Εισαγωγή στα microrna Δ. ΣΙΔΕΡΗΣ

Transcript

1 Εισαγωγή στα microrna Δ. ΣΙΔΕΡΗΣ

2 Non-Coding RNA: Παλαιότερα γνωστό ως «JUNK» NC-RNAs: Αποτελούν την πλειοψηφία των μεταγράφων σε σύνθετα γονιδιώματα

3 Non-Coding RNA: Κλειδί στην πολυπλοκότητα των ευκαρυωτικών?

4 Τα ρυθμιστικά RNA είναι ευρέως διαδεδομένα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Υπάρχουν πολλά είδη ευκαρυωτικών ρυθμιστικών RNA μορίων που χαρακτηρίζονται με βάση: Το μέγεθός τους (μικρά, μεγάλα) Την προέλευσή τους Τους μηχανισμούς από τους οποίους δημιουργούνται και ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση. Σήμερα πιστεύεται ότι το 30-70% των γονιδίων των ανώτερων οργανισμών ρυθμίζονται σε κάποιο βαθμό από το RNA, με τον ρόλο των τελευταίων να επεκτείνεται από την ανάπτυξη έως την κυτταρική ομοιόσταση και την προστασία του κυττάρου από ιούς και τρανσποζόνια.

5 Μικρά ρυθμιστικά Non-Coding RNAs Τα μικρά ρυθμιστικά μόρια RNA έχουν διάφορα ονόματα, τα οποία εξαρτώνται από την προέλευσή τους και τον τρόπο δράσης τους. Αυτά που παρασκευάζονται με τεχνητό τρόπο, ή παράγονται από φυσικής προέλευσης δίκλωνα RNA ονομάζονται κατά κανόνα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (small interfering RNAs, sirnas). Μια άλλη ομάδα μικρών ρυθμιστικών μορίων RNA που προέρχονται από πρόδρομα μόρια RNA που κωδικοποιούνται από γονίδια ονομάζονται μικρο-rna (micro RNAs, mirnas). Μικρά μόρια RNA που αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες Piwi, δρουν στα γαμετικά κύτταρα καταστέλλοντας την κινητικότητα των τρανσποζονίων και ονομάζονται pirnas. Τα sirna και mirna παράγονται από πρόδρομα μόρια RNA που υφίστανται επεξεργασία από το σύμπλοκο Dicer που αναγνωρίζει και αποικοδομεί μακρύτερα dsrna μόρια και χρησιμεύουν στην παρεμβολή του RNA ή στο μεταγραφικό/μεταφραστικό έλεγχο. Τα pirna παράγονται μέσω της επεξεργασίας μακρύτερων μονόκλωνων μεταγραφικών προϊόντων χωρίς την απαίτηση δράσης του Dicer.

6 sirna mirna

7 Η παραγωγή των sirna και mirna και ο τρόπος δράσης τους. 3 Τα sirna και mirna κατευθύνουν ένα σύμπλοκο, που ονομάζεται RISC για την καταστολή γονιδίων με τρείς τρόπους: 1. προσβάλλει και υδρολύει το mrna με το οποίο εμφανίζει ομολογία ή 2. παρεμποδίζει τη μετάφραση των mrna ή 3. κατευθύνει ένζυμα τροποποίησης της χρωματίνης στους υποκινητές γονιδίων που ελέγχουν την σύνθεση των mrna αυτών. 2 1 Μέσω στρατολόγησης μιας RNA-εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης, τα sirna παράγουν περισσότερα μόρια dsrna τροφοδοτώντας έτσι το Dicer προκειμένου αυτό να παράγει περισσότερα μόρια sirna. (Ενίσχυση)

8 Χαρακτηριστικά των mirnas Μικρά μη-κωδικά RNA, μήκους nt Καταστέλλουν την μετάφραση ή / και προκαλούν την αποικοδόμηση των συμπληρωματικών mrnas στόχων Ρυθμίζουν το 30% των προϊόντων γονιδίων των θηλαστικών 1 mirna = εκατοντάδες mrnas "Μπορείτε να αλλάξετε το φαινότυπο με τη διαμόρφωση ενός ενιαίου mirna" (Thomas Wurdinger) Έχουν περιγραφεί σε ασπόνδυλα και σπονδυλωτά: σκουλήκια, μύκητες, φυτά και θηλαστικά Πολλά είναι συντηρημένα μεταξύ των σπονδυλωτών και των ασπόνδυλων. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα υπολογίζεται ότι υπάρχουν >1000 mirnas.

