Το 1998 άρχισε να εγκαθιδρύεται η. αντεπιδρούν µε το mrna και να

Transcript

1 Το 1998 άρχισε να εγκαθιδρύεται η αντίληψη ότι τα δίκλωνα RNA µόρια µπορούν να αντεπιδρούν µε τα γονίδια και να τα αδρανοποιούν ή µπορούν να αντεπιδρούν µε το mrna και να προωθούν την αποικοδόµηση του ή να ρυθµίζουν τη µετάφρασή του.

2 Στο τέλος του 1980 οµάδα βοτανικών εισήγαγαν στο φυτό πετούνια αντίγραφα γονιδίων που κωδικοποιούν για βαθύ ερυθρό χρώµα στα άνθη. Αποτέλεσµα παραγωγή ανθέων µε λευκό ή µωσαϊκό χρώµα. Εξήγηση που δόθηκε για τα γονίδια που εισήχθησαν στο κύτταρο ότι όχι µόνο δεν εκφράστηκαν αλλά τουναντίον αλληλεπίδρασαν µε τα γονίδια που κωδικοποιούσαν για το ερυθρό χρώµα.

3 Οι ιδέες για λειτουργικό ρόλο των µικρών RNA εγκαθιδρύθηκαν όταν: α. Ερευνητές διαπίστωσαν ότι µόλυνση φυτών µε RNA ιούς που είχαν τροποποιηθεί γενετικά και περιείχαν κοµµάτια γονιδίων όµοια µε τα γονίδια που υπήρχαν στα φυτά είχε ως συνέπεια σιώπηση στα φυτά των γονιδίων εκείνων που ήταν όµοια µε αυτά που εισήχθησαν. β. ιαπιστώθηκε ότι η αντιγραφή των ιών γίνεται µέσω δίκλωνων µορίων. γ. Με την ένεση στο κύτταρο γονιδίων σε πολλά αντίγραφα δηµιουργούν δίκλωνα RNA µόρια. δ. Σε διάφορους ιστούς εντοπίσθηκαν µια σειρά µικρά µόρια RNA.

4

5

6 Τα S 1 RNA δηµιουργούνται από µεγάλου µήκους δίκλωνα RNA µόρια που προέρχονται είτε από το γονιδιακό υλικό είτε µετά από ιϊκή επιµόλυνση µε τη βοήθεια συγκεκριµένων νουκλεασών (Dicer) Τα S 1 RNA συγκροτούνται από δύο αλυσίδες µήκους 21 νουκλεοτιδίων. Τα 19 νουκλεοτίδια βρίσκονται υπό τη δίκλωνη µορφή ενώ δύο υπό τη µη συνεζευγµένη.

7 Μετά τη δηµιουργία του s 1 RNA ένα σύµπλεγµα επαγόµενο από το RNA, το RISC (RNA induced silencing complex) διακρίνει τις δύο αλυσίδες που υπάρχουν στο s 1 RNA. Η αλυσίδα η οποία έχει την ίδια ακολουθία µε το γονίδιο που πρόκειται να σιωπήσει (καταστρέφεται µπλε αλυσίδα), η antisense αλυσίδα η οποία έχει συµπληρωµατική αλληλουχία (κίτρινη στην εικόνα) χρησιµοποιείται για να αδρανοποιήσει το γονίδιο στόχο µε διάφορους τρόπους ανάλογα µε τον οργανισµό που µελετάται.

8 Στους σκώληκες και στα φυτά η antisense αλυσίδα του SiRNA πρώτα πολλαπλασιάζεται µε τη βοήθεια RNA πολυµεράσης και στη συνέχει υβριδοποιείται µε το mrna µόριο. Το υβριδικό µόριο µπορεί να λειτουργήσει ως σηµείο εκκίνησης για τη δηµιουργία νέων µεγάλων µορίων δίκλωνου RNA. Μετά τη δηµιουργία του νέου δίκλωνου RNA µπορεί να εµπλακεί εκ νέου το Dicer και να δηµιουργήσει νέα SiRNA τα οποία να είναι ειδικά για διάφορες αλληλουχίες του ίδιου mrna.

