ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΡΑΦΤΟΠΟΥΛΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS ΓΙΑ ΤΗ ΒΙΟΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΠΑΡΑΚΤΙΩΝ ΟΙΚΟΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΕΙΚΤΩΝ ΟΙΚΟΛΟΓΙΚΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2010

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES, SCHOOL OF BIOLOGY DEPARTMENT OF GENETICS, DEVELOPMENT AND MOLECULAR BIOLOGY RAFTOPOULOU ELENI BIOLOGIST EXAMINATION OF CELLULAR PARAMETERS IN TISSUES OF THE MUSSEL MYTILUS GALLOPROVINCIALIS TO FACILITATE BIOMONITORING OF THE POLLUTION IN COASTAL ECOSYSTEMS AND TO EVALUATE ECOLOGICAL QUALITY INDICES DOCTORAL THESIS THESSALONIKI, 2010

3 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ηµητριάδης Βασίλειος * Καθηγητής Τοµέα Γενετικής Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας Τµήµα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Χιντήρογλου Χαρίτων ** Καθηγητής Τοµέα Ζωολογίας Τµήµα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Καλογιάννη Μάρθα ** Καθηγήτρια Τοµέα Ζωολογίας, Τµήµα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Λαζαρίδου Μαρία Καθηγήτρια Τοµέα Ζωολογίας Τµήµα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Μιχαηλίδης Βασίλειος Αναπληρωτής Καθηγητής Τοµέα Ζωολογίας, Τµήµα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αγγελίδης Παναγιώτης Αναπληρωτής Καθηγητής Τοµέα Ζωικής Παραγωγής, Ιχθυολογίας, Οικολογίας και Προστασίας Περιβάλλοντος Κτηνιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Νταϊλιάνης Στέφανος Λέκτορας Τοµέα Βιολογίας Ζώων, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών * Επιβλέπων Καθηγητής ** Μέλη της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπης

4 Στους γονείς µου

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Οικοτοξικολογίας του Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του Τµήµατος Βιολογίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω, θερµά, τον επιβλέποντα Καθηγητή κ. ηµητριάδη Βασίλειο για την εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό µου µε την ανάθεση του θέµατος της διατριβής, για την καθοδήγηση και τη συνεργασία του κατά την εκπόνησή της, καθώς και για τις πολύτιµες συµβουλές και επισηµάνσεις του κατά τη συγγραφή της. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω, επίσης, και για τη βοήθεια που µου προσέφερε όλα τα χρόνια της συνεργασίας µας. Ευχαριστώ, ιδιαίτερα, τα άλλα δύο µέλη της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής τον Καθηγητή κ. Χιντήρογλου Χαρίτων και την Καθηγήτρια κ. Καλογιάννη Μάρθα για τη συνεργασία τους και την πολύτιµη βοήθειά τους στη διαµόρφωση του κειµένου της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια κ. Λαζαρίδου Μαρία, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Μιχαηλίδη Βασίλειο και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Αγγελίδη Παναγιώτη που συµµετείχαν στην Επταµελή Εξεταστική Επιτροπή και µε τις εύστοχες παρατηρήσεις τους συνέβαλαν στη βελτίωση του κειµένου της διατριβής. Ευχαριστώ, θερµά, το Λέκτορα κ. Νταϊλιάνη Στέφανο που, ως µέλος της Επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής, συνέβαλε στην τελική διαµόρφωση του κειµένου της διατριβής µε τις επισηµάνσεις και τις διορθώσεις του. Τον ευχαριστώ για την πολύ καλή συνεργασία µας, τη βοήθεια και τη φιλική του συµπαράσταση καθ όλο το διάστηµα εκπόνησης αυτής της διατριβής. Ένα µεγάλο ευχαριστώ στα µέλη του εργαστηρίου και ιδάκτορες του Τµήµατος Βιολογίας κ. οµουχτσίδου Λίνα, Κουκουζίκα Νικολέτα και Ίτζιου Κατερίνα. Η άψογη συνεργασία µας, η αµέριστη βοήθεια και στήριξη που µου προσέφεραν, αλλά πάνω από όλα η φιλία τους είχαν τη δική τους ξεχωριστή σηµασία στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω, ιδιαίτερα, όλους τους φίλους µου που στάθηκαν δίπλα µου σε αυτή την προσπάθεια. Η στήριξή τους στις δύσκολες στιγµές αυτής της πορείας ήταν, πραγµατικά, πολύτιµη και ουσιαστική. Ευχαριστώ τους θείους µου Γεωργία και Ronald για την ηθική και υλική τους υποστήριξη κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Τέλος, το µεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στους γονείς µου Κοσµά και Κυπαρισσία και στον αδερφό µου Παναγιώτη για την κατανόηση, την πολύπλευρη στήριξη και την ενθάρρυνση που µου προσέφεραν καθ όλο το διάστηµα της ενασχόλησής µου µε τη παρούσα διατριβή, στοιχεία τα οποία ήταν σηµαντικά και απαραίτητα για την ολοκλήρωσή της.

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΘΑΛΑΣΣΙΑ ΡΥΠΑΝΣΗ 1. Εκτίµηση της θαλάσσιας ρύπανσης 1 2. Οι βιοµάρτυρες ως εργαλεία βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης 2 3. Τα µύδια ως οργανισµοί-βιοενδείκτες 5 Β. ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΕΛΕΤΗΣ: ΘΕΡΜΑΪΚΟΣ ΚΑΙ ΣΤΡΥΜΟΝΙΚΟΣ ΚΟΛΠΟΣ 1. Γεωγραφικά χαρακτηριστικά 7 2. Μελέτη της ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου 9 Γ. ΓΕΝΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ Μ. galloprovincialis 1. Γεωγραφική κατανοµή ιατροφή και πέψη Πεπτικός αδένας Το λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών Βράγχια Αιµοκύτταρα 17. ΚΥΡΙΑ ΕΙ Η ΡΥΠΩΝ ΠΟΥ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΝΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΘΑΛΑΣΣΙΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ 1. Βαρέα µέταλλα Οργανικοί ρύποι 21 Ε. ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΕΣ ΠΟΥ ΕΦΑΡΜΟΣΤΗΚΑΝ 1. Λυσοσωµικές αποκρίσεις Σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS) οµικά χαρακτηριστικά των λυσοσωµάτων Συσσώρευση των ουδέτερων λιπιδίων και των λιποφουσκινών Συγκέντρωση µεταλλοθειονινών ραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης Συχνότητα µικροπυρήνων Πάχος επιθηλίου 31 ΣΤ. ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ 31 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ 34 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Α. ειγµατοληψίες µυδιών από το πεδίο 36 Β. ειγµατοληψία µυδιών και επίδραση οργανικών ρύπων σε συνθήκες 38 εργαστηρίου Γ. ειγµατοληψία µυδιών και επίδραση βαρέων µετάλλων σε συνθήκες 39 εργαστηρίου. ειγµατοληψία µυδιών και µελέτη των λυσοσωµικών παραµέτρων 39 Ε. Μέθοδοι προσδιορισµού 40 I

7 Βιοµάρτυρες που χρησιµοποιήθηκαν 1. Τεχνική «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» Τεχνική «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» Μορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων (ΝL) Μορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών (LΡF) Προσδιορισµός του πάχους του επιθηλίου (ΜET) στα πεπτικά σωληνάρια «Συχνότητα µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» σε αιµοκύτταρα µυδιών Μέθοδος προσδιορισµού των µεταλλοθειονινών (ΜΤ) Προσδιορισµός της ενζυµικής δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE) 53 είκτες οικολογικής ποιότητας που χρησιµοποιήθηκαν 1. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε το δείκτη «Health Status Index (HIS)», που 56 υπολογίζεται από το expert system 2. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε τον δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε το δείκτη «Integrated Biomarker Response (IBR)» Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε τον «Πειραµατικό είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης 60 ( ΘΡ)» Τεχνικές προσδιορισµού βαρέων µετάλλων 1. Συγκέντρωση βαρέων µετάλλων σε ιστούς των µυδιών µε τη χρήση της ατοµικής 62 απορρόφησης 2. Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός βαρέων µετάλλων σε ιστούς των µυδιών 62 Ιστοχηµικές τεχνικές 1. Ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο όξινη φωσφατάση Ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο β-γλουκουρονιδάση 65 Σύστηµα ανάλυσης εικόνας 66 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων 67 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΡΟΣ Α: ΜΕΛΕΤΗ ΠΕ ΙΟΥ 1. ιερεύνηση βιοµαρτύρων ρύπανσης και µελέτη των εποχικών τους διακυµάνσεων σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis 1.1. Εκτίµηση του χρόνου της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» στον 69 πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.2. Εκτίµηση του χρόνου της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» στα 71 αιµοκύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis 1.3. Μορφολογικές και µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των 73 µυδιών M. galloprovincialis 1.4. Μορφολογικές και µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα 78 των µυδιών M. galloprovincialis 1.5. Εκτίµηση της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. 81 galloprovincialis 1.6. Εκτίµηση της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης στον πεπτικό αδένα των µυδιών 83 M. galloprovincialis 1.7. Μορφολογικές και µορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών στον πεπτικό αδένα των 85 µυδιών M. galloprovincialis 1.8. Μορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών M. 90 galloprovincialis 1.9. Στατιστική συσχέτιση µεταξύ των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων ρύπανσης 96 που εφαρµόστηκαν σε ιστούς των µυδιών M. galloprovincialis κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών περιόδων ιαφοροποίηση των δειγµατοληπτικών σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού 109 II

8 κόλπου µε τη χρήση της ανάλυσης δενδρογράµµατος 2. Ποιοτική και ποσοτική εκτίµηση της ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου: µια ενοποιηµένη προσέγγιση βιοµαρτύρων µε τη χρήση δεικτών οικολογικής ποιότητας 2.1. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τη χρήση του δείκτη «Health Status Index (HIS)», που υπολογίζεται από το expert system 2.2 Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τον υπολογισµό του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» 2.3. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τον υπολογισµό του δείκτη «Integrated Biomarker Response (IBR)» 2.4. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τον υπολογισµό του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης ( ΘΡ)» ΜΕΡΟΣ Β: ΜΕΛΕΤΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 1. ιερεύνηση και καθιέρωση βιοµαρτύρων ρύπανσης σε ιστούς του µυδιού Μ. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε οργανικούς ρύπους Εκτίµηση των µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.2. Εκτίµηση της «συχνότητας µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών στα αιµοκύτταρα µυδιών M. galloprovincialis 1.3. Εκτίµηση του χρόνου της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και του χρόνου της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» 1.4. Εκτίµηση των µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα µυδιών M. galloprovincialis 1.5. Στατιστική συσχέτιση των βιοµαρτύρων ρύπανσης που εφαρµόστηκαν σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε οργανικούς ρύπους Συγκριτική µελέτη της συσσώρευσης και αποτοξικοποίησης του Cu (απαραίτητο µέταλλο) και του Hg (µη απαραίτητο µέταλλο) στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση αναλυτικών και ιστοχηµικών µεθόδων Χηµικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης των βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis 2.2. Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός των βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 2.3. Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός των βαρέων µετάλλων στα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis Μορφοµετρικές αλλαγές των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων (BSD) στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis 2.5. Μορφολογικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 2.6. Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis ΜΕΡΟΣ Γ: ΜΕΛΕΤΗ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 1. Ιστοχηµική µελέτη που αφορά στον εντοπισµό των λυσοσωµικών ενζύµων Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β-γλουκουρονιδάση στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 153 III

9 2. Μελέτη λυσοσωµικών παραµέτρων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εµφανίζουν διαφορετικό µέγεθος (µικρά και µεγάλα µύδια) 2.1. «Σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 2.2. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» και ιστοχηµική µελέτη των λυσοσωµικών ενζύµων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 2.3. Εκτίµηση της κατάστασης υγείας των µυδιών M. galloprovincialis µε τον υπολογισµό του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» 2.4. Μορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών M. galloprovincialis ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΡΟΣ Α: ΜΕΛΕΤΗ ΠΕ ΙΟΥ 1. ιερεύνηση βιοµαρτύρων ρύπανσης και µελέτη των εποχικών τους διακυµάνσεων σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis 1.1. «Σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.2. «Κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» στα αιµοκύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis 1.3 «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.4. «Μορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.5 «Συγκέντρωση των µεταλλοθειονινών (ΜΤ)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.6. «ραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.7. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 1.8. «Μορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων» των µυδιών M. galloprovincialis Ποιοτική και ποσοτική εκτίµηση της ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου: µια ενοποιηµένη προσέγγιση βιοµαρτύρων µε τη χρήση δεικτών οικολογικής ποιότητας 2.1. Ενοποίηση (integration) των βιοµαρτύρων µε τον υπολογισµό των δεικτών «HIS», 181 «LRI» και «ΙΒR» 2.2. Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα των δεικτών οικολογικής ποιότητας Εποχικό πρότυπο των επιπέδων ρύπανσης µε τον υπολογισµό των δεικτών «HIS», «LRI» 185 και «IBR» 2.4. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου µε τον 186 υπολογισµό των δεικτών «HIS», του «LRI» και του «IBR» 2.5. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου µε τον 187 υπολογισµό του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης» ΜΕΡΟΣ Β: ΜΕΛΕΤΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 1. ιερεύνηση και καθιέρωση βιοµαρτύρων ρύπανσης σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε οργανικούς ρύπους 1.1. Εκτίµηση των «µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων» στον πεπτικό αδένα 190 των µυδιών M. galloprovincialis 1.2. Εκτίµηση της «συχνότητας µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» στα 192 IV

10 αιµοκύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis 1.3. Εκτίµηση του χρόνου της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης» και του χρόνου της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» 1.4. Εκτίµηση των «µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Συγκριτική µελέτη της συσσώρευσης και της αποτοξικοποίησης του Cu (απαραίτητο µέταλλο) και του Hg (µη απαραίτητο µέταλλο) στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση αναλυτικών και ιστοχηµικών µεθόδων Αλληλεπίδραση του Hg και του Cu που σχετίζεται µε τη συσσώρευσή τους στον πεπτικό 194 αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis 2.2. Θέση συσσώρευσης του Hg και του Cu στα µύδια M. galloprovincialis Χρόνος αποτοξικοποίησης του Hg και του Cu στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των 197 µυδιών M. galloprovincialis 2.4. Προσδιορισµός της συγκέντρωσης του Cu και του Hg στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια 198 των µυδιών M. galloprovincialis σύµφωνα µε την ατοµική απορρόφηση και την εκτίµηση της πυκνότητας όγκου των BSD 2.5.Λυσοσωµικές αλλαγές στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis µετά από 199 την επίδραση Cu, Hg και µίγµατος Cu και Hg ΜΕΡΟΣ Γ: ΜΕΛΕΤΗ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 1. Ιστοχηµική µελέτη που αφορά στον εντοπισµό των λυσοσωµικών ενζύµων Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β-γλουκουρονιδάση στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis 2. Μελέτη λυσοσωµικών παραµέτρων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εµφανίζουν διαφορετικό µέγεθος (µικρά και µεγάλα µύδια) ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 206 CONCLUSIONS 209 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 212 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 242 SUMMARY 247 V

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ A. ΘΑΛΑΣΣΙΑ ΡΥΠΑΝΣΗ Η θαλάσσια ρύπανση αναφέρεται στην άµεση ή έµµεση απελευθέρωση ρυπογόνων ουσιών στο θαλάσσιο περιβάλλον και προκαλεί ή είναι δυνατόν να προκαλέσει επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία, βλάβη στους ζωντανούς οργανισµούς, υποβιβασµό των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων και των φυσικών πόρων ή παρακώλυση νόµιµων δραστηριοτήτων που σχετίζονται µε τη θάλασσα (OSPAR Commission 2000). Μερικές από τις πηγές που προκαλούν ρύπανση στα θαλάσσια οικοσυστήµατα είναι τα αστικά και βιοµηχανικά απόβλητα, η έκπλυση των γεωργικών εδαφών, τα λύµατα των υπονόµων, οι διαδικασίες εξαγωγής άµµου και χαλικιού, οι βιοµηχανίες εξόρυξης πετρελαίου, φυσικού αερίου και ορυκτών, η τοποθέτηση καλωδίων και σωληνώσεων, ο τουρισµός, οι ποικίλες ψυχαγωγικές δραστηριότητες, οι υδατοκαλλιέργειες, η αλιεία, οι θαλάσσιες µεταφορές, τα ατυχήµατα διαρροής πετρελαίου κ.ά. (ΕΕΑ 1999, GESAMP 2001). 1. Εκτίµηση της θαλάσσιας ρύπανσης Οι ρύποι που απελευθερώνονται στα θαλάσσια ύδατα έχουν σηµαντικές επιπτώσεις σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης της ζωής και εποµένως καθίσταται επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης µεθόδων για την ταυτοποίηση, µέτρηση, συγκριτική εκτίµηση και διαχείριση των αποτελεσµάτων που προκύπτουν από την απελευθέρωση χηµικών ουσιών στο θαλάσσιο περιβάλλον (Cajaraville et al. 2000, Broeg et al. 2005). Μια µέθοδος εκτίµησης της θαλάσσιας ρύπανσης αποτελεί η βιοπαρακολούθηση (biomonitoring) δηλ. η παρακολούθηση των αποτελεσµάτων της ρύπανσης σε ζωντανούς οργανισµούς, η οποία άρχισε να εφαρµόζεται στις αρχές της δεκαετίας του 70. Το πεδίο της βιοπαρακολούθησης είναι ιδιαίτερα ευρύ και περιλαµβάνει µια πληθώρα τεχνικών (για µια συνοπτική παρουσίαση αυτών των τεχνικών βλ. Kramer 1994). Τα τελευταία χρόνια οι βιολογικές παράµετροι που χαρακτηρίζονται ως βιοµάρτυρες συνιστούν θεµελιώδη εργαλεία για τη βιοπαρακολούθηση της θαλάσσιας ρύπανσης (Bayne 1989, Gray 1992). Επιπρόσθετα, οι βιοδείκτες, οι οποίοι αναφέρονται σε βιολογικές αποκρίσεις σε ανώτερα επίπεδα οργάνωσης της ζωής, όπως επίπεδο πληθυσµού, βιοκοινότητας και οικοσυστήµατος, παρέχουν χρήσιµες πληροφορίες σχετικά µε την καθορότητα του 1

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ νερού (NCMR 1997) και σε συσνδυασµό µε τη µέτρηση διάφορων φυσικοχηµικών και υδροµορφολογικών παραµέτρων, όπως απαιτείται από την Οδηγία 2000/60 ΕΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα νερά, δίνει µια πιο ολοκληρωµένη εικόνα της οικολογικής ποιότητας των υδάτων. Μια άλλη µέθοδος εκτίµησης της θαλάσσιας ρύπανσης αποτελεί ο υπολογισµός της συγκέντρωσης των χηµικών ουσιών στο νερό, στα ιζήµατα και στους ζωντανούς οργανισµούς. Η παρουσία των ρύπων µπορεί να αποκαλυφθεί µε τη χηµική ανάλυση, η οποία όµως δεν είναι σε θέση να προσδιορίσει τις επιπτώσεις τους στη χλωρίδα και την πανίδα, ούτε το αποτέλεσµα που µπορεί να προκαλέσει ο συνδυασµός ποικίλων ρύπων (συνεργατικά, ανταγωνιστικά ή προσθετικά φαινόµενα), ούτε το διαφορετικό αποτέλεσµα που µπορεί να επιφέρει ένας ρύπος σε έναν οργανισµό κάτω από την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών. Εποµένως, αν και η χηµική ανάλυση συνιστά βασική µέθοδο για την παρακολούθηση της ρύπανσης των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων (χηµική παρακολούθηση, chemical monitoring), δεν αποτελεί αποτελεσµατικό εργαλείο για τον προσδιορισµό των επιπτώσεων της ρύπανσης (UNEP/STAP 2003). 2. Οι βιοµάρτυρες ως εργαλεία βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης Ως βιοµάρτυρας (biomarker) χαρακτηρίζεται κάθε µεταβολή που µπορεί να παρατηρηθεί ή και να µετρηθεί σε βιοχηµικό και κυτταρικό επίπεδο, καθώς και µεταβολές σε επίπεδο φυσιολογίας και συµπεριφοράς του οργανισµού, οι οποίες αποκαλύπτουν την έκθεση του ατόµου στο παρόν ή στο παρελθόν σε µία τουλάχιστο χηµική ουσία µε χαρακτηριστικά ρύπου (Adams 1990, Roy & Hanninen 1993, Fishelson 1995, Lagadic et al. 1997, Bresler et al. 1999, Fishelson et al. 1999). Οι βιοµάρτυρες µπορούν να εφαρµοστούν σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης της ζωής, από το µοριακό επίπεδο έως το επίπεδο οργανισµού. Η χρήση τους σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης προϋποθέτει τη συγκέντρωση ορισµένων χαρακτηριστικών όπως είναι η επαναληψιµότητα, η ευαισθησία, η εξειδίκευση, ο σύντοµος χρόνος απόκρισης, η αναστρεψιµότητα, το µεγάλο εύρος ειδών στα οποία εφαρµόζεται, η ευκολία εφαρµογής και το χαµηλό κόστος του σε σύγκριση µε την αποτελεσµατικότητά του (Gosling 1994). Οι βιοµάρτυρες που αφορούν στο µοριακό και κυτταρικό επίπεδο αποτελούν εργαλεία έγκαιρης προειδοποίησης (early warning tools) για τις µακροπρόθεσµες επιπτώσεις της ρύπανσης στο επίπεδο του οργανισµού, 2

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ του πληθυσµού ή της βιοκοινότητας, εξαιτίας της πολύ γρήγορης επίδρασης των τοξικών ουσιών στο µοριακό και κυτταρικό επίπεδο (McCarthy & Shugart 1990, Huggert et al. 1992). Σε µοριακό επίπεδο έχει προταθεί ότι οι πρωτεϊνες θερµικού πλήγµατος θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως βιοµάρτυρες (Sole 2000, Hamer et al. 2004), εκφράζοντας το βαθµό του κυτταρικού «stress» των θαλάσσιων οργανισµών και παρέχοντας πληροφορίες για τη φύση του παράγοντα «stress» (Sanders 1988). Μέλη της οικογένειας γονιδίων HSP70 έχουν περιγραφεί για αρκετά µαλάκια (Piano et al. 2004, Farcy et al. 2007), αλλά και για το είδος Μ. galloprovincialis στο οποίο έχουν αποµονωθεί τόσο θερµοεπαγόµενα όσο και συστατικά εκφραζόµενα γονίδια (Kourtidis et al. 2006α,β). Η επαγωγή των πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος µπορεί να προκληθεί από την αύξηση της θερµοκρασίας και την υποξία (Feder & Hofmann 1999, Αnestis et al. 2010, Anestis et al ), καθώς επίσης και από το ψυχρό πλήγµα, την αλατότητα, τα ιόντα βαρέων µετάλλων, τις οργανικές ουσίες, τις ιώσεις, τις µικροβιακές µολύνσεις, κ.α. (Feder & Hofmann 1999). Οι βιοµάρτυρες ανάλογα µε το εύρος της εξειδίκευσης τους διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: σε βιοµάρτυρες γενικού «stress» που περιλαµβάνουν αποκρίσεις, οι οποίες µπορεί να προκληθούν από µια µεγάλη ποικιλία ρύπων και σε βιοµάρτυρες ειδικού «stress» που σχετίζονται µε την έκθεση των οργανισµών σε συγκεκριµένους ρύπους ή οµάδες ρύπων ( ηµητριάδης κ.ά. 2006). Η χρήση ενός πακέτου βιοµαρτύρων που καλύπτει όλο το εύρος της εξειδίκευσης είναι προτιµότερη από τη χρήση ενός µεµονωµένου βιοµάρτυρα, διότι µε τον τρόπο αυτό επιτρέπεται η αποτελεσµατική εκτίµηση των επιπτώσεων των διαφόρων ρύπων στους οργανισµούς και η διαµόρφωση µιας σαφέστερης εικόνας της κατάστασης του περιβάλλοντος στο οποίο διαβιούν. Η πρόσφατη Οδηγία της Ευρωπαϊκής Ένωσης (2000/60/EC), που αφορά στη δράση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας στο πλαίσιο της πολιτικής των υδάτων, προτείνει τη σηµαντικότητα µιας πολυδιάστατης προσέγγισης µε σκοπό την εκτίµηση της ποιότητας των υδάτων, τον καθορισµό των σχέσεων µεταξύ των τιµών της έκθεσης σε ρύπους και της επίδρασής τους στους οργανισµούς και τα πιθανά δυσµενή αποτελέσµατα που έχουν σε αυτούς (Van der Oost et al. 2003). Η αξιολόγηση του περιβαλλοντικού κινδύνου βασίζεται, κυρίως, σε πληροφορίες που αφορούν στα χαρακτηριστικά των ρύπων, καθώς και σε πληροφορίες που προέρχονται από τα εργαστηριακά τεστ τοξικότητας (Moore et al. 2004). Αυτές οι διαδικασίες είναι σε 3

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ θέση να αναγνωρίζουν τα πιθανά αποτελέσµατα της τοξικότητας µόνο όταν υπάρχει σοβαρή επίπτωση στον υπό εξέταση οργανισµό και δεν µπορούν να αναγνωρίσουν άµεσα άλλα δυσµενή αποτελέσµατα που οφείλονται στη διάδραση χηµικών ουσιών (Howard 1997, Kortenkamp & Altenburger 1998). Υπάρχει, λοιπόν, επιτακτική ανάγκη να εγκαθιδρυθεί µια σταθερή, απλή, εύκολη στην εκµάθηση και µε χαµηλό κόστος µεθοδολογία, η οποία να είναι σε θέση να αναγνωρίζει έγκαιρα τις µεταβολές στους ζωντανούς οργανισµούς και να κατατάσσει τα υπό µελέτη οικοσυστήµατα ανάλογα µε την οικολογική τους ποιότητα και τις συνθήκες επιβάρυνσης που επικρατούν (Moore et al. 2004) σε µια πενταβάθµια κλίµακα. Ο τελικός στόχος που καθορίζεται από τους διεθνείς φορείς και αφορά στην περιβαλλοντική προστασία είναι να εγκαθιδρυθούν δείκτες περιβαλλοντικής ποιότητας βασισµένοι σε χηµικά, υδροµορφολογικά και/ή βιολογικά κριτήρια, ώστε να κατηγοριοποιηθούν οι υπό µελέτη περιοχές ανάλογα µε το επίπεδο «stress» (Narbonne et al. 2005). Για το σκοπό αυτό, τα τελευταία χρόνια έχουν προταθεί αρκετές διαφορετικές µαθηµατικές προσεγγίσεις που βασίζονται στην ενοποίηση µιας πληθώρας βιοµαρτύρων και επιτρέπουν την εκτίµησης της φυσιολογικής κατάστασης των θαλάσσιων οργανισµών και κατ επέκταση την κατηγοριοποίηση των οικοσυστηµάτων τους σε ένα επίπεδο «stress» (Beliaeff & Burgeot 2002, Narbonne et al. 1999,2005, Chevre et al. 2003, Broeg et al. 2005, Dagnino et al. 2007, Hagger et al. 2008). Οι δείκτες που εφαρµόζονται στην παρούσα διατριβή είναι: ο Health Status Index (HIS), ο οποίος εκτιµάται από το expert system (Dagnino et al. 2007), o Lysosomal Response Index (LRI) (Izagirre & Marigomez, 2009) και ο Integrated Biomarker Response (IBR) (Beliaeff & Burgeot, 2002). Ο δείκτης «HIS» αναπτύχθηκε µε σκοπό να ενοποιηθούν οι αποκρίσεις των βιοµαρτύρων και να κατηγοριοποιηθεί η κατάσταση υγείας των µυδιών ανάλογα µε το επίπεδο ρύπανσης της εκάστοτε δειγµατοληπτικής περιοχής (Dagnino et al. 2007). Χρησιµοποιώντας διαφορετικά πακέτα βιοµαρτύρων (διαφέρουν ως προς τον τύπο και τον αριθµό των βιοµαρτύρων), o δείκτης «HIS» εφαρµόστηκε ικανοποιητικά σε περιορισµένες µελέτες πεδίου (Dondero et al. 2006, Dagnino et al. 2007) και εργαστηρίου (Dagnino et al. 2007) προβάλλοντας µια σαφή ένδειξη των επιπέδων «stress» στα µύδια. Από την άλλη µεριά, ο δείκτης «LRI» ενοποιεί δύο όχι απαραίτητα εξαρτώµενες λυσοσωµικές αποκρίσεις (σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης /LMS και δοµικές λυσοσωµικές αλλαγές/lcs) σε ένα δείκτη, ο οποίος σχετίζεται άµεσα µε τα επίπεδα ρύπανσης (Izagirre & Marigomez, 2009) 4

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παρουσιάζοντας την απόκλιση του µεγέθους των λυσοσωµάτων και της σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης από τις τιµές του σταθµού αναφοράς (Dagnino et al. 2007, Marigomez et al. 2006). Τέλος, ο δείκτης «IBR» που προτάθηκε από τους Beliaeff & Burgeot (2002) παρουσιάστηκε ως µια µέθοδος για τη διερευνητική ανάλυση των δεδοµένων σε µια ολιστική προσέγγιση µε τη χρήση πολλών διαφορετικών βιοµαρτύρων. Σύµφωνα µε προηγούµενες µελέτες πεδίου, ο δείκτης «IBR» αποτελεί ένα πιθανό εργαλείο για την οπτικοποίηση των βιολογικών αποτελεσµάτων των ρύπων στα θαλάσσια οικοσυστήµατα (Beliaeff & Burgeot 2002, Broeg & Lehtonen 2006, Damiens et al. 2007, Pytharopoulou et al. 2008). Η εφαρµογή και η σύγκριση των παραπάνω τριών δεικτών αποτελεί ένα ενδιαφέρον αντικείµενο της παρούσας διατριβής, µε σκοπό να ενισχυθεί η καταλληλότητα και η αξιοπιστία τους σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. 3. Τα µύδια ως οργανισµοί βιο-ενδείκτες Οι βιοµάρτυρες ρύπανσης (biomarkers ή stress indices) εφαρµόζονται σε ζωντανούς οργανισµούς, οι οποίοι χαρακτηρίζονται ως οργανισµοί βιο-ενδείκτες (bioindicators or sentinel species). Οι περισσότερο διαδεδοµένοι οργανισµοί που χρησιµοποιούνται εκτεταµένα για την εκτίµηση της κατάστασης των υδάτινων οικοσυστηµάτων είναι τα µαλάκια και συγκεκριµένα τα στρείδια, οι πεταλίδες και περισσότερο τα µύδια (Cajaraville et al. 1990, Livingstone et al. 1990, Smolders et al. 2003, Marigomez et al. 2006, ICES 2006). Τα δίθυρα µαλάκια, και ιδιαίτερα τα µύδια, αποτελούν ιδανικούς οργανισµούς βιο-ενδείκτες σε µελέτες βιοπαρακολούθησης λόγω κάποιων χαρακτηριστικών που διαθέτουν (σύµφωνα µε τους NCR 1980, Phillips 1980, Widdows 1985, Farrington et al. 1987): Τα µύδια παρουσιάζουν ευρεία γεωγραφική κατανοµή Είναι προσκολληµένα είδη γεγονός που τα καθιστά καταλληλότερους οργανισµούς από άλλους (διότι δεν έχουν τη δυνατότητα µετανάστευσης) για την πρόσληψη ρύπων από το περιβάλλον στο οποίο διαβιούν. Εµφανίζουν ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ φάσµα περιβαλλοντικών συνθηκών και µεγάλη αντοχή µετά από επίδραση σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων ρύπων. 5

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα δίθυρα, σε σύγκριση µε τα αρθρόποδα και τα ψάρια, εµφανίζουν χαµηλό επίπεδο δραστικότητας των ενζυµικών συστηµάτων, τα οποία είναι υπεύθυνα για το µεταβολισµό των οργανικών τοξικών ουσιών. Εποµένως, οι συγκεντρώσεις ρύπων στους ιστούς τους αντικατοπτρίζουν µε µεγαλύτερη ακρίβεια την έκταση της περιβαλλοντικής ρύπανσης. Η µέτρηση των τοξικών ουσιών στους ιστούς των δίθυρων αντικατοπτρίζει µε µεγαλύτερη σαφήνεια τη βιοσυσσώρευσή τους, η οποία δεν µπορεί να αξιολογηθεί όταν οι µετρήσεις πραγµατοποιούνται στο νερό, στα αιωρούµενα σωµατίδια ή στα ιζήµατα, οπότε µόνον µέσω δεικτών βιοµαρτύρων θα µπορούµε να αποφανθούµε για την καλή/µέτρια κατάσταση. Είναι διηθηµατοφάγοι οργανισµοί και συσσωρεύουν στους ιστούς τους πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις ρύπων από αυτές που παρατηρούνται στο θαλασσινό νερό λόγω της ικανότητάς τους να φιλτράρουν σηµαντικό όγκο νερού. Εποµένως, ακόµη και πολύ µικρές συγκεντρώσεις τοξικών ουσιών που εµφανίζονται στο θαλασσινό νερό µπορούν να προσδιορισθούν ευκολότερα στους ιστούς των οργανισµών αυτών. Τα µύδια εµφανίζουν σχετικά σταθερούς και πολυπληθείς πληθυσµούς, γεγονός που επιτρέπει την πραγµατοποίηση επανειληµµένων δειγµατοληψιών για τη µακροχρόνια παρακολούθηση του υδάτινου περιβάλλοντος. Μεταφέρονται και διατηρούνται εύκολα µέσα σε κλωβούς στις περιοχές ενδιαφέροντος. ιατηρούνται κάτω από ελεγχόµενες εργαστηριακές συνθήκες, γεγονός που επιτρέπει την πραγµατοποίηση πειραµάτων στο εργαστήριο. Υπάρχει εκτεταµένη βασική γνώση για τις βασικές λειτουργίες τους, µε αποτέλεσµα τη δυνατότητα εξαγωγής συµπερασµάτων µε οικοτοξικολογική συνάφεια. 6

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Β. ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΕΛΕΤΗΣ: ΘΕΡΜΑΪΚΟΣ ΚΑΙ ΣΤΡΥΜΟΝΙΚΟΣ ΚΟΛΠΟΣ 1. Γεωγραφικά χαρακτηριστικά Ο Θερµαϊκός κόλπος βρίσκεται στο Β.. Αιγαίο και οριοθετείται ανατολικά από τη χερσόνησο της Κασσάνδρας, δυτικά από τα παράλια του νοµού Πιερίας και βόρεια από την ακτογραµµή της πόλης της Θεσσαλονίκης (Εικ. 1). Χωρίζεται σε τέσσερα τµήµατα, 1) τον Όρµο της Θεσσαλονίκης, που εκτείνεται µέχρι τη νοητή γραµµή που ενώνει το ακρωτήριο Μικρό έµβολο µε την Παληοµάνα, 2) τον εσωτερικό Θερµαϊκό, που εκτείνεται µέχρι τη νοητή γραµµή που συνδέει το ακρωτήριο Μεγάλο Έµβολο και τις εκβολές του Αξιού, 3) τον Κεντρικό Θερµαϊκό, που εκτείνεται µέχρι τη νοητή γραµµή που συνδέει τα ακρωτήρια Επανοµής και Αθερίδας και 4) τον Εξωτερικό ή Νότιο Θερµαϊκό, που εκτείνεται µέχρι τη νοητή γραµµή που συνδέει τα ακρωτήρια Ποσείδι (Κασσάνδρα) και ερµατάς (Όσσα) (Φάµελλος και συν., 2008). Είναι σχετικά ρηχός κόλπος και το µέσο βάθος του δε ξεπερνά τα 50 m (Karageorgis et al. 2005). Θεσσαλονίκη Όρµος Θεσ/νίκης Λουδίας Αξιός Εσωτερικός Αλιάκµονας Κεντρικός Εξωτερικός Εικόνα 1. Φωτογραφία δορυφόρου που απεικονίζει το Θερµαϊκό κόλπο. Figure 1. Satellite photography of Thermaikos gulf. 7

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ O Θερµαϊκός κόλπος αποτελεί τον τελικό αποδέκτη πλήθους ρυπογόνων φορτίων, τα οποία παράγονται από το πολεοδοµικό συγκρότηµα της Θεσσαλονίκης (πάνω από κατοίκους), από τη βιοµηχανική του περιοχή και από τη λειτουργία του λιµανιού. Επιπρόσθετα, αποτελεί τελικό αποδέκτη των νερών τριών µεγάλων ποταµών, του Αξιού, του Λουδία και του Αλιάκµονα. Ο Αλιάκµονας και ο Αξιός δέχονται αστικά λύµατα από αρκετές πυκνοκατοικηµένες περιοχές, καθώς επίσης και βιοµηχανικά και γεωργικά απόβλητα. Επίσης, ο Λουδίας είναι ένα από τα ποτάµια της Ελλάδας µε αυξηµένη ρύπανση, εξαιτίας των αγροτικών αποβλήτων και των αποβλήτων από τις βιοµηχανίες επεξεργασίας φρούτων και ζάχαρης. Ο Λουδίας χρησιµεύει ως αποδέκτης των νερών άρδευσης από την πεδιάδα µεταξύ του Αλιάκµονα και του Αξιού και το οργανικό του φορτίο είναι αρκετά µεγαλύτερο από αυτό του Αξιού (Voulgaropoulos et al. 1987). Τέλος, ο ποταµός Αλιάκµονας δέχεται σηµαντικά φορτία ρύπανσης στο πεδινό τµήµα της κοίτης του από την Τάφρο 66. Στην τάφρο αυτή πέφτουν χωρίς καµία επεξεργασία τα απόβλητα από τις κονσερβοποιίες, ενώ σηµαντική είναι η επιβάρυνσή της από τα φυτοφάρµακα και τα γεωργικά λιπάσµατα, καθώς στην ίδια περιοχή υπάρχουν εντατικές καλλιέργειες. Οι ακτές του Θερµαϊκού κόλπου αποτελούν ιδανικό περιβάλλον για την ανάπτυξη φυσικών πληθυσµών µυδιών M. galloprovincialis (Arsenoudi et al. 2003) και για το λόγο αυτό φιλοξενούν τις πιο εκτεταµένες και παραγωγικές µονάδες καλλιέργειας µυδιών στην Ελλάδα. Σύµφωνα µε τα στοιχεία του Υπουργείου Γεωργίας (2002) το 70% της συνολικής Ελληνικής παραγωγής προέρχεται από τη συγκεκριµένη περιοχή, ενώ µονάδες µυδοκαλλιέργειας έχουν αναπτυχθεί στο Στρυµονικό κόλπο και σε άλλους µικρούς κόλπους. Ο Στρυµονικός κόλπος εκτείνεται µεταξύ της χερσονήσου της Χαλκιδικής και της χερσονήσου που σχηµατίζει το όρος Παγγαίο καθώς καταλήγει στο Αιγαίο Πέλαγος. Οι κύριες πηγές γλυκού νερού, θρεπτικών ουσιών και ρύπων (οικιακής και γεωργικής προέλευσης) του Στρυµονικού κόλπου αποτελούν ο ποταµός Στρυµόνας που πηγάζει από τη Βουλγαρία, και ο µικρότερος Ρήχιος ποταµός στα δυτικά (Stamatis et al. 2002, Kallianiotis et al. 2004). Ο κόλπος αυτός αποτελεί µια από τις πιο σηµαντικές περιοχές για τον πολλαπλασιασµό και την αλιεία πελαγικών ειδών στο Βόρειο Αιγαίο (Sylaios et al. 1999). Τα τελευταία χρόνια ο κόλπος δέχεται την επίδραση αυξηµένης ποσότητας λιπασµάτων και εντοµοκτόνων από τις καλλιέργειες γειτονικών εκτάσεων, συγκεντρώνει λύµατα από τους γύρω οικισµούς και βιοµηχανικά απόβλητα από τις χηµικές βιοµηχανίες που αναπτύσσονται στην περιοχή 8

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Dassenakis 2000, Lazaridou-Dimitriadou et al. 2004), σε σχέση µε το παρελθόν όπου δεν ανιχνεύονταν υψηλά επίπεδα ρύπων (Vasilikiotis et al. 1983). Παρόλα αυτά, ο Στρυµονικός κόλπος εµφανίζει χαµηλότερα επίπεδα ρύπανσης, όπως αυτά καταδεικνύονται από συγκριτικές µελέτες στο νερό, στα ιζήµατα και στους ιστούς µυδιών, σε σχέση µε το Θερµαϊκό κόλπο ( ΕΠΠΠΕΘ 2004). 2. Μελέτη της ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου Η θαλάσσια περιοχή του Θερµαϊκού κόλπου, που αποτελεί τελικό αποδέκτη σηµαντικών πηγών ρύπανσης, έχει αποτελέσει αντικείµενο µελέτης πολλών ελληνικών ερευνητικών εργαστηρίων. Υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδοµένα που αφορούν στη χηµική παρακολούθηση αυτού του οικοσυστήµατος µε εργαλείο τον υπολογισµό των συγκεντρώσεων βαρέων µετάλλων (Anagnostou et al. 1998, Voutsinou-Taliadouri et al. 1998, Catsiki et al. 2001) και οργανικών ρύπων (Albanis et al. 1994, Hatzianestis et al. 2000, Kamarianos et al. 2002) τόσο στο θαλασσινό νερό όσο και στους ιστούς των ζωντανών οργανισµών και κυρίως των µυδιών. Τα τελευταία 15 χρόνια έχει πραγµατοποιηθεί βιοπαρακολούθηση του Θερµαϊκού κόλπου µε τη χρήση µιας πληθώρας κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων, µε στόχο την ποιοτική εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης κατά µήκος των ακτών του και την επίπτωση που αυτή έχει στους ζωντανούς οργανισµούς (Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Domouhtsidou et al. 2004, Koukouzika & Dimitriadis 2005). Ωστόσο, δεν υπάρχουν δεδοµένα για το Θερµαϊκό κόλπο µιας σφαιρικής προσέγγισης, η οποία θα βασίζεται σε κάποιο δείκτη περιβαλλοντικής ποιότητας των υδάτων και θα δείχνει τα επίπεδα ρύπανσης της εκάστοτε περιοχής. Ένας από τους σκοπούς της παρούσας διατριβής είναι η εφαρµογή ενός πακέτου βιοµαρτύρων σε ιστούς των µυδιών M. galloprovincialis µε απώτερο στόχο την ενοποίηση των αποκρίσεών τους σε ένα δείκτη «stress», ο οποίος θα παρουσιάζει µια ολοκληρωµένη εικόνα της επιβάρυνσης των υδάτων κατά µήκος των ακτών του Θερµαϊκού κόλπου. Επίσης, η διερευνητική µελέτη για την εξαγωγή ενός δείκτη «stress» (Πειραµατικός είκτης Θαλάσσιας Ρύπανσης) που θα αφορά την εκτίµηση της ρύπανσης των ελληνικών ακτών, συγκρινόµενος µε άλλους καθιερωµένους δείκτες ποιότητας των υδάτων, αποτελεί ενδιαφέρον αντικείµενο της παρούσας διατριβής. 9

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γ. ΓΕΝΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ Μ. galloprovincialis 1. Γεωγραφική κατανοµή Τα είδη του γένους Mytilus χρησιµοποιούνται σε µεγάλη κλίµακα σε µελέτες βιοπαρακολούθησης στο πεδίο (Mussel Watch Programmes) και αποτελούν κατάλληλους οργανισµούς για την εκτίµηση της ποιότητας των θαλάσσιων εκβολικών ή παράκτιων οικοσυστηµάτων. Το γένος Mytilus, η εµφάνιση του οποίου τοποθετείται πριν από 1-2 εκατοµµύρια χρόνια (Seed 1976), παρουσιάζει ευρεία κατανοµή τόσο στο βόρειο όσο και στο νότιο ηµισφαίριο και περιλαµβάνει τέσσερα είδη: M. edulis, M. galloprovincialis, M. trossulus, M. californianus. Πρόκειται για εδώδιµα είδη, τα οποία σχηµατίζουν µεγάλους πληθυσµούς, ζουν προσκολληµένα σε στερεά υποστρώµατα, όπως πέτρες και βράχια (Εικ. 2α), αλλά µπορούν και να καλλιεργηθούν σε ευρεία κλίµακα σε µυδοκαλλιέργειες (Εικ. 2β). α β Εικόνα 2. (α) Φυσικός πληθυσµός των µυδιών M. galloprovincialis. (β) Καλλιεργούµενος πληθυσµός µυδιών M. galloprovincialis µε τη µέθοδο των πασάλων. Figure 2. (α) Natural population of mussels M. galloprovincialis. (β) Cultured populations of mussels M. galloprovincialis by the use of poles. Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκε ως οργανισµός βιο-ενδείκτης το µύδι M. galloprovincialis (Lamarck 1819) (Εικ. 3), φυσικοί πληθυσµοί του οποίου ευδοκιµούν στη Μεσόγειο Θάλασσα, στην Αδριατική Θάλασσα και στη Μαύρη Θάλασσα. Το είδος αυτό κυριαρχεί στην παράκτια ζώνη και οι συναθροίσεις του 10

