερο μέρος τους (75, 77). Παλιότερα είχε προταθεί ότι ο ρόλος της φωσφορυλίωσης διευκολύνει τη σωστή σύνδεση των πρωταμινών με το DNA, ενώ η αποφωσφορυλίωση τους κατά τα τελικά στάδια της σπερματογένεσης οδηγεί πιθανότατα σε μία περαιτέρω συμπύκνωση της χρωματίνης (77). Στη συνέχεια διατυπώθηκε η άποψη ότι επειδή υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση πρωταμινών και άλλων βασικών πρωτεϊνών γύρω από το DNA, η φωσφορυλίωση σε συγκεκριμένες θέσεις στο μόριο των P1 πρωταμινών θα μειώνει τις δυνάμεις απώθησης μεταξύ γειτονικών θετικών φορτίων (62). Πρόσφατα όμως αποτελέσματα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της με τον πυρηνικό φάκελο (35). Δεδομένου δε ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες γίνεται στην πυρηνική περιφέρεια, η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης και η συνεπακόλουθη εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, μάλλον συνεισφέρει στη διαδικασία αντικατάστασης. Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR) Όπως έχει αναφερθεί και σε προηγούμενη παράγραφο (Α.1.3) ο υποδοχέας της λαμίνης Β περιέχει μία ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης στο αμινοτελικό του άκρο και συγκαθαρίζεται με μία δραστικότητα SR κινάσης πρωτεϊνών. Διεξοδικότερη ανάλυση της δραστικότητας αυτής κινάσης θα ακολουθήσει στα αποτελέσματα καθώς ο καθαρισμός και χαρακτηρισμός της αποτελούν έναν από σκοπούς της εργασίας αυτής. Α.3.5. Άλλοι ρόλοι της οικογένειας των κινασών σερίνης/αργινίνης Πρόσφατες αναφορές εμπλέκουν την κινάση πρωτεϊνών Sky1 της ζύμης S. cerevisiae στη ρύθμιση της μεταφοράς πολυαμινών στο κύτταρο καθώς και στην ομοιόσταση ιόντων (78). Μεταλλαγμένα κύτταρα ζύμης όπου έγινε ρήξη του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν

46 42 μεγάλη ανεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερμίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε με επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο που κωδικοποιεί την Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο μετά από επιμόλυνση τους, με ένα μεταλλαγμένο γονίδιο που εκφράζει μια μη λειτουργική μορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξημένη ευαισθησία στη σπερμίνη. H ρήξη του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύμης έδωσε επίσης μειωμένη πρόσληψη σπερμιδίνης και πουτρεσκίνης. Η ίδια μεταλλαγμένη μορφή των κυττάρων έδειξε ακόμα και μία μεγάλη ανεκτικότητα στα ιόντα λιθίου και νατρίου (78). Το μέλος της οικογένειας αυτής των κινασών, SPK-1, στο νηματοειδές C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων (79). Η SPK-1 δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνη CeSF2 in vitro (79). Επίσης δείχθηκε ότι η κινάση και το υπόστρωμα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηματοειδούς και παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια του εμβρυϊκού σταδίου σταδίου του C. elegans (79). A.3.6. Φωσφορυλίωση επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης από άλλες κινάσες πρωτεϊνών Α Φωσφορυλίωση των RS παραγόντων ματίσματος από την κινάση πρωτεϊνών CLK1 (CLK/STY) Η αναγνώριση της CLK1 ως κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την RS περιοχή των παραγόντων ματίσματος έγινε μετά από ανάλυση με το σύστημα των δύο υβριδίων. Χρησιμοποιώντας το γονίδιο της ως δόλωμα βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με πολλαπλές πρωτεΐνες, οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια των SR παραγόντων ματίσματος (80). Αξιοσημείωτο στη περίπτωση της πρωτεϊνικής αυτής κινάσης είναι το γεγονός ότι παρ ότι οι δραστικές περιοχές της έχουν τη γενική δομή των κινασών σερίνης/θρεονίνης, υπάρχουν αναφορές ότι η ίδια αυτοφωσφορυλιώνεται, in vitro, σε τυροσίνες, αν και για τη δράση της αυτή υπάρχουν αντικρουόμενες αναφορές (81-84). Ακόμα συγκρινόμενη με την κινάση πρωτεϊνών SRPK1 βρέθηκε ότι τα δύο μόρια παρουσιάζουν 32% ομολογία στις δραστικές περιοχές κινάσης, που περιλαμβάνουν ορισμένα αμινοξέα τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση των υποστρωμάτων (80). Ένα ακόμη ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της CLK1 είναι ότι αντίθετα με την SRPK1, αυτή περιέχει στο αμινοτελικό της άκρο μία μικρή επαναλαμβανόμενη ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης, παρόμοια

47 43 μ αυτή των παραγόντων ματίσματος του mrna (80). Η CLK1 κατατάσσεται στην ευρύτερη οικογένεια κινασών πρωτεϊνών LAMMER οι οποίες περιέχουν στο μόριο τους τη χαρακτηριστική ακολουθία «EHLAMMERILG», που εντοπίζεται στην καταλυτική τους υποπεριοχή Χ (85). Μετά από πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης διαφόρων υποστρωμάτων προκύπτουν 5 κριτήρια με βάση τα οποία οι κινάσες αυτής της κατηγορίας επιλέγουν τα υποστρώματα τους: (1) η φωσφορυλίωση γίνεται σε σερίνη και όχι θρεονίνη, (2) προτιμούν ένα βασικό αμινοξύ (κυρίως Arg) στην Ρ-3 θέση, (3) προτιμούν την ύπαρξη βασικού περιβάλλοντος γύρω από το RXXS μοτίβο, (4) προτιμούν την ύπαρξη αργινίνης ή υδρόφοβου αμινοξέος στη θέση Ρ+1, (5) προτιμούν πολικά (μη φορτισμένα) ή υδρόφοβα αμινοξέα στις θέσεις Ρ-1 και Ρ-2 (85). Όσον αφορά τη φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος έχει γίνει σύγκριση της ικανότητας φωσφορυλίωσης του ASF/SF2 από τις CLK1 και SRPK1 (86). Τα γενικά συμπεράσματα ήταν ότι και οι δύο κινάσες φωσφορυλιώνουν την RS ακολουθία του ASF/SF2 αν και η ειδική δραστικότητα της SRPK1 υπήρξε σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή της CLK1. Το γεγονός αυτό αποδίδεται στην ύπαρξη του RS μοτίβου στο μόριο της CLK1 και η πιθανή αλληλεπίδραση του με το αντίστοιχο του ASF/SF2 συμβάλλει στη δυσκολία αποσύζευξης της κινάσης μετά τη φωσφορυλίωση του ASF/SF2, κάτι που δεν συμβαίνει στην περίπτωση της SRPK1. Όπως ήδη αναφέρθηκε, η CLK1 επιδεικνύει ευρύτερη εξειδίκευση σε σχέση με την SRPK1, φωσφορυλιώνοντας τον ASF/SF2 και σε θέσεις εκτός της RS αλληλουχίας κάτι που δεν συμβαίνει στην περίπτωση της SRPK1. Ακόμα η CLK1 μπορεί και φωσφορυλιώνει σε κάποια έκταση πρωτεΐνες που δεν περιέχουν το τυπικό RS μοτίβο που απαιτεί η SRPK1 για να δράσει, όπως η ιστόνη Η1 και η ΜΒΡ. Τα γεγονότα αυτά δείχνουν ότι η CLK1 σε σχέση με την SRPK1, πρέπει να παίζει έναν ευρύτερο ρόλο στη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών, αναγνωρίζοντας και φωσφορυλιώνοντας πολλαπλά υποστρώματα στο κύτταρο, ενώ αντίθετα η SRPK1 παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση στην επιλογή των υποστρωμάτων της, απαιτώντας την ύπαρξη επαναλαμβανόμενων ακολουθιών αργινίνης/σερίνης (86). A Η DNA τοποϊσομεράση Ι των θηλαστικών φωσφορυλιώνει την RS περιοχή των παραγόντων ματίσματος Η DNA τοποϊσομεράση Ι είναι μία πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από 765 αμινοξέα με μία προβλεπόμενη μοριακή μάζα 91 kda. Η καταλυτική της

48 44 δραστικότητα στο DNA, έχει ως αποτέλεσμα τη χαλάρωση των υπερελικωμένων δομών του DNA. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι το ένζυμο αυτό έχει και ιδιότητες κινάσης, αναγνωρίζοντας υποστρώματα που περιέχουν επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης. Η ιδιότητα του αυτή έγινε γνωστή κατά την απομόνωση δράσης κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στους RS παράγοντες ματίσματος από πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων HeLa (87). Έτσι παρατηρήθηκε ότι η εκλουόμενη δράση κινάσης πρωτεϊνών συνέπιπτε με μία δράση χαλάρωσης υπερελικωμένου DNA σε πειράματα δραστικότητας κατάλληλα σχεδιασμένα για την τοποϊσομεράση Ι. Επίσης η εκλουόμενη δραστικότητα φωσφορυλιώνει εκλεκτικά τους RS παράγοντες ματίσματος σε σχέση με άλλα υποστρώματα που δοκιμάστηκαν (ιστόνη Η1, καζεΐνη). Αν και το μόριο της τοποϊσομεράσης Ι δεν περιέχει χαρακτηριστικές περιοχές δέσμευσης του ATP, πειράματα έδειξαν ότι ορισμένα από τα 13 μόρια τρυπτοφάνης που περιέχει η τοποϊσομεράση Ι, πρέπει να είναι υπεύθυνα για τη δέσμευση του ATP με μία σταθερά Kd=50 nm (87). Πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας μεταλλαγμένες μορφές της τοποϊσομεράσης Ι από τις οποίες έλειπαν ορισμένα τμήματα από το μόριο της καθώς και μεταλλάγματα του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 έδειξαν τα ακόλουθα: (1) η επαναλαμβανόμενη ακολουθία αργινίνης/σερίνης του ASF/SF2 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με την τοποϊσομεράση Ι και τη φωσφορυλίωση του, (2) η ύπαρξη τουλάχιστον 5 τουλάχιστον επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης είναι κρίσιμη για την ικανή φωσφορυλίωση του υποστρώματος, (3) η περιοχή με την οποία η τοποϊσομεράση Ι δεσμεύεται στο υπόστρωμα της βρίσκεται στην αμινοτελική της περιοχή, ενώ η αλληλεπίδραση φαίνεται να μην είναι μόνο ηλεκτροστατικής φύσης (88) και (4) η καρβοξυτελική περιοχή που είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση της τοποϊσομεράσης Ι στο DNA είναι υπεύθυνη και για τη δέσμευση του ΑΤΡ και τη δραστικότητα της ως κινάση. Έτσι γίνεται απαραίτητη η αναδίπλωση των δύο περιοχών της τοποϊσομεράσης Ι σε γειτονικές θέσεις στην τρισδιάστατη δομή του μορίου της. Ακόμη η Tyr723 που είναι αναγκαία για τη δέσμευση της στο DNA, αν και βρίσκεται σε γειτονικές θέσεις με την περιοχή δέσμευσης του ΑΤΡ δεν παίζει ρόλο στη δραστικότητα της ως κινάση (89). Η δέσμευση του DNA στην περιοχή αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών κατά 3 φορές και η επίδραση αυτή του DNA ενισχύεται όταν συνυπάρχει το αλκαλοειδές camptothecin. Κατά τον τρόπο αυτό φαίνεται να υπάρχει συναγωνισμός για τη δέσμευση των υποστρωμάτων στην τοποϊσομεράση Ι και την καταλυτική της δραστικότητα (87, 89).

49 45 A.4. ΚΙΝΑΣΕΣ ΚΑΖΕΪΝΗΣ ΤΥΠΟΥ 2 (CK2) Η κινάση πρωτεϊνών CK2 αναφέρθηκε αρχικά από τους Burnett και Kennedy το 1954 σε εκχυλίσματα από ήπαρ, και από τότε η κινάση καζεΐνης 2 εντοπίστηκε σε πολλούς οργανισμούς από τις ζύμες ως τον άνθρωπο (90). Η κινάση καζεΐνης 2 είναι μία κινάση πρωτεϊνών σερίνης/θρεονίνης, που παρουσιάζει υψηλή συντήρηση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και εντοπίζεται σε πολλές περιοχές του κυττάρου. Μπορεί να χρησιμοποιεί το ίδιο καλά με το ATP και το GTP ως δότη φωσφορικών για τη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων της. Η ετεροτετραμερής δομή της αποτελείται από 2 καταλυτικές α- ή α -υπομονάδες και δύο ρυθμιστικές β-υπομονάδες. Μέχρι σήμερα έχουν γίνει γνωστά πάνω από 160 υποστρώματα της CK2 τα οποία εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής, στη μεταφορά μηνύματος, στον έλεγχο της ανάπτυξης και τη δημιουργία του κυτταρικού σχήματος και αρχιτεκτονικής. Τελευταία υπάρχουν αρκετές αναφορές για αλληλεπίδραση των ανεξάρτητων υπομονάδων της CK2 με άλλες πρωτεΐνες χωρίς τη συμμετοχή του ολοενζύμου (91). Αν και μέχρι σήμερα δεν έχει αποδοθεί στην κινάση καζεΐνης 2 κάποιος κεντρικός ρυθμιστικός ρόλος στις λειτουργίες του κυττάρου, η συνεχής παρουσία της κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και τα πολλαπλά υποστρώματα της, υποδεικνύουν ότι η κινάση καζεΐνης 2 παίζει σημαντικό ρόλο στους ζωντανούς οργανισμούς. A.4.1. Δομή της κινάσης καζεΐνης 2 Η ετεροτετραμερής δομή του ολοενζύμου που αποτελείται από τις α-, α - και βυπομονάδες μπορεί να λάβει τις εξής μορφές: α2β2, αα β και α2 β. Η κλωνοποίηση των υπομονάδων της CK2 (92, 93) και η ανάλυση της αμινοξικής τους ακολουθίας (94, 95) έδειξε ότι η κεντρική περιοχή των α- και α - υπομονάδων αποτελεί τη δραστική περιοχή της κινάσης, ενώ οι δύο αυτές καταλυτικές υπομονάδες παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες μεταξύ τους. Η α-υπομονάδα αποτελείται από 391 αμινοξέα παρουσιάζοντας μια μοριακή μάζα 42 kda, ενώ η α -υπομονάδα αποτελείται από 350 αμινοξέα με μοριακή μάζα 40 kda. Οι αμινοτελικές περιοχές των δύο αυτών υπομονάδων παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα, ενώ οι καρβοξυτελικές περιοχές τους διαφέρουν σημαντικά. Οι δύο καταλυτικές υπομονάδες παρουσιάζουν υψηλότατη συντήρηση κατά την εξέλιξη, έχοντας στην περίπτωση της α-υπομονάδας 99% ομολογία στην αμινοξική ακολουθία μεταξύ των θηλαστικών, ενώ μεταξύ ανθρώπου και πτηνών υπάρχει 98% ομολογία (93, 96). Στην α -υπομονάδα παρουσιάζεται 97% ομολογία μεταξύ των δύο ειδών.

50 46 Οι ιδιότητες που αποδίδονται στις δύο αυτές υπομονάδες είναι η χρήση του ΑΤΡ και του GTP ως δότες φωσφορικών και η ρύθμιση τους από πολυανιόντα καθώς και από τη β-υπομονάδα. Η αμινοξική ανάλυση της β-υπομονάδας έδειξε ότι αποτελείται από 215 αμινοξέα παρουσιάζοντας μοριακή μάζα 25 kda. Η σύγκριση της αλληλουχίας της έδειξε ότι δεν παρουσιάζει καμία ομοιότητα με γνωστές καταλυτικές ή ρυθμιστικές περιοχές κινασών πρωτεϊνών. Όπως και οι καταλυτικές υπομονάδες της CK2, έτσι και η β- παρουσιάζεται συντηρημένη κατά την εξέλιξη. Μεταξύ των β-υπομονάδων του ανθρώπου, του ποντικού και του κοτόπουλου (96-98), υπάρχει απόλυτη ομολογία στην αμινοξική ακολουθία, ενώ σε σχέση με τη β-υπομονάδα του X. laevis υπάρχει διαφορά μόνο σε ένα αμινοξύ. Ποια είναι η λειτουργική σημασία της συμμετοχής της β-υπομονάδας στο ολοένζυμο δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως, αν και της αποδίδονται οι ιδιότητες της σταθεροποίησης του ενζύμου, της ρύθμισης της ενζυμικής δραστικότητας, της εξειδίκευσης όσον αφορά ορισμένα υποστρώματα που φωσφορυλιώνονται, της ενεργοποίησης από πολυκατιόντα και της στόχευσης στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (99-101). Επίσης έχει παρατηρηθεί τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo πειράματα ότι υφίσταται δράση αυτοφωσφορυλίωσης, χωρίς να υπάρχουν ενδείξεις για το ρόλο της φωσφορυλίωσης αυτής στη λειτουργικότητα του ενζύμου (102). Σε πειράματα που διεξήχθησαν για τη μελέτη της ιδιότητας αυτής έδειξαν ότι όταν υπήρχε μετάλλαξη στην περιοχή της αυτοφωσφορυλίωσης, η μεταλλαγμένη μορφή της βυπομονάδας διατηρούσε την ικανότητα δέσμευσης με τις καταλυτικές υπομονάδες του ενζύμου και τη ρύθμιση της δραστικότητας τους (103). Άλλες ιδιότητες της β-υπομονάδας είναι, ότι συνθέτεται σε περίσσεια ως προς την α-υπομονάδα και ο ρυθμός ενσωμάτωσης της στο ολοένζυμο είναι σημαντικά μικρότερος σε σχέση με την α-υπομονάδα η οποία ενσωματώνεται ταχύτατα. Επίσης οι α- και β-υπομονάδες που συμμετέχουν στη δομή του ενζύμου παρουσιάζουν αυξημένη περίοδο ημιζωής σε σχέση με τις ελεύθερες β-υπομονάδες οι οποίες αποσυνθέτονται με πιο γρήγορους ρυθμούς (104). Πρόσφατα, μελετήθηκε η κρυσταλλική δομή της ανθρώπινης μορφής της CK2 η οποία περιείχε τις δύο καταλυτικές υπομονάδες που τους έλειπε ένα τμήμα από την καρβοξυτελική τους περιοχή, καθώς και τις δύο ρυθμιστικές υπομονάδες. Το σχηματιζόμενο σύμπλοκο έδειξε ότι οι δύο ρυθμιστικές υπομονάδες σχηματίζουν ένα σταθερό διμερές το οποίο συνδέει τις δύο καταλυτικές υπομονάδες οι οποίες δεν έρχονται σε άμεση επαφή μεταξύ τους. Η κάθε καταλυτική υπομονάδα αλληλεπιδρά και με τις δύο ρυθμιστικές υπομονάδες, κυρίως μέσω μίας εκτεταμένης καρβοξυτελικής «ουράς» της κάθε βυπομονάδας (105). Μια άλλη κρυσταλλογραφική μελέτη που επικεντρώνεται περισσότερο

51 47 στη δομή του διμερούς το οποίο σχηματίζεται από τη β-υπομονάδα, αναφέρει ότι ο διμερισμός επάγεται από έναν δάκτυλο ψευδαργύρου που υπάρχει σε κάθε μονομερές. Το κάθε μονομερές αποτελείται από δύο περιοχές μία α-έλικα και το δάκτυλο ψευδαργύρου. Στο κάθε άκρο του διμερούς υπάρχει από μία πολύ όξινη περιοχή, η οποία πρέπει να είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση των πολυαμινών (106). Επίσης υπάρχει συμφωνία μεταξύ των αναφορών αυτών σχετικά με μία εκτεταμένη αλληλουχία αμινοξέων μέσω της οποίας γίνεται η αλληλεπίδραση με τις καταλυτικές υπομονάδες. Σύμφωνα με τα παραπάνω η παρατηρηθείσα δομή είναι σε συμφωνία με τη συνεχή δραστικότητα που παρουσιάζει το ένζυμο, καθώς και με το ρόλο που παίζει η β-υπομονάδα ως πρωτεΐνη ελλιμενισμού διαφόρων κινασών πρωτεϊνών. Σχήμα Α.11. Αναπαράσταση του ολοενζύμου που συγκροτείται από τις α/α, β-υπομονάδες της CK2 και οι ρόλοι που αποδίδονται σε κάθε υπομονάδα.

52 48 Σχήμα Α.12. Αναπαράσταση των σημαντικότερων δεσμών κατά τη δημιουργία του διμερούς από δύο βυπομονάδες. Το διμερές σχηματίζεται κυρίως μέσω υδρόφοβων δεσμών καθώς το 65% των αμινοξέων της περιοχής είναι μη πολικά. Οι πιό σημαντικοί είναι οι υδρόφοβοι δεσμοί που δημιουργούνται από τα αμινοξέα Pro110, Tyr144, Lys147 του ενός μονομερούς με τα αντίστοιχα του άλλου. Μόρια νερού παρεμβάλλονται μεταξύ των ΟΗ της Τyr144 καθώς και μεταξύ του Asp142 του ενός και της Tyr113 του άλλου μονομερούς.

53 49 Σχήμα Α.13. (Α) Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του διμερούς που σχηματίζει η β-υπομονάδα. Με κόκκινο χρώμα αναπαρίστανται τα β-ελάσματα και με πράσινο οι α-έλικες. Με καφέ συνεχόμενη γραμμή οι βρόχοι και με διακεκομμένη η όξινη περιοχή της β-υπομονάδας. Τα άτομα του ψευδαργύρου αναπαρίστανται σαν γαλάζιες σφαίρες. (Β) Αναπαράσταση του δακτύλου ψευδαργύρου που σχηματίζει η β-υπομονάδα της CK2 σε σύγκριση με τον αντίστοιχο του TFIIS.

54 50 Α.4.2. Εξειδίκευση του ενζύμου. Μετά από μελέτες που έγιναν για την εύρεση της εξειδίκευσης της κινάσης καζεΐνης 2 σε διάφορα υποστρώματα καθώς και συνθετικά πεπτίδια βρέθηκε ότι η ακολουθία που αναγνωρίζει ως υπόστρωμα το ένζυμο είναι S/T-X-X-όξινο αμινοξύ (107). Πίνακας Α.1: Ορισμένα υποστρώματα της CK2 και θέσεις φωσφορυλίωσης. Hsp 90a EVSDDEAEEK Πρωτεΐνη πυρηνίσκου Β23 ElF-1β Τοποϊσομεράση II VGSDEEEEK AESEDEDEED FGSDEEDEEA ESDDDDIEIDEDDDDD FSDEEED Χρωμοσωμική πρωτεΐνη D1 ASGDEVDEFD DSENEDDQDEDDD ESNGDGE NSDGENDAND Το ρόλο του όξινου αμινοξέος μπορούν να τον παίξουν, εκτός από το ασπαραγινικό και γλουταμινικό οξύ, φωσφορυλιωμένη σερίνη ή τυροσίνη. Αν και η παρουσία του όξινου αμινοξέος στην +3 θέση αποτελεί τον πιο σημαντικό παράγοντα της εξειδίκευσης, πρόσθετα όξινα αμινοξέα στις θέσεις από 2 έως +7, και ίσως σε μεγαλύτερη απόσταση, επιδρούν επίσης ως θετικοί παράγοντες για την εξειδίκευση του ενζύμου. Η παρουσία στις θέσεις αυτές βασικών αμινοξέων, προλίνης στη θέση +1, καθώς και δύο υδρόφοβων αμινοξέων στις θέσεις +1 και +2, επιδρά αρνητικά στη φωσφορυλίωση του υποστρώματος (108). Γενικά θα πρέπει να σημειωθεί ότι η όξινη περιοχή που επιδρά θετικά στην εξειδίκευση του ενζύμου βρίσκεται συνήθως προς την καρβοξυτελική περιοχή ως προς τη θέση φωσφορυλίωσης. Σε ορισμένες περιπτώσεις τα τοπικά αυτά χαρακτηριστικά δεν είναι δυνατόν από μόνα τους να αποτελέσουν παράγοντες για την ικανότητα φωσφορυλίωσης του υποστρώματος, αλλά αυτή εξαρτάται επίσης και από τη συνολική δομή της πρωτεΐνης όπως φαίνεται στις περιπτώσεις της φωσφορυλίωσης της β-υπομονάδας της CK2 και της πρωτεΐνης p53 (107).

55 51 Α.4.3. Κινητικά χαρακτηριστικά της CK2 Το χαρακτηριστικό των κινασών καζεΐνης 2 είναι ότι μπορούν να χρησιμοποιήσουν ως δότη φωσφορικών εκτός του ATP και το GTP. Οι τιμές Km για το ATP κυμαίνονται μεταξύ 5-30 μμ, ενώ για το GTP βρίσκονται στην περιοχή μμ. Οι τιμές αυτές για το GTP είναι από τις μικρότερες για κινάσες πρωτεϊνών. Η περιοχή του ph που οι κινάσες καζεΐνης 2 παρουσιάζουν βέλτιστη δράση είναι κυμαίνεται από 7 έως 9, ενώ τα ισοηλεκτρικά τους σημεία από 5,2 έως 8,8. Τα ένζυμα αυτά απαιτούν για τη δράση τους 5-15 mμ Mg+2. Το Mg+2 μπορεί να αντικατασταθεί από το Μn+2 και το Co+2 στην απαίτηση του ενζύμου για μέταλλο προκειμένου να δράσει καταλυτικά. Σε CK2 η οποία απομονώθηκε από ωοκύτταρα του X. laevis οι βέλτιστες συγκεντρώσεις για το Mg+2 ήταν 7-10 mμ, για το Mn+2 0,5-0,7 mm και για το Co mm. Επίσης παρατηρήθηκε ότι όταν το μέταλλο ήταν Mn+2 ή Co+2 το ένζυμο χρησιμοποιούσε πιο αποτελεσματικά το GTP σε σχέση με το ATP. Το αντίθετο συμβαίνει αν χρησιμοποιηθεί Mg+2 στη θέση των δύο αυτών μετάλλων. Τα ιόντα αυτά παρουσιάζουν μια βέλτιστη συγκέντρωση που αν ξεπεραστεί το ένζυμο καθίσταται ανενεργό. Τα παραπάνω αφορούν πειράματα που έγινα χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την καζεΐνη. Όταν χρησιμοποιήθηκε το συνθετικό πεπτίδιο RRREEETEEE ως υπόστρωμα, το Mn+2 και το Co+2 απέδιδαν το 25% της μέγιστης δραστικότητας που παρουσίαζε το ένζυμο με χρήση του Mg+2, ενώ και η παραμικρή αύξηση στη συγκέντρωση τους καθιστούσε το ένζυμο ανενεργό (109111). Όπως αναφέρθηκε, τα πολυανιόντα ή πολυκατιόντα ρυθμίζουν τη δραστικότητα των κινασών καζεΐνης τύπου 2. Πολυανιόντα όπως η ηπαρίνη αναστέλλουν τη δράση της CK2 και η ανασταλτική αυτή ικανότητα φαίνεται να εντοπίζεται στην αλληλεπίδραση τους πάνω στην α-υπομονάδα του ενζύμου (112). Πολυκατιόντα όπως η σπερμίνη ενεργοποιούν μετρίως τη δραστικότητα της κινάσης, ενώ μεγαλύτερα μόρια όπως η πρωταμίνη και η πολυλυσίνη αυξάνουν δραματικά τη δράση της. Η ρύθμιση της δράσης από τα πολυκατιόντα γίνεται μέσω της β-υπομονάδας του ενζύμου, η οποία στην περίπτωση αυτή έχει καθοριστική συμβολή στη ρύθμιση της δραστικότητας του ολοενζύμου (112).

56 52 Α.4.4. Κατανομή της κινάσης καζεΐνης 2 στους ιστούς Η CK2 εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ιστούς των ανώτερων οργανισμών, ενώ διαφορές παρουσιάζει η κατανομή των καταλυτικών υπομονάδων της (α,α ) στους διάφορους ιστούς. Η μελέτη της κατανομής της στους διάφορους ιστούς έγινε σε τρία επίπεδα: (α) στο επίπεδο του mrna, είτε με ανάλυση κατά Northern, είτε με in situ υβριδισμό, (β) στο επίπεδο της πρωτεΐνης με ανοσοαποτύπωση ή ανοσοιστοχημικές μελέτες, (γ) στο επίπεδο της δράσης με πειράματα ελέγχου ενζυμικής δραστικότητας (113). Στα έμβρυα του ποντικού, μετά από in situ υβριδισμό και ανοσοϊστοχημική ανάλυση, μελετήθηκε η κατανομή των α- και β-υπομονάδων της CK2 στους διάφορους ιστούς. Σε επίπεδο mrna εντοπίστηκε η ύπαρξη της CK2 σχεδόν σε όλους τους ιστούς του εμβρύου, η οποία βρισκόταν γενικότερα σε συμφωνία με τα επίπεδα της πρωτεΐνης που εντοπίστηκε. Μόνο στο δέρμα παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα του mrna ήταν πολύ υψηλότερα από την εκφραζόμενη πρωτεΐνη (114). Στην ίδια μελέτη αναφέρεται ότι τα επίπεδα της CK2 ήταν αυξημένα σε κύτταρα του νευρικού συστήματος, συμφωνώντας έτσι με μελέτες που δείχνουν μία μεγάλη συγκέντρωση της CK2 στον εγκέφαλο του αρουραίου σε σχέση με τους υπόλοιπους ιστούς (114, 115). Αναλύοντας την ενζυμική δραστικότητα της CK2 που εντοπίζεται στους πυρήνες των κυττάρων των διαφόρων ιστών, βρέθηκε ότι η υψηλότερη δραστικότητα εντοπίζεται στους όρχεις, στον εγκέφαλο και το ήπαρ. Χαμηλά επίπεδα δραστικότητας εντοπίστηκαν στο νεφρό και τη σπλήνα (116). Σε κυτταροπλασματικά κλάσματα διαφόρων ιστών βρέθηκε ότι υπάρχει υψηλή δραστικότητα στον πνεύμονα, τη σπλήνα, τους όρχεις και το θύμο αδένα, ενώ χαμηλότερη στο σκελετικό μυ, τον καρδιακό μυ και τον επινεφριδιακό αδένα (116). Όσον αφορά την έκφραση των υπομονάδων της κινάσης καζεΐνης 2 σε κάθε ιστό χωριστά, έγινε γνωστό με ανοσοαποτύπωση, ότι η α-υπομονάδα εντοπίζεται εντονότερα στον εγκέφαλο και τους όρχεις, με μέτρια επίπεδα στη σπλήνα, το ήπαρ και τον πνεύμονα, ενώ χαμηλά ήταν τα επίπεδα της στην καρδιά και το νεφρό. Η α -υπομονάδα εκφράζεται μόνο στους όρχεις και την καρδιά, ενώ η β-υπομονάδα εντοπίζεται σε υψηλά επίπεδα στους όρχεις, το σπέρμα και τον εγκέφαλο (91). Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα των διαφορετικών επιπέδων έκφρασης της κάθε υπομονάδας γίνεται φανερό κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Στα αρχικά στάδια της σπερματογένεσης η α-υπομονάδα εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα, ενώ αρχίζει να μειώνεται μετά τη μείωση, στις σφαιρικές σπερματίδες (round spermatids), και εξαφανίζεται κατά τα

57 53 στάδια της επιμήκυνσης τους. Η α -υπομονάδα ακολουθεί την ακριβώς αντίθετη πορεία με τα επίπεδα έκφρασης της να είναι τα υψηλότερα κατά τα τελικά στάδια της διαφοροποίησης. Η β-υπομονάδα βρίσκεται σε αφθονία σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησης (118). Α.4.5. Υποκυτταρική κατανομή της CK2 Αρχικές αναφορές σχετικά με τον εντοπισμό της CK2 μέσα στο κύτταρο έδειχναν την παρουσία της στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα. Όμως πρόσφατα υπάρχουν στοιχεία για την παρουσία της σχεδόν σε όλα τα σημεία του κυττάρου. Κυτταροπλασματική μεμβράνη Έχει αναφερθεί η απομόνωση του ενζύμου από υψηλής καθαρότητας κυτταροπλασματικές μεμβράνες ήπατος αρουραίου καθώς και ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων ( ). Σύμφωνα με τις αναφορές αυτές η CK2 βρίσκεται συνδεδεμένη στη μεμβράνη με τη μορφή ολιγομερών και ότι ο εντοπισμός της στη μεμβράνη εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης του οργανισμού. Τα επίπεδα της CK2 στη μεμβράνη είναι εξαιρετικά χαμηλά πριν τη γέννηση, ενώ αυξάνονται μέσα στην πρώτη εβδομάδα ανάπτυξης. Σημαντικό ρόλο στην εντόπιση της κινάσης καζεΐνης 2 στην κυτταροπλασματική μεμβράνη παίζει η βυπομονάδα της, ενώ υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι η περιοχή της που είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση της στη μεμβράνη είναι η ίδια που δεσμεύονται οι πολυαμίνες κατά τη ρύθμιση της (121). Με βάση τα υποστρώματα της φαίνεται ότι η CK2 σχετίζεται τόσο με ενδοκυτταρικούς, όσο και εξωκυτταρικούς στόχους (βλέπε υποστρώματα κυτταροπλασματικής μεμβράνης). Κυτταρόπλασμα Υπάρχουν πολλές αναφορές σχετικά με την εντόπιση ενζυμικής δράσης κινάσης καζεΐνης 2 σε κυτταροπλασματικά κλάσματα ( ). Πειράματα ανοσοφθορισμού σε κύτταρα HeLa έδειξαν ότι οι α- και β-υπομονάδες της CK2 βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της μεσόφασης και κατανέμονται σ όλο το κύτταρο κατά τη μίτωση. Η α υπομονάδα βρίσκεται στον πυρήνα κατά την G1-φάση, ενώ έχει κυτταροπλασματική εντόπιση κατά την S-φάση (125). Σε νευρικά κύτταρα ΝΙΑ-103 αναφέρθηκε ότι τα κυτταροπλασματικά επίπεδα της CK2 είναι ανεβασμένα σε συνθήκες έλλειψης θρεπτικών

58 54 συστατικών (126). Τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι η κατανομή της κινάσης μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα εξαρτάται από συγκεκριμένες συνθήκες στις οποίες βρίσκεται το κύτταρο καθώς και από το είδος των κυττάρων και ότι ο εντοπισμός της στη μία ή την άλλη περιοχή είναι μια δυναμική διαδικασία. Μιτοχόνδρια Μία δραστικότητα κινάσης καζεΐνης 2 απομονώθηκε από μιτοχόνδρια νεφρού. Η δραστικότητα αυτή χαρακτηρίστηκε ως CK2 με βάση τη δυνατότητα της να φωσφορυλιώνει το συνθετικό πεπτίδιο RRREEETEEE (127). H μιτοχονδριακή CK2 εντοπίζεται στο χώρο μεταξύ των δύο μιτοχονδριακών μεμβρανών, ενώ μετατόπιση της προς την εσωτερική μεμβράνη παρατηρείται παρουσία σπερμίνης. Ο πιθανότερος λόγος γι αυτή τη μετατόπιση είναι η φωσφορυλίωση υποστρωμάτων στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων (128). Ενδοπλασματικό δίκτυο Η συσχέτιση της CK2 με το ενδοπλασματικό δίκτυο έγινε με βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει in vitro τις πρωτεΐνες του ενδοπλασματικού δικτύου καλνεξίνη και SRSα (Signal Sequence Receptor-α) (129). Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι το κυτταροπλασματικό τμήμα της καλνεξίνης φωσφορυλιώνεται in vivo σε θέσεις που έχουν το μοτίβο φωσφορυλίωσης από CK2 (130). Πυρήνας Όπως στην περίπτωση της κυτταροπλασματικής εντόπισης της CK2 έτσι και στην περίπτωση της κατανομής της στον πυρήνα οι αναφορές που υπάρχουν είναι αντιφατικές μεταξύ τους, αν και έχουν αναφερθεί πολλές πρωτεΐνες του πυρήνα που αποτελούν υποστρώματα της κινάσης καζεΐνης 2. Τα πυρηνικά υποστρώματα της CK2 είναι παράγοντες μεταγραφής, πρωτοογκογονίδια, πρωτεΐνες καταστολής όγκων καθώς και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην σύνθεση των νουκλεϊνικών οξέων,. Έτσι υπάρχουν αναφορές που δείχνουν ότι η CK2 εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα. Άλλες αναφορές δείχνουν ότι το ένζυμο μεταφέρεται στον πυρήνα όταν το κύτταρο εισέρχεται στον κυτταρικό κύκλο. Ενώ υπάρχουν και αναφορές όπου η υποκυτταρική εντόπιση του ολοενζύμου και των υπομονάδων του, ως ξεχωριστές οντότητες, αλλάζουν ανάλογα με το είδος των κυττάρων που χρησιμοποιούνται ή

59 55 τα στάδια του κυτταρικού κύκλου (131, 132). Από τις αναφορές αυτές φαίνεται ότι υπάρχει μια δυναμική μετακίνηση της CK2 μεταξύ των διαφόρων διαμερισμάτων του κυττάρου η οποία εξαρτάται από το στάδιο που βρίσκεται κάθε στιγμή το κύτταρο. Στις α- και α -υπομονάδες της κινάσης καζεΐνης 2 εντοπίστηκε ένα σήμα εντοπισμού τους στον πυρήνα στην περιοχή KVKKKKIKR79 το οποίο και θεωρείται 71 υπεύθυνο για την είσοδο τους στον πυρήνα (132). Η β-υπομονάδα δεν διαθέτει ανάλογο σήμα στο μόριο της αν και υπάρχουν στοιχεία ότι μεταφέρεται στον πυρήνα δεσμευμένη στην πυρηνική πρωτεΐνη NOPP140 (133). Πυρηνικό πλέγμα (Nuclear matrix) Το πυρηνικό πλέγμα αποτελείται από την πυρηνική λάμινα, τον πυρηνίσκο και ένα δίκτυο ινωδών πρωτεϊνών. Είναι ότι απομένει μετά από εκχύλιση πυρήνων με άλατα και πέψη με δεοξυριβονουκλεάσες. Το πυρηνικό πλέγμα παίζει ρόλο στο σχήμα και την αρχιτεκτονική του πυρήνα. Αλλαγές στο σχήμα του πυρήνα συντελούν σε αλλαγές στη σύνθεση του DNA και την έκφραση των γονιδίων. Υπάρχουν αναφορές όπου μετά από κατάλληλα ερεθίσματα η κινάση καζεΐνης 2 αλληλεπιδρά εκλεκτικά με το πυρηνικό πλέγμα και τη χρωματίνη (134). Παράλληλα έλλειψη ανδρογόνων σε αρουραίους οδηγεί σε μειωμένη δράση της CK2 κατά 80% στο πυρηνικό πλέγμα, ενώ αντίθετα η πρόσληψη ανδρογόνων από τους αρουραίους αυτούς οδηγεί στην αύξηση της παρατηρούμενης δράσης κινάσης καζεΐνης 2 στο πυρηνικό πλέγμα κατά 110% (135). Επίσης η ρυθμιστική β-υπομονάδα της CK2 φαίνεται σε ορισμένες περιπτώσεις να αγκυροβολεί με ομοιοπολικούς σουλφυδριλικούς δεσμούς σε πρωτεΐνες του πυρηνικού πλέγματος (136). Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση ότι σε ποντίκια που τους έχει αφαιρεθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί την α -υπομονάδα της CK2 (knockout mice) το πυρηνικό πλέγμα των ώριμων σπερματοκυττάρων έχει ακαθόριστο σχήμα. Στα ποντίκια αυτά τα σπερματοκύτταρα τους έχουν λανθασμένη μορφολογία και παρουσιάζουν αζωοσπερμία (118). Με χρήση επίσης αντισωμάτων απέναντι στην CK2 και ανάλυση με ανοσοφθορισμό παρατηρήθηκε έντονο σήμα στους πυρηνίσκους σε κύτταρα ποντικού (137).

