ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΜΙΧΟΥ ΕΛΕΝΗ ΙΑΤΡΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΠΜΣ «ΝΑΝΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ» ΜΙΧΟΥ ΕΛΕΝΗ ΙΑΤΡΟΣ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ Α1 ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VON WILLEBRAND ΚΑΙ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ GPIb/IX/V ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2

3 ΜΙΧΟΥ ΕΛΕΝΗ ΙΑΤΡΟΣ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ Α1 ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VON WILLEBRAND ΚΑΙ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ GPIb/IX/V ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με επιβλέπουσα καθηγήτρια την κα. Θεοδώρα Χολή-Παπαδοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βιοχημείας. Μέλη τριμελούς επιτροπής Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια) Καθηγήτρια Τμήματος Χημείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Λογοθετίδης Στέργιος Καθηγητής Τμήματος Φυσικής, Διευθυντής ΔΠΜΣ «Νανοεπιστήμες και Νανοτεχνολογίες», Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Φράγκης Νικόλαος Καθηγητής Τμήματος Φυσικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

4

5 Στον Κυριάκο, για την απεριόριστη υπομονή και συμπαράστασή του

6

7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Τις θερμές ευχαριστίες μου οφείλω στην Καθηγήτρια Βιοχημείας κ. Χολή- Παπαδοπούλου Θεοδώρα υπό την επίβλεψη της οποίας εκπονήθηκε η συγκεκριμένη διπλωματική εργασία. Θα ήθελα να την ευχαριστήσω για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την υποδοχή στο εργαστήριό της, την ουσιαστική συνεργασία και βοήθειά της σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου εργασίας. Κυρίως, όμως, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για την καταλυτική παρουσία της και τις εύστοχες υποδείξεις της τη στιγμή που όλα έμοιαζαν να οδηγούνται σε αδιέξοδο. Πραγματικά, αποτελεί για μένα υπόδειγμα καθηγήτριας, δασκάλας και ανθρώπου. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Φυσικής και Διευθυντή του ΔΠΜΣ «Νανοεπιστήμες & Νανοτεχνολογίες» κ. Λογοθετίδη Στέργιο για την ευκαιρία που μου έδωσε, στα πλαίσια του διατμηματικού αυτού προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών, να συνεργαστώ με επιστήμονες άλλων ειδικοτήτων και να δω την Ιατρική από διαφορετική οπτική γωνία. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω και στον Καθηγητή Φυσικής κ. Φράγκη Νικόλαο για την πολύ σημαντική βοήθεια και τις συμβουλές του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τη Δρ. Παπαχρήστου Ελένη για την καθοδήγησή της στην εκμάθηση των διαδικασιών της εργαστηριακής Βιοχημείας και της Μοριακής Βιολογίας, για τη βοήθεια και την υποστήριξη που μου προσέφερε σε όλη τη διάρκεια διεξαγωγής των βιοχημικών πειραμάτων, αλλά και για τις συμβουλές και τις εμπνευσμένες υποδείξεις της. Τις ευχαριστίες μου θα ήθελα, επίσης, να απευθύνω στην υποψήφια διδάκτορα κ. Τσιτουρούδη Φανή χωρίς τη συνεισφορά της οποίας το πειραματικό μέρος αυτής της διπλωματικής θα ήταν δύσκολο να ολοκληρωθεί, όπως επίσης και στους πτυχιακούς φοιτητές Φωτόπουλο Ιωάννη και Παπαγρηγοράκη Μαριάνε για την πολύτιμη βοήθειά τους. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τους γονείς μου, τον αδελφό μου και τον Κυριάκο για τη στήριξη, την υπομονή και την ενθάρρυνση να φέρω εις πέρας όλους μου τους στόχους.

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 Α.1. Αιμόσταση... 1 Α.2. Ο παράγοντας von Willebrand... 3 Α.2.1. Οι επικράτειες του vwf... 4 Α.2.2. Η μεταλλοπρωτεάση ADAMTS Α.2.3. Βιοσύνθεση και πολυμερισμός του vwf 7 Α.2.4. Αποθήκευση, έκκριση και κυκλοφορία του vwf... 9 Α.3. Ο βιολογικός ρόλος του vwf 10 Α.3.1. Σχηματισμός θρόμβου αιμοπεταλίων. 11 Α.3.2. Αρχική προσκόλληση των αιμοπεταλίων σε θρομβογόνες επιφάνειες.. 13 Α.3.3. Η αλληλεπίδραση του vwf με τον υποδοχέα GPIbα στην αρτηριακή νόσο. 15 Α.3.4. Η συσσώρευση των αιμοπεταλίων και ο σχηματισμός θρόμβου Α.3.5. Η αλληλεπίδραση του vwf με τον παράγοντα VIII.. 18 Α.3.6. Ο ρόλος της ADAMTS A.4. Το σύμπλεγμα του υποδοχέα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων 21 Α.5. Η δομή της επικράτειας Α1 του vwf 23 Α.6. Η αλληλεπίδραση της επικράτειας Α1 του παράγοντα von Willebrand με το σύμπλεγμα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων 25 Α.6.1. Η δομή του συμπλέγματος GPIbα-A1-vWF A.7. Ο ρόλος του συμπλόκου vwf/gpibα σε θρομβωτικές καταστάσεις 32 A.7.1. vwf και Οξέα Στεφανιαία Σύνδρομα 33 Α.7.2. vwf και PCI Α.8. Παρεμβάσεις που στοχεύουν στον vwf A.8.1. Μονοκλωνικά αντισώματα ενάντια στον vwf.. 38 Α AJvW-2 38 Α AJW Α.8.2. Νανοσώματα Α ALX

10 Α ALX Α.8.3. Απταμερή 42 Α ARC Α ARC Α ARC Α.9. Η επικράτεια Α2 του vwf. 46 Α.9.1. Δομή της επικράτειας Α2 του vwf 46 Α.9.2. Σχέσεις των λειτουργιών των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf Α.10. Βιολειτουργικότητα Biofunctionalization 48 Α Υποστρώματα για την καθήλωση πρωτεϊνών.. 49 Α Τεχνικές καθήλωσης πρωτεϊνών.. 52 Α Σύστημα στρεπταβιδίνης βιοτίνης. 52 ΣΚΟΠΟΣ Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ. 57 Β.1. Υλικά. 57 Β.1.1. Βιολογικά υλικά. 57 Β.1.2. Χημικά αντιδραστήρια 57 Β.1.3. Υλικά χρωματογραφίας.. 57 Β.1.4. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Β.2. Μέθοδοι βιοχημείας και μοριακής βιολογίας Β.2.1 Καλλιέργειες βακτηρίων E.coli Β.2.2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (PAGE) Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 59 Β.2.3. Στερέωση και χρώση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 63 Β Χρώση με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R Β Χρώση με νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) Β.2.4. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS-PAGE σε μεμβράνη 65 Β.2.5. Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη (Western Blot) 67 Β.2.6. Χρωματομετρική μέθοδος ανοσοανίχνευσης. 69

11 Β.2.7. Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Β.2.8. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR). 73 Β.2.9. Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR.. 77 Β Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης.. 77 Β Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς 78 Β Πέψη με ένζυμα/ενδονουκλεάσες περιορισμού. 80 Β Αντίδραση λιγάσης 80 Β Αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου. 81 Β Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό κυττάρων (competent cells) 81 B Μέθοδος των δύο διαλυμάτων CaCl Β Μέθοδος δύο διαλυμάτων CaCl 2 (αποθηκεύονται στους -70 ο C) Β Εισαγωγή πλασμιδίου στα επιδεκτικά κύτταρα (μετασχηματισμός) 84 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA.. 85 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική «λύση» και καθαρισμός με φαινόλη/χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη 85 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) 86 Β Υπερέκφραση γονιδίων στο σύστημα pet Β Ήπια λύση κυττάρων με heat shock 89 Β Λύση κυττάρων με υπερήχους (sonication).. 89 Β Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών με ουρά έξι ιστιδινών (His-tag) 90 Β Κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο 92 Β In vivo βιοτινυλίωση πρωτεϊνών.. 93 Β Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών - Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.. 97 Γ.1. Κλωνοποίηση, υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf. 97 Γ.1.1. Ενίσχυση του γονιδίου της Α1 επικράτειας του vwf και κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pet29c(+). 97 Γ.1.2. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.coli TOP10 και BL21(DE3) με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pet29c(+)-a1-vwf 98

12 Γ.1.3. Υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf.. 98 Γ.2. Κλωνοποίηση, βιοτινυλίωση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf. 100 Γ.2.1. Ενίσχυση του γονιδίου της Α1 επικράτειας του vwf μαζί με την ουρά έξι ιστιδινών και κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pan Γ.2.2. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.coli AVB101 με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pan5-α1-vwf, υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της Α1 επικράτειας του vwf. 101 Γ.2.3. Καθαρισμός της βιοτινυλιωμένης Α1 επικράτειας του vwf με ουρά έξι ιστιδινών (His-tag) με τη χρήση στήλης Νi-ΝΤΑ. 102 Γ.2.4. Έλεγχος βιοτινυλίωσης της Α1-vWF-biotin Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δ.1. Κλωνοποίηση, υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της ανθρώπινης Α1 επικράτειας του vwf Δ.2. Ο αποκλεισμός της αλληλεπίδρασης μεταξύ της Α1 επικράτειας του vwf και του υποδοχέα των αιμοπεταλίων ως νέα αντιαιμοπεταλιακή αγωγή ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...115

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. Αιμόσταση Αιμόσταση είναι το σύνολο των φυσιολογικών μηχανισμών του οργανισμού που εξασφαλίζει την ομαλή ροή του αίματος μέσα στα αγγεία, τον έλεγχο της αιμορραγίας μετά από τραυματισμό ενός αγγείου ή μετά από απώλεια αίματος με το σχηματισμό του αιμοστατικού θρόμβου (clot) και τον περιορισμό του θρόμβου με ταυτόχρονη διατήρηση της βατότητας των αγγείων. Η διεργασία είναι δυνατό να διαχωριστεί σε πρωτογενές και δευτερογενές στοιχείο κι αρχίζει, όταν κάποιος τραυματισμός, χειρουργική επέμβαση ή νόσος προκαλέσει διακοπή της συνέχειας του αγγειακού ενδοθηλίου με αποτέλεσμα επαφή του αίματος με τον υποενδοθηλιακό ιστό. Πρωτογενής αιμόσταση ονομάζεται η διεργασία σχηματισμού αιμοπεταλιακού βύσματος στις θέσεις της βλάβης. Λαμβάνει χώρα εντός δευτερολέπτων κι έχει μεγάλη σημασία για τη διακοπή της απώλειας αίματος από τα τριχοειδή, τα μικρά αρτηρίδια και τα φλεβίδια. Η δευτερογενής αιμόσταση περιλαμβάνει τις αντιδράσεις του συστήματος πήξης του πλάσματος που οδηγούν στο σχηματισμό ινώδους. Απαιτεί αρκετά λεπτά της ώρας, για να ολοκληρωθεί. Η αντίδραση αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική στα μεγαλύτερα αγγεία κι εμποδίζει την υποτροπή της αιμορραγίας. Η πρωτογενής και η δευτερογενής αιμόσταση συνδέονται άμεσα (Handin 2005). Η αποτελεσματική πρωτογενής αιμόσταση απαιτεί τρία βασικά γεγονότα: α) προσκόλληση των αιμοπεταλίων, β) απελευθέρωση κοκκίων και γ) συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Εντός μερικών δευτερολέπτων από τη βλάβη του ενδοθηλίου, τα αιμοπετάλια προσκολλώνται σε ινίδια του κολλαγόνου στο αγγειακό υπενδοθήλιο. Η αλληλεπίδραση αυτή με το κολλαγόνο σταθεροποιείται από τον παράγοντα von Willebrand (vwf), μία προσκολλητική γλυκοπρωτεΐνη, η οποία επιτρέπει στα αιμοπετάλια να παραμένουν προσκολλημένα στο αγγειακό τοίχωμα, παρά τις μεγάλες αποσχιστικές δυνάμεις που αναπτύσσονται εντός του αυλού του αγγείου. Τα προσκολλώμενα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια απελευθερώνουν στη συνέχεια προσχηματισμένα κοκκία και σχηματίζουν εξαρχής μεσολαβητές. Το τελικό γεγονός είναι η σύνδεση των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων στο στρώμα των προσκολλημένων αιμοπεταλίων κατά τη διαδικασία συσσώρευσής τους (Handin 2005). 1

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Καθώς σχηματίζεται το πρωτογενές αιμοστατικό βύσμα, ενεργοποιούνται οι πρωτεΐνες πήξης του πλάσματος, για να αρχίσει η δευτερογενής αιμόσταση. Μια συνολική εικόνα της διαδικασίας της πήξης φαίνεται στην Εικόνα 1. Οι δύο πολύ συναφείς οδοί ενεργοποίησης του μηχανισμού της πήξης αναφέρονται ως ενδογενής κι εξωγενής οδός της πήξης. Η εξωγενής οδός περιλαμβάνει τον ιστικό παράγοντα (Tissue Factor, TF) και τον παράγοντα VII (Γαρυπίδου 2004). Ο TF που απελευθερώνεται κατά τον τραυματισμό των αγγείων δημιουργεί σύμπλεγμα με τον παράγοντα VIIa, το οποίο με τη σειρά του ενεργοποιεί περαιτέρω τον VII και μετατρέπει τον παράγοντα Χ σε Χa. Η ενδογενής οδός αποτελείται από τους ενεργοποιημένους παράγοντες XII (ενεργοποιείται σε XIIa μετά την επαφή του με τραυματισμένες επιφάνειες), XI και IX και οδηγεί στην ενεργοποίηση του X. Επίσης, το σύμπλεγμα TF/VIIa δρα και στο ενδογενές σύστημα ενεργοποιώντας τον IX. Ο ενεργοποιημένος Χ (Xa) από την ενδογενή και εξωγενή οδό, με την παρουσία του παράγοντα Va και ασβεστίου οδηγεί στο σχηματισμό θρομβίνης από την προθρομβίνη. Η θρομβίνη μετατρέπει το ινωδογόνο σε μονομερή ινικής. Με την παρουσία του XIIIa τα μονομερή της ινικής αλληλεπιδρούν και ο θρόμβος σταθεροποιείται. Εικόνα 1. Σχηματικό διάγραμμα ορισμένων από τις κλινικά σημαντικές αντιδράσεις του μηχανισμού της πήξης. Διαφαίνεται η άμεση σύνδεση των δύο οδών, ενδογενούς κι εξωγενούς. 2

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.2. Ο παράγοντας von Willebrand Ο παράγοντας von Willebrand (vwf) είναι μία μεγάλη προσκολλητική, πολυμερής γλυκοπρωτεΐνη, η οποία διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στο μηχανισμό της αιμόστασης. Λειτουργεί ως γέφυρα μεταξύ του υποενδοθηλιακού ιστού και των κυκλοφορούντων αιμοπεταλίων στη θέση της αγγειακής βλάβης. Η προσκόλληση και η συσσώρευση των αιμοπεταλίων είναι απαραίτητες για το σχηματισμό μηχανικού αιμοστατικού βύσματος, αλλά και για την αλληλεπίδραση των παραγόντων της πήξης και των φωσφολιπιδίων που απαιτούνται για το σχηματισμό πήγματος ινικής. Η δεύτερη σημαντική λειτουργία είναι η δέσμευση του παράγοντα VIII και ως εκ τούτου η σταθεροποίηση και η προστασία αυτού του παράγοντα από πρόωρη αποδόμηση από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C. Η ομοιόσταση του vwf αποτελεί απαραίτητο χαρακτηριστικό ελέγχου του μηχανισμού της αιμόστασης, καθώς η ελαττωμένη δράση του, είτε λόγω ανεπαρκούς παραγωγής είτε λόγω παρουσίας δυσλειτουργικών μορφών, προκαλεί αιμορραγική διάθεση, ενώ η αυξημένη δράση του ενισχύει τον κίνδυνο θρομβώσεων (Lenting 2007). Ο vwf κωδικοποιείται από ένα γονίδιο που εντοπίζεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 12, το οποίο αποτελείται από 180 kb και 52 εξόνια. Το γονίδιο του vwf μεταγράφεται σε ένα mrna 9 kb, το οποίο με τη σειρά του μεταφράζεται σε μία πρωτεΐνη 2813 αμινοξέων με M r daltons. Στο χρωμόσωμα 22 εντοπίζεται κι ένα ψευδογονίδιο (21 kb) που παρουσιάζει απόκλιση κατά 3,1% από το γονίδιο του vwf και κωδικοποιεί περίπου το 34% της πρόδρομης αλληλουχίας του (Mancuso 1991). Ο vwf συντίθεται ως προ-προ-vwf που αποτελείται από ένα πεπτίδιοσηματοδότη (signal peptide) 22 αμινοξέων, ένα προπεπτίδιο (propeptide) 741 αμινοξέων (γνωστό και ως αντιγόνο ΙΙ του vwf) και το ώριμο μόριο του vwf (mature subunit) 2050 αμινοξέων (Εικόνα 2). 3

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 2. Δομή κι επικράτειες του vwf. Διακρίνονται το πεπτίδιο-σηματοδότης (signal peptide), το προπεπτίδιο (propeptide) και η ώριμη υπομονάδα (mature subunit), όπως επίσης και οι επικράτειες D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Α.2.1. Οι επικράτειες του vwf Στις επικράτειες του vwf αντιστοιχούν επαναλαμβανόμενες περιοχές που είναι υπεύθυνες για διαφορετικές λειτουργίες δέσμευσης του μορίου. Ο προ-προ-vwf διαθέτει τις τέσσερις επικράτειες A, B, C, D σε δύο έως πέντε επαναλήψεις την καθεμία. Συγκεκριμένα υπάρχουν τρεις Α επικράτειες, τρεις Β επικράτειες, δύο C επικράτειες και τέσσερις D επικράτειες. Οι Α επικράτειες αντιστοιχούν στην πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή του vwf. Οι Β επικράτειες είναι μικρές και περιέχουν 25 έως 35 κατάλοιπα αμινοξέων, ενώ οι διπλές C επικράτειες αποτελούνται από 116 έως 119 κατάλοιπα αμινοξέων. Οι τέσσερις D επικράτειες περιέχουν 351 με 376 κατάλοιπα αμινοξέων σε τέσσερα αντίγραφα. Οι επικράτειες εμφανίζονται με την αλληλουχία D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Η πρωτεΐνη είναι εξαιρετικά πλούσια σε κυστεΐνη, η οποία αποτελεί τα 384 από τα 2813 κατάλοιπα αμινοξέων στον προ-προ-vwf (Peyvandi 2011). Οι επικράτειες Α αποτελούν εσωτερικά τριπλά μοτίβα των καταλοίπων του ώριμου vwf. Διακρίνονται στις Α1, Α2 και Α3 και παρουσιάζουν ομοιότητες στην πρωτοταγή και δευτεροταγή τους δομή (Zhang et al 2009). Η επικράτεια Α1 αποτελεί τη θέση πρόσδεσης του γλυκοπρωτεϊνικού υποδοχέα Ib των αιμοπεταλίων (GPIbα). Επιπλέον, διαθέτει διακριτές θέσεις δέσμευσης για την ηπαρίνη, τα σουλφογλυκολιπίδια, το κολλαγόνο, το αντιβιοτικό ριστοσετίνη (rictocetin) και τις πρωτεΐνες βοτροσετίνη (botrocetin) και βιτισετίνη (biticetin) (Sixma et al 1991, 4

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Mendolicchio et al 2005). Η επικράτεια Α2 δε διαθέτει κάποια σαφή λειτουργική θέση δέσμευσης, αλλά αποτελεί το στόχο της μεταλλοπρωτεάσης ADAMTS13. Η αλληλεπίδραση της ADAMTS13 με την επικράτεια Α2 καθορίζει το μέγεθος των κυκλοφορούντων πολυμερών και ρυθμίζει τις λειτουργίες προσκόλλησης (Dent et al 1991). Η επικράτεια Α3 αποτελεί την κύρια περιοχή πρόσδεσης για το ινώδες κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ (Cruz et al 1995). Λίγα είναι γνωστά για τις επικράτειες Β του vwf, Β1, Β2, Β3. Η μετάλλαξη του καταλοίπου Cys 1599 της επικράτειας Β2 σε Phe σχετίζεται με σημαντικές μεταβολές των πολυμερών του vwf και μη φυσιολογική πρωτεόλυση από τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13 (Casonato et al 2007). Οι επικράτειες C ονομάζονται C1, C2 και CK. Η αλληλουχία Arg-Gly-Asp (RGD) που εντοπίζεται στην περιοχή C1 αποτελεί τη θέση αναγνώρισης του υποδοχέα GPIIb/IIIa των αιμοπεταλίων (Beacham et al 1992). Η περιοχή CK που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο είναι πλούσια σε κυστεΐνες και συμμετέχει στο σχηματισμό των διμερών του vwf. Στις επικράτειες D του πρόδρομου vwf περιλαμβάνονται οι D1, D2, D, D3 και D4 που παρουσιάζουν ομοιότητες στην αμινοξική τους αλληλουχία και διαθέτουν 32 έως 36 κατάλοιπα κυστεΐνης η καθεμία. Το προπεπτίδιο του vwf απαρτίζεται από τις επικράτειες D1 και D2 που εντοπίζονται ακριβώς πριν από το αμινοτελικό άκρο του ώριμου vwf. Στον ώριμο vwf εντοπίζεται ένα μέρος της επικράτειας D, η D3 και η D4 μεταξύ των επικρατειών Α και Β (Καρούλια 2011). Οι επικράτειες D -D3 περιέχουν θέσεις δέσμευσης για τον παράγοντα FVIII και την P-σελεκτίνη (Sadler 1998). Η P-σελεκτίνη διαμεσολαβεί την πρόσδεση των ULvWF στην ενδοθηλιακή επιφάνεια διευκολύνοντας με τον τρόπο αυτό την αποικοδόμηση των πολυμερών από την ADAMTS13 μέσω αποκάλυψης της θέσης πρωτεόλυσης στην επικράτεια Α2 (Michaux et al 2006). Τα κατάλοιπα των κυστεϊνών της επικράτειας D3 συμμετέχουν σε διαμοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς κατά τη δημιουργία των πολυμερών του vwf, ενώ αυτά των D, D1, D2 και D4 εμπλέκονται αποκλειστικά σε ενδομοριακούς δεσμούς (Ruggeri et al 1993). Στην επικράτεια D2 εντοπίζεται η αλληλουχία RGD και η περιοχή πρόσδεσης του κολλαγόνου, ενώ στις D και D3 οι περιοχές δέσμευσης της ηπαρίνης και του παράγοντα FVIII (Peyvandi et al 2011). 5

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.2.2. Η μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13 Η ADAMTS13 ανήκει στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεασών ADAMTS (A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin type-1 motif) που σχετίζονται συνήθως με την αποικοδόμηση πρωτεϊνών της εξωκυττάριας μήτρας και οι οποίες με τη σειρά τους σχετίζονται με τη μεγαλύτερη οικογένεια ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease) (Levy et al 2005, Εικόνα 3). Πρόκειται για μία Zn 2+ /Ca 2+ εξαρτώμενη πρωτεάση, το γονίδιο της οποίας εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 9q34 (Nishio et al 2004). Η ADAMTS13 εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ από τα αστεροειδή κύτταρα, ενώ ανευρίσκεται επίσης στα αιμοπετάλια, σε καλλιεργημένα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα σπειραματικά ποδοκύτταρα (de Groot et al 2010). Είναι μία μεταλλοπρωτεάση με πολλές επικράτειες/περιοχές, οι οποίες εμφανίζονται με την εξής σειρά από το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης: περιοχή μεταλλοπρωτεάσης (metalloprotease domain, MP), περιοχή που ομοιάζει με δισιντεγκρίνη (disintegrin-like domain, Dis), μία επανάληψη θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (thrombospondin type 1 repeat, TSP1), περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη (cysteine-rich domain), ενδιάμεση περιοχή (spacer domain), επτά επιπλέον TSP1 επαναλήψεις. Επιπλέον, η ADAMTS13 είναι η μοναδική πρωτεΐνη της οικογένειας ADAMTS, η οποία διαθέτει δύο περιοχές CUB στο καρβοξυτελικό άκρο της (Zheng et al 2001). Εικόνα 3. Σχηματική απεικόνιση των μεταλλοπρωτεασών ADAM, ADAMTS και ADAMTS 13. Το μέγεθος των πολυμερών του vwf παίζει καθοριστικό ρόλο στη λειτουργία του, καθώς τα μεγαλύτερα πολυμερή όχι μόνο διαθέτουν περισσότερες θέσεις σύνδεσης με το κολλαγόνο και τα αιμοπετάλια, αλλά επιπλέον ξεδιπλώνονται 6

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ γρηγορότερα αποκαλύπτοντας με τον τρόπο αυτό τις περιοχές δέσμευσης των αιμοπεταλίων. Το μέγεθος των πολυμερών (και συνεπώς η ικανότητα του vwf να προσδένει τα αιμοπετάλια) ρυθμίζεται από την ADAMTS13. Συγκεκριμένα, η ADAMTS13 υδρολύει έναν πεπτιδικό δεσμό μεταξύ αμινοξέων στην επικράτεια Α2 του vwf, διασπώντας τον σε μικρότερα πολυμερή. Η σημασία της ADAMTS13 καταδεικνύεται στους ασθενείς με ανεπάρκεια της μεταλλοπρωτεάσης, οι οποίοι αναπτύσσουν θρομβωτική μικροαγγειοπάθεια (Levy et al 2001). Ο σχηματισμός θρόμβων πλούσιων σε αιμοπετάλια οφείλεται στην παραμονή στο πλάσμα των ασθενών αυτών των ULvWF σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από τις φυσιολογικές, λόγω απουσίας της ADAMTS13. Α.2.3. Βιοσύνθεση και πολυμερισμός του vwf Η βιοσύνθεση του vwf περιορίζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα μεγακαρυοκύτταρα (Jaffe 1974, Sporm1985). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, στα ενδοθηλιακά κύτταρα ο vwf συντίθεται ως προ-προ-vwf (πεπτίδιο-σηματοδότης, προπεπτίδιο και ώριμο μόριο). Μετά τη σύνθεση στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το πεπτίδιο-σηματοδότης αποκόπτεται και σχηματίζονται ενδομοριακοί δισουλφιδικοί δεσμοί μεταξύ των CK περιοχών. Τα προκύπτοντα ομοιοπολικά προ-vwf διμερή αποτελούν τις πρωτομερείς μονάδες του πολυμερισμού. Κατά τη μεταφορά τους διαμέσου της συσκευής Golgi τα διμερή σουλφώνονται και γλυκοζυλιώνονται. 22 (10 Ο- και 12 N-linked) ολιγοσακαχαριδικές αλυσίδες προστίθενται στο μόριο του vwf και αποτελούν περίπου το 20% της μάζας του. Ο πολυμερισμός επιτυγχάνεται μέσω δισουλφιδικών δεσμών που συνδέουν τα αμινοτελικά άκρα του κάθε διμερούς στις D3 επικράτειες. Τα μεγαλύτερα πολυμερή που προκύπτουν (ULvWF) είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική βιολογική λειτουργία του vwf. Ως τελικό αποτέλεσμα, ο ώριμος vwf εξέρχεται στο πλάσμα με τη μορφή ολιγομερών, τα οποία αποτελούνται από διαφορετικό αριθμό υπομονάδων, από (το ελάχιστο) δύο μέχρι (το μέγιστο) σαράντα, με τα μεγαλύτερα πολυμερή να έχουν μοριακό βάρος που ξεπερνά τα kda (Sadler 1998) (Εικόνα 4). Μετά τον πολυμερισμό γίνεται μεταφορά στο μετα-golgi δίκτυο, όπου το προπεπτίδιο vwf αποκόπτεται από ένζυμα (φουρίνη ή σχετικές πρωτεάσες) και το πολυμερές προϊόν εκκρίνεται άμεσα ή αποθηκεύεται στα αιμοπετάλια (Ruggeri et al 2007). 7

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 4. Σχηματική απεικόνιση του πολυμερισμού του vwf και του σχηματισμού των ULvWF. Ο ώριμος vwf με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μικροσκοπίου εμφανίζεται είτε ως μία ινώδης δομή με διάμετρο 2-3 nm και μήκος μέχρι 1300 nm είτε ως ελικωμένο μόριο με διάμετρο nm. Το ώριμο μόριο προκύπτει από ενδοκυττάριες διαδικασίες που καταλήγουν στην αποθήκευση κι έκκριση ενός ετερογενούς πληθυσμού πολυμερών γλυκοπρωτεϊνών που καλούνται συλλογικά vwf. Το προπεπτίδιο του vwf φαίνεται ότι απαιτείται για τη φυσιολογική δημιουργία των ULvWF, αλλά ο τρόπος με τον οποίο μετέχει στο σχηματισμό τους παραμένει ένα ενδιαφέρον ερώτημα. Παρόλο που το σύστημα Golgi δε διαθέτει πρωτεΐνες συνοδούς που μπορούν να μετέχουν στη δομική διαμόρφωση άλλων πρωτεϊνών και το περιβάλλον του είναι όξινο μη ευνοώντας τη δημιουργία των δισουλφιδικών δεσμών, σε περίπτωση μεταβολής των συνθηκών, δεν επιτυγχάνεται ο πολυμερισμός του vwf. Μια εκδοχή είναι πως το προπεπτίδιο μπορεί να λειτουργεί ως ενδογενής οξειδοαναγωγάση ευαίσθητη στο PH και να καταλύει το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών για το σχηματισμό των ULvWF (Καρούλια 2011). 8

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.2.4. Αποθήκευση, έκκριση και κυκλοφορία του vwf Ο vwf που συντίθεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα είτε απελευθερώνεται απευθείας στο πλάσμα μέσω ενός ρυθμιζόμενου μονοπατιού έκκρισης είτε αποθηκεύεται σε οργανίδια γνωστά ως σωμάτια Weibel-Palade (WPBs), τα οποία είναι ραβδόμορφα σωμάτια μοναδικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Εικόνα 5). Ο vwf δεν αποθηκεύεται απλά στα εν λόγω σωμάτια, αλλά επιπλέον συμβάλλει και στο σχηματισμό τους. Η αποθήκευση του vwf με τη μορφή σωληνωδών δομών έχει ως αποτέλεσμα τη συμπύκνωσή του κατά 100 φορές, διαμορφώνει το μοναδικό σχήμα των WPBs, ενώ συγχρόνως είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της αιμοστατικής λειτουργίας της πρωτεΐνης (Michaux et al 2006). Εικόνα 5. Σωμάτια Weibel-Palade (WPBs). Μεγάλα ραβδόμορφα εκκριτικά οργανίδια μοναδικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εικόνα ανοσοφθορισμού ανθρώπινου ενδοθηλιακού κυττάρου σεσημασμένου με ειδικά αντισώματα εναντίον της κύριας πρωτεΐνης των WPBs, του vwf (πράσινο) και του ηωσινόφιλου χημειοτακτικού eotaxin-3 (κόκκινο). Ο vwf αποθηκεύεται στα WPBs με τη μορφή των μεγαλύτερων πολυμερών ULvWF, τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν ανευρίσκονται στο πλάσμα φυσιολογικών ατόμων. Το περιεχόμενο των WPBs εκκρίνεται σε απόκριση σε μία ποικιλία φυσιολογικών ερεθισμάτων (Wagner 1990). Τα πολυμερή του vwf και το προπεπτίδιο εκκρίνονται σε αναλογία 1:1, αλλά τελικά ακολουθούν διαφορετικούς δρόμους. Αμέσως μετά την έκκριση, το προπεπτίδιο αποκόπτεται από τα πολυμερή και κυκλοφορεί ανεξάρτητα ως ένα μη ομοιοπολικό ομοδιμερές με πολύ μικρό χρόνο 9

