ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ NICASTRIN ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ALZHEIMER ΣΕ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΠΟΝΤΙΚΙΑ-ΜΟΝΤΕΛΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΚΑΔΗΜΙΑ ΑΘΗΝΩΝ ΙΔΡΥΜΑ ΙΑΤΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΡΕΥΝΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ NICASTRIN ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ALZHEIMER ΣΕ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΠΟΝΤΙΚΙΑ-ΜΟΝΤΕΛΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΣΕΣΕΛΕ ΑΜ ΑΘΗΝΑ 2011

2 -1-

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σπύρος Ευθυμιόπουλος (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) Αναπληρωτής Καθηγητής Τομέας Φυσιολογίας Ζώων και Ανθρώπου Τμήμα Βιολογίας Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Παναγιώτα Παπαζαφείρη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τομέας Φυσιολογίας Ζώων και Ανθρώπου Τμήμα Βιολογίας Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Σπύρος Γεωργόπουλος (ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ) Ερευνητής Γ Εργαστήριο Κυτταρικής Νευροβιολογίας Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών -2-

4 -3-

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία διεξήχθη στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης «Εφαρμογές της Βιολογίας στην Ιατρική», που οργανώνεται από το Τμήμα Βιολογίας και την Ιατρική Σχολή του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Η εκπόνηση της έγινε κατά το χρονικό διάστημα Ιούλιος 2010 έως Σεπτέμβριος 2011, στο Εργαστήριο Κυτταρικής Νευροβιολογίας του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών, υπό την επιστημονική καθοδήγηση του Ερευνητή Γ κ. Σπύρου Γεωργόπουλου. Ο επιβλέπων της διπλωματικής εργασίας είναι ο Αναπληρωτής Καθηγητής του Τμήματος Βιολογίας κ. Σπύρος Ευθυμιόπουλος και στην εξεταστική επιτροπή συμμετέχει ακόμα η Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας κα. Παναγιώτα Παπαζαφείρη. Φτάνοντας στο τέλος αυτής της προσπάθειας θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα πρόσωπα που συνέβαλαν στην επιτυχή διεξαγωγή, συγγραφή και παρουσίαση της εργασίας αυτής. Πρωτίστως θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Ερευνητή κ. Γεωργόπουλο που με ενέταξε στην ερευνητική του ομάδα και μου έδωσε την ευκαιρία να εργαστώ σε ένα θέμα που προσέλκυσε από την αρχή το ενδιαφέρον μου. Σε όλη αυτή την πορεία παράλληλα με το σχεδιασμό και την επίβλεψη των πειραμάτων ήταν πάντα διαθέσιμος για να προσφέρει απάντηση στα ερωτήματά μου και να λύσει τα καθημερινά μικροπροβλήματα του εργαστηρίου. Κυρίως όμως αισθάνομαι ευγνώμων απέναντί του για το χρόνο που μου έχει αφιερώσει, τις πολύτιμες συμβουλές που μου έχει δώσει και την υποστήριξη που μου έχει προσφέρει σαν σωστός διδάσκαλος με την ευρεία έννοια του όρου. Η καθοδήγηση και η συμπαράστασή του αποτέλεσαν πολύτιμη βοήθεια για την επιτυχή ολοκλήρωση της εργασίας αυτής αλλά και για το σχεδιασμό της μελλοντικής μου πορείας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ευθυμιόπουλο για τη βοήθειά του κατά την αναζήτηση της διπλωματικής μου εργασίας και για τη διευκόλυνσή του σε διάφορα πρακτικά και τυπικά ζητήματα σε κάθε στάδιο αυτής, από την επιλογή μέχρι την παρουσίασή της. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω και την -4-

6 Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Παπαζαφείρη για την ιδιαίτερα πρόθυμη συμμετοχή της στην εξεταστική επιτροπή. Θα ήταν παράληψή μου πριν το τέλος του προλόγου να μην αναφερθώ στα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου, τη μεταδιδακτορική συνεργάτιδα δρ. Καλλιόπη Θανοπούλου και την προπτυχιακή φοιτήτρια Μιράντα Καψιμάλη, οι οποίες συντέλεσαν στη δημιουργία ευχάριστου και φιλικού κλίματος στο χώρο εργασίας μας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην Καλλιόπη Θανοπούλου που δεν κουράστηκε ποτέ να απαντάει σε απορίες μου, να με βοηθάει και να με συμβουλεύει τόσο για το πρακτικό όσο και για το θεωρητικό κομμάτι της παρούσας εργασίας. Εκτός όμως από τη βοήθειά της πάνω στα θέματα του εργαστηρίου, μου προσέφερε ταυτόχρονα υποστήριξη, εμψύχωση και κατανόηση στα καθημερινά προβλήματα και τις ανησυχίες μου. Κλείνοντας τον πρόλογο αυτό θα ήθελα να εκφράσω την απεριόριστη ευγνωμοσύνη μου απέναντι στο Κοινωφελές Ίδρυμα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης που χρηματοδότησε τις μεταπτυχιακές σπουδές μου κατά το χρονικό διάστημα Οκτώβριος 2009 έως Σεπτέμβριος Είναι για μένα ξεχωριστή τιμή και υπερηφάνεια να ονομάζομαι υπότροφος του Ιδρύματος καθώς ο τίτλος αυτός αποτελεί την πιο μεγάλη επιβεβαίωση και αναγνώριση της προσπάθειάς μου έως σήμερα. Ταυτόχρονα όμως λειτουργεί και ως κίνητρο για την περαιτέρω συνέχιση των σπουδών μου στο μέλλον και τη σταδιοδρομία μου στο χώρο της επιστήμης και της έρευνας. -5-

7 -6-

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΕΛ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 7 ΜΕΡΟΣ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η ΝΟΣΟΣ ΤΟΥ ALZHEIMER 15 - Κλινικά γνωρίσματα και μορφές της νόσου Παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά της νόσου Το β αμυλοειδές πεπτίδιο (Αβ) Παθογένεση της νόσου Η ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΥ β ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΥΣ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ (Αβ) 2.1. Η πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (APP) Η οικογένεια της APP Λειτουργία της APP Πρωτεολυτική επεξεργασία της APP 20 - Ρυθμιζόμενη Ενδομεμβρανική Πρωτεόλυση Τα μονοπάτια επεξεργασίας της APP Το σύμπλοκο της γ-εκκριτάσης 23 - Σύσταση του συμπλόκου Η Presenilin Η Nicastrin. 24 -Η Aph-1 και η Pen Σταδιακό κόψιμο του APP από τη γ-εκκριτάση ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ 27 - Ορισμός Διαγονιδιακά ζώα 27-7-

9 - Μέθοδος παραγωγής διαγονιδιακών ποντικών Μειονεκτήματα της μεθόδου Ρύθμιση της έκφρασης του διαγονιδίου Γονιδιακά στοχευμένα ζώα - Πλεονεκτήματα της μεθόδου Διαδικασία δημιουργίας γονιδιακά στοχευμένων ποντικών Τα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα Επιλογή βλαστοκυττάρων που έχουν υποστεί ομόλογο ανασυνδυασμό Υπό συνθήκη γονιδιακή στόχευση Εφαρμογές διαγονιδιακής τεχνολογίας. 4. ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕΝΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ 4.1. Ποντίκια CamKIIα icre Κατασκευή των διαγονιδιακών ποντικών Φαινότυπος των ποντικών Ποντίκια Nicastrin -/ Δημιουργία της γονιδιακής κατασκευής Ποντίκια 5XFAD Οι FAD μεταλλάξεις στον άνθρωπο Εισαγωγή των FAD μεταλλάξεων σε ποντίκια-μοντέλα της νόσου Κατασκευή των διαγονιδιακών ποντικών Φαινότυπος των 5XFAD ποντικών. 40 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 46 ΜΕΡΟΣ Β ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΒΙΟΨΙΕΣ ΟΥΡΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ ΜΕ PCR 51-8-

10 - Συστατικά της αντίδρασης Αρχή της μεθόδου Μια τυπική αντίδραση Συνθήκες της αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Υβριδοποίηση των εκκινητών Επέκταση Αριθμός κύκλων Τελική επέκταση. 54 Γενετικός χαρακτηρισμός των CamKIIα icre ποντικών. 54 Γενετικός χαρακτηρισμός των Nicastrin -/- ποντικών. 55 Έλεγχος της αφαίρεσης του γονιδίου της Nicastrin από την icre ρικομπινάση. 56 Γενετικός χαρακτηρισμός των 5XFAD ποντικών ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΙΣΤΩΝ ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ 63 - Βασικές αρχές ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών Προετοιμασία πρωτεϊνικών δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση Προετοιμασία πηκτώματος ηλεκτροφόρησης Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΤΑ WESTERN 69 - Γενικές αρχές Υλικά πρόσδεσης πρωτεϊνών Μεταφορά σε μεμβράνη Ανοσοεντόπιση πρωτεϊνών στη μεμβράνη. 71 Ανοσοεντόπιση Nicastrin. 73 Ανοσοεντόπιση GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). 73 Ανοσοεντόπιση Iba1 (Ionized calcium binding adaptor -9-

11 molecule 1) Εμφάνιση σήματος Πολλαπλές ανοσοεντοπίσεις. 75 Ανοσοεντόπιση Tubulin. 76 Ανοσοεντόπιση GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ΛΗΨΗ ΤΟΜΩΝ ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΧΡΩΣΗ NISSL ΧΡΩΣΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΥΣ ΜΕ THIOFLAVIN S ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ 80 - Γενικές αρχές Μέθοδος ανοσοφθορισμού. 81 Ανίχνευση Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1) με ανοσοφθορισμό. 82 Ανίχνευση GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) με ανοσοφθορισμό Ανοσοενζυμική μέθοδος. 84 Ανίχνευση του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου (Αβ) με ανοσοενζυμική μέθοδο Στατιστική ανάλυση. 87 ΜΕΡΟΣ Γ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 90 - Χρησιμοποιούμενα πειραματόζωα Διασταυρώσεις μεταξύ των πειραματοζώων Καθορισμός των ομάδων μελέτης και ομάδων ελέγχου Συμπεριφορικός φαινότυπος των Nicastrin knock-out ποντικών Επιβίωση των Nicastrin knock-out ποντικών ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΑΦΑΙΡΕΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ NICASTRIN ΣΤΟΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΤΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ

12 2.1. Επίπεδα της Nicastrin στον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών 95 -Έλεγχος της αφαίρεσης του γονιδίου με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. 95 -Έλεγχος των επιπέδων της πρωτεΐνης με ανοσοαποτύπωμα κατά Western Μορφολογία του εγκεφάλου των CamKIIα icre Nicastrin -/Ποντικών 98 - Έλεγχος της μορφολογίας του εγκεφάλου με χρώση Nissl Κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος στον εγκέφαλο των ποντικών Έλεγχος για αστροκυττάρωση στον εγκέφαλο των ποντικών. Ανίχνευση της GFAP με ανοσοφθορισμό Έλεγχος των επιπέδων της GFAP με ανοσοαποτύπωμα κατά Western Έλεγχος για μικρογλοίωση στον εγκέφαλο των ποντικών. Ανίχνευση της Iba1 με ανοσοφθορισμό Έλεγχος των επιπέδων της Iba1 με ανοσοαποτύπωμα κατά Western ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΑΦΑΙΡΕΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ NICASTRIN ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΥ β ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΥΣ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ (Αβ) 3.1. Παραγωγή του Αβ Ανίχνευση του Αβ με ανοσοϊστοχημεία Ενδονευρωνική και εξωνευρωνική εντόπιση του Αβ Συσσωμάτωση του παραγόμενου Αβ 123 -Ανίχνευση του συσσωματωμένου Αβ με χρώση με Thioflavin S. 123 ΜΕΡΟΣ Δ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ NICASTRIN ΣΤΟ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑ ΤΗΣ γ-εκκριτασησ

13 1.1. Ο ρόλος της στη συγκρότηση, σταθεροποίηση και ωρίμανση του συμπλόκου Αλληλεπίδραση της Nicastrin με τα υπόλοιπα μέλη του συμπλόκου Επιπτώσεις απώλειας ή μεταλλαγής της Nicastrin Αμφισβήτηση του ρόλου της Nicastrin στη συγκρότηση του συμπλόκου Ο ρόλος της ως υποδοχέας των υποστρωμάτων του συμπλόκου - Ομολογία της Nicastrin με υποδοχείς Συμμετοχή της Nicastrin στην παραγωγή του β αμυλοειδούς πεπτιδίου (Αβ) Ενδείξεις για το ρόλο της Nicastrin ως υποδοχέα υποστρωμάτων Αμφισβήτηση του ρόλου της Nicastrin ως υποδοχέα υποστρωμάτων Συμμετοχή της Nicastrin στην εμφάνιση της σποραδικής μορφής της νόσου Alzheimer Ρόλος των πολυμορφισμών στο γονίδιο της Nicastrin Ο απλότυπος HapB Ρόλος των πολυμορφισμών στον υποκινητή του γονιδίου της Nicastrin ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Επιπτώσεις της αφαίρεσης του γονιδίου της Nicastrin στον εγκέφαλο των ποντικών Επιπτώσεις της αφαίρεσης του γονιδίου της Nicastrin στην παραγωγή του β αμυλοειδούς πεπτιδίου (Αβ) Το ενδονευρωνικό β αμυλοειδές πεπτίδιο (Αβ). 142 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 145 SUMMARY 147 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

14 - 13 -

15 ΜΕΡΟΣ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ

16 1. Η ΝΟΣΟΣ ΤΟΥ ALZHEIMER Κλινικά γνωρίσματα και μορφές της νόσου. Η νόσος του Alzheimer (Alzheimer s disease, AD) είναι μια αργή και προοδευτική νευροεκφυλιστική διαταραχή του κεντρικού νευρικού συστήματος και αποτελεί την πιο κοινή αιτία άνοιας, καθώς ευθύνεται για το 50 έως 60% όλων των περιπτώσεων. (11) Τα κύρια κλινικά χαρακτηριστικά της ασθένειας περιλαμβάνουν τη σταδιακή εξασθένιση της αυτοβιογραφικής μνήμης (episodic memory), την αφασία (aphasia), την απραξία (apraxia), και την αγνωσία (agnosia), μαζί με άλλα γενικά γνωσιακά συμπτώματα, όπως η εξασθενημένη κρίση, η αδυναμία λήψης αποφάσεων, και η απώλεια του προσανατολισμού. (11) Η οικογενής μορφή της νόσου (familial Alzheimer s disease, FAD) είναι μια πολύ σπάνια αυτοσωμική επικρατής ασθένεια με πρόωρη εμφάνιση. (11) Προκαλείται από μεταλλαγές στα γονίδια της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς (amyloid precursor protein, APP) και της πρεσενιλίνης (Presenilin, PS), οι οποίες συνδέονται με την παραγωγή του β αμυλοειδούς πεπτιδίου (amyloid β, Αβ). (11) Σε αντίθεση με την οικογενή, η σποραδική μορφή (sporadic Alzheimer s disease, SAD) είναι πολύ κοινή, με περισσότερους από 15 εκατομμύρια ασθενείς παγκοσμίως. (11) Η αιτία της σποραδικής μορφής της νόσου είναι άγνωστη, πιθανώς επειδή είναι ετερογενής και προκαλείται από τη γήρανση σε συνδυασμό με πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου. (11) Παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά της νόσου. Η πρόοδος στην έρευνα έχει επιτρέψει τη λεπτομερέστερη κατανόηση της μοριακής παθογένεσης της νόσου, όμως όσο οι γνώσεις μας αυξάνονται τόσο γίνεται φανερή και η πολυπλοκότητά της. (11) Σε μικροσκοπικό επίπεδο, οι χαρακτηριστικές αλλοιώσεις της νόσου που εμφανίζονται κυρίως στις δομές του φλοιού και του ιππόκαμπου του εγκεφάλου είναι οι νευριτικές πλάκες (neuritic plaques), τα νευροϊνιδιακά δεμάτια (neurofibrillary tangles), καθώς και ο εκφυλισμός των νευρώνων και των συνάψεων και η αγγειακή βλάβη (βλ. Εικόνα 1). (11) Οι πλάκες είναι εξωκυττάριες εναποθέσεις (extracellular deposits) Aβ που περιβάλλονται από δυστροφικούς νευρίτες

17 (dystrophic neuritis), ενεργοποιημένα αστροκύτταρα (reactive astrocytes) και μικρογλοία (microglia), ενώ τα δεμάτια είναι ενδοκυτταρικά συσσωματώματα (intracellular aggregates) που αποτελούνται από την υπερφωσφορυλιωμένη μορφή της σχετιζόμενης με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνης tau (microtubule-associated protein tau). (11) νευριτικές πλάκες νευροϊνιδιακά δεμάτια Εικόνα 1. Νευριτικές πλάκες και νευροϊνιδιακά δεμάτια στο φλοιό του εγκεφάλου ασθενή με τη νόσο Alzheimer. [11] Το β αμυλοειδές πεπτίδιο (Αβ). Η εύρεση ενός συσχετισμού μεταξύ του αριθμού των πλακών και της σοβαρότητας της άνοιας στους ασθενείς εστίασε το ενδιαφέρων των ερευνητών στη συμμετοχή των πλακών στην παθογένεση της νόσου. (11) Λόγω του ότι οι πλάκες είναι αδιάλυτες, οι προσπάθειες να προσδιοριστεί η πρωτεϊνική σύστασή τους ήταν άκαρπες μέχρι τα μέσα της δεκαετίας του (11) Τότε για πρώτη φορά οι ερευνητές πέτυχαν να απομονώσουν τον πυρήνα των πλακών και να προσδιορίσουν την αμινοξική αλληλουχία του υδρόφοβου β αμυλοειδούς πεπτιδίου (Aβ), που αποτελεί το

18 κυριότερο συστατικό τους. (50, 101) Το εύρημα αυτό άνοιξε το δρόμο για τη μοριακή κλωνοποίηση του γονιδίου της πρόδρομης πρωτεΐνης του APP. (75) Αρχικά, το Aβ που βρέθηκε στις πλάκες θεωρήθηκε ότι ήταν μια ανώμαλη πρωτεΐνη. (11) Επομένως, ένα πολύ σημαντικό εύρημα ήταν ότι το Aβ παράγεται κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού μεταβολισμού των κυττάρων. (61) Μετά από αυτό το εύρημα άρχισε η αναζήτηση των δύο ενζύμων που αποκόπτουν το Aβ από την APP και ονομάστηκαν β- και γ-εκκριτάση (β- και γ-secretase). (44) Από το κόψιμο της APP από αυτές τις δύο πρωτεάσες προκύπτει το Aβ40, που είναι αφθονότερο και μια ελαφρώς μακρύτερη μορφή, το Aβ42, που παράγεται σε ποσοστό περίπου 10% του συνολικού Αβ στο φυσιολογικό εγκέφαλο. (13, 44, 73, 92) Το διαλυτό Aβ42 θεωρείται ότι υποβάλλεται σε μια αλλαγή στη διαμόρφωσή του σε β-πτυχωτή επιφάνεια και έτσι καθίσταται επιρρεπές στη συσσωμάτωση σε διαλυτά ολιγομερή (oligomers) και μεγαλύτερα αδιάλυτα ινίδια που τελικά σχηματίζουν τις αμυλοειδείς πλάκες. (73) Σε αυτήν την διαδικασία, το ινιδογενές (fibrillogenic) Aβ42 προκαλεί το λανθασμένο δίπλωμα και των άλλων ειδών Aβ. (73) Αρχικά, πιστευόταν ότι μόνο το Aβ στις πλάκες είναι νευροτοξικό, αλλά διάφορα ευρήματα προτείνουν ότι τα διαλυτά ολιγομερή του Aβ μπορεί να είναι οι ένοχοι για την εμφάνιση της νόσου, διαταράσσοντας τη συναπτική πλαστικότητα. (151) Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, το Aβ στον εγκέφαλο αποικοδομείται από τις πεπτιδάσες ένζυμο αποικοδόμησης της ινσουλίνης (insulin-degrading enzyme) και νεπρελυσίνη (neprilysin), και τη μεταλλοπρωτεάση ένζυμο μετατροπής της ενδοθηλίνης (endothelin converting enzyme). (19) Το Aβ απομακρύνεται επίσης από τον εγκέφαλο μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού με μια διαδικασία που ισορροπείται από την εκροή του, μεσολαβούμενη από την πρωτεΐνη σχετιζόμενη με τον υποδοχέα της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (low-density lipoprotein receptor-related protein), και την εισροή του, μεσολαβούμενη από τον υποδοχέα για τα τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (receptor for advanced glycation end products). (145) Δεν υπάρχουν όμως στοιχεία για οποιεσδήποτε διαταραχές σε αυτά τα πρωτεολυτικά ένζυμα ή τους μηχανισμούς μεταφοράς στη νόσο. (11)

19 Παθογένεση της νόσου. Η κεντρική υπόθεση για την παθογένεση της νόσου του Alzheimer είναι η υπόθεση του καταρράκτη του αμυλοειδούς, σύμφωνα με την οποία μια ανισσοροπία μεταξύ της παραγωγής και της εκκαθάρισης του Aβ στον εγκέφαλο είναι το εναρκτήριο γεγονός που οδηγεί στη συσσώρευσή του και τελικά στο νευρωνικό εκφυλισμό και την άνοια. (58) Συγκεκριμένα στην οικογενή μορφή της νόσου οι μεταλλαγές στα γονίδια της APP ή της Presenilin προκαλούν τη χρόνια αύξηση της παραγωγής του Aβ42. (59) Στη σποραδική μορφή η γήρανση σε συνδυασμό με περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες κινδύνου όπως το αλληλόμορφο ε4 της ApoE και πιθανόν άλλα γονίδια οδηγούν σε αποτυχία της απομάκρυνσης του Aβ42 με αποτέλεσμα τα επίπεδά του να αυξάνονται βαθμιαία στον εγκέφαλο. (59) Η συσσώρευση του Aβ42 και στις δύο περιπτώσεις οδηγεί στον ολιγομερισμό του και τα ολιγομερή προκαλούν βλάβες στις συνάψεις. (59) Η βαθμιαία εναπόθεση των ολιγομερών του Aβ42 σε διάχυτες πλάκες οδηγεί σε φλεγμονώδη απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος του εγκεφάλου συνοδευόμενη από ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων και των αστροκυττάρων. (59) Τελικά η νευρωνική ιοντική ομοιόσταση αλλάζει, προκαλείται οξειδωτικό στρες ενώ τροποποιείται και η λειτουργία κινασών και φωσφατασών οδηγώντας σε υπερφωσφορυλίωση της πρωτεΐνης tau και σχηματισμό των δεματίων. (59) Τα φαινόμενα αυτά επιφέρουν νευρωνική δυσλειτουργία και αλλοίωση της συναπτικής μεταβίβασης που εμφανίζεται κλινικά ως άνοια. (59) Η υπόθεση του καταρράκτη του αμυλοειδούς υποστηρίζεται από το γεγονός ότι οι μεταλλάξεις που προκαλούν την οικογενή πρώιμη μορφή της νόσου συμβαίνουν είτε στο υπόστρωμα (στην APP) είτε στα βασικά ένζυμα (στην PS1 και PS2) που εμπλέκονται στην παραγωγή του Αβ. (11, 72) Μάλιστα οι περισσότερες μεταλλάξεις στην APP συγκεντρώνονται γύρω από την περιοχή όπου κόβουν οι εκκριτάσες α, β και γ. (11, 72) Επιπλέον οι μεταλλαγές στην APP και τις Presenilins αυξάνουν την παραγωγή ή και τη συσσώρευση του Aβ42. (11, 72) Είναι επίσης γνωστό ότι οι ασθενείς με σύνδρομο Down, που προκαλείται από τρισωμία του χρωμοσώματος 21, το οποίο περιέχει το γονίδιο της APP, αναπτύσσουν πολύ νωρίς παθολογία παρόμοια με της νόσου του Alzheimer. (98) Τέλος, πρόσφατα βρέθηκε ένα διπλασιασμός της χρωμοσωματικής περιοχής που περιλαμβάνει το γονίδιο της APP σε κάποιες οικογένειες με την οικογενή μορφή της νόσου. (118)

20 2. Η ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΥ Β ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΥΣ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ (Αβ) 2.1. Η πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (APP) Η οικογένεια της APP. Η πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (amyloid precursor protein, APP) ανήκει σε μια συντηρημένη οικογένεια γονιδίων που περιλαμβάνει ακόμα τις APP-like protein-1 και -2 (APLP1 και APLP2) στα θηλαστικά, και τις APP-like proteins APPL στη Drosophila melanogaster και APL-1 στον Caenorhabditis elegans. (31, 117, 152, 153) Όλα τα μέλη της οικογένειας της APP είναι τύπου 1 διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, με μια διαμεμβρανική επικράτεια που διαπερνά μια φορά τη μεμβράνη, μια μεγάλη εξωκυττάρια αμινοτελική περιοχή και μια μικρότερη κυτταροπλασματική καρβοξυτελική περιοχή. (36, 75) Η APP είναι το καλύτερα μελετημένο μέλος της οικογένειας λόγω του ρόλου της νόσο του Alzheimer. (72) Λειτουργία της APP. Υπάρχουν τρεις σημαντικές ισομορφές διαφορετικού μήκους της APP στα θηλαστικά: η APP695, η APP751, και η APP770. (72) Η APP εκφράζεται παντού στον οργανισμό (ubiquitously), με την κάθε ισομορφή να παρουσιάζει προτίμηση σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. (72) Για παράδειγμα, η ισομορφή μήκους 695 αμινοξέων, βρίσκεται κυρίως σε κύτταρα νευρωνικής προέλευσης. (72) Όμως η ακριβής βιολογική λειτουργία της APP και των ομολόγων της δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστή. (72) Όταν η APP κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά, εικαζόταν ότι θα μπορούσε να λειτουργεί ως υποδοχέας. (72) Αυτή η θεωρία έχει τεκμηριωθεί περαιτέρω από μελέτες που δείχνουν ότι η APP και τα ομόλογά της δεσμεύουν και εξωκυττάριους συνδέτες (ligands) και ενδοκυττάριες πρωτεΐνες διασύνδεσης (adaptor proteins). (72) Παρ όλα αυτά, υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι η APP μπορεί να λειτουργεί ως υποδοχέας αλλά και ως συνδέτης. (72) Διάφορες in vitro και in vivo μελέτες έχουν δώσει ισχυρές ενδείξεις για τους ρόλους της APP στο αναπτυσσόμενο και ενήλικο νευρικό σύστημα, στην κυτταρική προσκόλληση, τη νευρωνική επιβίωση και απόπτωση, τη νευριτική έκφυση, τη συναπτογένεση, την κυστιδιακή αξονική

21 μεταφορά, τη νευρωνική μετανάστευση, τη διαμόρφωση της συναπτικής πλαστικότητας, και την ομοιόσταση της ινσουλίνης και της γλυκόζης. (72) 2.2. Πρωτεολυτική επεξεργασία της APP Ρυθμιζόμενη Ενδομεμβρανική Πρωτεόλυση. Η έρευνα πάνω στα μέλη της οικογένειας της APP και στην ίδια την APP έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη της έννοιας της πρεσενιλινο-εξαρτώμενης ρυθμιζόμενης ενδομεμβρανικής πρωτεόλυσης (regulated intramembrane proteolysis, RIP). (72) Οι πρωτεΐνες της οικογένειας της APP υποβάλλονται σε RIP, παράγοντας εκκρινόμενα και κυτταροπλασματικά τμήματα στα οποία έχουν αποδοθεί διαφορετικές λειτουργίες. (72) Κατά τη διαδικασία αυτή, μια μεμβρανική πρωτεΐνη, που διαπερνά μια φορά τη μεμβράνη, (single span membrane protein) χαρακτηριστικά υποβάλλεται σε δύο διαδοχικά κοψίματα (βλ. Εικόνα 2). (92) Το πρώτο γίνεται στην εξωτερική επικράτεια (ectodomain, ED) της πρωτεΐνης, σε έναν πεπτιδικό δεσμό κοντά στη διαμεμβρανική επικράτειά της (transmembrane domain, TDM). (92) Αυτό οδηγεί στην αποκοπή της εξωτερικής επικράτειας (ectodomain shedding), την απελευθέρωσή της στο εσωτερικό ενός κυστιδίου ή στον εξωκυττάριο χώρο και στη δημιουργία ενός συνδεδεμένου στη μεμβράνη στελέχους (membrane-bound stub). (92) Το δεύτερο κόψιμο γίνεται μέσα στη διαμεμβρανική επικράτεια (transmembrane domain, TDM) του στελέχους αυτού, με συνέπεια την έκκριση ενός μικρού πεπτιδίου στο εσωτερικό ενός κυστιδίου ή στον εξωκυττάριο χώρο και την απελευθέρωση της ενδοκυττάριας επικράτειάς του (intracellular domain, ICD) μέσα στο κυτταρόπλασμα. (92) Τα θραύσματα (fragments) του πρωτεολυτικού κοψίματος δρουν ως σηματοδοτικά μόρια πολλαπλών λειτουργιών, που μια από αυτές μπορεί να είναι και η μεταγραφική ενεργοποίηση ή αποικοδομούνται. (92)

22 εξωτερική επικράτεια αποκοπή της εξωτερικής επικράτειας ενδομεμβρανική πρωτεόλυση Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της ρυθμιζόμενης ενδομεμβρανικής πρωτεόλυσης (RIP) σε ένα γενικό μοντέλο (αριστερά) και για την APP (δεξιά) (η μεμβράνη παριστάνεται ως γκρίζο ορθογώνιο). Αριστερά: Μια μεμβρανική πρωτεΐνη υποβάλλεται σε δύο διαδοχικά πρωτεολυτικά κοψίματα από δύο διαφορετικές πρωτεάσες (παρουσιάζονται με μπλε). Δεξιά: Η APP κόβεται πρωτεολυτικά από την α-, τη β- και τη γ-εκκριτάση σε δύο ανταγωνιστικά μονοπάτια RIP. [92] Τα μονοπάτια επεξεργασίας της APP. Η πρωτεολυτική επεξεργασία της APP μπορεί να διαιρεθεί σε δύο διαφορετικά μονοπάτια, το αμυλοειδογενές μονοπάτι (amyloidogenic pathway), που οδηγεί στην παραγωγή του Αβ, και το μη αμυλοειδογενές μονοπάτι (non-amyloidogenic pathway), που την αποτρέπει. (72, 92) Και τα δύο μονοπάτια περιλαμβάνουν τουλάχιστον τρία διαδοχικά κοψίματα (βλ. Εικόνα 3). (72) Το αμυλοειδογενές μονοπάτι επεξεργασίας της APP αρχίζει μέσω κοψίματος από τη β-εκκριτάση (β-secretase) στο αμινοτελικό άκρο της επικράτειας του Αβ, και οδηγεί στην έκκριση της μεγάλης αμινοτελικής εξωτερικής επικράτειας (N-terminal ectodomain) της APP, sappβ (soluble APPβ). (72, 92) Η βεκκριτάση έχει ταυτοποιηθεί ως μια ασπάρτυλο-πρωτεάση (aspartyl protease), η BACE1 (β-site APP cleaving enzyme 1). (92) Το υπόλοιπο καρβοξυτελικό τμήμα (Cterminal fragment, CTF) μήκους 99 αμινοξέων (C99) μπορεί να κοπεί περαιτέρω από τη γ-εκκριτάση (γ-secretase), μέσα στη διαμεμβρανική του επικράτεια (transmembrane domain), προκαλώντας την απελευθέρωση του Αβ και της ενδοκυττάριας επικράτειας της APP, AICD (APP intracellular domain). (72, 92) Το AICD πιθανόν μεταφέρεται στον πυρήνα όπου μπορεί να λειτουργεί ως μεταγραφικός παράγοντας, αν και τα αποτελέσματα των μελετών που υπάρχουν είναι αντιφατικά. (15, 16, 63) Στο μη αμυλοειδογενές μονοπάτι, η παραγωγή του Αβ αποκλείεται δεδομένου ότι η APP κόβεται αρχικά από την α-εκκριτάση (α- 21 -