60 56 Α.4.6. Υποστρώματα της CK2-Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί πάνω από 160 υποστρώματα για τις κινάσες καζεΐνης τύπου 2, και τα οποία παίζουν ρόλο στον έλεγχο της ανάπτυξης, τη ρύθμιση της μεταγραφής, τη μεταφορά μηνύματος και την αρχιτεκτονική του κυττάρου (138). Στις επόμενες παραγράφους θα αναφερθεί η φωσφορυλίωση ορισμένων από αυτά από την CK2. Κυτταροπλασματική μεμβράνη Η β-υπομονάδα της κινάσης καζεΐνης 2 αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με το κυτταροπλασματικό τμήμα της διαμεμβρανικής πρωτεΐνης CD5, ενώ συγχρόνως η CK2 φωσφορυλιώνει την CD5 στις σερίνες 459 και 461. Η πρωτεΐνη CD5 εκφράζεται σε όλα τα Τ καθώς και στα Β1 κύτταρα και ρυθμίζει την ενεργοποίηση του υποδοχέα του αντιγόνου. Η αναφορά αυτή, ήταν η πρώτη όπου η CK2 εντοπιζόταν στην κυτταροπλασματική μεμβράνη αλληλεπιδρώντας με έναν υποδοχέα της επιφάνειας του κυττάρου και η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται να παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση του υποδοχέα (139). Επίσης, μια δράση κινάσης καζεΐνης 2 απομονώθηκε στο εξωτερικό μέρος της μεμβράνης σε κύτταρα HeLa (119). Η δράση αυτή φωσφορυλιώνει τα πεπτίδια RRREEETEEE και RRRADSDDDDD που αποτελούν υποστρώματα της κινάσης καζεΐνης. Επίσης αναστέλλεται από χαμηλές συγκεντρώσεις ηπαρίνης και μπορεί να χρησιμοποιεί το ATP και το GTP ως δότες φωσφορικών. Περαιτέρω μελέτη με πειράματα αυτοφωσφορυλίωσης και ανοσοαποτύπωσης έδειξαν ότι αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες (43 kda και 40 kda) καθώς και μία ρυθμιστική υπομονάδα (28 kda) (140). Αυτή η δράση κινάσης που εντοπίζεται στο εξωτερικό τμήμα της μεμβράνης φωσφορυλιώνει φυσιολογικά υποστρώματα όπως το ινωδογόνο, το ινώδες, τη λεκτίνη L-29 και νευροχορδίνες (141,142). Κυτταρόπλασμα Ένα κυτταροπλασματικό υπόστρωμα της CK2 είναι το μεγάλο Τ αντιγόνο του ιού SV40 το οποίο φωσφορυλιώνεται στις θέσεις Ser106 και Ser111/112 και η φωσφορυλίωση αυτή είναι αναγκαία για τη μεταφορά του μεγάλου Τ αντιγόνου στον πυρήνα. Αναφέρεται ότι αυτό συμβαίνει γιατί η φωσφορυλίωση γίνεται σε αμινοξέα που βρίσκονται κοντά σε ένα σήμα εντοπισμού της πρωτεΐνης στον πυρήνα (NLS) επηρεάζοντας έτσι τη μεταφορά της (143).

61 57 Αυτό δείχνει ότι μια σπουδαία λειτουργία της CK2 στο κυτταρόπλασμα είναι η ρύθμιση της μεταφοράς πρωτεϊνών στον πυρήνα με φωσφορυλίωση. Άλλα κυτταροπλασματικά υποστρώματα της CK2 αποτελούν η τροπονίνη (144), η δυνεΐνη (dynein) την οποία εκτός ότι τη φωσφορυλιώνει, αλληλεπιδρά και μαζί της μέσω της β-υπομονάδας (145). Επίσης τροποποιεί τη σταθμίνη στη θέση 146 επάγοντας τον αποπολυμερισμό των μικροσωληνίσκων (146). Η φωσφορυλίωση της β-τουμπουλίνης (β-tubulin) αυξάνει την αλληλεπίδραση της με την πρωτεΐνη των νευρικών κυττάρων NP185. Η β-τουμπουλίνη δεν αποτελεί μόνο υπόστρωμα της κινάσης καζεΐνης 2 αλλά και συνδέεται με τις καταλυτικές α και α υπομονάδες της. Ένας λόγος της αλληλεπίδρασης αυτής φαίνεται να είναι ότι με τον τρόπο αυτό η CK2 μεταφέρεται και εντοπίζεται πολύ κοντά σε πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού που αποτελούν υποστρώματα της, έτσι ώστε να τις φωσφορυλιώνει με έναν πιο αποτελεσματικό τρόπο (147, 148). Ακόμη θεωρείται ότι η CK2 συμμετέχει στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης φωσφορυλιώνοντας τον EF1β. In vitro πειράματα σε διάφορους οργανισμούς όπως ο άνθρωπος, ο Xenopus, και ο S. cerevisiae έδειξαν ότι ο EF1β αποτελεί υπόστρωμα της κινάσης καζεΐνης 2 ( ). Ενδοπλασματικό δίκτυο Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, έχει αναγνωριστεί δράση κινάσης καζεΐνης 2 στο ενδοπλασματικό δίκτυο η οποία φωσφορυλιώνει in vitro την καλνεξίνη και την πρωτεΐνη SRSα. Η SRSα είναι μια πρωτεΐνη του ενδοπλασματικού δικτύου η οποία δεσμεύει ισχυρά ασβέστιο και έχει λειτουργία πρωτεϊνικού συνοδού. Η καλνεξίνη είναι επίσης μια πρωτεΐνη που δεσμεύει ασβέστιο και έχει δομή λεκτίνης, η λειτουργία της δε, ως πρωτεϊνικού συνοδού σχετίζεται με τη σωστή αναδίπλωση των νεοσυντιθέμενων γλυκοπρωτεϊνών. Φωσφορυλιώνεται in vivo στις θέσεις Ser534 και Ser544 που συμπεριλαμβάνονται στο μοτίβο αναγνώρισης από την CK2 και οι οποίες βρίσκονται στο κυτταροπλασματικό τμήμα της καλνεξίνης (129, 130). Επίσης έχει δειχθεί ότι η φωσφορυλίωση αυτή οδηγεί την καλνεξίνη κοντά στα ριβοσώματα (152, 153). Έτσι φαίνεται ότι ο ρόλος της CK2 στο ενδοπλασματικό δίκτυο είναι η ρύθμιση πρωτεϊνών που έχουν λειτουργίες συνοδού πρωτεϊνών για τη σωστή αναδίπλωση των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών.

62 58 Πυρήνας Υπάρχουν αρκετές αναφορές για υποστρώματα της CK2 πυρήνα, που σχετίζονται με τη μεταγραφή γονιδίων. Στον οργανισμό S. cerevisiae αναφέρεται ότι η παρουσία της κινάσης καζεΐνης 2 είναι απαραίτητη προκειμένου να υπάρξει αποτελεσματική μεταγραφή από την RNA πολυμεράση III. Η μεταγραφή μέσω της RNA πολυμεράσης III είναι ελάχιστη σε συνθήκες αναστολής της CK2 σε κυτταρικά εκχυλίσματα, ενώ μετά από την προσθήκη ενεργής CK2 σ αυτό, τα επίπεδα της μεταγραφής επανέρχονται στα φυσιολογικά. Το ίδιο αποτέλεσμα είχαν και in vivo μελέτες όπου με ανενεργή την CK2 η μεταγραφή από την πολυμεράση III παρεμποδίζεται σημαντικά (154). Επίσης υπάρχουν αναφορές για τη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα NF-kappaB από την CK2 στην Ser529 καθώς και αλληλεπίδραση του ολοενζύμου με το μεταγραφικό παράγοντα in vivo. Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση του NF-kappaB ως μεταγραφικού παράγοντα (155). Η φωσφορυλίωση ενός άλλου μεταγραφικού παράγοντα (PC4) από την κινάση καζεΐνης 2 έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της δράσης του. Αυτό συμβαίνει γιατί ο PC4 σε συνθήκες μεταγραφικής ενεργοποίησης ακετυλιώνεται από τον παράγοντα p300 σε δύο λυσίνες, με αποτέλεσμα η αλληλεπίδραση του με το DNA να ενισχύεται. Η φωσφορυλίωση από την κινάση έχει ως αποτέλεσμα τη μη ακετυλίωση του από τον p300 και έτσι να καταστέλλεται η δράση του (156). Η CK2 επίσης ρυθμίζει τη δράση του ογκοκαταστολέα p53 επιδρώντας με δύο τρόπους. Μπορεί και τον φωσφορυλιώνει στην Ser386 επάγοντας τη σύνδεση της πρωτεΐνης αυτής σε συγκεκριμένα σημεία στο DNA, οδηγώντας έτσι σε μεταγραφική καταστολή και παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αξιοσημείωτο είναι ότι η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή είναι σταθερή και in vivo δεν υπάρχει αποφωσφορυλίωση της από κάποια φωσφατάση πρωτεϊνών. Ακόμη η β-υπομονάδα της CK2 συνδέεται ανεξάρτητα με την p53 και παρεμποδίζει τη σύνδεση της με το DNA (157,158). Επίσης παρατηρήθηκε ότι κατά τη διάρκεια της γονιμοποίησης η φωσφορυλίωση των ιστονών H1 και Η2Β από την κινάση καζεΐνης 2, έχει ως αποτέλεσμα την προστασία τους από πρωτεολυτική δράση, κάτι που συμβαίνει γρήγορα στη μη φωσφορυλιωμένη μορφή τους. Έτσι φαίνεται ότι η CK2 παίζει σημαντικό ρόλο στην οργάνωση της χρωματίνης κατά τη γονιμοποίηση προστατεύοντας τις ιστόνες (159). Ακόμη η ετεροχρωματινική πρωτεΐνη HP1 που παίζει ρόλο στη συγκρότηση της ετεροχρωματίνης υπερφωσφορυλιώνεται in vivo. Με in vivo και in vitro πειράματα

63 59 εντοπίστηκαν τρεις σερίνες στα δύο άκρα της HP1 που φωσφορυλιώνονται από την CK2. Η μετάλλαξη των σερινών αυτών σε αλανίνες έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της δέσμευσης της HP1 στην ετεροχρωματίνη. Αντίθετα, σύμφωνα με τα πειράματα αυτά φαίνεται ότι η φωσφορυλίωση της HP1 από την CK2 προάγει την αλληλεπίδραση της με άλλες ετεροχρωματινικές πρωτεΐνες (160). Πυρηνικό πλέγμα Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη παράγραφο έχει αναγνωριστεί δράση κινάσης καζεΐνης 2 στις πρωτεΐνες του πυρηνικού πλέγματος, αν και τα φυσιολογικά της υποστρώματα δεν έχουν ταυτοποιηθεί πλήρως. Η φωσφορυλίωση αυτή των πρωτεϊνών του πυρηνικού πλέγματος φαίνεται να επηρεάζεται από την παρουσία ιστονών, η οποία ενισχύει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών του πλέγματος από την CK2 (161). Ένα από τα υποστρώματα της CK2 στο πυρηνικό πλέγμα που έχουν ταυτοποιηθεί, είναι η φωσφοπρωτεΐνη Β23. Η πρωτεΐνη αυτή εμφανίζεται να εμπλέκεται στη σύνθεση του rrna και τη συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης αυτής από την CK2 φαίνεται να ελέγχεται από την παρουσία ανδρογόνων (162). Επίσης έχει απομονωθεί δράση κινάσης καζεΐνης 2 ισχυρά δεσμευμένη στην πυρηνική λάμινα, η οποία φωσφορυλιώνει μια πρωτεΐνη παρόμοια με τη λαμίνη Α (Laminlike). Φαινόμενα υπερφωσφορυλίωσης σε πρωτεΐνες της πυρηνικής λάμινας συνδέονται με το πέρασμα του κυττάρου στη φάση της μίτωσης, μεταβάλλοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που την αποτελούν (163). Ένα άλλο πολύ καλό υπόστρωμα της CK2 είναι η νουκλεολίνη, η κύρια πρωτεΐνη του πυρηνίσκου. Επίσης η νουκλεολίνη αλληλεπιδρά με το ένζυμο μέσω των δύο καταλυτικών του υπομονάδων (164). Η νουκλεολίνη συνδέεται με τη φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η1 και επάγει την αποσυμπύκνωση της χρωματίνης. Έτσι επιτρέπεται η πρόσβαση στο DNA της RNA πολυμεράσης ΙΙ, προκειμένου να ξεκινήσει η μεταγραφή του DNA (165). Η φωσφορυλίωση της νουκλεολίνης επάγει την πέψη της από μια πρωτεάση σε δύο πεπτίδια (30 kda και 72 kda) με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση της. Η διαδικασία αυτή αναστέλλεται από την ηπαρίνη και ενεργοποιείται από πολυαμίνες (166).

64 60 Άλλες ιδιότητες της CK2 Πρόσφατα έχει αναφερθεί, μετά από ανάλυση κατά Northern και ανοσοαποτύπωση ότι υπάρχουν αυξημένες συγκεντρώσεις «ελεύθερης» β-υπομονάδας σε κύτταρα όρχεων και εγκεφάλου, η οποία δεν σχηματίζει σύμπλοκο με τις καταλυτικές υπομονάδες του ολοενζύμου της CK2. Η «ελεύθερη» αυτή μορφή της ρυθμιστικής υπομονάδας της CK2 φαίνεται να συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες (91). Επίσης όπως έχει ήδη αναφερθεί υπάρχει δέσμευση της β-υπομονάδας της κινάσης καζεΐνης 2, ανεξάρτητη από τη δράση του ολοενζύμου με τον ογκοκαταστολέα p53. Η δέσμευση αυτή λαμβάνει μέρος στο καρβόξυτελικό άκρο της p53 και ρυθμίζει την ικανότητα δέσμευσης της πάνω στο DNA (158). Τέλος αναφέρεται η ικανότητα της καταλυτικής α-υπομονάδας της CK2 να δεσμεύεται πάνω στο DNA, με αποτέλεσμα την απώλεια της ενζυμικής της δραστικότητας. Η δέσμευση του DNA με την α-υπομονάδα φαίνεται να είναι συναγωνιστική σε σχέση με υπόστρωμα καζεΐνης. Η απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας επανέρχεται πλήρως με την παρουσία της β-υπομονάδας και το σχηματισμό ενός πλήρως λειτουργικού ολοενζύμου (110). A.5. ΣΠΕΡΜΑΤΟΓΕΝΕΣΗ Σπερματογένεση ονομάζεται η διαδικασία της ανάπτυξης των σπερματικών κυττάρων, όπου ανώριμα σπερματικά κύτταρα μέσω διαδοχικών μιτωτικών και μειωτικών διαιρέσεων (σπερματοκυτογένεση) και σταδίων διαφοροποίησης (σπερμιογένεση) παράγουν τελικά σπερματοζωάρια. Σχήμα Α.14. Σχηματική αναπαράσταση των αλληλοδιάδοχων συμβάντων κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης.

65 61 Α.5.1. Σπερματοφόρος σωληνίσκος Η διαδικασία της σπερματογένεσης λαμβάνει χώρα στους σπερματοφόρους σωληνίσκους των όρχεων. Οι σωληνίσκοι αποτελούνται από το σπερματοφόρο επιθήλιο, έναν ιστό που περιλαμβάνει τους δύο βασικούς τύπους κυττάρων: τα σωματικά Sertoli κύτταρα (Sertoli cells) και τα γεννητικά κύτταρα (167, 168). Σχήμα Α.15. Σχηματική αναπαράσταση τμήματος του σπερματοφόρου επιθηλίου όπου παρουσιάζονται οι βασικοί τύποι των σωματικών και διαφοροποιούμενων κυττάρων. Στους όρχεις ενηλίκων, τα Sertoli κύτταρα είναι ένας πληθυσμός μη πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων και το καθένα απ αυτά εκτείνεται από τη βασική μεμβράνη έως τον αυλό. Τα γεννητικά κύτταρα είναι ένας πολλαπλασιαζόμενος πληθυσμός κυττάρων, τα οποία βρίσκονται σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης. Τα πιο ανώριμα από τα γεννητικά κύτταρα εντοπίζονται κοντά στη βασική μεμβράνη και τα πιο ώριμα κινούνται προς τον αυλό του σπερματοφόρου σωληνίσκου. Συνήθως τέσσερις ή πέντε ομόκεντρες στοιβάδες γεννητικών κυττάρων μπορούν να αναγνωριστούν μέσα στο επιθήλιο. Οι σωληνίσκοι περιβάλλονται από έναν βασικό υμένα στον οποίο περιέχονται εύκαμπτα μυοειδή κύτταρα (167, 168). Ο χώρος που περιβάλλει τους σωληνίσκους είναι γεμάτος με μεσοκυττάριο ιστό, ο οποίος περιέχει αγγεία, νεύρα, συνδετικό ιστό και Leydig κύτταρα τα οποία εκκρίνουν ανδρογόνα (169).

66 62 Α.5.2. Διαφοροποίηση γεννητικών κυττάρων Η διαφοροποίηση των γεννητικών κυττάρων ξεκινά κατά την εμβρυϊκή περίοδο, όταν τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα αποικίζουν τη βασική μεμβράνη. Εκεί, υπό την επιρροή των Sertoli κυττάρων, τα αρχέγονα κύτταρα πολλαπλασιάζονται και μετατρέπονται σε γονοκύτταρα (170). Αυτά παραμένουν σε στάση μέχρι και μετά τη γέννηση, οπότε επανενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε σπερματογόνια. Μεταγεννετικά ορισμένα από τα σπερματογόνια μπορεί να διαφοροποιηθούν προς πρωτογενή σπερματοκύτταρα, αλλά η πλειονότητα των γεννητικών κυττάρων μπαίνει στη μείωση μόνο μετά την εφηβεία (171). Κατά την ενηλικίωση, τα κύτταρα μεταμορφώνονται από σπερματογόνια σε σπερματόζωα μέσω πολλών ενδιάμεσων σταδίων. Τα διπλοειδή σπερματογόνια, πολλαπλασιάζονται με μιτωτικές διαιρέσεις δίνοντας νέες γενιές κυττάρων οι οποίες προχωρούν προς τη διαφοροποίηση. Επίσης μερικά απ αυτά διπλασιάζονται ώστε να υπάρχει ένας σταθερός αριθμός αρχικών σπερματογονίων, και εξ αυτών ένας αριθμός διαιρείται με πολύ αργό ρυθμό αποτελώντας τα «εφεδρικά» κύτταρα, τα οποία ενεργοποιούνται σε έκτακτες περιπτώσεις καταστροφής των «κανονικών» κυττάρων επαναφέροντας έτσι τον πληθυσμό των σπερματογονίων στα αρχικά τους επίπεδα ( ). Η τελευταία μιτωτική διαίρεση των σπερματογονίων παράγει πρώιμα προλεπτοτενή σπερματοκύτταρα, τα οποία αρχικά εντοπίζονται στο βασικό υμένιο και μοιάζουν σε δομή με τα σπερματογόνια. Σε μικρό χρονικό διάστημα μετατοπίζονται μακριά από το υμένιο και περνούν μέσα από το συνδετικό σύμπλεγμα των Sertoli κυττάρων προς το εσωτερικό του σωληνίσκου. Εκεί αυξάνεται ο όγκος τους και αναπτύσσουν την ιδιαίτερη μορφολογία τους καθώς περνούν τα λεπτοτενή, ζυγοτενή, παχυτενή και διπλοτενή στάδια της μειωτικής πρόφασης. Οι δύο διαδοχικές μειωτικές διαιρέσεις έχουν ως αποτέλεσμα την παραγωγή απλοειδών σπερματίδων (168). Από το σημείο αυτό ξεκινά η διαδικασία της διαφοροποίησης που καλείται σπερμιογένεση κατά την οποία τα κύτταρα μεταμορφώνονται από κυκλικές σπερματίδες σε σπερματόζωα ( , 172). Οι κύριες μορφολογικές αλλαγές που επιτελούνται κατά τη σπερμιογένεση είναι: 1. Σχηματισμός του ακροσώματος. 2. Ανάπτυξη του μαστιγίου. 3. Συμπύκνωση της χρωματίνης. 4. Αλλαγές στο σχήμα και μέγεθος του πυρήνα.

67 63 Τελικά, αφού το πλεονάζον κυτταρόπλασμα και τα οργανίδια απορριφθούν ως «υπολειπόμενο κυστίδιο» στο επιθήλιο, τα σπερματόζωα απελευθερώνονται απ αυτό στον αυλό. Μόνο ένα πολύ μικρό ποσοστό του κυτταροπλασματικού υλικού παραμένει δεσμευμένο ως κυτταροπλασματικό σταγονίδιο, στο μεσαίο τμήμα του σπερματόζωου καθώς αυτό μετακινείται προς την επιδιδυμίδα (172). Α.5.3. Τα Sertoli κύτταρα (Sertoli cells) Τα σωματικά Sertoli κύτταρα συμβάλουν στη δομική οργάνωση του σπερματοφόρου σωληνίσκου καθώς εκτείνονται σε όλο το πάχος του επιθηλίου και γειτονικά Sertoli κύτταρα σχηματίζουν μεταξύ τους συνεκτικά συμπλέγματα. Τα συμπλέγματα αυτά χωρίζουν το επιθήλιο σε δύο κύριες περιοχές. Τη βασική περιοχή η οποία περιέχει τα σπερματογόνια και τα πρώιμα σπερματοκύτταρα και τη γειτονική στον αυλό περιοχή η οποία περιέχει τα ώριμα σπερματοκύτταρα και τις σπερματίδες (173,174). Τα Sertoli κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη των σπερματογονικών κυττάρων. Εκκρίνοντας υγρά ή ρυθμίζοντας τη μεταφορά μορίων τα Sertoli δημιουργούν μικροπεριβάλλοντα τα οποία βοηθούν στη διαφοροποίηση των γεννητικών κυττάρων. Οι κύριες λειτουργίες των Sertoli κυττάρων είναι (174): 1. Η φυσική (δομική) υποστήριξη των γεννητικών κυττάρων. 2. Διακινούν στο σπερματοφόρο επιθήλιο ορμόνες, μεταβολίτες και θρεπτικά συστατικά προς στα γεννητικά κύτταρα. 3. Προστατεύουν τα σπερματοκύτταρα, σπερματίδες και σπερματόζωα από αυτοάνοση αντίδραση του οργανισμού απέναντι τους (Blood-Testis barrier). 4. Απομακρύνουν τα «υπολειπόμενα κυστίδια» και εκφυλισμένα κύτταρα με φαγοκύτωση. 5. Εκκρίνουν ουσίες που ρυθμίζουν τις λειτουργίες των όρχεων. 6. Ρυθμίζουν τη μετακίνηση των κυττάρων διαμέσου του επιθηλίου και την απελευθέρωση των σπερματόζωων στον αυλό.

68 64 Α.5.4. Ο κύκλος του σπερματοφόρου επιθηλίου Τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης δεν κατανέμονται τυχαία στο επιθήλιο, αλλά οργανώνονται σε καθορισμένους συνδυασμούς κυττάρων (στάδια). Το αποτέλεσμα της οργάνωσης αυτής είναι ότι σε συγκεκριμένες φάσεις ανάπτυξης παρουσιάζονται οι ίδιοι συνδυασμοί κυττάρων κατά μήκος του σωληνίσκου. Τα στάδια διαδέχονται το ένα το άλλο με συγκεκριμένη σειρά και αποτελούν τον κύκλο του σπερματοφόρου επιθηλίου (172, 175). Ο αριθμός των σταδίων (6 στον άνθρωπο, 12 στο ποντίκι και 14 στον αρουραίο) και η διάρκεια του κάθε κύκλου (16 ημέρες για τον άνθρωπο, 12 για τον αρουραίο), είναι σταθερά για κάθε είδος. Στα τρωκτικά κάθε στάδιο καταλαμβάνει σημαντικό μέρος του σωληνίσκου και τυπικά μια εγκάρσια τομή του αποτελείται ένα μοναδικό στάδιο της σπερματογένεσης, ενώ στον άνθρωπο τα στάδια κατανέμονται σπειροειδώς και μία εγκάρσια τομή αποτελείται από δύο ή παραπάνω στάδια ταυτόχρονα ( , 172, 175). Σχήμα Α.16. Σχηματική αναπαράσταση σπερματοφόρου σωληνίσκου αρουραίου και των συνδυασμών κυττάρων που αποτελούν τα ανάλογα στάδια.

69 65 Α.5.5. Περαιτέρω ωρίμανση Τα σπερματόζωα που απελευθερώνονται από το σωληνίσκο δεν έχουν πλήρη κινητικότητα και ικανότητα γονιμοποίησης, έτσι κατά τη διάρκεια της μετακίνησης μέσα στην επιδιδυμίδα (διάρκειας περίπου δύο εβδομάδων) ολοκληρώνονται οι μορφολογικές αλλαγές που προσδίδουν τα παραπάνω χαρακτηριστικά. Τα κύρια γεγονότα κατά την περίοδο αυτή είναι η απόρριψη του κυτταροπλασματικού σταγονιδίου που βοηθά στην αύξηση της κινητικότητας και η ολοκλήρωση τελικής μορφής του ακροσώματος που παίζει σημαντικό ρόλο στη γονιμοποίηση (176).

70 66 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Όπως ήδη αναφέρθηκε στην εισαγωγή ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR) είναι μια πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, η οποία κατά την απομόνωση της από πυρήνες ερυθροκυττάρων γαλοπούλας συγκαθαρίζεται με τη μορφή συμπλόκου με άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες (2, 29). Μεταξύ των πρωτεϊνών του συμπλόκου συμπεριλαμβάνεται και μία κινάση πρωτεϊνών η οποία φωσφορυλιώνει εξειδικευμένα τον LBR στις σερίνες μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που βρίσκεται στο αμινοτελικό του άκρο (30). Οι βιβλιογραφικές αναφορές ότι αλληλουχίες αυτού του τύπου αποτελούν επιφάνειες αλληλεπίδρασης μεταξύ πρωτεϊνών και ότι η φωσφορυλίωση τους από τις κινάσες της οικογένειας των SRPK ρυθμίζει τις αλληλεπιδράσεις αυτές, καταδεικνύουν τη σημασία της φωσφορυλιωτικής δράσης (30, 32, 33). Το γεγονός επίσης ότι ο LBR συμμετέχει μαζί με άλλες πρωτεΐνες σε σύμπλοκο στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη καθώς και το ότι η ετεροχρωματίνη βρίσκεται σε στενή επαφή με τον πυρηνικό φάκελο κάνει το σύστημα του υποδοχέα και της κινάσης ακόμα πιο ελκυστικό προς μελέτη. Για τους λόγους αυτούς, ο καθαρισμός και χαρακτηρισμός της συγκεκριμένης αυτής δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στον LBR, αποτέλεσε αρχικό στόχο της εργασίας. Ως πηγή καθαρισμού χρησιμοποιήθηκε κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου που αποτελεί πλούσια πηγή του ενζύμου, σύμφωνα και με παλιότερες μελέτες (62, 177). Χρησιμοποιήθηκαν χρωματογραφικές τεχνικές σε συνδυασμό με τεχνικές ραδιενεργής επισήμανσης φυσιολογικών και μεταλλαγμένων τμημάτων του LBR. Στη συνέχεια για την ταυτοποίηση της δραστικότητας αυτής χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές ανοσοανίχνευσης, in situ επαναφορά ενζυμικής δράσης μετά από SDS ηλεκτροφόρηση, καθώς και τεχνικές συγκατακρήμνισης. Σε ένα επόμενο στάδιο μελετήθηκε η επίδραση που έχει η φωσφορυλίωση του υποδοχέα στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων του με την πρωτεΐνη p32, ένα άλλο μέλος του συμπλόκου του LBR. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν κυρίως τεχνικές συγκατακρήμνισης. Ένας διαδεδομένος τρόπος ρύθμισης πρωτεϊνικών κινασών στο κύτταρο είναι η φωσφορυλίωση τους από άλλες κινάσες. Έτσι ένα άλλο σημείο που έγινε αντικείμενο μελέτης κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας, είναι η μελέτη της φωσφορυλίωσης της SRPK1 και κατά πόσο η φωσφορυλίωση αυτή ρυθμίζει τη δράση ή την υποκυτταρική κατανομή της SRPK1. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές χρωματογραφίας, πειράματα

71 67 ανάλυσης φωσφοαμινοξέων και φωσφοπεπτιδίων, χρήση αναστολέων, τεχνικές ανοσοανίχνευσης, σημειακές μεταλλάξεις στο μόριο της SRPK1 και έκφραση τόσο των φυσιολογικών όσο και των μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε βακτήρια και σε ευκαρυωτικά κύτταρα καθώς και τεχνικές ανοσοφθορισμού. Τέλος ένα τελευταίο αντικείμενο μελέτης αποτέλεσε η μελέτη της κατανομής τόσο της SR πρωτεϊνικής κινάσης αλλά και των LBR και p32 κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Το κύριο ερέθισμα για τη μελέτη αυτή ήταν η υψηλή έκφραση της SRPK1 στους όρχεις, όπου τα επίπεδα της είναι πολλαπλάσια σε σχέση με τους άλλους ιστούς. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές ανοσοανίχνευσης, in situ υβριδισμού και ανοσοφθορισμού. Συζητείται επίσης ο ρόλος των πρωτεϊνών αυτών κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης.

72 68 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Βιολογικό υλικό Οι όρχεις που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή κυτταροπλασματικών και πυρηνικών εκχυλισμάτων προέρχονται από αρουραίους ηλικίας 5 μηνών της φυλής Wistar και από ποντίκια C57BL/6. Για τα πειράματα ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκαν τομές από όρχεις ποντικών C57BL/6. B.2. Χημικά αντιδραστήρια Η προμήθεια των χημικών αντιδραστηρίων, αναλυτικής καθαρότητας έγινε από τους εξής οίκους: Merck (Darmstadt, Germany), Sigma (St. Louis, USA) και Serva (Heidelberg, Germany). Το γ-32ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol είναι του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Τα ακτινογραφικά φιλμ που χρησιμοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες είναι του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ ήταν αντίστοιχα: X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρίας. B.3. Υλικά χρωματογραφίας Ο κατιονικός ανταλλάκτης φωσφοκυτταρίνη είναι της εταιρίας Sigma (St. Louis, USA), ενώ οι στήλες αγχιστείας Affigel-10 και Affigel-15 είναι της εταιρίας Biorad. Οι πλάκες κυτταρίνης T.L.C. πάχους 0.1 mm, διαστάσεων 20x20 cm είναι της εταιρίας Merck (Darmstadt, Germany). B.4. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Η κινάση καζεΐνης τύπου 2 καθώς και τα ένζυμα μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας New England BioLabs Inc. Ο πλασμιδιακός φορέας palter-1 και το σύστημα in vitro σημειακών μεταλλάξεων Altered Sites II ήταν της εταιρείας Promega Corporation (USA). Για την

73 69 έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρίας Amersham Pharmacia Biotech, ενώ για την έκφραση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ο φορέας κλωνοποίησης pflag-cmv-2 της εταιρίας Eastman Kodak Company. Η εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας έγινε χρησιμοποιώντας το Sequencing Kit της εταιρίας Amersham Pharmacia Biotech. Όλα τα θρεπτικά υλικά που Τ7 χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας GIBCO BRL. Ο κλώνος του LBR παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Howard Worman και Günter Blobel (25) ενώ η έκφραση του αμινοτελικού του άκρου και των μεταλλάξεων του ως πρωτεϊνών σύντηξης με την GST, καθώς και η κλωνοποίηση των SRPK1/SRPK1a από μία cdna βιβλιοθήκη από ανθρώπινους όρχεις έγιναν από τη Λέκτορα Ελένη Νικολακάκη. Για την παρασκευή της p32 ως πρωτεΐνης σύντηξης με έξι ιστιδίνες χρησιμοποιήθηκε το κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pet-15b γονίδιο της που παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Göran Akusjärvi (Department of Medical Biology and Microbiology, BMC, Uppsala Univ., Sweden). B.5. Κλασμάτωση εκχυλισμάτων όρχεων αρουραίου ή ποντικού (178) Σε πρώτο στάδιο γίνεται ζύγιση των όρχεων αρουραίου ή ποντικού ώστε να γίνει γνωστή η αρχική τους μάζα. Οι όρχεις καθαρίζονται προσεκτικά από το λιπώδη ιστό με τη βοήθεια λαβίδας (στην περίπτωση των όρχεων ποντικού αφαιρείται και το εξωτερικό υμένιο που καλύπτει τους σωληνίσκους) και ακολουθεί η αιώρηση τους σε διπλάσιο όγκο από το διάλυμα ομογενοποίησης το οποίο αποτελείται από 0.25 Μ σουκρόζη, 25 mm KCl, 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 5 mm MgCl2, 5 mm DTT και 3 mm PMSF. Το μίγμα ομογενοποιείται σε συσκευή ομογενοποίησης ιστών Potter-Elvehjem. Ακολουθούν δύο φυγοκεντρήσεις στα 2500 g η πρώτη για 10 λεπτά, όπου παραλαμβάνεται το ακατέργαστο πυρηνικό κλάσμα και στα g η δεύτερη, για 10 λεπτά επίσης, ώστε να απομακρυνθούν τα διάφορα υποκυτταρικά οργανίδια μαζί με τα θραύσματα των μεμβρανών. Το υπερκείμενο που παραλαμβάνουμε από τη πιο πάνω διαδικασία υποβάλλεται σε υπερφυγοκέντρηση στα x g για 1.5 ώρα, ώστε να παραληφθεί το κυτταροπλασματικό κλάσμα. Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης το υπερκείμενο παραλαμβάνεται με τη βοήθεια πιπέτας Pasteur ογκομετρείται και προσδιoρίζεται η περιεκτικότητα του σε πρωτεΐνες σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford. Η φύλαξη του κυτταροπλάσματος γίνεται στους 20 C.

74 70 Το ακατέργαστο πυρηνικό κλάσμα στη συνέχεια επαναιωρείται στο διάλυμα ομογενοποίησης και το αιώρημα των πυρήνων επιστοιβάζεται πάνω σε διάλυμα επιστοίβαξης (cushion) σουκρόζης που αποτελείται από 2.3 Μ σουκρόζη, 25 mm KCl, 50 mm Tris-HCl ph 7.5, 5 mm MgCl2, 5mM DTT και 3 mm PMSF και φυγοκεντρείται στα x g για 90 λεπτά. Το λευκό ίζημα που καθιζάνει στον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης αποτελεί τους πυρήνες. Το ίζημα αιωρείται σε διάλυμα 10 mm Na2HPO4/NaH2PO4, 2 mm MgCl2, 1 mm PMSF, ph 7.5 και ακολουθεί πέψη με 100 µg/ml Dnase I για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στο αιώρημα προστίθεται NaCl σε τελική συγκέντρωση 1 Μ και αναδεύεται για 2 ώρες στους 4 C. Το πυρηνικό εκχύλισμα συλλέγεται μετά από φυγοκέντρηση στα x g για 30 λεπτά, ογκομετρείται και προσδιορίζεται η περιεκτικότητα του σε πρωτεΐνες σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford. Η φύλαξη του πυρηνικού εκχυλίσματος γίνεται στους 20 C. B.6. Προσδιορισμός πρωτεΐνης B.6.1 Φασματοφωτομετρική μέθοδος (179) Η ιδιότητα των πρωτεϊνών να παρουσιάζουν απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην περιοχή του υπεριώδους με μέγιστο τα 280 nm λόγω της παρουσίας στο μόριο τους των αμινοξέων τυροσίνη και τρυπτοφάνη, αποτελεί τη βάση του προσδιορισμού τους με τη μέθοδο αυτή. Η ταχύτητα της μεθόδου και η μη καταστροφή του δείγματος κατά τον προσδιορισμό συνιστούν τα βασικά πλεονεκτήματα της μεθόδου. Η ύπαρξη όμως μειονεκτημάτων, όπως η έλλειψη ακρίβειας και εξειδίκευσης λόγω απορροφήσεων στο ίδιο μήκος κύματος και από άλλες ουσίες όπως τα νουκλεϊνικά οξέα, ελεύθερα νουκλεοτίδια κ.λ.π., περιορίζουν τη χρήση της στον κατά προσέγγιση προσδιορισμό των πρωτεϊνών, κυρίως στην περίπτωση της παρακολούθησης της έκλουσης πρωτεϊνικών κλασμάτων από στήλες χρωματογραφίας. B.6.2. Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford (180) τροποποιημένη από τον Bearden (181) Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας ενός δείγματος σε πρωτεΐνη σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, βασίζεται στη δημιουργία συμπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής σε όξινο περιβάλλον, τη μεταβολή του μεγίστου απορρόφησης μετά τη συμπλοκοποίηση (από τα 465 nm στα 595 nm) και τη μέτρηση της απορρόφησης του συμπλόκου αυτού.

