ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ C1858T ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΤΥΡΟΣΙΝΙΚΗΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ 22 ΣΕ ΠΑΙΔΙΑ ΚΑΙ ΕΦΗΒΟΥΣ ΜΕ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ Ι

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΠΑΙΔΙΟΥ Δ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΕΜΠΟΡΙΑΔΟΥ-ΠΕΤΙΚΟΠΟΥΛΟΥ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ 3555 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ C1858T ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΤΥΡΟΣΙΝΙΚΗΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ 22 ΣΕ ΠΑΙΔΙΑ ΚΑΙ ΕΦΗΒΟΥΣ ΜΕ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ Ι ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΑΛ. ΓΚΙΖΑ ΠΑΙΔΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 2

3 3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΣΗΜΙΝΑ ΓΑΛΛΗ-ΤΣΙΝΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΥΦΗΜΙΑ ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ-ΑΛΑΤΑΚΗ ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΓΟΥΛΑΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΣΗΜΙΝΑ ΓΑΛΛΗ-ΤΣΙΝΟΠΟΥΛΟΥ ΕΥΦΗΜΙΑ ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ-ΑΛΑΤΑΚΗ ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΓΟΥΛΑΣ ΜΑΡΙΑ ΕΜΠΟΡΙΑΔΟΥ-ΠΕΤΙΚΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΙΑ ΧΑΤΖΗΣΤΥΛΙΑΝΟΥ-ΣΙΔΗΡΟΠΟΥΛΟΥ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΓΟΥΛΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/32, άρθρ και ν.1268/82, αρθρ. 50 8)

4 4

5 5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ-ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ ΤΟΥ ΤΟΜΕΑ ΥΓΕΙΑΣ ΠΑΙΔΙΟΥ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΔΡΟΣΟΥ-ΑΓΑΚΙΔΟΥ

6 6

7 7 Στη μνήμη του πατέρα μου. Έφυγε στην έναρξη αυτής της προσπάθειας. Στο γιο μου. Ήρθε στην ολοκλήρωσή της.

8 8

9 9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 13 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ορισμός-Επιδημιολογία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 (ΣΔ1) Παθογένεια, φυσική πορεία και παθοφυσιολογία του ΣΔ Γενετική επιδημιολογία του ΣΔ Ο ρόλος των πρωτεϊνικών τυροσινικών φωσφατασών (PTPs) H λεμφοειδική φωσφατάση (Lyp) Ο ρόλος της Lyp στη σηματοδότηση του υποδοχέα των Τ 35 λεμφοκυττάρων (TCR) 1.7 Η λειτουργική επίδραση του C1858T πολυμορφισμού του γονιδίου 41 της πρωτεϊνικής τυροσινικής φωσφατάσης μη υποδοχέα τύπου 22 (ΡΤΡΝ22) στη Lyp 1.8 Η συμβολή του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού στην παθογένεια 46 του ΣΔ1 1.9 Μελέτες συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το 50 ΣΔ Μελέτες ανάλυσης σύνδεσης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού 54 με το ΣΔ Άλλου τύπου γενετικές μελέτες της σχέσης του ΡΤΡΝ22 C1858T 56 πολυμορφισμού με το ΣΔ Συσχέτιση του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με άλλες παθήσεις Η εθνική ποικιλότητα του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού Η Lyp ως μελλοντικός θεραπευτικός στόχος 60 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Τύπος μελέτης Δείγμα 65 Ομάδα ασθενών 65 Ομάδα ελέγχου 66 Μέγεθος 67 Ηθική δεοντολογία Πρωτόκολλο 68

10 Μέθοδος 75 Απομόνωση ολικού δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) 75 Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 77 Επώαση των PCR προϊόντων με ένζυμο περιορισμού 79 Ηλεκτροφόρηση Χρηματοδότηση Στατιστική ανάλυση Έλεγχος αντιπροσωπευτικότητας δείγματος με τη χρήση του 82 θεωρήματος Hardy-Weinberg 2.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ευρήματα γονοτύπισης 84 Απομόνωση ολικού DΝΑ 84 Εκλεκτική ενίσχυση του ΡΤΡΝ22 γονιδίου με την PCR 84 Ενζυμική πέψη των PCR προϊόντων Χαρακτηριστικά ομάδας ασθενών Συγκρίσεις μεταξύ ομάδας ασθενών και ομάδας ελέγχου ως προς 88 τους γονότυπους και τα αλληλόμορφα του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού Ευρήματα ως προς την ισορροπία Hardy-Weinberg Έλεγχος γενετικού αποτελέσματος μεταλλαγμένου αλληλόμορφου Συγκρίσεις ασθενών φορέων και μη του ελάσσονος 93 αλληλόμορφου ως προς δημογραφικά στοιχεία Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 94 ως προς στοιχεία από το περιγεννητικό ιστορικό Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 95 ως προς στοιχεία από το ατομικό ιστορικό Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 98 ως προς το οικογενειακό ιστορικό ΣΔ1 και άλλων αυτοάνοσων νοσημάτων Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 98 ως προς κλινικές παραμέτρους και στοιχεία του ηλεκτροκαρδιογραφήματος (ΗΚΓ) Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 99 ως προς παραμέτρους του λιπιδαιμικού ελέγχου Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς προθρομβωτικούς παράγοντες 104

11 Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 104 ως προς το γλυκαιμικό έλεγχο Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 105 ως προς τον ορμονικό έλεγχο της θυρεοειδικής λειτουργίας Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 106 ως προς τα αυτοαντισώματα της θυρεοειδικής αυτοανοσίας και της κοιλιοκάκης Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου 108 ως προς τα HLA-DRB1 και HLA-DQB1 αλληλόμορφα 2.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 141 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 145 SUMMARY 151 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 155 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 185 Πρωτόκολλο 185 Δεδομένα

12 12

13 13 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ AGA-IgA anti-gliadin antibodies IgA AGA-IgG anti-gliadin antibodies IgG anti-tg anti-thyroglobulin antibodies anti-tpo anti-thyroid peroxidase antibodies APC antigen presenting cell ApoA1 apolipoprotein A1 ApoB apolipoprotein B Arg arginine BCR B cell receptor C cytosine Ca calcium CBP Csk binding protein c-cbl c-casitas b-lineage lymphoma CD cluster of differentiation CI confidence interval Csk C-terminal Src kinase CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte antigen-4 DAISY Diabetes Autoimmunity Study in the Young DNA deoxyribonucleic acid dntp deoxynucleotide DPT-1 Diabetes Prevention Trial-Type 1 EDTA ethylene-diamine-tetraacetic-acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay EMA endomysial antibodies ERK extracellular signal-regulated kinase ESPGHAN European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition FOXP3 forkhead box P3 ft 3 free T 3 ft 4 free T 4 GADA glutamic acid decarboxylase antibodies Grb2 growth factor receptor-bound protein 2 GWAS genome-wide association study HbA1c glycosylated hemoglobulin

14 14 HDL HLA IAA IA-2A ICA IDF Ig IL INF INS ISPAD ITAM LAT Lck LD LDL LOD Lp(a) Lyp λs MHC NK OGTT OR P PAG PAI-1-Ag p c PCR-SSP PDT PEST PTK PTP high density lipoprotein human leukocyte antigen insulin autoantibodies insulinoma-associated antigen-2 autoantibodies islet cell autoantibodies International Diabetes Federation immunoglobulin interleukin interferon insulin International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes immunoreceptor tyrosine-based activation motif linker of activated T cells lymphocyte specific kinase linkage disequilibrium low density lipoprotein logarithm of odds lipoprotein (a) lymphoid phosphatase sibling risk ratio major histocompatibility complex natural killer oral glucose tolerance test odds ratio proline protein associated with GEM plasminogen activator inhibitor-1 antigen p corrected polymerase chain reaction-sequence specific primer pedigree disequilibrium test proline-, glutamic acid-, serine- and threonine-rich protein tyrosine kinase protein tyrosine phosphatase PTPN22 protein tyrosine phosphatase non receptor type 22 p value probability value rpm round per minute

15 15 RR relative risk SH2 Src Homology 2 SH3 Src Homology 3 SLP76 SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kda SNP single nucleotide polymorhism SD standard deviation SDS standard deviation score T thymine T1DGC Type 1 Diabetes Genetics Consortium TC total cholesterol TCF7 transcription factor 7 TCR T cell receptor TG triglyceride Th T helper Treg T regulatory Trp tryptophane TSH thyroid stimulating hormone TTG tissue transglutaminase antibodies Tyr tyrosine VCP valosine containing protein vwf-ag von Willebrand factor-antigen WHO World Health Organization ZAP-70 zeta-chain associated protein 70 ZnT8Ab zinc transporter 8 autoantibodies ΒΓ βάρος γέννησης ΒΣ βάρος σώματος ΔΑΠ διαστολική αρτηριακή πίεση ΔΚΟ διαβητική κετοξέωση ΔΜΣ δείκτης μάζας σώματος ΕΘ εκατοστιαία θέση ΗΚΓ ηλεκτροκαρδιογράφημα ΗΠΑ Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής ΜΘ μητρικός θηλασμός ΠΛ περίμετρος λαιμού ΠΜ περίμετρος μέσης ΡΑ ρευματοειδής αρθρίτιδα

16 16 ΣΑΠ συστολική αρτηριακή πίεση ΣΔ1 σακχαρώδης διαβήτης τύπου 1 ΣΕΛ συστηματικός ερυθηματώδης λύκος Συν συνεργάτες ΥΣ ύψος σώματος

17 17 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Αρχικά, αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω την απεριόριστη ευγνωμοσύνη μου στην επιβλέπουσα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, την κυρία Ασημίνα Γαλλή-Τσινοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παιδιατρικής- Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας, για την τιμή την οποία μου έκανε να μου αναθέσει την παρούσα διδακτορική διατριβή. Θα ήθελα να την ευχαριστήσω ολόψυχα για την άψογη επίβλεψη, την ουσιαστική καθοδήγηση, τις συμβουλές και τις υποδείξεις, την αμέριστη υποστήριξη και τη συνεχή ενθάρρυνση, τις οποίες μου παρείχε προκειμένου να αντιμετωπιστούν όλες οι δυσκολίες και να ολοκληρωθεί αυτή η προσπάθεια, καθώς και για τις πολύτιμες γνώσεις τις οποίες μου μετέδωσε και την ανέκτιμητη εμπειρία την οποία μοιράστηκε μαζί μου σε όλα τα`χρόνια της συνεργασίας μας. Επίσης, θεωρώ υποχρέωσή μου να ευχαριστήσω όλους όσους χωρίς τη βοήθεια των οποίων δε θα είχε ολοκληρωθεί η παρούσα διδακτορική διατριβή. Την κυρία Ευφημία Παπαδοπούλου-Αλατάκη, Επίκουρη Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Παιδιατρικής Ανοσολογίας, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για το συνεχές ενδιαφέρον, τη βοήθεια την οποία μου παρείχε με προθυμία και τις εμπεριστατωμένες επιστημονικά επισημάνσεις και διορθώσεις κυρίως σε ό,τι αφορά το ανοσολογικό μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Τον κύριο Αντώνιο Γούλα, Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακολογίας, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, ο οποίος με τις γνώσεις του με μύησε στον κόσμο της μοριακής γενετικής και με τη βοήθεια, την καθοδήγηση και την ενθάρρυνση του οποίου πραγματοποιήθηκε το κύριο εργαστηριακό μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Η συμβολή του στο σχεδιασμό, τη διενέργεια και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων του κύριου εργαστηριακού μέρους της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ουσιαστική.

18 18 Την κυρία Μαρία Εμποριάδου, Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Παιδιατρικής Πνευμονολογίας, την κυρία Μαρία Χατζηστυλιανού-Σιδηροπούλου, Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Παιδιατρικής Ανοσολογίας, τον κύριο Γεώργιο Καρακιουλάκη, Καθηγητή Φαρμακολογίας, Κοσμήτορα της Σχολής Επιστημών Υγείας, και τον κύριο Δημήτριο Γουλή, Επίκουρο Καθηγητή Ενδοκρινολογίας Αναπαραγωγής, για την τιμή την οποία μου έκαναν να συμμετάσχουν στη επταμελή εξεταστική επιτροπή, τον πολύτιμο χρόνο τον οποίο αφιέρωσαν στη μελέτη της παρούσας διδακτορικής διατριβής και τα εύστοχα σχόλια για την τελική διαμόρφωση του κειμένου. Την κυρία Σμαράγδα Ευφραιμίδου, βιολόγο στο Αιματολογικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου, και την κυρία Εμμανουέλα Γκμπάντι, βιολόγο και υποψήφια διδάκτορα στο Α Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, για τη βοήθεια στην πραγματοποίηση του κύριου εργαστηριακού μέρους της παρούσας διδακτορικής διατριβής καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές. Το προσωπικό του Αιματολογικού και Βιοχημικού Εργαστηρίου καθώς και του Εργαστηρίου Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου για τη διενέργεια του εργαστηριακού ελέγχου των παιδιών και εφήβων με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1. Τους συνεργάτες στο Παιδοδιαβητολογικό Εξωτερικό Ιατρείο και το ιατρικό και νοσηλευτικό προσωπικό της Δ Παιδιατρικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στο Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου για τη βοήθεια στη συλλογή των δειγμάτων. Τα παιδιά, τους εφήβους και τις οικογένειές τους για τη συμμετοχή χωρίς την οποία δε θα είχε πραγματοποιηθεί η παρούσα διδακτορική διατριβή. Τους συμμετέχοντες στην ομάδα ελέγχου για την προθυμία και την κατανόηση τις οποίες επέδειξαν μετά τη λεπτομερή ενημέρωσή τους.

19 19 Τη Διαβητολογική Εταιρεία Βορείου Ελλάδος για την οικονομική υποστήριξη την οποία παρείχε άμεσα για τη διενέργεια του κύριου εργαστηριακού μέρους της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω το σύζυγό μου, Αστέριο Γκαγκάλη, γαστρεντερολόγο, για την υπομονή την οποία επέδειξε και την ενθάρρυνση την οποία μου παρείχε σε όλη την πορεία αυτής της προσπάθειας και κυρίως στην τελική φάση συγγραφής της παρούσας διδακτορικής διατριβής, την αδερφή μου, Ευαγγελία Γκίζα, νευρολόγο, για την ψυχική υποστήριξη, τις`συμβουλές και την προθυμία να παρέχει οποιουδήποτε είδους βοήθεια και τη μητέρα μου, Αναστασία, για τη διαρκή ηθική συμπαράσταση και για ό,τι είμαι μέχρι σήμερα. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είναι αφιερωμένη στη μνήμη του πατέρα μου, ο οποίος μου εμφύσησε υποσυνείδητα την αγάπη για την Παιδιατρική και υπήρξε παράδειγμα σε όλη την επιστημονική πορεία μου, και στο γιο μου, η προσμονή του οποίου μου παρείχε το ψυχικό σθένος για την ολοκλήρωσή της.