9 Micro RNA εµπλέκονται στη ρύθµιση της ενεργότητας του mrna. Είναι µονόκλωνα µόρια Υπάρχουν σε αφθονία στο κύτταρο από µερικές χιλιάδες µέχρι Κωδικοποιούνται από το γονιδίωµα.

10 Ε ίκοσι δύο χρόνια πριν το 2001 στο επ ιστημονικό π εριοδικό science χαρακτηρίστηκαν mir NA ως μόρια του έτους. Σ ήμερα αυτά τα μικρά μόρια τα οποία είναι μη κωδικοποιούντα RNA και έχουν μέσο μέγεθος 22 νουκλεοτίδια σε μήκος, έχουν ανακαλυφθεί σε πολλούς ευκαρυώτικους οργανισμούς και έχει υπ ολογισθεί ότι ελέγχουν π ερίπ ου το ένα τέταρτο του συνόλου των κυτταρικών mr NA σε μετα μεταγραφικό επ ίπ εδο.

11 Τα γονίδια για τα mir NA κωδικοποιούνται ως μονοσιστρονικά και πολυσιστρονικά δίκτυα γονιδίων και έχουν βρεθεί στις π εριοχές των ιντρονίων των γονιδίων π ου κωδικοπ οιούν για πρωτεΐνες, μέσα σε περιοχές ιντρονίων που δεν κωδικοπ οιούν γονίδια αλλά και ως ανεξάρτητες μεταγραφικές μονάδες. Μεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν για mir NA με την RNA πολυμεράση οδηγεί στην παραγωγή μεγάλων προδρόμων mir NA μορίων (pri/mir NA) τα οπ οία π εριέχουν φουρκέτες οι οποίες περιέχουν τα ώριμα mir NA.

12 Γ ια να δημιουργηθούν τα ώριμα λειτουργικά mir NAs μόρια. Τα mir NA π ρέπ ει να εξαχθούν απ ό τα pri mir NA στα π λαίσια μιας π ορείας ωρίμανσης στην οπ οία λαμβάνουν χώρα γεγονότα απόσχισης τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπ λασμα.

13 ΗωρίμανσητουmiR NA γίνεται σταδιακά και απ αιτεί δύο ένζυμα π ου ανήκουν στις RNAσες ΙΙΙ. Την Ριβονουκλεάση Drosha για την έναρξη της ωρίμανσης του mir NA και την Ρ ιβονουκλεάση Dicer για την ολοκλήρωση της ωρίμανσης.

14 Σ τον π υρήνα η διάσχ ιση των pri/mir NAs απ ό την Drosha γίνεται πάρα πολύ γρήγορα και δίδει ένα κατά προσέγγιση 70 νουκλεoτιδίων RNA π ου έχει βραχίονα και θηλειά και ονομάζεται pre mir NA. Ακολουθεί η έξοδος του pre mir NA απ ό τον π υρήνα με τη βοήθεια της εξπ ορτίνης. Στην συνέχεια η Dicer διασχίζει γρήγορα το premir NAs προκειμένου να παραχθούν δίκλωνα mir NA μήκους 22 νουκλεoτιδίων.

15

16 Τα συμπλέγματα των mir NA π ου επ ιτελούν τις λειτουργίες σιώπ ισης των mr NA είναι συμπ λέγματα ριβονουκλεοπ ρωτεϊνών π ου π εριέχουν ένα μεγάλο αριθμό πρωτεϊνικών συστατικών και την αλυσίδα οδηγό του mir NA. Μετά την διάσχιση με Dicer επ ιλέγεται απ ό το δίκλωνο mir NA μόριο μήκους 22 νουκλεoτιδίων ή μία αλυσίδα η οποία μπορεί υβριδοποιηθεί με το mr NA στόχο π ου έχει συμπ ληρωματική αλληλουχία.