23 secretase) μέσα στην επικράτεια του Αβ, κοντά στην εξωκυττάρια πλευρά της πλασματικής μεμβράνης. (41, 132) Πρόσφατα η α-εκκριτάση ταυτοποιήθηκε οριστικά ως μια μεταλλοπρωτεϊνάση του ψευδαργύρου (zinc metalloproteinase), η ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10), γεγονός που έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που έδειχναν ότι η ADAM10 μπορεί να λειτουργήσει όπως η α-εκκριτάση. (74, 81, 83, 114) Το κόψιμο της APP από την α-εκκριτάση απελευθερώνει τη μεγάλη αμινοτελική εξωτερική επικράτεια (N-terminal ectodomain) της APP, sappα (soluble APPα) από την κυτταρική επιφάνεια αφήνοντας ένα καρβοξυτελικό τμήμα (C-terminal fragment, CTF) μήκους 83 αμινοξέων (C83) δεσμευμένο στη μεμβράνη. (72) Αυτό το τμήμα μπορεί να κοπεί περαιτέρω από τη γ-εκκριτάση (γ-secretase) με παρόμοιο τρόπο όπως στο αμυλοειδογενές μονοπάτι, δίνοντας στον εξωκυττάριο χώρο το μικρό πεπτίδιο p3, που δε συμβάλει στην παθογένεση της νόσου και την ενδοκυττάρια επικράτεια της APP, AICD, στο κυτταρόπλασμα. (35, 72) εξωκυττάριος χώρος α-εκκριτάση κυτταρόπλασμα β-εκκριτάση γ-εκκριτάση γ-εκκριτάση Εικόνα 3. Σχηματική απεικόνιση της επεξεργασίας της APP όπου αριστερά φαίνεται το μη αμυλοειδογενές και δεξιά το αμυλοειδογενές μονοπάτι. Το κυριότερο κόψιμο της APP στην

24 εξωτερική επικράτειά της συμβαίνει στην α και τη β-θέση, από την α- και τη β-εκκριτάση αντίστοιχα, με συνέπεια την απελευθέρωση του sappα ή sappβ. Τα εναπομείναντα δεσμευμένα στη μεμβράνη τμήματα, CTFα (C83) και CTFβ (C99), κόβονται στη συνέχεια στη διαμεμβρανική περιοχή τους από τη γ-εκκριτάση, απελευθερώνοντας το AICD και το p3 ή το Αβ. [96] 2.3. Το σύμπλοκο της γ-εκκριτάσης Σύσταση του συμπλόκου. Η γ-εκκριτάση είναι μια πρωτεάση με χαμηλή ειδικότητα αλληλουχίας που κόβει το υπόστρωμά της μέσα στη διαμεμβρανική του επικράτεια. (72) Στην πραγματικότητα είναι ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από τέσσερεις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες: την καταλυτική υπομονάδα Presenilin (PS) και τρεις άλλες, τη Nicastrin (NCT), την Anterior pharyx defective-1 (Aph-1), και την Presenilin enhancer-2 (Pen-2) (βλ. Εικόνα 4). (17, 40, 42, 43, 48, 54, 77, 78, 87, 90, 91, 124, 125, 136, 137, 144, 146, 156, 162, 163) Αυτές οι τέσσερις πρωτεΐνες είναι απαραίτητες και επαρκείς για την ανασυγκρότηση της δραστηριότητας της γ-εκκριτάσης. (40) Η στοιχειομετρία των υπομονάδων στο σύμπλοκο έχει προσδιοριστεί ότι είναι 1: 1: 1: 1. (121) Τα κύτταρα των θηλαστικών περιέχουν δύο ομόλογα της PS (PS1 και PS2) καθώς επίσης και της Aph-1 (Aph-1a και Aph-1b). (48) Επίσης η Aph-1a δίνει μια μικρή και μια μεγάλη παραλλαγή, την Aph-1aS και Aph-1aL αντίστοιχα, λόγω εναλλακτικού ματίσματος. (87) Έτσι στον άνθρωπο, ανάλογα με τη σχετική έκφραση των μεμονωμένων υπομονάδων, μπορούν να υπάρξουν μέχρι και έξι διαφορετικά σύμπλοκα της γ-εκκριτάσης. (130, 131) Εάν αυτά διαφέρουν στις πρωτεολυτικές τους ιδιότητες και ειδικά στην ικανότητά τους να παραγάγουν Aβ42 είναι ακόμα αμφιλεγόμενο. (126, 131) Η Presenilin. Η PS είναι μια πρωτεΐνη με εννέα διαμεβρανικές επικράτειες, που κόβεται με αυτοπρωτεόλυση στη μεγάλη κυτταροπλασματική θηλιά της σε δύο τμήματα, το αμινοτελικό (N-terminal fragment, NTF) και το καρβοξυτελικό (Cterminal fragment, CTF). (65, 85, 109, 110, 135) Είναι μια ασπάρτυλο-πρωτεάση (aspartyl protease) και θεωρείται ότι αποτελεί το ενεργό κέντρο του ενζύμου. (156, 162) Δύο ιδιαίτερα συντηρημένα κατάλοιπα ασπαρτικού (το Asp257 και το Asp385 στην ανθρώπινη PS1) στις διαμεμβρανικές επικράτειες 6 και 7 (TM6 και TM7)

25 αποτελούν τον πυρήνα του καταλυτικού κέντρου, που σχηματίζει έναν υδρόφοβο πόρο στο εσωτερικό της μεμβράνης. (120, 147, 156) Η Nicastrin. Η Nicastrin, η μεγαλύτερη υπομονάδα του συμπλόκου, είναι μια τύπου Ι διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, 709 αμινοξικών καταλοίπων στον άνθρωπο, που διασχίζει μια φορά τη μεμβράνη. (160, 163) Έχει μια μικρή υδρόφιλη κυτταροπλασματική καρβοξυτελική επικράτεια, μια διαμεμβρανική επικράτεια και μια μεγάλη, υδρόφιλη και εκτενώς γλυκοζυλιωμένη εξωκυττάρια αμινοτελική επικράτεια. (163) Η Nicastrin συντίθεται στους νευρώνες αρχικά ως μια πρόδρομη πρωτεΐνη, η οποία γρήγορα γλυκοζυλιώνεται μερικώς στο ενδοπλασματικό δίκτυο δίνοντας την ανώριμη μορφή της (immature Nicastrin, imnct). (66, 122) Αυτή στη συνέχεια τροποποιείται με πολλαπλή γλυκοζυλίωση (complex glycosylation) και σιαλυλίωση (sialylation) στο σύμπλεγμα trans-golgi, καταλήγοντας στην ώριμη μορφή της (mature Nicastrin, mnct). (66) Η Nicastrin είναι σημαντική για τη συγκρότηση, ωρίμανση και σταθεροποίηση του συμπλόκου και έχει προταθεί ότι λειτουργεί ως υποδοχέας των υποστρωμάτων της γ-εκκριτάσης. (72) Η Aph-1 και η Pen-2. Οι λειτουργίες της Aph-1, μιας πρωτεΐνης που διασχίζει τη μεμβράνη επτά φορές, και της Pen2, της μικρότερης υπομονάδας του συμπλόκου, που διασχίζει τη μεμβράνη δύο φορές, δεν είναι ακόμα πλήρως αντιληπτές. (28, 46, 72) Η Aph-1 παίζει σημαντικό ρόλο στη συγκρότηση και σταθεροποίηση του συμπλόκου λειτουργώντας ως σκαλωσιά κατά τη μετακίνησή του στα μεμβρανικά κυτταρικά διαμερίσματα, ενώ η Pen-2 σταθεροποιεί το τελικό σύμπλοκο και εμπλέκεται στην ενδοπρωτεόλυση της Presenilin, κατά την ωρίμανση του συμπλόκου. (106, 115, 144, 149, 155)

26 Εικόνα 4. Σχηματική αναπαράσταση της γ-εκκριτάσης. Η γ-εκκριτάση είναι ένα μεμβρανικό πρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από την καταλυτική υπομονάδα Presenilin (PS) και τρεις άλλες μεμβρανικές πρωτεΐνες, τη Nicastrin (NCT), την Aph-1 και την Pen-2. Οι διαμεμβρανικές επικράτειες 6 και 7 της PS, που περιέχουν τα κατάλοιπα ασπαρτικού του ενεργού κέντρου (D) επισημαίνονται με πράσινο. Στο κάτω πλαίσιο παριστάνεται η διάταξη των υπομονάδων του συμπλόκου όπως φαίνεται πάνω στη μεμβράνη. [92] Σταδιακό κόψιμο του APP από τη γ-εκκριτάση. Το καρβοξυτελικό τμήμα που απελευθερώνεται μετά το κόψιμο του C99 από τη γ-εκκριτάση είναι αναμενόμενο να έχει μήκος 59 αμινοξέων, εφόσον το Αβ αποτελείται από 40 αμινοξέα. (72) Αντ αυτού ως AICD έχει αναγνωριστεί ένα τμήμα μήκους 50 αμινοξέων και έτσι προτάθηκε ότι η παραγωγή του Αβ είναι αποτέλεσμα τριών κοψιμάτων από τη γ-εκκριτάση (βλ. Εικόνα 5). (72, 119) Αυτό που συμβαίνει είναι ένα σταδιακό κόψιμο του C99 (CTFβ) έως ότου η διαμεμβρανική επικράτειά του είναι αρκετά μικρή προκειμένου να απαλλαγεί η μεμβράνη από αυτό. (92) Πρώτα κόβεται στην ε-θέση στο δεσμό Leu646-Val647, κοντά στην κυτταροπλασματική πλευρά της μεμβράνης, και απελευθερώνεται το AICD στο κυτταρόπλασμα. (56, 119, 154, 161) Ακολουθεί κόψιμο του προκύπτοντος συγκρατούμενου στη μεμβράνη πεπτιδίου 49 αμινοξέων στη ζ-θέση μεταξύ Val643 και Ile644, για να παραχθεί ένα πεπτίδιο μήκους 46 αμινοξέων που κόβεται στις πολλαπλές γ-θέσεις, δίνοντας διαφορετικά Αβ μήκους 37 έως 43 αμινοξέων. (92, 116, 165, 167) Τα τρία αυτά κοψίματα στις θέσεις ε, ζ και γ είναι ετερογενή και έτσι οδηγούν στην παραγωγή δύο διακριτών σειρών προϊόντων. (116, 143) Η σημαντικότερη σειρά είναι: αρχικά ένα διαμεμβρανικό πεπτίδιο 49 αμινοξέων, στη συνέχεια ένα διαμεμβρανικό πεπτίδιο 46 αμινοξέων και τέλος παραγωγή των Aβ43 ή Aβ40 ή Aβ37,

27 από τα οποία το Aβ40 είναι το κυριότερο. (116) Η δευτερεύουσα σειρά είναι: αρχικά ένα διαμεμβρανικό πεπτίδιο 48 αμινοξέων, στη συνέχεια ένα διαμεμβρανικό πεπτίδιο 45 αμινοξέων και τέλος παραγωγή των Αβ42 ή Aβ38, σε συγκρίσιμες ποσότητες. (116) Εικόνα 5. Κόψιμο της APP από τη γ-εκκριτάση. Οι θέσεις κοψίματος στη διαμεμβρανική περιοχή του καρβοξυτελικού τμήματος της APP (CTFβ) απεικονίζονται με έντονα και λεπτά κάθετα βέλη (κύριες και δευτερεύουσες θέσεις αντίστοιχα). Τα οριζόντια βέλη δείχνουν την κατεύθυνση του κοψίματος για την κύρια σειρά παραγωγής (ε49-γ37), που δίνει το Αβ40 (έντονο βέλος), και τη δευτερεύουσα (ε48-γ38), που δίνει το Aβ42 (λεπτό βέλος). [92]

28 3. ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ορισμός. Διαγονιδιακή είναι η τεχνολογία κατά την οποία μη ενδογενές DNA (από το ίδιο είδος, από διαφορετικό είδος ή τεχνητό γενετικό υλικό) εισάγεται μέσω ειδικών φορέων, στο γονιδίωμα ενός οργανισμού ή το ενδογενές DNA ενός οργανισμού τροποποιείται με κατάλληλες τεχνικές. Η διαγονιδιακή τεχνολογία μπορεί να εφαρμοστεί εν δυνάμει σε όλα τα έμβια συστήματα, με διαφορετικές προσεγγίσεις και διαφορετική αποτελεσματικότητα. Στη Βιολογική έρευνα η διαγονιδιακή τεχνολογία εφαρμόζεται ως επί το πλείστον σε ζώα και μάλιστα σε ποντίκια. Πέρα από τους πρακτικούς λόγους (μικρά ζώα με εύκολη αναπαραγωγή), τα ποντίκια είναι ανώτερα θηλαστικά με μεγάλο ποσοστό των γονιδίων τους κοινών με αυτά του ανθρώπου, συνεπώς αποτελούν το ιδανικότερο σύστημα για την προτυποποίηση ανθρώπινων ασθενειών Διαγονιδιακά ζώα Η παραγωγή διαγονιδιακών (transgenic) ποντικών προϋποθέτει την εισαγωγή και ενσωμάτωση εξωγενούς DNA στο γονιδίωμά τους μέσω μικροένεσης DNA σε γονιμοποιημένα ωάρια. (6) Τέτοιου είδους συστήματα επιτρέπουν την in vivo μελέτη των εισαγόμενων γονιδίων σε όλους τους τύπους κυττάρων και σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του οργανισμού. (6, 51) Μέθοδος παραγωγής διαγονιδιακών ποντικών. Το ωάριο του ποντικού, αμέσως μετά τη γονιμοποίηση και για μικρό χρονικό διάστημα, έχει δύο πυρήνες, που ονομάζονται προπυρήνες, πριν αυτοί συντηκούν. (6) Ο πυρήνας που προέρχεται από το σπερματοζωάριο είναι μεγαλύτερος από τον πυρήνα του ωαρίου. (6) Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η ένεση κλωνοποιημένου DNA, που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο, στον πυρήνα που προέρχεται από το σπερματοζωάριο (αρσενικός προπυρήνας). (6, 133) Σε αυτή την απαιτητική τεχνική, τα γονιμοποιημένα ωάρια του ποντικού κρατούνται υπό αναρρόφηση στην άκρη μιας πιπέτας και το διαγονίδιο μικροεγχύεται στον προπυρήνα με μια λεπτή

29 βελόνα. (51) Το διαγονίδιο ενσωματώνεται στο χρωμοσωμικό DNA του προπυρήνα και μεταβιβάζεται στα θυγατρικά κύτταρα των ζυγωτών που επιβιώνουν της διαδικασίας. (51) Στη συνέχεια τα έμβρυα καλλιεργούνται in vitro μέχρι το στάδιο του μοριδίου ή του βλαστιδίου και εισάγονται στον ωαγωγό μιας ψευδοεγκύου μητέρας δέκτη. (6, 51) Τα ψευδοέγκυα θηλυκά ποντίκια αποκτώνται με το ζευγάρωμά τους με στείρα αρσενικά. (51) Στην πράξη το 10-30% των ζώων που αναπτύσσονται από αυτά τα έμβρυα περιέχουν αντίγραφα του εξωγενούς DNA. (6) Τα υποψήφια διαγονιδιακά ζώα που γεννιούνται ελέγχονται για να διαπιστωθεί το κατά πόσο φέρουν το διαγονίδιο με στύπωμα κατά Southern (Southern blot) και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). (133) Στα διαγονιδιακά ποντίκια το ξένο DNA βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα του ζώου, και στα σωματικά και στα γεννητικά, και μεταβιβάζεται από γενιά σε γενιά. (6) Τα ζώα αυτά διασταυρώνονται με ποντίκια αγρίου τύπου (wild type) για να γίνει εδραίωση του διαγονιδιακού στελέχους και στις διασταυρώσεις που γίνονται για το σκοπό αυτό, το διαγονίδιο συμπεριφέρεται συνήθως ως ένα απλό επικρατές γονίδιο. (133) Τα διαγονιδιακά στελέχη είναι συνήθως ετερόζυγα ως προς το διαγονίδιο, εάν όμως θεωρηθεί σκόπιμο, είναι δυνατόν να πραγματοποιηθούν διασταυρώσεις μεταξύ των ετερόζυγων ζώων, ώστε στους απογόνους να βρεθεί το διαγονίδιο σε ομοζυγωτία. (133) Μειονεκτήματα της μεθόδου. Η ενσωμάτωσή του ξένου DNA σε ένα από τα χρωμοσώματα του ξενιστή είναι σταθερή και συμβαίνει σε πολύ αρχικό στάδιο της ανάπτυξης της εμβρύου, πριν γίνει διαίρεση και διαφοροποίηση των κυττάρων. (6) Όμως ο μηχανισμός ενσωμάτωσης του ξένου DNA δεν είναι απόλυτα γνωστός, η θέση ενσωμάτωσης είναι τυχαία και συνήθως εισάγονται σε αυτήν περισσότερα από ένα αντίγραφα με κοινό προσανατολισμό. (6, 133) Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ποικίλλουν, αλλά σε γενικές γραμμές παρατηρούνται υψηλότερα επίπεδα όταν ενίεται γραμμικό DNA χωρίς πλασμιδιακές αλληλουχίες, οι οποίες, όπως έχει δειχτεί, παρεμποδίζουν την έκφραση των διαγονιδίων και όταν το διαγονίδιο περιέχει εσόνια. (133)

30 Ρύθμιση της έκφρασης του διαγονιδίου. Τα γονίδια που εισάγονται συνοδεύονται και από τις κατάλληλες ρυθμιστικές αλληλουχίες. (113) Ορισμένες φορές απαιτείται ομοιόμορφη έκφραση του υπό μελέτη γονιδίου σε ολόκληρο τον οργανισμό, κάτι που επιτυγχάνεται με τη χρήση υποκινητών γονιδίων κυτταρικής οικονομίας (housekeeping genes) όπως είναι το γονίδιο που κωδικοποιεί την ακτίνη β ή την ιστόνη H4. (113) Σε άλλες περιπτώσεις απαιτείται ένας υποκινητής ειδικός για ένα συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο ή τμήμα του οργανισμού προκειμένου να καθοδηγήσει την έκφραση του υπό μελέτη γονιδίου σε συγκεκριμένη χρονική περίοδο ή στάδιο ανάπτυξης ή σε συγκεκριμένο ιστό ή όργανο του ζώου. (113) Ο υποκινητής του γονιδίου της ινσουλίνης για παράδειγμα επάγει τη μεταγραφή ενός διαγονιδίου μόνο στα κύτταρα του παγκρέατος. (51) 3.2. Γονιδιακά στοχευμένα ζώα Η πρόκληση συγκεκριμένων μετατροπών σε γονίδια του ποντικού στη φυσιολογική τους θέση ονομάζεται γονιδιακή στόχευση με ομόλογο ανασυνδυασμό (gene targeting by homologous recombination). (6) Επιτυγχάνεται με ανασυνδυασμό ανάμεσα στο εισαγόμενο εξωγενές DNA και στην ομόλογη περιοχή του, στο γονιδίωμα ενός εμβρυϊκού βλαστοκυττάρου (embryonic stem cells, ES cells). (6, 113) Η τεχνική αυτή δημιουργίας διαγονιδιακών ποντικών με αντικατάσταση γονιδίων επιτρέπει την επιλεκτική και στοχευμένη αδρανοποίηση (knock-out) ενός ενδογενούς γονιδίου, εφόσον αυτό αντικαθίσταται με ένα μη λειτουργικό αλληλόμορφο. (6, 113) Η στοχευμένη αδρανοποίηση ενός γονιδίου πραγματοποιείται με την προσδοκία ότι ο φαινότυπος του μεταλλάγματος θα αποκαλύψει τη λειτουργία του. (113) Η ίδια μέθοδος χρησιμοποιείται όχι μόνο για την αδρανοποίηση ενός γονιδίου αλλά και για την αντικατάστασή του από μια παραλλαγή του που φέρει μια συγκεκριμένη τροποποίηση (knock-in). (113) Πλεονεκτήματα της μεθόδου. Το πλεονέκτημα που παρουσιάζει η μέθοδος της γονιδιακής στόχευσης είναι ότι τα γονίδια τροποποιούνται στο φυσικό χρωμοσωματικό τους περιβάλλον ενώ με τη συμβατική μέθοδο εισαγωγής DNA σε γεννητικά κύτταρα δεν ελέγχεται η θέση ενσωμάτωσης και ο αριθμός των

31 εισαγόμενων αντιγράφων, γεγονός που περιπλέκει την εξήγηση των αποτελεσμάτων μελέτης των ζώων που προκύπτουν. (6) Με τη γονιδιακή στόχευση η θέση ένθεσης είναι συγκεκριμένη, επομένως στα πειραματικά αποτελέσματα δεν αναμένονται επιπτώσεις που να οφείλονται σε αυτή και στα ρυθμιστικά στοιχεία που μπορεί να περιέχει (position effects). (113) Διαδικασία δημιουργίας γονιδιακά στοχευμένων ποντικών. Αρχικά γίνονται οι επιθυμητές τροποποιήσεις στην αλληλουχία μιας κλωνοποιημένης γενετικής θέσης. (6) Το τροποποιημένο DNA εισάγεται σε πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα με ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) ή επιμόλυνση (transfection) και σε κάποια από αυτά ενσωματώνεται στη σωστή θέση με ομόλογο ανασυνδυασμό. (6, 113) Τα κύτταρα που έχουν υποστεί ομόλογο ανασυνδυασμό επιλέγονται και πολλαπλασιάζονται κλωνικά σε καλλιέργεια. (51) Τα κύτταρα αυτά, που περιέχουν ένα τροποποιημένο αλληλόμορφο του γονιδίου που μελετάται, είναι δηλαδή ετερόζυγα ως προς τη συγκεκριμένη μεταλλαγή, εισάγονται με μικροένεση σε έμβρυα ποντικού σταδίου βλαστοκύστης, ηλικίας 4,5 ημερών. (6) Στη συνέχεια τα έμβρυα εμφυτεύονται σε ψευδοέγκυο μητέρα δέκτη. (6) Τα ζώα που γεννιούνται είναι χίμαιρες και περιέχουν ιστούς που προέρχονται από τα εμφυτευμένα πολυδύναμα κύτταρα και ιστούς που προέρχονται από τα πολυδύναμα κύτταρα της βλαστοκύστης του ξενιστή. (6) Το στέλεχος των εμβρύων-δεκτών επιλέγεται ώστε το χρώμα του τριχώματός του να διαφέρει από αυτό του στελέχους από το οποίο έχουν προέλθει τα βλαστοκύτταρα, έτσι τα χιμαιρικά ζώα εντοπίζονται εύκολα. (51, 113) Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές βλαστοκυττάρων προέρχονται από το στέλεχος ποντικού 129, το οποίο έχει χρώμα τριχώματος ανάμεικτο μαύρο-κίτρινο (agouti), και για τις βλαστοκύστεις επιλέγεται ένα στέλεχος με μαύρο χρώμα ή ένα αλφικό στέλεχος. (113) Συνεπώς το διπλό χρώμα τριχώματος των ζώων που προκύπτουν αποτελεί ένδειξη ότι αυτά είναι πράγματι χιμαιρικά. (113) Τα βλαστοκύτταρα που έχουν εισαχθεί μπορεί να συνεισφέρουν στον πληθυσμό των σωματικών αλλά και των γεννητικών κυττάρων της αναπαραγωγικής σειράς του οργανισμού. (6, 113) Όταν τα κύτταρα της αναπαραγωγικής σειράς του ζώου προέρχονται από τα γενετικά τροποποιημένα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα, η γενετική τροποποίηση μπορεί να μεταβιβαστεί στους απογόνους. (51) Τα χιμαιρικά

32 ζώα διασταυρώνονται με ζώα του στελέχους από το οποίο προήλθαν τα έμβρυαδέκτες, για να εντοπιστούν εκείνα στα οποία το τροποποιημένο DNA έχει ενσωματωθεί στα γεννητικά κύτταρα και μπορεί να μεταβιβάζεται. (6) Χιμαιρικά ζώα που το κάθε ένα είναι ετερόζυγο ως προς το τροποποιημένο αλληλόμορφο μπορούν να διασταυρωθούν μεταξύ τους ώστε να παραχθούν ομόζυγα ζώα. (6) Τα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα. Τα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα απομονώνονται από την εσωτερική κυτταρική μάζα (inner cell mass) της βλαστοκύστης του πρώιμου εμβρύου. (6, 51) Μπορούν να διατηρηθούν σε καλλιέργεια, στο κατάλληλο θρεπτικό μέσο, για πολλές γενιές χωρίς να χάνουν την πολυδυναμικότητά τους (pluripotency), ενώ διατηρούνται και για μεγάλο χρονικό διάστημα κατεψυγμένα. (6, 113) Έτσι όταν ενεθούν στο βλαστόκοιλο των εμβρύωνδεκτών, ενσωματώνονται στη βλαστοκύστη και συμμετέχουν στην ανάπτυξη του εμβρύου. (6) Επιλογή βλαστοκυττάρων που έχουν υποστεί ομόλογο ανασυνδυασμό. Η συχνότητα ανασυνδυασμού του εξωγενούς DNA με τις χρωμοσωματικές αλληλουχίες είναι περίπου 1%. (6) Επιπλέον, σε μερικά κύτταρα, έχουμε ανασυνδυασμό του εισαγόμενου DNA με την ομόλογη χρωμοσωμική θέση, αλλά πολύ πιο συχνά έχουμε μη ομόλογο, τυχαίο, ανασυνδυασμό. (6, 51) Έτσι τα κύτταρα στα οποία συνέβει ομόλογος ανασυνδυασμός εντοπίζονται με συνδυασμό θετικής και αρνητικής επιλογής (positive-negative selection) πριν ενεθούν στο ζώο. (6) Θετική επιλογή γίνεται για την ανίχνευση των κυττάρων που έχουν υποστεί οποιοδήποτε ανασυνδυασμό και αρνητική επιλογή για την απομάκρυνση κυττάρων στα οποία συνέβει μη ομόλογος ανασυνδιασμός. (6) Για να γίνει η επιλογή πρέπει το εισαγόμενο κομμάτι DNA να περιέχει, εκτός από τις αλληλουχίες που απαιτούνται για την αντικατάσταση του επιθυμητού γονιδίου, δύο γονίδια επιλογής. (6) Το ένα από αυτά είναι το γονίδιο neor το οποίο προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό νεομυκίνη (neomycin), βρίσκεται εντός της περιοχής ομολογίας, και επιτρέπει θετική επιλογή των κυττάρων στα οποία έχει συμβεί ανασυνδυασμός ομόλογος ή μη. (6) Με προσθήκη νεομυκίνης, επιλέγονται τα κύτταρα αυτά, εφόσον όσα δεν έχουν ενσωματώσει το εξωγενές DNA στο

33 γονιδίωμά τους είναι ευαίσθητα στη νεομυκίνη και επομένως πεθαίνουν. (6, 113) Το δεύτερο γονίδιο επιλογής είναι το γονίδιο κινάσης της θυμιδίνης του ιού του απλού έρπητα (tkhsv), που προσδίδει ευαισθησία στο κυτταροτοξικό νουκλεοτιδικό ανάλογο γανσυκλοβίρη (gancyclovir) και εισάγεται εκτός της περιοχής ομολογίας. (6) Το ιικό γονίδιο tk, σε αντίθεση με το ενδογενές του ποντικού, μπορεί να μετατρέψει τη γανσυκλοβίρη στη μονοφωσφορική της μορφή, που στη συνέχεια τροποποιείται στην τριφωσφορική, η οποία αναστέλλει την αντιγραφή του DNA στα κύτταρα προκαλώντας το θάνατό τους. (6) Έτσι, επιτρέπει την αρνητική επιλογή των κυττάρων στα οποία έχει συμβεί μη ομόλογος ανασυνδυασμός και περιλαμβάνουν το γονίδιο αυτό στην αλληλουχία που έχουν ενσωματώσει, οπότε πεθαίνουν παρουσία γανσυκλοβίρης. (6, 113) Μόνο τα κύτταρα που έχουν υποστεί ομόλογο ανασυνδυασμό μπορούν να επιβιώσουν έπειτα από τη διαδικασία της αρνητικής επιλογής. (6) Ύστερα από τη διαδικασία επιλογής τα κύτταρα που έχουν απομείνει αναπτύσσονται ως μεμονωμένοι κλώνοι και ελέγχονται με στύπωμα κατά Southern (Southern blot) και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), για να εξακριβωθεί αν η γονιδιακή κατασκευή στόχευσης έχει πράγματι εντεθεί στη σωστή θέση και να επιλεγούν οι κλώνοι που θα ενεθούν στα έμβρυα-δέκτες. (113) Υπό συνθήκη γονιδιακή στόχευση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, αυτό που ενδιαφέρει είναι η μελέτη της επίδρασης μεταλλαγών γονιδιακής στόχευσης σε ένα συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο ή σε ένα συγκεκριμένο στάδιο ανάπτυξης. (6) Επειδή τα περισσότερα γονίδια δρουν σε διαφορετικά όργανα και σε διαφορετικούς χρόνους της ζωής του οργανισμού, ένα knock-out ποντίκι ενδέχεται να μην επιβιώνει ή να παρουσιάζει βλάβες σε διάφορους ιστούς πριν φτάσει στο αναπτυξιακό στάδιο που πρόκειται να αναλυθεί. (6) Για να παρακαμφθεί το πρόβλημα αυτό, έχει αναπτυχθεί η τεχνική της υπό συνθήκη απενεργοποίησης γονιδίου (conditional knock-out). (113) Σε ένα σύστημα υπό συνθήκη απενεργοποίησης γονιδίων η επιθυμητή αλλαγή στο γονιδίωμα λαμβάνει χώρα μόνο όταν ικανοποιείται κάποια προϋπόθεση-συνθήκη. (113) Το σύστημα που χρησιμοποιείται συνηθέστερα στις περιπτώσεις αυτές είναι το σύστημα Cre-loxP (Cre-loxP system). (113) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί τις 34bp ειδικές θέσεις ανασυνδυασμού του DNA loxp (loxp sites) και το ένζυμο Cre ρικομπινάση (Cre

34 recombinase) που καταλύει τον ανασυνδυασμό του τμήματος DNA μεταξύ των θέσεων αυτών, απομακρύνοντάς το. (6, 113) Το σύστημα ανασυνδυασμού Cre-loxP υπάρχει στο βακτηριοφάγο P1 αλλά μπορεί να επάγει τον ανασυνδυασμό και όταν εισαχθεί στο γονιδίωμα του ποντικού. (6) Οι αλληλουχίες loxp μπορούν να εισαχθούν δεξιά και αριστερά του γονιδίου που μελετάται ή ενός σημαντικού εξωνίου και αυτή η κατασκευή να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων με ομόλογο ανασυνδυασμό. (6) Εφόσον οι θέσεις loxp δεν βρίσκονται μέσα σε εξώνια δε διακόπτουν την πρωτεϊνική αλληλουχία και έτσι δεν επηρεάζουν τη λειτουργία της. (6) Επίσης κατασκευάζονται διαγονιδιακά ζώα που περιέχουν το γονίδιο της Cre ρικομπινάσης συνδεδεμένο με έναν ιστοειδικό υποκινητή που καθοδηγεί την έκφρασή του. (6, 113) Διασταύρωση αυτών των δύο τύπων ποντικών θα δώσει απογόνους που φέρουν το γονίδιο ενδιαφέροντος με τις θέσεις loxp καθώς και το γονίδιο της Cre ρικομπινάσης. (6) Στα ζώα αυτά ο ανασυνδυασμός μεταξύ των θέσεων loxp, που θα καταστρέψει την αλληλουχία του υπό μελέτη γονιδίου, θα συμβεί μόνο στα κύτταρα εκείνα όπου ο υποκινητής του γονιδίου της Cre ρικομπινάσης είναι ενεργός οπότε παράγεται η πρωτεΐνη αυτή και καταλύει τον ανασυνδυασμό. (6) Με αυτό τον τρόπο πραγματοποιείται στοχευμένη αδρανοποίηση ενός γονιδίου σε ένα μόνο ιστό και έτσι παρακάμπτεται το πρόβλημα της θνησιμότητας. (113) Εφαρμογές διαγονιδιακής τεχνολογίας. Η εφαρμογή των τεχνικών αυτών στα ποντίκια μεταβάλει τη γενετική τους σύσταση με σκοπό να μελετηθεί ο ρόλος ενός συγκεκριμένου γονιδίου. (6) Ζώα που φέρουν συγκεκριμένες μεταλλαγές οι οποίες είναι γνωστό ότι ευθύνονται ή συμμετέχουν σε νοσήματα του ανθρώπου αποτελούν ζωικά μοντέλα (animal models) για τα νοσήματα αυτά. (6, 113) Στα ζώα αυτά γίνεται προσομοίωση των ανθρώπινων ασθενειών και η μελέτη τους βοηθά στην κατανόηση της παθολογίας και των μηχανισμών πρόκλησης της ασθένειας. (6, 113) Επίσης χρησιμοποιούνται για να δοκιμαστούν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις και να διαπιστωθεί η αποτελεσματικότητά τους σε ένα in vivo σύστημα. (113)