20 20

21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 21

22 22

23 Ορισμός-Επιδημιολογία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 (ΣΔ1) Ο ΣΔ1, χρόνια διαταραχή του μεταβολισμού της γλυκόζης, είναι η πιο συχνή αυτοάνοση πάθηση της παιδικής ηλικίας, με επίπτωση στην ηλικιακή ομάδα 0-14 ετών η οποία κυμαίνεται ευρέως. Συγκεκριμένα, στη Φινλανδία και στη Σαρδηνία παρουσιάζονται τα υψηλότερα ποσοστά (>40 και 37.8/ παιδικού πληθυσμού/έτος, αντίστοιχα), ενώ τα χαμηλότερα ποσοστά έχουν αναφερθεί στη Βενεζουέλα και στην Κίνα (0.1 και / παιδικού πληθυσμού/έτος, αντίστοιχα) (1). Σε ό,τι αφορά την Ελλάδα, με βάση τα τελευταία δημοσιευμένα στη διεθνή βιβλιογραφία δεδομένα, η επίπτωση υπολογίστηκε σε 9.7 (2), 6.2 (3) και 6.1 (4) / παιδικού πληθυσμού/έτος στη μητροπολιτική Αθήνα, σε πέντε περιοχές της Βόρειας Ελλάδας και στην Κρήτη, αντίστοιχα (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Η επίπτωση του ΣΔ1 σε αγόρια και κορίτσια ηλικίας 0-14 ετών ανά ηλικιακή ομάδα και έτος καταγραφής στη μητροπολιτική Αθήνα (τροποποιημένο από Bartsokas CS, et al. Epidemiology of childhood IDDM in Athens: trends in incidence for the years Eurodiab ACE G1 Group. Diabetologia 1998;41: ) (2)

24 Παθογένεια, φυσική πορεία και παθοφυσιολογία του ΣΔ1 Ο ΣΔ1 αποτελεί μία όργανο-ειδική αυτοάνοση διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από εκλεκτική καταστροφή των ινσουλινοπαραγωγών β- κυττάρων των παγκρεατικών νησιδίων του Langerhans, η οποία οδηγεί σε ισόβια εξάρτηση από τη θεραπεία υποκατάστασης με εξωγενή χορήγηση ινσουλίνης (5). Θεωρείται πολυπαραγοντική νόσος, καθώς απαιτείται η αλληλεπίδραση γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων για την πυροδότηση της αυτοανοσίας των β-κυττάρων σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα (6). Η ένδειξη για την επίδραση των γενετικών παραγόντων στην εμφάνιση ΣΔ1 είναι ισχυρή, όπως υποδηλώνεται όχι μόνο από την υψηλότερη συμπτωτικότητα στους μονοωογενείς (40-50%) (7) συγκριτικά με τους διωογενείς διδύμους (5-6%) (8) αλλά και από την ενδοοικογενειακή συνάθροιση περιστατικών της νόσου (9). Αν και η αναλογία ταυτόχρονης εμφάνισης του ΣΔ1 στους διωογενείς διδύμους είναι παρόμοια με αυτή η οποία παρατηρείται στα αμφιθαλή αδέρφια, παραμένει 10 ως 15 φορές υψηλότερη συγκριτικά με το γενικό πληθυσμό ( %) (10). Μία καλή εκτίμηση της γενετικής επίδρασης σε μία πάθηση αποτελεί η αναλογία κινδύνου αδερφών (sibling risk ratio, λs), η οποία υπολογίζεται ως η αναλογία του επιπολασμού της πάθησης στα αδέρφια προσβεβλημένων ατόμων ως προς τον επιπολασμό της πάθησης στο γενικό πληθυσμό. Μία λs μεγαλύτερη του 5 συνήθως υποδεικνύει μία σημαντική γενετική επίδραση στην παθογένεια μιας πάθησης (11). Στην περίπτωση του ΣΔ1, η λs υπολογίστηκε 15, μία από τις υψηλότερες μεταξύ των πολυπαραγοντικών νόσων (12). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η συμβολή της κληρονομικότητας στην αιτιολογία του ΣΔ1 εκτιμάται να προσεγγίζει το 50%. Από την άλλη πλευρά, η έλλειψη συμπτωτικότητας στους μονοωογενείς διδύμους υποστηρίζει και το σημαντικό ρόλο των περιβαλλοντικών παραγόντων στην πυροδότηση του ΣΔ1 (7). Μεταξύ αυτών έχουν προταθεί η διατροφή, η πρωτεΐνη του γάλατος αγελάδας, η ανεπάρκεια της βιταμίνης D, ιοί, φάρμακα,

25 25 τοξίνες, το στρες, χωρίς να έχει αποδειχθεί σαφής και οριστική αιτιολογική συσχέτιση του ΣΔ1 με ένα συγκεκριμένο περιβαλλοντικό παράγοντα (13). Η αλληλεπίδραση γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων οδηγεί σε μία σειρά γεγονότων στη φυσική πορεία του ΣΔ1. Η υπόθεση της γραμμικής απώλειας των β-κυττάρων η οποία διατυπώθηκε από τον Eisenbarth το 1986 εξακολουθεί να αποτελεί το πιο διαδεδομένο μοντέλο αναφοράς για τη φυσική πορεία του ΣΔ1. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο γενετικά προδιατεθειμένα άτομα έρχονται σε επαφή με συγκεκριμένους περιβαλλοντικούς παράγοντες οι οποίοι πυροδοτούν την αυτοανοσία των παγκρεατικών νησιδίων του Langerhans, οδηγώντας σε γραμμική ελάττωση της μάζας των β-κυττάρων, ανάπτυξη αυτοαντισωμάτων, υπεργλυκαιμία και τελικά απώλεια του C-πεπτιδίου (14) (Εικόνα 2). Εικόνα 2. Φυσική πορεία του ΣΔ1 (τροποποιημένο από van Belle TL, et al. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev 2011;91:79-118) (15) Έχει τεκμηριωθεί ότι η αυτοάνοση καταστροφή των β-κυττάρων διενεργείται από τα κυτταροτοξικά CD8 + T λεμφοκύτταρα με τη συμβολή των βοηθητικών CD4 + Τ λεμφοκυττάρων (16). Ο ΣΔ1 χαρακτηρίζεται από την

26 26 επέκταση των αυτοαντιδραστικών CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία εμπλέκονται ενεργά στην εμφάνιση της νόσου, την ενεργοποίηση του ενδογενούς ανοσιακού συστήματος και την παραγωγή αυτοαντισωμάτων (17). Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι τα CD8 + T λεμφοκύτταρα διαδραματίζουν κύριο ρόλο στα πρώιμα στάδια του ΣΔ1 (18), ενώ τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα είναι απαραίτητα στην επαγωγή της αυτοανοσίας. Τα αυτοαντισώματα δεν έχουν άμεσο παθογενετικό ρόλο, αλλά, στην περίπτωση κατά την οποία ανιχνεύονται στο περιφερικό αίμα, είναι προγνωστικά για τη μετάβαση σε κλινικό ΣΔ1 (17, 18). Στον ορό των ασθενών με ΣΔ1 μπορούν να ανιχνευθούν ειδικά αυτοαντισώματα έναντι των κυττάρων των νησιδίων (islet cell autoantibodies, ICA), της ινσουλίνης (insulin autoantibodies, IAA), των ισομορφών 65 και 67 της αποκαρβοξυλάσης του γλουταμινικού οξέος (glutamic acid decarboxylase autoantibodies, GADA), του σχετιζόμενου με το ινσουλίνωμα αντιγόνου 2 (insulinoma-associated antigen- 2 autoantibodies, IA-2A), και του ψευδαργυρικού μεταφορέα 8 (zinc transporter 8 autoantibodies, ZnT8Ab) (13). Έχει προταθεί ότι άγνωστοι παθογενετικοί παράγοντες πιθανόν προάγουν την απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών και αυτοαντιγόνων από τα β-κύτταρα. Τα αυτοαντιγόνα μπορεί να δεσμευτούν από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (antigen presenting cell, APC) και να παρουσιαστούν σε βοηθητικά (T helper, Th) τύπου 1 και ρυθμιστικά (T regulatory, Treg) Τ λεμφοκύτταρα επί των παγκρεατικών λεμφαδένων. Σε φυσιολογικές συνθήκες τα Treg λεμφοκύτταρα αναστέλλουν την Th1 απάντηση μέσω κυτταροκινών, αλλά τα προδιατεθειμένα άτομα παρουσιάζουν ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων, παραγωγή αυτοαντισωμάτων και καταστροφή των β-κυττάρων από τα Τ λεμφοκύτταρα (17). Μία πιθανή εξήγηση για την εμφάνιση αυτοαντιδραστικών Τ λεμφοκυττάρων έναντι αυτοαντιγόνων τα οποία εντοπίζονται στα β-κύτταρα είναι η αποτυχία των φυσιολογικών μηχανισμών της κεντρικής και περιφερικής ανοχής. Στην πρώτη περίπτωση, αντιγόνο-ειδικά αυτοαντιδραστικά Τ

27 27 λεμφοκύτταρα ωριμάζουν και διαφεύγουν της αρνητικής επιλογής από το θύμο στην περιφέρεια στην περιγεννητική περίοδο. Στη δεύτερη περίπτωση, δεν καταστέλλεται η ενεργοποίηση των φυσιολογικών Τ λεμφοκυττάρων (19). Συγκεκριμένα, η κεντρική ανοχή λαμβάνει χώρα στο θύμο, οδηγεί στην ωρίμανση και επιλογή των θυμικών κυττάρων και περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (major histocompatibility complex, MHC) επί των APCs, των πεπτιδίων της προϊνσουλίνης και του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (Τ cell receptor, TCR) των θυμικών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας η συντριπτική πλειοψηφία (98%) των ισχυρών αυτοαντιδραστικών θυμικών κυττάρων υφίστανται αρνητική επιλογή, ενώ μόνο ένα μικρό ποσοστό (2%), τα οποία παρουσιάζουν μικρή συγγένεια με αυτό το σύμπλεγμα, υφίστανται θετική επιλογή και μεταναστεύουν ως ώριμα θυμικά κύτταρα στην περιφέρεια. Εκεί, εξελίσσονται σε ώριμα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα και μεσολαβούν στις ανοσιακές απαντήσεις. Τα πεπτίδια της προϊνσουλίνης από τα β-κύτταρα του παγκρέατος, αφού υποστούν επεξεργασία από τα APCs, παρουσιάζονται από τα MHC τάξης II μόρια στον υποδοχέα των CD4 + T λεμφοκυττάρων. Στη συνέχεια, τα αυτοαντιδραστικά CD4 + T λεμφοκύτταρα διεγείρουν τα CD8 + T λεμφοκύτταρα να επιτεθούν στα β-κύτταρα του παγκρέατος τα οποία εκφράζουν τα πεπτίδια της προϊνσουλίνης μέσω των MHC τάξης I μορίων επί της επιφάνειάς τους. Ένας άλλος πληθυσμός Τ λεμφοκυττάρων, ο οποίος μεταναστεύει από το θύμο και εκφράζει το μεταγραφικό παράγοντα FOXP3 (forkhead box P3), εξελίσσεται σε CD4 + /CD25 + Treg λεμφοκύτταρα. Αυτά τα κύτταρα αποτελούν μεσολαβητέςκλειδιά της περιφερικής ανοχής. Ο μηχανισμός δράσης τους δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητός. Ωστόσο, η ισορροπία μεταξύ των Treg και των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων διαδραματίζει κύριο ρόλο στην ανάπτυξη της ανοχής (20) (Εικόνα 3).

28 28 Εικόνα 3. Οι μηχανισμοί της κεντρικής και περιφερικής ανοχής στο ΣΔ1 (τροποποιημένο από Ounissi-Benkalha H, et al. The molecular genetics of type 1 diabetes: new genes and emerging mechanisms. Trends Mol Med 2008;14: ) (20)

29 29 Και στις δύο περιπτώσεις αποτυχίας των μηχανισμών ανοχής σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η TCR σηματοδότηση. Πράγματι, διαταραχές στην TCR σηματοδότηση εμπλέκονται γενικά στην αυτοανοσία (21, 22) αλλά και ειδικά στο ΣΔ1, καθώς έχει ανευρεθεί ανώμαλη TCR σηματοδότηση στα περιφερικά Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών (23, 24). Είναι εύκολο να υποθέσει κανείς ότι μεταβολές στα συστατικά των μορίων τα οποία μεσολαβούν στην TCR σηματοδότηση θα μπορούσαν να επηρεάσουν την έκβασή της (25). Ο βασικός ρόλος της σηματοδότησης των Τ λεμφοκυττάρων στην παθοφυσιολογία του ΣΔ1 ενισχύεται από μελέτες οι οποίες υποδεικνύουν ότι πολλές προδιαθεσικές γονιδιακές θέσεις κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται σε αυτή. Ειδικά, τα γονίδια τα οποία κωδικοποιούν τυροσινικές φωσφατάσες αποτελούν ενδιαφέρον αντικείμενο μελέτης για την ταυτοποίηση προδιαθεσικών πολυμορφισμών, οι οποίοι εμπλέκονται στην καταστολή της αυτόματης ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων και περιορίζουν την απάντηση στο αντιγόνο, αποφωσφορυλιώνοντας και απενεργοποιώντας τις TCR σχετιζόμενες τυροσινικές κινάσες και τα υποστρώματά τους (26). Έτσι, η σηματοδότηση των Τ λεμφοκυττάρων αποτελεί ευρύ αντικείμενο μελέτης στο ΣΔ Γενετική επιδημιολογία του ΣΔ1 Η αναγνώριση των υπεύθυνων γενετικών παραγόντων καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη σύγχρονη κατανόηση της υποκείμενης παθοφυσιολογίας της νόσου και συμβάλλει στην αναγνώριση ατόμων υψηλού κινδύνου για εμφάνιση ΣΔ1, τα οποία θα ωφεληθούν από τη μελλοντική εφαρμογή δοκιμασιών παρέμβασης κατά τη διάρκεια των προκλινικών σταδίων της διαταραχής. Οι προσπάθειες ταυτοποίησης των υπεύθυνων γονιδίων βασίζονται σε δύο καλά τεκμηριωμένα εργαλεία, τις μελέτες συσχέτισης και τις μελέτες ανάλυσης σύνδεσης. Οι μελέτες συσχέτισης μπορούν να ανιχνεύσουν γενετικούς παράγοντες με μικρή συμβολή στον κίνδυνο εμφάνισης μιας νόσου με γενετικό