17 Μοντέλο λειτουργίας των microrna στους νηµατώδεις σκώληκες. 1. Μεταγράφονται υπό τη µορφή µεγάλων RNA µορίων που βρίσκονται υπό τη µορφή φουρκέτας µια και παρουσιάζουν ατελή συµπληρωµατικότητα στις διάφορες περιοχές (Pri- m 1 RNA) 2. Με τη βοήθεια ενός πυρηνικού ενζύµου Drosha µετατρέπονται τα Prem 1 RNA σε µικρότερα µόρια (~70 νουκλεοτίδια)τα τα prem 1 RNA. 3. Υπό τη µορφή των prem 1 RNA εξέρχονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα όπου ένα άλλο ένζυµο το Dicer τα διασπά και τα µετατρέπει σε ώριµα µονόκλωνα Micro RNA µεγέθους νουκλεοτίδια.

18 4.Το m 1 RNA αντεπιδρά µε πρωτεΐνες και δηµιουργεί ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύµπλεγµα m 1 RNP. Υπό τη µορφή του συµπλέγµατος δεσµεύεται στη µη µεταφραζόµενη περιοχή του mrna µέσω αντεπιδράσεων συµπληρωµατικών βάσεων. 5. Σε µερικές περιπτώσεις µέσω της αντεπίδρασης προκαλείται αποικοδόµηση του mrna και τότε ο τρόπος δράσης micro RNA S1RNA είναι όµοιος.

19

20 Ο τρόπος δράσης των δύο τάξεων µικρών RNA φαίνεται να είναι εντελώς διαφορετικός 1.Στα microrna η µεταγραφή δεν εµποδίζεται και τα µηνύµατα δεν καταστρέφονται. 2.Τα microrna ρυθµίζουν µηνύµατα RNA τα οποία προέρχονται από διαφορετικά γονίδια. 3.Πολλαπλά microrna µπορεί να εµπλέκονται στη ρύθµιση ενός mrna και φαίνεται ο βαθµός αναστολής να εξαρτάται άµεσα από τον αριθµό των microrna που δεσµεύονται πάνω στο µόριο. 4.Σε κάθε µόριο mrna µπορεί να εντοπίσει κανείς διάφορες περιοχές όπου µπορούν να δεσµευθούν διάφορα microrna που κατευθύνονται στην ίδια περιοχή.

21 Με διάφορες εµπειρικές προσεγγίσεις έχει προσδιορισθεί ότι το κάθε microrna µπορεί να στοχεύει τουλάχιστον σε πέντε διαφορετικά mrna. εδοµένου ότι σε κάθε κύτταρο εντοπίζονται περίπου 200 microrna φαίνεται ιδιαίτερα πιθανό ότι αυτή η διαδικασία ρύθµισης είναι ιδιαίτερα σηµαντική για ένα µεγάλο αριθµό µηνυµάτων.

22 Για τη δημιουργία του mir NP τόσο η επιλογή τηςαλυσίδαςαπότοδίκλωνομόριοόσοκαιη ενσωμάτωση του RNPδεν είναι π ορεία ιδιαίτερα καλά ξεκαθαρισμένη. Έ να καλά μελετημένο μοντέλο είναι η δημιουργία του short interfering RISC (si RISC ) στην δροσόφιλα. Πρόσφατες μελέτες απ εκάλυψαν ότι η Dicer απ αιτεί την συνδρομή μιας σειράς π ρωτεϊνικών παραγόντων για την επιλογή της αλυσίδας του RNA.