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ βρίσκονται τόσο στις καθαρές όσο και στις επιβαρυµένες θαλάσσιες περιοχές παρουσιάζοντας υψηλό ενδιαφέρον σε µελέτες βιοπαρακολούθησης (Chintiroglou et al. 2004). α β Πεπτικός αδένας Βράγχια Εικόνα 3. (α) Μύδι του είδους M. galloprovincialis. (β) Ανατοµία του µυδιού M. galloprovincialis. Figure 3. (α) Mussel M. galloprovincialis. (β) Anatomy of mussel M. galloprovincialis. Η γνώση της φυσιολογίας και της συµπεριφοράς των µυδιών δίνει τη δυνατότητα στους ερευνητές να εκτιµήσουν τις επιπτώσεις των περιβαλλοντικών ρύπων σε κυτταρογενετικό και βιοχηµικό επίπεδο και να αξιολογήσουν µε αυτό τον τρόπο την ποιότητα των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων (Regoli 1998, Lafontaine et al. 2000). 2. ιατροφή και πέψη Τα µύδια είναι διηθηµατοφάγοι οργανισµοί. Τα σωµατίδια της τροφής εισέρχονται µε το νερό µέσω ενός προσαγωγού σιφωνίου (Bayne et al. 1976) και στη συνέχεια µεταφέρονται µε συνδυασµένες κινήσεις των βλεφαρίδων των βραγχίων και των χειλικών προσακτρίδων προς τον γαστρεντερικό σωλήνα. Στα δίθυρα µαλάκια ο γαστρεντερικός σωλήνας αποτελείται από έναν απλό και κοντό οισοφάγο, έναν πολύπλοκο στόµαχο και το έντερο. Το οπίσθιο τµήµα του στοµάχου επικοινωνεί µε µια δοµή που περιέχει το στύλο. Ο στύλος είναι κρυσταλλικής πρωτεϊνικής φύσεως και βοηθάει στη διαδικασία της εξωκυτταρικής πέψης (Morton 1983). Από το στόµαχο ξεκινούν µικροί αγωγοί που οδηγούν στον πεπτικό αδένα, ένα όργανο 11

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υπεύθυνο για την απορρόφηση και την ενδοκυτταρική πέψη, η οποία πραγµατοποιείται στο λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων (Morton 1983). 3. Πεπτικός αδένας Ο πεπτικός αδένας των µαλακίων αποτελεί σηµαντικό όργανο στις έρευνες βιοπαρακολούθησης για την εκτίµηση της περιβαλλοντικής ρύπανσης (Marigomez et al. 2002, Moore & Allen 2002), καθώς, εκτός από τη συµµετοχή του στη διαδικασία της πέψης, έχει την ικανότητα να συσσωρεύει µεγάλη ποικιλία ρύπων και να συµβάλλει ενεργά στις διαδικασίες αποτοξικοποίησής τους. Ο πεπτικός αδένας των δίθυρων µαλακίων (Εικ. 4) αποτελείται από πολυάριθµους τυφλούς σωλήνες, τα πεπτικά σωληνάρια, τα οποία επικοινωνούν µε το στόµαχο διαµέσου ενός συστήµατος διακλαδισµένων βλεφαριδοφόρων αγωγών (Nakazima 1956). Εικόνα 4. Σχηµατική απεικόνιση του πεπτικού αδένα των µαλακίων (από διδ. διατριβή του Benat Zaldibar Aranburu, 2006). Figure 4. Schematic presentation of mollusks digestive gland (from PhD thesis of Benat Zaldibar Aranburu, 2006). Οι κύριοι αγωγοί διακλαδίζονται και σχηµατίζουν δευτερεύοντες αγωγούς (Owen 1955), οι οποίοι αποτελούνται από απλό επιθήλιο µε µικρολάχνες. Οι δευτερεύοντες αγωγοί διακλαδίζονται περισσότερο και σχηµατίζουν τα πεπτικά σωληνάρια. Ο ρόλος των αγωγών είναι η µεταφορά υλικών από και προς τα πεπτικά σωληνάρια (Owen 1972, Morton 1983), ο µεταβολισµός των λιπιδίων (Owen 1973) και η απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών (Morton 1983). 12

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (α) m (β) en hp m sv hl ger Gb mi rb p li p α β Εικόνα 5. Σχηµατική απεικόνιση των κύριων κυτταρικών τύπων από τους οποίους συνίσταται το επιθήλιο των πεπτικών σωληναρίων των δίθυρων µαλακίων (α) πεπτικό κύτταρο και (β) βασεόφιλο κύτταρο rb: υπολειπόµενo σωµάτιo, en: ενδόσωµα, Gb: συσκευή Golgi, ger: αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο, hl: ετερολυσόσωµα, hp: ετεροφαγόσωµα, li: λιπίδιο, m: µικρολάχνες, mi: µιτοχόνδριο, p: υπεροξειδιόσωµα, sv: εκκριτικό κοκκίο (από Owen 1973). Figure 5. Schematic presentation of the main cell types in the epithelium of the digestive tubules of mollusks (α) digestive cell and (β) basophilic cell. rb: residual body, en: endosome, Gb: Golgi complex, ger: granular endoplasmic reticulum, hl: heterolysosome, hp: heterophagosome, li: lipid, m: microvilli, mi: mitochondrion, p: peroxisome, sv: secretory vesicle (from Owen 1973). Το επιθήλιο των πεπτικών σωληναρίων των δίθυρων µαλακίων συνίσταται από δύο κυτταρικούς τύπους, τα πεπτικά κύτταρα που είναι ο πιο συχνός κυτταρικός τύπος (Εικ. 5α) και τα βασεόφιλα κύτταρα (Εικ. 5β). Τα πεπτικά κύτταρα έχουν κιονοειδές σχήµα και διαθέτουν ένα καλά ανεπτυγµένο λυσοσωµικό σύστηµα (De Duve & Wattiaux, 1966), στο οποίο πραγµατοποιείται η ενδοκυτταρική πέψη των θρεπτικών ουσιών (Owen 1972, Morton 1983). Τα βασεόφιλα κύτταρα του πεπτικού αδένα έχουν πυραµιδοειδές σχήµα και χαρακτηρίζονται από ένα καλά ανεπτυγµένο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο και πολυάριθµα µιτοχόνδρια (Pugh 1963). Στο κορυφαίο τµήµα του κυτταροπλάσµατος εµφανίζονται συµπλέγµατα Golgi µε κυπελοειδή µορφή, τα οποία παράγουν κυστίδια που εντοπίζονται στην κορυφή των κυττάρων και αποτελούν πιθανότατα εκκριτικά κοκκία (Summer 1966, McQuiston 1969, Owen 1972, Owen 1973). Τα βασεόφιλα κύτταρα είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση και την έκκριση πρωτεϊνών ενζυµικής 13

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φύσεως, οι οποίες είναι απαραίτητες για την εξωκυτταρική πέψη των τροφών (Owen 1972). 4. Το λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών Τα λυσοσώµατα αποτελούν υποκυτταρικές δοµές που περιέχουν µεγάλο αριθµό υδρολυτικών ενζύµων (Εικ. 6), όπως νουκλεάσες, φωσφατάσες, υπεροξειδάσες κ.α. και συµµετέχουν στην αποικοδόµηση ποικίλων µακροµορίων ενδογενούς και εξωγενούς προέλευσης (Klionsky & Emr 2000, Moore et al. 2006b, Robledo et al. 2006, Moore et al. 2007). Εικόνα 6. Σχηµατική απεικόνιση λυσοσώµατος στην οποία φαίνονται τα διάφορα είδη των υδρολυτικών ενζύµων (Alberts et al., 2002). Figure 6. Schematic presentation of lysosome showing the various types of hydrolytic enzymes (Alberts et al., 2002). Τα πεπτικά κύτταρα των µυδιών περιέχουν ποικίλλες οµάδες λυσοσωµάτων µε διαφορετικό µέγεθος και ενζυµικό περιεχόµενο (Moore 1976, ICES 2004, Robledo et al. 2006). Το λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων αποτελείται από δυναµικά διαµερίσµατα, τα οποία είναι υπεύθυνα για την ενδοκυτταρική πέψη των σωµατιδίων της τροφής (Owen 1973, Robledo & Cajaraville 1996) και ταυτοποιούνται µε βάση τη θέση που κατέχουν στο κυτταρόπλασµα. Τα ενδοκυτικά κυστίδια εντοπίζονται στην κορυφή των πεπτικών κυττάρων, τα ετερολυσοσώµατα βρίσκονται, κυρίως, στην ενδιάµεση περιοχή και τα υπολειπόµενα σωµάτια εντοπίζονται στην ενδιάµεση προς βασική περιοχή των πεπτικών κυττάρων (Cajaraville et al. 1991, Owen 1972, 1973, Pipe & Moore 1985). Τα λυσοσώµατα δεν µπορούν εύκολα να ταυτοποιηθούν από το µέγεθός τους, το σχήµα και την εσωτερική δοµή τους, διότι παρουσιάζουν έντονο πολυµορφισµό. Είναι γνωστό ότι διαφορετικά τµήµατα του λυσοσωµικού συστήµατος µπορεί να 14

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιέχουν διαφορετικές ποσότητες ενζύµων ((Luzio et al. 2000) ή διαφορετικά είδη ενζύµων (Imort et al. 1983). Εποµένως, η ταυτοποίησή τους σε επίπεδο οπτικού και ηλεκτρονικού µικροσκοπίου επιτυγχάνεται µε την ανίχνευση κατάλληλων λυσοσωµικών ενζύµων. Στην περιβαλλοντική τοξικολογία, τα περισσότερο διαδεδοµένα λυσοσωµικά ένζυµα είναι η όξινη φωσφατάση, η β-γλουκουρονιδάση και η Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση (UNEP/RAMOGE 1999, ICES 2004). Τα λυσοσώµατα, εκτός από τη συµµετοχή τους στην ενδοκυτταρική πέψη, συµβάλλουν στη συγκέντρωση και αδρανοποίηση µετάλλων, αλλά και πολλών οργανικών ουσιών (Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Soto et al. 2002, Marigomez & Baybay-Villacorta 2003, Moore et al. 2004, Einsporn et al. 2005), αφού αποτελούν την κύρια ενδοκυτταρική θέση συσσώρευσης ρύπων (Moore 1985, 1988, Sarasquete et al. 1992). Για το λόγο αυτό, οι λυσοσωµικές αποκρίσεις στους ρύπους έχουν αξιοποιηθεί σε µεγάλο βαθµό τόσο σε µελέτες πεδίου (Romeo et al. 2000, Alvarado et al. 2005, Broeg et al. 2005, Bilbao et al. 2006, Champeau & Narbonne 2006, Guerlet et al. 2006, 2007, Schiedek et al. 2006, Zorita 2006) όσο και σε εργαστηριακές µελέτες (Moore et al. 1982, Moore 1988, Regoli 1992, Krishnakumar et al. 1994, Etxeberria et al. 1995, Marigomez et al. 1996a) ως βιοµάρτυρες για τον προσδιορισµό των επιπτώσεων της ρύπανσης. 5. Βράγχια Τα βράγχια των µυδιών αποτελούνται από δύο ηµιβράγχια σε σχήµα W ένα σε κάθε πλευρά του σώµατος. Κάθε ηµιβράγχιο περιλαµβάνει δύο βραγχιακά φύλλα, ένα εξωτερικό και ένα εσωτερικό, τα οποία περιέχουν πολυάριθµα νηµάτια σε παράλληλη διάταξη. Τα βραγχιακά νηµάτια (Εικ. 7α) συνδέονται µεταξύ τους µε βλεφαριδοφόρους συνδέσµους και αναδιπλώνονται το καθένα σε σχήµα V. Στο µονόστιβο επιθήλιο των βραγχιακών νηµατίων τα κύτταρα επικάθονται σε βασική µεµβράνη, η οποία αποτελείται από ινίδια ανάλογα µε αυτά του κολλαγόνου, ενώ εσωτερικά υπάρχει µια συνεχής στιβάδα από υλικό τύπου χητίνης που επενδύεται από µια ασυνεχή στιβάδα ενδοδερµικών κυττάρων (Wright et al. 1987). Σε εγκάρσια τοµή, κάθε βραγχιακό νηµάτιο µπορεί να διαχωριστεί σε τρεις περιοχές: την κορυφαία, την πλευρική και τη βασική περιοχή (Εικόνα 7β). 15

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κορυφαία ζώνη Κοκκία λιποφουσκίνης Ουδέτεροι βλεννοπολυσακχαρίτες Όξινοι βλεννοπολυσακχαρίτες Πλευρική ζώνη ραστικότητα ηλεκτρικής BrdU ανοσοεντοπισµός πολλαπλασιαζόµενων κυττάρων Ουδέτερα λιπίδια α β Βασική ζώνη Λυσοσώµατα µε θετική αντίδραση για την όξινη φωσφατάση Εικόνα 7. (α) Φωτογραφία από το οπτικό µικροσκόπιο, όπου φαίνεται εγκάρσια τοµή του βραγχιακού νηµατίου του µυδιού Μ. galloprovincialis (από Raftopoulou et al. 2002). (β) Σχηµατική απεικόνιση του βραγχιακού νηµατίου του µυδιού Μ.galloprovincialis (από Gómez-Mendikute et al., 2005), όπου φαίνονται τα διάφορα συστατικά (κοκκία λιποφουσκίνης, βλεννοπολυσακχαρίτες, ουδέτερα λιπίδια), οι δραστικότητες των ενζύµων (SDH, όξινη φωσφατάση) και τα διαιρούµενα κύτταρα κατά µήκος του νηµατίου (FC κορυφαία κύτταρα, EFC πλευροκορυφαία κύτταρα, PLFC µεταπλευροκορυφαία κύτταρα, LC πλευρικά κύτταρα, PLC µεταπλευρικά κύτταρα, EC ενδοθηλιακά κύτταρα, S αιµολεµφατική κοιλότητα, ACC βλεφαριδοφόρα κύτταρα βασικής περιοχής, AC µη βλεφαριδοφόρα κύτταρα βασικής περιοχής). Figure 7. (α) Light microscopical photograph of a transverse section of gill filament of the mussel M. galloprovincialis (from Raftopoulou et al, 2002). (β) Schematic presentation of a long central filament from the middle of a gill lamella of M. galloprovincialis (from Gómez-Mendikute et al. 2005). The location of the various compounds (lipofuscin granules, mucopolysaccharides, neutral lipids), enzyme activities (SDH, acid phosphatase) and proliferating cells along the different portions of the gill filaments are shown (FC frontal cells, EFC eu-latero-frontal cells, PLFC postlatero frontal cells, LC lateral cells, PLC post-lateral cells, EC endothelial cells, S haemolymphatic sinus, ACC abfrontal ciliated cells, AC abfrontal non-ciliated cells). Η κορυφαία περιοχή του βραγχιακού νηµατίου αποτελείται από βλεφαριδοφόρα κύτταρα, κιονοειδή επιθηλιακά κύτταρα και βλεννοκύτταρα. Στην πλευρική περιοχή υπάρχουν βλεννοκύτταρα και βλεφαριδοφόρα κύτταρα που σταδιακά µετατρέπονται σε πλακώδη ενδοθηλιακά. Η βασική περιοχή των βραγχιακών νηµατίων συνίσταται από βλεφαριδοφόρα και µη βλεφαριδοφόρα κιονοειδή κύτταρα και βλεννοκύτταρα (Sunila 1986, Wright et al. 1987). Τα βράγχια των µαλακίων συµµετέχουν στην ανταλλαγή αερίων, στην έκκριση, στην ωσµορύθµιση, στη µεταφορά της τροφής προς τις χειλικές προσακτρίδες και το στόµα και στο σχηµατισµό ενός προστατευτικού στρώµατος 16

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ γλυκοπρωτεϊνης που λειαίνει την επιφάνεια του επιθηλίου (Nuwayhid et al. 1978, Morton 1983, Cajaraville et al. 1990,1991). Τα µύδια φιλτράρουν το θαλασσινό νερό µε συνδυασµένες κινήσεις των βλεφαρίδων των επιθηλιακών κυττάρων των βραγχιακών νηµατίων. Στα πλευρικά κύτταρα οι βλεφαρίδες παρουσιάζουν µια µεταχρονική κίνηση (Aeilo & Sleigh 1972) που βοηθάει στη δηµιουργία προσαγωγού και απαγωγού ρεύµατος νερού. Οι πλευροκορυφαίες βλεφαρίδες είναι υπεύθυνες για την κατακράτηση µικρών σωµατιδίων τροφής (Moore 1971, Owen 1974), ενώ οι προπλευροκορυφαίες βλεφαρίδες µεταφέρουν την τροφή από τις πλευροκορυφαίες στις κορυφαίες βλεφαρίδες (Owen 1974, Owen & McRae 1976). Οι κορυφαίες βλεφαρίδες, που βρίσκονται διαρκώς σε κίνηση, µεταφέρουν τα µικρά σωµατίδια της τροφής προς το στοµατικό άνοιγµα (Morton 1983). Τέλος, στα κύτταρα της βασικής περιοχής οι βλεφαρίδες αποµακρύνουν τα σωµατίδια της τροφής που έχουν διαφύγει από το κορυφαίο τµήµα του νηµατίου και τα αποβάλλουν (Good et al. 1990). 6. Αιµοκύτταρα Τα αιµοκύτταρα των δίθυρων µαλακίων δέχονται την άµεση επίδραση των περιβαλλοντικών ρύπων, καθώς ο φυσιολογικός τους ρόλος σχετίζεται µε τη µεταφορά ενδογενών και εξωγενών παραγόντων αλλά και µε τη διαδικασία της άµυνας (Mersh et al. 1996). Τα κύτταρα αυτά αποµονώνονται εύκολα από το σώµα των µυδιών χωρίς να υπάρχει κίνδυνος καταστροφής τους, µε αποτέλεσµα να καθίστανται πολύ εύχρηστο βιολογικό υλικό σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Τα αιµοκύτταρα του µυδιού M. galloprovincialis διακρίνονται µορφολογικά σε δύο τύπους, τα κοκκώδη και τα υαλώδη κύτταρα. Τα κοκκώδη κύτταρα έχουν αυξηµένο µέγεθος και σχηµατίζουν επιµήκη ψευδοπόδια. ιαθέτουν αυξηµένο αριθµό κυτταροπλασµατικών κοκκίων, τα οποία ποικίλλουν σε µέγεθος, παρουσιάζουν µεγάλη ηλεκτρονική πυκνότητα και καταλαµβάνουν το µεγαλύτερο όγκο του κυττάρου. Μερικά από τα κοκκία αυτά είναι πιθανότατα λυσοσώµατα, εφόσον αντιδρούν θετικά στην ανίχνευση λυσοσωµικών ενζύµων (Huffman & Tripp 1982, Moore & Gelder 1985, Pipe 1990, Pal & Cajaraville 1994). Τα κοκκώδη αιµοκύτταρα φαίνεται να αποτελούν τον κύριο τύπο φαγοκυττάρων στα δίθυρα µαλάκια (Foley & Cheng 1975, Rodrick & Ulrich 1984, Cajaraville & Pal 1995) και 17

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σχετίζονται µε την παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου, καθώς και αντιµικροβιακών ουσιών που βοηθούν στην εξουδετέρωση τοξικών ουσιών (Cheng 1992, Pipe 1992, Cajaraville et al. 1994, Bachere et al. 1995, Oliver & Fisher 1999). Τα µη κοκκώδη, υαλώδη αιµοκύτταρα σχηµατίζουν αρκετά λεπτά και µακριά ψευδοπόδια, διαθέτουν µεγάλο πυρήνα µε µάζες πυκνής χρωµατίνης, περιορισµένο κυτταρόπλασµα, καλά σχηµατισµένο σύµπλεγµα Golgi, ελάχιστα λυσοσώµατα, αρκετά µιτοχόνδρια, σηµαντική ποσότητα αδρού και λείου ενδοπλασµατικού δικτύου και άφθονα ριβοσώµατα. Τα κύτταρα αυτά περιέχουν ελάχιστα ή καθόλου κοκκία και είτε αποτελούν πρόδροµες µορφές των κοκκωδών κυττάρων (Mix 1976) είτε συνιστούν ένα διαφορετικό τύπο ώριµων κυττάρων που ανήκουν σε µια ξεχωριστή κυτταρική σειρά (Cheng 1981, 1984, Auffret 1989). Τα υαλώδη κύτταρα δεν επιτελούν κάποια συγκεκριµένη λειτουργία, παρόλο που έχει συνδεθεί η δράση τους µε την αιµόσταση και µε τη διαδικασία επούλωσης τραυµάτων (Suzuki et al. 1991, Suzuki & Funakoshi 1992).. ΚΥΡΙΑ ΕΙ Η ΡΥΠΩΝ ΠΟΥ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΝΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΘΑΛΑΣΣΙΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ 1. Βαρέα µέταλλα Τα µέταλλα, ανάλογα µε τη βιολογική τους σηµασία, διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: σε απαραίτητα µέταλλα (π.χ. χαλκός και ψευδάργυρος) και σε µη απαραίτητα µέταλλα (π.χ. υδράργυρος, κάδµιο, αρσενικό, µόλυβδος). Τα απαραίτητα µέταλλα βοηθούν στην εύρυθµη λειτουργία του οργανισµού, καθώς συµµετέχουν στην ενεργοποίηση µεταλλοενζύµων και πρωτεϊνών «stress», βοηθούν στη µεταφορά οξυγόνου και σε αναγωγικές και πολλές άλλες βιολογικές διαδικασίες. Για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων απαιτούνται µικρές µόνο συγκεντρώσεις τους από τους ζωντανούς οργανισµούς, οι οποίοι διαθέτουν ειδικούς µηχανισµούς για την πρόσληψη και µεταφορά των στοιχείων αυτών στους ιστούς. Τα απαραίτητα µέταλλα µπορεί να εµφανίσουν τοξική δράση στην περίπτωση που η συγκέντρωσή τους υπερβεί τα φυσιολογικά όρια (Nicaise et al. 1989, Nott 1991). Τα µη απαραίτητα µέταλλα δεν έχουν γνωστό βιολογικό ρόλο, αλλά εµφανίζουν µεγάλη τοξικότητα ακόµη και σε µικρές συγκεντρώσεις (Rainbow 1993). Συγκεκριµένα, µπορούν να προκαλέσουν νευροφυσιολογικές διαταραχές στους 18

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ζωντανούς οργανισµούς, γενετικές αλλοιώσεις των κυττάρων (µεταλλάξεις), επιδράσεις στην ενζυµική και ορµονική δραστηριότητα, προβλήµατα στην αναπαραγωγή, τερατογενέσεις και καρκινογενέσεις. Τα µη απαραίτητα µέταλλα συναγωνίζονται τα απαραίτητα µέταλλα στις θέσεις σύνδεσης των τελευταίων, µε αποτέλεσµα την εµφάνιση δυσµενών επιπτώσεων στο µεταβολισµό των οργανισµών (Hartwig 1998). Γενικότερα, η τοξική δράση των µετάλλων εξαρτάται από το συνδυασµό ποικίλων παραγόντων, όπως η συγκέντρωσή τους, το είδος του µετάλλου, η παρουσία και η συνεργατική δράση άλλων µετάλλων και το είδος του οργανισµού. Η µεµονωµένη έκθεση, καθώς επίσης και η ταυτόχρονη έκθεση των µυδιών σε απαραίτητα και µη απαραίτητα µέταλλα (Cu και Hg, αντίστοιχα) αποτελεί αντικείµενο µελέτης της παρούσας διατριβής και έχει ως στόχο να δώσει χρήσιµες πληροφορίες που αφορούν στη συσσώρευσή τους στους ιστούς του µυδιού Μ. galloprovincialis, τόσο κατά τη διάρκεια της πειραµατικής έκθεσης όσο και κατά τη διάρκεια της αποτοξικοποίησης. Ο Cu είναι ένα απαραίτητο στοιχείο για την ανάπτυξη των δίθυρων µαλακίων, αλλά γίνεται ιδιαίτερα τοξικός όταν η συγκέντρωσή του αυξηθεί πάνω από τα φυσιολογικά επίπεδα (Sunda & Guillard 1976, Engel & Sunda 1979, Chavez-Crooker et al. 2003, Nicholson 2003a). Ο Cu βρίσκεται στο θαλασσινό νερό και συσσωρεύεται σε σχετικά υψηλά επίπεδα σε µη τοξική µορφή στους ιστούς αρκετών µαλακίων (George et al. 1978). Ο Hg, ο οποίος απελευθερώνεται στο θαλάσσιο περιβάλλον από φυσικά και ανθρωπογενή αίτια, είναι ένα µη απαραίτητο µέταλλο µε άγνωστη βιολογική λειτουργία (Cossa et al. 2002). Η µεµονωµένη εξέταση της συσσώρευσης του Cu και του Hg στους ιστούς των θαλάσσιων οργανισµών έχει µελετηθεί εκτεταµένα, ενώ µόνο µερικές αναφορές προσδιόρισαν τη συνδυασµένη τοξικότητα αυτών των µετάλλων στους θαλάσσιους οργανισµούς, όπως στα κωπήποδα (Barnes & Stanbury 1948), στους εχίνους (Murakkami et al. 1976), στα αµφίποδα (Moulder 1980) και στις προνύµφες µυδιών (Prato & Biandolino 2007). Με βάση τις βιβλιογραφικές αναφορές δεν υπάρχουν δεδοµένα που να αφορούν στην παράλληλη έκθεση του Cu και του Hg σε ενήλικα άτοµα µυδιών. Εποµένως, η παρούσα διατριβή µε τη χρήση χηµικών και ιστοχηµικών µεθόδων αποσκοπεί να προβάλλει καινούργιες πληροφορίες για τη συνεργατική ή ανταγωνιστική δράση των δύο παραπάνω µετάλλων που αφορά στη συσσώρευσή τους στους ιστούς των µυδιών. Τα βαρέα µέταλλα µπορούν να ανιχνευθούν και να εντοπιστούν στους ιστούς των µαλακίων µε διάφορες µεθόδους, όπως µε την αυτοµεταλλογραφία και την 19

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ατοµική απορρόφηση. Η αυτοµεταλλογραφία (Danscher 1984) είναι µια κυτοχηµική τεχνική που χαρακτηρίζεται από µεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία, καθώς λίγα άτοµα ενός µετάλλου αρκούν για να ξεκινήσει η διαδικασία ανίχνευσης και εντοπισµού των βαρέων µετάλλων µέσα στα κύτταρα (Danscher & Montagnese 1994). Μεταλλικά σουλφίδια και µεταλλικά σελενίδια µπορούν να ενισχυθούν µε άργυρο και να γίνουν ορατά στο οπτικό και ηλεκτρονικό µικροσκόπιο µε τη µορφή µαύρων κόκκων αργύρου (Danscher & Moller-Madsen 1985). Με τη χρήση της αυτοµεταλλογραφίας στο οπτικό µικροσκόπιο βρέθηκε ότι o πεπτικός αδένας, τα βράγχια και τα αιµοκύτταρα των µαλακίων αποτελούν κύριες θέσεις συσσώρευσης των βαρέων µετάλλων (Marigomez et al. 1996b, Domouhtsidou & Dimitriadis 2000, Dimitriadis et al. 2003, Raftopoulou et al. 2002). Η τεχνική της αυτοµεταλλογραφίας έχει εφαρµοστεί µε επιτυχία σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis, µε σκοπό να εκτιµηθεί η βιοδιαθεσιµότητα των µετάλλων στο πεδίο και προτάθηκε η χρήση της σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης (Soto & Marigomez 1997b, Dimitriadis & Papadaki 2004). Από την άλλη µεριά, η ατοµική απορρόφηση είναι µια τεχνική µε την οποία εκτιµάται η συγκέντρωση ενός συγκεκριµένου µετάλλου σε ένα δείγµα. Η τεχνική αυτή χρησιµοποιείται ευρύτατα σε µελέτες παρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης, στις οποίες υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις διαφόρων µετάλλων στους ιστούς των µυδιών, και παρέχει χρήσιµες πληροφορίες για το όργανο-θέση στο οποίο συσσωρεύονται (Amiard et al. 1986, Regoli & Orlado 1994a,b, Regoli 1998, Domouhtsidou et al. 2004). Τα θαλάσσια µαλάκια έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν πολλά διαφορετικά είδη µετάλλων στους ιστούς τους (Goldberg 1980, Philips 1980, Goldberg 1986, Rainbow 1992, 1993). Η εισαγωγή των µετάλλων στους ιστούς των µαλακίων µπορεί να πραγµατοποιηθεί παθητικά, µε διάχυση από την επιφάνεια του σώµατος ή µέσω της τροφής (Carpene & George 1981, Depledge & Rainbow 1990). Ο πεπτικός αδένας, τα βράγχια και τα νεφρίδια των µαλακίων αποτελούν τις κύριες θέσεις συσσώρευσης και αποτοξικοποίησης για τα περισσότερα µέταλλα (Bryan 1979, Amiard et al. 1986, Cossa 1989, Truchet et al. 1990, Regoli & Orlando 1994b, Bigas et al. 1997). Τα κύτταρα προκειµένου να αντιµετωπίσουν την τοξικότητα των µετάλλων έχουν αναπτύξει διάφορους προστατευτικούς µηχανισµούς, όπως τη συσσώρευση των µετάλλων σε µη τοξικές µορφές είτε µε τη σύνδεσή τους µε οργανικές χειλικές ενώσεις είτε µε το σχηµατισµό συµπλόκων µε ανόργανα υλικά σε µορφή ιζηµάτων (Simkiss & Taylor 1989, Viarengo 1989, Depledge & Rainbow 20

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1990). Η συσσώρευση µεταλλικών ιόντων στους ιστούς των µυδιών δεν επηρεάζεται µόνο από τη συγκέντρωση, αλλά φαίνεται να εξαρτάται και από ποικίλους φυσικούς παράγοντες, όπως το µέγεθος των ατόµων, η ηλικία, το φύλο, ο ρυθµός αύξησης, η αναπαραγωγική δραστηριότητα, η εποχικότητα, το ύψος της υδάτινης στήλης, η αλατότητα, η ταυτόχρονη παρουσία άλλων ρύπων και ο ρυθµός έκκρισης των ρύπων από τα διάφορα όργανα (Boyden 1977, Cossa et al. 1980, Cossa 1989, Depledge & Rainbow 1990). 2. Οργανικοί ρύποι Οι οργανικές ουσίες µπορούν να δράσουν ως ρύποι και να προκαλέσουν σηµαντικές επιπτώσεις στη φυσιολογική κατάσταση των υδρόβιων οργανισµών. Οι περισσότεροι οργανικοί ρύποι έχουν λιπόφιλο χαρακτήρα (Cossarini-Dunier et al. 1987) και ο ρυθµός συσσώρευσης τους στους ιστούς των οργανισµών είναι υψηλός (La Rocca et al. 1991). Οι πολυκυκλικοί αρωµατικοί υδρογονάνθρακες, τα οργανοχλωριωµένα εντοµοκτόνα και τα ζιζανιοκτόνα συνιστούν κύριους τοξικούς παράγοντες για τους οργανισµούς, λόγω της µικρής υδατοδιαλυτότητας τους και της απουσίας µηχανισµών βιοδιάσπασης και αποµάκρυνσής τους από τους ιστούς. Οι οργανικοί ρύποι εισέρχονται στα κύτταρα µε διάχυση από την πλασµατική µεµβράνη ή συνδέοται µε άλλα µόρια από το περιβάλλον δηµιουργώντας σύµπλοκα, τα οποία στη συνέχεια εισέρχονται µέσα στα κύτταρα µε φαγοκύτωση ή ενδοκύτωση και οδηγούνται στα λυσοσώµατα για ενδοκυτταρική πέψη (Moore 1990). Οι πολυκυκλικοί αρωµατικοί υδρογονάνθρακες (PAH) είναι µια µεγάλη οµάδα οργανικών ενώσεων µε δύο ή περισσότερους συµπυκνωµένους αρωµατικούς δακτυλίους. Οι PAH είναι γνωστό ότι επηρεάζουν µια ποικιλία βιολογικών διαδικασιών και µπορεί να είναι ισχυροί µεταλλαξιγόνοι και καρκινογόνοι παράγοντες (Pelkonen & Nebert 1982). Οι οργανικοί αυτοί ρύποι εισάγονται, συνήθως, στο περιβάλλον µέσω των ανθρωπογενών δραστηριοτήτων, οι οποίες έχουν αυξηθεί µε ταχείς ρυθµούς κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Γενικά, η παραγωγή των ΡΑΗ είναι αποτέλεσµα πυρολυτικών διαδικασιών, όπως η ατελής καύση των οργανικών υλικών κατά τις βιοµηχανικές και άλλες ανθρώπινες δραστηριότητες ή µπορεί να σχετίζεται µε φυσικές διεργασίες, όπως είναι οι πυρκαγιές. Στο υδάτινο περιβάλλον οι PAH απελευθερώνονται µέσω των υγρών αποβλήτων, του οπτάνθρακα, των βιοµηχανιών πετρελαίου, της κυκλοφορίας των οχηµάτων και των 21

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πετρελαιοκηλίδων. Οι PAH συσσωρεύονται στα ψάρια και στα κελύφη ορισµένων υδρόβιων οργανισµών όπως τα µύδια (Heintz et al. 2000, Carls et al. 1999, Okay et al. 2003). Το φαινανθρένιο, το ανθρακένιο και το ναφθαλένιο (Πίν. 1) είναι µερικοί από τους ΡΑΗ που απελευθερώνονται στο περιβάλλον και επηρεάζουν την εύρυθµη λειτουργία των υδρόβιων οργανισµών και ειδικότερα των µυδιών. Πίνακας 1: Παραδείγµατα οργανικών ρύπων που απαντώνται στα υδάτινα οικοσυστήµατα. Table 1: Examples of organic pollutants presented in the marine ecosystems Χηµικός τύπος Οργανικός ρύπος Φαινανθρένιο (phenanthrene) Ανθρακένιο (anthracene) Ναφθαλένιο (naphthalin) Λινδάνιο (γ-εξαχλωροκυκλοεξάνιο) Lindane (γ-hexachlorocyclohexane) 2, 4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ (2,4 dichloro-phenoxyacetic acid) Το φαινανθρένιο που συντίθεται από τρεις συντηγµένους δακτυλίους βενζολίου αποτελεί σηµαντικό συστατικό του αργού πετρελαίου (Carls et al. 1999, Kennedy & Farrell 2005) και είναι πολύ τοξικό για τους υδρόβιους οργανισµούς (Neff & Anderson 1981). Το ανθρακένιο αποτελείται, επίσης, από τρεις συντηγµένους δακτυλίους βενζολίου και χρησιµοποιείται σε συντηρητικά ξύλου, σε εντοµοκτόνα 22

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ και σε υλικά επίστρωσης. Σε αντίθεση µε άλλους PAH, το ανθρακένιο δεν είναι καρκινογόνος ρύπος, αλλά θεωρείται τοξικός εξαιτίας της ικανότητάς του να βιοσυσσωρεύεται στους ιστούς των θαλάσσιων οργανισµών. Το ναφθαλένιο αποτελείται από δύο συντηγµένους δακτυλίους βενζολίου και χρησιµοποιείται, κυρίως, ως αντισκωριακό και ως χηµικός διαµεσολαβητής για τη σύνθεση άλλων χηµικών ουσιών (Walker et al. 2001). Τα οργανοχλωριωµένα εντοµοκτόνα είναι µια σχετικά µεγάλη οµάδα εντοµοκτόνων µε διαφοροποιήσεις στη δοµή, στις ιδιότητες και στις χρήσεις τους (Brooks 1974). Η κατηγορία αυτή των εντοµοκτόνων περιέχει οργανικές ουσίες µε χαµηλή διαλυτότητα και υψηλό λιπόφιλο χαρακτήρα. Ορισµένα από τα οργανοχλωριωµένα εντοµοκτόνα διατηρούν σταθερή την αρχική τους δοµή ή συµπεριφέρονται ως σταθεροί µεταβολίτες, ενώ τα περισσότερα είναι νευροδηλητήρια (Walker et al. 2001). ύο από τους κύριους εκπρόσωπους των οργανοχλωριωµένων εντοµοκτόνων είναι το γ-εξαχλωροκυκλοεξάνιο (λινδάνιο) και το 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ (Πίν. 1). Το λινδάνιο είναι ένας επίµονος οργανικός ρύπος, του οποίου η παραγωγή και η αγροτική χρήση αποτελούν τις κύριες πηγές της περιβαλλοντικής επιβάρυνσης. Έχει σχετικά µεγάλο χρόνο ζωής στο περιβάλλον, απελευθερώνεται στα επιφανειακά και υπόγεια ύδατα και µπορεί να βιοσυσσωρευτεί στους ιστούς των οργανισµών κατά µήκος της τροφικής αλυσίδας (NARAP 2006). Το 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ είναι το πιο ευρέως διαδεδοµένο ζιζανιοκτόνο στον κόσµο. Γενικά, είναι ένας µη επίµονος ρύπος και έχει µικρό χρόνο ηµιζωής στα υδάτινα οικοσυστήµατα (Walker et al. 2001). Ε. ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΕΣ ΠΟΥ ΕΦΑΡΜΟΣΤΗΚΑΝ Οι βιολογικές παράµετροι που χρησιµοποιούνται ως βιοµάρτυρες (biomarkers) σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης εµφανίζουν σηµαντικές εποχικές µεταβολές (Marigomez et al. 1996b, Cancio et al. 1999, Petrovic et al. 2004, Guerlet et al. 2007), µε αποτέλεσµα να καθίσταται δύσκολος ο διαχωρισµός των αποκρίσεων των οργανισµών που οφείλονται στην παρουσία ρύπων από αυτές που οφείλονται σε εποχικές διακυµάνσεις των περιβαλλοντικών παραγόντων (Kagley et al. 2003). Εποµένως, η εφαρµογή µιας πληθώρας βιοµαρτύρων σε διαφορετικές εποχές του έτους θα δώσει χρήσιµες πληροφορίες για το εύρος των εποχικών τους 23

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διακυµάνσεων, οι οποίες θα χρησιµοποιηθούν για την ορθότερη εκτίµηση των αποτελεσµάτων που συγκεντρώνονται σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης. 1. Λυσοσωµικές αποκρίσεις Οι λυσοσωµικές αποκρίσεις στο περιβαλλοντικό «stress», οι οποίες βασίζονται στην ιστοχηµική µελέτη των λυσοσωµικών ενζύµων (Marigomez et al. 2005b), διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: µεταβολές στη διαπερατότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης, αλλαγές στο µέγεθος των λυσοσωµάτων και διαφοροποιήσεις στο περιεχόµενό τους, όπως είναι η συσσώρευση ακόρεστων ουδέτερων λιπιδίων και λιποφουσκινών (Lowe 1988, Moore 1988, Marigomez & Baybay - Villacorta 2003). Οι κυτταρικοί αυτοί βιοµάρτυρες είναι αποδεκτοί από διεθνείς οργανισµούς, όπως ο WHO (World Health Organization) και ο FAO (Food Agruculture Organization) για την εκτίµηση της ποιότητας του θαλάσσιου περιβάλλοντος (Group of Experts on the Scientific Aspects of Marine Protection GESAMP 1980) Σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS) Η επίδραση της ρύπανσης στη διαπερατότητα της µεµβράνης των λυσοσωµάτων µπορεί να εκτιµηθεί µε την εφαρµογή ιστοχηµικών µεθόδων, όπως η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)», αλλά και µε την εφαρµογή in vitro µεθόδων, όπως η τεχνική «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)». Ο βιοµάρτυρας «LMS» που εφαρµόζεται στον πεπτικό αδένα των µαλακίων και των ψαριών (ICES 2004) αποτελεί χρήσιµο και ευαίσθητο εργαλείο για την εκτίµηση των αποτελεσµάτων των επιβλαβών χηµικών ουσιών που βρίσκονται ακόµα και σε πολύ µικρή συγκέντρωση στο εσωτερικό των κυττάρων (UNEP/RAMOGE 1999). Σε εργαστηριακές µελέτες έχει αναφερθεί η αποσταθεροποίηση της λυσοσωµικής µεµβράνης µετά από την έκθεση των οργανισµών σε οργανικούς ρύπους και βαρέα µέταλλα (Moore 1988, Regoli 1992, Krishnakumar et al. 1994, Raftopoulou et al. 2005, Koukouzika & Dimitriadis 2008). Η µέθοδος αυτή έχει χρησιµοποιηθεί και σε µελέτες πεδίου (Moore et al. 1982, 1986, 1987, Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Domouhtsidou et al. 2004, Koukouzika & Dimitriadis 2005) και είναι εξίσου αποτελεσµατική τόσο σε προγράµµατα παθητικής όσο και ενεργητικής βιοπαρακολούθησης (Viarengo & Canessi 1991, Regoli & Orlando 1993, Stien et al. 24

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1998). Εκτός από την παρουσία ρυπογόνων παραγόντων, η παράµετρος αυτή είναι δυνατόν να επηρεαστεί και από φυσιολογικούς/περιβαλλοντικούς παράγοντες που εµφανίζουν εποχικότητα, όπως είναι η θερµοκρασία και ο αναπαραγωγικός κύκλος (Regoli 1992, Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Camus et al. 2000). Ο βιοµάρτυρας NRR εφαρµόστηκε στα αιµοκύτταρα µυδιών για την εκτίµηση των επιπτώσεων των οργανικών ρύπων (Lowe & Pipe 1994, Fernley et al. 2000) ή των βαρέων µετάλλων (Svendsen & Weeks 1995) τόσο σε µελέτες πεδίου (Fernley et al. 2000) όσο και σε εργαστηριακές έρευνες (Lowe et al. 1995b). Ο χρόνος της κατακράτησης της χρωστικής στα λυσοσώµατα επηρεάζεται, κυρίως, από την παρουσία ρύπων, ενώ η µεταβολή περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως η θερµοκρασία και η αλατότητα, έχουν µικρότερη επίδραση σε αυτή την παράµετρο (Ringwood et al. 1998). Η NRR έχει θεωρηθεί πολύ ευαίσθητος βιοµάρτυρας «stress» και έχει εφαρµοσθεί τόσο σε προγράµµατα ενεργητικής όσο και παθητικής βιοπαρακολούθησης (Ringwood et al. 1998, Lowe et al. 1995a). Ο κυριότερος λόγος για τον οποίο γίνεται αναφορά στους δύο παραπάνω βιοµάρτυρες κατά την παρούσα έρευνα, εκτός από την εξέταση των εποχικών τους διακυµάνσεων, είναι η συσχέτισή τους µε τους υπό διερεύνηση βιοµάρτυρες, µε σκοπό οι τελευταίοι να καθιερωθούν σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης 1.2. οµικά χαρακτηριστικά των λυσοσωµάτων Η αλλαγή στη δοµή των λυσοσωµάτων έχει προταθεί ως βιοµάρτυρας ρύπανσης σε πολλά είδη µαλακίων και ψαριών έπειτα από την επίδραση διαφορετικού είδους «stress» (Alvarado et al. 2005, Bilbao et al. 2006, Champeau & Narbonne 2006, Guerlet et al. 2006, Marigomez et al. 2006). Η διόγκωση των λυσοσωµάτων στα πεπτικά κύτταρα αποτελεί την πιο κοινή αντίδραση µετά από την έκθεση των θαλάσσιων οργανισµών σε ρυπογόνους παράγοντες (Lowe et al. 1981, Lowe 1988, Moore 1988, Marigomez et al. 1989, Kohler 1991, Regoli 1992, Etxeberria et al. 1994, Regoli et al. 1998). Κατά το χρονικό διάστηµα της αποτοξικοποίησης των πεπτικών κυττάρων από τα µέταλλα, τα οποία έχουν συγκεντρωθεί στα λυσοσώµατα, έχει παρατηρηθεί αύξηση στο µέγεθος των λυσοσωµάτων και αποσταθεροποίηση της µεµβράνης τους (Viarengo et al. 1981b, Moore 1990, Regoli et al. 1998, Marigomez et al. 2005b). Ωστόσο, σε ορισµένες περιπτώσεις έχει παρατηρηθεί µείωση στο µέγεθος των λυσοσωµάτων έπειτα από µακροχρόνια επίδραση σε ρύπους (Cajaraville 25