30 30 υπόβαθρο, με την προϋπόθεση ότι το υπό μελέτη αλληλόμορφο απαντάται συχνά στον πληθυσμό. Από την άλλη πλευρά, οι μελέτες σύνδεσης μπορούν να αναγνωρίσουν γονίδια με μικρή συχνότητα εμφάνισης στον πληθυσμό, εφόσον παρουσιάζουν σημαντική επίδραση στον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου (27). Για πολυγονιδιακές νόσους, όπως ο ΣΔ1, η ισχύς των μελετών ανάλυσης σύνδεσης είναι περιορισμένη εξαιτίας της ελλιπούς γνώσης του αριθμού των εμπλεκόμενων γονιδίων, των πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους (επίσταση) και της δράσης άγνωστων περιβαλλοντικών παραγόντων. Έτσι, πολλοί ερευνητές έχουν στραφεί σε μελέτες συσχέτισης, εστιάζοντας σε υποψήφια γονίδια (28). Από το 2007 έχει αρχίσει και η δημοσίευση μελετών ευρείας γονιδιωματικής συσχέτισης (genome-wide association study, GWAS), οι οποίες αφορούν σε πέντε μεγάλες σειρές ασθενών και έχουν διερευνήσει περισσότερους από 2x10 5 μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (single nucleotide polymorphism, SNP) (29). Με τη χρήση αυτών των εργαλείων έχει αυξηθεί ο αριθμός των γονιδιακών θέσεων οι οποίες έχουν συσχετιστεί με το ΣΔ1. Ωστόσο, λίγες έχουν χαρτογραφηθεί με ακρίβεια και έχουν αντιστοιχηθεί με μία συγκεκριμένη μετάλλαξη ή με ένα συγκεκριμένο γονίδιο (29). Μέχρι σήμερα, περισσότερα από 60 γονίδια έχουν αναγνωριστεί να προδιαθέτουν στην εμφάνιση ΣΔ1 (30) (Εικόνα 4) και μεταξύ αυτών πρωτεύοντα ρόλο διαδραματίζουν εκείνα των αντιγόνων των ανθρώπινων λευκών αιμοσφαιρίων (human leucocyte antigen, HLA) του MHC, τα οποία εντοπίζονται στο χρωμόσωμα 6p21, το γονίδιο της ινσουλίνης (insulin, INS) στο χρωμόσωμα 11p15, το γονίδιο του αντιγόνου-4 του κυτταροτοξικού Τ λεμφοκυττάρου (cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4) στο χρωμόσωμα 2q31 και το γονίδιο της πρωτεϊνικής τυροσινικής φωσφατάσης μη υποδοχέα τύπου 22 (protein tyrosine phosphatase non receptor type 22, PTPN22) στο χρωμόσωμα 1p13 (31). Από αυτά τα γονίδια, τα HLA, CTLA-4 και το πιο πρόσφατα μελετημένο PTPN22 κωδικοποιούν μόρια τα οποία διαδραματίζουν

31 κύριο ρόλο στο σύστημα της ανοσίας και εμπλέκονται ενεργά στη διαδικασία της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων (32). 31 Εικόνα 4. Κατάλογος των πιο συχνά μελετούμενων υποψήφιων γονιδίων/γονιδιακών θέσεων του ΣΔ1 (τροποποιημένο από Morahan G. Insights into type 1 diabetes provided by genetic analyses. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2012;19: ) (30) Το ΡΤΡΝ22 γονίδιο κλωνοποιήθηκε το 1999, εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 1p13.2 (33) και αποτελείται από 21 εξόνια (34). Κωδικοποιεί μία πρωτεϊνική τυροσινική φωσφατάση (protein tyrosine phosphatase, PTP), τη λεμφοειδική φωσφατάση (lymphoid phosphatase, Lyp) (33). Η Lyp διαδραματίζει ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της TCR σηματοδότησης (26, 35-37), η οποία είναι καθοριστική για τον πολλαπλασιασμό και την

32 ωρίμανση των Τ λεμφοκυττάρων (38), και, επομένως, εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία του ΣΔ1 (26) Ο ρόλος των πρωτεϊνικών τυροσινικών φωσφατασών (PTPs) Οι πρωτεϊνικές τυροσινικές κινάσες (protein tyrosine kinase, PTK) και οι PTPs αποτελούν ένζυμα τα οποία καταλύουν αντιστρεπτά την προσθήκη ή απελευθέρωση φωσφορικών ομάδων καταλοίπων τυροσίνης (tyrosine, Tyr) σηματοδοτικών μεσολαβητών. Οι σηματοδοτικοί μεσολαβητές αποτελούν χημικούς αγγελιοφόρους οι οποίοι επιστρατεύονται για τη μετάδοση μηνυμάτων από τον εξωκυττάριο στον ενδοκυττάριο χώρο και οδηγούν σε αλλαγές της κυτταρικής συμπεριφοράς. Η φωσφορυλίωση και η αποφωσφορυλίωση πρωτεϊνών, οι οποίες συντελούνται αντίστοιχα από τις PTKs και PTPs σε διεγερτικά ή ανασταλτικά κατάλοιπα τυροσίνης σηματοδοτικών μεσολαβητών, ισοδυναμούν με μοριακούς διακόπτες, οι οποίοι μεταβάλλουν την ενζυμική δραστικότητα ή τη συγγένεια σύνδεσης λειτουργικών περιοχών, οι οποίες ενισχύουν ή αναστέλλουν μία σειρά μοριακών αλληλεπιδράσεων και αντιδράσεων. Επομένως, η κατάσταση φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών μπορεί να θεωρηθεί ως μία θεμελιώδης και συντονισμένη διαδικασία η οποία επιτρέπει στα κύτταρα να προσαρμόζονται σε σταδιακές ή αιφνίδιες αλλαγές του περιβάλλοντος, αλλά πρέπει να τελεί υπό αυστηρό έλεγχο. Το γεγονός αυτό εκφράζεται απόλυτα στο πλαίσιο μιας ανοσιακής απάντησης, κατά την οποία τα κύτταρα πρέπει να ενεργοποιούνται κάτω από κατάλληλες συνθήκες για να ελέγχουν λοιμώξεις ή νεοπλασίες, αλλά να αποφεύγουν τις αυτοαντιδράσεις οι οποίες χαρακτηρίζουν την αυτοανοσία (39). Οι PTPs και οι PTKs δρουν συνεργικά για τον έλεγχο των οδών σηματοδότησης με αποτέλεσμα τη ρύθμιση ποικίλων φυσιολογικών κυτταρικών διαδικασιών όπως είναι η διαφοροποίηση, η μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός, η ενεργοποίηση και η απόπτωση των κυττάρων του

33 33 ανοσιακού συστήματος (40). Ωστόσο, αν και οι ΡΤΚs ενισχύουν σήματα, η οδός, ο ρυθμός και η διάρκεια του σήματος βρίσκονται υπό την εποπτεία των ΡΤΡs (39). Έτσι, στην περίπτωση σφάλματος στη λειτουργία ή έκφραση συγκεκριμένων ΡΤΡs, οι οποίες εμπλέκουν σημαντικούς σηματοδοτικούς μεσολαβητές υπεύθυνους για την οριοθέτηση της ανοσιακής απάντησης, γίνεται αντιληπτή η σημασία της λειτουργίας των ΡΤΡs στη διατήρηση της ανοσιακής ομοιόστασης (41). Οι PTPs διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τις τύπου υποδοχέα, οι οποίες χαρακτηρίζονται από την παρουσία εξωκυττάριων τμημάτων τα οποία μπορούν να συνδεθούν με εξωκυττάρια συνδετικά μόρια, και τις τύπου μη υποδοχέα, οι οποίες αποτελούν ενδοκυττάριες πρωτεΐνες των οποίων η εντόπιση είναι κυρίως κυτταροπλασματική. Και οι δύο κατηγορίες εμπλέκονται σε διαδικασίες όπως η διαφοροποίηση, η ενεργοποίηση ή η αναστολή των λεμφοκυττάρων (39, 42-44). Μεταξύ των PTPs τύπου μη υποδοχέα ιδιαίτερη θέση κατέχει η Lyp H λεμφοειδική φωσφατάση (Lyp) Η Lyp περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1999 (33) και ανήκει στην οικογένεια των PTPs πλούσιων σε προλίνη, γλουταμινικό οξύ, σερίνη και θρεονίνη (proline-, glutamic acid-, serine- and threonine-rich, PEST) (41, 42, 45, 46). Το ανάλογό της στον επίμυ είχε περιγραφεί το 1992 (47), αποτελεί μία πλούσια σε προλίνη φωσφατάση (proline enriched phosphatase, PEP) (34, 47) και φέρει την ονομασία ΡΤΡΝ8. Η Lyp αποτελεί μία 105 kda πρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από 807 αμινοξέα. Περιλαμβάνει μία καταλυτική περιοχή -η οποία παρουσιάζει 89% ταύτιση αλληλουχίας με την ΡΕΡ- στο αμινο- (ΝΗ 2 -) τελικό άκρο (33), μία ενδιάμεση περιοχή -της οποίας η δομή δεν έχει εξακριβωθεί- (34) και μία μη καταλυτική περιοχή -η οποία παρουσιάζει 61% ταύτιση αλληλουχίας με την ΡΕΡστο μακρύ καρβοξυ- (COOH-) τελικό άκρο, το οποίο αποτελεί τα 2/3 του μήκους

34 34 της πρωτεΐνης. Η καταλυτική περιοχή φέρει δραστηριότητα ΡΤΡ, ενώ η μη καταλυτική περιοχή φέρει εντός των τελευταίων 200 καταλοίπων τέσσερις πλούσιες σε προλίνη (proline, P) αλληλουχίες (Ρ1-Ρ4), οι οποίες εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση της Lyp με άλλες πρωτεΐνες (33). Στον άνθρωπο ανιχνεύονται τρεις ισομορφές της Lyp: η Lyp1, η οποία αποτελεί την κύρια ισομορφή και αποτελείται από 807 αμινοξέα (41), η Lyp2, η οποία αποτελεί τη βραχύτερη ισομορφή (33, 41) και περιλαμβάνει μόνο την Ρ1 αλληλουχία του COOH-τελικού άκρου (41) και η Lyp3, η οποία παρουσιάζει μία απαλοιφή 28 αμινοξέων μεταξύ των αλληλουχιών Ρ1 και Ρ2 (34) (Εικόνα 5). Η Lyp1 ανιχνεύεται στις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις και αποτελεί το αντικείμενο όλων των λειτουργικών μελετών μέχρι σήμερα. Έτσι, ενώ η λειτουργία της Lyp1 έχει διερευνηθεί εκτενώς και έχει διευκρινιστεί η εμπλοκή της στη ρύθμιση των ανοσιακών απαντήσεων, ο βιολογικός ρόλος των Lyp2 και Lyp3 παραμένει άγνωστος (41). Εικόνα 5. Τα γονίδια των ισομορφών της Lyp (τροποποιημένο από Burn GL, et al. Why is PTPN22 a good candidate susceptibility gene for autoimmune disease? FEBS Lett 2011;585: ) (41) Η Lyp αναγνωρίζεται ως μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, αν και μία μικρή ποσότητα ανιχνεύεται και στην περιπυρηνική περιοχή (33). Εκφράζεται

35 35 αποκλειστικά στα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος, το θύμο (33, 48, 49), το σπλήνα (33, 48), το μυελό των οστών (48, 49), το εμβρυικό ήπαρ, τους λεμφαδένες (48), τις αμυγδαλές (33), τα Β και Τ λεμφοκύτταρα (33, 49, 50), τα δενδριτικά κύτταρα, τα κύτταρα φυσικούς φονείς (natural killer, NK), τα μονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα. Τα επίπεδα έκφρασης της Lyp διαφέρουν στις κυτταρικές σειρές του ανοσιακού συστήματος και είναι υψηλότερα στα ΝΚ, τα ουδετερόφιλα και τα δενδριτικά κύτταρα, ενδιάμεσα στα CD8 + T λεμφοκύτταρα και χαμηλά στα CD4 + T και Β λεμφοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα (49) Ο ρόλος της Lyp στη σηματοδότηση του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) Έχει υποτεθεί ότι η Lyp διαδραματίζει ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της TCR σηματοδότησης (26, 35-37), η οποία είναι καθοριστική για τον πολλαπλασιασμό και την ωρίμανση των Τ λεμφοκυττάρων (38). Η αναγνώριση του ειδικού αντιγόνου, το οποίο έχει υποστεί επεξεργασία και παρουσιάζεται από τα MHC μόρια, από τον TCR επάγει την ενεργοποίησή του μέσω μιας διαδικασίας καταρράκτη η οποία περιλαμβάνει τη διαδοχική αποφωσφορυλίωση και επακόλουθη φωσφορυλίωση πρωτεϊνικών υποστρωμάτων (35, 38, 51, 52). Το κύριο γεγονός της TCR σηματοδότησης είναι η ενεργοποίηση της λεμφοκυτταρικής ειδικής κινάσης (lymphocyte specific kinase, Lck) της οικογένειας των Src κινασών. Το CD45 ενεργοποιεί την Lck μέσω αποφωσφορυλίωσης στην Tyr505 (41, 42), η οποία ακολουθείται από την αυτοφωσφορυλίωση στην Tyr394 (35, 41, 42, 51). Ως συνέπεια, η Lck πλησιάζει τα κυτταροπλασματικά τμήματα των αμετάβλητων TCR υπομονάδων όπως οι TCRζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ. Καθεμιά από αυτές τις υπομονάδες περιλαμβάνει τουλάχιστον ένα ανοσοδεσμευτικό βασισμένο στην τυροσίνη μοτίβο ενεργοποίησης (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM). Η ενεργοποιημένη Lck δρα φωσφορυλιώνοντας τα κατάλοιπα Tyr εντός των

36 36 προστατευμένων αλληλουχιών αναγνώρισης των ITAMs (35, 53). Όταν τα ITAMs του TCR ενεργοποιούνται, προκύπτουν υψηλής συγγένειας θέσεις σύνδεσης για τις διαδοχικές SH2 (Src Homology 2) θέσεις της ΡΤΚ ZAP-70 (zeta-chain associated protein 70), η οποία ανήκει στην οικογένειας Syk, και περιλαμβάνει πολλά διεγερτικά και ανασταλτικά κατάλοιπα τυροσίνης (35, 38, 51). Μετά τη σύνδεση της ZAP-70 με τα ITAMs, η ZAP-70 ενεργοποιείται από την Lck (35, 51), ή εναλλακτικά από μόνη της, οδηγώντας σε αυξημένη καταλυτική δραστικότητα (51). Στη συνέχεια, η ZAP-70 φωσφορυλιώνει μεσολαβητές του καταρράκτη (41), συμπεριλαμβανομένων του συνδέσμου των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων (linker of activated T cells, LAT) (35, 54, 55), της περιλαμβανόμενης εντός της SH2 περιοχής λευκοκυτταρικής πρωτεΐνης των 76 kda (SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kda, SLP76) (35, 56), του Vav και της συνδετικής πρωτεΐνης του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (growth factor receptorbound protein 2, Grb2). Το Vav αποτελεί έναν παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (35, 41, 57), ενώ το Grb2 αποτελεί ένα ρυθμιστικό μόριο το οποίο εμπλέκεται στη σύνδεση των PTKs στη σηματοδότηση του Ras (58). Μεταξύ των τελικών επιδράσεων περιλαμβάνονται η ενεργοποίηση της ERK (extracellular signal-regulated kinases) οδού, μιας αλυσίδας πρωτεϊνών η οποία μεταφέρει το μήνυμα από την επιφάνεια του κυττάρου στον πυρήνα, η επαγωγή της μεταγραφής της ιντερλευκίνης (interleukin, IL) 2 και η απελευθέρωση του ασβεστίου (calcium, Ca 2+ ) από το ενδοπλασματικό δίκτυο (59). Η Lyp στοχεύει σε ποικίλους σηματοδοτικούς μεσολαβητές, οι οποίοι είναι γνωστό ότι συμμετέχουν σε εγγύς σηματοδοτικά γεγονότα, τα οποία ακολουθούν την αλληλεπίδραση του TCR με σύμπλοκα MHC μορίων-πεπτιδίων (41). Πειράματα απομόνωσης υποστρώματος σε ανθρώπινα Jurkat Τ λεμφοκύτταρα έδειξαν ότι η Lyp αλληλεπιδρά με την Lck, τη ZAP-70, το Vav, τα CD3ε ITAMs, τον TCRf, την περιέχουσα βαλοσίνη πρωτεΐνη (valosine containing