75 71 Το αντιδραστήριο αποτελείται από τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue G250 που προστίθεται σε συγκέντρωση 1 mg/ml, σε 200 ml διαλύματος φωσφορικού οξέως 85% υπό ανάδευση και το διάλυμα που προκύπτει αραιώνεται με νερό στο 1 lt. Μετά την ανάμιξη του πρωτεϊνικού δείγματος και του αντιδραστηρίου, το σχηματιζόμενο σύμπλοκο απορροφά στα 595 nm. Με βάση την απορρόφηση αυτή και την αναγωγή της σε συγκέντρωση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη αναφοράς με αλβουμίνη (BSA), προσδιορίζεται η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτεΐνη. B.7. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (T.L.C.) (182) Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας επιτρέπει το διαχωρισμό μικρών μορίων (αμινοξέα, πεπτίδια, νουκλεοτίδια κ.α.) ενός μίγματος ουσιών, τα οποία αναλύονται καθώς κινούνται με διαφορετική ταχύτητα μέσα στη λεπτή στοιβάδα που δημιουργούν οι κόκκοι ενός προσροφητικού μέσου (κυτταρίνη, αλουμίνα, διοξείδιο του πυριτίου) το οποίο διαβρέχεται από έναν κινούμενο διαλύτη. Η διαφορά στην ταχύτητα που παρουσιάζουν τα μόρια οφείλεται στη διαφορετική κατανομή τους μεταξύ της στατικής και της κινούμενης φάσης λόγω των διαφορών τους στο μέγεθος και στην πολικότητα τους (ως στατική φάση θεωρείται το νερό προσροφημένο στο μέσο, ενώ ως κινούμενη φάση οι υπόλοιποι διαλύτες). Ο λόγος της απόστασης που διανύει κάθε συστατικό προς την απόσταση που διανύει ο διαλύτης συμβολίζεται Rf και αποτελεί σταθερή παράμετρο κάθε ουσίας που χρωματογραφείται σε σταθερές συνθήκες. Κατά τη διάρκεια της εργασίας η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη των φωσφοπεπτιδίων και των φωσφοαμινοξέων της SRPK1 μετά τη φωσφορυλίωση της από την κινάση καζεΐνης 2 ή από διάφορα ενζυμικά παρασκευάσματα στηλών χρωματογραφίας. Το προσροφητικό μέσο που χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις ήταν πλάκες κυτταρίνης (Merk). Η ταυτοποίηση έγινε μετά από αυτοραδιογραφία και αντιπαραβολή των κηλίδων του ακτινογραφικού film σε σχέση με τις αντίστοιχες των μαρτύρων στις πλάκες χρωματογραφίας που εμφανίζονται μετά από ψεκασμό με νινυδρίνη (φωσφοαμινοξέα). B.8. Χρωματογραφία ιονικής ανταλλαγής (183) Η χρωματογραφία ιονικής ανταλλαγής χρησιμοποιείται για την κλασμάτωση των μορίων με βάση το ηλεκτρικό τους φορτίο. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται για τον καθαρισμό

76 72 των πρωτεϊνών, αφού μόρια που παρουσιάζουν έστω και μικρές διαφορές στο φορτίο τους μπορούν εύκολα να διαχωριστούν. Οι χρησιμοποιούμενοι για τον καθαρισμό πρωτεϊνών ιονικοί ανταλλάκτες αποτελούνται από αδιάλυτο στο νερό υλικό, πάνω στο οποίο βρίσκονται ομοιοπολικά συνδεδεμένες οι φορτισμένες ομάδες, οι οποίες έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν αμφίδρομα από το περιβάλλον τους, με ηλεκτροστατικές δυνάμεις, ιόντα και πρωτεΐνες αντιθέτου φορτίου. Ανάλογα με το είδος του φορτίου που οι ανταλλάκτες μπορούν να δεσμεύσουν διακρίνονται σε ανιονικούς και κατιονικούς. Η αποδέσμευση των πρωτεϊνών από έναν ανταλλάκτη, επιτυγχάνεται συνήθως με τη διαβίβαση από τη στήλη, ρυθμιστικού διαλύματος με διαβαθμισμένη συγκέντρωση άλατος, ώστε με τη σταδιακή αύξηση της ιονικής ισχύος του διαλύματος έκλουσης οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις μεταξύ ανταλλάκτη πρωτεϊνών να εξασθενούν, επιτρέποντας την απόσπαση τους από τον ανταλλάκτη και τον εκλεκτικό τους διαχωρισμό. Ο ιονικός ανταλλάκτης που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία είναι ο κατιονικός ανταλλάκτης φωσφοκυτταρίνη. Ο χρησιμοποιούμενος ανταλλάκτης μετά από κάθε χρήση αναγεννάτε, με σκοπό την αποδέσμευση όλων των πρωτεϊνών και ρυπαντών, με διαδοχικές πλύσεις οξέως και βάσεως. Συγκεκριμένα ακολουθείται η διαδοχική αιώρηση για 30 λεπτά σε 0.5 Ν HCl, 0.5 Ν NaOH, 0.5 N HCl. Μετά από κάθε αιώρηση ακολουθεί διήθηση του υλικού σε χωνί Buchner και πλύση με άφθονο νερό ώστε να απομακρυνθεί τελείως το ελεύθερο οξύ ή άλκαλι. Με το πέρας της κατεργασίας ο ανταλλάκτης αιωρείται στο ρυθμιστικό διάλυμα της χρωματογραφίας, πακετάρεται στη στήλη και εξισορροπείται με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. B.9. Χρωματογραφία αγχιστείας (184) Ο καθαρισμός μιας πρωτεΐνης από ένα μίγμα πρωτεϊνών μπορεί να επιτευχθεί με βάση την εξειδικευμένη και αντιστρεπτή δέσμευση της, πάνω σε μόρια (ligands) που βρίσκονται καθηλωμένα πάνω σε αδρανές υλικό χρωματογραφίας. Μόρια (ligands) που είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για το διαχωρισμό πρωτεϊνών είναι το υπόστρωμα ή ένα ανάλογο του υποστρώματος ενός ενζύμου, ένα συνένζυμο, ένας αναστολέας ή ακόμη μια άλλη πρωτεΐνη που δεσμεύεται στην πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Η έκλουση των δεσμευμένων πρωτεϊνών από τη στήλη επιτυγχάνεται είτε με τη διαβίβαση του ίδιου του ligand ή αναλόγου του από τη στήλη, είτε με τη μεταβολή της

77 73 ιονικής ισχύος του διαλύματος έκλουσης προκαλώντας έτσι την εξασθένηση των δεσμών που αναπτύσσονται μεταξύ ligand-πρωτεΐνης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα υλικά Affigel-10 και Affigel-15 που αποτελούνται από αγαρόζη και ενεργές ομάδες οι οποίες έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν ομοιοπολικά τις αμινομάδες των ligand που επιλέχθηκαν (Η Affigel-10 χρησιμοποιείται για τη δέσμευση βασικών και ουδετέρων πεπτιδίων ενώ η Affigel-15 για τη δέσμευση όξινων πεπτιδίων. Ως ligands χρησιμοποιήθηκαν είτε ένα συνθετικό πεπτίδιο (Ser Ser Pro Ser Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Gly Arg Pro Ala Lys Gly) το οποίο περιέχει στο μόριο του μια επαναλαμβανόμενη ακολουθία αργινίνης/σερίνης, για τον καθαρισμό της δράσης κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στον LBR, είτε αποφωσφορυλιωμένη καζεΐνη του εμπορίου για τον καθαρισμό της δράσης κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην SRPK1. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε και στις δύο περιπτώσεις περιλαμβάνει αρχικά τη διάλυση 15 mg από το ligand σε ρυθμιστικό διάλυμα 0.1 Μ HEPES ph 7.5, 1 mm EDTA, 0.5 mm PMSF, σε τελικό όγκο 1 ml. Συγχρόνως το υλικό χρωματογραφίας (2-3 ml από το αιώρημα της στήλης) αφήνεται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και πλένεται με άφθονο ddh2o ώστε να απομακρυνθεί η αλκοόλη στην οποία φυλάσσεται. Η σύζευξη μεταξύ ligand και Affigel-10/15 συντελείται υπό ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και 3 ώρες στους 4 C. Μετά το τέλος της διαδικασίας σύζευξης το υλικό της στήλης ενδέχεται να περιέχει ακόμη ελεύθερες ενεργοποιημένες ομάδες ικανές να συνδεθούν με τις αμινομάδες των πρωτεϊνών του δείγματος μας ομοιοπολικά, κάτι που δεν είναι επιθυμητό. Για το λόγο αυτό γίνεται εξουδετέρωση των ενεργοποιημένων αυτών ομάδων που έχουν απομείνει με ένα διάλυμα (blocking buffer) το οποίο αποτελείται από 1 Μ Tris-Cl ph 8.0, 1 mm EDTA, 1 mm DTT και 0.5 mm PMSF υπό ανάδευση στους 4 C για 16 ώρες. Ακολουθεί πλύση της στήλης χρωματογραφίας 3 φορές για 10 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 150 mm NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 0.5 mm PMSF και μία τελική πλύση με διάλυμα 7 Μ ουρίας που περιέχει 1 Μ NaCl. Η στήλη εξισορροπείται σε διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 mm β-msh και 0.5 mm PMSF. Μετά από κάθε χρήση η στήλη αναγεννάτε in situ με διάλυμα 6 Μ ουρίας και 2 Μ NaCl.

78 74 B.10. Ανίχνευση δράσης RS κινάσης πρωτεϊνών ή δράσης κινάσης καζεΐνης 2 με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους (185) Η ανίχνευση της ύπαρξης δράσης RS κινάσης ή κινάσης καζεΐνης 2 στηρίζεται στην επώαση μικρών ποσοτήτων των κλασμάτων που συλλέγονται από τις στήλες χρωματογραφίας με τα αντίστοιχα υποστρώματα της ενζυμικής δραστικότητας που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Για την περίπτωση της δραστικότητας RS κινάσης χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της Λαμίνης Β (GST-wtNt) εκφρασμένο ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST στα Ε. coli, το οποίο περιέχει στο μόριο του έξι επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, ενώ για να ανιχνευθεί η δραστικότητα κινάσης καζεΐνης 2 ως υποστρώματα χρησιμοποιούνται αποφωσφορυλιωμένη καζεΐνη και η SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST. Και στις δύο περιπτώσεις χρησιμοποιείται ως δότης φωσφορικών το [γ-32ρ] ΑΤΡ. Το μίγμα επώασης επίσης περιλαμβάνει 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl2, 80 mm NaCl, 0.6 μci [γ-32ρ] ΑΤΡ και 25 μμ ψυχρό ΑΤΡ. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 μl και ρυθμίζεται με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη2ο. Τα δείγματα επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 50 mm DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων που χρησιμοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται. Ακολουθεί βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και αποχρωματισμός της. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής, αυτοραδιογραφία και κοπή των ζωνών της πηκτής που αντιστοιχούν στα μοριακά βάρη των υποστρωμάτων σε συμφωνία και με τις ζώνες που εμφανίζονται στο film της αυτοραδιογραφίας. Ακολουθεί η μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή (Packard) κατά Cherenkov. Κατ αυτό τον τρόπο ανιχνεύεται η επιθυμητή δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών καθώς και η έκταση της ενσωμάτωσης της ραδιενέργειας από το [γ-32ρ] ΑΤΡ στα αντίστοιχα υποστρώματα. B.11. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) (186) Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός δείγματος πραγματοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύμφωνα με την εξίσωση:

79 75 v=e*q/f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH2=CH-CO-NH2) και του Ν,Ν μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bis- ακρυλαμιδίου (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH-CH2) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα που διαθέτει πόρους που το μέγεθος τους εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού ανάλογα και με τη συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη του υπερθειϊκού αμμωνίου (NH4)2S2O8 για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για τη διάδοση του. Το σχήμα των πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα με τη συσκευή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στη συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, το πήκτωμα επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για τη συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωμα διαχωρισμού που είναι υπεύθυνο για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώματα είναι διαφορετικά ως προς το ph και τη σύσταση τους. Επίσης το ρυθμιστικό διάλυμα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούμενα. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου). Απουσία τέτοιων παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση.

80 76 B.12. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (187) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσει τις πρωτεΐνες δεσμεύεται πάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων κατά τη διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωμα διαχωρισμού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωμα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωμα διαχωρισμού και οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιμέρους στοιχείων του συστήματος είναι οι εξής: Διάλυμα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris 0.19 M γλυκίνη 0.1% SDS ph 8.9 Πήκτωμα επιστοίβαξης: 5% ακρυλαμίδιο 0.25% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS Μ Tris-Cl ph 6.8 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED

81 77 Πήκτωμα διαχωρισμού: 12% ακρυλαμίδιο 0.62% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS Μ Tris-Cl ph 8.9 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων το οποίο αποτελείται από: Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανού της βρωμοφαινόλης Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 μl του διαλύματος αυτού σε 25 μl του μίγματος επώασης. Τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDS-πρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη που χρησιμοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υπομονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος 25 ma έως τη στιγμή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. B.13. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250 Για να βαφούν οι πρωτεϊνικές οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα που περιέχει 0.1% Coomasie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% μεθανόλη, όπου και ανακινείται για διάστημα 1 ώρας. Στο διάλυμα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται με ανακίνηση σε διάλυμα 10% οξικό οξύ, 10% μεθανόλη.

82 78 B.14. Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO3) (188) Η βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με νιτρικό άργυρο χρησιμοποιείται αντί της πιο απλής μεθόδου με Coomasie Brilliant Blue R-250 για τη μεγαλύτερη ευαισθησία της στην ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών. Οι ποσότητες των πρωτεϊνών που μπορεί να ανιχνεύσει είναι μέχρι 1 ng έχοντας περίπου 100 φορές μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Η διαδικασία που ακολουθείται έχει ως εξής: Αρχικά η πηκτή πολυακρυλαμιδίου εμβαπτίζεται σε διάλυμα που αποτελείται από 50% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ για 30 λεπτά προκειμένου να στερεωθούν οι ζώνες των πρωτεϊνών. Κατόπιν η πηκτή ανακινείται σε απιονισμένο νερό για τουλάχιστον 2 ώρες, με αρκετές αλλαγές του νερού κατά τη διάρκεια της πλύσης. Ακολουθεί εμβάπτιση της πηκτής σε διάλυμα 5 μg/ml DTT για 30 λεπτά και εν συνεχεία σε διάλυμα AgNO3 (0.1% w/v) για το ίδιο χρονικό διάστημα υπό συνεχή ανακίνηση. Η πηκτή αφού υποστεί δύο πολύ γρήγορες πλύσεις με απιονισμένο νερό, εμβαπτίζεται στο διάλυμα εμφάνισης των πρωτεϊνικών ζωνών (3% w/v NaCO3, % HCHO). Εφόσον οι πρωτεϊνικές ζώνες στην πηκτή αποκτήσουν την επιθυμητή ένταση, η αντίδραση εμφάνισης σταματά με την προσθήκη κιτρικού οξέως. Η πηκτή ξεπλένεται και φυλάσσεται σε απιονισμένο νερό. B.15. Αυτοραδιογραφία (189) Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεμπόμενη β-ακτινοβολία είτε του ισοτόπου Ρ που χρησιμοποιείται για την 32 επισήμανση διάφορων πρωτεϊνικών μορίων, είτε του ισοτόπου 35S που χρησιμοποιείται στην εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων μορίων DNA. Στην περίπτωση των πηκτωμάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωμα ανακινείται για 30 λεπτά σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3MM για 1 ώρα υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Οι πλάκες χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας ξηραίνονται σε ρεύμα αέρος. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους. Μία πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger. Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα.

83 79 Β.16. In situ επαναφορά ενζυμικής δράσης μετά από SDS-PAGE (190) Η μέθοδος αυτή επιτρέπει την ανίχνευση ενζυμικών δράσεων σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα σύμφωνα με το μοριακό τους μέγεθος χρησιμοποιώντας πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου στα οποία έχει συμπολυμεριστεί η πρωτεΐνη στόχος. Γενικά η μέθοδος αυτή έχει ως βάση τον πολυμερισμό του πρωτεϊνικού υποστρώματος στο πήκτωμα διαχωρισμού υπό την προϋπόθεση ότι αυτό δεν είναι πολύ μικρού μεγέθους ώστε να διαχέεται από την πηκτή. Όταν το υπόστρωμα συμπεριληφθεί από την αρχή παγιδεύεται στο πλέγμα της πηκτής και δεν ηλεκτροφορείται (ένα μέρος δεσμεύεται ομοιοπολικά στα πολυμερή του ακρυλαμιδίου). Ακολουθεί ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός κυτταρικού εκχυλίσματος στο πήκτωμα, η απομάκρυνση του αποδιατακτικού παράγοντα (SDS) και η επαναδιάταξη των ενζύμων. Έτσι μετά από επώαση του πηκτώματος σε κατάλληλες συνθήκες τα επαναδιατεταγμένα ένζυμα δρουν στο δεσμευμένο υπόστρωμα τους και οι αντίστοιχες ενζυμικές δραστικότητες ανιχνεύονται στην πηκτή σε θέση αντίστοιχη του μεγέθους τους. Αναλυτικότερα η διαδικασία που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση RS κινασών πρωτεϊνών έχει ως εξής. Η πρωτεΐνη σύντηξης GST-wtNt προστίθεται στο πήκτωμα διαχωρισμού (10%) πριν τον πολυμερισμό σε συγκέντρωση 0.1 mg/ml. Ως πήκτωμα αναφοράς χρησιμοποιείται παρόμοιο πήκτωμα στο οποίο η πρωτεΐνη σύντηξης GST-wtNt αντικαθίσταται από σκέτη GST (0.1 mg/ml). Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση για 1 ώρα με ένταση ρεύματος 25 ma. Ο αποδιατακτικός παράγοντας SDS απομακρύνεται από το πήκτωμα διαχωρισμού με πλύσεις σε διάλυμα 20 % ισοπροπανόλης, 50 mm Tris-Cl ph 8.0. Στη συνέχεια η κινάση αποδιατάσεται πλήρως με επώαση σε 6 Μ υδροχλωρική γουανιδίνη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ακολουθεί επαναδιάταξη του ενζύμου με επώαση για 16 ώρες σε θερμοκρασία 4 C σε διάλυμα 50 mm Tris-Cl ph 8.0, 14 mm 2-μερκαπτεθανόλη, και 0.04 % Tween 40. Ακολούθως τα πηκτώματα επωάζονται σε διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 80 mm NaCl και 10 mm MgCl2 (assay buffer) σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 20 λεπτά προστίθενται στο διάλυμα επώασης 50 μμ ΑΤΡ και μci (γ-32ρ) ΑΤΡ (6000 Ci/mmol) ως δότης φωσφορικών και η επώαση συνεχίζεται για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη διαλύματος 5 % τριχλωροξικού οξέως που περιέχει και 10 mm πυροφωσφορικό νάτριο. Ακολουθούν διαδοχικές πλύσεις με το παραπάνω διάλυμα έως ότου απομακρυνθεί πλήρως το ελεύθερο ΑΤΡ. Τα πηκτώματα υφίστανται ξήρανση και εκθέτονται σε film προκειμένου να ανιχνευθούν οι ραδιενεργές ζώνες.

84 80 B.17. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (191,192) Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF, βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, από την πηκτή προς τη μεμβράνη κατά την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού και στον εγκλωβισμό τους στο πλέγμα της μεμβράνης. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η μεμβράνη και η πηκτή μεταφέρονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) το οποίο αποτελείται από: 12.5 mm TrisΒορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT (στην περίπτωση της PVDF μεμβράνης προηγείται ένα στάδιο εμβαπτίσεως της μεμβράνης σε 100% μεθανόλη πριν βυθιστεί στο διάλυμα μεταφοράς). Η τοποθέτηση τους στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε δύο χαρτιά Whatman 3MM με τη μεμβράνη προσανατολισμένη στο θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter της εταιρίας Hoeffer. Η μεταφορά γίνεται για 1 ώρα κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος (45-65 ma ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής και των πρωτεϊνών που πρόκειται να μεταφερθούν). B.18. Υπερδιήθηση-Λυοφίλιση Η συμπύκνωση πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας υπερδιήθηση ή λυοφίλιση. Η υπερδιήθηση συνιστά την απομάκρυνση του διαλύτη από το παρασκεύασμα υπό πίεση διοχετεύοντας άζωτο σε συσκευή Amicon σε θερμοκρασία 4 C. Χρησιμοποιούνται φίλτρα PM-10 με πόρους που δεν επιτρέπουν τη διέλευση μορίων με μοριακό βάρος άνω των Η λυοφίληση γίνεται με πάγωμα του δείγματος στους -20 C και στη συνέχεια εξάχνωση του ύδατος σε συσκευή.

85 81 B.19. Παρασκευή πολυκλωνικού αντισώματος απέναντι στην SRPK1 (193) Η παραγωγή αντισώματος απέναντι στη κινάση πρωτεϊνών SRPK1 έγινε με τη χρήση 2 ανοσολογικά ώριμων κουνελιών (12 εβδομάδων). Η ανοσοποίηση των ζώων έγινε με εμβολιασμό ολόκληρου του μορίου της SRPK1 ως πρωτεΐνης σύντηξης με GST. Το διάλυμα της πρωτεΐνης αναμίχθηκε με ίσο όγκο CFA (Complete Freund s Adjuvant-πλήρες ανοσοενισχυτικό). Για τη δεύτερη δόση χρησιμοποιήθηκε ο αντίστοιχος όγκος IFA (Incomplete Freunds s Adjuvant-μη πλήρες ανοσοενισχυτικό), ενώ στην τρίτη δόση δεν έγινε προσθήκη ανοσοενισχυτικού. Τα γαλακτώματα που προέκυψαν χορηγήθηκαν με υποδόριες ενέσεις στην αυχενική περιοχή των κουνελιών ως εξής: 1η δόση ~100 μg πρωτεΐνης 2η δόση (μετά από 1 μήνα) ~100 μg πρωτεΐνης 3η δόση (μετά από 1 μήνα) ~100 μg πρωτεΐνης Μετά το πέρας μιας εβδομάδας από την τελευταία δόση έγινε θανάτωση και αφαίμαξη των ζώων. Το αίμα που συλλέχθηκε αφέθηκε για 60 λεπτά στους 37 C ώστε να υποστεί θρόμβωση. Ακολούθως αφέθηκε να παραμείνει για ώρες σε θερμοκρασία 4 C ώστε να συρρικνωθεί ο θρόμβος. Η κατακρήμνιση του θρόμβου έγινε με φυγοκέντρηση στα x g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο αποτελεί τον αντιορό και φυλάσσεται στους 20 C για αποθήκευση ή στους 4 C για άμεση χρήση. B.20. Ανοσοανίχνευση (194) Η ανοσοανίχνευση είναι μια τεχνική που μας επιτρέπει τον εντοπισμό μιας καθηλωμένης σε μεμβράνη πρωτεΐνης με τη βοήθεια αντισώματος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσμευθεί με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου. Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρμόσθηκε για την ταυτοποίηση της RS κινάσης, τον εντοπισμό της κινάσης καζεΐνης 2 σε δραστικά κλάσματα στηλών χρωματογραφίας καθώς και τον εντοπισμό της πρωτεΐνης p32 σε κυτταρικά εκχυλίσματα. Για

86 82 το σκοπό αυτό η ανίχνευση της SRPK1 στα διάφορα πρωτεϊνικά παρασκευάσματα έγινε με αντιορό κουνελιού που είχε ανοσοποιηθεί με την αντίστοιχη πρωτεΐνη σύντηξης με GST, η ανίχνευση της κινάσης καζεΐνης 2 έγινε με κατάλληλα αντισώματα που αναγνωρίζουν τις α, α και β υπομονάδες της αντίστοιχα, και που ευγενικά μας προμήθευσε ο Dr. David Litchfield (University of Western Ontario, Ontario, Canada), ενώ το αντίσωμα απέναντι στην πρωτεΐνη p32 μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Σπύρο Γεωργάτο (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων). Το συγκεκριμένο αντίσωμα αναπτύχθηκε απέναντι σε πεπτίδιο της καρβοξυτελικής περιοχή της πρωτεΐνης (CGG141TGESEWKDTNYTLNTDS157) με το τρινουκλεοτίδιο CGG να χρησιμοποιείται για λόγους σύζευξης (40). Το δεύτερο αντίσωμα απέναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού είναι συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση και προέρχεται από την εταιρία Cell Signalling. Επίσης στις περιπτώσεις που χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα παροδικά επιμολυσμένων κυττάρων με πρωτεΐνες σύντηξης που περιέχουν την ακολουθία FLAG, χρησιμοποιήθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει την αμινοξική ακολουθία Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (FLAG) και ανιχνεύεται με τη χρωμοαντίδραση αλκαλικής φωσφατάσης του δευτέρου αντισώματος το οποίο δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες IgG ποντικού. Η διαδικασία που εφαρμόζεται, είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Αρχικά η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς εμβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 ώρα σε διάλυμα κορεσμού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na2HPO4, 0.2 gr/l KH2PO4), ώστε να κορεστεί η μεμβράνη από τη ζελατίνη και να αποφύγουμε τις μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις της μεμβράνης με το αντίσωμα. Κατόπιν η μεμβράνη επωάζεται με το αντίστοιχο αντίσωμα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 λεπτών στη μεμβράνη με διάλυμα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της μεμβράνης για 1 ώρα υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1 : 2000) σε διάλυμα κορεσμού. Αφού η μεμβράνη υποστεί 2 πλύσεις των 10 λεπτών με PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromochloroindolyl phosphate) και 30 μl NBT (Nitro Blue Tetrazolium) σε 10ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-Cl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl2) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddh2o φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddh2o που περιέχει και NaN3.

87 83 B.21. Ανοσοκατακρήμνηση-Ανοσοαπομάκρυνση (195) Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης Α (Protein A) του μικροοργανισμού staphylococcus aureus να δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες. Χρησιμοποιώντας την ιδιότητα αυτή, τα αντισώματα που έχουν δεσμεύσει το αντιγόνο τους από ένα πρωτεϊνικό εκχύλισμα δεσμεύονται στη συνέχεια στην πρωτεΐνη Α η οποία είναι καθηλωμένη σε ένα αδρανές υλικό. Στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα όπως είναι το αντίσωμα που αναγνωρίζει την ακολουθία FLAG σε πρωτεΐνες σύντηξης, η στήλη που χρησιμοποιείται είναι πρωτεΐνη G-σεφαρόζη. Σύμφωνα με την τεχνική, η επώαση πρωτεϊνικού εκχυλίσματος με συγκεκριμένο αντίσωμα σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα και τη συμπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του παραπάνω μίγματος σε στήλη σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, εξισορροπημένης στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει ως αποτέλεσμα τη δέσμευση του συμπλόκου αντισώματος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α και την παραλαβή του από το εκχύλισμα. Έτσι με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνουμε τον εξειδικευμένο διαχωρισμό/καθαρισμό της φυσιολογικής μορφής μιας πρωτεΐνης μέσα από ένα μίγμα πρωτεϊνών. Επίσης είναι δυνατόν κάτω από κατάλληλα διαμορφωμένες συνθήκες εφαρμογής της τεχνικής, να συγκαθαριστούν και πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται ισχυρά πάνω στην πρωτεΐνη-στόχο (υποστρώματα, ρυθμιστές, κ.α.), προσφέροντας μια γενική εικόνα των αλληλεπιδράσεων στο φυσιολογικό περιβάλλον της πρωτεΐνης. Εναλλακτικά η ίδια μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πειράματα ανοσοαπομάκρυνσης πρωτεϊνών από κυτταρικά εκχυλίσματα ιστών. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή ακολουθείται το ίδιο πρωτόκολλο κατακρήμνισης της πρωτεΐνης στόχου από το αντίσωμα της, με τη διαφορά ότι το εκχύλισμα αφού αφαιρεθεί η πρωτεΐνη στόχος συλλέγεται και χρησιμοποιείται ως πηγή ενζυμικής δράσης σε διάφορα υποστρώματα ή για πειράματα αλληλεπίδρασης μεταξύ πρωτεϊνών προκειμένου να διαλευκανθεί η επίδραση της απουσίας της αφαιρεθείσας πρωτεΐνης στη συμπεριφορά του εκχυλίσματος. Κατά τη διάρκεια της εργασίας χρησιμοποιήθηκαν τα πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στις κινάσες πρωτεϊνών SRPK1 και CK2 και το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία. Τα σφαιρίδια εξισορροπούνται, με 3 πλύσεις των 10 λεπτών η καθεμία, σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 1% Triton X-100, 0.1 M NaCl και παραλαμβάνονται μετά από σύντομη φυγοκέντρηση, με απομάκρυνση του ρυθμιστικού

88 84 διαλύματος. Παράλληλα κατάλληλος όγκος από τα κυτταρικά εκχυλίσματα (ανάλογα με το πείραμα) επωάζονται με 5-10 μl αντιορού, υπό ανακίνηση για χρονικό διάστημα 3 ωρών στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν τα αντισώματα με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν. Μετά το πέρας της διαδικασίας μεταφέρονται στους σωλήνες με την καθηλωμένη πρωτεΐνη-α στα σφαιρίδια. Η δέσμευση του αντισώματος στα σφαιρίδια διαρκεί ώρες και ακολουθούν 3 πλύσεις των 10 λεπτών με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε να αποφευχθούν οι τυχόν ασθενείς αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες των εκχυλισμάτων. Στα σφαιρίδια με τις ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες είτε γίνονται πειράματα ελέγχου της δραστικότητας των κινασών με την προσθήκη των υποστρωμάτων τους και ραδιενεργού [γ32 Ρ] ΑΤΡ, είτε ανοσοανίχνευση για να ανιχνεύσουμε τις πρωτεΐνες που κατακρημνίστηκαν. Πριν τα δείγματα αναλυθούν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και ακολούθως θερμαίνονται στους 100 C για 3 λεπτά ώστε να διασπαστούν τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος. B.22. Πειράματα συγκατακρήμνισης (pulldown assays) Τα πειράματα συγκατακρήμνισης συνιστούν μία μέθοδο, η οποία επιτρέπει τη διερεύνηση της δυνατότητας των διαφόρων πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, Μας δίδει επίσης και μία πρώτη εκτίμηση για το πόσο ισχυρή είναι η αλληλεπίδραση αυτή. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στη δυνατότητα καθήλωσης διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης (π.χ με GST ή 6xHis) στα σφαιρίδια των αντίστοιχων στηλών χρωματογραφίας (γλουταθειόνη-σεφαρόζη, Ni2+-αγαρόζη) με τις οποίες παρουσιάζουν αγχιστεία. Οι καθηλωμένες αυτές πρωτεΐνες μπορούν να δεσμεύσουν άλλες πρωτεΐνες οι οποίες είτε βρίσκονται σε καθαρή μορφή, είτε περιέχονται σε συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και με τις οποίες παρουσιάζουν αγχιστεία. Η διαδικασία γίνεται παρουσία σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων ή/και απορρυπαντικών ώστε να αποφεύγονται τυχαίες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα εκχυλίσματα, και οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε εσφαλμένα συμπεράσματα. Στην παρούσα εργασία ως μέσο καθήλωσης χρησιμοποιήθηκε, κατά κύριο λόγο, η στήλη σεφαρόζης-γλουταθειόνης για τη δέσμευση πρωτεϊνών που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης. Στα πειράματα αναφοράς έγινε δέσμευση σκέτης GST στα σφαιρίδια. Τα γενικά στάδια της διαδικασίας που ακολουθούνται σε κάθε περίπτωση είναι τα παρακάτω: Αρχικά τα σφαιρίδια της στήλης εξισορροπούνται με

89 85 τρεις διαδοχικές πλύσεις των 10 λεπτών η κάθε μία, στους 4 C, σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na2HPO4, 0.2 gr/l KH2PO4, 1% Triton X-100), είτε σε ρυθμιστικό διάλυμα πού αποτελείται από 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2 mm MgCl2, 1% Triton X-100. Η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης με την GST (ή της σκέτης GST) στα σφαιρίδια της στήλης γίνεται παρουσία του ίδιου ρυθμιστικού, υπό ανακίνηση, στους 4 C για 1 ώρα. Το υπερκείμενο της στήλης απομακρύνεται μετά από φυγοκέντρηση στις x g και τα σφαιρίδια της στήλης πλένονται 2 φορές με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για 10 λεπτά στους 4 C. Στη συνέχεια μία συγκεκριμένη ποσότητα από τις πρωτεΐνες των οποίων η αλληλεπίδραση πρόκειται να ελεγχθεί (είτε πρόκειται για κυτταρικά εκχυλίσματα, είτε για ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που για την υπερέκφραση τους χρησιμοποιήθηκε κάποιο διαφορετικό σύστημα από αυτό της GST, π.χ με 6xHis, είτε για καθαρές κυτταρικές πρωτεΐνες) αραιώνεται στο ρυθμιστικό διάλυμα της διαδικασίας και επωάζεται με τα σφαιρίδια της στήλης, όπου είναι καθηλωμένη η GST-πρωτεΐνη, υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση στις x g και απομάκρυνση του υπερκειμένου, ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων των 10 λεπτών η κάθε μία, στους 4 C, στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολούθως, απομακρύνεται όλο το υγρό από τα σφαιρίδια της στήλης και επαναιωρούνται σε 25 μl νερού. Αφού προστεθεί 1.5 μl DTT 1 M και 5 μl από το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων, τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 90 C και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών γίνεται με δύο τρόπους. Όταν πρόκειται για πρωτεΐνες σύντηξης μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή βάφεται με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύονται με τη χρώση. Όταν πρόκειται για πρωτεΐνες, από εκχυλίσματα ευκαρυωτικών κυττάρων, που περιέχουν την αλληλουχία FLAG στο μόριο τους ή πρωτεΐνες από εκχυλίσματα ιστών (π.χ. όρχεις) μετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία ή με το αντίστοιχο πολυκλωνικό αντίσωμα της πρωτεΐνης στόχου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπου η GST-πρωτεΐνη αποτελεί υπόστρωμα κινάσης πρωτεϊνών, γίνεται έλεγχος της δυνατότητας της να φωσφορυλιωθεί εφ όσον έχει δεσμευθεί στο μόριο της η αντίστοιχη κινάση. Στην περίπτωση αυτή μετά τις πλύσεις, στα σφαιρίδια προστίθεται το διάλυμα όπου ελέγχεται η δραστικότητα της συγκεκριμένης κινάσης (assay buffer) και γίνεται ραδιενεργός επισήμανση της GST-πρωτεΐνης με [γ-32p] ATP. Η ύπαρξη ή μη ραδιενεργού ζώνης πάνω στο φιλμ αυτοραδιογραφίας μαρτυρά την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης-σύντηξης με την κινάση και τη δυνατότητα φωσφορυλίωσης της.

90 86 B.23. Ανάλυση φωσφοαμινοξέων (196) Η ταυτοποίηση του αμινοξέος μιας πρωτεΐνης που φωσφορυλιώνεται είναι δυνατή μετά από όξινη υδρόλυση σε υψηλή θερμοκρασία της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης, η οποία βρίσκεται καθηλωμένη σε μεμβράνη PVDF. Τα φωσφοαμινοξέα που προκύπτουν αναλύονται σε δύο διαστάσεις σε πλάκες κυτταρίνης, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, χρησιμοποιώντας κατάλληλο διάλυμα οργανικών διαλυτών συγκεκριμένου ph. Με βάση τη διαφορετική κινητικότητα που παρουσιάζουν τα φωσφοαμινοξέα (P-Ser, P-Thr, P-Tyr) γίνεται ο διαχωρισμός τους. Αναλυτικότερα η διαδικασία που ακολουθήθηκε στην παρούσα εργασία είναι η ακόλουθη: Μετά από τη φωσφορυλίωση της SRPK1 (ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST) από την CK2 ή τα δραστικά κλάσματα των στηλών χρωματογραφίας, γίνεται αρχικά διαχωρισμός των πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS ηλεκτροφόρηση). Ακολουθεί ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη PVDF για 1 ώρα με σταθερή ένταση ρεύματος 45 ma (η χρήση μεμβράνης νιτροκυτταρίνης δεν είναι δυνατή λόγω της ύπαρξης υπολειμμάτων μετά την όξινη υδρόλυση που παρεμποδίζουν την υπόλοιπη διαδικασία.). Έπειτα από την ταυτοποίηση πάνω στη μεμβράνη, της ραδιενεργής ζώνης που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη στόχο (στη προκειμένη περίπτωση στην GST-SRPK1), μετά από έκθεση της μεμβράνης σε X-Omat S film (Kodak) για 8-16 ώρες, το τμήμα αυτό της μεμβράνης τεμαχίζεται και εμβαπτίζεται σε διάλυμα HCl 5.7 Ν σε θερμοκρασία 110 C για 60 λεπτά. Η υδρόλυση διακόπτεται με την άμεση προσθήκη 500 μl κρύου ddh2o ώστε να παρεμποδιστεί η περαιτέρω υδρόλυση προς ελεύθερα φωσφορικά και το δείγμα τοποθετείται στους -20 C. Αφού ακολουθήσουν δύο λυοφιλήσεις με ενδιάμεση επαναιώρηση του στερεού υπολείμματος σε 500 μl ddh2o γίνεται μια τελευταία λυοφίληση αφού το στερεό υπόλειμμα έχει αιωρηθεί σε 100 μl ddh2o. Το υπόλειμμα διαλύεται σε 10 μl του πρώτου διαλύτη ανάπτυξης και γίνεται προσθήκη μη ραδιενεργών φωσφοαμινοξέων τελικής συγκέντρωσης 70 μg/ml το καθένα. Ο διαχωρισμός γίνεται σε πλάκες κυτταρίνης (βλ. και Β.7. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας). Ένας μικρός όγκος του δείγματος (<5 μl, ανάλογα και με τις κρούσεις που δίνει σε μετρητή Geiger) ενσταλάσσεται πολύ προσεκτικά πάνω στην πλάκα κυτταρίνης. και

91 87 ξηραίνεται με ρεύμα αέρα. Μετά την ενστάλαξη του δείγματος (η διάμετρος του στίγματος υπολογίζεται σε 2 mm) η πλάκα διαβρέχεται με τη βοήθεια χαρτιού Whatman 3ΜΜ που έχει εμβαπτιστεί στο πρώτο διάλυμα ανάπτυξης ph 1.9 (οξικό οξύ : μυρμηκικό οξύ : νερό, σε αναλογία 75 : 50 : 875). Η υγρή πλάκα ηλεκτροφορείται σε συσκευή HTLE-7000 υπό την παρουσία ενός έγχρωμου δείκτη (5 mg/ml DNP-lysine + 1 mg/ml xylene cyanol FF) σε σταθερό δυναμικό 1000 V για 30 λεπτά. Κατά την ηλεκτροφόρηση υπάρχει ψύξη με νερό και πίεση 10 bar για την αποφυγή σχηματισμού κηλίδων υγρού στις πλάκες. Μετά το τέλος της πρώτης ηλεκτροφόρησης η πλάκα αφήνεται να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου. Η ηλεκτροφόρηση κατά τη δεύτερη διάσταση γίνεται κατά τον ίδιο τρόπο μόνο που στην περίπτωση αυτή το διάλυμα ανάπτυξης έχει ph 3.5 (οξικό οξύ : πυριδίνη : νερό, σε αναλογία 50 : 5 : 945) και εφαρμόζεται σταθερό δυναμικό 1300 V για 20 λεπτά. Αφού η πλάκα κυτταρίνης ξηραθεί, ακολουθεί ψεκασμός με 0.25% w/v νινυδρίνης σε ακετόνη και ξήρανση στους 65 C για 5 λεπτά, ώστε να γίνει η εμφάνιση των κηλίδων των τριών φωσφοαμινοξέων αναφοράς που προσθέσαμε στο αρχικό μας δείγμα. Οι πλάκες εκτίθενται σε X-Omat S film (Kodak), για δύο ημέρες έως μία εβδομάδα στους -20 C. Με την εμφάνιση των ραδιενεργών κηλίδων του δείγματος και την άμεση σύγκριση τους με τις αντίστοιχες των φωσφοαμινοξέων αναφοράς της πλάκας κυτταρίνης, γίνεται η ταυτοποίηση του αμινοξέος που φωσφορυλιώνεται. B.24. Ανάλυση φωσφοπεπτιδίων (197) Η συγκεκριμένη μέθοδος μας επιτρέπει μέσω των «χαρτών» φωσφοπεπτιδίων που προκύπτουν, την εξαγωγή συμπερασμάτων για την ομολογία που παρουσιάζει η φωσφορυλίωση ενός υποστρώματος από διάφορα ενζυμικά παρασκευάσματα, αλλά και μία εκτίμηση των κυριοτέρων θέσεων φωσφορυλίωσης ενός υποστρώματος. Η ανάλυση των φωφοπεπτιδίων γίνεται σε πλάκες κυτταρίνης υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου κατά την πρώτη διάσταση και με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (T.L.C.) κατά τη δεύτερη διάσταση. Τα βασικά στάδια της μεθόδου αποτελούν: - Η απευθείας τρυψινόλυση της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης πάνω σε PVDF μεμβράνη.