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ et al. 1995a, Marigomez et al. 1996b). Σε µελέτες πεδίου υπάρχουν αντικρουόµενα αποτελέσµατα σχετικά µε τις µεταβολές των δοµικών χαρακτηριστικών των λυσοσωµάτων (Moore 1988, Regoli 1992, Etxeberia et al. 1995, Marigomez et al. 1996b), οι οποίες έχουν αποδοθεί σε γενετικές αλλαγές, στην ταυτόχρονη παρουσία ποικίλων ρύπων ή στην αλληλεπίδραση µε περιβαλλοντικούς παράγοντες (Moore 1988, Ward 1990, Marigomez et al. 1996b, Da Ros et al. 2000, 2002, Marigomez et al. 2005a). Κάτω από τις ελεγχόµενες εργαστηριακές συνθήκες, τα αποτελέσµατα κάποιων πηγών «stress» διαφορετικών των ρύπων µπορούν να κρατηθούν σε πολύ χαµηλά επίπεδα, ενώ στο πεδίο παράγοντες όπως η αλατότητα, η θερµοκρασία, η διαθεσιµότητα της τροφής, ο αναπαραγωγικός κύκλος κ.α. µπορούν να επηρεάσουν τη δοµή των λυσοσωµάτων και τη σταθερότητα της µεµβράνης τους, να επισκιάσουν τις αποκρίσεις στους ρύπους και να παρεµποδίσουν τις µετρήσεις τους (Etxeberria et al. 1995, Marigomez et al. 1996a, Leinio & Lehtonen 2005). Για το λόγο αυτό, οι περιβαλλοντικές παράµετροι θα πρέπει να είναι σταθερές όταν πραγµατοποιούνται µελέτες στο πεδίο, ώστε τυχόν αλλαγές που σηµειώνονται στις λυσοσωµικές αποκρίσεις να αφορούν αλλαγές που συµβαίνουν λόγω της ρύπανσης. Εποµένως, η εξέταση των αλλαγών που παρατηρούνται στον αριθµό και το µέγεθος των λυσοσώµατων των πεπτικών κυττάρων των µυδιών σε διάφορες εποχές του έτους θα οδηγήσει σε επιπλέον συµπεράσµατα, τα οποία θα χρησιµοποιηθούν για τη σωστή ερµηνεία των αποτελεσµάτων σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης Συσσώρευση των ουδέτερων λιπιδίων και των λιποφουσκινών Η συσσώρευση των ουδέτερων λιπιδίων αποτελεί χρήσιµη παράµετρο για τις αλλαγές που συµβαίνουν στη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων του πεπτικού αδένα των µυδιών και των ηπατοκυττάρων των ψαριών λόγω της παρουσίας περιβαλλοντικών ρύπων (Koehler et al. 2002, 2004). Ο σχηµατισµός αυτών των συστατικών στον πεπτικό αδένα των µυδιών αποτελεί µια µορφή λιπίδωσης που επάγεται από τοξικές χηµικές ουσίες (Moore 1988). Τα ουδέτερα λιπίδια εντοπίζονται, αρχικά, στο κυτταρόπλασµα των οργανισµών που εκτίθενται σε ρύπους και στη συνέχεια συγκεντρώνονται µε τη µορφή λιπιδιακών εγκλείστων στο εσωτερικό των λυσοσωµάτων µε τη διαδικασία της αυτοφαγίας (Moore 1988). H συσσώρευση των ουδέτερων λιπιδίων στο εσωτερικό των κυττάρων φαίνεται να σχετίζεται περισσότερο µε οργανική ρύπανση, όπως έχει παρατηρηθεί σε 26

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ εργαστηριακές έρευνες (Fahraeus Van-Ree & Spurrell 2000, Marigomez & Baybay Villacorta 2003, Moore et al. 2006a), και αποτελεί µια «όλα ή τίποτα» απόκριση (allor-nothing response) µετά από την έκθεση των µυδιών σε συγκεκριµένους οργανικούς ρύπους (Marigomez & Baybay-Villacorta 2003). Από την άλλη µεριά, σε µελέτες πεδίου δεν υποστηρίζεται η συσσώρευση των ουδέτερων λιπιδίων ως ευαίσθητο εργαλείο σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης (Domouhtsidou & Dimitriadis 2001). Σύµφωνα µε τα παραπάνω δεδοµένα υπάρχει µια διχογνωµία για το αν οι µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως βιοµάρτυρας της οργανικής ρύπανσης. Η παρούσα διατριβή θα δώσει επιπρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε την καθιέρωση των µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών ως βιοµάρτυρα της οργανικής ρύπανσης, συσχετίζοντας αυτήν την παράµετρο µε ήδη καθιερωµένους βιοµάρτυρες. Προηγούµενες βιβλιογραφικές αναφορές υποστηρίζουν την έντονη εποχική διαφοροποίηση της συσσώρευσης των ουδέτερων λιπιδίων ιδιαίτερα κατά την αναπαραγωγική διαδικασία (Cancio et al. 1999, Petrovic et al. 2001, Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Gorbi et al. 2008). Τα ουδέτερα λιπίδια καταναλώνονται κατά τη γαµετογένεση και συνιστούν την κύρια µορφή αποθηκευµένης ενέργειας των ωοκυττάρων για την κάλυψη των ενεργειακών αναγκών των εµβρύων και των πρώτων προνυµφικών σταδίων (Holland 1978). Ένας άλλος λόγος για τον οποίο γίνεται αναφορά στα ουδέτερα λιπίδια κατά την παρούσα διατριβή είναι να δοθούν επιπλέον πληροφορίες σχετικά µε τις εποχικές διακυµάνσεις αυτής της παραµέτρου, µε σκοπό την ορθότερη ερµηνεία των αποτελεσµάτων και την αξιοποίησή τους σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Οι λιποφουσκίνες αποτελούν το τελικό προϊόν της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (Moore 1990, Yin 1996, Terman et al. 1999, Brunk & Terman 2002) και συσσωρεύονται στα πεπτικά κύτταρα των δίθυρων µαλακίων λόγω της επίδρασης περιβαλλοντικών ρύπων (Viarengo et al. 1990, Regoli 1992, Riveros et al. 2002) όπως υποστηρίχτηκε τόσο σε µελέτες πεδίου όσο και σε εργαστηριακές µελέτες (Krishnakumar et al. 1994, 1997). Η αυξηµένη συσσώρευση λιποφουσκινών µέσα στα υπολειπόµενα σωµάτια έχει θεωρηθεί υπεύθυνη για τη διαταραχή της λειτουργίας του λυσοσωµικού συστήµατος (Moore 1990). Οι λιποφουσκίνες προκαλούν δυσλειτουργία των λυσοσωµάτων, αφού δεσµεύουν τα λυσοσωµικά ένζυµα και περιορίζουν µε τον τρόπο αυτό την ικανότητα της ενδοκυτταρικής πέψης (Brunk & 27

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Terman 2002, Moore et al. 2006b). Ωστόσο, η παράµετρος αυτή βρίσκεται υπό διερεύνηση όσον αφορά στη χρησιµοποίησή της ως βιοµάρτυρα της θαλάσσιας ρύπανσης. Για το λόγο αυτό η εξέταση των µορφοµετρικών αλλαγών των λιποφουσκινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών και η συσχέτισή τους µε άλλους καθιερωµένους βιοµάρτυρες θα δώσει πολύτιµες πληροφορίες, οι οποίες θα µπορούσαν να αξιοποιηθούν σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης. Επιπλέον, υπάρχουν περιορισµένες και αντικρουόµενες αναφορές που σχετίζονται µε τις εποχικές διακυµάνσεις της συσσώρευσης των λιποφουσκινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών (Botchetti & Regoli 2006, Petrovic et al. 2004). Εποµένως, η εξέταση των εποχικών διακυµάνσεων των µορφοµετρικών αλλαγών των λιποφουσκινών θα οδηγήσει σε χρήσιµα συµπεράσµατα, τα οποία θα συµβάλλουν στην ορθότερη ερµηνεία των αποτελεσµάτων που προκύπτουν από την εφαρµογή αυτής της παραµέτρου για την εκτίµηση της ποιότητας του θαλάσσιου περιβάλλοντος. 2. Συγκέντρωση µεταλλοθειονινών Οι µεταλλοθειονίνες, οι οποίες συνδέονται µε µεταλλικά ιόντα στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων, είναι µια οµάδα πρωτεϊνών µε χαµηλό µοριακό βάρος και είναι πλούσιες σε κυστεΐνη. Η κύρια λειτουργία των µεταλλοθειονινών είναι η συµβολή τους στο µεταβολισµό των απαραίτητων µετάλλων του οργανισµού, ενώ συµµετέχουν και στη διαδικασία της αποτοξικοποίησης των κυττάρων από τα µη απαραίτητα µέταλλα (Engel & Βrouwer 1987, Brouwer et al. 1989). Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών αποτελεί έναν έγκυρο και αξιόπιστο βιοµάρτυρα για την παρουσία βαρέων µετάλλων στους ιστούς των µυδιών και άλλων θαλάσσιων οργανισµών και εφαρµόζεται εκτεταµένα σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης (Roesijadi 1992, Langston et al. 1998, Rotchell et al. 2001, Domouhtsidou et al. 2004). Το περιεχόµενο των µεταλλοθειονινών στους ιστούς των µαλακίων δεν επηρεάζεται µόνο από την παρουσία βαρέων µετάλλων, αλλά είναι δυνατόν να επηρεαστεί και από φυσιολογικούς ή/και περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως είναι ο αναπαραγωγικός κύκλος, η θερµοκρασία, η ηλικία και το µέγεθος των ζώων (Viarengo et al. 1997, Cosson 2000, Rotchell et al. 2001). 28

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μολονότι η συγκέντρωση των µεταλλοθειονινών συνιστά ένα καθιερωµένο βιοµάρτυρα της έκθεσης των οργανισµών σε βαρέα µέταλλα, οι εποχικές διακυµάνσεις αυτής της παραµέτρου και ο συσχετισµός της µε περιβαλλοντικούς παράγοντες δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Εποµένως, η παρούσα διατριβή θα δώσει επιπρόσθετες πληροφορίες προς αυτή την κατεύθυνση, ώστε αυτές να αξιοποιηθούν σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης των θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστηµάτων. 3. ραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης Η ακετυλχολινεστεράση ανήκει σε µια οµάδα εστερασών που ονοµάζονται χολινεστεράσες. (Valbonesi et al. 2003). Βρίσκεται σε µεγάλες συγκεντρώσεις στην αιµόλεµφο των δίθυρων µαλακίων και πιστεύεται ότι ο ρόλος της σχετίζεται µε την υδρόλυση της ακετυλοχολίνης σε χολίνη και οξικό οξύ (Von Watchtendonk & Neef, 1979). Ο προσδιορισµός της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης έχει προταθεί ως αποτελεσµατικός βιοµάρτυρας σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης µε τη χρήση του µυδιού M. galloprovincialis (UNEP 1993,1997, UNEP/RAMOGE 1999) και έχει χρησιµοποιηθεί σε πολλές µελέτες πεδίου για την εκτίµηση της ποιότητας των υδάτων (Varela & Augspurger 1996, Stien et al , Dailianis et al. 2003, Rank et al. 2007). Βιβλιογραφικές αναφορές έχουν προτείνει την αναστολή της δραστικότητας αυτού του ενζύµου από την παρουσία οργανοφωσφορικών ενώσεων, παραγώγων του πετρελαίου, εντοµοκτόνων (Stien et al. 1998, Wogram et al. 2001), βαρέων µετάλλων κ.α. (Payne et al. 1996, Hamza-Chaffai et al. 1998) σε ιστούς των θαλάσσιων οργανισµών, καθώς και από περιβαλλοντικούς παράγοντες που εµφανίζουν εποχικότητα, όπως είναι η θερµοκρασία του θαλασσινού νερού (Dellali et al. 2001). Η εκτίµηση της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης στην παρούσα διατριβή θα παρέχει σηµαντικές πληροφορίες σχετικά µε τις εποχικές διακυµάνσεις αυτής της παραµέτρου και θα συµβάλλει στην περαιτέρω αξιολόγηση της αποτελεσµατικότητάς της ως αξιόπιστο εργαλείο σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. 29

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4. Συχνότητα µικροπυρήνων Οι µικροπυρήνες προκύπτουν από τη θραύση των χρωµοσωµάτων ή το µη σωστό διαχωρισµό του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης (Bolognesi et al. 2004). Αυτές οι δοµές που αποτελούν µικρές, κυτταροπλασµατικές µάζες χρωµατίνης και περιβάλλονται από µεµβράνη, εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα και δεν συνδέονται µε τον πυρήνα (Heddle 1973, Heddle et al. 1991). Οι µικροπυρήνες σχηµατίζονται στα ερυθροκύτταρα ποικίλων ειδών ψαριών (Ayllon & Garcia-Vasquez 2000, 2001, Gravato & Santos 2002, Pacheco et al. 2005), καθώς και στα αιµοκύτταρα και στα βραγχιακά κύτταρα διάφορων µαλακίων (Mersch et al. 1996, Izquierdo et al. 2003, Bolognesi et al. 2004, Barsiene et al. 2006a, 2006b, 2006c, Villela et al. 2007). Η καταµέτρηση των µικροπυρήνων σε ενεργώς διαιρούµενους πληθυσµούς κυττάρων µε την εφαρµογή της τεχνικής «συχνότητα µικροπυρήνων (micronuclei frequency)» έχει χρησιµοποιηθεί ως παράµετρος για την ένδειξη κυτογενετικής βλάβης (Ayllon & Garcia-Vazquez 2001). Το τεστ «συχνότητα µικροπυρήνων» αντιπροσωπεύει µια ευρέως διαδεδοµένη µέθοδο, η οποία είναι ικανή να προσδιορίσει την παρουσία γενοτοξικών παραγόντων στο περιβάλλον (Hooftman & Raat 1982, Manna et al. 1985). Η τεχνική αυτή έχει εφαρµοστεί τόσο σε µελέτες πεδίου (Brunetti et al. 1988, Mersch & Beauvais 1997) όσο και σε εργαστηριακές µελέτες έπειτα από την έκθεση σε ποικίλες ανόργανες (Majone et al. 1987, Mersch & Pihan 1993, Camusso et al. 1994, Bolognesi et al. 1999, Koukouzika & Dimitriadis 2008) και οργανικές ουσίες (Scarpato et al. 1990, Mersch et al. 1992, Brieger & Hunter 1993, Marvin et al. 1994, Becker-van Slooten & Tarradellas 1995, Koukouzika & Dimitriadis 2008) δίνοντας ικανοποιητικά αποτελέσµατα που αφορούν στην επίδραση των ρύπων. Παρόλα αυτά, υπάρχουν αναφορές οι οποίες δεν υποστηρίζουν τη χρήση της συγκεκριµένης τεχνικής ως αξιόπιστο βιοµάρτυρα για την εκτίµηση της ποιότητας του θαλάσσιου περιβάλλοντος (Dailianis et al. 2003, Koukouzika & Dimitriadis 2005). Εποµένως, η εξέταση της εµφάνισης των µικροπυρήνων ή άλλων πυρηνικών ανωµαλιών και η συσχέτισή τους µε ήδη καθιερωµένους βιοµάρτυρες αποτελεί αντικείµενο µελέτης της παρούσας διατριβής, προκειµένου να αποσαφηνιστεί η δυνατότητα αξιοποίησης αυτών των µεθόδων σε µελέτες βιοπαρακολούθησης των παράκτιων οικοσυστηµάτων. 30

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5. Πάχος επιθηλίου Το µέγεθος του αγωγού των πεπτικών σωληναρίων στα δίθυρα µαλάκια ποικίλει ανάλογα µε τη φάση της πεπτικής διαδικασίας στην οποία αυτά βρίσκονται (Langton 1975, Robinson et al. 1981) ή µπορεί να µεταβάλλεται λόγω της επίδρασης του περιβαλλοντικού «stress» (Lowe et al. 1981, Couch 1984, Tripp et al. 1984). Το γεγονός ότι το ύψος των πεπτικών κυττάρων των µαλακίων µειώνεται ως απόκριση στους παράγοντες που προκαλούν «stress» έχει µελετηθεί εδώ και πολλά χρόνια (Thompson et al. 1974, Moore et al. 1978b) και η ποσοτική εκτίµηση αυτής της παραµέτρου χρησιµοποιήθηκε ως ένδειξη της επίδρασης των περιβαλλοντικών ρύπων (Lowe et al. 1981, Recio et al. 1988, Vega et al. 1989, Cajaraville et al. 1992) και κυρίως της παρουσίας καδµίου (Vega et al. 1989, Marigomez et al. 1990a). Σε πρόσφατες µελέτες θαλάσσιων οικοσυστηµάτων αναφέρονται αλλαγές στο πάχος του επιθηλίου των πεπτικών κυττάρων των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από περιοχές µε αυξηµένη επιβάρυνση σε ρύπους (Da Ros et al. 2000, Marigomez et al. 2006). Επιπρόσθετα, η παράµετρος αυτή φαίνεται να εµφανίζει εποχική διακύµανση, όπως έχει δειχτεί σε περιορισµένες µελέτες που έχουν γίνει στο παρελθόν και αφορούσαν στα θαλάσσια µαλάκια (Marigomez et al. 1992a, Marigomez et al. 2006). Παρόλο που οι αλλαγές στη µορφολογία των πεπτικών σωληναρίων των µαλακίων αποτελούν δείκτη περιβαλλοντικού «stress», η παράµετρος αυτή δεν έχει χρησιµοποιηθεί εκτεταµένα σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης χρησιµοποιώντας ως οργανισµό βιο-ενδείκτη το µύδι M. galloprovincialis. Η ποσοτική εκτίµηση αυτής της παραµέτρου σε συνδυασµό µε τη µελέτη των εποχικών της διακυµάνσεων θα παρέχει χρήσιµες πληροφορίες, οι οποίες θα αξιοποιηθούν σε µελέτες της ποιότητας των υδάτων. Επίσης, η συσχέτιση των µορφολογικών αλλαγών των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών µε τους ήδη καθιερωµένους βιοµάρτυρες θα οδηγήσει σε πολύτιµα συµπεράσµατα σχετικά µε την αξιοποίησή τους ως βιοµάρτυρες της περιβαλλοντικής ρύπανσης. ΣΤ. ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ Οι µεταβολές στη διαπερατότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης και οι αλλαγές στο µέγεθος των λυσοσωµάτων (Lowe 1988, Moore 1988, Marigomez & Baybay- 31

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Villacorta 2003), όπως αυτές καταδεικνύονται από την ιστοχηµική µελέτη των λυσοσωµικών ενζύµων, αποτελούν δύο από τις κύριες λυσοσωµικές αποκρίσεις στο περιβαλλοντικό «stress» (Marigomez et al. 2005b). Οι ενζυµικοί µάρτυρες των λυσοσωµάτων που χρησιµοποιούνται σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης είναι η Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, η όξινη φωσφατάση και η β-γλουκουρονιδάση (UNEP/RAMOGE 1999, ICES 2004). Η ιστοχηµική ανίχνευση της N-ακετυλ-βεξοζαµινιδάσης έχει χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία για την εκτίµηση των βιοµαρτύρων «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» και «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών τόσο σε µελέτες πεδίου (Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Domouhtsidou et al. 2004, Koukouzika & Dimitriadis 2005, Koukouzika et al. 2009) όσο και σε εργαστηριακές µελέτες (Koukouzika & Dimitridis 2008). Από την άλλη µεριά, βιβλιογραφικές µελέτες υποστηρίζουν ότι και η χρήση του λυσοσωµικού ενζύµου β-γλουκουρονιδάση µπορεί να δώσει συγκρίσιµα αποτελέσµατα που αφορούν στις µορφοµετρικές και δοµικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στα πεπτικά κύτταρα του πεπτικού αδένα των µυδιών και στα ηπατοκύτταρα των ψαριών (Marigomez et al. 2006, Izagirre et al. 2009a). Η ανίχνευση της όξινης φωσφατάσης έχει χρησιµοποιηθεί για την εφαρµογή του τεστ «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» σε ηπατοκύτταρα ψαριών (Broeg et al. 1999, 2005), αλλά και σε περιορισµένες µελέτες στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών (Izagirre et al. 2009b). Σύµφωνα µε τα παραπάνω δεδοµένα, υπάρχουν αντικρουόµενες απόψεις σχετικά µε την καταλληλότητα των τριών λυσοσωµικών ενζύµων για την εκτίµηση των λυσοσωµικών αποκρίσεων των µυδιών. Η ταυτόχρονη ιστοχηµική ανίχνευση της Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάσης, της β-γλουκουρονιδάσης και της όξινης φωσφατάσης και ο τρόπος µε τον οποίο αυτά τα ένζυµα εντοπίζονται στο εσωτερικό των λυσοσωµάτων αποτελεί αντικείµενο µελέτης της παρούσας διατριβής, µε στόχο να διευκρινιστεί η χρήση των παραπάνω ενζύµων στην εφαρµογή των βιοµαρτύρων που σχετίζονται µε τα λυσοσώµατα. Στόχος της διατριβής είναι, επίσης, και η µελέτη της επίδρασης των κόκκων λιποφουσκίνης στη δραστικότητα των τριών λυσοσωµικών ενζύµων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. Τα µύδια, και ειδικότερα αυτά του γένους Mytilus, χρησιµοποιούνται ευρύτατα σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης λόγω µιας πληθώρας ιδιαίτερων χαρακτηριστικών που διαθέτουν, τα οποία αναφέρθηκαν σε προηγούµενη ενότητα. Κατά τις δειγµατοληψίες είναι δυνατό να συλλέγονται µύδια διαφορετικού µεγέθους, τα οποία διαβιούν κάτω από τις ίδιες περιβαλλοντικές 32

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνθήκες και υφίστανται τα ίδια επίπεδα «stress». Τα διαφορετικού µεγέθους µύδια στο είδος Mytilus edulis έδειξαν να έχουν διαφορετική απόκριση στα περιβαλλοντικά ερεθίσµατα (Lobel & Wright 1982). Αντίθετα, οι µορφολογικές αλλαγές των πεπτικών σωληναρίων δεν έδειξαν να σχετίζονται µε το µέγεθος των θαλάσσιων σαλιγκαριών Littorina littorea (Marigomez et al. 1993) και των µυδιών Mercenaria mercenaria (Robinson 1983). Ανάλογες µελέτες που αφορούν στις µεταβολές των παραµέτρων που σχετίζονται µε το λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων δεν έχουν αναφερθεί σε διαφορετικού µεγέθους µύδια του είδους Mytilus galloprovincialis. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να διερευνηθεί αν τα µύδια που έχουν διαφορετικό µέγεθος και διαβιούν κάτω από τις ίδιες περιβαλλοντικές συνθήκες εµφανίζουν το ίδιο πρότυπο απόκρισης των λυσοσωµικών παραµέτρων, ώστε οι πληροφορίες που θα προκύψουν να αξιοποιηθούν σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. 33

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Στην παρούσα διατριβή εφαρµόζεται µια πληθώρα κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων ρύπανσης σε ιστούς µυδιών M. galloprovincialis, που συλλέχθηκαν από δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τις περιόδους καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη Η µελέτη των εποχικών διακυµάνσεων των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων θεωρείται ότι θα δώσει χρήσιµες πληροφορίες, οι οποίες θα αξιοποιηθούν σε οικοτοξικολογικές έρευνες µε σκοπό την ορθότερη ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Η παρούσα διατριβή έχει, επίσης, σκοπό να συσχετίσει τους υπό διερεύνηση βιοµάρτυρες («µορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών» και «δοµικές αλλαγές των πεπτικών σωληναρίων») µε τους ήδη καθιερωµένους βιοµάρτυρες, ώστε να ενισχυθεί η αξιοπιστία των πρώτων ως κατάλληλα εργαλεία για τη βιοπαρακολούθηση της ρύπανσης των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων. Σκοπός της εφαρµογής των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων είναι και η ενοποίηση των αποκρίσεών τους σε έναν πολυµετρικό δείκτη οικολογικής ποιότητας όπως το δείκτη «HIS», το δείκτη «LRI» και το δείκτη «IBR», ώστε να ενισχυθεί η καταλληλότητα και η αξιοπιστία τους σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης και να προβληθούν τα πλεονεκτήµατα και τα µειονεκτήµατα του καθενός από αυτούς. Επίσης, η παρούσα διατριβή έχει σκοπό να δώσει συµπληρωµατικές πληροφορίες σχετικά µε τα µακροχρόνια αποτελέσµατα των παραγόντων «stress» στην κατάσταση υγείας των µυδιών κατά µήκος της θαλάσσιας περιοχής του Θερµαϊκού κόλπου. Στην παρούσα διατριβή γίνεται µια διερευνητική προσέγγιση για την εισαγωγή ενός δείκτη οικολογικής ποιότητας («Πειραµατικός είκτης Θαλάσσιας Ρύπανσης»), µε σκοπό την εκτίµηση της ποιότητας των ελληνικών ακτών. Στην παρούσα διατριβή, η διερεύνηση των βιοµαρτύρων «µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων» στον πεπτικό αδένα και «συχνότητα µικροπυρήνων» στα αιµοκύτταρα µυδιών που εκτέθηκαν σε οργανικούς ρύπους (PAH, λινδάνιο, 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ) γίνεται µε σκοπό την καθιέρωση αυτών των παραµέτρων ως αξιόπιστα εργαλεία σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της οργανικής ρύπανσης. Η συσχέτιση των παραπάνω βιοµαρτύρων µε άλλους καθιερωµένους βιοµάρτυρες, όπως η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» και η «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό», θα δώσει χρήσιµες πληροφορίες προς αυτή την κατεύθυνση. 34

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι και ο προσδιορισµός της συνεργατικής ή ανταγωνιστικής δράση του Cu και του Hg που αφορά στη συσσώρευση τους στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis κατά το διάστηµα της πειραµατικής έκθεσης και της περιόδου της αποτοξικοποίησης. Επιπρόσθετα, η παρούσα διατριβή αποσκοπεί να προβάλλει καινούργια δεδοµένα που σχετίζονται µε το χρόνο αποτοξικοποίησης του Hg και του Cu από τους ιστούς των µυδιών Μ. galloprovincialis. Σκοπός είναι να δοθούν και επιπρόσθετα δεδοµένα που αφορούν στις θέσεις συσσώρευσης των παραπάνω µετάλλων και να δοθούν χρήσιµες πληροφορίες σχετικά µε τις λυσοσωµικές αποκρίσεις που προκαλούνται από την έκθεση των µυδιών στο Cu, τον Hg και το µίγµα Cu και Hg. Επίσης, η παρούσα διατριβή αποσκοπεί να διερευνήσει την ευαισθησία της τεχνικής της αυτοµεταλλογραφίας και της ατοµικής απορρόφησης για τον προσδιορισµό της βιοδιαθεσιµότητας του Cu και του Hg στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis. Η ταυτόχρονη ιστοχηµική ανίχνευση των λυσοσωµικών ενζύµων Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση, β-γλουκουρονιδάση και όξινη φωσφατάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών έχει σκοπό την ταυτοποίηση του τρόπου µε τον οποίο τα ένζυµα αυτά εντοπίζονται στο εσωτερικό των λυσοσωµάτων. Με τον τρόπο αυτό θα αποσαφηνιστεί η χρήση του κατάλληλου λυσοσωµικού ενζύµου για την εφαρµογή των βιοµαρτύρων που σχετίζονται µε τα λυσοσώµατα («σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» και «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων»), ώστε να είναι συγκρίσιµα τα αποτελέσµατά τους σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Τέλος, η παρούσα διατριβή έχει σκοπό να διερευνήσει αν τα µύδια διαφορετικού µεγέθους που προέρχονται από την ίδια συνάθροιση και διαβιούν κάτω από τις ίδιες περιβαλλοντικές συνθήκες έχουν το ίδιο πρότυπο απόκρισης σε ορισµένες λυσοσωµικές παραµέτρους, ώστε οι πληροφορίες που θα προκύψουν να αξιοποιηθούν κατά τις µελέτες βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων για την ορθότερη ερµηνεία των αποτελεσµάτων. 35

47 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ

48 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Α. ειγµατοληψίες µυδιών από το πεδίο Μύδια του είδους M. galloprovincialis συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο (Εικ. 8) κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους: αρχές Ιουλίου 2004 (καλοκαίρι 2004), αρχές Οκτωβρίου 2004 (φθινόπωρο 2004) και µέσα Μαρτίου 2005 (άνοιξη 2005). Χαλάστρα Καλοχώρι Αγγελοχώρι Περαία Στρυµονικός κόλπος Ολυµπιάδα Θερµαϊκός κόλπος Εικόνα 8. Χάρτης των περιοχών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου, όπου φαίνονται οι σταθµοί από τους οποίους πραγµατοποιήθηκαν οι δειγµατοληψίες των µυδιών M. galloprovincialis (Google Earth). Figure 8. Map of Thermaikos and Strymonikos gulf showing the sampling stations of mussels M. galloprovincialis (Google Earth). Οι δειγµατοληψίες των µυδιών πραγµατοποιήθηκαν από τέσσερις σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου: 1) Αγγελοχώρι (40 ο N, 22 ο 48 8 E), 2) Περαία (40 ο N, 22 ο 55 6 E), 3) Έξοδος αγωγού βιολογικού καθαρισµού στο Καλοχώρι (40 ο 34 8 N, 22 ο E) και 4) Χαλάστρα (40 ο 33 2 N, 22 ο 45 7 E). Επίσης, µύδια συλλέχθηκαν από ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου, την Ολυµπιάδα (40 ο Ν, 23 ο Ε), ο οποίος αποτέλεσε το σταθµό αναφοράς σύµφωνα µε προηγούµενα αποτελέσµατα βιοπαρακολούθησης (Dailianis et al. 2003, Koukouzika & Dimitriadis 2001) και χηµικής παρακολούθησης (Zahariadis & Stratis 1995, Kamarianos et al. 2002). Στην περιοχή της Ολυµπιάδας είναι καλά ανεπτυγµένες 36

49 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ γεωργικές και κτηνοτροφικές δραστηριότητες, αλλά οι κύριες ανθρώπινες δραστηριότητες σχετίζονται µε την εξόρυξη και επεξεργασία µεταλλευµάτων στην περιοχή Καλύβια Αγ. Βαρβάρας. Τα µύδια προήλθαν από άγριους πληθυσµούς, µε σκοπό να εκτιµηθούν οι µακροχρόνιες επιπτώσεις του περιβαλλοντικού «stress» στην υγεία τους (Brooks et al. 2009). Τα µήκη κελύφους των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους φαίνονται στον πίνακα 2. Η θερµοκρασία του θαλασσινού νερού στους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου ήταν 16 ο C στις αρχές Ιουλίου, 17 ο C στις αρχές Οκτωβρίου και 14 ο C στο τέλος Μαρτίου. Πίνακας 2. Μήκος κελύφους (cm) των µυδιών από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005 (Μ.Ο ± τυπική απόκλιση, n=10). Table 2. Shell length (cm) of mussels collected from the sampling stations of Thermaikos and Strymonikos gulf during the sampling periods of summer 2004, autumn 2004 and spring 2005 (mean ± S.D, n=10). ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ 2004 ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ 2004 ΑΝΟΙΞΗ 2005 Ολυµπιάδα 4,82 ± 0,43 4,07 ± 0,3 4,78 ± 0,22 Αγγελοχώρι 4,83 ± 0,36 4,41 ± 0,33 4,37 ± 0,66 Περαία 4,8 ± 0,31 4,49 ± 0,34 4,29 ± 0,41 Καλοχώρι 4,48 ± 0,25 4,23 ± 0,33 4,21 ± 0,6 Χαλάστρα 4,24 ± 0,34 4,19 ± 0,45 4,51 ± 0,57 Μετά τη συλλογή τους τα µύδια µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο µέσα σε πλαστικά δοχεία µε παγοκύστεις και πραγµατοποιήθηκε εξαγωγή του πεπτικού αδένα και της αιµολέµφου, µε σκοπό τη χρήση κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων ρύπανσης. Οι βιοµάρτυρες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)», η «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)», οι «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων (LYS), των ουδέτερων λιπιδίων (NL) και των λιποφουσκινών (LPF)», το «πάχος του επιθηλίου (ΜΕΤ)», ο λόγος «ακτίνα του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου (MLR/MET)», ο λόγος «πάχος του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου (MET/MDR)», η 37

50 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ «συγκέντρωση των µεταλλοθειονινών (MT)» και η «δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)». Β. ειγµατοληψία µυδιών και επίδραση οργανικών ρύπων σε συνθήκες εργαστηρίου Μύδια του είδους M. galloprovincialis συλλέχθηκαν από τον καλλιεργούµενο πληθυσµό της Χαλάστρας τον Μάιο του 2004, µεταφέρθηκαν σε πλαστικά δοχεία µε παγοκύστεις στο εργαστήριο και παρέµειναν χωρίς τροφή σε θαλασσινό νερό για 15 ηµέρες. Η παραµονή των µυδιών στο εργαστήριο πραγµατοποιήθηκε µε σκοπό να εγκλιµατιστούν τα µύδια στις συνθήκες του εργαστηρίου και να αποβάλλουν το περιεχόµενο του εντέρου τους πριν την επίδραση των οργανικών ρύπων. Μετά τον εγκλιµατισµό, τα µύδια χωρίστηκαν σε 5 οµάδες των 30 ατόµων, τοποθετήθηκαν σε πλαστικά ενυδρεία τα οποία περιείχαν 7lt θαλασσινό νερό (αλατότητα 33, θ=17 0 C) και πραγµατοποιήθηκε έκθεση των ζώων σε οργανικούς ρύπους για 15 ηµέρες. Στην 1 η οµάδα έγινε επίδραση µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων (0.3 mg/lt PAH: ανθρακένιο, φαινανθρένιο και ναφθαλένιο σε αναλογία 1:1:1, διαλυµένα σε ακετόνη). Στην 2 η οµάδα έγινε επίδραση 0.3 mg/lt 2,4 δίχλωροφαινοξυοξικό οξύ διαλυµένο σε νερό, ενώ στην 3 η οµάδα έγινε επίδραση 0.3 mg/lt λινδανίου διαλυµένο σε νερό. Την 4 η οµάδα αποτέλεσαν τα µύδια ελέγχου, στα οποία δεν έγινε έκθεση κάποιου ρύπου, ενώ την 5 η οµάδα αποτέλεσαν τα ζώα τα οποία εκτέθηκαν σε ακετόνη (0,1 mg/lt). Η χορήγηση τροφής και οργανικών ρύπων, καθώς επίσης και η αλλαγή του θαλασσινού νερού πραγµατοποιούνταν κάθε 2 ηµέρες. Το µήκος του κελύφους των µυδιών ήταν 6,6 ± 0,4 cm (Μ.Ο.± τυπική απόκλιση, n=10). Μετά το τέλος της πειραµατικής έκθεσης, έγινε εξαγωγή του πεπτικού αδένα και της αιµολέµφου των µυδιών, µε σκοπό να εκτιµηθούν κυτταρικοί βιοµάρτυρες, όπως η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)», η «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)», οι «µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων (VvNL, NvNL)», οι «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων (VvLYS, NvLYS)» και το τεστ «συχνότητα µικροπυρήνων (MN) και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών». 38

51 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Γ. ειγµατοληψία µυδιών και επίδραση βαρέων µετάλλων σε συνθήκες εργαστηρίου Μύδια του είδους M. galloprovincialis συλλέχθηκαν από τον καλλιεργούµενο πληθυσµό της Χαλάστρας τον Νοέµβριο του Στη συνέχεια µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο, όπου και παρέµειναν χωρίς τροφή σε θαλασσινό νερό για 7 ηµέρες, µε σκοπό να εγκλιµατιστούν στις συνθήκες του εργαστηρίου και να αποβάλλουν το περιεχόµενο του εντέρου τους. Μετά τον εγκλιµατισµό, τα µύδια χωρίστηκαν σε 4 οµάδες, τοποθετήθηκαν σε πλαστικά ενυδρεία (35 άτοµα/ενυδρείο) που περιείχαν 7lt θαλασσινό νερό (αλατότητα 33, θ=17 0 C) και πραγµατοποιήθηκε έκθεση των ζώων σε βαρέα µέταλλα για 11 ηµέρες και αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Στη 1 η οµάδα έγινε επίδραση 0.08 mg/lt Hg (HgCl 2 ). Στην 2 η οµάδα έγινε επίδραση 0.08 mg/lt Cu (CuSO 4 * 5 H 2 O), ενώ στην 3 η οµάδα έγινε επίδραση 0.16 mg/lt µίγµατος Hg και Cu σε αναλογία 1:1. Την 4 η οµάδα αποτέλεσαν τα µύδια ελέγχου, στα οποία δεν έγινε επίδραση βαρέων µετάλλων. Η χορήγηση της τροφής και των διαλυµάτων των βαρέων µετάλλων, καθώς επίσης και η αλλαγή του θαλασσινού νερού πραγµατοποιούνταν καθηµερινά. Κατά τη διάρκεια της πειραµατικής έκθεσης, έγινε εξαγωγή του πεπτικού αδένα και των βραγχίων των µυδιών την 5 η, την 8 η και την 11 η ηµέρα έκθεσης, ενώ κατά την περίοδο της αποτοξικοποίησης έγινε εξαγωγή των παραπάνω ιστών κατά την 4 η και 7 η ηµέρα. Το µήκος κελύφους των µυδιών ήταν 5,8 ± 0,25 cm (Μ.Ο.± τυπική απόκλιση, n=10). Οι ιστοί των µυδιών χρησιµοποιήθηκαν στη συνέχεια για τον προσδιορισµό παραµέτρων, όπως ο «χηµικός προσδιορισµός του Hg και του Cu στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια», ο «αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός των βαρέων µετάλλων» στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια, η «πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων (VvBSD)» στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια και οι «µορφοµετρικές (VvLYS, NvLYS) και µορφολογικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα.. ειγµατοληψία µυδιών και µελέτη των λυσοσωµικών παραµέτρων Μύδια του είδους M. galloprovincialis µε µήκος κελύφους 5,5 ± 0,3 cm (Μ.Ο.± τυπική απόκλιση, n=10). συλλέχθηκαν από άγριο πληθυσµό της Χαλάστρας τον Ιούνιο και το εκέµβριο του Επίσης, µύδια µικρού και µεγάλου µεγέθους 39

52 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ του είδους M. galloprovincialis µε µήκος κελύφους 2,38 ± 0,15 cm και 6,58 ± 0,27 cm (Μ.Ο.± τυπική απόκλιση, n=10), αντίστοιχα, συλλέχθηκαν από φυσικό πληθυσµό της Χαλάστρας τον Ιούνιο του Τα µύδια µεταφέρθηκαν σε πλαστικά δοχεία µε παγοκύστεις στο εργαστήριο και έγινε εξαγωγή του πεπτικού αδένα, µε σκοπό την εφαρµογή ιστοχηµικών µεθόδων για τον εντοπισµό τριών λυσοσωµικών ενζύµων: της Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάσης, της όξινης φωσφατάσης και της β-γλουκουρονιδάσης. Οι ιστοί των µυδιών που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα τον Ιούνιο του 2010 χρησιµοποιήθηκαν, επίσης, για την εφαρµογή λυσοσωµικών παραµέτρων, όπως είναι η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)», οι «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων (VvLYS, NvLYS)», ο δείκτης «Lysosomal Response Index (LRI)», «το πάχος του επιθηλίου (ΜΕΤ)» ο λόγος «ακτίνα του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου (MLR/MET)», ο λόγος «πάχος του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου (MET/MDR)». Ε. Μέθοδοι προσδιορισµού Βιοµάρτυρες που χρησιµοποιήθηκαν 1. Τεχνική «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» Η µέθοδος αυτή εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα πέντε µυδιών, στις οποίες έγινε ιστοχηµεία για την ανίχνευση του λυσοσωµικού ενζύµου N-ακετυλβ-εξοζαµινιδάση µε µια διαδικασία που προτάθηκε από τους Moore (1976) και UNEP (1997). Προετοιµασία ιστών 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα από πέντε ζώα. 2. Τεµαχισµός των ιστών σε κοµµάτια 5mm 3 και τοποθέτησή τους σε ειδικές βάσεις αλουµινίου. 3. Μονιµοποίηση των ιστών σε υγρό n-hexane για 40 sec, το οποίο είχε ψυχθεί προηγουµένως σε υγρό άζωτο. 4. Αποθήκευση των ιστών στους C έως την εφαρµογή της ιστοχηµείας. 40

53 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Ιστοχηµική µέθοδος 1. Κρυοτοµές πεπτικού αδένα πάχους 9 µm κόπηκαν σε κρυοστάτη Reichert- Jung Cryocut 1800 (Leica) σε θερµοκρασία C και µεταφέρθηκαν σε αντικειµενοφόρους πλάκες. 2. Βύθιση των τοµών για τα χρονικά διαστήµατα 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 40 min σε διάλυµα κατεργασίας, το οποίο αποτελείται από ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού οξέος 0.1 Μ (pη =4.5) που περιέχει 2.5% ΝaCl (w:v). 3. Μεταφορά των αντικειµενοφόρων πλακών σε µέσο επώασης, το οποίο περιείχε 20 mg υποστρώµατος naphtol AS-BI-N-acetyl-β-D glucosaminide (Sigma) διαλυµένο σε 2.5 ml 2-methoxyethanol και συµπληρωνόταν ως τα 50 ml µε 0,1 mμ ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού οξέος που περιείχε 2.5% ΝaCl και 3.5 gr ενός πολυπεπτιδίου χαµηλής πυκνότητας (Sigma POLYPEP, P5115) για τη σταθεροποίηση των τοµών. 4. Επώαση για 20 min στους 37 0 C σε υδατόλουτρο µε συνεχή ανάδευση και ξέπλυµα των τοµών µε 3% NaCl στους 37 0 C για 2 min. 5. Χρώση των τοµών µε 1 mg/ml Fast Violet B (Sigma) σε 0.1 Μ ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (ρη=7.4) σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 min. 6. Ξέπλυµα των τοµών µε νερό βρύσης για 5 min και στερέωση σε calcium formal (30% paraformaldeyde, 2% calcium acetate) για 10 min στους 4 0 C. 7. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O, τοποθέτηση entellan και καλυπτρίδας. Οι τοµές, οι οποίες δεν επωάστηκαν στο διάλυµα κατεργασίας, χρησιµοποιήθηκαν για τη µορφοµετρική ανάλυση των λυσοσωµάτων και τις µορφολογικές αλλαγές των πεπτικών σωληναρίων µε τη βοήθεια του συστήµατος ανάλυσης εικόνας, αλλά και για την παρατήρηση τους σε µικροσκόπιο φθορισµού Olympus CKX41. Προσδιορισµός του χρόνου της τεχνικής «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» Ο χρόνος (σε min) αποσταθεροποίησης της λυσοσωµικής µεµβράνης, που αντιπροσωπεύει την τιµή του βιοµάρτυρα «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» για µια περιοχή δειγµατοληψίας, αντιστοιχεί στο µέσο όρο των τιµών από τα πέντε ζώα που χρησιµοποιήθηκαν. Η τοµή του πεπτικού αδένα από κάθε ζώο χωρίζεται σε τέσσερα τεταρτηµόρια και υπολογίζεται ο χρόνος της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης» σε καθένα από αυτά, µετά από την παρατήρηση τους 41