37 protein, VCP), το Grb2 και το πρωτοογκογονίδιο c-cbl (c-casitas b-lineage lymphoma) (35, 48, 60) (Εικόνα 6). 37 Εικόνα 6. Οι σηματοδοτικοί μεσολαβητές της TCR σηματοδότησης στους οποίους δρα η Lyp (τροποποιημένο από Burn GL, et al. Why is PTPN22 a good candidate susceptibility gene for autoimmune disease? FEBS Lett 2011;585: ) (41) Καθώς η Lyp αποτελεί κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, αλλά τα υποστρώματα-στόχοι της στο πλαίσιο αναστολής της TCR σηματοδότησης εντοπίζονται κοντά στην κυτταρική μεμβράνη, πρέπει η Lyp να προσεγγίσει την κυτταρική μεμβράνη. Η Lyp μπορεί να στοχεύσει στην κυτταρική μεμβράνη μέσω αλληλεπίδρασης με την Csk κινάση (C-terminal Src kinase). Η Csk, αν και, επίσης, εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, μπορεί να στοχεύσει στην κυτταρική μεμβράνη μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με τη διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία εντοπίζεται στις «σχεδίες λιπιδίων» και η οποία καλείται συνδετική της Csk πρωτεΐνη (Csk binding protein, CBP) ή, διαφορετικά, συνδεόμενη με την GEM πρωτεΐνη (protein associated with GEM, PAG). Όταν η PAG φωσφορυλιώνεται από τη Fyn της οικογένειας των Src κινασών, προσελκύει την Csk μέσω της

38 38 υψηλής συγγένειας SH2 θέσης σύνδεσης. Από την άλλη πλευρά, η ασυνήθιστα υψηλής συγγένειας αλληλεπίδραση της Lyp και της Csk πραγματοποιείται μέσω της Ρ1 αλληλουχίας της Lyp με την SH3 περιοχή της Csk και, συγκεκριμένα, της αργινίνης (arginine, Arg) 620 με την τρυπτοφάνη (tryptophane, Trp) 47, αντίστοιχα, και καταλήγει σε ένα Csk/Lyp σύμπλοκο το οποίο προσκολλάται στην κυτταρική μεμβράνη μέσω της PAG και δρα συνεργικά για την αναστολή της εγγύς TCR σηματοδότησης (60, 61) (Εικόνα 7). Η αναστολή της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων επιτυγχάνεται μέσω σύνδεσης της Lyp με μία ποικιλία μορίων προσκόλλησης συμπεριλαμβανομένων όχι μόνο της Csk (60) αλλά και των c-cbl (33) και Grb2 (48). Προκειμένου να ασκηθεί η αρνητική ρυθμιστική δράση, απαιτείται η αποφωσφορυλίωση βασικών πρωτεϊνικών τυροσινικών κινασών του TCR σηματοδοτικού καταρράκτη, στις οποίες περιλαμβάνονται οι Lck και ZAP-70 (60). Το κύριο γεγονός της αναστολής της TCR σηματοδότησης αποτελεί η απενεργοποίηση της Lck για την οποία απαιτείται η συνεργική δράση Csk και Lyp. Η Csk είναι μία 50 kda κυτταροπλασματική κινάση, η οποία εκφράζεται σε όλους τους τύπους κυττάρων αλλά σε μεγαλύτερη αναλογία στα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος και ελέγχει την ωρίμανση των κυττάρων του θύμου σε ώριμα Τ λεμφοκύτταρα (62). Περιλαμβάνει τις SH2 και SH3 περιοχές στο ΝΗ 2 - τελικό άκρο καθώς και το CΟΟΗ-τελικό καταλυτικό άκρο (60). Θα έπρεπε να τονιστεί ότι η Lyp και η Csk στοχεύουν σε διαφορετικά κατάλοιπα τυροσίνης της Lck. Η Csk φωσφορυλιώνει την Lck στην ανασταλτική Tyr505 του CΟΟΗ-τελικού άκρου δημιουργώντας μία εσωτερική SH2 συνδετική περιοχή, η οποία διευκολύνει το σχηματισμό μιας εσωτερικής αγκύλης δίκην «δήγματος ουράς» και απενεργοποιεί εν μέρει την Lck. Για την πλήρη απενεργοποίηση της καταλυτικής δραστηριότητάς της Lck απαιτείται η αποφωσφορυλίωση της διεγερτικής με δράση PTK Tyr394 της Lck από τη Lyp (63, 64) (Εικόνα 7).

39 39 Εικόνα 7. Η απενεργοποίηση της Lck με τη συνεργική δράση Csk και Lyp (τροποποιημένο από Burn GL, et al. Why is PTPN22 a good candidate susceptibility gene for autoimmune disease? FEBS Lett 2011;585: ) (41) Η αναστολή της TCR σηματοδότησης μπορεί να επιτευχθεί και με τη σύνδεση της Lyp και με άλλα ρυθμιστικά μόρια. Υπάρχει η θεωρία ότι η Lyp μπορεί να στοχεύει στη ZAP-70 μέσω του c-cbl. Η ZAP-70 φωσφορυλιώνει τους εγγύς TCR σηματοδοτικούς μεσολαβητές καθώς και τα ρυθμιστικά μόρια στα οποία στοχεύει και πιθανό ρυθμίζει αρνητικά η Lyp. Από την άλλη πλευρά, το c- Cbl είναι ένα πρωτοογκογονίδιο (33) το οποίο φωσφορυλιώνεται μετά την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων (65). Η Lyp, με την οποία συνδέεται στα κύτταρα του θύμου, μπορεί να ρυθμίσει τη δραστηριότητά του, ελέγχοντας το επίπεδο φωσφορυλίωσης του. Η αύξηση της δραστικότητας της Lyp ελαττώνει τη φωσφορυλίωση του c-cbl (33). Η Lyp συνδεόμενη με το c-cbl μπορεί να έχει ως στόχο και να ρυθμίσει αρνητικά τη ZAP-70 (66, 67). Συγκεκριμένα, το σύμπλοκο Lyp και c-cbl μέσω της SH2 περιοχής του c-cbl μπορεί να συνδεθεί με τη φωσφορυλιωμένη ανασταλτική Tyr292 της ZAP-70, προκειμένου να απενεργοποιηθεί και να ανασταλεί η περαιτέρω ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων μέσω αποφωσφορυλίωσης διεγερτικών καταλοίπων τυροσίνης από τη Lyp (36) (Εικόνα 8).

40 40 Εικόνα 8. Ο μηχανισμός με τον οποίο η Lyp στοχεύει στη ZAP-70 μέσω του c-cbl (τροποποιημένο από Brand O, et al. HLA, CTLA-4 and PTPN22: the shared genetic master-key to autoimmunity? Expert Rev Mol Med 2005;7:1-15) (32) Ένα άλλο ρυθμιστικό μόριο στο οποίο στοχεύει και ρυθμίζει αρνητικά η Lyp αποτελεί το Grb2. Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι το Grb2 μπορεί να διαδραματίζει ένα διπλό ρόλο σε ό,τι αφορά τον καταρράκτη της οδού σηματοδότησης της μεσολαβούμενης από το CD28 ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων (68, 69, 70). Από τη μία πλευρά επάγει την TCR σηματοδότηση ενεργοποιώντας το Ras, ενώ, από την άλλη πλευρά, συνδέεται με το CTLA-4, ένα ανάλογο του CD28 και αναστολέα της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων, και το λειτουργικό σύμπλοκο του Grb2 με τη Lyp χρησιμοποιείται για τη διευκόλυνση της αναστολής της TCR σηματοδότησης (48) (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Ο προτεινόμενος μηχανισμός με τον οποίο το CTLA-4 μπορεί να χρησιμοποιεί το σύμπλοκο Lyp/Grb2 για την αναστολή της TCR σηματοδότησης (τροποποιημένο από Brand O, et al. HLA, CTLA-4 and PTPN22: the shared genetic master-key to autoimmunity? Expert Rev Mol Med 2005;7:1-15) (32)

41 41 Γίνεται αντιληπτό ότι η Lyp διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αναστολή της TCR σηματοδότησης καθώς και στην αναστολή της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Καθώς η δραστικότητα της Lyp επάγεται ακολουθώντας την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, πιθανολογείται ότι η τροποποίηση της σηματοδότησης των Τ λεμφοκυττάρων αποτελεί μία σημαντική δράση της Lyp (41) Η λειτουργική επίδραση του C1858T πολυμορφισμού του γονιδίου της πρωτεϊνικής τυροσινικής φωσφατάσης μη υποδοχέα τύπου 22 (ΡΤΡΝ22) στη Lyp Το προδιαθεσικό σε αυτοανοσία αλληλόμορφο του ΡΤΡΝ22 γονιδίου είναι μία μετάλλαξη η οποία χαρακτηρίζεται από αντικατάσταση της αζωτούχου βάσης κυτοσίνης (cytosine, C) από θυμίνη (thymine, T) στο νουκλεοτίδιο 1858 της αλληλουχίας του δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος (deoxyribonucleic acid, DNA). Η μετάλλαξη οδηγεί σε αντικατάσταση του αμινοξέος Arg από Trp στο κωδικόνιο 620 της Lyp (Lyp R620W). Αυτή η μετάλλαξη δεν επηρεάζει την καταλυτική περιοχή της Lyp (71). Η Arg620 είναι ένα σημαντικό αμινοξύ στην P1 περιοχή της Lyp, καθώς αλληλεπιδρά με την Trp47 στη συνδετική σχισμή της SH3 περιοχής της Csk (72). Η μελέτη της τρισδιάστατης δομής του Csk/Lyp συμπλόκου έδειξε ότι η πλευρική αλυσίδα της Trp620 είναι ογκωδέστερη της Arg620. Έτσι, η Lyp R620W αποτυγχάνει να συνδεθεί με την Csk (73). Καθώς η δημιουργία του Csk/Lyp συμπλόκου είναι σημαντική για την άσκηση της ανασταλτικής δράσης της Lyp στην TCR σηματοδότηση, αναμένεται μεταβολή το ορίου πυροδότησης αυτής. Ωστόσο, οι λειτουργικές συνέπειες της Lyp R620W και ο μηχανισμός με τον οποίο το PTPN22 γονίδιο δρα ως προδιαθεσική γονιδιακή περιοχή της αυτοανοσίας παραμένουν υπό διερεύνηση (74). Οι πρώτες μελέτες οι οποίες αφορούσαν στις λειτουργικές συνέπειες της Lyp R620W σε ανθρώπινα Τ

42 42 λεμφοκύτταρα υποστήριξαν ότι αποτελεί μετάλλαξη επαγωγής λειτουργικότητας (75, 76). Από την άλλη πλευρά, πιο πρόσφατα δεδομένα συνηγορούν υπέρ της υπόθεσης ότι η Lyp R620W αποτελεί μετάλλαξη έκπτωσης λειτουργικότητας (74). Οι Vang και συν (75) μελέτησαν ανθρώπινα πρωτογενή και Jurkat T λεμφοκύτταρα ασθενών με ΣΔ1, ετεροζυγωτών φορέων και μη του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου. Διαπίστωσαν συγκριτικά μειωμένη παραγωγή IL-2 μετά TCR διέγερση με αντισώματα έναντι των CD3ε και CD28, αυξημένη καταλυτική δραστικότητα της κωδικοποιούμενης φωσφατάσης, με αποτέλεσμα μειωμένη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες εμπλέκονται στα πρώιμα στάδια της TCR σηματοδότησης και, επομένως, ισχυρότερη αναστολή της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων στους φορείς του ελάσσονος αλληλόμορφου. Παράλληλα, δεν κατέγραψαν διαφορά στους υποπληθυσμούς των Τ λεμφοκύτταρων, στην οποία θα μπορούσαν να αποδοθούν αυτές οι παρατηρήσεις. Πιο πρόσφατα, οι Rieck και συν (76) διερεύνησαν τις λειτουργικές επιπτώσεις της Lyp R620W απευθείας σε ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα ετεροζυγωτών και ομοζυγωτών υγιών φορέων του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου. Καταγράφηκε μειωμένη κινητοποίηση Ca +2 από τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα ομοζυγωτών φορέων του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου μετά από TCR διέγερση με αντίσωμα έναντι του CD3. Ανάλογες παρατηρήσεις δεν πραγματοποιήθηκαν μετά φαρμακολογική διέγερση με ιονομυκίνη, η οποία παρακάμπτει τα πρώιμα γεγονότα της TCR σηματοδότησης. Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν υπέρ του ρόλου του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού στην κεντρική οδό της TCR σηματοδότησης και της ισχυρότερης αναστολής της. Επιπλέον, κατά την TCR διέγερση των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων των ετεροζυγωτών φορέων του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου διαπιστώθηκαν μειωμένη έκφραση του πρώιμου δείκτη ενεργοποίησης CD25 και μειωμένη παραγωγή IL-10. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήθηκε τάση μειωμένης παραγωγής IL-2 αλλά σε

43 43 στατιστικά μη σημαντικό επίπεδο. Ο πολλαπλασιασμός των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων, ο οποίος αποτελεί λιγότερο ευαίσθητο δείκτη της TCR σηματοδότησης, δε μεταβλήθηκε στους ετεροζυγώτες φορείς της μετάλλαξης συγκριτικά με τους μη φορείς. Εντούτοις, το προφίλ των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων διαφοροποιήθηκε, με αποτέλεσμα αύξηση των μνημονικών και μείωση των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων. Οι Aarnisalo και συν (77) κατέγραψαν στα CD4 + T λεμφοκύτταρα παιδιών με ΣΔ1, φορέων του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου, μειωμένο πολλαπλασιασμό και παραγωγή IL-2 μετά από διέγερση με αντισώματα έναντι των CD3 και CD28 καθώς και σημαντικά μειωμένη κινητοποίηση Ca +2 μετά από φαρμακολογική διέγερση με φυτοαιμαγλουτινίνη. Μειωμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού διαπιστώθηκε και στα CD4 + T λεμφοκύτταρα υγιών ατόμων με PTPN22 C1858Τ γονότυπο μετά από διέγερση με αντισώματα έναντι των CD3 και CD28. Οι Zikherman και συν (74) χρησιμοποίησαν ως εργαλείο μέτρησης τη φωσφορυλίωση της ERK οδού σε Jurkat Τ λεμφοκύτταρα, στα οποία εκφράζεται η Lyp R620 ή η Lyp W620 μόνη της ή σε συνδυασμό με την Csk, μετά από διέγερση με αντίσωμα έναντι του CD3. Διαπιστώθηκαν σημαντικά αυξημένη ενεργοποίηση της ERK οδού και κινητοποίηση Ca +2 στα κύτταρα τα οποία συνεκφράζουν την Lyp W620 και την Csk. Αυτά τα αποτελέσματα ενισχύουν την υπόθεση ότι η Lyp R620W στην περίπτωση συνέκφρασης με την Csk αποτελεί μία μετάλλαξη έκπτωσης λειτουργικότητας, η οποία οδηγεί σε αυξημένη TCR σηματοδότηση. Η σημασία της συνέκφρασης της Lyp R620W με την Csk απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Σε μία μελέτη η οποία αφορούσε σε ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με μυασθένεια Gravis, διαπιστώθηκε αύξηση του αριθμού των κυττάρων τα οποία παράγουν IL-2 στους φορείς της Lyp R620W μετάλλαξης μετά από διέγερση με αυτοαντιγόνο. Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι αυτό το εύρημα συνεπάγεται αύξηση της παραγωγής IL-2, αλλά δεν προχώρησαν σε απευθείας