35 4. ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕΝΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ 4.1. Ποντίκια CamKIIα icre Τα διαγονιδιακά ποντίκια CamKIIα icre εκφράζουν την icre ρικομπινάση (codon-improved Cre recombinase), σε επιλεγμένες περιοχές του εγκεφάλου, υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου CamKIIα (calcium/calmodulin dependent protein kinase II alpha). (20) Κατασκευή των διαγονιδιακών ποντικών. Η κασέτα που χρησιμοποιήθηκε, περιείχε την icre ρικομπινάση, ένα IRES-eGFP-PolyA και ένα γονίδιο αντοχής στην αμπικιλίνη (ampicillin resistance gene) περιβαλλόμενο από δύο FRT (Flippase Recognition Target) θέσεις με τον ίδιο προσανατολισμό. (20) Μια 5 περιοχή ομολογίας με το γονίδιο CamKIIα 150bp πολλαπλασιάστηκε με PCR και εισήχθηκε μπροστά από την icre ρικομπινάση, αντικαθιστώντας έτσι το ενδογενές κωδικόνιο έναρξης ATG του γονιδίου CamKIIα με το ATG της icre ρικομπινάσης. (20) Μια 3 περιοχή ομολογίας με το γονίδιο CamKIIα, 200bp πολλαπλασιάστηκε επίσης με PCR και εισήχθηκε στο τέλος της γονιδιακής κατασκευής. (20) Η κασέτα αυτή μεταφέρθηκε με ηλεκτροδιάτρηση σε βακτήρια Escherichia coli του στελέχους DH10B που περιείχαν ένα συνθετικό βακτηριακό χρωμόσωμα (bacterial artificial chromosome, BAC) 170kb, με το CamKIIα γονίδιο και το pbad-et πλασμίδιο αντοχής στην τετρακυκλίνη. (20) Με ομόλογο ανασυνδυασμό στην Escherichia coli (homologous recombination in Escherichia coli, ET-recombination) η κασέτα εισήχθηκε στο BAC. (20) Τα σωστά βακτήρια επιλέχθηκαν με αμπικιλίνη και χλωραμφαινικόλη (chloramphenicol). (20) Το τροποποιημένο BAC από τις αποικίες που απέμειναν ελέγχθηκε για την παρουσία του σωστού ανασυνδυασμού με περιοριστικά ένζυμα, Southern blot και αλληλούχιση. (20) Στη συνέχεια εισήχθηκε σε βακτήρια Escherichia coli του στελέχους MM294, που εξέφραζαν τη ρικομπινάση FLP (flippase recombinase), η οποία αναγνωρίζει τις θέσεις FTR, για να αφαιρεθεί το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη. (20) Τέλος το DNA του CamKIIα icre BAC

36 απομονώθηκε από τα βακτήρια αυτά, καθαρίστηκε, και ενέθηκε στον προπυρήνα ωοκυττάρων ποντικών του στελέχους FVB/N. (20) Φαινότυπος των ποντικών. Το CamKIIα icre διαγονίδιο δίνει ένα πρότυπο έκφρασης που μοιάζει με αυτό του ενδογενούς γονιδίου CamKIIα. (20) Συγκεκριμένα, υψηλά επίπεδα του διαγονιδίου ανιχνεύονται στον ιππόκαμπο (hippocampus), το φλοιό (cortex), τους οσφρητικούς βολβούς (olfactory bulbs), και την αμυγδαλή (amygdala), και χαμηλότερα επίπεδα στο ραβδωτό σώμα (striatum), στο θάλαμο (thalamus), και τον υποθάλαμο (hypothalamus) (βλ. Εικόνα 6). (20) Όπως είναι αναμενόμενο, δεν ανιχνεύεται καθόλου έκφραση στην παρεγκεφαλίδα (cerebellum) ή έξω από τον εγκέφαλο. (20) Εικόνα 6. Αριστερά. Ανοσοϊστοχημεία με τη χρήση αντισώματος έναντι της icre ρικομπινάσης σε διαγονιδιακό ποντίκι CamKIIα icre, ηλικίας 2 μηνών, όπου το υψηλότερο σήμα εμφανίζεται στον ιππόκαμπο και το φλοιό. Cx: φλοιός, h: ιππόκαμπος, Cpu: ραβδωτό σώμα. Δεξιά. Λεπτομέρεια από ανοσοϊστοχημεία με τη χρήση του ίδιο αντισώματος από (A) φλοιό και ιππόκαμπο (B) φλοιό σε μεγέθυνση (C) ιππόκαμπο σε μεγέθυνση. [20]

37 Η μεταγεννητική αναπτυξιακή έκφραση της icre ρικομπινάσης στα ζώα αυτά ξεκινάει από την ημέρα P3 (postnatal day 3). (20) Η πρωτεΐνη ανιχνεύεται αρχικά την ημέρα P3 στον ιππόκαμπο και το φλοιό και αυξάνεται βαθμιαία φτάνοντας σε μέγιστο επίπεδο την ημέρα P15. (20) Σε αυτό το σημείο το επίπεδο έκφρασης είναι αντίστοιχο με αυτό που παρατηρείται και στο ενήλικο ποντίκι. (20) Τα ζώα αυτά λήφθηκαν από το German Cancer Research Center (dkfz) και στεγάζονται στη Μονάδα Ζωικών Προτύπων του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών Ποντίκια Nicastrin -/- Για να παραχθούν τα ποντίκια που φέρουν ένα αλληλόμορφο του γονιδίου της Nicastrin, το οποίο μπορεί να αφαιρεθεί υπό συνθήκη (conditional knock-out) χρησιμοποιήθηκαν οι καθιερωμένες τεχνικές γονιδιακής στόχευσης (gene targeting) με εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ES cells). (79) Δημιουργία της γονιδιακής κατασκευής. Ως στόχος του εξαρτώμενου από την Cre ρικομπινάση ανασυνδυασμού χρησιμοποιήθηκαν τα εξώνια 5, 6 και 7 του γονιδίου της Nicastrin (βλ. Εικόνα 7). (79) Η αφαίρεση αυτών των εξωνίων δημιουργεί μέσα στο πλαίσιο ανάγνωσης ένα κωδικόνιο λήξης, που τερματίζει πρόωρα τη μετάφραση. (79) Η περιοχή ομολογίας του γονιδίου της Nicastrin, που χρησιμοποιήθηκε για να αντικατασταθεί το ενδογενές γονίδιο, είναι ένα κομμάτι μεγέθους 7kb που εκτείνεται από το εσόνιο 2 έως το εσόνιο 11. (79) Στο 5 άκρο η περιοχή αυτή έχει μια αλληλουχία αναγνώρισης του περιοριστικού ενζύμου BsrGI και στο 3 άκρο του EcoRI. (79) Η πρώτη θέση loxp (loxp site) καθώς και η κασέτα PGK-NEO περιβαλλόμενη από δύο FRT (Flippase Recognition Target) θέσεις έχουν εισαχθεί σε μια αλληλουχία αναγνώρισης του EcoRV που βρίσκεται στο εσόνιο 4, ενώ η δεύτερη loxp θέση σε μια αλληλουχία αναγνώρισης του PmlI στο εσόνιο 7. (79) Η κασέτα PGK-NEO περιέχει το γονίδιο αντίστασης στη νεομυκίνη (NEO), του οποίου η έκφραση καθοδηγείται από τον υποκινητή του γονιδίου της κινάσης του φωσφογλυκερινικού (phosphoglycerate kinase, PGK). (128) Η γονιδιακή αυτή

38 κατασκευή εισήχθηκε σε αποικίες εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (στελέχους ποντικού 129/sj) οι οποίες ελέγχθηκαν με Southern blot του γενωμικού DNA, κομμένου με το περιοριστικό ένζυμο BamHI. (79) Τα επιθυμητά βλαστοκύτταρα ενέθηκαν σε βλαστοκύστεις εμβρύων ποντικού στελέχους C57BL6 από όπου προήλθαν χιμαιρικά ζώα. (79) Μετά από εξακρίβωση της κληρονόμησης του διαγονιδίου στους απογόνους των ζώων αυτών, η κασέτα PGK-NEO αφαιρέθηκε μέσω διασταύρωσης με διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν τη ρικομπινάση FLP (flippase recombinase), η οποία αναγνωρίζει τις θέσεις FRT, στη γαμετική σειρά. (79) Οι απόγονοι αυτών των διασταυρώσεων φέρουν το τροποποιημένο γονίδιο της Nicastrin (Nicastrin -/-) που περιλαμβάνει τις θέσεις loxp και έτσι μπορεί να αφαιρεθεί από την Cre ρικομπινάση και η παραγωγή της πρωτεΐνης να σταματήσει (βλ. Εικόνα 7). (79) Εικόνα 7. Παραγωγή του υπό συνθήκη (conditional) αλληλόμορφου του γονιδίου της Nicastrin (Ncstn). Στο διάγραμμα φαίνονται τα εξώνια του γονιδίου (ex 1-17), οι θέσεις loxp και oι αλληλουχίες αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού (Β: BamHI, BS: BsrGI, Ε: EcoRI) που χρησιμοποιήθηκαν για τη στόχευση του γονιδίου (gene targeting) και τον έλεγχο των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων με Southern blot. Επάνω παριστάνεται το φυσιολογικό αλληλόμορφο του γονιδίου της Nicastrin, (WT allele), στο κέντρο το τροποποιημένο αλληλόμορφο που αντικαθιστά το φυσιολογικό με ομόλογο ανασυνδυασμό (Targeted allele) και κάτω το αλληλόμορφο που προκύπτει μετά από αποκοπή της αλληλουχίας που περιβάλλεται από τις θέσεις loxp, από το ένζυμο Cre ρικομπινάση (Excised allele). [79] Τα ζώα αυτά αποτελούν ευγενική προσφορά του δρ. Απόστολου Κλινάκη, Ερευνητή Γ στο Κέντρο Βασικής Έρευνας του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών

39 4.3. Ποντίκια 5XFAD Οι FAD μεταλλάξεις στον άνθρωπο. Αυτοσωμικές επικρατείς μεταλλάξεις στα γονίδια της APP και των πρεσενιλινών PS1 και PS2 αυξάνουν την παραγωγή του Aβ42 και προκαλούν την οικογενή μορφή της νόσου Alzheimer (FAD). (107) Το Αβ42 είναι πιο ινιδογενές (fibrillogenic) από τα κοντύτερα πεπτίδια Αβ, και οι αυξημένες συγκεντρώσεις Αβ42 θεωρείται πως οδηγούν στο σχηματισμό των αδιάλυτων ινιδίων που αποτελούν τις αμυλοειδείς πλάκες. (107) Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, το μεγαλύτερο μέρος του Αβ που παράγεται είναι το Aβ 40, και σε λιγότερο βαθμό το Αβ42. (107) Οι FAD μεταλλάξεις της APP που συγκεντρώνονται κοντά στις περιοχές κοψίματος (cleavage sites) της β και γ-εκκριτάσης είτε αυξάνουν την παραγωγή του συνολικού Αβ, όπως συμβαίνει με την υποκατάσταση K670N/M671L (Swedish mutation, Σουηδική μετάλλαξη), είτε αυξάνουν ειδικά την παραγωγή του Aβ42, όπως συμβαίνει με την υποκατάσταση I716V (Florida mutation, μετάλλαξη της Φλώριδας) και την υποκατάσταση V717I (London mutation, μετάλλαξη του Λονδίνου). (107) Οι FAD μεταλλάξεις στις PS1 και PS2, όπως η M146L και η L286V στην PS1 αυξάνουν ειδικά την παραγωγή του Αβ42. (107) Εισαγωγή των FAD μεταλλάξεων σε ποντίκια-μοντέλα της νόσου. Διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν τις FAD μεταλλαγμένες APP και PS1 υπερπαράγουν Αβ42 και εμφανίζουν παθολογικές αμυλοειδείς πλάκες παρόμοιες με αυτές που βρίσκονται στους ασθενείς, όμως τα περισσότερα διαγονιδιακά μοντέλα αναπτύσσουν πλάκες με αργό ρυθμό (6-12 μήνες ή και περισσότερο). (107) Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι οι FAD μεταλλάξεις αύξησης του Αβ42 στην APP ή την PS1 σε διαγονιδιακά ποντίκια δρουν κατά τρόπο προσθετικό στην αύξηση της παραγωγής του Aβ42 και επιταχύνουν την εναπόθεση του αμυλοειδούς, όταν βρίσκονται στο ίδιο μόριο. (107) Επιπλέον, ο διαμοριακός συνδυασμός των μεταλλάξεων που αυξάνουν το Αβ42 στην APP και την PS1, επίσης αυξάνει προσθετικά την παραγωγή του Aβ42 στα διαγονιδιακά ζώα που συνεκφράζουν τα δύο διαγονίδια. (107) Για να επιταχυνθεί λοιπόν η εναπόθεση του αμυλοειδούς και η ανάπτυξη των πλακών και να μελετηθούν οι επιπτώσεις των πολύ υψηλών επιπέδων Αβ42 στον εγκέφαλο, δημιουργήθηκαν διπλά διαγονιδιακά ποντίκια

40 APP/PS1 που συνεκφράζουν πέντε μεταλλάξεις FAD (5XFAD ποντίκια) οι οποίες αυξάνουν προσθετικά την παραγωγή Αβ42. (107) Οι μεταλλάξεις αυτές είναι στην APP του ανθρώπου η K670N/M671L, η I716V και η V717I και στην PS1 του ανθρώπου η M146L και η L286V. (107) Κατασκευή των διαγονιδιακών ποντικών. Οι FAD μεταλλάξεις της APP K670N/M671L (αρίθμηση με βάση την ισομορφή 770 καταλοίπων), I716V και V717I και της PS1 M146L και L286V εισήχθηκαν σε cdnas της APP (695 καταλοίπων) και της PS1 με κατευθυνόμενη (site-directed) μεταλλαξιγένεση (βλ. Εικόνα 8). (107) Αυτά ενσωματώθηκαν στο εξώνιο 2 της διαγονιδιακής κασέτας του γονιδίου Thy1 του ποντικού και αλληλουχήθηκαν (βλ. Εικόνα 8). (107) Ο υποκινητής του γονιδίου Thy1 είναι ειδικός για τους νευρώνες και οδηγεί σε υπερέκφραση στον εγκέφαλο. Μετά τον καθαρισμό των διαγονιδίων από την αλληλουχία του φορέα, τα διαγονίδια προστέθηκαν σε ίσες αναλογίες και ενέθηκαν στους προπυρήνες μονοκύτταρων υβριδικών C57/B6XSJL εμβρύων. (107) Τα διαγονιδιακά ποντίκια που προέκυψαν αναγνωρίστηκαν με PCR και ταυτοποιήθηκαν με Southern blot. (107) Τα ζώα ιδρυτές (founders) που συνεξέφραζαν τα διαγονίδια της APP και της PS1 σε υψηλότερα επίπεδα διασταυρώθηκαν με B6/SJL F1 υβρίδια και διατηρήθηκαν ως ημιζυγώτες σε B6/SJL υβριδικό γενετικό υπόβαθρο (background) για περισσότερες από 10 γενιές. (107) Οι απόγονοί τους είναι διπλά θετικοί για τα διαγονίδια της APP και της PS1, κάτι που δείχνει τη σταθερή γενωμική ενσωμάτωση και των δύο διαγονιδίων και την κληρονόμησή τους ως ένα γονίδιο. (107) Εικόνα 8. Σχηματικό διάγραμμα των 5XFAD APP (πάνω) και PS1 (κάτω) διαγονιδίων. Οι FAD μεταλλάξεις στα διαγονίδια Thy1-APP και Thy1-PS1 υποδεικνύονται με βέλη. Sw: Σουηδική μετάλλαξη, Fl: μετάλλαξη της Φλώριδας, Lon: μετάλλαξη του Λονδίνου. Τα μικρά γκρίζα ορθογώνια αντιπροσωπεύουν τα εξώνια του γονιδίου Thy1. [107]

41 Φαινότυπος των 5XFAD ποντικών. Τα 5XFAD ποντίκια παράγουν Αβ42 σχεδόν αποκλειστικά και πολύ γρήγορα συσσωρεύουν πολύ υψηλά επίπεδα στον εγκέφαλο, τα οποία ξεπερνούν κατά πολύ τα επίπεδα του Αβ40, που αρχίζουν να αυξάνονται σε μεγαλύτερες ηλικίες (βλ. Εικόνα 9). (107) Ως αποτέλεσμα, τα 5XFAD ποντίκια αναπτύσσουν την αμυλοειδική παθολογία της νόσου Alzheimer από πολύ μικρή ηλικία. (107) Ο παθολογικός φαινότυπος των 5XFAD ποντικών συνίσταται από αμυλοειδείς πλάκες (amyloid plaques), γλοίωση (gliosis), και απώλεια μνήμης (memory deficits). (107) Επιπλέον, εμφανίζουν ενδονευρωνικό (intraneuronal) Αβ και νευροεκφυλισμό (neurodegeneration) δηλαδή απώλεια νευρώνων και συνάψεων, ένα θεμελιώδες χαρακτηριστικό της νόσου που λείπει από τα περισσότερα διαγονιδιακά μοντέλα της. (107) Εικόνα 9. Στη γραφική παράσταση φαίνεται η γρήγορη αύξηση των επιπέδων του Aβ42 στον εγκέφαλο των 5XFAD ποντικών. Η ανάλυση έγινε από ομογενοποίημα ολόκληρου εγκεφάλου ποντικών ηλικίας 1,5 έως 16 μηνών με χρήση σάντουιτς ELISA (sandwich ELISA) ειδική για το τελικό άκρο (end-specific) του Aβ40 (μαύρη γραμμή) και του Aβ42 (γκρι γραμμή). Οι μέσοι όροι των αρσενικών (τρίγωνα) και θηλυκών ζώων (κύκλοι) παριστάνονται χωριστά (αναλύθηκαν τέσσερα με πέντε ζώα ανά φύλο και ηλικία). [107] Η εναπόθεση του αμυλοειδούς σε πλάκες αρχίζει στους 2 μήνες στο στρώμα 5 του φλοιού (cortical layer 5) και στο υπόθεμα (subiculum) του ιππόκαμπου (hippocampus) και καθώς τα ζώα μεγαλώνουν, οι πλάκες καταλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος του φλοιού και του ιππόκαμπου (βλ. Εικόνα

42 10). (107) Προοδευτικά οι αμυλοειδείς πλάκες εξαπλώνονται και σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου φθάνοντας σε πολύ μεγάλο φορτίο. (107) Συγκεκριμένα εμφανίζονται στο θάλαμο, το εγκεφαλικό στέλεχος, και τους οσφρητικούς βολβούς, αλλά σε αυτές τις περιοχές είναι λιγότερο πολυάριθμες, ενώ δεν εμφανίζονται καθόλου στην παρεγκεφαλίδα. (107) Οι αμυλοειδείς αυτές εναποθέσεις βάφονται έντονα με Τhioflavin S, ένδειξη του ότι το Αβ είναι συσσωματωμένο (aggregated) με διαμόρφωση β-πτυχωτής επιφάνειας (β-pleated sheet) (βλ. Εικόνα 11). (107) Επίσης τα 5XFAD ποντίκια παρουσιάζουν φλεγμονή, που εμφανίζεται χαρακτηριστικά ως αστροκυττάρωση (astrocytosis) και μικρογλοίωση (microgliosis) (βλ. Εικόνα 10). (107) Ενεργοποιημένα αστροκύτταρα και μικρογλοιακά κύτταρα εμφανίζονται από την ηλικία των 2 μηνών, ταυτόχρονα με την εμφάνιση των πλακών και ο αριθμός τους αυξάνεται με την ηλικία παράλληλα με την αύξηση του αμυλοειδικού φορτίου (βλ. Εικόνα 10). (107) Στις τομές από εγκεφάλους 5XFAD ποντικών παρατηρούνται αστροκύτταρα που περιβάλλουν τις εναποθέσεις του αμυλοειδούς (βλ. Εικόνα 12). (107) Εικόνα 10. Στις εικόνες φαίνεται η ταχεία εναπόθεση αμυλοειδούς στον εγκέφαλο καθώς και η γλοίωση στα 5XFAD ποντίκια. Από εγκεφάλους ποντικών 2 (Α, Ε, Ι, Μ), 4 (Β, F, J, Ν), 6 (C, G, Κ, Ο), και

43 9 (D, H, L, P) μηνών λήφθηκαν παραοβελιαίες (parasagittal) σειριακές (serial) τομές και βάφτηκαν με ανοσοϊστοχημεία με αντισώματα που αναγνωρίζουν το καρβοξυτελικό άκρο του Aβ42 (A-D), το καρβοξυτελικό άκρο του Aβ40 (E-H), την GFAP (I-L), και το F4/80 (M-P) και για αντιπαράθεση με αιματοξυλίνη. Φαίνεται ότι η χρώση για το Aβ42 είναι πολύ εντονότερη από αυτή για το Aβ40 σε κάθε ηλικία και οι πυκνότητες των αστροκυττάρων (χρώση για GFAP) και της μικρογλοίας (χρώση για F4/80) είναι παράλληλες με αυτή για το Aβ42. [107] Εικόνα 11. Εναπόθεση αμυλοειδούς στα 5XFAD ποντίκια. Τομές από εγκεφάλους ποντικών ηλικίας 2 (αριστερά) και 7 (δεξιά) μηνών βάφτηκαν με Τhioflavin S (πράσινο) και παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο. [107] Εικόνα 12. Η τομή από εγκέφαλο ποντικού ηλικίας 7 μηνών έχει βαφτεί με ανοσοφθορισμό με αντίσωμα έναντι της GFAP (πράσινο) και με thiazin red (κόκκινο) και παρατηρήθηκε σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Στην εικόνα φαίνονται ενεργοποιημένα αστροκύτταρα γύρω από μια αμυλοειδή πλάκα, τα οποία εμφανίζουν διακλαδιζόμενες απολήξεις και εκφράζουν GFAP, ενδεικτικό ενεργοποιημένου φαινότυπου που συνδέεται με φλεγμονή. [107] Το ενδονευρωνικό Αβ42 αρχίζει να συσσωρεύεται στα 5XFAD ποντίκια σε ηλικία 1,5 μηνών, πριν από το σχηματισμό των πλακών στους 2 μήνες. (107) Είναι συσσωματωμένο (aggregated) σε β-πτυχωτή επιφάνεια, όπως προσδιορίζεται από

44 χρώση με Thioflavin S, και εμφανίζεται μέσα στα νευρωνικά σώματα (neuron soma) και τους νευρίτες (neurites) (νευρωνικές αποφυάδες, δενδρίτες ή νευράξονες) (βλ. Εικόνα 13 και 14). (107) Αρχικά η συσσώρευση του ενδονευρωνικού Αβ εμφανίζεται μέσα στους μεγάλους πυραμιδικούς νευρώνες του στρώματος 5 του φλοιού και του υποθέματος, ενδεχομένως ως αποτέλεσμα του προτύπου έκφρασης του υποκινητή του γονιδίου Thy1. (107) Η χρώση του ενδονευρωνικού Αβ στον εγκέφαλο των 5XFAD είναι κατά κύριο λόγο στικτή, κάτι που υπονοεί διαμερισματοποίησή του σε κυστίδια. (107) Με βάση τις έρευνες για τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της APP και των εκκριτασών, είναι πιθανό το συσσωματωμένο ενδονευρωνικό Αβ να βρίσκεται μέσα σε όξινα διαμερίσματα όπως τα ενδοσώματα (endosomes). (107) Οι αμυλοειδείς πλάκες φαίνεται να προέρχονται από τα κυτταρικά σώματα μορφολογικά ανώμαλων νευρώνων με συσσωματωμένο ενδονευρωνικό Αβ (βλ. Εικόνα 13). (107) Εικόνα 13. Ενδονευρωνική συσσώρευση Αβ και σχηματισμός πλακών. Τομές εγκεφάλου από ποντίκια ηλικίας 1,5 έως 6 μηνών βάφτηκαν με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμό με αντίσωμα έναντι του καρβοξυτελικού άκρου του Aβ42 (A, καφέ, C, κόκκινο) και με αντίσωμα έναντι όλων των μορφών του Αβ (B, καφέ, G, κόκκινο) και για αντιπαράθεση με αιματοξυλίνη (Α, Β, μπλε) ή με

45 ανοσοφθορισμό με ένα αντίσωμα έναντι του νευρωνικού δείκτη NeuN (C, G, πράσινο). Οι ηλικίες των ποντικών ήταν 1,5 (Α, ένθετη φωτογραφία), 2 (Α, C, G) και 6 (B) μηνών. Οι ενδονευρωνικές συσσωρεύσεις του Αβ παρατηρούνται αρχικά ως μικρά στίγματα, αν και περιστασιακά εμφανίζονται μεγάλες ανώμαλες συσσωρεύσεις κοντά στον εκφυτικό κώνο των νευραξόνων (axon hillock) (Β, μαύρα βέλη). Σε κάποιες περιπτώσεις παρατηρείται ότι η εναπόθεση του αμυλοειδούς ξεκινάει από το κυτταρικό σώμα ενός νευρώνα με ανώμαλη μορφολογία (G, άσπρη κεφαλή βέλους). Αυτοί οι νευρώνες έχουν πολύ λίγη χρώση με το αντίσωμα έναντι της NeuN, κάτι που δείχνει ότι πιθανόν βρίσκονται σε διαδικασία εκφυλισμού. Επιπλέον, και άλλοι νευρώνες φαίνεται να βρίσκονται σε διάφορα στάδια εκφυλισμού (G, κάτω δεξιά) ενώ βρίσκονται πολύ κοντά σε αμυλοειδείς πλάκες (G, κέντρο άκρη αριστερά). Παρατηρείται ακόμα η ύπαρξη νευριτών γεμάτων με Αβ που εμφανίζονται ως κόκκινες γραμμικές δομές (G, άσπρα βέλη). [107] Εικόνα 14. Ενδονευρωνική συσσώρευση Αβ σε ενδοκυτταρικά συσσωματώματα και σχηματισμός πλακών. Τομές εγκεφάλου από ποντίκια ηλικίας 2 (D, F) και 3 (E) μηνών βάφτηκαν με Thioflavin S (D, E, F, πράσινο). Η χρώση δείχνει ενδονευρωνικά συσσωματώματα Αβ που αποτελούνται από συσσωρεύσεις αμυλοειδούς με διαμόρφωση β-πτυχωτής επιφάνειας και εμφανίζονται ως στικτά σήματα μέσα στο σώμα (D, E) και ως γραμμικές δομές στους νευρίτες (F, άσπρα βέλη). [107] Προσυναπτικοί δείκτες όπως η συναπτοφυσίνη (synaptophysin) και η συντατίξη (syntaxin) και μετασυναπτικοί όπως η PSD-95 (postsynaptic density-95) μειώνονται με την ηλικία στον εγκέφαλο των 5XFAD, γεγονός που αποτελεί ένδειξη νευροεκφυλισμού, δηλαδή νευρωνικής απώλειας και καταστροφής των συνάψεων. (107) Η μείωση των επιπέδων της συναπτοφυσίνης ξεκινάει από την ηλικία των 4 μηνών και στους 9 μήνες βρίσκεται στο 75% περίπου των φυσιολογικών επιπέδων. (107) Τα επίπεδα της συνταξίνης και της PSD-95 εμφανίζονται επίσης μειωμένα στην ηλικία των 9 μηνών και περισσότερο των 12 μηνών. (107) Σε ζώα ηλικίας 9 μηνών οι μεγάλοι πυραμιδικοί νευρώνες στο στρώμα 5 του φλοιού είναι εμφανώς ελαττωμένοι και το στρώμα 1 του φλοιού είναι σημαντικά λεπτότερο πιθανότατα εξαιτίας της απώλειας των δενδριτών των νευρώνων του στρώματος 5 που προβάλλουν και διακλαδίζονται στο στρώμα

46 (107) Επιπλέον, οι νευρώνες στο υπόθεμα του ιππόκαμπου των ζώων αυτών εμφανίζονται πολύ αμυδρά ή λείπουν εξ ολοκλήρου. (107) Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η νευρωνική απώλεια εμφανίζεται στις περιοχές αυτές του εγκεφάλου όπου υπάρχουν τα υψηλότερα επίπεδα ενδονευρωνικής συσσώρευση Αβ και αμυλοειδών πλακών. (107) Τέλος, τα 5XFAD ποντίκια έχουν εξασθενημένη χωρική μνήμη (spatial memory) στο λαβύρινθο Y (Y-maze), από την ηλικία των 4 μηνών. (107) Συνεπώς τα 5XFAD ποντίκια εμφανίζουν γρήγορα τα κύρια χαρακτηριστικά της αμυλοειδικής παθολογίας της νόσου Alzheimer και είναι χρήσιμα μοντέλα του επαγόμενου από το ενδονευρωνικό Αβ42 νευροεκφυλισμού και σχηματισμού αμυλοειδών πλακών. (107) Τα ζώα αυτά λήφθηκαν από το Jackson Laboratory και στεγάζονται στη Μονάδα Ζωικών Προτύπων του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών

47 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η γ-εκκριτάση είναι ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών με δράση πρωτεάσης, που συμμετέχει στην επεξεργασία πολλών τύπου Ι διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, μεταξύ των οποίων της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς (APP) και του υποδοχέα Notch. (12) Η επεξεργασία της APP από τη γ-εκκριτάση (γ-secretase) οδηγεί στην παραγωγή του β αμυλοειδούς πεπτιδίου (β amyloid, Aβ), που είναι το κύριο συστατικό των νευριτικών πλακών στον εγκέφαλο των ασθενών με τη νόσο Alzheimer. (44, 111) Το σύμπλοκο της γ-εκκριτάσης αποτελείται από τέσσερα συστατικά τις Presenilins (PS1 ή PS2), τη Nicastrin (NCT), την Anterior pharyx defective-1 (Aph-1), και την Presenilin enhancer-2 (Pen-2). (87, 137, 156, 163) Ενώ για την Presenilin είναι γνωστό ότι αποτελεί το καταλυτικό κέντρο του συμπλόκου, υπεύθυνο για το κόψιμο των υποστρωμάτων, η λειτουργία των υπόλοιπων συστατικών του συμπλόκου δεν είναι ξεκαθαρισμένη. (156) Εκεί έχει στραφεί το ενδιαφέρον της έρευνας προκειμένου να βρεθεί πώς η γ-εκκριτάση επιλέγει τα διαφορετικά υποστρώματά της για επεξεργασία, στοιχείο σημαντικό για το σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων που στοχεύουν επιλεκτικά στη μείωση της παραγωγής του Aβ χωρίς να επηρεάζουν τις άλλες ζωτικής σημασίας λειτουργίες του συμπλόκου. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να μελετηθεί ο ρόλος της Nicastrin, ενός από τα συστατικά του συμπλόκου της γ-εκκριτάσης, στην παθολογία της νόσου του Alzheimer. Η μελέτη αυτή έγινε για πρώτη φορά σε in vivo σύστημα προκειμένου να ληφθούν αποτελέσματα με μεγαλύτερο επιστημονικό ενδιαφέρον, που πλησιάζουν περισσότερο στην ανθρώπινη κατάσταση. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε ένα διαγονιδιακό στέλεχος ποντικών (5XFAD), που αποτελεί μοντέλο της νόσου και εμφανίζει τα κύρια χαρακτηριστικά της παθολογίας της λόγω ιδιαίτερα αυξημένης παραγωγής Αβ στον εγκέφαλο. (20) Στο μοντέλο αυτό έγινε στοχευμένη απενεργοποίηση του γονιδίου της Nicastrin μόνο στον εγκέφαλο. Για να επιτευχθεί αυτό χρησιμοποιήθηκε επιπλέον ένα στέλεχος γονιδιακά στοχευμένων ποντικών (Nicastrin -/-) όπου το γονίδιο της Nicastrin έχει

48 τροποποιηθεί με την προσθήκη των αλληλουχιών loxp που αναγνωρίζονται από την Cre ρικομπινάση. (79) Επίσης χρησιμοποιήθηκε ένα στέλεχος διαγονιδιακών ποντικών (CamKIIα icre) που εκφράζει την Cre ρικομπινάση μόνο στον εγκέφαλο υπό τον έλεγχο ενός ιστοειδικού υποκινητή. (20) Τα ζώα αυτά διασταυρώνονται μεταξύ τους προκειμένου να ληφθούν απόγονοι στους οποίους γίνεται αφαίρεση του γονιδίου Nicastrin στον εγκέφαλο και ταυτόχρονα διασταυρώνονται με τα διαγονιδιακά ποντίκια-μοντέλα της νόσου 5XFAD προκειμένου να διαπιστωθεί αν η απώλεια της Nicastrin μεταβάλει την παθολογία τους. Στην ανάλυση που ακολούθησε αρχικά εξετάστηκαν οι γενικότερες επιπτώσεις της αφαίρεσης του γονιδίου στον εγκέφαλο των ποντικών και στη συνέχεια διερευνήθηκε το κύριο ερώτημα που είναι οι επιπτώσεις της αφαίρεσης του γονιδίου στην επεξεργασία της APP από τη γ-εκκριτάση και στην παραγωγή του Αβ στον εγκέφαλο των ποντικών. Η υπόθεση που έγινε είναι πως αν ο ρόλος της Nicastrin στη λειτουργικότητα του συμπλόκου της γ-εκκριτάσης είναι κρίσιμος, η παραγωγή του Αβ στα ζώα αυτά αναμένεται να είναι μειωμένη. Σε διαφορετική περίπτωση, αν η Nicastrin δε διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, δε θα παρατηρηθούν αλλαγές στο φαινότυπο των ζώων αυτών και η παραγωγή του Αβ θα παραμένει αυξημένη. Η απάντηση στο ερώτημα αυτό παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς η Nicastrin θα μπορούσε να αποτελεί έναν πιθανό φαρμακολογικό στόχο για την αδρανοποίηση του συμπλόκου της γ-εκκριτάσης και την ελάττωση αν όχι εξάλειψη της παραγωγής του Αβ

49 ΜΕΡΟΣ Β ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

50 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΒΙΟΨΙΕΣ ΟΥΡΑΣ Από ποντίκια 2-3 εβδομάδων κόβεται 1cm από το άκρο της ουράς και μπαίνει σε σωληνάκι Eppendorf. Προστίθενται 500μL διαλύματος TENS (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS) σύστασης 50mM Tris-HCl ph 8.0, 100mM EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ, ethylene diamine tetra acetic acid, SIGMA), 100mM NaCl (χλωριούχο νάτριο, sodium chloride, AppliChem), 1% SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate, SIGMA) διαλυμένα σε ddη2ο και 4μL πρωτεϊνάσης Κ (proteinase K, AppliChem) συγκέντρωσης 10mg/mL και γίνεται επώαση overnight στους 55οC. Το DNA επειδή είναι ιοντισμένο, είναι πιο σταθερό και διαλυτό σε διαλύματα αλάτων παρά σε απεσταγμένο νερό, γι αυτό το μέσο διάλυσής του περιέχει NaCl. Το EDTA δημιουργώντας χηλικά σύμπλοκα, δεσμεύει δισθενή ιόντα μετάλλων, όπως το μαγνήσιο, τα οποία είναι δυνατόν να σχηματίζουν άλατα με τις ανιοντικές φωσφορικές ομάδες του DNA. Επίσης αναστέλλει έμμεσα τις δεοξυριβονουκλεάσες του κυττάρου, οι οποίες χρειάζονται αυτά τα ιόντα για να δράσουν. Το SDS είναι ένα απορρυπαντικό, το οποίο λύει την πλασματική και την πυρηνική μεμβράνη των κυττάρων προσκειμένου να απελευθερωθεί το DNA. Ακόμα χρησιμεύει στην αποδιάταξη, δέσμευση και απομάκρυνση των πρωτεϊνών με τις οποίες είναι συνδεδεμένο το DNA, όπως οι ιστόνες, καθώς και στην απενεργοποίηση των νουκλεασών. Η πρωτεϊνάση Κ είναι ένα πρωτεολυτικό ένζυμο, που διασπά τις αποδιατεταγμένες πρωτεΐνες δίνοντας μικρότερα πεπτίδια που απομακρύνονται ευκολότερα. Το μέτρια αλκαλικό ph του διαλύματος, προκαλεί μείωση των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του DNA και των βασικών ιστονών, ελαττώνει τη δράση των νουκλεασών και μετουσιώνει άλλες πρωτεΐνες. Την επόμενη μέρα γίνεται αρχικά μια σύντομη ανακίνηση στο vortex mixer (VX100, Labnet) προκειμένου να διαλυθούν καλά οι δομές του ιστού που έχουν παραμένει. Στη συνέχεια προστίθεται 1μL ριβονουκλεάσης A (RNase A, AppliChem) συγκέντρωσης 10mg/mL, και γίνεται επώαση για 30 λεπτά στους 37οC, προκειμένου να απομακρυνθεί το RNA. Ακολουθεί καθαρισμός του DNA και απομάκρυνση των πρωτεϊνών μέσω εκχύλισης με τη χρήση οργανικών διαλυτών. Αρχικά προστίθενται 500μL διαλύματος φαινόλη : χλωροφόρμιο : ισοαμυλική αλκοόλη

51 (phenol, AppliChem : chloroform, AppliChem : isoamyl alcohol, AppliChem) αναλογίας 25:24:1 και γίνεται έντονη ανακίνηση στο vortex mixer για 5 λεπτά. Στη συνέχεια γίνεται φυγοκέντρηση (Biofuge fresco, Heraeus) για 15 λεπτά, στις rpm, στους 22οC, και το μίγμα διαχωρίζεται σε δύο φάσεις. Η πάνω φάση είναι η υδατική και εκεί βρίσκεται διαλυμένο το DNA, η κάτω φάση είναι η οργανική και στην ενδιάμεση ζώνη βρίσκονται οι πρωτεΐνες. Η φαινόλη και το χλωροφόρμιο προκαλούν αποδιάταξη των πρωτεϊνών ενώ η ισοαμυλική αλκοόλη σταθεροποιεί την ενδιάμεση ζώνη. Η πάνω φάση αφαιρείται και μπαίνει σε καινούργιο σωληνάκι ενώ η κάτω φάση απορρίπτεται. Στο σωληνάκι με την πάνω φάση προστίθεται ίσος όγκος (περίπου 500μL) διαλύματος φαινόλη : χλωροφόρμιο : ισοαμυλική αλκοόλη, γίνεται έντονη ανακίνηση στο vortex mixer για 5 λεπτά και φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες, για καλύτερο καθαρισμό του DNA. Πάλι λαμβάνεται η πάνω φάση που μπαίνει σε καινούργιο σωληνάκι και προστίθεται ίσος όγκος (περίπου 450μL) χλωροφορμίου που χρησιμεύει στην απομάκρυνση της φαινόλης που έχει παραμείνει. Για ακόμα μια φορά γίνεται έντονη ανακίνηση στο vortex mixer για 5 λεπτά, φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες και απομόνωση της πάνω φάσης (περίπου 350μL) σε καθαρό σωληνάκι. Το DNA στο διάλυμα αυτό είναι διαλυτό και με την προσθήκη του οργανικού διαλύτη ισοπροπανόλη (isopropanol, CARLO ERBA) σε ποσότητα 0,7 του όγκου του (περίπου 245μL) και ελαφριά ανακίνηση καθίσταται αδιάλυτο και κατακρημνίζεται. Οι ίνες του DNA που προκύπτουν μετά την προσθήκη της αλκοόλης λαμβάνονται με γυάλινη πιπέτα παστέρ (BRAND) η οποία κλείνεται στην άκρη της με φλόγα. Η πιπέτα ξεπλένεται σε αιθανόλη 70% και 100% (ethanol absolute, AppliChem) για να καθαριστεί το DNA και αφήνεται να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, οπότε το DNA εμφανίζεται ως μια λευκή μάζα. Τέλος η άκρη της πιπέτας κόβεται και μπαίνει σε ένα σωληνάκι Eppendorf που περιέχει 30μL διαλύματος TE (Tris-EDTA) ph 8.0, σύστασης 100mM Tris-HCl ph 8.0, 10mM EDTA ph 8.0, διαλυμένα σε ddη2ο. Το TE είναι ρυθμιστικό διάλυμα και έτσι διατηρεί το ph του διαλύματος κοντά στο 8.00, ενώ το EDTA που περιέχει αναστέλλει τη δράση των νουκλεασών. Τα σωληνάκια ανακινούνται για μία ώρα σε περιστροφικό ανακινητήρα ρυθμισμένο στους 37οC προκειμένου να διαλυθεί πλήρως το DNA και μετά μπορούν να φυλαχθούν στους 4οC

52 2. ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ ΜΕ PCR Η τεχνική της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reacion, PCR) επιτρέπει τον ειδικό in vitro πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA με τρόπο εκθετικό, χρησιμοποιώντας μια πολύ μικρή μόνο ποσότητα. Συστατικά της αντίδρασης. Για να γίνει η αντίδραση χρειάζεται το γενωμικό DNA που απομονώνεται από την ουρά του ποντικού και λειτουργεί ως μήτρα, το ένζυμο DNA πολυμεράση, εκκινητές (primers) forward και reverse ειδικοί για την περιοχή του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε, τα τέσσερα δεοξυριβονουκλεοτίδια (deoxyribonucleotides triphosphate, dntps) αδενίνη, θυμίνη, κυτοσίνη, γουανίνη, το ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης, ιόντα μαγνησίου, DMSO και αποστειρωμένο ddh2o όπου διαλύονται όλα τα παραπάνω. Αρχή της μεθόδου. Προϋπόθεση για να εφαρμοστεί η μέθοδος της PCR είναι να είναι γνωστό ένα μέρος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του τμήματος DNA που είναι επιθυμητό να πολλαπλασιαστεί. (5) Η γνωστή αλληλουχία χρησιμοποιείται για το σχεδιασμό των δύο εκκινητών, οι οποίοι είναι συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μήκους 15-30bp. (1, 5) Ο ένας εκκινητής είναι συμπληρωματικός προς το 3 άκρο της μιας αλυσίδας του DNA και ο άλλος προς το 3 άκρο της άλλης αλυσίδας της αλληλουχίας-στόχου. (3) Το DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση και οι εκκινητές υβριδοποιούνται με τις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες. (3) Τα υβρίδια αυτά χρησιμεύουν ως σημεία εκκίνησης (πρωταρχικά τμήματα) της αντιγραφής του DNAμήτρα από τη θερμοσταθερή DNA πολυμεράση. (1, 3, 5) Μετά την αντιγραφή των αρχικών κλώνων, τα προϊόντα αποδιατάσσονται πάλι, γίνεται υβριδοποίηση των εκκινητών με τα προϊόντα σύνθεσης και τους αρχικούς κλώνους και ξεκινάει ο επόμενος κύκλος αντιγραφής. (3) Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές και μετά τους πρώτους κύκλους η πλειονότητα των προϊόντων αποτελείται από το τμήμα του DNA-μήτρα μεταξύ των δύο εκκινητών, ενώ οι επεκτάσεις του αρχικού DNA πέραν αυτών των θέσεων αποτελούν αμελητέο ποσό. (3) Τα τμήματα

53 DNA που αντιστοιχούν στην αλληλουχία-στόχο και δημιουργούνται σε κάθε κύκλο χρησιμοποιούνται ως μήτρες για τον επόμενο κύκλο. Έτσι σε κάθε κύκλο ο αριθμός των αντιγράφων διπλασιάζεται με αποτέλεσμα τον εκθετικό πολλαπλασιασμό τους. (5) Μια τυπική αντίδραση. Η τεχνική εφαρμόζεται με τη χρήση του kit της Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEW ENGLAND BioLabs). Αρχικά προετοιμάζεται ένα διάλυμα που περιέχει όλα τα υλικά της αντίδρασης (master mix) σε ποσότητες ανάλογες με τον αριθμό των δειγμάτων και στη συνέχεια αυτό μοιράζεται σε ίσα μέρη σε ειδικά σωληνάκια (PCR-CUP, RAINBOW, 0,2ML, FLAT CAP, greiner bio-one), ένα για το κάθε δείγμα. Για το κάθε δείγμα χρειαζόμαστε 12,3μL ddh2o, 4,0 μl ρυθμιστικού διαλύματος 5x HF Buffer (παρέχεται από το kit), 0,2μL MgCl2 (διάλυμα 50mM MgCl2 που παρέχεται από το kit), 1,0 μl dntps (από stock διάλυμα συγκέντρωσης 2,5mM το κάθε ένα) (DNTP100-1KT Deoxynoucleotide Set, SIGMA-ALDRICH), 0,4μL εκκινητή forward (από stock διάλυμα συγκέντρωσης 50pmol/μL) και 0,4μL εκκινητή reverse (από stock διάλυμα συγκέντρωσης 50pmol/μL) (Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας, Εργαστήριο Μικροχημείας), 0,6μL DMSO (Dimethyl Sulfoxide, παρέχεται από το kit), 0,2μL DNA πολυμεράση (Phusion DNA Polymerase, παρέχεται από το kit), και 0,3μL DNA. Το master mix προετοιμάζεται σε ένα αποστειρωμένο σωληνάκι Eppendorf όπου προστίθενται με τη σειρά το ddh2ο, το ρυθμιστικό διάλυμα, το MgCl2, τα dntps, οι εκκινητές, το DMSO και τελευταίο το ένζυμο. Είναι σημαντικό το ένζυμο να είναι το τελευταίο συστατικό που προστίθεται στο μίγμα, καθώς έχει δράση 3 5 εξωνουκλεάσης και μπορεί να αποικοδομήσει τους εκκινητές απουσία νουκλεοτιδίων. Αφού το μίγμα μοιραστεί στα σωληνάκια, στο κάθε ένα προστίθεται το DNA του αντίστοιχου δείγματος. Σε ένα σωληνάκι αντί για DNA προστίθεται αποστειρωμένο ddh2o, οπότε σε αυτό δεν πραγματοποιείται η αντίδραση και λειτουργεί ως τυφλό (blanc), εκτός αν υπάρχει στα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται κάποια εξωγενής μόλυνση από DNA. Συνθήκες της αντίδρασης. Η αντίδραση πραγματοποιείται στο ειδικό μηχάνημα που ονομάζεται θερμικός κυκλοποιητής και για κάθε αλληλουχία που

54 ανιχνεύεται χρησιμοποιείται διαφορετικό πρόγραμμα. Ανάλογα με το είδος του DNA που χρησιμοποιείται ως μήτρα (γενωμικό DNA, πλασμιδιακό DNA, λ DNA, BAC, cdna), το μήκος και την πολυπλοκότητα της αλληλουχίας που πολλαπλασιάζεται καθώς και την αλληλουχία των εκκινητών, οι θερμοκρασίες και οι χρόνοι των διαφόρων σταδίων της αντίδρασης αλλάζουν. Αρχική αποδιάταξη. Η θερμοκρασία της αρχικής αποδιάταξης (initial denaturation) είναι συνήθως 98oC αλλά λόγω της υψηλής θερμοανθεκτικότητας της πολυμεράσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί και υψηλότερη θερμοκρασία. Για τα περισσότερα DNA-μήτρα ο χρόνος της αρχικής αποδιάταξης είναι 30 δευτερόλεπτα, κάποια όμως απαιτούν περισσότερο χρόνο που μπορεί να φτάσει έως και 3 λεπτά, αν η αλληλουχία τους είναι πολύ πλούσια σε γουανίνη και κυτοσίνη. Αποδιάταξη. Ο χρόνος αποδιάταξης (denaturation) κάθε κύκλου πρέπει να είναι όσο το δυνατόν συντομότερος. Συνήθως 5-10 δευτερόλεπτα στους 98oC είναι αρκετά για τα περισσότερα DNA-μήτρα. Υβριδοποίηση των εκκινητών. Για να καθοριστεί η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών με το DNA, υπολογίζεται αρχικά με βάση την αλληλουχία τους, η θερμοκρασία τήξης (Tm) του κάθε εκκινητή με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος (NEB Tm calculator, που συνιστάται από το kit. Στη συνέχεια για να υπολογιστεί η θερμοκρασία υβριδοποίησης που θα εισαχθεί στο πρόγραμμα του κυκλοποιητή χρησιμοποιείται ένας εμπειρικός κανόνας. Για εκκινητές μεγαλύτερους από 20 νουκλεοτίδια η υβριδοποίηση γίνεται για δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία 3oC πιο πάνω από την Tm του εκκινητή με τη χαμηλότερη τιμή. Για εκκινητές ίσους ή μικρότερους από 20 νουκλεοτίδια η θερμοκρασία υβριδοποίησης πρέπει να είναι ίση με την Tm του εκκινητή με τη χαμηλότερη τιμή. Όταν η Tm ενός εκκινητή είναι τουλάχιστον 69oC για εκκινητές μεγαλύτερους από 20 νουκλεοτίδια ή 72 oc για εκκινητές μικρότερους ή ίσους από 20 νουκλεοτίδια τότε εφαρμόζεται ένα πρωτόκολλο δύο βημάτων όπου το ενιαίο βήμα υβριδοποίησης/επέκτασης γίνεται στους 72 oc ακόμα και αν η Tm του εκκινητή είναι μεγαλύτερη από 72oC. Αυξάνοντας τη θερμοκρασία υβριδοποίησης, αυξάνεται η ειδικότητα του τελικού προϊόντος, καθώς έτσι περιορίζεται η υβριδοποίηση των εκκινητών στις περιοχές του DNA με τη μεγαλύτερη συμπληρωματικότητα

55 Επέκταση. Ο χρόνος της επέκτασης (extension) της επιθυμητής αλληλουχίας, που γίνεται στους 72oC, εξαρτάται από το μήκος και την πολυπλοκότητά της. Για χαμηλής πολυπλοκότητας DNA (πλασμιδιακό DNA, λ DNA, BAC) ο συνολικός χρόνος επέκτασης είναι 15 δευτερόλεπτα για κάθε 1Kb, για υψηλής πολυπλοκότητας γενωμικό DNA ο συνολικός χρόνος είναι 30 δευτερόλεπτα για κάθε 1Kb, ενώ για cdna ο χρόνος μπορεί να είναι μέχρι και 40 δευτερόλεπτα για κάθε 1Kb. Αριθμός κύκλων. Ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης εξαρτάται κυρίως από την αρχική συγκέντρωση του DNA μήτρα. Η διεξαγωγή πολλών κύκλων αυξάνει τον αριθμό των μη ειδικών προϊόντων ενώ λίγων οδηγεί στην παραγωγή μικρής ποσότητας προϊόντος. Τελική επέκταση. Ακολουθεί ένα στάδιο τελικής επέκτασης (final extension) στους 72oC για 5-10 λεπτά και μετά από αυτό η θερμοκρασία πέφτει στους 4oC για να αδρανοποιηθεί το ένζυμο και να σταματήσει πλήρως η αντίδραση αλλά και για να διατηρηθούν τα προϊόντα της. Γενετικός χαρακτηρισμός των CamKIIα icre ποντικών. Για να ανιχνευτεί το διαγονίδιο CamKIIα icre στο γενετικό υλικό των ποντικών χρησιμοποιούνται οι εκκινητές forward 5 -TGGTTCCCTGCTGAACCTGA- 3 με Tm=68,46oC και reverse 5 CAGCATTCTCCCACCATCGG- 3' με Tm=70,30 oc, οι οποίοι πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα μεγέθους 396bp στο γονίδιο της icre ρικομπινάσης. Το στάδιο της αρχικής αποδιάταξης γίνεται στους 98oC για 2 λεπτά και ακολουθούν 30 κύκλοι που περιλαμβάνουν αποδιάταξη στους 98oC για 10 δευτερόλεπτα, υβριδοποίηση των εκκινητών και επέκταση στους 60oC για 30 δευτερόλεπτα. Η τελική επέκταση γίνεται για 2 λεπτά στους 72oC και στη συνέχεια η θερμοκρασία πέφτει στους 16oC, προκειμένου να σταματήσει η αντίδραση. Μετά από ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 2% w/v παίρνουμε τις παρακάτω χαρακτηριστικές εικόνες

56 396bp Εικόνα 15. Πάνω και κάτω: Στο πρώτο πηγαδάκι του πηκτώματος φαίνεται ο DNA ladder, και στα υπόλοιπα τα προϊόντα της PCR από το τυφλό (blanc), το θετικό μάρτυρα (positive control) που εμφανίζει μια ζώνη, καθώς και από το DNA των ζώων που ελέγχονται για το αν φέρουν το διαγονίδιο CamKIIα icre. Γενετικός χαρακτηρισμός των Nicastrin -/- ποντικών. Για να ανιχνευτεί το στοχευμένο γονίδιο της Nicastrin (-) και το φυσιολογικό αλληλόμορφό του (+) στο γενετικό υλικό των ποντικών χρησιμοποιούνται οι εκκινητές forward 5 GTCCCTCTGCAGCATACTTTAGGTATC- 3 με Tm=66,84oC και reverse 5 - AGCTGGAACAGCAGAAGATAGGAAAG- 3 με Tm=67,77oC. Οι εκκινητές αυτοί πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα μεγέθους 185bp στο φυσιολογικό αλληλόμορφο του γονιδίου της Nicastrin και ένα τμήμα μεγέθους 219bp στο στοχευμένο γονίδιο, το οποίο περιέχει και τη μια loxp θέση γι αυτό είναι μεγαλύτερο σε μέγεθος. Το στάδιο της αρχικής αποδιάταξης γίνεται στους 98 oc για 2 λεπτά και ακολουθούν 35 κύκλοι που περιλαμβάνουν αποδιάταξη στους 98oC για 10 δευτερόλεπτα, υβριδοποίηση των εκκινητών στους 67oC για 20 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72oC για 30 δευτερόλεπτα. Η τελική επέκταση γίνεται για 2 λεπτά στους 72 oc και στη συνέχεια η θερμοκρασία πέφτει στους 16oC, προκειμένου να σταματήσει η

57 αντίδραση. Μετά από ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 2% w/v παίρνουμε τις παρακάτω χαρακτηριστικές εικόνες. 219bp 185bp Εικόνα 16. Πάνω και κάτω: Στο πρώτο πηγαδάκι του πηκτώματος φαίνεται ο DNA ladder, και στα υπόλοιπα τα προϊόντα της PCR από το τυφλό (blanc), καθώς και από το DNA των ζώων που ελέγχονται για το αν φέρουν το φυσιολογικό ή το στοχευμένο αλληλόμορφο της Nicastrin. Από τις διασταυρώσεις προκύπτουν απόγονοι ομόζυγοι για το στοχευμένο αλληλόμορφο (Nicastrin -/-) που εμφανίζουν μια μόνο ζώνη και ετερόζυγοι με ένα φυσιολογικό και ένα στοχευμένο αλληλόμορφο (Nicastrin +/-) που εμφανίζουν δύο διακριτές ζώνες. Έλεγχος της αφαίρεσης του γονιδίου της Nicastrin από την icre ρικομπινάση. Για να ελεγχθεί εάν γίνεται η αφαίρεση του γονιδίου της Nicastrin από την icre ρικομπινάση στον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών χρησιμοποιούνται οι εκκινητές forward 5 -GACTAATCGTTACTCCAGGGGCAG- 3 με Tm=66,84oC και reverse 5 -AGCTGGAACAGCAGAAGATAGGAAAG- 3 με Tm=67,77oC. Οι εκκινητές αυτοί πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα μεγέθους 2.520bp στο στοχευμένο αλληλόμορφο της Nicastrin που δεν έχει υποστεί ανασυνδυασμό και ένα τμήμα

58 370bp στο στοχευμένο αλληλόμορφο που έχει υποστεί ανασυνδυασμό από την icre ρικομπινάση. Το στάδιο της αρχικής αποδιάταξης γίνεται στους 98oC για 2 λεπτά και ακολουθούν 35 κύκλοι που περιλαμβάνουν αποδιάταξη στους 98 oc για 10 δευτερόλεπτα, υβριδοποίηση των εκκινητών στους 67 oc για 20 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72oC για 150 δευτερόλεπτα. Η τελική επέκταση γίνεται για 2 λεπτά στους 72oC και στη συνέχεια η θερμοκρασία πέφτει στους 16 oc, προκειμένου να σταματήσει η αντίδραση. Γενετικός χαρακτηρισμός των 5XFAD ποντικών. Για να ανιχνευτούν τα διαγονίδια 5XFAD στο γενετικό υλικό των ποντικών χρησιμοποιούνται οι εκκινητές forward 5 -GAATTCCGACATGACTCAGG- 3 με Tm=62,61oC και reverse 5 GTTCTGCTGCATCTTGGACA- 3' με Tm=64,57 oc, οι οποίοι πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα μεγέθους 246bp στο γονίδιο της ανθρώπινης APP. Το στάδιο της αρχικής αποδιάταξης γίνεται στους 98oC για 2 λεπτά και ακολουθούν 30 κύκλοι που περιλαμβάνουν αποδιάταξη στους 98oC για 10 δευτερόλεπτα, υβριδοποίηση των εκκινητών στους 65oC για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72oC για 20 δευτερόλεπτα. Η τελική επέκταση γίνεται για 2 λεπτά στους 72 oc και στη συνέχεια η θερμοκρασία πέφτει στους 16oC, προκειμένου να σταματήσει η αντίδραση. Μετά από ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 2% w/v παίρνουμε τις παρακάτω χαρακτηριστικές εικόνες. 246bp

59 Εικόνα 17. Πάνω και κάτω: Στο πρώτο πηγαδάκι του πηκτώματος φαίνεται ο DNA ladder, και στα υπόλοιπα τα προϊόντα της PCR από το τυφλό (blanc), το θετικό μάρτυρα (positive control) που εμφανίζει μια ζώνη, καθώς και από το DNA των ζώων που ελέγχονται για το αν φέρουν τα διαγονίδια των 5XFAD ποντικών. 3. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR Η ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων διαχωρίζει διαφορετικού μεγέθους τμήματα DNA ή RNA υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. (1) Τα προϊόντα της PCR, που είναι μόρια DNA μικρού μήκους, εισάγονται σε πήκτωμα (gel) αγαρόζης, που καλύπτεται από ειδικό διάλυμα και διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά, δηλαδή με την εφαρμογή ρεύματος. (1) Η φωσφορική ομάδα κάθε νουκλεοτιδίου φέρει ένα αρνητικό φορτίο, που είναι πολύ ισχυρότερο από αυτό που φέρει οποιαδήποτε βάση. (7) Έτσι, τα μόρια του DNA έχουν σχεδόν ίδιο λόγο φορτίου/μάζας, ανεξάρτητα από την αλληλουχία τους, γιατί το κάθε νουκλεοτίδιο συμβάλει με το ίδιο περίπου φορτίο και μάζα. (7) Έτσι ο διαχωρισμός των μορίων του DNA σε ζώνες γίνεται με βάση το μήκος τους, με τα μεγαλύτερα να κινούνται πιο αργά και τα μικρότερα πιο γρήγορα, περνώντας μέσα από τους πόρους του πηκτώματος. Στο πήκτωμα η αγαρόζη σχηματίζει ένα δίκτυο πόρων, των οποίων το μέγεθος εξαρτάται από τη συγκέντρωσή της. Όσο μεγαλύτερη είναι αυτή, τόσο μικρότεροι είναι οι πόροι με αποτέλεσμα να γίνεται καλύτερος διαχωρισμός μικρότερων σε μέγεθος μορίων DNA. Για την παρασκευή του πηκτώματος χρησιμοποιείται αγαρόζη (agarose low EEO/agarose standard, AppliChem) 2% w/v διαλυμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE (Tris-acetate EDTA) 1x, σύστασης 40mM Tris-acetate και 1mM EDTA (αιθυλενοδιαμινο-τετραοξικό οξύ, ethylene diamine tetra acetic acid, SIGMA),

60 διαλυμένα σε ddη2ο. Ακόμα προστίθεται βρωμιούχο αιθίδιο (ethidium bromide, AppliChem) συγκέντρωσης 10mg/mL, ώστε η τελική του συγκέντρωση στο πήκτωμα να είναι 5μg/mL. Το βρωμιούχο αιθίδιο χρησιμοποιείται για να γίνει ορατό το DNA, το οποίο σημαίνει και όταν εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία εκπέμπει φθορισμό. Για να διαλυθεί η αγαρόζη στο ρυθμιστικό διάλυμα ζεσταίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων για μερικά λεπτά και αφού κρυώσει λίγο προστίθεται το βρωμιούχο αιθίδιο. Όσο το διάλυμα είναι ακόμα ζεστό, χύνεται στο καλούπι της συσκευής ηλεκτροφόρησης, στο οποίο έχουν στερεωθεί από πριν χτενάκια που θα σχηματίσουν τα πηγαδάκια του πηκτώματος. Αφήνεται να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά ή σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά και στους 4 οc για άλλα 10 λεπτά. Στη συνέχεια αφαιρούνται τα χτενάκια και στη συσκευή μπαίνει ρυθμιστικό διάλυμα TAE μέχρι να καλύψει πλήρως το πήκτωμα. Τα δείγματα φορτώνονται στον αρνητικό πόλο και κινούνται με τη βοήθεια του ηλεκτρικού ρεύματος προς το θετικό πόλο. Το ηλεκτρικό ρεύμα εφαρμόζεται στους πόλους της συσκευής από ένα τροφοδοτικό και η τάση του ρυθμίζεται ανάλογα με το μήκος του πηκτώματος. Για να παρακολουθείται η κίνηση των δειγμάτων στο πήκτωμα αγαρόζης προστίθεται στο κάθε ένα ειδική χρωστική μπλε χρώματος, σύστασης 0,25% κυανόλη του ξυλενίου (xylene cyanol), 0,25% κυανό της βρωμοφαινόλης (bromophenol blue) και 5% γλυκερόλη (glycerin, CARL ROTH) διαλυμένα σε ddη2ο. Η χρωστική φυλάσσεται σε stock διάλυμα 6x από το οποίο λαμβάνεται η αντίστοιχη ποσότητα προκειμένου στον τελικό όγκο του διαλύματος της PCR να βρίσκεται σε περιεκτικότητα 1x. Στο πρώτο πηγαδάκι φορτώνονται 5μL DNA ladder (NEW ENGLAND, BioLabs) των 100bp (base pairs, ζεύγη βάσεων), που περιέχει κομμάτια DNA μεγέθους 1517bp, 1200bp, 1000bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500/517bp, 400bp, 300bp, 200bp και 100bp για να μπορεί να υπολογιστεί κατά προσέγγιση το μέγεθος των προϊόντων της PCR που ηλεκτροφορούνται. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης το αποτέλεσμα γίνεται ορατό κάτω από λάμπα υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) στη συσκευή Dolphin-DOC (WEALTEC). Μέσω κάμερας CCD ενσωματωμένης στη συσκευή η εικόνα μεταφέρεται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή και με το πρόγραμμα που συνοδεύει τη συσκευή Dolphin-1D λαμβάνεται μια ασπρόμαυρη φωτογραφία του πηκτώματος