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ημίσειας ζωής περίπου 2 ωρών. Τα επίπεδα του προπεπτιδίου στο πλάσμα είναι της τάξης του 1 μg/ml. Αντιθέτως, τα πολυμερή απομακρύνονται πιο αργά με χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 12 ώρες και μέση συγκέντρωση στο πλάσμα περίπου 10 μg/ml. Το δεύτερο σημείο αποθήκευσης του vwf είναι τα α-κοκκία των αιμοπεταλίων και των μεγακαρυοκυττάρων, τα οποία περιέχουν μέχρι και 20% του συνολικού vwf που κυκλοφορεί στο πλάσμα. Όπως και στα WPBs, στα α-κοκκία των αιμοπεταλίων περιέχεται λειτουργικός κι ολοκληρωμένος vwf με τη μορφή των ULvWF. Η απελευθέρωση του vwf από τα α-κοκκία διεγείρεται, επίσης, από ποικιλία ερεθισμάτων κι εξασφαλίζει τη διαθεσιμότητα των ULvWF πολυμερών στις περιοχές αγγειακού τραυματισμού. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα λαμβάνουν χώρα δύο οδοί έκκρισης του vwf, μία ιδιοσυστατική που σχετίζεται με τη σύνθεση του παράγοντα και μία ρυθμιζόμενη που αφορά την αποθήκευση και απελευθέρωση του παράγοντα από εκκριταγωγά ερεθίσματα. Στα μεγακαρυοκύτταρα και στα αιμοπετάλια μόνο η ρυθμιζόμενη οδός είναι λειτουργική in vivo, οπότε το σύνολο του vwf που κυκλοφορεί στο πλάσμα είναι αποκλειστικά ενδοθηλιακής προέλευσης. Α.3. Ο βιολογικός ρόλος του vwf Ο vwf έχει τρεις σημαντικές λειτουργίες στη διαδικασία σχηματισμού θρόμβου. Πρώτον, η σύνδεση του vwf στα αιμοπετάλια είναι κριτικής σημασίας για τη φυσιολογική προσκόλληση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων, που λαμβάνει χώρα σε υψηλούς ρυθμούς διάτμησης. Η σύνδεση στα αιμοπετάλια απαιτεί ενεργοποίηση του vwf και επακόλουθη δομική αλλαγή, ώστε η Α1 περιοχή να προσδεθεί στον υποδοχέα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων. Η σύνδεση αυτή πραγματοποιείται ακόμα και σε μη ενεργοποιημένα αιμοπετάλια (Miura et al 2000). Ένας δεύτερος υποδοχέας των αιμοπεταλίων, ο GPIIb/IIIa, δεν προσδένει τον vwf αν τα αιμοπετάλια δεν είναι ενεργοποιημένα. Η αλληλεπίδραση μεταξύ αιμοπεταλίων, υποδοχέα GPIIb/IIIa και vwf συνεισφέρει στην τελική, μη αναστρέψιμη σύνδεση των αιμοπεταλίων στην υποενδοθηλιακή στιβάδα και παίζει κύριο ρόλο στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων ιδίως σε συνθήκες υψηλής διατμηματικής τάσης (Fredrickson et al 1998). 10

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Δεύτερον, ο vwf συνδέεται με διάφορους τύπους κολλαγόνου, κυρίως με το κολλαγόνο τύπου IV στον υποενδοθηλιακό συνδετικό ιστό (Santoro 1981). Η σύνδεση του κολλαγόνου προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση της περιοχής πρόσδεσης του παράγοντα VIII με αποτέλεσμα να ελαττώνεται η συγγένεια του vwf για τον παράγοντα VIIΙ. Συνεπώς, ο ελεύθερος παράγοντας VIII υποστηρίζει τοπικά το σχηματισμό θρόμβου ινικής (Bendetowicz et al 1999). Το γεγονός αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία στην περίπτωση των οξέων στεφανιαίων συνδρόμων. Τρίτον, ο vwf συμμετέχει στο σχηματισμό θρόμβου ινικής λειτουργώντας ως πρωτεΐνη φορέας για τον παράγοντα VIII. Χωρίς τον vwf ο χρόνος ημίσειας ζωής του παράγοντα VIII ελαττώνεται κατά δέκα έως είκοσι φορές, λόγω πρωτεόλυσης από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C και το συμπαράγοντά της, την πρωτεΐνη S (Koedam et al 1988). Η κλινική σημασία του παράγοντα VIII διαφαίνεται από το γεγονός ότι η έλλειψή του προκαλεί τη θορυβώδη κλινική εικόνα της αιμορροφιλίας α. Επιπλέον, ο παράγοντας VIII ελαττώνεται περαιτέρω στη νόσο von Willebrand. Τα χαμηλά επίπεδα του παράγοντα VIII οδηγούν σε ελαττωματικό σχηματισμό θρόμβου ινικής, όπως επίσης και σε ελαττωμένο σχηματισμό της πρωτογενούς πλάκας αιμοπεταλίων στους εν λόγω ασθενείς. Τέλος, η σημασία του vwf στις θρομβωτικές καταστάσεις αντανακλάται και στη βιολογική λειτουργία της ADAMTS13. Η μεταλλοπρωτεϊνάση αυτή μετατρέπει ενζυματικά τα μεγάλα πολυμερή του vwf (ULvWF) σε μικρότερα μόρια. Επειδή τα ULvWF είναι περισσότερα ενεργά στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, η αδυναμία διάσπασής τους σε μικρότερα μόρια προάγει τη θρόμβωση (Dong et al 2002). Είναι γεγονός ότι οι ασθενείς με έλλειψη της ADAMTS13 διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο θρόμβωσης. Επιπλέον, η συσχέτιση της θρομβωτικής θρομβοπενικής πορφύρας με αντισώματα κατά της ADAMTS13 ή με συγγενή έλλειψή της καταδεικνύει το φυσιολογικό ρόλο της εν λόγω πρωτεάσης. Α.3.1. Σχηματισμός θρόμβου αιμοπεταλίων Οι σύνθετες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων, του τοιχώματος των αγγείων και των μορίων σε διάλυμα, οι οποίες λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής αιμόστασης επηρεάζονται από τη ροή του αίματος. Η ταχύτητα του αίματος κοντά στο τοίχωμα του αγγείου είναι μικρότερη από αυτή στο κέντρο του αγγείου. Η διαφορά αυτή στην ταχύτητα δημιουργεί διατμηματική τάση μεταξύ 11

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παρακείμενων στρωμάτων υγρών, η οποία είναι μεγαλύτερη κοντά στο τοίχωμα του αγγείου κι ελαττώνεται προοδευτικά προς το κέντρο του αυλού του αγγείου (Εικόνα 6). Ο ρυθμός διάτμησης (shear rate), η διαφορά στην ταχύτητα ροής ως συνάρτηση της απόστασης από το τοίχωμα του αγγείου, εκφράζεται σε cm/sec ανά cm ή sec -1. Η διατμηματική τάση είναι η δύναμη ανά μονάδα επιφάνειας κι εκφράζεται σε Pascal (Pa), ισοδύναμο με 1 N/m 2 ή σε dynes/cm 2 (1 Pa = 10 dynes/cm 2 ). Ο ρυθμός διάτμησης είναι ανάλογος προς τη διατμηματική τάση κι αντιστρόφως ανάλογος προς το ιξώδες του υγρού. Για το αίμα, του οποίου το ιξώδες είναι περίπου 0,004 Pa x sec (ή 0,04 dynes/cm 2 x sec), διατμηματική τάση 1 dyne/cm 2 αντιστοιχεί σε ρυθμό διάτμησης 25 sec -1. Η δύναμη που αντιτίθεται στη σταθερή προσκόλληση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων αυξάνεται με το ρυθμό διάτμησης. Συνεπώς, τα φαινόμενα διάτμησης είναι εντονότερα στις περιοχές του αγγειακού δέντρου όπου οι δυνάμεις διάτμησης είναι μεγαλύτερες (δηλαδή στις αρτηρίες περισσότερο από τις φλέβες) και ιδίως στα αρτηριόλια. Οι μεγαλύτεροι ρυθμοί τοιχωματικής διάτμησης σημειώνονται στα μικρά αρτηριόλια διαμέτρου 10-50μm και κυμαίνονται μεταξύ 500 και 5000 sec -1. Ρυθμοί διάτμησης της τάξης των 3000 έως sec -1 έχουν μετρηθεί στην κορυφή πλακών που προκαλούν 50% απόφραξη των στεφανιαίων αρτηριών, ενώ ακόμα μεγαλύτερες τιμές (>50000 sec -1 ) έχουν υπολογιστεί στις κορυφές ακόμα μεγαλύτερων στενώσεων (Strony et al 1993). Εικόνα 6. Σχηματική αναπαράσταση της ροής του αίματος εντός του αυλού ενός αγγείου και του φαινόμενου της διατμηματικής τάσης. Ο ρυθμός διάτμησης είναι η μεταβολή της ταχύτητας σε συνάρτηση με την απόσταση μετρούμενη κάθετα προς την κατεύθυνση της ροής. Το αρνητικό πρόσημο σημαίνει ότι η βαθμίδωση γίνεται από το κέντρο (μέγιστη ταχύτητα) προς το τοίχωμα του αγγείου (ελάχιστη ταχύτητα). 12

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.3.2. Αρχική προσκόλληση των αιμοπεταλίων σε θρομβογόνες επιφάνειες Η θρομβογένεση αρχίζει σε περιοχές αγγειακού τραυματισμού, λόγω αλληλεπιδράσεων του τύπου συνδέτη-υποδοχέα, οι οποίες εξαρτώνται από την ταχύτητα του ρέοντος αίματος. Σε ρυθμούς διάτμησης μεγαλύτερους από το όριο των ~ 1000 sec -1 η όλη διαδικασία εξαρτάται αποκλειστικά από τον vwf και τον υποδοχέα GPIbα, ακόμα και σε υποστρώματα στα οποία η προσκόλληση των αιμοπεταλίων μπορεί να πραγματοποιηθεί σε χαμηλότερους ρυθμούς διάτμησης (Savage et al 1998). Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της αλληλεπίδρασης μεταξύ της Α1 επικράτειας του vwf και του υποδοχέα GPIbα είναι η ικανότητα πρόσδεσης των αιμοπεταλίων σε θρομβογόνες επιφάνειες, ακόμα και όταν η ταχύτητα ροής του αίματος κοντά στο τοίχωμα του αγγείου είναι αυξημένη. Εντούτοις, η αλληλεπίδραση αυτή χαρακτηρίζεται επίσης από έναν ταχύ ρυθμό αποδέσμευσης με αποτέλεσμα τα αιμοπετάλια να μην ακινητοποιούνται πλήρως αλλά να κινούνται διαρκώς με πιο αργό ρυθμό κατά τη ροή του αίματος. Η ταχύτητα μετατόπισης είναι τυπικά μικρότερη από το 2% της ελεύθερης ταχύτητας ροής των μη αλληλεπιδρώντων αιμοπεταλίων στην ίδια απόσταση από την επιφάνεια του αυλού. Αυτή η αργή κίνηση επιτρέπει την ανάπτυξη επιπρόσθετων δεσμών μεταξύ υποδοχέων που ανήκουν κυρίως στην υπεροικογένεια των ιντεγκρινών. Τέτοιοι υποδοχείς διαθέτουν μικρότερο ρυθμό δημιουργίας δεσμών σε σύγκριση με τον υποδοχέα GPIbα, αλλά μπορούν να διαμεσολαβούν σταθερές αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στην οριστική σύλληψη μεμονωμένων αιμοπεταλίων και στον επακόλουθο σχηματισμό θρόμβου. Επίσης, έχει διευκρινιστεί ένας πρόσθετος μηχανισμός που εξηγεί πώς ο διαλυτός στο πλάσμα vwf συμβάλλει στην προσκόλληση των αιμοπεταλίων (Savage et al 2002). Σύμφωνα με το μηχανισμό αυτό, στη διεπιφάνεια μεταξύ του διαλυτού και του προσδεμένου στην επιφάνεια vwf λαμβάνει χώρα μία διαδικασία αυτοσύνδεσης, κατά την οποία το πρώτο στρώμα των πολυμερών του vwf που είναι συνδεδεμένα στη στιβάδα του κολλαγόνου ευνοεί και υποστηρίζει την προσρόφηση επιπλέον πολυμερών από το πλάσμα, στα οποία μπορούν να συνδεθούν τα αιμοπετάλια με μεγαλύτερη ευκολία. Ο μηχανισμός αυτός τεκμηριώθηκε με σύνδεση στο κολλαγόνο μεταλλαγμένου vwf που στερούνταν Α1 επικράτειας και ο οποίος κατά συνέπεια δεν μπορούσε να προάγει την προσκόλληση των αιμοπεταλίων. Στο εν λόγω πείραμα, η διαμεσολαβούμενη από τον υποδοχέα GPIbα πρόσδεση αποκαταστάθηκε από την παρουσία διαλυτού στο πλάσμα vwf. Μάλιστα, η 13

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ προσρόφηση του διαλυτού vwf στον καθηλωμένο vwf είναι αντιστρεπτή διαδικασία. Συνεπώς, ο vwf του πλάσματος έχει διπλό ρόλο στην προσκόλληση των αιμοπεταλίων σε συνθήκες ροής. Πρώτον, μέσω της Α3 επικράτειας επιτυγχάνεται η σύνδεση στο κολλαγόνο και δεύτερον με την αντιστρεπτή αυτοσύνδεσή του στον καθηλωμένο vwf διαμορφώνεται κι ενισχύεται η προσκολλητική ικανότητα του τελευταίου. Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι για να επιτευχθεί η λειτουργία σύνδεσης μέσω του υποδοχέα GPIbα δεν είναι απαραίτητη η άμεση αλληλεπίδραση του vwf με μία επιφάνεια, όπως το κολλαγόνο (Savage et al 2002). Η σύνδεση της Α1 επικράτειας του vwf στον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIbα επάγει σήματα, τα οποία συνεισφέρουν στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων Εικόνα 7). Στα σήματα αυτά περιλαμβάνονται η αύξηση του κυτταροπλασματικού Ca 2+ και η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C και της κινάσης της τυροσίνης. Εικόνα 7. Μεταφορά μηνυμάτων που ξεκινούν από την πρόσδεση του vwf στον υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων και προκαλούν την ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης αιιbβ3 ή υποδοχέα GPIIb-IIIα των αιμοπεταλίων. Έχουν καταγραφεί δύο διακριτές αυξήσεις του ενδοκυτταροπλασματικού Ca 2+ όσον αφορά τη διαμεσολαβούμενη από τον υποδοχέα GPIbα προσκόλληση των αιμοπεταλίων στον καθηλωμένο vwf. Μία πρώτη αύξηση συμβαίνει κατά τη 14

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διάρκεια των πρώτων επαφών, που είναι δυνητικά αναστρέψιμες, και προηγείται της σταθερής προσκόλλησης των αιμοπεταλίων. Μία δεύτερη αύξηση λαμβάνει χώρα στα αιμοπετάλια, τα οποία έχουν προσκολληθεί σταθερά μέσω της ιντεγκρίνης αιιbβ3, και φαίνεται να είναι απαραίτητη για την επακόλουθη συσσώρευση. Έτσι, η αρχική αλληλεπίδραση της Α1 επικράτειας του vwf με τον υποδοχέα GPIbα προκαλεί μία πρώτου βαθμού ενεργοποίηση της αιιbβ3 ιντεγκρίνης, η οποία είναι επαρκής για τη σταθερή προσκόλληση των αιμοπεταλίων στον καθηλωμένο vwf, όχι όμως αρκετή για την πρόσδεση του διαλυτού vwf ή του ινωδογόνου (απαραίτητα για τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων) (Kasirer-Friede et al 2002, Kasirer-Friede et al 2004). Α.3.3. Η αλληλεπίδραση του vwf με τον υποδοχέα GPIbα στην αρτηριακή νόσο Στις αθηροσκληρωτικές αρτηρίες η προσκόλληση των αιμοπεταλίων στον εκτεθειμένο vwf επισπεύδει την απόφραξη του αυλού του αγγείου με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της ροής του αίματος και την επικείμενη καταστροφή των ιστών. Η διατμηματική τάση είναι ιδιαίτερα αυξημένη στις αθηροσκληρωτικές βλάβες, επειδή ο περιορισμός του εύρους του αυλού προκαλεί τοπική αύξηση της ταχύτητας ροής του αίματος. Η υψηλή διατμηματική τάση ενισχύει την αντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων μέσω της οδού αλληλεπίδρασης του vwf με τον υποδοχέα GPIb/IX/V, η οποία οδηγεί στην προσκόλληση κι ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων (Goto et al 1999). Κλινικά και πειραματικά δεδομένα συνδέουν τον vwf με την οξεία αρτηριακή θρόμβωση. Ο σακχαρώδης διαβήτης αποτελεί παράγοντα κινδύνου για καρδιαγγειακά συμβάντα, ενώ αυξημένα επίπεδα vwf σχετίζονται με διαβήτη σε ασθενείς με ιστορικό εμφράγματος του μυοκαρδίου (Zareba et al 2001). Επιπλέον, η διαμεσολαβούμενη από τον vwf προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο αγγειακό τοίχωμα συνεισφέρει στη γένεση κι εξέλιξη των αθηρωματικών πλακών, οι οποίες αποτελούν τις περιοχές όπου θα επισυμβεί η οξεία αρτηριακή απόφραξη. Η αυξημένη έκκριση του vwf ως απάντηση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα οδηγεί σε τοπική στρατολόγηση των αιμοπεταλίων, διαδικασία η οποία μπορεί να ενισχυθεί και από συνυπάρχουσα υπερχοληστερολαιμία (Theilmeier et al 2002). Έτσι, μπορεί να εξηγηθεί γιατί η έλλειψη του vwf προσφέρει κάποιο βαθμό προστασίας από την αθηροσκλήρωση (Methia et al 2001). 15

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.3.4. Η συσσώρευση των αιμοπεταλίων και ο σχηματισμός θρόμβου Μετά την αρχική προσκόλληση των αιμοπεταλίων στην περιοχή της βλάβης του αγγείου ο σχηματισμός του θρόμβου εξελίσσεται μέσω της τοπικής συσσώρευσης επιπρόσθετων αιμοπεταλίων σε μία διαδικασία συσσωμάτωσης. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια προσδένουν διαλυτές προσκολλητικές πρωτεΐνες, κυρίως ινωδογόνο και vwf, οι οποίες μετά την καθήλωση στην κυτταρική μεμβράνη γίνονται υποστρώματα για την προσκόλληση κυκλοφορούντων αιμοπεταλίων σε διαδοχικά στρώματα (Savage et al 1998). Ο vwf που απελευθερώνεται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια αυξάνει την τοπική συγκέντρωση συνδετών και κατά συνέπεια την πρόσδεση στην κυτταρική μεμβράνη. Η διαδικασία συνεχίζεται με την ενεργοποίηση των νέων αιμοπεταλίων και ο θρόμβος αυξάνει σε μέγεθος έως ότου σταματήσει η διαφυγή αίματος από το τραυματισμένο αγγείο ή έως ότου ρυθμιστικοί μηχανισμοί διακόψουν τη διαδικασία ή ο αυλός του αγγείου αποφραχθεί, όπως συμβαίνει σε παθολογικές καταστάσεις. Το ινωδογόνο που είναι συνδεδεμένο στην ενεργοποιημένη αιιbβ3 ιντεγκρίνη θεωρείται η σημαντικότερη προσκολλητική γέφυρα μεταξύ των συναθροιζόμενων αιμοπεταλίων (Lefkovits et al 1995). Σε συνθήκες αυξημένων ρυθμών διάτμησης, συνήθως μεγαλύτερων από 5000 sec -1, ο vwf διαμεσολαβεί τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων εναλλακτικά του ινωδογόνου, καθώς μπορεί να συνδεθεί με τα αιμοπετάλια με μία διαδικασία που αφορά διαδοχικά τους υποδοχείς GPIbα και αιιbβ3 (Goto et al 1998). Εντούτοις, αυτές οι θεωρίες πηγάζουν από πειράματα που αφορούν αιμοπετάλια σε διάλυμα και τα οποία δεν αλληλεπιδρούν με υπόστρωμα. Μελέτες που αφορούν τους δεσμούς που διαμεσολαβούν τη σύνδεση των αιμοπεταλίων μεταξύ τους κατά τη διάρκεια σχηματισμού θρόμβου σε ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι καταδεικνύουν ένα συνεργικό ρόλο μεταξύ του ινωδογόνου και του vwf στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων (Εικόνα 8). Απουσία του ινωδογόνου οι διαμεσολαβούμενοι από τον vwf θρόμβοι αναπτύσσονται ταχέως σε συνθήκες υψηλών ρυθμών διάτμησης, αλλά είναι ασταθείς. Παρουσία του vwf και του ινωδογόνου οι θρόμβοι αναπτύσσονται πιο αργά, αλλά είναι σταθεροί (Ruggeri et al 1999). Τα αποτελέσματα αυτά εξηγούν τις διαφορετικές αιμοστατικές ιδιότητες των αιμοπεταλίων σε ασθενείς με συγγενή ανεπάρκεια είτε του ινωδογόνου είτε του vwf. Επειδή καμία από τις δύο πρωτεΐνες από μόνη της δεν μπορεί να διαμεσολαβήσει την ανάπτυξη σταθερών θρόμβων, η αιμόσταση μπορεί να είναι φυσιολογική κι επιτυχής 16

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 8. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας προσκόλλησης των αιμοπεταλίων και του σχηματισμού θρόμβου σε ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι σε συνθήκες υψηλού ρυθμού διάτμησης. (a) Ο συνδεδεμένος με το κολλαγόνο vwf είναι απαραίτητος για τη δημιουργία της πρώτης επαφής μεταξύ των αιμοπεταλίων και της επιφάνειας, όταν ο ρυθμός διάτμησης υπερβαίνει την οριακή τιμή των 1000 sec -1. Οι δεσμοί μεταξύ της Α1 επικράτειας του vwf και του υποδοχέα GPIbα δημιουργούνται ταχέως και είναι ανθεκτικοί στην τάση εφελκυσμού, έχουν όμως πολύ μικρό χρόνο ημίσειας ζωής. Απουσία άλλων δεσμών τα αιμοπετάλια αποκολλώνται από την επιφάνεια και κινούνται προς τα εμπρός με περιστροφική κίνηση (ρολάρισμα), εξαιτίας της ροπής. Νέοι δεσμοί μεταξύ της Α1 επικράτειας του vwf και του υποδοχέα GPIbα δημιουργούνται, καθώς διαφορετικές περιοχές της μεμβράνης των αιμοπεταλίων έρχονται σε επαφή με την επιφάνεια, με αποτέλεσμα τα αιμοπετάλια να παραμένουν σε επαφή με το υπόστρωμα για μεγάλα χρονικά διαστήματα, ενώ συγχρόνως μετακινούνται με χαμηλή ταχύτητα. Ωστόσο, σε φυσιολογικές συνθήκες η αρχική πρόσδεση στον vwf ακολουθείται ταχέως από πρόσδεση στο κολλαγόνο διαμέσου υποδοχέων (κυρίως GPVI και α 2 β 1 ), ενώ ακολουθεί σταθερή προσκόλληση, ενεργοποίηση και σχηματισμός σταθερών πρόσθετων δεσμών διαμεσολαβούμενων από τον υποδοχέα αιιbβ3. (b) Το πρώτο στρώμα ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων που έχουν προσκολληθεί σταθερά σε μία επιφάνεια αποτελεί το υπόστρωμα για τη συνάθροιση περισσότερων αιμοπεταλίων και την αύξηση του θρόμβου. Πρόσθετοι συνδέτες, κυρίως ινωδογόνο και vwf, συνδέονται στον ενεργοποιημένο υποδοχέα αιιbβ3 της μεμβράνης των αιμοπεταλίων και αποτελούν το υπόστρωμα για την προσκόλληση κι άλλων αιμοπεταλίων. Οι μοναδικές εμβιομηχανικές ιδιότητες του δεσμού μεταξύ της Α1 επικράτειας του vwf και του υποδοχέα GPIbα είναι απαραίτητες για την αρχική σύνδεση των ρεόντων αιμοπεταλίων στα προσκολλημένα αιμοπετάλια, όταν ο ρυθμός διάτμησης είναι αυξημένος. Έτσι εξηγείται γιατί σε ταχέως ρέον αίμα τόσο ο vwf όσο και ο υποδοχέας GPIbα παίζουν καθοριστικό ρόλο τόσο στην αρχική προσκόλληση όσο και στην ακόλουθη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. 17

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μόνο όταν και οι δύο είναι παρούσες και λειτουργικές. Μελέτες σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια έχουν, επίσης, δείξει ότι θρόμβοι μπορούν να σχηματιστούν ακόμα και όταν απουσιάζουν και οι δύο πρωτεΐνες (Ni et al 2000), ενώ υπάρχουν στοιχεία ότι η ινωδονεκτίνη (φιμπρονεκτίνη), ένας άλλος συνδέτης του αιιbβ3 υποδοχέα, μπορεί να συνεισφέρει στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων κατά τη διάρκεια σχηματισμού του θρόμβου (Ni et al 2003). Α.3.5. Η αλληλεπίδραση του vwf με τον παράγοντα VIII Ο vwf λειτουργεί ως σταθεροποιητής του παράγοντα VIII στην κυκλοφορία. Αυτό επιτυγχάνεται με το σχηματισμό ενός μη ομοιοπολικού συμπλόκου του vwf με τον παράγοντα VIII που προστατεύει τον τελευταίο από αποικοδόμηση από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, ενώ συγχρόνως τον μεταφέρει σε περιοχές βύσματος αιμοπεταλίων και κατά συνέπεια περιοχές σχηματισμού θρόμβου (Wise et al 1991, Εικόνα 9). Η περιοχή πρόσδεσης του παράγοντα VIII στον vwf εντοπίζεται στα τελευταία 272 αμινοτελικά κατάλοιπα αμινοξέων της ώριμης υπομονάδας. Τα κατάλοιπα των αμινοξέων του πρωτεϊνικού μορίου του παράγοντα VIII που εμπλέκονται στην πρόσδεση στον vwf εντοπίζονται στην περιοχή μεταξύ των καταλοίπων , ενώ η βέλτιστη πρόσδεση απαιτεί σούλφωση της Tyr1680. Όταν ο παράγοντας VIII ενεργοποιείται κατά τη διαδικασία πήξης του αίματος, η θρομβίνη κόβει το πρωτεϊνικό μόριο μετά την Arg1689. Αυτό το κόψιμο καταστρέφει τη θέση πρόσδεσης με τον vwf κι απελευθερώνει τον ενεργοποιημένο παράγοντα VIIIα. Επιπλέον, ο vwf αναστέλλει την αλληλεπίδραση του παράγοντα VIII με υποδοχείς λιποπρωτεϊνών και κατά συνέπεια αυξάνει το χρόνο ημίσειας ζωής του παράγοντα VIII. Ο vwf έχει προστατευτικό ρόλο για τον παράγοντα VIII τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε ασθενείς με αιμορροφιλία (Franchini et al 2007). Συγκεκριμένα, στους αιμορροφιλικούς ασθενείς που έχουν αναπτύξει αναστολείς του παράγοντα VIII, o vwf ασκεί προστατευτική δράση στον εξωγενή παράγοντα VIII αποτρέποντας τη σύνδεση με αυτόν ανασταλτικών αντισωμάτων (Gensana et al 2001). 18

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 9. Μετά την απελευθέρωσή του στην κυκλοφορία ο παράγοντας VIII προσδένεται στον vwf. Το σύμπλοκο προστατεύει τον παράγοντα VIII από αποικοδόμηση, ενώ συγχρόνως μεταφέρει τον τελευταίο στην περιοχή σχηματισμού θρόμβου. Α.3.6. Ο ρόλος της ADAMTS13 Ο vwf ανευρίσκεται με μορφή πολυμερών ποικίλου μεγέθους, τα μεγαλύτερα από τα οποία συνήθως περιέχονται στα αποθηκευτικά κοκκία και δεν ανιχνεύονται στο αίμα υγιών ανθρώπων. Τα ULvWF ανιχνεύονται στο πλάσμα μόνο περιστασιακά μετά από επαγωγή της έκκρισής τους από τα ενδοθηλιακά κύτταρα με το θεραπευτικό παράγοντα I-deamino-δ-D-arginine vasopressin (DDAVP) ή σε ασθένειες, όπως η θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα (TTP)/αιμολυτικό ουραιμικό σύνδρομο. Τα ULvWF προσδένονται στον GPIb/IX/V υποδοχέα των αιμοπεταλίων με μεγάλη ευκολία προκαλώντας αυθόρμητη συσσώρευση αιμοπεταλίων. Εξαιτίας αυτής της προθρομβωτικής τους ιδιότητας, τα ULvWF θα πρέπει να απομακρύνονται ταχέως από το πλάσμα υγιών ατόμων. Η ρύθμιση του μεγέθους του κυκλοφορούντος στο πλάσμα vwf επιτυγχάνεται μέσω μίας πρωτεολυτικής διαδικασίας που επιτελείται από τη μεταλλοπρωτεϊνάση ADAMTS13 (Levy et al 2001). Ο vwf κόβεται εντός της Α2 επικράτειάς του στο ύψος του δεσμού Tyr1605-Met1606 και χωρίζεται σε δύο μικρότερες υπομονάδες. Πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν ότι ο ρυθμός διάτμησης εντός των αρτηριών προάγει την πρωτεόλυση του vwf (Dong et al 2002). Τα ULvWF υπόκεινται σε μορφολογικές αλλαγές, λόγω της υδροδυναμικής διατμηματικής τάσης, με αποτέλεσμα να εκτίθενται σε ενζυμική διάσπαση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μίας μελέτης στην οποία χρησιμοποιήθηκε μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (AFM), ο vwf υφίσταται μία επαγόμενη από τη διατμηματική 19