44 44 μέτρηση της εκκρινόμενης IL-2. Ωστόσο, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τουλάχιστον στους ασθενείς με μυασθένεια Gravis πρόκειται μάλλον για μετάλλαξη έκπτωσης λειτουργικότητας (78). Οι διαφορές στα αποτελέσματα των μελετών μπορεί να οφείλονται στα διαφορετικά μέσα διέγερσης της TCR σηματοδότησης ή στα διαφορετικά εργαλεία εκτίμησης αυτής. Εξάλλου, τα αποτελέσματα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή ανάλογα με το είδος και την προέλευση των κυττάρων μελέτης. Είναι πιθανόν ότι στην περίπτωση μελέτης κυττάρων ασθενών και άλλα προδιαθεσικά στην αυτοανοσία γονίδια τα οποία κωδικοποιούν ανοσολογικά ή λειτουργικά σχετιζόμενες πρωτεΐνες μπορεί να εμπλέκονται στις παρατηρούμενες λειτουργικές συνέπειες, δρώντας ανεξάρτητα ή συνεργικά με τη Lyp R620W. Εντούτοις, αν και δεν υπάρχει ακόμη ομοφωνία, οι περισσότερες μελέτες οι οποίες βασίζονται σε ανθρώπινα πρωτογενή Τ λεμφοκύτταρα υποστηρίζουν ότι η Lyp R620W μετάλλαξη οδηγεί σε επαγωγή λειτουργικότητας (41). Αν και η συντριπτική πλειοψηφία των μελετών έχει εστιάσει στα Τ λεμφοκύτταρα και στην καταγραφή της TCR σηματοδότησης, ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός φαίνεται να επηρεάζει και τη σηματοδότηση του υποδοχέα των Β λεμφοκυττάρων (B cell receptor, BCR). Υπάρχουν αρχόμενες ενδείξεις υπέρ πιθανής διαταραχής της BCR σηματοδότησης στους φορείς της Lyp R620W μετάλλαξης (41). Οι Rieck και συν (76) μελέτησαν τις λειτουργικές επιπτώσεις της Lyp R620W και σε Β λεμφοκύτταρα και κατέγραψαν μειωμένη κινητοποίηση Ca +2 μετά από BCR διέγερση με αντίσωμα έναντι της ανοσοσφαιρίνης (immunoglobulin, Ig) M καθώς και τροποποίηση των δεξαμενών τους και, συγκεκριμένα, μείωση των μνημονικών Β λεμφοκυττάρων. Οι Μenard και συν (79) επιβεβαίωσαν την παρουσία αυξημένου αριθμού πολυδραστικών νέων μεταναστευτικών/μεταβατικών και ώριμων παρθένων Β λεμφοκυττάρων σε υγιείς φορείς του PTPN Τ αλληλόμορφου,

45 45 υποδεικνύοντας το ρόλο του PTPN22 C1858T πολυμορφισμού στην επαγωγή της μεταβολής των κεντρικών και περιφερικών μηχανισμών ανοχής των Β λεμφοκυττάρων. Παρόμοια, στους ασθενείς με ΣΔ1, φορείς του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου, διαπίστωσαν υψηλότερες συχνότητες αυτοαντιδραστικών κλώνων στις δεξαμενές των νέων μεταναστευτικών/μεταβατικών και ώριμων παρθένων Β λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, παρατήρησαν ότι ο PTPN22 C1858T πολυμορφισμός επηρεάζει τη μεταγραφή του γονιδίου σε ώριμα παρθένα Β λεμφοκύτταρα υγιών ατόμων και προκαλεί την επαγωγή αρκετών γονιδίων τα οποία ανήκουν σε οδούς των BCR, CD40 και TLR (Toll like receptor), οι οποίες συγκλίνουν στον NF-kB (nuclear factor-kappa B). Τέλος, ώριμα παρθένα Β λεμφοκύτταρα τα οποία έφεραν το προδιαθεσικό αλληλόμορφο παρουσίαζαν όχι μόνο αυξημένη έκφραση του CD40 αλλά και αυξημένη απαντητικότητα μετά CD40 διέγερση. Οι Habib και συν (80) κατέγραψαν επέκταση των πληθυσμών των μεταβατικών και ανεργικών IgD + IgM - CD27 - Β λεμφοκυττάρων, μειωμένη BCR σηματοδότηση και αντίσταση στην απόπτωση στις δεξαμενές τόσο των μεταβατικών όσο και των παρθένων Β λεμφοκυττάρων. σε υγιείς ετεροζυγώτες φορείς του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου. Αυτές οι διαταραχές παρατηρήθηκαν και σε ασθενείς με ΣΔ1 ανεξάρτητα από την παρουσία του PTPN22 C1858T πολυμορφισμού. Μέχρι στιγμής δεν έχει αποδειχθεί αν ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός επηρεάζει τη λειτουργία και άλλων κυτταρικών σειρών οι οποίες εμπλέκονται στους μηχανισμούς της αυτοανοσίας, όπως τα δενδριτικά και NK κύτταρα (81). Είναι χαρακτηριστικό ότι η Lyp εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα δενδριτικά κύτταρα (41) και έχει βρεθεί ότι είναι σημαντική για τον πολλαπλασιασμό των ΝΚ κυττάρων (82). Πάντως, απαιτείται περαιτέρω έρευνα σε ό,τι αφορά τα κύτταρα του ανοσιακού συστήματος πλην των λεμφοκυττάρων.

46 Η συμβολή του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού στην παθογένεια του ΣΔ1 Αν και οι λειτουργικές συνέπειες των Lyp R620 και Lyp W620 έχουν αναγνωριστεί, ο τρόπος με τον οποίο δρουν στην εκδήλωση της αυτοανοσίας παραμένει υπό διερεύνηση. Δεν είναι απίθανο η Lyp R620W μετάλλαξη να οδηγεί τόσο σε επαγωγή όσο και σε έκπτωση λειτουργικότητας σε διαφορετικές οδούς εντός του ίδιου κυττάρου ή σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (41). Το γεγονός ότι η Lyp εκφράζεται στα λεμφοκύτταρα, τα οποία με τη μορφή των κυτταροτοξικών CD8 + αλλά και με τη συμβολή των βοηθητικών CD4 + Τ λεμφοκυττάρων εμπλέκονται στην καταστροφή των β-κυττάρων των νησιδίων του παγκρέατος, συνεπάγεται ότι η προδιάθεση σε ΣΔ1 πιθανόν συσχετίζεται με διαταραχή της λειτουργίας των Τ λεμφοκυττάρων (50). Καθώς η Lyp αποτελεί σημαντικό ρυθμιστικό παράγοντα της TCR σηματοδότησης, είναι αναμενόμενο ότι το όριο πυροδότησης αυτής μεταβάλλεται. Η μεταβολή αυτή μπορεί να συμβάλει στην απώλεια της κεντρικής ή και της περιφερικής ανοχής ή να επηρεάσει τα Treg λεμφοκύτταρα (41). Μία ερμηνεία για τον τρόπο με τον οποίο η Lyp R620W μετάλλαξη μπορεί να συμβάλει στην παθογένεια του ΣΔ1 είναι μέσω αλλαγών στα όρια της θυμικής επιλογής. Αν και δεν υπάρχουν αναφορές για την εμπλοκή της Lyp στη θετική και αρνητική επιλογή, ο υψηλός βαθμός έκφρασης της Lyp στα θυμικά κύτταρα πιθανόν υπονοεί σημαντικό ρόλο κατά την εκπαίδευση των Τ λεμφοκυττάρων. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι μόνο στο θύμο μπορούν να ανιχνευθούν και οι τρεις ισομορφές της Lyp (34). Πιθανολογείται ότι η Lyp παρουσιάζει σημαντική εμπλοκή στο επίπεδο ανοχής των θυμικών κυττάρων και διαφυγής των αυτοαντιδραστικών Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες θα είχαν υποστεί αρνητική επιλογή (83). Στην περίπτωση κατά την οποία το προδιαθεσικό στη νόσο αλληλόμορφο αποδειχθεί ότι επάγει τη λειτουργικότητα της Lyp, οδηγώντας σε περαιτέρω αναστολή της TCR σηματοδότησης, προκύπτει το εύλογο ερώτημα πως η

47 47 αναστολή της ενεργοποίησης των κυττάρων του ανοσιακού συστήματος επάγει την αυτοανοσία. Ωστόσο, η αύξηση στον ουδό της θυμικής επιλογής, ο οποίος απαιτείται για την αποτελεσματική TCR σηματοδότηση και την ωρίμανση των θυμικών κυττάρων, μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της αρνητικής επιλογής υψηλής συγγένειας αυτοαντιδραστικών Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες θα είχαν καταστραφεί κατά την ανάπτυξη του θύμου, οδηγώντας σε μία μεγάλη δεξαμενή αυτοαντιδραστικών Τ λεμφοκυττάρων και σε αυξημένη προδιάθεση σε αυτοανοσία (84). Αντίστροφα, μία Lyp R620W μετάλλαξη έκπτωσης δραστικότητας μπορεί να δρα στα λίγα κύτταρα τα οποία τυχαία διαφεύγουν την αρνητική επιλογή, οδηγώντας σε συντήρηση ή και αύξηση της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων και κατευθύνοντας τη διαφοροποίηση των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια, γεγονός το οποίο συντελεί τελικά στην αυτοανοσία (41). Μία εναλλακτική ερμηνεία σχετίζεται με την πιθανή εμπλοκή των Treg λεμφοκυττάρων. Στην περιφέρεια όλων των φυσιολογικών ατόμων κυκλοφορούν αυτοαντιδραστικά Τ λεμφοκύτταρα και τα Treg λεμφοκύτταρα αποτελούν μείζονα ρυθμιστικό μηχανισμό για να αποτρέψουν την εμφάνιση της αυτοανοσίας (85). Αν και ο ρόλος του ΡΤΡΝ22 γονιδίου στα Treg λεμφοκύτταρα δεν έχει αποδειχθεί, στην περίπτωση επιβεβαίωσης της επαγωγικής ενζυμικής δραστικότητας της Lyp R620W μετάλλαξης, αυτή θα μπορούσε να ερμηνεύσει τη μειωμένη TCR σηματοδότηση στα Treg λεμφοκύτταρα με αποτέλεσμα ανεπάρκεια στη ρύθμιση των αυτοαντιδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια (41, 86). Πράγματι, η αύξηση της δραστικότητας της Lyp W620 των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τη δραστηριότητα και την επέκταση των Treg λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια. Βρέθηκε ότι τα Treg λεμφοκύτταρα φέρουν χαμηλότερα επίπεδα Lyp συγκριτικά με τα δραστικά Τ λεμφοκύτταρα, γεγονός το οποίο υπονοεί έναν άμεσο πιθανό μηχανισμό επίδρασης της Lyp στη λειτουργία των Treg λεμφοκυττάρων. Εξάλλου, καθώς το

48 48 επίπεδο της TCR σηματοδότησης αποτελεί σημαντικό ρυθμιστικό παράγοντα της διαφοροποίησης των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων, είναι πιθανόν ότι η μειωμένη TCR σηματοδότηση επηρεάζει τη διαφοροποίηση των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων σε ειδικά Th λεμφοκύτταρα, ευνοώντας πιθανόν την εμφάνιση διαβητογόνων Τh1 λεμφοκυττάρων τα οποία παράγουν ιντερφερόνη (interferon, INF) γ στους φορείς της Lyp R620W μετάλλαξης. Η παρατήρηση ότι τα Τ λεμφοκύτταρα των φορέων της Lyp W620 παρουσιάζουν διαφορετικό προφίλ έκκρισης κυτταροκινών συνάδει με αυτή την υπόθεση (87) (Εικόνα 10). Εικόνα 10. Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί εμπλοκής της πιθανολογούμενης αυξημένης ενζυμικής δραστικότητας της Lyp R620W μετάλλαξης στην αυτοανοσία (τροποποιημένο από Gregersen PK. Gaining insight into PTPN22 and autoimmunity. Nat Genet 2005;37: ) (86) Είναι ενδιαφέρον να επισημανθεί το γεγονός ότι ένα κοινό χαρακτηριστικό των αυτοάνοσων παθήσεων με τις οποίες έχει συσχετιστεί ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός, μεταξύ των οποίων και ο ΣΔ1, είναι η παρουσία αυτοαντισωμάτων (86). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε απώλεια της ανοχής των Τ

49 49 λεμφοκυττάρων ή σε επίδραση των Τh λεμφοκυττάρων. Εναλλακτικά, το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο μπορεί να επηρεάζει άμεσα την ωρίμανση, επιλογή και λειτουργία των Β λεμφοκυττάρων μεταβάλλοντας τη μετάδοση της ΒCR σηματοδότησης (88). Εξάλλου, το επίπεδο της BCR σηματοδότησης είναι άρρηκτα συνδεδεμένο με την κεντρική και την περιφερική ανοχή. Διαταραχή των μηχανισμών κεντρικής και περιφερικής ανοχής των Β λεμφοκυττάρων, οι οποίοι χαρακτηρίζουν το ΣΔ1, έχουν διαπιστωθεί ήδη από το προκλινικό στάδιο, καθώς παρόμοιες διαταραχές καταγράφηκαν και σε υγιείς φορείς του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού. Έχει υποτεθεί ότι ο αυξημένος αριθμός αυτοαντιδραστικών Β λεμφοκυττάρων ο οποίος παρατηρήθηκε σε φορείς της Lyp R620W μετάλλαξης θα μπορούσε να επάγει την αυτοανοσία μέσω της δέσμευσης και της παρουσίασης των αυτοαντιγόνων στα Τ λεμφοκύτταρα (79, 89). Αν και τα λεμφοκύτταρα είναι η πιο προφανής κατηγορία κυττάρων του ανοσιακού συστήματος τα οποία συνδέονται άρρηκτα με την αυτοανοσία, μία ανοσιακή απάντηση απαιτεί τη συμμετοχή όλων των κυττάρων του ανοσιακού συστήματος. Εξάλλου, μία αυτοάνοση απάντηση είναι πιθανό να μην οφείλεται αποκλειστικά σε ενδογενείς διαταραχές των λεμφοκυττάρων (41). Επομένως, είναι πιθανόν ότι και η μεταβολή της σηματοδότησης και άλλων κυτταρικών σειρών του ανοσιακού συστήματος μπορεί να συμβάλει στη δράση του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού και την αυξημένη προδιάθεση των φορέων σε αυτοανοσία (81). Είναι χαρακτηριστικό ότι τα δενδριτικά κύτταρα τα οποία είναι υπεύθυνα για την αντιγονοπαρουσίαση και την προσέλκυση Th λεμφοκυττάρων εκφράζουν υψηλά επίπεδα Lyp. Επομένως, η υπερβολική ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, η οποία οδηγεί σε ανάπτυξη αυτοανοσίας, μπορεί να είναι αποτέλεσμα διαταραγμένης αντιγονοπαρουσίασης (41). Παράλληλα, έχει βρεθεί ότι η Lyp είναι σημαντική για τον πολλαπλασιασμό των ΝΚ κυττάρων (82), τα οποία συμβάλλουν στην αυτοανοσία με ποικίλους μηχανισμούς (90).