92 88 - Ο δισδιάστατος διαχωρισμός των φωσφοπεπτιδίων που προκύπτουν. B.25. Απευθείας τρυψινόλυση Στη συγκεκριμένη εργασία υιοθετήθηκε η μέθοδος που αναπτύχθηκε από τους Luo, Hurley και Shefton (1991). Οι επισημασμένες με [γ-32ρ] πρωτεΐνες διαχωρίζονται με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολουθεί ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη εκτίθεται σε film ώστε από το αυτοραδιογράφημα να προκύψουν με ακρίβεια οι ζώνες που μας ενδιαφέρουν πάνω στη μεμβράνη. Ακολουθεί ο τεμαχισμός των τμημάτων της μεμβράνης, πού αντιστοιχούν στις ζώνες που μας ενδιαφέρουν, σε μικρότερα τμήματα (~ 4x2 mm) τα οποία ξεπλένονται αρχικά με μεθανόλη και ακολούθως με νερό. Για να εμποδίσουμε την τρυψίνη να αλληλεπιδράσει με τη μεμβράνη με αποτέλεσμα την περιορισμένη απόδοση της πρωτεόλυσης, τα τμήματα της μεμβράνης σταθεροποιούνται σε διάλυμα 0.5% πολυβίνυλπυρρολιδόνης (PVP-40) στους 37 C για 60 λεπτά. Η μεμβράνη πλένεται δύο φορές με νερό και τοποθετείται σε 100 μl διαλύματος NH4HCO3 ph Ακολουθεί διαδοχική προσθήκη 2x15 μl διαλύματος τρυψίνης 1 mg/ml. Η πρώτη επώαση διαρκεί ώρες ενώ η δεύτερη 5-7 ώρες. Τα πεπτίδια που προκύπτουν διαχωρίζονται από τα κομμάτια της μεμβράνης τα οποία αφού πλυθούν δύο φορές με νερό φυλάσσονται σε νερό για την περίπτωση που η τρυψινόλυση δεν ήταν επιτυχής. Το NH4HCO3 στο οποίο είναι διαλυμένα τα πεπτίδια παρεμποδίζει το σωστό διαχωρισμό τους. Για το λόγο αυτό προσθέτουμε 0.5 ml ddh2o και ακολουθεί λυοφίληση για την απομάκρυνση του NH4HCO3, η οποία και επαναλαμβάνεται ακόμα μία φορά μετά από προσθήκη και πάλι 0.5 ml ddh2o στο στερεό υπόλειμμα. Ακολουθεί μία τρίτη λυοφίληση με την προσθήκη 0.5 ml από το διάλυμα ανάπτυξης και το τελικό στερεό υπόλειμμα που προκύπτει διαλύεται σε μl του ίδιου διαλύματος. Από το δείγμα αυτό θα ληφθεί ικανός όγκος για ενστάλαξη στην πλάκα κυτταρίνης, ο οποίος υπολογίζεται με τη μέτρηση των ραδιενεργών κρούσεων του δείγματος σε συσκευή Geiger. B.26. Δισδιάστατος διαχωρισμός φωσφοπεπτιδίων Η ενστάλαξη των δειγμάτων στην πλάκα κυτταρίνης γίνεται πολύ αργά με ταυτόχρονη ξήρανση με ρεύμα αέρα. Το στίγμα που προκύπτει (διαμέτρου μέχρι 2 mm) δεν διαβρέχεται

93 89 απ ευθείας, αλλά μέσω τριχοειδών φαινομένων, εμποτίζοντας την πλάκα με χαρτί Whatman 3MM, στο οποίο έχουμε σχηματίσει ένα κενό κυκλικό διάστημα διαμέτρου 3 cm. Ο διαχωρισμός των πεπτιδίων στην υγρή πλάκα κατά την πρώτη διάσταση επιτυγχάνεται σε συσκευή ηλεκτροφόρησης HTLE-7000, παρουσία έγχρωμου δείκτη, (5 mg/ml DNP-lysine + 1 mg/ml xylene cyanol FF) σε σταθερό δυναμικό 500 V για 1 ώρα. Ο διαχωρισμός γίνεται σε συνθήκες ψύξης κυκλοφορώντας συνεχώς νερό, για την αποφυγή δημιουργίας κηλίδων υγρού πάνω στις πλάκες χρωματογραφίας. Στη συνέχεια αφού οι πλάκες κυτταρίνης στεγνώσουν εντελώς, ακολουθεί διαχωρισμός των πεπτιδίων κατά τη δεύτερη διάσταση με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. Οι πλάκες τοποθετούνται σε αεροστεγές δοχείο χρωματογραφίας που έχει προηγουμένως εξισορροπηθεί με 200 ml (2 cm ύψος) ρυθμιστικού διαλύματος (n-βουτανόλη : πυριδίνη : οξικό οξύ : νερό με αναλογία 75 : 50 : 15 : 60). Ο χρόνος που παραμένουν οι πλάκες χρωματογραφίας στο θάλαμο ανάπτυξης είναι 7-16 ώρες. Μετά το τέλος του χρονικού αυτού διαστήματος αφήνονται να στεγνώνουν στον αέρα και στη συνέχεια εκτίθενται σε film στους -70 C με φωτοπολλαπλασιαστές για 114 ημέρες. B.27. Αναστολή δράσης από την ηπαρίνη Προκειμένου να διαπιστωθεί ότι η εκλουόμενη δράση κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την SRPK1 είναι η κινάση καζεΐνης 2, διερευνήθηκε κατά πόσο παρατηρείται αναστολή της φωσφορυλίωσης στα δραστικά κλάσματα των στηλών χρωματογραφίας με προσθήκη ηπαρίνης, η οποία αποτελεί ισχυρό αναστολέα της κινάσης καζεΐνης 2. Ο έλεγχος της αναστολής γίνεται με προσθήκη αυξανομένων συγκεντρώσεων ηπαρίνης (0.05 mg/ml) σε 6 μl δραστικού κλάσματος στήλης χρωματογραφίας, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1. Το μίγμα επώασης επίσης περιλαμβάνει παρουσία Tris-ΗCl ph 7.5 (25 mm), MgCl2 (10 mm), ATP (0.025 mm) 0.6 μci [γ-32ρ] ΑΤΡ και 25 μμ ψυχρό ΑΤΡ. Ακολουθεί η επώαση των δειγμάτων για 30 λεπτά στους 30 C, SDS- ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. Η ύπαρξη αναστολής στη δράση κινάσης πρωτεϊνών διαπιστώνεται με αυτοραδιογραφία συγκρίνοντας την ένταση των ραδιενεργών ζωνών που εμφανίζονται.

94 90 B.28. Διερεύνηση της ρύθμισης στη δράση της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση με την κινάση καζεΐνης 2 Το γεγονός ότι η κινάση καζεΐνης 2 φωσφορυλιώνει την SRPK1 σε συγκεκριμένες θέσεις μας οδήγησε στη διερεύνηση της υπόθεσης ότι η φωσφορυλίωση ρυθμίζει τη δραστικότητα της SRPK1 απέναντι στα υποστρώματα της. Για να εξεταστεί η περίπτωση αυτή γίνεται χρήση της ικανότητας της CK2 να χρησιμοποιεί ως δότη φωσφορικών το GTP μεταφέροντας τη γ-φωσφορική του ομάδα στα υποστρώματα της. Συγκεκριμένα γίνεται σε αρχικό στάδιο προεπώαση 5 μl GST-SRPK1 ή των μεταλλαγμάτων της τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα φωσφορυλίωσης τους από την CK2 με 0.5 μl ανασυνδυασμένης κινάσης καζεΐνης 2 (500000U/ml, BioLabs) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 80 mm KCl, 10 mm MgCl2) και 0.6 mm GTP. Το στάδιο της προεπώασης διαρκεί 1.5 ώρα στους 30 C ώστε η φωσφορυλίωση της SRPK1 από την CK2 να είναι όσο το δυνατόν πιό στοιχειομετρική. Ακολουθεί η προσθήκη στους ίδιους σωλήνες τού υποστρώματος της SRPK1 (GST-wtNt), 1.5 μl του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος καθώς και 25 μμ ψυχρού ΑΤΡ και 0.6 μci [γ-32ρ] ΑΤΡ για τη ραδιενεργή επισήμανση του υποστρώματος από την SRPK1. Σημειώνεται ότι η SRPK1 χρησιμοποιεί αποκλειστικά ως δότη φωσφορικών το ΑΤΡ. Το γεγονός ότι η CK2 χρησιμοποιεί εξ ίσου καλά και το GTP και το ΑΤΡ και η παρουσία υψηλής συγκέντρωσης GTP εξασφαλίζει ότι το GST-wtNt δεν θα επισημανθεί ραδιενεργά από την CK2. Τα δείγματα επωάζονται στους 30 C για 5 λεπτά και ακολουθεί SDSηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Στο δείγμα αναφοράς απουσιάζει η SRPK1 ώστε να μπορεί να διαπιστωθεί ότι η CK2 πράγματι δεν φωσφορυλιώνει το GST-wtNt υπό τις συνθήκες του πειράματος. Στη συνέχεια η πηκτή ξηραίνεται και εκτίθεται σε film αυτοραδιογραφίας. Μετά από την οπτική σύγκριση των ραδιενεργών ζωνών που προκύπτουν, γίνεται κοπή των τμημάτων της πηκτής που αντιστοιχούν στις ραδιενεργές ζώνες και μέτρηση των κρούσεων τους κατά Cherenkov. Βάση της μέτρησης γίνεται η ποσοτική εκτίμηση του αποτελέσματος της επίδρασης της φωσφορυλίωσης στη δράση της SRPK1. B.29. Ηλεκτροφόρηση και απομόνωση DNA σε πηκτή αγαρόζης (198, 199) Η ηλεκτροφόρηση συγκεκριμένων τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης και η απομόνωση τους απ αυτές αποτελεί έναν απλό και αποδοτικό τρόπο διαχωρισμού και καθαρισμού τους.

95 91 Η μέθοδος βασίζεται στην παρασκευή πηκτών αγαρόζης με τήξη της αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα έως ότου σχηματιστεί ένα διαυγές διάλυμα. Με τη ψύξη του διαλύματος σχηματίζεται ένα πλέγμα που η πυκνότητα του εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τα τμήματα του DNA, που είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο ph, μετακινούνται προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από ορισμένους παράγοντες. (1) Το μέγεθος των τμημάτων του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. (2) Η συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. (3) Η διαμόρφωση των τμημάτων DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA ίδιου μοριακού βάρους κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. (4) Το δυναμικό που εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. (5) Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται πηκτές με συγκέντρωση 1% αγαρόζης, σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE (0.04 M Tris-οξικό, M EDTA ph 8.0), παρουσία και βρωμιούχου αιθιδίου σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA. Η ιδιότητα του να απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία και να την επανεκπέμπει στο κόκκινο ορατό φάσμα χρησιμοποιείται για να ανιχνευθούν τα τμήματα του DNA πάνω στην πηκτή. Το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων αποτελείται από 5% γλυκερόλη, 0.42% μπλε της βρωμοφαινόλης, 0.42% κυανούν του ξυλενίου ενώ η χρησιμοποιούμενη συσκευή ηλεκτροφόρησης είναι της εταιρείας International Biotechnologies, Inc. Για την απομόνωση των διαχωρισθέντων τμημάτων του DNA από την αγαρόζη χρησιμοποιούνται τα αντιδραστήρια και το πρωτόκολλο που παρέχονται από το Qiaquick Gel Extraction Kit της εταιρίας Qiagen. Η απομόνωση τμημάτων DNA σύμφωνα με τη μέθοδο

96 92 αυτή βασίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάτε από ειδικά σφαιρίδια στήλης, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων, ενώ οι προσμίξεις διέρχονται από τη στήλη. Το τμήμα του DNA που μας ενδιαφέρει αποκόπτεται από την πηκτή αγαρόζης και τοποθετείται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης (eppendorff). Εκεί προστίθεται το διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης (3 Μ NaI, 4 M NaClO4, 19 mm Tris-ΗCl, 0.1% Na2SO3 ph 7.0) σε αναλογία 300 μl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση για 10 λεπτά στους 50 C με περιοδική ανάδευση ώστε να διαλυτοποιηθεί η πηκτή. Η παραλαβή του DNA γίνεται με προσθήκη κατάλληλου όγκου σφαιριδίων στήλης Qiaquick και θέρμανση στους 50 C για 10 λεπτά, αναδεύοντας περιοδικά ώστε τα σφαιρίδια να καλύπτουν όλο τον όγκο του διαλύματος. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του διαλύματος για 30 δευτερόλεπτα στις x g και απόχυση το υπερκείμενο. Στα σφαιρίδια προστίθεται δύο φορές διάλυμα πλύσης QX2 (8 M NaClO4, 10 mm Tris-ΗCl ph 7.0) και δύο φορές αιθανολικό διάλυμα QX3 (100 mm NaCl, 10 mm Tris-ΗCl, 1mM EDTA ph 7.5), ώστε να απομακρυνθούν οι τυχόν προσμίξεις. Τα σφαιρίδια αφήνονται να ξηραθούν για 2 λεπτά και στη συνέχεια το DNA εκλούεται με προσθήκη 20 μl Η2Ο ή ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 1mM EDTA ph 8.0). Μικρή ποσότητα από το έκλουσμα (2-4 μl) ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης για να διαπιστωθεί κατ εκτίμηση η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε. B.30. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς (200) Η κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς βασίζεται στην ικανότητα του πλασμιδιακού DNA να διασπάται σε συγκεκριμένες θέσεις μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού και να συνδέεται με το ξένο τμήμα DNA που έχει υποστεί την ίδια κατεργασία. Τα πλασμίδια είναι μικρά, κυκλικά, δίκλωνα μόρια DNA που μπορούν να αναπτύσσονται ημι-αυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε αντιβιοτικά. Το πλασμιδιακό DNA καθώς και το ξένο τμήμα DNA που έχουν κατεργαστεί με τα ίδια ένζυμα περιορισμού μπορούν να επανακυκλοποιηθούν συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού που καταλύει μία λιγάση. Το ανασυνδιασμένο πλασμίδιο μπορεί να μεταφερθεί σε κύτταρα και να αναπτυχθεί παρουσία αντιβιοτικών επιτρέποντας την επιλογή τους σε σχέση με τα κύτταρα που δεν περιέχουν το πλασμίδιο. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι ο pgex2t, ο pflag-cmv-2 και ο palter-1.

97 93 Ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t έχει μέγεθος 4948 bp και περιέχει στο μόριο του έναν tac προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου, το γονίδιο laq Iq που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST). Η περιοχή κλωνοποίησης του πλασμιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει θέσεις για τη διάσπαση του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού BamH1 και EcoR1 που χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή των ξένων γονιδίων. Ο πλασμιδιακός φορέας palter-1 της εταιρίας Promega χρησιμοποιείται για την εισαγωγή επιθυμητών σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της SRPK1 και είναι κατάλληλος για την εύκολη παρασκευή και επιλογή μεταλλαγμάτων σύμφωνα με την ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Προσφέρει αντίσταση στην τετρακυκλίνη και αμπικιλλίνη (στην περίπτωση της αμπικιλλίνης η ανθεκτικότητα επανέρχεται με τη χρήση κατάλληλου ολιγονουκλεοτιδίου) για την επιλογή των μεταλλαγμένων κλώνων. Διαθέτει δύο προαγωγείς για την Τ7 και SP6 RNA πολυμεράση προκειμένου να γίνει η σύνθεση του μεταλλαγμένου κλώνου. Περιέχει χαρακτηριστικές περιοχές (phage f1 region) που βοηθούν την παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων. Επιτρέπει την κλωνοποίηση τμημάτων DNA με μέγεθος έως 6 kb, καθώς και επιλογή των κυττάρων που φέρουν το κλωνοποιημένο τμήμα DNA με τη δράση β-γαλακτοσιδάσης καθώς ο πλασμιδιακός φορέας περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί το lacz α-πεπτίδιο. Η περιοχή κλωνοποίησης περιέχει θέσεις για την πέψη του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoR I και BamH I όπου και βρίσκεται κλωνοποιημένο το γονίδιο της SRPK1. Ο φορέας κλωνοποίησης pflag-cmv-2 επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο αμινοτελικό τους άκρο με την ακολουθία Met-FLAG (Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-AspLys). Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για την παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με το κλωνοποιημένο τμήμα DNA. Η μεταγραφή των τμημάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus. Είναι ανθεκτικός στην αμπικιλλίνη και περιέχει θέσεις για την πέψη του από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoR I και BamH I όπου και βρίσκονται κλωνοποιημένα το γονίδιο της SRPK1, καθώς και των μεταλλαγμάτων της. Η αντίδραση λιγάσης πραγματοποιείται με την προσθήκη στο μίγμα αντίδρασης του τμήματος DNA και του φορέα σε αναλογία 7:1, 1.5 μl Τ4 DNA λιγάσης ( U/ml, BioLabs), 2 μl 10x ρυθμιστικού διαλύματος Τ4 DNA λιγάσης (500 mm Tris-Cl, 100 mm

98 94 MgCl2, 100 mm DTT, 10 mm ATP, 25 μg/ml BSA ph 7.5) και απιονισμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 20 μl. Το μίγμα επωάζεται για ώρες σε θερμοκρασία 15 C και ακολουθεί μετασχηματισμός των κατάλληλων σε κάθε περίπτωση κυττάρων E. coli. B.31. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων επιδεκτικών για μετασχηματισμό (Competent Cells) (201) Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων, ώστε να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασμένα με διαλύματα CaCl2 στους 4ο C και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές. Πολλές παραλλαγές της βασικής τεχνικής έχουν περιγραφεί και μία από αυτές χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Σύμφωνα μ αυτή 2 ml θρεπτικού υλικού L.B. (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1%) εμβολιάζονται είτε με βακτηριακά κύτταρα XL1/B, είτε με βακτηριακά κύτταρα TOP-10, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (15 μg/ml τετρακυκλίνη ή 20 μg/ml στρεπτομυκίνη, αντίστοιχα). Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για ώρες στους 37 C υπό ανακίνηση. Με 1 ml από την καλλιέργεια αυτή εμβολιάζουμε 50 ml θρεπτικού υγρού L.B. το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό ανάλογα με το είδος των κυττάρων που χρησιμοποιούμε. Ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C μέχρις ότου αυτή παρουσιάσει απορρόφηση Α260 = Η καλλιέργεια ψύχεται στον πάγο για 10 λεπτά και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση 3000 x g για 20 λεπτά στους 4 C. Τα κύτταρα αιωρούνται σε 16 ml (που αντιστοιχούν στο 1/3 του όγκου της καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος που αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaCl2, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικού καλίου ph 7.5, όπου και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στις 3000 x g και τα κύτταρα αιωρούνται σε 4 ml του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος (1/12.5 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρημα που προκύπτει μοιράζεται σε κλάσματα των 200 μl και εμβαπτίζεται σε λουτρό που αποτελείται από ξηρό πάγο/αιθανόλη για μικρό χρονικό διάστημα. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετό χρονικό διάστημα.

99 95 B.32. Μετασχηματισμός κυττάρων Ε. coli (202) Ο μετασχηματισμός κυττάρων E. coli με το κλωνοποιημένο σε πλασμιδιακούς φορείς DNA γίνεται με τη χρήση 2 διαφορετικών τεχνικών ανάλογα με το αν χρησιμοποιούνται κύτταρα XL1/B ή TOP-10. Στην περίπτωση χρήσης βακτηριακών κυττάρων XL1/B, το αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων (200 μl) στο οποίο έχουν προστεθεί λίγα μl από το DNA που θέλουμε να εισαγάγουμε, αφήνονται στον πάγο για 60 λεπτά και στο τέλος του χρονικού διαστήματος επωάζονται για 2 λεπτά στους 37 C. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται κύτταρα TOP-10 μετά την προσθήκη του DNA αφήνονται στον πάγο για 30 λεπτά και υπόκεινται σε θερμικό σοκ για 2 λεπτά στους 42 C. Ακολουθεί η προσθήκη 500 μl υγρού θρεπτικού υλικού LB και επώαση στους 37 C για 20 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση 1 λεπτού στις 5000 x g αφαιρείται το μεγαλύτερο μέρος του υπερκειμένου και γίνεται αιώρηση του ιζήματος των κυττάρων με το υπερκείμενο που εναπομένει. Το αιώρημα απλώνεται με τον ίδιο τρόπο στα προαναφερθέντα τριβλία. Τα τριβλία επωάζονται στους 37 C για ώρες ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα που περιέχουν τους ανασυνδιασμένους, με το ξένο DNA, πλασμιδιακούς φορείς. Η επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων γίνεται παρουσία της αμπικιλλίνης διότι οι ανασυνδυασμένοι πλασμιδιακοί φορείς περιέχουν το γονίδιο αντίστασης στο αντιβιοτικό αυτό. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τριβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και αναπτύσσονται εκ νέου σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αμπικιλλίνης ώστε είτε να απομονώσουμε το πλασμιδιακό DNA, είτε να προχωρήσουμε σε έκφραση της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης. B.33. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση (203) Η απομόνωση και ο καθαρισμός του πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα περιλαμβάνει τρία στάδια: την ανάπτυξη της μεταμορφωμένης βακτηριακής καλλιέργειας, τη συλλογή και λύση των κυττάρων και το καθαρισμό του πλασμιδιακού DNA. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας γίνεται με επώαση των βακτηρίων στους 37 C για 16 ώρες σε υγρό θρεπτικό μέσο LB παρουσία του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη (100 μg/ml). Η συλλογή των βακτηριακών κυττάρων γίνεται με φυγοκέντρηση στις 4000 x g για 10 λεπτά και ακολουθεί η αλκαλική λύση τους σύμφωνα με τα εξής. Το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 200 μl

100 96 διαλύματος GTE (50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8.0) και στο αιώρημα προστίθεται ο διπλάσιος όγκος (400 μl) διαλύματος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 300 μl ψυχρού διαλύματος 3 Μ οξικού καλίου και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις x g. Στο υπερκείμενο που παραλαμβάνεται γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 0.7 όγκου ισοπροπανόλης και παραμονή στους -20 C για 30 λεπτά. Το ίζημα που προκύπτει, αιωρείται σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) παρουσία RNase A (20 μg/ml) και το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 20 λεπτά. Το DNA εκχυλίζεται με την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορμίου. Στην υδατική στοιβάδα που απομονώνεται μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών στις x g, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 2.5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αμμωνίου. Το DNA διαλύεται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου ddh2o και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του. B.34. Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το kit Qiagen-tip 500 Για την απομόνωση και καθαρισμό πλασμιδιακού DNA με το kit Qiagen-tip 500 ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο. Βακτηριακή καλλιέργεια 500 ml LB που περιέχει αμπικιλλίνη (100 μg/ml) αφήνεται να αναπτυχθεί για 16 ώρες στους 37 C και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στις 5000 x g για 10 λεπτά. Το ίζημα που απομένει μετά από την απόχυση του υπερκειμένου αιωρείται σε 10 ml διαλύματος Ρ1 (50 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8.0) στο οποίο έχουμε προσθέσει 100 μg/ml RNase A και στη συνέχεια προστίθεται 10 ml διαλύματος Ρ2 (200 mm NaOH, 1% SDS) με απαλή ανάδευση ώστε να καταστεί ομογενές. Μετά από διάστημα 5 λεπτών σε θερμοκρασία περιβάλλοντος προστίθενται 10 ml ψυχρού διαλύματος P3 (3 M οξικό κάλιο ph 5.5) και μετά από απαλή ανακίνηση αφήνεται για 20 λεπτά στους 4 C. Η φυγοκέντρηση που ακολουθεί διαρκεί 30 λεπτά στις x g ενώ συγχρόνως γίνεται και η εξισορρόπηση της στήλης tip 500 με 10 ml διαλύματος QBT (750 mm NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, 0.15% Triton X-100, ph 7.0). Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης αφού απομακρυνθεί με προσοχή από το σωλήνα φυγοκέντρησης ώστε να μην παραληφθεί συγχρόνως το κολλώδες ίζημα, διαβιβάζεται από τη στήλη tip 500. Μετά τη διέλευση του υπερκειμένου από τη στήλη, γίνεται πλύση της στήλης, δύο φορές, με 30 ml διαλύματος QC (1.0 M NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, ph 7.0), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν προσμίξεις από την προηγούμενη κατεργασία. Η έκλουση του DNA γίνεται με τη διέλευση

101 97 διαλύματος QF (1.25 Μ NaCl, 50 mm Tris-ΗCl, 15% αιθανόλη, ph 8.5). Αφού συλλεχθεί το σύνολο του παραπάνω διαλύματος γίνεται κατακρήμνιση του DNA προσθέτοντας 0.7 όγκους ισοπροπανόλης και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις x g για 30 λεπτά. Μετά από προσεκτική απόχυση του υπερκειμένου γίνεται μια σύντομη πλύση με 5 ml 70% αιθανόλη και το ίζημα που παραλαμβάνεται μετά από νέα φυγοκέντρηση στις x g διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8.0). Η περιεκτικότητα του διαλύματος σε DNA προσδιορίζεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm και το παρασκεύασμα φυλάσσεται στους -20 C. B.35. Εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του DNA (204) Η χρησιμοποιούμενη τεχνική για την εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του DNA είναι η μέθοδος των διδεοξυνουκλεοτιδίων ή ενζυμική μέθοδος κατά Sanger. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στον τερματισμό, μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης, από την DNA πολυμεράση, με τη χρήση τριφωσφορικών διδεοξυριβονουκλεοζιτών (ddntp s). Η DNA πολυμεράση καταλύει την ενσωμάτωση των μορίων αυτών στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα του DNA, αλλά η έλλειψη του 3 υδροξυλίου στη διδεοξυριβόζη εμποδίζει τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού με επόμενα dntp s σταματώντας ουσιαστικά την επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας του DNA. Κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε στηρίζεται στο T7 sequencing kit της εταιρίας Pharmacia Biotech. Σύμφωνα με αυτό η συγκέντρωση του εκμαγείου ρυθμίζεται ώστε να περιέχονται 2 μg DNA σε 32 μl νερού. Με την προσθήκη 8 μl ΝαΟΗ 2 Μ και επώαση 10 λεπτών σε θερμοκρασία περιβάλλοντος γίνεται η αποδιάταξη των κλώνων του DNA σε μονόκλωνα μόρια. Η κατακρήμνιση των μορίων του DNA γίνεται με την προσθήκη στο διάλυμα 7 μl οξικού νατρίου 3 Μ (ph 4.8), 4 μl ddh2o και 120 μl απόλυτης αιθανόλης και παραμονή στους -20 C για 15 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση 15 λεπτών στις x g γίνεται μια σύντομη πλύση του ιζήματος με 70% αιθανόλη και επαναφυγοκέντρηση. Το τελικό ίζημα που προκύπτει διαλύεται σε 10 μl ddh2o και γίνεται προσθήκη 2 μl εκκινητή 0.13 μg/μl και 2 μl διαλύματος υβριδισμού 10x (1 M Tris-Cl ph 7.6, 100 mm MgCl2, 160 mm DTT). Το διάλυμα ανακινείται απαλά και επωάζεται στους 65 C για 5 λεπτά, στους 37 C για 10 λεπτά και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 5 λεπτά. Η σήμανση των νεοσυντιθέμενων κλώνων γίνεται με προσθήκη στο διάλυμα υβριδισμού 3 μl μίγματος επισήμανσης (1.375 μμ από dctp, dgtp, dttp και mm

102 98 NaCl), 2 μl [α-35s] datp, και 2 μl Τ7 DNA πολυμεράσης (1.8 u/μl) αραιωμένης σε διάλυμα που περιέχει 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 5 mm DTT, 100 μg BSA/ml και 5% γλυκερόλη. Το μίγμα αφήνεται να επωαστεί για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ενώ συγχρόνως προεπωάζονται στους 37 C τα τέσσερα διαφορετικά σωληνάκια που περιέχουν το μίγμα των τεσσάρων δεοξυνουκλεοτιδίων και ένα διαφορετικό διδεοξυνουκλεοτίδιο το καθένα. Μεταφέροντας από 4.5 μl του αρχικού δείγματος, όπου έγινε η επισήμανση, σε κάθε σωληνάκι που περιέχει το αντίστοιχο διδεοξυνουκλεοτίδιο και επώαση στους 37 C για 5 λεπτά γίνεται η περαιτέρω επιμήκυνση και ο τερματισμός της αντιγραφής των διαφορετικών τμημάτων DNA. Έτσι προκύπτουν τμήματα DNA διαφορετικού μήκους τα οποία έχουν το ίδιο 5 άκρο (εκκινητή) αλλά διαφορετικό 3 άκρο το οποίο καθορίζεται από το διδεοξυνουκλεοτίδιο που ενσωματώθηκε. Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη 5 μl διαλύματος τερματισμού (0.3% Bromophenol Blue και Xylene Cyanol FF, 10 mm EDTA ph 7.5, 97.5% απιονισμένο φορμαμίδιο). Μετά από θέρμανση στους 100 C των τεσσάρων αντιδράσεων ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (6% ακρυλαμίδιο, 0.3% bis-ακρυλαμίδιο, 8 Μ ουρία), σε τέσσερις παράλληλες διαδρομές, υπό σταθερή τάση 1300 V, για 4-6 ώρες. Τόσο το ρυθμιστικό διάλυμα της πηκτής όσο και το διάλυμα της ηλεκτροφόρησης είναι το TBE (0.089 Tris-βορικό, βορικό οξύ, Μ EDTA). Η στερέωση του πηκτώματος γίνεται σε 5% οξικό οξύ, 5% ισοπροπανόλη και ακολουθεί αυτοραδιογραφία για 16 ώρες. Με ανάγνωση των ζωνών (διαβάζοντας από κάτω προς τα πάνω) που αποτυπώνονται στο film αυτοραδιογραφίας αποκαλύπτεται η ακολουθία του τμήματος DNA που εξετάζεται. B.36. Παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων (205) Η ύπαρξη πλασμιδιακών φορέων, που περιλαμβάνουν στο μόριο τους χαρακτηριστικά βακτηριοφάγων επιτρέπει την παραγωγή αντιγράφων μονόκλωνου DNA (ssdna) του τμήματος που έχει κλωνοποιηθεί στους φορείς αυτούς, με τη βοήθεια κατάλληλων φάγων. Τέτοιου είδους πλασμιδιακοί φορείς φέρουν στο μόριο τους όλες τις αλληλουχίες των γονιδίων που απαιτούνται για την έναρξη και τον τερματισμό της σύνθεσης ιϊκού DNA, τη μορφογένεση σωματιδίων βακτηριοφάγων καθώς και γονίδιο που τους προσδίδει αντίσταση σε αντιβιοτικό. Με βάση τα παραπάνω όταν τα βακτηριακά κύτταρα-ξενιστές που έχουν μεταμορφωθεί με τα πλασμιδία αυτά, επιμολυνθούν με κατάλληλο φάγο, θα παραχθούν

103 99 αντίγραφα μονόκλωνου DNA τα οποία θα πακεταριστούν στους βακτηριοφάγους. Το παραγόμενο ssdna μπορεί να υποστεί καθαρισμό και να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο για διάφορες διεργασίες, όπως η in vitro ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Με τη μέθοδο αυτή παραγωγής μονόκλωνου DNA, μόνο ο ένας κλώνος του ενσωματωμένου στο πλασμίδιο DNA θα πακεταριστεί στο φάγο. Εάν είναι επιθυμητή η ύπαρξη και των δύο κλώνων ως ssdna, θα πρέπει το τμήμα του ξένου DNA να κλωνοποιηθεί και προς στις δύο κατευθύνσεις, ώστε να σχηματιστούν βακτηριοφάγοι που θα περιέχουν είτε τον έναν είτε τον άλλο κλώνο. Στην παρούσα εργασία η μέθοδος παρασκευής μονόκλωνου DNA ακολουθεί τα εξής στάδια. Επιλέγονται από τρυβλίο βακτηριακές αποικίες που έχουν μεταμορφωθεί με τον πλασμιδιακό φορέα (p-alter1) που φέρει κλωνοποιημένο το ξένο DNA (SRPK1). Στη συνέχεια 2 ml θρεπτικού υλικού TYP (1.6% w/v Bacto-tryptone, 1.6% w/v yeast extract, 0.5% w/v NaCl, 0.25% w/v K2HPO4) που περιέχουν και το αντιβιοτικό επιλογής (12.5 μg/ml τετρακυκλίνη) εμβολιάζονται με τις αντίστοιχες αποικίες και επωάζονται υπό ανακίνηση στους 37 C για 16 ώρες. Με 100 μl από την καλλιέργεια αυτή εμβολιάζονται 5 ml θρεπτικού υλικού TYP (12.5 μg/ml τετρακυκλίνη) και η επώαση που ακολουθεί γίνεται υπό έντονη ανάδευση σε κωνική φιάλη των 250 ml για 30 λεπτά στους 37 C. Η βακτηριακή καλλιέργεια επιμολύνεται με 40 μl αιωρήματος του φάγου R408 (Promega) και συνεχίζεται η επώαση για 6-16 ώρες στους 37 C. Η ύπαρξη K2HPO4 στο θρεπτικό υγρό της καλλιέργειας, καθώς και η επώαση για όσο το δυνατόν περισσότερες ώρες βελτιώνουν την απόδοση σε μονόκλωνο DNA. Η συλλογή των βακτηριοφάγων γίνεται στο υπερκείμενο που προκύπτει από δύο συνεχόμενες φυγοκεντρήσεις των 15 λεπτών η κάθε μία στα x g. Για να αυξηθεί η καθαρότητα του ssdna γίνεται επώαση του υπερκειμένου για 15 λεπτά στους 37 C παρουσία DNase I και RNase A. Οι φάγοι παραλαμβάνονται από το υπερκείμενο με προσθήκη 0.25 όγκων διαλύματος κατακρημνίσεως φάγων (3.75 Μ οξικό αμμώνιο, 20% πολυαιθύλενογλυκόλη, ph 7.5), παραμονή για 30 λεπτά στους 4 C και φυγοκέντρηση για 15 λεπτά στα x g. Μετά την προσεκτική απομάκρυνση όλου του υπερκειμένου, το ίζημα αιωρείται σε 400 μl ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8.0) και το αιώρημα μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου. Η λύση των φάγων επιτυγχάνεται με την προσθήκη 400 μl χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (24:1), έντονη ανακίνηση για 1 λεπτό και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα x g. Η υδατική στοιβάδα που περιέχει το DNA του φάγου μεταφέρεται σε νέο σωλήνα όπου το DNA εκχυλίζεται με φαινόλη:χλωροφόρμιο:ισοαμυλική αλκοόλη (25:24:1) σε ΤΕ και μετά από έντονη ανακίνηση 1 λεπτού φυγοκεντρείται στα x g για 5 λεπτά. Η διαδικασία της εκχύλισης

104 100 επαναλαμβάνεται ώστε να παραληφθεί όσο το δυνατόν καθαρότερο ssdna. Στην υδατική στοιβάδα γίνεται προσθήκη 0.5 όγκων από οξικό αμμώνιο 7.5 Μ, 2 όγκων απόλυτης αιθανόλης και αφήνεται στους -20 C για 30 λεπτά ώστε να κατακρημνιστεί το DNA. Μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών στα x g το ίζημα πλένεται με 70% αιθανόλη και επαναφυγοκεντρείται. Το DNA διαλύεται σε 20 μl ddh2o και η απόδοση σε ssdna εκτιμάται με ηλεκτροφόρηση 2 μl από το διάλυμα σε πηκτή αγαρόζης 1%. Οι κύριες ζώνες που εμφανίζονται είναι δύο, μία για το μονόκλωνο DNA και μία το DNA του φάγου. Επίσης μερικές φορές μπορεί να εμφανιστούν και υπολείμματα από το χρωμοσωμικό DNA και RNA των βακτηρίων. B.37. Σημειακή in vitro ολιγονουκλεοτιδίου-κατευθυνόμενη μετάλλαξη (205, 206) Η μέθοδος στηρίζεται στον υβριδισμό ενός συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου συμπληρωματικού ως προς το μονόκλωνο εκμαγείο στο οποίο γίνεται η σημειακή μετάλλαξη. Το ολιγονουκλεοτίδιο φέρει τη μετάλλαξη στο κέντρο του μορίου, ενώ τα άκρα του παραμένουν συμπληρωματικά ως προς το εκμαγείο. Οι συνθήκες πραγματοποίησης της αντίδρασης είναι τέτοιες, ώστε να ευνοούν τον εξειδικευμένο υβριδισμό του ολιγονουκλεοτιδίου στην επιθυμητή περιοχή του γονιδίου. Η επιμήκυνση της αλυσίδας του DNA γίνεται με εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο από μία DNA πολυμεράση, ενώ η δημιουργία του φωσφοδιεστερικού δεσμού στο χάσμα μεταξύ εκκινητή και κλώνου γίνεται από μία λιγάση. Η επιλογή των μεταλλαγμάτων γίνεται με τη χρήση αντιβιοτικού, στο οποίο ο πλασμιδιακός φορέας προσδίδει ανθεκτικότητα. Για να παραχθούν δίκλωνα μεταλλαγμένα μόρια DNA, στα βακτηριακά κύτταρα, τα οποία μεταμορφώνονται με το DNA που φέρει τη μετάλλαξη μόνο στον ένα κλώνο, πρέπει να λείπουν τα γονιδιακά στοιχεία που προκαλούν την in vivo επιδιόρθωση των μεταλλάξεων (κύτταρα ES 1301 muts). Οι δίκλωνοι μεταλλαγμένοι κλώνοι που παραλαμβάνονται από αυτά, μεταμορφώνουν βακτηριακά κύτταρα JM 109 τα οποία επιτρέπουν τη δημιουργία πολλών αντιγράφων πλασμιδιακού DNA. Ο έλεγχος για την ύπαρξη της μετάλλαξης στο γονίδιο γίνεται με την ενζυμική μέθοδο Sanger. Συγκεκριμένα στην εργασία χρησιμοποιείται το Altered SitesR II, in vitro mutagenesis system της εταιρίας Promega. Με βάση αυτό, το κλωνοποιημένο σε πλασμιδιακό φορέα palter1 γονίδιο της SRPK1 αφού έχει γίνει μονόκλωνο με τη βοήθεια φάγων, υφίσταται τη διαδικασία υβριδισμού με τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια. Τα ολιγονουκλεοτίδια των

105 101 σημειακών μεταλλάξεων της SRPK1 σχεδιάστηκαν με βάση τις πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης της, από την κινάση πρωτεϊνών CKII από προγράμματα Η/Υ στο διαδίκτυο. Ser37 Ala37: 5 P TCA CTC TCA GCG TGG GGA GCA 3 Ser51 Ala51: 5 P TCA TCA TCA GCT CCC AGA ATC 3 Ser222 Ala222: 5 P TCA TTC ACT GCC AAT AAG ATG 3 Ser311 Gly311: 5 P TCA ACA GGA CCC TCT GAT TCT 3 Ser369 Gly369: 5 P TCA TTA TTA CCG TTC TGA GTA 3 Ser436 Ala436: 5 P TCA CTG AAT GCC TGA CCT ACA 3 Ser555 Ala555: 5 P TCT TCC CCT GCA TGA GGT TCA 3 Ser618 Ala618: 5 P TCT TCC TGA GCC CAC TCA TAC 3 Η αντίδραση υβριδισμού εκτελείται με την προσθήκη 2 μl ssdna (0.1 μg) ως εκμαγείο, 1 μl ολιγονουκλεοτιδίου μετάλλαξης (30 ng/μl), 1 μl Ampicillin Repair Oligo (2.2 ng/μl) το οποίο επαναφέρει την ανθεκτικότητα του πλασμιδίου στην αμπικιλλίνη, και 2 μl 10x διαλύματος υβριδισμού (200 mm Tris-Cl, 100 mm MgCl2, 500 mm NaCl ph 7.5) σε 14 μl ddh2o. Το μίγμα της αντίδρασης αφήνεται για 5 λεπτά στους 75 C σε υδατόλουτρο και με απομάκρυνση του σκεύους της επώασης από την πηγή θερμότητας γίνεται αργή ψύξη του μίγματος σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο τρόπος αυτός επιτρέπει τον εξειδικευμένο υβριδισμό του ολιγονουκλεοτιδίου στο εκμαγείο. Ακολουθεί η σύνθεση του μεταλλαγμένου κλώνου, προσθέτοντας στο μίγμα της αντίδρασης υβριδισμού 3 μl 10x διαλύματος σύνθεσης (100 mm Tris-Cl, 5 mm dntps, 10 mm ATP, 20 mm DTT ph 7.5), 1.2μl T4 DNA polymerase (BioLabs), 1 μl T4 DNA ligase (BioLabs) και 4.8 μl ddh2o. Το διάλυμα επωάζεται για 90 λεπτά στους 37 C. Από το διάλυμα σύνθεσης του μεταλλαγμένου κλώνου αφαιρούνται 15 μl με τα οποία μεταμορφώνονται βακτηριακά κύτταρα ES 1301 muts. Αυτά αναπτύσσονται σε τρυβλία LB/άγαρ με 100 μg/ml αμπικιλλίνη και μετά από επιλογή και ανάπτυξη των αποικιών σε υγρό θρεπτικό υλικό LB με αμπικιλλίνη (100 μg/ml) γίνεται απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση. Χρησιμοποιώντας 1 μl του DNA αυτού, μεταμορφώνονται κύτταρα JM 109 και αφού αναπτυχθούν σε τρυβλία LB/άγαρ (100 μg/ml αμπικιλλίνη) γίνεται επιλογή μερικών αποικιών και απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Με εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων διαπιστώνεται η ύπαρξη θετικού

106 102 μεταλλαγμένου κλώνου σε κάποια αποικία. Ο μεταλλαγμένος κλώνος της SRPK1 κλωνοποιείται στους πλασμιδιακούς φορείς pgex-2t και pflag-cmv-2 για την έκφραση των κλώνων ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτήρια και για την παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων αντίστοιχα. Στην περίπτωση που είναι επιθυμητή η ύπαρξη περισσοτέρων από μίας μεταλλάξεων σε διαφορετικές θέσεις στο γονίδιο, ακολουθείται η ίδια διαδικασία με μόνη διαφορά την προσθήκη των επιπλέον μεταλλαγμένων ολιγονουκλεοτιδίων με σύγχρονη αφαίρεση ddh2o από την αντίδραση υβριδισμού. Σχήμα Β.1. Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας εισαγωγής σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της SRPK1 με το in vitro σύστημα Altered Sites II της εταιρίας Promega.