54 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ στο οπτικό µικροσκόπιο. Η µέση τιµή των χρόνων των 4 τεταρτηµορίων ενός ζώου αντιστοιχούσε στην τιµή της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης» για το συγκεκριµένο ζώο. Η τιµή αυτή αντιστοιχούσε σε εκείνο το χρόνο κατεργασίας στο διάλυµα αποσταθεροποίησης, στον οποίο παρατηρούνταν η µέγιστη ένταση της χρώσης (Εικ. 9). Στο χρόνο στον οποίο παρατηρήθηκε η µέγιστη ένταση της χρώσης, οι λυσοσωµικές µεµβράνες είχαν αποσταθεροποιηθεί µε αποτέλεσµα να επιτρέπεται η είσοδος του υποστρώµατος στο εσωτερικό των λυσοσωµάτων και να αντιδρά πλήρως µε το υδρολυτικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση (Εικ. 10). 9 min 12 min 15 min α β γ L L L Εικόνα 9. Τεχνική της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης» σε διαδοχικές κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. gallooprovincialis, µετά από ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση. (α) Κατεργασία των τοµών για 9 min σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού οξέος, όπου παρατηρείται αχνή χρώση των λυσοσωµάτων. (β) Κατεργασία των τοµών για 12 min σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού οξέος, όπου παρατηρείται εντονότερη χρώση των λυσοσωµάτων, σε σχέση µε αυτή των 9 min. (γ) Κατεργασία των τοµών για 15 min σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού οξέος, όπου παρατηρείται πιο αχνή χρώση των λυσοσωµάτων, σε σχέση µε αυτή των 12 min. Ο χρόνος των 12 min, στον οποίο παρατηρείται η µέγιστη ένταση της χρώσης αντιστοιχεί στο χρόνο της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης» για το συγκεκριµένο τεταρτηµόριο της τοµής. 1700x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 9. Technique of «lysosomal membrane stability» on serial digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis, after the N-acetyl-β-hexozaminidase histochemistry. (α) Cryosections after 9 min pretreatment in citrate buffer showing limited reactive lysosomes. (β) Cryosections after 12 min pretreatment in citrate buffer showing greater reactive lysosomes, in relation to those of 9 min. (γ) Cryosections after 15 min pretreatment in citrate buffer showing limited reactive lysosomes, in relation to those of 12 min. The maximum staining intensity at 12 min corresponds to the «lysosomal membrane stability» value in this tissue segment of the animal. 1700x, L: digestive tubule lumen 42

55 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Λυσόσωµα «υγιούς» κυττάρου Λυσόσωµα σε συνθήκες «stress» ένζυµο υπόστρωµα Λυσοσωµική µεµβράνη Εικόνα 10. Στα λυσοσώµατα των «υγιών» κυττάρων οι λυσοσωµικές µεµβράνες είναι µη-διαπερατές σε διάφορα υποστρώµατα και τα λυσοσωµικά ένζυµα είναι ανενεργά. Σε καταστάσεις «stress» οι λυσοσωµικές µεµβράνες αποσταθεροποιούνται µε αποτέλεσµα να αυξάνεται η διαπερατότητά τους στα υποστρώµατα. Επίσης, παρατηρείται ενεργοποίηση των λυσοσωµικών υδρολυτικών ενζύµων, διαταραχή της φυσιολογικής λυσοσωµικής λειτουργίας και απελευθέρωση των υδρολασών στο κυτταρόπλασµα. Figure 10. In the lysosomes of unstressed cells the lysosomal membranes are largely impermeable to many substrates and the lysosomal enzymes are inactive. In stress conditions the lysosomal membranes are destabilized resulting in increased permeability to substrates. Additionally, it is evidenced an activation of lysosomal hydrolases, disruption of normal lysosomal function and release of hydrolases into the cytoplasm. 2. Τεχνική «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» Η µέθοδος αυτή εφαρµόστηκε σε αποµονωµένα αιµοκύτταρα µυδιών µε σκοπό τον προσδιορισµό του χρόνου κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό στο εσωτερικό των λυσοσωµάτων, ακολουθώντας τη διαδικασία που προτάθηκε από τους Lowe & Pipe (1994) µε ορισµένες διαφοροποιήσεις. Προετοιµασία ιστών 1. Εξαγωγή της αιµολέµφου από 10 ζώα µε αποστειρωµένη σύριγγα από τον οπίσθιο προσαγωγό µυ (Εικ. 11). 43

56 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2. Τοποθέτηση της αιµολέµφου στον πάγο µέσα σε σωλήνα eppendorf που περιέχει ίση ποσότητα φυσιολογικού διαλύµατος (4.77g/l HEPES, g/l NaCl, g/l MgSO 4, 0.75 g/l KCl, 1.47 g/l CaCl 2, pη=7.3). Προσαγωγός µυς Εικόνα 11. Φωτογραφία µυδιού όπου φαίνεται η θέση του οπίσθιου προσαγωγού µυ, από τον οποίο γίνεται λήψη της αιµολέµφου. Figure 11. Photograph of mussel showing the position of the muscle adductor for the haemolymph collection. Εφαρµογή της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (neutral red)» 1. Τοποθέτηση 40 µl της αιµολέµφου πάνω σε αντικειµενοφόρους πλάκες για 15 min, µέσα σε µαύρο κουτί όπου υπάρχουν συνθήκες υγρασίας και χαµηλής θερµοκρασίας, µε σκοπό να κολλήσουν τα κύτταρα πάνω στην πλάκα. 2. Τίναγµα της σταγόνας από την πλάκα εώς ότου αποµακρυνθεί όλο το φυσιολογικό διάλυµα. 3. ιάλυση 10 µl διαλύµατος stock (28.8 g neutral red σε 100ml DMSO) σε 5 ml φυσιολογικού διαλύµατος. 4. Προσθήκη 40 µl της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (neutral red) πάνω στα αιµοκύτταρα και κάλυψή τους µε καλυπτρίδα. 5. Συστηµατική παρατήρηση των αιµοκυττάρων κάθε 15 min στο οπτικό µικροσκόπιο. Προσδιορισµός του χρόνου της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» Ο χρόνος (σε min) της αποσταθεροποίησης της λυσοσωµικής µεµβράνης των αιµοκυττάρων για κάθε ζώο προσδιορίζεται µετά από παρατήρηση των αιµοκυττάρων στο οπτικό µικροσκόπιο. Ο χρόνος στον οποίο το 50% των αιµοκυττάρων έχουν απελευθερώσει το περιεχόµενο των λυσοσωµάτων τους στο κυτταρόπλασµα ή παρατηρούνται άλλες λυσοσωµικές ανωµαλίες (Εικ. 12), αντιστοιχεί στο χρόνο 44

57 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ κατακράτησης της χρωστικής για κάθε ζώο. Η µέση τιµή των χρόνων από τα 10 ζώα αντιστοιχεί στο χρόνο της αποσταθεροποίησης της λυσοσωµικής µεµβράνης για κάθε δειγµατοληπτική περιοχή. α β γ δ Εικόνα 12. Φωτογραφίες αιµοκυττάρων από οπτικό µικροσκόπιο στις οποίες φαίνονται τα διάφορα στάδια των αιµοκυττάρων των µυδιών κατά την εφαρµογή της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)». α) 1 ο στάδιο: η χρωστική έχει εισέλθει και κατακρατείται στα λυσοσώµατα, τα οποία είναι µικρά σε µέγεθος. β) 2 ο στάδιο: η χρωστική κατακρατείται στα λυσοσώµατα, τα οποία αρχίζουν να διογκώνονται. γ) 3 ο στάδιο: τα λυσοσώµατα είναι περισσότερο διογκωµένα και παρατηρείται απελευθέρωση µικρής ποσότητας της χρωστικής στο κυτταρόπλασµα. δ) 4 ο στάδιο: τα λυσοσώµατα έχουν αποσταθεροποιηθεί και η χρωστική έχει διαχυθεί στο κυτταρόπλασµα. Figure 12. Light micrographs exhibiting the various stages of mussels haemocytes during the NRR. α) 1 st stage: the NR is retained in the small haemocyte lysosomes. β) 2 nd stage: the NR is still retained into the lysosomes, however signs of lysosomal enlargement are evidenced. γ) 3 rd stage: the lysosomes are more enlarged and the NR is leaking to the cytoplasm. δ) 4 th stage: haemocytes showing total leaking of the NR into the cytoplasm. 3. Μορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων (ΝL) Οι µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων όπως η πυκνότητα όγκου (volume density, VvNL) και η αριθµητική πυκνότητα numerical density, NvNL) προσδιορίστηκαν σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µετά από ιστοχηµεία για τα ουδέτερα λιπίδια (Εικ. 13), η οποία βασίστηκε στη διαδικασία που προτάθηκε από τον Moore (1988). Προετοιµασία ιστών 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα από 5 ζώα. 2. Τεµαχισµός των ιστών σε κοµµάτια 5mm 3 και τοποθέτησή τους σε ειδικές βάσεις αλουµινίου. 45

58 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 3. Μονιµοποίηση των ιστών σε υγρό n-hexane για 40 sec, το οποίο είχε ψυχθεί προηγουµένως σε υγρό άζωτο. 4. Αποθήκευση των ιστών στους C έως την εφαρµογή της ιστοχηµείας. Εικόνα 13. Πεπτικό σωληνάριο µυδιού µετά από ιστοχηµεία για τα ουδέτερα λιπίδια. Figure 13. Digestive tubule of mussel after neutral lipids histochemistry. Ιστοχηµεία 1. Κρυοτοµές πεπτικού αδένα πάχους 9 µm κόπηκαν σε κρυοστάτη Reichert- Jung Cryocut 1800 (Leica) σε θερµοκρασία C και µεταφέρθηκαν σε αντικειµενοφόρους πλάκες. 2. Μονιµοποίηση των τοµών µε calcium formal (30% paraformaldeyde, 2% calcium acetate) για 10 min στους 4 0 C. 3. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 4. Προσθήκη 60% triethylphosphate για 5 min. 5. Χρώση µε oil red 1% (1g oil red σε 100 ml triethylphosphate 60%). 6. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 7. Έγκλειση των τοµών µε το υδατικό µέσο glycergel και κάλυψή τους µε καλυπτρίδα. 8. Υπολογισµός της πυκνότητας όγκου (volume density) και της αριθµητικής πυκνότητας (numerical density) των ουδέτερων λιπιδίων µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας. 4. Μορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών (LΡF) Οι µορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών, όπως η πυκνότητα όγκου (volume density, VvLPF) και η αριθµητική πυκνότητα (numerical density, NvLPF), προσδιορίστηκαν σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα µετά από ιστοχηµεία των λιποφουσκινών (Εικ. 14), η οποία βασίστηκε στη διαδικασία που προτάθηκε από τον Moore (1988). 46

59 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Προετοιµασία ιστών 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα από 5 ζώα. 2. Τεµαχισµός των ιστών σε κοµµάτια 5mm 3 και τοποθέτησή τους σε ειδικές βάσεις αλουµινίου. Εικόνα14. Πεπτικό σωληνάριο µυδιού µετά από ιστοχηµεία για λιποφουσκίνη Figure 14. Digestive tubule of mussel after lipofuscin histochemistry 3. Μονιµοποίηση των ιστών σε υγρό n-hexane για 40 sec, το οποίο είχε ψυχθεί προηγουµένως σε υγρό άζωτο. 4. Αποθήκευση των ιστών στους C έως την εφαρµογή της ιστοχηµείας. Ιστοχηµεία 1. Κρυοτοµές πεπτικού αδένα πάχους 9 µm κόπηκαν σε κρυοστάτη Reichert- Jung Cryocut 1800 (Leica) σε θερµοκρασία C και µεταφέρθηκαν σε αντικειµενοφόρους πλάκες. 2. Μονιµοποίηση των τοµών µε calcium formal (30% paraformaldeyde, 2% calcium acetate) για 10 min στους 4 0 C. 3. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 4. Προσθήκη 1% ferric chloride και 1% potassium ferricyanide (3,5:0,5) για 5 min. 5. Ξέπλυµα µε οξικό οξύ 1% για 1min και έπειτα ξέπλυµα µε ddh 2 O. 6. Έγκλειση των τοµών µε το υδατικό µέσο glycergel και κάλυψή τους µε καλυπτρίδα. 6. Υπολογισµός της πυκνότητας όγκου (volume density) και της αριθµητικής πυκνότητας (numerical density) των λιποφουσκινών σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας. 47

60 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 5. Προσδιορισµός του πάχους του επιθηλίου (ΜET) στα πεπτικά σωληνάρια Ο προσδιορισµός του πάχους του επιθηλίου πραγµατοποιήθηκε σε κρυοτοµές πεπτικών σωληναρίων των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από το πεδίο κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους: καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη Η µέθοδος που ακολουθήθηκε είναι αυτή που προτάθηκε από τους Marigomez et al. (1990) µε ορισµένες παραλλαγές. Τα βήµατα που ακολουθήθηκαν για τον υπολογισµό του πάχους του επιθηλίου ήταν τα εξής: 1. Λήψη 10 φωτογραφιών των πεπτικών σωληναρίων από καθένα από τα 5 ζώα (συνολικά 50 φωτογραφίες για κάθε δειγµατοληπτική περιοχή) από κρυοτοµές πεπτικού αδένα, στις οποίες έγινε ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλβ-εξοζαµινιδάση. 2. Μέτρηση του περιγράµµατος του πεπτικού σωληναρίου και του αγωγού του µε τη χρήση του προγράµµατος ανάλυσης εικόνας. 3. Απεικόνιση του πεπτικού σωληναρίου και του κεντρικού αγωγού µε τη µορφή δύο τέλειων οµόκεντρων κύκλων µε βάση την περίµετρό τους (Εικ. 15). (α) (β) (γ) Ρ ο Ρ 1 S 1 So Ρ 1 S 1 S ο h S o S 1 Ρ o h = 2*(S o S 1 )/(P o + Εικόνα 15. Προσδιορισµός του πάχους του επιθηλίου στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis.(α) Σχηµατική απεικόνιση του πεπτικού σωληναρίου όπως παρατηρείται στο οπτικό µικροσκόπιο. (β) Απεικόνιση του πεπτικού σωληναρίου και του κεντρικού αγωγού µε τη µορφή δύο οµόκεντρων κύκλων, όπου οι επιφάνειες So και S 1 αντιστοιχούν στις επιφάνειες So και S 1 του σχήµατος α. (γ) Υποθετικό τραπέζιο ίδιου εµβαδού µε το εµβαδό της εξωτερικής επιφάνειας στο σχήµα β. Το ύψος (h) του τραπεζίου λαµβάνεται ως το πάχος του πεπτικού σωληναρίου για αυτή την τοµή. h: το πάχος του επιθηλίου, S o : η επιφάνεια που καλύπτει ο εξωτερικος κύκλος S 1 : η επιφάνεια που καλύπτει ο εσωτερικός κύκλος, Ρ ο : η περίµετρος του εξωτερικού κύκλου και Ρ 1 : η περίµετρος του εσωτερικού κύκλου (από Marigomez et al. 1990). Figure 15. Evaluation of the mean epithelial thickness in mussels M. galloprovincialis. (α) Schematical presentation of a tubule section observed under the light microscope. (β) Regular figure with the form of concentric circles obtained from the shape α, where the surfaces So and S 1 correspond to those of the shape α. (γ) Hyphothetical trapezium characterized by the same area with the area of the outer circumference in the shape β. The height of this trapezium (h) is considered to be the thickness of the digestive tubule for this section. h: epithelial thickness, S o : area covered by the outer circle S 1 : area covered by the inner circle Ρ ο : perimeter of the outer circle Ρ 1 : perimeter of the inner circle (from Marigomez et al. 1990). 48

61 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 4. Υπολογισµός της ακτίνας και της επιφάνειας των δύο κύκλων. 5. Γεωµετρική µεταφορά της επιφάνειας του εξωτερικού κύκλου σε ένα υποθετικό τραπέζιο ίδιου εµβαδού µε αυτό του εξωτερικού κύκλου. 6.Υπολογισµός του ύψους του τραπεζίου, το οποίο αντιστοιχεί στο πάχος του επιθηλίου (ΜΕΤ) των πεπτικών σωληναρίων σύµφωνα µε τον τύπο: h (ΜΕΤ) = 2*(S o S 1 )/(P o + P 1 ) όπου h: το πάχος του επιθηλίου, S o : η επιφάνεια του εξωτερικού κύκλου S 1 : η επιφάνεια του εσωτερικού κύκλου Ρ ο : η περίµετρος του εξωτερικού κύκλου και Ρ 1 : η περίµετρος του εσωτερικού κύκλου. 7. Υπολογισµός των λόγων «ακτίνα του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου (MLR/MET)» και «πάχος του επιθηλίου προς ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου (MET/MDR)». 6. Συχνότητα µικροπυρήνων (MN) και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών σε αιµοκύτταρα µυδιών Η µέθοδος εκτίµησης των µικροπυρήνων εφαρµόστηκε σε αιµοκύτταρα µυδιών M. galloprovincialis σύµφωνα µε το πρωτόκολλο της UNEP/RAMOGE (1999). Προετοιµασία των αιµοκυττάρων 1. Εξαγωγή αιµολέµφου από 10 µύδια µε αποστειρωµένη σύριγγα και τοποθέτησή της σε σωλήνες eppendorf που περιέχουν ίση ποσότητα φυσιολογικού διαλύµατος (0,47g HEPES - 2,54g NaCl 1,3g MgSO 4 0,075 g KCl 0,147g CaCl 2 σε 100 ml ddh 2 Ο, ρύθµιση ph = 7,3 µε NaOH 1Μ). 2. Τοποθέτηση 40µl αιµολέµφου από κάθε ζώο στο κέντρο των αντικειµενοφόρων πλακών. 3. Αναµονή 15 min για να καθιζάνουν τα κύτταρα και έπειτα τίναγµα της σταγόνας για να αποµακρυνθεί η περίσσεια της αιµολέµφου. 4. Προσθήκη διαλύµατος µεθανόλης-οξικού οξέος σε αναλογία 3:1 αντίστοιχα για 5 min. 49

62 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 5. Ξέπλυµα µε ddh 2 O και στέγνωµα της αντικειµενοφόρου σε θερµοκρασία δωµατίου. 6. Προσθήκη Geimsa (3%) για 3 min και ξέπλυµα µε ddh 2 O. 7. Τοποθέτηση µέσου έγκλεισης (Eukitt R ) και καλυπτρίδας. Προσδιορισµός της «συχνότητας µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» στα αιµοκύτταρα Κάθε µια από τις 10 αντικειµενοφόρους πλάκες εξετάστηκαν στο οπτικό µικροσκόπιο µε φακό 100x και µετρήθηκαν 1000 µη κοκκώδη αιµοκύτταρα. Τα κριτήρια µε βάση τα οποία έγινε η ταυτοποίηση των µικροπυρήνων (Εικ. 16α) ήταν τα εξής: οι µικροπυρήνες α) έχουν σφαιρικό σχήµα β) έχουν µέγεθος το 1/3 ή 1/5 του πυρήνα γ) έχουν ίδιο χρώµα και ίδια εστίαση µε τον πυρήνα και δ) δεν είναι συνδεδεµένοι µε τον πυρήνα. Εκτός όµως από τον προσδιορισµό των µικροπυρήνων, εντοπίστηκαν και άλλες πυρηνικές ανωµαλίες, όπως κύτταρα µε δύο πυρήνες (Binucleated cells Εικ. 16β), κύτταρα µε δύο µικροπυρήνες (Two micronuclei cells Εικ. 16γ) και κύτταρα µε µικροπυρήνα ενωµένο µε τον πυρήνα (Eight shaped cells Εικ. 16δ). α β γ δ Εικόνα 16. Φωτογραφίες από το οπτικό µικροσκόπιο στις οποίες φαίνονται µη κοκκώδη αιµοκύτταρα µυδιών M. galloprovincialis µε µικροπυρήνες και άλλες πυρηνικές ανωµαλίες. α) Αιµοκύτταρο µε µικροπυρήνα (βέλος). β) Αιµοκύτταρο µε δύο πυρήνες (βέλος). γ) Αιµοκύτταρο µε δύο µικροπυρήνες (βέλος). δ) Αιµοκύτταρο µε µικροπυρήνα ενωµένο µε τον πυρήνα (βέλος). Figure 16. Agranular haemocytes of mussels M. galloprovincialis showing micronuclei and other nuclear abnormalities. α) Haemocyte with micronuclei (arrow). β) Binucleated haemocyte. γ) Haemocyte bearing two micronuclei (arrow). δ) Haemocyte showing a micronuclei connected to the main nucleus (arrow), referred as eihgt-shaped cell. 50

63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 7. Μέθοδος προσδιορισµού της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών (ΜΤ) Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών (ΜΤ) στον πεπτικό αδένα των µυδιών χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος ποσοτικής ανάκτησης των ΜΤ µε τη χρήση RNA (Viarengo et al. 1996, UNEP/RAMOGE, 1999). Προετοιµασία των δειγµάτων 1. Συλλογή 1g πεπτικού αδένα από 10 τουλάχιστον ζώα. 2. Οµογενοποίηση του ιστού µε τη χρήση οµογενοποιητή (γυάλινου ή από τεφλόν) σε 3 όγκους διαλύµατος 0.5 Μ Sucrose-20mM TRIS, ph=8.6 (διάλυµα οµογενοποίησης), που περιέχει επιπρόσθετα 0.01% β- µερκαπτοαιθανόλη και PMSF (1.5µl/ml και λουπεπτίνη 3µl/ml). 3. Φυγοκέντρηση του οµογενοποιήµατος στις 3000 στροφές για 20 λεπτά στους 4 o C. 4. Συλλογή του υπερκείµενου των δειγµάτων, το οποίο µπορεί να διατηρηθεί στους -85 o C, µέχρι τον προσδιορισµό των ΜΤ. Αιθανολική κατακρήµνιση 1. Προσθήκη 1.05 ml ψυχρής αιθανόλης (-20 0 C) και 80 µl χλωροφορµίου σε 1 ml από το υπερκείµενο. 2. Ανάδευση για µερικά δευτερόλεπτα και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στις 6000 στροφές για 10 λεπτά, στους 4 o C. Στη συνέχεια το υπερκείµενο συλλέγεται και υπολογίζεται ο όγκος του. 3. Πρσθήκη 40 µl HCl 37% και 10 µl RNA (1mg/10µl) και τριπλάσιος όγκος ψυχρής αιθανόλης. Μετά από παραµονή 1 ώρας στους C ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 6000 στροφές για 10 λεπτά. 4. Το υπερκείµενο αποµακρύνεται και το ίζηµα πλένεται µε διάλυµα οµογενοποίησης που περιέχει 87% αιθανόλη, 1% χλωροφόρµιο και 12% buffer οµογενοποίησης, χωρίς την προσθήκη β-µερκαπτοαιθανόλης, PMSF και λουπεπτίνης. 5. Φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 6000 στροφές και συλλογή του ιζήµατος. Το ίζηµα που παραµένει υφίσταται ξήρανση µε αέριο άζωτο για περίπου 10 λεπτά. 51

64 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Επαναιώρηση του εµπλουτισµένου µε ΜΤ κλάσµατος Στα αποξηραµένα δείγµατα προστίθεται 150 µl NaCl 0.25M και 150 µl HCl 1Ν-EDTA 4mM (διάλυµα αποσταθεροποίησης). Ακολουθεί επαναιώρηση των δειγµάτων µε τη χρησιµοποίηση γυάλινης ράβδου. Ανάλυση DTNB (Αντίδραση Ellman) Πρότυπη καµπύλη γλουταθειόνης 1. Ετοιµασία φρέσκου διαλύµατος γλουταθειόνης (GSH) συγκέντρωσης 1 mgr/ml σε 0.25 M NaCl το οποίο φυλάσσεται στον πάγο. 2. Πριν την ανάλυση ετοιµάζεται φρέσκο διάλυµα DTNB 0.43 mm (7.14 mg/42 ml 0.2 M φωσφορικού διαλύµατος, pη=8, που περιέχει 2 Μ NaCl. (Το διάλυµα 0.2 Μ phosphate buffer ετοιµάζεται από stock διάλυµα 200 ml Na 2 HPO M, 200 ml NaH 2 PO M, 1 lt NaCl 2M. Τα φωσφορικά άλατα αραιώνονται στο διάλυµα NaCl 2M). 3. Φυγοκέντρηση στις 3000 στροφές για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Τα δείγµατα για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης ετοιµάζονται σύµφωνα µε τον πίνακα Μέτρηση της απορρόφησης (ABS 412 ) σε µήκος κύµατος 412 nm. 5. Επώαση για 30 λεπτά στο σκοτάδι και τα δείγµατα φωτοµετρούνται ξανά. Με αυτό τον τρόπο ελαχιστοποιούνται πιθανά σφάλµατα στις µετρήσεις που οφείλονται στην έλλειψη ικανού χρόνου για την ανάπτυξη του φθορισµού. Πίνακας 3. Πίνακας για την κατασκευή πρότυπης καµπύλης γλουταθειόνης και προετοιµασία µέτρησης των άγνωστων δειγµάτων. Table 3. Table for the calibration curve of glutathione and unknown samples preparation GSH 0.25 M NaCl 1 N HCl ιάλυµα V τελ 4 mm EDTA DTNB είγµατα µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml Τυφλό µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 7.2 nmol/ml 10 µl 140 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 14.4 nmol/ml 20 µl 130 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 28.8 nmol/ml 40 µl 110 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 57.6 nmol/ml 80 µl 70 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 52

65 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Υπολογισµός και ερµηνεία των αποτελεσµάτων Καταγραφή της πρότυπης καµπύλης Εκφράζουµε την πρότυπη καµπύλη της γλουταθειόνης (Πιν. 3) σε nmol/ml. Σχεδιάζουµε την καλύτερη ευθεία που περνάει από τα σηµεία της πρότυπης καµπύλης της γλουταθειόνης. ABS GSH 412=ε[-SH] όπου: ABS GSH 412 (OD 412 ): οπτική πυκνότητα των δειγµάτων της γλουταθειόνης σε µήκος κύµατος 412 nm, ε (OD 412 /nmol/ml): σταθερά που αντιπροσωπεύει τον εξαλειφθέντα συντελεστή για τη γλουταθειόνη και [-SH] (nmol/ml): αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση των σουλφυδρυλοµάδων στα δείγµατα της γλουταθειόνης. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό των ΜΤ οι τιµές της απορρόφησης των δειγµάτων παρεµβάλλονται στην πρότυπη καµπύλη και στη συνέχεια υπολογίζεται η συγκέντρωση των σουλφυδρυλοµάδων που περιέχονται στα δείγµατα, όπως παρουσιάζονται από τον άξονα Χ του διαγράµµατος. Λαµβάνοντας υπόψη µας τα µοριακά χαρακτηριστικά των ΜΤ των µυδιών (Berger 1995), όπου το υπόλειµµα κυστεϊνης είναι 21, το µοριακό βάρος 8600 Da, ο τελικός όγκος της αντίδρασης DTNB (4.5 ml), η συγκέντρωση των ΜΤ στο µύδι (ng/g κ.β. ιστού) µπορεί να υπολογιστεί από τον παρακάτω τύπο: [χ/18] ,5 4 όπου, χ (nmol/ml): αντιπροσωπεύει τις τιµές του άξονα Χ που προέρχονται από την παρεµβολή των τιµών απορρόφησης στην πρότυπη καµπύλη. 8. Προσδιορισµός της ενζυµικής δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE) Οι Ellman et al. (1961) ανέπτυξαν µια µέθοδο µε την οποία µπορεί να µετρηθεί η δραστικότητα της AChE µε τη χρήση µικροπλακών. Με τη χρήση ακετυλθειοχολίνης (ACTC) ως ειδικό υπόστρωµα, η µέθοδος αυτή βασίζεται στην αύξηση του κίτρινου χρώµατος που παράγεται από τη θειοχολίνη, όταν αυτή αντιδρά µε τα ιόντα DTNB (δι-θειο-δις-νιτροβενζοϊκό οξύ). (ένζυµο) ACTC θειοχολίνη + οξικό οξύ Θειοχολίνη + DTNB κίτρινο χρώµα 53

66 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Εξαγωγή της συνολικής ενζυµικής δραστικότητας 1. Εξαγωγή 1 gr πεπτικού αδένα των µυδιών. 2. Οµογενοποίηση µε τετραπλάσιο όγκο διαλύµατος 0.1Μ TRIS/HCl + 0.1% TRITON X 100, ph=7, για περίπου sec µε τη χρησιµοποίηση οµογενοποιητή Ultra Turrax. 3. Φυγοκέντρηση στις g για 20 λεπτά. Το υπερκείµενο µπορεί να διατηρηθεί στους -85 ο C και να χρησιµοποιηθεί ως πηγή ενζύµου. Προσδιορισµός της συνολική ενζυµικής δραστικότητας Η µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας γίνεται µε τη χρησιµοποίηση µικροπλάκας 96 οπών. Σε κάθε οπή προστίθενται 10 µl υπερκείµενου, 170 µl 0.1M TRIS/HCl + 0.1% TRITON X 100, ph 7, 20 µl DTNB (DTNB διαλυµένο σε 0.1Μ TRIS/HCl, ph 8, τελικής συγκέντρωσης 0.53 mm) και ακριβώς πριν από τη µέτρηση προστίθενται 5 µl ACTC 2.8 mm. Η µέτρηση της δραστικότητας γίνεται σε µήκος κύµατος 412 nm, όπου λαµβάνεται η αλλαγή της οπτικής πυκνότητας κάθε 1 λεπτό για περισσότερο από 4 λεπτά. Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης, (BCA method) Για τη µέτρηση της ποσότητας της πρωτεΐνης χρησιµοποιείται η µέθοδος BCA (bicinchoninic acid) που πρότειναν οι Sorensen και Brodbeck (1986). Για τη µέτρηση της πρωτεΐνης ετοιµάζεται πρότυπη καµπύλη της πρωτεΐνης αλβουµίνης (bovine serum alboumin, BSA), σύµφωνα µε τον πίνακα 4. Πίνακας 4. Προσδιορισµός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης σε άγνωστα δείγµατα. Πίνακας για την κατασκευή πρότυπης καµπύλης της αλβουµίνης. Table 4. Table for the calibration curve with the use of bovine-serum alboumin for determination of protein concentration in unknown samples. Ν ο eppendorf µl BSA(2mg/ml) ml 2d H 2 O C τελ (µg/ml)

67 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 1. Μεταφορά 20 µl από κάθε πρότυπο δείγµα σε διαφορετικά πηγαδάκια µιας πλάκας ELISA (96 οπών). 2. Προσθήκη 180 µl από το µίγµα των αντιδραστηρίων Α και Β. Προηγουµένως έχουµε ετοιµάσει διάλυµα των αντιδραστηρίων που περιέχει 50 µέρη από το Α και 1 µέρος από το Β. Τα άγνωστα δείγµατα που πρόκειται να µετρηθούν και να υπολογιστούν µε την πρότυπη καµπύλη, προετοιµάζονται µε τον ίδιο τρόπο, όπως και τα πρότυπα δείγµατα που περιγράφηκαν, δηλ. προσθήκη 3-5 µl δείγµατος σε κάθε πηγαδάκι, 180 µl από το αντιδραστήριο BCA και 2d H 2 O µέχρι τα 200 µl. 3. Επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C και µέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε µήκος κύµατος 570 nm. Από την πρότυπη καµπύλη (OD 570 -µg/ml) υπολογίζεται η ποσότητα της πρωτεΐνης που περιέχεται στα άγνωστα δείγµατα. Έκφραση της ενζυµικής δραστικότητας Η ειδική δραστικότητα (specific activity) εκφράζεται σε nmol ακετυλθειοχολίνης (ACTC) που υδρολύεται ανά λεπτό ανά mgr πρωτεΐνης (nmol ACTC/min/mg protein). Ο υπολογισµός της ενζυµικής δραστικότητας γίνεται σύµφωνα µε τον παρακάτω τύπο: OD (412nm) /min [protein] όπου, OD: η µεταβολή της οπτικής απορρόφησης που ισούται µε την υδρόλυση 75 nmoles ACTC (nmol/min/mg protein), [protein]: η συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε mgr. Γνωρίζοντας την ποσότητα της πρωτεΐνης που περιέχεται σε 20µl δείγµατος υπολογίζεται η ενζυµική δραστικότητα ανά mg πρωτεΐνης ανά λεπτό (U/mg protein). Η ενζυµική δραστικότητα εκφράζεται σε nmol/min/mg πρωτεϊνης, µε πολλαπλασιασµό της OD/min/mg πρωτείνης µε το συντελεστή 75, δηλ. την ποσότητα σε nmol της ακετυλθειοχολίνης που υδρολύεται (nmol/min/mg protein) από την αλλαγή της οπτικής απορρόφησης κατά µία µονάδα. 55

68 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ είκτες οικολογικής ποιότητας που χρησιµοποιήθηκαν 1. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε το δείκτη «Health Status Index (HIS)», που υπολογίζεται από το expert system Με σκοπό να εκτιµηθούν τα επίπεδα «stress» που προκαλούνται εξαιτίας των ρυπογόνων παραγόντων στα µύδια που συλλέχθηκαν από τον Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005, χρησιµοποιήθηκε το expert system, ένας αλγόριθµος που προτάθηκε από τους Dagnino et al. (2007). Στο σύστηµα αυτό είναι απαραίτητη η χρήση τουλάχιστον τριών βιοµαρτύρων «stress», των οποίων οι τιµές αυξάνονται ή µειώνονται ανάλογα µε τη ρύπανση και τουλάχιστον δύο βιοµαρτύρων από το επίπεδο ιστού/οργάνου. Επιπλέον, µεταξύ των βιοµαρτύρων πρέπει να συγκαταλέγεται και η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)», που είναι ο πλέον αντιπροσωπευτικός βιοµάρτυρας για να καταδείξει την κατάσταση υγείας των οργανισµών. Το πρόγραµµα αυτό βασίζεται σε µια οµάδα κανόνων που έχουν τη µορφή αν..τότε και χρησιµοποιούνται οι τιµές των βιοµαρτύρων από όλα τα επίπεδα οργάνωσης της ζωής. Στην παρούσα διατριβή χρησιµοποιήθηκαν οι τιµές πέντε βιοµαρτύρων από το κυτταρικό επίπεδο (LMS, MT, AChE, VvNL, VvLPF) και δύο βιοµαρτύρων από το επίπεδο ιστού (VvLYS, ΜΕΤ). Σύµφωνα µε τους Dagnino et al. (2007) η περιγραφή των παραπάνω βιοµαρτύρων παρουσιάζεται στον πίνακα 5. Πίνακας 5. Χαρακτηριστικά των βιοµαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν στο expert system (Dagnino et al. 2007). Table 5. Description of biomarkers employed in the expert system (Dagnino et al., 2007). Βιοµάρτυρας Επίπεδο οργάνωσης Προφίλ βιοµάρτυρα Τύπος βιοµάρτυρα LMS Κυτταρικό επίπεδο/cell level Μειώνεται/ Decreasing Γενικού «stress» VvNL Κυτταρικό επίπεδο/cell level Σχήµα καµπάνας/bell-shaped Γενικού «stress» VvLPF Κυτταρικό επίπεδο/cell level Αυξάνεται/ Increasing Γενικού «stress» MT Κυτταρικό επίπεδο/cell level Σχήµα καµπάνας/bell-shaped Έκθεση σε µέταλλα AChE Κυτταρικό επίπεδο/cell level Μειώνεται/Decreasing Έκθεση σε καρβαµικά, οργανοφωσφορικά / Γενικού «stress» VvLYS Επίπεδο ιστού/tissue level Αυξάνεται/Increasing Γενικού «stress» MET Επίπεδο ιστού/tissue level Μειώνεται/Decreasing Γενικού «stress» LMS: σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης, VvNL: πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων VvLPF: πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών, MT: συγκέντρωση µεταλλοθειονινών, AChE: δραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης, VvLYS: πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων, MET: πάχος επιθηλίου πεπτικών σωληναρίων LMS: lysosomal membrane stability, VvNL: volume density of neutral lipids VvLPF: volume density of lipofuscins, MT: metallothionein content, AChE: acetylcholinesterase activity, VvLYS: volume density of lysosomes, MET: mean epithelial thickness 56

69 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Οι τιµές των παραπάνω επτά βιοµαρτύρων εισήχθησαν στο expert system και η στατιστική ανάλυση των δεδοµένων πραγµατοποιήθηκε µε το Mann-Whitney U test (P<0.05), παρουσιάζοντας τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών σταθµών του Θερµαϊκού κόλπου και του σταθµού αναφοράς (Ολυµπιάδα) κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005 (δες και σελ ). Ο δείκτης «HIS» που εκτιµάται από το expert system κατηγοριοποιεί τα µύδια σε πέντε επίπεδα «stress» από το Α έως το Ε, όπου: Α-συνθήκες χωρίς «stress», Β-χαµηλό «stress», C-µέτριο «stress», D- υψηλό «stress» και Ε- παθολογικό «stress» και χαρακτηρίστηκε η περιοχή µε ένα χρώµα (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο), όπως φαίνεται στον πίνακα 6. Πίνακας 6. Κατάσταση υγείας των µυδιών µε βάση τo δείκτη «HIS», που εκτιµάται από το expert system. Table 6. Health status of mussels according to «HIS», calculated by the expert system. Επίπεδο «stress» Φυσιολογική κατάσταση µυδιών Χρώµα A Συνθήκες χωρίς «stress»/unstressed conditions B Χαµηλό «stress»/low stress C D Μέτριο «stress»/medium stress Υψηλό «stress»/high stress Ο δείκτης «HIS» µπορεί να εφαρµοστεί ακόµη και όταν δεν υπάρχουν βιοµάρτυρες από το επίπεδο του οργανισµού, αλλά στην περίπτωση αυτή το επίπεδο Ε δεν υπολογίζεται και το ανώτερο επίπεδο που µπορεί να αναγνωρίσει το σύστηµα είναι το D (Dagnino et al. 2007, Dondero et al. 2006). Στην παρούσα µελέτη το επίπεδο Ε δεν µπορεί να υπολογιστεί καθώς δεν έχουν χρησιµοποιηθεί βιοµάρτυρες από το επίπεδο του οργανισµού. Επιπρόσθετα, το expert system µπορεί να εκτιµήσει την έκθεση σε βαρέα µέταλλα και οργανικούς ρύπους, βασιζόµενο στις τιµές του περιεχοµένου των µεταλλοθειονινών και της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης, αντίστοιχα. Το expert system διατίθεται δωρεάν στην ιστοσελίδα 57

70 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε τον δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» Ο δείκτης «LRI» υπολογίστηκε µε βάση τις τιµές των βιοµαρτύρων «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και «πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων (volume density, VvLYS)», µε µια µαθηµατική µέθοδο που προτάθηκε από τους Izagirre & Marigomez (2009). Κάθε λυσοσωµικός δείκτης παρουσιάστηκε µε δύο συντεταγµένες που αντιστοιχούν στην «πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων» και στην τιµή της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης». Ο υπολογισµός της απόστασης (LRI) από τις τιµές της περιοχής αναφοράς υπολογίστηκε µε µια τριγωνοµετρική µέθοδο, η οποία περιελάµβανε τις τιµές του σταθµού αναφοράς και τους λογάριθµους των τιµών της LMS και της VvLYS µε διαφορετικές βάσεις (2 και 2,5 αντίστοιχα) ως εξής: LRI = (A 2 + B 2 ) όπου, Α=log 2.5 (VvLYS 0 /VvLYS), Β=log 2 (LMS 0 /LMS) και LMS 0 = η τιµή της LMS του σταθµού αναφοράς (20 min), LMS = η τιµή της LMS του δειγµατοληπτικού σταθµού, VvLYS 0 = η πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων του σταθµού αναφοράς (0,1 µm 3 / µm 3 ) και VvLYS = η πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων του δειγµατοληπτικού σταθµού. Πίνακας 7. Φυσιολογική κατάσταση των µυδιών µε βάση την τιµή του δείκτη «LRI». Table 7. Health status of the mussels according to «LRI». Τιµή LRI Φυσιολογική κατάσταση µυδιών Χρώµα <0,5 Συνθήκες χωρίς «stress» /unstressed conditions 0,5<LRI<1 Χαµηλό «stress»/low stress 1<LRI< 2 Μέτριο «stress»/medium stress > 2 Υψηλό «stress»/high stress Οι τιµές αναφοράς της LMS και της VvLYS που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό του δείκτη «LRI» επιλέχθηκαν µε βάση τις τιµές προηγούµενων 58

71 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ αναφορών του εργαστηρίου µας (Domouhtsidou & Dimitriadis 2001, Domouhtsidou et al. 2004, Koukouzika & Dimitriadis 2005, Koukouzika et al. 2009). Η κατάσταση των µυδιών της κάθε περιοχής σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο χαρακτηρίστηκε µε ένα χρώµα (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο) µε βάση την τιµή του LRI όπως φαίνεται στον πίνακα Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε το δείκτη «Integrated Biomarker Response (IBR)» Ο δείκτης «ΙΒR» υπολογίστηκε για όλους τους σταθµούς δειγµατοληψίας του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους (καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005) µε µια µαθηµατική προσέγγιση που προτάθηκε από τους Beliaeff & Burgeot (2002). Ο υπολογισµός του δείκτη «IBR», που βασίστηκε στις τιµές επτά βιοµαρτύρων (LMS, MT, AChE, VvLYS, VvNL, VvLPF, ΜΕΤ), για τους οποίους δεν χρησιµοποιείται συντελεστής βαρύτητας, πραγµατοποιήθηκε ακολουθώντας τα παρακάτω βήµατα: 1. Υπολογισµός του µέσου όρου και της τυπικής απόκλισης για κάθε βιοµάρτυρα και για κάθε σταθµό. 2. Σταντάρισµα των δεδοµένων για κάθε σταθµό: x i = (x i meanx)/s, όπου x i είναι η στανταρισµένη τιµή του βιοµάρτυρα, x i είναι η µέση τιµή του βιοµάρτυρα από κάθε σταθµό, το meanx είναι ο µέσος όρος του βιοµάρτυρα που υπολογίστηκε από όλους τους σταθµούς και από όλες τις δειγµατοληψίες και s είναι η τυπική απόκλιση του βιοµάρτυρα από όλους τους σταθµούς και από όλες τις δειγµατοληψίες. 3. Χρησιµοποιώντας τα στανταρισµένα δεδοµένα, η τιµή Z υπολογίστηκε ως + x i στην περίπτωση που παρατηρείται αύξηση του βιοµάρτυρα κατά τη ρύπανση και - x i στην περίπτωση που παρατηρείται µείωση του βιοµάρτυρα κατά τη ρύπανση. 4. Στη συνέχεια επιλέχθηκε η µικρότερη τιµή για όλους τους σταθµούς για κάθε βιοµάρτυρα και προστέθηκε στο Ζ. 5. Η τιµή του Β για κάθε βιοµάρτυρα υπολογίστηκε µε τη σχέση Β = Ζ + min, όπου Β 0 και min είναι η µικρότερη απόλυτη τιµή του Ζ. 6. Ο υπολογισµός του δείκτη «IBR» για κάθε σταθµό που παριστάνει την ενοποίηση των βιοµαρτύρων στα star plots υπολογίζεται από τη σχέση: 59

72 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ IBR = {[Β 1 x Β 2 )/2] + [Β 2 x Β 3 )/2] +.[Β n-1 x Β n )/2] + [Β n x Β 1 )/2]} 7. Σχεδιασµός των star plots (EXCELL, Microsoft) για κάθε δειγµατοληπτική περίοδο. 8. Στα αποτελέσµατα οι τελικές τιµές του δείκτη «IBR» διαιρούνται µε τον αριθµό των βιοµαρτύρων (n) που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό του «IBR» και παρουσιάζονται µε τη µορφή IBR/n (Broeg & Lehtonen, 2006). 4. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης µε τον «Πειραµατικό είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης ( ΘΡ)» Ο «Πειραµατικός είκτης Θαλάσσιας Ρύπανσης» είναι µια απλή µαθηµατική προσέγγιση και υπολογίστηκε για τα µύδια που συλλέχθηκαν από κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών περιόδων: καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη Για τον υπολογισµό του δείκτη χρησιµοποιήθηκαν οι τιµές επτά βιοµαρτύρων (LMS, MT, AChE, VvLYS, VvNL, VvLPF, ΜΕΤ) και ακολουθήθηκαν τα παρακάτω βήµατα: 1. Καθορισµός των ορίων κάθε βιοµάρτυρα σε µια τετράβαθµη κλίµακα από το (Πίν. 8). Η τιµή 10 αντιστοιχεί σε συνθήκες χωρίς «stress», ενώ η τιµή 40 αντιστοιχεί σε συνθήκες µε υψηλό «stress». Πίνακας 8. Καθορισµός των ορίων κάθε βιοµάρτυρα σε µια τετράβαθµη κλίµακα από το 10 έως το 40. (LMS σε min, ΜΤ σε µg/g ιστού, AChE σε nmol/mg πρωτεϊνης, ΜΕΤ σε mm και VvLYS, VvNL, VvLPF σε µm3/µm3) Table 8. Definition of the biomarker limits into a scale with four levels from 10 to 40. (LMS in min, ΜΤ in µg/g ιστού, AChE in nmol/mg protein, MET in mm and VvLYS, VvNL, VvLPF in µm3/µm3) LMS MT AChE VvLYS VvNL VvLPF ΜET 10 > > ,1 0-0,0875 >0, ,1-0,2 0,1-0,2 0,0875-0,175 0,015-0, ,2-0,3 0,2-0,3 0,175-0,2625 0,0075-0, <5 > >0,3 >0,3 >0, ,0075 LMS: σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης, MT: συγκέντρωση µεταλλοθειονινών, AChE: δραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης, VvLYS: πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων, VvNL: πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων VvLPF: πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών, MET: πάχος επιθηλίου πεπτικών σωληναρίων LMS: lysosomal membrane stability, MT: metallothionein content, AChE: acetylcholinesterase activity, VvLYS: volume density of lysosomes, VvNL: volume density of neutral lipids VvLPF: volume density of lipofuscins, MET: mean epithelial thickness 60