50 Μελέτες συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 Η συσχέτιση ανάμεσα στον ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμό και το ΣΔ1 αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Bottini και συνεργάτες (συν) (50) σε δύο ανεξάρτητες μελέτες ασθενών-ομάδας ελέγχου από τη Βόρεια Αμερική (294 ασθενείς/395 υγιή άτομα) και τη Βόρεια Σαρδηνία (174 ασθενείς/214 υγιή άτομα). H τιμή πιθανότητας (probability value, p value, p) και η αναλογία πιθανοτήτων (odds ratio, OR) για την εμφάνιση ΣΔ1 στους φορείς του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου έναντι των μη φορέων υπολογίστηκαν σε p<0.001 και OR=1.83 για τον πρώτο πληθυσμό και p<0.05 και OR=2.31 για το δεύτερο. Η συσχέτιση αυτή επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια σε αρκετές μελέτες συσχέτισης, η πλειοψηφία των οποίων αφορά σε πληθυσμούς της λευκής φυλής με υψηλή συχνότητα του ελάσσονος αλληλόμορφου. Πιο συγκεκριμένα, το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο έχει αναφερθεί να συσχετίζεται με το ΣΔ1 σε πληθυσμούς από το Ηνωμένο Βασίλειο (91-94), τη Φινλανδία (95), τη Σουηδία (96, 97), τη Νορβηγία (98), τη Γερμανία (99-101), την Ουκρανία (102), την Εσθονία (103), τη Ρωσία (104, 105), την Πολωνία (106, 107), την Ολλανδία (108), τη Δανία (109), τη Γαλλία (110), την Τσεχία (111), την Κροατία (112), την Ισπανία (113), την Ιταλία (114, 115), τις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής (ΗΠΑ) ( ). Ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός μελετήθηκε και επιβεβαιώθηκε η συσχέτισή του και σε πληθυσμούς της Νότιας Αμερικής και, συγκεκριμένα, της Βραζιλίας (120, 121). Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν και λίγες μελέτες σε πληθυσμούς οι οποίοι δεν ανήκουν στη λευκή φυλή με ποικίλα αποτελέσματα (116, 122, 123). Συγκεκριμένα, στη μελέτη των Zheng και συν (116) σε πληθυσμό (103 ασθενείς/302 υγιή άτομα) κινέζικης καταγωγής το έλασσον αλληλόμορφο δεν ανιχνεύτηκε. Από τις μελέτες συνολικά, λίγες είναι εκείνες οι οποίες αφορούν σε παιδικό και εφηβικό πληθυσμό (50, 91-95, 98, 109, 111, 115, 120, 122). Τα χαρακτηριστικά των μελετών συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 και τα κύρια αποτελέσματα αυτών φαίνονται στον πίνακα 1.

51 51 Η σχέση του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού δεν εξετάστηκε μόνο στο πλαίσιο μελέτης ασθενών με ΣΔ1 αλλά και παρακολούθησης ατόμων υψηλού κινδύνου για εμφάνιση ΣΔ1. Ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός φαίνεται να εμπλέκεται στη ρύθμιση της αντινησιδιακής αυτοανοσίας και να επηρεάζει την εξέλιξη από προδιαβήτη σε κλινική νόσο. Συγκεκριμένα, ο PTPN22 T1858T γονότυπος συσχετίστηκε με την εμφάνιση ΙΑΑ (p= ). Επιπλέον, οι PTPN22 T1858T και PTPN22 C1858T γονότυποι βρέθηκε να προδιαθέτουν σε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ICA, IAA, GADA, IA-2A ή κλινικού ΣΔ1 (p=0.003) (95). Οι Steck και συν (124) στο πλαίσιο της μελέτης Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) σε παιδιά υψηλού κινδύνου για εμφάνιση ΣΔ1 από τις ΗΠΑ κατέγραψαν συσχέτιση του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου με την ανάπτυξη εμμένουσας αντινησιδιακής αυτοανοσίας (IAA, GADA, ICA, ZnT8Ab) (αναλογία κινδύνου 1.83). Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ένα σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο εμμένουσας αντινησιδιακής αυτοανοσίας στη δεκαετία για τον ΡΤΡΝ22 Τ1858Τ γονότυπο (27.3%) συγκριτικά με τους ΡΤΡΝ22 C1858T και ΡΤΡΝ22 C1858C γονότυπους (7.9 και 5.3%, αντίστοιχα). Στο πλαίσιο της μελέτης DAISY, οι Steck και αυν (125) υποστήριξαν για δεύτερη φορά ότι ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός προέβλεπε την ανάπτυξη τόσο αντινησιδιακής αυτοανοσίας (IAA, ICA, GADA, ZnT8Ab) (p<0.001) όσο και κλινικού ΣΔ1 (p=0.03).από την άλλη πλευρά, οι Aly και συν (126) δεν ανέδειξαν επίδραση του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού στην εμφάνιση αντινησιδιακών αντισωμάτων σε 85 υψηλού κινδύνου με βάση τον HLA γονότυπο (HLA-DR3/DQ2, HLA-DR4/DQ8) συγγενείς ασθενών με ΣΔ1. Επιπλέον, στο πλαίσιο της μελέτης Diabetes Prevention Trial-Type 1 (DPT-1) σε συγγενείς ασθενών με ΣΔ1 από τη Βόρεια Αμερική δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα των αλληλόμορφων μεταξύ των 348 ατόμων τα οποία εμφάνισαν κλινικό ΣΔ1 και των 227 ατόμων τα οποία παρέμειναν νορμογλυκαιμικά κατά την περίοδο παρακολούθησης (127).

52 Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά των μελετών συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 και κύρια αποτελέσματα 52 αυτών Πρώτος συγγραφέας (Βιβλιογραφία) Έτος Χώρα Ηλικία εξέτασης ασθενών (έτη) Μέγεθος δείγματος αλληλόμορφο (%) Ομάδα ελέγχου ΡΤΡΝ Τ Ομάδα Ομάδα Ομάδα ασθενών ελέγχου ασθενών OR (95% CI) ΡΤΡΝ Τ έναντι 1858C αλληλόμορφου Bottini (50) 2004 ΗΠΑ ( ) Ιταλία 7.4± ( ) Smyth (91) 2004 Ηνωμένο Βασίλειο < ( ) Zheng (116) 2005 ΗΠΑ ( ) Zhernakova (108) 2005 Ολλανδία ( ) Gomez (122) 2005 Κολομβία 8.8± ( ) Kahles (99) 2005 Γερμανία 27.9±12.9 (6 69) ( ) Griswell (117) 2005 ΗΠΑ ( ) Hermann (95) 2006 Φιλανδία ( ) Fedetz (102) 2006 Ουκρανία 36.0±11.6 (16-65) ( ) Steck (118) 2006 ΗΠΑ ( ) Cinek (111) 2007 Αζερμπαϊτζάν ( ) 2007 Τσεχία παιδιά ( ) Chelala (110) 2007 Γαλλία ( ) Santiago (113) 2007 Ισπανία ( ) Nielsen (109) 2007 Δανία παιδιά, έφηβοι ( ) Petrone(114) 2008 Ιταλία ( ) Saccucci (115) 2008 Ιταλία 15.6± ( ) Baniasadi (123) 2008 Ινδία ( ) Smyth (92) 2008 Ηνωμένο Βασίλειο < ( ) Smyth (93) 2008 Ηνωμένο Βασίλειο, Ρουμανία, Νορβηγία, Σουηδία, ΗΠΑ < ( )

53 Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά των μελετών συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 και κύρια αποτελέσματα 53 αυτών (συνέχεια) Πρώτος συγγραφέας (Βιβλιογραφία) Έτος Χώρα Ηλικία εξέτασης ασθενών (έτη) Μέγεθος δείγματος αλληλόμορφο (%) Ομάδα ελέγχου ΡΤΡΝ Τ Ομάδα Ομάδα Ομάδα ασθενών ελέγχου ασθενών OR (95% CI) ΡΤΡΝ Τ έναντι 1858C αλληλόμορφου Cervin (96) 2008 Σουηδία ( ) Douroudis (103) 2008 Εσθονία 29.53± ( ) Dultz (100) 2009 Γερμανία ( ) Korolija (112) 2009 Κροατία ( ) Lavrikova (104) 2009 Ρωσία ( ) Maziarz (97) 2010 Σουηδία ( ) Stene (98) 2010 Νορβηγία ( ) Chagastelles (120) 2010 Βραζιλία 15.13± ( ) Kordonouri (101) 2010 Γερμανία ( ) Fichna (106) 2010 Πολωνία ( ) Zhebrun (105) 2011 Ρωσία ( ) Reddy (119) 2011 ΗΠΑ ( ) Plagnol (94) 2011 Ηνωμένο Βασίλειο διάμεσος ( ) Okruszko (107) 2012 Πολωνία ( ) Mainardi-Novo (121) 2013 Βραζιλία διάστημα εμπιστοσύνης (CI, confidence interval) δεν αναφέρεται

54 Μελέτες ανάλυσης σύνδεσης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 Το ίδιο έτος της πρώτης ανακοίνωσης συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 (50) διενεργήθηκε και μελέτη ανάλυσης σύνδεσης. Οι Smyth και συν (91), εκτός από μελέτη ασθενών-ομάδας ελέγχου, διεξήγαγαν και μελέτη ανάλυσης σύνδεσης σε 1388 οικογένειες με ΣΔ1 από το Ηνωμένο Βασίλειο, τις ΗΠΑ και τη Ρουμανία. Συγκεκριμένα, ανέδειξαν την ύπαρξη συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 [p=5.62x10-14, σχετικός κίνδυνος (relative risk, RR)=1.67]. Ακολούθησαν και άλλες μελέτες ανάλυσης σύνδεσης η συντριπτική πλειοψηφία των οποίων υποστήριξε τη συσχέτιση του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 σε οικογένειες με ΣΔ1 της λευκής φυλής από την Ευρώπη και τη Βόρεια Αμερική (75, 95, 110, 116, 108, ). Μόνο δύο μελέτες δεν ανέδειξαν στατιστικά αυξημένη μεταβίβαση του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου από τους ετεροζυγώτες γονείς στους πάσχοντες απογόνους (104, 131). Αξίζει να σημειωθεί ότι στη μελέτη των Qu και συν (129) ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός χαρτογραφήθηκε σε ένα σύμπλεγμα γενετικής σύνδεσης (linkage disequilibrium, LD), το οποίο περιλαμβάνει πολυάριθμους πολυμορφισμούς, εγείροντας την υπόνοια ότι άλλοι δυνητικά λειτουργικοί πολυμορφισμοί μπορεί να ευθύνονται για τη συσχέτιση με το ΣΔ1 αποκλειστικά ή σε συνδυασμό με τον ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμό. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά των μελετών ανάλυσης σύνδεσης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 και τα κύρια αποτελέσματα αυτών φαίνονται στον πίνακα ο οποίος ακολουθεί (Πίνακας 2).

55 Πίνακας 2. Χαρακτηριστικά των μελετών ανάλυσης σύνδεσης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 και κύρια 55 αποτελέσματα αυτών Πρώτος συγγραφέας (Βιβλιογραφία) Έτος Χώρα Οικογένειες Κληροδότηση ΡΤΡΝ Τ Αριθμός Είδος αλληλόμορφου (%) Smyth (91) 2004 Ηνωμένο Βασίλειο 791 ΗΠΑ 336 απλές, πολλαπλές x10-14 Ρουμανία 261 Ladner (128) 2005 ΗΠΑ 341 πολλαπλές Qu (129) 2005 Καναδάς 588 πυρηνικές x10-5 Vang (75) 2005 Iταλία 631 δεν αναφέρεται Zheng (116) 2005 ΗΠΑ 410 απλές 57.2 <0.003 Zhernakova (108) 2005 Γερμανία 218 απλές E -09 Hermann (95) 2006 Φινλανδία 245 πυρηνικές Kawasaki (131) 2006 Ηνωμένο Βασίλειο 89 πολλαπλές Chelala (110) 2007 Γαλλία Δανία 159 πολλαπλές ΗΠΑ Zoledziewska (130) 2008 Ιταλία 694 απλές, πυρηνικές Lavrikova (104) 2009 Ρωσία 89 απλές, πυρηνικές p

56 Άλλου τύπου γενετικές μελέτες της σχέσης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 Αν και οι μελέτες συσχέτισης και ανάλυσης σύνδεσης αποτελούν τη συντριπτική πλειοψηφία των μελετών της σχέσης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφσμού με το ΣΔ1, διενεργήθηκαν και μελέτες με άλλο σχεδιασμό. Οι Onengut-Gumuscu και συν (132) πραγματοποίησαν ανάλυση γονιδιώματος σε 406 οικογένειες με ΣΔ1 από τις ΗΠΑ. Η πολυσημειακή ένδειξη σύνδεσης του ΡΤΡΝ22 γονιδίου με το ΣΔ1 ήταν χαμηλή (logarithm of odds, LOD=0.75). H λs υπολογίστηκε σε Για να εξεταστεί το ενδεχόμενο συσχέτισης του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου με το ΣΔ1 χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία ανισορροπίας γενιάς (pedigree disequilibrium test, PDT) και διαπιστώθηκε ότι το έλασσον αλληλόμορφο κληροδοτούνταν σε αυξημένη αναλογία από τους ετεροζυγώτες γονείς στους πάσχοντες απογόνους (p=2.5x10-5 ). Επιπλέον, οι ερευνητές πρότειναν την πιθανότητα αλληλεπίδρασης του ΡΤΡΝ22 γονιδίου με νέες γονιδιακές θέσεις στα χρωμοσώματα 3 ή 21. Οι Concannon και συν (133) πραγματοποίησαν ευρεία γονιδιωματική ανάλυση σύνδεσης σε 1435 οικογένειες με ΣΔ1, συνδυάζοντας τον υπό μελέτη πληθυσμό 254 οικογενειών από τις ΗΠΑ, το Ηνωμένο Βασίλειο και την Αυστραλία με εκείνους τριών δημοσιευμένων μελετών, οι οποίες περιελάμβαναν 767 οικογένειες από τις ΗΠΑ και το Ηνωμένο Βασίλειο και 424 οικογένειες από τη Σκανδιναβία. Σε αντίθεση με τις ήδη δημοσιευμένες μελέτες, δεν υποστήριξαν τη σύνδεση της χρωμοσωμικής περιοχής 1p13, στην οποία εντοπίζεται το ΡΤΡΝ22γονίδιο, με το ΣΔ1. Η αδυναμία ανάδειξης σύνδεσης δικαιολογήθηκε με βάση τη χαμηλή λs (1.05) συγκριτικά με την OR (1.7). Έτσι, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι, με την προϋπόθεση ενός πολυπαραγοντικού μοντέλου, το ΡΤΡΝ22 γονίδιο ευθύνεται σε πολύ μικρότερο ποσοστό συγκριτικά με το HLA σύμπλεγμα (περίπου 2% έναντι 40%) για την οικογενή εμφάνιση της νόσου.