107 103 B.38. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) (207) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα με υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους κατάλληλους προαγωγείς που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης μ αυτή. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με στήλη αγχιστείας που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το εκχύλισμα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST με τη γλουταθειόνη, με αποτέλεσμα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται με την προσθήκη διαλύματος γλουταθειόνης σε περίσσεια και εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτημα να γίνεται σε πολύ ήπιες συνθήκες χωρίς να υπάρχει κίνδυνος αλλαγών στη δομή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν με τον τρόπο αυτό είναι το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της Λαμίνης Β (GST-wtNt), η μεταλλαγμένη μορφή του χωρίς την αλληλουχία αργινίνης/σερίνης (GST-ΔRS) και η SR κινάση πρωτεϊνών 1 (GST-SRPK1) με τα μεταλλάγματα της σε πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση καζεΐνης 2. Ο πλασμιδιακός φορέας στον οποίο είναι κλωνοποιημένα τα παραπάνω γονίδια είναι ο pgex2t (Pharmacia) που φέρει το γονίδιο της GST. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα (XL1/B) που έχουν μεταμορφωθεί με τον ανασυνδιασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τρυβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Από την καλλιέργεια που προκύπτει αφαιρούνται 10 ml με τα οποία εμβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού LB που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων γίνει ίση με Α590= Τη δεδομένη χρονική στιγμή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG που ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες κυτταρικές λειτουργίες, καθώς και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις

108 104 πρωτεολυτικών ενζύμων. Η επώαση συνεχίζεται για ώρες και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση 15 λεπτών στις 4000 rpm. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 8 ml διαλύματος PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na2HPO4, 0.2 gr/l KH2PO4, 1% Triton X-100, 0.1% β-μερκαπταιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρημα σε υπέρηχους για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά, μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά στις 8500 rpm και λαμβάνεται το υπερκείμενο εκχύλισμα των πρωτεϊνών. Το υπερκείμενο αναμιγνύεται με το αιώρημα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C, ώστε να δεσμευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις 3000 rpm και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 λεπτά στους 4 C υπό ανάδευση. Στους κόκκους της στήλης που λαμβάνονται μετά από φυγοκέντρηση 2 λεπτών στις 3000 rpm, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 λεπτών η κάθε μία με διάλυμα που περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris-Cl ph 8.0. Τα εκλούσματα λαμβάνονται με φυγοκέντρηση 2 λεπτών στις 3000 rpm και το ληφθέν υπερκείμενο που περιέχει την πρωτεΐνη σύντηξης φυλάσσεται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης μετά από κάθε χρήση αναγεννάτε με διαδοχικές πλύσεις σε όξινο (0.1 M CH3COONa, 0.5 M NaCl, ph 4.5) και βασικό (0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-Cl, ph 8.5) διάλυμα, τρεις φορές στους 4 C για 30 λεπτά στο κάθε διάλυμα. Η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυμα PBST. B.39. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με 6 Ιστιδίνες (208) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται εναλλακτικά για την έκφραση πρωτεϊνών σε βακτρηριακά κύτταρα και τον εύκολο καθαρισμό τους. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, την έκφραση της οποίας επιθυμούμε, κλωνοποιείται σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα ο οποίος φέρει εκτός των χαρακτηριστικών εκείνων που εξυπηρετούν την παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγάλες ποσότητες και μια αλληλουχία η οποία κωδικοποιεί έξι συνεχόμενες ιστιδίνες. Έτσι η πρωτεΐνη θα εκφραστεί με μια «ουρά» έξι ιστιδινών στο ένα της άκρο. Η μικρή αυτή αλληλουχία εξυπηρετεί τον εύκολο καθαρισμό της πρωτεΐνης με μια στήλη Ni+2-αγαρόζης. Η ακολουθία των 6 ιστιδινών έχει τη δυνατότητα να δεσμεύεται στη στήλη δημιουργώντας, μέσω των ιμιδαζολίων, δεσμούς συναρμογής με το δισθενές κατιόν του νικελίου. Παράλληλα στο ρυθμιστικό διάλυμα συνυπάρχει και μια μικρή συγκέντρωση ιμιδαζολίου ώστε να αποφεύγονται μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις με τα

109 105 συστατικά του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται με την προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου το οποίο συναγωνίζεται με τις έξι ιστιδίνες για τις θέσεις δέσμευσης στο Ni+2. Η πρωτεΐνη που παρασκευάστηκε με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι η p32/p34, το γονίδιο της οποίας ήταν κλωνοποιημένο στο φορέα κλωνοποίησης pet-15b και ήταν προσφορά του Dr. Göran Akusjärvi (Department of Medical Biology and Microbiology, BMC, Uppsala Univ., Sweden). Κύτταρα BL21 μεταμορφωμένα με τον ανασυνδιασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό L.B./άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τρυβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού L.B. (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Με 10 ml από την παραπάνω καλλιέργεια εμβολιάζονται 500 ml L.B. (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και επωάζονται υπό ανακίνηση στους 37 C έως ότου παρουσιάσει απορρόφηση Α590= Στην καλλιέργεια προστίθενται 5 mm IPTG και η θερμοκρασία επώασης μειώνεται στους 28 C. Μετά την πάροδο 2 ωρών επώασης της καλλιέργειας υπό ανακίνηση, γίνεται φυγοκέντρηση των κυττάρων για 20 λεπτά στις 4500 rpm και μετά την απόχυση του υπερκειμένου, τα κύτταρα αιωρούνται σε 8 ml ρυθμιστικού διαλύματος 50 mm Na2HPO4 ph 8.0, 300 mm NaCl και 5 mm ιμιδαζολίου. Το αιώρημα ψύχεται σε λουτρό ξηρού πάγου/αλκοόλης και αφήνεται να ξεπαγώσει σε θερμοκρασία 4 C ώστε να υποβοηθηθεί η ρήξη των μεμβρανών, η οποία γίνεται με υπερήχηση του αιωρήματος 5 φορές, για 20 δευτερόλεπτα η καθεμία, μεσολαβώντας διαστήματα των 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να μην υπερθερμανθεί το δείγμα. Το δείγμα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά στις 8500 rpm και παραλαμβάνεται το υπερκείμενο. Η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης στη στήλη Ni+2αγαρόζης γίνεται υπό ανακίνηση στους 4 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί μία πλύση της στήλης για 10 λεπτά στους 4 C με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που έγινε η αιώρηση των κυττάρων και 2 πλύσεις των 10 λεπτών στην ίδια θερμοκρασία έχοντας αυξήσει τη συγκέντρωση του ιμιδαζολίου στα 50 mm. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με την ανακίνηση της στήλης για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 1 ml διαλύματος 50 mm Na2HPO4 ph 8.0, 300 mm NaCl και 300 mm ιμιδαζολίου, δύο συνεχόμενες φορές. Από τα υπερκείμενα προτού τα φυλάξουμε στους 20 C, παραλαμβάνονται δείγματα των 10 μl ώστε μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250 να αποφανθούμε για την απόδοση της έκφρασης της πρωτεΐνης.

110 106 B.40. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων (209) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων ως πρωτεΐνες σύντηξης με χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιμες. Σχήμα Β.2. Σχηματική αναπαράσταση της παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων Η παροδική επιμόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή μίξη του πλασμιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυμα CaCl2 με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσμα της ανάμιξης είναι η δημιουργία κατακρημνισμάτων DNA με φωσφορικό ασβέστιο. Το κατακρημνίσματα αυτά διαπερνούν την κυτταροπλασματική μεμβράνη πιθανώς με ενδοκύττωση. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις μεταβολές του ph (βέλτιστο ph ) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εμπορικά kit καθαρισμού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρμογή της μεθόδου). Τα χαρακτηριστικά της μεθόδου είναι η εντόπιση του κλωνοποιημένου πλασμιδιακού φορέα εκτός του γενώματος των κυττάρων, καθώς και η ανίχνευση και παραμονή του προϊόντος του κλωνοποιημένου γονιδίου για χρονικό διάστημα 1-4 ημερών. Επίσης σε κάθε κυτταρική διαίρεση μόνο τα μισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασμιδιακού DNA που εισάχθηκε κατά την επιμόλυνση.

111 107 Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται τα ανθρώπινα 293Τ κύτταρα, τα οποία επιμολύνονται παροδικά με τα γονίδια της SRPK1, των μεταλλαγμάτων της και της SRPK1a κλωνοποιημένα στον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιμόλυνση πρέπει να καταλαμβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλύου. Το διάλυμα του DNA με το CaCl2 (250 mm CaCl2, 20 μg/ml πλασμιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 μg/ml περιλαμβάνουν το δραστικό κλάσμα του DNA που φέρει το κλωνοποιημένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος HEPES-φωσφορικών (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na2HPO4 ph 7.1), το μίγμα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως απομακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1ml του αιωρήματος DNA-φωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τρυβλίο της καλλιέργειας. Τα τρυβλία αφήνονται για 20 λεπτά με παροδική ανακίνηση κάθε 10 λεπτά. Στο τρυβλίο προστίθενται 4 ml DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)/ 10% v/v FCS (Fetal Calf Serum-Εμβρυϊκός ορός βοδιού) με 5 μl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυμα που διασπούν το DNA, καθώς και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Τα τρυβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία CO2. Μετά το πέρας τεσσάρων ωρών τα 5 ml του υγρού που έγινε η επιμόλυνση αφαιρούνται και προστίθενται εκ νέου 10 ml από το θρεπτικό υγρό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί με επώαση στους 37 C σε ατμόσφαιρα CO2 για 24 ώρες και ακολουθεί ακόμη ένας κύκλος αφαίρεσης-προσθήκης θρεπτικού μέσου και επώασης για άλλες 24 ώρες. Με τη συμπλήρωση συνολικά 48 ωρών από τη στιγμή της επιμόλυνσης τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης. Ακολούθως προσθέτουμε 200 μl στο τρυβλίο των 100 mm από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 μg/ml απροτινίνη και 1 mm PMSF) και τα κύτταρα αφαιρούνται από την επιφάνεια του τρυβλίου με τη βοήθεια σπάτουλας. Τα κύτταρα αφήνονται εν αιώρηση για 30 λεπτά στους 4 C στο διάλυμα λύσης και κατόπιν διαβιβάζονται συνεχόμενα μέσα από σύριγγα πολύ στενής διαμέτρου, ώστε να διαρηχθούν εντελώς οι κυτταρικές μεμβράνες. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 15 λεπτά στους 4 C και συλλέγεται το υπερκείμενο. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυλάσσεται στους 70 C και η ανίχνευση της παραγόμενης πρωτεΐνης γίνεται με ηλεκτροφόρηση 10 μl από το εκχύλισμα, κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ανοσοανίχνευση με το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG αλληλουχία.

112 108 Β.41. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού (210, 211) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πρωτεϊνών σε γεννητικά κύτταρα τα οποία έχουν απομονωθεί από το σπερματοφόρο σωληνίσκο ποντικού. Η απομόνωση των κυττάρων γίνεται σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφουν οι Parvinen και Vanha-Perttula (210). Η τεχνική έχει ως βάση το γεγονός ότι τα στάδια της σπερματογένεσης μπορούν να αναγνωριστούν σε πρόσφατα απομονωμένους σωληνίσκους με τη βοήθεια στερεομικροσκοπίου. Ο σωληνίσκος παρουσιάζει διαφορετικά επίπεδα απορρόφησης του διερχόμενου φωτός ανάλογα με το στάδιο της διαφοροποίησης των κυττάρων που βρίσκονται σ αυτόν. Έτσι σύμφωνα με το μέγεθος του πυρήνα, του βαθμού συμπύκνωσης της χρωματίνης και της μορφολογικής ανάπτυξης του ακροσώματος των κυττάρων, ο σωληνίσκος παρουσιάζει περιοχές διαφορετικής φωτεινότητας. Σύμφωνα με τα παραπάνω, στα στάδια I-VI παρουσιάζονται σκοτεινές κηλίδες πάνω στο φωτεινό υπόβαθρο του σωληνίσκου, το τμήμα των σταδίων VII-VIII απορροφά σχεδόν πλήρως το φως και εμφανίζεται ως μια σκούρα συνεχής σκοτεινή περιοχή, ενώ στα στάδια IX-XII η απορρόφηση είναι πολύ ασθενής και ο σωληνίσκος παρουσιάζεται διαπερατός από το φως. Μεγαλύτερη ακρίβεια στην απομόνωση συγκεκριμένων σταδίων είναι δυνατή με τη χρήση μικροσκοπίας phase-contrast, όπου το κάθε στάδιο αναγνωρίζεται χωριστά ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων που περιέχονται στο επιθήλιο. Ο ανοσοφθορισμός (211) βασίζεται στην αλληλεπίδραση των κατάλληλων αντισωμάτων με τα αντίστοιχα αντιγόνα τους που βρίσκονται στις διάφορες υποκυτταρικές περιοχές των απομονωμένων γεννητικών κυττάρων. Περαιτέρω επεξεργασία με δεύτερα αντισώματα, τα οποία φέρουν συζευγμένες φθορίζουσες ομάδες επιτρέπει τον εντοπισμό των πρωτεϊνών στα κύτταρα. Ο φθορισμός επιτυγχάνεται με την επίδραση φωτός κατάλληλου μήκους κύματος, το οποίο προσπίπτει κάθετα στο επίπεδο των δειγμάτων. Η παρατήρηση γίνεται με τη χρήση μικροσκοπίου το οποίο φέρει κατάλληλους φακούς και φίλτρα απορρόφησης του φωτός. Σχήμα Β.3. Σχηματική αναπαράσταση των σταδίων της σπερματογένεσης σε σωληνίσκο όρχεως ποντικού όπως αυτός εμφανίζεται σε στερεομικροσκόπιο.

113 109 Αναλυτικότερα η διαδικασία που ακολουθείται στην παρούσα εργασία είναι η εξής. Όρχεις ενηλίκου ποντικού αφού τους αφαιρεθεί το εξωτερικό υμένιο εμβαπτίζονται σε τρυβλίο που περιέχει διάλυμα PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na2HPO4, 0.2 gr/l KH2PO4). Αυτό τοποθετείται κάτω από το φακό στερεομικροσκοπίου και με τη βοήθεια λαβίδας ευθυγραμμίζονται οι σωληνίσκοι. Μετά την αναγνώριση των σταδίων VII και VIII αποκόπτονται και τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρο πλάκα η οποία είχε επεξεργαστεί προηγουμένως με διάλυμα πολύ-λυσίνης 100 μl/ml για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Με τη βοήθεια phase contrast μικροσκοπίας βρίσκεται το ακριβές στάδιο της σπερματογένεσης και σημειώνεται στο πλακίδιο. Τα κύτταρα απλώνονται προσεκτικά στην αντικειμενοφόρο πλάκα και αφήνονται να προσκολληθούν σ αυτή για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα υφίστανται δύο πλύσεις των 10 λεπτών με PBS, 2 mm MgCl2 και στερεώνονται σε διάλυμα PBS, 4% παραφορμαλδεΰδη (PAF) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 15 λεπτά. Ακολουθούν δύο πλύσεις με διάλυμα PBS, 50 mm NH4Cl για 5 λεπτά και τα κύτταρα γίνονται διαπερατά με διάλυμα PBS, 0.2% Triton X-100 για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Τα κύτταρα πλένονται δύο φορές με διάλυμα PBS και επωάζονται με το πρώτο αντίσωμα (α-p32 ή α-lbr) για 45 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και αραίωση 1:100. Μετά από τρεις πλύσεις των 5 λεπτών με PBS ακολουθεί επώαση με το δεύτερο αντίσωμα Cy3 που φέρει τη φθορίζουσα ομάδα, για 30 λεπτά και αραίωση 1:500. Τα κύτταρα πλένονται τρεις φορές με διάλυμα PBS για 5 λεπτά και ακολουθεί επώαση με τη χρωστική ουσία DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) για τη χρώση του πυρήνα των κυττάρων, τέλος τα κύτταρα επικαλύπτονται με πλακίδια. Η λήψη των φωτογραφιών γίνεται σε μικροσκόπιο DMLB Leica με λάμπα HBO 100-W. Β.42. In situ υβριδισμός σε τομές όρχεων ποντικού (212) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την ανίχνευση συγκεκριμένων μορίων mrna σε ιστούς χρησιμοποιώντας ραδιοεπισημασμένους RNA ιχνηλάτες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η εντόπιση του mrna μιας πρωτεΐνης in situ στα κύτταρα κάποιου ιστού, δίνοντας πληροφορίες για το είδος των κυττάρων στα οποία εκφράζεται και τυχόν διαφορές στην κατανομή της πρωτεΐνης στα διάφορα στάδια ανάπτυξης. Ο ιστός δεν υποβάλλεται σε ακραίες συνθήκες ώστε τα μόρια του DNA να παραμένουν δίκλωνα αποφεύγοντας έτσι την αλληλεπίδραση με τον ιχνηλάτη. Σύμφωνα με την τεχνική ο ιστός στερεώνεται σε ήπιες

114 110 συνθήκες ώστε τα μόρια του RNA να παραμένουν εκτεθειμένα για να υβριδοποιηθούν όταν ο ιστός επωαστεί με το συμπληρωματικό RNA ιχνηλάτη. Συγκεκριμένα όρχεις που παραλαμβάνονται από ενηλικιωμένα ποντίκια στερεώνονται σε 4 % παραφορμαλδεΰδη (PAF)/PBS στους 4 C, αφυδατώνονται με αιθανόλη και μετά από επίδραση ξυλένιου τοποθετούνται σε παραφίνη. Από του όρχεις αυτούς παίρνονται τομές πάχους 0.8 mm που τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Η απομάκρυνση της παραφίνης γίνεται με επίδραση ξυλένιου, δύο πλύσεις των 5 λεπτών σε απόλυτη αιθανόλη και δύο πλύσεις σε αιθανόλη 95 %, καθώς και μία πλύση για 10 λεπτά σε PBS. Κατόπιν οι τομές κατεργάζονται με 4 % παραφορμαλδεΰδη (PAF), πρωτεϊνάση Κ (0.02 mg/ml), 4 % παραφορμαλδεΰδη (PAF), 0.1 Μ τριαιθανολαμίνη και αφυδάτωση σε αιθανόλη με ενδιάμεσες πλύσεις σε PBS. Ως εκμαγείο για την παρασκευή των RNA ιχνηλατών χρησιμοποιείται ένα τμήμα 860 bp στο φορέα κλωνοποίησης pbluescript SK+ το οποίο αποτελεί τα πρώτα 860 νουκλεοτίδια στην αλληλουχία της SRPK1 του ποντικού. Ο νοηματικός κλώνος του ιχνηλάτη συντίθεται χρησιμοποιώντας την Τ3 RNA πολυμεράση και το πλασμίδιο γίνεται γραμμικό με την ενδονουκλεάση περιορισμού KpnI, ενώ ο αντινοηματικός κλώνος συντίθεται με την Τ7 RNA πολυμεράση και το πλασμίδιο γίνεται γραμμικό με την ενδονουκλεάση περιορισμού XbaI. Οι ιχνηλάτες είναι ραδιενεργά επισημασμένοι με 35S (1 x 108 cpm / ml) και διαλύονται στο ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού (300 mm NaCl, 10 mm Tris-Cl ph 7.4, 10 mm φωσφορικό νάτριο, 5 mm EDTA, 100 mm DTT, 10 % θειϊκό δεξτράνιο, 50 % φορμαμίδιο, 2 mg/ml φικόλη και 2 mg/ml πολυβινυλπυρρολιδόνη), ζεσταίνονται στους 80 C, απλώνονται στις τομές και καλύπτονται με σιλικοναρισμένα πλακίδια. Ο υβριδισμός επιτυγχάνεται με επώαση 12 ωρών στους 55 C. Ακολουθούν επαναλαμβανόμενες πλύσεις ως εξής: 5x SSC και 10 mm DTT για 30 λεπτά στους 37 C, 50 % φορμαμίδιο και 2x SSC για 30 λεπτά στους 65 C, 0.5 M NaCl, 10 mm Tris-Cl ph 7.4 και 4 mm EDTA για 10 λεπτά στους 37 C, 0.5 M NaCl, 10 mm Tris-Cl ph 7.4, 5 mm EDTA και 0.02 mg/ml RNase A για 10 λεπτά στους 37 C, 2x SSC, 10 mm DTT και 50 % φορμαμίδιο για 15 λεπτά στους 37 C, 2x SSC για 15 λεπτά στους 37 C και 0.1x SSC για 15 λεπτά στους 37 C. Για μορφολογικές μελέτες οι τομές βάφονται με PAS-H, ενώ για την αυτοραδιογραφία οι τομές εμβαπτίζονται με Kodak NTB-2 σε 1:1 αραίωση με ύδωρ και εκτίθενται για 10 ημέρες σε film.

115 111 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΡΟΣ Α Γ.1. Καθαρισμός και χαρακτηρισμός της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) Γ.1.1. Έκφραση του αμινοτελικού τμήματος του υποδοχέα της λαμίνης Β ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt) καθώς και του μεταλλάγματος από το οποίο έχουν αφαιρεθεί οι επαναλαμβανόμενες ακολουθίες αργινίνης/σερίνης (GST-ΔRS) Το αμινοτελικό άκρο του LBR (wtnt) χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της εργασίας ως υπόστρωμα για τον προσδιορισμό φωσφορυλιωτικής δράσης κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης. Για την έκφραση της πρωτεΐνης σε βακτήρια χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί το τμήμα του γονιδίου του υποδοχέα της λαμίνης Β, το οποίο κωδικοποιεί την αμινοτελική περιοχή του που περιλαμβάνει τα αμινοξέα (30). Ο μετασχηματισμός των βακτηριακών κυττάρων XL1/B με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.31. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας, η έκφραση και ο καθαρισμός του αμινοτελικού τμήματος ως πρωτεΐνης σύντηξης με GST ακολούθησε το γενικό σχήμα που περιγράφεται στην παράγραφο Β.37. Η επαγωγή της έκφρασης στους 28 C με 5 mm IPTG έγινε για χρονικό διάστημα 1.5 ωρών γιατί επαγωγή για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα είχε ως αποτέλεσμα την εκτεταμένη πρωτεόλυση της πρωτεΐνης. Από τα εκλούσματα της στήλης σεφαρόζης-γλουταθειόνης παραλαμβάνονται 10 μl τα οποία αφού αραιωθούν σε τελικό όγκο 25 μl με Η2Ο, ηλεκτροφορούνται κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (παράγρ. Β.12). Η επιτυχής έκφραση της πρωτεΐνης ταυτοποιείται μετά από βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, καθώς και με ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στον LBR (Σ.Δ. Γεωργάτος, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων). Το αντίσωμα αυτό αναπτύχθηκε σε κουνέλια απέναντι σε ένα πεπτίδιο (R1) του αμινο-τελικού τμήματος του LBR που βρίσκεται ακριβώς πριν από την RS ακολουθία (Σχήμα Γ.1.Α, περισσότερες πληροφορίες στην παραπομπή 30). H πρωτεΐνη σύντηξης εμφανίζεται με μοριακή μάζα ~51 kda στην πηκτή, ενώ εμφανίζονται και ζώνες μικρότερης μοριακής μάζας που

116 112 αντιπροσωπεύουν προϊόντα πρωτεόλυσης του GST-wtNt (Σχήμα Γ.1.Β). Παράλληλα εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST και η μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης από την οποία έχουν αφαιρεθεί τα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (30). Η διαδικασία που ακολουθείται για την έκφραση και τον καθαρισμό του μεταλλάγματος (GSTΔRS) είναι απολύτως όμοια μ αυτή του GST-wtNt, ενώ στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου εντοπίζεται ως μία ζώνη με ελαφρώς μικρότερη μοριακή μάζα από το μη μεταλλαγμένο τμήμα (σχήμα Γ.1. Β). Σχήμα Γ.1. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα του αμινοτελικού άκρου του LBR ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt) και του μεταλλάγματος από το οποίο έχει αφαιρεθεί η RS αλληλουχία (GST-ΔRS). (A) Σχηματική αναπαράσταση της πρωτείνης σύντηξης GST-wtNt. Στο σχήμα απεικονίζεται το R1 πεπτίδιο το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη πολυκλωνικού αντισώματος καθώς και η RS αλληλουχία του LBR (με έντονα γράμματα και υπογραμμισμένη). (Β) Βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. (Γ) Ανοσοανίχνευση των εκφρασμένων πρωτεϊνών με αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο R1 του αμινο-τελικού άκρου του LBR.

117 113 Η μεταλλαγμένη μορφή της παραπάνω πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε, για τη διάκριση μεταξύ των δραστικοτήτων διαφόρων κινασών πρωτεϊνών και της δραστικότητας RS κινάσης, η οποία φωσφορυλιώνει εξειδικευμένα τη φυσιολογική πρωτεΐνη, ενώ αδυνατεί να φωσφορυλιώσει το μετάλλαγμα που δεν περιέχει την RS ακολουθία. Γ.1.2. Κατανομή της δραστικότητας κινάσης απέναντι στην RS ακολουθία του αμινοτελικού άκρου του LBR σε ιστούς αρουραίου Προκειμένου να διαπιστωθεί ποιος ιστός αποτελεί την πιο πλούσια πηγή δράσης κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην RS ακολουθία του αμινοτελικού άκρου του LBR, έγιναν πειράματα κατανομής της δράσης σε διάφορους ιστούς αρουραίου. Η διαδικασία κλασμάτωσης που ακολουθήθηκε προκειμένου να γίνουν τα πειράματα αυτά περιγράφεται στην παράγραφο Β.5. Η δραστικότητα μετρήθηκε με βάση την ικανότητα των δειγμάτων να φωσφορυλιώνουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt σε αντιδιαστολή με τη δράση που εμφανίζουν απέναντι στο μετάλλαγμα GST-ΔRS (από τις κρούσεις που πήραμε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το GST-wtNt αφαιρέθηκαν οι κρούσεις που πήραμε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το GST-ΔRS). Σε όλους τους ιστούς η δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών που ανιχνεύθηκε, όταν χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα το μετάλλαγμα του αμινοτελικού άκρου (GST-ΔRS) ήταν πολύ χαμηλή, γεγονός που πρακτικά υποδηλώνει ότι η RS κινάση είναι η κινάση εκείνη που φωσφορυλιώνει το αμινο-τελικό τμήμα του LBR.

118 Units/gr ιστού 114 Εγκέφαλος Θύμος αδένας Κ αρδιά Πνεύμονας Ήπαρ Σπλήνα Νεφρό Όρχεις Μυϊκός ιστός Ιστοί Σχήμα Γ.2. Κατανομή της δραστικότητας RS κινάσης πρωτεϊνών σε κυτταροπλασματικά (λευκοί πύργοι) και πυρηνικά (σκιασμένοι πύργοι) εκχυλίσματα ιστών αρουραίου. Η δράση ελέγχθηκε με την επώαση 15 μl από τα εκχυλίσματα μαζί με 0.12 mgr/ml GST-wtNt παρουσία 50 μm [γ-32ρ] ΑΤΡ, 10 mm MgCl2 και 100 mm NaCl. Οι ραδιενεργές ζώνες της πηκτής πολυακρυλαμιδίου που αντιστοιχούν στο GST-wtNt κόπηκαν και μετρήθηκαν σε υγρό σπινθηριστή. Η φωσφορυλιωτική δράση που δεν οφείλεται στη δραστικότητα RS κινάσης υπολογίσθηκε με φωσφορυλίωση του GST-ΔRS από τα ίδια εκχυλίσματα και στη συνέχεια αφαιρέθηκε από τις κρούσεις που αντιστοιχούν στη φωσφορυλίωση του GST-wtNt. Η μία μονάδα αντιστοιχεί στο ποσό του ενζύμου που καταλύει τη μεταφορά 0.1 nmol φωσφορικού σε 2 μgr GST-wtNt σε διάστημα 30 λεπτών στους 30 C. Γ.1.3. Αρχική μελέτη της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στο GST-wtNt σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα από όρχεις αρουραίου Από το σχήμα Γ.2. προκύπτει ότι οι όρχεις αρουραίου αποτελούν την πιο πλούσια πηγή δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην RS ακολουθία του GST-wtNt.. Προκειμένου να διαπιστώσουμε ότι η δραστικότητα στα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα οφείλεται στο ίδιο ένζυμο έγιναν αρχικά πειράματα in situ επαναδιάταξης της ενζυμικής δραστικότητας (Β.16) τόσο σε κυτταροπλασματικά όσο και σε πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου (Σχήμα Γ.3., Α). Και στα δύο εκχυλίσματα εμφανίζεται μία ζώνη σε μοριακή μάζα ~97 kda που αντιστοιχεί στη μοριακή μάζα της SRPK1 (32), ενώ φαίνεται καθαρά ότι το κυτταροπλασματικό εκχύλισμα είναι πλουσιότερη πηγή κινάσης από το αντίστοιχο πυρηνικό. Αξίζει να σημειωθεί ότι σύμφωνα με υβριδισμό κατά Northern τα

119 115 επίπεδα έκφρασης της SRPK1 είναι πολύ υψηλότερα στους όρχεις σε σχέση με τους άλλους ιστούς (62). Σε ένα επόμενο βήμα έγιναν πειράματα συγκατακρήμνισης (Β.22) προκειμένου να διαπιστωθεί εάν η δραστικότητα αυτή κινάσης πρωτεϊνών μπορούσε να δεσμευθεί στο αμινο-τελικό άκρο του LBR. Σχήμα Γ.3. (Α) In situ πείραμα επαναφοράς της δράσης πρωτεϊνικής κινάσης πυρηνικών και κυτταροπλασματικών κλασμάτων όρχεων αρουραίου (150 μg συνολικής πρωτεΐνης από το καθένα) σε πηκτή πού είχε πολυμεριστεί παρουσία 0.1 mg/ml GST-wtNt. (B) Πείραμα συγκατακρήμνισης δραστικότητας πρωτεϊνικής κινάσης από GST-wtNt που είχε ακινητοποιηθεί σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης μετά από επώαση με κυτταροπλασματικό εκχύλισμα όρχεων αρουραίου Ο προσδιορισμός της δραστικότητας κινάσης που κατακρημνίσθηκε έγινε με επώαση των σφαιριδίων με [γ-32ρ] ΑΤΡ. Ως πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε σκέτη GST αντί για GST-wtNt. Για το σκοπό αυτό το GST-wtNt ή σκέτη GST (πείραμα αναφοράς) καθηλωμένα σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης επωάσθηκαν με κυτταροπλασματικό εκχύλισμα από όρχεις αρουραίου και στη συνέχεια έγινε δοκιμή φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης σύντηξης GST-wtNt ή της σκέτης GST παρουσία [γ-32ρ] ΑΤΡ. Από το πείραμα αυτό επιβεβαιώνεται ότι το κυτταροπλασματικό κλάσμα περιέχει δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών η οποία δεσμεύεται στο αμινοτελικό άκρο του LBR και το φωσφορυλιώνει (Σχήμα Γ.3. Β). Παρόμοιο πείραμα έδειξε ότι και στο πυρηνικό κλάσμα περιέχεται δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών που δεσμεύεται στο GST-wtNt (αποτέλεσμα που δεν δείχνεται).

120 116 Γ.1.4. Καθαρισμός της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στο αμινο-τελικό άκρο του LBR από κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου Από τα παραπάνω πειράματα γίνεται εμφανές ότι το κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου αποτελεί πλούσια πηγή δραστικότητας RS κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει αλλά και δεσμεύεται στο αμινο-τελικό άκρο του LBR. Για το σκοπό αυτό, το συγκεκριμένο κλάσμα χρησιμοποιήθηκε ως πηγή ενζυμικής δραστικότητας για τον καθαρισμό και χαρακτηρισμό της δραστικότητας RS κινάσης. Η επιλογή αυτή, αν και από πρώτη άποψη φαίνεται παράδοξη, δεδομένου ότι το υπόστρωμα (LBR) είναι πυρηνική πρωτεΐνη, δικαιολογείται από την κατανομή της δράσης RS κινάσης πρωτεϊνών στα κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα σε σχέση με τα αντίστοιχα πυρηνικά, καθώς και από την ιδιότυπη υποκυτταρική εντόπιση των έως τώρα γνωστών μελών της οικογένειας των RS κινασών πρωτεϊνών όπως περιγράφεται στην παράγραφο Α.3.3. Γ Χρωματογραφία ιονικής ανταλλαγής Το πρώτο στάδιο του καθαρισμού της δραστικότητας κινάσης απέναντι στις RS ακολουθίες του LBR περιλαμβάνει τη χρήση του κατιονικού ανταλλάκτη φωσφοκυτταρίνη. Τα σφαιρίδια της στήλης μετά την αναγέννηση τους σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.8., πακετάρονται σε στήλη (12 x 2.8 cm) μέχρις όγκου 55 ml. Κατόπιν η στήλη εξισορροπείται διαβιβάζοντας 550 ml (10xV στήλης) ρυθμιστικού διαλύματος 0.3 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5 σε θερμοκρασία 4 C. Το κυτταρόπλασμα διαβιβάστηκε από τη στήλη χρωματογραφίας, μετά από αραίωση του στο διάλυμα εξισορρόπησης έως ότου η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη να είναι mg/ml για την αποτελεσματικότερη δέσμευση των πρωτεϊνών στη στήλη. Ακολούθησε η έκπλυση της στήλης με 550 ml από το διάλυμα εξισορρόπησης, ώστε να αποδεσμευτούν από τη στήλη οι πρωτεΐνες που δεσμεύτηκαν χαλαρά σ αυτή. Η έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη πραγματοποιήθηκε με τη διαβίβαση 400 ml διαβαθμισμένης συγκέντρωσης M NaCl σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-ΗCl ph 7.5 σε θερμοκρασία των 4 C. Ο κλασματοσυλλέκτης ρυθμίστηκε ώστε να συλλέγονται κλάσματα των 8 ml (200 σταγόνες/σωλήνα). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των κλασμάτων παρακολουθήθηκε με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο (Β.6.2). Ο έλεγχος των κλασμάτων για δραστικότητα RS κινάσης πρωτεϊνών έγινε χρησιμοποιώντας 6 μl από κάθε κλάσμα ως πηγή δράσης, με υπόστρωμα 6 μl GST-wtNt παρουσία [γ-32ρ] ΑΤΡ, σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5 και 10 mm MgCl2. Ο τελικός όγκος επώασης ρυθμίστηκε στα 25 μl με προσθήκη ddh2o και τα δείγματα

121 117 επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 30 C. Στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και υπέστησαν αυτοραδιογραφία. Οι ζώνες της πηκτής που αντιστοιχούν στις ραδιενεργές ζώνες του GST-wtNt, όπως εμφανίστηκαν στο φιλμ, κόπηκαν από τη ξηραμένη πηκτή και μετρήθηκαν οι ραδιενεργές κρούσεις κατά Cherenkov. Τα κλάσματα της στήλης χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα και με το μετάλλαγμα GST-ΔRS ως 8 2,0 6 1,5 1,2 4 1,0 2 0,5 0, ,0 30 N a C l ( M) 0,9 A2 8 0 c p m x 10-3 υπόστρωμα αλλά η δραστικότητα τους ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη. 0,3 Α ρ ι θ μ ό ς Κλ ά σ μ α τ ο ς GST-wtNt - Σχήμα Γ.4. Κλασμάτωση κυτταροπλάσματος όρχεων αρουραίου σε στήλη φωσφοκυτταρίνης. Με τετράγωνα συμβολίζονται οι ραδιενεργές κρούσεις που αντιστοιχούν στο GST-wtNt μετά τη φωσφορυλίωση του από τα κλάσματα της στήλης, η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει την περιεκτικότητα των κλασμάτων σε πρωτεΐνη και η στικτή γραμμή τη διαβαθμισμένη συγκέντρωση NaCl που χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση των κλασμάτων. Στη φωτογραφία παρουσιάζεται το αυτοραδιογράφημα της πηκτής με τις φωσφορυλιωμένες ζώνες του GSTwtNt από τα αντίστοιχα κλάσματα της στήλης (Η ζώνη που εμφανίζεται ψηλότερα αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη σύντηξης, ενώ οι χαμηλότερης μοριακής μάζας ζώνες αντιστοιχούν στα πρωτεολύματα της).