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τάση δομική αλλαγή που έχει ως συνέπεια μετατροπή της σφαιρικής του δομής σε μία διαμόρφωση εκτεταμένης ή τεντωμένης αλυσίδας στην οποία αποκαλύπτονται κι εκτίθενται στη ροή του αίματος ενδομοριακές σφαιρικές επικράτειες (Siedlecki et al 1996). Πρόσφατα, ο Schneider και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι το μόριο του vwf εκτείνεται υπό την επήρεια μίας κρίσιμης διατμηματικής τάσης παίρνοντας τη μορφή ίνας. Παρουσία μίας κολλαγονικής επιφάνειας αυξάνεται η προσρόφηση των ινών του vwf κάτω από τις ίδιες συνθήκες διάτμησης με αποτέλεσμα αύξηση των σημείων σύνδεσης των αιμοπεταλίων. Ουσιαστικά δημιουργείται ένα κολλώδες πλέγμα από ακινητοποιημένες ίνες του vwf, το οποίο είναι απαραίτητο για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων κάτω από συνθήκες υψηλών ρυθμών διάτμησης (Schneider et al 2007) (Εικόνα 10). Το ίδιο απέδειξαν κι άλλοι ερευνητές χρησιμοποιώντας συσκευές που βασίζονται στη μηχανική των μικρορρευστών (Singh et al 2009). Οι μορφολογικές αλλαγές του vwf που επάγονται από υψηλούς ρυθμούς διάτμησης είναι ιδιαίτερης σημασίας, καθώς αυτές καθορίζουν τις αιμοστατικές λειτουργίες του παράγοντα, αλλά κι ευνοούν την πρωτεολυτική διάσπασή του από την ADAMTS13. Εικόνα 10. Η προσκόλληση του vwf. a) Όταν ο ρυθμός διάτμησης είναι μικρότερος της κρίσιμης τιμής, τότε μόνο λίγα σπειράματα του vwf προσκολλώνται στην κολλαγονική επιφάνεια. b) Ο vwf που προσκολλάται στο κολλαγόνο σε υψηλούς ρυθμούς διάτμησης σχηματίζει ένα δίκτυο ινών, το οποίο αποτελεί κατάλληλο υπόστρωμα για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων. Η επιτυχής αιμόσταση εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ της βιοσύνθεσης των ULvWF και της αποικοδόμησής τους από την ADAMTS13. Η σοβαρή έλλειψη της ενεργότητας της ADAMTS13 μπορεί να προκαλέσει θρομβωτική θρομβοπενική 20

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πορφύρα (TTP), μία θανατηφόρο αιματολογική νόσο, η οποία χαρακτηρίζεται από εκτεταμένο σχηματισμό θρόμβων πλούσιων σε αιμοπετάλια και vwf. Από την άλλη πλευρά, μεταλλάξεις στην Α2 περιοχή του vwf μπορεί να αυξήσουν την ευαισθησία του vwf σε πρωτεολυτική διάσπαση και να οδηγήσουν στη νόσο von Willebrand (VWD) τύπου 2Α, η οποία χαρακτηρίζεται από επιλεκτική έλλειψη των ULvWF. A.4. Το σύμπλεγμα του υποδοχέα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων Το σύμπλεγμα του υποδοχέα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων αποτελείται από 4 διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες, GPIbα, GPIbβ, GPIX και GPV, με την GPIbα να συνδέεται με δισουλφιδικό δεσμό με την GPIbβ. Ο υποδοχέας εμφανίζεται με μία στοιχειομετρία 2:2:1 (GPIb/IX/V) με περίπου GPIb/IX αντίγραφα στη μεμβράνη των αιμοπεταλίων (Andrews et al 2003). Όλες οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες είναι τύπου Ι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες με το αμινοτελικό άκρο τους να προβάλλει έξω από το αιμοπετάλιο, ενώ διαπερνούν τη διπλοστιβάδα των αιμοπεταλίων μόνο μία φορά (Εικόνα 11). Όλες οι υπομονάδες ανήκουν στην οικογένεια των πλούσιων σε λευκίνη πρωτεϊνών, περιέχουν δηλαδή μία ή περισσότερες διαδοχικές επαναλήψεις αλληλουχιών πλούσιων σε λευκίνη (24 περίπου κατάλοιπα αμινοξέων). Στην πραγματικότητα, η ικανότητα πρόσδεσης συνδετών του συμπλέγματος GPIb/IX/V εντοπίζεται στην αμινοτελική σφαιρική περιοχή (αμινοξέα 1-282) της GPIbα αλυσίδας. Εικόνα 11. Το σύμπλεγμα του υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIb/IX/V. 21

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πρόσφατα προσδιορίστηκε η κρυσταλλική δομή της αμινοτελικής σφαιρικής περιοχής της GPIbα (Uff et al 2002), η οποία είναι αρκετά επιμηκυμένη με καμπύλο σχήμα, τυπικό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών που είναι πλούσιες σε λευκίνη (Εικόνα 12). Η αμινοτελική αλληλουχία αποτελείται από μία β-φουρκέτα, η οποία οριοθετείται από μία δισουλφιδική γέφυρα, οχτώ επαναλήψεις αλληλουχιών πλούσιων σε λευκίνη, ένα βρόγχο που επίσης συνδέεται με δισουλφιδικό δεσμό με την πλούσια σε λευκίνη αλληλουχία και από μία καρβοξυτελική ανιονική περιοχή, η οποία περιέχει τρία σουλφωμένα κατάλοιπα τυροσίνης. Η αμινοτελική περιοχή (αμινοξέα 1-81) και η καρβοξυτελική περιοχή (αμινοξέα ) αλληλεπιδρούν ενδομοριακά: μονοκλωνικά αντισώματα (moabs) που αποκλείουν τη σύνδεση του vwf στον υποδοχέα GPIbα και που στρέφονται εναντίον της αμινοτελικής περιοχής φαίνονται να δρουν ως ανταγωνιστές μονοκλωνικών αντισωμάτων που συνδέονται στην καρβοξυτελική περιοχή και το αντίστροφο (Cauwenberghs et al 2001). Εικόνα 12. Η αλυσίδα GPIbα. Η αμινοτελική β φουρκέτα που ονομάζεται β-finger (β-δάχτυλο) χρωματίζεται μπλε. Οι οχτώ πλούσιες σε λευκίνη επαναλήψεις είναι πράσινες. Η καρβοξυτελική περιοχή χρωματίζεται κόκκινη και περιέχει ένα βρόγχο (κατάλοιπα ) που ονομάζεται β- switch (β-διακόπτης). Οι δισουλφιδικές γέφυρες χρωματίζονται κίτρινες με σχήμα κομβιοδόχης. Η κυτταροπλασματική ουρά της GPIbα αλυσίδας αποτελείται από 96 κατάλοιπα αμινοξέων και περιέχει περιοχές πρόσδεσης για την πρωτεΐνη που συνδέει την ακτίνη (Andrews et al 1992), την πρωτεΐνη ζ (Andrews et al 1998) και τη φιλαμίνη (Williamson 2002). Επιπλέον, η Ser609 στην κυτταροπλασματική ουρά της GPIbα αποτελεί μία περιοχή φωσφορυλίωσης. Η κυτταροπλασματική ουρά της GPIbβ 22

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποτελείται από 34 κατάλοιπα αμινοξέων και περιλαμβάνει μία επιπλέον περιοχή σύνδεσης για την πρωτεΐνη ζ και μία περιοχή φωσφορυλίωσης στη Ser166. Η φωσφορυλίωση της Ser166 της GPIbβ και της Ser609 της GPIbα εμπλέκονται λειτουργικά στη σύνδεση με την πρωτεΐνη ζ. Η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης ζ με το καρβοξυτελικό άκρο της GPIbα παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση που ξεκινά με τη σύνδεση του vwf στον υποδοχέα GPIb/IX/V και καταλήγει στην ενεργοποίηση του υποδοχέα αιιbβ3 (Gu et al 1999). Α.5. Η δομή της επικράτειας Α1 του vwf Η δομή της επικράτειας Α1 του vwf παρουσιάζει πολλές ομοιότητες με την επικράτεια Α3 του vwf και την περιοχή Ι της ιντεγκρίνης και διαθέτει την τυπική αναδίπλωση που συναντάται στις πρωτεΐνες που διαθέτουν επαναλήψεις πλούσιες σε λευκίνη (Kobe et al 2001, Εικόνα 13). Εικόνα 13. Στερεοδιάγραμμα σύγκρισης των δομών των επικρατειών Α1 (συνεχόμενες γραμμές) και Α3 (διακεκομμένες γραμμές) του vwf. Διακρίνονται τα αμινοξέα κάθε δέκα κατάλοιπα ξεκινώντας από το 506 (μικροί κύκλοι), όπως επίσης και τα κατάλοιπα των κυστεϊνών που σχηματίζουν τους δισουλφιδικούς δεσμούς (μεγάλοι κύκλοι). Η Α1 επικράτεια, η οποία περιέχει τη μοναδική γνωστή θέση σύνδεσης για τον υποδοχέα GPIbα, έχει τη δομή του α/β μοτίβου με έξι υδρόφοβες παράλληλες β 23

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αλυσίδες να σχηματίζουν ένα κεντρικό β-πτυχωτό φύλλο που περιβάλλεται από αμφιπαθείς α-έλικες (Celikel et al 1998). Η Α1 επικράτεια έχει σχήμα κυβοειδές, αποτελείται δηλαδή από έξι κατά προσέγγιση επίπεδες επιφάνειες. Στην κάτω επιφάνεια εντοπίζεται ο δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ των Cys509 και Cys695, ενώ στις πλάγιες επιφάνειες συγκεντρώνονται θετικά και αρνητικά φορτισμένα κατάλοιπα αμινοξέων αντίστοιχα. Τα κατάλοιπα αμινοξέων εκατέρωθεν του δισουλφιδικού δεσμού συσσωρεύονται μακριά από την κάτω επιφάνεια της επικράτειας υπό την επίδραση υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και ιοντικών γεφυρών. Η πρόσθια επιφάνεια εντοπίζεται στη μία άκρη του β-πτυχωτού φύλου και περιλαμβάνει τις πλάγιες αλυσίδες από τις έλικες α3 και α4, την αλυσίδα βc και τους βρόγχους που τις συνδέουν. Αυτή η επιφάνεια περιλαμβάνει επίσης τμήμα του δικτύου ιοντικών γεφυρών. Η επάνω επιφάνεια εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο του β-πτυχωτού φύλου και αποτελείται από βρόγχους που συνδέουν το πτυχωτό φύλλο με τις αμφίπλευρες έλικες. Η κάτω επιφάνεια περιλαμβάνει το αμινο- και καρβοξυτελικό άκρο και τους βρόγχους που συνδέουν τις α-έλικες με το αμινοτελικό άκρο του β- πτυχωτού φύλλου. Η μία πλάγια επιφάνεια περιλαμβάνει τις έλικες α4, α5 και α6 που εντοπίζονται στη μία πλευρά του β-πτυχωτού φύλλου και είναι βασική. Η άλλη πλάγια επιφάνεια περιλαμβάνει τις έλικες α1, α3 και α7 που εντοπίζονται στην απέναντι πλευρά του β-πτυχωτού φύλλου και είναι όξινη. Η πίσω επιφάνεια περιλαμβάνει τις έλικες α6 και α7 και την αλυσίδα βf (Εικόνα14) (Emsley et al 1998). Τέλος, η Α1 επικράτεια του vwf περιλαμβάνει μεγάλο αριθμό φορτισμένων αμινοξέων. Κάποια από αυτά σχηματίζουν ένα πολύπλοκο δίκτυο ιοντικών γεφυρών που τυλίγεται γύρω από το κατώτερο χείλος της επικράτειας (Εικόνα 14(α)). Αυτές οι σταθεροποιητικές ιοντικές γέφυρες μπορούν να εξηγήσουν την ευαισθησία αυτής της περιοχής σε ματαλλαξιογένεση της αλανίνης. 24

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 14. Χωροπληρωτικό μοντέλο των τεσσάρων επιφανειών της επικράτειας Α1 του vwf. Όλα τα κατάλοιπα των αμινοξέων χρωματίζονται γκρίζα, εκτός από τις λυσίνες και τις αργινίνες που είναι μπλε, τα ασπαρτικά οξέα και τα γλουταμικά οξέα που είναι κόκκινα και τις ιστιδίνες που είναι πράσινες. Διακρίνεται η προτεινόμενη περιοχή πρόσδεσης της μποτροσετίνης (Β) και η πιθανή περιοχή πρόσδεσης της ηπαρίνης (κυκλωμένη). Α.6. Η αλληλεπίδραση της επικράτειας Α1 του παράγοντα von Willebrand με το σύμπλεγμα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων Η περιοχή σύνδεσης του συμπλέγματος GPIb/IX/V εδρεύει στην επικράτεια Α1 του παράγοντα του vwf, ενώ η αμινοτελική σφαιρική GPIbα επικράτεια αποτελεί τη θέση αλληλεπίδρασης των αιμοπεταλίων με τον vwf. Ο διαλυτός στο πλάσμα vwf δεν αλληλεπιδρά με το σύμπλεγμα GPIb/IX/V. Για τη σύνδεση του vwf με το σύμπλεγμα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων απαιτούνται συνθήκες υψηλής 25

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διατμηματικής τάσης ή ακινητοποίηση του vwf κάτω από συνθήκες υψηλής διάτμησης (Ikeda et al 1991). Πιστεύεται ότι η αλλαγή στη διαμόρφωση του vwf επάγεται από τη διατμηματική τάση ή από την ακινητοποίηση του vwf, οι οποίες οδηγούν σε αποκάλυψη κι έκθεση της Α1 επικράτειας. Εντούτοις, ο μηχανισμός της δομικής αυτής αλλαγής δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί. Πρώιμες μελέτες έχουν καταδείξει ότι επέρχεται μία επαγόμενη από τη διατμηματική τάση αλλαγή στη διαμόρφωση του vwf με αποτέλεσμα μετατροπή από μία σφαιρική δομή σε μία εκτεταμένη αλυσίδα κατόπιν ακινητοποίησης σε μία υδρόφοβη επιφάνεια (Siedlecki et al 1996). Αντιθέτως, κάποιες μελέτες δεν μπόρεσαν να καταδείξουν μία μεγάλη γενικευμένη επαγόμενη από τη διατμηματική τάση μορφολογική αλλαγή στον καθηλωμένο σε κολλαγόνο vwf, εντούτοις παρατηρήθηκαν μικρής κλίμακας επιδράσεις της διατμηματικής τάσης σε μία ή περισσότερες επικράτειες του vwf (Novak et al 2002). Οι ιδιότητες της επιφάνειας αυτής καθεαυτής επηρεάζουν τη διαμόρφωση του vwf. Ο vwf προσκολλάται ταχέως σε επιφάνειες βιοϋλικών όταν αυτές εκτίθενται στο αίμα. Η προσροφημένη δομή του vwf επηρεάζει τις λειτουργικές αλληλεπιδράσεις με τα υπόλοιπα συστατικά του αίματος, τα οποία διαμεσολαβούν την επαγόμενη από την επιφάνεια θρόμβωση. Οι ιδιότητες της επιφάνειας καθορίζουν τη μοριακή δομή και λειτουργία του vwf και την επαγόμενη από αυτές θρόμβωση (Raghavachari et al 2003). Κάτω από στατικές συνθήκες, η αλληλεπίδραση μεταξύ του υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων και του vwf μπορεί να επαχθεί από το βακτηριδιακό γλυκοπεπτίδιο ριστοσετίνη και από την πρωτεΐνη του δηλητηρίου των όφεων βοτροσετίνη. Η ριστοσετίνη συνδέεται με τον vwf, αλλάζει τη διαμόρφωση της Α1 επικράτειας και ουδετεροποιεί σε επίπεδο φορτίου την αλληλεπίδραση (Berndt et al 1992) ή γεφυρώνει την αλληλεπίδραση συνδεόμενη τόσο με τον vwf όσο και με τον υποδοχέα GPIbα (Hoylaerts et al 1995). Η βοτροσετίνη δεν ενεργοποιεί την Α1 επικράτεια αλλοστερικά, αλλά επάγει την αλληλεπίδραση αυξάνοντας την επιφάνεια σύνδεσης για τον υποδοχέα GPIbα (Fukuda et al 2002). Η ριστοσετίνη μιμείται σε μεγαλύτερο βαθμό την επαγόμενη από τη διατμηματική τάση σύνδεση του vwf στον υποδοχέα GPIbα σε σύγκριση με τη βοτροσετίνη (Dong et al 2001). Η περιοχή σύνδεσης του υποδοχέα GPIbα εντοπίζεται γύρω από τον πρόσθιο θύλακο της Α1 επικράτειας και περιλαμβάνει τις αλυσίδες β3 και β4 μαζί με την έλικα α3 (Bonnefoy et al 2003). Η Α1 επικράτεια διαθέτει επιπλέον ρυθμιστικούς αμινο- και 26

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ καρβοξυτελικούς βραχίονες, οι οποίοι τυλίγονται κατά μήκος της κάτω επιφάνειας κι εμποδίζουν τη σύνδεση της GPIbα. Εντούτοις, οι προαναφερθείσες περιοχές δεν είναι οι μοναδικές που ρυθμίζουν τη δραστηριότητα της Α1 επικράτειας. Σύμφωνα με μελέτες, το μονοκλωνικό αντίσωμα ICIE7 διευκολύνει τη σύνδεση του vwf με τον υποδοχέα GPIb-IX-V. Το εν λόγω αντίσωμα στρέφεται εναντίον της αμινοτελικής περιοχής του vwf, γεγονός που σημαίνει ότι η εν λόγω περιοχή αλληλεπιδρά αρνητικά με την Α1 επικράτεια (Ulrichts et al 2004). Βάσει μελετών μεταλλαξιγένεσης (Shimitzu et al 2004) και καθορισμού επιτόπων με αντίσωμα (Cauwenberghs et al 2001) τουλάχιστον τρεις λειτουργικές υποεπικράτειες στην αμινοτελική σφαιρική περιοχή της GPIbα φαίνεται να εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με τον vwf. Η ανιονική σουλφωμένη αλληλουχία τυροσινών (αμινοξέα ) παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με τον vwf: 1) κατάργηση της σούλφωσης των καταλοίπων τυροσίνης ή μετάλλαξη των καταλοίπων ασπαρτικού 272, 274 και 277 σε ασπαραγίνη είχαν ως αποτέλεσμα ατελή επαγόμενη από βοτροσετίνη ή/και ριστοσετίνη αλληλεπίδραση με τον vwf (Marchese et al 1995), 2) το αμινοτελικό τμήμα της GPIbα που περιλαμβάνει τα αμινοξέα ανέστειλε την επαγόμενη από τη βοτροσετίνη σύνδεση με τον vwf, ενώ το αμινοτελικό τμήμα της GPIbα που περιλαμβάνει τα αμινοξέα ήταν κατά μία τάξη μεγέθους λιγότερο αποτελεσματικό (Ward et al 1996), 3) υποκαταστάσεις στην περιοχή που περιλαμβάνει τα αμινοξέα οδήγησαν σε ελάττωση της επαγόμενης από τη βοτροσετίνη ή/και ριστοσετίνη σύνδεση, ενώ υποκαταστάσεις στην περιοχή που περιλαμβάνει τα αμινοξέα επηρέασαν μόνο την επαγόμενη από τη βοτροσετίνη σύνδεση (Murata et al 1991) και 4) μετάλλαξη των σουλφωμένων καταλοίπων τυροσίνης σε φαινυλαλανίνη είχαν ως αποτέλεσμα μία ατελή επαγόμενη από βοτροσετίνη ή/και ριστοσετίνη αλληλεπίδραση με τον vwf (Dong et al 2001). Μία δεύτερη περιοχή σημαντική για τη σύνδεση του GPIbα υποδοχέα στον vwf είναι η καρβοξυτελική περιοχή περικλειόμενη από το δισουλφιδικό βρόγχο (αμινοξέα ). Μεταλλάξεις στην περιοχή αυτή της γλυκίνης 233 σε βαλίνη ή της μεθειονίνης 239 σε βαλίνη έχουν ως αποτέλεσμα μία αιμορραγική διαταραχή, γνωστή ως αιμοπεταλιακός τύπος της νόσου von Willebrand. Ο επίτοπος των αντι-gpibα μονοκλωνικών αντισωμάτων εντοπίζεται επίσης σ αυτή την περιοχή (Shen et al 2002, Cauwenberghs et al 2001). Τέλος, τόσο η αμινοτελική περιοχή όσο και η περιοχή LRR εμπλέκονται στη σύνδεση του vwf. Ομοίως, οι επίτοποι των αντι-gpibα μονοκλωνικών αντισωμάτων χαρτογραφήθηκαν επίσης 27

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σ αυτή την περιοχή (Cauwenberghs et al 2001). Συντηρημένα κατάλοιπα ασπαραγίνης στις LRR περιοχές είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της ικανότητας σύνδεσης με τον vwf (Afshar-Kharghan et al 2000), ενώ οι LRR περιοχές 2, 3 και 4 είναι κριτικής σημασίας για τη σύνδεση του vwf στον υποδοχέα GPIbα (Shen et al 2000). Επιπλέον, ο αλλοαντιγονικός διμορφισμός Thr145Met, γνωστός ως HPA-2a και b, που εντοπίζεται στην περιοχή LRR 5, επηρεάζει τη σύνδεση του vwf, πιθανότατα σχετιζόμενος με μία μορφολογική αλλαγή στην αμινοτελική GPIbα επικράτεια. Η παραπάνω μελέτη, όπως επίσης και σχετικές με αυτή μελέτες, θα μπορούσαν ίσως να εξηγήσουν τα κλινικά δεδομένα που συνδέουν τους πολυμορφισμούς του αιμοπεταλιακού GPIb γονιδίου με θρομβωτικές και διαμεσολαβούμενες από ανοσολογικούς μηχανισμούς διαταραχές (Ulrichts et al 2003). Α.6.1. Η δομή του συμπλέγματος GPIbα-A1-vWF Σύμφωνα με την κρυσταλλική δομή του συμπλέγματος GPIbα-A1-vWF, η σφαιρική Α1 επικράτεια αλληλεπιδρά με την κοίλη επιφάνεια της GPIbα (Εικόνα 15B). Η επιφάνεια αλληλεπίδρασης είναι εκτεταμένη αλλά ασυνεχής και αποτελείται από δύο διακριτές περιοχές στενής αλληλεπίδρασης (Εικόνα 15C). Το πρώτο και περισσότερο εκτεταμένο σημείο επαφής εντοπίζεται κοντά στην κορυφή της Α1 και αποτελεί μία επιφάνεια μεγέθους ~1700 Å. Σ αυτό το σημείο επαφής οι πλούσιες σε λευκίνη επαναλήψεις 5 έως 8 και το καρβοξυτελικό άκρο της GPIbα αλληλεπιδρούν με την έλικα α3, το βρόγχο α3β4 και την αλυσίδα β3 της επικράτειας Α1 (Εικόνες 15C και 15D). Το δεύτερο και μικρότερο σημείο επαφής αποτελεί μία επιφάνεια μεγέθους ~900 Å και αφορά τις αλληλεπιδράσεις του αμινοτελικού β-δάκτυλου και της πρώτης πλούσιας σε λευκίνη επανάληψης της GPIbα με τους βρόγχους α1β2, β3α2 και α2β4 της κάτω επιφάνειας της Α1 επικράτειας. Ο ευέλικτος βρόγχος από το αμινοξύ 227 μέχρι το 241 στο καρβοξυτελικό άκρο της GPIbα υφίσταται μία μορφολογική αλλαγή κατά το σχηματισμό του συμπλέγματος. Κατά το σχηματισμό του συμπλέγματος, αυτός ο βρόγχος, ο οποίος καλείται β-διακόπτης σχηματίζει μία β φουρκέτα 16 καταλοίπων αμινοξέων που εκτείνεται από τα κατάλοιπα 227 έως 242 και ευθυγραμμίζεται με τη β3 αλυσίδα της Α1 επικράτειας (κατάλοιπα 562 έως 566) με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός συνεχούς β πτυχωτού φύλλου μεταξύ των δύο μορίων (Εικόνα 15D). Οι μεταλλάξεις 28

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ που οδηγούν σε επικερδή λειτουργικότητα (gain-of-function mutations) και που σχετίζονται με τον αιμοπεταλιακό τύπο της νόσου von Willebrand εντοπίζονται όλες στο β-διακόπτη. Η μετάλλαξη M239V ενισχύει τη σύνδεση τρεις φορές περισσότερο και εντοπίζεται στην αλυσίδα του β-διακόπτη, η οποία συνδέεται απευθείας με δεσμούς υδρογόνου στην αλυσίδα β3 της Α1 επικράτειας. Άλλες αντίστοιχες γνωστές μεταλλάξεις είναι οι G233V, V234G, D235V και K237V (Dong et al 2001). Οι τέσσερις από τις πέντε μεταλλάξεις αφορούν αντικαταστάσεις αμινοξέων που φαίνονται να σταθεροποιούν τις δομές β φουρκέτας. Σε γενικές γραμμές, η ισορροπία στη διαμόρφωση του β διακόπτη της GPIbα είναι κριτικής σημασίας για τη συγγένεια της με τα αλληλεπιδρώντα με αυτή μόρια. Εικόνα 15B. Στερεοδομή του συμπλέγματος GPIbα-Α1-vWF. Ο υποδοχέας GPIbα χρωματίζεται με πράσινο, η επικράτεια Α1 με μπλε, οι μεταλλάξεις M239V και A1-R543Q με κόκκινο και η δισουλφιδική γέφυρα στην επικράτεια Α1 δίκην κίτρινης κομβιοδόχης. Ο β-διακόπτης της GPIbα λαμβάνει μια δομή β φουρκέτας που ευθυγραμμίζεται με το κεντρικό β φύλλο της Α1. Οι συντομογραφίες για τα κατάλοιπα αμινοξέων έχουν ως εξής: A-Ala, C-Cys, D-Asp, E-Glu, F-Phe, G- Gly, H-His, I-Ile, K-Lys, L-Leu, M-Met, N-Asn, P-Pro, Q-Gln, R-Arg, S-Ser, T-Thr, V-Val, W-Trp, Y- Tyr. 29

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 15C. Στερεοδομή των καταλοίπων αμινοξέων που εντοπίζονται στη διεπιφάνεια μεταξύ Α1- GPIbα, με εξαίρεση τα κατάλοιπα που εντοπίζονται στο β-διακόπτη της GPIbα και στην αλυσίδα β3 της Α1. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε ενδομοριακούς δεσμούς μικρότερους από 4.0 Å απεικονίζονται με μορφή ραβδίου. Τα κατάλοιπα αμινοξέων Lys 549, Trp 550 και Arg 571 της επικράτειας Α1 που έρχονται σε επαφή με το β-διακόπτη και την πρώτη πλούσια σε λευκίνη επανάληψη της GPIbα διαταράσσονται, λόγω ελαττωμένης ηλεκτρονιακής πυκνότητας των πλάγιων αλυσίδων τους. Εικόνα 15D. Στερεοδομή της αλληλεπίδρασης του β-διακόπτη με την αλυσίδα β3 της Α1. Οι δεσμοί υδρογόνου της κύριας αλυσίδας απεικονίζονται με διακεκομμένες γραμμές. Τα αμινοξέα που υφίστανται gain-of-function μεταλλάξεις και σχετίζονται με τον αιμοπεταλιακό τύπο της νόσου von Willebrand και που είναι δυνατό να επάγουν διαμόρφωση β φουρκέτας στο β-διακόπτη της GPIbα επισημαίνονται με κόκκινο. 30

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι μεταλλάξεις που οδηγούν σε επικερδή λειτουργικότητα (gain-of-function mutations) που σχετίζονται με τον τύπο 2Β της νόσου von Willebrand συγκεντρώνονται στην κάτω επιφάνεια της Α1 επικράτειας (Εικόνα 16), πλησίον του σημείου αλληλεπίδρασης με το β-δάκτυλο της GPIbα. Η μετάλλαξη R543Q, η οποία εντοπίζεται 20Å μακριά από το σημείο αλληλεπίδρασης, προκαλεί αύξηση της συγγένειας σύνδεσης της μεμονωμένης Α1 επικράτειας κατά 2,5 φορές. Η συγγένεια της wild-type Α1 επικράτειας, ωστόσο, είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτή του πολυμερούς vwf. Πολλές ακόμα μελέτες έχουν αποδείξει ότι η συγγένεια σύνδεσης της Α1 επικράτειας με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων εξαρτάται από το μήκος του τμήματος του vwf που χρησιμοποιείται σε κάθε μελέτη και που φυσικά περιλαμβάνει την Α1 επικράτεια. Στην κρυσταλλική δομή της wild-type Α1 επικράτειας τα αμινο- και καρβοξυτελικά άκρα πλησιάζουν το σημείο αλληλεπίδρασης στο β-δάκτυλο, με αποτέλεσμα μεγαλύτερα σε μήκος τελικά πεπτίδια να σφραγίζουν το σημείο σύνδεσης του β-δάκτυλου στον πολυμερή vwf (Emsley et al 1998). Εικόνα 16. Στερεοδομή των μορφολογικών αλλαγών της αμινο- και καρβοξυτελικής πλευράς της Α1 επικράτειας του vwf. Η κάτω επιφάνεια της Α1 επικράτειας, όπως φαίνεται στο σύμπλεγμα με την GPIbα, απεικονίζεται σε χωροπληρωτική αναπαράσταση με τα αμινο- και καρβοξυτελικά πεπτίδια, τα οποία χρωματίζονται με κίτρινο. Η θέση του β-δακτύλου φαίνεται με πράσινο. Τα αμινο- και καρβοξυτελικά πεπτίδια της μη συμπλεγμένης, άγριου τύπου (wild-type, wt) Α1 επικράτειας χρωματίζονται με κόκκινο. Τα κατάλοιπα των αμινοξέων με γνωστές gain-of-function μεταλλάξεις που ενοχοποιούνται για το φαινότυπο της τύπου 2Β νόσου von Willebrand είτε απεικονίζονται δίκην κομβιοδόχης στα wt αμινο- και καρβοξυτελικά πεπτίδια ή χρωματίζονται με μπλε στο χωροπληρωτικό μοντέλο. Στον εκτεταμένο vwf, τα αμφίπλευρα πεπτίδια της Α1 επικράτειας πιθανότατα «σφραγίζουν» το σημείο πρόσδεσης του β-δακτύλου της GPIbα. 31

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι μεταλλάξεις τύπου 2Β αποσταθεροποιούν το δίκτυο αλληλεπιδράσεων που παρατηρείται μεταξύ της κάτω επιφάνειας της Α1 επικράτειας και των τελικών πεπτιδίων της, με αποτέλεσμα το σημείο πρόσδεσης του υποδοχέα των αιμοπεταλίων να είναι εύκολα προσβάσιμο. Τα ηλεκτροστατικά δυναμικά των επιφανειών της Α1 επικράτειας και του GPIbα χαρακτηρίζονται από μεγάλες δόσεις αντίθετων φορτίων στη μεταξύ τους διεπιφάνεια, οι οποίες επάγουν και συντηρούν μία μακράς διάρκειας ηλεκτροστατική έλξη (Εικόνα 17). Εκτός από τη θετικά φορτισμένη επιφάνεια της Α1 επικράτειας στο σημείο επαφής με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων, η πρώτη διαθέτει ένα σημαντικό μεγάλο ποσό αρνητικού φορτίου στην ακριβώς αντίθετη επιφάνεια, το οποίο με τη σειρά του ενισχύει την ηλεκτροστατική έλξη. Εικόνα 17. Ηλεκτροστατικά δυναμικά των επιφανειών της Α1 επικράτειας και του υποδοχέα GPIbα. Η επιφάνεια χρωματίζεται μπλε για δυναμικά >6 kt/e και κόκκινη για δυναμικά < -6 kt/e. A.7. Ο ρόλος του συμπλόκου vwf/gpibα σε θρομβωτικές καταστάσεις Τα επίπεδα του vwf στο πλάσμα αυξάνονται στα οξέα στεφανιαία σύνδρομα, όπως το STEMI οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου (ΟΕΜ), ενώ η πρώιμη αύξηση των επιπέδων του σχετίζεται με αρνητική πρόγνωση (Ray et al 2005, 32