57 57 Οι Onengut-Gumuscu και συν (134) προσπάθησαν να διερευνήσουν το ρόλο του PTPN22 γονιδίου συνολικά και όχι του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού μεμονωμένα με ανάλυση απλότυπου της περιοχής. Το PTPN Τ αλληλόμορφο εντοπίστηκε σε ένα μόνο απλότυπο ο οποίος βρέθηκε να συσχετίζεται σημαντικά με το ΣΔ1 (p=7.9x10-5 ). Παράλληλα, δύο επιπλέον απλότυποι, οι οποίοι παρατηρήθηκε να συσχετίζονται ασθενώς με το ΣΔ1 (p<0.05) περιελάμβαναν έναν καινούριο πολυμορφισμό, τον ΡΤΡΝ22 G2250C. Έτσι, οι ερευνητές κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι εντός του ΡΤΡΝ22 γονιδίου ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός διαδραματίζει τον κύριο ρόλο στο ΣΔ1 χωρίς να αποκλείεται και ο ρόλος άλλων λιγότερο συχνών πολυμορφισμών. Οι Steck και συν (135) στο πλαίσιο του Type I Diabetes Genetics Consortium (T1DGC) διεξήγαγαν μία ανάλυση ανισορροπίας μεταβίβασης απλότυπων σε 2295 οικογένειες και αποκάλυψαν ότι και οι τρεις απλότυποι οι οποίοι περιελάμβαναν το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο κληροδοτούνταν σε αυξημένη αναλογία στους πάσχοντες απογόνους και μεταξύ αυτών οι δύο παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική μεταβίβαση (p=0.003 και 5.9x10-12 ). Τελικά, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο ΡΤΡΝ22 C1858Τ πολυμορφισμός, μεταξύ των 28 οι οποίοι μελετήθηκαν, ευθύνεται για το μεγαλύτερο ποσοστό της συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 γονιδίου με το ΣΔ1. Σε ό,τι αφορά τους πληθυσμούς της Ασίας, στους οποίους η επίπτωση του ΣΔ1 είναι χαμηλή (136), οι Kawasaki και συν (131) διεξήγαγαν μία συστηματική ανάλυση SNPs του ΡΤΡΝ22 γονιδίου σε πληθυσμό από την Ιαπωνία και αναγνώρισαν πέντε καινούριους πολυμορφισμούς αλλά όχι τον PTPN22 C1858T πολυμορφισμό. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν οι PTPN22 C1858T και PTPN22 C1123G πολυμορφισμοί σε 472 DNA δείγματα από 95 οικογένειες με ΣΔ1 και βρέθηκαν σε σημαντική LD (p=8.5x10-82 ). Έτσι, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το ΡΤΡΝ22 γονίδιο συσχετίζεται με το ΣΔ1, αλλά αυτή η συσχέτιση δεν μπορεί να αποδοθεί αποκλειστικά στον PTPN22 C1858T πολυμορφισμό, καθώς ο PTPN22

58 G1123C πολυμορφισμός στην περιοχή του προαγωγέα ανακύπτει ως πιο πιθανός προδιαθεσικός παράγοντας Συσχέτιση του του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με άλλες παθήσεις Ήδη το ίδιο έτος της πρώτης αναφοράς συσχέτισης του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με το ΣΔ1 (50) δημοσιεύτηκαν μελέτες οι οποίες διερευνούσαν το ρόλο του και σε άλλες αυτοάνοσες παθήσεις, το συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) (137), τη ρευματοειδή αρθρίτιδα (PA) (49) και τη νόσο Graves (138). Έκτοτε, για τις περισσότερες από τις αυτοάνοσες παθήσεις έχουν διενεργηθεί και μεταναλύσεις. Με βάση αυτές, το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο επιβεβαιώθηκε ότι συσχετίζεται με το ΣΕΛ (139). τη ΡΑ και ειδικά τις οροθετικές μορφές (140), τη νεανική ιδιοπαθή αρθρίτιδα (141), τη συστηματική σκλήρυνση (142), τις αυτοάνοσες θυρεοειδικές παθήσεις (143), τη νόσο Addison (144), την αγγειίτιδα με θετικά αντιουδετεροφιλικά κυτταροπλασματικά αντισώματα, την κοκκιωμάτωση Wegener (145), την κροταφική αρτηριίτιδα (146), τη λεύκη (147), τη μυασθένεια Gravis (148), τη νόσο Crohn αλλά όχι την ελκώδη κολίτιδα (149), αν και σε προγενέστερη μετανάλυση δεν είχε βρεθεί συσχέτιση με τη φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (150). Κατά κύριο λόγο, αυτές οι συσχετίσεις επιβεβαιώθηκαν σε πληθυσμούς της λευκής φυλής ευρωπαϊκής καταγωγής. Το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο έχει συσχετιστεί ασθενώς και με την κοιλιοκάκη, την ψωρίαση, την αγκυλοποιητική σπονδυλαρθρίτιδα, την κοινή πέμφιγα, την πρωτοπαθή σκληρυντική χολαγγειΐτιδα, την πρωτοπαθή χολική κίρρωση και την οξεία πρόσθια ραγοειδίτιδα (151). Στο πλαίσιο της αλληλεπίδρασης της φλεγμονής με την ανοσιακή απάντηση ο ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμός μελετήθηκε και σε σχέση με την αθηροσκλήρωση (152) και τη στεφανιαία νόσο (153, 154). Από την άλλη πλευρά, με βάση πρόσφατη μετανάλυση το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο βρέθηκε να ασκεί προστατευτική δράση έναντι της φυματίωσης

59 (155), ενώ δε βρέθηκε αλληλεπίδραση με άλλους λοιμογόνους παράγοντες ( ) Η εθνική ποικιλότητα του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού Ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού είναι η μεγάλη γεωγραφική διακύμανση της συχνότητας του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου. Υπάρχει τάση αύξησης της συχνότητας του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου σε υγιείς πληθυσμούς της λευκής φυλής στην Ευρώπη (από το Νότο προς το Βορρά). Συγκεκριμένα, απαντάται σε συχνότητα 2% στην Ιταλία, 6% στην Ισπανία, 12% στη Σουηδία και 15.5% στη Φινλανδία (Εικόνα 11). Ωστόσο, φαίνεται να απουσιάζει σχεδόν από πληθυσμούς της Ασίας και της Αφρικής (45). Στην Ελλάδα η συχνότητα του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου βρέθηκε χαμηλή ( %) (159, 160) σε τρεις ανεξάρτητες ομάδες υγιών ατόμων κρητικής καταγωγής. Πιθανές ερμηνείες για αυτές τις διαφορές στη συχνότητα του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου είναι η πρόσφατη εμφάνισή του κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και η ισχυρή διαφοροποίηση της συχνότητάς του κατά τη διαδικασία της επιλογής. Πράγματι, οι McPartland και συν (161) ανέδειξαν θετική επιλογή στο ΡΤΡΝ22 γονίδιο. Μία ενδιαφέρουσα υπόθεση είναι ότι το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο ασκεί προστατευτική δράση έναντι μερικών συχνών λοιμωδών νόσων. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες σχετικές μελέτες και με αντικρουόμενα αποτελέσματα. Οι Chapman και συν (162) βρήκαν ότι το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο μπορεί να αυξάνει τον κίνδυνο επιπλοκών στους ασθενείς με κοινές πνευμονιοκοκκικές λοιμώξεις, ενώ σε μία άλλη μελέτη, η οποία αφορούσε σε ανασοκατεσταλμένους μεταμοσχευθέντες ασθενείς, βρέθηκε προστατευτική δράση του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου έναντι λοιμώξεων (163). Σε ό,τι αφορά τη φυματίωση, το ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφο είναι πιθανόν ότι διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο ( ). Αυτό είναι ένα ενδιαφέρον εύρημα, αν

60 60 θεωρήσουμε ότι η φυματίωση μπορεί να ασκεί μία ισχυρή επιλεκτική δράση στη Βόρεια Ευρώπη (81). Σε ό,τι αφορά άλλους λοιμογόνους παράγοντες, δεν αναδείχθηκε προστατευτικός ή προδιαθεσικός ρόλος του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου έναντι της ηπατίτιδας C (156), της λοίμωξης από Trypanosoma Cruzi (157) και της βρουκέλλωσης (158). Αυτά τα αποτελέσματα πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω πριν εξαχθούν οριστικά συμπεράσματα. Εικόνα 11. Η κατανομή της συχνότητας του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου στην Ευρώπη (τροποποιημένο από Burn GL, et al. Why is PTPN22 a good candidate susceptibility gene for autoimmune disease? FEBS Lett 2011;585: ) (41) 3.0% (167) % (159, 160) Η Lyp ως μελλοντικός θεραπευτικός στόχος Αρκετά ερευνητικά πρωτόκολλα έχουν εστιάσει στο σχεδιασμό μικρών μοριακών αναστολέων της Lyp ( ). Θεωρώντας ως πιθανότερη εκδοχή την

61 61 αυξημένη δραστικότητα της Lyp W620, έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι ένας εκλεκτικός αναστολέας της Lyp θα μπορούσε να αντιστρέψει τις αρνητικές επιδράσεις της Lyp W620 στην TCR σηματοδότηση και, έτσι, να αποτελέσει μία αποτελεσματική αιτιολογική θεραπεία της αυτοανοσίας στους φορείς του προδιαθεσικού αλληλόμορφου. Αν και δεν έχει αποδειχθεί ακόμη ότι η δράση της Lyp στην αυτοανοσία είναι αναστρέψιμη, η επιτυχία των πειραμάτων τα οποία στοχεύουν στο ΣΔ1 με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του CD3 υποστηρίζουν την ιδέα ότι η θετική διαμόρφωση του TCR βοηθά την επανεγκατάσταση της ανοχής τουλάχιστον σε μία υποκατηγορία των ασθενών (172, 173). Από την άλλη πλευρά, η θεραπευτική αναστολή της Lyp στην αυτοανοσία μπορεί να ενέχει μερικούς κινδύνους. Για παράδειγμα, η υπερβολική αναστολή της δραστικότητας της Lyp μπορεί να οδηγήσει σε παράλληλη αύξηση της δραστηριότητας των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων. Επομένως, απαιτούνται περισσότερες μελέτες σε πειραματόζωα προκειμένου η Lyp να πιστοποιηθεί ως μελλοντικός θεραπευτικός στόχος.

62 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 62

63 ΣΚΟΠΟΣ Όπως αναφέρθηκε στο γενικό μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, το PTPN22 γονίδιο έχει μελετηθεί συχνά ως υποψήφιο γονίδιο στο ΣΔ1 λόγω του καθοριστικού ρόλου τον οποίο διαδραματίζει η Lyp στη ρύθμιση της ανοσίας. Ο πλέον συχνά μελετούμενος πολυμορφισμός του γονιδίου είναι ο C1858Τ. Σε πρόσφατα δημοσιευμένες μεταναλύσεις (151, ), ο PTPN22 C1858T πολυμορφισμός προτείνεται ότι πιθανόν συμβάλλει στη γενετική προδιάθεση του ΣΔ1 ειδικά σε πληθυσμούς της Ευρώπης και της Αμερικής. Ωστόσο, οι ερευνητές καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι υπάρχει ακόμη ανάγκη για περισσότερες μελέτες για την ενίσχυση αυτού του ευρήματος. Παράλληλα, οι μέχρι τώρα δημοσιευμένες μελέτες αποκάλυψαν ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό του PTPN22 C1858T πολυμορφισμού, τη μεγάλη γεωγραφική διακύμανση της συχνότητας του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου. Από την άλλη πλευρά, πρωτεύοντα ρόλο στη γενετική προδιάθεση του ΣΔ1 κατέχουν τα HLA τάξης ΙΙ γονίδια, τα οποία διαφέρουν μεταξύ των πληθυσμών. Με δεδομένο το κενό έρευνας του PTPN22 C1858Τ πολυμορφισμού σε ασθενείς ελληνικής καταγωγής με ΣΔ1, το πρωτόκολλο της παρούσας διδακτορικής διατριβής έθεσε ως: 1. κύριο σκοπό τη διεξαγωγή μελέτης γενετικής συσχέτισης του PTPN22 C1858Τ πολυμορφισμού σε πληθυσμό παιδιών και εφήβων ελληνικής καταγωγής σε σχέση με το ΣΔ1 και 2. επιμέρους σκοπούς i. την αναζήτηση συσχέτισης του πολυμορφισμού με τα HLA-DRΒ1 και HLA-DQΒ1 αλληλόμορφα ii. τη σύγκριση δημογραφικών, κλινικών και εργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ των ασθενών φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου.