23 Σ τα κύτταρα θηλαστικών έχει δειχθεί ότι το Dicer αντεπιδρά με δύο πρωτεΐνες την TRBP (trans activating regio RNA binding protein) and PACT (PKR activating protein) που λειτουργούν ως συμπ αράγοντες για την επ ιλογή της αλυσίδας. Αν και TRBP και PACT απ αιτούνται για την συσσώρευση των ώριμων αλυσίδων οδηγών του mir NA ο ακριβής ρόλος για την επ ιλογή της αλυσίδας απ ομένει να διευκρινισθεί.

24 Η μονόκλωνη αλληλουχία οδηγός του mir NA υποβοηθείται και από πρωτεΐνες τόσο για να εντοπ ίσει το στόχο όσο και για να ρυθμίσει την λειτουργία του στόχου mr NA. Μυριάδες π ρωτεϊνικοί π αράγοντες φαίνεται να συνεργάζονται για το σκοπό αυτό. Σε αυτές τις π ρωτεΐνες π εριλαμβάνονται αλλά δεν περιορίζονταισε αυτές η FMRP, FXR1, FXR2, Dicer, Αgo 1 4, Gemin3, Gemin4, MOV10, TNRC 6 B και PRMT5.

25 Για την Ago 2 έχει δειχθεί ότι συνδέεται με Dicer κατά τα τελευταία στάδια της επ ιλογής της αλυσίδας και στα αρχικά στάδια σχηματισμού mir NP. Η Ago 2 ως στοιχείο του mir NP εμφανίζεται να έχει ενδονουκλεολυτική ενεργότητα π ου είναι υπ εύθυνη για την απ ό το mir NA διευκολυνόμενη διάσπαση του συμπ ληρωματικού mr NA π ου έχει ενωθεί με το mir NA.

26 Από τις τέσσερις πρωτεΐνες Αργοναύτες, η Ago 2 εμφανίζ εται να είναι μέρος του ώριμου mir NP και να είναι εκείνη π ου έχει την ενδονουκλεολυτική ενεργότητα π ου είναι υπ εύθυνη για την διάσπ αση του m RNA στόχου μέσω του mir NA. Δεν είναι όμως καθόλου ξεκαθαρισμένος ο ρόλος τωντριώνπρόσθετωνπρωτεϊνώναργοναυτών. Το βέβαιο είναι ότι δεν έχουν ενδονουκλεολυτική ενεργότητα όπ ως η Ago 2 και γι αυτό θεωρείται ότι η βιολογική τους ενεργότητα σχετίζεται με ρυθμιστικές λειτουργίες.

27 Οι π ρωτεΐνες Αργοναύτες π αρουσιάζουν διακριτή έκφραση στους διάφορους τύπ ους ιστών και γι αυτό θεωρείται ιδιαίτερα π ιθανός ο ρόλος αυτών των π ρωτεϊνών στη ρύθμιση της λειτουργίας του mr NA.

28 Συστατικά του συμπλέγματος mirna/rnp έχουν βρεθεί επ ίσης να αντεπ ιδρούν με μια ευαίσθητη π ρωτεΐνη καθυστέρησης Χ της λεγόμενης FMRP (fragile X mental retardation protein) η οποία και ελέγχει αρνητικά την έναρξη της μετάφρασης των mr NA που έχουν τριτοταγείς δομές.

29 Η πλέον σημαντική λειτουργία του mir NP συμπ λέγματος είναι η αναγνώριση του mr NA στόχου. Συστηματική ανάλυση της 3 UTR στον c. elegans έδειξε ότι υπ άρχ ουν θέσεις δέσμευσης για το mir NA οι οπ οίες διατηρούνται συντηρητικές στα διάφορα είδη RNA με τις θέσεις αυτές τα mir NA δημιουργούν ζεύγη βάσεων.

30 Ζευγάρωμα βάσεων σύμφωνα με τους κανόνες Watson Crick μεταξύ έξι (6) συνεχών νουκλεοτιδίων στο mr NA τα επωνομαζόμενα (seed match) με αντίστοιχα νουκλεοτίδια 2 7 του mir NA (τα επωνομαζόμενα mir NA seed) βρέθηκαν ότι είναι ουσιώδη.