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Montalescot et al 1998). Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες η ελαττωμένη ροή στα στεφανιαία αγγεία έχει συσχετιστεί με υψηλά επίπεδα vwf, ενώ αυξημένα επίπεδα vwf, όπως επίσης και χαμηλά επίπεδα της ADAMTS13 σχετίζονται με αυξημένο καρδιαγγειακό κίνδυνο (Takahashi et al 2009, Bongers et al 2009). Η Θρομβωτική Θρομβοπενική Πορφύρα (ΘΘΠ) είναι μία διαταραχή που χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό πλούσιων σε vwf μικροθρόμβων, οι οποίοι επηρεάζουν τα αρτηριόλια και τα τριχοειδή πολλαπλών οργάνων. Η ΘΘΠ οφείλεται σε έλλειψη της μεταλλοπρωτεάσης ADAMTS13. Η έλλειψη της εν λόγω πρωτεΐνης, είτε λόγω αυτοάνοσων αναστολέων στις περιπτώσεις επίκτητης ΘΘΠ είτε λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο της ADAMTS13 στις κληρονομικές μορφές της νόσου, οδηγεί σε συσσώρευση vwf και αιμοπεταλίων με αποτέλεσμα τη μικροαγγειακή θρόμβωση της ΘΘΠ (Tsai et al 2010). Επίσης, κάποιοι πολυμορφισμοί του γονιδίου που κωδικοποιεί την GPIbα έχουν συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο στεφανιαίας νόσου σε νεαρούς ενήλικες. Ένα τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η αντικατάσταση της θρεονίνης με μεθειονίνη στο αμινοξύ 145, η οποία φαίνεται να επηρεάζει τη σύνδεση του vwf με τον υποδοχέα GPIbα. Επιπλέον, μία αντικατάσταση T/C στην περιοχή έναρξης της μετάφρασης του γονιδίου επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης. Η παρουσία του 5C αλληλόμορφου γονιδίου αυξάνει τη μέση πυκνότητα του υποδοχέα GPIbα που εκφράζεται στα αιμοπετάλια, ενώ υπάρχουν ενδείξεις που συσχετίζουν τον απλότυπο -5C με αρνητική πρόγνωση του ΟΕΜ σε νεαρούς ενήλικες ( 62 ετών) (Kunicki and Nugent 2002). Τέλος, έχει διαπιστωθεί μία συνεργική δράση μεταξύ των απλοτύπων 5C και Met145 στην αύξηση του κινδύνου αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων σε νεαρούς ενήλικες (Sonoda et al 2001). A.7.1. vwf και Οξέα Στεφανιαία Σύνδρομα Τα Οξέα Στεφανιαία Σύνδρομα προκαλούνται από ρήξη των αθηρωματικών πλακών, έκθεση των υποενδοθηλιακών προπηκτικών παραγόντων κι επακόλουθο σχηματισμό θρόμβου που οδηγεί σε έμφραγμα του μυοκαρδίου. Ο ρόλος του vwf στη διαδικασία αυτή είναι θεμελιώδης. Προάγει την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στην υποενδοθηλιακή στιβάδα των τραυματισμένων αγγειακών τοιχωμάτων, ενισχύει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων και προάγει το σχηματισμό θρόμβου ινικής. Κατά 33

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνέπεια, η επαγόμενη από τη διατμηματική τάση συσσώρευση των αιμοπεταλίων είναι σαφώς ενισχυμένη στους ασθενείς με ΟΕΜ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, λόγω των αυξημένων συγκεντρώσεων vwf (Goto et al 1999). Επιπλέον, η ουδός διατμηματικής τάσης που απαιτείται για να επάγει τη σύνδεση του vwf στα αιμοπετάλια είναι σημαντικά μειωμένη στο πλάσμα ασθενών με ΟΕΜ (Li et al 2000). Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του vwf και της προβλεπόμενης επίπτωσης ΟΕΜ σε αγγειακούς ασθενείς είναι καλά τεκμηριωμένη. Η μελέτη ECAT κατέδειξε ότι ο vwf είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας υποτροπιάζοντος εμφράγματος μυοκαρδίου σε ασθενείς με σταθερή στηθάγχη (Thomson et al 1995). Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν με πολλαπλές μελέτες που περιγράφουν τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του vwf και του επανεμφράγματος ή/και του κινδύνου θνητότητας. Για παράδειγμα, ο Haines και οι συνεργάτες του κατέδειξαν ότι οι ασθενείς με ΟΕΜ που κατέληξαν μέσα σε ένα χρόνο είχαν μεγαλύτερα επίπεδα vwf σε σύγκριση με αυτούς που επιβίωσαν (Haines et al 1983). Ομοίως, υψηλές συγκεντρώσεις vwf έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζονται ανεξάρτητα τόσο με επανεμφάνιση εμφράγματος όσο και με θνητότητα σε επιζήσαντες από ΟΕΜ <70 ετών (Jansson et al 1991). Σε συμφωνία με τα ανωτέρα είναι και η μελέτη SHEEP, η οποία κατέδειξε ότι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις vwf αποτελούν έναν καλό προγνωστικό παράγοντα της επανεμφάνισης ΟΕΜ (Wiman et al 2000). Λαμβάνοντας υπόψιν τα προαναφερθέντα αποτελέσματα καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι, ενώ η συσχέτιση των επιπέδων του vwf και των στεφανιαίων επεισοδίων στο γενικό υγιή πληθυσμό είναι ασθενής, εντούτοις γίνεται ισχυρότερη σε ασθενείς με προϋπάρχουσα αγγειακή νόσο, ιδίως σε επιζήσαντες από ΟΕΜ. Επειδή ο vwf φυσιολογικά αποικοδομείται ενζυματικά από τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13, είναι λογικό να θεωρηθεί ότι η λειτουργικότητα της ADAMTS13 είναι παθολογική στην ισχαιμική καρδιαγγειακή νόσο. Εντούτοις, ο ρόλος της ADAMTS13 στα πλαίσια στεφανιαίων συνδρόμων δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Σύμφωνα με τον Kaikita και τους συνεργάτες του, τα επίπεδα της ADAMTS-13 ήταν ελαττωμένα στους ασθενείς με ΟΕΜ (Kaikita et al 2006), ενώ ο Chion και οι συνεργάτες του κατέδειξαν ότι υπάρχει αυξημένος κίνδυνος ΟΕΜ σε ασθενείς με αυξημένα επίπεδα ADAMTS13 (Chion et al 2007). Τα επίπεδα του vwf παρουσιάζουν μία τυπική διακύμανση κατά τη διάρκεια ενός οξέος καρδιαγγειακού επεισοδίου. Στην περίπτωση του STEMI ΟΕΜ, τα επίπεδα του vwf αυξάνονται στις 24 ώρες, φτάνουν στις μέγιστες τιμές στις

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ώρες κι επανέρχονται σε φυσιολογικά επίπεδα την 14 η ημέρα (Sakai et al 2000). Το μέγεθος της αύξησης έχει επίσης προγνωστική αξία. Οι ασθενείς με ΟΕΜ έχουν υψηλότερα επίπεδα vwf σε σύγκριση με αυτούς με ασταθή στηθάγχη (Frossard et al 2004). Επιπλέον, το μέγεθος της αύξησης του vwf είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας των βραχυπρόθεσμων ανεπιθύμητων ενεργειών στους ασθενείς με ΟΕΜ. Για παράδειγμα, το μέγεθος της απελευθέρωσης του vwf (η διαφορά στην τιμή αναφοράς και στις τιμές μετά από 24 ώρες κατά τη διάρκεια του επεισοδίου), όχι μόνο σχετίζεται με την επίπτωση οξείας καρδιακής ανεπάρκειας, αλλά επίσης σχετίζεται με 30ήμερη θνητότητα σε ασθενείς με STEMI (Collet et al 2003). Στους ασθενείς με ασταθή στηθάγχη ή non-q ΟΕΜ η πρώιμη αύξηση του vwf είναι ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας των ανεπιθύμητων εκβάσεων τις ημέρες 14 και 30 (Montalescot et al 1998). Σ αυτή την ομάδα ασθενών η συνεκτίμηση του vwf και της τροπονίνης Ι παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τη μακροπρόθεσμη πρόγνωση. Υψηλά επίπεδα vwf και τροπονίνης Ι σχετίζονται με αύξηση του σύνθετου αποτελέσματος ΟΕΜ, υποτροπιάζουσα στηθάγχη κι επαναγγείωση μέσα στον πρώτο χρόνο (Montalescot et al 2000). Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, όχι μόνο ο vwf, αλλά και ο σχηματισμός πλάκας αιμοπεταλίων κάτω από συνθήκες υψηλής διατμηματικής τάσης είναι προγνωστικός του μεγέθους της μυοκαρδιακής νέκρωσης, της μυοκαρδιακής αιματικής ροής και των μελλοντικών συμβαμάτων στους ασθενείς με Οξύ Στεφανιαίο Σύνδρομο (Fossard et al 2004, Fuchs et al 2006, Campo et al 2006). Στις προαναφερθείσες μελέτες η αντιμετώπιση των οξέων στεφανιαίων συνίστατο σε διαδερμική αγγειοπλαστική (percutaneous coronary intervention PCI). Επειδή, όπως είναι γνωστό με τη διενέργεια PCI αποκαθίσταται κυρίως η αιματική ροή στο επικάρδιο, η προγνωστική αξία της εξαρτώμενης από τον vwf λειτουργίας των αιμοπεταλίων αποδίδεται στην ελαττωματική μικροαγγειακή αιμάτωση της καρδιάς και όχι στην αιματική ροή στο επικάρδιο. Η άποψη αυτή ενισχύεται από τη συσχέτιση μεταξύ της υπερλειτουργίας των αιμοπεταλίων και της ελαττωματικής αιμάτωσης του μυοκαρδίου, όπως αυτά μετρώνται/εκτιμώνται από το βαθμό ανάσπασης του ST διαστήματος και το βαθμό αιμάτωσης του μυοκαρδίου με την αγγειογραφική μέθοδο Myocardial Blush Grade (Campo et al 2006). 35

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.7.2. vwf και PCI Η διαδερμική αγγειοπλαστική αποτελεί τη θεραπεία επαναιμάτωσης εκλογής σε ασθενείς τόσο με STEMI ΟΕΜ όσο και σε ασθενείς με υψηλού κινδύνου non- STEMI ΟΕΜ, αφού έχει καταδειχθεί ότι βελτιώνει σημαντικά το κλινικό αποτέλεσμα (Anderson et al 2007). Ωστόσο, σε μια σημαντική μερίδα ασθενών, στους οποίους έχει εφαρμοστεί πρωτογενής PCI ως θεραπεία STEMI ΟΕΜ, η αιμάτωση του μυοκαρδίου παραμένει παθολογική, με αποτέλεσμα μεγαλύτερο μέγεθος εμφράκτου, ελαττωμένο κλάσμα εξώθησης αριστερής κοιλίας και μειωμένη επιβίωση. Η ελαττωματική μικροαγγειακή κυκλοφορία και μυοκαρδιακή αιμάτωση μετά από μία κατά τα άλλα επιτυχή PCI αποδίδεται στο γεγονός ότι η PCI και η εμφύτευση stent σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη και συνεπακόλουθη απελευθέρωση vwf, ιδίως στις περιπτώσεις πολλαπλής τοποθέτησης stents, η οποία προκαλεί μία ταχεία αύξηση στην έκφραση του vwf στη στεφανιαία κυκλοφορία (Heper et al 2004). Είναι, λοιπόν, πιθανό η προθρομβωτική κατάσταση των ασθενών με Οξέα Στεφανιαία Σύνδρομα να ενισχύεται από τη μηχανικώς επαγόμενη αύξηση του vwf, η οποία μη αναστρέψιμα συνεισφέρει στην ελαττωματική μικροαγγειακή κυκλοφορία μετά από μία επιτυχή PCI στην οποία έχει αποκατασταθεί η αιματική ροή στο επικάρδιο. Σύμφωνη με αυτή την υπόθεση είναι και η παρατήρηση ότι η τοποθέτηση drugeluting stents σχετίζεται με μειωμένη φλεγμονώδη απάντηση και ελαττωμένα επίπεδα vwf στη στεφανιαία κυκλοφορία (Kefer et al 2005). Α.8. Παρεμβάσεις που στοχεύουν στον vwf Ο vwf παίζει καθοριστικό ρόλο στην αρτηριακή θρομβογένεση, γεγονός που τον καθιστά έναν πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο. Στην πραγματικότητα οι ανταγωνιστές του vwf έχουν ήδη προταθεί ως νέα αντιαιμοπεταλιακά φάρμακα, ενώ έχουν ήδη δοκιμαστεί ποικίλες προσεγγίσεις με σκοπό τον αποκλεισμό της αλληλεπίδρασης του vwf με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIbα και κατά συνέπεια την παρεμπόδιση της εμπλοκής του vwf στη θρομβογένεση. Οι ηπαρίνες παραβλάπτουν σε σημαντικό βαθμό τους εξαρτώμενους από τον vwf αιμοστατικούς μηχανισμούς των αιμοπεταλίων μέσω σύνδεσης σε μία περιοχή του vwf, η οποία αποτελεί τμήμα της Α1 επικράτειας που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση με τον GPIbα (Sobel et al 1991). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η χορήγηση 36

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ηπαρίνης και συγκεκριμένα της ηπαρίνης χαμηλού μοριακού βάρους (ΗΧΜΒ) ενοξαπαρίνης σχετίζεται με ελάττωση της απελευθέρωσης του vwf, της επανεμφάνισης ΟΕΜ και του θανάτου σε έδαφος ΟΕΜ (Montalescot et al 1998). Αξίζει να αναφερθεί ότι έχουν ήδη κατασκευαστεί ηπαρίνες, οι οποίες μέσω κατάλληλων χημικών τροποποιήσεων (υπεριωδική οξείδωση, αναγωγή με βοριοϋδρίδιο) μπορούν να αναστέλλουν την αλληλεπίδραση vwf-αιμοπεταλίων μέχρι και επτά φορές περισσότερο (Sobel et al 1996). Σύμφωνα με κάποιες ex vivo μελέτες οι αναστολείς του υποδοχέα GPIIb/IIIa, κυρίως το μονοκλωνικό αντίσωμα c7e3 Fab (abciximab), καταστέλλουν τη διαμεσολαβούμενη από τον vwf ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Η έγχυση abciximab σε ασθενείς με ασταθή στηθάγχη οδηγεί σε αναστολή της επαγόμενης από τη ριστοσετίνη συσσώρευσης των αιμοπεταλίων (Gold et al 1990). Κάτω από συνθήκες υψηλής διατμηματικής τάσης η παρουσία abciximab στο αίμα ασθενών ελαττώνει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων στο κολλαγόνο τύπου Ι, όπως αυτή διαμεσολαβείται από την αλληλεπίδραση του GPIbα με τον vwf (Turner et al 1995). Ο Goto και οι συνεργάτες του κατέδειξαν ότι η abciximab συγκρινόμενη με tirofiban και eptifibatide αναστέλλει τη διαμεσολαβούμενη από το vwf ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και τις προπηκτικές δοκιμασίες με αποτέλεσμα ελάττωση του χρόνου πήξης με ενεργοποίηση καολίνης. Το γεγονός αυτό μπορεί να έχει ιδιαίτερη σημασία σε περιοχές αρτηριακής στένωσης με ταχεία ροή αίματος, ιδίως σε ασθενείς με ΟΕΜ. Ωστόσο, δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστό, αν ή σε τι βαθμό η δράση αυτή των ηπαρινών ή των αποκλειστών του υποδοχέα GPIIb/IIIa στη σηματοδότηση του vwf συνεισφέρει στη συνολική ευεργετική τους δράση. Επιπλέον, έχουν ερευνηθεί περισσότερο ειδικοί ανταγωνιστές της αλληλεπίδρασης του vwf με τον υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων. Συγκεκριμένα, ανασυνδυασμένα θραύσματα πεπτιδίων του vwf μπορούν να ανταγωνιστούν το φυσικό vwf για τη σύνδεση με τον GPIbα και να παρεμποδίσουν την προσκόλληση και συγκέντρωση των αιμοπεταλίων in vitro (Dardik et al 1993). Το aurinτρικαρβοξυλικό οξύ (aurin tricarboxylic acid ATA) είναι ένα μικρό μόριο με συγγένεια για μία περιοχή της Α1 επικράτειας του vwf, το οποίο παρεμποδίζει την επαγόμενη από τη ριστοσετίνη, διαμεσολαβούμενη από τον vwf συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Συγκεκριμένα, αλληλεπιδρά με αλληλουχίες του Α1 δισουλφιδικού βρόγχου (κατάλοιπα αμινοξέων ), ενώ η παρεμπόδιση της προσκόλλησης των 37

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αιμοπεταλίων λαμβάνει χώρα μόνο σε συνθήκες υψηλών ρυθμών διάτμησης, οπότε ο vwf παίζει καθοριστικό ρόλο (Girma et al 1992). Πρόσφατα, σχεδιάστηκαν μεγάλου μοριακού βάρους ανταγωνιστές που συνδέονται στην Α1 επικράτεια του vwf και παρεμποδίζουν τη σύνδεσή του στον υποδοχέα GPIbα. Παραδείγματα αυτής της προσέγγισης αποτελούν μονοκλωνικά αντισώματα, ολιγονουκλεοτίδια που ομοιάζουν με φάρμακα, νανοσώματα και απταμερή, κάποια από τα οποία υπόκεινται ήδη σε κλινικές δοκιμές (Εικόνα 18). Εικόνα 18. Στρατηγικές που στοχεύουν στην αλληλεπίδραση της Α1 επικράτειας του vwf με το υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIbα. A.8.1. Μονοκλωνικά αντισώματα ενάντια στον vwf Α AJvW-2 Το AJvW-2 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού εναντίον της Α1 επικράτειας του ανθρώπινου vwf, το οποίο μπλοκάρει την αλληλεπίδραση του vwf με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIbα. Συγκεκριμένα, το AJvW-2 παρεμποδίζει την επαγόμενη από τη ριστοσετίνη και βοτροσετίνη συσσώρευση, όπως επίσης και την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο κολλαγόνο τύπου Ι κάτω από συνθήκες υψηλής διατμηματικής τάσης. Επιπλέον, το μονοκλωνικό αυτό αντίσωμα φαίνεται να 38

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παρεμποδίζει τη φωτοχημικά επαγόμενη θρόμβωση της καρωτίδας αρτηρίας σε ινδικά χοιρίδια. χωρίς συγχρόνως να προκαλεί παράταση των χρόνων πήξης (Kageyama et al 1997). Αμέσως μετά από αγγειοπλαστική, η προσκόλληση αιμοπεταλίων στο τραυματισμένο αγγειακό τοίχωμα και η επακόλουθη απελευθέρωση διάφορων μιτογόνων έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός νέου έσω χιτώνα. Το AJvW-2 παρεμποδίζει το σχηματισμό αυτό μέσω αναστολής του σχηματισμού θρόμβου αιμοπεταλίων (Kageyama et al 2000). Τέλος, η ex vivo επώαση με AJvW-2 του πλούσιου σε αιμοπετάλια πλάσματος ασθενών με Οξέα Στεφανιαία Σύνδρομα είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την υψηλή διατμηματική τάση συσσώρευση των αιμοπεταλίων (Eto et al 1999). Α AJW200 Το AJW200 είναι ένα IgG4 μονοκλωνικό αντίσωμα εναντίον της Α1 επικράτειας του vwf, το οποίο αναπτύχθηκε με βάση το AJvW-2 μονοκλωνικό αντίσωμα επίμυος, και το οποίο αργότερα ανθρωποποιήθηκε (humanized) έτσι ώστε να ελαχιστοποιηθεί η ανοσολογική αντίδραση κατά τη χορήγησή του σε ανθρώπους. Το ανθρωποποιημένο AJW200 μονοκλωνικό αντίσωμα αποτελείται από αλληλουχίες που προέρχονται από επίμυες και που κωδικοποιούν τις υπερμεταβλητές περιοχές του μορίου που είναι υπεύθυνες για τη δέσμευση του αντιγόνου, ενσωματωμένες σε ένα σκελετό ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης (IgG4). Αυτή η δομή θεωρείται σαφώς λιγότερο ανοσογόνος, αλλά επαρκώς ειδική. Η ειδική αναστολή της αλληλεπίδρασης του vwf με τον υποδοχέα GPIbα από το AJW200 έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από τη ριστοσετίνη και βοτροσετίνη συσσώρευσης των αιμοπεταλίων χωρίς ταυτόχρονη παράταση των χρόνων πήξης, γεγονός που οφείλεται στην εξαρτώμενη από την υψηλή διατμηματική τάση ανασταλτική δράση (Kageyama et al 2002). Σύμφωνα με μία τυχαιοποιημένη διπλή τυφλή μελέτη πρώτης φάσης, στην οποία χορηγήθηκαν iv σε υγιείς άντρες είτε εικονικό φάρμακο είτε τρεις δόσεις AJW200 (0,01, 0,03 και 0,05 mg/kg), δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες ούτε και ανοσογονικότητα. Η μέγιστη κατάληψη του vwf που παρατηρήθηκε ήταν 19,4%, 51,0% και 62,4% αντίστοιχα σε συσχέτιση πάντα με τις συγκεντρώσεις του AJW200 στο πλάσμα. Το AJW200 προκάλεσε, επίσης, δοσοεξαρτώμενη αναστολή της RiCof (Ristocetin Co Factor activity δραστικότητα 39

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συμπαράγοντα ριστοσετίνης) μία ώρα μετά την έγχυση και παράταση του χρόνου σύγκλισης σε μελέτη με αναλυτή λειτουργικότητας αιμοπεταλίων (PFA-100 closure time) χωρίς ταυτόχρονη παράταση των χρόνων πήξης (Machin et al 2003). Α.8.2. Νανοσώματα Παρά τις σημαντικές κλινικές εφαρμογές τους, τα μονοκλωνικά αντισώματα εμφανίζουν σημαντικούς περιορισμούς που οδήγησαν στην ανάπτυξη μικρότερων και περισσότερο ευέλικτων αντισωμάτων. Τα νανοσώματα είναι αντισώματα που στερούνται ελαφρών αλυσίδων, τα οποία αρχικά ανευρέθηκαν στον ορό καμήλων και αργότερα στον ορό όλων των καμηλοειδών. Τα αντισώματα αυτά, εκτός των ελαφρών αλυσίδων, στερούνται και της πρώτης σταθερής περιοχής των βαριών αλυσίδων (CH1). Οι μεταβλητές περιοχές αυτών των αντισωμάτων αποτέλεσαν τη βάση για την ανάπτυξη των νανοσωμάτων, μίας νέας τάξης θεραπευτικών πρωτεϊνών που περιέχουν μία ή περισσότερες περιοχές σύνδεσης αντιγόνου (Εικόνα 19). Μέχρι στιγμής έχουν κατασκευαστεί πολλά νανοσώματα εναντίον στόχων ποικίλου θεραπευτικού ενδιαφέροντος, μεταξύ των οποίων και αντιθρομβωτικά νανοσώματα (Siller-Matula et al 2011). Εικόνα 19. Νανόσωμα. Σύγκριση με αντίσωμα. 40

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α ALX-0081 Το ALX-0081 είναι ένα δισθενές ανθρωποποιημένο νανόσωμα, το οποίο συνδέει με μεγάλη συγγένεια την Α1 επικράτεια του vwf, με αποτέλεσμα αναστολή της αλληλεπίδρασης του υποδοχέα GPIbα με τον vwf κάτω από συνθήκες υψηλής διατμηματικής τάσης (van Bonkenstaele et al 2009). Το ALX-0081 αποτελείται από δύο πανομοιότυπα δομικά συμπλέγματα, PMPaP2A2h1, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με ένα συνδέτη. Η δισθενικότητα είναι απαραίτητη για να επιτευχθεί υψηλή συγγένεια με την Α1 επικράτεια του vwf με σκοπό την αναστολή της πρόσδεσής του vwf στον υποδοχέα GPIbα. Το ALX-0081 επιδεικνύει δραστικότητα in vitro και in vivo. Πειράματα διάχυσης με αίμα ασθενών με Οξύ Στεφανιαίο Σύνδρομο υπό αντιθρομβωτική αγωγή κατέδειξαν πλήρη αναστολή της προσκόλλησης των αιμοπεταλίων μετά από προσθήκη του ALX-0081, ενώ απουσία του εν λόγω νανοσώματος παρατηρήθηκε υπολειπόμενη προσκόλληση. Σε ένα μοντέλο αποτελεσματικότητας και ασφάλειας σε μπαμπουίνο για τον έλεγχο οξείας θρόμβωσης και χειρουργικής αιμορραγίας το ALX-0081 εμφάνισε σαφώς καλύτερο θεραπευτικό παράθυρο σε σύγκριση με τα ήδη κυκλοφορούντα στην αγορά αντιθρομβωτικά. Πειράματα φαρμακοκινητικής και βιοδιασποράς κατέδειξαν διαμεσολαβούμενη από το στόχο κάθαρση του ALX-0081, η οποία έχει ως αποτέλεσμα αυτορυθμιζόμενη διάθεση του νανοσώματος (Ulrichts et al 2011). Σε μελέτες πρώτης φάσης που περιλαμβάνουν υγιείς ενήλικες και ασθενείς με σταθερή στηθάγχη που έχουν υποβληθεί σε αγγειοπλαστική το ALX-0081 εμφανίστηκε καλά ανεκτό, ασφαλές, δεν προκάλεσε αιμορραγία ούτε και ανοσολογική αντίδραση. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα έχει ήδη ξεκινήσει μία κλινική μελέτη δεύτερης φάσης που περιλαμβάνει υψηλού κινδύνου ασθενείς Οξέος Στεφανιαίου Συνδρόμου που έχουν υποβληθεί σε αγγειοπλαστική (Bartunek et al 2013) ( Η μελέτη αυτή έχει σχεδιαστεί να συγκρίνει την ασφάλεια και τη βιολογική αποτελεσματικότητα του ALX-0081 σε σύγκριση με τον αναστολέα του υποδοχέα GPIIb/IIIa ReoPro στους προαναφερθέντες ασθενείς, οι οποίοι ήδη λαμβάνουν ακετυλοσαλικυλικό οξύ μαζί με κλοπιδογρέλη και ηπαρίνη. Στους ασθενείς αυτούς χορηγούνται τυχαία ALX-0081 ή ReoPro. 41

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α ALX-0681 Το ALX-0681 είναι ένα νανόσωμα πανομοιότυπο με το ALX-0081, το οποίο στοχεύει την Α1 επικάτεια του vwf, αλλά είναι ειδικά σχεδιασμένο ώστε να χορηγείται υποδορίως. Ήδη διεξάγεται μία απλή τυφλή τυχαιοποιημένη κλινική μελέτη δεύτερης φάσης, η οποία περιλαμβάνει 51 ερευνητικά κέντρα παγκοσμίως και η οποία έχει σχεδιαστεί για να εκτιμήσει την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια του εν λόγω νανοσώματος ως συμπληρωματική θεραπεία στην πλασμαφαίρεση σε 110 ασθενείς με επίκτητη ΘΘΠ (ΤΙΤΑΝ Study). Πολύ πρώιμα αποτελέσματα (5/110 ασθενείς) δείχνουν σημαντική μείωση του χρόνου που απαιτείται για ομαλοποίηση του αριθμού των αιμοπεταλίων σε σύγκριση με την πλασμαφαίρεση ως μονοθεραπεία, μείωση του αριθμού των κυκλοφορούντων στο πλάσμα ULvWF και αναστολή της επαγόμενης από τη ριστοσετίνη συγκόλλησης των αιμοπεταλίων (Peyvandi et al 2011). Α.8.3. Απταμερή Τα απταμερή είναι μόρια νουκλεϊκών οξέων με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα για ένα συγκεκριμένο μόριο στόχο, ενώ διαθέτουν τη δυνατότητα αναδίπλωσης σε μοναδικές τρισδιάστατες δομές που προάγουν τη σύνδεση με το μόριο στόχο. Μέσω σύζευξης με μεγάλου μοριακού βάρους πολυαιθυλενογλυκόλη, τα απταμερή έχουν κατασκευαστεί έτσι, ώστε να διαθέτουν κάποια από τα γνωρίσματα των μονοκλωνικών αντισωμάτων και μερικά από τα γνωρίσματα κάποιων μικρού μοριακού βάρους χημικά συντεθιμένων φαρμάκων. Α ARC 1779 Το ARC 1779 (Archemix Corporation) (Εικόνα 20) είναι ένα απταμερές που συνδέεται στον ενεργοποιημένο vwf με υψηλή συγγένεια με αποτέλεσμα αναστολή της αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων (Gilbert et al 2007). 42

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 20. Κρυσταλλική δομή του απαταμερούς ARC 1779, όπως είναι συνδεδεμένο στην Α1 επικράτεια του vwf. Σε μία κλινική μελέτη πρώτης φάσης, στην οποία συμμετείχαν 47 εθελοντές, το ARC 1779 επέδειξε εξαρτώμενη από τη δοσολογία και τη συγκέντρωση αναστολή της δραστικότητας του vwf, αλλά και της εξαρτώμενης από τον vwf λειτουργίας των αιμοπεταλίων (Gilbert et al 2007). Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση του ARC 1779 σε ασθενείς με οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου σε μία ex vivo μελέτη. Καθώς τα επίπεδα του vwf αυξάνονται στους ηλικιωμένους και στην περίπτωση ΟΕΜ, σκοπός της εν λόγω μελέτης ήταν να αξιολογήσει την αναστολή της ex vivo λειτουργίας των αιμοπεταλίων από το ARC Αποδείχτηκε ότι το ARC 1779 μπορεί να αναστείλει τη δραστικότητα του vwf και την εξαρτώμενη από το vwf λειτουργία των αιμοπεταλίων, ακόμα και στην περίπτωση ΟΕΜ. Επιπλέον δεν παρατηρήθηκαν αιμορραγικές εκδηλώσεις (Spiel et al 2009). Σε μία άλλη μελέτη αξιολογήθηκαν τόσο η in vitro αναστολή της επαγόμενης από το vwf συσσώρευσης των αιμοπεταλίων όσο και η in vivo δραστηριότητα του ARC 1779 σε ένα μοντέλο θρόμβωσης της καρωτίδας κατόπιν ηλεκτρικού τραυματισμού σε πιθήκους cynomolgus. Το ARC 1779 όχι μόνο ανέστειλε τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων κι ελάττωσε την προσκόλληση των αιμοπεταλίων σε επιφάνειες καλυμμένες από κολλαγόνο, αλλά επιπλέον ανέστειλε το σχηματισμό αποφρακτικών θρόμβων (Diener et al 2009). Και οι δύο μελέτες αποδεικνύουν ότι το ARC 1779 έχει θεραπευτικό αποτέλεσμα ως αντι- 43