73 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Τα όρια του κάθε βιοµάρτυρα στην τετράβαθµη κλίµακα καθορίστηκαν µε βάση τις τιµές των βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στο πλαίσιο των δειγµατοληψιών από το Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο κατά το χρονικό διάστηµα , καθώς επίσης και από διαθέσιµα βιβλιογραφικά δεδοµένα. 2. Χαρακτηρισµός της τιµής του κάθε βιοµάρτυρα σε κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό µε µια παράµετρο Ν που αντιστοιχεί σε τιµή µε βάση τα παραπάνω όρια. 3. Χαρακτηρισµός του κάθε βιοµάρτυρα µε ένα συντελεστή βαρύτητας (σ.β), που είναι 2 για την LMS και 1 για τους υπόλοιπους βιοµάρτυρες. Ο συντελεστής βαρύτητας για την LMS χρησιµοποιήθηκε βασιζόµενος στο γεγονός ότι αυτός ο βιοµάρτυρας αποτελεί παράµετρο οδηγό κατά τον υπολογισµό του δείκτη «HIS» από το expert system (Dagnino et al., 2007). 4. Υπολογισµός του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης ( ΘΡ)» για κάθε σταθµό δειγµατοληψίας µε βάση τη µαθηµατική σχέση: ΘΡ = (σ.β 1 x Ν 1 + σ.β 2 Ν σ.β n x Ν n ) / Σ(σ.β 1 + σ.β 2 + σ.βn) 5. Χαρακτηρισµός της κατάστασης των µυδιών της κάθε περιοχής σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο µε ένα χρώµα (µπλε, πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο) µε βάση την τιµή του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης», όπως φαίνεται στον πίνακα 9. Πίνακας 9. Φυσιολογική κατάσταση των µυδιών µε βάση την τιµή του «Πειραµατικού είκτη Θαλλάσσιας Ρύπανσης» Table 9. Health status of mussels according to «Tentative Marine Pollution Index» Τιµή ΘΡ Φυσιολογική κατάσταση µυδιών Χρώµα συνθήκες χωρίς «stress»/unstressed conditions Χαµηλό «stress»/ low stress Μέτριο «stress»/medium stress Υψηλό «stress»/high stress 61

74 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Τεχνικές προσδιορισµού βαρέων µετάλλων 1. Συγκέντρωση βαρέων µετάλλων σε ιστούς των µυδιών µε τη χρήση της ατοµικής απορρόφησης Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών πραγµατοποιήθηκε µε ατοµική απορρόφηση ακολουθώντας τα εξής βήµατα: 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα και των βραγχίων από 20 ζώα και συλλογή τεσσάρων δειγµάτων που περιείχαν το καθένα 1g του ιστού. 2. Τεµαχισµός του ιστού σε µικρά κοµµάτια και ξήρανση για 48 ώρες στους C. 3. Μέτρηση της ξηρής µάζας και προσθήκη HNO 3 75% ώστε να καλύπτεται εντελώς ο αποξηραµένος ιστός. Ο όγκος του οξέος που προστίθεται είναι: ξηρό βάρος ιστού x Παραµονή του ιστού µέσα στο οξύ για 24 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια ακολουθεί βρασµός µέχρι εξάτµισης του οξέος. 5. Το στερεό υπόλειµµα αραιώνεται µε 5 ml HNO 3 0,5%. 6. ιήθηση του δείγµατος σε διηθητικό χαρτί και µέτρηση της συγκέντρωσης των µετάλλων µε όργανο ατοµικής απορρόφησης (Perkin Ellmer 2380). Οι συγκεντρώσεις των µετάλλων που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων µε τη µέθοδο της ατοµικής απορρόφησης συγκρίθηκαν µε το υλικό αναφοράς (Reference Material for Trace Metals from dogfish muscle/dorm-2, NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA). Από τα αποτελέσµατα προκύπτει ταύτιση των µετρήσεων του οργάνου µε τις τιµές των πρότυπων δειγµάτων σε ποσοστό 90-97%. 2. Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός βαρέων µετάλλων σε ιστούς των µυδιών Για τον ενδοκυτταρικό εντοπισµό των βαρέων µετάλλων µε την τεχνική της αυτοµεταλλογραφίας σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα και των βραγχίων των µυδιών στο επίπεδο του οπτικού µικροσκοπίου χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος που περιγράφεται από τον Dancher (1984), µε παραλλαγές που περιγράφονται από τους Raftopoulou et al. (2002). Η τεχνική της αυτοµεταλλογραφίας περιλαµβάνει τα εξής στάδια: 62

75 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα και των βραγχίων από 5 ζώα. 2. Τεµαχισµός των ιστών σε κοµµάτια 5mm 3 και τοποθέτησή τους σε ειδικές βάσεις αλουµινίου. 3. Μονιµοποίηση των ιστών σε υγρό n-hexane για 40 min το οποίο είχε ψυχθεί προηγουµένως σε υγρό άζωτο. 4. Αποθήκευση των ιστών στους C έως την εφαρµογή της τεχνικής της αυτοµεταλλογραφίας. 5. Κρυοτοµές πεπτικού αδένα και βραγχίων πάχους 9 µm κόπηκαν σε κρυοστάτη Reichert-Jung Cryocut 1800 (Leica) σε θερµοκρασία C και µεταφέρθηκαν σε αντικειµενοφόρους πλάκες. 6. Μονιµοποίηση των τοµών µε calcium formal (30% paraformaldeyde, 2% calcium acetate) για 10 min στους 4 0 C. 7. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 8. Κάλυψη των τοµών µε ένα οµοιόµορφο στρώµα φωτογραφικού γαλακτώµατος (Ilford nuclear emulsion L4) σε συνθήκες µειωµένου φωτισµού. Για το σκοπό αυτό µικρή ποσότητα φωτογραφικού γαλακτώµατος (1-2 gr) τοποθετήθηκε σε ύαλο ωρολογίου διαµέτρου 7cm. Για την τήξη του διαλύµατος και την επίστρωση των τοµών η ύαλος τοποθετήθηκε στο χείλος ποτηριού ζέσεως που περιείχε βραστό νερό. Στη συνέχεια µικρή ποσότητα ρευστοποιηµένου γαλακτώµατος επιστρώθηκε πάνω στις τοµές µε τη βοήθεια µιας καθαρής αντικειµενοφόρου, ώστε να δηµιουργηθεί ένα οµοιόµορφο στρώµα γαλακτώµατος. 9. Ξήρανση του γαλακτώµατος σε απόλυτο σκοτάδι για 15 min. 10. Εµφάνιση των τοµών σε Kodak D-19 για 1, 5 ώρα. 11. Ξέβγαλµα των τοµών µε βραστό νερό µέχρι να αποκολληθεί πλήρως το φωτογραφικό γαλάκτωµα από τις τοµές. 12. Στερέωση των τοµών σε Acidofix (Agfa) για 10 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 13. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 14. Έγκλειση των τοµών µε entellan και κάλυψή τους µε καλυπτρίδα. Μετά την εµφάνιση των τοµών, τα βαρέα µέταλλα ήταν ορατά µέσα στα κύτταρα ως µαύροι κόκκοι αργύρου (BSD), καταδεικνύοντας την ύπαρξη ατόµων αργύρου του γαλακτώµατος γύρω από αυτά (Εικ. 17). Στη συνέχεια, οι τοµές παρατηρήθηκαν στο 63

76 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ οπτικό µικροσκόπιο άβαφτες και η πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων υπολογίστηκε µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας. Μεταλλικός Ag Μέταλλο του ιστού Ιόντα Ag + e - Εικόνα 17. Tα βαρέα µέταλλα εντοπίζονται στους ιστούς µε τη µορφή µαύρων κόκκων αργύρου µετά την εφαρµογή της αυτοµεταλλογραφίας. Figure 17. Heavy metals are localized in the tissues as black silver deposits after the application of autometallography. Ιστοχηµικές τεχνικές 1. Ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο όξινη φωσφατάση Η µέθοδος αυτή εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα µυδιών, στις οποίες έγινε ιστοχηµεία για την ανίχνευση του λυσοσωµικού ενζύµου όξινη φωσφατάση µε µια διαδικασία που προτάθηκε από τον Broeg et al. (1999). Προετοιµασία ιστών 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα από 5 ζώα. 2. Τεµαχισµός των ιστών σε κοµµάτια 5mm 3 και τοποθέτησή τους σε ειδικές βάσεις αλουµινίου. 3. Μονιµοποίηση των ιστών σε υγρό n-hexane για 40 sec το οποίο είχε ψυχθεί προηγουµένως σε υγρό άζωτο. 4. Αποθήκευση των ιστών στους C έως την εφαρµογή της ιστοχηµείας. 64

77 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Ιστοχηµική µέθοδος 1. Κρυοτοµές πεπτικού αδένα πάχους 9 µm κόπηκαν σε κρυοστάτη Reichert- Jung Cryocut 1800 (Leica) σε θερµοκρασία C και µεταφέρθηκαν σε αντικειµενοφόρους πλάκες. 2. Μεταφορά των αντικειµενοφόρων πλακών σε µέσο επώασης, το οποίο περιείχε 10 mg υποστρώµατος naphtol AS-BI-phosphate (Sigma, N 2125) διαλυµένο σε 2.5 ml 2-methoxyethanol και συµπληρωνόταν ως τα 50 ml µε 0,1 mμ ρυθµιστικού διαλύµατος κιτρικού οξέος που περιείχε 2.5% ΝaCl και 3.5 gr ενός πολυπεπτιδίου χαµηλής πυκνότητας (Sigma POLYPEP, P5115) για τη σταθεροποίηση των τοµών. 3. Επώαση για 20 min στους 37 0 C σε υδατόλουτρο µε συνεχή ανάδευση και ξέπλυµα των τοµών µε 3% NaCl στους 37 0 C για 2 min. 4. Χρώση των τοµών µε 1 mg/ml Fast Violet B (Sigma F1631) σε 0.1 Μ ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (ρη=7.4) σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 min. 5. Ξέπλυµα των τοµών µε νερό βρύσης για 5 min και στερέωση σε calcium formal (30% paraformaldeyde, 2% calcium acetate) για 10 min στους 4 0 C. 6. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 7. Έγκλειση των τοµών µε entellan και κάλυψή τους µε καλυπτρίδα. 2. Ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο β-γλουκουρονιδάση Η µέθοδος αυτή εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών, στις οποίες έγινε ιστοχηµεία για την ανίχνευση του λυσοσωµικού ενζύµου β- γλουκουρονιδάση. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε προτάθηκε από τον Moore (1976) µε τις διαφοροποιήσεις που περιγράφηκαν από την Cajaraville et al. (1989). Προετοιµασία ιστών 1. Εξαγωγή του πεπτικού αδένα από 5 ζώα. 2. Τεµαχισµός των ιστών σε κοµµάτια 5mm 3 και τοποθέτησή τους σε ειδικές βάσεις αλουµινίου. 3. Μονιµοποίηση των ιστών σε υγρό n-hexane για 40 sec το οποίο είχε ψυχθεί προηγουµένως σε υγρό άζωτο. 4. Αποθήκευση των ιστών στους C έως την εφαρµογή της ιστοχηµείας. 65

78 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Ιστοχηµική µέθοδος 1. Κρυοτοµές πεπτικού αδένα πάχους 9 µm κόπηκαν σε κρυοστάτη Reichert- Jung Cryocut 1800 (Leica) σε θερµοκρασία C και µεταφέρθηκαν σε αντικειµενοφόρες πλάκες. Οι αντικειµενοφόρες πλάκες τοποθετήθηκαν στους 4 0 C για 30 min και έπειτα σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 min. 2. Μεταφορά των αντικειµενοφόρων πλακών σε µέσο επώασης το οποίο περιείχε 28 mg υποστρώµατος naphtol AS-BI-N-acetyl-β-D glucoronide (Sigma, N1875) διαλυµένο σε 1,2 ml από 50 mμ sodium bicarbonate και συµπληρωνόταν ως τα 100 ml µε 0,1 Μ acetate buffer (ph=4,5) που περιείχε 2.5% ΝaCl και 15% polyvinyl alcohol. 3. Επώαση για 40 min στους 37 0 C σε υδατόλουτρο µε συνεχή ανάδευση και ξέπλυµα των τοµών µε 2,5% NaCl στους 37 0 C για 2 min. 4. Προσθήκη 0,1% Fast Garnet διαλυµένη σε 0.1 Μ ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (ρη=7.4) σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 min στο σκοτάδι. 5. Ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 6. Στερέωση των τοµών σε calcium formal (30% paraformaldeyde, 2% calcium acetate) για 10 min στους 4 0 C και ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 7. Προσθήκη 0,1% Fast Green για 2 min και ξέπλυµα των τοµών µε ddh 2 O. 8. Έγκλειση των τοµών µε glycergel και κάλυψή τους µε καλυπτρίδα. Σύστηµα ανάλυσης εικόνας Η πυκνότητα όγκου (volume density) και η αριθµητική πυκνότητα (numerical density) των λυσοσωµάτων, των ουδέτερων λιπιδίων, των λιποφουσκινών και των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων υπολογίζεται µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας, το οποίο περιλαµβάνει µια βιντεοκάµερα JVC εφαρµοσµένη σε οπτικό µικροσκόπιο Olympus CX41. υαδικές εικόνες λαµβάνονται στον υπολογιστή µε το πρόγραµµα PINNACLE STUDIO, οι οποίες στη συνέχεια επεξεργάζονται µε το πρόγραµµα Adobe Photoshop 5.0. Τα λυσοσώµατα, τα ουδέτερα λιπίδια, τα κοκκία λιποφουσκίνης και οι αυτοµεταλλογραφικοί κόκκοι ξεχωρίζουν από το κυτταρόπλασµα και όποτε κρίνεται απαραίτητο αφαιρείται από την ανάλυση ο αγωγός των πεπτικών σωληναρίων και ο συνδετικός ιστός γύρω από αυτά. Γίνεται λήψη και ανάλυση 10 φωτογραφιών από κάθε ζώο, δηλαδή συνολικά 50 φωτογραφίες για κάθε δειγµατοληπτική περιοχή. Από τις δυαδικές εικόνες των 66

79 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ φωτογραφιών υπολογίζεται η πυκνότητα όγκου (volume density) και η αριθµητική πυκνότητα (numerical density) των λυσοσωµάτων, των ουδέτερων λιπιδίων, των λιποφουσκινών και των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων µέσω του προγράµµατος VISILOG 5. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων Η στατιστική ανάλυση των δεδοµένων από τη εφαρµογή των βιοµαρτύρων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρησιµοποίηση του στατιστικού πακέτου STATISTICA (STATISTIKA 6.0. statistical package, Microsoft Co. Auth, Greece). Τα αποτελέσµατα των βιοµαρτύρων «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης», «συγκέντρωση µεταλλοθειονινών» και «δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης» επεξεργάστηκαν στατιστικά µε την εφαρµογή µη παραµετρικών δοκιµασιών (Mann- Whitney-U-test, P<0.05). Τα αποτελέσµατα που εξήχθησαν από το «χηµικό προσδιορισµό των βαρέων µετάλλων» επεξεργάστηκαν στατιστικά µε το t-test (P<0.05) για ανεξάρτητα δείγµατα. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από την εφαρµογή των υπόλοιπων βιοµαρτύρων υποβλήθηκαν σε διαδικασία Komolvorov- Smirnov για να διαπιστωθεί αν ακολουθούσαν κανονική κατανοµή. Έπειτα από τη λογαριθµική µετατροπή όλων των παραµέτρων που δεν ακολουθούσαν κανονική κατανοµή εφαρµόστηκαν παραµετρικές διαδικασίες (Duncan s test, P<0.05). Οι αρνητικές και θετικές συσχετίσεις µεταξύ των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν στην παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκαν µε το τεστ της απλής γραµµικής συσχέτισης (Correlation matrices, Pearson s test, P<0.05), ενώ για την οµαδοποίηση των περιοχών δειγµατοληψίας στη µελέτη πεδίου χρησιµοποιήθηκε η ανάλυση οµάδων (Cluster analysis, Joining cluster analysis, P<0.05). 67

80 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

81 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ ΜΕΡΟΣ Α: ΜΕΛΕΤΗ ΠΕ ΙΟΥ 1. ιερεύνηση βιοµαρτύρων ρύπανσης και µελέτη των εποχικών τους διακυµάνσεων σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis Στη συγκεκριµένη ενότητα της παρούσας διατριβής εφαρµόστηκαν κυτταρικοί και βιοχηµικοί βιοµάρτυρες ρύπανσης («σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης», «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό», «µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων», «συγκέντρωση µεταλλοθειονινών», «δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης», «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» και «µορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου του πεπτικού αδένα») στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis σε τρεις διαφορετικές εποχές του έτους. Σκοπός της παρούσας ενότητας της διατριβής είναι και η εξέταση δύο υπό διερεύνηση βιοµαρτύρων («µορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών» και «µορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων») και η συσχέτισή τους µε τους ήδη καθιερωµένους βιοµάρτυρες προκειµένου να ενισχυθεί η ευρύτατη χρησιµοποίησή τους σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Επιπρόσθετα, ένας άλλος στόχος των διερευνήσεων είναι η µελέτη των εποχικών διακυµάνσεων των παραπάνω βιοµαρτύρων, µε σκοπό να προσδιοριστούν οι επιπτώσεις των εποχικών περιβαλλοντικών παραγόντων στον πεπτικό αδένα των µυδιών οι οποίες θα αξιοποιηθούν σε µελέτες βιοπαρακολούθησης των παράκτιων υδάτινων οικοσυστηµάτων Εκτίµηση του χρόνου της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Η εφαρµογή της µεθόδου «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» πραγµατοποιήθηκε σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα του µυδιού M. galloprovincialis. Η ανάλυση των αποτελεσµάτων κατάδειξε στατιστικώς χαµηλότερους χρόνους για τα µύδια που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και στις τρεις εποχές δειγµατοληψίας, σε σχέση µε 69

82 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς). Συγκεκριµένα, στατιστικώς χαµηλότερος χρόνος της τεχνικής παρατηρήθηκε στα µύδια που συλλέχθηκαν από το Καλοχώρι κατά τη δειγµατοληψία του καλοκαιριού 2004 και στα µύδια που συλλέχθηκαν από την Περαία κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του φθινοπώρου 2004 και της άνοιξης 2005 ( ιάγρ. 1). Σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης min Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 1. Χρόνοι της τεχνικής «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών σταθµών παρουσιάζονται µε αστερίσκους (Mann- Whitney U-test, P<0.05). Diagram 1. Lysosomal membrane stability values of the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. Significant differences between pairs of mean values are shown by asterisks on the upper triangular matrixes (Mann-Whitney U-test, P<0.05). Όσον αφορά τις εποχικές διακυµάνσεις αυτού του βιοµάρτυρα ( ιάγρ. 2), στατιστικώς σηµαντικές διαφορές στους χρόνους της τεχνικής «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» παρατηρήθηκαν στην περίπτωση των µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα, το Καλοχώρι και την Περαία. Συγκεκριµένα, χαµηλότεροι χρόνοι της τεχνικής καταδείχθηκαν στα µύδια της Περαίας κατά την περίοδο της άνοιξης 2005, σε σχέση µε αυτά που συλλέχθηκαν το καλοκαίρι 2004 και το φθινόπωρο Επιπρόσθετα, η τεχνική που εφαρµόστηκε στον πεπτικό αδένα 70

83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ των µυδιών του Καλοχωρίου κατέδειξε στατιστικώς υψηλότερους χρόνους το φθινόπωρο 2004, σε σχέση µε το καλοκαίρι 2004 και την άνοιξη Σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης min Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 2. Εποχικές διαφοροποιήσεις του χρόνου της τεχνικής «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών περιόδων σε κάθε σταθµό παρουσιάζονται µε αστερίσκους (Mann-Whitney U-test, P<0.05). Diagram 2. Seasonal variations of the LMS values in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. The statistical significant differences between the sampling periods in each sampling station are shown by asterisks in the upper triangular matrixes (Mann-Whitney U-test, P<0.05) Εκτίµηση του χρόνου της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» στα αιµοκύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis Η τεχνική «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» που εφαρµόστηκε στα αιµοκύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis δεν έδειξε στατιστικώς σηµαντικές διαφορές των χρόνων ανάµεσα στα µύδια που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών περιόδων ( ιάγρ. 71

84 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 3). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν εποχικές διαφοροποιήσεις στους χρόνους της NRR στα αιµοκύτταρα των µυδιών, µε εξαίρεση αυτά που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα, όπου υψηλότεροι χρόνοι καταδείχτηκαν την περίοδο της άνοιξης 2005, σε σχέση µε την περίοδο του φθινοπώρου 2004 ( ιάγρ. 4). Κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό min Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ Φ ΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 3. Χρόνοι της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» στα αιµοκύτταρα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών σταθµών παρουσιάζονται µε αστερίσκους (Duncan s test, P<0.05). Diagram 3. Neutral Red Retention (NRR) times in the haemocytes of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. Significant differences between pairs of mean values are shown by asterisks on the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). 72

85 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη min Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 4. Εποχικές διαφοροποιήσεις του χρόνου της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» στα αιµοκύτταρα µυδιών M. galloprovincialis, που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών περιόδων σε κάθε σταθµό παρουσιάζονται µε αστερίσκους (Duncan s test, P<0.05). Diagram 4. Seasonal variations of the NRR values in the haemocytes of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. The statistical significant differences between the sampling periods in each sampling station are shown by asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05) Μορφολογικές και µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Η ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο έδειξε αυξηµένη παρουσία λυσοσωµάτων στο κυτταρόπλασµα των πεπτικών κυττάρων. Σύµφωνα µε τις παρατηρήσεις στο οπτικό µικροσκόπιο (Εικ. 18 α-γ), την περίοδο του καλοκαιριού 2004 υπήρχαν πολυάριθµα λυσοσώµατα στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών, τα οποία παρουσιάσαν έντονη χρώση για το ένζυµο Ν-ακετυλβ-εξοζαµινιδάση (Εικ. 18α). Την περίοδο του φθινοπώρου 2004, παρατηρήθηκαν µικρά και περιορισµένα σε αριθµό λυσοσώµατα στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών 73

86 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (Εικ. 18β), ενώ την περίοδο της άνοιξης 2005 υπήρχαν διογκωµένα και λίγα σε αριθµό λυσοσώµατα µε ανοµοιόµορφη χρώση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση (Εικ. 18γ). α β γ L L L δ ε στ L L L Εικόνα 18. Ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. (α-γ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών που συλλέχθηκαν από το Αγγελοχώρι (α) το καλοκαίρι του 2004, (β) το φθινόπωρο του 2004 και (γ) την άνοιξη του (δ-στ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) (δ) το καλοκαίρι του 2004, (ε) το φθινόπωρο του 2004 και (στ) την άνοιξη του x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 18. Ν-acetyl-β-hexozaminidase histochemistry in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis. (α-γ) Digestive tubules of mussels collected from Aggelochorion (α) in summer 2004, (β) in autumn 2004 and (γ) in spring (δ-στ) Digestive tubules of mussels collected from Olympiada (reference station) (δ) in summer 2004, (ε) in autumn 2004 and (στ) in spring x, L: digestive tubule lumen Οι εποχικές διαφοροποιήσεις των λυσοσωµάτων και των λιποφουσκινών στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) παρουσίασαν διαφορετικό πρότυπο από αυτό που παρουσίασαν τα µύδια του Θερµαϊκού κόλπου (Εικ. 18 δ-στ). Συγκεκριµένα, την περίοδο του καλοκαιριού 2004 τα λυσοσώµατα στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών της Ολυµπιάδας ήταν αρκετά διογκωµένα µε ασθενή χρώση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση (Εικ. 18δ). 74

87 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) µm3/µm3 0,5 0,4 0,3 0,2 Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0,1 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ (β) αριθµός/µm3 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 5. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στα πεπτικά κύτταρα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του (α) Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων (β) Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Duncan s test, P<0.05). Diagram 5. «Morphometrical alterations of lysosomes» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring (α) Volume density of lysosomes (β) Numerical density of lysosomes. Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between the stations of Thermaikos gulf and the station of Olympiada in each sampling period (Duncan s test, P<0.05). Την περίοδο του φθινοπώρου 2004, τα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών είχαν το φυσιολογικό τους µέγεθος µε έντονη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο (Εικ. 18ε). Τέλος, την περίοδο της άνοιξης 2005 τα πεπτικά κύτταρα των 75

88 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα παρουσίασαν λίγα και πολύ µικρά σε µέγεθος λυσοσώµατα, µε περιορισµένη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλβ-εξοζαµινιδάση (Εικ. 18στ). Με σκοπό να επιβεβαιωθούν οι εποχικές µορφολογικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών, πεπτικά σωληνάρια αναλύθηκαν µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density) και αριθµητική πυκνότητα (numerical density) των λυσοσωµάτων. Κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του καλοκαιριού 2004 και της άνοιξης 2005 παρατηρήθηκαν στατιστικώς υψηλότερες τιµές της πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, σε σχέση µε αυτά που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) ( ιάγρ. 5α). Κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004, στατιστικώς µικρότερη πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων παρουσιάστηκε στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Αγγελοχώρι και τη Χαλάστρα, ενώ µεγαλύτερη πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων παρατηρήθηκε στα µύδια του Καλοχωρίου ( ιάγρ. 5α). Όσον αφορά στην αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων ( ιάγρ. 5β), παρατηρήθηκε στατιστικώς µικρότερη τιµή αυτής της παραµέτρου στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου το καλοκαίρι 2004 και στατιστικώς αυξηµένη τιµή της ίδιας παραµέτρου στα µύδια που συλλέχθηκαν την άνοιξη 2005, σε σχέση µε τα µύδια της Ολυµπιάδας. Επιπρόσθετα, η στατιστική ανάλυση έδειξε υψηλότερη αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών του Αγγελοχωρίου και της Περαίας το φθινόπωρο 2004, σε σχέση µε αυτά του Καλοχωρίου και της Χαλάστρας την ίδια εποχή. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν εποχικές διακυµάνσεις της πυκνότητας όγκου ( ιάγρ. 6α) και της αριθµητικής πυκνότητας ( ιάγρ. 6β) των λυσοσωµάτων. Συγκεκριµένα, παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση της πυκνότητας όγκου και αύξηση της αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών του Αγγελοχωρίου κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004, σε σχέση µε αυτή της άνοιξης 2005 και του καλοκαιριού Αντίθετα, τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα παρουσίασαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου και σηµαντική µείωση της αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων το φθινόπωρο 2004, σε σχέση µε αυτά της άνοιξης 2005 και του καλοκαιριού

89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων µm3/µm3 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα (β) 0,05 Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων αριθµός/µm3 0,04 0,03 0,02 0,01 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη 0 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 6. Εποχικές διαφοροποιήσεις των «µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων» στα πεπτικά κύτταρα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του (α) Πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων (β) Αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτών των παραµέτρων ανάµεσα στις περιόδους δειγµατοληψίας σε κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Duncan s test, P<0.05). Diagram 6. Seasonal variations of «morphometrical alterations of lysosomes» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring (α) Volume density of lysosomes (β) Numerical density of lysosomes. Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences of these parameters between the sampling periods in each station of Thermaikos and Strymonikos gulf are indicated with asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). 77

90 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 1.4. Μορφολογικές και µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Η µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis µετρήθηκαν µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας και εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density) και αριθµητική πυκνότητα (numerical density). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων ( ιάγρ. 7α) έδειξε αυξηµένη πυκνότητα όγκου των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από όλους του δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου το φθινόπωρο 2004 και την άνοιξη 2005, σε σύγκριση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα τις ίδιες εποχές. Αντίθετα, το καλοκαίρι 2004 παρατηρήθηκε στατιστικώς µειωµένη πυκνότητα όγκου των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών του Θερµαϊκού κόλπου, σε σχέση µε τα µύδια της Ολυµπιάδας. Επιπλέον, η στατιστική ανάλυση έδειξε σηµαντική µείωση της αριθµητικής πυκνότητας των ουδέτερων λιπιδίων στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο το καλοκαίρι 2004 και την άνοιξη 2005, συγκριτικά µε αυτά που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα ( ιάγρ. 7β). Εξετάζοντας τις εποχικές διαφοροποιήσεις των µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων ( ιάγρ. 8, Εικ. 19), τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου ( ιάγραµµα 8α) και της αριθµητικής πυκνότητας ( ιάγρ. 8β) των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Αγγελοχώρι και το Καλοχώρι το φθινόπωρο 2004 και την άνοιξη 2005, σε σχέση µε αυτά που συλλέχθηκαν την περίοδο του καλοκαιριού 2004 (Εικ. 19α-γ και ιάγρ. 8α, β). Στα µύδια που συλλέχθηκαν από την Περαία παρουσιάστηκε σηµαντική µείωση της πυκνότητας όγκου των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα το φθινόπωρο 2004, σε σχέση µε την ίδια παράµετρο το καλοκαίρι 2004 και την άνοιξη 2005 ( ιάγρ. 8α). Στον πεπτικό αδένα των µυδιών της Ολυµπιάδας παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση αυτών των παραµέτρων το φθινόπωρο 2004 και την άνοιξη 2005, σε σχέση µε το καλοκαίρι 2004 (Εικ. 19δ-στ και ιάγρ. 18α, β). 78

91 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) Πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων µm3/µm3 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0,1 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ (β) αριθµός/µm3 0,03 0,02 0,01 Αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 7. «Μορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων» στα πεπτικά κύτταρα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του (α) Πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων (β) Αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Duncan s test, P<0.05). Diagram 7. «Morphometrical alterations of neutral lipids» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring (α) Volume density of neutral lipids (β) Numerical density of neutral lipids. Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between the stations of Thermaikos gulf and the station of Olympiada in each sampling period (Duncan s test, P<0.05). 79

92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) Πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων µm3/µm3 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα (β) αριθµός/µm3 0,03 0,02 0,01 Αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη 0 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 8. Εποχικές διαφοροποιήσεις των «µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων» στα πεπτικά κύτταρα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του (α) Πυκνότητα όγκου των ουδέτερων λιπιδίων (β) Αριθµητική πυκνότητα των ουδέτερων λιπιδίων. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτών των παραµέτρων ανάµεσα στις περιόδους δειγµατοληψίας σε κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Duncan s test, P<0.05). Diagram 8. Seasonal variations of «morphometrical alterations of neutral lipids» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring 2005 (α) Volume density of neutral lipids (β) Numerical density of neutral lipids. Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences of these parameters between the sampling periods in each station of Thermaikos and Strymonikos gulf are indicated with asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). 80

93 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ α β γ L L L δ ε στ L L L Εικόνα 19. Ιστοχηµεία ουδέτερων λιπιδίων σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. (αγ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών που συλλέχθηκαν από το Αγγελοχώρι (α) το καλοκαίρι του 2004, (β) το φθινόπωρο του 2004 και (γ) την άνοιξη του (δ-στ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) (δ) το καλοκαίρι του 2004, (ε) το φθινόπωρο του 2004 και (στ) την άνοιξη του x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 19. Neutral lipids histochemistry in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis. (α-γ) Digestive tubules of mussels collected from Aggelochorion (α) in summer 2004, (β) in autumn 2004 and (γ) in spring (δ-στ) Digestive tubules of mussels collected from Olympiada (reference station) (δ) in summer 2004, (ε) in autumn 2004 and (στ) in spring x, L: digestive tubule lumen 1.5. Εκτίµηση της «συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών (ΜΤ)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Η εκτίµηση της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών πραγµατοποιήθηκε στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. Τα αποτελέσµατα ( ιάγρ. 9) έδειξαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο (µε εξαίρεση το σταθµό του Αγγελοχωρίου) το καλοκαίρι 2004, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα. Την άνοιξη 2005 η συγκέντρωση των µεταλλοθειονινών ήταν σηµαντικώς µειωµένη στα µύδια που συλλέχθηκαν από το 81

94 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Θερµαϊκό κόλπο, µε εξαίρεση το σταθµό της Περαίας, σε σχέση µε αυτά που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν στατιστικώς υψηλότερη συγκέντρωση των µεταλλοθειονινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα και την Περαία κατά την περίοδο της άνοιξης 2005 ( ιάγρ. 10), σε σχέση µε την εκτίµηση της ίδιας παραµέτρου κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του φθινοπώρου 2004 και του καλοκαιριού µg M T/gr ιστού Συγκέντρωση µεταλλοθειονινών ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ Φ ΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 9. Εκτίµηση της «συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι στα τριγωνάκια δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των σταθµών του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Mann Whitney U-test, P<0.05). Diagram 9. Evaluation of «metallothioneins content» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and spring Values are expressed as means ± SD. Asterisks in the triangular matrixes represent the statistical differences between the stations of Thermaikos gulf and Olympiada in each sampling period (Mann Whitney U-test, P<0.05). 82

95 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Συγκέντρωση µεταλλοθειονινών µg ΜΤ/gr ιστού Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη 0 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 10. Εποχικές διαφοροποιήσεις της «συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών περιόδων σε κάθε σταθµό παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Mann-Whitney U-test, P<0.05). Diagram 10. Seasonal variations of the «metallothioneins content» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences between the sampling periods in each sampling station are shown by asterisks in the upper triangular matrixes (Mann-Whitney U-test, P<0.05) Εκτίµηση της «δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Τα αποτελέσµατα της παρούσας ενότητας της διατριβής ( ιάγρ. 11) έδειξαν αναστολή της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο το καλοκαίρι 2004 και το φθινόπωρο 2004, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα τις ίδιες δειγµατοληπτικές περιόδους. Την περίοδο της άνοιξης 2005 παρατηρήθηκε αύξηση της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου (µε 83

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ εξαίρεση το σταθµό του Καλοχωρίου), συγκρινόµενα µε αυτά που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα. Όσον αφορά στις εποχικές διαφοροποιήσεις ( ιάγρ. 12), στατιστικώς αυξηµένη δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης εκτιµήθηκε στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο κατά την περίοδο της άνοιξης 2005, σε σχέση µε την ίδια παράµετρο κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του φθινοπώρου 2004 και του καλοκαιριού ραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης nmol/mgr πρωτεϊνης ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 11. Εκτίµηση της «δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι στα τριγωνάκια δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των σταθµών του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Mann Whitney U-test, P<0.05). Diagram 11. Evaluation of «acetylcholinesterase activity» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. Asterisks in the triangular matrixes represent the statistical differences between the stations of Thermaikos gulf and Olympiada in each sampling period (Mann Whitney U-test, P<0.05). 84

97 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ ραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης nmol/mg πρωτεϊνης Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 12. Εποχικές διαφοροποιήσεις της «δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµατοληπτικών περιόδων σε κάθε σταθµό παρουσιάζονται µε αστερίσκους (Mann-Whitney U-test, P<0.05). Diagram 12. Seasonal variations of the «acetylcholinesterase activity» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences between the sampling periods in each sampling station are shown by asterisks in the upper triangular matrixes (Mann-Whitney U-test, P<0.05). Υπό διερεύνηση βιοµάρτυρες 1.7. Μορφολογικές και µορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Με σκοπό την εύρεση εποχικών µορφολογικών διαφορών της συσσώρευσης των λιποφουσκινών στα κύτταρα του πεπτικού αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο και την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) πραγµατοποιήθηκε ιστοχηµεία λιποφουσκινών σε κρυοτοµές πεπτικών σωληναρίων και παρατήρησή τους σε επίπεδο οπτικού µικροσκοπίου. Σύµφωνα µε τις παρατηρήσεις, τα πεπτικά 85

98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ κύτταρα του πεπτικού αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου την περίοδο του καλοκαιριού 2004 (Εικ. 20α) εµφάνισαν µικρή ποσότητα κόκκων λιποφουσκίνης στα πεπτικά τους κύτταρα, ενώ την περίοδο του φθινοπώρου 2004 (Εικ. 20β) και της άνοιξης 2005 (Εικ. 20γ) το περιεχόµενο των κυττάρων σε λιποφουσκίνη ήταν ιδιαίτερα αυξηµένο. α β γ L L L δ ε στ L L L Εικόνα 20. Ιστοχηµεία λιποφουσκινών σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. (α-γ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών που συλλέχθηκαν από το Αγγελοχώρι (α) το καλοκαίρι του 2004, (β) το φθινόπωρο του 2004 και (γ) την άνοιξη του (δ-στ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) (δ) το καλοκαίρι του 2004, (ε) το φθινόπωρο του 2004 και (στ) την άνοιξη του x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 20. Lipofuscin histochemistry in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis. (α-γ) Digestive tubules of mussels collected from Aggelochorion (α) in summer 2004, (β) in autumn 2004 and (γ) in spring (δ-στ) Digestive tubules of mussels collected from Olympiada (reference station) (δ) in summer 2004, (ε) in autumn 2004 and (στ) in spring x, L: digestive tubule lumen Στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (Εικ. 20δστ), η ποσότητα της λιποφουσκίνης ήταν µικρότερη, σε σχέση µε αυτή των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο (Εικ. 20α-γ). Την περίοδο του καλοκαιριού 2004 τα πεπτικά κύτταρα των µυδιών της Ολυµπιάδας δεν εµφάνισαν σχεδόν καθόλου κοκκία λιποφουσκίνης (Εικ. 20δ), ενώ την περίοδο του φθινοπώρου 2004 (Εικ. 20ε) και της άνοιξης 2005 (Εικ. 20στ) η συσσώρευση των λιποφουσκινών ήταν αυξηµένη. 86

99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Οι παραπάνω µορφολογικές αλλαγές των λιποφουσκινών επιβεβαιώθηκαν και µε τις µορφοµετρικές αλλαγές των κόκκων λιποφουσκίνης, οι οποίες εκτιµήθηκαν µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis και τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density) και αριθµητική πυκνότητα (numerical density). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα ( ιάγρ. 13α), παρατηρήθηκαν στατιστικώς υψηλότερες τιµές της πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, σε σχέση µε τα µύδια της Ολυµπιάδας κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004 και της άνοιξης Κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004, η πυκνότητα όγκου των λιποφουσκινών στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο (µε εξαίρεση τα µύδια του Καλοχωρίου) ήταν ιδιαίτερα χαµηλή. Στατιστικώς σηµαντικές διαφοροποιήσεις παρατηρήθηκαν και µεταξύ των δειγµατοληπτικών σταθµών της ανατολικής και δυτικής πλευράς του Θερµαϊκού κόλπου ( ιάγρ. 13α). Επιπρόσθετα, η ανάλυση των αποτελεσµάτων έδειξε στατιστικώς σηµαντικές διαφορές της αριθµητικής πυκνότητας των λιποφουσκινών στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το σταθµό αναφοράς και αυτών που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου ( ιάγρ. 13β). Όσον αφορά τις εποχικές διακυµάνσεις ( ιάγρ. 14), παρατηρήθηκε στατιστικώς αυξηµένη πυκνότητα όγκου και αριθµητική πυκνότητα των λιποφουσκινών ( ιαγρ. 14α,β, αντίστοιχα) σε όλους σχεδόν τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του φθινοπώρου 2004 και της άνοιξης 2005, συγκριτικά µε τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού

100 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) Πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών µm3/µm3 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ (β) Αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών αριθµός/µm3 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ Φ ΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 13. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λιποφουσκινών» στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του (α) Πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών (β) Αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Duncan s test, P<0.05). Diagram 13. «Morphometrical alteratins» of lipofuscins» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring (α) Volume density of lipofuscins (β) Numerical density of lipofuscins. Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between the stations of Thermaikos gulf and the station of Olympiada in each sampling period (Duncan s test, P<0.05). 88

101 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) Πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών µm3/µm3 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη 0 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα (β) Αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών αριθµ ός/µm3 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 14. Εποχικές διαφοροποιήσεις των «µορφοµετρικών αλλαγών των λιποφουσκινών» στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του (α) Πυκνότητα όγκου των λιποφουσκινών (β) Αριθµητική πυκνότητα των λιποφουσκινών. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτών των παραµέτρων ανάµεσα στις περιόδους δειγµατοληψίας σε κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Duncan s test, P<0.05). Diagram 14. Seasonal variations of «morphometrical alterations of lipofuscins» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring (α) Volume density of lipofuscins (β) Numerical density of lipofuscins. Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences of these parameters between the sampling periods in each station of Thermaikos and Strymonikos gulf are indicated with asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). 89

102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 1.8. Μορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών M. galloprovincialis Η εκτίµηση των µορφολογικών αλλαγών του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων πραγµατοποιήθηκε σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis, έπειτα από ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση. Οι παράµετροι που εκτιµήθηκαν ήταν το «πάχος του επιθηλίου (ΜΕΤ)», ο «λόγος της ακτίνας του αγωγού των πεπτικών σωληναρίων προς το πάχος του επιθηλίου (MLR/MET)» και ο «λόγος του πάχους του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου (MET/MDR)». Πάχος επιθηλίου (MET) 0,04 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0,03 mm 0,02 0,01 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 15. Εκτίµηση του «πάχους του επιθηλίου» στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Duncan s test, P<0.05). Diagram 15. Evaluation of the «mean epithelial thickness (MET)» of the digestive tubules of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between the stations of Thermaikos gulf and the station of Olympiada in each sampling period (Duncan s test, P<0.05). 90

103 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Σύµφωνα µε τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων ( ιάγρ. 15), κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004 παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση του ΜΕΤ στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών που συλλέχθηκαν από το δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Αγγελοχωρίου και της Χαλάστρας, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς). Κατά την περίοδο του φθινοπώρου 2004, δε σηµειώθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτής της παραµέτρου ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου. Τέλος, κατά τη δειγµατοληπτική περιόδο της άνοιξης 2005, παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική αύξηση του ΜΕΤ στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα, τόσο σε σχέση µε τα µύδια των υπόλοιπων σταθµών του Θερµαϊκού κόλπου, όσο και σε σχέση µε τα µύδια της Ολυµπιάδας (σταθµός αναφοράς). Πάχος επιθηλίου (MET) 0,04 0,03 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη mm 0,02 0,01 0 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 16. Εποχικές διαφοροποιήσεις του «πάχους του επιθηλίου (ΜΕΤ)» στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτής της παραµέτρου ανάµεσα στις περιόδους δειγµατοληψίας σε κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Duncan s test, P<0.05). Diagram 16. Seasonal variations of the «mean epithelial thickness (ΜΕΤ)» of the digestive tubules of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences of this parameter between the sampling periods in each station of Thermaikos and Strymonikos gulf are indicated with asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). 91

104 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Εξετάζοντας τις εποχικές διαφοροποιήσεις του πάχους του επιθηλίου στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών ( ιάγρ. 16), στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µετρήθηκαν µόνο στα µύδια που συλλέχθηκαν από το σταθµό της Χαλάστρας. Συγκεκριµένα, παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση του ΜΕΤ των πεπτικών σωληναρίων το φθινόπωρο 2004 και στατιστικώς σηµαντική αύξηση του ΜΕΤ την άνοιξη 2005, σε σχέση µε το πάχος του επιθηλίου των µυδιών που συλλέχθηκαν το καλοκαίρι MLR/MET mm/mm 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ Φ ΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ ιάγραµµα 17. Εκτίµηση του λόγου MLR/MET στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Duncan s test, P<0.05). Diagram 17. Evaluation of the MLR/MET ratio in the digestive tubules of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between the stations of Thermaikos gulf and the station of Olympiada in each sampling period (Duncan s test, P<0.05). Όσον αφορά το λόγο MLR/MET ( ιάγρ. 17), στατιστικώς σηµαντική αύξηση του λόγου αυτού βρέθηκε στα µύδια που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα το φθινόπωρο 2004, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα. Κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο της άνοιξης 2005 παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική αύξηση του λόγου MLR/MET στα µύδια που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο 92