61 4. ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΙΣΤΩΝ ΠΟΝΤΙΚΟΥ Η θανάτωση των ποντικών προκαλείται από ασφυξία από ατμούς CO2 που δημιουργούνται με την εξάχνωση CO2 σε στερεή μορφή (πελέτες ξηρού πάγου) μέσα σε ένα κλειστό δοχείο σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια γίνεται αφαίρεση του αίματος από το σώμα του ποντικού (transcardiac perfusion) με τη χρήση παγωμένου διαλύματος 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), σύστασης 13,7mM NaCl (χλωριούχο νάτριο, sodium chloride, AppliChem), 2,7mM KCl (χλωριούχο κάλιο, potassium chloride, CARLO ERBA), 10mM Na2HPO4 (όξινο φωσφορικό νάτριο, sodium phosphate dibasic, SIGMA), 2mM KH2PO4 (δισόξινο φωσφορικό κάλιο, potassium dihydrogen phosphate, CARLO ERBA), διαλυμένα σε ddη2ο, για να γίνει καλύτερη ιστολογική ανάλυση του εγκεφάλου. Το ζώο ανοίγεται και αποκαλύπτεται η καρδιά του, στην αριστερή κοιλία της οποίας εισάγεται μια βελόνα, από την οποία παροχετεύεται το PBS μέσα από ένα σωληνάκι που εφαρμόζεται στην άλλη άκρη της. Αφού εισαχθεί η βελόνα κόβεται ο δεξιός κόλπος της καρδιάς και από εκεί διέρχεται το αίμα εξαναγκαζόμενο να κινηθεί από το PBS. Όσο η καρδιά του ζώου πάλλεται, η αριστερή κοιλία προωθεί το PBS που διοχετεύεται σε αυτήν σε όλους τους ιστούς του σώματος μέσω των αρτηριών και των αρτηριδίων όπως ακριβώς κάνει και με το αίμα. Στη συνέχεια μέσω των φλεβιδίων και των φλεβών το PBS, όπως φυσιολογικά κάνει και το αίμα, επιστρέφει στο δεξιό κόλπο της καρδιάς από όπου εξέρχεται. Καθώς το PBS κινείται μέσω της περιφερειακής κυκλοφορίας του καρδιαγγειακού συστήματος παρασύρει και το αίμα του ζώου, απομακρύνοντάς το. Σημειώνεται ότι για κάθε ζώο χρειάζονται περίπου 30-40mL PBS για να γίνει πλήρης αφαίμαξη. Στη συνέχεια απομονώνεται ο εγκέφαλος του ποντικού και χωρίζονται τα δύο ημισφαίρια με ξυραφάκι. Το δεξί ημισφαίριο χρησιμοποιείται για ιστολογική επεξεργασία και παραμένει σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης (paraformaldehyde, SIGMA-ALDRICH) 4% w/v σε PBS (Phosphate Buffered Saline), για 48 ώρες, στους 4οC, προκειμένου να μονιμοποιηθεί και στη συνέχεια φυλάσσεται σε διάλυμα σουκρόζης (D-Sucrose, AppliChem) 20% w/v σε PBS (Phosphate Buffered Saline) στους 4οC. Η μονιμοποίηση έχει ως σκοπό την προστασία του ιστού από αυτόλυση και βακτηριακή μόλυνση

62 καθώς και τη σταθεροποίησή του ώστε να διατηρηθεί η κυτταρική δομή του στα επόμενα στάδια της ιστολογικής επεξεργασίας. Για τους λόγους αυτούς γίνεται αμέσως μετά τη θανάτωση του ζώου ώστε να αποφευχθούν οι αλλοιώσεις. Οι αλδεΰδες γενικά σχηματίζουν ομοιοπολικούς δεσμούς με τις ελεύθερες αμινομάδες των πρωτεϊνών και με αυτό τον τρόπο διασυνδέουν τις γειτονικές πρωτεΐνες και τις σταθεροποιούν. Για αυτό το λόγο οι αλδεΰδες, όπως η παραφορμαλδεΰδη, είναι καλά μονιμοποιητικά για τη διατήρηση της γενικής δομής του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα λόγω του πρωτεϊνικού τους περιεχομένου. Το αριστερό ημισφαίριο μπαίνει σε σωληνάκι Eppendorf και ψύχεται ακαριαία σε δοχείο με υγρό άζωτο (liquid nitrogen). Στη συνέχεια φυλάσσεται στους -80οC για μακροχρόνια συντήρηση και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για απομόνωση πρωτεϊνών και εφαρμογή ανοσολογικών τεχνικών (Western blot, ELISA). Τέλος αν είναι επιθυμητό αφαιρείται και το ήπαρ του ποντικού, το οποίο ψύχεται σε υγρό άζωτο και φυλάσσεται στους -80οC για να γίνει αργότερα απομόνωση πρωτεϊνών. 5. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΠΟΝΤΙΚΟΥ Οι εγκέφαλοι των ποντικών αποψύχονται από τους -80oC σε πάγο για να μην αλλοιωθούν και στη συνέχεια ζυγίζονται. Η απομόνωση των πρωτεϊνών από τους εγκεφάλους γίνεται σε τρία διαδοχικά στάδια. (68) Η αρχική ομογενοποίηση του ιστού γίνεται με προσθήκη 8 όγκων παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος PBS (Phosphate Buffered Saline) με 1x αναστολείς πρωτεασών (protease inhibitors, Complete Mini Protease Inhibitor Coctail Tablets, Roche) σε χειροκίνητο ομογενοποιητή (homogenizer, AA46, Thomas Scientific), βυθισμένο σε πάγο. (68) Η ομογενοποίηση του ιστού εξυπηρετεί στο να σπάσουν οι μεμβράνες των κυττάρων και να απελευθερωθεί το περιεχόμενό τους. Ο ομογενοποιητής αποτελείται από ένα γυάλινο σωλήνα και ένα έμβολο που εφαρμόζει απόλυτα μέσα σε αυτόν. Ο ιστός και το κατάλληλο διάλυμα τοποθετούνται στο σωλήνα και μέσα σε αυτόν ανεβοκατεβαίνει το έμβολο το οποίο ταυτόχρονα περιστρέφεται. Καθώς ο ιστός συμπιέζεται ανάμεσα στα τοιχώματα του

63 σωλήνα και στο έμβολο, τα κύτταρά του σπάνε. Το ομογενοποίημα μοιράζεται σε δύο σωληνάκια Eppendorf και φυγοκεντρείται (Biofuge fresco, Heraeus) στις rpm, για 45 λεπτά, στους 4oC. (68) Το υπερκείμενο, που αποτελεί το διαλυτό κλάσμα (soluble fraction) και περιέχει όλες τις υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος και του εξωκυττάριου χώρου (εκκρινόμενες πρωτεΐνες), μπαίνει σε καθαρό σωληνάκι Eppendorf και φυλάσσεται στους -80oC. (68) Σε αυτό δεν εντοπίζονται καθόλου διαμεμβρανικές πρωτεΐνες γιατί όλες οι κυτταρικές μεμβράνες και τα κυτταροπλασματικά οργανίδια βρίσκονται στο ίζημα που προκύπτει από τη φυγοκέντρηση. (68) Το ίζημα μπορεί να φυλαχθεί στους -80oC για μελλοντική χρήση, διαφορετικά επαναδιαλύεται με πιπετάρισμα σε 500μL παγωμένου διαλύματος λύσης (lysis buffer) σύστασης PBS (Phosphate Buffered Saline), 10% γλυκερόλη (glycerin, CARL ROTH), 1% Triton X-100 (AppliChem) με 1x αναστολείς πρωτεασών (protease inhibitors, Complete Mini Protease Inhibitor Coctail Tablets, Roche). (68) Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm, για 10 λεπτά, στους 4oC και το υπερκείμενο που αποτελεί το κλάσμα λύσης (lysis fraction) μπαίνει σε καθαρό σωληνάκι Eppendorf και φυλάσσεται στους -80oC. (68) Στο κλάσμα αυτό μπορούν στη συνέχεια να ανιχνευθούν οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και οι πρωτεΐνες που βρίσκονται μέσα στα κυτταροπλασματικά οργανίδια. (68) Οι πρωτεΐνες αυτές απελευθερώνονται με την προσθήκη του διαλύματος λύσης, που καταστρέφει τη δομή των μεμβρανών, και λαμβάνονται στο υπερκείμενο μετά από τη φυγοκέντρηση. (68) Το ίζημα μπορεί να φυλαχθεί στους -80oC για μελλοντική χρήση, διαφορετικά επαναδιαλύεται σε 1mL διαλύματος υδροχλωρικής γουανιδίνης (guanidine hydrocloride) 5Μ σε 50mM Tris-HCl ph 8.0. (68) Προκειμένου να διαλυθεί το ίζημα, τα σωληνάκια ανακινούνται σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph), για 3-4 ώρες, σε θερμοκρασία δωματίου. (68) Αυτό αποτελεί το αδιάλυτο κλάσμα (insoluble fraction) των μη διαλυτών πρωτεϊνών που υπάρχουν στον ιστό, όπως είναι για παράδειγμα το αμυλοειδές πεπτίδιο καθώς και άλλες πρωτεΐνες που εντοπίζονται τις αμυλοειδείς πλάκες, και φυλάσσεται στους -80oC. (68)

64 6. ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Μετά την απομόνωση των πρωτεϊνών γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός τους στο κάθε δείγμα, με τη χρήση του Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Η μέθοδος που χρησιμοποιεί βασίζεται στο δις-κιγχονινικό οξύ (bicinchoninic acid, BCA) για τη χρωματομετρική ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση της συνολικής πρωτεΐνης ενός δείγματος. Συνδυάζει την αναγωγή του δισθενούς κατιόντος χαλκού (Cu+2) σε μονοσθενές (Cu+1) από τις πρωτεΐνες του δείγματος σε αλκαλικό μέσο (αντίδραση Biuret) με την ιδιαίτερα ευαίσθητη και εκλεκτική χρωματομετρική ανίχνευση του μονοσθενούς κατιόντος του χαλκού με ένα αντιδραστήριο που περιέχει BCA. Το μωβ χρώματος προϊόν της αντίδρασης προκύπτει από το σχηματισμό χηλικού αντιδραστηρίου από δύο μόρια BCA και ενός μονοσθενούς κατιόντος χαλκού. Αυτό το υδροδιαλυτό σύμπλοκο παρουσιάζει ισχυρή απορρόφηση στα 562nm, η οποία είναι σχεδόν γραμμική με τις αυξανόμενες πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις σε ένα μεγάλο εύρος ( μg/mL). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις των δειγμάτων γενικά καθορίζονται σε σχέση με πρότυπα (standards) μιας κοινής πρωτεΐνης όπως η αλβουμίνη ορού βοός (bovine serum albumin, BSA). Μια σειρά αραιώσεων γνωστής συγκέντρωσης της πρωτεΐνης αυτής προετοιμάζονται και μετρώνται παράλληλα με τα άγνωστα δείγματα. Η απορρόφηση των πρότυπων και των άγνωστων δειγμάτων στα 562nm μετράται σε absorbance microplate reader (SpectraMax 190, Molecular Devices). Οι τιμές της απορρόφησης των προτύπων αντιστοιχίζονται με τις γνωστές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης που περιέχουν και προκύπτει μια πρότυπη καμπύλη (standard curve) από την οποία υπολογίζεται η συγκέντρωση των άγνωστων δειγμάτων από το πρόγραμμα SoftMax Pro (Molecular Devices) που συνοδεύει το μετρητή απορρόφησης. 7. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ Η ηλεκτροφόρηση των απομονωθέντων πρωτεϊνών από τους εγκεφάλους των ποντικών έχει ως σκοπό το διαχωρισμό τους κατά μήκος ενός πηκτώματος με τελικό σκοπό την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνικών μορίων ενδιαφέροντος

65 Βασικές αρχές ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών. Η τεχνική βασίζεται στο ότι τα πρωτεϊνικά μακρομόρια φέρουν ηλεκτρικό φορτίο που τους προσδίδει την ικανότητα να κινούνται μέσα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο. (2) Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός γίνεται συνήθως σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE), το οποίο έχει πόρους και λειτουργεί σαν μοριακός ηθμός καθιστώντας ευκολότερο το διαχωρισμό των μορίων. Το πήκτωμα σχηματίζεται με πολυμερισμό του μονομερούς ακρυλαμιδίου σε μακριές αλειφατικές αλυσίδες πολυακρυλαμιδίου, που συνδέονται κατά διαστήματα μεταξύ τους, με μόρια του συνδέτη (cross-linker) Ν-Ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο (N-N -methylene-bis- acrylamide) δημιουργώντας έτσι ένα τρισδιάστατο πλέγμα. Το πολυμερές που προκύπτει, αποτελείται από ένα πλέγμα μακρομορίων πολυακρυλαμιδίου, διασυνδεδεμένα σταυρωτά διαμέσου του δις-ακρυλαμιδίου. (7) Ο σχηματισμός του πηκτώματος γίνεται με τη βοήθεια του Ν,Ν,Ν,Ν-τετραμεθυλο-1,2-διαμινο-αιθάνιο (N,N,N,N -tetramethyl-ethylene diamine, TEMED), το οποίο καταλύει το σχηματισμό ελευθέρων ριζών από το υπερθειϊκό αμμώνιο (ammonium persulfate, APS). (2) Με την παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου ξεκινάει ο πολυμερισμός του πηκτώματος. Πηκτώματα διαφορετικού μεγέθους πόρων μπορούν να διαχωρίσουν μακρομόρια διαφορετικού μοριακού βάρους. (2) Τα μόρια που είναι μικρά σε σχέση με τους πόρους του πηκτώματος μετακινούνται εύκολα διαμέσου του πηκτώματος, ενώ τα μεγάλα μόρια καθυστερούν. (3) Μόρια ενδιάμεσου μεγέθους μετακινούνται μέσα από το πήκτωμα με διαφορετικές ταχύτητες. (3) Το μέγεθος των πόρων του πηκτώματος είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του πηκτώματος η οποία εξαρτάται τόσο από την ολική συγκέντρωση του μείγματος ακρυλαμιδίου και διςακρυλαμιδίου αλλά και τη σχετική συγκέντρωση του δις-ακρυλαμιδίου σε σχέση με τη συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου. (2) Πηκτώματα χαμηλής συγκέντρωσης του μείγματος είναι μαλακά και επειδή έχουν μεγάλους πόρους χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό μακρομορίων μεγάλου μοριακού βάρους. (2) Πηκτώματα με υψηλές συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 12% είναι σκληρότερα και περισσότερο εύθραυστα, έχουν μικρούς πόρους και χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών μικρού σχετικά μοριακού βάρους. (2)

66 Προετοιμασία πρωτεϊνικών δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση. Προκειμένου κατά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες να διαχωριστούν με βάση τη μάζα τους εξασφαλίζονται αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων κατά την προετοιμασία των δειγμάτων, στο πήκτωμα και στο ρυθμιστικό διάλυμα της ηλεκτροφόρησης. (2) Τέτοιος παράγοντας είναι το δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο (sodium dodecyl sulfate, SDS), ένα ανιοντικό απορρυπαντικό, το οποίο αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες και τους δίνει ραβδοειδή μορφή, καταστρέφοντας τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και τους δεσμούς-η, που εξασφαλίζουν τη δευτεροταγή δομή τους, ενώ ταυτόχρονα τους προσθέτει περίσσεια αρνητικών φορτίων. (2,7) Το μόριό του αποτελείται από μια αρνητικά φορτισμένη υδρόφιλη θειϊκή ομάδα και μια υδρόφοβη δωδεκαδακτυλική ομάδα. (2) Όταν η υδρόφοβη ομάδα του μορίου συνδεθεί με τις πλευρικές ομάδες των υδρόφοβων αμινοξέων των πρωτεϊνών, καταστρέφει τη δομή τους και όλες λόγω του κορεσμού τους με μόρια SDS καθίστανται αρνητικά φορτισμένες και το αρχικό τους φορτίο να είναι αμελητέο. (2) Τα ανιόντα του SDS δεσμεύονται στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες με αναλογία ένα περίπου μόριο SDS ανά δύο αμινοξέα και έτσι το συνολικό φορτίο του συμπλέγματος είναι ανάλογο με τη μάζα της πρωτεΐνης. (3) Επίσης χρησιμοποιείται μερκαπτοαιθανόλη (mercaptoethanol), ένας αναγωγικός παράγοντας που καταστρέφει τους δισουλφιδικούς δεσμούς (S-S) μεταξύ δύο ομάδων -SH κυστεϊνών της ίδιας ή δύο διαφορετικών πολυπεπτιδικών αλυσίδων και η αποδιάταξη ολοκληρώνεται με θέρμανση. (7) Έτσι οι όποιες διαφορές υπάρχουν στη στερεοδιάταξη και στο φορτίο των πρωτεϊνών παύουν να υφίστανται, συνεπώς η ηλεκτροφορητική κινητικότητά τους εξαρτάται μόνο από το μοριακό τους βάρος. Συγκεκριμένα τα μικρότερα μόρια περνούν από τους πόρους του πηκτώματος πιο εύκολα από τα μεγάλα, δηλαδή η κινητικότητα αυξάνει όσο μικραίνει το μοριακό βάρος των μορίων. (7) Το αποτέλεσμα είναι το μίγμα των πρωτεϊνών του κάθε δείγματος να κλασματώνεται κατά την ηλεκτροφόρηση σε μια σειρά διακριτών ζωνών που κατανέμονται με βάση το μοριακό τους βάρος. (3) Τα δείγματα των πρωτεϊνών φυλάσσονται στους -80 οc και ξεπαγώνονται σε πάγο για να μη μετουσιωθούν. Σε ένα σωληνάκι Eppendorf προστίθεται μια ποσότητα του δείγματος αραιωμένη όπου χρειάζεται και ίση ποσότητα διαλύματος 2x SDS gel loading buffer, προκειμένου στον τελικό όγκο να βρίσκεται σε

67 περιεκτικότητα 1x. Η σύσταση του διαλύματος 2x SDS gel loading buffer είναι 1% SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate, SIGMA), 10mM EDTA (αιθυλενοδιαμινο-τετραοξικό οξύ, ethylene diamine tetra acetic acid, SIGMA), 10mM sodium phosphate buffer ph 7.0, 1% μερκαπτοαιθανόλη (2-mercaptoethanol, MERCK), 15% γλυκερόλη (glycerin, CARL ROTH), 0,01% κυανό της βρωμοφαινόλης (bromophenol blue), διαλυμένα σε ddh2o. Στη συνέχεια τα δείγματα βράζονται για 10 λεπτά και μέχρι να φορτωθούν στο πήκτωμα ηλεκτροφόρησης διατηρούνται στον πάγο. Προετοιμασία πηκτώματος ηλεκτροφόρησης. Αρχικά προετοιμάζεται το πήκτωμα της ηλεκτροφόρησης, το οποίο αποτελείται από δύο μέρη, το πήκτωμα διαχωρισμού (separating gel) και το πήκτωμα πακεταρίσματος (stacking gel). Το καλούπι για το πήκτωμα αποτελείται από δύο γυάλινα πλακάκια, το ένα πιο παχύ από το άλλο, με διαφράγματα δεξιά και αριστερά. Το πάχος του πηκτώματος μπορεί να είναι 0,75mm ή 1,5mm ανάλογα με το πάχος των διαφραγμάτων και επιλέγεται με βάση την ποσότητα του δείγματος των πρωτεϊνών που χρειάζεται να ηλεκτροφορηθεί. Τα δύο γυαλάκια στερεώνονται σε κατακόρυφη διάταξη, έτσι ώστε να σχηματίζεται ένα κενό μεταξύ τους και ένα άνοιγμα από πάνω. Το πήκτωμα διαχωρισμού παρασκευάζεται πρώτο και πάνω σε αυτό πολυμερίζεται το πήκτωμα πακεταρίσματος. Το πήκτωμα διαχωρισμού αποτελείται από ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού (separating buffer), μείγμα ακρυλαμιδίου και δις-ακρυλαμιδίου 40% (Acrylamide 2K - Solution, 40%, Mix 24:1, AppliChem), APS (υπερθειϊκό αμμώνιο, ammonium persulfate, MERCK) και TEMED (τετραμεθυλο-διαμινο-αιθάνιο, tetramethyl-ethylene diamine, AppliChem) διαλυμένα σε ddh2o. Η σύσταση του 4x διαλύματος διαχωρισμού είναι 1,5M Tris-HCl, 0,4% SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate, SIGMA) και το ph προσαρμόζεται στο 8.8 με προσθήκη πυκνού υδροχλωρίου (HCl, hydrochloric acid 37%, CARLO ERBA). Για ένα πήκτωμα 10% προστίθενται σε ένα σωληνάκι falcon των 15mL τα παρακάτω αντιδραστήρια με τη σειρά που αναγράφονται: 1,957mL ddh2o, 1mL 4x διάλυμα διαχωρισμού, 1mL 40% ακρυλαμίδιο/δις-ακρυλαμίδιο, 40μL APS 10% w/v και 3μL TEMED. Τα δύο τελευταία συστατικά τοποθετούνται ταυτόχρονα γιατί μετά την προσθήκη τους

68 ξεκινάει ο πολυμερισμός του πηκτώματος. Αφού τα συστατικά ανακατευτούν καλά προκειμένου να διαλυθούν πλήρως ώστε να πήξει ομοιόμορφα το πήκτωμα, όσο αυτό είναι ακόμα υγρό μπαίνει στο καλούπι που έχει σχηματιστεί από τα γυάλινα πλακάκια. Πάνω από το πήκτωμα προστίθεται 1mL ισοβουτανόλης (isobutanol, AppliChem) κεκορεσμένη (saturated) με ddh2o προκειμένου να ευθυγραμμιστεί η στάθμη του και να μην παρεμποδιστεί ο πολυμερισμός από το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Αφήνεται να πολυμεριστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, στη συνέχεια απομακρύνεται η ισοβουτανόλη και ξεπλένεται 3 φορές με ddh2o. Το πήκτωμα πακεταρίσματος αποτελείται από ρυθμιστικό διάλυμα πακεταρίσματος (stacking buffer), μείγμα ακρυλαμιδίου και δις-ακρυλαμιδίου 40% (Acrylamide 2K - Solution, 40%, Mix 24:1, AppliChem), APS (υπερθειϊκό αμμώνιο, ammonium persulfate, MERCK) και TEMED (τετραμεθυλο-διαμινο-αιθάνιο, tetramethyl-ethylene diamine, AppliChem) διαλυμένα σε ddh2o. Η σύσταση του 4x διαλύματος πακεταρίσματος είναι 0,5M Tris-HCl, 0,4% SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate, SIGMA) και το ph προσαρμόζεται στο 6.8 (δύο μονάδες μικρότερο από το ph του διαλύματος διαχωρισμού) με προσθήκη πυκνού HCl (HCl, hydrochloric acid 37%, CARLO ERBA). Για ένα πήκτωμα πακεταρίσματος, το οποίο χρησιμοποιείται πάντα σε συγκέντρωση 4%, προστίθενται σε ένα σωληνάκι falcon των 15mL τα παρακάτω αντιδραστήρια με τη σειρά που αναγράφονται: 1,278mL ddh2o, 500μL 4x διάλυμα πακεταρίσματος, 200μL ακρυλαμίδιο/διςακρυλαμίδιο 40%, 20μL APS 10% w/v και 2μL TEMED. Τα δύο τελευταία συστατικά τοποθετούνται ταυτόχρονα γιατί μετά την προσθήκη τους ξεκινάει ο πολυμερισμός του πηκτώματος. Αφού τα συστατικά ανακατευτούν καλά προκειμένου να διαλυθούν πλήρως ώστε να πήξει ομοιόμορφα το πήκτωμα, όσο αυτό είναι ακόμα υγρό μπαίνει στο καλούπι, πάνω από το πήκτωμα διαχωρισμού. Τέλος τοποθετείται το χτενάκι που θα δημιουργήσει τα πηγαδάκια όπου θα εισαχθούν τα δείγματα των πρωτεϊνών και το πήκτωμα αφήνεται να πολυμεριστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Για την εντόπιση της πρωτεΐνης Nicastrin χρησιμοποιείται το κλάσμα λύσης (lysis fraction) των απομονωθέντων πρωτεϊνών, το οποίο ηλεκτροφορείται σε

69 πήκτωμα διαχωρισμού 8% λόγω του μεγάλου μεγέθους της (110 και 150kDa η ανώριμη και η ώριμη μορφή αντίστοιχα). Για την εντόπιση της πρωτεΐνης Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1) χρησιμοποιείται το κλάσμα PBS (PBS fraction) των απομονωθέντων πρωτεϊνών, το οποίο ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα διαχωρισμού 16% λόγω του μικρού μεγέθους της (17kDa). Για την εντόπιση της πρωτεΐνης GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) χρησιμοποιείται το κλάσμα λύσης (lysis fraction) των απομονωθέντων πρωτεϊνών, το οποίο ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα διαχωρισμού 10% λόγω του ενδιάμεσου μεγέθους της (55kDa). Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων. Μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος το καλούπι μπαίνει στη συσκευή ηλεκτροφόρησης (BIORAD), η οποία γεμίζεται με το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (running buffer) σύστασης 25mM Tris-HCl, 192mM γλυκίνη (glycine, AppliChem) και 0,1% SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate, SIGMA) διαλυμένα σε ddh2o (χρειάζονται περίπου 400mL). Το χτενάκι αφαιρείται, στην πρώτη θέση του φορτώνεται ένας protein ladder (Color Plus Prestained Protein Ladder, NEW ENGLAND, BioLabs), που περιέχει πρωτεΐνες μοριακού βάρους 230kDa, 150kDa, 100kDa, 80kDa, 60kDa, 50kDa, 40kDa, 30kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa, 10kDa, και στις υπόλοιπες τα πρωτεϊνικά δείγματα. Τα ηλεκτρόδια της συσκευής συνδέονται με ένα τροφοδοτικό ρεύματος και η ηλεκτροφόρηση γίνεται για 30 λεπτά σε τάση ρεύματος 50V (μέχρι τα δείγματα να φτάσουν το πήκτωμα διαχωρισμού) και για 90 λεπτά στα 125V (μέχρι το μέτωπο της χρωστικής που περιέχουν τα δείγματα να φτάσει το κάτω μέρος του πηκτώματος). Όταν εφαρμοστεί ηλεκτρικό πεδίο στο πήκτωμα, οι πρωτεΐνες και η χρωστική κυανό της βρωμοφαινόλης αρχίζουν να κινούνται προς το θετικό πόλο (άνοδος). (2) Στο πήκτωμα πακεταρίσματος τα ιόντα της χρωστικής είναι περισσότερο κινητικά των πρωτεϊνών και έτσι το μέτωπο των ζωνών τους προηγείται του μετώπου των πρωτεϊνών. (2) Οι πρωτεΐνες σχηματίζουν σε αυτό επικαλυπτόμενες μεταξύ τους, πυκνές ζώνες, κατά την κίνησή τους προς την αρχή του πηκτώματος διαχωρισμού. (2) Το πήκτωμα πακεταρίσματος εξασφαλίζει ότι οι πρωτεΐνες του κάθε δείγματος θα φτάσουν την ίδια χρονική στιγμή στο πήκτωμα

70 διαχωρισμού και θα διαχωριστούν μαζί. Σε αυτό η ταχύτητά τους μειώνεται λόγω της αντίστασης που συναντούν στη διέλευσή τους μέσω των μικρών πόρων του πηκτώματος και έτσι οι ζώνες αρχίζουν να διαχωρίζονται μεταξύ τους. (2) Οι μικρές πρωτεΐνες μετακινούνται εύκολα διαμέσου του πηκτώματος ενώ οι μεγάλες μένουν κοντά στην κορυφή. Για να είναι συγκρίσιμα τα αποτελέσματα που θα ληφθούν, χρησιμοποιείται η ίδια ποσότητα ολικής πρωτεΐνης από το κάθε δείγμα, π.χ. 15mg/mL. Έτσι γνωρίζοντας την ποσότητα της συνολικής πρωτεΐνης που περιέχει το κάθε δείγμα υπολογίζεται ο όγκος που πρέπει να φορτωθεί, στον οποίο θα περιέχεται η ζητούμενη ποσότητα. 8. ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΤΑ WESTERN Γενικές αρχές. Η μέθοδος του ανοσοαποτυπώματος ή μεταφοράς κατά Western (Western blotting) περιλαμβάνει τη μεταφορά των πρωτεϊνών που έχουν διαχωριστεί ηλεκτροφορητικά από το πήκτωμα σε ένα λεπτό μεμβρανώδες υλικό στήριξης (μεμβράνη) και την ανίχνευσή τους με τη χρήση μονοκλωνικών ή πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών. Η διαδικασία μεταφοράς των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται και αυτή ηλεκτροφορητικά. Το ρεύμα εδώ εφαρμόζεται κάθετα ως προς το πήκτωμα με κατεύθυνση προς τη μεμβράνη προκειμένου οι πρωτεΐνες να μεταναστεύσουν σε αυτή. Η μεταφορά αυτή είναι απαραίτητη γιατί οι πρωτεΐνες είναι περισσότερο προσβάσιμες στα αντισώματα όταν βρίσκονται στην επιφάνεια της μεμβράνης παρά στο πήκτωμα. Επίσης οι μεμβράνες είναι πιο εύχρηστες και πιο ανθεκτικές σε σχέση με τα πηκτώματα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν εύκολα για περισσότερες από μια ανοσοεντοπίσεις. Υλικά πρόσδεσης πρωτεϊνών. Τα συνηθέστερα υλικά στήριξης είναι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, νάιλον ή PVDF, στην επιφάνεια των οποίων προσδένονται με μη ομοιοπολικούς δεσμούς και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και ακινητοποιούνται οι πρωτεΐνες. Πιο συχνά επιλέγονται οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης καθώς δίνουν αρκετά καλά αποτελέσματα στη μεταφορά και την ανοσοαποτύπωση λόγω της χαμηλής μη-ειδικής πρόσδεσης αντισωμάτων σε αυτές. Οι μεμβράνες PVDF σε σύγκριση με της νιτροκυτταρίνης συγκρατούν