9 Ιστορία των mirnas

10 lin-4, το πρώτο mirna που έχει περιγραφεί στο C. Elegans (1993), και είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη του σκουληκιού από προνύμφη σε ενήλικες. let-7, περιγράφεται επίσης στο C. elegans (Reinhard BJ et al, 2000) ως κρίσιμο μόριο που σταματά την κυτταρική διαίρεση των βλαστικών κυττάρων και προκαλεί διαφοροποίηση της κατάστασής τους. represses accumulation of LIN-14 protein Μειωμένη έκφραση του let-7 συνδέεται με ανθρώπινους καρκίνους.

11 Οι Fire και Mello, σε πειράματα με C. elegans, έδειξαν πρώτοι ότι το dsrna είναι πολύ πιο ισχυρό στην αναστολή της γονιδιακής έκφρασης απ ότι το antisense RNA, θέτοντας έτσι τη βάση της κατανόησης του ρόλου των mirnas στην ανάπτυξη και ρύθμιση των γονιδίων. (Βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής, 2006).

12 The first described mirna lin-4 =Evolutionarily conserved

13

14 Γονιδιακή οργάνωση

15

16 Αρχικά τα γονίδια των mirna μεταγράφονται στον πυρήνα δημιουργώντας μετάγραφα μήκους αρκετών kilobases, τα οποία υφίστανται επεξεργασία ωρίμανσης με προσθήκη καπέλου στο 5 άκρο και poly-a ουράς στο 3 άκρο τος.

17 Τα mirna κωδικοποιούνται στο εσωτερικό τόσο εσωνίων, όσο και εξωνίων RNA μορίων

18 Ο μηχανισμός βιογένεσης των microrna Η μεταγραφή ενός γονιδίου που κωδικοποιεί mirna από μια πολυμεράση ή τη συρραφή ενός ιντρονίου δημιουργεί ένα αρχικό προϊόν μετεγγραφής που ονομάζεται pri-mirna. Το μόριο αυτό διασπάται από την RΝάση Drosha που συνδέεται με την πρωτεΐνη DGCR8 και δημιουργεί ένα πρόδρομο RNA που ονομάζεται pre-mirna. To μόριο αυτό εξέρχεται στη συνέχεια στο κυτταρόπλασμα μέσω της exportin-5 και αποκόπτεται από το ένζυμο Dicer, η οποία συνδέεται με την πρωτεΐνη TRBP. Μόνον ο ένας από τούς δύο κλώνους του mirna, που ονομάζεται ώριμος κλώνος (ή καθοδηγητής RNA), ενσωματώνεται στο σύμπλοκο RISC, που αποτελείται κυρίως από τις πρωτεΐνες Argonaute, ενώ ο άλλος κλώνος που ονομάζεται επιβάτης RNA διασπάται.

19 Σύγκριση της βιογένεσης των mirnas, sirnas, και pirnas Πρωτεϊνες Piwi Δρουν στα γαμετικά κύτταρα

20 Ωρίμανση των pri-mirna σε pre-mirna από το σύμπλοκο Drosha/DGCR8 Ο DGCR8 δεσμεύεται σε δίκλωνο RNA, αναγνωρίζει τις πλευρικές αλληλουχίες του pri-mirna, επιτρέποντας την ασύμμετρη διάσπαση του στελέχους-βρόχου από την ριβονουκλεάση Drosha, περίπου 11 bp από τη διασταύρωση μεταξύ των πλευρικών αλληλουχιών από το στελέχος-βρόχο. Αυτή η ασύμμετρη διάσπαση αφήνει δύο μη ζευγαρωμένα νουκλεοτίδια στο τελικό 3 ΟΗ.

21 Αναγνώριση και θραύση του pri-mirna σε pre-mirna από το σύμπλοκο του μικροεπεξεργαστή.

22 Στον πυρήνα, μικρά ιντρόνια με δυνατότητα σχηματισμού φουρκέτας, που ονομάζονται mirtrons, μπορεί να συρραφούν δημιουργώντας φουρκέτες pre-mirna. Το δυναμικό σχηματιμού φουρκέτας οφείλεται στην συμπληρωματικότητα των αλληλουχιών των 5 και 3' περιοχών των ιντρονίων (κόκκινο και μπλε περιοχές του ιντρονίου στο σχήμα, αντιστοίχως).

23 Μηχανισμός εξαγωγής του pre-mirna από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα Οι πρωτεΐνες Exp-5 και RAN- GTP δημιουργούν σύμπλοκο με το pre-mirna το οποίο συνδεόμενο με νουκλεοπορίνες περνά μέσα από τους πυρηνικούς πόρους στο κυτταρόπλασμα. Η απελευθέρωση των premirnas στο κυτταρόπλασμα συνδέεται με την υδρόλυση του συνδεδεμένου στη RΑΝ GTP σε GDP από την RAN-GAP. H RΑΝ-GDP και ηexp-5 στη συνέχεια μεταφέρονται πίσω στον πυρήνα και η RAN-GDP αναγεννάται από την RCC1 (παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίου της RAN ).