31 Τ ο νουκλεοτίδιο π ου ακολουθεί το seed match στη θέση 8 ( +8) είναι π άρα π ολύ συντηρητικό και έχ ει την τάση να σχηματίζει ζεύγος βάσεων με το νουκλεοτίδιο 8 του mir NA (m8). Ηαντεπίδρασημεταξύτουt8 και του m8 έχει οριστεί ως m8 match.

32 Τ ο νουκλεοτίδιο π ου βρίσκεται μια θέση downstream στο seed match είναι επ ίσης π ολύ συντηρητικό και είναι συχνά κατάλοιπο αδενίνης και ονομάζεται ( t1 A άγκυρα). Αν και δεν είναι τόσο π ολύ συντηρητικές όπ ως οι άλλες θέσεις π ου αναφέρθησαν π αραπ άνω και η θέση 9 του mi RNA (Target site t9) τείνει επίσης να είναι συντηρητική και είναι συχνά επ ίσης μια Αδενίνη (t9 άγκυρα).

33 Προτείνονται σήμερα δύο μηχανιστικά μοντέλα για τον τρόπ ο με τον οπ οίο τα mir NA ελέγχουν την μετάφραση του mr NA. Τ ο ένα μοντέλο υπ οστηρίζει ότι το mir NA/ mir NP αντεπιδρά με πρωτεΐνη η οποία δεσμεύεταιστο κάλυμμα της eif4e και με αυτό τον τρόπο π αρεμπ οδίζεται η συνεργατική λειτουργία των eif 4E και των PABP γιαναστρατολογήσουνeif 4E κατά συνέπεια η δέσμευση του συμπλέγματος mir NA/ mir NP θα οδηγήσει στην διακοπ ή της έναρξης της μετάφρασης. Τ ο δεύτερο μοντέλο υπ οστηρίζει ότι η αντεπ ίδραση mir NP με το mr NA μπ ορεί να οδηγήσει σε πρώιμη λήξη της μετάφρασης π ροκαλώντας μια απ ομάκρυνση των ριβοσωμάτων π ου μεταφράζουν.

34

35 Αντεπίδραση των mir NA με mr NA στόχους μπορεί να οδηγήσει σε επιτάχυνση ή επιβράδυνση της μετάφρασης του mr NA στόχου. Αύξηση της μεταφραστικής ικανότητας του mr NA έχει μόνο π αρατηρηθεί στην μετάφραση του HCV RNA με το mir 122 (Topling et al 2005) μόνο που ο μηχανισμός δεν είναι ακόμη γνωστός. Περισσότερο έχει μελετηθεί η επ ιβράδυνση της μετάφρασης του mr NA. Βασικά φαίνονται να υπ άρχουν δύο κύριοι μηχανισμοί π ου δεν είναι πάντοτε αποκλειστικοί η μεταφραστική αναστολή των mr NA και η αποικοδόμησή της.

36 Ό π ως έχει δειχθεί για το mir 196 και mir 16 τα mir NAs μπορούνναεπάγουντηναποικοδόμηση του mr ΝΑ στόχου. Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό με τον οποίο τα mir NA επ άγουν την απ οικοδόμηση ο Wu και οι συνεργάτες του το (2006) διερεύνησαν την κινητική της αποικοδόμησης του mr ΝΑ στόχου. Βρέθηκε ότι τα mir NA επ ιταχύνουν την απ οικοδόμηση του mr ΝΑ απομακρύνοντας το 3 τελικό νουκλεοτίδιο τηςπολυαδενοσίνηςτουmr ΝΑ. Αυτός ο μηχανισμός ήταν σαφώς διαφορετικός από την ενδονουκλεολυτική διάσπ αση π ου π ροκαλείται απ ό το SiRNA.