71 αποτελεσματικότερα τις πρωτεΐνες σε συγκεκριμένες δύσκολες συνθήκες ανοσοεντόπισης, όπως παρουσία οργανικών διαλυτών ή σε ιδιαίτερα υψηλά ή χαμηλά ph. Επίσης η μεγαλύτερη μηχανική ανθεκτικότητά τους τις καθιστά πλεονεκτικότερες σε περιπτώσεις πολλαπλών ανοσοεντοπίσεων. Μεταφορά σε μεμβράνη. Μετά την ηλεκτροφόρηση το πήκτωμα πακεταρίσματος απομακρύνεται και το πήκτωμα διαχωρισμού μπαίνει σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (transfer buffer) σύστασης 25mM Tris-HCl, 192mM γλυκίνη (glycine, AppliChem) και 10% v/v μεθανόλη (methanol, AppliChem) και αφήνεται να εξισορροπηθεί για 15 λεπτά. Το διάλυμα μεταφοράς περιέχει μεθανόλη η οποία ελαχιστοποιεί τη διόγκωση του πηκτώματος κατά τη διάρκεια της μεταφοράς και αυξάνει την ικανότητα πρόσδεσης των πρωτεϊνών στη μεμβράνη, ταυτόχρονα όμως δυσκολεύει την απομάκρυνση των πρωτεϊνών από το πήκτωμα. Για τη μεταφορά χρησιμοποιείται μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (PROTRAN nitrocellulose transfer membrane, Whatman) ή μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride, Immobilon-P Transfer Membrane, Millipore), κατάλληλη για την ανίχνευση πρωτεϊνών που βρίσκονται σε μικρή συγκέντρωση στο δείγμα. Η μεμβράνη κόβεται κατά 0,5cm μεγαλύτερη σε μέγεθος από το πήκτωμα, καθώς αυτό μεγαλώνει λίγο όταν διαβρέχεται από το διάλυμα μεταφοράς. Επίσης κόβεται ένα μικρό κομματάκι από την πάνω αριστερή πλευρά της για να μπορεί να ταυτοποιηθεί ο προσανατολισμός των δειγμάτων. Η μεμβράνη PVDF πριν χρησιμοποιηθεί, διαβρέχεται με μεθανόλη για 15 δευτερόλεπτα, ξεπλένεται με ddh2o για 2 λεπτά και τέλος μπαίνει σε διάλυμα μεταφοράς για τουλάχιστον 5 λεπτά. Η διάταξη μεταφοράς έχει στο κάτω μέρος ένα αφρώδες μαξιλαράκι, δύο κομμάτια χαρτί Whatman 3MM μεγέθους 0,5cm μεγαλύτερα από τη μεμβράνη, το πήκτωμα γυρισμένο ανάποδα ώστε ο protein ladder να βρίσκεται στη δεξιά πλευρά, τη μεμβράνη με την κομμένη άκρη της στην πάνω δεξιά πλευρά του πηκτώματος, άλλα δύο κομμάτια χαρτί Whatman 3MM ίδιου μεγέθους και ένα ακόμα αφρώδες μαξιλαράκι και κλείνεται μέσα στην ειδική κασέτα. Τα αφρώδη μαξιλαράκια και τα χαρτιά Whatman, εμποτίζονται πριν χρησιμοποιηθούν με διάλυμα μεταφοράς. Κάθε στοιχείο της διάταξης μεταφοράς που τοποθετείται στην κασέτα επιστρώνεται με τη βοήθεια μιας πλαστικής πιπέτας μιας χρήσεως για να απεγκλωβιστούν τυχόν

72 φυσαλίδες που θα εμποδίσουν τη μεταφορά. Η κασέτα μπαίνει στη συσκευή μεταφοράς (BIORAD) μαζί με μια παγοκύστη και η συσκευή γεμίζεται μέχρι πάνω με διάλυμα μεταφοράς (χρειάζονται περίπου 800mL). Το πήκτωμα βρίσκεται από την πλευρά του αρνητικού πόλου (κάθοδος) και η μεμβράνη από την πλευρά του θετικού πόλου (άνοδος), έτσι ώστε όταν εφαρμοστεί το ηλεκτρικό ρεύμα οι πρωτεΐνες που είναι αρνητικά φορτισμένες να μεταφερθούν από τον αρνητικό πόλο στο θετικό και έτσι από το πήκτωμα στη μεμβράνη. Ακόμα προστίθεται ένα μαγνητάκι και η συσκευή τοποθετείται πάνω σε ένα μαγνητικό αναδευτήρα (magnetic stirrer, SCHOTT), ώστε το διάλυμα μεταφοράς να παγώνει ομοιόμορφα από την παγοκύστη. Τα ηλεκτρόδια της συσκευής συνδέονται με ένα τροφοδοτικό ρεύματος και η μεταφορά γίνεται για λεπτά, ανάλογα με το μέγεθος της πρωτεΐνης, σε τάση ρεύματος 300V και ένταση 400mA. Μετά τη μεταφορά η μεμβράνη μπορεί να φυλαχθεί στους 4oC σε ένα δοχείο με ρυθμιστικό διάλυμα TBS (Tris-Buffered Saline) ph 7.6, σύστασης 10mM Tris-HCl ph 7.6, 15mM NaCl (χλωριούχο νάτριο, sodium chloride, AppliChem) διαλυμένα σε ddh2o, ή στους -20 o C αφού στεγνώσει στον αέρα για 10 λεπτά και τυλιχτεί σε διάφανη μεμβράνη μέχρι να χρησιμοποιηθεί για ανοσοεντόπιση των ζητούμενων πρωτεϊνών. Για την εντόπιση της πρωτεΐνης Nicastrin, η μεταφορά γίνεται σε μεμβράνη PVDF για 90 λεπτά. Για την εντόπιση της πρωτεΐνης Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1), η μεταφορά γίνεται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για 60 λεπτά. Για την εντόπιση της πρωτεΐνης GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), η μεταφορά γίνεται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για 60 λεπτά. Ανοσοεντόπιση πρωτεϊνών στη μεμβράνη. Από τη στιγμή που οι πρωτεΐνες έχουν προσδεθεί στην επιφάνεια της μεμβράνης, μπορεί να ξεκινήσει η διαδικασία της ανοσολογικής εντόπισης (immynoblotting). Καθώς η ταυτοποίηση βασίζεται στην ειδική πρόσδεση αντισωμάτων σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες είναι πολύ σημαντική η ελαχιστοποίηση της μη ειδικής σύνδεσης των αντισωμάτων στη μεμβράνη. Έτσι οι μη ειδικές αντιγονικές θέσεις δεσμεύονται με την επώαση της μεμβράνης με διάλυμα κάλυψης (blocking

73 solution) πού είναι διάλυμα 1-5% αλβουμίνης ορού βοός (bovine serum alvumin, BSA) ή ορού εμβρύου βοός (fetal bovine serum, FBS) ή διάλυμα 3-5% αποβουτυρωμένου γάλακτος σε σκόνη (non-fat dry milk). Τα συστατικά αυτά διαλύονται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα όπως το TBS (Tris-Buffered Saline) ή το PBS (Phosphate Buffered Saline) μαζί με κάποιο απορρυπαντικό όπως το Tween-20. Το πρωτογενές αντίσωμα στοχεύει την προς ανίχνευση πρωτεΐνη και συνήθως διαλύεται σε διάλυμα κάλυψης σε τέτοια αραίωση ώστε να μην προσδένεται μη ειδικά σε άλλες πρωτεΐνες που υπάρχουν στη μεμβράνη. Γενικά, υψηλές συγκεντρώσεις αντισώματος, μεγάλοι χρόνοι επώασης και υψηλές θερμοκρασίες αυξάνουν τη μη ειδική πρόσδεση. Οι περισσότερες πρωτεΐνες που διαχωρίζονται σε SDS πηκτώματα πολυακρυλαμίδης και μεταφέρονται με διαλύματα μεταφοράς που περιέχουν SDS διατηρούν σε σημαντικό βαθμό τη δομική ακεραιότητα των επιτόπων τους ώστε να αναγνωρίζονται εύκολα από ειδικά αντισώματα. Μετά την επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα η μεμβράνη ξεπλένεται καλά με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει και κάποιο απορρυπαντικό ώστε να απομακρυνθεί το μη προσδεδεμένο αντίσωμα και να διασπαστούν οι ασθενείς μη ειδικές αλληλεπιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος μέσω της δράσης του απορρυπαντικού. Στη συνέχεια η μεμβράνη επωάζεται με το δευτερογενές αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει το πρωτογενές και συγκεκριμένα την Fc σταθερή περιοχή του, η οποία είναι χαρακτηριστική του ζώου στο οποίο παρασκευάστηκε. Συνήθως το δευτερογενές αντίσωμα είναι ομοιοπολικά συζευγμένο με ένα ένζυμο όπως η υπεροξειδάση του ραπανακίου (horseradish peroxidase, HRP) ή η αλκαλική φωσφατάση (alkaline phosphatase, AP), προκειμένου να γίνει ο εντοπισμός του μετά από προσθήκη του υποστρώματος του ενζύμου και ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης. Η ποσότητα του μη προσδεδεμένου δευτερογενούς αντισώματος απομακρύνεται με ξέπλυμα της μεμβράνης με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται και για το ξέπλυμα από το πρωτογενές αντίσωμα

74 Ανοσοεντόπιση Nicastrin. Αρχικά γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20 (AppliChem), 5% γάλα σε σκόνη (Regilait), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Nicastrin του ανθρώπου, (goat polyclonal anti-nicastrin, sc-14369, Santa Cruz Biotechnology) αραιωμένο 1:1.000 σε διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 2,5% γάλα σε σκόνη, για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς (rabbit anti-goat IgG-HRP, sc-2768, Santa Cruz Biotechnology), αραιωμένο 1:5.000 σε διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 2,5% γάλα σε σκόνη, για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και ακολουθεί η εμφάνιση του σήματος. Ανοσοεντόπιση GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). Αρχικά γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20 (AppliChem), 5% γάλα σε σκόνη (Regilait), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης GFAP του ποντικού (mouse monoclonal anti-gfap, G3839, SIGMA), αραιωμένο 1:3.000 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 5% γάλα σε σκόνη), overnight, στους 4oC, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2302, Santa Cruz Biotechnology), αραιωμένο 1:3.000 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 5% γάλα σε

75 σκόνη), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και ακολουθεί η εμφάνιση του σήματος. Ανοσοεντόπιση Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1). Αρχικά γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20 (AppliChem), 4% γάλα σε σκόνη (Regilait), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Iba1 του ποντικού, (rabbit polyclonal anti-iba1, , Wako) αραιωμένο 1:300 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 4% γάλα σε σκόνη), overnight, στους 4oC, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς (goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, Santa Cruz Biotechnology), αραιωμένο 1:3.000 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 4% γάλα σε σκόνη), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και ακολουθεί η εμφάνιση του σήματος. Εμφάνιση σήματος. Για δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με την υπεροξειδάση του ραπανακίου (horseradish peroxidase, HRP), η ανίχνευση μπορεί να γίνει με το σύστημα ECL (Enhanced ChemiLuminescence) που βασίζεται στη χημειοφωταύγεια. Η φωταύγεια είναι η εκπομπή φωτός ως αποτέλεσμα της έκλυσης ενέργειας από μία ουσία σε διεγερμένη κατάσταση και στη χημειοφωταύγεια η διέγερση αυτή προκαλείται από μια χημική αντίδραση. Η ένωση luminol (3-aminophthalic hydrazide), που ανήκει στην κατηγορία των

76 κυκλικών διάκυλο-υδραζιδίων (cyclic diacylhydrazides), οξειδώνεται από την HRP, παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου, σε αλκαλικές συνθήκες και διεγείρεται. Επιστρέφοντας από τη διεγερμένη κατάσταση στην κατάσταση ηρεμίας, αμέσως μετά την οξείδωση, εκπέμπεται φως μήκους κύματος 428nm. Το φως αυτό είναι χαμηλής έντασης αλλά με τη χρήση χημικών ενισχυτών όπως τροποποιημένες φαινόλες επιτυγχάνεται ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Ως αποτέλεσμα η έντασή του μπορεί να αυξηθεί έως και φορές και ο χρόνος εκπομπής να επεκταθεί, βελτιώνοντας έτσι κατά πολύ την ευαισθησία της μεθόδου. Το φως που παράγεται φτάνει σε μέγιστο μετά από 5-20 λεπτά και στη συνέχεια φθίνει αργά με ένα χρόνο ημιζωής περίπου 60 λεπτά. Το σήμα μπορεί να ανιχνευθεί προσβάλλοντας ένα φωτοευαίσθητο φιλμ αυτοραδιογραφίας ύστερα από σύντομη έκθεση. Η μεμβράνη μετά το ξέπλυμα του δευτερογενούς αντισώματος επωάζεται με το μίγμα των αντιδραστηρίων που παρέχονται από το kit ενισχυμένης χημειοφωταύγειας Amersham ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) για 1 λεπτό. Αφού απομακρυνθεί η περίσσεια των αντιδραστηρίων, ακουμπώντας τη μια άκρη της μεμβράνης σε απορροφητικό χαρτί, αυτή τυλίγεται με διάφανη μεμβράνη και τοποθετείται σε μια κασέτα αυτοραδιογραφίας (Hypercassette, Amersham Biosciences). Σε σκοτεινό δωμάτιο, τοποθετείται πάνω στη μεμβράνη ένα ισομεγέθες κομμάτι φιλμ (Fuji medical X-ray film, Super Rx, 18x24, FUJIFILM), η κασέτα κλείνεται για χρόνους έκθεσης 30 δευτερόλεπτα έως 2 λεπτά και το φιλμ εμφανίζεται σε ειδικό μηχάνημα (film processor, OPTIMAX 2010, PROTEC). Πάνω στο φωτογραφικό φιλμ αποτυπώνονται σκουρόχρωμες ζωνώσεις που αντιστοιχούν στις ζώνες της πρωτεΐνες όπου συνδέθηκε το πρωτογενές αντίσωμα και σε αυτό με τη σειρά του το δευτερογενές. Πολλαπλές ανοσοεντοπίσεις. Μετά την πρώτη αντίδραση ανοσοεντόπισης και την καταγραφή του σήματος είναι δυνατό μια μεμβράνη να επαναχρησιμοποιηθεί για την εντόπιση μιας άλλης πρωτεΐνης που βρίσκεται στο ίδιο δείγμα. Επίσης μπορεί να γίνει ανίχνευση μιας πρωτεΐνης που υπάρχει σε όλα τα κύτταρα, όπως είναι η ακτίνη ή η τουμπουλίνη, προκειμένου να συγκριθούν οι ποσότητες των συνολικών πρωτεϊνών που περιέχονται στο κάθε δείγμα που έχει φορτωθεί. Απαραίτητη προϋπόθεση για το νέο κύκλο ανοσοεντόπισης είναι η

77 αποκόλληση (stripping) των προηγούμενων αντισωμάτων που δεσμεύτηκαν στη μεμβράνη κατά τον πρώτο κύκλο. Συνήθως αυτό επιτυγχάνεται με θέρμανση και με παράγοντες όπως το SDS, η μερκαπτοαιθανόλη και η ουρία. Οι παράγοντες αυτοί βέβαια μπορούν να αποκολλήσουν από τη μεμβράνη εκτός από τα αντισώματα και τις πρωτεΐνες του δείγματος, μετά από παρατεταμένη έκθεση σε αυτούς. Αυτό εξαρτάται και από το υλικό της μεμβράνης, για παράδειγμα οι μεμβράνες PVDF είναι πιο ανθεκτικές σε σχέση με τις μεμβράνες νιτροκυτταρίνης σε επαναλαμβανόμενες αποκολλήσεις. Για να γίνει δεύτερος κύκλος ανοσοεντόπισης, η μεμβράνη επωάζεται με διάλυμα αποκόλλησης (stripping solution), σύστασης 25mM γλυκίνη (glycine, AppliChem) με ph 2.0 που ρυθμίζεται με προσθήκη πυκνού υδροχλωρίου (HCl, hydrochloric acid 37%, CARLO ERBA), 1% w/v SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate, SIGMA), για 30 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Ακολουθεί δύο φορές πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα PBS, για 10 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση και η μεμβράνη μπορεί να φυλαχθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7.6 μέχρι τον επόμενο κύκλο ανοσοεντόπισης. Ανοσοεντόπιση Tubulin. Για να γίνει μια ποιοτική σύγκριση των ποσοτήτων των πρωτεϊνικών δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοεντόπιση της Nicastrin και της Presenilin, γίνεται ανίχνευση της πρωτεΐνης Tubulin στις ίδιες μεμβράνες. Αρχικά γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20 (AppliChem), 5% γάλα σε σκόνη (Regilait), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Tubulin του ανθρώπου (mouse monoclonal anti-β-tubulin III, T8660, SIGMA), αραιωμένο 1:500 σε διάλυμα στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 5% γάλα σε σκόνη), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε

78 θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς (goat anti-mouse IgG-HRP, sc2302, Santa Cruz Biotechnology), αραιωμένο 1:3.000 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 5% γάλα σε σκόνη), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και ακολουθεί η εμφάνιση του σήματος. Ανοσοεντόπιση GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Εναλλακτικά, αντί για την Tubulin μπορεί να γίνει ανίχνευση της πρωτεΐνης GAPDH, προκειμένου να συγκριθούν οι ποσότητες των πρωτεϊνικών δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοεντόπιση της GFAP και του Iba1. Αρχικά γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20 (AppliChem), 5% γάλα σε σκόνη (Regilait), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης GAPDH του ποντικού (goat polyclonal anti-gapdh, sc-20357, Santa Cruz Biotechnology), αραιωμένο 1:400 σε διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 3% γάλα σε σκόνη, overnight, στους 4oC, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς (rabbit anti-goat IgG-HRP, sc-2768, Santa Cruz Biotechnology), αραιωμένο 1:5.000 σε διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, 3% γάλα σε σκόνη, για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τρία πλυσίματα της μεμβράνης με διάλυμα TBS ph 7.6, 0,05% Tween 20, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και ακολουθεί η εμφάνιση του σήματος. 9. ΛΗΨΗ ΤΟΜΩΝ ΑΠΟ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΠΟΝΤΙΚΟΥ

79 Με τη χρήση μικροτόμου δονούμενης λεπίδας (vibratome, vibrating blade microtome, VT1000 S, Leica) παίρνουμε οβελιαίες, σειριακές τομές (sagittal, serial sections), πάχους 20 ή 40μm, από το δεξί ημισφαίριο του εγκεφάλου των ποντικών, χρησιμοποιώντας ξυραφάκια μίας χρήσεως (ASTOR, BiC, stainless, double edge blades). Ο εγκέφαλος στερεώνεται με κόλλα στιγμής (LOGO) στην τράπεζα, η οποία γεμίζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS (Tris-Buffered Saline) ph 8.0, σύστασης 10mM Tris-HCl ph 8.0, 15mM NaCl (χλωριούχο νάτριο, sodium chloride, AppliChem), διαλυμένα σε ddh2o, μέχρι ο εγκέφαλος να καλυφθεί πλήρως. Η μικροτόμος ρυθμίζεται σε ταχύτητα και συχνότητα κίνησης της λεπίδας 7. Αρχικά κόβονται τομές πάχους 150μm, οι οποίες απορρίπτονται, μέχρι να αποκαλυφθεί ο ιππόκαμπος και στη συνέχεια λαμβάνονται από όλο τον υπόλοιπο εγκέφαλο τομές πάχους 20 ή 40μm, ανάλογα με το πρωτόκολλο στο οποίο θα χρησιμοποιηθούν. Οι τομές μπαίνουν σε πιάτα κυτταροκαλλιέργιας 24 πηγαδιών (24-well tissue culture test plates, TPP) γεμισμένα με διάλυμα TBS ph 8.0 με νατραζίδιο (sodium azide, NaN3, AppliChem) 0,05% w/v. Κάθε τομή μπαίνει σε ένα πηγαδάκι ξεκινώντας από το 1A μέχρι το 6D και όταν το πιάτο γεμίσει μια φορά ξαναρχίζει να γεμίζεται από την αρχή. Τα πιάτα κλείνονται περιφερειακά με ταινία parafilm για αποκλεισμό της υγρασίας και φυλάσσονται στους 4οC. 10. ΧΡΩΣΗ NISSL Η χρώση Nissl (Nissl staining) ανήκει στις ιστολογικές χρώσεις, οι οποίες έχουν ως σκοπό την αύξηση της αντίθεσης μεταξύ των διαφόρων συστατικών των ιστών και των κυττάρων ώστε να γίνουν αυτά ορατά και να παρατηρηθεί η μορφολογία τους, καθώς τα περισσότερα κύτταρα φυσιολογικά είναι διάφανα. Η χρωστική ουσία που δίνει τη χρώση Nissl ονομάζεται cresyl violet, βάφει τα νουκλεϊνικά οξέα και χρησιμοποιείται κυρίως για το νευρικό ιστό. Αρχικά διαλέγονται τομές εγκεφάλου ποντικού πάχους 20μm, οι οποίες απλώνονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες διαστάσεων 25x75x1mm (microscope slides, SUPERFROST PLUS, Thermo Scientific) και αφήνονται να στεγνώσουν στον

80 αέρα για 24 ώρες. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται για τη χρώση μπαίνουν σε σωληνάκια falcon των 50mL, μέσα στα οποία βυθίζονται οι αντικειμενοφόροι ανά δύο. Την επόμενη μέρα οι τομές ενυδατώνονται σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline), για 10 λεπτά, υπό ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Στη συνέχεια γίνεται χρώση με τη χρωστική cresyl violet 0,5% διαλυμένη σε ddh2ο για 8 λεπτά και ακολουθεί ξέπλυμα βυθίζοντας τις αντικειμενοφόρους 5-8 φορές σε ένα σωληνάκι με ddh2ο. Για να διαφοροποιηθεί η χρώση οι αντικειμενοφόροι βυθίζονται 1-2 φορές σε διαλυμένο οξικό οξύ (dilute acetic acid) που παρασκευάζεται προσθέτοντας 2-3 σταγόνες οξικού οξέως (acetic acid, Fluka) σε 100mL ddh2ο και ξεπλένονται βυθίζοντάς τες 2-3 φορές σε σωληνάκι με ddh2ο. Στη συνέχεια γίνεται αφυδάτωση των τομών βυθίζοντάς τες διαδοχικά 1-2 φορές σε μια σειρά διαλυμάτων αιθανόλης σε ddh2ο, αυξανομένης συγκέντρωσης 30%, 50%, 75%, 90% και 100% v/v (ethanol absolute, AppliChem). Τέλος οι αντικειμενοφόροι μπαίνουν διαδοχικά σε δύο σωληνάκια με ξυλίνη (xylenes, Riedel-de Haën), για 5 λεπτά στο κάθε ένα. Πριν στεγνώσει η ξυλίνη μπαίνει πάνω στις τομές ένα λεπτό στρώμα από το διάφανο υλικό επικάλυψης DPX (DPX mountant for microscopy, BDH) και τοποθετούνται καλυπτρίδες διαστάσεων 24x50mm (CARL ROTH). Το υλικό επικάλυψης αποτελείται από μια συνθετική ρητίνη (DPX) διαλυμένη σε ξυλίνη που είναι οργανικός διαλύτης, γι αυτό μετά τη χρώση απαιτείται απομάκρυνση όλου του νερού των τομών με τη βοήθεια των αυξανόμενων συγκεντρώσεων αλκοόλης. Τέλος οι αντικειμενοφόροι αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες προκειμένου να στεγνώσει πλήρως και να στερεοποιηθεί το κολλώδες υλικό επικάλυψης. Η παρατήρησή τους γίνεται σε οπτικό μικροσκόπιο (light microscope, DM LS2, Leica) και η λήψη φωτογραφιών με τη χρήση κάμερας (DFC500, Leica) και του ανάλογου προγράμματος (LAS V3.6). 11. ΧΡΩΣΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΥΣ ΜΕ THIOFLAVIN S Η χρώση με Thioflavin S κατατάσσεται στις ιστοχημικές χρώσεις που σκοπό έχουν την ανίχνευση συγκεκριμένων χημικών ομάδων και ενώσεων στους ιστούς και στα κύτταρα. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες της χρωστικής είναι αυτές που

81 καθορίζουν την επιλεκτική προσρόφησή της σε συγκεκριμένες δομές. Το Thioflavin S είναι μια χρωστική που δεσμεύεται στα β-πτυχωτά ινίδια και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του ινώδους αμυλοειδούς στις πλάκες και τα αιμοφόρα αγγεία. (157) Το πρωτόκολλο εφαρμόζεται σε τομές εγκεφάλου ποντικού πάχους 40μm που μπαίνουν σε πηγαδάκια πιάτων κυτταροκαλλιέργειας (tissue culture test plates, TPP), στα οποία το κάθε αντιδραστήριο προστίθεται με πλαστικό πουάρ (ROTH) και απομακρύνεται με αναρρόφηση με γυάλινη πιπέτα παστέρ (BRAND). Αρχικά οι τομές ξεπλένονται τρείς φορές με διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline) για να απομακρυνθεί το διάλυμα φύλαξής τους, υπό έντονη ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph). Στη συνέχεια προστίθεται η χρωστική Thioflavin S (SIGMA) 1% w/v διαλυμένη σε ddh2ο, η οποία παρασκευάζεται κάθε φορά αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί και φιλτράρεται και η χρώση διαρκεί 8 λεπτά υπό ελαφριά ανακίνηση. (157) Η χρωστική αφαιρείται και ακολουθούν αφυδατώσεις, δύο φορές με αιθανόλη 80% v/v σε ddh2ο, για 3 λεπτά και μία φορά με αιθανόλη 95% v/v σε ddh2ο, για 3 λεπτά, υπό ανακίνηση. (157) Τέλος γίνεται ξέπλυμα τρεις φορές με ddh2ο για να απομακρυνθεί πλήρως η αιθανόλη. (157) Οι τομές απλώνονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες διαστάσεων 25x75x1mm (microscope slides, SUPERFROST PLUS, Thermo Scientific), καλύπτονται με υδατικό μέσο στερέωσης για φθορισμό (VECTASHIELD, VECTOR, mounting medium for fluorescence, H-1000), κλείνονται με καλυπτρίδες διαστάσεων 24x50mm (CARL ROTH) και φυλάσσονται στους 4οC προστατευμένες από το φως. Η παρατήρηση γίνεται σε μικροσκόπιο φθορισμού (fluorescence microscope, DMRA2, Leica) εφοδιασμένο με το κατάλληλο φίλτρο και με τη χρήση κάμερας (DFC350FX, Leica) και του ανάλογου προγράμματος (LAS V3.6) λαμβάνονται φωτογραφίες ή σε συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal microscope, TCS SP5, Leica) και με τη χρήση του ανάλογου προγράμματος (LAS AF Lite) λαμβάνονται φωτογραφίες. 12. ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

82 Γενικές αρχές. Η ανοσοϊστοχημεία (immunohistochemistry) αποτελεί τομέα της ιστοπαθολογίας και ασχολείται με την αναγνώριση φυσιολογικών ή παθολογικών συστατικών των κυττάρων και των ιστών. (4) Η αναγνώριση αυτή επιτυγχάνεται με την χρήση αντισωμάτων εναντίον των αντιγόνων-στόχων, τα οποία είναι συνδεδεμένα με ειδικές χρωστικές που καθιστούν έτσι ορατές τις θέσεις εντόπισης των αντιγόνων αυτών. (4) Η ανάπτυξη του ανοσοφθορισμού (immunofluorescence) άρχισε με τη σύνδεση αντισωμάτων με φθορίζουσες χρωστικές, όπως η ισοθειοκυανική φλουροσκεΐνη (fluorescein isothiocyanate, FITC), που δίνει πράσινο φθορισμό. (4) Τα διάφορα μειονεκτήματα του ανοσοφθορισμού οδήγησαν στην ανάπτυξη νέων τεχνικών που βασίζονται στη χρησιμοποίηση ενζύμων ή ενζυμικών συστημάτων. (4) Αυτά εφαρμόζονται στους ιστούς μετά τη σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος, χρωματίζοντας έντονα και σταθερά τις θέσεις εντόπισής τους, για να γίνουν έτσι ορατές με το κοινό μικροσκόπιο. (4) Οι τεχνικές αυτές ονομάζονται ανοσοενζυμικές και οι πιο σημαντικές είναι η τεχνική της ανοσοϋπεροξειδάσης, της αβιδίνης-βιοτίνης και της στρεπταβιδίνης, που λύνουν αρκετά από τα μειονεκτήματα του ανοσοφθορισμού έχοντας επιπλέον πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία. (4) Σήμερα είναι δυνατή η εντόπιση διαφόρων ενζύμων και πρωτεϊνών, προϊόντων έκκρισης των κυττάρων, κυτταρικών υποδοχέων, αντιγόνων μικροβίων και ιών καθώς και διαφόρων κυτταροπλασματικών και επιφανειακών αντιγονικών ομάδων με κυτταρική και ιστική ειδικότητα. (4) Σαν ειδικοί αντιοροί δηλαδή ειδικά αντισώματα έναντι στα αναζητούμενα αντιγόνα χρησιμοποιούνται πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα. (4) Τα πολυκλωνικά αντισώματα είναι λιγότερο εξειδικευμένα, επειδή στρέφονται εναντίον περισσότερων επιτόπων (καθοριστικών ομάδων), ενώ τα μονοκλωνικά αντισώματα θεωρούνται ιδιαίτερα εξειδικευμένα. (4) Μέθοδος ανοσοφθορισμού. Αρχικά γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων για αποφυγή μη ειδικής χρωστικής αντίδρασης (background staining). Στη συνέχεια προστίθεται το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης που αναζητείται, το οποίο σχηματίζει σταθερά ανοσοσυμπλέγματα με αυτή. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα που είναι ειδικό έναντι του πρωτογενούς και είναι συνδεδεμένο με μια χημική ουσία που έχει την ιδιότητα να

83 φθορίζει. Οι τομές εξετάζονται σε μικροσκόπιο φθορισμού, που παράγει υπεριώδες φως, το οποίο διεγείρει τη φθορίζουσα ουσία και αυτή κατά την αποδιέγερσή της εκπέμπει φως ορατού μήκους κύματος. Το βασικότερο μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ότι η φθορίζουσα χρώση ελαττώνεται γρήγορα με αποτέλεσμα την αδυναμία επανεξέτασης των παρασκευασμάτων μετά από κάποιο χρονικό διάστημα. (4) Επίσης η μορφολογική αξιολόγηση του ιστού είναι σχεδόν ανέφικτη καθώς κατά τη μικροσκόπηση του παρασκευάσματος διακρίνεται μόνο το ειδικό σήμα που παράγεται στις θέσεις σύνδεσης του αντισώματος με το αντιγόνο-στόχο. (4) Ανίχνευση Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1) με ανοσοφθορισμό. Αρχικά γίνονται τρία πλυσίματα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline), για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph), για να απομακρυνθεί το διάλυμα φύλαξής τους. Ακολουθεί διαπερατοποίηση (permeabilization) τού ιστού με διάλυμα PBS, 0,1% Triton X-100 (AppliChem) για 45 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση. Για κάλυψη των μη ειδικών θέσεων οι τομές επωάζονται με διάλυμα PBS, 0,01% Triton X-100, 10% ορός εμβρύου βοός (fetal calf serum, FCS, Gibco), 1% αλβουμίνη ορού βοός (albumin from bovine serum, BSA, SIGMA), για 3 ώρες, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση. Η επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης Iba1 του ποντικού (rabbit polyclonal anti-iba1, , Wako), αραιωμένο 1:250 σε διάλυμα PBS, 0,01% Triton X-100, 1% FCS, 0,1% BSA, γίνεται overnight, στους 4oC, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με ένα ξέπλυμα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα PBS, ακολουθούμενο από πέντε πλυσίματα με το ίδιο διάλυμα για 10 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς, συζευγμένο με φθορίζουσα ένωση (goat anti-rabbit IgG Cy 3-conjugated, , Jackson ImmunoResearch), αραιωμένο 1:300 σε διάλυμα PBS, 0,01% Triton X-100, 1% FCS, 0,1% BSA, για 90 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση και στο σκοτάδι. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί απομακρύνεται με ένα