105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (µε εξαίρεση το σταθµό της Χαλάστρας), σε σχέση µε τα µύδια της Ολυµπιάδας. Τέλος, κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004 δεν καταδείχθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτής της παραµέτρου. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι τα µύδια του Θερµαϊκού κόλπου διαβιούν κάτω από συνθήκες «stress», σε αντίθεση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα, τα οποία ζουν σε καλύτερης ποιότητας περιβάλλον όπως αποδεικνύεται από τις τεχνικές. MLR/MET mm/mm 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 18. Εποχικές διαφοροποιήσεις του λόγου MLR/MET στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτής της παραµέτρου ανάµεσα στις περιόδους δειγµατοληψίας σε κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Duncan s test, P<0.05). Diagram 18. Seasonal variations of the MLR/MET ratio in the digestive tubules of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and spring Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences of this parameter between the sampling periods in each station of Thermaikos and Strymonikos gulf are indicated with asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). Εξετάζοντας τις εποχικές διαφοροποιήσεις του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 18) στατιστικώς υψηλότερη τιµή αυτού του λόγου παρατηρήθηκε κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του φθινοπώρου 2004 και της άνοιξης 2005, σε σχέση µε την περίοδο του καλοκαιριού 2004 στα µύδια που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς 93

106 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ του Θερµαϊκού κόλπου. Ο λόγος MLR/MET παρουσίασε στατιστικώς υψηλότερη τιµή στα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα (σταθµός αναφοράς) την περίοδο του φθινοπώρου 2004, σε σχέση µε τις περιόδους του καλοκαιριού 2004 και της άνοιξης Στην παρούσα µελέτη εκτιµήθηκε και ο λόγος MET/MDR σε κρυοτοµές των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων ( ιάγρ. 19) έδειξε σηµαντικές διαφορές του λόγου αυτού µόνο στα µύδια που συλλέχθηκαν την περίοδο του καλοκαιριού Συγκεκριµένα παρατηρήθηκε µείωση του λόγου MET/MDR στα µύδια που συλλέχθηκαν από το δειγµατοληπτικό σταθµό του Αγγελοχωρίου, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα και την Ολυµπιάδα. MET/MDR mm/mm 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ Φ ΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 19. Εκτίµηση του λόγου ΜΕΤ/MDR στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο (Duncan s test, P<0.05). Diagram 19. Evaluation of the MET/MDR ratio in the digestive tubules of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between the stations of Thermaikos gulf and the station of Olympiada in each sampling period (Duncan s test, P<0.05). 94

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Όσον αφορά στις εποχικές διακυµάνσεις του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 20), δεν δείχθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτής της παραµέτρου στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου (µε εξαίρεση τα µύδια της Χαλάστρας) κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών περιόδων. MET/MDR mm/mm 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα ιάγραµµα 20. Εποχικές διαφοροποιήσεις του λόγου MET/MDR στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τέσσερις δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και ένα σταθµό του Στρυµονικού κόλπου (Ολυµπιάδα, σταθµός αναφοράς) το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές αυτής της παραµέτρου ανάµεσα στις περιόδους δειγµατοληψίας σε κάθε σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου παρουσιάζονται µε αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια (Duncan s test, P<0.05). Diagram 20. Seasonal variations of the MET/MDR ratio in the digestive tubules of mussels M. galloprovincialis collected from four sampling stations of Thermaikos and one station of Strymonikos gulf (Olympiada, reference area) in summer and autumn 2004 and in spring Values are expressed as means ± S.D. The statistical significant differences of this parameters between the sampling periods in each station of Thermaikos and Strymonikos gulf are indicated with asterisks in the upper triangular matrixes (Duncan s test, P<0.05). 95

108 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 1.9. Στατιστική συσχέτιση µεταξύ των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων ρύπανσης που εφαρµόστηκαν σε ιστούς των µυδιών M. galloprovincialis κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών περιόδων Η χρησιµοποίηση των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων ρύπανσης και η µελέτη των αποκρίσεών τους στον πεπτικό αδένα των µυδιών µπορεί να δώσει χρήσιµα συµπεράσµατα για την απόκριση των οργανισµών σε συνθήκες περιβαλλοντικού «stress». Συγκεκριµένα, από τη µελέτη των τιµών και των διακυµάνσεων που παρουσιάσαν οι βιοµάρτυρες στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005 διαπιστώθηκαν σηµαντικές γραµµικές συσχετίσεις που ισχυροποιούν την επιλογή τους ως αξιόπιστα εργαλεία για τη βιοπαρακολούθηση της θαλάσσιας ρύπανσης. Για τη γραµµική συσχέτιση των βιοµαρτύρων κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004 χρησιµοποιήθηκαν οι µέσοι όροι των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών αυτή την εποχή και η στατιστική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε µε το Pearson s test (P<0.05). Τα αποτελέσµατα της συσχέτισης που φαίνονται στον πίνακα 10 έδειξαν τις παρακάτω γραµµικές συσχετίσεις των βιοµαρτύρων κατά την περίοδο του καλοκαιριού 2004: Ισχυρή θετική συσχέτιση (r=+1,00) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF)» και της «αριθµητικής πυκνότητας των λιποφουσκινών (NvLPF)» ( ιάγρ. 21α). Θετική συσχέτιση (r=+0,94) µεταξύ της «αριθµητικής πυκνότητας των ουδέτερων λιπιδίων (NvNL)» και της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεβράνης (LMS)» ( ιάγρ. 21β). Θετική συσχέτιση (r=+0,90) µεταξύ της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και της «δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)» ( ιάγρ. 21γ). Θετική συσχέτιση (r=+0,93) µεταξύ της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» και του «πάχους του επιθηλίου (ΜET) ( ιάγρ. 21δ). Θετική συσχέτιση (r=+0,96) µεταξύ του «πάχους του επιθηλίου (ΜΕΤ)» και του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 21ε). 96

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Πίνακας 10. Στατιστική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν το καλοκαίρι του Οι τιµές µε τα έντονα γράµµατα δείχνουν τη στατιστικώς σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων (Pearson s test, P<0.05). Table 10. Correlation analysis among the biomarkers evaluated in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected in summer The bold values show the statistically significant correlation among the biomarkers used (Pearson test, P<0.05). VvNL NvNL VvLPF NvLPF VvLYS NvLYS LMS NRR MT AChE MET MLR/MET MET/MDR VvNL 1,00 0,23-0,57-0,51-0,81 0,25 0,81 0,65-0,70 0,56 0,38-0,45 0,16 NvNL 1,00 0,34 0,35-0,20 0,94 0,45 0,68 0,08 0,17 0,78 0,33 0,85 VvLPF 1,00 1,00 0,85 0,33-0,50-0,45 0,49-0,55-0,21 0,73 0,06 NvLPF 1,00 0,82 0,33-0,49-0,43 0,48-0,58-0,19 0,76 0,07 VvLYS 1,00-0,18-0,80-0,84 0,53-0,66-0,61 0,58-0,37 NvLYS 1,00 0,59 0,57-0,18 0,41 0,59 0,08 0,65 LMS 1,00 0,74-0,79 0,90 0,47-0,65 0,29 NRR 1,00-0,21 0,48 0,93-0,17 0,80 MT 1,00-0,85 0,15 0,85 0,35 AChE 1,00 0,19-0,87 0,00 ΜET 1,00 0,16 0,96 MLR/MET 1,00 0,39 MET/MDR 1,00 VvNL, πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων; NvNL, αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων; VvLPF, πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών; NvLPF, αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών; VvLYS, πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων; NvLYS, αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων; LMS, σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης; NRR, κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό; MT, συγκέντρωση µεταλλοθειονινών; AChE, δραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης; MET, πάχος επιθηλίου; MLR/MET, λόγος της ακτίνας του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου; MET/MDR: λόγος του πάχους του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου VvNL, volume density of neutral lipids; NvNL, numerical density of neutral lipids; VvLPF, volume density of lipofuscins; NvLPF, numerical density of lipofuscins; VvLYS, volume density of lysosomes; NvLYS, numerical density of lysosomes; LMS, lysosomal membrane stability; NRR, neutral red retention assay; MT, metallothionein content; AChE, acetylcholinesterase activity; MET, mean epithelial thickness; MLR/MET, ratio of mean luminal radius to mean epithelial thickness; MET/MDR, ratio of mean epithelial thickness to diverticular radius 97

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ NvLPF Scatterplot: V vlpf vs. N vlpf (Casewise MD deletion) (α) NvLPF =, ,18596 * VvLPF Correlation: r =, ,030 0,028 0,026 0,024 0,022 0,020 0,018 0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000-0,002-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 VvLPF 95% confidence Scatterplot: N vnl vs. N vlys (Casewise MD deletion) NDLYS =, ,5478 * NDLP Correlation: r =,93679 (β) NDLYS 0,028 0,026 0,024 0,022 0,020 0,018 0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 NvNL 95% confidence (γ) Scatterplot: LMS vs. ACHE 150 (Casewise MD deletion) ACHE = 68, ,2752 * LMS Correlation: r =,89536 Scatterplot: NRR vs. MET (δ) 0,017 (Casewise MD deletion) DET =, ,43E-3 * NRR Correlation: r =, , , ,014 ACHE 110 MET 0, , , , LMS 95% confidence 0, NRR 95% confidence (ε) 0,016 Scatterplot: MET/MDR vs. MET (Casewise MD deletion) MET = -,0023 +,03047 * MET/MDR Correlation: r =, ,015 0,014 MET 0,013 0,012 0,011 0,010 0,009 0,38 0,40 0,42 0,44 0,46 0,48 0,50 0,52 0,54 0,56 0,58 MET/MDR 95% confidence ιάγραµµα 21. Γραφικές παραστάσεις των συντελεστών συσχέτισης µεταξύ των βιοµαρτύρων κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004 (Pearson s test, P<0.05). Diagram 21. Graphs of correlation coefficients between the biomarkers used in the sampling period of summer 2004 (Pearson s test, P<0.05). 98

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Για τη γραµµική συσχέτιση των βιοµαρτύρων τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004 χρησιµοποιήθηκαν οι µέσοι όροι των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών αυτή την εποχή και η στατιστική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε µε το Pearson s test (P<0.05). Τα αποτελέσµατα της συσχέτισης που φαίνονται στον πίνακα 11 έδειξαν τις παρακάτω γραµµικές συσχετίσεις κατά την περίοδο του φθινοπώρου 2004: Ισχυρή θετική συσχέτιση (r=+1,00) µεταξύ «της αριθµητικής πυκνότητας των ουδέτερων λιπιδίων (NvNL)» και «της αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων (NvLYS)» ( ιάγρ. 22α). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,91) µεταξύ της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 22β). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,88) µεταξύ του «πάχους του επιθηλίου (MET)» και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 22γ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,96) µεταξύ του λόγου MET/MDR και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 22δ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,91) µεταξύ της «αριθµητικής πυκνότητας των ουδέτερων λιπιδίων (NvNL)» και του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 22ε). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,91) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων (NvLYS)» και του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 22στ) 99

112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Πίνακας 11. Στατιστική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν το φθινόπωρο του Οι τιµές µε τα έντονα γράµµατα δείχνουν τη στατιστικώς σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων (Pearson s test, P<0.05). Table 11. Correlation analysis among the biomarkers evaluated in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected in autumn The bold values show the statistically significant correlation among the biomarkers used (Pearson test, P<0.05). VvNL NvNL VvLPF NvLPF VvLYS NvLYS LMS NRR MT AChE MET MLR/MET MET/MDR VvNL 1,00-0,30 0,30-0,26-0,36-0,29-0,75-0,34 0,59 0,32-0,19 0,25 0,01 NvNL 1,00 0,03 0,44-0,42 1,00-0,12-0,77-0,67 0,01-0,81 0,82-0,91 VvLPF 1,00-0,77-0,14-0,04-0,26-0,05 0,60 0,85 0,00 0,35-0,34 NvLPF 1,00 0,24 0,44-0,20-0,45-0,53-0,87-0,23 0,12-0,10 VvLYS 1,00-0,43 0,05 0,45 0,37-0,57 0,83-0,62 0,60 NvLYS 1,00-0,12-0,77-0,68 0,01-0,82 0,82-0,91 LMS 1,00 0,70-0,47-0,00 0,28-0,53 0,28 NRR 1,00 0,24-0,01 0,83-0,91 0,81 MT 1,00 0,31 0,55-0,24 0,40 AChE 1,00-0,24 0,37-0,39 MET 1,00-0,88 0,86 MLR/MET 1,00-0,96 MET/MDR 1,00 VvNL, πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων; NvNL, αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων; VvLPF, πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών; NvLPF, αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών; VvLYS, πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων; NvLYS, αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων; LMS, σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης; NRR, κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό; MT, συγκέντρωση µεταλλοθειονινών; AChE, δραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης; MET, πάχος επιθηλίου; MLR/MET, λόγος της ακτίνας του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου; MET/MDR: λόγος του πάχους του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου VvNL, volume density of neutral lipids; NvNL, numerical density of neutral lipids; VvLPF, volume density of lipofuscins; NvLPF, numerical density of lipofuscins; VvLYS, volume density of lysosomes; NvLYS, numerical density of lysosomes; LMS, lysosomal membrane stability; NRR, neutral red retention assay; MT, metallothionein content; AChE, acetylcholinesterase activity; MET, mean epithelial thickness; MLR/MET, ratio of mean luminal radius to mean epithelial thickness; MET/MDR, ratio of mean epithelial thickness to diverticular radius 100

113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Scatterplot: N vnl vs. N vlys (α) 0,14 (Casewise MD deletion) NDLYS =, ,64696 * NDLP Correlation: r =,99989 Scatterplot: NRR vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) (β) 1,8 MLR/MET = 1,9345 -,0245 * NRR Correlation: r = -,9126 0,12 1,7 0,10 1,6 NvLYS 0,08 0,06 MLR/MET 1,5 1,4 0,04 1,3 0,02 1,2 0,00 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 NvNL 95% confidence 1, NRR 95% confidence (γ) Scatterplot: MET vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) 1,8 MLR/MET = 3, ,2 * MET Correlation: r = -,8805 Scatterplot: MET/MDR vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) (δ) MLR/MET = 3,8829-5,619 * MET/MDR Correlation: r = -,9590 1,8 1,7 1,7 1,6 1,6 MLR/MET 1,5 1,4 MLR/MET 1,5 1,4 1,3 1,3 1,2 1,2 1,1 0,0094 0,0098 0,0102 0,0106 0,0110 0,0114 0,0118 0,0122 0,0126 0,0096 0,0100 0,0104 0,0108 0,0112 0,0116 0,0120 0,0124 MET 95% confidence 1,1 0,36 0,38 0,40 0,42 0,44 0,46 0,48 MET/MDR 95% confidence Scatterplot: N vnl vs. MET/MDR (Casewise MD deletion) (ε) 0,48 MET/MDR =, ,4760 * NDLP Correlation: r = -,9081 Scatterplot: N vlys vs. MET/MDR (Casewise MD deletion) MET/MDR =, ,7368 * NDLYS Correlation: r = -,9095 (στ) 0,48 0,46 0,46 0,44 0,44 MET/MDR 0,42 0,40 MET/MDR 0,42 0,40 0,38 0,38 0,36 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 NvNL 95% confidence 0,36 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 NvLYS 95% confidence ιάγραµµα 22. Γραφικές παραστάσεις των συντελεστών συσχέτισης µεταξύ των βιοµαρτύρων κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004 (Pearson s test, P<0.05). Diagram 22. Graphs of correlation coefficients between the biomarkers used in the sampling period of autumn 2004 (Pearson s test, P<0.05). 101

114 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Για τη γραµµική συσχέτιση των βιοµαρτύρων κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο της άνοιξης 2005, χρησιµοποιήθηκαν οι µέσοι όροι των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών αυτή την εποχή και η στατιστική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε µε το Pearson s test (P<0.05). Τα αποτελέσµατα της συσχέτισης φαίνονται στον πίνακα 12, σύµφωνα µε τα οποία βρέθηκαν οι παρακάτω γραµµικές συσχετίσεις των βιοµαρτύρων κατά την περίοδο της άνοιξης 2005: Θετική συσχέτιση (r=+0,97) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των ουδέτερων λιπιδίων (VvNL)» και της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF)» ( ιάγρ. 23α). Θετική συσχέτιση (r=+0,92) µεταξύ της «αριθµητικής πυκνότητας των λιποφουσκινών (NvLPF)» και της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» ( ιάγρ. 23β). Θετική συσχέτιση (r=+0,88) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των ουδέτερων λιπιδίων (VvNL)» και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 23γ). Θετική συσχέτιση (r=+0,95) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF)» και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 23δ). Θετική συσχέτιση (r=+0,89) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων (VvLYS)» και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 23ε). Θετική συσχέτιση (r=+0,97) µεταξύ της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 23στ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,94) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των ουδέτερων λιπιδίων (VvNL)» και της «αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων (NvLYS)» ( ιάγρ. 23ζ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,88) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF)» και της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» ( ιάγρ. 23η). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,96) µεταξύ του λόγου MET/MDR και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 23θ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,92) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF)» και του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 23ι). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,92) µεταξύ της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 23κ). 102

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Πίνακας 12. Στατιστική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν την άνοιξη του Οι τιµές µε τα έντονα γράµµατα δείχνουν τη στατιστικώς σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων (Pearson s test, P<0.05). Table 12. Correlation analysis among the biomarkers evaluated in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected in spring The bold values show the statistically significant correlation among the biomarkers used (Pearson test, P<0.05) VvNL NvNL VvLPF NvLPF VvLYS NvLYS LMS NRR MT AChE MET MLR/MET MET/MDR VvNL 1,00-0,68 0,97-0,63 0,60-0,94-0,72-0,08 0,41 0,19-0,54 0,88-0,79 NvNL 1,00-0,69 0,72-0,81 0,39 0,66 0,05-0,60-0,75 0,01-0,76 0,61 VvLPF 1,00-0,76 0,71-0,87-0,88 0,13 0,21 0,15-0,35 0,95-0,92 NvLPF 1,00-0,69 0,41 0,92-0,20-0,09-0,15-0,31-0,76 0,80 VvLYS 1,00-0,38-0,84 0,53 0,06 0,61 0,07 0,89-0,84 NvLYS 1,00 0,57 0,08-0,25 0,07 0,72-0,75 0,69 LMS 1,00-0,47 0,10-0,14-0,12-0,92 0,97 NRR 1,00-0,79-0,03 0,34 0,34-0,50 MT 1,00 0,59-0,38 0,13 0,11 AChE 1,00 0,00 0,34-0,13 MET 1,00-0,23 0,09 MLR/MET 1,00-0,96 MET/MDR 1,00 VvNL, πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων; NvNL, αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων; VvLPF, πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών; NvLPF, αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών; VvLYS, πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων; NvLYS, αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων; LMS, σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης; NRR, κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό; MT, συγκέντρωση µεταλλοθειονινών; AChE, δραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης; MET, πάχος επιθηλίου; MLR/MET, λόγος της ακτίνας του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου; MET/MDR: λόγος του πάχους του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου VvNL, volume density of neutral lipids; NvNL, numerical density of neutral lipids; VvLPF, volume density of lipofuscins; NvLPF, numerical density of lipofuscins; VvLYS, volume density of lysosomes; NvLYS, numerical density of lysosomes; LMS, lysosomal membrane stability; NRR, neutral red retention assay; MT, metallothionein content; AChE, acetylcholinesterase activity; MET, mean epithelial thickness; MLR/MET, ratio of mean luminal radius to mean epithelial thickness; MET/MDR, ratio of mean epithelial thickness to diverticular radius 103

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ VDLF (α) 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 Scatterplot: VvN L vs. V v LPF (Casewise MD deletion) VDLF_70 = -, ,3783 * VDLP Correlation: r =,96506 (β) LMS Scatterplot: N vlpf vs. LMS (Casewise MD deletion) LMS = -5, ,5 * NDLF_70 Correlation: r =, ,00 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 0,36 0,38 VDLP 95% confidence (γ) 1,6 1,5 Scatterplot: VvNL vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) MLR/MET =, ,6683 * VDLP Correlation: r =, ,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 0,018 NvLPF 95% confidence Scatterplot: V vlpf vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) MLR/MET =, ,0215 * VDLF Correlation: r =,95346 (δ) 1,5 1,4 MLR/MET 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 MLR/MET 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 0,36 0,38 VDLP 95% confidence 0,7 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 VDLF 95% confidence (ε) 1,5 Scatterplot: VvLYS vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) MLR/MET =, ,2795 * VD_LYS Correlation: r =,88697 Scatterplot: LMS vs. MET/MDR (Casewise MD deletion) MET/MDR =, ,00710 * LMS Correlation: r =,96965 (στ) 0,60 1,4 0,58 1,3 0,56 MLR/MET 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7-0,02 0,02 0,06 0,10 0,14 0,18 0,22 0,26 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 (ζ) 0,026 VD_LYS 95% confidence Scatterplot: VvNL vs. NvLYS (Casewise MD deletion) ND_LYS =, ,0502 * VDLP Correlation: r = -,9372 MET/MDR 0,54 0,52 0,50 0,48 0,46 0, (η) 0,026 LMS Scatterplot: VvLPF vs. LMS (Casewise MD deletion) LMS =, ,0330 * VDLF Correlation: r = -, % confidence 0,024 0,024 0,022 0,022 NvLYS 0,020 0,018 LMS 0,020 0,016 0,018 0,014 0,016 0,012 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 0,36 0,38 0,014 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 VvN L 95% confidence VvLPF 95% confidence 104

117 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ MLR/MET Scatterplot: MET/MDR vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) (θ) 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 MLR/MET = 3,6911-5,075 * MET/MDR Correlation: r = -,9635 0,7 0,44 0,46 0,48 0,50 0,52 0,54 0,56 0,58 0,60 MET/MDR 95% confidence MET/MDR (ι) Scatterplot: VvLPF vs. MET/MDR (Casewise MD deletion) 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 0,50 0,48 0,46 0,44 MET/MDR =, ,3697 * VDLF Correlation: r = -,9186 0,42 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 VvLPF 95% confidence (κ) MLR/MET Scatterplot: LMS vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) MLR/MET = 1,4763 -,0353 * LMS Correlation: r = -,9166 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0, LMS 95% confidence ιάγραµµα 23. Γραφικές παραστάσεις των συντελεστών συσχέτισης µεταξύ των βιοµαρτύρων κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο της άνοιξης 2005 (Pearson s test, P<0.05). Diagram 23. Graphs of correlation coefficients between the biomarkers used in the sampling period of spring 2005 (Pearson s test, P<0.05). Για τη συνολική γραµµική συσχέτιση των βιοµαρτύρων κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους χρησιµοποιήθηκαν οι µέσοι όροι των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών και η στατιστική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε µε το Pearson s test (P<0.05). Τα αποτελέσµατα της συσχέτισης φαίνονται στον πίνακα 13, σύµφωνα µε τα οποία οι σηµαντικότερες γραµµικές συσχετίσεις των βιοµαρτύρων που βρέθηκαν κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους ήταν οι εξής: 105

118 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Θετική συσχέτιση (r=+0,71) µεταξύ της «συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών (ΜΤ) και της «δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)» ( ιάγρ. 24α). Θετική συσχέτιση (r=+0,62) µεταξύ της «αριθµητικής πυκνότητας των λιποφουσκινών (NvLPF) και της «θερµοκρασίας του νερού (TEMΡ)» ( ιάγρ. 24β). Θετική συσχέτιση (r=+0,72) µεταξύ της «αριθµητικής πυκνότητας των ουδέτερων λιπιδίων (NvNL) και της «θερµοκρασίας του νερού (TEMΡ)» ( ιάγρ. 24γ). Θετική συσχέτιση µεταξύ (r=+0,55) της «αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων (NvLYS)» και του «πάχους του επιθηλίου (MET) ( ιάγρ. 24δ). Θετική συσχέτιση (+0,89) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF) και του λόγου MLR/MET ( ιάγρ. 24ε). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,69) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων (VvLYS)» και της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» ( ιάγρ. 24στ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,63) µεταξύ της «θερµοκρασίας του νερού (ΤΕΜΡ) και της «συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών (MT)» ( ιάγρ. 24ζ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,85) µεταξύ της «θερµοκρασίας του νερού (ΤΕΜΡ)» και της «δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)» ( ιάγρ. 24η). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,63) µεταξύ της «πυκνότητας όγκου των λιποφουσκινών (VvLPF)» και του λόγου ΜΕΤ/MDR ( ιάγρ. 24θ). Αρνητική συσχέτιση (r=-0,74) µεταξύ του λόγου MLR/MET και του λόγου MET/MDR ( ιάγρ. 24ι). 106

119 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Πίνακας 13. Συνολική στατιστική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στα µύδια M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι τιµές µε τα έντονα γράµµατα δείχνουν τη στατιστικώς σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων (Pearson s test, P<0.05). Table 13. Total correlation analysis among the biomarkers evaluated in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis collected in summer and autumn 2004 and in spring The bold values show the statistically significant correlation among the biomarkers used (Pearson test, P<0.05). VvNL NvNL VvLPF NvLPF VvLYS NvLYS LMS NRR TEMP MT AChE MET MLR/MET MET/MDR VvNL 1,00 0,18 0,48-0,22 0,16-0,09-0,09 0,00-0,21 0,16 0,31-0,07 0,08 0,00 NvNL 1,00 0,38 0,59 0,16-0,09 0,32 0,26 0,72-0,38-0,56-0,24 0,41-0,10 VvLPF 1,00 0,40 0,19-0,03-0,37 0,02 0,02 0,25 0,03-0,22 0,89-0,63 NvLPF 1,00 0,10-0,16 0,05-0,03 0,62-0,16-0,49-0,35 0,46-0,31 VvLYS 1,00 0,21-0,69-0,17-0,06 0,14 0,15-0,01 0,06-0,21 NvLYS 1,00-0,13 0,39-0,04-0,26 0,17 0,55-0,05 0,23 LMS 1,00 0,36 0,20-0,21-0,07-0,10-0,34 0,31 NRR 1,00 0,16-0,45-0,11 0,17 0,11 0,01 TEMΡ 1,00-0,63-0,85-0,51 0,14-0,29 MT 1,00 0,71 0,11-0,24 0,37 AChE 1,00 0,44-0,04 0,20 DET 1,00 0,10 0,20 MLR/MET 1,00-0,74 MET/MDR 1,00 VvNL, πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων; NvNL, αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων; VvLPF, πυκνότητα όγκου λιποφουσκινών; NvLPF, αριθµητική πυκνότητα λιποφουσκινών; VvLYS, πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων; NvLYS, αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων; LMS, σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης; NRR, κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό; TEMP, θερµοκρασία νερού; MT, συγκέντρωση µεταλλοθειονινών; AChE, δραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης; MET, πάχος επιθηλίου; MLR/MET, λόγος της ακτίνας του αγωγού προς το πάχος του επιθηλίου; MET/MDR: λόγος του πάχους του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου VvNL, volume density of neutral lipids; NvNL, numerical density of neutral lipids; VvLPF, volume density of lipofuscins; NvLPF, numerical density of lipofuscins; VvLYS, volume density of lysosomes; NvLYS, numerical density of lysosomes; LMS, lysosomal membrane stability; NRR, neutral red retention assay; TEMP, water temperature; MT, metallothionein content; AChE, acetylcholinesterase activity; MET, mean epithelial thickness; MLR/MET, ratio of mean luminal radius to mean epithelial thickness; MET/MDR, ratio of mean epithelial thickness to diverticular radius 107

120 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ ACHE (α) Scatterplot: MT vs. AChE (Casewise MD deletion) ACHE = -22,53 +,36013 * MT Correlation: r =, (γ) MT 95% confidence Scatterplot: NDLP vs. TEMP (Casewise MD deletion) TEMP = 10, ,57 * NDLP Correlation: r =,72493 (β) NDLF_70 Scatterplot: TEMP vs. NDLF_70 (Casewise MD deletion) NDLF_70 = -,0342 +,00314 * TEMP Correlation: r =, ,040 0,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000-0, TEMP 95% confidence (δ) 0,028 0,026 0,024 Scatterplot: MET vs. NvLYS NDLYS =, ,51924 * DET Correlation: r =,55272 (Casewise MD deletion) TEMP ,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 0,018 0,020 NDLP 95% confidence NvLYS 0,022 0,020 0,018 0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,008 0,012 0,016 0,020 0,024 0,028 0,032 0,010 0,014 0,018 0,022 0,026 0,030 MET 95% confidence MLR/MET (ε) 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 Scatterplot: VvLPF vs. MLR/MET (Casewise MD deletion) MLR/MET =, ,1210 * VDLF Correlation: r =, ,6-0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 VvLPF 95% confidence LMS Scatterplot: VvLYS vs. LMS (Casewise MD deletion) LMS = 17,671-50,88 * VDLYS Correlation: r = -, ,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 VvLYS 95% confidence (στ) (ζ) Scatterplot: TEMP vs. MTS (Casewise MD deletion) MTS = 1064,2-41,80 * TEMP Correlation: r = -,5153 (η) Scatterplot: ACHE vs. TEMP (Casewise MD deletion) TEMP = 17,797 -,0190 * ACHE Correlation: r = -,7826 MTS 600 TEMP TEMP 95% confidence ACHE 95% confidence 108

121 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ MET/MDR Scatterplot: VvLPF vs. MET/MDR (Casewise MD deletion) (θ) 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 0,50 0,48 0,46 0,44 0,42 0,40 0,38 MET/MDR =, ,2945 * Vv LPF Correlation: r = -,6325 0,36-0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 VvLPF 95% confidence (ι) MET/MDR Scatterplot: MLR/MET vs. MET/MDR (Casewise MD deletion) 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 0,50 0,48 0,46 0,44 0,42 0,40 0,38 MET/MDR =, ,1435 * MLR/MET Correlation: r = -,7352 0,36 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 MLR/MET 95% confidence ιάγραµµα 24. Γραφικές παραστάσεις των συντελεστών συσχέτισης µεταξύ των βιοµαρτύρων κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους καλοκαίρι και φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005 (Pearson s test, P<0.05). Diagram 24. Graphs of correlation coefficients between the biomarkers used in summer and autumn 2004 and in spring 2005 (Pearson s test, P<0.05) ιαφοροποίηση των δειγµατοληπτικών σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου µε τη χρήση της ανάλυσης δενδρογράµµατος Βιοχηµικοί και κυτταρικοί βιοµάρτυρες εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα µυδιών που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου και από τη στατιστική ανάλυση των τιµών τους προκύπτουν σηµαντικά στοιχεία που σχετίζονται µε τη διαφοροποίηση των περιοχών ανάλογα µε την επιβάρυνσή τους. Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε στατιστική ανάλυση µε την οποία διαπιστώνεται η συγγένεια των σταθµών δειγµατοληψίας µε βάση τις µετρήσιµες τιµές κάθε παραµέτρου σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο. Επίσης, εκτιµήθηκε η συγγένεια των κυτταρικών και βιοχηµικών παραµέτρων που χρησιµοποιήθηκαν ως βιοµάρτυρες για την εκτίµηση των θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστηµάτων (Cluster analysis, STATISTICA package, Microsoft Co.). Συγκεκριµένα, η ανάλυση δενδρογράµµατος έδειξε σηµαντική διαφοροποίηση της Ολυµπιάδας, σε σχέση µε τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου κατά την περίοδο του καλοκαιριού 2004 ( ιάγρ. 25). Από τις περιοχές του 109

122 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Θερµαϊκού κόλπου την ίδια περίοδο παρατηρήθηκε σηµαντική διαφοροποίηση του Καλοχωρίου και του Αγγελοχωρίου, σε σχέση µε τις υπόλοιπες περιοχές του κόλπου. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σηµαντική διαφοροποίηση της Περαίας, σε σχέση µε τους υπόλοιπους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004 ( ιάγρ. 26). Ανάµεσα στις δειγµατοληπτικές περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου µεγαλύτερη συγγένεια παρουσίασαν οι περιοχές της Χαλάστρας και του Αγγελοχωρίου. Κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο της άνοιξης 2005 ( ιάγρ. 27), η ανάλυση δενδρογράµµατος, που βασίστηκε στις τιµές των βιοµαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών, κατέδειξε σαφή διαφοροποίηση της Ολυµπιάδας από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου. Μεταξύ των σταθµών του Θερµαϊκού κόλπου σηµαντική συγγένεια διαπιστώθηκε για τους σταθµούς της Περαίας και του Αγγελοχωρίου, καθώς επίσης και µεταξύ του Καλοχωρίου και της Χαλάστρας. Επιπρόσθετα, χρησιµοποιώντας τους µέσους όρους των βιοµαρτύρων από τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους, η ανάλυση δενδρογράµµατος έδειξε σηµαντική διαφοροποίηση της Ολυµπιάδας, σε σχέση µε τις περιοχές δειγµατοληψίας του Θερµαϊκού κόλπου ( ιάγρ. 28). Μεταξύ των περιοχών του Θερµαϊκού κόλπου µεγαλύτερη συγγένεια διαπιστώθηκε ανάµεσα στο Αγγελοχώρι και την Περαία, καθώς επίσης και ανάµεσα στους δειγµατοληπτικούς σταθµούς της Χαλάστρας και του Καλοχωρίου. Οι τιµές του βιοµάρτυρα «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» που προσδιορίστηκαν σε κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου χρησιµοποιήθηκαν από την ανάλυση δενδρογράµµατος, µε σκοπό της διαφοροποίηση των δειγµατοληπτικών σταθµών και τα αποτελέσµατα συνοψίζονται στο διάγραµµα 29. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα, σηµαντική διαφοροποίηση παρουσίασε η Ολυµπιάδα, σε σχέση µε τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου. Επίσης, από τις δειγµατοληπτικές περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, πολύ στενή συγγένεια παρουσίασαν οι σταθµοί του Αγγελοχωρίου και της Χαλάστρας, καθώς και οι σταθµοί της Περαίας και του Καλοχωρίου. 110

123 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ 2004 Complete Linkage Euclidean distances Olympiada Aggelochor Peraia Halastra Kalochorion 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Linkage Distance ιάγραµµα 25. ιαφοροποίηση των σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου σύµφωνα µε τις τιµές των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004, Joining (tree clustering). Diagram 25. Relationships among the station of Thermaikos and Strymonikos gulf according to the values of cellular and biochemical biomarkers evaluated in the digestive gland of mussels Μ. galloprovincialis in summer 2004, Joining (tree clustering). ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ 2004 Complete Linkage Euclidean distances Olympiada Kalochorion Aggelochor Halastra Peraia 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Linkage Distance ιάγραµµα 26. ιαφοροποίηση των σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου σύµφωνα µε τις τιµές των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του φθινοπώρου 2004, Joining (tree clustering). Diagram 26. Relationships among the station of Thermaikos and Strymonikos gulf according to the values of cellular and biochemical biomarkers used in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis, autumn 2004, Joining (tree clustering). 111

124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ ΑΝΟΙΞΗ 2005 Complete Linkage Euclidean distances Olympiada kalochorion Halastra Aggelochor Peraia 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 Linkage Distance ιάγραµµα 27. ιαφοροποίηση των σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου σύµφωνα µε τις τιµές των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο της άνοιξης 2005, Joining (tree clustering). Diagram 27. Relationships among the station of Thermaikos and Strymonikos gulf according to the values of cellular and biochemical biomarkers evaluated in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis, in spring 2005, Joining (tree clustering). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΩΝ 3 ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΠΤΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟ ΩΝ(καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005) Complete Linkage Euclidean distances Olympiada Aggelochor Peraia Kalochorion Halastra 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 Linkage Distance ιάγραµµα 28. ιαφοροποίηση των σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου σύµφωνα µε τις τιµές των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους, Joining (tree clustering). Diagram 28. Relationships among the station of Thermaikos and Strymonikos gulf according to the values of cellular and biochemical biomarkers used in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis in the three sampling periods, Joining (tree clustering). 112

125 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ LMS: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΩΝ 3 ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΠΤΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟ ΩΝ (καλοκαίρι 2004, φθινόπωρο 2004 και άνοιξη 2005) Complete Linkage Euclidean distances Olympiada Aggelochor Halastra Peraia Kalochorion 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Linkage Distance ιάγραµµα 29. ιαφοροποίηση των σταθµών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου σύµφωνα µε τις τιµές του βιοµάρτυρα «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» που εκτιµήθηκε στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους, Joining (tree clustering). Diagram 29. Relationships among the station of Thermaikos and Strymonikos gulf according to the values of biomarker «lysosomal membrane stability (LMS)» evaluated in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis in the three sampling periods, Joining (tree clustering) 113

126 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 2. Ποιοτική και ποσοτική εκτίµηση της ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου: µια ενοποιηµένη προσέγγιση βιοµαρτύρων µε τη χρήση δεικτών οικολογικής ποιότητας Η παρούσα ενότητα της διατριβής έχει ως κύριο στόχο την ενοποίηση όλων των βιοµαρτύρων ρύπανσης που εφαρµόστηκαν στην προηγούµενη ενότητα, εκτός από το βιοµάρτυρα «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» και τους λόγους. MLR/MET και MET/MDR, σε τρεις δείκτες οικολογικής ποιότητας: α) το δείκτη «Health Status Index (HIS)» που υπολογίζεται από το expert system β) το δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» που καταδεικνύει µόνο τις λυσοσωµικές αποκρίσεις του πεπτικού αδένα των µυδιών και γ) το µαθηµατικό δείκτη «Integrated Biomarker Response (IBR)». Ο παραπάνω στόχος, που αποσκοπεί στην ποσοτική και ποιοτική εκτίµηση των επιπέδων «stress» στο Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο, θα αποτελέσει ένα καινούργιο και σηµαντικό δεδοµένο στο πλαίσιο των προγραµµάτων βιοπαρακολούθησης των ελληνικών θαλάσσιων οικοσυστηµάτων. Επιπλέον, στην παρούσα ενότητα πραγµατοποιείται µια πιλωτική προσπάθεια για τον υπολογισµό του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης», ο οποίος συγκρίνεται µε τους παραπάνω δείκτες, µε σκοπό την αποτίµηση των επιπέδων «stress» στα ελληνικά θαλάσσια περιβάλλοντα Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τη χρήση του δείκτη «Health Status Index (HIS)» που υπολογίζεται από το expert system Οι µέσοι όροι των βιοµαρτύρων, οι οποίοι εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών, χρησιµοποιήθηκαν από το expert system και ενοποιήθηκαν µε σκοπό τον υπολογισµό του δείκτη «HIS» και την κατηγοριοποίηση των µυδιών σε ένα από τα τέσσερα επίπεδα ρύπανσης (Α-D). Είναι σηµαντικό να αναφερθεί ότι το πέµπτο επίπεδο (Ε) δεν καταδεικνύεται στους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς δεν εφαρµόστηκε βιοµάρτυρας από το επίπεδο του οργανισµού. Τα αποτελέσµατα από την εφαρµογή αυτού του συστήµατος φαίνονται στον πίνακα 14 και στην εικόνα

127 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Πίνακας 14. Αποτελέσµατα του δείκτη «HIS» για κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου το καλοκαίρι του 2004, το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Οι αστερίσκοι δείχνουν την επιβάρυνση των δειγµατοληπτικών σταθµών µε βαρέα µέταλλα. Table 14. Results of the index «HIS» for each of the sampling station of Thermaikos and Strymonikos gulf in summer and autumn 2004 and in spring The asterisks show the heavy metal contamination in the sampling stations. Περιοχή δειγµατοληψίας ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ Ολυµπιάδα A A A Αγγελοχώρι D B D Περαία D* C* D Καλοχώρι D* D D Χαλάστρα D* Β D Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα, τα µύδια που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο το καλοκαίρι 2004 και την άνοιξη 2005 παρουσίασαν υψηλά επίπεδα «stress» (επίπεδο D). Το φθινόπωρο 2004, τα µύδια που συλλέχθηκαν από το Αγγελοχώρι και τη Χαλάστρα παρουσίασαν χαµηλά επίπεδα «stress» (επίπεδο Β). Στα µύδια της Περαίας καταδείχθηκαν µέτρια επίπεδα «stress» (επίπεδο C) το φθινόπωρο 2004, ενώ τα µύδια από το σταθµό του Καλοχωρίου παρουσίασαν υψηλά επίπεδα «stress» (επίπεδο D) την ίδια εποχή. Σε όλες τις περιπτώσεις τα µύδια που συλλέχθηκαν από το δειγµατοληπτικό σταθµό της Ολυµπιάδας δε διαβιούν σε περιβάλλον µε συνθήκες «stress» (επίπεδο Α). Επιπρόσθετα, σύµφωνα µε τις τιµές της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών, το expert system έδειξε επιβάρυνση µε βαρέα µέταλλα στο σταθµό της Περαίας κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του καλοκαιριού 2004 και του φθινοπώρου 2004, καθώς επίσης και στους σταθµούς του Καλοχωρίου και της Χαλάστρας κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του καλοκαιριού 2004 (Πίν. 14, αστερίσκοι). 115

128 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Χαλάστρα HEALTH STATUS INDEX (HIS) Καλοχώρι Περαία Αγγελοχώρι Ολυµπιάδα D - High stress C - Medium stress B - Low stress A - Healthy Εικόνα 21. Χάρτης στον οποίο φαίνονται τα επίπεδα ρύπανσης των περιοχών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου (σε τετράβαθµη κλίµακα) σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο σύµφωνα µε το δείκτη «HIS». Οι κύκλοι από αριστερά προς τα δεξιά αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα ρύπανσης το καλοκαίρι 2004, το φθινόπωρο 2004 και την άνοιξη 2005, αντίστοιχα. Figure 21. Map showing the pollution levels of the stations located in Thermaikos and Strymonikos gulf (in fourlevel scale) for each sampling period according to «HIS». The circles from left to right correspond to the pollution levels in summer 2004, in autumn 2004 and in spring 2005, respectively. 2.2 Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τον υπολογισµό του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» Για τον υπολογισµό του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» χρησιµοποιήθηκαν οι τιµές των βιοµαρτύρων «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» και «πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων» που εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα (Πίν. 15), ο δειγµατοληπτικός σταθµός της Ολυµπιάδας εµφάνισε χαµηλά επίπεδα «stress» (0.5<LRI<1) και είναι λιγότερο επιβαρυµένος, σε σχέση µε τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου σε όλες της περιόδους δειγµατοληψίας (Εικ. 22). Όσον αφορά τις δειγµατοληπτικές περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, υψηλά επίπεδα περιβαλλοντικού «stress» (LRI> 2) καταδείχτηκαν το καλοκαίρι 2004 και την άνοιξη 2005, ενώ το φθινόπωρο 2004 βρέθηκαν µέτρια επίπεδα «stress» (1<LRI< 2) στο Αγγελοχώρι και τη Χαλάστρα και υψηλά επίπεδα «stress» (LRI> 2) στην Περαία και το Καλοχώρι. 116

129 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ Πίνακας 15. Αναλυτικές τιµές του δείκτη «LRI» για κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Table 15. Analytical values of the «LRI» for each sampling station of Thermaikos and Strymonikos gulf in summer and autumn 2004 and in spring Περιοχή δειγµατοληψίας ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ LRI LRI LRI Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0, , , , , , , , , , , , , , , LYSOSOMAL RESPONSE INDEX (LRI) Χαλάστρα Καλοχώρι Αγγελοχώρι Περαία Ολυµπιάδα > 2 High stress 1<LRI< 2 Medium stress 0,5<LRI<1 Low stress <0,5 Healthy Εικόνα 22. Χάρτης στον οποίο φαίνονται τα επίπεδα ρύπανσης των περιοχών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου (σε τετράβαθµη κλίµακα) σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο σύµφωνα µε το δείκτη «LRI». Οι κύκλοι από αριστερά προς τα δεξιά αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα ρύπανσης το καλοκαίρι 2004, το φθινόπωρο 2004 και την άνοιξη 2005, αντίστοιχα. Figure 22. Map which is showing the pollution levels of the stations located in Thermaikos and Strymonikos gulf (in four-level scale) for each sampling period according to «LRI». The circles from left to right correspond to the pollution levels in summer 2004, in autumn 2004 and in spring 2005, respectively. 117