122 118 Γ Χρωματογραφία αγχιστείας Τα κλάσματα της φωσφοκυτταρίνης που εμφάνισαν την υψηλότερη δράση ενώθηκαν και υπολογίσθηκε η μέση συγκέντρωση τους σε NaCl, η οποία ήταν περίπου 0.6 M. Σε ένα επόμενο στάδιο καθαρισμού χρησιμοποιήθηκε στήλη αγχιστείας. Η στήλη αυτή παρασκευάζεται με τη σύζευξη ενός συνθετικού πεπτιδίου, που περιέχει επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, και αντιπροσωπεύει την αντίστοιχη περιοχή του αμινοτελικού άκρου του LBR (70SSPSRRSRSRSRSRSPGRPAKG91), στα σφαιρίδια στήλης Affi-gel 10 σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.9. Ο τελικός όγκος της στήλης είναι 3 ml και η εξισορρόπηση της έγινε με διαβίβαση 30 ml ρυθμιστικού διαλύματος 0.6 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, σε θερμοκρασία 4 C. Τα δραστικά κλάσματα της φωσφοκυτταρίνης διαβιβάστηκαν στη στήλη αγχιστείας και ακολούθως έγινε έκπλυση της στήλης με το διάλυμα εξισορρόπησης. Η έκλουση των πρωτεϊνών από αυτή, έγινε με 30 ml διαβαθμισμένης συγκέντρωσης Μ NaCl σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5 και ρύθμιση του κλασματοσυλλέκτη στις 75 σταγόνες/σωλήνα (~3.5 ml). Ο έλεγχος των κλασμάτων για δραστικότητα RS κινάσης έγινε χρησιμοποιώντας 6 μl από κάθε κλάσμα ως πηγή δράσης, με υπόστρωμα 6 μl GST-wtNt παρουσία [γ-32ρ] ΑΤΡ, σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5 και 10 mm MgCl2. Τα δείγματα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 30 C, στη συνέχεια ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και υπέστησαν αυτοραδιογραφία. Οι ζώνες της πηκτής που αντιστοιχούν στις ραδιενεργές ζώνες του GSTwtNt κόπηκαν από τη ξηραμένη πηκτή και μετρήθηκαν οι ραδιενεργές κρούσεις κατά Cherenkov. Η μέση συγκέντρωση του NaCl στην οποία εκλούστηκαν τα δραστικά κλάσματα ήταν 1.2 Μ NaCl.

123 , ,8 2 1,2 1 0 NaCl(M) c p m x ,4 0, Α ρ ιθ μ ό ς Κλ α σ μ α το ς GST-wtNt - Σχήμα Γ.5. Κλασμάτωση των δραστικών κλασμάτων της στήλης φωσφοκυτταρίνης σε στήλη αγχιστείας Affigel-RS peptide. Τα τετράγωνα αντιπροσωπεύουν τις ραδιενεργές κρούσεις που αντιστοιχούν στο GST-wtNt μετά από φωσφορυλίωση του από τα κλάσματα της στήλης. Η στικτή γραμμή συμβολίζει τη διαβαθμισμένη συγκέντρωση NaCl που χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση των πρωτεϊνών (Η περιεκτικότητα των κλασμάτων σε πρωτεΐνη ήταν πολύ μικρή για να μετρηθεί στα 280 nm). Στη φωτογραφία παρουσιάζονται οι ραδιενεργές ζώνες του GST-wtNt όπως εμφανίζονται στο φιλμ αυτοραδιογραφίας, μετά από τη φωσφορυλίωση του με τα αντίστοιχα κλάσματα της στήλης (Η ζώνη που εμφανίζεται ψηλότερα αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη σύντηξης, ενώ οι χαμηλότερης μοριακής μάζας ζώνες αντιστοιχούν στα πρωτεολύματα της).

124 120 Γ.1.5. Πίνακας καθαρισμού Τα αποτελέσματα του καθαρισμού της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στο αμινοτελικό άκρο του LBR, συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα καθαρισμού. Πίνακας Γ.1. Πρωτόκολλο καθαρισμού της δραστικότητας RS κινάσης πρωτεϊνών από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου. Όγκος (ml) Κυτταρόπλασμα 130 P-Cellulose 47 RS-peptide 15 Πρωτεΐνη (mgr) Units S/A (U/mgr) Καθαρισμός Απόδοση (%) Η μία μονάδα αντιστοιχεί στο ποσό του ενζύμου που καταλύει τη μεταφορά 0.1 nmol φωσφορικού σε 2 μgr GST-wtNt μετά από επώαση 30 λεπτών στους 30 C. Σε πειράματα κινητικής μελέτης της δραστικότητας RS κινάσης πρωτεϊνών από τα κλάσματα των στηλών χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα αυξανόμενα ποσά GST-wtNt, κυμαινόμενα από μg, και συγκέντρωση ATP 100 μm, βρέθηκε ότι η Km που παρουσιάζει η εκλουόμενη δράση RS κινάσης ως προς το αμινοτελικό άκρο του LBR είναι 1.31 μμ. Γ.1.6. Χρώση με νιτρικό άργυρο Τα δραστικά κλάσματα της στήλης αγχιστείας συμπυκνώθηκαν έως τον όγκο του 1 ml με υπερδιήθηση σε συσκευή Amicon PM-10. Στη συνέχεια το συμπύκνωμα αυτό διαπιδύθηκε εξαντλητικά σε Η2Ο και ακολούθως λυοφιλήθηκε μέχρι όγκου ~150 μl. Δείγμα όγκου 30 μl (ολική πρωτεΐνη < 1 μg) από το τελικό συμπύκνωμα αναλύθηκε σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες. Στην πηκτή έγινε χρώση με νιτρικό άργυρο σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.14.

125 Σχήμα Γ.6. Ηλεκτροφόρηση του τελικού παρασκευάσματος μετά τη στήλη αγχιστείας σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και χρώση της πηκτής με νιτρικό άργυρο (2η διαδρομή). Στην 1η διαδρομή εμφανίζονται οι μάρτυρες μοριακού βάρους. Μετά τη χρώση της πηκτής, εμφανίστηκε μία ζώνη με μοριακή μάζα ~55 kda, η οποία όμως δεν αντιστοιχεί σε καμία από τις γνωστές κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης. Επίσης η μοριακή μάζα της ζώνης αυτής δεν ταιριάζει και με τη μοριακή μάζα της ζώνης που εμφανίστηκε στα πειράματα in situ επαναφοράς της δράσης (βλ. παράγραφο Γ.1.3.). Η ταυτοποίηση της ζώνης αυτής από τον Dr. Volker Kruft (PE Biosystems, Applied Biosystems GmbH, Brunnenweg 13, D Weiterstadt, Germany) με βάση την ανάλυση της αμινοξικής της ακολουθίας, με τη μέθοδο της κατά Edman αποικοδόμησης, δεν κατέστη δυνατή πιθανότατα γιατί το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης ήταν μπλοκαρισμένο. Συγχρόνως, δεν παρατηρήθηκε ζώνη στα 97 kda στην οποία οφείλεται η δραστικότητα απέναντι στο αμινοτελικό άκρο του LBR σύμφωνα με το πείραμα της in situ επαναδιάταξης. Η συγκεκριμένη ζώνη πιθανά δεν ανιχνεύτηκε λόγω χρησιμοποίησης μικρής ποσότητος δείγματος.

126 122 Γ.1.7. Έκφραση της SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST Η κινάση πρωτεϊνών SRPK1 εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης ώστε να χρησιμοποιηθεί σε in vitro πειράματα φωσφορυλίωσης και για την παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος. Τo γονίδιo της SRPK1 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t από τη λέκτορα Ελένη Νικολακάκη (62). Η διαδικασία της έκφρασης της πρωτεΐνης σύντηξης σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B περιγράφεται στην παράγραφο Β.38. Ο χρόνος της επαγωγής της σύνθεσης στα βακτήρια ήταν 2 ώρες στους 28 C. Μετά την έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης 10 μl από το κάθε έκλουσμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 (Σχήμα Γ.7. Α). Γ.1.8. Έκφραση της SRPK1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα ως πρωτεΐνη σύντηξης με την ακολουθία FLAG Τo γονίδιo της SRPK1 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2 από τη λέκτορα Ελένη Νικολακάκη (59). Η έκφραση της SRPK1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα επιτεύχθηκε με παροδική επιμόλυνση 293Τ κυττάρων σύμφωνα με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου που περιγράφεται στην παράγραφο Β.40. Με τη συμπλήρωση 48 ωρών από τη στιγμή της επιμόλυνσης τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν και έγινε ανίχνευση της παραγόμενης FLAG-SRPK1 με ηλεκτροφόρηση 10 μl από το κυτταρικό εκχύλισμα, κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία (Σχήμα Γ.7. Γ). Γ.1.9. Παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος απέναντι στην SRPK1 Για την ανίχνευση της SRPK1 στα κλάσματα των στηλών καθαρισμού αλλά και σε κυτταρικά εκχυλίσματα ήταν αναγκαία η παρασκευή ενός πολυκλωνικού αντισώματος. Το αντίσωμα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο τη πρωτεΐνη σύντηξης με GST σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.19. Δεδομένου ότι κατά την παρασκευή του αντιορού χρησιμοποιήθηκε πρωτεΐνη σύντηξης με την GST, ο αντιορός εκτός του αντισώματος απέναντι στην SRPK1 περιείχε και αντισώματα απέναντι στην GST. Έτσι πριν τη χρήση των αντιορού, αυτός διαβιβάστηκε 3 φορές από στήλη σεφαρόζηςγλουταθειόνης στην οποία είχε καθηλωθεί καθαρή GST, ώστε μετά τη δέσμευση των αντισωμάτων της GST σ αυτή, να παραληφθεί ο αντιορός κατά το δυνατόν απαλλαγμένος

127 123 από αντισώματα απέναντι στην GST. Έγινε έλεγχος του αντισώματος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου τόσο της GST-SRPK1 (Σχήμα Γ.7. Β) όσο και κυτταρικών εκχυλισμάτων 293Τ κυττάρων που υπερεκφράζουν την FLAG-SRPK1 (Σχήμα Γ.7. Δ). Η ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.20. Σχήμα Γ.7. (Α) Ηλεκτροφόρηση σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου της καθαρής πρωτεΐνης σύντηξης GSTSRPK1 και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. Η GST-SRPK1 αντιστοιχεί στη ζώνη με μοριακή μάζα ~110 kda, ενώ η ζώνη με μοριακό βάρος ~27.5 kda αντιστοιχεί στην GST. (Β) Ανοσοανίχνευση της GSTSRPK1 με τον αντίστοιχο αντιορό σε μεμβράνη νιτροκυταρρίνης. Διακρίνεται η πλήρους μήκους μορφή της καθώς και κάποιο ποσό GST στο ύψος του μάρτυρα των 29 kda. (Γ) Ανοσοανίχνευση εκχυλισμάτων από κύτταρα 293Τ που έχουν επιμολυνθεί παροδικά με FLAG-SRPK1 με το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία. (Δ) Ανοσοανίχνευση των ίδιων κυτταρικών εκχυλισμάτων με το πολυκλωνικό αντίσωμα που

128 124 αναπτύχθηκε απέναντι στην SRPK1. Και στις δύο περιπτώσεις στα πειράματα αναφοράς (control) χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων τα οποία είχαν επιμολυνθεί με τον πλασμιδιακό φορέα μόνο του. Γ Ανοσοανίχνευση των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας με το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1 Δείγμα όγκου 30 μl από το τελικό συμπύκνωμα μετά τη στήλη αγχιστείας, που παρουσιάζει δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στον LBR, ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία μαρτύρων μοριακού βάρους. Για συγκριτικούς λόγους στην ίδια πηκτή ηλεκτροφορήθηκαν και 5 μl από κυτταρικό εκχύλισμα 293Τ ευκαρυωτικών κυττάρων όπου είχε υπερεκφρασθεί η SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με το επίτοπο FLAG (FLAG-SRPK1). Έγινε ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.8. η δραστικότητα κινάσης που απομονώθηκε από τη στήλη αγχιστείας αντιστοιχεί σε μία ζώνη με μοριακή μάζα περίπου 97 kda η οποία αναγνωρίζεται από το αντίσωμα της SRPK1 και εμφανίζει την ίδια ηλεκτροφορητική κινητικότητα με την FLAG-SRPK1. Σχήμα Γ.8. Ανοσοανίχνευση της κινάσης πρωτεϊνών SRPK1 στο συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης. Διαδρομές: 1η Μάρτυρες Μοριακής Μάζας, 2η FLAG-SRPK1, 3η Συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας.

129 125 Γ Δέσμευση της SRPK1 στο αμινοτελικό άκρο του LBR Στα αρχικά πειράματά μας (παρ. Γ.1.3.) είχε φανεί ότι η δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών από το κυτταροπλασματικό κλάσμα όρχεων αρουραίου που φωσφορυλίωνε το αμινο-τελικό άκρο του LBR μπορούσε και να δεσμευθεί στο αμινο-τελικό άκρο. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι η SRPK1 δεσμεύεται πράγματι στο αμινοτελικό άκρο του LBR αλλά και να μελετήσουμε τη σημασία της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης στην αλληλεπίδραση αυτή, εκτελέστηκε πείραμα συγκατακρήμνισης σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.22. Σε στήλη σεφαρόζηςγλουταθειόνης, καθηλώθηκαν ~4 μg από την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, την πρωτεΐνη σύντηξης GST-wtNT καθώς και το μετάλλαγμα αυτής GST-ΔRS, αντίστοιχα. Η καθήλωση έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα PBSΤ. Ο έλεγχος της αλληλεπίδρασης της SRPK1 με τις καθηλωμένες πρωτεΐνες, έγινε με προσθήκη σε κάθε περίπτωση στα σφαιρίδια της στήλης 60 μl από κυτταρικό εκχυλίσμα 293Τ ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η κινάση ως πρωτεΐνη σύντηξης με την FLAG ακολουθία, και 1 ml PBST. Μετά από συνεχή ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και 3 πλύσεις με PBST, οι πρωτεΐνες που δεσμεύθηκαν στα σφαιρίδια της στήλης, αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή ακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες και στη συνέχεια ανοσοαποτύπωση των πρωτεϊνικών ζωνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.9., η FLAG-SRPK1 δεσμεύεται στο αμινο-τελικό άκρο του LBR (GST-wtNt). Η αδυναμία δέσμευσης της κινάσης στο μετάλλαγμα GST-ΔRS καταδεικνύει ότι η ακολουθία των διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης είναι απαραίτητη για τη δέσμευση του ενζύμου στον LBR.

130 126 FLAG-SRPK1 GST GST-wtNt GST-ΔRS Σχήμα Γ.9. Ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία της FLAG-SRPK1 εκφρασμένης σε κύτταρα 293Τ που συγκατακρημνίστηκε με τις πρωτεΐνες σύντηξης GST, GST-wtNT, GSTΔRS. Στην πρώτη διαδρομή έτρεξαν μάρτυρες μοριακής μάζας, ενώ στη δεύτερη έτρεξαν 10 μl (1/6 του όγκου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα συγκατακρήμνισης) κυτταρικού εκχυλίσματος 293Τ κυττάρων όπου είχε υπερεκφραστεί η FLAG-SRPK1. Γ Φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων του αμινο-τελικού άκρου του LBR από την SRPK1 και το δραστικό κλάσμα της στήλης αγχιστείας Σε ένα επόμενο βήμα έγινε έλεγχος της δυνατότητας του δραστικού εκλούσματος της στήλης αγχιστείας καθώς και της FLAG-SRPK1 που έχει υπερεκφραστεί σε κύτταρα 293Τ να φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες της RS ακολουθίας του GST-wtNt. Για το σκοπό αυτό, έγινε παροδική επιμόλυνση κυττάρων 293Τ με τον πλασμιδιακό φορέα pcmv-2, ο οποίος έφερε την FLAG-SRPK1 (Β.40). Μετά την πάροδο 48 ωρών το κυτταρικό εκχύλισμα ανοσοκατακριμνήστηκε με το M5 anti-flag μονοκλωνικό αντίσωμα (Β.21). Η ανοσοκατακριμνησμένη κινάση επωάστηκε για 30 λεπτά στους 30 C σε συνθήκες in vitro φωσφορυλίωσης με LBR, καθαρισμένο από πυρήνες ερυθροκυττάρων γαλοπούλας, το ανασυνδιασμένο αμινο-τελικό άκρο GST-wtNt, το μετάλλαγμα GST-ΔRS, που δεν περιέχει

131 127 την RS ακολουθία, καθώς και με τις πρωτεΐνες σύντηξης GST-wtNtG78, GST-wtNtA80, GSTwtNtA82, GST-wtNtA84, στις οποίες οι Ser78, Ser80, Ser82 και Ser84 έχουν αντίστοιχα μεταλλαχθεί σε Gly, Ala, Ala και Ala αντίστοιχα (οι μεταλλάξεις έγιναν από τη Λέκτορα Ε. Νικολακάκη, για περισσότερες πληροφορίες βλ. παραπομπή 30). Οι ίδιες πρωτεΐνες σύντηξης επωάστηκαν επίσης και με το συμπύκνωμα (σε συσκευή Amicon) των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας. Οι ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDSηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία. Όπως προκύπτει από το σχήμα Γ.11. τόσο η FLAG-SRPK1 όσο και το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας φωσφορυλιώνουν στο ίδιο επίπεδο το αμινοτελικό άκρο του LBR και τις διάφορες μεταλλαγμένες μορφές του, ενώ αδυνατούν να φωσφορυλιώσουν το μετάλλαγμα χωρίς την RS αλληλουχία (GST-ΔRS). Η εμφάνιση των ίδιων επιπέδων φωσφορυλίωσης στις σημειακά μεταλλαγμένες μορφές του GST-wtNt σε σύγκριση με τη φυσιολογική μορφή, αφ ενός υποδηλώνει ότι η SRPK1 και το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας παρουσιάζουν την ίδια εξειδίκευση και αφ ετέρου ότι κάθε μία σερίνη από την RS ακολουθία μπορεί να αποτελέσει στόχο φωσφορυλίωσης της SRPK1 και του συμπυκνώματος της στήλης αγχιστείας.

132 128 Πρωτεΐνη σύντηξης Περιοχή RS GS T-wtNt 71SPSRRSRSRSRSRSPGRP 88 GS T-ΔRS 71SPSR P GRP88 GS T-wtNtG SPSRRSR GRSRSRSP GRP 88 GS T-wtNtA SPSRRSRSR ARSRSP GRP 88 GS T-wtNtA SPSRRSRSRSR A RSP GRP88 GS T-wtNtA SPSRRSRSRSRSR AP GRP88 Σχήμα Γ.10. Ηλεκτροφόρηση σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου (12%) της πρωτεΐνης σύντηξης GST-wtNt και των μεταλλαγμάτων αυτού και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. Στο πάνω μέρος της φωτογραφίας δίδεται μία σχηματική αναπαράσταση των μεταλλάξεων που έχει υποστεί η RS αλληλουχία διπεπτιδίων του LBR.

133 129 Σχήμα Γ.11. (Α) Φωσφορυλίωση του GST-wtNt και των μεταλλαγμάτων του από την κινάση πρωτεϊνών FLAGSRPK1 η οποία είχε προηγουμένως ανοσοκατακριμνηστεί με το Μ5 μονοκλωνικό αντίσωμα από παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα 293Τ. (Β) Φωσφορυλίωση του GST-wtNt και των μεταλλαγμάτων του από το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας. Γ Ανάλυση φωσφοπεπτιδίων του αμινοτελικού άκρου του LBR μετά από φωσφορυλίωση με GST-SRPK1 και το δραστικό κλάσμα της στήλης αγχιστείας Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ακόμα παραπέρα ότι η εκλουόμενη δράση κινάσης από τις στήλες καθαρισμού, οφείλεται στην κινάση πρωτεϊνών SRPK1 έγινε ανάλυση φωσφοπεπτιδίων του ανασυνδυασμένου αμινοτελικού άκρου του LBR (GST-wtNt) μετά από φωσφορυλίωση του με GST-SRPK1 και το δραστικό κλάσμα της στήλης αγχιστείας. Αρχικά η πρωτεΐνη σύντηξης GST-wtNt επισημάνθηκε ραδιενεργά με γ-32ρ ΑΤΡ σε συνθήκες in vitro φωσφορυλίωσης τόσο με το συμπύκνωμα (σε συσκευή Amicon) των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας, όσο και με τις ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1. Μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη, έγινε αυτοραδιογραφία και οι ραδιενεργές ζώνες του GST-wtNt αποκόπηκαν και εμβαπτίστηκαν σε 0.5% PVP-360, 100 mm οξικό οξύ, για 1 ώρα στους 37 C. Η πέψη των πρωτεϊνών έγινε με επίδραση τρυψίνης σε 50 mm NH4HCO3 πάνω στη μεμβράνη. Ο δισδιάστατος διαχωρισμός έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.26 σε πλάκες κυτταρίνης TLC ενώ η έκθεση τους σε ακτινογραφικό φιλμ διήρκεσε 15 ημέρες.

134 130 Όπως φαίνεται από τους χάρτες φωσφοπεπτιδίων (Σχήμα Γ.12.) που προέκυψαν μετά την εμφάνιση του φιλμ, η πρωτεΐνη σύντηξης GST-wtNt φωσφορυλιώνεται στις ίδιες θέσεις από την GST-SRPK1 και από το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας. Σχήμα Γ.12. Χάρτες φωσφοπεπτιδίων του αμινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (GST-wtNt) μετά τη φωσφορυλίωση του από την ανασυνδυασμένη κινάση πρωτεϊνών (SRPK1) και το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας (LBRK) αντίστοιχα.

135 131 Γ Φωσφορυλίωση του αμινοτελικού άκρου του LBR από την SRPK1 σε σχέση με άλλες κινάσες πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνουν RS αλληλουχίες διπεπτιδίων Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή (Α.3.6) υπάρχουν και άλλες κινάσες πρωτεϊνών οι οποίες έχουν την ικανότητα να φωσφορυλιώνουν επαναλαμβανόμενες ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης έστω και με μικρότερη εξειδίκευση από την SRPK1. Στη συγκεκριμένη περίπτωση έγινε έλεγχος της ικανότητας φωσφορυλίωσης του αμινοτελικού άκρου του LBR (GST-wtNt) από την SRPK1 αλλά και από τις CLK2 και τοποϊσομεράση Ι. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε επίσης και ο παράγοντας ματίσματος του RNA ASF/SF2 που είναι γνωστό ότι φωσφορυλιώνεται και από τις τρεις κινάσες στην RS περιοχή του (8587). Για το σκοπό αυτό έγινε in vitro φωσφορυλίωση των GST-wtNt και ASF/SF2 από τις ανασυνδιασμένες κινάσες πρωτεϊνών GST-SRPK1, CLK2 και τοποϊσομεράση Ι με [γ-32ρ] ΑΤΡ. Ο ASF/SF2 και η ανασυνδυασμένη τοποϊσομεράση Ι μας παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Dr. Jamal Tazi (Institut de Genetique Moleculaire de Montpellier, Universite Montpellier II, France), ενώ η ανασυνδυασμένη CLK2 από τον Dr. Leonard Rabinow (Laboratoire de Signalisation, Developpement et Cancer, Universite de Paris, Orsay, France). Σε κάθε επώαση προστέθηκαν 3 μg υποστρώματος και η φωσφορυλίωση έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl2, και 100 mμ NaCl. Μετά από επώαση 30 λεπτών στους 30 C τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε αυτοραδιογραφία της πηκτής. Από την αυτοραδιογραφία προέκυψε ότι μόνο η GST-SRPK1 φωσφορυλιώνει πολύ καλά και τα δύο υποστρώματα, σε συγκρίσιμα μεταξύ τους επίπεδα, ενώ αντιθέτως οι δύο άλλες κινάσες παρουσιάζουν πολύ μεγαλύτερη δραστικότητα με υπόστρωμα τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 σε σχέση με το αμινοτελικό άκρο του LBR. Το αποτέλεσμα αυτό αποτελεί ακόμη μία ένδειξη ότι η δράση κινάσης πρωτεϊνών που τροποποιεί τον υποδοχέα της λαμίνης Β, στους όρχεις, είναι η SRPK1.

136 132 GST -wtnt ASF/SF2 GST -wtnt Δ. ASF/SF2 GST -wtnt Γ. ASF/SF2 GST -wtnt Β. ASF/SF2 A. Σχήμα Γ.13. Φωσφορυλίωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ASF/SF2 και GST-wtNt από διάφορες κινάσες που φωσφορυλιώνουν RS ακολουθίες διπεπτιδίων. (Α) Ηλεκτροφόρηση σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου (12%) των ASF/SF2 και GST-wtNt και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) Φωσφορυλίωση των δύο υποστρωμάτων από την κινάση GST-SRPK1. (Γ) Φωσφορυλίωση των δύο υποστρωμάτων από την κινάση CLK2. (Δ) Φωσφορυλίωση των δύο υποστρωμάτων από την τοποϊσομεράση Ι. Γ.2. Μελέτη της δέσμευσης της πρωτεΐνης p32 στο αμινοτελικό άκρο του LBR Γ.2.1. Έκφραση της πρωτεΐνης p32 ως πρωτεΐνη σύντηξης με 6 ιστιδίνες Η πρωτεΐνη p32 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pet-15b, ο οποίος είναι κατάλληλος για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με 6 ιστιδίνες, και στη συνέχεια εκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα BL21. Η διαδικασία έκφρασης και καθαρισμού της p32 περιγράφεται στην παράγραφο Β.39. Η έκλουση της στήλης αγαρόζης-ni+2 έγινε με διάλυμα 50 mm Na2HPO4 ph 8.0, 300 mm NaCl και 300 mm ιμιδαζολίου. Από το έκλουσμα της στήλης ελήφθησαν 10 μl δείγματος και ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η βαφή της πηκτής με χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και η ανοσοαποτύπωση σε

137 133 μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην p32 (40) επιβεβαίωσαν τη σωστή έκφραση της πρωτεΐνης 6xHis-p32 (Σχήμα Γ.14). A. B xHis p Σχήμα Γ.14. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της πρωτεΐνης p32 ως πρωτεΐνη σύντηξης με 6 ιστιδίνες. (Α) Χρώση της πηκτής πολυακρυλαμιδίου με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 όπου διακρίνεται η ανασυνδυασμένη p32. (Β) Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη όπως εμφανίζεται μετά από ανοσοανίχνευση με πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην p32. Γ.2.2. Αλληλεπίδραση της p32 με την RS περιοχή του υποδοχέα της λαμίνης Β Η πρωτεΐνη p32 είχε βρεθεί παλαιότερα ότι δεσμεύεται στο αμινο-τελικό άκρο του LBR (30). Προκειμένου να μελετηθεί πιο συστηματικά η αλληλεπίδραση αυτή αλλά και να διαλευκανθεί ο ρόλος της RS περιοχής του LBR και της φωσφορυλίωσης της από την SRPK1 διεξήχθησαν πειράματα συγκατακρήμνισης (B.22). Συγκεκριμένα, σε σφαιρίδια σεφαρόζηςγλουταθειόνης καθηλώθηκαν οι πρωτεΐνες GST, GST-wtNt, η φωσφορυλιωμένη μορφή μετά από φωσφορυλίωση με FLAG-SRPK1 και GST-ΔRS από την οποία έχει αφαιρεθεί η RS αλληλουχία. Η δέσμευση της GST και των πρωτεϊνών σύντηξης στα σφαιρίδια της στήλης έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα πού αποτελείται από 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2 mm MgCl2 και 1% Triton X-100. Η φωσφορυλίωση της πρωτείνης GST-wtNt έγινε πριν τη

138 134 δέσμευση της στη στήλη για 2 ώρες στους 30 C, σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 mm MgCl2 και 100 μμ NaCl παρουσία 0.6 mm ΑΤΡ. Χρησιμοποιήθηκε υψηλή συγκέντρωση ψυχρού ΑΤΡ για την επίτευξη κατά το δυνατόν πιο στοιχειομετρικής φωσφορυλίωσης. Μετά την καθήλωση των πρωτεϊνών σύντηξης στη στήλη, ακολούθησε η δέσμευση της πρωτεΐνη σύντηξης 6xHis-p32 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις πάλι στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα τέλος οι πρωτεΐνες αποδεσμεύτηκαν από τη στήλη μετά από αιώρηση τους σε διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και θέρμανση 5 λεπτών στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτοφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R250. Η εμφάνιση των ζωνών στην πηκτή έδειξε ότι η πρωτεΐνη p32 δεσμεύεται μόνο στην περίπτωση της μη φωσφορυλιωμένης GST-wtNt. Η περιοχή λοιπόν των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης του LBR είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση του με την πρωτεΐνη p32 ενώ η φωσφορυλίωση της περιοχής αυτής από την SRPK1 παρεμποδίζει τη δέσμευση της p32 στον LBR, ρυθμίζοντας έτσι τη μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Σχήμα Γ.15. (Α) Έλεγχος της δέσμευσης της πρωτεΐνης His-p32 στο αμινοτελικό άκρο του LBR (GST-wtNt), στο φωσφορυλιωμένο άκρο (GST-wtNt*) και στο μετάλλαγμα του χωρίς την RS αλληλουχία (GST-ΔRS).

139 135 Χρησιμοποιήθηκαν ~3 μg κάθε ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης και 4 μg GST. (Β) Δέσμευση αυξανομένων συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης p32 στο αμινοτελικό άκρο του LBR (GST-wtNt). Και στις δύο περιπτώσεις η εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με χρώση της πηκτής με Coomasie Brilliant Blue R-250. Γ.2.3. Η δέσμευση της p32 στο αμινοτελικό άκρο του LBR παρεμποδίζει τη δέσμευση και φωσφορυλίωση του από την SRPK1 κινάση πρωτεϊνών Δεδομένου ότι τόσο η πρωτεΐνη p32 όσο και η SRPK1 δεσμεύονται στην RS περιοχή του αμινο-τελικού άκρου του LBR έγιναν πειράματα συγκατακρήμνισης για να διαπιστωθεί εάν η δέσμευση της p32 επηρεάζει τη δέσμευση της SRPK1 και την ακόλουθη φωσφορυλίωση του LBR. Για το σκοπό αυτό έγινε αρχικά η συγκατακρήμνιση της πρωτεΐνης GST-wtNt και της p32 όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη παράγραφο. Μετά τη δέσμευση της p32 ακολούθησε δέσμευση της SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την FLAG ακολουθία (χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα 293Τ ευκαρυωτικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την FLAG-SRPK1), για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. H δέσμευση της FLAG-SRPK1 έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na2HPO4, 0.2 gr/l KH2PO4, 1% Triton X-100). Ακολούθησαν τρεις πλύσεις σε PBST και στη συνέχεια τα δείγματα αφού ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και έγινε ανοσοανίχνευση της δεσμευμένης SRPK1 με το M5 anti-flag μονοκλωνικό αντίσωμα. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.16Α η δέσμευση της p32 παρεμποδίζει σημαντικά τη δέσμευση της SRPK1. Σε ένα επόμενο βήμα ελέγχθηκε εάν η παρεμπόδιση της δέσμευσης της FLAG-SRPK1 οδηγεί και σε αντίστοιχη παρεμπόδιση της φωσφορυλίωσης του αμινο-τελικού άκρου του LBR. Για το σκοπό αυτό επαναλήφθηκε το προηγούμενο πείραμα (συγκατακρήμνιση GSTwtNt και p32 και ακολούθως δέσμευση της FLAG-SRPK1) με τη διαφορά ότι στο τέλος στα σφαιρίδια έγινε δοκιμασία φωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλίωση έγινε με προσθήκη στα σφαρίδια της στήλης ρυθμιστικού διαλύματος 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl2 και 100 mμ NaCl παρουσία [γ-32ρ] ΑΤΡ. Η επώαση των δειγμάτων έγινε στους 30 C για 30 λεπτά. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και αυτοραδιογραφία. Oπως αναμενόταν (σχήμα Γ.16.Β) η αύξηση των ποσοτήτων της δεσμευμένης p32 συνοδεύεται από μια αντίστοιχη μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης του από την SRPK1.

140 136 Σχήμα Γ.16. Η πρωτεΐνη p32 παρεμποδίζει τη δέσμευση της SRPK1 και την ακόλουθη φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού άκρου του LBR. (A) H πρωτεΐνη σύντηξης GST-wtNt (3 μg) καθηλωμένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης προεπωάσθηκε με αυξανόμενες ποσότητες (0, 4, 6, 10 μg) p32 και στη συνέχεια επωάσθηκε με κυτταρικά εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που υπερεκφράζουν την SRPK1 με το επίτοπο FLAG. Τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες και η δεσμευμένη FLAGSRPK1 ανοσοανιχνεύθηκε μετά από ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, χρησιμοποιώντας το Μ5 μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία της SRPK1. (Β) Σε παρόμοια πειράματα συγκατακρήμνισης έγινε δοκιμή φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης σύντηξης από την FLAG-SRPK1 που είχε δεσμευθεί. Η φωσφορυλίωση έγινε στους 30 C για 30 λεπτά, με προσθήκη στα σφαιρίδια της στήλης ρυθμιστικού διαλύματος 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl2 και 100 mμ NaCl παρουσία 25 μμ [γ-32ρ] ΑΤΡ. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και αυτοραδιογραφία. Από τα παραπάνω πειράματα προκύπτει ότι η πρωτεΐνη p32 και η SRPK1 συναγωνίζονται για την RS περιοχή του LBR. Η δέσμευση της p32 παρεμποδίζει τη φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού άκρου του LBR από την SRPK1, μην επιτρέποντας τη δέσμευση της τελευταίας στην RS ακολουθία, ενώ δέσμευση της SRPK1 και φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας παρεμποδίζει τη δέσμευση της p32. Γ.2.4. Συγκατακρίμνηση της πρωτεΐνης p32 από πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων ποντικού με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt Προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα πιο πάνω πειράματα τα οποία εκτελέστηκαν με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώθηκαν πυρηνικά εκχυλίσματα από όρχεις ποντικού (Β.5) και έγινε συγκατακρήμνιση της πρωτεΐνης p32 που υπάρχει σε αυτά με το ανασυνδυασμένο αμινο-τελικό άκρο του LBR. Για τον έλεγχο της εξειδίκευσης της αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών έγινε και δοκιμή συγκατακρήμνισης με καθαρή GST. Οι καθηλωμένες σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης πρωτεΐνες επωάστηκαν με τα πυρηνικά εκχυλίσματα (~300 μg συνολικής πρωτεΐνης) σε συνολικό όγκο 250 μl σε

141 137 ρυθμιστικό διάλυμα 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2 mm MgCl2 και 1% Triton X-100 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στα δείγματα προστέθηκε διάλυμα διαλυτοποίησης και έγινε ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και έγινε ανοσοανίχνευση της δεσμευμένης p32 χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα της p32 (40). Σχήμα Γ.17. Συγκατακρήμνιση της p32 από πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου με την ανασυνδιασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt. Όπως προκύπτει από την ανοσοαποτύπωση η πρωτεΐνη p32 κατακρημνίζεται εξειδικευμένα από το αμινο-τελικό άκρο του LBR από πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων επιβεβαιώνοντας έτσι τις παρατηρήσεις που έγιναν χρησιμοποιώντας τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης.

142 138 Γ.3. Εντοπισμός των πρωτεϊνών SRPK1, LBR και p32 κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης Δεδομένου ότι η SRPK1 εκφράζεται κατά κύριο λόγο στους όρχεις αλλά και τα επίπεδα των LBR και p32 στο συγκεκριμένο ιστό είναι σχετικά υψηλά (35) έγιναν πειράματα εντοπισμού των τριών αυτών πρωτεϊνών σε ιστούς όρχεων, σε μία πρώτη προσέγγιση για την αποσαφήνιση του ρόλου τους κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Γ.3.1. Διερεύνηση της κατανομής της SRPK1 στα διάφορα στάδια της σπερματογένεσης με ανοσοανίχνευση Προκειμένου να διερευνηθεί η παρουσία της SRPK1 κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης έγινε ανοσοανίχνευση της στα διάφορα στάδια του σωληνίσκου όρχεων αρουραίου που απομονώθηκαν με τη βοήθεια στερεομικροσκοπίου (Β.41). Από τα τμήματα του σωληνίσκου που απομονώθηκαν και αντιστοιχούν σε σπερματογενετικά στάδια έγινε ολική εκχύλιση πρωτεϊνών με προσθήκη διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων (Laemmli Buffer) σε αραίωση 1:1 και μετά από ομογενοποίηση των δειγμάτων έγινε φυγοκέντρηση στα x g για 1 λεπτό και κρατήθηκε το υπερκείμενο. Μετά από βρασμό 5 λεπτών πάρθηκαν δείγματα των 5 μl που αντιστοιχούσαν σε κάθε στάδιο και ηλεκροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12 %. Ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση με το αντίσωμα απέναντι στην SRPK1. Σχήμα Γ.18. Ανοσοανίχνευση της κινάσης πρωτεϊνών SRPK1 σε εκχυλίσματα σπερματογενετικών σταδίων αρουραίου. Σύμφωνα με το αποτέλεσμα της ανοσοανίχνευσης φαίνεται να υπάρχει μία σταθερή κατανομή της SRPK1 μέχρι και τα στάδια VII-VIII, στα οποία παρατηρείται η διαφοροποίηση των σπερματίδων από την κυκλική στην επιμήκη μορφή, ενώ η κινάση μειώνεται σταδιακά

143 139 από το ένατο στάδιο μέχρι την εμφάνιση των ώριμων σπερματόζωων στο στάδιο XIV, όπου η κινάση είναι ελάχιστη. Γ.3.2. Εντοπισμός της SRPK1 με in situ υβριδισμό σε τομές όρχεων ποντικού Σε ένα δεύτερο στάδιο προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η κατανομή της κινάσης στα διάφορα σπερματογενετικά κύτταρα έγινε in situ υβριδισμός σε τομές όρχεων ποντικού, χρησιμοποιώντας ως ιχνηλάτη ραδιενεργά επισημασμένο RNA που αντιστοιχούσε στα πρώτα 860 νουκλεοτίδια της αλληλουχίας της SRPK1 (από ποντίκι). Χρησιμοποιήθηκε τμήμα του αντινοηματικού κλώνου προκειμένου να γίνει ο υβριδισμός με το mrna. Σε πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε τμήμα του νοηματικού κλώνου που δεν έδωσε κανένα σήμα. Η διαδικασία του υβριδισμού περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.42. Σχήμα Γ.19. Εντοπισμός της SRPK1 με in situ υβριδισμό σε τομές όρχεων ποντικού. Ως ιχνηλάτης χρησιμοποιήθηκε ραδιενεργά επισημασμένο RNA που συντέθηκε από το cdna της SRPK1 και αντιστοιχούσε στα πρώτα 860 νουκλεοτίδια της αλληλουχίας της SRPK1. Χρησιμοποιήθηκε τμήμα του αντινοηματικού κλώνου προκειμένου να γίνει ο υβριδισμός με το mrna. Σε πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε τμήμα του νοηματικού κλώνου που δεν έδωσε σήμα. Στην αριστερή φωτογραφία παρουσιάζεται η μορφολογική εξέταση του τμήματος του ιστού μετά από βαφή με PAS-H, ενώ στη δεξιά το σήμα που δίνει ο υβριδισμός. Σύμφωνα και με το αποτέλεσμα του υβριδισμού (σχήμα Γ.19) φαίνεται ότι η SRPK1 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησης κατά τη σπερματογένεση, εκτός από την περίπτωση των ώριμων σπερματόζωων (απουσία σήματος στην περιοχή του αυλού). Έτσι επιβεβαιώνεται περαιτέρω ανοσοανίχνευσης που είχε γίνει προηγουμένως. το αποτέλεσμα της

144 140 Γ.3.3. Υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και p32 σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρων σωληνίσκων ποντικού Η υποκυτταρική εντόπιση του υποδοχέα της λαμίνης Β και της πρωτεΐνης p32 έγινε με ανοσοφθορισμό σε απομονωμένα κύτταρα του σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.41. Για την απομόνωση των κυττάρων επιλέχθηκαν τμήματα του σωληνίσκου των σταδίων VII και VIII, ώστε να περιλαμβάνονται οι σπερματίδες που βρίσκονται στην έναρξη της φάσης επιμήκυνσης. Χρησιμοποιήθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στον LBR και την πρωτεΐνη p32. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι το Cy3 το οποίο κατά το φθορισμό του στο μικροσκόπιο δίνει κόκκινη χροιά. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφηκαν με τη χρωστική ουσία DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) που δεσμεύεται στη χρωματίνη και κατά το φθορισμό δίνει γαλάζια χροιά στον πυρήνα των κυττάρων. Σχήμα Γ.20. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού. Οι σπερματίδες προέρχονται από διάφορα στάδια επιμήκυνσης (Α:Αρχή της επιμήκυνσης, Δ: Επιμήκεις σπερματίδες).