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ vwf παράγοντας στη διαμεσολαβούμενη από τον vwf θρόμβωση, όπως συμβαίνει στα Οξέα Στεφανιαία Σύνδρομα. Πρόσφατα, μελετήθηκε η επίδραση του ARC 1779 στη λειτουργία των αιμοπεταλίων σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο, οι οποίοι λαμβάνουν διπλή αντιαιμοπεταλιακή αγωγή (Arzamendi et al 2010). Το αίμα ασθενών που λάμβαναν ασπιρίνη και κλοπιδογρέλη και υγιών εθελοντών επωάστηκε ex vivo με ARC 1779 ή abciximab τόσο πριν από τη θεραπεία επαναιμάτωσης (pretherapy) όσο και 10 min μετά την έναρξη της επαναιμάτωσης (posttherapy) στις προσβεβλημένες αρτηρίες. Στην πρώτη περίπτωση (pretherapy) όχι όμως στη δεύτερη (posttherapy) η προσκόλληση των αιμοπεταλίων ελαττώθηκε τόσο υπό την επίδραση του ARC 1779 όσο και από το abciximab. Σε αντίθεση με το abciximab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα, το οποίο χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της στεφανιαίας νόσου, το ARC 1779 δεν επηρέασε σημαντικά τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, την έκφραση της P- σελεκτίνης ή την αλληλεπίδραση αιμοπεταλίων-λευκοκυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά ανοίγουν το δρόμο για χρήση του ARC 1779 ως νέα αντιαιμοπεταλιακή αγωγή στους ασθενείς με στεφανιαία νόσο (Arzamendi et al 2010). Εκτός από τις προαναφερθείσες μελέτες, το ARC 1779 έχει επίσης αξιολογηθεί στη ΘΘΠ (Jilma-Stohlawetz et al 2011), αλλά και στην τύπου 2Β νόσο von Willebrand (Jilma et al 2010). Α ARC 1172 Το ARC 1172 είναι ένα 41-μερές DNA απταμερές, το οποίο επίσης συνδέεται στην Α1 επικράτεια του vwf. Ένα παράγωγο του ARC 1172, το οποίο σχεδιάστηκε με τέτοιο τρόπο, ώστε να επιμηκύνεται η ενδοαγγειακή επιβίωση, αποδείχτηκε ικανό να αναστείλει τη θρόμβωση καρωτίδας αρτηρίας σε πίθηκο cynomolgus, όπως επίσης και τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων σε ανθρώπους (Huang et al 2009). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μίας άλλης μελέτης, ένα RNA απταμερές ανέστειλε τη διαμεσολαβούμενη από τον vwf προσκόλληση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Επιπροσθέτως, στην ίδια μελέτη σχεδιάστηκε ένα μόριο-αντίδοτο, για να αναστρέψει τη δράση του απταμερούς και να αποκαταστήσει τη λειτουργία των αιμοπεταλίων γρήγορα και αποτελεσματικά. Ένα τέτοιο ζεύγος απταμερούς-αντιδότου αντιπροσωπεύει έναν αντιαιμοπεταλιακό παράγοντα με αναστρέψιμη δράση και συνεπώς μεγαλύτερη ασφάλεια (Oney et al 2007). 44

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α ARC Το ARC είναι ένα δεύτερης γενιάς απταμερές που αποκλείει την Α1 επικράτεια του vwf. Ειδικότερα, το ARC αποτελείται από 21 νουκλεοτίδια συζευγμένα σε πολυαιθυλενογλυκόλη 40kDa, ενώ διαθέτει ιδιότητες και φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά κατάλληλα για χρόνια υποδόρια θεραπεία. Εικόνα 21. Προσκόλληση αιμοπεταλίων σε τμήματα τραυματισμένων αρτηριών χοίρων. Α. Το ARC15105, ARC 1779 και abciximab ανέστειλαν την προσκόλληση ραδιοσημασμένων με 111 In αιμοπεταλίων στις εν λόγω αρτηρίες. Β. Αντιπροσωπευτικές μικρογραφίες SEM της προσκόλλησης των αιμοπεταλίων μετά από έκθεση πλήρους αίματος σε αρτηρίες χοίρων. Σύμφωνα με μία πρόσφατη μελέτη, το ARC15105 ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από τη ριστοσετίνη συσσώρευση των αιμοπεταλίων σε πλήρες αίμα, ενώ ελάττωσε σημαντικά τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων την επαγόμενη από πεπτίδια που ενεργοποιούν τους υποδοχείς κολλαγόνου, ADP, αραχιδονικού οξέος και θρομβίνης. 45

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ARC15105 (40nmol/L) ελάττωσε την προσκόλληση των αιμοπεταλίων >90% σε απογυμνωμένες αρτηρίες χοίρων, ποσοστό συγκρίσιμο με αυτό της αναστολής που προκαλείται από το abciximab (Εικόνα 21). Ο χρόνος ημίσειας ζωής από την iv και sc χορήγηση του ARC15105 στους πιθήκους cynomolgus ήταν 67 και 65 ώρες αντίστοιχα, ενώ η βιοδιαθεσιμότητα κατά την υποδόρια χορήγηση ήταν ~98%. Η φαρμακοδυναμική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι το ARC15105 αναστέλλει τη δραστικότητα του vwf >90% σε δείγματα αίματος πιθήκου, τα οποία λήφθηκαν 300 ώρες μετά την iv ή sc χορήγηση ARC15105 σε δόση 20 mg/kg. Συνεπώς, η δραστικότητα, το φαρμακοκινητικό προφίλ και η βιοδιαθεσιμότητα μετά από υποδόρια χορήγηση του ARC15105 το καθιστούν κατάλληλο για περαιτέρω μελέτες με σκοπό τη χρόνια αναστολή της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων από το vwf σε ασθενείς με οξέα στεφανιαία σύνδρομα (Siller-Matula et al 2012). Α.9. Η επικράτεια Α2 του vwf Α.9.1. Δομή της επικράτειας Α2 του vwf Η δομή της επικράτειας Α2 του vwf έχει προσδιοριστεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Ο υδρόφοβος πυρήνας με δομή β-πτυχωτού φύλλου αποτελείται από έξι β-ελάσματα με τη σειρά β3-β2-β1-β4-β5-β6 με το β3-έλασμα αντιπαράλληλο στα υπόλοιπα, ενώ περιβάλλεται από έξι α-έλικες (Εικόνα 22). Η επικράτεια Α2 του vwf διαφέρει από τις άλλες Α επικράτειες, γιατί διαθέτει μία α-έλικα λιγότερη. Στη θέση της υπάρχει ένας μακρύς βρόγχος που εκτείνεται από το καρβοξυτελικό άκρο του ελάσματος β4 μέχρι το αμινοτελικό άκρο του ελάσματος β5 και καλείται βρόγχος α4. Οι α-έλικες της επικράτειας Α2, εκτός από το βρόγχο α4, διαθέτουν ένα εκτεταμένο δίκτυο δεσμών υδρογόνου που σταθεροποιεί τη δομή της. Η περιοχή πέψης της μεταλλοπρωτεάσης ADAMTS13 μεταξύ των καταλοίπων Tyr 1605 και Met 1606 εντοπίζεται στο κέντρο του β-πτυχωτού φύλλου κοντά στο μέσο του κεντρικού β4- ελάσματος (Zhang et al 2009). 46

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 22. Η τριτοταγής δομή της επικράτειας Α2 του vwf,όπου διακρίνεται ο βρόγχος α4 (ροζ) και η θέση πρωτεόλυσης από τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13 στο βρόγχο α3β4. Στη δεξιά εικόνα απεικονίζεται υπέρθεση των επικρατειών Α1 και Α3. Α.9.2. Σχέσεις των λειτουργιών των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf Όπως ήδη έχει αναφερθεί το κεντρικό τμήμα της ώριμης υπομονάδας του vwf περιλαμβάνει τις Α επικράτειες. Στην Α1 επικράτεια εντοπίζονται οι περιοχές σύνδεσης για τον υποδοχέα GPIbα, την ηπαρίνη, τα σουλφατίδια και το κολλαγόνο. Η Α3 επικράτεια συνδέεται στα ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ, ενώ η Α2 επικράτεια περιέχει τη θέση πέψης για τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13. Η διαδοχική αυτή οργάνωση των εν λόγω λειτουργικών περιοχών στο τμήμα Α1Α2Α3 υποδεικνύει ότι τουλάχιστον μία από τις επικράτειες μπορεί να επηρεάζει τη λειτουργία μίας γειτονικής επικράτειας. Υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν μία στενή συσχέτιση των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf. Έτσι, σύμφωνα με μία μελέτη, η Α1 επικράτεια αναστέλλει την πέψη της Α2 επικράτειας και η αλληλεπίδραση του υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIbα με την Α1 επικράτεια τερματίζει αυτή την αναστολή, καθιστώντας με τον τρόπο αυτό την Α2 επικράτεια περισσότερο ευάλωτη σε πέψη από την ADAMTS13 (Nishio et al 2004). Μία άλλη μελέτη κατέδειξε ότι η εξάλειψη της Α2 επικράτειας από τον vwf είχε ως αποτέλεσμα μία ήπια αύξηση της επαγόμενης από τη ριστοσετίνη σύνδεσης στον υποδοχέα GPIbα (Lankhof et al 1997). Πρόσφατα, ο Martin και οι συνεργάτες του πραγματοποίησαν λειτουργικές μελέτες 47

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ χρησιμοποιώντας μία ανασυνδυασμένη Α2 επικράτεια, η οποία ειδικά συνδέεται στην Α1 επικράτεια του vwf. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εν λόγω μελέτης, το ανασυνδυασμένο πολυπεπτίδιο της Α2 επικράτειας αναγνωρίζει ειδικά τον ενεργοποιημένο vwf και η αλληλεπίδραση αυτή αναστέλλει αποτελεσματικά τη σύνδεση στον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIbα κάτω από συνθήκες ροής. Α.10. Βιολειτουργικότητα - Biofunctionalization Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για την καθήλωση και τον έλεγχο της απελευθέρωσης πεπτιδίων/πρωτεϊνών από διάφορες επιφάνειες. Ο προσδιορισμός και τελικά η χρήση των κατάλληλων τεχνικών για την τροποποίηση συγκεκριμένων υλικών, ώστε να προσδεθούν στην επιφάνειά τους βιολειτουργικά μόρια με τις επιθυμητές ιδιότητες αποτελεί πρόκληση και είναι ιδιαίτερης σημασίας. Κάθε τεχνική καθήλωσης πρωτεϊνών πρέπει να είναι κατάλληλα προσαρμοσμένη, λαμβάνοντας υπόψη το υλικό, το πεπτίδιο/πρωτεΐνη, αλλά και την αναμενόμενη αλληλεπίδραση του τμήματος της πρωτεΐνης που πρόκειται να καθηλωθεί με το υπόστρωμα. Η καθήλωση πρωτεϊνών κι ενζύμων στη βιολογικά ενεργή τους κατάσταση σε επιφάνειες είναι απαραίτητη για την παραγωγή βιολειτουργικών επιφανειών για διάφορες βιοεφαρμογές, όπως βιοαισθητήρες, ενζυμικούς αντιδραστήρες, πρωτεϊνικές και πεπτιδικές micro arrays (Katranidis, Choli-Papadopoulou 2012). Οι πρωτεΐνες τείνουν να χάνουν τη λειτουργικότητά τους κατά την καθήλωση σε επιφάνειες, λόγω της διαδικασίας ξεδιπλώματος (Norde 1986). Συνεπώς, η γνώση της στερεοδιάταξης, του προσανατολισμού και της ακριβούς λειτουργίας της κάθε πρωτεΐνης που πρόκειται να ακινητοποιηθεί σε κάποια επιφάνεια είναι απαραίτητη για την κατασκευή βέλτιστων, με μεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία νανοσυσκευών. Μέχρι στιγμής έχουν περιγραφεί πολλές τεχνικές καθήλωσης πρωτεϊνών που αφορούν μη ειδική προσρόφηση ή με ειδική ομοιοπολική σύνδεση. Η καθήλωση αυτή των πρωτεϊνών μέσω λειτουργικών ομάδων που στερούνται ειδικότητας, όπως είναι οι αμινομάδες και οι καρβοξυλομάδες, έχει ως αποτέλεσμα ακινητοποίηση του μορίου με τυχαίο προσανατολισμό. Επιπλέον, αν το σημείο πρόσδεσης εντοπίζεται κοντά στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, τότε η δραστικότητα του πρωτεϊνικού μορίου μπορεί μερικώς ή πλήρως να χαθεί, λόγω στερικών αλληλεπιδράσεων (Huang et al 1997). Γίνονται, λοιπόν, προσπάθειες για προσανατολισμένη καθήλωση πρωτεϊνών σε επιφάνειες. Μία τέτοιου είδους στρατηγική ακινητοποίησης έχει ως σκοπό την 48

61 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ελαχιστοποίηση των στερικών αλληλεπιδράσεων και την εύκολη πρόσβαση στο ενεργό κέντρο του ενζύμου ή στο σημείο πρόσδεσης των υποδοχέων, όπως επίσης και στη διατήρηση της ολικής σταθερότητας του πρωτεϊνικού μορίου (Turková 1999). Α Υποστρώματα για την καθήλωση πρωτεϊνών Πολλά πολυμερή έχουν επιλεγεί ως υποστρώματα για ακινητοποίηση βιομορίων στην επιφάνειά τους και είναι προτεινόμενα για μια πληθώρα εφαρμογών με βάση τις ιδιότητές τους, όπως είναι η ελαστικότητα, η αγωγιμότητα, η αντοχή, οι οπτικές ιδιότητες και η προέλευση (φυσικά ή συνθετικά) (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Πολυμερικά υποστρώματα για βιολειτουργικότητα-βιοσύζευξη. Λόγω της αδρανούς φύσης τους, τα περισσότερα πολυμερή που κυκλοφορούν στο εμπόριο πρέπει να υποβληθούν, πριν την προσκόλληση των βιομορίων, σε ενεργοποίηση της επιφάνειάς τους (Εικόνα 23). Το επόμενο βήμα, επομένως, είναι η 49

62 ΕΙΣΑΓΩΓΗ βελτιστοποίηση των τεχνικών που θα χρησιμοποιηθούν για αυτήν την διαδικασία, έτσι ώστε να επιτευχθεί τόσο η πρόσδεση των κατάλληλων βιομορίων, αλλά και ο επαρκής αριθμός των επιθυμητών λειτουργικών ομάδων. Για τη χρησιμοποίηση των πολυμερικών επιφανειών σε βιοεφαρμογές είναι αναγκαία η μεγιστοποίηση του αριθμού των βιοενεργών συστατικών/λειτουργικών ομάδων ανά μονάδα επιφάνειας, το οποίο μπορεί να επιτευχθεί με την πρόσδεση ενός πολυλειτουργικού παράγοντα επάνω στην επιφάνεια. Η πρόσδεση ενός βιοενεργού συστατικού σε μία στερεή επιφάνεια με τη διαμεσολάβηση ενός άλλου μορίου έχει ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της βιοδραστικότητας, μέσω ελάττωσης των στερεοχημικών περιορισμών, αλλά και προστασίας του συστατικού από υδρόφοβη επιφανειακή αποδιάταξη. Το τελικό βήμα είναι η ομοιοπολική πρόσδεση του βιοενεργού συστατικού. Τα βιοενεργά συστατικά μπορεί, επίσης, να είναι φυσικά ή συνθετικά και δρουν καταλύοντας μία συγκεκριμένη αντίδραση σε ένα βιολογικό σύστημα. Στον Πίνακα 2 φαίνονται διάφοροι τύποι βιοενεργών συστατικών, όπως επίσης και οι διάφορες εφαρμογές τους (Goddard et al. 2007). Πίνακας 2. Τύποι βιοενεργών συστατικών. Αν η αρχική τροποποίηση της επιφάνειας δεν έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία πολλών ενεργών λειτουργικών ομάδων ή όταν το βιοενεργό συστατικό χάνει τη δραστικότητά του κατά την απευθείας σύνδεση στην υδρόφοβη πολυμερική 50

63 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιφάνεια, τότε είναι απαραίτητη η παρεμβολή ενός ενδιάμεσου συστατικού μεταξύ της επιφάνειας και του βιοενεργού μορίου. Άριστο πολυμερές που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για την καθήλωση βιολειτουργικών μορίων είναι η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), ένα πολυμερές του οξειδίου του αιθυλενίου, η οποία μπορεί να καθηλωθεί σε ικρίωμα πολυμερούς αντιδρώντας με αμινομάδες που έχουν δημιουργηθεί επί του ικριώματος μετά από χημική κατεργασία η επεξεργασία με ακτινοβολία (Εικόνα 24). Η χρήση ενός υδρόφιλου ενδιάμεσου μορίου, όπως η PEG, έχει ως αποτέλεσμα προστασία του βιοενεργού συστατικού από αποικοδόμηση και ταυτόχρονη βελτίωση της βιοενεργότητάς του. Συνήθως, χρησιμοποιείται μίγμα PEG και βιοτινυλιωμένης PEG (biotin-peg-nhs) (Groll et al. 2004). Εικόνα 23. Η αρχή της βιολογικής επιφανειακής τροποποίησης-ενεργοποίησης. Εικόνα 24. Πολυαιθυλενογλυκόλη καθηλωμένη πάνω σε κατάλληλο υπόστρωμα. Φαίνονται, επίσης, σποραδικά τοποθετημένα στην επιφάνεια, μόρια βιοτινυλιωμένης PEG επί των οποίων έχει προσδεθεί διαδοχικά στρεπταβιδίνη και βιοτινυλιωμένο βιοδραστικό μόριο. Η κατάλληλη αναλογία μη βιοτινυλιωμένης και βιοτινυλιωμένης PEG αποτρέπει την πιθανή στερεοχημική παρεμπόδιση (steric conflict) που μπορεί να προκύψει κατά την καθήλωση των βιοενεργών μορίων ( 51

64 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η εισαγωγή αμινομάδων επί του πολυμερικού ικριώματος μπορεί να γίνει με την χρήση πολυαιθυλενοϊμίνης (PEI, polyethylene imine). Η ΡΕΙ είναι ένα οργανικό πολυμερές με μεγάλη πυκνότητα αμινομάδων, οι οποίες μπορούν να πρωτονιωθούν. Α Τεχνικές καθήλωσης πρωτεϊνών Οι πρωτεΐνες συνήθως προσροφώνται στην επιφάνεια ενός στερεού υποστρώματος με τυχαίο προσανατολισμό με αποτέλεσμα να υφίστανται αλλαγές στη διαμόρφωσή τους, γεγονός που καθιστά τις λειτουργικές ομάδες τους μη προσβάσιμες στα αλληλεπιδρώντα μόρια και στα υποστρώματα για ενζυμικές αντιδράσεις. Η έκταση της αλλαγής στη διαμόρφωση της πρωτεΐνης στην προσροφημένη της κατάσταση διαφέρει ανάλογα με τον τύπο της πρωτεΐνης, την υδροφιλικότητα/υδροφοβικότητα της επιφάνειας και τις περιβαλλοντικές συνθήκες (θερμοκρασία, ph, ιοντική ισχύς διαλύματος) (Kumada et al 2007b). Η καθιέρωση μίας τεχνικής ελεγχόμενης καθήλωσης πρωτεϊνών απαιτεί τα εξής: 1) μία ισχυρή και ειδική συγγένεια της πρωτεΐνης για την επιφάνεια, 2) τοποκατευθυνόμενη (site-directed) καθήλωση και 3) διατήρηση της φυσιολογικής διαμόρφωσης και της βιολογικής λειτουργίας της πρωτεΐνης στην προσροφημένη της κατάσταση. Συνεπώς, οι περισσότερες τεχνικές καθήλωσης αφορούν τροποποίηση ή επικάλυψη της επιφάνειας με κατάλληλες ουσίες με σκοπό αλλαγή των ιδιοτήτων της επιφάνειας και/ή παροχή λειτουργικών ομάδων για την πρόσδεση της πρωτεΐνης. Κάποιες από τις διάφορες τεχνικές καθήλωσης που έχουν μέχρι στιγμής προταθεί απεικονίζονται στην Εικόνα 25, ενώ τα χαρακτηριστικά τους συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Α Σύστημα στρεπταβιδίνης - βιοτίνης Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες βιοχημικές αντιδράσεις με σκοπό την καθήλωση πρωτεϊνών σε στερεά υποστρώματα με ταυτόχρονη διατήρηση του προσανατολισμού των πρωτεϊνικών μορίων. Μεταξύ των διαφόρων συστημάτων που έχουν μελετηθεί, το σύστημα στρεπταβιδίνης - βιοτίνης είναι το περισσότερο γνωστό και χρησιμοποιημένο. 52

65 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 25. Διάφορες μέθοδοι ακινητοποίησης πρωτεϊνών. (a) Φυσική προσρόφηση. (b) Μέθοδος καθήλωσης με χρήση hydrogels. (c) Καθήλωση με ουρά ιστιδίνης (6xHis-tag) και Καθήλωση σε επιφάνεια Au. (d) Καθήλωση με διαμεσολάβηση σιλανίων, τρανσγλουταμινάσης. (e) Μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. (f) Καθήλωση με διαμεσολάβηση αντισώματος-πρωτεΐνης Α (FLAG-tag). (g) Καθήλωση διαμεσολαβούμενη από γλουταθειόνη/gst. Πίνακας 3. Διάφορες μέθοδοι καθήλωσης πρωτεϊνών και τα χαρακτηριστικά τους. 53

66 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η πολύ ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ στρεπταβιδίνης και βιοτίνης (Εικόνα 26) είναι ένας από τους ισχυρότερους μη ομοιοπολικούς δεσμούς (K a =10 15 M -1 ). Η στρεπταβιδίνη είναι μία τετραμερής πρωτεΐνη με τέσσερις θέσεις σύνδεσης, η οποία είναι παρόμοια με την αβιδίνη. Η ισχύς του δεσμού, όπως επίσης και το πολύ μικρό μέγεθος της βιοτίνης (MW 244.3), εξασφαλίζουν ένα ιδανικό σύστημα σύζευξης με πολλαπλές εφαρμογές. Επειδή η στρεπταβιδίνη στερείται υδρογονανθράκων και έχει ένα σχεδόν ουδέτερο pi, εμφανίζει ελάχιστες μη ειδικές συνδέσεις με πρωτεΐνες. Μετά τη σύνδεση στη βιοτινυλιωμένη επιφάνεια, η στρεπταβιδίνη διαθέτει τρεις ακόμα περιοχές σύνδεσης, στις οποίες μπορούν να προσδεθούν βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες με τον ίδιο προσανατολισμό (Katranidis, Choli-Papadopoulou 2012). Εικόνα 26. Σχηματική απεικόνιση της προσανατολισμένης καθήλωσης μίας πρωτεΐνης μέσω της αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης - βιοτίνης. 54

67 ΣΚΟΠΟΣ ΣΚΟΠΟΣ Ο σχηματισμός θρόμβου αιμοπεταλίων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των αθηροθρομβωτικών επεισοδίων. Στην πολυσταδιακή αυτή διαδικασία μετέχουν ποικίλοι παράγοντες μεταξύ των οποίων κεντρικό ρόλο διαθέτει ο vwf, ο οποίος αποτελεί γέφυρα μεταξύ του τραυματισμένου αγγειακού τοιχώματος και των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, κυρίως σε συνθήκες υψηλής διατμηματικής τάσης. Λόγω, λοιπόν, του προαναφερθέντα ρόλου του vwf στη θρομβογένεση, η αλληλεπίδραση μεταξύ της Α1 επικράτειάς του και του υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIb/IX/V αποτελεί έναν ιδιαίτερο ελκυστικό στόχο νέων αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας γίνεται αναφορά στη δομή και λειτουργία της Α1 επικράτειας του vwf, όπως επίσης και στην αλληλεπίδραση της εν λόγω επικράτειας με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIb/IX/V με τελικό σκοπό την αποσαφήνιση του ρόλου του συμπλόκου A1-vWF-GPIb/IX/V στη θρομβογένεση. Επιπλέον, γίνεται ανασκόπηση της σύγχρονης βιβλιογραφίας σχετικά με τις μεθόδους αποκλεισμού της αλληλεπίδρασης αυτής και καταγραφή της σύγχρονης γνώσης σχετικά με τις διαφορετικές τάξεις φαρμάκων που στοχεύουν εναντίον του συμπλόκου A1-vWF-GPIb/IX/V. Στο πειραματικό μέρος της διπλωματικής εργασίας έγινε κλωνοποίηση, υπερέκφραση και καθαρισμός τόσο της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας όσο και του βιοτινυλιωμένου παραγώγου αυτής. Απώτερος σκοπός των πειραμάτων αυτών είναι η λήψη σε μεγάλη ποσότητα της βιοτινυλιωμένης Α1 πρωτεΐνης, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μελλοντικά πειράματα καθήλωσης σε βιοσυμβατές επιφάνειες με τελικό σκοπό τη μελέτη του αποκλεισμού της αλληλεπίδρασης της Α1 επικράτειας του vwf με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIb/IX/V ως νέα αντιαιμοπεταλιακή αγωγή. 55

68

69 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1. Υλικά Β.1.1. Βιολογικά υλικά Χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη E.coli BL21(DE3), TOP10 και AVB101 (Invitrogen Life Technologies) για την υπερέκφραση και την in vivo βιοτινυλίωση της πρωτεΐνης Α1 του vwf αντίστοιχα. Β.1.2. Χημικά αντιδραστήρια Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma Aldrich (St.Louis, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) και οι μεμβράνες PVDF (Polyvinylidene difluoride-immobilon) της εταιρείας Millipore (Bedford, USA). Τα σφαιρίδια αγαρόζης ήταν της εταιρίας Upstate (Protein G Agarose, Fast Flow, , USA). Β.1.3. Υλικά χρωματογραφίας Για τον καθαρισμό των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με ουρά έξι ιστιδινών, χρησιμοποιήθηκε υλικό χρωματογραφίας χημικής συγγένειας (σφαιρίδια Ni-NTA), της εταιρείας Qiagen. Β.1.4. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού προμηθεύτηκαν από την NEBiolabs, (Beverly, USA) και από την Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). Η πολυμεράση Expand long polymerase και το Rapid DNA ligation kit ήταν από την εταιρεία Roche. 57

70 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας Applichem Biochemica GmBH, (Darmstadt, Germany). Ο πλασμιδιακός φορέας pet29c(+) που χρησιμοποιήθηκε για την υπερέκφραση της Α1 επικράτειας του vwf, όπως επίσης και ο πλασμιδιακός φορέας pan5 που χρησιμοποιήθηκε για τη βιοτινυλίωση της ίδιας πρωτεΐνης ήταν της Avidity (Denver, CO, USA). Το αντίσωμα της στρεπταβιδίνης - αλκαλικής φωσφατάσης που χρησιμοποιήθηκε για την δοκιμασία dot-blot με σκοπό την ανίχνευση βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών ήταν της εταιρείας ACRIS GmBH Pharmaceuticals (Herford, Germany). H αλβουμίνη (bovin serum albumin, BSA) που χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμασία dot-blot ήταν της εταιρείας Serva (Heidelberg, Germany). Ο πλασμιδιακός φορέας pet29c(+) με κλωνοποιημένο το γονίδιο της A1- vwf απομονώθηκε με kit mini-prep της εταιρίας Qiagen. H βιοτίνη που χρησιμοποιήθηκε για την in vivo βιοτινυλίωση της Α1 επικράτειας του vwf ήταν της εταιρείας Sigma-Aldrich GmBH (Deisenhofen, Germany). Β.2. Μέθοδοι βιοχημείας και μοριακής βιολογίας Β.2.1 Καλλιέργειες βακτηρίων E.coli Τα στελέχη BL21(DE3) και TOP10 του E.coli αναπτύχθηκαν στο ευρέως χρησιμοποιούμενο θρεπτικό υλικό Luria-Bertani (LB) (Sambrook et al 1989), του οποίου η σύσταση ήταν η ακόλουθη: Θρεπτικό υλικό Luria-Bertani Εκχύλισμα ζύμης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 1.0 % w/v NaCl 1.0 % w/v Αποσταγμένο ύδωρ Η ρύθμιση της οξύτητας έγινε με προσθήκη NaOH. Η αποστείρωση του θρεπτικού υλικού έγινε σε κλίβανο στους 120 ο C, υπό πίεση μιας Atm, για 30 λεπτά. 58

71 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η ανάπτυξη των κυττάρων έγινε στους 37 ο C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν αυτό ήταν απαραίτητο. Β.2.2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (PAGE) Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE Οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα σωματίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται διά μέσου των πόρων μιας πηκτής υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα (ν), με την οποία κινούνται οι πρωτεΐνες στην πηκτή, εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και από το φορτίο της πρωτεΐνης (q), σχέση που δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: E q v, f όπου f είναι παράγοντας της εξίσωσης που εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης, όπως επίσης και το ιξώδες της πηκτής όπου κινείται η πρωτεΐνη. Υπάρχουν πολλά είδη PAGE και παρέχουν διαφορετικές πληροφορίες για τις πρωτεΐνες. Η μη αποδιατακτική PAGE, γνωστή και ως native PAGE, διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση την αναλογία μάζας-φορτίου. Η αποδιατακτική και αναγωγική SDS-PAGE, η περισσότερο χρησιμοποιούμενη τεχνική ηλεκτροφόρησης διαχωρίζει τις πρωτεΐνες κυρίως βάσει της μάζας τους. Η δισδιάστατη (2D) PAGE διαχωρίζει τις πρωτεΐνες σε ένα πρώτο βήμα με βάση το ενδογενές φορτίο τους, χρησιμοποιώντας την τεχνική της ισοηλεκτρικής εστίασης, και σε ένα δεύτερο βήμα με βάση τη μάζα τους. Η ακρυλαμίδη είναι το υλικό εκλογής για την κατασκευή gels ηλεκτροφόρησης, όταν σκοπός είναι ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μέγεθος. Όταν η ακρυλαμίδη αναμειγνύεται με bis-ακρυλαμίδη σχηματίζει ένα τρισδιάστατο πολυμερές πλέγμα, με την προσθήκη του παράγοντα πολυμερισμού ammonium persulfate (APS). Η ουσία TEMED (N,N,N,N'-tetramethylenediamine) καταλύει την αντίδραση πολυμερισμού προάγοντας την παραγωγή ελεύθερων ριζών από το APS. Το μέγεθος των πόρων που δημιουργούνται στο gel είναι αντιστρόφως ανάλογο με την ποσότητα της ακρυλαμίδης. Ένα gel πολυακρυλαμίδης 7% έχει μεγαλύτερο μέγεθος πόρων από gel πολυακρυλαμίδης 12%. 59