24 Dicer-εξαρτώμενη διάσπαση του pre-mirna Η επικράτεια PAZ της Dicer αναγνωρίζει την μονόκλωνη προεξοχή των δύο νουκλεοτιδίων στο 3 άκρο του pre-mirna. Η επικράτεια πρόσδεσης της Dicer dsrbd επιτρέπει την τοποθέτηση των περιοχών με ενεργότητα RNase III στη σωστή θέση και ακολουθεί η διάσπαση του pre-mirna.

25 Η κρυσταλλική δομή της Dicer Καθεμία από τις επικράτειες RNάσης διαθέτει στο ενεργό της κέντρο ένα ζεύγος δισθενών ιόντων μετάλλου, τα οποία στην κρυσταλλική δομή είναι ιόντα μαγγανίου (μοβ σφαίρες), ενώ στο κύτταρο ενδέχεται να είναι ιόντα μαγνησίου. Η απόσταση ανάμεσα στα ζεύγη των ιόντων μετάλλου είναι 17,5 Å και αντιστοιχεί στο πλάτος της μεγάλης αύλακας του δίκλωνου RNA. Η απόσταση ανάμεσα στη θέση ΡΑΖ, όπου προσδένεται το 3 προεξέχον άκρο του δίκλωνου RNA, και στο ενεργό κέντρο της RNάσης ΙΙΙa είναι περίπου 65 Å και αντιστοιχεί στο μήκος περίπου 25 νουκλεοτιδίων του δίκλωνου RNΑ.

26 Σχηματική αναπαράσταση που απεικονίζει τη Dicer να κόβει το δίκλωνο RNA Η επικράτεια ΡΑΖ προσδένεται στο ένα άκρο του δίκλωνου RNA (πράσινο). Η απόσταση ανάμεσα στη θέση πρόσδεσης της ΡΑΖ και στο ενεργό κέντρο της RNάσης ΙΙΙa είναι περίπου 65 Å και αντιστοιχεί στο μήκος 25 περίπου ζευγών βάσεων του δίκλωνου RNΑ. Συνεπώς η Dicer λειτουργεί σαν μοριακός χάρακας που μετρά και κόβει ανά 25 περίπου νουκλεοτίδια από το άκρο του δίκλωνου RNΑ.

27 Σχηματισμός του συμπλόκου mirisc Το σύμπλοκο RLC (αποτελούμενο από την Dicer, την TRBP και την Ago2) δεσμεύεται στο pre-mirna και προκαλεί: Τη διάσπασή του, τον διαχωρισμό των δύο κλώνων και τον σχηματισμό του συμπλόκου mirisc (αριστερά). Το δεύτερο μοντέλο (δεξιά) επικαλείται, πρώτα την διάσπαση του συμπληρωματικού κλώνου από την Ago2, επιτρέποντας το σχηματισμό μιας μεταβατικής mirna μορφής που ονομάζεται Acpre-miRNA (Ago2-clived προmirna) και ακολούθως τη διάσπαση από την Dicer. Σε αυτό το μοντέλο, ο κλώνος επιβάτης αποικοδομείται στη συνέχεια.

28 Σχηματικό μοντέλο αλληλεπίδρασης μεταξύ των mirnas και των mrnas στόχων στα μετάζωα. Τα mirnas προσδένονται στην 3 UTR των mrnas στόχων σε απόσταση μεγαλύτερη 15 nt από το κωδικόνιο λήξης. Τέλεια συμπληρωματικότητα παρατηρείται στην περιοχή «seed», νουκλεοτίδια 2-7 από το 5 άκρο του mirna (μωβ ορθογώνιο). Ακολουθεί μια κεντρική διόγκωση, όπου δεν υπάρχει συμπληρωματικότητα και παρατηρείται μερική συμπληρωματικότητα στο 3 άκρο του mirna. Απόλυτη συμπληρωματικότητα παρατηρείται επίσης μεταξύ των νουκλεοτιδίων (πράσινο ορθογώνιο) και είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση του υβριδίου mirna/mrna. Η παρουσία στην αλληλουχία του mrna ενός καταλοίπου A στη θέση 1 και μιας A ή U στη θέση 9 αυξάνει την αποτελεσματικότητα δράσης του mirna.

29

30 Αρχή δράσης των mirnas ~ 70 nucleotides ~ 22 nucleotides Μόνο μέρος της αλληλουχίας του mirna είναι συμπληρωματική προς το στόχο του, έτσι η ειδικότητά του είναι περιορισμένη. Ως εκ τούτου, ένα mirna μπορεί να έχει διαφορετικούς στόχους, αλλά και ένα mrna στόχος μπορεί να αναγνωρίζεται από περισσότερα του ενός mirnas.