84 ξέπλυμα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα PBS, ακολουθούμενο από τρία πλυσίματα με το ίδιο διάλυμα για 15 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και στο σκοτάδι. Για ταυτόχρονη χρώση των τομών με Thioflavin S, μετά το τελευταίο πλύσιμο, γίνεται χρώση με Thioflavin S 1% w/v σε ddh2ο, για 5 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση και στο σκοτάδι. Ακολουθούν δύο ξεπλύματα με 70% αιθανόλη, ένα πλύσιμο με 70% αιθανόλη, για 3 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση και στο σκοτάδι και τρία ξεπλύματα με ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Ανίχνευση GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) με ανοσοφθορισμό. Αρχικά γίνονται τρία πλυσίματα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα TBS (TrisBuffered Saline) ph 8.0, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph) για να απομακρυνθεί το διάλυμα φύλαξής τους. Οι τομές επωάζονται με διάλυμα TBS ph 8.0, 0,4% Triton X-100 (AppliChem), 5% φυσιολογικός ορός αλόγου (normal horse serum, NHS, VECTOR), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση. Η επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης GFAP του ποντικού (mouse monoclonal anti-gfap, G3839, SIGMA), αραιωμένο 1:500 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 8.0, 0,4% Triton X-100, 5% NHS), γίνεται overnight, στους 4oC, υπό ήπια ανακίνηση. Το πρωτογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με ένα ξέπλυμα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα ΤBS ph 8.0, ακολουθούμενο από πέντε πλυσίματα με το ίδιο διάλυμα για 10 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Ακολουθεί επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς, συζευγμένο με φθορίζουσα ένωση (goat anti-mouse IgG-FITC, F2012, Sigma), αραιωμένο 1:500 στο διάλυμα κάλυψης (TBS ph 8.0, 0,4% Triton X-100, 5% NHS), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ήπια ανακίνηση και στο σκοτάδι. Το δευτερογενές αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί απομακρύνεται με ένα ξέπλυμα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 8.0, ακολουθούμενο από τρία πλυσίματα με το ίδιο διάλυμα για 15 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση και στο σκοτάδι

85 Για ταυτόχρονη χρώση των τομών με Thioflavin S, μετά το τελευταίο πλύσιμο, γίνεται χρώση με Thioflavin S 1% w/v σε ddh2ο, για 5 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση και στο σκοτάδι. Ακολουθούν δύο ξεπλύματα με 70% αιθανόλη, ένα πλύσιμο με 70% αιθανόλη, για 3 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση και στο σκοτάδι και τρία ξεπλύματα με ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 8.0. Τέλος οι τομές απλώνονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες διαστάσεων 25x75x1mm (microscope slides, SUPERFROST PLUS, Thermo Scientific), καλύπτονται με υδατικό μέσο στερέωσης (VECTASHIELD, VECTOR, mounting medium for fluorescence, H-1000), κλείνονται με καλυπτρίδες διαστάσεων 24x50mm (CARL ROTH) και φυλάσσονται στους 4οC προστατευμένες από το φως. Η παρατήρηση γίνεται σε μικροσκόπιο φθορισμού (fluorescence microscope, DMRA2, Leica) εφοδιασμένο με το κατάλληλο φίλτρο και με τη χρήση κάμερας (DFC350FX, Leica) και του ανάλογου προγράμματος (LAS V3.6) λαμβάνονται φωτογραφίες. Ανοσοενζυμική μέθοδος. Η μεθοδολογία αυτή βασίζεται στην ανοσοδραστηριότητα των αντισωμάτων και στις χημικές ιδιότητες ενζύμων ή ενζυμικών συμπλεγμάτων. (4) Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται κυρίως είναι η υπεροξειδάση του υδρογόνου, η αλκαλική φωσφατάση και λιγότερο η οξειδάση της γλυκόζης. (4) Αυτά αντιδρούν με χρωμογόνα υποστρώματα, τα συνηθέστερα από τα οποία είναι η διαμινοβενζιδίνη (3,3'-diaminobenzidine, DAB) και η ερυθροκαρβαζόλη, προς σχηματισμό έγχρωμων τελικών προϊόντων. (4) Χαρακτηριστικό γνώρισμα της μεθόδου είναι η σύνδεση των αντισωμάτων έναντι της πρωτεΐνης που ανιχνεύεται με το ένζυμο και η προσθήκη του χρωμογόνου για εντοπισμό των ανοσοσυμπλεγμάτων. (4) Η τεχνική αυτή μπορεί να συνδυαστεί με τη μέθοδο του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης (avidin-biotin complex, ABC), αυξάνοντας έτσι την ευαισθησία της λόγω της μεγάλης δεσμευτικής ικανότητας μεταξύ βιοτίνης και αβιδίνης. (4) Η βιταμίνη βιοτίνη είναι ένα μικρό μόριο, χαμηλού μοριακού βάρους, που βρίσκεται στη λέκιθο του αυγού. (4, 51) Μπορεί να συζευχθεί με ένα αντίσωμα (ή οποιοδήποτε άλλο πρωτεϊνικό μόριο) με ήπια χημική αντίδραση, η οποία δεν

86 προκαλεί απώλεια της δραστικότητας του αντισώματος. (51) Η αβιδίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με μεγάλο μοριακό μέγεθος, που προέρχεται από το λεύκωμα του αυγού. (4, 51) Έχει μεγάλη τάση σύνδεσης με τη βιοτίνη καθώς φέρει τέσσερεις συνδετικές θέσεις ανά μόριο και έτσι μπορεί να σημανθεί με ραδιενεργά ισότοπα, φθορίζοντα μόρια ή ένζυμα συνδεδεμένα με τη βιοτίνη. (4, 51) Αρχικά ο ιστός επωάζεται με ένα βιοτινυλιωμένο αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης που ανιχνεύεται και στη συνέχεια προστίθεται ένα σύμπλεγμα αβιδίνης και ενζύμου συνδεδεμένου με βιοτίνη. (4) Στο σύμπλεγμα αυτό η αβιδίνη συνδέεται με το ένζυμο μέσω της βιοτίνης και έχει και κάποιες ελεύθερες θέσεις για να συνδεθεί με τη βιοτίνη του αντισώματος. (4) Η αντίδραση μεταξύ βιοτίνης και αβιδίνης έχει υψηλή ειδικότητα και τόσο ισχυρή συγγένεια, ώστε ο δεσμός μεταξύ των δύο μορίων είναι μη αντιστρεπτός κάτω από τις περισσότερες πειραματικές συνθήκες. (51) Το αντίσωμα που είναι συνδεδεμένο με τη βιοτίνη μπορεί να είναι είτε το πρωτογενές έναντι της πρωτεΐνης που ανιχνεύεται είτε ένα δευτερογενές αντίσωμα έναντι του πρωτογενούς. (4) Ανίχνευση του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου (Αβ) με ανοσοενζυμική μέθοδο. Αρχικά γίνονται τρία πλυσίματα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα TBS (TrisBuffered Saline) ph 8.0, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση σε εργαστηριακό αναδευτήρα (platform shaker, POLYMAX 1040, Heidolph) για να απομακρυνθεί το διάλυμα φύλαξής τους. (157) Ακολουθεί διαπερατοποίηση (permeabilization) τού ιστού με διάλυμα TBS ph 8.0, 0,1% Triton X-100 (AppliChem) για 3 φορές από 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση. Στη συνέχεια οι τομές επωάζονται με διάλυμα TBS ph 8.0, 0,6% υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, H2O2, 30%, SIGMA) για 30 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ελαφριά ανακίνηση. (157) Το στάδιο αυτό γίνεται για να εξουδετερωθεί η ενεργότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης, διαφορετικά εμφανίζεται στον ιστό μη ειδική χρωστική αντίδραση (background staining) εξαιτίας της δραστηριότητάς της κατά το στάδιο της προσθήκης του χρωμογόνου υποστρώματος. (4) Το διάλυμα αυτό απομακρύνεται με τρία πλυσίματα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 8.0, από 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. (157) Ακολουθεί επώαση των τομών με %

87 φορμικό οξύ (formic acid %, AppliChem) για 5 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ελαφριά ανακίνηση, προκειμένου να γίνει αποκάλυψη των επιτόπων του β-αμυλοειδούς, προσφέροντας έτσι περισσότερες αντιγονικές θέσεις για σύνδεση με το αντίσωμα. (4, 157) Το διάλυμα αυτό απομακρύνεται με ένα ξέπλυμα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 8.0, ακολουθούμενο από τρία πλυσίματα με το ίδιο διάλυμα για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. (157) Στη συνέχεια γίνεται κάλυψη των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων για αποφυγή μη ειδικής χρωστικής αντίδρασης (background staining). Οι τομές επωάζονται με διάλυμα TBS ph 8.0, 0,1% Triton X-100 (AppliChem), 15% φυσιολογικός ορός αλόγου (normal horse serum, NHS, VECTOR), για 60 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση. (157) Η επώαση με το αντίσωμα 6E10 έναντι του αμινοτελικού άκρου του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου (αμινοξικά κατάλοιπα 1 έως 16), συζευγμένο με βιοτίνη (mouse monoclonal antibeta amyloid, 6E10, biotin labeled, SIG-39340, SIGNET, COVANCE), αραιωμένο 1:500 σε διάλυμα TBS ph 8.0, 0,1% Triton X-100, 5% NHS, γίνεται overnight, στους 4oC, υπό ήπια ανακίνηση. (157) Το αντίσωμα, που δεν έχει προσδεθεί, απομακρύνεται με τέσσερα πλυσίματα των τομών με ρυθμιστικό διάλυμα ΤBS ph 8.0, για 5 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. (157) Επίσης γίνεται ένα τελικό πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline), για 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. (157) Ακολουθεί επώαση με το αντιδραστήριο ABC (Avidin and Biotynylated horseradish peroxidase Complex, Standard VECTASTAIN Elite ABC kit, VECTOR LABORATORIES), που περιέχει ένα σύμπλεγμα αβιδίνης και του ενζύμου υπεροξειδάση του ραπανακίου συνδεδεμένου με βιοτίνη, για 90 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανακίνηση. (157) Το σύμπλεγμα που δεν έχει προσδεθεί στο βιοτινυλιωμένο αντίσωμα απομακρύνεται με δύο πλυσίματα με ρυθμιστικό διάλυμα ΤBS ph 8.0, για 10 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. (157) Στη συνέχεια γίνεται χρώση των τομών με την προσθήκη διαλύματος που περιέχει διαμινοβενζιδίνη (DAB), υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, H2O2) και χλωριούχο νικέλιο (nickel chloride) (DAB Peroxidase Substrate kit, VECTOR LABORATORIES), για 1-2 λεπτά. (157) Η διαμινοβενζιδίνη πολυμερίζεται παρουσία

88 της υπεροξειδάσης και υπεροξειδίου του υδρογόνου, σχηματίζοντας ένα αδιάλυτο πολυμερές, που εντοπίζεται στις θέσεις αντιγόνου-αντισώματος, δίνοντας ένα καφέ χρώμα ορατό στο φωτονικό μικροσκόπιο. (4) Με την προσθήκη του χλωριούχου νικελίου το χρώμα που προκύπτει είναι αντί για καφέ γκρι-μαύρο για μεγαλύτερη αντίθεση. Οι μοριακές μεταβολές της διαμινοβανζιδίνης οδηγούν στο σχηματισμό σταθερού χρώματος που δεν είναι διαλυτό σε οργανικούς διαλύτες. (4) Για τερματισμό της χρώσης οι τομές ξεπλένονται δύο φορές με ddh2o και ακολουθούν δύο πλυσίματα με ddh2o, για 10 λεπτά το κάθε ένα, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό έντονη ανακίνηση. Οι τομές απλώνονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες διαστάσεων 25x75x1mm (microscope slides, SUPERFROST PLUS, Thermo Scientific) και αφήνονται να στεγνώσουν πλήρως στον αέρα. (157) Στη συνέχεια γίνεται αφυδάτωση των τομών με μια σειρά διαλυμάτων αιθανόλης σε ddh2ο αυξανομένης συγκέντρωσης, 50%, 75%, 95% και δύο 100% v/v (ethanol absolute, AppliChem) για 3 λεπτά στην κάθε μια. (157) Τέλος οι αντικειμενοφόροι μπαίνουν διαδοχικά σε δύο σωληνάκια falcon με ξυλίνη (xylenes, Riedel-de Haën), για 5 λεπτά στο κάθε ένα. (157) Πριν στεγνώσει η ξυλίνη μπαίνει πάνω στις τομές ένα λεπτό στρώμα από το διάφανο υλικό επικάλυψης DPX (DPX mountant for microscopy, BDH) και τοποθετούνται καλυπτρίδες διαστάσεων 24x50mm (CARL ROTH). (157) Τέλος οι αντικειμενοφόροι αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες προκειμένου να στεγνώσει πλήρως και να στερεοποιηθεί το κολλώδες υλικό επικάλυψης. Η παρατήρησή τους γίνεται σε οπτικό μικροσκόπιο (light microscope, DM LS2, Leica) και η λήψη φωτογραφιών με τη χρήση κάμερας (DFC500, Leica) και του ανάλογου προγράμματος (LAS V3.6). Στατιστική ανάλυση. Από τον εγκέφαλο του κάθε ζώου λαμβάνονται 6 οβελιαίες τομές, που απέχουν μεταξύ τους 200μm η κάθε μια και θεωρείται ότι τον αντιπροσωπεύουν ολόκληρο. Οι τομές βάφονται με ανοσοϊστοχημεία και λαμβάνονται φωτογραφίες από το φλοιό και τον ιππόκαμπο. Η έκταση της χρώσης στις περιοχές αυτές της κάθε τομής, που αντιπροσωπεύει και την εναπόθεση του αμυλοειδούς, ποσοτικοποιείται με τη χρήση του προγράμματος Image J (NIH). Η τιμή που λαμβάνεται αντιστοιχεί στο ποσοστό της επιφάνειας του φλοιού ή του ιππόκαμπου που έχει καλυφθεί από την εναπόθεση του αμυλοειδούς. Η μέτρηση

89 γίνεται ξεχωριστά για το φλοιό και τον ιππόκαμπο σε κάθε τομή και οι τιμές από όλες τις τομές ενός ζώου προστίθενται. Με τη χρήση του προγράμματος GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) λαμβάνεται ο μέσος όρος των μετρήσεων για την εναπόθεση του αμυλοειδούς στο φλοιό και τον ιππόκαμπο για όλα τα ζώα της ομάδας μελέτης και της ομάδα ελέγχου ξεχωριστά. Επίσης με το ίδιο πρόγραμμα τα αποτελέσματα συγκρίνονται μεταξύ της ομάδας μελέτης και της ομάδας ελέγχου με unpaired t-test προκειμένου να βρεθεί αν υπάρχουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές

90 ΜΕΡΟΣ Γ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

91 1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Χρησιμοποιούμενα πειραματόζωα. Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της Nicastrin, ενός από τα συστατικά του συμπλόκου της γ-εκκριτάσης (γ-secretase), στην παθολογία της νόσου του Alzheimer, έγινε απενεργοποίηση του γονιδίου της στον εγκέφαλο ενός διαγονιδιακού στελέχους ποντικών που αποτελεί μοντέλο της νόσου. Για να επιτευχθεί αυτό χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές σειρές διαγονιδιακών και γονιδιακά στοχευμένων ζώων που διασταυρώθηκαν μεταξύ τους: Τα διαγονιδιακά CamKIIα icre ποντίκια, που εκφράζουν την icre ρικομπινάση (codon-improved Cre recombinase) σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, κυρίως στο φλοιό και τον ιππόκαμπο, υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου CamKIIα (calcium/calmodulin dependent protein kinase IIα). (20) Τα γονιδιακά στοχευμένα Nicastrin -/- ποντίκια, που φέρουν δύο αντίγραφα ενός τροποποιημένου αλληλομόρφου του γονιδίου της Nicastrin, στο οποίο έχουν προστεθεί οι αλληλουχίες loxp και μπορούν να αφαιρεθούν από την icre ρικομπινάση, με αποτέλεσμα η πρωτεΐνη να μην παράγεται καθόλου. (79) Τα διπλά διαγονιδιακά 5XFAD ποντίκια-μοντέλα της νόσου Alzheimer, που συνεκφράζουν στον εγκέφαλο, υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου Thy1, την ανθρώπινη APP (amyloid precursor protein) με τρεις διαφορετικές FAD (familial Alzheimer s disease) μεταλλάξεις και την ανθρώπινη PS1 (presenilin 1) με δύο διαφορετικές FAD μεταλλάξεις, με αποτέλεσμα να υπερπαράγουν Αβ42. (107) Διασταυρώσεις μεταξύ των πειραματοζώων. Τα Nicastrin -/- ποντίκια διασταυρώνονται με τα CamKIIα icre και τα 5XFAD ποντίκια, προκειμένου να ληφθούν απόγονοι με το συνδυασμό CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD στο γονότυπό τους. Στα ζώα αυτά το γονίδιο της Nicastrin έχει απενεργοποιηθεί (Nicastrin knock-out) στις περιοχές του εγκεφάλου όπου εκφράζεται η icre ρικομπινάση και ταυτόχρονα στον εγκέφαλό τους υπάρχει η τάση για αυξημένη παραγωγή Αβ. Αν ο ρόλος της Nicastrin στη λειτουργικότητα του συμπλόκου της γεκκριτάσης είναι κρίσιμος, η παραγωγή του Αβ στα ζώα αυτά αναμένεται να είναι

92 μειωμένη. Σε διαφορετική περίπτωση, αν η Nicastrin δε διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, δε θα παρατηρηθούν αλλαγές στο φαινότυπο των ζώων αυτών και η παραγωγή του Αβ θα παραμένει αυξημένη. Πιο συγκεκριμένα οι διασταυρώσεις που πραγματοποιούνται είναι: Nicastrin -/- (x) CamKIIα icre Nicastrin +/- 5XFAD ή CamKIIα icre Nicastrin +/- 5XFAD (x) Nicastrin -/και CamKIIα icre Nicastrin +/- (x) Nicastrin -/- 5XFAD ή Nicastrin -/- 5XFAD (x) CamKIIα icre Nicastrin +/και οι απόγονοι που λαμβάνονται από αυτές τις διασταυρώσεις έχουν γονότυπο: Nicastrin +/ Nicastrin -/ CamKIIα icre Nicastrin +/ CamKIIα icre Nicastrin -/ Nicastrin +/- 5XFAD Nicastrin -/- 5XFAD CamKIIα icre Nicastrin +/- 5XFAD CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD Οι διασταυρώσεις γίνονται συνήθως μεταξύ ενός αρσενικού και ενός ή δύο θηλυκών ζώων που έχουν τον ίδιο γονότυπο, ηλικίας 6 εβδομάδων και άνω, οπότε έχουν φτάσει σε αναπαραγωγική ωριμότητα. Η εγκυμοσύνη διαρκεί 19 έως 21 ημέρες και η φροντίδα των μικρών από το θηλυκό διαρκεί περίπου 3 εβδομάδες. Σε αυτή την ηλικία τα μικρά απομακρύνονται από τη μητέρα, χωρίζονται σε αρσενικά και θηλυκά και τοποθετούνται σε ξεχωριστά κλουβιά. Το κάθε ζώο μαρκάρεται στα αυτιά και κόβεται ένα κομμάτι μήκους 1cm από την ουρά του, προκειμένου να γίνει απομόνωση DNA (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 1) και προσδιορισμός του γονότυπού του με χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reacion,

93 PCR) (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 2). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των τριών διαφορετικών διαγονιδίων στο γενετικό υλικό των ποντικών. Καθορισμός των ομάδων μελέτης και ομάδων ελέγχου. Τα ζώα που θα μελετηθούν είναι τα CamKIIα icre Nicastrin -/-, τα οποία συγκρίνονται με τα Nicastrin +/- και τα Nicastrin -/-, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου και τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD, τα οποία συγκρίνονται με τα Nicastrin -/- 5XFAD και τα Nicastrin +/- 5XFAD, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Τα Nicastrin +/- και τα Nicastrin -/- ποντίκια έχουν τον ίδιο φαινότυπο και μεταξύ τους και με φυσιολογικά ποντίκια Nicastrin +/+, καθώς απουσία της Cre ρικομπινάσης το γονιδιακά στοχευμένο αλληλόμορφο της Nicastrin (-) δεν αφαιρείται και η πρωτεΐνη παράγεται κανονικά. Αντίστοιχα τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD έχουν τον ίδιο φαινότυπο και μεταξύ τους και με τα διαγονιδιακά ποντίκια Nicastrin +/+ 5XFAD για τον ίδιο λόγο. Τα ποντίκια CamKIIα icre Nicastrin -/- συγκρίνονται με τα Nicastrin +/- και τα Nicastrin -/- για να βρεθούν οι γενικότερες επιπτώσεις που έχει η αφαίρεση του γονιδίου της Nicastrin στον εγκέφαλο των ποντικών. Τα ποντίκια CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD συγκρίνονται με τα Nicastrin -/- 5XFAD και τα Nicastrin +/- 5XFAD για να βρεθούν οι επιπτώσεις που έχει η αφαίρεση του γονιδίου της Nicastrin στην επεξεργασία της APP από τη γ-εκκριτάση και στην παραγωγή του Αβ στον εγκέφαλο των ποντικών. Συμπεριφορικός φαινότυπος των Nicastrin knock-out ποντικών. Οι απόγονοι που μας ενδιαφέρουν είναι οι CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD και δευτερευόντως οι CamKIIα icre Nicastrin -/-. Τα ζώα αυτά μπορούν να διακριθούν εύκολα από τα υπόλοιπα επειδή παρουσιάζουν το αντανακλαστικό του σφιξίματος των οπίσθιων ποδιών (hind-leg clasping reflex), χαρακτηριστικό σε ζώα που εμφανίζουν νευροεκφυλισμό. Για να αξιολογηθεί το αντανακλαστικό αυτό, το ποντίκι πιάνεται από την ουρά και σηκώνεται στον αέρα για πάνω από πέντε έως δέκα δευτερόλεπτα. (86) Τα φυσιολογικά ποντίκια εκτείνουν τα άκρα τους ενώ τα ποντίκια με νευροεκφυλιστικές ανωμαλίες μαζεύουν τα πίσω άκρα τους κοντά στο σώμα τους ή/και τα πιάνουν μεταξύ τους (βλ. Εικόνα 18). (86) Η όλη διαδικασία

94 πρέπει να γίνει γρήγορα, δεδομένου ότι τα ποντίκια που κρέμονται από την ουρά τους για μεγάλα διαστήματα αρχίζουν να αγωνίζονται, να στριφογυρίζουν, ακόμα και να λυγίζουν τον κορμό τους ώστε να σκαρφαλώσουν πάνω στην ουρά τους με τα μπροστινά πόδια τους. (86) Αν και αυτό το αντανακλαστικό αξιολογείται συνήθως ποιοτικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και βαθμοί σοβαρότητας (π.χ. 0 = φυσιολογικό, 1 = ένα ή και τα δύο πίσω πόδια μαζεύονται αλλά δεν πιάνονται, 2 = τα πίσω πόδια πιάνονται μεταξύ τους, 3 = και τα τέσσερα πόδια πιάνονται μεταξύ τους). (86) Εικόνα 18. Αριστερά: φυσιολογικό ποντίκι 12 μηνών όταν σηκώνεται από την ουρά. Δεξιά: ποντίκι της ίδιας ηλικίας με υψηλό βαθμό νευροεκφυλισμού που παρουσιάζει το ανώμαλο αντανακλαστικό σφιξίματος και των τεσσάρων άκρων όταν σηκώνεται από την ουρά. [99] Επιβίωση των Nicastrin knock-out ποντικών. Ιδανικό είναι τα ζώα που θα μελετηθούν να βρίσκονται σε όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ηλικία προκειμένου να υπάρχει μεγαλύτερη εναπόθεση Αβ στα 5XFAD ποντίκια και οι όποιες διαφορές μεταξύ της ομάδας μελέτης και ελέγχου να είναι εντονότερες. Όμως τα CamKIIα icre Nicastrin -/- και τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια, στα οποία έχουν αφαιρεθεί και τα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου της Nicastrin στις περιοχές του εγκεφάλου όπου εκφράζεται η icre ρικομπινάση, εμφανίζουν καθολική θνησιμότητα μετά την ηλικία των 2,5 μηνών. Είναι γνωστό ότι η Nicastrin παίζει

95 ουσιαστικό ρόλο στην κυτταρική επιβίωση και κατά συνέπεια στην ανάπτυξη του οργανισμού όπως έχει φανεί από το γεγονός ότι η πλήρης εξάλειψη του γονιδίου της σε ποντίκια (constitutive Nicastrin knockout mice) είναι εμβρυικά θανατογόνος. (88, 89) Συνεπώς η πρώιμη απομάκρυνση της πρωτεΐνης, από τον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/- και τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντικών, από την τρίτη κιόλας μέρα μετά τη γέννησή τους οδηγεί σε νευρωνικό θάνατο (νευροεκφυλισμό) που καταλήγει στο θάνατο των ζώων. Για το λόγο αυτό όλα τα πειραματόζωα των ομάδων μελέτης και ελέγχου θανατώνονται όταν βρίσκονται σε ηλικία περίπου 2,5 μηνών, συγκεκριμένα 70 έως 75 ημερών ανάλογα με τη σοβαρότητα του φαινοτύπου που παρουσιάζουν. Επειδή τα αρσενικά ποντίκια 5XFAD δεν έχουν αρχίσει ακόμα να εμφανίζουν την παθολογία της νόσου Alzheimer στην ηλικία αυτή, χρησιμοποιούνται για μελέτη μόνο τα θηλυκά ποντίκια τα οποία αρχίζουν να συσσωρεύουν Αβ από την ηλικία των 1,5 μηνών. (107) Τα ζώα θανατώνονται, απομακρύνεται όλο το αίμα από το σώμα τους και αφαιρείται ο εγκέφαλός τους (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 4), από τον οποίο το δεξί ημισφαίριο χρησιμοποιείται για ιστολογική ανάλυση (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 9) και το αριστερό για πρωτεϊνική ανάλυση (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 5). Τελικά συγκεντρώθηκε μια ομάδα μελέτης 11 θηλυκών CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών και μια ομάδα ελέγχου για αυτή 9 θηλυκών Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντικών. Επίσης συγκεντρώθηκε μια ομάδα μελέτης 7 θηλυκών CamKIIα icre Nicastrin -/5XFAD ποντικών και μια ομάδα ελέγχου για αυτή 10 θηλυκών Nicastrin -/- 5XFAD και Nicastrin +/- 5XFAD ποντικών

96 2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΑΦΑΙΡΕΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ NICASTRIN ΣΤΟΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΤΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ Στο παρελθόν είχε δημιουργηθεί ένα μοντέλο μεταγεννητικής επιλεκτικής αδρανοποίησης του γονιδίου της Nicastrin (conditional Νicastrin knock-out) ειδικά στον πρόσθιο εγκέφαλο (forebrain) των ποντικών και συγκεκριμένα στους ώριμους διεγερτικούς νευρώνες του φλοιού. (140) Και αυτά τα ζώα προέκυψαν από διασταύρωση γονιδιακά στοχευμένων Nicastrin -/- ποντικών με διαγονιδιακά ποντίκια που εξέφραζαν την Cre ρικομπινάση υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου CamKIIα. (140) Tα ποντίκια αυτά επιδεικνύουν μια γενική αποσταθεροποίηση του συμπλόκου της γ-εκκριτάσης, ηλικιο-εξαρτώμενη νευρωνική και συναπτική απώλεια στο φλοιό, που συνοδεύεται από αστροκυττάρωση, μικρογλοίωση, καθώς και υπερφωσφορυλίωση της σχετιζόμενης με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνης tau, με συμπεριφορικό αποτέλεσμα την προοδευτική εξασθένιση μάθησης και μνήμης. (140) Αρχικά ο φαινότυπος των ποντικών αυτών συγκρίθηκε με το φαινότυπο των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών για να διαπιστωθεί αν οι επιπτώσεις αυτές εμφανίζονται και σε αυτό το μοντέλο και να ερμηνευθεί ο πρόωρος θάνατος των ζώων Επίπεδα της Nicastrin στον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών Έλεγχος της αφαίρεσης του γονιδίου με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Για να διαπιστωθεί αν η αφαίρεση του γονιδίου της Nicastrin από την icre ρικομπινάση είναι επιτυχής στον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/ποντικών ελέγχθηκε σε αυτά η ακεραιότητά του με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reacion, PCR) (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 2). Συγκεκριμένα απομονώθηκε DNA (Βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 1) από το φλοιό και τον ιππόκαμπο του εγκεφάλου ενός CamKIIα icre Nicastrin -/- και ενός Nicastrin -/ποντικού, ηλικίας 2,5 μηνών. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε η τεχνική της PCR, στο DNA και των δύο ζώων, για να πολλαπλασιαστεί το κομμάτι αυτό του γονιδίου που περιέχει τις loxp θέσεις. Ο ένας εκκινητής της αντίδρασης είναι συμπληρωματικός

97 με μια αλληλουχία στο εξώνιο 4, πριν δηλαδή από το εσόνιο 4 όπου βρίσκεται η πρώτη loxp θέση στο στοχευμένο γονίδιο. Ο δεύτερος εκκινητής είναι συμπληρωματικός με μια αλληλουχία στο εξώνιο 8, μετά δηλαδή από το εσόνιο 7 όπου βρίσκεται η δεύτερη θέση loxp στο στοχευμένο γονίδιο. Με PCR, στο Nicastrin -/- ποντίκι πολλαπλασιάζεται ένα μεγάλου μεγέθους τμήμα (2.520bp) που περιέχει όλες τις ενδιάμεσες αλληλουχίες μεταξύ των δύο εκκινητών (βλ. Εικόνα 19). Αντίθετα στο CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκι πολλαπλασιάζεται ένα μικρότερο τμήμα (370bp) που δεν περιέχει την αλληλουχία που περιβάλλεται από τις θέσεις loxp καθώς αυτή έχει αφαιρεθεί από την icre ρικομπινάση με ανασυνδυασμό (βλ. Εικόνα 19). Όπως παρατηρείται στην εικόνα ο ανασυνδυασμός φαίνεται να συμβαίνει σε όλα τα κύτταρα του φλοιού και του ιππόκαμπου του CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικού καθώς στο δείγμα DNA που απομονώθηκε από αυτά δεν πολλαπλασιάζεται καθόλου το μεγάλου μεγέθους τμήμα 2.520bp. Η αντίδραση της PCR για τα δύο ζώα γίνεται και με τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται για να εντοπιστούν τα αλληλόμορφα του γονιδίου της Nicastrin που φέρουν, το στοχευμένο (-) ή το φυσιολογικό (+) (βλ. Εικόνα 19) bp 370bp 219bp 219bp

98 Εικόνα 19. Αριστερά: προϊόντα PCR με DNA που απομονώθηκε από το φλοιό και τον ιππόκαμπο ενός Nicastrin -/- ζώου ηλικίας 75 ημερών, και Δεξιά: προϊόντα PCR με DNA που απομονώθηκε από το φλοιό και τον ιππόκαμπο ενός CamKIIα icre Nicastrin -/- ζώου ηλικίας 73 ημερών. Αριστερά και Δεξιά: Στο πρώτο πηγαδάκι του πηκτώματος φαίνεται ο DNA ladder, στο δεύτερο είναι τα προϊόντα της αντίδρασης με τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστούν τα αλληλόμορφα που φέρουν τα ζώα και στο τρίτο είναι τα προϊόντα της αντίδρασης με τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί αν έχει γίνει επιτυχής ανασυνδυασμός. Έλεγχος των επιπέδων της πρωτεΐνης με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Τα επίπεδα της Nicastrin στον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/- και των CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντικών, εξετάστηκαν με ανοσοαποτύπωμα κατά Western (Western blotting) στα δείγματα των πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από το φλοιό του εγκεφάλου (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 5) ποντικών ηλικίας 2,5 μηνών. Παρατηρούμε ότι η απουσία της Nicastrin είναι πλήρης στα ζώα αυτά και συνεπώς ο ανασυνδυασμός που πραγματοποιείται από την icre ρικομπινάση είναι επιτυχής (βλ. Εικόνα 20). Στο προγενέστερο μοντέλο CamKIIα icre Nicastrin -/ποντικών, τα επίπεδα της απογλυκοζυλιωμένης Nicastrin στο φλοιό ποντικών ηλικίας 2 μηνών μετά από ανοσοαποτύπωμα κατά Western, εμφανίζουν μια μείωση κατά περίπου 50%. (140) Το υπόλοιπο ποσό της πρωτεΐνης αποδίδεται στην έκφρασή της στη γλοία (glia), στους διάμεσους νευρώνες (interneurons), και σε ένα μικρό ποσοστό διεγερτικών νευρώνων (excitatory neurons) που στερούνται την έκφραση της Cre ρικομπινάσης. (140) 55kDa CamKIIα icre Nicastrin -/ CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD Tubulin Nicastrin -/- 5XFAD 110/150kDa Nicastrin -/- Nicastrin