72 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η ηλεκτροφόρηση γίνεται απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων, όπως είναι το ανιονικό απορρυπαντικό SDS (sodium dodecyl sulfate) ή η ουρία. Στην πρώτη περίπτωση οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους και παραμένουν ενεργές, ενώ στην περίπτωση προσθήκης αποδιατακτικών παραγόντων οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Επίσης, η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει παρουσία ή απουσία αναγωγικών ουσιών, όπως είναι η β-μερκαπτοαιθανόλη και το DTT (διθειοθρεϊτόλη) (Stern et al 1993). Οι αναγωγικές ουσίες ανάγουν τις σουλφιδρυλικές ομάδες των κυστεϊνών και καταστρέφουν τους δισουλφιδικούς δεσμούς. Το σύστημα της ηλεκτροφόρησης μπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστημα χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα τόσο στην πηκτή όσο και στα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστημα χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβασης, όπου γίνεται συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια λεπτή στοιβάδα (χαμηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~7), και η πηκτή διαχωρισμού, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~9). Το διάλυμα ηλεκτροδίων διαφέρει από τα δύο προηγούμενα (Andrews 1968). Στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση το gel της πηκτής εμβαπτίζεται σε διάλυμα που περιέχει SDS, ενώ τα πρωτεϊνικά δείγματα θερμαίνονται με SDS πριν από την ηλεκτροφόρηση, έτσι ώστε η πυκνότητα φορτίου σε όλες τις πρωτεΐνες να είναι περίπου ίδια. Η θέρμανση με SDS, ένα ανιονικό αποδιατακτικό, έχει ως αποτέλεσμα την αποδιάταξη των πρωτεϊνών, ενώ το ίδιο το SDS συνδέεται στενά στα αποδιαταγμένα μόρια. Συνήθως προστίθεται επιπλέον ένα αναγωγικό μέσο, όπως το DTT, το οποίο διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς και καταστρέφει την τριτοταγή και τεταρτοταγή δομή των πρωτεϊνών. Κάτω από αυτές τις συνθήκες οι πρωτεΐνες κατά την ηλεκτροφόρηση διαχωρίζονται με βάση το μοριακό τους βάρος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό γλυκοσυλίωσης. Οι πρωτεΐνες αυτές δεσμεύουν μικρότερα ποσά SDS ανά μονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή διαχωρισμού με αποτέλεσμα να παρουσιάζουν φαινομενικό μοριακό βάρος υψηλότερο του πραγματικού. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων αποτελείται από την πηκτή επιστοίβασης (stacking 60

73 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ gel) και την πηκτή διαχωρισμού (separating/running gel). Η αναλογία της ακρυλαμίδης εξαρτάται από το μέγεθος της πρωτεΐνης στόχου. Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγματος (wells) δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός της πηκτής επιστοίβασης (Εικόνα 27). Εικόνα 27. Αριστερά: Σχηματική απεικόνιση της συσκευής που χρησιμοποιείται για SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Δεξιά: Αναλογίες ακρυλαμίδης ανάλογα με το μοριακό βάρος των πρωτεϊνών. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισμού και επιστοίβασης ήταν η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβασης (Συνολικός όγκος 5 ml) Πηκτή διαχωρισμού (Συνολικός όγκος 10 ml) Ακρυλαμίδη 5% w/v Ακρυλαμίδη 12%, 15%, 20% w/v Bis-ακρυλαμίδη 0.17% w/v Bis-ακρυλαμίδη 0.40% w/v SDS 0.50% w/v SDS 0.50% w/v Tris-HCl 0.125M Tris-HCl 0.375M APS 0.08% w/v APS 0.08% w/v TEMED 0.20% v/v TEMED 0.20% v/v Επίσης χρησιμοποιήθηκε διάλυμα ηλεκτροφόρησης (running buffer), το οποίο προστέθηκε στους θαλάμους των ηλεκτροδίων, με την παρακάτω σύσταση: 61

74 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Διάλυμα ηλεκτροφόρησης ph 8.9 Tris-HCl 25mM Γλυκίνη 0.192M SDS 0.1% w/v Στα δείγματα πριν την ηλεκτροφόρηση (πριν μεταφερθούν στις θέσεις που δημιουργήθηκαν στην πηκτή επιστοίβασης) προστέθηκε το διάλυμα διαλυτοποίησης δειγμάτων (loading buffer). Η σύσταση του διαλύματος δειγμάτων ήταν η παρακάτω: Διάλυμα δειγμάτων SDS 2% w/v Tris-HCl ph mM β- μερκαπτοαιθανόλη 1% v/v Γλυκερόλη 10% v/v Κυανούν της βρωμοφαινόλης 0,02% w/v Το αρχικό διάλυμα των ηλεκτροδίων ήταν 4 φορές πιο πυκνό (4x). Τα δείγματα, πριν την τοποθέτησή τους στην πηκτή επιστοίβασης, θερμάνθηκαν για 5 min στους 100 ο C, για να αποδιαταχθούν πλήρως οι πρωτεΐνες και να δημιουργηθεί το σύμπλοκο SDS-πρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσμούς και αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες. Επιπλέον, συμβάλλει στο διαχωρισμό των υπομονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Απουσία β-μερκαπτοαιθανόλης απεικονίζονται πρωτεΐνες που αποτελούνται από παραπάνω από μία υπομονάδες. Αρχικά εφαρμόστηκε σταθερή τάση 180V μέχρι τα δείγματα να εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού και κατόπιν εφαρμόστηκε σταθερή τάση 200V μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Για την ηλεκτροφόρηση αυτού του τύπου χρησιμοποιήθηκαν οι επίπεδες συσκευές πάχους 1,5mm και μήκους 7.5cm που κατασκευάστηκαν στο Ινστιτούτο Max-Panck Μοριακής Γενετικής του Βερολίνου. Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκε σύστημα ασυνεχές κατά Laemmli (Laemmli 1970). 62

75 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.3. Στερέωση και χρώση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου Β Χρώση με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 Μετά το διαχωρισμό των πρωτεϊνικών ζωνών στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση είναι απαραίτητη η εμφάνιση και ανάγνωσή τους. Γι αυτό το σκοπό μπορούν είτε να μεταφερθούν σε μία μεμβράνη για ανάλυση με Western-blotting είτε να γίνουν ορατές στην πηκτή με κατάλληλες μεθόδους χρώσης ή ανίχνευσης. Η χρωστική Coomassie είναι το περισσότερο διαδεδομένο αντιδραστήριο για τη χρώση πρωτεϊνικών ζωνών στις πηκτές ηλεκτροφόρησης. Σε συνθήκες όξινου διαλύματος η χρωστική Coomassie συνδέεται σε βασικά και υδρόφοβα κατάλοιπα πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα αλλαγή του χρώματός της από θαμπό κοκκινωπό-καφέ σε έντονο μπλε. Όπως συμβαίνει με όλες τις χρώσεις, τα αντιδραστήρια της χρωστικής Coomassie ανιχνεύουν κάποιες πρωτεΐνες καλύτερα από κάποιες άλλες, λόγω των διαφορετικών χημικών ιδιοτήτων τους, αλλά και της διαφορετικής σύνθεσής τους. Ωστόσο, για τις περισσότερες πρωτεΐνες, με τη χρώση Coomassie είναι δυνατή η ανίχνευση μέχρι και 10 ng πρωτεΐνης ανά ζώνη σε μία πηκτή. Στο συγκεκριμένο πείραμα χρησιμοποιήθηκε η χρωστική CBB R-250. Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών, η πηκτή ξεπλένεται με νερό, ώστε να απομακρυνθούν καλά όλα τα διαλύματα. Ακολουθεί έκπλυση με οξύ ή αλκοόλη, ώστε να στερεωθεί η πηκτή και να αποφευχθεί διάχυση των πρωτεϊνικών ζωνών. Στη συνέχεια γίνεται κατεργασία με το αντιδραστήριο χρωστικής (διάλυμα χρώσης), ώστε η χρωστική να διαχυθεί και να αντιδράσει με τα πρωτεϊνικά μόρια. Η διαδικασία ολοκληρώνεται με αποχρωματισμό της πηκτής (διάλυμα αποχρωματισμού), ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται έχουν την εξής σύσταση: Διάλυμα χρώσης Διάλυμα αποχρωματισμού CBB R % w/v Μεθανόλη 50% v/v Μεθανόλη 50% v/v Οξικό οξύ 10% v/v Οξικό οξύ 10% v/v 63

76 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υπάρχουν πολλές διαφορετικές τεχνικές χρώσης των πρωτεϊνικών ζωνών σε πηκτή. Μία αρκετά δημοφιλής μέθοδος είναι η χρώση με άργυρο, κατά την οποία εναποτίθεται μεταλλικός άργυρος στην επιφάνεια της πηκτής στην περιοχή των πρωτεϊνικών ζωνών. Η χρώση Pierce Zinc Reversible Stain (αναστρέψιμη χρώση με ψευδάργυρο) δε βάφει άμεσα τις πρωτεΐνες, αλλά προκαλεί τη δημιουργία ενός αδιαφανούς υπόβαθρου πάνω στο οποίο φαίνονται καθαρά οι μη κεχρωσμένες πρωτεϊνικές ζώνες. Η χρώση με ψευδάργυρο είναι τόσο ευαίσθητη όσο και η τυπική χρώση με άργυρο, μπορεί όμως εύκολα να απομακρυνθεί πλήρως με αποτέλεσμα να είναι εφικτή η περαιτέρω επεξεργασία της πηκτής (π.χ. με Western blotting). Τα τελευταία χρόνια έχει, επίσης, αυξηθεί η ζήτηση για φθορίζουσες χρωστικές, ενώ έχουν κατασκευαστεί ειδικά kits για ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνικών μορίων, όπως γλυκοπρωτεϊνών και φωσφοπρωτεϊνών. Β Χρώση με νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) Στα πειράματα της συγκεκριμένης διπλωματικής η βαφή των πρωτεϊνών έγινε με Coomassie blue ή με νιτρικό άργυρο. Η βαφή με Coomassie blue περιγράφηκε προηγουμένως. Το χαρακτηριστικό της βαφής με νιτρικό άργυρο είναι η μεγαλύτερη ευαισθησία που παρουσιάζει στην ανίχνευση πρωτεϊνών σε σχέση με τη χρώση με Coomassie blue. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που μπορεί να ανιχνευθεί είναι μέχρι και 0,1 ng. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ιόντων αργύρου να αντιδρούν με πρωτεΐνες και ιδιαίτερα με τις ελεύθερες αμινομάδες και τις θειούχες ομάδες τους. Η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν είναι η ακόλουθη: Διάλυμα στερέωσης Διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου Μεθανόλη 50% w/v Na 2 S 2 O % w/v Οξικό οξύ 12% w/v Διάλυμα εμφάνισης Διάλυμα νιτρικού αργύρου Na 2 CO 3 6% w/v AgNO 3 0.2% w/v Φορμαλδεΰδη v/v Φορμαλδεΰδη v/v Na 2 S 2 O % w/v 64

77 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά η πηκτή εμβαπτίζεται στο διάλυμα στερέωσης για τουλάχιστον δύο ώρες, προκειμένου να στερεωθούν οι ζώνες των πρωτεϊνών στην πηκτή. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 15 λεπτών με 50 % v/v αιθανόλη και μία πλύση των 20 λεπτών με 30 % v/v αιθανόλη. Κατόπιν γίνεται μία πλύση του ενός λεπτού με απιονισμένο νερό και στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίζεται για 1 λεπτό στο διάλυμα του θειοθειϊκού νατρίου (Na 2 S 2 O 3 ), το οποίο ακολούθως απομακρύνεται με 3 πλύσεις των 20 δευτερολέπτων με απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίζεται για 20 λεπτά στο διάλυμα του νιτρικού αργύρου (AgNO 3 ) και ξεπλένεται δύο φορές με απιονισμένο νερό. Ακολουθεί εμβάπτιση της πηκτής στο διάλυμα εμφάνισης, οπότε και εμφανίζονται οι πρωτεϊνικές ζώνες. Η αντίδραση σταματά με την εμβάπτιση της πηκτής στο διάλυμα στερέωσης για 10 λεπτά. Η πηκτή ξεπλένεται και φυλάσσεται σε απιονισμένο νερό (Blum 1987). Β.2.4. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS-PAGE σε μεμβράνη Η μεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή πολυβινυλοδιφθοριδίου ((PolyVinylidene DiFluoride, PVDF) με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου είναι γνωστή ως Western Blot. Η μέθοδος στηρίζεται στο γεγονός ότι τα σύμπλοκα SDS-πρωτεϊνών, τα οποία είναι αρνητικά φορτισμένα, κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου κινούνται προς το θετικό πόλο, εξέρχονται από την πηκτή και καθηλώνονται στη μεμβράνη λόγω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Μετά τη μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή στη μεμβράνη, τα ελεύθερα σημεία της μεμβράνης αποκλείονται με κατάλληλο διάλυμα προς αποφυγή μη ειδικών συνδέσεων των ανιχνευτικών αντισωμάτων. Τις περισσότερες φορές η μεταφερόμενη πρωτεΐνη είναι συζευγμένη με ένα αντίσωμα σεσημασμένο με ένζυμο ως δείκτη. Στη συνέχεια προστίθεται το κατάλληλο υπόστρωμα και παράγεται το ανιχνεύσιμο προϊόν της ενζυμικής αντίδρασης που μπορεί να είναι για παράδειγμα χρωμογόνο ίζημα για χρωματομετρική ανίχνευση. Οι πιο ευαίσθητες μέθοδοι ανίχνευσης χρησιμοποιούν το φαινόμενο της χημειοφωταύγειας. Εναλλακτικά, χρησιμοποιούνται φθορίζοντα αντισώματα, ατ οποία ανιχνεύονται με απεικονιστικό σύστημα φθορισμού. Σε κάθε περίπτωση, η ένταση του σήματος συσχετίζεται με την ποσότητα των αντιγόνων στη μεμβράνη. Η ανίχνευση των πρωτεϊνών που έχουν καθηλωθεί σε μεμβράνη μπορεί να γίνει, επίσης, με αυτόματο αναλυτή μέσω 65

78 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ προσδιορισμού της αμινοξικής ακολουθίας τους (protein sequencing). Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται αποκλειστικά η μεμβράνη PVDF. Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε SDS-PAGE έγινε εμβάπτιση της πηκτής και της μεμβράνης σε διάλυμα μεταφοράς (transfer buffer). Αν χρησιμοποιείται μεμβράνη PVDF, είναι απαραίτητη η ενεργοποίησή της με μεθανόλη 100% για ένα λεπτό, πριν την εμβάπτιση στο διάλυμα της μεταφοράς Η σύσταση του διαλύματος μεταφοράς είναι η εξής: Διάλυμα μεταφοράς Γλυκίνη 39 mm Tris 48 mm Μεθανόλη 20 % v/v Στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς (Semi-Dry Blotter της εταιρείας Hoeffer) το κάτω ηλεκτρόδιο είναι το αρνητικό. Σε αυτό τοποθετούνται 6 φύλλα Whatmann κομμένα στο μέγεθος της πηκτής και διαβρεγμένα με διάλυμα μεταφοράς. Από πάνω τοποθετείται η πηκτή, έπειτα η μεμβράνη (επίσης κομμένη στο μέγεθος της πηκτής) και τέλος άλλα 6 φύλλα Whatmann. Δίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης να είναι άμεση και χωρίς παρεμβολή φυσαλίδων, οι οποίες παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Το θετικό ηλεκτρόδιο τοποθετείται από πάνω και κλείνει τη συσκευή (Εικόνα 28). Όπως γίνεται αντιληπτό, η πηκτή τοποθετείται προς το αρνητικό ηλεκτρόδιο και η μεμβράνη προς το θετικό. Για την μεταφορά εφαρμόζεται σταθερή ένταση ηλεκτρικού ρεύματος 1 ma/cm 2 της πηκτής επί 2 ώρες. Εικόνα 28. Σχηματική απεικόνιση της συσκευής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών σε μεμβράνη. 66

79 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Μετά τη μεταφορά και πριν τη έναρξη της Western blot, οι πρωτεΐνες βάφονται με μία χρωστική, όπως η Ponceau S ή η amido black 10B, για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα της ηλεκτρομεταφοράς. Επειδή οι περισσότερες χρωστικές εμπλέκονται στη σύνδεση και ανίχνευση των αντισωμάτων, πρέπει να χρησιμοποιείται χρωστική που απομακρύνεται εύκολα. Η χρωστική Ponceau S είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο κατάλληλο για αντιστρεπτή χρώση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη. Είναι μία αρνητικά φορτισμένη χρωστική, η οποία δεσμεύεται στις θετικά φορτισμένες αμινομάδες των πρωτεϊνών, καθώς και στις μη πολικές περιοχές τους. Μειονεκτήματα της εν λόγω χρωστικής είναι η περιορισμένη ευαισθησία, η μη καλή απεικόνιση σε film και το γρήγορα ξεθώριασμα της χρωστικής. Έχουν χρησιμοποιηθεί βελτιωμένες μέθοδοι για χρώση πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ή PVDF, οι οποίες επιτρέπουν την ανίχνευση πολύ χαμηλών επιπέδων πρωτεϊνών (λίγα νανογραμμάρια), την εύκολη φωτογράφηση και τη διατήρηση της χρώσης μέχρι την απομάκρυνσή της. Για τη χρώση με Ponceau S η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε διάλυμα 0.2% (w/v) Ponceau S σε 3% τριχλωροοξικό οξύ (TriChloroAcetic acid, TCA) για 5 min. Πλύσεις με απιονισμένο νερό καθαρίζουν το υπόβαθρο και εμφανίζουν τις ζώνες των πρωτεϊνών με κόκκινο χρώμα. Με τη μέθοδο αυτή μπορούν να ανιχνευτούν έως και ng πρωτεΐνης, έχει δηλαδή περίπου ίδια ευαισθησία με τη χρωστική CBB R Το πλεονέκτημα της Ponceau S είναι ότι δε χρειάζεται να προηγηθεί στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών. Η χρωστική μπορεί εύκολα να απομακρυνθεί με πλύσεις με απιονισμένο νερό και η μεμβράνη να χρησιμοποιηθεί περαιτέρω για ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνών (Salinovich and Montelaro 1986). Β.2.5. Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη (Western Blot) Η ανοσοανίχνευση επιτρέπει τον εντοπισμό μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης (πρωτεΐνη-στόχος), που βρίσκεται καθηλωμένη σε μεμβράνη, με τη βοήθεια πολυκλωνικού ή μονοκλωνικού αντισώματος. Η αρχή της τεχνικής στηρίζεται ουσιαστικά στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης-στόχου με το κατάλληλο αντίσωμα. Η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο εκτός του ότι αναγνωρίζει και δεσμεύεται στο πρώτο αντίσωμα, είναι συζευγμένο με ένα δείκτη, ο οποίος μπορεί να ανιχνευθεί με κάποια από τις μεθόδους που αναλύονται παρακάτω. 67

80 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Οι ενζυμικές σημάνσεις χρησιμοποιούνται πιο συχνά στη μέθοδο Western blot και, αν και απαιτούν επιπλέον βήματα, μπορεί να είναι εξαιρετικά ευαίσθητες όταν βελτιστοποιούνται με το κατάλληλο υπόστρωμα. Η αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) και η υπεροξειδάση ραπανιού (HRP) είναι τα δύο ένζυμα που χρησιμοποιούνται περισσότερο για την ανίχνευση πρωτεϊνών. Μια σειρά από χρωμογόνα, φθορισμογόνα και χημειοφωταύγειας υποστρώματα είναι διαθέσιμα για χρήση για κάθε ένα από τα δύο ένζυμα. Η HRP είναι το ένζυμο που χρησιμοποιείται στις περισσότερες εφαρμογές. Τα συζευγμένα με ένζυμο αντισώματα προσφέρουν τη μέγιστη ευελιξία στην ανίχνευση πρωτεϊνών με τη μέθοδο Western blot, λόγω της ποικιλίας των διαθέσιμων υποστρωμάτων. Το απλούστερο σύστημα είναι η χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων, τα οποία επιτρέπουν την άμεση οπτικοποίηση των πρωτεϊνικών ζωνών. Τα υποστρώματα χημειοφωταύγειας διαφέρουν από τα άλλα υποστρώματα στο ότι το σήμα που παράγεται είναι ένα παροδικό προϊόν της αντίδρασης ενζύμουυποστρώματος και εξακολουθεί να υφίσταται μόνο για όσο διάστημα λαμβάνει χώρα η αντίδραση. Ωστόσο, σε καλά βελτιστοποιημένες δοκιμασίες, χρησιμοποιώντας κατάλληλες αραιώσεις αντισώματος και επαρκές υπόστρωμα, η αντίδραση μπορεί να παράγει φως για 1 έως 24 ώρες, ανάλογα με το υπόστρωμα, επιτρέποντας ανίχνευση με μεγάλη ευαισθησία, η οποία μπορεί να απεικονιστεί σε film ακτίνων-χ ή με ψηφιακό σύστημα. Η χρήση αντισωμάτων συζευγμένων με κάποια φθορίζουσα ουσία σε μία ανοσοδοκιμασία απαιτεί λιγότερα βήματα, επειδή δεν υπάρχει στάδιο ανάπτυξης του υποστρώματος. Ενώ το πρωτόκολλο της δοκιμασίας είναι απλούστερο και πιο σύντομο, η μέθοδος απαιτεί ειδικό εξοπλισμό για την ανίχνευση του σήματος φθορισμού, αφού απαραίτητη προϋπόθεση είναι η ύπαρξη μίας πηγής διέγερσης φωτός. Οι πρόσφατες εξελίξεις στην ψηφιακή απεικόνιση και στην ανάπτυξη νέων φθορισμοφόρων, όπως είναι αυτά που διεγείρονται στο υπέρυθρο και οι κβαντικές τελείες, έχουν αυξήσει την ευαισθησία και τη δημοτικότητα των ανιχνευτών φθορισμού στη μέθοδο Western blot, αλλά και σε άλλες ανοσοδοκιμασίες. Παρά το γεγονός ότι ο εξοπλισμός και τα συζευγμένα με φθορίζουσες ουσίες αντισώματα μπορεί να είναι αρκετά ακριβά, αυτή η μέθοδος έχει το πρόσθετο πλεονέκτημα της πολλαπλής συμβατότητας (δυνατότητα χρήσης περισσότερων του ενός φθορισμοφόρων στο ίδιο πείραμα). 68

81 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Συνήθως η ανοσοανίχνευση γίνεται σε δύο στάδια. Στη μέθοδο Western blot η μεμβράνη σημαίνεται με ένα πρωτεύον αντίσωμα, το οποίο αναγνωρίζει μία συγκεκριμένη πρωτεΐνη ή έναν επίτοπο σε μία ομάδα πρωτεϊνών. Το πρωτεύον αυτό αντίσωμα δεν είναι άμεσα ανιχνεύσιμο. Για το λόγο αυτό σημασμένα δευτερεύοντα αντισώματα ή άλλα αντιδραστήρια ανίχνευσης χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του πρωτεύοντος αντισώματος και κατά συνέπεια της πρωτεΐνης στόχου (έμμεση ανίχνευση). Χρησιμοποιείται μία μεγάλη ποικιλία δευτερευόντων αντισωμάτων, ανάλογα με το είδος του ζώου στο οποίο αναπτύχθηκε το πρωτεύον αντίσωμα ή την ουρά του αντισώματος (π.χ. βιοτίνη, DIG). Τα τελευταία χρόνια, όμως, η προσοχή στράφηκε στην ανάπτυξη συστημάτων ανοσοανίχνευσης ενός σταδίου, λόγω της ανάγκης για ταχύτερη ανίχνευση των πρωτεϊνών. Σε αυτά τα συστήματα το αντίσωμα αναγνωρίζει την πρωτεΐνη-στόχο και συγχρόνως είναι συζευγμένο με ένα ένζυμοδείκτη. Η αναγνώριση της πρωτεΐνης-στόχου συνήθως γίνεται μέσω κάποιας μικρής αλληλουχίας σήμανσης (protein tag), όπως η ουρά 6 ιστιδινών ή η βιοτίνη. Β.2.6. Χρωματομετρική μέθοδος ανοσοανίχνευσης Η μέθοδος στηρίζεται στην οξειδοαναγωγική αντίδραση μεταξύ των ενώσεων NBT (Nitro Blue Tetrazolium chloride) και BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indonyl Phosphate). Το ΝΒΤ, με μοριακό βάρος 817.6, είναι μέλος μιας ομάδας ετεροκυκλικών οργανικών ενώσεων που είναι γνωστές ως άλατα τετραζολίου. Μετά από αναγωγή, η ένωση αποδίδει ΝΒΤ-φορμαζάνη, ένα ιδιαίτερα χρωματισμένο, αδιάλυτο στο νερό προϊόν. Το BCIP έχει μοριακό βάρος 433,6 και η υδρόλυσή του από την αλκαλική φωσφατάση έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός μωβ-μπλε ιζήματος που μπορεί να εναποτεθεί σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ή νάιλον. Ο συνδυασμός των ΝΒΤ και BCIP προκαλεί το σχηματισμό ενός έντονου, μαύρου-μωβ ιζήματος που παρέχει πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία από το κάθε υπόστρωμα χωριστά. Το αποφωσφορυλιωμένο από την AP BCIP οξειδώνεται από το NBT και δίνει χαρακτηριστικό μπλε χρώμα. Το NBT που ανάγεται δίνει επίσης μπλε χρώμα, κάνοντας την αντίδραση πιο ευαίσθητη (Εικόνα 29). Αυτή η αντίδραση εξελίσσεται με σταθερό ρυθμό, που επιτρέπει ακριβή έλεγχο της σχετικής ευαισθησίας της. Ο συνδυασμός ΝΒΤ/ΒCΙΡ παράγει χαρακτηριστικά ζώνες με ανάλυση υψηλής ευκρίνειας με λίγη χρώση του υπόβαθρου της μεμβράνης. 69

82 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 29. Οξειδοαναγωγική αντίδραση μεταξύ NBT και BCIP, η οποία δίνει προϊόντα μπλε χρώματος. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο βιοτινυλίωσης της απομονωμένης πρωτεΐνης A1-vWF. Για τον κορεσμό της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιήθηκε το ακόλουθο διάλυμα με το οποίο επωάστηκε η μεμβράνη σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα: Διάλυμα κορεσμού Σκόνη γάλακτος 10 % w/v Αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) 5 % w/v TBS-T (20 mm Tris-HCl, ph 7.6, 137 mm NaCl, 0.1 % (v/v) Tween-20) Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με TBS. Αντί για αντίσωμα η μεμβράνη επωάστηκε με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αλκαλική φωσφατάση αραιωμένη σε TBS-T (αραίωση 1:2000) υπό συνεχή ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν, έγιναν τρεις πλύσεις με TBS. Για την ανίχνευση της πρωτεΐνης-στόχου χρησιμοποιήθηκε διάλυμα ανίχνευσης με σύσταση: Διάλυμα ανίχνευσης Tris-HCl, ph mm NaCl 100 mm MgCl 2 5 mm 70

83 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η μεμβράνη εμβαπτίστηκε σε 10 ml διαλύματος ανίχνευσης στο οποίο είχαν προστεθεί 200 μl του διαλύματος NBT/BCIP και η χρωμοαντίδραση έλαβε μέρος σε θερμοκρασία δωματίου χωρίς ανακίνηση. Ο χρόνος εμφάνισης των ζωνών εξαρτάται από την ποσότητα της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης. Για τη διακοπή της χρωμοαντίδρασης, η μεμβράνη ξεπλύθηκε με δις αποσταγμένο νερό, αφέθηκε να στεγνώσει και φυλάχθηκε σε σκοτεινό χώρο. Το συνολικό πρωτόκολλο που ακολουθείται για την ανίχνευση in vivo βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών με χρήση αντισώματος στρεπταβιδίνης συζευγμένης με αλκαλική φωσφατάση είχε ως εξής: Πρωτόκολλο τεχνικής ανίχνευσης Dot-Blot 1. Επίσταξη δειγμάτων των πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται ως αρνητικό και θετικό control σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, όπως επίσης και δείγματος της προς έλεγχο βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης. Οι απαιτούμενες διαστάσεις της μεμβράνης είναι 7 cm x 2 cm. Ως θετικό control χρησιμοποιήθηκαν 10 μl GFP-biotin. 2. Επώαση σε 10ml διαλύματος κορεσμού (10 % w/v σκόνη γάλακτος σε TBS-T) για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Τρεις πλύσεις με TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου (10 ml TBS-T σε κάθε πλύση διάρκειας ενός λεπτού). 4. Επώαση σε 10 ml διαλύματος TBS, 5% σκόνη γάλακτος με «αντίσωμα» στρεπταβιδίνης συζευγμένης με αλκαλική φωσφατάση σε αραίωση περίπου 1/2000 (7 μl αντισώματος για 10 ml διαλύματος). 5. Τρεις πλύσεις των 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου με10 ml TBS-T η καθεμία. 6. Γρήγορο ξέπλυμα με διάλυμα αλκαλικής φωσφατάσης. 7. Επώαση με 10 ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης και 30 μl BCIP/ 30 μl NBT. Β.2.7. Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην παρασκευή πηκτών με τήξη της αγαρόζης, η οποία είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού μοριακού μεγέθους. Πρόκειται για ένα γραμμικό πολυμερές με βασική μονάδα τη D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-Lγαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται με θέρμανση παρουσία κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος. Η ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης 71

84 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ βασίζεται στη μετακίνηση των αρνητικά φορτισμένων μορίων DNA σε ουδέτερο ph προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από: Το μέγεθος των τμημάτων του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. Τη διαμόρφωση των τμημάτων DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA, ίδιου μοριακού βάρους, κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. Τη διαφορά δυναμικού που εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. Τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης. Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης % w/v, όπως επίσης και τα ακόλουθα διαλύματα: Ρυθμιστικό διάλυμα TBE Ρυθμιστικό διάλυμα TAE Tris 89 mm Tris-acetate 40 mm Η 3 ΒΟ 3 0,45 M EDTA ph mm EDTA ph mm Διάλυμα διαλυτοποίησης δειγμάτων 6x Γλυκερόλη 30 % v/v Κυανούν του ξυλενίου 0,25 % w/v Κυανούν της βρωμοφαινόλης 0,25 % w/v Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά, γίνεται διαλυτοποίηση της αγαρόζης στο ρυθμιστικό διάλυμα (TBE ή TAE) με θέρμανση στους 100 ο C. Ακολουθεί ελάττωση της θερμοκρασίας (μέχρι τους 60 ο C περίπου), προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) σε συγκέντρωση 0,5 μg/ml και μεταφορά στην ειδική συσκευή. Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης είναι το TBE ή το ΤΑΕ σε τελική συγκέντρωση 1x. Στην Εικόνα 30 φαίνεται η συσκευή πηκτής αγαρόζης που χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό του γονιδίου της Α1 επικράτειας μετά τον πολλαπλασιασμό του με PCR. Η εμφάνιση των ζωνών των μορίων του DNA στην αγαρόζη επιτυγχάνεται με την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο διάλυμα της πηκτής ή/και στο διάλυμα των 72