145 141 Σύμφωνα με το αποτέλεσμα του ανοσοφθορισμού (σχήμα Γ.20) ο υποδοχέας της λαμίνης Β εντοπίζεται αρχικά, όταν ξεκινά η διαδικασία επιμήκυνσης, στην περιφέρεια του πυρήνα (Α) ενώ κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης μετακινείται προς το πίσω μέρος των σπερματίδων (Δ). Παρόμοια εντόπιση κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης έχει παρατηρηθεί και για άλλες πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης όπως η LAP2 (214). Η πρωτεΐνη p32 αρχικά εντοπίζεται και αυτή περιπυρηνικά (Α), με παρόμοια κατανομή όπως και ο LBR, γεγονός που επιβεβαιώνει την αλληλεπίδραση τους που παρατηρήθηκε στα πειράματα συγκατακρήμνισης. Όσο προχωρά η διαφοροποίηση των σπερματικών κυττάρων αρχίζει η μετακίνηση της από την περιφέρεια προς τον πυρήνα (Β), η οποία ολοκληρώνεται αργότερα, δίνοντας ισχυρό πυρηνικό σήμα συγχρόνως με μία ασθενή ακροσωμική εντόπιση (Γ) και τελικά μετακινείται ολοκληρωτικά προς την περιοχή του ακροσώματος (Δ). Παρόμοια πειράματα ανοφθορισμού έγιναν και για τον ακριβή προσδιορισμό της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1. Δυστυχώς όμως το πολυκλωνικό αντίσωμα της SRPK1 δεν έδωσε καθόλου σήμα σε πειράματα ανοσοφθορισμού.

146 142 ΜΕΡΟΣ Β Γ.4. Καθαρισμός και μελέτη της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνική κινάση SRPK1 Γ.4.1. Η SRPK1 φωσφορυλιώνεται από κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου και από εκχυλίσματα ευκαρυωτικών κυττάρων HeLa Κατά τη διάρκεια της μελέτης της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στον LBR προέκυψαν δύο βασικά ερωτήματα. Το πρώτο ήταν ότι η δραστικότητα της κυτταρικής SRPK1 ήταν πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με τη δραστικότητα του ανασυνδιασμένου ενζύμου που εκφράζεται σε βακτήρια. Το δεύτερο αφορούσε τη μεγάλη δραστικότητα της κινάσης αυτής στα κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα σε σχέση με τα αντίστοιχα πυρηνικά, αν και μέχρι τώρα γνωστά υποστρώματα της είναι πυρηνικές πρωτεΐνες (βλ. και Εισαγωγή, παρ. Α.3.3, Α.3.4.) Οι παρατηρήσεις αυτές εγείρουν ερωτήματα αναφορικά με την ύπαρξη μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων στο μόριο της SRPK1, οι οποίες είναι δυνατόν να οδηγούν σε ρύθμιση της δράσης της ή/ και της υποκυτταρικής της κατανομής. Ένας συνηθισμένος τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η δράση των κινασών πρωτεϊνών στα κύτταρα είναι η φωσφορυλίωση τους από κάποια άλλη κινάση πρωτεϊνών. Έτσι στην περίπτωση της SRPK1 έγινε δοκιμή κατά πόσο αυτή φωσφορυλιώνεται από το αρχικό κυτταροπλασματικό εκχύλισμα όρχεων αρουραίου καθώς και από εκχύλισμα ευκαρυωτικών κυττάρων HeLa. Για το σκοπό αυτό έγινε επώαση των παραπάνω κυτταρικών εκχυλισμάτων (5 μg από το κάθε εκχύλισμα) με GST-SRPK1 για 30 λεπτά στους 30 C, παρουσία 25 μμ [γ-32ρ]ατρ, 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl2 και 50 mm NaCl. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.21 η SRPK1 πράγματι φωσφορυλιώνεται από κινάση(ες) πρωτεϊνών που υπάρχουν στα εκχυλίσματα των κυττάρων.

147 143 Σχήμα Γ.21. (Α) Ηλεκτροφόρηση σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου (10%) της καθαρής πρωτεΐνης σύντηξης GST-SRPK1 και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) Αυτοραδιογραφία στην οποία παρουσιάζεται η φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 από εκχύλισμα κυττάρων HeLa (5 μg) και κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου (5 μg). Διαδρομές: 1η Αυτοφωσφορυλίωση εκχυλίσματος από κύτταρα HeLa, 2η Φωσφορυλίωση της GSTSRPK1 από εκχύλισμα κυττάρων HeLa, 3η Αυτοφωσφορυλίωση κυτταροπλάσματος όρχεων αρουραίου, 4η Φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 από το κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου. Γ.4.2. Καθαρισμός της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την SRPK1 από κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα όρχεων αρουραίου. Γ Στήλη φωσφοκυτταρίνης Σε ένα επόμενο βήμα έγινε προσπάθεια για τον καθαρισμό και χαρακτηρισμό της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την SRPK1. Ως πρώτη στήλη στη διαδικασία καθαρισμού επιλέχθηκε στήλη φωσφοκυτταρίνης. Χρησιμοποιήθηκε η ίδια στήλη φωσφοκυτταρίνης που είχε χρησιμοποιηθεί και για τον καθαρισμό δραστικότητας LBR κινάσης (βλ. παρ. Γ.1.4.1). Η στήλη εξισορροπήθηκε διαβιβάζοντας 550 ml (10xV στήλης) ρυθμιστικού διαλύματος 0.3 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5 σε θερμοκρασία 4 C. Το κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου (2 g συνολική πρωτεΐνη) διαβιβάστηκε από τη στήλη

148 144 χρωματογραφίας, μετά από αραίωση του στο διάλυμα εξισορρόπησης έως ότου η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη να είναι mg/ml. Ακολούθησε έκπλυση της στήλης με 550 ml από το διάλυμα εξισορρόπησης και έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη με διαβίβαση 400 ml διαβαθμισμένης συγκέντρωσης M NaCl σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-ΗCl ph 7.5. Συλλέχθηκαν κλάσματα των 8 ml (200 σταγόνες/σωλήνα) και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των κλασμάτων παρακολουθήθηκε φασματοφωτομετρικά. Ο έλεγχος των κλασμάτων για δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει την SRPK1 έγινε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα 2 μg από την πρωτεΐνη σύντηξης GST- SRPK1. Επίσης χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα και καζεΐνη (2 μg), προκειμένου να ελεγχθεί η πιθανότητα να εκλούεται αντίστοιχη δράση στην ίδια περιοχή έκλουσης με τη δραστικότητα απέναντι στην SRPK1. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία (119) ότι η κινάση της καζεΐνης 2 συγκρατείται και εκλούεται από στήλη φωσφοκυτταρίνης κάτω από τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν στον παρόντα καθαρισμό. Επωάστηκαν 6 μl από κάθε κλάσμα της στήλης με τα υποστρώματα παρουσία 25 μμ [γ-32ρ] ΑΤΡ, σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5 και 10 mm MgCl2, σε τελικό όγκο επώασης 25 μl (η ρύθμιση έγινε με προσθήκη ddh2o), για 30 λεπτά, στους 30 C. Στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε αυτοραδιογραφία και μέτρηση των ραδιενεργών κρούσεων κατά Cherenkov των αντιστοίχων ζωνών των υποστρωμάτων πάνω στην πηκτή. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.22 η δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην GST-SRPK1, που εντοπίζεται στα κλάσματα της στήλης, εκλούεται στην ίδια περιοχή μαζί με μία δραστικότητα κινάσης απέναντι σε καζεΐνη. Ο υπολογισμός της μέσης συγκέντρωσης των δραστικών κλασμάτων σε NaCl, έδειξε ότι η δράση εκλούεται σε CNaCl= M. Χαρακτηριστικό επίσης είναι ότι η δραστικότητα αυτή εκλούεται περίπου στην ίδια περιοχή που εκλούεται και η δραστικότητα LBR κινάσης (βλ. και σχήμα Γ.4).

149 145 2,0 1,2 8 1,0 4 A2 8 0 c p m x 10 0,9 6 0,6 0, ,0 N a C l ( M) -3 1,5 0,3 Α ρ ι θ μ ό ς Κλ ά σ μ α τ ο ς GST-wtNt GST-SRPK1 Καζεΐνη Σχήμα Γ.22. Κλασμάτωση κυτταροπλάσματος όρχεων αρουραίου σε στήλη φωσφοκυτταρίνης. Στο διάγραμμα διακρίνονται με τετράγωνα οι ραδιενεργές κρούσεις που αντιστοιχούν στο GST-wtNt μετά τη φωσφορυλίωση του από τα κλάσματα της στήλης, με τρίγωνα οι κρούσεις που αντιστοιχούν στη φωσφορυλίωση της GSTSRPK1, και με κύκλους οι κρούσεις που αντιστοιχούν στη φωσφορυλίωση της καζεΐνης. Η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει την περιεκτικότητα των κλασμάτων σε πρωτεΐνη και η στικτή γραμμή τη διαβαθμισμένη συγκέντρωση NaCl που χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση των κλασμάτων. Στις φωτογραφίες παρουσιάζονται τα αντίστοιχα αυτοραδιογραφήματα για κάθε υπόστρωμα.

150 146 Γ Στήλη αγχιστείας Προκειμένου να διαπιστωθεί ότι η δραστικότητα κινάσης που εκλούεται από τη στήλη φωσφοκυτταρίνης και φωσφορυλιώνει την SRPK1 αντιστοιχεί σε δραστικότητα κινάσης καζεΐνης 2 χρησιμοποιήθηκε για τον περαιτέρω καθαρισμό μία στήλη αγχιστείας. Η στήλη παρασκευάστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.9 καθηλώνοντας στα σφαιρίδια της στήλης αποφωσφορυλιωμένη καζεΐνη, η οποία και αποτελεί άριστο υπόστρωμα της CK2. Ο όγκος της στήλης ήταν 3 ml και εξισορροπήθηκε με 30 ml ρυθμιστικού διαλύματος 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5 και 0.1 Μ NaCl. Πριν διαβιβαστούν τα δραστικά κλάσματα της στήλης αραιώθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, ώστε η μέση συγκέντρωση άλατος να είναι ίση με 0.1 Μ NaCl. Η έκπλυση της στήλης έγινε χρησιμοποιώντας 30 ml από το διάλυμα εξισορρόπησης, ενώ η έκλουση των πρωτεϊνών έγινε διαβιβάζοντας από τη στήλη 30 ml διαλύματος διαβαθμισμένης συγκέντρωσης άλατος Μ NaCl σε 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5 σε θερμοκρασία 4 C. Συλλέχθηκαν κλάσματα των 3.5 ml στα οποία έγινε έλεγχος δραστικότητας χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα GST-SRPK1 και απο-φωσφορυλιωμένη καζεΐνη. Η επώαση έγινε για 30 λεπτά, στους 30 C παρουσία 25 μμ [γ-32ρ] ΑΤΡ, σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5 και 10 mm MgCl2. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, αυτοραδιογραφία και μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών των υποστρωμάτων κατά Cherenkov. Και στη στήλη αγχιστείας η δραστικότητα κινάσης που φωσφορυλιώνει την GSTSRPK1 συνεκλούεται με μία δραστικότητα κινάσης της καζεΐνης (Σχήμα Γ.23). Η μέση συγκέντρωση NaCl στην οποία εκλούονται οι δύο δραστικότητες είναι 0.7 Μ.

151 147 2,0 1,5 4 1,0 2 Na Cl ( M ) c p m x , ,1 Α ρ ι θ μ ό ς Κλ ά σ μ α τ ο ς GST-SRPK1 Καζεΐνη Σχήμα Γ.23. Κλασμάτωση των δραστικών κλασμάτων της στήλης φωσφοκυτταρίνης σε στήλη αγχιστείας Affigel-καζεΐνης. Στο διάγραμμα διακρίνονται με τρίγωνο οι ραδιενεργές κρούσεις της GST-SRPK1 μετά τη φωσφορυλίωση της από τα κλάσματα της στήλης, ενώ με κύκλο οι αντίστοιχες ραδιενεργές κρούσεις που αντιστοιχούν στη φωσφορυλίωση της καζεΐνης. Η στικτή γραμμή συμβολίζει τη διαβαθμισμένη συγκέντρωση NaCl που χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση των πρωτεϊνών. Στις φωτογραφίες παρουσιάζονται οι αντίστοιχες αυτοραδιογραφίες.

152 148 Γ Πίνακας καθαρισμού Τα αποτελέσματα του καθαρισμού της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην GST-SRPK1 συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα καθαρισμού. Πίνακας Γ.2. Πρωτόκολλο καθαρισμού της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην GST-SRPK1 από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου. Όγκος (ml) Κυτταρόπλασμα 130 P-Cellulose 64 Affigel-Casein 18 Πρωτεΐνη (mg) Units S/A (U/mgr) Καθαρισμός Απόδοση (%) Η μία μονάδα αντιστοιχεί στο ποσό του ενζύμου που καταλύει τη μεταφορά 0.1 nmol φωσφορικού σε 1 μg GST-SRPK1 μετά από επώαση 30 λεπτών στους 30 C. Γ Χρώση με νιτρικό άργυρο Τα δραστικά κλάσματα της στήλης αγχιστείας συμπυκνώθηκαν έως όγκου 1 ml με υπερδιήθηση σε συσκευή Amicon PM-10. Από το συμπύκνωμα δείγμα όγκου 30 μl (ολική πρωτεΐνη ~1.2 μg) αναλύθηκε σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες. Στην πηκτή έγινε χρώση με νιτρικό άργυρο σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.14. Εμφανίστηκαν τέσσερις ζώνες στην πηκτή μετά τη χρώση (σχήμα Γ.24), μεταξύ των οποίων και δύο ζώνες με μοριακή μάζα 42 και 25 kda, πού αντιστοιχούν στη μοριακή μάζα που εμφανίζουν οι α- και β-υπομονάδες της κινάσης καζεΐνης 2 των θηλαστικών.

153 Σχήμα Γ.24. Χρώση με νιτρικό άργυρο της πηκτής πολυακρυλαμιδίου όπου αναλύθηκε το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας. Στην 1η διαδρομή διακρίνονται οι μάρτυρες μοριακής μάζας ενώ στη 2η οι πρωτεϊνικές ζώνες του συμπυκνώματος της στήλης αγχιστείας. Γ.4.3. Ανοσοανίχνευση της CK2 στα κλάσματα της στήλης αγχιστείας Για να διαπιστωθεί η ύπαρξη της κινάσης της καζεΐνης 2 στο συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας χρησιμοποιήθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στις υπομονάδες της κινάσης καζεΐνης 2, τα οποία ήταν προσφορά του Dr. David Litchfield (University of Western Ontario, Ontario, Canada). Από το συμπύκνωμα των κλασμάτων ελήφθησαν 40 μl τα οποία ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου μαζί με μάρτυρες μοριακού βάρους. Έγινε ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση με αντισώματα απέναντι στην α- και β- υπομονάδα της CK2. Μετά από χρωμοαντίδραση αλκαλικής φωσφατάσης, εμφανίστηκε μία ζώνη με μοριακή μάζα 40 kda, όταν χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα απέναντι στην α-υπομονάδα και μία ζώνη με μοριακή μάζα 25 kda με το αντίσωμα απέναντι στη β-υπομονάδα. Το γεγονός της ανοσοανίχνευσης των υπομονάδων της CK2 στα κλάσματα της στήλης που εμφανίζουν δράση απέναντι στην SRPK1 αποτελεί μια ισχυρή ένδειξη ότι η CK2 αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα κινάσης πρωτεινών που είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση της SRPK1.

154 150 Σχήμα Γ.25. Ανοσοανίχνευση του συμπυκνώματος της στήλης αγχιστείας με αντισώματα απέναντι στην CK2. (Α) Ανοσοανίχνευση με αντίσωμα απέναντι στην α-υπομονάδα. (Β) Ανοσοανίχνευση με αντίσωμα απέναντι στη β-υπομονάδα. Γ.4.4. Αναστολή του συμπυκνώματος των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας από την ηπαρίνη Η ηπαρίνη είναι γνωστός αναστολέας της κινάσης καζεΐνης 2 και χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να αποτελέσει μία πρόσθετη ένδειξη ότι η εκλουόμενη δράση από τη στήλη αγχιστείας είναι η CK2. Επωάστηκαν 6 μl από το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης με GST-SRPK1 παρουσία 25 μμ [γ-32ρ] ΑΤΡ και αυξανομένων ποσοτήτων ηπαρίνης (0, 1, 2, 4, και 8 μg/ml), σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-ΗCl ph mm MgCl2. Η επώαση έγινε σε τελικό όγκο 25 μl (η ρύθμιση έγινε με προσθήκη ddh2o) για 30 λεπτά, στους 30 C. Στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε αυτοραδιογραφία και μέτρηση των ραδιενεργών κρούσεων, που αντιστοιχούσαν στη ζώνη της GST-SRPK1, κατά Cherenkov.

155 151 Σχήμα Γ.26. Αναστολή της δραστικότητας του συμπυκνώματος των δραστικών κλασμάτων της στήλης Affigelκαζεΐνης από αυξανόμενες συγκεντρώσεις ηπαρίνης. Επωάστηκαν 6 μl από το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης με GST-SRPK1 παρουσία 25 μμ [γ-32ρ] ΑΤΡ και αυξανομένων ποσοτήτων ηπαρίνης (0, 1, 2, 4, και 8 μg/ml). Στην αυτοραδιογραφία στην 1η διαδρομή παρουσιάζεται η φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 χωρίς την προσθήκη ηπαρίνης, ενώ στις διαδρομές 2, 3, 4 και 5 εμφανίζεται η φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 μετά την προσθήκη των αντίστοιχων συγκεντρώσεων ηπαρίνης. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.26 αύξηση της συγκέντρωσης της ηπαρίνης, οδηγεί σε κλιμακούμενη αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας που παρουσιάζει το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας απέναντι στην SRPK1. Η αναστολή είναι πλήρης όταν η συγκέντρωση της ηπαρίνης στο δείγμα γίνει 8 μg/ml.

156 152 Γ.4.5. Ανοσοαπομάκρυνση της κινάσης καζεΐνης 2 από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου Η τεχνική της ανοσοαπομάκρυνσης (Β.21) χρησιμοποιήθηκε για να αφαιρεθεί η δραστικότητα κινάσης καζεΐνης 2 από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου και να μελετηθεί η επίδραση της απουσίας της στην φωσφορυλιωτική ικανότητα του εκχυλίσματος απέναντι στην SRPK1. Για το σκοπό αυτό μίγμα αντιορών που αναγνωρίζει τις α και β υπομονάδες της CK2 δεσμεύτηκε σε σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-σεφαρόζης, σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm TrisΗCl ph 7.5, 150 mm NaCl και 1 % Triton X-100. Η δέσμευση έγινε για 2 ώρες στους 4 C. Στη συνέχεια 5 μg από το κυτταροπλασματικό εκχύλισμα επωάστηκαν με τα ανοσοσφαιρίδια δύο φορές συνεχόμενα (δύο διαφορετικά σωληνάκια μικροφυγοκέντρου με ανοσοσφαιρίδια), για 2 ώρες κάθε φορά, στους 4 C, υπό ανάδευση. Τα σφαιρίδια αφού πλύθηκαν 3 φορές με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα ως πηγή δράσης κινάσης καζεΐνης 2. Σε πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε κυτταροπλασματικό εκχύλισμα που είχε υποστεί την ίδια κατεργασία αλλά με σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-σεφαρόζης στα οποία δεν είχαν δεσμευθεί τα αντισώματα απέναντι στις υπομονάδες της CK2. Σχήμα Γ.27. Ανοσοαπομάκρυνση της CK2 από κυτταροπλασματικό εκχύλισμα (5 μg) όρχεων αρουραίου. (1) Φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 από κατεργασμένο κυτταρόπλασμα. με σκέτα σφαιρίδια πρωτεΐνης Ασεφαρόζης. (2) Φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 από την ανοσοκατακρημνισμένη δραστικότητα κινάσης καζεΐνης 2 του κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος. (3) Φωσφορυλίωση της SRPK1 από το κυτταροπλασματικό εκχύλισμα από το οποίο είχε γίνει ανοσοαπομάκρυνση της CK2 χρησιμοποιώντας μίγμα αντισωμάτων απέναντι στις δύο υπομονάδες. Στη φωτογραφία φαίνεται μόνο το τμήμα της αυτοραδιογραφίας στην περιοχή του μάρτυρα με μοριακή μάζα 97 kda. Όπως προκύπτει από το σχήμα Γ.27, στο κυτταροπλασματικό εκχύλισμα που έχει ανοσοαπομακρυνθεί η CK2 η υπολειπόμενη δραστικότητα απέναντι στην GST-SRPK1 είναι ελάχιστη. Η ελάχιστη αυτή δραστικότητα πιθανόν να οφείλεται στη μη πλήρη απομάκρυνση της CK2. Η ανοσοκατακρημνισμένη δε δραστικότητα κινάσης της καζεΐνης 2 φωσφορυλιώνει

157 153 ισχυρά την SRPK1. Τα πειράματα αυτά αποτελούν μία ακόμα ισχυρή ένδειξη ότι η CK2 είναι η κινάση πρωτεϊνών εκείνη η οποία φωσφορυλιώνει την SRPK1. Γ.4.6. Ανάλυση φωσφοπεπτιδίων Η ανάλυση φωσφοπεπτιδίων της SRPK1 πραγματοποιήθηκε μετά από in vitro φωσφορυλίωση της από καθαρή CK2 του εμπορίου αφ ενός και το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης Affigel-καζεΐνης αφ ετέρου. Για το σκοπό αυτό επωάστηκε η πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 τόσο με ανασυνδυασμένη κινάση καζεΐνης 2 (της εταιρείας BioLabs), όσο και με τα δραστικά κλάσματα της στήλης, παρουσία [γ-32ρ] ΑΤΡ για 1.5 ώρα στους 30 C. Οι πρωτεϊνικές ζώνες αναλύθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και έγινε ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη εκτέθηκε σε φιλμ αυτοραδιογραφίας και μετά την εμφάνιση του κόπηκαν οι αντίστοιχες ζώνες της GST-SRPK1 από τη μεμβράνη. Τα τεμάχια της μεμβράνης σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα πολυβίνυλπυρρολιδόνης (PVP-40) 0.5% στους 37 C για 60 λεπτά. Μετά από συνεχόμενες πλύσεις με νερό έγινε η πέψη της πρωτεΐνης από την τρυψίνη προσθέτοντας 15 μl από διάλυμα τρυψίνης 1 mg/ml (TPCK treated) σε 100 μl NH4HCO3 ph Η περαιτέρω διαδικασία της τρυψινόλυσης και του δισδιάστατου διαχωρισμού των φωσφοπεπτιδίων με τεχνικές ηλεκτροφόρησης και χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας περιγράφονται διεξοδικά στις παραγράφους Β.25-Β.26. Η εμφάνιση του φιλμ αυτοραδιογραφίας που προκύπτει από την έκθεση της πλάκας κυτταρίνης για 15 ημέρες στους -70 C, δίνει τους χάρτες φωσφοπεπτιδίων της SRPK1. Στο φιλμ αυτοραδιογραφίας αποτυπώνονται δύο κηλίδες οι οποίες αντιστοιχούν σε αντίστοιχα φωσφοπεπτίδια της SRPK1 που προκύπτουν από φωσφορυλίωση της και από τις δύο δραστικότητες κινάσης (δραστικά κλάσματα στήλης αγχιστείας, ανασυνδυασμένη CK2 του εμπορίου). Αυτή η ταυτόσημη εικόνα που παρουσιάζουν οι δύο χάρτες φωσφοπεπτιδίων αποτελεί ακόμα μία ισχυρή ένδειξη ότι η δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών που απομονώθηκε από τις στήλες χρωματογραφίας και φωσφορυλιώνει την SRPK1 είναι η κινάση καζεΐνης τύπου 2.

158 154 CK2 Δράση από Affigel-Casein Σχήμα Γ.28. Χάρτες φωσφοπεπτιδίων της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση της με ανασυνδιασμένη CK2 (1η αυτοραδιογραφία) και το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης Affigel-καζεΐνης (2η αυτοραδιογραφία). Γ.4.7. Κινητική μελέτη της φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την κινάση καζεΐνης 2 Η κινητική μελέτη της φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την κινάση πρωτεϊνών CK2 έγινε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και ως πηγή δράσης την ανασυνδυασμένη κινάση CK2. Στο πείραμα έγινε in vitro φωσφορυλίωση αυξανομένων συγκεντρώσεων GST-SRPK1, κυμαινόμενων από έως 1.18 μm, σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl2 και 50 mm NaCl. Η συγκέντρωση του ΑΤΡ παρέμενε σταθερή στα 100 μμ. Τα δείγματα επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 30 C. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και αυτοραδιογραφία. Με βάση τις ραδιενεργές κρούσεις που αντιστοιχούσαν σε κάθε συγκέντρωση GST-SRPK1 σχεδιάστηκε καμπύλη διπλού αντιστρόφου Lineweaver-Burk, απ όπου προκύπτει ότι η Km για τη φωσφορυλίωση της SRPK1 από την CK2 είναι 0.1 μμ. Αυτή η τιμή της Km είναι πολύ μικρή, συγκρινόμενη με άλλα υποστρώματα της CK2 (112), υποδεικνύοντας την πολύ μεγάλη αγχιστεία της CK2 για την SRPK1.

159 155 1/v 0,04 0,02 0, / [S] Σχήμα Γ.29. Καμπύλη διπλού αντιστρόφου Lineweaver-Burk, η οποία προέκυψε από την κινητική μελέτη της δράσης κινάσης καζεΐνης 2 με υπόστρωμα την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-SRPK1. Στις ένθετες φωτογραφίες παρουσιάζονται οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις του υποστρώματος όπως εμφανίζονται μετά τη χρώση της πηκτής με Coomasie Brilliant Blue R-250 (πάνω φωτογραφία), καθώς και η αντίστοιχη αυτοραδιογράφια όπου παρουσιάζεται η φωσφορυλίωση του υποστρώματος (κάτω φωτογραφία). Γ.4.8. Ανάλυση φωσφοαμινοξέων της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση της από την CK2 Ως πρώτο βήμα για την εύρεση των θέσεων φωσφορυλίωσης στο μόριο της SRPK1 έγινε ανάλυση των φωσφοαμινοξέων προκειμένου να βρεθεί εάν το αμινοξύ που φωσφορυλιώνεται από την CK2 είναι σερίνη ή θρεονίνη. Η ανάλυση των φωσφοαμινοξέων έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο η οποία περιγράφεται στην παράγραφο Β.23. Συνοπτικά έγινε in vitro φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 με το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας καθώς και με ανασυνδυασμένη CK2 (BioLabs). Μετά των διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη PVDF και έκθεση σε φιλμ. Η ραδιενεργή ζώνη που αντιστοιχεί στην GST-SRPK1 αποκόπηκε από τη μεμβράνη και υπέστη όξινη υδρόλυση σε διάλυμα HCl 5.7 Ν σε θερμοκρασία 110 C για 60 λεπτά. Στο διάλυμα των φωσφοαμινοξέων που προέκυψε, προστέθηκαν και 1 μg από τα τρία φωσφοαμινοξέα (P-Ser, P-Thr, P-Tyr) προκειμένου να

160 156 χρησιμεύσουν ως μάρτυρες για την ταυτοποίηση των ραδιενεργών κηλίδων μετά των δισδιάστατο διαχωρισμό τους σε πλάκες κυτταρίνης. Η πλάκα κυτταρίνης μετά το διαχωρισμό ψεκάστηκε με νυνιδρίνη (0.25% w/v σε ακετόνη) για την εμφάνιση των μαρτύρων. Στη συνέχεια η πλάκα εκτέθηκε σε φιλμ αυτοραδιογραφίας για μία εβδομάδα στους -70 C και μετά την εμφάνιση των ραδιενεργών κηλίδων αυτές συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες των τριών φωσφοαμινοξέων της πλάκας κυτταρίνης. Από τη σύγκριση αυτή, προκύπτει ότι το αμινοξύ που φωσφορυλιώνεται στο μόριο της SRPK1 είναι αποκλειστικά σερίνη. P-S P-T P-Y -O CK2 P-S P-T P-Y -O Δράση από Affigel-Casein Σχήμα Γ.30. Ανάλυση φωσφοαμινοξέων της GST-SRPK1 μετά τη φωσφορυλίωση της από την CK2 (1η αυτοραδιογραφία) και το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας (2η αυτοραδιογραφία). Τα σύμβολα P-S, P-T, P-Y αντιστοιχούν στις κηλίδες που εμφανίζουν η φωσφοσερίνη, φωσφοθρεονίνη και φωσφοτυροσίνη αντίστοιχα., στην πλάκα κυτταρίνης, μετά από ψεκασμό με νινυδρίνη. Το σημείο Ο αντιστοιχεί στην κηλίδα όπου έγινε η ενστάλαξη των δειγμάτων. Γ.4.9. Εύρεση των θέσεων φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 Γ Πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 Σε ένα επόμενο βήμα έγινε ανάλυση της αμινοξικής ακολουθίας της SRPK1 με το πρόγραμμα του διαδικτύου PROSITE ( για την εύρεση των πιθανών

161 157 θέσεων φωσφορυλίωσης της από την κινάση καζεΐνης 2 (213). Σύμφωνα με το πρόγραμμα αυτό υπάρχουν 14 πιθανές σερίνες ή θρεονίνες που ανταποκρίνονται στο μοτίβο (motif) που αναγνωρίζει η CK2. ΠΙΘΑΝΕΣ ΘΕΣΕΙΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΜΟΡΙΟΥ ΤΗΣ SRPK1 ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΙΝΑΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ CK2 ΓΕΝΙΚΟ ΜΟΤΙΒΟ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗΣ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΗΝ CK2 SXXE(D),TXXE(D) Αριθμός Αμινοξέος Αλληλουχία SESD SDDD TALD SVNE SPVE TLME SNNE TSQE SFSE TPAD SGEE TRDE SQEE TAAE Πίνακας Γ.3. Πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης του μορίου της SRPK1 από την CK2 όπως προβλέπονται από το πρόγραμμα PROSITE. Γ Σημειακή μετάλλαξη των πιθανών θέσεων φωσφορυλίωσης στο μόριο της SRPK1 από την CK2 Από τις παραπάνω πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης αποκλείστηκαν σύμφωνα με το αποτέλεσμα της ανάλυσης φωσφοαμινοξέων οι θέσεις που περιέχουν θρεονίνη ως αμινοξύ προς φωσφορυλίωση. Για να διαπιστωθεί ποια από τις υπόλοιπες οκτώ σερίνες αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης της CK2 έγιναν σημειακές μεταλλάξεις στο μόριο της SRPK1 με ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη, ώστε οι υποψήφιες σερίνες να αλλαχθούν σε αλανίνη ή γλυκίνη ώστε να μην είναι δυνατή η φωσφορυλίωση στις θέσεις αυτές. Τα

162 158 ολιγονουκλεοτίδια που σχεδιάστηκαν για το σκοπό αυτό καθώς και η διαδικασία της μετάλλαξης περιγράφονται στην παράγραφο Β.37. Ο σχεδιασμός των ολιγονουκλεοτιδίων ήταν τέτοιος ώστε να προκύψουν οι ακόλουθες μεταλλάξεις: S37ESD S51DDD S222VNE S311PVE S369NNE 1 S436FSE S555GEE S618QEE 655 Ser37 Ala, Ser51 Ala, Ser222 Ala, Ser311 Gly Ser369 Gly, Ser436 Ala, Ser555 Ala, Ser618 Ala Πίνακας Γ.4. Θέσεις των σερινών στο μόριο της SRPK1 που μεταλλάχθηκαν σε αντίστοιχες αλανίνες ή γλυκίνες με σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου της. Η επιτυχής μετάλλαξη των αμινοξέων στις θέσεις αυτές επιβεβαιώθηκε με την εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στις αντίστοιχες περιοχές της SRPK1 σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.35. Οι επιτυχώς μεταλλαγμένοι κλώνοι μετά από πέψη με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoR I και BamH I κλωνοποιήθηκαν στις αντίστοιχες θέσεις των πλασμιδιακών φορέων pgex-2t και pflag-cmv-2 (Β.30), προκειμένου τα μεταλλάγματα να εκφραστούν σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B και ευκαρυωτικά κύτταρα 293Τ, αντίστοιχα.

163 159 C T A G C T A G Ala37 αντί Ser37 Gly 369 αντί Ser369 AGC αντί AGA ACC αντί ACT Ala51 αντί Ser51 Ala436 αντί Ser436 GCT αντί TCT TGC αντί TGA Ala222 αντί Ser 222 Ala555 αντί Ser555 TGC αντί TGA TGC αντί TGA Gly 311 αντί Ser311 Ala618 αντί Ser618 ACC αντί ACT AGC αντί AGA Σχήμα Γ.31. Εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων της SRPK1 μετά τις σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο της. Στο σχήμα η μετάλλαξη της Ser51 σε Ala51 παρουσιάζεται με βάση το νοηματικό κλώνο του γονιδίου, ενώ σε όλες τις άλλες περιπτώσεις με βάση τον αντινοηματικό.

164 160 Γ Έκφραση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B Τα μεταλλάγματα της SRPK1 εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B μετά από τη μεταμόρφωση τους με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pgex-2t. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την έκφραση των μεταλλαγμάτων ήταν η ίδια με αυτή που ακολουθήθηκε για την έκφραση της φυσιολογικής GST-SRPK1 (Γ.1.7). Μετά τον καθαρισμό τους με στήλη σεφαρόζης-γλουταθειόνης οι πρωτεΐνες σύντηξης ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και έγινε βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R GST-SRPK1A GST-SRPK1G GST-SRPK1G GST-SRPK1A GST-SRPK1A GST-SRPK1A GST-SRPK1A GST-SRPK1A GST-SRPK Σχήμα Γ.32. Ηλεκτροφόρηση σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου (10%) της GST-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της (ως πρωτεΐνες σύντηξης με GST) και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250.

165 161 Γ Φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 από την CK2 Προκειμένου να βρεθούν οι θέσεις φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 έγινε in vitro φωσφορυλίωση τόσο της φυσιολογικής GST-SRPK1 όσο και των μεταλλαγμάτων της από ανασυνδυασμένη CK2 (BioLabs). Τα μεταλλάγματα εκείνα τα οποία θα παρουσίαζαν μεγάλη αναστολή στα επίπεδα φωσφορυλίωσης τους, καθώς οι σερίνες τους είναι αλλαγμένες σε αμινοξέα που δεν είναι δυνατό να φωσφορυλιωθούν (Ala ή Gly), θα αντιστοιχούσαν σε θέσεις φωσφορυλίωσης της CK2. Η επώαση έγινε για 5 λεπτά στους 30 C, και τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. αυτοραδιογραφία Από την της πηκτής και τη μέτρηση των αντίστοιχων ραδιενεργών ζωνών προέκυψαν τα ποσοστά φωσφορυλίωσης των μεταλλαγμάτων. Σχήμα Γ.33. Αυτοραδιογραφία της πηκτής μετά από in vitro φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της από την CK2. Στη φωτογραφία φαίνεται μόνο το τμήμα της αυτοραδιογραφίας στην περιοχή του μάρτυρα με μοριακή μάζα 97 kda. Με βάση τα ποσοστά φωσφορυλίωσης (Σχήματα Γ.33 και Γ.34) η μεγαλύτερη αναστολή στη φωσφορυλίωση της SRPK1 από την CK2 παρατηρείται κυρίως στο μετάλλαγμα GST-SRPK1A51 και κατά δεύτερο λόγο στο μετάλλαγμα GST-SRPK1A555. Η αναστολή αυτή οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τις κύριες θέσεις φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την κινάση καζεΐνης 2 αποτελούν οι σερίνες των θέσεων 51 και 555.

166 162 Σχήμα Γ.34. Ποσοστά φωσφορυλίωσης των μεταλλαγμάτων της GST-SRPK1 όπως αυτά προέκυψαν από τη μέτρηση των ραδιενεργών κρούσεων των αντίστοιχων πρωτεϊνικών ζωνών της πηκτής πολυακρυλαμιδίου. (Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 3 πειραμάτων). Γ Ρύθμιση της δράσης της SRPK1 μετά από φωσφορυλίωση από την CK2 Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της φωσφορυλίωσης, από την CK2, στη δραστικότητα της SRPK1 έγινε εκμετάλλευση της ικανότητας της CK2 να χρησιμοποιεί το GTP ως δότη φωσφορικών, το ίδιο αποτελεσματικά με το ATP, ενώ η SRPK1 μπορεί να χρησιμοποιεί μόνο το ΑΤΡ. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται διεξοδικά στην παράγραφο Β.28 και αποτελείται από δύο κύρια στάδια. Ένα στάδιο κατά το δυνατόν στοιχειομετρικής φωσφορυλίωσης της GST-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της GSTSRPK1A51, GST-SRPK1A555 από την CK2, για 1.5 ώρα στους 30 C με δότη φωσφορικών ψυχρό GTP, καθώς και ένα δεύτερο στάδιο που περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση του GSTwtNt από τη φυσιολογική ή μεταλλαγμένη GST-SRPK1 για 5 λεπτά στους 30 C με τη χρήση [γ-32ρ] ΑΤΡ ως δότη της φωσφορικής ομάδας. Στο παρακάτω σχήμα δίνεται ένα σχεδιάγραμμα της μεθοδολογίας που ακολουθήθηκε.

167 163 ΠΡΟΕΠΩΑΣΗ για 1.5 h στους 30 C CK 2 (BioLabs) + GST-SRPK1, GST-SRPK1A51 και GST-SRPK1A555 Δότης φωσφορικών GTP EΠΩΑΣΗ για 5 min στους 30 C (P)-GST-SRPK1, (P)-GST-SRPK1A51 και (P)-GST-SRPK1A555 + GST-wtNt Δότης φωσφορικών το ATP/ATP* ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ / ΑΥΤΟΡΑΔΙΟΓΡΑΦΙΑ Σχήμα Γ.35. Συνοπτική παρουσίαση του πειράματος για τη μελέτη της επίδρασης της φωσφορυλίωσης από την CK2 στη δράση της SRPK1. Με το πρόθεμα (P)- συμβολίζεται η φωσφορυλιωμένη μορφή της GST-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της ενώ με τον αστερίσκο συμβολίζεται το [γ-32ρ] ΑΤΡ. Μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, αυτοραδιογραφία και εμφάνιση του φιλμ (Σχήμα Γ.36) κόπηκαν οι ζώνες που αντιστοιχούσαν στο αμινο-τελικό άκρο του LBR και μετρήθηκαν οι αντίστοιχες ραδιενεργές κρούσεις κατά Cherenkov.