99 Εικόνα 20. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western για την πρωτεΐνη Nicastrin στα δείγματα απομονωμένων πρωτεϊνών από φλοιό εγκεφάλου από αριστερά προς τα δεξιά: δύο ποντικών Nicastrin -/-, ηλικίας 70 και 73 ημερών, δύο ποντικών CamKIIα icre Nicastrin -/-, ηλικίας 73 και 74 ημερών, δύο ποντικών Nicastrin +/- 5XFAD ηλικίας 70 ημερών, και δύο ποντικών CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ηλικίας 70 ημερών Μορφολογία του εγκεφάλου των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών Έλεγχος της μορφολογίας του εγκεφάλου με χρώση Nissl. Για να εξετάσει εάν η απενεργοποίηση του γονιδίου της Nicastrin έχει επιπτώσεις στη μορφολογία του εγκεφάλου, έγινε χρώση Nissl (Nissl staining) (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 10), σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 20μm (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 9) από τα CamKIIα icre Nicastrin -/- και τα Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, ηλικίας 2,5 μηνών. Στους εγκεφάλους των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών παρατηρείται ατροφία στο φλοιό και τον ιππόκαμπο με μείωση του όγκου τους, καθώς και σημαντική αύξηση του μεγέθους των πλάγιων κοιλιών, φαινόμενα που οφείλονται στην εκτεταμένη απώλεια νευρικών κυττάρων (βλ. Εικόνα 21). Ο έντονος νευροεκφυλισμός στον εγκέφαλο εξηγεί και τον πρόωρο θάνατο των ζώων αυτών σε μικρή ηλικία. Αντίστοιχα φαινόμενα παρατηρήθηκαν και στο προγενέστερο μοντέλο CamKIIα icre Nicastrin /- ποντικών, σε μεγαλύτερη όμως ηλικία (6 μηνών και άνω), με μαζική ατροφία στο φλοιό, μείωση του όγκου του και μεγέθυνση των πλάγιων κοιλιών λόγω της σημαντικής μείωσης του αριθμού των νευρώνων. (140) Ο νευροεκφυλισμός που παρατηρείται στα ποντίκια αυτά πιθανόν συμβαίνει μέσω απόπτωσης, όπως φαίνεται από τους αυξημένους αριθμούς αποπτωτικών νευρώνων που εντοπίζονται. (140) Παρ όλα αυτά στην ηλικία των 2 μηνών η μορφολογία του εγκεφάλου αυτών των ποντικών εμφανίζεται φυσιολογική, ο αριθμός των νευρώνων στο φλοιό δεν έχει σημαντικές διαφορές και ο όγκος του φλοιού και του ιππόκαμπου εμφανίζεται ανεπηρέαστος. (140)

100 Εικόνα 21. Οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 20μm μετά από χρώση Nissl. Στις εικόνες εμφανίζεται φλοιός και ιππόκαμπος από ένα Nicastrin -/- (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/- (κάτω) ποντίκι, ηλικίας 73 και 70 ημερών αντίστοιχα. Μεγέθυνση 50x

101 2.3. Κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος στον εγκέφαλο των ποντικών Δεδομένου ότι ο νευροεκφυλισμός συνοδεύεται συχνά από φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ανοσοποιητικού συστήματος, ελέγχθηκαν τα επίπεδα δεικτών φλεγμονής στα CamKIIα icre Nicastrin -/- συγκριτικά με τα Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια. Επίσης είναι γνωστό ότι η φλεγμονή στον εγκέφαλο αποτελεί βασικό γνώρισμα της νόσου Alzheimer και χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενεργοποιημένων αστροκυττάρων (αστροκυττάρωση) και μικρογλοιακών κυττάρων (μικρογλοίωση) που περιβάλλουν τις αμυλοειδείς πλάκες. (8) Παρόμοια με τη νόσο Alzheimer, τα διαγονιδιακά ποντίκια-μοντέλα της νόσου έχουν αυξημένους δείκτες φλεγμονής και γλοίωσης που συνδέονται με τις εναποθέσεις του αμυλοειδούς σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου. (49, 69, 139) Η αστροκυττάρωση και η μικρογλοίωση στα 5XFAD ποντίκια είναι ανάλογη με τα επίπεδα του Αβ42 και της εναπόθεσης του αμυλοειδούς στον εγκέφαλο και αρχίζει περίπου τη στιγμή που οι πλάκες πρωτοξεκινούν να εμφανίζονται, δηλαδή για τα θηλυκά ζώα από την ηλικία των 2 μηνών. (107) Το χωρικό πρότυπο της μικρογλοίωσης και της αστροκυττάρωσης στον εγκέφαλο των ζώων αυτών ακολουθεί στενά την κατανομή των αμυλοειδικών εναποθέσεων. (107) Μάλιστα στις τομές από εγκεφάλους 5XFAD ποντικών παρατηρούνται αστροκύτταρα που περιβάλλουν τις εναποθέσεις του αμυλοειδούς. (107) Για το λόγο αυτό ελέγχθηκαν τα επίπεδα δεικτών φλεγμονής και στα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD συγκριτικά με τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια. Έλεγχος για αστροκυττάρωση στον εγκέφαλο των ποντικών. Για να εξεταστεί εάν υπάρχει σε εξέλιξη αστροκυττάρωση (astrocytosis), δηλαδή αύξηση του αριθμού και ενεργοποίηση των αστροκυττάρων στον εγκέφαλο των ποντικών, ελέγχθηκε η πρωτεΐνη GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), ένας δείκτης δραστηριοποίησης των αστροκυττάρων. Ανίχνευση της GFAP με ανοσοφθορισμό. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης έγινε με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού (immunofluorescence) (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 12) σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 9) από τα

102 CamKIIα icre Nicastrin -/- και τα Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου καθώς και από τα CamKIIα icre Nicastrin /- 5XFAD και τα Nicastrin +/- 5XFAD και Nicastrin -/-5XFAD ποντίκια, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, ηλικίας 2,5 μηνών. Παρατηρούμε ότι η ανοσοδραστικότητα (immunoreactivity) της GFAP στο φλοιό και στον ιππόκαμπο είναι πολύ έντονη στα CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκια σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια της ίδιας ηλικίας (βλ. Εικόνα 22 και 23) λόγω του εκτεταμένου νευροεκφυλισμού. Στο προγενέστερο μοντέλο CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών η ανοσοδραστικότητα της GFAP εμφανίζει μια μικρή αύξηση στο φλοιό και καμία αλλαγή στον ιππόκαμπο των ποντικών ηλικίας 2 μηνών αλλά στις ηλικίες των 6 και 9 μηνών αυξάνεται προοδευτικά και στο φλοιό και στον ιππόκαμπο. (140) Τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια έχουν ελαφρώς αυξημένη ανοσοδραστικότητα σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια, που εντοπίζεται κυρίως στο υπόθεμα (subiculum) του ιππόκαμπου (βλ. Εικόνα 24 και 25). Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος στην περιοχή αυτή δικαιολογείται από το γεγονός ότι εκεί υπάρχει αυξημένη εναπόθεση Αβ και σχηματισμός αμυλοειδών πλακών στα ζώα αυτά. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από την ταυτόχρονη χρώση για αμυλοειδές με Thioflavin S και εντόπιση της GFAP με ανοσοφθορισμό (βλ. Εικόνα 24). Τέλος, τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια εμφανίζουν έντονη ανοσοδραστικότητα στο φλοιό και τον ιππόκαμπο συγκρίσιμη με αυτή των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών λόγω εκτεταμένου νευροεκφυλισμού (βλ. Εικόνα 24 και 25). Παρατηρούμε όμως ότι δεν υπάρχει αυξημένη ανοσοδραστικότητα στο υπόθεμα του ιππόκαμπου όπως συμβαίνει στα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια, κάτι που ερμηνεύεται από την ελαττωμένη εναπόθεση αμυλοειδούς στην περιοχή αυτή

103 Εικόνα 22. Ανοσοφθορισμός για την πρωτεΐνη GFAP σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm. Στις εικόνες εμφανίζεται ο φλοιός από ένα Nicastrin -/- (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/(κάτω) ποντίκι, ηλικίας 72 και 75 ημερών αντίστοιχα. Μεγέθυνση 50x

104 Εικόνα 23. Εστίαση στο φλοιό των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin -/- και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκι. Μεγέθυνση 200x

105 Εικόνα 24. Ανοσοφθορισμός για την πρωτεΐνη GFAP σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm. Στις εικόνες εμφανίζεται ο φλοιός από ένα Nicastrin +/- 5XFAD (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD (κάτω) ποντίκι, ηλικίας 72 και 70 ημερών αντίστοιχα. Μεγέθυνση 50x. Ένθετη φωτογραφία: εικόνα από το υπόθεμα του ιππόκαμπου μετά από ταυτόχρονη χρώση με Thioflavin S και εντόπιση της GFAP με ανοσοφθορισμό σε μια τομή από το ίδιο ζώο. Μεγέθυνση 100x

106 Εικόνα 25. Εστίαση στο φλοιό των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin +/- 5XFAD και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκι. Μεγέθυνση 200x

107 Έλεγχος των επιπέδων της GFAP με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Η παρουσία της πρωτεΐνης στον εγκέφαλο των ποντικών εξετάστηκε και με ανοσοαποτύπωμα κατά Western στα δείγματα των πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από ολικό εγκέφαλο (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 5) και των τεσσάρων ομάδων ζώων. Τα αποτελέσματα που παίρνουμε συμβαδίζουν πλήρως με τις εικόνες από τον ανοσοφθορισμό. Παρατηρούμε ότι η αύξηση των επιπέδων της GFAP είναι πολύ έντονη στα CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκια σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια της ίδιας ηλικίας (βλ. Εικόνα 26). Τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια δε φαίνεται να παρουσιάζουν αύξηση σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια καθώς η ενεργοποίηση των αστροκυττάρων εντοπίζεται σε μια πολύ μικρή περιοχή του εγκεφάλου, το υπόθεμα του ιππόκαμπου (βλ. Εικόνα 26). Τέλος τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια εμφανίζουν πολύ έντονη αύξηση συγκρίσιμη με αυτή των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών (βλ. Εικόνα 26). Στο προγενέστερο μοντέλο CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών στην ηλικία των 2 μηνών παρατηρείται μια μικρή αλλά στατιστικώς σημαντική αύξηση των επιπέδων της GFAP στο φλοιό και μεγάλη αύξηση στην ηλικία των 6 μηνών. (140) GFAP 55kDa 33kDa Nicastrin +/- 5XFAD CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD CamKIIα icre Nicastrin -/- Nicastrin -/- GAPDH Εικόνα 26. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western για την πρωτεΐνη GFAP στα δείγματα απομονωμένων πρωτεϊνών από ολικό εγκέφαλο από αριστερά προς τα δεξιά: δύο ποντικών Nicastrin -/- 72 και

108 ημερών, δύο ποντικών CamKIIα icre Nicastrin -/- 75 ημερών, δύο ποντικών CamKIIα icre Nicastrin -/5XFAD 70 και 72 ημερών και δύο ποντικών Nicastrin +/- 5XFAD 72 ημερών. Έλεγχος για μικρογλοίωση στον εγκέφαλο των ποντικών. Για να εξεταστεί εάν υπάρχει μικρογλοίωση (microgliosis), δηλαδή αύξηση του αριθμού και ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων στον εγκέφαλο των ποντικών, ελέγχθηκε η πρωτεΐνη Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1), ένας δείκτης δραστηριοποίησης των μικρογλοιακών κυττάρων. Ανίχνευση της Iba1 με ανοσοφθορισμό. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης έγινε με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού (immunofluorescence) (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 12) σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 9) από τα CamKIIα icre Nicastrin -/- και τα Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου καθώς και από τα CamKIIα icre Nicastrin /- 5XFAD και τα Nicastrin +/- 5XFAD και Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, ηλικίας 2,5 μηνών. Παρατηρούμε ότι η ανοσοδραστικότητα (immunoreactivity) της Iba1 στο φλοιό και στον ιππόκαμπο είναι πολύ έντονη στα CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκια σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια της ίδιας ηλικίας (βλ. Εικόνα 27 και 28) λόγω του εκτεταμένου νευροεκφυλισμού. Στο προγενέστερο μοντέλο CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών η ανοσοδραστικότητα της Iba1 εμφανίζει μια μικρή αύξηση στο φλοιό και στον ιππόκαμπο των ποντικών ηλικίας 2 μηνών και στις ηλικίες των 6 και 9 μηνών η αύξηση στο φλοιό και στον ιππόκαμπο είναι δραματική. (140) Τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια έχουν ελαφρώς αυξημένη ανοσοδραστικότητα σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια, που εντοπίζεται κυρίως στο υπόθεμα (subiculum) του ιππόκαμπου (βλ. Εικόνα 29 και 30). Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος στην περιοχή αυτή δικαιολογείται από το γεγονός ότι εκεί υπάρχει αυξημένη εναπόθεση Αβ και σχηματισμός αμυλοειδών πλακών στα ζώα αυτά. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από την ταυτόχρονη χρώση με Thioflavin S και εντόπιση της Iba1 με ανοσοφθορισμό (βλ. Εικόνα 29). Τέλος, τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια εμφανίζουν έντονη ανοσοδραστικότητα στο φλοιό και

109 τον ιππόκαμπο συγκρίσιμη με αυτή των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών λόγω εκτεταμένου νευροεκφυλισμού (βλ. Εικόνα 29 και 30). Παρατηρούμε όμως ότι δεν υπάρχει εντόπιση της ανοσοδραστικότητας στο υπόθεμα του ιππόκαμπου όπως συμβαίνει στα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια, κάτι που ερμηνεύεται από την ελαττωμένη εναπόθεση αμυλοειδούς στην περιοχή αυτή

110 Εικόνα 27. Ανοσοφθορισμός για την πρωτεΐνη Iba1 σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm. Στις εικόνες εμφανίζεται ο φλοιός από ένα Nicastrin -/- (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/- (κάτω) ποντίκι, ηλικίας 75 ημερών. Μεγέθυνση 50x

111 Εικόνα 28. Εστίαση στο φλοιό των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin -/- και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκι. Μεγέθυνση 200x

112 Εικόνα 29. Ανοσοφθορισμός για την πρωτεΐνη Iba1 σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm. Στις εικόνες εμφανίζεται ο φλοιός από ένα Nicastrin +/- 5XFAD (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/5XFAD (κάτω) ποντίκι, ηλικίας 72 και 70 ημερών αντίστοιχα. Μεγέθυνση 50x. Ένθετη φωτογραφία: εικόνα από το υπόθεμα του ιππόκαμπου μετά από ταυτόχρονη χρώση με Thioflavin S και εντόπιση της Iba1 με ανοσοφθορισμό σε μια τομή από το ίδιο ζώο. Μεγέθυνση 100x

113 Εικόνα 30. Εστίαση στο φλοιό των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin +/- 5XFAD και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκι. Μεγέθυνση 200x

114 Έλεγχος των επιπέδων της Iba1 με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Η παρουσία της πρωτεΐνης στον εγκέφαλο των ποντικών εξετάστηκε και με ανοσοαποτύπωμα κατά Western στα δείγματα των πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από ολικό εγκέφαλο (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 5) και των τεσσάρων ομάδων ζώων. Τα αποτελέσματα που παίρνουμε συμβαδίζουν πλήρως με τις εικόνες από τον ανοσοφθορισμό. Παρατηρούμε ότι η αύξηση των επιπέδων της Iba1 είναι πολύ έντονη στα CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντίκια σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια της ίδιας ηλικίας (βλ. Εικόνα 31). Τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια δε φαίνεται να παρουσιάζουν αύξηση σε σχέση με τα φυσιολογικά Nicastrin +/- και Nicastrin -/- ποντίκια καθώς η ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων εντοπίζεται σε μια πολύ μικρή περιοχή του εγκεφάλου, το υπόθεμα του ιππόκαμπου (βλ. Εικόνα 31). Τέλος τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια εμφανίζουν πολύ έντονη αύξηση συγκρίσιμη με αυτή των CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών (βλ. Εικόνα 31). Στο προγενέστερο μοντέλο CamKIIα icre Nicastrin -/- ποντικών στην ηλικία των 2 μηνών παρατηρείται σημαντική αύξηση των επιπέδων της Iba1 στο φλοιό και πολύ μεγάλη αύξηση στην ηλικία των 6 μηνών. (140) Iba1 17kDa 33kDa Nicastrin +/- 5XFAD CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD CamKIIα icre Nicastrin -/- Nicastrin -/- GAPDH Εικόνα 31. Ανοσοαποτύπωμα κατά Western για την πρωτεΐνη Iba1 στα δείγματα απομονωμένων πρωτεϊνών από ολικό εγκέφαλο από αριστερά προς τα δεξιά: δύο ποντικών Nicastrin -/- 72 και

115 ημερών, δύο ποντικών CamKIIα icre Nicastrin -/- 75 ημερών, δύο ποντικών CamKIIα icre Nicastrin -/5XFAD 70 και 72 ημερών και δύο ποντικών Nicastrin +/- 5XFAD 72 ημερών

116 3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΑΦΑΙΡΕΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ NICASTRIN ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΥ β ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΥΣ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ (Αβ) Τα 5XFAD ποντίκια εμφανίζουν από πολύ μικρή ηλικία υψηλά επίπεδα β αμυλοειδούς πεπτιδίου (Αβ) στον εγκέφαλο, κυρίως Αβ42 και πολύ λιγότερο Αβ40. (107) Τα επίπεδα του Αβ42 και του Αβ40 αυξάνονται με σχεδόν γραμμικό τρόπο όσο τα ποντίκια μεγαλώνουν αλλά ο ρυθμός αύξησης του Αβ 40 είναι μικρότερος. (107) Στα θηλυκά ζώα η συσσώρευση του Αβ42 ξεκινάει από τους 1,5 μήνες ενώ του Αβ40 από τους 2 μήνες περίπου, συνεπώς τα νεαρά ποντίκια παράγουν Αβ 42 σχεδόν αποκλειστικά. (107) Έτσι αποτελούν ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης της απαλοιφής της Nicastrin από τον εγκέφαλο των ποντικών στην επεξεργασία της APP και στην παραγωγή του Αβ Παραγωγή του Αβ Ανίχνευση του Αβ με ανοσοϊστοχημεία. Εξαιτίας των πολύ υψηλών επιπέδων Αβ42 που συσσωρεύονται γρήγορα, υπάρχει σημαντική εναπόθεση αμυλοειδούς σε μορφή πλακών στον εγκέφαλο των 5XFAD ποντικών ακόμα και σε μικρές ηλικίες. (107) Οι εναποθέσεις αυτές γίνονται ορατές σε τομές εγκεφάλου θηλυκών ποντικών από την ηλικία των 2 μηνών και άνω με ανοσοϊστοχημεία (immunohistochemistry) όπου χρησιμοποιούνται αντισώματα έναντι του συνολικού Αβ, του Αβ42 και του Αβ40. (107) Στις εναποθέσεις αυτές κυριαρχεί το Αβ42 και σε πολύ μικρό βαθμό εμφανίζεται Αβ40, σε αναλογία με τα χαμηλά επίπεδά του στον εγκέφαλο των ποντικών. (107) Όσον αφορά το χωρικό πρότυπο της εναπόθεσης του αμυλοειδούς στον εγκέφαλο, στα νεαρά ποντίκια οι πλάκες εμφανίζονται αρχικά στο στρώμα 5 του φλοιού (cortical layer 5) και στο υπόθεμα (subiculum) του ιππόκαμπου. (107) Με ανάλογη τεχνική εξετάστηκε η εναπόθεση του αμυλοειδούς στον εγκέφαλο των CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD και των Nicastrin +/- 5XFAD και Nicastrin -/- 5XFAD ποντικών, που αποτελούν την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, ηλικίας 2,5 μηνών. Συγκεκριμένα σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm των

117 ποντικών εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία (immunohistochemistry) με το αντίσωμα 6E10 (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 12). Αυτό είναι ένα μονοκλωνικό IgG1 αντίσωμα που παράγεται από ποντίκι και αναγνωρίζει τα αμινοξικά κατάλοιπα 1 έως 16 του ανθρώπινου Αβ. Συγκεκριμένα ο επίτοπός του βρίσκεται στα αμινοξικά κατάλοιπα 3 έως 8 του Αβ και αναγνωρίζει τις διάφορες μορφές διαφορετικού μήκους του Αβ καθώς και τις πρόδρομες μορφές του δηλαδή την APP και τα καρβοξυτελικά τμήματα της APP (CTFs) που προκύπτουν μετά από κόψιμο από την α- και βεκκριτάση. Παρατηρούμε ότι στην ανοσοϊστοχημική χρώση με το αντίσωμα 6E10 τα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD θηλυκά ποντίκια ηλικίας 2,5 μηνών εμφανίζουν έντονη εναπόθεση Αβ με τη μορφή πλακών κυρίως στο υπόθεμα του ιππόκαμπου και λιγότερο στο στρώμα 5 του φλοιού (βλ. Εικόνα 32, 33 και 34). Τα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD θηλυκά ποντίκια της ίδιας ηλικίας από την άλλη πλευρά εμφανίζουν αισθητά μειωμένη εναπόθεση Αβ στο υπόθεμα του ιππόκαμπου ενώ στο φλοιό η εναπόθεση είναι σχεδόν ίδια με αυτή που εμφανίζεται στα Nicastrin +/- 5XFAD και τα Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια (βλ. Εικόνα 32, 33 και 34). Μετά από ποσοτικοποίηση της έκτασης της χρώσης σε έξι τομές και στατιστική επεξεργασία σε έξι ζώα κάθε ομάδας προκύπτει ότι στον ιππόκαμπο υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά (p<0,05) ενώ στο φλοιό όχι (p>0,05) (βλ. Εικόνα 35). Στο προγενέστερο μοντέλο απενεργοποίησης της Nicastrin στον εγκέφαλο των ποντικών τα επίπεδα της ενδογενούς APP και του ενδογενούς sappα, που προκύπτει μετά από κόψιμο της APP από την α-εκκριτάση, είναι φυσιολογικά στο φλοιό του εγκεφάλου ποντικών ηλικίας 2 μηνών. (140) Όμως τα καρβοξυτελικά τμήματα της APP (CTFs), συσσωρεύονται στο φλοιό των ποντικών αυτών, όπως συμβαίνει και στο φλοιό ποντικών της ίδιας ηλικίας όπου έχει απενεργοποιηθεί η Presenilin, γιατί δεν μπορούν να κοπούν από τη γ-εκκριτάση. (140) Μάλιστα η αύξηση των CTFs στα ποντίκια όπου έχει απενεργοποιηθεί η Nicastrin και σε αυτά που έχει απενεργοποιηθεί η Presenilin σε σχέση με τα φυσιολογικά γίνεται κατά τον ίδιο βαθμό (περίπου 60 φορές). (140) Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Nicastrin παίζει ουσιαστικό ρόλο στην επεξεργασία της APP από τη γ-εκκριτάση αλλά η παρουσία της δεν είναι αναγκαία και απαραίτητη

118 Εικόνα 32. Ανοσοϊστοχημεία με αντίσωμα έναντι του Αβ και της APP σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm. Στις εικόνες εμφανίζεται ο φλοιός και ο ιππόκαμπος από ένα Nicastrin +/- 5XFAD (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD (κάτω) ποντίκι, ηλικίας 70 και 72 ημερών αντίστοιχα. Μεγέθυνση 50x

119 Εικόνα 33. Εστίαση στο υπόθεμα του ιππόκαμπου των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin +/- 5XFAD και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκι. Μεγέθυνση 100x

120 Εικόνα 34. Εστίαση στο υπόθεμα του ιππόκαμπου των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin +/- 5XFAD και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκι. Μεγέθυνση 200x

121 12.5 a e r A e v it i s o P β A % 10.0 ns x o ex po rte rt p pp o o i i c c h h AD AD AD AD F F F F 5X 5X 5X 5X -/-/-/-/c c c c i i Ni Ni en en r r C C IIα ΙΙα K Κ m m Ca Ca Εικόνα 35. Ποσοτικοποίηση της επιφάνειας του φλοιού και του ιππόκαμπου που καλύπτεται από την εναπόθεση του αμυλοειδούς όπως αυτή εμφανίζεται μετά από ανοσοϊστοχημική χρώση με το αντίσωμα 6E10. Το unpaired t-test μεταξύ των τιμών του φλοιού των CamKIIα icre Nicastrin -/5XFAD και των Nicastrin +/- 5XFAD και Nicastrin -/- 5XFAD ποντικών έδωσε μη στατιστικώς σημαντική διαφορά (ns p=0,498), ενώ μεταξύ των τιμών του ιππόκαμπου έδωσε στατιστικώς σημαντική διαφορά ( p=0,031) Ενδονευρωνική και εξωνευρωνική εντόπιση του Αβ Μια παρατήρηση που μπορεί να γίνει στις εικόνες της ανοσοϊστοχημικής εντόπισης του Αβ στα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια είναι ότι το Αβ δε σχηματίζει πλάκες αλλά μικρές εξωκυττάριες εναποθέσεις στο στρώμα 5 του φλοιού και το υπόθεμα του ιππόκαμπου (βλ. Εικόνα 36). Επίσης φαίνεται ότι βρίσκεται κυρίως στο εσωτερικό των νευρικών κυττάρων, πιθανώς εντός κυστιδίων αφού η χρώση είναι στικτή (βλ. Εικόνα 36). Ενδονευρωνικό Αβ παρατηρείται στους εγκεφάλους των 5XFAD ποντικών με ανοσοϊστοχημική χρώση με αντισώματα έναντι του συνολικού Αβ και του Αβ 42 κυρίως μέσα στους μεγάλους πυραμιδικούς νευρώνες του στρώματος 5 του φλοιού και του υποθέματος. (107) Επιπλέον η χρώση για το Αβ42 είναι στικτή, υποδηλώνοντας ότι η συσσώρευση του γίνεται μέσα στα κυστίδια του κυττάρου. (107) Το ενδονευρωνικό Αβ εμφανίζεται

122 αρχικά στα θηλυκά 5XFAD ποντίκια σε ηλικία 1,5 μηνών, ακριβώς πριν από το σχηματισμό αμυλοειδών εναποθέσεων στους 2 μήνες, και συμπίπτει με την αρχική άνοδο των επιπέδων του Αβ42 στον εγκέφαλο. (107) Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις φαίνεται ότι η απενεργοποίηση του γονιδίου της Nicastrin καθυστερεί την πορεία της παθολογικής επεξεργασίας της APP μειώνοντας τα συνολικά επίπεδα του Αβ και περιορίζοντας την παραγωγή του κυρίως στο εσωτερικό των νευρώνων

123 Εικόνα 36. Ανοσοϊστοχημεία με αντίσωμα έναντι του Αβ και της APP σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm. Στις δύο μεγάλες εικόνες (πάνω και κάτω) εμφανίζεται το στρώμα 5 του φλοιού από δύο CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια ηλικίας 72 ημερών και στις δύο μικρές (αριστερά και δεξιά) το υπόθεμα του ιππόκαμπου από δύο CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια ηλικίας 72 και 71 ημερών αντίστοιχα. Μεγέθυνση 200x

124 3.3. Συσσωμάτωση του παραγόμενου Αβ Ανίχνευση του συσσωματωμένου Αβ με χρώση με Thioflavin S. Η παρατήρηση έντονης ενδονευρωνικής χρώσης με στικτό πρότυπο στα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια δείχνει ότι η ενδοκυττάρια συγκέντρωση του Αβ είναι υψηλή και πιθανόν αυτό να είναι συσσωματωμένο. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, έγινε χρώση με Thioflavin S (βλ. Μέρος Β, Κεφάλαιο 11), που δεσμεύεται στα συσσωματώματα του Αβ, σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm των CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD και των Nicastrin +/- 5XFAD και Nicastrin -/- 5XFAD ποντικών που αποτελούν την ομάδα ελέγχου, ηλικίας 2,5 μηνών. Πράγματι, η χρώση με Thioflavin S δείχνει ένα στικτό, υποκυτταρικό πρότυπο σε πολύ λίγα κύτταρα στο στρώμα 5 του φλοιού και στο υπόθεμα του ιππόκαμπου και μικρή εξωκυττάρια εναπόθεση (βλ. Εικόνα 37, 38 και 39). Αυτό δείχνει ότι και ενδοκυτταρικά το αμυλοειδές βρίσκεται συσσωματωμένο με διαμόρφωση βπτυχωτής επιφάνειας. Στα Nicastrin +/- 5XFAD και Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια εμφανίζονται μεγάλες εναποθέσεις αμυλοειδούς σε μορφή πλακών όπως αναμενόταν (βλ. Εικόνα 37). Στα 5XFAD ποντίκια μετά από χρώση με Thioflavin S εμφανίζεται επίσης στικτή υποκυτταρική εναπόθεση αμυλοειδούς μέσα στα κυτταρικά σώματα των μεγάλων πυραμιδικών νευρώνων του στρώματος 5 του φλοιού και του υποθέματος του ιππόκαμπου. (107) Συνεπώς το ενδονευρωνικό Αβ42 βρίσκεται σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις στα ενδοκυτταρικά διαμερίσματα ώστε να διαμορφώνει συσσωματώματα β-πτυχωτής επιφάνειας. (107) Τα θετικά με Thioflavin S στίγματα είναι παρόμοιου αριθμού και χωρικού προτύπου όπως και αυτά που προκύπτουν μετά από ανοσοϊστοχημική χρώση για Αβ42. (107) Η κατά προσέγγιση 1:1 αναλογία των θετικών με Thioflavin S και θετικών για Αβ42 στιγμάτων καταδεικνύει ότι ένα μεγάλο μέρος του ενδονευρωνικού Αβ42 είναι σε μορφή συσσωματώματος. (107) Οι παρατηρήσεις αυτές δείχνουν ότι η παραγωγή του Αβ42 στα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκια αν και μειωμένη βρίσκεται σε τέτοια επίπεδα που ευνοούν τη συσσωμάτωσή του

125 Εικόνα 37. Χρώση με Thioflavin S σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm και παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Στις εικόνες εμφανίζεται ο φλοιός και ο ιππόκαμπος από ένα Nicastrin +/5XFAD (πάνω) και ένα CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD (κάτω) ποντίκι, ηλικίας 70 και 73 ημερών αντίστοιχα, και στην ένθετη εικόνα γίνεται εστίαση στο υπόθεμα του ιππόκαμπου. Μεγέθυνση 50x

126 Εικόνα 38. Εστίαση στο υπόθεμα του ιππόκαμπου των προηγούμενων εικόνων όπου αντίστοιχα εμφανίζεται πάνω το Nicastrin +/- 5XFAD και κάτω το CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντίκι. Μεγέθυνση 200x

127 Εικόνα 39. Χρώση με Thioflavin S σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου πάχους 40μm ενός CamKIIα icre Nicastrin -/- 5XFAD ποντικού ηλικίας 72 ημερών και παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Πάνω εμφανίζεται το υπόθεμα του ιππόκαμπου και κάτω εστίαση της ίδιας περιοχής. (Μεγέθυνση 200x και 400x αντίστοιχα)