85 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ηλεκτροδίων. Πρόκειται για μια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 και 366 nm και να την επανεκπέμπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσματος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA. Η ένταση φθορισμού του ελεύθερου EtBr είναι πολύ μικρότερη από αυτή του συμπλόκου EtBr-DNA, επομένως, είναι δυνατή η ανίχνευση μικρών ποσοτήτων DNA (Sharp et al 1973, Sambrook et al 1989). Εικόνα 30. Συσκευή πηκτής αγαρόζης για τον καθαρισμό του γονιδίου της Α1 επικράτειας του vwf μετά τον πολλαπλασιασμό του με PCR. Β.2.8. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) είναι μια in vitro μέθοδος για τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, όπως επίσης και για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Έτσι, με τη μέθοδο αυτή ακόμη και ένα μόνο αντίγραφο γονιδίου μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέσα σε λίγες ώρες σε εκατομμύρια αντίτυπα, δεδομένου ότι είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία. Επίσης, χρησιμοποιείται για την εισαγωγή μεταλλάξεων, καθώς και για 73

86 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ την ραδιοεπισήμανση μίας συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειμένου να πραγματοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση (sequencing). Η τεχνική αυτή μπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, διαδικασία που γίνεται στα κύτταρα, αφού το αποτέλεσμα είναι το ίδιο, η παραγωγή δηλαδή συμπληρωματικών κλώνων DNA από κάποιον ήδη υπάρχοντα κλώνο. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοανθεκτικής και επομένως ενεργής DNA πολυμεράσης, η οποία απομονώνεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus και η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές), τα οποία και καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας που επιθυμούμε να πολλαπλασιάσουμε. Η DNA πολυμεράση ξεκινά τον πολυμερισμό από το 3 υδροξύλιο του εκκινητή πολυμερίζοντας πάντα προς 5 3 κατεύθυνση. Κάθε κύκλος της PCR αποτελείται από τα ακόλουθα τρία βήματα: 1) Αποδιάταξη: Το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με επώαση σε υψηλή θερμοκρασία, 90 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. 2) Υβριδισμός: Οι εκκινητές (primers) υβριδίζονται, λόγω συμπληρωματικότητας, στις κατάλληλες περιοχές του DNA στόχου. Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές) υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. 3) Πολυμερισμός: Στο στάδιο αυτό η DNA πολυμεράση, χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο τη μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη -ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δύο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DNA. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος 74

87 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων (Εικόνα 31). Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται φορές και παράγονται 2n μόρια DNA, όπου n ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 68 C για 5 λεπτά, όταν χρησιμοποιείται η expand long πολυμεράση και στους 72 ο C για 5 λεπτά, όταν χρησιμοποιείται η taq πολυμεράση της Finnzymes και της Bioline, ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός (Innis et al 1990). Τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης φαίνονται στον Πίνακα 4. Πίνακας 4. Συστατικά μίγματος για PCR. DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (sense) Εκκινητής αντινοηματικός (antisense) Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10 x Πολυμεράση (Taq) H ng 20 pmol 20 pmol 3,5 mm 5 μl 1 μl έως 50 μl Στην παρούσα εργασία αρχικά ενισχύθηκε με PCR το γονίδιο της Α1 επικράτειας του vwf. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, τα ένζυμα περιορισμού και ο πλασμιδιακός φορέας που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 5. Πίνακας 5. Ακολουθία εκκινητών, γονίδιο, ένζυμα περιορισμού και πλασμιδιακός φορέας που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR. Εκκινητής Γονίδιο Ένζυμο περιορισμού Πλασμιδιακός φορέας 5 -GCGCATATGGACCTGGTCTTCCTGCTGGATG-3 (νοηματικός) 5 -CGCCTCGAGGATCTCGTCCCTTTGCTGCTCC-3 (αντινοηματικός) A1-vWF NdeI pet29c(+) A1-vWF XhoI pet29c(+) Επιπλέον, ενισχύθηκε με PCR το γονίδιο της Α1 επικράτειας του vwf μαζί με την ουρά έξι ιστιδινών πριν την ενσωμάτωσή του στον πλασμιδιακό φορέα pan5. 75

88 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 31. Αναπαράσταση της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια, στάδιο αποδιάταξης, στάδιο υβριδισμού και στάδιο πολυμερισμού. Φαίνεται, επίσης, ο εκθετικός πολλαπλασιασμός του DNA. Β.2.9. Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR 76

89 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Τα τμήματα DNA που προκύπτουν από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ή μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν σε άλλες αντιδράσεις, θα πρέπει να διαχωριστούν από τους εκκινητές, το εκμαγείο, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια, τα άλατα και την πολυμεράση ή τα αντίστοιχα ένζυμα. Ο καθαρισμός των τμημάτων αυτών DNA γίνεται με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της εταιρείας Qiagen. Στο μίγμα της αντίδρασης προστίθενται 5 όγκοι διαλύματος PB, το οποίο περιέχει ένα χαοτροπικό παράγοντα, και ακολουθεί ανάμιξη και διαβίβαση του συνολικού όγκου στη στήλη Qiaquick. Κατόπιν, γίνεται φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε x g. Το DNA δεσμεύεται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα συστατικά απομακρύνονται με τη φυγοκέντρηση. Ακολουθεί πλύσιμο της στήλης με το διάλυμα αιθανόλης PE και τελικά γίνεται έκλουση του DNA με μl αποστειρωμένου δις-αποσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DNA, προκειμένου να ελεγχθεί η καθαρότητά του (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). Β Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης H μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται, όπως και η προηγούμενη (παράγραφος Β.2.9.), για τον καθαρισμό τμημάτων DNA μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, όταν η πέψη γίνεται διαδοχικά ή έπειτα από τον πολλαπλασιασμό τους με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Χρησιμοποιείται το Qiaquick Gel Extraction Kit της εταιρείας Qiagen. Η αρχή του συστήματος στηρίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται σε μικρές στήλες που περιέχουν πηκτές πυριτίου (silica gel) παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων και στη διέλευση των προσμίξεων από τις στήλες χωρίς να συγκρατούνται. Η διαδικασία έχει ως εξής: Το επιθυμητό τμήμα του DNA αποκόπτεται από την πηκτή και τοποθετείται σε σωλήνα επιτραπέζιας μικροφυγοκέντρου (eppendorf). Κατόπιν, προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης QG σε αναλογία 300 μl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση στους 50 ο C για 10 λεπτά με περιοδική ανάδευση, προκειμένου να διαλυτοποιηθεί η αγαρόζη. Στη συνέχεια, το μίγμα αυτό διαβιβάζεται σε στήλη Qiaquick και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε x g. Το DNA συγκρατείται στη στήλη και ξεπλένεται από τις προσμίξεις με τη διαβίβαση του αιθανολικού διαλύματος PE. H 77

90 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ έκλουση του DNA γίνεται με μl αποστειρωμένου δις-αποσταγμένου νερού ή ΤΕ, (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA ph 8.0). Κατόπιν, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DNA, προκειμένου να ελεγχθεί η καθαρότητά του και για να διαπιστωθεί κατ εκτίμηση η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). Β Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Κατά την κλωνοποίηση γίνεται εισαγωγή ενός τμήματος DNA στο γονιδίωμα ενός αυτόνομα πολλαπλασιαζόμενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασμιδίου. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι μικρά κυκλικά μόρια δίκλωνου DNA, που μπορούν να αναπτύσσονται ημιαυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασμιδιακός φορέας όσο και το ξένο τμήμα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν επωάζονται με τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισμού και στη συνέχεια, επανακυκλοποιούνται συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, αντίδραση που καταλύεται από μια DNA λιγάση (Sambrook, Fritsch et al 1989). Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι ο pet29c(+) και ο pan5. Το σύστημα pet της Novagen αποτελεί ένα από τα καλύτερα συστήματα για την κλωνοποίηση και την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα Ε.coli, εξασφαλίζοντας υψηλά επίπεδα έκφρασης και αυστηρό έλεγχο στο βασικό επίπεδο της μετάφρασης. Το γονίδιο-στόχος κλωνοποιείται στο πλασμίδιο pet κάτω από τον έλεγχο του προαγωγέα από Τ7 βακτηριοφάγο, ενώ η επαγωγή της έκφρασης γίνεται από την Τ7 RNA πολυμεράση, η οποία είναι τόσο επιλεκτική και δραστική ώστε το σύνολο σχεδόν των αποθεμάτων του κυττάρου να μετατρέπονται σε προϊόν έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Ο πλασμιδιακός φορέας pet29c(+) έχει μέγεθος 5372 ζεύγη βάσεων και περιέχει στο μόριο του έναν Τ7 προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου, το γονίδιο laq I που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, γονίδιο ανθεκτικότητας στην καναμυκίνη καθώς και μία αλληλουχία που κωδικοποιεί ουρά ιστιδινών (His-tag). Ο πλασμιδιακός φορέας pan5 της Avidity έχει 4201 ζεύγη βάσεων και φέρει τη νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός 14μερούς που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo. Το γονίδιο της πρωτεΐνης που πρόκειται να βιοτινυλιωθεί κλωνοποιείται αμέσως μετά 78

91 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ την ουρά, οπότε η πρωτεΐνη σύντηξης που παράγεται μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo από το ένζυμο BirA. Το γονίδιο του 14μερούς βρίσκεται κάτω από τον αυστηρό έλεγχο του Trc προαγωγέα και η έκφρασή του επάγεται από το IPTG. Το πλασμίδιο φέρει, επίσης, γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη (Εικόνα 32). Εικόνα 32. Σχηματική απεικόνιση του γονιδιακού χάρτη του πλασμιδιακού φορέα pan5. Β Πέψη με ένζυμα/ενδονουκλεάσες περιορισμού 79

92 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προκειμένου να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει: το DNA (που μπορεί να είναι γενωμικό DNA, πλασμιδιακός φορέας ή το τμήμα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση, τα ένζυμα περιορισμού και σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουμίνη. Ο συνολικός όγκος του μίγματος κυμαίνεται από 20 έως 50 μl. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως στους 37 ο C, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύμων που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δύο με τρείς ώρες. Μερικές φορές όμως, για τα τμήματα του DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ κοντά στα άκρα, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η πέψη. Όταν πρόκειται για πέψη πλασμιδίων, γίνεται επώαση πρώτα με το ένα ένζυμο, ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή αγαρόζης και μετά επώαση με το δεύτερο ένζυμο. Ο λόγος που γίνεται η διαδοχική πέψη, είναι προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι μετά την πέψη με το πρώτο ένζυμο, το πλασμίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραμμικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο μορφές του πλασμιδίου. Διαδοχική επώαση με τα δυο ένζυμα γίνεται, όταν αυτά δεν είναι συμβατά για να γίνει ταυτόχρονη επώαση. Β Αντίδραση λιγάσης Προκειμένου να γίνει η ενσωμάτωση του τμήματος του DNA που μας ενδιαφέρει στον αντίστοιχο πλασμιδιακό φορέα χρησιμοποιείται μια DNA λιγάση. Η αναλογία των δυο αντιδρώντων είναι συνήθως 6:1. Στην προκείμενη εργασία χρησιμοποιήθηκε το ligation kit της εταιρείας Takara (2011S). Οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: DNA πλασμιδιακού φορέα DNA τμήματος που θα ενσωματωθεί 10 ng 60 ng 80

93 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης του DNA 10x (DNA Dilution buffer) 2 μl T4 DNA λιγάση (5 units/μl) 1 μl H 2 O μέχρι τα 20 μl Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης μετά από την προσθήκη της λιγάσης είναι 20 μl. H επώαση γίνεται για 16 περίπου ώρες σε θερμοκρασία 15 ο C Β Αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου Το DNA που έχει κοπεί από ενδονουκλεάσες περιορισμού διαθέτει μία φωσφορική ομάδα στο 5 άκρο του, η οποία είναι απαραίτητη για την ενσωμάτωση του γονιδίου στον πλασμιδιακό φορέα κατά τη διαδικασία της κλωνοποίησης. Προς αποφυγή της επανακυκλοποίησης του πλασμιδίου πριν την ενσωμάτωση του γονιδίου, η 5 φωσφορική ομάδα μπορεί να απομακρυνθεί. Η αποφωσφορυλίωση του 5 άκρου κατά συνέπεια αποτρέπει την επανακυκλοποίηση του πλασμιδίου και δίνει στον ερευνητή τη δυνατότητα να χειριστεί το πλασμιδιακό DNA με τον επιθυμητό τρόπο. Η αποφωσφορυλίωση μπορεί να γίνει με τη χρήση φωσφατάσης. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω η αντίδραση λιγάσης γίνεται και απουσία του τμήματος DNA που πρόκειται να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο, προκειμένου να ελεγχθεί το ποσοστό επανακυκλοποίησης του πλασμιδιακού φορέα, χωρίς την παρεμβολή του ξένου DNA. Αν παρατηρηθεί μεγάλο τέτοιο ποσοστό, κρίνεται σκόπιμο να γίνει αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου πριν αυτό χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Στη συγκεκριμένη εργασία δε διενεργήθηκε αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου, λόγω κόστους. Β Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό κυττάρων (competent cells) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή τα βακτηριακά κύτταρα καθίστανται ικανά (επιδεκτικά), προκειμένου να γίνει εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA (Sambrook, Fritsch et al 1989). Η συνηθέστερη μέθοδος είναι η κατεργασία των κυττάρων με ιόντα ασβεστίου, κατά την οποία η επιδεκτικότητα επιτυγχάνεται με τη δημιουργία πόρων στο κυτταρικό τοίχωμα μετά από αιώρηση των κυττάρων σε διάλυμα με υψηλή συγκέντρωση ασβεστίου (Εικόνα 33). 81

94 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B Μέθοδος των δύο διαλυμάτων CaCl 2 Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο την επαγωγή της επιδεκτικότητας των βακτηριακών κυττάρων προκειμένου να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια που υπέστησαν κατεργασία με διαλύματα CaCl 2 στους 4 ο C και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές (Sambrook, Fritsch et al 1989). Η συγκεκριμένη τεχνική εφαρμόστηκε στα στελέχη E.coli XL1 και BL21(DE3) και αναλυτικά έχει ως εξής: Εμβολιασμός 3ml θρεπτικού υλικού LB (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1% w/v), που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, με κύτταρα Ε.coli (XL1 ή BL21) και επώαση των κυττάρων με ανακίνηση στους 37 ο C για ώρες (over night). Εμβολιασμός 10ml LB, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, με 100 μl από την προηγούμενη καλλιέργεια και επώαση στους 37 ο C, μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει περίπου ίση με 0.3 (αρχή της λογαριθμικής φάσης). Τοποθέτηση της καλλιέργειας στον πάγο για 10 λεπτά, προκειμένου να σταματήσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Φυγοκέντρηση σε 9000 x g για 10 λεπτά. Απόχυση του υπερκειμένου και αιώρηση των κυττάρων σε 5 ml CaCl mm (1/2 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Παραμονή των κυττάρων για 20 λεπτά στον πάγο και πραγματοποίηση νέας φυγοκέντρησης σε 9000 x g για άλλα 10 λεπτά, για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα θρεπτικού υλικού. Προσεκτική απομάκρυνση τoυ υπερκείμενου, αιώρηση των κυττάρων σε 1 ml CaCl 2 50 mm (1/10 του όγκου της αρχικής καλλιέργειας) και παραμονή στον πάγο για 45 λεπτά, οπότε και τα κύτταρα είναι έτοιμα να δεχθούν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Για κάθε δείγμα DNA χρησιμοποιούνται 200 μl επιδεκτικών κυττάρων. Τα κύτταρα χρησιμοποιούνται άμεσα και δεν μπορούν να αποθηκευτούν (Mandel and Higa 1970). 82

95 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β Μέθοδος δύο διαλυμάτων CaCl 2 (αποθηκεύονται στους -70 ο C) Η μέθοδος αυτή στηρίζεται, όπως και αυτή της παραγράφου Β , στην ιδιότητα του CaCl 2 να δημιουργεί επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα για την εισαγωγή DNA. Μπορεί να εφαρμοστεί στα στελέχη E.coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα TFB-I ph 7.0 Διάλυμα TFB-II ph 7.0 CH 3 COOK 30 mm MOPS 10 mm MnCl 2 50 mm CaCl 2 75 mm KCl 100 mm KCl 100 mm CaCl 2 10 mm Γλυκερόλη 15% v/v Γλυκερόλη 15% v/v Η διαδικασία έχει ως εξής: 3 ml θρεπτικού υλικού LB ή TYM εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού [15μg/ml τετρακυκλίνη (XL1), 20μg/ml στρεπτομυκίνη (TOP 10)]. Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για ώρες στους 37 C υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml LB, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. 1 ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού LB και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή Η καλλιέργεια στη συνέχεια ψύχεται στον πάγο για 10 λεπτά και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 20 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο αποχύνεται και τα κύτταρα αιωρούνται σε 25 ml (αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος TFB-I και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 4000 x g και τα κύτταρα αιωρούνται τελικά σε 1 ml διαλύματος TFB-II. Το αιώρημα που προκύπτει χωρίζεται σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου (eppendorf) σε κλάσματα των μl και αυτά εμβαπτίζονται για μικρό χρονικό διάστημα σε λουτρό, στο οποίο έχει προστεθεί ξηρός πάγος/αιθανόλη. Με τη διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται η άμεση ψύξη των κλασμάτων, τα οποία μπορούν κατόπιν να διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα στους -70 C. 83

96 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β Εισαγωγή πλασμιδίου στα επιδεκτικά κύτταρα (μετασχηματισμός) Ένα τμήμα DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί σε έναν πλασμιδιακό φορέα και στη συνέχεια να εισαχθεί σε κύτταρα E.coli (μετασχηματισμός, transformation), ώστε να παραχθούν μέσα σε λίγες ώρες υψηλές ποσότητες του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου. Από το πλασμίδιο αυτό μπορεί εύκολα να απομονωθεί το τμήμα DNA, όπως επίσης και η υπερπαραγώμενη πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό το DNA. Τα επιδεκτικά κύτταρα, δηλαδή, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασμιδιακού DNA (καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Η διαδικασία έχει ως εξής: Προσθήκη ng πλασμιδιακού DNA ή 5-10 μl από το μίγμα της αντίδρασης της λιγάσης σε 100 μl επιδεκτικών κυττάρων. Παραμονή στον πάγο για 30 min. Heat shock του μίγματος των κυττάρων με το DNA στους 42 C για 1.5 min. Ψύξη στον πάγο για 1 min. Προσθήκη στο μίγμα 800 μl θρεπτικού υλικού LB ή dyt. Επώαση στους 37 C για 1 ώρα, ώστε να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται τα κύτταρα. Φυγοκέντρηση στα x g για 1 min. Απόχυση μέρους του υπερκείμενου και επαναιώρηση των κυττάρων σε περίπου 100 μl θρεπτικού υλικού. Επίστρωση σε τρυβλία που περιέχουν θρεπτικό υλικό dyt με άγαρ και το κατάλληλο αντιβιοτικό, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το πλασμίδιο. Τα τρυβλία τοποθετούνται στους 37 C για ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Τα πλασμίδια προσδίδουν στα κύτταρα ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό, με αποτέλεσμα οι αποικίες που εμφανίζονται στα τρυβλία να αποτελούνται μόνο από κύτταρα που περιέχουν τον πλασμιδιακό φορέα (μόνο του ή ανασυνδυασμένο). Τα κύτταρα στα οποία δεν εισήλθε το πλασμίδιο δεν παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό και επομένως δεν αναπτύσσονται. 84

97 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 33. Σχηματική απεικόνιση της επιδεκτικότητας και του heat shock βακτηριακών κυττάρων. Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική «λύση» και καθαρισμός με φαινόλη/χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη Μια αποικία από τα μετασχηματισμένα κύτταρα, τα οποία έχουν αναπτυχθεί σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3ml θρεπτικού υλικού, στο οποίο έχει προστεθεί επίσης αντιβιοτικό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί με ανάδευση για ώρες στους 37 ο C. Ποσότητα 1,5 ml από την καλλιέργεια μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου (eppendorf) και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Ακολουθεί απόχυση του υπερκείμενου και στο ίζημα προστίθενται 50 μl ψυχρού διαλύματος που περιέχει 50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl ph 8,0 και 10 mm EDTA ph 8,0. Μετά από έντονη ανάδευση, στο ίδιο διάλυμα προστίθενται 100 μl πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 0,2 Ν NaOH και 1% w/v SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Κατόπιν, ακολουθεί προσθήκη 80 μl ψυχρού διαλύματος CH 3 COOK 5M και έπειτα από έντονη ανάδευση ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Με τη φυγοκέντρηση απομακρύνονται τα μεμβρανικά συστατικά, οι πρωτεΐνες, το χρωμοσωμικό DNA και το SDS. 85

98 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στο υπερκείμενο προστίθενται 2,5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και στη συνέχεια αυτό αφήνεται στους -20 ο C για 30 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η κατακρήμνιση του DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Το ίζημα αιωρείται σε 50 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) παρουσία RNase A (20 μg/ml) και επωάζεται στους 37 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη 50 μl επιπλέον TE και κατόπιν, γίνεται εκχύλιση του DNA με προσθήκη 1 όγκου μίγματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης σε αναλογία 25:24:1. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται άλλη μια φορά. Στο τέλος γίνεται μια ακόμη εκχύλιση με την προσθήκη 1 όγκου χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης σε αναλογία 24:1, για να απομακρυνθεί η εναπομένουσα φαινόλη. Κάθε φορά απομονώνεται η υδατική στοιβάδα έπειτα από φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Στο τέλος, προστίθενται 1/10 όγκου CH 3 COONa 3 M ph 5,2 και 2,5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και ύστερα από παραμονή στους -20 ο C για 30 λεπτά και φυγοκέντρηση, το DNA διαλυτοποιείται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του (Sambrook, Fritsch et al 1989). Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) Σε 3 ml θρεπτικού υλικού LB, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, αιωρείται μια αποικία και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. Ποσότητα 1,5 ml της πλήρους ανεπτυγμένης καλλιέργειας μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου (eppendorf) και φυγοκεντρείται στις x g για 1 λεπτό. Ακολουθεί απόχυση του υπερκείμενου και αιώρηση των κυττάρων σε 250 μl διαλύματος P1. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη 250 μl διαλύματος P2 και ήπια ανάδευση. Έπειτα από παραμονή 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου, προστίθενται 350 μl διαλύματος Ν3 και έπειτα από εντονότερη ανάδευση γίνεται φυγοκέντρηση σε x g για 10 λεπτά για το διαχωρισμό του χρωμοσωμικού από το πλασμιδιακό DNA των βακτηρίων. Το υπερκείμενο διαβιβάζεται στη στήλη Qiagen tip-10 και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Το DNA συγκρατείται στη στήλη, ενώ οι πρωτεΐνες διέρχονται. Για την απομάκρυνση τυχόν προσμίξεων γίνεται πλύση με διάλυμα αιθανόλης PB. Το διάλυμα απομακρύνεται με διπλή φυγοκέντρηση σε 86

99 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ x g για 1 λεπτό. Η έκλουση του πλασμιδιακού DNA από τη στήλη γίνεται με 30 μl αποστειρωμένου δις-αποσταγμένου νερού. Για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεγάλες ποσότητες χρησιμοποιούνται οι στήλες Qiagen tip-100. Στην περίπτωση αυτή, γίνεται εμβολιασμός 50 ή 100 ml θρεπτικού υλικού LB, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, από μια μικρότερη καλλιέργεια. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι ανάλογη αυτής που περιγράφηκε πιο πάνω (Qiagen Plasmid Purification Handbook, 1997). Β Υπερέκφραση γονιδίων στο σύστημα pet Το σύστημα pet της Novagen αποτελεί ένα από τα καλύτερα συστήματα για την κλωνοποίηση και την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα Ε.coli, εξασφαλίζοντας υψηλά επίπεδα έκφρασης και αυστηρό έλεγχο στο βασικό επίπεδο της μετάφρασης. Το γονίδιο-στόχος κλωνοποιείται στο πλασμίδιο pet κάτω από τον έλεγχο του προαγωγέα από Τ7 βακτηριοφάγο, ενώ η επαγωγή της έκφρασης γίνεται από την Τ7 RNA πολυμεράση, η οποία είναι τόσο επιλεκτική και δραστική ώστε το σύνολο σχεδόν των αποθεμάτων του κυττάρου να μετατρέπονται σε προϊόν έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Αρχικά, τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια μετασχηματίζονται σε κύτταρα ξενιστές που δεν περιέχουν το γονίδιο της Τ7 πολυμεράσης (XL1 ή TOP10), έτσι ώστε το γονίδιο στόχος να είναι ανενεργό και επομένως να μην προκαλέσει αστάθεια του πλασμιδίου λόγω της παραγωγής πρωτεϊνών, τοξικών για το κύτταρο. Στη συνέχεια γίνεται μεταφορά του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε βακτηριακά στελέχη τα οποία περιέχουν στο χρωμόσωμα τους ένα αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης (λde3 λυσογόνο), το οποίο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του lacuv5 προαγωγέα και η έκφρασή του επάγεται με την προσθήκη του ισοπροπυλ-β- D-1-θειογαλακτοπυρανοζιδίου (IsoPropyl-β-D-1-ThioGalactopyranoside,IPTG). Στην περίπτωση των λde3 λυσογόνων, λόγω της ύπαρξης του lacuv5 προαγωγέα, μπορεί να επιτευχθεί η μεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και η έκφραση γονιδίων που τα προϊόντα τους δεν είναι τοξικά για την ανάπτυξη των κυττάρων, χωρίς την προσθήκη του IPTG. Όταν όμως απαιτείται αυστηρότερος έλεγχος, τότε χρησιμοποιούνται κύτταρα ξενιστές που περιέχουν το πλασμίδιο plyss ή plyse. Τα πλασμίδια αυτά παράγουν σε μικρά και μεγάλα ποσά την Τ7 λυσοζύμη, η οποία είναι 87

100 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ φυσικός καταστολέας της Τ7 RNA πολυμεράσης. Ακόμη αυστηρότερος έλεγχος της μεταγραφής από την Τ7 RNA πολυμεράση επιτυγχάνεται με τη χρησιμοποίηση του Τ7 lac προαγωγέα ο οποίος περιλαμβάνει μια ακολουθία 25 bp του lac χειριστή μετά από την περιοχή των 17 bp του Τ7 προαγωγέα. Ο lac καταστολέας δεσμεύεται στην περιοχή του χειριστή ελαττώνοντας σημαντικά την μεταγραφή από την Τ7 RNA πολυμεράση. Με την προσθήκη του IPTG επάγεται τόσο η έκφραση του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης, όσο και η έκφραση του κλωνοποιημένου στο peτ γονιδίου (Εικόνα 34). Εικόνα 34. Στοιχεία ελέγχου του συστήματος pet στα κύτταρα BL21(DE3). Ένα άλλο πλεονέκτημα των φορέων έκφρασης pετ είναι ότι περιέχουν διάφορες ακολουθίες που βρίσκονται δίπλα στις θέσεις κλωνοποίησης και κωδικοποιούνται προς πεπτίδια-ουρές που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και καθαρισμό των γονιδίων στόχων. Τέτοια πεπτίδια-ουρές είναι μια ακολουθία 6 ιστιδινών (6xΗis-tag) ή 10 ιστιδινών (10xΗis-tag), η S-ακολουθία (S-tag), η Τ7- ακολουθία (Τ7-tag) και η HSV-ακολουθία (ΗSV-tag). Οι ακολουθίες αυτές μπορεί να βρίσκονται είτε στο Ν-τελικό άκρο είτε στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης. 88

101 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β Ήπια λύση κυττάρων με heat shock Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται για την λύση μικρής ποσότητας κυττάρων των οποίων το πρωτεϊνικό προφίλ θα θέλαμε να παρατηρήσουμε. Με αυτόν τον τρόπο δεν χάνονται σχεδόν καθόλου πρωτεΐνες, γεγονός που καθιστά την συγκεκριμένη τεχνική ιδανική για παρατήρηση της υπερέκφρασης ενός γονιδίου. Η λύση των κυττάρων πραγματοποιείται με διαδοχικούς κύκλους ψύξης-απόψυξης. Το διάλυμα λύσης (lysis buffer) αποτελείται από ουρία 6Μ και Tris-HCl 20mM, ph 7,5. Η ουρία έχει διπλό ρόλο. Αφενός ως πολικό, μη ιοντικό αποδιατακτικό διαλυτοποιεί τις μεμβρανικές πρωτεΐνες και τα λιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης και αφετέρου, λόγω της μεγάλης συγκέντρωσής της στο διάλυμα, δημιουργεί ωσμωτική πίεση. Τα κύτταρα, αφού προηγουμένως αιωρηθούν στο διάλυμα, ψύχονται στους -80 o C για 25min και στη συνέχεια στους 5 o C για ίσο χρονικό διάστημα. Ο κύκλος ψύξηςαπόψυξης επαναλαμβάνεται άλλες δύο φορές. Όλες οι πρωτεΐνες του κυττάρου βρίσκονται στο υπερκείμενο μετά από φυγοκέντρηση. Β Λύση κυττάρων με υπερήχους (sonication) Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται για λύση μεγαλύτερης ποσότητας κυττάρων. Τα κύτταρα αιωρούνται σε διάλυμα λύσης που αποτελείται από NaCl 0,8M, Tris-HCl 20mM, ph 7,5, β-μερκαπτοαιθανόλη 0.1% και αναστολείς πρωτεασών (PMSF) 0,2mM. Το NaCl είναι υπεύθυνο για τη διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών μετά τη λύση του κυττάρου, ενώ η β-μερκαπτοαιθανόλη και το PMSF προστατεύουν τη δομή των πρωτεϊνών. Η μεν β-μερκαπτοαιθανόλη προστατεύει τις δισουλφιδικές γέφυρες μεταξύ των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, το δε PMSF είναι αναστολέας πρωτεασών, οι οποίες απελευθερώνονται από τα κύτταρα μετά τη λύση τους. Ο όγκος του διαλύματος λύσης είναι το 1/50 του όγκου της υγρής καλλιέργειας των κυττάρων. Η όλη διαδικασία περιλαμβάνει 6 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων και ένα χρονικό διάστημα των 40 δευτερολέπτων κατά τη διάρκεια των οποίων εφαρμόζονται υπέρηχοι, ενώ μεταξύ των χρονικών διαστημάτων παρεμβάλλεται κάθε φορά μία παύση ενός λεπτού, κατά τη διάρκεια της οποίας τα δείγματα εμβαπτίζονται σε πάγο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Ακολουθεί φυγοκέντρηση. Οι πρωτεΐνες του κυττάρου βρίσκονται στο υπερκείμενο. 89