168 GST-SRPK1A CK 2 GST-SRPK1A GST-SRPK1A CK 2 GST-SRPK1A 5 1 GST-SRPK1 + CK 2 GST-SRPK1 164 Σχήμα Γ.36. Αυτοραδιογραφία στην οποία αποτυπώνεται η αύξηση της δραστικότητας της SRPK1 ως προς το GST-wtNt μετά τη φωσφορυλίωση της από την CK2, σε σχέση με τα μεταλλάγματα της στις θέσεις 51 και 555. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η φωσφορυλιωμένη SRPK1 ήταν κατά 5-6 φορές πιο ενεργή σε σχέση με τη μη φωσφορυλιωμένη μορφή της. Τα μεταλλάγματα της όμως στις θέσεις 51 και 555, δεν εμφάνισαν τέτοιο ποσοστό αύξησης της δραστικότητας τους λόγω της αδυναμίας τους να φωσφορυλιωθούν πλήρως από την κινάση καζεΐνης 2. Γ Έκφραση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της φωσφορυλίωσης σε in vivo συνθήκες έγινε κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων της SRPK1 στις θέσεις 51 και 555 στον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2. Η κλωνοποίηση έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου Β.30 και η πέψη του πλασμιδιακού φορέα έγινε με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoRI και BamHI. Για την έκφραση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της επιμολύνθηκαν παροδικά κύτταρα 293Τ, σύμφωνα με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου (παράγραφος Β.40). Η συλλογή των κυττάρων έγινε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τους και μετά την παραμονή τους σε θερμοκρασία 4 C για 30 λεπτά έγινε λύση των κυττάρων, και συλλογή των αντίστοιχων κυτταρικών εκχυλισμάτων μετά από φυγοκέντρηση 15 λεπτών στα x g σε

169 165 θερμοκρασία 4 C. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και η έκφραση των πρωτεϊνών ελέγχθηκε με την ανοσοανίχνευση της FLAG ακολουθίας που αυτά περιέχουν. Δυστυχώς, αν και η SRPK1 εκφράζεται κανονικά στα 293Τ ευκαρυωτικά κύτταρα (βλ. παράγραφο Γ.1.8. και σχήμα Γ.7) τα μεταλλάγματα SRPK1Α51 στα SRPK1Α555 δεν μπορούσαν να ανιχνευθούν με το αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία. Όπως φάνηκε και στα πειράματα ανοσοφθορισμού (επόμενη παράγραφος) ο πληθυσμός των επιμολυσμένων κυττάρων στην περίπτωση των μεταλλαγμάτων ήταν πολύ μικρός, στην περίπτωση της επιμόλυνσης με το μετάλλαγμα SRPK1Α51 ή ανύπαρκτος, στην περίπτωση της επιμόλυνσης με το μετάλλαγμα SRPK1Α555, γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανώς η έκφραση των μεταλλαγμένων κλώνων (κυρίως της SRPK1Α555) να είναι τοξική για τα κύτταρα. Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού της SRPK1 και του μεταλλάγματος της SRPK1Α51 σε ευκαρυωτικά κύτταρα Σε πειράματα ανοσοφθορισμού που έγιναν από την Επικ. Καθηγήτρια Θ. Παπαμαρκάκη (Ιατρική σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) σε παροδικά επιμολυσμένα ευκαρυωτικά κύτταρα με τα γονίδια της SRPK1 και του μεταλλάγματος της SRPK1Α51, μελετήθηκε ο ρόλος της φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την κινάση πρωτεϊνών CK2 στην υποκυτταρική της κατανομή σε συνθήκες in vivo. Το αποτέλεσμα του ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η φυσιολογική μορφή της SRPK1 η οποία εκφράζεται στα παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα κατανέμεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα ενώ ένα μικρό μόνο κλάσμα της εντοπίζεται στον πυρήνα υπό τη μορφή κηλίδων (nuclear speckles). Στο αντίστοιχο πείραμα που έγινε με τη μεταλλαγμένη της μορφή, SRPK1Α51, η οποία αδυνατεί να φωσφορυλιωθεί από την κινάση καζεΐνης 2 στη θέση 51, αυτή παρουσιάζει πλήρη κυτταροπλασματική κατανομή και οι πυρηνικές κηλίδες έχουν εξαφανιστεί (Σχήμα Γ.37). Αν και η κυτταροπλασματική κατανομή του φυσιολογικού κλώνου παραμένει μεγάλη, αυτό μπορεί να αποδοθεί στην υπερέκφραση της SRPK1 μέσα στο κύτταρο, ώστε τα φυσιολογικά επίπεδα της CK2 του κυττάρου να μην επαρκούν για την πλήρη φωσφορυλίωση της. Έτσι εκτός από την αύξηση στη δραστικότητας της SRPK1 που επιφέρει η φωσφορυλίωση από την CK2, είναι πιθανόν να επηρεάζεται και η υποκυτταρική της κατανομή.

170 166 Σχήμα Γ. 37. Ανοσοφθορισμός της SRPK1 και του μεταλλάγματος SRPK1Α51.

171 167 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισμών η τροποποίηση των πρωτεϊνών από διάφορες πρωτεϊνικές κινάσες, αποτελεί έναν από τους κυριότερους μηχανισμούς ρύθμισης των κυτταρικών λειτουργιών. Η δράση των ενζύμων αυτών επηρεάζεται τόσο από εξωγενείς παράγοντες, όπως οι συνθήκες που υπάρχουν στο κυτταρικό περιβάλλον, όσο και από ενδογενείς παράγοντες, όπως η φάση στην οποία βρίσκεται το κύτταρο. Στην εργασία αυτή έγινε μελέτη της δραστικότητας κινάσης πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης, η οποία δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει το αμινο-τελικό ακρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR). Η μελέτη της δραστικότητας αυτής επικεντρώθηκε αρχικά στο χαρακτηρισμό της, μετά από χρωματογραφικό καθαρισμό, χρησιμοποιώντας ως πηγή κυτταροπλασμασματικό εκχύλισμα όρχεων αρουραίου. Σε ένα επόμενο βήμα, μελετήθηκε η επίδραση που έχει η φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού άκρου του LBR στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών του συμπλέγματος του LBR (30). Επίσης μελετήθηκε η εντόπιση της πρωτεϊνικής αυτής κινάσης καθώς και πρωτεϊνών του συμπλόκου του LBR κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Τέλος, αφού η παραπάνω δραστικότητα κινάσης χαρακτηρίστηκε ως η πρωτεϊνική κινάση SRPK1, η μελέτη επεκτάθηκε στη διερεύνηση της ρύθμισης της SRPK1 με φωσφορυλίωση από άλλες κινάσες πρωτεϊνών και τον πιθανό ρόλο που παίζει η τροποποίηση αυτή στη λειτουργικότητα και την υποκυτταρική κατανομή της. Ο καθαρισμός της δραστικότητας RS κινάσης πρωτεϊνών έγινε από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου καθώς αυτό αποτελεί πλούσια πηγή δράσης όπως έδειξαν πειράματα κατανομής της σε ιστούς αρουραίου. In situ επαναδιάταξη της δραστικότητας κινάσης από κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα έδειξε ότι αυτή οφείλεται στο ίδιο ένζυμο και αποτέλεσε την πρώτη ένδειξη ότι πρόκειται για την SRPK1 πρωτεϊνική κινάση λόγω της εμφάνισης μιας ζώνης σε μοριακή μάζα ~97 kda και στις δύο περιπτώσεις. Παράλληλα, πειράματα συγκατακρήμνισης που έγιναν με το αμινοτελικό άκρο του LBR και κυτταροπλασματικό εκχύλισμα όρχεων αρουραίου έδειξαν ότι υπάρχει δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών η οποία δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει το αμινοτελικό άκρο. Για τον καθαρισμό επιλέχθηκε ο κατιονικός ανταλλάκτης φωσφοκυτταρίνη και μία στήλη αγχιστείας στην οποία είχε καθηλωθεί ένα συνθετικό πεπτίδιο που περιείχε την αντίστοιχη ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης του αμινο-τελικού άκρου του LBR. Η εκλουόμενη από τις στήλες χρωματογραφίας δραστικότητα ελέγχθηκε με βάση την ικανότητα φωσφορυλίωσης του αμινο-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β εκφρασμένου ως πρωτεΐνη σύντηξης με

172 168 την GST σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B. Παράλληλα για τη διάκριση μεταξύ της φωσφορυλιωτικής δράσης που οφείλεται σε RS κινάσες ή σε άλλες κινάσες πρωτεϊνών οι οποίες φωσφορυλιώνουν την αμινοτελική περιοχή του LBR, έγινε χρήση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης σύντηξης GST-ΔRS από την οποία είχε αφαιρεθεί η αλληλουχία των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης και το οποίο έτσι δεν έχει δυνατότητα φωσφορυλίωσης από τις RS κινάσες πρωτεϊνών. Τα δραστικά κλάσματα της στήλης αφού συμπυκνώθηκαν αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με νιτρικό άργυρο. Στην πηκτή εμφανίστηκε μόνο μία ζώνη μοριακής μάζας 55 kda η οποία όμως δεν αντιστοιχούσε σύμφωνα με τη φαινόμενη μοριακή της μάζα σε καμία από τις ήδη γνωστές κινάσες πρωτεϊνών αργινίνης/σερίνης. Στην πρωτεϊνική αυτή ζώνη αφού απομονώθηκε μετά την ηλεκτρομεταφορά της σε μεμβράνη PVDF, έγινε ανάλυση της αμινοξικής ακολουθίας της από τον Dr. Volker Kruft (PE Biosystems, Applied Biosystems GmbH, Brunnenweg 13, D Weiterstadt, Germany). Δυστυχώς το αποτέλεσμα υπήρξε αρνητικό καθώς το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης ήταν μπλοκαρισμένο και η μέθοδος της κατά Edman αποικοδόμησης δεν λειτούργησε. Περαιτέρω προσπάθεια μελέτης της πρωτεϊνικής αυτής ζώνης με ανάλυση των εσωτερικών της πεπτιδίων δεν ήταν δυνατή καθώς η ποσότητα που απομονώθηκε δεν επαρκούσε για την εφαρμογή της μεθόδου. Έτσι δεν κατέστη δυνατή η ταυτοποίηση της πρωτεϊνικής αυτής ζώνης ως κινάση πρωτεϊνών ή ως υδρόλυμα της SRPK1 ή σαν κάποια πρωτεΐνη η οποία συγκαθαρίζεται με την εν λόγω δραστικότητα. Στο ίδιο πείραμα δεν ήταν δυνατός ο εντοπισμός κάποιας πρωτεϊνικής ζώνης στην περιοχή του μάρτυρα μοριακής μάζας 97 kda όπως αναμενόταν με βάση το πείραμα της in situ επαναδιάταξης ενζυμικής δραστικότητας. Η μικρή ποσότητα του τελικού δείγματος που παραλαμβάνεται κατά τον καθαρισμό και η μικρή συγκέντρωση πρωτεϊνών σε αυτό, εμπόδισε τον πιθανό εντοπισμό της ζώνης αυτής. Η ενδελεχής μελέτη της εξειδίκευσης που παρουσιάζει η εκλουόμενη δραστικότητα RS κινάσης έγινε με βάση τη φωσφορυλίωση μιας σειράς μεταλλαγμάτων του αμινο-τελικού άκρου του LBR, τα οποία προκύπτουν από σημειακές μεταλλάξεις κάθε μίας από τις σερίνες, της RS αλληλουχίας, σε αλανίνη ή γλυκίνη που δεν φωσφορυλιώνονται. Η φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων τόσο από τη δραστικότητα κινάσης που απομονώθηκε από τις στήλες χρωματογραφίας όσο και από FLAG-SRPK1 που είχε ανοσοκατακρημνιστεί από εκχυλίσματα παροδικά επιμολυσμένων 293Τ κυττάρων, έδειξε ότι και οι δύο αυτές δραστικότητες παρουσιάζουν παρόμοια εξειδίκευση, έχοντας τη δυνατότητα να

173 169 φωσφορυλιώνουν κάθε μία από τις σερίνες της χαρακτηριστικής αυτής ακολουθίας διπεπτιδίων του υποδοχέα. Περαιτέρω μελέτη της εκλουόμενης δραστικότητας έγινε με ανάλυση των φωσφοπεπτιδίων που προκύπτουν από τη φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού άκρου του LBR (GST-wtNt), από το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας καθώς και από ανασυνδυασμένη SRPK1 η οποία είχε εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST. Το αποτέλεσμα της δισδιάστατης ανάλυσης των φωσφοπεπτιδίων έδειξε ότι οι θέσεις φωσφορυλίωσης στο αμινο-τελικό άκρο του LBR είναι ταυτόσημες και στις δύο περιπτώσεις. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε μία ακόμη ένδειξη ότι η εκλουόμενη δραστικότητα RS κινάσης πρωτεϊνών από όρχεις αρουραίων οφείλεται στην SRPK1. Η πιθανότητα η εκλουόμενη δράση RS κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στον LBR να είναι η SRPK1 έκανε επιτακτική την ανάπτυξη αντισωμάτων απέναντι στην SRPK1. Τα πολυκλωνικά αντισώματα παρασκευάστηκαν με ανοσοποίηση κουνελιών χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1. Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν πράγματι η εκλουόμενη δραστικότητα RS κινάσης από τη στήλη αγχιστείας αντιστοιχεί στην SRPK1, τα δραστικά κλάσματα της στήλης αγχιστείας μετά τη συλλογή τους, αφού συμπυκνώθηκαν, αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, έγινε ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ακολούθησε ανοσοανίχνευση με το πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην SRPK1. Εμφανίστηκε μία πρωτεϊνική ζώνη, με μοριακή μάζα ~97 kdα που εμφανίζει την ίδια ηλεκτροφορητική κινητικότητα με την FLAG-SRPK1. Με βάση το αποτέλεσμα αυτό και βιβλιογραφικές αναφορές που αφορούν την ανάλυση των μελών της οικογένειας των SRPK κινασών πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου ενισχύεται η άποψη ότι η SRPK1 είναι αυτή που φωσφορυλιώνει το αμινοτελικό άκρο του LBR, καθώς τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας εμφανίζουν μεγαλύτερη ηλεκτροφορητική κινητικότητα από αυτή (59, 60). Δεδομένου ότι η LBR κινάση έχει την ικανότητα να δεσμεύεται στο αμινο-τελικό άκρο του LBR, στη συνέχεια έγινε έλεγχος εάν η SRPK1 έχει αυτή την ικανότητα. Για το λόγο αυτό, σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης όπου είχαν δεσμευτεί οι GST, GST-wtNt και GST-ΔRS, συγκατακρημνίστηκαν με κυτταρικά εκχυλίσματα κυττάρων 293Τ, όπου είχε υπερεκφραστεί η FLAG-SRPK1 μετά από παροδική τους επιμόλυνση. Ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνών με το Μ5 μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία έδειξε ότι η

174 170 SRPK1 δεσμεύεται ισχυρά στην RS ακολουθία του αμινο-τελικού άκρου του LBR, όπως προκύπτει από την πλήρη αδυναμία δέσμευση της στο GST-ΔRS μετάλλαγμα. Από βιβλιογραφικές αναφορές, είναι γνωστό ότι οι σερίνες μιας αντίστοιχης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που υπάρχει στο μόριο του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2, φωσφορυλιώνονται και από άλλες δραστικότητες κινασών πρωτεϊνών εκτός της οικογένειας των SRPK s, όπως οι CLK κινάσες και η τοποϊσομεράση I (80-89). Για να διαπιστωθεί εάν οι κινάσες αυτές έχουν την ικανότητα να φωσφορυλιώνουν και το αμινοτελικό άκρο του LBR έγιναν πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης με τη χρήση των ανασυνδιασμένων κινασών GST-SRPK1, CLK2 και τοποϊσομεράσης Ι χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα το αμινοτελικό άκρο του LBR και τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2. Παρατηρήθηκε ότι και οι τρεις αυτές δραστικότητες φωσφορυλιώνουν ικανοποιητικά τον ASF/SF2, ενώ αντίθετα μόνο η SRPK1 παρουσιάζει υψηλή δραστικότητα απέναντι στην RS αλληλουχία διπεπτιδίων του GST-wtNt. Το παραπάνω αποτέλεσμα και το γεγονός ότι οι CLK κινάσες πρωτεϊνών παρουσιάζουν ευρύτερη εξειδίκευση σε σχέση με την SRPK1 (85), ενώ η τοποϊσομεράση Ι φωσφορυλιώνει μη στοιχειομετρικά τα υποστρώματα της (87), οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα μέλη της SRPK οικογένειας κινασών πρωτεϊνών είναι πιθανότατα υπεύθυνα για τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα της λαμίνης B στο κύτταρο. Προκειμένου να διαπιστωθεί ο ρόλος της φωσφορυλίωσης του αμινοτελικού άκρου του LBR από την SRPK1 ελέγχθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του αμινοτελικού άκρου με άλλες πρωτεΐνες του συμπλόκου, και συγκεκριμένα με την πρωτεΐνη p32, καθώς σε προηγούμενες μελέτες είχε βρεθεί ότι η πρωτεΐνη αυτή έχει την ικανότητα να δεσμεύεται στην RS ακολουθία διπεπτιδίων του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2, παρεμποδίζοντας τη φωσφορυλίωση του από την SRPK1, και μη επιτρέποντας κατ αυτόν τον τρόπο τη συγκρότηση του συμπλόκου ματίσματος (41). Για το σκοπό αυτό ανασυνδυασμένη p32 η οποία είχε εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα BL21 ως πρωτεΐνη σύντηξης με 6 ιστιδίνες συγκατακρμνήστικε με σφαιρίδια αγαρόζης στα οποία είχαν προηγουμένως δεσμευτεί GST, GST-wtNt, GST-ΔRS καθώς και GST-wtNt φωσφορυλιωμένο κατά το δυνατόν στοιχειομετρικά από την SRPK1. Το αποτέλεσμα της συγκατακρήμνισης, έδειξε ότι η πρωτεΐνη p32 απαιτεί για τη δέσμευση της στο αμινο-τελικό άκρο του LBR την επαναλαμβανόμενη ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης, ενώ ταυτόχρονα, η αλληλεπίδραση αυτή αναστέλλεται πλήρως εάν έχει προηγηθεί φωσφορυλίωση της ίδιας περιοχής από την κινάση πρωτεϊνών SRPK1. Περαιτέρω διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο πρωτεϊνών έδειξε ότι η δέσμευση της p32

175 171 στο αμινο-τελικό άκρο του LBR είναι πολύ ισχυρή καθώς συμβαίνει ακόμα και με την προσθήκη 0.5 Μ NaCl στο ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και καταλήγει σε κατάσταση κορεσμού. Η συγκατακρήμνιση της πρωτεΐνης p32 με το αμινοτελικό άκρο του LBR, όπως φαίνεται από το αντίστοιχο πείραμα προκαλεί απώλεια της ικανότητας δέσμευσης της SRPK1 στο αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα και την ακόλουθη παρεμπόδιση της φωσφορυλίωσης των σερινών της RS αλληλουχίας. Η αναστολή που προκαλεί η πρωτεΐνη p32 στην φωσφορυλίωση της αμινο-τελικής περιοχής του LBR από την SRPK1 αποτελεί γενικότερο φαινόμενο καθώς όπως έχει αναφερθεί η δέσμευση της p32 στις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αργινίνης/σερίνης του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 έχει επίσης ανασταλτικό χαρακτήρα σε σχέση με την φωσφορυλίωση της περιοχής αυτής από την SRPK1 και την συμμετοχή του παράγοντα σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις (41). Αποδεικνύεται λοιπόν από τη σειρά αυτή των πειραμάτων ότι η πρωτεΐνη p32 συναγωνίζεται την SRPK1 για την ικανότητα δέσμευσης στην RS ακολουθία του LBR. Δέσμευση της p32 παρεμποδίζει τη δέσμευση της κινάσης και την ακόλουθη φωσφορυλίωση του LBR ενώ δέσμευση της κινάσης και φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας οδηγεί σε παρεμπόδιση της δέσμευσης της πρωτεΐνης p32. Προκειμένου να διερευνηθεί η σημασία των αλληλεπιδράσεων αυτών έγιναν πειράματα κατανομής και υποκυτταρικής εντόπισης των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στη δημιουργία του συμπλόκου κατά τη σπερματογένεση, λόγω των υψηλών επιπέδων έκφρασης τους στους όρχεις. Στην περίπτωση της κινάσης πρωτεϊνών SRPK1 πειράματα ανοσοανίχνευσης της σε τμήματα σπερματοφόρου σωληνίσκου αρουραίου καθώς και in situ υβριδισμού του mrna της σε τομές όρχεων ποντικού, κατέδειξαν τη συνεχή παρουσία της κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης εκτός από την περίπτωση των ώριμων σπερματόζωων. Συγκεκριμένα, το σήμα ανοσοανίχνευσης της σε ολικά εκχυλίσματα τμημάτων σπερματοφόρου σωληνίσκου αρουραίου παραμένει περίπου σταθερό στην πλειονότητα των σταδίων της σπερματογένεσης, ενώ παρουσιάζεται πολύ αδύνατο στα τελικά στάδια XIII-XIV της σπερματογένεσης. Το ίδιο παρατηρείται και κατά τον in situ υβριδισμό της, όπου τα επίπεδα του mrna παραμένουν σταθερά στις περιοχές του επιθηλίου που αντιστοιχούν στα διαφοροποιούμενα κύτταρα, ενώ υπάρχει πλήρης απουσία σήματος στην περιοχή του αυλού όπου απελευθερώνονται τα σπερματόζωα κατά το τέλος της σπερματογένεσης.

176 172 Η μελέτη της SRPK1 σε πειράματα ανοσοφθορισμού δεν ήταν δυνατή, καθώς το πολυκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για τον σκοπό αυτό, δεν έδωσε κάποιο σήμα κατά την παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Όσον αφορά τις δύο άλλες πρωτεΐνες, ο LBR, στα πειράματα ανοσοφθορισμού, εμφανίζει περιπυρηνική εντόπιση κατά την έναρξη της επιμήκυνσης των σπερματίδων, ενώ μετατοπίζεται προς το πίσω τμήμα του πυρήνα (posterior pole) κατά τα επόμενα στάδια της επιμήκυνσης, ακολουθώντας τη μετατόπιση του πυρηνικού φακέλου. Με βάση βιβλιογραφικές αναφορές, παρόμοια υποκυτταρική εντόπιση εμφανίζει και η πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης LAP2 (214), γεγονός πού επιβεβαιώνει τη συρρίκνωση του πυρηνικού φακέλου κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης, περιοριζόμενος μόνο σε ένα μικρό τμήμα του πυρήνα των σπερματοζωαρίων. Η πρωτεΐνη p32 εντοπίζεται και αυτή περιπυρηνικά κατά την έναρξη της επιμήκυνσης των σπερματίδων, γεγονός που επιβεβαιώνει την αλληλεπίδρασης της με τον LBR όπως είχε δειχθεί στα πειράματα συγκατακρήμνισης. Σε μεταγενέστερα στάδια επιμήκυνσης η πρωτεΐνη p32 μετατοπίζεται σταδιακά στην κεντρική περιοχή του πυρήνα, ενώ στις επιμηκυσμένες σπερματίδες καθώς και στα ώριμα σπερματόζωα εντοπίζεται εξολοκλήρου στην ακροσωμική περιοχή. Ένα πιθανό μοντέλο το οποίο προτείνεται για την ερμηνεία των παρατηρούμενων αλληλεπιδράσεων κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης είναι το ακόλουθο: Σχήμα Δ.1. Σχηματικό μοντέλο των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR), της πρωτεΐνης p32 και του παράγοντα ματίσματος του mrna, ASF/SF2, κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης.

177 173 Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό στα αρχικά στάδια της σπερμιογένεσης η p32 καθηλώνεται στον LBR στην περιοχή της πυρηνικής μεμβράνης, επιτρέποντας τη φωσφορυλίωση, στο πυρηνόπλασμα, του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 στην RS περιοχή του. Κατ αυτόν τον τρόπο καθίσταται δυνατή η συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος και η ακόλουθη ωρίμανση των διαφόρων mrnas (41). Καθώς προχωρά η διαφοροποίηση των γεννητικών κυττάρων όπου σταματά η μεταγραφή και συμπυκνώνεται η χρωματίνη του πυρήνα, η πρωτεΐνη p32 αποδεσμεύεται από τον υποδοχέα της λαμίνης Β και μετακινείται στο πυρηνόπλασμα όπου πιθανά δεσμεύεται στο μη φωσφορυλιωμένο παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 εμποδίζοντας τη φωσφορυλίωση του και την περαιτέρω δημιουργία του συμπλόκου ματίσματος. Έτσι, συγχρόνως το αμινοτελικό άκρο του LBR μένει ελεύθερο να αλληλεπιδράσει με άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα, όπως η πρωταμίνη 1 που παίζουν σημαντικό ρόλο στην συμπύκνωση της χρωματίνης κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης (35, 41, 71). Ο τελικός εντοπισμός της p32 στην ακροσωμική περιοχή των επιμηκυσμένων σπερματίδων στα πειράματα ανοσοφθορισμού συμφωνεί με παλαιότερες μελέτες κατανομής της σε σπερματοζωάρια (215). Αν και δεν έχει αποδοθεί κάποιος συγκεκριμένος ρόλος που να εξηγεί την παρουσία της p32 στο οργανίδιο αυτό, λαμβάνοντας υπόψη την δυνατότητα αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης p32 με την πρωτεΐνη του συμπληρώματος C1q η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση μεταξύ των γεννητικών κυττάρων (216), καθώς και την καθοριστική συμβολή του ακροσώματος στην γονιμοποίηση των ωαρίων από τα σπερματοζωάρια βοηθώντας στη σύζευξη τους, είναι πιθανό η παρουσία της σ αυτό να συμβάλει στην ικανότητα γονιμοποίησης των ώριμων σπερματοζωαρίων συμμετέχοντας σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις κατά την διάρκεια της προσβολής του ωαρίου από το σπερματοζωάριο (176, 215). Έχοντας διευκρινίσει ότι η SRPK1 κινάση πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση της αλληλουχίας επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης του LBR, δημιουργήθηκε το ερώτημα της πιθανής ρύθμισης της δραστικότητας της SRPK1 μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Ερέθισμα για τη μελέτη αυτή αποτέλεσε το γεγονός ότι η κυτταρική SRPK1 εμφανίζει σημαντικά μεγαλύτερη δραστικότητα σε σχέση με το ανασυνδυασμένο ένζυμο. Ένας από τους πιο διαδεδομένους μηχανισμούς ρύθμισης κινασών πρωτεϊνών στο κύτταρο σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, είναι η φωσφορυλίωση τους από άλλες πρωτεϊνικές κινάσες. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε σε πρώτη φάση κατά πόσο η GST-SRPK1, η οποία είχε εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B, μπορούσε να φωσφορυλιωθεί από συνολικό κυτταροπλασμασματικό εκχύλισμα όρχεων αρουραίου καθώς

178 174 και από εκχύλισμα ευκαρυωτικών κυττάρων HeLa. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι και τα δύο κυτταρικά εκχυλίσματα μπορούσαν να φωσφορυλιώσουν ικανοποιητικά την SRPK1. Προκειμένου να χαρακτηριστεί η δραστικότητα αυτή κινάσης που είχε την ικανότητα να φωσφορυλιώνει την SRPK1 έγινε σε πρώτη φάση προσπάθεια καθαρισμού της, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και ως ενζυμική πηγή κυτταροπλασματικό εκχύλισμα όρχεων αρουραίου. Για τον καθαρισμό χρησιμοποιήθηκε αρχικά στήλη ιονικής ανταλλαγής φωσφοκυτταρίνη. Δεδομένου ότι και η κινάση της καζεΐνης τύπου 2 συγκρατείται και εκλούεται από την στήλη φωσφοκυτταρίνης περίπου στην ίδια συγκέντρωση NaCl, τα κλάσματα της στήλης ελέγχθηκαν ως προς τη δραστικότητα τους και με υπόστρωμα αποφωσφορυλιωμένη καζεΐνη για να διαπιστωθεί εάν οι δύο δράσεις συνεκλούονται. Πράγματι, στα κλάσματα όπου ανιχνεύθηκε δραστικότητα απέναντι στην GST-SRPK1, ανιχνεύθηκε και δραστικότητα απέναντι στην καζεΐνη. Το γεγονός ότι οι δύο δράσεις συνεκλούονται από τη στήλη φωσφοκυτταρίνης οδήγησε στη χρήση ως δεύτερου στάδιου καθαρισμού μιας στήλης αγχιστείας Affigel-10, στην οποία είχε καθηλωθεί αποφωσφορυλιωμένη καζεΐνη. Και στην περίπτωση αυτή οι δράσεις απέναντι στην GST-SRPK1 και την αποφωσφορυλιωμένη καζεΐνη συνεκλούονταν, γεγονός που αποτέλεσε την πρώτη ένδειξη ότι η κινάση της καζεΐνης 2 είναι η κινάση η οποία τροποποιεί την SRPK1. Το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας αναλύθηκε σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και μετά από χρώση με νιτρικό άργυρο εμφανίστηκαν διάφορες πρωτεϊνικές ζώνες. Οι πιο χαρακτηριστικές πρωτεϊνικές ζώνες πάνω στην πηκτή, εμφανίστηκαν σε μοριακή μάζα 42 και 25 kda, που αντιστοιχεί στη μοριακή μάζα των α- και β-υπομονάδων της κινάσης καζεΐνης τύπου 2 (CK2). Το γεγονός αυτό αποτέλεσε μία δεύτερη ένδειξη ότι η CK2 είναι η υπεύθυνη κινάση για τη φωσφορυλίωση της SRPK1. Η περαιτέρω ενίσχυση της πιθανότητας αυτής, έγινε δυνατή με την ανοσοανίχνευση στα δραστικά κλάσματα της στήλης αγχιστείας των υπομονάδων της CK2 με τη βοήθεια αντίστοιχων αντισωμάτων, τα οποία μας παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Dr. David Litchfield (University of Western Ontario, Ontario, Canada). Μια από της χαρακτηριστικές ιδιότητες της CK2 είναι και η αναστολή της δραστικότητας της από την ηπαρίνη, η οποία δρα συναγωνιστικά με το υπόστρωμα καθώς δεσμεύεται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου (112). Για το λόγο αυτό τα δραστικά κλάσματα της στήλης επωάστηκαν με υπόστρωμα την GST-SRPK1 παρουσία διαφόρων

179 175 συγκεντρώσεων ηπαρίνης. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι αυξανόμενες συγκεντρώσεις ηπαρίνης προκαλούσαν αντίστοιχη αναστολή στη δραστικότητα των κλασμάτων της στήλης αγχιστείας απέναντι στην SRPK1, γεγονός που ενίσχυσε περαιτέρω την άποψη ότι η εκλουόμενη δράση από το κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου είναι η CK2. Ανοσοαπομάκρυνση της CK2 από κυτταροπλασματικό εκχύλισμα όρχεων με τη χρήση των αντισωμάτων απέναντι στις α- και β- υπομονάδες της, οδηγεί σε σχεδόν πλήρη απώλεια της ικανότητας του να φωσφορυλιώνει την SRPK1. Το πείραμα αυτό επιβεβαιώνει την υπόθεση ότι η απομονωθείσα δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών απέναντι στην SRPK1 οφείλεται κυρίως στην δράση της κινάσης καζεΐνης 2. Περαιτέρω μελέτη της φωσφορυλίωσης του μορίου της SRPK1 από την CK2 έγινε με δισδιάστατη ανάλυση των φωσφοπεπτιδίων που προκύπτουν από τη φωσφορυλίωση της GST-SRPK1 τόσο από το συμπύκνωμα των δραστικών κλασμάτων της στήλης αγχιστείας όσο και από ανασυνδυασμένη CK2 της εταιρείας BioLabs. Τα φωσφοπεπτίδια που προέκυψαν, μετά από την τρυψινόλυση της ραδιενεργά επισημασμένης GST-SRPK1, αναλύθηκαν με δισδιάστατο διαχωρισμό σε πλάκες TLC. Οι χάρτες φωσφοπεπτιδίων και στις δύο περιπτώσεις ήταν πανομοιότυποι, εμφανίζοντας δύο ραδιενεργές κηλίδες με την ίδια ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Το συμπέρασμα που προκύπτει από το σύνολο των πειραμάτων που εκτελέστηκαν είναι ότι η κινάση πρωτεϊνών που ευθύνεται για τη φωσφορυλίωση της SRPK1 είναι η κινάση καζεΐνης 2. Για την εύρεση της θέσης φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 έγινε αρχικά δισδιάστατος διαχωρισμός των φωσφοαμινοξέων που προκύπτουν μετά την όξινη υδρόλυση του φωσφορυλιωμένου μορίου της SRPK1. Το φωσφορυλιούμενο αμινοξύ βρέθηκε ότι είναι σερίνη. Το γεγονός αυτό συνδυαζόμενο με την πρόβλεψη των θέσεων φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 με τη βοήθεια του προγράμματος PROSITE ( οδήγησε στον εντοπισμό 8 πιθανών θέσεων φωσφορυλίωσης που αντιστοιχούν σε σερίνες. Για τον εντοπισμό των σερινών που αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την CK2, παρασκευάστηκαν οκτώ διαφορετικά μεταλλάγματα της SRPK1, καθένα από τα οποία περιείχε και από μία σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο της, η οποία αντιστοιχούσε στην αντικατάσταση μιας σερίνης με αλανίνη ή γλυκίνη. Η δημιουργία των μεταλλαγμάτων αυτών έγινε με τη βοήθεια του in vitro συστήματος σημειακών μεταλλάξεων της εταιρίας Promega έχοντας το γονίδιο της SRPK1 κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα palter-1 και η

180 176 επιβεβαίωση των χρησιμοποιώντας το μεταλλάξεων έγινε με τη μέθοδο των διδεοξυνουκλεοτιδίων Sequencing Kit της εταιρίας Amersham Pharmacia Biotech για την Τ7 εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Τα μεταλλαγμένα γονίδια της SRPK1 κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t, ο οποίος επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτήρια και εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B. In vitro φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων αυτών από την CK2 (BioLabs) με δότη φωσφορικών το [γ-32p] ATP, έδειξε ότι οι δύο κύριες θέσεις φωσφορυλίωσης της SRPK1 από την CK2 είναι η σερίνη της θέσης 51 κατά πρώτο λόγο και η σερίνη της θέσης 555 κατά δεύτερο. Η αναστολή στην φωσφορυλίωση των μεταλλαγμάτων στις σερίνες 51 και 555 του μορίου της SRPK1 όπως εκφράζεται από τον μέσο όρο τριών πειραμάτων είναι ~70% και ~30% αντίστοιχα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τόσο η σερίνη 51 όσο και η σερίνη 555 βρίσκονται εντός των καταλυτικών περιοχών της κινάσης, ελέγχθηκε εν συνεχεία η πιθανότητα να ρυθμίζεται η δραστικότητα της SRPK1 μέσω φωσφορυλίωσης από την CK2. Για το σκοπό αυτό έγινε προεπώαση της GST-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της με την ανασυνδυασμένη CK2 (BioLabs) και δότη φωσφορικών το GTP. Η μεταβολή στην παρατηρούμενη δράση της SRPK1 ελέγχθηκε με την επώαση αυτής και των μεταλλαγμάτων της με υπόστρωμα το GSTwtNt σε συνθήκες in vitro φωσφορυλίωσης και δότη φωσφορικών το [γ-32p] ATΡ. Το αυτοραδιογράφημα που προέκυψε μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου έδειξε ότι η φωσφορυλίωση της SRPK1 από την CK2 αυξάνει τη δράση της απέναντι στο αμινοτελικό άκρο του LBR περίπου 5-6 φορές. Ανάλογη ενεργοποίηση του ενζύμου μετά από φωσφορυλίωση δεν παρατηρείται στα μεταλλάγματα της SRPK1, τα οποία δεν φωσφορυλιώνονται πλήρως από την CK2. Προκειμένου να διερευνηθεί η τροποποίηση στη δομή του μορίου της SRPK1 μετά τη φωσφορυλίωση της από την CK2 χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα spdbv. Το πρόγραμμα αυτό βρίσκεται διαθέσιμο για ελεύθερη χρήση στο διαδίκτυο ( και επιτρέπει την αναπαράσταση του τρισδιάστατου μοντέλου μιας πρωτεΐνης συγκρίνοντας την αμινοξική της ακολουθία με γνωστές πρωτεϊνικές δομές που υπάρχουν στις βάσεις δεδομένων, απαιτώντας ομολογία μεγαλύτερη του 25% μεταξύ της πρωτοταγούς δομής των πρωτεϊνών με τις οποίες γίνεται η σύγκριση. Μία άλλη υπηρεσία που προσφέρει το συγκεκριμένο πρόγραμμα είναι η εισαγωγή μεταλλάξεων σε συγκεκριμένα αμινοξέα πάνω στο τρισδιάστατο μοντέλο και η μελέτη της επίδρασης τους στις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (217, 218). Για τη

181 177 δημιουργία του μοντέλου χρησιμοποιήθηκαν τόσο η πλήρης αμινοξική ακολουθία της SRPK1, όσο και τμήματα αυτής, τα οποία περιελάμβαναν, τα 140 αμινοξέα της αμινο-τελικής περιοχής και τα 164 αμινοξέα της καρβόξυ-τελικής περιοχής του μορίου της SRPK1. Δυστυχώς, η ανάλυση ολόκληρου του μορίου της SRPK1 και της αμινο-τελικής του περιοχής δεν ήταν δυνατή λόγω της πολύ χαμηλής ομολογίας τους με πρωτεΐνες των οποίων η δομή είναι ήδη γνωστή. Το γεγονός αυτό ήταν αναμενόμενο, καθώς κατά την κρυσταλογραφική μελέτη της ομόλογης μορφής της κινάσης (Sky1p) στην ζύμη S. Cerevisiae είχαν αφαιρεθεί 137 αμινοξέα από την αμινο-τελική της περιοχή και το κεντρικό τμήμα αυτής (61). Αντίθετα, η μελέτη του καρβόξυ-τελικού τμήματος της SRPK1, στο οποίο περιέχεται η Ser555, προχώρησε κανονικά. Σύμφωνα με το τρισδιάστατο μοντέλο που παρουσιάζεται στο παρακάτω σχήμα (Δ2Α), η περιοχή φωσφορυλίωσης από την CK2 (554HSGEEYTR561) σχηματίζει βρόχο, στον οποίο το υδροξύλιο της σερίνης βρίσκεται προς το εσωτερικό του, προεξέχει όμως από το επίπεδο που ορίζει αυτός (Δ2Β). Χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα εργαλεία του προγράμματος, δημιουργήθηκε εικονική φωσφορυλίωση στην Ser555 και μελετήθηκαν οι αλλαγές στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αμινοξέων που συμμετέχουν στο βρόχο. Σχήμα Δ.2. (Α) Τρισδιάστατο μοντέλο της καρβόξυ-τελικής περιοχής της SRPK1 όπως σχεδιάσθηκε από το πρόγραμμα spdbv. (Β) Η περιοχή του βρόχου στον οποίο συμμετέχει η Ser555. (Γ) Η περιοχή του βρόχου μετά