130 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 2.3. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τον υπολογισµό του δείκτη «Integrated Biomarker Response (IBR)» Ο δείκτης «IBR», που υπολογίστηκε µε βάση τις αναλυτικές τιµές των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων ρύπανσης που εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis, παρουσιάζεται µε τη µορφή star plots στο διάγραµµα 30. Η πράσινη περιοχή στα star plots δείχνει την ενοποίηση των επτά βιοµαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό του δείκτη «IBR» για κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο. Οι τιµές IBR/n για κάθε σταθµό φαίνονται στον πίνακα 16. Πίνακας 16. Τιµές του IBR/n για κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Table 16. IBR/n for each sampling station of Thermaikos and Strymonikos gulf in summer and autumn 2004 and in spring Περιοχή δειγµατοληψίας ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΑΝΟΙΞΗ IBR IBR IBR Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα 0, , , , , , , , , , , , , , , Σύµφωνα µε τα star plots, µεγαλύτερη ενοποίηση των βιοµαρτύρων για τον υπολογισµό του δείκτη «IBR» καταδεικνύεται στα µύδια που συλλέχθηκαν από τους δειγµατοληπτικούς σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου σε όλες τις εποχές, σε σχέση µε αυτά που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα ( ιάγρ. 30). Αξίζει, επίσης, να σηµειωθεί ότι η ενοποίηση των βιοµαρτύρων για όλους τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου ήταν µικρότερη το φθινόπωρο 2004 ( ιάγρ. 30β) και υψηλότερη το καλοκαίρι 2004 ( ιάγρ. 30α) και την άνοιξη 2005 ( ιάγρ. 30γ). Οι τιµές IBR/n (Πίν. 16) ήταν υψηλότερες στα µύδια που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο, σε σχέση µε τις αντίστοιχες τιµές στα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα και στις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους. Ο σταθµός της Ολυµπιάδας (σταθµός αναφοράς) εµφανίστηκε να είναι ο λιγότερο επιβαρυµένος το καλοκαίρι 2004 και το φθινόπωρο Την άνοιξη 2005 η τιµή ΙBR/n στο σταθµό της Ολυµπιάδας (σταθµός 118

131 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ αναφοράς) ήταν µεγαλύτερη, σε σχέση µε τις αντίστοιχες τιµές των σταθµών του Καλοχωρίου και της Χαλάστρας. ιάγραµµα 30. Γραφικές παραστάσεις µε τη µορφή star plots που παρουσιάζουν την ενοποίηση των τιµών των επτά βιοµαρτύρων (LMS, VvLYS, VvNL, VvLPF, MET, MT, AChE), οι οποίοι χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό του δείκτη «IBR» στα µύδια M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό και Στρυµονικό κόλπο (α) το καλοκαίρι του 2004, (β) το φθινόπωρο του 2004 και (γ) την άνοιξη του Diagram 30. Star plots representing the integration of the values of seven biomarkers (LMS, VvLYS, VvNL, VvLPF, MET, MT, AChE) used to compute the «IBR» in mussels M. galloprovincialis collected from Thermaikos and Strymonikos gulf (α) in summer 2004 (β) in autumn 2004 and (γ) in spring

132 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ (α) ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ 2004 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS (β) ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ 2004 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS (γ) ΑΝΟΙΞΗ 2005 Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Καλοχώρι Χαλάστρα MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E MET VvLYS VvLPF MT AC h E VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS VvNL LMS 120

133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ 2.4. Εκτίµηση των επιπέδων ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου µε τον υπολογισµό του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης ( ΘΡ)» Οι αναλυτικές τιµές των κυτταρικών και βιοχηµικών βιοµαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη ενοποιήθηκαν µε τη χρήση µαθηµατικής µεθόδου (δες κεφάλαιο «Υλικά και Μέθοδοι») προκειµένου να υπολογιστεί ο «Πειραµατικός είκτης Θαλάσσιας Ρύπανσης ( ΘΡ)». Τα αποτελέσµατα από τη µαθηµατική αυτή προσέγγιση φαίνονται στον πίνακα 17. Πίνακας 17. Αναλυτικές τιµές του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης» για κάθε δειγµατοληπτικό σταθµό του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου το καλοκαίρι του 2004, το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του Table 17. Analytical values of the «Tentative Marine Pollution Index» for each sampling station of Thermaikos and Strymonikos gulf in summer 2004, autumn 2004 and spring Περιοχή δειγµατοληψίας Καλοκαίρι Φθινόπωρο Άνοιξη Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αγωγός Χαλάστρα 20 26,25 21,25 27,5 31,25 28, , ,75 31,25 33,75 26,25 28,75 25 Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του «Πειραµατικού είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης ( ΘΡ)» (Εικ. 23), τα µύδια που συλλέχθηκαν από το Θερµαϊκό κόλπο κατά τις τρεις δειγµατοληπτικές περιόδους παρουσίασαν µέτρια επίπεδα «stress» (πορτοκαλί χρώµα), µε εξαίρεση αυτά που συλλέχθηκαν από το Καλοχώρι και από τη Χαλάστρα την περίοδο της άνοιξης 2005, τα οποία διαβιούν σε περιβάλλον µε χαµηλά επίπεδα «stress» (κίτρινο χρώµα). Από την άλλη µεριά, τα µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα έδειξαν να ζουν σε περιβάλλον µε χαµηλά επίπεδα «stress» (κίτρινο χρώµα) κατά την περίοδο του καλοκαιριού 2004 και της άνοιξης 2005, ενώ κατά την περίοδο του φθινοπώρου 2004 τα επίπεδα «stress» ήταν αυξηµένα (πορτοκαλί χρώµα). 121

134 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕ ΙΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΕΙΚΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΑΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ Χαλάστρα Καλοχώρι Αγγελοχώρι Περαία Ολυµπιάδα High stress Medium stress Low stress Healthy Εικόνα 23. Χάρτης στον οποίο φαίνονται τα επίπεδα ρύπανσης των περιοχών του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου (σε τετράβαθµη κλίµακα) σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο σύµφωνα µε τον «Πειραµατικό είκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης». Οι κύκλοι από αριστερά προς τα δεξιά αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα ρύπανσης το καλοκαίρι 2004, το φθινόπωρο 2004 και την άνοιξη 2005, αντίστοιχα. Figure 23. Map which is showing the pollution levels of the stations located in Thermaikos and Strymonikos gulf (in four-level scale) for each sampling period according to «Tentative Marine Pollution Index». The circles from left to right correspond to the pollution levels in summer 2004, in autumn 2004 and in spring 2005, respectively. 122

135 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΜΕΡΟΣ Β: ΜΕΛΕΤΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 1. ιερεύνηση και καθιέρωση βιοµαρτύρων ρύπανσης σε ιστούς του µυδιού Μ. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε οργανικούς ρύπους Με σκοπό την ανίχνευση της διαφοροποίησης των «µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών που εκτέθηκαν σε οργανικούς ρύπους (0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων, 0.3 mg/lt λινδάνιο και 0.3 mg/lt 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ) και την καθιέρωση αυτής της παραµέτρου ως βιοµάρτυρα οργανικής ρύπανσης, πραγµατοποιήθηκε ιστοχηµεία των ουδέτερων λιπιδίων σε κρυοτοµές των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών M. galloprovincialis. Οι µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density, VvNL) και αριθµητική πυκνότητα (numerical density, NvNL) και συσχετίστηκαν στατιστικώς µε ήδη καθιερωµένους βιοµάρτυρες ρύπανσης, όπως είναι η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» και η «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό». Επιπρόσθετα, σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν και η διερεύνηση των γενοτοξικών αλλαγών που παρατηρούνται στα αιµοκύτταρα των µυδιών Μ. galloproncialis µετά από την έκθεσή τους σε οργανικούς ρύπους. Για την πραγµατοποίηση αυτής της διερεύνησης εφαρµόστηκε το τεστ «συχνότητα µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» στα αιµοκύτταρα των µυδιών Εκτίµηση των «µορφοµετρικών αλλαγών των ουδέτερων λιπιδίων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Η εφαρµογή της ιστοχηµείας των ουδέτερων λιπιδίων έδειξε ότι η πυκνότητα όγκου και η αριθµητική πυκνότητα των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών ήταν στατιστικώς υψηλότερη στα µύδια που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους (0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων, 0.3 mg/lt λινδάνιο και 0.3 mg/lt 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου 123

136 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ και αυτά που εκτέθηκαν σε 0.1 mg/lt ακετόνη ( ιάγρ. 31α). Επιπρόσθετα, τα αποτελέσµατα της παρούσας ενότητας της διατριβής έδειξαν σηµαντική µείωση της αριθµητικής πυκνότητας των ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών που εκτέθηκαν στο µίγµα των πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων ή στο λινδάνιο, σε σύγκριση µε την αριθµητική πυκνότητα των ουδέτερων λιπιδίων που εκτιµήθηκε στον πεπτικό αδένα των µυδιών που εκτέθηκαν στο 2,4 δίχλωροφαινοξυοξικό οξύ ( ιάγρ. 31β). (α) (β) 0,3 Πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων 0,04 Αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων µm3/µm3 0,2 0,1 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο αριθµ ός/µm3 0,03 0,02 0,01 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο ιάγραµµα 31. «Μορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων και 0.1 mg/lt ακετόνη για 15 ηµέρες. (α) πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων (β) αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων. Oι τιµές εκφράστηκαν ως Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι στα τρίγωνα δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στα µύδια ελέγχου και στα µύδια που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους. Duncan s τεστ (ANOVA, P <0.05). Control 0: µύδια µετά την περίοδο εγκλιµατισµού, Control 15: µύδια ελέγχου µετά από 15 ηµέρες, 2,4 D: 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ, PAH: µίγµα ανθρακενίου, φαινανθρενίου και ναφθαλενίου. Diagram 31. «Morphometrical alterations of neutral lipids» in the digestive cells of mussels M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants and 0.1 mg/lt acetone for 15 days (α) volume density of neutral lipids and (β) numerical density of neutral lipids. The values were expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the statistically significant differences between the control mussels and those exposed to organic pollutants. Duncan s test (ANOVA, P<0.05). Control 0: mussels after acclimatization, Control 15: control mussels after 15 days, 2,4 D: 2,4 dichlorophenoxy-acetic acid, PAH: mixture of phenanthrene, anthracene and naphthalin. 124

137 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Με σκοπό να επιβεβαιωθούν οι µορφοµετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων πραγµατοποιήθηκε παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο των κρυοτοµών του πεπτικού αδένα των µυδιών. Οι παρατηρήσεις έδειξαν µεγαλύτερη συσσώρευση ουδέτερων λιπιδίων στον πεπτικό αδένα των µυδιών που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους (πολυκυκλικοί αρωµατικοί υδρογονάνθρακες, λινδάνιο και 2,4 δίχλωροφαινοξυοξικό οξύ) (Εικ. 24β), σε σχέση µε αυτή που παρατηρήθηκε στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών ελέγχου και αυτών που εκτέθηκαν σε ακετόνη (Εικ. 24α). α β L L Εικόνα 24. Ιστοχηµεία ουδέτερων λιπιδίων σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων και 0.1 mg/lt ακετόνη για 15 ηµέρες. (α) Πεπτικό σωληνάριο µυδιού που εκτέθηκε σε 0.1 mg/lt ακετόνη µε περιορισµένη συσσώρευση ουδέτερων λιπιδίων. β) Πεπτικό σωληνάριο µυδιού που εκτέθηκε σε 0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων (φαινανθρένιο, ανθρακένιο, ναφθαλένιο) µε αυξηµένη συσσώρευση ουδέτερων λιπιδίων, σε σχέση µε τα µύδια που εκτέθηκαν σε ακετόνη. 2500x L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου. Figure 24. Neutral lipid histochemistry in the digestive gland cryosections of mussel M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants and to 0.1 mg/lt acetone for 15 days. (α) Digestive tubule of mussel exposed to 0.1 mg/lt acetone showing limited accumulation of neutral lipids. (β) Digestive tubule of mussel exposed to 0.3 mg/lt mixture of PAH (phenanthrene, anthracene, naphthalin) showing increased neutral lipids αψψθµθλατιον, in relation to mussels treated in acetone. 2500x, L: digestive tubule lumen Εκτίµηση της «συχνότητας µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» στα αιµοκύτταρα µυδιών M. galloprovincialis Με σκοπό την ανίχνευση των γενοτοξικών αλλαγών εφαρµόστηκε η τεχνική «συχνότητα µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» στα αιµοκύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis, έπειτα από την πειραµατική τους έκθεση σε οργανικούς ρύπους (0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων, 0.3 mg/lt λινδάνιο και 0.3 mg/lt 2,4-δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ). 125

138 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 5 (α) Συχνότητα µικροπυρήνων 2 (β) Συχνότητα δύο µικροπυρήνων ποσοστό ( ) ποσοστό ( ) 1 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο ποσοστό ( ) (γ) Συχνότητα δύο πυρήνων ποσοστό ( ) (δ) Συχνότητα µικροπυρήνων ενωµένων µε τον πυρήνα 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο ιάγραµµα 32. «Συχνότητα µικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωµαλιών» (ανά 1000 αιµοκύτταρα) σε αιµοκύτταρα µυδιών M.galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων και 0.1 mg/lt ακετόνη για 15 ηµέρες. (α) µικροπυρήνες, (β) κύτταρα µε δύο µικροπυρήνες, (γ) κύτταρα µε δύο πυρήνες και (δ) κύτταρα µε µικροπυρήνα ενωµένο µε τον πυρήνα. Καµία στατιστικώς σηµαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε ανάµεσα στα µύδια ελέγχου και στα µύδια που εκτέθηκαν στους ρύπους. Duncan s τεστ (ANOVA, P <0.05). Control 0: µύδια µετά την περίοδο εγκλιµατισµού, Control 15: µύδια ελέγχου µετά από 15 ηµέρες, 2,4 D: 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ, PAH: µίγµα ανθρακενίου, φαινανθρενίου και ναφθαλενίου. Diagram 32. «Micronuclei frequencies or other nuclear abnormalities» (per 1000 haemocytes) in the haemocytes of mussels M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants and to 0.1 mg/lt acetone for 15 days. (α) micronuclei, (β) cells with two micronuclei, (γ) binucleated cells and (δ) eightshaped cells. Values are expressed as means ± SD. No significant differences between pairs of mean values were indicated. Duncan s test (ANOVA, P<0,05). Control 0: mussels after acclimatization, Control 15: control mussels after 15 days, 2,4 D: 2,4 dichloro-phenoxyacetic acid, PAH: mixture of phenanthrene, anthracene and naphthalin. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων (Anova, Duncan s test) δεν έδειξε στατιστικώς σηµαντική διαφοροποίηση στην εµφάνιση των µικροπυρήνων ανάµεσα στα µύδια που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους και τα µύδια ελέγχου ή αυτά που εκτέθηκαν σε 0.1 mg/lt ακετόνη ( ιάγρ. 32α). Επιπρόσθετα, δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική διαφορά στη συχνότητα των κυττάρων µε δύο µικροπυρήνες 126

139 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ( ιάγρ. 32β), των κυττάρων µε δύο πυρήνες ( ιάγρ. 32γ) ή των κυττάρων µε µικροπυρήνες ενωµένους µε τον πυρήνα ( ιάγρ. 32δ) µεταξύ των µυδιών που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους και των µυδιών ελέγχου Εκτίµηση του χρόνου της «σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και του χρόνου της «κατακράτησης της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» Ο βιοµάρτυρας «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική τους έκθεση σε οργανικούς ρύπους (0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων, 0.3 mg/lt λινδάνιο και 0.3 mg/lt 2,4-δίχλωροφαινοξυοξικό οξύ). α β L L Εικόνα 25. Ιστοχηµεία για το ένζυµο N-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων και 0.1 mg/lt ακετόνη για 15 ηµέρες. (α) Πεπτικό σωληνάριο µυδιού που εκτέθηκε σε 0.1 mg/lt ακετόνη, όπου παρατηρούνται µικρά λυσοσώµατα (βέλος). (β) Πεπτικό σωληνάριο µυδιού που εκτέθηκε σε 0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων (φαινανθρένιο, ανθρακένιο, ναφθαλένιο), όπου παρατηρείται διόγκωση των λυσοσωµάτων (βέλος), σε σχέση µε τα µύδια που εκτέθηκαν σε ακετόνη. 2500x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου. Figure 25. Histochemistry for the enzyme N-acetyl-β-hexosaminidase in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of organic pollutants and to 0.1 mg/lt acetone for 15 days. (α) Digestive tubule of mussel exposed to 0.1 mg/lt acetone showing small lysosomes (arrow). (β) Digestive tubule of mussel exposed to 0.3 mg/lt mixture of PAH (phenanthrene, anthracene, naphthalin); the enlargement of enzyme reactive lysosomes (arrow) was greater, in relation to mussels exposed to acetone. 2500x, L: digestive tubule lumen. 127

140 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Οι παρατηρήσεις στο οπτικό µικροσκόπιο, µετά από ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση (Εικ. 25), αποκάλυψαν µεγάλο αριθµό λυσοσωµάτων και γενικά µικρότερα σε µέγεθος λυσοσώµατα στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών ελέγχου (Εικ. 25α) και αυτών που εκτέθηκαν σε 0.1 mg/lt ακετόνη (Εικ. 25β), συγκριτικά µε τα µύδια που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους. Επιπρόσθετα, µια άλλη σηµαντική παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο ήταν ο µικρός αριθµός και η διόγκωση των λυσοσωµάτων στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους, συγκρινόµενα µε τα λυσοσώµατα των µυδιών ελέγχου, τα οποία ήταν πολλά σε αριθµό και µικρότερα σε µέγεθος. min (α) Σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης min (β) Κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR) 0 0 Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο ιάγραµµα 33. (α) Χρόνοι της τεχνικής «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» στον πεπτικό αδένα µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων και 0.1 mg/lt ακετόνη για 15 ηµέρες. Στατιστικώς σηµαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν ανάµεσα στα µύδια ελέγχου και σε αυτά που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους (Mann-Whitney U-test, P <0.05). (β) Χρόνοι της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» στα αιµοκύτταρα των µυδιών που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρύπους. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές καταδεικνύονται µε τους αστερίσκους µέσα στα τριγωνάκια. Στα µύδια που εκτέθηκαν στο 2,4 D, η τυπική απόκλιση είναι µηδέν. (Duncan s test ANOVA, P < 0.05). Control 0: µύδια µετά την περίοδο εγκλιµατισµού, Control 15: µύδια ελέγχου µετά από 15 ηµέρες, 2,4 D: 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ, PAH: µίγµα ανθρακενίου, φαινανθρενίου και ναφθαλενίου. Diagram 33. (α) LMS values (min) in the digestive gland of mussels M galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants and to 0.1 mg/lt acetone for 15 days. Significant differences between pairs of mean values are shown between control mussels and those exposed to pollutants. (Mann Whitney U- test, P< 0.05). (β) NRR values (min) of mussel haemocytes exposed to organic pollutants. The significant differences between pairs of mean values are shown in the triangular matrix by asterisks. In the 2,4-D group the SD bar was zero. (Duncan s test, ANOVA, P<0.05). Control 0: mussels after acclimatization, Control 15: control mussels after 15 days, 2,4 D: 2,4 dichloro-phenoxyacetic acid, PAH: mixture of phenanthrene, anthracene and napthalin. 128

141 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων (Mann-Whitney U-test, p<0.05) έδειξε στατιστικώς χαµηλότερες τιµές του βιοµάρτυρα «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» στα µύδια που εκτέθηκαν στο 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ και στο λινδάνιο, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 33α). Επίσης, η ανάλυση των αποτελεσµάτων δε φανέρωσε στατιστικώς σηµαντική διαφοροποίηση των τιµών αυτού του βιοµάρτυρα ανάµεσα στα µύδια που δέχθηκαν την επίδραση των πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων και στα µύδια που εκτέθηκαν σε ακετόνη. Η εφαρµογή του βιοµάρτυρα «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (NRR)» που εκτιµήθηκε στα αιµοκύτταρα των µυδιών αποκάλυψε στατιστικώς υψηλότερους χρόνους της τεχνικής στα µύδια που εκτέθηκαν σε ακετόνη, σε σύγκριση µε αυτά που εκτέθηκαν στο µίγµα των πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων ή στο λινδάνιο ( ιάγρ. 33β). Επιπρόσθετα, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές στους χρόνους της τεχνικής «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό» ανάµεσα στα µύδια ελέγχου και σε αυτά που εκτέθηκαν στο 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ (Duncan s test, p< 0.05) Εκτίµηση των «µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα µυδιών M. galloprovincialis Η ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που δέχθηκαν την επίδραση οργανικών ρύπων (0.3 mg/lt µίγµατος πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων, 0.3 mg/lt λινδάνιο και 0.3 mg/lt 2,4 δίχλωροφαινοξυοξικό οξύ) σε συνθήκες εργαστηρίου. Οι «µορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density, VvLYS) και αριθµητική πυκνότητα (numerical density, NvLYS) των λυσοσωµάτων. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων άδειξε στατιστικώς υψηλότερη πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων στα µύδια που εκτέθηκαν στους πολυκυκλικούς αρωµατικούς υδρογονάνθρακες και στο 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ, συγκριτικά µε τα µύδια που εκτέθηκαν σε 0.1 mg/lt ακετόνη και στατιστικώς χαµηλότερη πυκνότητα όγκου στα µύδια που εκτέθηκαν στο λινδάνιο, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 34α). 129

142 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Όσον αφορά στην αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων, η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων φανέρωσε υψηλότερη τιµή αυτής της παραµέτρου στα µύδια που εκτέθηκαν σε ακετόνη, σε σχέση µε αυτά που δέχτηκαν την επίδραση των πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων ή του λινδάνιου ( ιάγρ. 34β). (α) (β) 0,4 Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων 0,02 Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων µm3/µm3 0,3 0,2 0,1 αριθµός/µm2 0, Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο Control 0 Control 15 Ακετόνη 2,4-D PAH Λινδάνιο ιάγραµµα 34. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων και 0.1 mg/lt ακετόνη για 15 ηµέρες. Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως (α) πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων και (β) αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων. Οι αστερίσκοι στα τρίγωνα δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στα µύδια ελέγχου και σε αυτά που εκτέθηκαν στους ρύπους. Οι µορφοµετρικές αλλαγές µετρήθηκαν µε το σύστηµα ανάλυσης εικόνας κάτω από το οπτικό µικροσκόπιο. Duncan s τεστ (ANOVA, P <0.05). Control 0: µύδια µετά την περίοδο εγκλιµατισµού, Control 15: µύδια ελέγχου µετά από 15 ηµέρες, 2,4 D: 2,4 δίχλωρο-φαινοξυοξικό οξύ, PAH: µίγµα ανθρακενίου, φαινανθρενίου και ναφθαλενίου. Diagram 34. «Morphometrical alterations of lysosomes» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants and to 0.1 mg/lt acetone for 15 days. The results were expressed as (α) volume density of lysosomes (β) numerical density of lysosomes. Values are expressed as means ± SD. The asterisks in the upper triangular matrixes indicate the significant differences between control and experimental groups. The lysosomes were measured under the light microscope using image analysis. Duncans test (ANOVA, P<0.05). Control 0: mussels after acclimatization, Control 15: control mussels after 15 days, 2,4 D: 2,4 dichloro-phenoxy-acetic acid, PAH: mixture of phenanthrene, anthracene and napthalin. 130

143 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 1.5. Στατιστική συσχέτιση των βιοµαρτύρων ρύπανσης που εφαρµόστηκαν σε ιστούς του µυδιού M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε οργανικούς ρύπους Με σκοπό την εκτίµηση της ευαισθησίας των βιοµαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα ενότητα της διατριβής, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης (correlation analysis) µεταξύ των βιολογικών παραµέτρων που εξετάστηκαν στους ιστούς των µυδιών M. galloprovincialis. Η στατιστική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων πραγµατοποιήθηκε µε το Pearson s test (Ρ<0.05) και τα αποτελέσµατα φαίνονται στον πίνακα 18. Πίνακας 18. Στατιστική συσχέτιση των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν σε ιστούς των µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων για 15 ηµέρες. Οι έντονες τιµές δείχνουν τη στατιστικώς σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των βιοµαρτύρων µε τη χρήση του Pearson s test (P<0.05). Table 18. Correlation analysis among the biomarkers used in tissues of mussels M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants for 15 days. The bold values show the statistically significant correlation among the biomarkers using the Pearson s test (P<0,05). LMS NRR VvNL NvNL VvLYS NvLYS MN TWO MN BIN EIGHTSH LMS NRR VvNL NvNL VvLYS NvLYS MN TWOΜ BIN EIGHTSH 1 VvNL, πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων; NvNL, αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων; MN, συχνότητα µικροπυρήνων; TWOMN, συχνότητα δύο µικροπυρήνων; BIN, συχνότητα κυττάρων µε δύο πυρήνες; EIGHTSH, κύτταρα µε µικροπυρήνα ενωµένο µε τον πυρήνα; NRR, κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό; LMS, σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης; VvLYS, πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων; NvLYS, αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων VvNL, volume density of neutral lipids; NvNL, numerical density of neutral lipids; MN, micronuclei frequency; TWOMN, two micronuclei frequency; BIN, binucleated cells frequency; EIGHTSH, eight-shaped cells frequency; NRR, neutral red retention assay; LMS, lysosomal membrane stability; VvLYS, volume density of lysosomes; NvLYS, numerical density of lysosomes 131

144 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ (α) NvNL Scatterplot: VvNL vs. NvNL (Casewise MD deletion) NvNL =,79E-4 +,11169 * V vnl Correlation: r =, ,022 0,020 0,018 0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000-0,002 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,02 0,06 0,10 0,14 0,18 (β) LMS 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 Scatterplot: VvNL vs. LMS (Casewise MD deletion) LMS = 7, ,67 * V v ΝL Correlation: r = -,8192 3,5 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,02 0,06 0,10 0,14 0,18 VvNL 95% confidence VvNL 95% confidence (γ) 8,0 Scatterplot: NvNL vs. LMS (Casewise MD deletion) LMS = 7, ,8 * N vnl Correlation: r = -,8653 7,5 7,0 6,5 LMS 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5-0,002 0,002 0,006 0,010 0,014 0,018 0,022 0,000 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 NvNL 95% confidence ιάγραµµα 35. Συντελεστές συσχέτισης µεταξύ των βιοµαρτύρων που εφαρµόστηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν σε 0.3 mg/lt οργανικών ρύπων για 15 ηµέρες (Pearson s test, P<0.05). VvNL, πυκνότητα όγκου ουδέτερων λιπιδίων; NvNL, αριθµητική πυκνότητα ουδέτερων λιπιδίων; LMS, σταθερότητα λυσοσωµικής µεµβράνης. Diagram 35. Correlation coefficients between the biomarkers applied in digestive gland of mussels M. galloprovincialis exposed to 0.3 mg/lt of various organic pollutants for 15 days (Pearson s test, P<0.05). VvNL, volume density of neutral lipids; NvNL, numerical density of neutral lipids; LMS, lysosomal membrane stability. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του πίνακα παρατηρήθηκαν οι παρακάτω γραµµικές συσχετίσεις µεταξύ των βιοµαρτύρων: θετική συσχέτιση (r= +0.97) µεταξύ του βιοµάρτυρα «πυκνότητα όγκου των ουδέτερων λιπιδίων (VvNL)» και «αριθµητική πυκνότητα των ουδέτερων λιπιδίων (NvNL)» ( ιάγρ. 35α). 132

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ αρνητική συσχέτιση (r= -0.97) µεταξύ του βιοµάρτυρα «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και «πυκνότητα όγκου των ουδέτερων λιπιδίων (VvNL)» ( ιάγρ. 35β). αρνητική συσχέτιση (r= -0.91) µεταξύ του βιοµάρτυρα «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» και «αριθµητική πυκνότητα των ουδέτερων λιπιδίων (NvNL)» ( ιάγρ. 35γ). 133

146 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 2. Συγκριτική µελέτη της συσσώρευσης και αποτοξικοποίησης του Cu (απαραίτητο µέταλλο) και του Hg (µη απαραίτητο µέταλλο) στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση αναλυτικών και ιστοχηµικών µεθόδων Χηµικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης των βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis Mύδια του είδους M. galloprovincialis εκτέθηκαν σε 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu και σε 0.16 mg/lt µίγµατος Hg και Cu (1:1) σε συνθήκες εργαστηρίου για 11 ηµέρες, µε σκοπό την εκτίµηση της συγκέντρωσης των απαραίτητων και µη απαραίτητων βαρέων µετάλλων στους ιστούς τους κατά τη διάρκεια της πειραµατικής έκθεσης και της περιόδου αποτοξικοποίησης. Μετά το πέρας της πειραµατικής έκθεσης τα µύδια µεταφέρθηκαν σε θαλασσινό νερό χωρίς βαρέα µέταλλα για 7 ηµέρες, προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η αποτοξικοποίησή τους. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε χηµικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης των βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µε τη µέθοδο της ατοµικής απορρόφησης. Τα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg εµφάνισαν στατιστικώς αυξηµένη συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 36α). Στα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης του Hg στον πεπτικό αδένα (η οποία ήταν σχεδόν ίδια µε τη συγκέντρωση του Hg στον πεπτικό αδένα των µυδιών ελέγχου), σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στον Hg. Από την άλλη µεριά, τα µύδια που εκτέθηκαν στον Ηg δεν εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική διαφορά της συγκέντρωσης του Hg στα βράγχια, συγκρινόµενα µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 36β). Σχετικά µε τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg, παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του Ηg στα βράγχια κατά τις 4 πρώτες ηµέρες της αποτοξικοποίησης, ενώ από την 4 η εώς την 7 η ηµέρα της αποτοξικοποίησης καταδείχθηκε σταδιακή µείωση της συγκέντρωσης του Hg ( ιάγρ. 36β). 134

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ (α) 8 Συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα Control Hg (β) 8 Συγκέντρωση Hg στα βράγχια Control Hg µg/g tissue Έκθεση Αποτοξικοποίηση µg/g tissue Έκθεση Αποτοξικοποίηση 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 36. Συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση της ατοµικής απορρόφησης. (α) Συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0,08 mg/lt Hg για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Συγκέντρωση Hg στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Mann-Whitney U-test, P <0.05). Diagram 36. Ηg concentration in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis using atomic absorption spectrophotometry. (α) Ηg concentration in the digestive gland of mussels after the exposure to 0.08 mg/lt Hg for 11 days and after 7 days of detoxification. (β) Ηg concentration in the gills of mussels after the exposure to 0.08 mg/lt Hg for 11 days and 7 days of detoxification. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the experimental exposure (Mann-Whitney U-test, P <0.05). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο Cu έδειξαν αυξοµείωση της συγκέντρωσης του Cu στον πεπτικό αδένα, τόσο κατά τη διάρκεια της πειραµατικής έκθεσης όσο και κατά τη διάρκεια της περιόδου της αποτοξικοποίησης ( ιάγρ. 37α). Η στατιστική ανάλυση που βασίστηκε στα αποτελέσµατα της ατοµικής απορρόφησης έδειξε ότι τα µύδια που εκτέθηκαν στο Cu εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της συγκέντρωση του Cu στα βράγχια, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 37β). Κατά τη διάρκεια της αποτοξικοποίησης, η συγκέντρωση του Cu στα βράγχια των µυδιών ήταν µικρότερη συγκρινόµενη µε αυτή που εκτιµήθηκε στα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο Cu ( ιάγρ. 37β). Τέλος, µια αντίστροφη αυξοµείωση της συγκέντρωσης του Cu καταδείχτηκε στα βράγχια των µυδιών τόσο κατά τη διάρκεια της πειραµατικής τους έκθεσης στο Cu 135

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ όσο και κατά τη διάρκεια των 7 ηµερών της αποτοξικοποίησης, σε σχέση µε τη συγκέντρωση του Cu που παρατηρήθηκε στον πεπτικό αδένα. 30 (α) Συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα Control Cu 30 (β) Συγκέντρωση Cu στα βράγχια Control Cu µg/g tissue Έκθεση Αποτοξικοποίηση µg/g tissue Έκθεση Αποτοξικοποίηση 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 37. Συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση της ατοµικής απορρόφησης. (α) Συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Συγκέντρωση Cu στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Mann-Whitney U-test, P <0.05). Diagram 37. Cu concentration in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis using atomic absorption spectrophotometry. (α) Cu concentration in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Cu for 11 days and after 7 days of detoxification. (β) Cu concentration in the gills of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Cu for 11 days and the 7 days of detoxification. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on 11 th day of the experimental exposure (Mann-Whitney U-test, P <0.05). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu δεν εµφάνισαν σηµαντική διαφοροποίηση της συγκέντρωσης του Hg στον πεπτικό αδένα κατά τη διάρκεια των 8 πρώτων ηµερών της πειραµατικής έκθεσης, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 38α). Από την 8 η ως την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης, τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του Hg στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. Στα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης του Hg στον πεπτικό αδένα µέχρι 136

149 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ την 4 η ηµέρα και στατιστικώς σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του Hg από την 4 η εώς την 7 η ηµέρα, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεση στο µίγµα των δύο µετάλλων ( ιάγρ. 38α). (α) 15 Συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα µετά την έκθεση στο µίγµα Hg και Cu Control Hg+Cu 15 (β) Συγκέντρωση Hg στα βράγχια µετά την έκθεση στο µίγµα Hg και Cu Control Hg+Cu µg/g ιστού 10 5 Έκθεση Αποτοξικοποίηση µg/g ιστού 10 5 Έκθεση Αποτοξικοποίηση 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 38. Συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση της ατοµικής απορρόφησης. (α) Συγκέντρωση Hg στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση στο µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Συγκέντρωση Hg στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση στο µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Mann-Whitney U-test, P <0.05). Diagram 38. Ηg concentration in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis using atomic absorption spectrophotometry. (α) Hg concentration in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days and after 7 days of detoxification. (β) Hg concentration in the gills of mussels after the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days and the 7 days of detoxification. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on 11 th day of the experimental exposure (Mann- Whitney U-test, P <0.05). Στα βράγχια των µυδιών που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu, η χηµική ανάλυση έδειξε στατιστικώς σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του Hg κατά τη διάρκεια της πειραµατικής έκθεσης, σε σχέση µε τη συγκέντρωση του Hg που προσδιορίστηκε στα βράγχια των µυδιών ελέγχου ( ιάγρ. 38β). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν στατιστικώς 137

150 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ αυξηµένη συγκέντρωση Hg στα βράχια, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου και τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο µίγµα των δύο µετάλλων. (α) (β) 30 Συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα µετά την έκθεση στο µίγµα Hg και Cu Control Hg+Cu 30 Συγκέντρωση Cu στα βράγχια µετά την έκθεση στο µίγµα Hg και Cu Control Hg+Cu µg/g tissue Έκθεση Αποτοξικοποίηση µg/g tissue Έκθεση Αποτοξικοποίηση 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 39. Συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis µε τη χρήση της ατοµικής απορρόφησης. (α) Συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση στο µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Συγκέντρωση Cu στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση στο µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Mann-Whitney U-test, P <0.05). Diagram 39. Cu concentration in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis using atomic absorption spectrophotometry. (α) Cu concentration in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days and after 7 days of detoxification. (β) Cu concentration in the gills of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days and after detoxification for 7 days. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on 11 th day of the experimental exposure (Mann- Whitney U-test, P <0.05). Στα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu, τα αποτελέσµατα της ατοµικής απορρόφησης έδειξαν στατιστικώς σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης του Cu στον πεπτικό αδένα κατά τη διάρκεια των 8 πρώτων ηµερών της πειραµατικής έκθεσης και στατιστικώς σηµαντική αύξηση από την 8 η ως την 11 η ηµέρα της έκθεσης, σε σχέση µε τη συγκέντρωση του Cu που σηµειώθηκε στον πεπτικό αδένα των µυδιών ελέγχου (Εικ. 39α). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από 138

151 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ το µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν υψηλότερη συγκέντρωση Cu στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε την αντίστοιχη συγκέντρωση των µυδιών ελέγχου και των µυδιών που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης (Εικ. 39α). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του Cu στα βράγχια, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 39β). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu παρουσίασαν σταδιακή µείωση της συγκέντρωσης του Cu στα βράγχια, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο µίγµα Hg και Cu Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός των βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. Η τεχνική της αυτοµεταλλογραφίας εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εκτέθηκαν στον Hg, στο Cu και στο µίγµα Ηg και Cu, µε σκοπό να προσδιοριστούν οι θέσεις συσσώρευσης των βαρέων µετάλλων (µε τη µορφή µαύρων κόκκων αργύρου/bsd) µέσα στα κύτταρα. Η παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο έδειξε ότι τα βαρέα µέταλλα εντοπίζονται µε τη µορφή µαύρων αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στις δοµές του λυσοσωµικού συστήµατος των πεπτικών κυττάρων των µυδιών (Εικ. 26). Συγκεκριµένα, στα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg (Εικ. 26β) και στο Cu (Εικ. 26γ) παρατηρήθηκε παρόµοια συσσώρευση BSD στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου (Εικ. 26α). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν πιο έντονη αυτοµεταλλογραφική αντίδραση στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων (Εικ. 26δ), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου (Εικ. 26α). Στα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu παρατηρήθηκε µείωση της ποσότητας των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων (Εικ. 26η), σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο µίγµα των δύο µετάλλων (Εικ. 26δ). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg (Εικ. 26στ) ή το Cu (Εικ. 26ζ) εµφάνισαν αυξηµένη ποσότητα αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων, σε σχέση 139

152 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στον Hg (Εικ. 26β) ή το Cu (Εικ. 26γ), αντίστοιχα. α Control Hg Cu Hg + Cu β γ δ L L L L ε στ ζ η L L L L Εικόνα 26. (α-δ) Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός βαρέων µετάλλων µε τη µορφή µαύρων κόκκων αργύρου (BSD) σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu και σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες. (α) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών ελέγχου µε µικρό εντοπισµό BSD στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων. (β) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που εκτέθηκαν στον Ηg για 11 ηµέρες, µε παρόµοια ποσότητα BSD στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (γ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που εκτέθηκαν στο Cu για 11 ηµέρες µε παρόµοια ποσότητα BSD στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (δ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu για 11 ηµέρες µε πολύ αυξηµένη ποσότητα BSD στα πεπτικά κύτταρα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (ε-η) Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός βαρέων µετάλλων σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis µετά την αποτοξικοποίηση από τον Hg, το Cu και το µίγµα Hg και Cu για 7 ηµέρες. (ε) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών ελέγχου µε περιορισµένη ποσότητα BSD στα πεπτικά κύτταρα. (στ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών µετά από 7 ηµέρες αποτοξικοποίησης από τον Ηg µε αυξηµένη ποσότητα αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου και αυτά που συλλέχθηκαν µετά από 11 ηµέρες έκθεσης στον Hg. (ζ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών µετά από 7 ηµέρες αποτοξικοποίησης από το Cu µε αυξηµένη ποσότητα BSD στα πεπτικά κύτταρα, σε σύγκριση µε τα µύδια ελέγχου και αυτά που συλλέχθηκαν µετά από 11 ηµέρες έκθεσης στο Cu. (η) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών µετά από 7 ηµέρες αποτοξικοποίησης από το µίγµα Hg και Cu, µε µειωµένη ποσότητα BSD στα πεπτικά κύτταρα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου και αυτά που συλλέχθηκαν µετά από 11 ηµέρες έκθεσης στο µίγµα Hg και Cu. 1200x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 26. (α-δ) Autometallographic localization of heavy metals with the form of black silver deposits (BSD) in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis, after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu and the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days. (α) Digestive tubule of control mussels showing low accumulation of BSD in the digestive cell lysosomes. (β) Digestive tubule of mussels exposed to Hg for 11 days showing comparable amount of BSD in the digestive cell lysosomes, in relation to controls. (γ) Digestive tubule of mussels exposed to Cu for 11 days showing comparable amount of BSD in the digestive cell lysosomes, in relation to controls. (δ) Digestive tubule of mussels exposed to the mixture of Hg and Cu for 11 days showing extremely increased amount of BSD in the digestive cell lysosomes, in relation to controls. (ε-η) Autometallographic localization of heavy metals (BSD) in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis after the detoxification of Hg, Cu and the mixture of Hg and Cu for 7 days. (ε) Digestive tubule of control mussels showing limited amount of BSD in the digestive cells. (στ) Digestive tubule of mussels after 7 days of Hg detoxification showing increased amount of BSD in the digestive cell lysosomes, in relation to control mussels and those exposed to Hg. (ζ) Digestive tubules of mussels after 7 days of Cu detoxification showing increased amount of BSD in the digestive cells, in relation to control mussels and those exposed to Cu for 11 days. (η) Digestive tubule of mussels after 7 days of Hg and Cu detoxification showing decreased amount of BSD in the digestive cells, in relation to control mussels and those collected after the exposure to Hg and Cu mixture. 1200x, L: digestive tubule lumen 140

153 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 2.3. Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός των βαρέων µετάλλων στα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis Στην παρούσα ενότητα της διατριβής, κρυοτοµές των βραγχίων των µυδιών παρατηρήθηκαν στο οπτικό µικροσκόπιο µετά από εφαρµογή της τεχνικής της αυτοµεταλλογραφίας (Εικ. 27). Η παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο έδειξε θετική αυτοµεταλλογραφική αντίδραση κατά µήκος των βραγχιακών νηµατίων των µυδιών ελέγχου µε µεγαλύτερη συσσώρευση στα επιθηλιακά κύτταρα του πρόσθιου τµήµατος τους, τόσο κατά την περίοδο της πειραµατικής έκθεσης (Εικ. 27α) όσο και κατά την περίοδο της αποτοξικοποίησης (Εικ. 27ε). Τα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg εµφάνισαν υψηλότερη συσσώρευση BSD στα επιθηλιακά κύτταρα των βραγχιακών νηµατίων (Εικ. 27β), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου (Εικ. 27α). Επίσης, τα µύδια που εκτέθηκαν στο Cu εµφάνισαν αυξηµένη συσσώρευση BSD στα βράγχια (Εικ. 27γ), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου, αλλά αυτή η συσσώρευση ήταν µικρότερη συγκρινόµενη µε τα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg (Εικ. 27β). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν υψηλότερη συσσώρευση αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα επιθηλιακά κύτταρα, κυρίως, του πρόσθιου και οπίσθιου τµήµατος των βραγχιακών νηµατίων (Εικ. 27δ), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου (Εικ. 27α). Η παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο έδειξε µικρότερη ποσότητα αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα κύτταρα των βραγχιακών νηµατίων των µυδιών µετά από την περίοδο των 7 ηµερών της αποτοξικοποίησης (Εικ. 27ε-η), σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν µετά το πέρας της πειραµατικής έκθεσης στα βαρέα µέταλλα (Εικ. 27α-δ). Συγκεκριµένα, τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg (Εικ. 27στ) ή το Cu (Εικ. 27ζ) εµφάνισαν µικρότερη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα των βραγχίων των µυδιών, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν µετά την πειραµατική έκθεση στον Hg (Εικ. 27β) ή στο Cu (Εικ. 27γ), αντίστοιχα. Τέλος, στα βραγχιακά νηµάτια των µυδιών που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu, παρατηρήθηκε µικρότερη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα, κυρίως, του πρόσθιου και οπίσθιου τµήµατος των βραγχιακών νηµατίων (Εικ. 27η), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου (Εικ. 27ε) και τα µύδια που συλλέχθηκαν µετά από την πειραµατική έκθεση στο µίγµα Hg και Cu (Εικ. 27δ). 141