102 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών με ουρά έξι ιστιδινών (His-tag) Η έκφραση των πρωτεϊνών γίνεται στο σύστημα pet με χρήση του πλασμιδίου pet29c(+). Η έκφραση πρωτεϊνών με ουρά έξι ιστιδινών (6xHis-tag) έχει το πλεονέκτημα της εύκολης απομόνωσης και καθαρισμού των πρωτεϊνών με στήλες αγχιστείας. Η ουρά ιστιδινών μπορεί στη συνέχεια να απομακρυνθεί με πέψη από κάποια πρωτεϊνάση, αν και συνήθως δεν είναι απαραίτητο, καθώς δεν παρεμποδίζει τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Η στήλη αγχιστείας που χρησιμοποιείται αποτελείται από σφαιρίδια Ni-NTA (Νickel-ΝitriloΤriΑcetic acid), δηλαδή σφαιρίδια που φέρουν στο πλέγμα τους παγιδευμένα ιόντα νικελίου. Τα ιόντα αυτά δεσμεύουν τις πρωτεΐνες με ουρά ιστιδινών, σχηματίζοντας ενώσεις συναρμογής. Η διαδικασία της έκφρασης και του καθαρισμού αναλυτικά έχει ως εξής: Βακτηριακά κύτταρα BL21(DΕ3), που έχουν μετασχηματιστεί με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pet29c(+), απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό dyt/άγαρ που περιέχει καναμυκίνη (50 μg/ml) και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Εμβολιασμός 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού dyt, που περιέχει καναμυκίνη, με μια αποικία η οποία επιλέγεται από το τρυβλίο. Επώαση της καλλιέργειας υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Εμβολιασμός 1,5 lt θρεπτικού υλικού dyt, που περιέχει καναμυκίνη, με 10 ml από την προηγούμενη καλλιέργεια. Ανάπτυξη της καλλιέργειας με ισχυρή ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων στα 600 nm φτάσει περίπου στο 0.6. Προσθήκη 1 mm IPTG και συνέχεια της επώασης στους 37 C για 3 ώρες. Συλλογή κυττάρων με φυγοκέντρηση στα 6000 rpm (4500 x g) για 20 min σε κεφαλή Beckman JA Ακολουθεί ο καθαρισμός της υπερπαραγμένης πρωτεΐνης με την ουρά ιστιδινών (Εικόνα 35). Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται φαίνονται παρακάτω: Διάλυμα λύσης κυττάρων Διάλυμα πλύσης Διάλυμα έκλουσης Tris-HCl, ph 8 50 mm Tris-HCl, ph 8 50 mm Tris-HCl, ph 8 50 mm NaCl 600 mm NaCl 600 mm NaCl 600 mm Ιμιδαζόλιο 2.5 mm Ιμιδαζόλιο 5 mm Ιμιδαζόλιο 250 mm 90

103 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 35. Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου καθαρισμού πρωτεϊνών με ουρά ιστιδινών με στήλη νικελίου. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Αιώρηση των κυττάρων σε διάλυμα λύσης. Λύση των κυττάρων με υπερήχους (6 χρονικά διαστήματα των 20 sec), ενώ μεταξύ των διαστημάτων παρεμβάλλεται κάθε φορά παύση 40 sec, κατά τη διάρκεια της οποίας τα κύτταρα εμβυθίζονται σε πάγο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Φυγοκέντρηση στις rpm για 20 min και λήψη του υπερκείμενου, στο οποίο ανευρίσκονται οι πρωτεΐνες. Εξισορρόπηση της στήλης Ni-NTA με το διάλυμα λύσης. Ανάμιξη του εκχυλίσματος των πρωτεϊνών με την εξισορροπημένη στήλη. Ανάδευση για 2 ώρες στους 4 C, ώστε να επιτευχθεί η δέσμευση της πρωτεΐνης με την ουρά ιστιδινών στη στήλη. Φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min, ώστε να κατακαθίσουν τα σφαιρίδια της στήλης και λήψη του υπερκείμενου (πρωτεΐνες που δε δεσμεύτηκαν). Πλύση της στήλης 3-5 φορές με διάλυμα πλύσης (10 min η κάθε πλύση) στους 4 C υπό ανάδευση. 91

104 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min και λήψη του υπερκείμενου (πρωτεΐνες χαλαρά δεσμευμένες στη στήλη) Έκλουση των δεσμευμένων πρωτεϊνών 2-3 φορές με διάλυμα έκλουσης (10 min η κάθε έκλουση) στους 4 C υπό ανάδευση. Τα εκλούσματα, που περιέχουν την καθαρή πρωτεΐνη με την ουρά ιστιδινών, φυλάσσονται στους -20 C. Β Κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο Ο καθαρισμός των πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο στηρίζεται στο διαχωρισμό με προσθήκη άλατος σε υψηλές συγκεντρώσεις (salt out), ο οποίος εξαρτάται από την υδροφοβικότητα των πρωτεϊνών. Όπως είναι γνωστό ένα τυπικό μόριο πρωτεΐνης, όταν βρίσκεται μέσα σε διάλυμα, έχει στην επιφάνειά του υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες. Όταν αυτές έρθουν σε επαφή με ένα υδατικό διαλύτη, τα μόρια του νερού διευθετούνται γύρω από τις αλυσίδες, όπου και παραμένουν (Εικόνα 36). Η διευθέτηση αυτή είναι μια θερμοδυναμικά ασταθής κατάσταση, εφόσον η εντροπία είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με την αδιάλυτη πρωτεΐνη και τα ελεύθερα μόρια νερού. Με την προσθήκη άλατος στο διάλυμα, τα ιόντα του άλατος ενυδατώνονται, δηλαδή υπάρχουν πολύ λίγα ελεύθερα μόρια ύδατος, και έτσι υπάρχει μεγαλύτερη τάση απομάκρυνσης των μορίων του νερού από τις πλευρικές αλυσίδες, με αποτέλεσμα αυτές να μένουν εκτεθειμένες και να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Οι πρωτεΐνες που διαθέτουν μεγαλύτερο αριθμό ή μεγαλύτερου μεγέθους τέτοια συσσωματώματα θα κατακρημνιστούν γρηγορότερα, ενώ οι πρωτεΐνες με λιγότερες μη πολικές ομάδες στην επιφάνεια τους θα παραμείνουν στο διάλυμα, ακόμα και σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις άλατος. Για να υπολογιστεί η ποσότητα του θειικού αμμωνίου που πρέπει να προστεθεί σε ένα διάλυμα πρωτεϊνών, συνήθως χρησιμοποιείται ο εκατοστιαίος κορεσμός αντί για τη συγκέντρωση, εφόσον γίνει η υπόθεση ότι το αρχικό διάλυμα είναι ισοδύναμο με το νερό όσον αφορά την ικανότητα διάλυσης του θειικού αμμωνίου. Η σχέση με την οποία υπολογίζονται τα γραμμάρια του θειικού αμμωνίου που προστίθενται σε ένα διάλυμα είναι: 92

105 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Όπου: V: ο όγκος του διαλύματος, S 2 : το ποσοστό κορεσμού που θέλω να πετύχω και S 1 : το αρχικό ποσοστό κορεσμού Εικόνα 36. Διευθέτηση των μορίων του νερού γύρω από τα υδρόφοβα συστατικά της επιφάνειας μιας πρωτεΐνης. Β In vivo βιοτινυλίωση πρωτεϊνών Οι πολλαπλές εφαρμογές της υψηλής συγγένειας αλληλεπίδρασης μεταξύ βιοτίνης και στρεπταβιδίνης στη βιοχημεία, την ανοσολογία, την κυτταρική βιολογία και τη βιοτεχνολογία έχουν επισκιάσει τη ζωτική σημασία της βιοτίνης. Η βιοτίνη (ή βιταμίνη Β7) ανήκει στο σύμπλεγμα βιταμινών Β. Είναι ένα συνένζυμο που συντίθεται από τα φυτά, τα περισσότερα βακτήρια και κάποιους μύκητες και συμμετέχει στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων και της λευκίνης, ενώ παίζει σημαντικό ρόλο στη γλυκονεογένεση, στη λιπογένεση, στον καταβολισμό των αμινοξέων και στη μεταφορά ενέργειας. Η βιοτίνη είναι βιολογικά ενεργή, όταν είναι συνδεδεμένη με πρωτεΐνη και ενδοκυττάρια είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με μεταβολικά ένζυμα, τις καρβοξυλάσες και τις αποκαρβοξυλάσες. Αυτά τα ένζυμα καταλύουν τη μεταφορά CO 2 χρησιμοποιώντας το συμπαράγοντα βιοτίνη ως μεταφορέα καρβοξυλομάδων (Samols et al 1988). Η λιγάση της βιοτίνης (biotin protein ligase, BPL), γνωστή ως ολοκαρβοξυλάση συνθετάση, είναι το υπεύθυνο 93

106 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ένζυμο για τη σύνδεση της βιοτίνης στις πρωτεΐνες. Η BPL καταλύει το μεταμεταφραστικό σχηματισμό ενός αμιδικού δεσμού μεταξύ της καρβοξυλομάδας της βιοτίνης και της ε-αμινομάδας ενός συγκεκριμένου καταλοίπου λυσίνης σε μία διαδικασία δύο βημάτων (Εικόνα 37). Εικόνα 37. Η αντίδραση της λιγάσης της βιοτίνης (BPL). Η καλύτερα χαρακτηρισμένη BPL είναι η πολυλειτουργική BirA πρωτεΐνη του E.coli, η οποία δρα επίσης ως καταστολέας του οπερονίου της βιοτίνης. Η BirA πρωτεΐνη είναι μία μονομερής πρωτεΐνη 35,5 kda γνωστής δομής. Το μικρότερο υπόστρωμα που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo από το ένζυμο BirA είναι ένα πεπτίδιο με 14 κατάλοιπα αμινοξέων, το οποίο εμφανίζει την ίδια κινητική βιοτινυλίωσης με το φυσικό πρωτεϊνικό υπόστρωμα. Το 14μερές (G-L-N-D-I-F-E-A- Q-K-I-E-W-H) βιοτινυλιώνεται in vivo με ρυθμό δύο φορές μεγαλύτερο από το φυσικό πρωτεϊνικό υπόστρωμα (Εικόνα 38). Η σύντηξη του πεπτιδίου με την πρωτεΐνη στόχο μπορεί να γίνει είτε στο αμινοτελικό είτε στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης (Beckett et al 1999, Chapman-Smith et al 2001). 94

107 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 38. Το 14μερές που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo από το BirA και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ουρά σύντηξης από τα διάφορα συστήματα in vivo βιοτινυλίωσης πρωτεϊνών. Σήμερα, υπάρχουν συστήματα για την in vivo βιοτινυλίωση πρωτεϊνών (Εικόνα 39). Το στέλεχος AVB101 του E.coli φέρει ένα πλασμίδιο με το γονίδιο του BirA (pbiracm), το οποίο είναι έτσι σχεδιασμένο ώστε να υπερεκφράζει το BirA ένζυμο από έναν ισχυρό Tac προαγωγέα. Το στέλεχος αυτό μπορεί επίσης να μετασχηματιστεί με ένα δεύτερο πλασμίδιο (pan5), το οποίο μεταφέρει ως ουρά τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του 14μερούς που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo. Το γονίδιο της πρωτεΐνης που πρόκειται να βιοτινυλιωθεί μπορεί να κλωνοποιηθεί αμέσως μετά την εν λόγω ουρά. Έτσι, η πρωτεΐνη σύντηξης βιοτινυλιώνεται in vivo στο αμινοτελικό άκρο από το ένζυμο BirA ( Εικόνα 39. Το στέλεχος AVB101 που μεταφέρει τα δύο πλασμίδια. Το γονίδιο του BirA χρωματίζεται πορτοκαλί, το γονίδιο της πρωτεΐνης που πρόκειται να βιοτινυλιωθεί είναι μπλε και η ουρά κόκκινη. 95

108 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών - Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει η χρωστική ουσία Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσμεύεται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465nm και το χρώμα της είναι καστανό. Η δημιουργία του συμπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση κυανού χρώματος και τη μεταβολή του μέγιστου απορρόφησης στα 595nm, όπου και μετράται φωτομετρικά. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάστηκε ως εξής: Ανάδευση για ώρες, αραίωση του διαλύματος με απιονισμένο νερό στο 1lt. Το αντιδραστήριο είναι φωτοευαίσθητο και για το λόγο αυτό, φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα δείγματα προσδιορίστηκε με ανάμιξη του κάθε δείγματος (αραιωμένου στα 2ml με απιονισμένο νερό) με 2 ml αντιδραστηρίου Bradford και ακολούθησε μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη αναφοράς με αλβουμίνη ή σφαιρίνη βόειου ορού (BSA) (Bradford 1976, Bearden 1978). Αντιδραστήριο Bradford CBB G mg/ml H 3 PO 4 85 % 200 ml 96

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το πρώτο μέρος της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας περιλαμβάνει πειράματα που αφορούν την υπερέκφραση της Α1 επικράτειας του vwf στον πλασμιδιακό φορέα pet29c(+). Η ανασυνδυασμένη Α1 πρωτεΐνη που εκφράζεται στον πλασμιδιακό φορέα pet29c(+) διαθέτει στο καρβοξυτελικό της άκρο μία ουρά έξι ιστιδινών, γεγονός που επιτρέπει τον ταχύτερο και ευκολότερο καθαρισμό της με στήλη νικελίου (Ni-NTA). Το δεύτερο μέρος περιλαμβάνει πειράματα που αφορούν την έκφραση και τη βιοτινυλίωση της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf στον πλασμιδιακό φορέα pan5. Ο εν λόγω πλασμιδιακός φορέας αντιγράφεται με μικρότερο ρυθμό (low copy πλασμίδιο) σε σύγκριση με τον pet29c(+), μεταφέρει, όμως, ως ουρά τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του 14μερούς που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo. Με τον τρόπο αυτό η πρωτεΐνη σύντηξης που προκύπτει βιοτινυλιώνεται στο αμινοτελικό άκρο της και μπορεί κατόπιν να χρησιμοποιηθεί σε πειράματα πρόσδεσης σε νανοεπιφάνειες (καλυμμένες με στρεπταβιδίνη). Γ.1. Κλωνοποίηση, υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf Γ.1.1. Ενίσχυση του γονιδίου της Α1 επικράτειας του vwf και κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pet29c(+) Το γονίδιο που κωδικοποιεί την Α1 επικράτεια του vwf ενισχύθηκε με PCR από πλασμίδιο, το οποίο εμπεριέχει το cdna του ανθρώπινου vwf. Η ενίσχυση της Α1 επικράτειας επιτεύχθηκε με χρήση κατάλληλων εκκινητών και συγκεκριμένα του νοηματικού εκκινητή (sense primer) (5 -GCGCATATGGACCTGGTCTTCCTGCTGGATG- 3 ) και του αντινοηματικού εκκινητή (antisense primer) (5 - CGCCTCGAGGATCTCGTCCCTTTGCTGCTCC-3 ). Οι εκκινητές ήταν κατάλληλα σχεδιασμένοι, ώστε να διαθέτουν εκ των προτέρων θέσεις για πέψη από ενδονουκλεάσες περιορισμού και συγκεκριμένα για τις ενδονουκλεάσες NdeI και XhoI (Πίνακας 5, Παράγραφος Β.2.8.). Μετά το τέλος της PCR, το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Το DNA, με το αναμενόμενο μοριακό βάρος, εκχυλίστηκε από την πηκτή 97

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ αγαρόζης και ακολούθησε καθαρισμός με το Gel Extraction Kit (Παράγραφος Β.2.10.). Τόσο το DNA που απομονώθηκε όσο και το πλασμίδιο pet29c(+) επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού NdeI και XhoI. Μετά το τέλος της επώασης το γονίδιο της Α1 επικράτειας του vwf καθαρίστηκε με το PCR Purification Kit (Παράγραφος Β.2.9.). Ο φορέας ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% κι εκχυλίστηκε από την πηκτή με το Gel Extraction Kit. Ακολούθησε η αντίδραση της λιγάσης (Παράγραφος Β ), ώστε να ενσωματωθεί το γονίδιο της Α1 επικράτειας του vwf στο πλασμίδιο pet29c(+). Το ενισχυμένο θραύσμα της Α1 επικράτειας μήκους 531bp κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pet29c(+) με τέτοιο τρόπο, ώστε το τελικό προϊόν να έχει στο καρβοξυτελικό άκρο του μία ουρά έξι ιστιδινών (6xHistidine tag). Γ.1.2. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.coli TOP10 και BL21(DE3) με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pet29c(+)-a1-vwf Στη συνέχεια, τα επιδεκτικά κύτταρα E.coli BL21(DE3) και E.coli TOP10 μετασχηματίστηκαν με τον ανασυνδυασμένο φορέα έκφρασης pet29c(+)-a1-vwf και τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το συγκεκριμένο πλασμίδιο (Παράγραφος Β.2.13.). Οι αποικίες που προέκυψαν από τα κύτταρα E.coli TOP10 χρησιμοποιήθηκαν για απομόνωση πλασμιδιακού DNA, ώστε αυτό να χρησιμοποιηθεί σε επόμενα πειράματα της παρούσας εργασίας, ενώ οι αποικίες που προέκυψαν από τα κύτταρα E.coli BL21(DE3) χρησιμοποιήθηκαν για υπερέκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Α1. Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA έγινε με το kit mini prep Qiagen (Παράγραφος Β ). Γ.1.3. Υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf Η υπερέκφραση της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας έγινε με προσθήκη 1mM IPTG στις αποικίες των μετασχηματισμένων κυττάρων, όταν η απορρόφηση στα 600nm έφτασε ~0.7 OD (Παράγραφος Β.2.15.). Όταν ολοκληρώθηκε η διαδικασία της υπερέκφρασης, έγινε λύση των κυττάρων που συλλέχθηκαν με 98

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ φυγοκέντρηση με την προσθήκη 6Μ ουρίας και Tris-HCl PH 7.5 και διαδοχικό πάγωμα-ξεπάγωμα ανά 20 λεπτά (Παράγραφος Β ). Το ολικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή SDS-PAGE 12% w/v, για να ελεγχθεί το επίπεδο έκφρασης της Α1 πρωτεΐνης. Στην Εικόνα 40 φαίνεται η υπερέκφραση της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας. Εικόνα 40. SDS-PAGE 12% w/v ηλεκτροφόρηση των ολικών εκχυλισμάτων κυττάρων BL21 (DE3) μετασχηματισμένων με pet29c(+)-a1-vwf. Μ: Πρωτεϊνικοί μάρτυρες (το μέγεθος σε kda), Διαδρομές 1 και 2: Εκχυλίσματα από κύτταρα E.coli πριν την επαγωγή με IPTG, Διαδρομές 3, 5, 7: Εκχυλίσματα από κύτταρα E.coli μετά από επαγωγή με IPTG στους 16 ο C για 5 ώρες, Διαδρομές 4, 6, 8: Εκχυλίσματα από κύτταρα E.coli μετά από επαγωγή με IPTG στους 37 ο C για 5 ώρες. Η A1-vWF μεταναστεύει ως μία ζώνη στο αναμενόμενο μοριακό βάρος ~20 kda. Τα κύτταρα που συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (μετά την υπερέκφραση) λύθηκαν με υπερήχους (Παράγραφος Β ). Τα ανασυνδυασμένα θραύσματα της Α1 επικράτειας του vwf με την ουρά έξι ιστιδινών απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία στήλης νικελίου με καθαρότητα >95% (Παράγραφος Β.2.16.). Συγκεκριμένα, το εκχύλισμα των κυττάρων επωάστηκε με σφαιρίδια στήλης νικελίου και η προσδεμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε με 6M ουρία. Πραγματοποιήθηκαν 3-5 εκλούσεις των συνδεδεμένων πρωτεϊνών και τα εκλουσμένα θραύσματα (περιέχουν την καθαρή Α1 επικράτεια με την ουρά έξι ιστιδινών) αναλύθηκαν με SDS-PAGE 12% w/v. Η χρώση με Coomassie Blue (Παράγραφος Β ) αποκάλυψε μία μόνο ζώνη με ΜΒ περίπου 21kDa (Εικόνα 41). 99

112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 41. Καθαρισμός της Α1 επικράτειας του vwf με την ουρά έξι ιστιδινών με χρωματογραφία στήλης νικελίου. Μ: Πρωτεϊνικοί μάρτυρες, Διαδρομή 1: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα, Διαδρομή 2: Δείγμα που λήφθηκε μετά από πλύσεις της στήλης με το διάλυμα πλύσης, Διαδρομές 3 και 4: η καθαρή ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μετά από την 1 η και 2 η έκλουση αντίστοιχα. Γ.2. Κλωνοποίηση, βιοτινυλίωση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α1 επικράτειας του vwf Γ.2.1. Ενίσχυση του γονιδίου της Α1 επικράτειας του vwf μαζί με την ουρά έξι ιστιδινών και κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pan5 Προκειμένου να ενισχύσουμε το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Α1 του vwf, πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το cdna του συγκεκριμένου γονιδίου κλωνοποιημένου στον πλασμιδιακό φορέα pet29c(+). Χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένοι εκκινητές, ώστε να προκύψουν τα επιθυμητά προϊόντα, τα οποία διαθέτουν στα άκρα τους αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από συγκεκριμένα περιοριστικά ένζυμα. Επιπλέον, οι εκκινητές ήταν κατάλληλα σχεδιασμένοι, ώστε η ανασυνδυασμένη επικράτεια A1 να περιέχει επίσης και ουρά έξι ιστιδινών, για να καθαριστεί αργότερα με στήλη νικελίου. Μετά το τέλος της PCR, το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Το DNA, με το αναμενόμενο μοριακό βάρος, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και ακολούθησε καθαρισμός με το Gel Extraction Kit (Παράγραφος Β.2.10.). Τόσο το DNA που απομονώθηκε όσο και το πλασμίδιο pan5 επωάστηκαν με τα επιλεγμένα ένζυμα περιορισμού. Μετά το τέλος της επώασης το γονίδιο της Α1 επικράτειας του vwf καθαρίστηκε με το PCR Purification Kit (Παράγραφος Β.2.9.). Ο φορέας ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% κι εκχυλίστηκε από την πηκτή 100

113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ με το Gel Extraction Kit. Ακολούθησε η αντίδραση της λιγάσης (Παράγραφος Β ), ώστε να ενσωματωθεί το γονίδιο της Α1 επικράτειας του vwf στον πλασμιδιακό φορέα pan5. Το ενισχυμένο θραύσμα της Α1 επικράτειας, μήκους 531bp, κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pan5, αμέσως μετά τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του 14μερούς που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo. Στη συνέχεια ο ανασυνδυασμένος πλασμιδιακός φορέας pan5-α1-vwf χρησιμοποιήθηκε για την υπερέκφραση και τη βιοτινυλίωση της πρωτεΐνης Α1-vWF. Γ.2.2. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.coli AVB101 με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pan5-α1-vwf, υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της Α1 επικράτειας του vwf Για την υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της πρωτεΐνης Α1 χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα AVB101, στα οποία εισήχθη ο ανασυνδυασμένος πλασμιδιακός φορέας pan5-α1-vwf. Με τον τρόπο αυτόν προέκυψε το στέλεχος AVB101-pAN5-Α1- vwf. Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην Παράγραφο Β.2.18., τα κύτταρα AVB101 αποτελούν ένα σύστημα in vivo βιοτινυλίωσης και αναπτύχθηκαν παρουσία του αντιβιοτικού χλωραμφαινικόλη (10 μg/ml τελική συγκέντρωση). Ακολούθησε προετοιμασία των επιδεκτικών κυττάρων και μετασχηματισμός σύμφωνα με τις τεχνικές που περιγράφονται στις Παραγράφους Β και Β Τα κύτταρα AVB 101 έχουν ανθεκτικότητα στην χλωραμφαινικόλη, λόγω του πλασμιδίου pbiracm που περιέχουν. Με την εισαγωγή του πλασμιδιακού φορέα pan5 αποκτούν ανθεκτικότητα και στην αμπικιλλίνη. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία με LB και άγαρ παρουσία των δύο αντιβιοτικών, της αμπικιλλίνης (100 μg/ml) και της χλωραμφαινικόλης (10 μg/ml). Η επώαση έγινε στους 37 C για ώρες. Από τα τρυβλία επιλέχτηκε μία αποικία μετασχηματισμένων κυττάρων και εμβολιάστηκε σε 5 ml θρεπτικού υποστρώματος LB παρουσία των αντιβιοτικών χλωραμφαινικόλη και αμπικιλλίνη σε τελικές συγκεντρώσεις 10 μg/ml και 100 μg/ml αντίστοιχα. Ακολούθησε επώαση στους 37ºC για ώρες με ανακίνηση. Από την αρχική αυτή καλλιέργεια έγινε ενοφθαλμισμός 1:150 σε 2 κωνικές φιάλες των 2lt που περιείχαν έκαστη 300 ml αποστειρωμένου LB καθώς και τις ανάλογες ποσότητες χλωραμφαινικόλης και αμπικιλλίνης. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν στους 37ºC με ήπια ανάδευση μέχρι η απορρόφηση στα 600nm να φθάσει ~0.7 OD και ~0.8 OD για κάθε φιάλη και προστέθηκε 1mΜ IPTG, προκειμένου να ενεργοποιηθεί η 101

114 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ μεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και συνακόλουθα των γονιδίων στόχων, και 50 μm βιοτίνη σε Bicine buffer. Η υπερέκφραση δοκιμάστηκε σε δυο διαφορετικές συνθήκες απορρόφησης, ώστε να διασφαλιστούν οι ιδανικές συνθήκες υπερέκφρασης της πρωτεΐνης. Το IPTG επάγει τη σύνθεση τόσο του ενζύμου BirA όσο και της πρωτεΐνης, η οποία έχει ενωμένο στο αμινοτελικό της άκρο το 14-μερές πεπτίδιο (Εικόνα 42). Η προστιθέμενη βιοτίνη συνδέεται από το BirA στο αμινοτελικό άκρο της Α1. Η επώαση, μετά την προσθήκη του IPTG και της βιοτίνης, συνεχίστηκε για 3 ώρες στην ίδια θερμοκρασία και ακολούθησε παραγωγή των πρωτεϊνών σύντηξης. Η διαδικασία της υπερέκφρασης είναι η ίδια με αυτή που περιγράφηκε στην παράγραφο Β Ελήφθη 1ml δείγματος πριν την επαγωγή με IPTG και μετά το τέλος αυτής και για τις δύο υπερεκφράσεις στα ~0.7 OD και στα ~0.8 OD. Ακολούθησε λύση των κυττάρων με υπερήχους (Παράγραφος Β ) και ακολούθησε η παραλαβή των κυτταρικών εκχυλισμάτων και η ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή SDS-PAGE 12% w/v. Εικόνα 42. Σχηματική απεικόνιση του τελικού βιοτινυλιωμένου προϊόντος που προέκυψε από την υπερέκφραση της Α1-vWF στα κύτταρα E.coli AVB101. Διακρίνεται η ουρά έξι ιστιδινών, απαραίτητη για τον καθαρισμό της Α1-vWF, το 14-πεπτίδιο και η συνδεδεμένη βιοτίνη. Γ.2.3. Καθαρισμός της βιοτινυλιωμένης Α1 επικράτειας του vwf με ουρά έξι ιστιδινών (His-tag) με τη χρήση στήλης Νi-ΝΤΑ Μετά από την υπερέκφραση της Α1 επικράτειας του vwf ακολούθησε ο καθαρισμός και η απομόνωσή της με στήλη νικελίου (Ni 2+- NTA-αγαρόζη) 102

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Παράγραφος Β.2.16.). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και λύθηκαν με υπερήχους. Ακολούθησε η διαδικασία παραλαβής του ολικού κυτταρικού εκχυλίσματος, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β Κατόπιν, το εκχύλισμα των κυττάρων επωάστηκε με τα σφαιρίδια της στήλης νικελίου, με αποτέλεσμα την πρόσδεση με υψηλή συγγένεια της Α1 επικράτειας στη στήλη μέσω των ιστιδινών. Ακολούθησε έκλουση της πρωτεΐνης με ιμιδαζόλιο (δύο φορές) και ηλεκτροφόρηση σε SDS-PAGE 12% w/v μιας μικρής ποσότητας του εκλούσματος (Εικόνα 43). Εικόνα 43. Καθαρισμός της Α1-vWF-biotin-6xΗis tag με στήλη Ni-NTA. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες, Διαδρομή 1: Καθαρισμένη πρωτεΐνη Α1-vWF-biotin-6xΗis tag στα 25kD περίπου, λόγω φαινομένου μοριακού βάρους (1 η έκλουση), Διαδρομή 2: 2 η έκλουση Στη συνέχεια η πρωτεΐνη τοποθετήθηκε σε σάκο διαπίδυσης σε διάλυμα 20mΜ Hepes-KOH, PH=7.6, 6mM οξικού Mg, 30mM ACNH 4 και 4mM β- μερκαπτοαιθανόλης, (Tico buffer) με σκοπό την απομάκρυνση του ιμιδαζολίου και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε SDS-PAGE 12% v/v, προκειμένου να ελεγχθεί ο βαθμός καθαρότητας της Α1. Η συγκέντρωση της Α1 μετρήθηκε με την μέθοδο Bradford (Παράγραφος Β.2.19.) και προσδιορίστηκε στα 0,308 mg/ml. Μετά την ηλεκτροφόρηση οι καθαρισμένες πρωτεΐνες μοιράστηκαν σε μικρούς όγκους (aliquots) και τοποθετήθηκαν στους -20 C. Γ.2.4. Έλεγχος βιοτινυλίωσης της Α1-vWF-biotin Ο έλεγχος της βιοτινυλίωσης της Α1-vWF-biotin έγινε με επίσταξη Α1-vWFbiotin διαλυμένης σε Tico buffer, σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Dot Blot) και ως 103

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ «αντίσωμα» χρησιμοποιήθηκε η αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη με στρεπταβιδίνη η οποία δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση παρουσία βιοτίνης (παράγραφος Β.2.6.). Για την τεχνική Dot Blot χρησιμοποιήθηκαν ένα δείγμα Α1-vWF-biotin μετά την επαγωγή, ένα θετικό και ένα αρνητικό control. Ως αρνητικό control μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία οποιαδήποτε πρωτεΐνη, αρκεί να μην είναι βιοτινυλιωμένη. Στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη SRPK (SR protein kinase). Ως θετικό control χρησιμοποιήθηκε η GFP σημασμένη με βιοτίνη. Στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης έγινε επίσταξη μίας σταγόνας από το θετικό control, μίας σταγόνας από το αρνητικό control, και μιας σταγόνας διαλύματος Tico με Α1-vWF-biotin. Η μεμβράνη επωάστηκε με διάλυμα κορεσμού (blocking solution) για 1 ώρα και κατόπιν με το αντίσωμα για 2.5 ώρες. Ακολούθησαν δύο πλύσεις με PBS και έπειτα επώαση με το προαναφερθέν «αντίσωμα» και τα χρωμοφόρα BCIP και NBT (Παράγραφος Β.2.6.) για την πραγματοποίηση της χρωμοαντίδρασης. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 44, εμφανίστηκαν οι κηλίδες στο θετικό control και στο δείγμα της Α1-vWF-biotin, ενώ στο αρνητικό control δεν εμφανίστηκε τίποτα. Αυτό αποτελεί ένδειξη ύπαρξης βιοτινυλιωμένου προϊόντος Α1. Εικόνα 44. Δοκιμασία Dot Blot πρωτεΐνης Α1-biotin διαλυμένης σε Tico buffer σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Από αριστερά προς τα δεξιά: βιοτινυλιωμένη GFP (θετικό control), SRPK (αρνητικό control), δείγμα Α1-vWF-biotin, το οποίο εμφανίζει σαφή χρώση. 104