31 Tρόποι δράσης του mirisc Όταν υπάρχει πλήρης ομολογία αλληλουχίας ανάμεσα στο μήκους 22 νουκλεοτιδίων mirna-οδηγό και σε μια περιοχή του mrna-στόχου, τότε το mirisc κόβει το mrnaστόχο. Αν η ομολογία είναι ατελής, τότε το mirisc προσδένεται στην 3 αμετάφραστη περιοχή του mrna-στόχου και καταστέλλει τη μετάφρασή του.

32 Μηχανισμοί καταστολής της μετάφρασης μέσω mirna Α. Καταστολή στο επίπεδο της έναρξης Αυτή η ρύθμιση μπορεί να συμβεί: - είτε με αναστολή της πρόσδεσης του eif4e στο κάλυμμα του μηνύματος λόγω του ανταγωνισμού με τις πρωτεΐνες Ago, - είτε μέσω παρεμπόδισης σύνδεσης της 60S ριβοσωμικής υπομονάδας.

33 Β. Καταστολή στο επίπεδο της επιμήκυνσης Έχουν περιγραφεί τρεις μηχανισμοί. Ρύθμιση στη πρόωρη απελευθέρωση των ριβοσωμάτων (drop-off), στη μείωση της κινητικής της επιμήκυνση, καθώς και στη αποικοδόμηση του νεοσυντιθέμενου πεπτιδίου.

34 Γ. Ρύθμιση μέσω αποικοδόμησης του mrna Ένα σύμπλοκο που περιλαμβάνει δύο αποαδενυλάσες (CCR4 and CAF1) και η πρωτεΐνη NOT αποικοδομούν την polya ουρά. Το σύμπλοκο decapping απομακρύνει τη δομή του καπέλου από το 5 άκρο και το mrna αποικοδομείται από την ριβονουκλεάση Xrn1 (5 3 ) ή/και από το εξόσωμα (3 5 ).

35 Πρόσφατα βρέθηκε ότι ορισμένα mirnas μπορούν να ρυθμίσουν θετικά την έκφραση συγκεκριμένων μεταγράφων και πρωτεϊνών σε ειδικούς κυτταρικούς τύπους κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. International Journal of Genomics Volume 2014 (2014), Article ID , 15 pages

36 Παράδειγμα: Ρύθμιση της έκφρασης των KLF4 και myt1 mrnas. Τα mir-334 και mir-27a συνδέονται με την 3 UTR των KLF4 και myt1 mrna, σε πολλαπλασιαζόμενα και καρκινικά κύτταρα ρυθμίζοντας αρνητικά την έκφρασή τους τόσο με μεταφραστική αναστολή όσο και με αποικοδόμηση του mrna. Στους παράγοντες πρόκλησης της καταστολής συμπεριλαμβάνονται οι AGO1/2, η GW182, αποαδενυλάσες και νουκλεάσες. Αντίθετα, σε κύτταρα φάσης G 0 και σε ανώριμα ωοκύτταρα όπου η έκφραση της GW182 μειώνεται και της FXR1 αυξάνεται, το mir-206 συνδέεται με το ΚLF4 mrna και το xmir-16 συνδέεται με το myt1 mrna αντίστοιχα, τα οποία μέσω της αλληλεπίδρασης της ago2 με την πρωτεΐνη FXR1 οδηγούν σε υπερέκφραση των αντίστοιχων πρωτεϊνών.

37

38 Πρότυπα ιστοειδικής έκφρασης mirnas σε έμβρυα ποντικού με in situ υβριδισμό mir-1, heart, and somites; mir-206, somites; mir-124a, central nervous system; mir-126, blood vessels mir-10a, posterior trunk; mir-219, midbrain, hindbrain, and spinal cord.

39 mirnas και καρκίνος Η μείωση της έκφρασης ή η απαλειφή ενός mirna που λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό οδηγεί στο σχηματισμό όγκου Η ενίσχυση ή υπερέκφραση ενός mirna που έχει ένα ογκογόνο ρόλο θα οδηγούσε επίσης στο σχηματισμό όγκων.

40 Microarray analysis of mirnas

41 Τα mirnas έχουν αναδειχθεί ως βασικοί ρυθμιστές της βιολογίας των καρκινικών κυττάρων. Τα πρότυπα (υπογραφές) των mirnas μπορούν να καθορίσουν τους καρκινικούς τύπους, την ευαισθησία, την πρόγνωση και την ανταπόκριση. Τα κυκλοφορούντα στα βιολογικά υγρά mirnas παρέχουν μια πιθανή πηγή των βιοδεικτών. Η διερεύνηση των συγκεκριμένων δραστηριοτήτων των mirnas ανοίγει μια πιθανή θεραπευτική λεωφόρο. Καρκίνος και mirnas