154 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ α β γ δ ε στ ζ η Εικόνα 27. (α-δ) Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός βαρέων µετάλλων µε τη µορφή µαύρων κόκκων αργύρου (BSD) σε κρυοτοµές βραγχίων των µυδιών M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu και σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες. (α) Βράγχια µυδιών ελέγχου όπου τα BSD εντοπίζονται στα επιθηλιακά κύτταρα, κυρίως, του πρόσθιου τµήµα των βραγχιακών νηµατίων. (β) Βράγχια µυδιών που εκτέθηκαν στον Ηg για 11 ηµέρες, µε αυξηµένη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα των βραγχιακών νηµατίων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (γ) Βράγχια µυδιών που εκτέθηκαν στο Cu για 11 ηµέρες µε αυξηµένη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα των βραγχιακών νηµατίων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (δ) Βράγχια µυδιών που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu για 11 ηµέρες µε πολύ αυξηµένη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα των βραγχιακών νηµατίων, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (ε-η) Αυτοµεταλλογραφικός εντοπισµός βαρέων µετάλλων (BSD) σε κρυοτοµές των βραγχίων των µυδιών M. galloprovincialis που παρέµειναν για 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από τον Hg, το Cu και το µίγµα Hg και Cu. (ε) Βράγχια µυδιών ελέγχου µε συσσώρευση BSD στα επιθηλιακά κύτταρα, κυρίως, του πρόσθιου τµήµατος των βραγχιακών νηµατίων. (στ) Βράγχια µυδιών µετά από 7 ηµέρες αποτοξικοποίησης από τον Hg µε µικρότερη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα, σε σχέση µε τα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg. (ζ) Βράγχια µυδιών που οδηγήθηκαν για 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το Cu µε περιορισµένη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου και αυτά που συλλέχθηκαν µετά από την πειραµατική τους έκθεση στο Cu. (η) Βράγχια µυδιών που οδηγήθηκαν για 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu µε µικρότερη ποσότητα BSD στα επιθηλιακά κύτταρα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου και αυτά που συλλέχθηκαν µετά από την πειραµατική έκθεση στο µίγµα Hg και Cu. 1200x Figure 27. (α-δ) Autometallographic localization of heavy metals with the form of black silver deposits (BSD) in the gill cryosections of mussels M. galloprovincialis after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu and the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days. (α) Gills of control mussels showing the localization of BSD in the epithelial cells, mainly, in the frontal part of the gill filament. (β) Gills of mussels exposed to Hg for 11 days, showing increased amount of BSD in the epithelial cells of the gill filament, in relation to controls. (γ) Gills of mussels exposed to Cu for 11 days showing increased amount of BSD in the epithelial cells of the gill filament, in relation to controls. (δ) Gills of mussels exposed to Hg and Cu mixture for 11 days showing extremely increased amount of BSD in the epithelial cells of the gill filament, in relation to controls. (ε-η) Autometallographic localization of heavy metals (BSD) in the gill cryosections of mussels M. galloprovincialis after the 7 days detoxification from Hg, Cu and the mixture of Hg and Cu. (ε) Gills of control mussels showing accumulation of BSDin the epithelial cells, mainly, in the frontal part. (στ) Gills of mussels after 7 days of detoxification from Hg showing decreased amount of BSD in the epithelial cells, in relation to mussels exposed to Hg and increased accumulation of BSD, in relation to controls. (ζ) Gills of mussels after 7 days of detoxification from Cu showing limited accumulation of BSD in the epithelial cells, in relation to controls and those collected on the 11 th day of the exposure to Cu. (η) Gills of mussels after 7 days of detoxification from the mixture of Hg and Cu showing decreased amount of BSD in the epithelial cells, in relation to control mussels and those collected on the 11 th day of exposure to the mixture of Hg and Cu. 1200x 142

155 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 2.4. Μορφοµετρικές αλλαγές των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων (BSD) στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis Μετά την περίοδο της πειραµατικής έκθεσης των ζώων στα βαρέα µέταλλα και την περίοδο της αποτοξικοποίησης, η τεχνική της αυτοµεταλλογραφίας εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα και των βραγχίων των µυδιών M. galloprovincialis, µε σκοπό να εκτιµηθούν οι µορφοµετρικές αλλαγές των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων (BSD) στους ιστούς και να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσµατα των µορφολογικών παρατηρήσεων που αναφέρθηκαν στην προηγούµενη ενότητα. Με τη χρήση του συστήµατος ανάλυσης εικόνας προσδιορίστηκε η πυκνότητα όγκου (volume density, VvBSD) των BSD στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών. µm3/µm3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 (α) Πυκνότητα όγκου BSD στον πεπτικό αδένα µετά την έκθεση στον Hg Έκθεση BSD Hg Control Αποτοξικοποίηση µm3/µm3 (β) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Πυκνότητα όγκου BSD στα βράγχια µετά την έκθεση στον Hg BSD Hg Control Αποτοξικοποίηση 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 40. Μορφοµετρικές αλλαγές των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis. (α) Πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Diagram 40. Morphometrical alterations of autometallographic deposits in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis. (α) Volume density of autometallographic deposits in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg for 11 days and after 7 days of detoxification. (β) Volume density of autometallographic deposits in the gills of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg for 11 days and after 7 days of detoxification. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the experimental exposure (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). 143

156 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Τα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg δεν παρουσίασαν σηµαντική διαφοροποίηση της πυκνότητας όγκου των BSD στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 40α). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των BSD στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στον Hg. Από την άλλη µεριά, τα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των BSD στα βράγχια, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 40β). Κατά τη διάρκεια της περιόδου αποτοξικοποίησης από τον Hg, η πυκνότητα όγκου των BSD στα βράγχια παρέµεινε υψηλότερη, σε σχέση µε αυτή των µυδιών ελέγχου, ενώ δεν παρουσίασε στατιστικώς σηµαντική διαφοροποίηση, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στον Hg. Τα µύδια που εκτέθηκαν στο Cu σηµείωσαν παρόµοια πυκνότητα όγκου των BSD στον πεπτικό αδένα µε αυτή των µυδιών ελέγχου ( ιάγρ. 41α). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το Cu δεν εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική διαφοροποίηση της πυκνότητας όγκου των BSD στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο Cu ( ιάγρ. 41α). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο Cu παρουσίασαν στατιστικώς αυξηµένη πυκνότητα όγκου των BSD στα βράγχια, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 41β). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το Cu εµφάνισαν στατιστικώς σηµαντική µείωση της πυκνότητας όγκου των BSD στα βράγχια, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο Cu ( ιάγρ. 41β). 144

157 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ µm3/µm3 (α) 1 0,8 0,6 0,4 Πυκνότητα όγκου BSD στον πεπτικό αδένα µετά την έκθεση στο Cu Έκθεση (β) BSD Cu Control 1 0,8 Αποτοξικοποίηση 0,6 µm3/µm3 0,4 Πυκνότητα όγκου BSD στα βράγχια µετά την έκθεση στο Cu Έκθεση BSD Cu Control Αποτοξικοποίηση 0,2 0,2 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 41. Μορφοµετρικές αλλαγές των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis. (α) Πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Diagram 41. Morphometrical alterations of autometallographic deposits in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis. (α) Volume density of autometallographic deposits in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Cu for 11 days and after 7 days of detoxification. (β) Volume density of autometallographic deposits in the gills of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Cu for 11 days and after 7 days of detoxification. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the exposure (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu παρουσίασαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των BSD στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 42α). Τα ζώα που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν στατιστικώς µειωµένη πυκνότητα όγκου των BSD στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο µίγµα των δύο µετάλλων. Τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu έδειξαν στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των BSD στα βράγχια, συγκρινόµενα µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 42β). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu εµφάνισαν στατιστικώς µειωµένη πυκνότητα όγκου των BSD, σε σχέση µε 145

158 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η έκθεσης στο µίγµα των δύο µετάλλων ( ιάγρ. 42β). ηµέρα) της πειραµατικής 1 0,8 (α) Πυκνότητα όγκου BSD στον πεπτικό αδένα µετά την έκθεση στο µίγµα Hg and Cu BSD Hg+Cu Control (β) 1 0,8 Πυκνότητα όγκου BSD στα βράγχια µετά την έκθεση στο µίγµα Hg and Cu Έκθεση BSD Hg+Cu Control Αποτοξικοποίηση µm3/µm3 0,6 0,4 Έκθεση Αποτοξικοποίηση µm3/µm3 0,6 0,4 0,2 0,2 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 42. Μορφοµετρικές αλλαγές των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών M. galloprovincialis. (α) Πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Πυκνότητα όγκου των αυτοµεταλλογραφικών κόκκων στα βράγχια των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Diagram 42. Morphometrical alterations of autometallographic deposits in the digestive gland and gills of mussels M. galloprovincialis. (α) Volume density of autometallographic deposits in the digestive gland of mussels after 11 days of the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu and after 7 days of detoxification. (β) Volume density of autometallographic deposits in the gills of mussels after 11 days of the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu and after 7 days of detoxification. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the experimental exposure (Duncan s test, ANOVA, P<0,05) Μορφολογικές αλλαγές των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Με σκοπό να µελετηθούν οι µορφολογικές αλλαγές των λυσοσωµάτων τόσο κατά τη διάρκεια της πειραµατικής έκθεσης των µυδιών στα βαρέα µέταλλα όσο και κατά τη διάρκεια της περιόδου αποτοξικοποίησης εφαρµόστηκε ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών. Οι µορφολογικές παρατηρήσεις στο οπτικό µικροσκόπιο έδειξαν, σε 146

159 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ γενικές γραµµές, διογκωµένα λυσοσώµατα µε έντονη αντίδραση για το λυσοσωµικό ένζυµο στον πεπτικό αδένα των µυδιών που εκτέθηκαν στον Hg (Εικ. 28β), σε σχέση µε τα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών ελέγχου (Εικ. 28α). Τα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών που εκτέθηκαν στο Cu ήταν µικρότερα σε µέγεθος και εµφάνισαν αχνή χρώση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση (Εικ. 28γ), συγκρινόµενα µε αυτά των µυδιών που εκτέθηκαν στον Hg (Εικ. 28β). Τέλος, τα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu παρουσίασαν µεγαλύτερου µεγέθους λυσοσώµατα στα πεπτικά τους κύτταρα (Εικ. 28δ), σε σχέση µε τα λυσοσώµατα των µυδιών ελέγχου (Εικ. 28α). Οι παρατηρήσεις στο οπτικό µικροσκόπιο της µορφολογίας των λυσοσωµάτων έδειξαν, σε γενικές γραµµές, περισσότερο διογκωµένα λυσοσώµατα µε έντονη χρώση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από τον Hg (Εικ. 28στ), σε σχέση µε τα λυσοσώµατα των µυδιών ελέγχου (Εικ. 28ε) και των µυδιών που εκτέθηκαν στον Hg (Εικ. 28β). Τα κύτταρα του πεπτικού αδένα των µυδιών που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το Cu εµφάνισαν παρόµοιου µεγέθους λυσοσώµατα µε λιγότερο έντονη αντίδραση για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση (Εικ. 28ζ), σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου (Εικ. 28ε). Επιπλέον, στα πεπτικά σωληνάρια των µυδιών που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu παρατηρήθηκαν διογκωµένα λυσοσώµατα (Εικ. 28η), σε σχέση µε αυτά των µυδιών ελέγχου (Εικ. 28ε) και παρόµοιου µεγέθους λυσοσώµατα µε αυτά των µυδιών που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu (Εικ. 28δ). 147

160 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ α Control Hg Cu Hg + Cu β γ δ L L L L ε στ ζ η L L L L Εικόνα 28. (α-δ) Ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu και σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες. (α) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών ελέγχου µε µικρού µεγέθους λυσοσώµατα και έντονη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο. (β) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που εκτέθηκαν για 11 ηµέρες στον Hg µε µεγαλύτερου µεγέθους λυσοσώµατα και έντονη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (γ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που εκτέθηκαν για 11 ηµέρες στο Cu µε µεγαλύτερου µεγέθους λυσοσώµατα και αχνή χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (δ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που εκτέθηκαν για 11 ηµέρες στο µίγµα Hg και Cu µε µεγαλύτερου µεγέθους λυσοσώµατα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. (ε-η) Ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis που παρέµειναν για 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από τον Hg, το Cu και το µίγµα Hg και Cu. (ε) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών ελέγχου µε κανονικού µεγέθους λυσοσώµατα και έντονη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο. (στ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από τον Hg, µε διογκωµένα λυσοσώµατα και έντονη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο, σε σχέση µε αυτά των µυδιών ελέγχου και αυτά που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης στον Hg. (ζ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το Cu µε κανονικού µεγέθους λυσοσώµατα. (η) Πεπτικό σωληνάριο µυδιών που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu µε διογκωµένα λυσοσώµατα και έντονη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου. 1200x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 28. (α-δ) Histochemistry for the lysosomal enzyme N-acetyl-β-hexozaminidase in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg, 0.08 mg/lt Cu and the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days (α) Digestive tubule of control mussels showing small in size lysosomes and great reaction for the lysosomal enzyme. (β) Digestive tubule of mussels exposed to Hg for 11 days showing larger in size lysosomes, in relation to controls and great reaction for the lysosomal enzyme. (γ) Digestive tubule of mussels treated to Cu for 11 days showing larger in size lysosomes and tiny reaction for the lysosomal enzyme, in contrast to controls. (δ) Digestive tubule of mussels exposed to the mixture of Hg and Cu for 11 days showing larger in size lysosomes, in relation to controls. (ε-η) Histochemistry for the lysosomal enzyme N-acetyl-β-hexosaminidase in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis after 7 days of detoxification from Hg, Cu and the mixture of Hg and Cu. (ε) Digestive tubule of control mussels after 7 days of detoxification showing normal and great reactive lysosomes. (στ) Digestive tubule of mussels after 7 days of Hg detoxification showing enlarged lysosomes with great reaction for the lysosomal enzyme, in relation to controls and those exposed to Hg. (ζ) Digestive tubule of mussels after 7 days of Cu detoxification showing normal in size lysosomes, in relation to controls. (η) Digestive tubule of mussels after 7 days of detoxification from the mixture of Hg and Cu indicating enlarged lysosomes with great reaction for the lysosomal enzyme N-acetyl-β-hexosaminidase, in relation to those of control mussels. 1200x, L: digestive tubule lumen 148

161 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ 2.6. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Με σκοπό την εκτίµηση των µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων εφαρµόστηκε ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis µετά από την πειραµατική τους έκθεση στον Hg, στο Cu και στο µίγµα Hg και Cu και µετά από την περίοδο των 7 ηµερών της αποτοξικοποίησης. Η µελέτη των µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του συστήµατος ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density, VvLYS) και αριθµητική πυκνότητα (numerical density, NvLYS) των λυσοσωµάτων ( ιάγρ. 43). (α) (β) µm3/µm3 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων µετά την έκθεση στον Hg Έκθεση VvLYS Hg Control Αποτοξικοποίηση αριθµός/µm3 Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων 0,05 µετά την έκθεση στον Hg NvLYS Hg Control 0,04 0,03 Έκθεση Αποτοξικοποίηση 0,02 0, Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 43. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. (α) Πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Hg για 11 ηµέρες και αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Diagram 43. «Morphometrical alterations of lysosomes» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis. (α) Volume density of lysosomes in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg for 11 days and after the detoxification for 7 days. (β) Numerical density of lysosomes in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Hg for 11 days and detoxification for 7 days. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the experimental exposure (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). 149

162 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Στα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg δείχτηκε σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 43α). Στα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg, παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης ( ιάγρ. 43α). Στα µύδια που εκτέθηκαν στον Hg δείχτηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση αυτής της παραµέτρου, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου, ενώ στα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από τον Hg παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική αύξηση της αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων από την 4 η έως και την 7 η ηµέρα, συγκρινόµενη µε την ίδια παράµετρο στα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στον Hg ( ιάγρ. 43β). µm3/µm3 (α) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Time O Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων µετά την έκθεση στο Cu Έκθεση 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα VvLYS Cu Control Αποτοξικοποίηση 7η ηµέρα αριθµός/µm3 (β) Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων 0,05 µετά την έκθεση στο Cu NvLYS Cu 0,04 0,03 Έκθεση 0,02 0,01 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα Control Αποτοξικοποίηση 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 44. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. (α) Πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Diagram 44. «Morphometrical alterations of lysosomes» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis. (α) Volume density of lysosomes in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Cu for 11 days and detoxification for 7 days. (β) Numerical density of lysosomes in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to 0.08 mg/lt Cu for 11 days and detoxification for 7 days. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the experimental exposure (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). 150

163 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Στα µύδια που εκτέθηκαν στο Cu σηµειώθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση της πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα από την 8 η έως την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 44α). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το Cu εµφάνισαν σταδιακή µείωση της πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων, η οποία δε διέφερε στατιστικώς από αυτή των µυδιών που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο Cu ( ιάγρ. 44α). Τα µύδια που οδηγήθηκαν σε αποτοξικοποίηση από το Cu εµφάνισαν παρόµοια αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων µε αυτή των µυδιών που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο Cu ( ιάγρ. 44β). (α) (β) µm3/µm3 Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων µετά την έκθεση στο µίγµα 0,5 Hg και Cu 0,4 Έκθεση 0,3 0,2 0,1 VvLYS Hg+Cu Control Αποτοξικοποίηση αριθµ ός/µm 3 Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων 0,05 µετά την έκθεση στο µίγµα Hg και Cu 0,04 0,03 0,02 0,01 Έκθεση NvLYS Hg+Cu Control Αποτοξικοποίηση 0 0 Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα Time O 5η ηµέρα 8η ηµέρα 11η ηµέρα 4η ηµέρα 7η ηµέρα ιάγραµµα 45. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis. (α) Πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. (β) Αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα των µυδιών µετά από την πειραµατική έκθεση σε µίγµα 0.08 mg/lt Hg και 0.08 mg/lt Cu για 11 ηµέρες και την αποτοξικοποίηση για 7 ηµέρες. Το αστεράκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια ελέγχου, ενώ το τριγωνάκι δείχνει τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την 11 η ηµέρα της πειραµατικής έκθεσης (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). Diagram 45. «Morphometrical alterations of lysosomes» in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis. (α) Volume density of lysosomes in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days and detoxification for 7 days. (β) Numerical density of lysosomes in the digestive gland of mussels after the experimental exposure to the mixture of 0.08 mg/lt Hg and 0.08 mg/lt Cu for 11 days and detoxification for 7 days. The asterisk shows the statistical significant differences with control mussels, while the triangle shows the statistical significant differences with the mussels collected on the 11 th day of the experimental exposure (Duncan s test, ANOVA, P<0,05). 151

164 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Στα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική αύξηση της πυκνότητας όγκου των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου τόσο κατά την περίοδο της πειραµατικής έκθεσης όσο και κατά την περίοδο της αποτοξικοποίησης ( ιάγρ. 45). Στα µύδια που εκτέθηκαν στο µίγµα Hg και Cu παρατηρήθηκε στατιστικώς µικρότερη τιµή της αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια ελέγχου ( ιάγρ. 45β). Στα µύδια που οδηγήθηκαν σε 7 ηµέρες αποτοξικοποίηση από το µίγµα Hg και Cu παρατηρήθηκε στατιστικώς σηµαντική µείωση της αριθµητικής πυκνότητας των λυσοσωµάτων στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα µύδια που συλλέχθηκαν την τελευταία ηµέρα (11 η ηµέρα) της πειραµατικής έκθεσης στο µίγµα Hg και Cu ( ιάγρ. 45β). Γενικά, η αυξηµένη πυκνότητα όγκου και η µειωµένη αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις καταδεικνύουν διόγκωση των λυσοσωµάτων στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis. 152

165 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΜΕΡΟΣ Γ: ΜΕΛΕΤΗ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 1. Ιστοχηµική µελέτη που αφορά στον εντοπισµό των λυσοσωµικών ενζύµων Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β- γλουκουρονιδάση στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα τον Ιούνιο και το εκέµβριο του 2009 εφαρµόστηκε ιστοχηµεία για τρία λυσοσωµικά ένζυµα, τη Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, την όξινη φωσφατάση και τη β-γλουκουρονιδάση. Ο σκοπός της παρούσας ενότητας της διατριβής είναι η εξέταση του τρόπου µε τον οποίο τα παραπάνω ένζυµα εντοπίζονται στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών, καθώς επίσης και η διερεύνηση της ευαισθησία τους σε εφαρµογές βιοµαρτύρων που αφορούν στις λυσοσωµικές αποκρίσεις. Τα µύδια που συλλέχθηκαν τον Ιούνιο του 2009 εµφάνισαν ενεργά και εµφανώς διογκωµένα λυσοσώµατα στα πεπτικά τους κύτταρα (Εικ. 29). Το ένζυµο Ν- ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση εντοπίστηκε µε έντονη και οµοιόµορφη µωβ χρώση στα διογκωµένα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών (Εικ. 29α, βέλος), ενώ σε αντίστοιχα πεπτικά σωληνάρια η ιστοχηµεία για το ένζυµο όξινη φωσφατάση κατέδειξε θετική αντίδραση για το λυσοσωµικό ένζυµο µε τη µορφή µικρών κόκκων, κυρίως στην περιφέρεια των λυσοσωµάτων (Εικ. 29β, βέλος). Η ιστοχηµεία για το ένζυµο β-γλουκουρονιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα αποκάλυψε ότι το λυσοσωµικό αυτό ένζυµο εντοπίζεται µε τη µορφή καφέ πυρήνων στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών (Εικ. 29γ, βέλος). 153

166 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ Figure 29. (α-γ) Histochemistry for the lysosomal enzymes N-acetyl-β-hexozaminidase, acid phosphatase and β- glucuronidase in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis collected from Halastra on June (α) Digestive tubule epithelium showing strong and homogenous reaction for the enzyme N-acetyl-β-hexosaminidase in the heterolysosomes and the residual bodies of the digestive cells. (β) Digestive tubule epithelium showing positive reaction for the enzyme acid phosphatase with the form of small granules, as in the periphery of lysosomal membrane, as well as in the centre of the heterolysosmes and the residual bodies. (γ) Digestive tubule epithelium showing a positive reaction for the enzyme β-glucuronidase, as brown cores in the lysosomal system of mussels digestive cells. (δ-στ) Histochemistry for the lysosomal enzymes N-acetyl-β-hexozaminidase, acid phosphatase and β- glucuronidase in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis collected from Halastra on December (δ) Digestive tubule epithelium showing tiny and homogenous reaction for the enzyme N-acetyl-β-hexosaminidase in the heterolysosomes and the residual bodies of the digestive cells, while the lipofuscin granules are scarce from enzyme reaction (arrowhead). (ε) Digestive tubule epithelium showing positive and homogenous reaction for the enzyme acid phosphatase in the heterolysosmes and the residual bodies, while the lipofuscin granules are scarce from enzyme reaction (arrowhead). (στ) Digestive tubule epithelium showing a positive reaction for the enzyme β-glucuronidase as brown granules in the periphery of lysosomal membrane, as well as in the lipofuscin granules (arrows) x, L: digestive tubule lumen 154

167 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ α δ L L β ε L L γ στ L L Εικόνα 29. (α-γ) Ιστοχηµεία για τα λυσοσωµικά ένζυµα N-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β- γλουκουρονιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα τον Ιούνιο του (α) Τµήµα πεπτικού σωληναρίου στο οποίο παρατηρείται έντονη και οµοιόµορφη αντίδραση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση στα ετερολυσοσώµατα και τα υπολειπόµενα σωµάτια των πεπτικών κυττάρων. (β) Τµήµα πεπτικού σωληναρίου στο οποίο παρατηρείται θετική αντίδραση για το ένζυµο όξινη φωσφατάση µε τη µορφή µικρών κόκκων τόσο στην περιφέρεια της λυσοσωµικής µεµβράνης όσο και στο κέντρο των ετερολυσοσωµάτων και των υπολειπόµενων σωµατίων. (γ) Τµήµα πεπτικού σωληναρίου στο οποίο εντοπίζεται θετική αντίδραση για το ένζυµο β-γλουκουρονιδάση µε τη µορφή καφέ πυρήνων σε συγκεκριµένα τµήµατα του λυσοσωµικού συστήµατος των πεπτικών κυττάρων. (δ-στ) Ιστοχηµεία για τα λυσοσωµικά ένζυµα N-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β- γλουκουρονιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα το εκέµβριο του (δ) Τµήµα πεπτικού σωληναρίου στο οποίο παρατηρείται αχνή και οµοιόµορφη αντίδραση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση (βέλος) στα ετερολυσοσώµατα και τα υπολειπόµενα σωµάτια των πεπτικών κυττάρων, ενώ τα λυσοσώµατα µε λιποφουσκίνη δεν εµφανίζουν θετική αντίδραση για αυτό το ένζυµο (κεφαλή βέλους). (ε) Τµήµα πεπτικού σωληναρίου στο οποίο παρατηρείται θετική και οµοιόµορφη αντίδραση για το ένζυµο όξινη φωσφατάση στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων (βέλος), ενώ τα κοκκία λιποφουσκίνης δεν εµφανίζουν θετική αντίδραση για αυτό το ένζυµο (κεφαλή βέλους). (στ) Τµήµα πεπτικού σωληναρίου στο οποίο εντοπίζεται θετική αντίδραση για το ένζυµο β-γλουκουρονιδάση µε τη µορφή κόκκων στην περιφέρεια των λυσοσωµάτων (βέλη) x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου 155

168 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ Τα µύδια που συλλέχθηκαν το εκέµβριο του 2009 εµφάνισαν µικρότερου µεγέθους λυσοσώµατα (Εικ. 29 δ-στ), σε σχέση µε αυτά των µυδιών που συλλέχθηκαν τον Ιούνιο του Παράλληλα στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών που συλλέχθηκαν το εκέµβριο του 2009 παρατηρήθηκε αυξηµένη ποσότητα λιποφουσκίνης (Εικ. 30α, βέλος), η οποία επιβεβαιώθηκε τόσο µετά από ιστοχηµική χρώση για λιποφουσκίνη (Εικ. 30β, βέλος) όσο και µετά από παρατήρηση των κρυοτοµών σε οπτικό µικροσκόπιο φθορισµού, όπου οι κόκκοι λιποφουσκίνης φθορίζουν µε κίτρινο χρώµα κάτω από µπλε λάµπα UV (Εικ. 30γ, βέλος). α β γ lys L L L Εικόνα 30. Κρυοτοµές πεπτικών σωληναρίων µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα το εκέµβριο (α) Ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όπου οι λιποφουσκίνες εντοπίζονται µε καφέ χρώµα (βέλος). (β) Ιστοχηµεία για τον εντοπισµό των λιποφουσκινών, όπου τα κοκκία λιποφουσκίνης εµφανίζονται µε κίτρινο χρώµα (βέλος). (γ) Πεπτικό σωληνάριο µυδιού έπειτα από ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση και παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο φθορισµού. Τα κοκκία λιποφουσκίνης φθορίζουν σε κίτρινο χρώµα κάτω από µπλε λάµπα UV (βέλος). 2500x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου, lys: λυσοσώµατα Figure 30. Cryosections of digestive tubules epithelium of mussels M. galloprovincialis collected from Halastra on December (α) N-acetyl-β-hexozaminidase histochemistry showing the lipofuscin granules colored in brown (arrow). (β) Lipofuscin histochemistry showing the lipofuscin granules colored in yellow (arrow). (γ) Digestive tubule of mussels after N-acetyl-β-hexozaminidase histochemistry and after the observation under the light fluorescent microscopy. The lipofuscin granules fluorescent in yellow under the blue UV light (arrow). 2500x, L: digestive tubule lumen, lys: lysosomes Το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση εντοπίστηκε µε αχνή και σχεδόν οµοιόµορφη µωβ χρώση σε περιορισµένο αριθµό ετερολυσοσωµάτων και υπολειπόµενων σωµατίων στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών (Εικ. 29δ), ενώ τα λυσοσώµατα τα οποία περιείχαν λιποφουσκίνη εµφάνισαν µειωµένη αντίδραση για το λυσοσωµικό αυτό ένζυµο (Εικ. 29δ, βέλος). Σε αντίστοιχα πεπτικά σωληνάρια µυδιών M. galloprovincialis, η ιστοχηµεία για την όξινη φωσφατάση έδειξε ότι το λυσοσωµικό αυτό ένζυµο εντοπίζεται µε µωβ και σχεδόν ανοµοιόµορφη χρώση σε περιορισµένο αριθµό λυσοσωµάτων στα πεπτικά κύτταρα (Εικ. 29ε), ενώ τα κοκκία 156

169 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ λιποφουσκίνης δεν εµφάνισαν θετική αντίδραση για την όξινη φωσφατάση (Εικ. 29ε, βέλος). Τέλος, η ιστοχηµεία για τη β-γλουκουρονιδάση αποκάλυψε ότι το λυσοσωµικό αυτό ένζυµο εντοπίζεται µε τη µορφή κόκκων περιφερειακά της λυσοσωµικής µεµβράνης, τόσο στα λυσοσώµατα που έδωσαν θετική αντίδραση για την Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση και την όξινη φωσφατάση, όσο και στα κοκκία που περιείχαν αυξηµένο περιεχόµενο λιποφουσκινών (Εικ. 29στ). 2. Μελέτη λυσοσωµικών παραµέτρων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis που εµφανίζουν διαφορετικό µέγεθος (µικρά και µεγάλα µύδια) Στην συγκεκριµένη ενότητα της παρούσας διατριβής εξετάστηκαν λυσοσωµικές παράµετροι, όπως η «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)», η «πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων (VvLYS)», η «αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων (NvLYS)», οι «µορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων», ο δείκτης «Lysosomal Response Index (LRI)» και η «ιστοχηµική µελέτη των λυσοσωµικών ενζύµων», στον πεπτικό αδένα µυδιών M. galloprovincialis που διέφεραν ως προς το µέγεθος του κελύφους τους. Τα µύδια συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο 2010 και το µήκος κελύφους για τα µικρού µεγέθους µύδια ήταν 2,38 cm και για τα µεγάλου µεγέθους µύδια ήταν 6,56 cm. Σκοπός της παρούσας ενότητας της διατριβής είναι να διερευνηθεί αν τα µύδια, τα οποία έχουν διαφορετικό µέγεθος κελύφους, ανήκουν στην ίδια συνάθροιση και διαβιούν κάτω από απόλυτα ταυτόσηµες περιβαλλοντικές συνθήκες, εµφανίζουν το ίδιο πρότυπο απόκρισης των λυσοσωµικών παραµέτρων στα πεπτικά τους σωληνάρια «Σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (LMS)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών Μ. galloprovincialis. Η τεχνική «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis. Η ανάλυση των 157

170 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ αποτελεσµάτων έδειξε ότι τα µικρού µεγέθους µύδια εµφάνισαν στατιστικώς υψηλότερο χρόνο της τεχνικής (20,35±6,68 min), σε σχέση µε τον αντίστοιχο χρόνο (13,9±2,51 min) που εκτιµήθηκε στα µεγάλου µεγέθους µύδια ( ιάγρ. 46) Σταθερότητα λυσοσωµικής µεβράνης min ΜΙΚΡΑ ΜΥ ΙΑ ΜΕΓΑΛΑ ΜΥ ΙΑ ιάγραµµα 46. Χρόνοι της τεχνικής «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis µικρού και µεγάλου µεγέθους που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δειγµάτων παρουσιάζονται µε αστερίσκο (Mann-Whitney U-test, P<0.05). Diagram 46. Lysosomal membrane stability values of the digestive gland of small and large in size mussels M. galloprovincialis collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June Values are expressed as means ± SD. Significant differences between pairs of mean values are shown by asterisk (Mann- Whitney U-test, P<0.05) «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» και ιστοχηµική µελέτη των λυσοσωµικών ενζύµων στον πεπτικό αδένα των µυδιών M. galloprovincialis Η ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µυδιών M. galloprovincialis έδειξε ότι τα πεπτικά κύτταρα των µυδιών µε µικρό µέγεθος κελύφους εµφάνισαν λιγότερα και µικρότερα σε µέγεθος λυσοσώµατα στα πεπτικά τους κύτταρα (Εικ. 31α, 31β), σε σχέση µε τα λυσοσώµατα των µυδιών µε µεγάλο κέλυφος, τα οποία ήταν εµφανώς διογκωµένα (Εικ. 31γ, 31δ). Τα αποτελέσµατα των παρατηρήσεων στο οπτικό µικροσκόπιο επιβεβαιώθηκαν και µε την εκτίµηση των «µορφοµετρικών αλλαγών των λυσοσωµάτων», οι οποίες εκφράστηκαν ως πυκνότητα όγκου (volume density, VvLYS) και αριθµητική 158

171 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ πυκνότητα (numerical density, NvLYS) των λυσοσωµάτων. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα, τα µικρού µεγέθους µύδια εµφάνισαν στατιστικώς µειωµένη πυκνότητα όγκου και αριθµητική πυκνότητα των λυσοσωµάτων στα πεπτικά τους κύτταρα, σε σχέση µε τις αντίστοιχες παραµέτρους στα µεγάλου µεγέθους µύδια ( ιάγρ. 47). α β L L γ δ L L Εικόνα 31. Ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο (α-β) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών µε µικρό µέγεθος κελύφους, όπου φαίνονται λυσοσώµατα κανονικού µεγέθους στα πεπτικά κύτταρα. (γ-δ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών µε µεγάλο µέγεθος κελύφους, όπου φαίνονται διογκωµένα λυσοσώµατα στα πεπτικά κύτταρα. 1700x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 31. Ν-acetyl-β-hexozaminidase histochemistry in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June (α-β) Digestive tubule of mussels with small in size shell showing normal in size lysosomes in the digestive cells. (γ-δ) Digestive tubule of mussels with large in size shell showing enlarged lysosomes in the digestive cells. 1700x, L: digestive tubule lumen 159

172 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ (α) Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων (β) Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων 0,3 0,025 0,25 0,02 µm3/µm3 0,2 0,15 0,1 µm3/µm3 0,015 0,01 0,05 0,005 0 ΜΙΚΡΑ ΜΥ ΙΑ ΜΕΓΑΛΑ ΜΥ ΙΑ 0 ΜΙΚΡΑ ΜΥ ΙΑ ΜΕΓΑΛΑ ΜΥ ΙΑ ιάγραµµα 47. «Μορφοµετρικές αλλαγές των λυσοσωµάτων» στα πεπτικά κύτταρα των µυδιών M. galloprovincialis µικρού και µεγάλου µεγέθους που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο (α) Πυκνότητα όγκου λυσοσωµάτων. (β) Αριθµητική πυκνότητα λυσοσωµάτων. Οι τιµές εκφράζονται σαν Μ.Ο ± τυπική απόκλιση. Οι αστερίσκοι δείχνουν τις στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στα δείγµατα (Duncan s test, P<0.05). Diagram 47. «Morphometrical alterations» of lysosomes in the digestive cells of small and large in size mussels M. galloprovincialis collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June (α) Volume density of lysosomes. (β) Numerical density of lysosomes. Values are expressed as means ± SD. The asterisks indicate the significant differences between the pairs of mean values (Duncan s test, P<0.05). Η ιστοχηµεία των λυσοσωµικών ενζύµων Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β-γλουκουρονιδάση εφαρµόστηκε σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µικρών και µεγάλων σε µέγεθος µυδιών που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα τον Ιούνιο του Η παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο έδειξε έντονη και οµοιόµορφη χρώση για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων τόσο στα µικρού µεγέθους µύδια (Εικ. 32α, 32δ) όσο και στα µεγάλου µεγέθους µύδια (Εικ. 33α, 33δ). Η ιστοχηµεία για την όξινη φωσφατάση έδειξε ότι το λυσοσωµικό αυτό ένζυµο εντοπίζεται µε τη µορφή κόκκων στην περιφέρεια των λυσοσωµάτων στα µεγάλου µεγέθους µύδια (Εικ. 33β, 33ε), ενώ στα µικρού µεγέθους µύδια η χρώση για την όξινη φωσφατάση είναι οµοιόµορφη και καλύπτει σχεδόν ολόκληρη την επιφάνεια των λυσοσωµάτων (Εικ. 32β, 32ε). Τέλος, η ιστοχηµεία για τη β-γλουκουρονιδάση έδειξε το ίδιο πρότυπο εντοπισµού αυτού του ενζύµου στα λυσοσώµατα των πεπτικών κυττάρων τόσο στα µικρού µεγέθους µύδια (Εικ.32γ, 32στ) όσο και στα µεγάλου µεγέθους µύδια (Εικ. 33γ, 33στ). Συγκεκριµένα, η παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο έδειξε ότι η β- 160

173 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ γλουκουρονιδάση εντοπίζεται µε τη µορφή καφέ πυρήνων στο λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών. α δ L β ε L L γ στ L L Εικόνα 32. Ιστοχηµεία για τα λυσοσωµικά ένζυµα N-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β- γλουκουρονιδάση σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα των µικρού µεγέθους µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο (α, δ) Πεπτικό σωληνάριο και τµήµα πεπτικού σωληναρίου, αντίστοιχα, στα οποία παρατηρείται έντονη και οµοιόµορφη αντίδραση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση στα ετερολυσοσώµατα και τα υπολειπόµενα σωµάτια των πεπτικών κυττάρων. (β, ε) Πεπτικό σωληνάριο και τµήµα πεπτικού σωληναρίου, αντίστοιχα, στα οποία παρατηρείται θετική και οµοιόµορφη αντίδραση για το ένζυµο όξινη φωσφατάση στα ετερολυσοσώµατα και στα υπολειπόµενα σωµάτια. (γ, στ) Πεπτικό σωληνάριο και τµήµα πεπτικού σωληναρίου, αντίστοιχα, στα οποία εντοπίζεται θετική αντίδραση για το ένζυµο β- γλουκουρονιδάση µε τη µορφή καφέ πυρήνων στο λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών. α-γ: 1800 x, δ-στ: 4000x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 32. Histochemistry for the lysosomal enzymes N-acetyl-β-hexozaminidase, acid phosphatase and β- glucuronidase in the digestive gland cryosections of the small in size mussels M. galloprovincialis collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June (α, δ) Digestive tubule and part of digestive tubule, respectively, showing strong and homogenous reaction for the enzyme N-acetyl-βhexosaminidase in the heterolysosomes and the residual bodies of the digestive cells. (β, ε) Digestive tubule and part of the digestive tubule, respectively, showing positive and homogenous reaction for the enzyme acid phosphatase in the heterolysosmes and the residual bodies. (γ, στ) Digestive tubule and part of the digestive tubule, respectively, showing a positive reaction for the enzyme β-glucuronidase, as brown cores in the lysosomal system of mussels digestive cells. α-γ: 1800 x, δ-στ: 4000x, L: digestive tubule lumen L 161

174 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ α δ L L β ε L L γ στ L Εικόνα 33. Ιστοχηµεία για τα λυσοσωµικά ένζυµα N-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση, όξινη φωσφατάση και β- γλουκουρονιδάση σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα των µεγάλου µεγέθους µυδιών M. galloprovincialis που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο (α, δ) Πεπτικό σωληνάριο και τµήµα πεπτικού σωληναρίου, αντίστοιχα, στα οποία παρατηρείται έντονη και οµοιόµορφη αντίδραση για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση στα ετερολυσοσώµατα και τα υπολειπόµενα σωµάτια των πεπτικών κυττάρων. (β, ε) Πεπτικό σωληνάριο και τµήµα πεπτικού σωληναρίου, αντίστοιχα, στα οποία παρατηρείται θετική αντίδραση για το ένζυµο όξινη φωσφατάση µε τη µορφή κόκκων, κυρίως, στην περιφέρεια της των ετερολυσοσωµάτων και των υπολειπόµενων σωµατίων. (γ, στ) Πεπτικό σωληνάριο και τµήµα πεπτικού σωληναρίου, αντίστοιχα, στα οποία εντοπίζεται θετική αντίδραση για το ένζυµο β-γλουκουρονιδάση µε τη µορφή καφέ πυρήνων στο λυσοσωµικό σύστηµα των πεπτικών κυττάρων των µυδιών. α-γ: 1800 x, δ-στ: 4000x, L: αγωγός πεπτικού σωληναρίου Figure 33. Histochemistry for the lysosomal enzymes N-acetyl-β-hexozaminidase, acid phosphatase and β- g;ucuronidase in the digestive gland cryosections of the large in size mussels M. galloprovincialis collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June (α, δ) Digestive tubule and part of the digestive tubule, respectively, showing strong and homogenous reaction for the enzyme N-acetyl-βhexosaminidase in the heterolysosomes and residual bodies of the digestive cells. (β, ε) Digestive tubule and part of the digestive tubule, respectively, showing positive reaction for the enzyme acid phosphatase with the form of small granules, mainly in the periphery of the heterolysosmes and the residual bodies. (γ, στ) Digestive tubule and part of the digestive tubule, respectively, showing a positive reaction for the enzyme β-glucuronidase, as brown cores in the endolysosomal system of mussels digestive cells. α-γ: 1800 x, δ-στ: 4000x, L: digestive tubule lumen L 162

175 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 2.3. Εκτίµηση της κατάστασης υγείας των µυδιών M. galloprovincialis µε τον υπολογισµό του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» Για τον υπολογισµό του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)», που αφορά αποκλειστικά στα λυσοσώµατα, χρησιµοποιήθηκαν οι τιµές των παραµέτρων «σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης» και «πυκνότητα όγκου των λυσοσωµάτων». Οι τιµές των παραπάνω παραµέτρων εκτιµήθηκαν στον πεπτικό αδένα µυδιών M. galloprovincialis, τα οποία είχαν µικρό και µεγάλο µέγεθος κελύφους και συλλέχθηκαν από την περιοχή της Χαλάστρας τον Ιούνιο του Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα ( ιάγρ. 48), τα µικρού µεγέθους µύδια εµφάνισαν χαµηλά επίπεδα «stress» (0.5<LRI<1), ενώ τα µεγάλου µεγέθους µύδια εµφάνισαν µέτρια επίπεδα περιβαλλοντικού «stress» (1<LRI< 2). 2 Lysosomal Response Index (LRI) 1,5 1 0,5 high stress medium stress low stress unstress 0 ΜΙΚΡΑ ΜΥ ΙΑ ΜΕΓΑΛΑ ΜΥ ΙΑ ιάγραµµα 48. Τιµές του δείκτη «Lysosomal Response Index (LRI)» στον πεπτικό αδένα των µυδιών Μ. galloprovincialis µε µικρό και µεγάλο µέγεθος κελύφους που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο Τα µύδια κατηγοριοποιούνται σε τέσσερα επίπεδα «stress» ως εξής: LRI<0.5 (συνθήκες χωρίς «stress»), 0.5<LRI<1 (χαµηλά απίπεδα «stress»), 1<LRI< 2 (µέτρια επίπεδα «stress») και LRI> 2 (υψηλά επίπεδα «stress»). Diagram 48. Lysosomal Response Index (LRI) values in the digestive gland of mussels M. galloprovincialis with small and large in size shell collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June The mussels are classified in four stress levels as: LRI<0.5 (unstress), 0.5<LRI<1 (low stress), 1<LRI< 2 (medium stress) and LRI> 2 (high stress). 163

176 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 2.4. Μορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων των µυδιών M. galloprovincialis Οι µορφολογικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων εκτιµήθηκαν σε κρυοτοµές του πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis µε µικρό και µεγάλο κέλυφος µετά από ιστοχηµεία για το λυσοσωµικό ένζυµο Ν-ακετυλ-βεξοζαµινιδάση. Οι παράµετροι που εκτιµήθηκαν ήταν το «πάχος του επιθηλίου (ΜΕΤ)», ο «λόγος της ακτίνας του αγωγού των πεπτικών σωληναρίων προς το πάχος του επιθηλίου (MLR/MET)» και ο «λόγος του πάχους του επιθηλίου προς την ακτίνα του πεπτικού σωληναρίου (MET/MDR)». α β γ δ Εικόνα 34. Ιστοχηµεία για το ένζυµο Ν-ακετυλ-β-εξοζαµινιδάση σε κρυοτοµές πεπτικού αδένα µυδιών M. galloprovincialis µικρού και µεγάλου µεγέθους που συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα (Θερµαϊκός κόλπος) τον Ιούνιο (α-β) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών µικρού µεγέθους µε αυξηµένο πάχος επιθηλίου, σε σχέση µε τα µεγάλου µεγέθους µύδια. (γ-δ) Πεπτικά σωληνάρια µυδιών µεγάλου µεγέθους µε λεπτότερο πάχος επιθηλίου, σε σχέση µε τα µικρού µεγέθους µύδια. 500x Figure 34. N-acetyl-β-hexozaminidase histochemistry in the digestive gland cryosections of mussels M. galloprovincialis with small and large in size shell collected from Halastra (Thermaikos gulf) on June (α-β) Digestive tubules of small in size mussels showing increased digestive epithelial thickness. in relation to the large in size mussels. (γ-δ) Digestive tubules of large in size mussels showing decreased digestive epithelial thickness, in relation to the small in size mussels. 500x 164