64 65 Με τη μελέτη αυτή επιχειρείται να διαπιστωθεί αν ο υποψήφιος πολυμορφισμός συσχετίζεται με το ΣΔ1 και στον ελληνικό πληθυσμό. Εξάλλου, απαιτείται η δημοσίευση πληροφοριών σχετικά με το ρόλο του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού σε άτομα ελληνικής καταγωγής με ΣΔ1 για την καλύτερη κατανόηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού και την αξιολόγηση του πρακτικού ενδιαφέροντος των θεραπευτικών εφαρμογών, οι οποίες αφορούν στη Lyp, σε ασθενείς ελληνικής καταγωγής ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Τύπος μελέτης Πρόκειται για μελέτη παρατήρησης ασθενών-ομάδας ελέγχου Δείγμα Ομάδα ασθενών Μελετήθηκαν 130 ασθενείς (παιδιά και έφηβοι) οι οποίοι παρακολουθούνται για ΣΔ1 στο παιδοδιαβητολογικό εξωτερικό ιατρείο της Δ Παιδιατρικής Κλινικής του Ιατρικού Τμήματος της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στο Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου. Οι ασθενείς οι οποίοι συμμετείχαν στη μελέτη επιλέχθηκαν σύμφωνα με τα ακόλουθα κριτήρια: 1. διάγνωση σακχαρώδη διαβήτη με βάση τις κατευθυντήριες οδηγίες της Διεθνούς Εταιρείας για τον Παιδικό και Εφηβικό Διαβήτη (International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes, ISPAD) (179, 180) οπότε πρέπει να πληρείται μία από τις ακόλουθες προϋποθέσεις: i. συμπτώματα διαβήτη (πολυουρία, πολυδιψία, θόλωση όρασης, απώλεια βάρους) διάρκειας αρκετών εβδομάδων σε συνδυασμό με τυχαία συγκέντρωση γλυκόζης πλάσματος 200 mg/dl και στις πιο

65 66 σοβαρές περιπτώσεις κετοξέωση ή πιο σπάνια μη κετωτικό υπερωσμωτικό κώμα ii. συγκέντρωση γλυκόζης πλάσματος νηστείας 126 mg/dl iii. συγκέντρωση γλυκόζης 2 ώρες μετά τη φόρτιση 200 mg/dl κατά τη διάρκεια από του στόματος δοκιμασίας ανοχής γλυκόζης (oral glucose tolerance test, OGTT) 2. ινσουλινοεξάρτηση από το χρόνο της διάγνωσης, η οποία πιστοποιείται από τα χαμηλά επίπεδα ινσουλίνης και C πεπτιδίου ορού νηστείας (181) 3. ηλικία κατά την εισαγωγή στη μελέτη ως 19 ετών, η οποία αποτελεί το ανώτερο ηλικιακό όριο για τον ορισμό της εφηβείας σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (World Health Organization, WHO) (182) 4. παρέλευση τουλάχιστον ενός έτους από την ημερομηνία διάγνωσης, η οποία θεωρείται η ημερομηνία της πρώτης ένεσης ινσουλίνης 5. ιστορικό τουλάχιστον τριών γενεών καταγωγής από τη λευκή φυλή, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η γενετική ετερογένεια 6. απουσία συγγένειας. Ομάδα ελέγχου Ως ομάδα ελέγχου για τη διεξαγωγή της μελέτης γενετικής συσχέτισης επιλέχθηκαν τυχαία 135 φαινοτυπικά υγιή άτομα ελληνικής καταγωγής με κατανομή φύλου ανάλογη με αυτή της ομάδας ασθενών. Σε αυτά διαπιστώθηκαν φυσιολογική συγκέντρωση γλυκόζης ορού, φυσιολογικές συγκεντρώσεις ελεύθερων θυρεοειδικών ορμονών (free Τ3, fτ3, free Τ4, fτ4) και θυρεοτρόπου ορμόνης (thyroid stimulating hormone, TSH) ορού, ελεύθερο ατομικό ιστορικό αυτοάνοσου νοσήματος και ελεύθερο οικογενειακό ιστορικό ΣΔ1 και άλλων αυτοάνοσων νοσήματων. Πρόκειται για παιδιά και εφήβους ηλικίας >10 ετών, φοιτητές του Ιατρικού Τμήματος της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου

66 67 Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και προσωπικό του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου ηλικίας <40 ετών. Τα ηλικιακά όρια επιλέχθηκαν με βάση το γεγονός ότι η επίπτωση του ΣΔ1 παρουσιάζει δίπολο με ισοϋψείς αιχμές στις ηλικιακές ομάδες 0-9 ετών και ετών. Με άλλα λόγια, αν και ο ΣΔ1 αποτελεί πάνω από το 90% των περιπτώσεων παιδικού και εφηβικού διαβήτη στις περισσότερες χώρες του δυτικού κόσμου, λιγότερες από τις μισές περιπτώσεις διαγιγνώσκονται σε ηλικία <15 ετών (183). Μέγεθος Για να ανιχνευθεί μία διαφορά στη συχνότητα του ελάσσονος αλληλόμορφου μεταξύ των ομάδων ασθενών και ελέγχου της τάξης του 2.8%, όπως στην παρούσα μελέτη, με μία δοκιμασία διπλής κατεύθυνσης σε επίπεδο σημαντικότητας 0.05 και με ισχύ 80%, πρέπει να συμπεριληφθούν 912 αλληλόμορφα δηλαδή 456 άτομα σε κάθε ομάδα. Για το επιλεγέν μέγεθος του δείγματος και την τελική ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να ληφθούν υπόψη τα ακόλουθα. Σύμφωνα με την έκθεση της Διεθνούς Ομοσπονδίας Διαβήτη (International Diabetes Federation, IDF) του 2009 για την Ελλάδα (184), ο αριθμός των ασθενών όλων των ηλικιών με ΣΔ1 εκτιμάται να ανέρχεται σε Από την άλλη πλευρά, σύμφωνα με στοιχεία της Ελληνικής Στατιστικής Αρχής τα παιδιά και οι έφηβοι αποτελούν περίπου το 20% του πληθυσμού στην Ελλάδα. Όπως αναφέρθηκε, στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν ασθενείς οι οποίοι παρακολουθούνται στο παιδοδιαβητολογικό εξωτερικό ιατρείο της Δ Παιδιατρικής Κλινικής του Ιατρικού Τμήματος της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στο Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου, σε ένα από τα ιατρεία για τον παιδικό και εφηβικό διαβήτη στη Βόρεια Ελλάδα. Εξάλλου, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η γενετική ετερογένεια, δε συμπεριλήφθηκαν

67 68 όλοι οι ασθενείς οι οποίοι παρακολουθούνται για ΣΔ1 αλλά μη συγγενή άτομα με ιστορικό τουλάχιστον τριών γενεών καταγωγής από τη λευκή φυλή. Ως αποτέλεσμα, το εφικτό μέγεθος του δείγματος περιορίστηκε. Τελικά επιλέχθηκε ένα μέγεθος παρόμοιο αυτού ορισμένων ανάλογων μελετών και το οποίο ήταν οικονομικά δυνατό να αναλυθεί. Ηθική δεοντολογία Πριν από την είσοδο στη μελέτη, ζητήθηκε η μετά από ενημέρωση συγκατάθεση από τους ενήλικες συμμετέχοντες και τους γονείς ή κηδεμόνες για άτομα ηλικίας <18 ετών. Το ερευνητικό πρωτόκολλο δηλώθηκε στην υπηρεσία ClinicalTrials.gov με τον κωδικό NCT και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Βιοηθικής και Δεοντολογίας του Ιατρικού Τμήματος της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με αριθμό πρωτοκόλλου Α Η μελέτη διενεργήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια της Διακήρυξης του Ελσίνκι τα οποία αφορούν στη λήψη ανθρώπινου βιολογικού υλικού για ερευνητικούς σκοπούς (185) Πρωτόκολλο Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε κλινικό και εργαστηριακό έλεγχο ο οποίος περιελάμβανε: 1. Λήψη ατομικού ιστορικού με έμφαση στο περιγεννητικό ιστορικό [είδος τοκετού, βάρος γέννησης (ΒΓ), μητρικός θηλασμός (ΜΘ), χορήγηση εξανθρωποποιημένου γάλατος πριν την ηλικία των 6 μηνών], τη διάγνωση του ΣΔ1 (ηλικία, στάδιο ήβης, βαρύτητα) και τη συνύπαρξη αυτοάνοσων νοσημάτων (θυρεοειδίτιδα Hashimoto, κοιλιοκάκη) ή ιστορικού αλλεργίας (τροφική αλλεργία, βρογχικό άσθμα, αλλεργική ρινίτιδα, αλλεργική επιπεφυκίτιδα, έκζεμα) και οικογενειακού ιστορικού με έμφαση στο ΣΔ1, τη θυρεοειδίτιδα Hashimoto και άλλα αυτοάνοσα νοσήματα. Η θυρεοειδίτιδα

68 69 Hashimoto διαγνώστηκε από έμπειρη παιδίατρο υποειδικευμένη στην παιδιατρική ενδοκρινολογία με βάση τα ακόλουθα κριτήρια: 1) βρογχοκήλη, 2) υποκλινικός και κλινικός υποθυρεοειδισμός, ο οποίος απαιτεί θεραπεία υποκατάστασης με L-θυροξίνη και 3) υψηλοί τίτλοι αντιθυρεοειδικών αντισωμάτων (μόνο anti-thyroglobulin, anti-tg, ή anti-thyroid peroxidase, anti-tpo, ή και των δύο). Ο θυρεοειδής αδένας θεωρήθηκε κλινικά διογκωμένος κατά την ψηλάφηση, όταν κάθε λοβός είχε όγκο μεγαλύτερο από την τελική φάλαγγα του αντίχειρα του εξεταζόμενου ατόμου (186). Ο υποθυρεοειδισμός ορίστηκε ως το αυξημένο επίπεδο TSH σε συνδυασμό με φυσιολογικές ή ελαττωμένες συγκεντρώσεις ελεύθερων θυρεοειδικών ορμονών (fτ3, fτ4). Η κοιλιοκάκη διαγνώστηκε σύμφωνα με τα κριτήρια της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Παιδιατρικής Γαστρεντερολογίας, Ηπατολογίας και Διατροφής (European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, ESPGHAN) (187). Ως θετικό οικογενειακό ιστορικό θεωρήθηκε το γνωστό ιστορικό νόσου σε έναν τουλάχιστον συγγενή πρώτου βαθμού. 2. Διενέργεια πλήρους κλινικής εξέτασης συμπεριλαμβανομένης της καταγραφής των σωματομετρικών χαρακτηριστικών και της εκτίμησης του σταδίου ήβης κατά Tanner και Marshall (188, 189). Το βάρος σώματος (ΒΣ) μετρήθηκε με ζυγαριά (SECA 711, Germany) και ακρίβεια 0.1 kg με τον ασθενή να φέρει ελαφρύ ρουχισμό. Το ύψος σώματος (ΥΣ) μετρήθηκε με αναστημόμετρο (HARPENDEN, Veeder-Root, Elizabethtown, NC, USA) και ακρίβεια 0.1 cm. Η περίμετρος μέσης (ΠΜ) μετρήθηκε με εύκαμπτη μεζούρα και ακρίβεια 0.1 cm, με τη μεζούρα να τοποθετείται στο τέλος μιας φυσιολογικής εκπνοής σε χαλαρή κοιλιά χωρίς πίεση του δέρματος και σε παράλληλο επίπεδο στο μέσο της απόστασης μεταξύ της τελευταίας πλευράς και της λαγόνιας ακρολοφίας στο ύψος του ομφαλού. Ταξινομήθηκε σε διαστήματα εκατοστιαίων θέσεων (ΕΘ) ανάλογα με την ηλικία με βάση δεδομένα μελέτης η οποία αφορούσε σε παιδικό και εφηβικό πληθυσμό της

69 70 Κρήτης (190). Η περίμετρος λαιμού (ΠΛ) μετρήθηκε με εύκαμπτη μεζούρα και ακρίβεια 0.1 cm, με τον ασθενή να φέρει το κεφάλι σε οριζόντιο επίπεδο και με τη μεζούρα να τοποθετείται στο τέλος μιας φυσιολογικής εκπνοής κάθετα στο λαιμό ακριβώς κάτω από το θυρεοειδή χόνδρο χωρίς πίεση. Η αρτηριακή πίεση μετρήθηκε δύο φορές με ψηφιακό πιεσόμετρο (DINAMAP, Johnson & Johnson, Medical INC, Arlington, TX, USA), με ακρίβεια 5 mm Hg και με τον ασθενή ήρεμο σε ύπτια θέση και υπολογίστηκε ο μέσος όρος τόσο για τη συστολική αρτηριακή πίεση (ΣΑΠ) όσο και για τη διαστολική αρτηριακή πίεση (ΔΑΠ). Ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) υπολογίστηκε ως το πηλίκο του ΒΣ σε kg προς το τετράγωνο του ΥΣ σε m. 3. Διενέργεια ηλεκτροκαρδιογραφήματος (ΗΚΓ) 12 απαγωγών για τον προσδιορισμό των QT/QTc διαστημάτων. Το ΗΚΓ διενεργήθηκε με τον ασθενή ήρεμο σε ύπτια θέση με έναν απλό φορητό ηλεκτροκαρδιογράφο (ECG Nihon Kohden Cardiofax 9620) σύμφωνα με τις συστάσεις της Αμερικανικής Καρδιολογικής Εταιρείας (191). 4. Διενέργεια βυθοσκόπησης από ειδικό οφθαλμίατρο κατόπιν πρόκλησης μυδρίασης και με τη χρήση διόφθαλμου έμμεσου οφθαλμοσκόπιου για την πρώιμη ανίχνευση διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας. 5. Συλλογή τυχαίου δείγματος ούρων για την πρώιμη ανίχνευση μικρολευκωματινουρίας με τον προσδιορισμό του πηλίκου μικρολευκωματίνη/κρεατινίνη με καθιερωμένες μεθόδους χρησιμοποιώντας έναν αυτόματο αναλυτή (Architect 8000c, Abbott Laboratories, II, USA). Το πηλίκο μικρολευκωματίνη/κρεατινίνη θεωρήθηκε φυσιολογικό σε τιμές <30 μg/mg. 6. Διενέργεια αιμοληψίας για τον προσδιορισμό βιοχημικών, ορμονικών και ανοσολογικών παραμέτρων. Ο προσδιορισμός τους πραγματοποιήθηκε στα εργαστήρια του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Παπαγεωργίου μέσα στα πλαίσια του ετήσιου ελέγχου των παιδιών και εφήβων με ΣΔ1.

70 71 i. Η γλυκόζη, η ολική χοληστερόλη (total cholesterol, TC), τα τριγλυκερίδια (triglycerides, TG), η υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (high density lipoprotein, HDL), η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (low density lipoprotein, LDL), η απολιποπρωτεΐνη Α1 (apolipoprotein A1, ApoA1), η απολιποπρωτεΐνη Β (apolipoprotein B, ApoB) και η λιποπρωτεΐνη (a) [lipoprotein(a), Lp(a)] ορού καθορίστηκαν με καθιερωμένες μεθόδους χρησιμοποιώντας έναν αυτόματο αναλυτή (Architect 8000c, Abbott Laboratories, II, USA). Τα επίπεδα των ApoA1, ApoB και Lp(a) θεωρήθηκαν φυσιολογικά σε τιμές >101 mg/dl, <103 mg/dl και <30 mg/dl, αντίστοιχα. Επιπλέον, υπολογίστηκε η ApoB/ApoA1 αναλογία και θεωρήθηκε φυσιολογική σε τιμές <1.2 (192, 193). ii. Το αντιγόνο του αναστολέα 1 του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (plasminogen activator inhibitor-1 antigen, PAI-1-Ag) και το αντιγόνο του παράγοντα von Willebrand (von Willebrand factor-antigen, vwf- Ag) πλάσματος καθορίστηκαν ποσοτικά με δοκιμασία ανοσοαπορρόφησης μέσω ενζύμου (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (ASSERACHROM PAI-1-Ag, Diagnostica Stago, Asnières, France) και ανοσοοπτικής πυκνότητας (STA-Liatest vwf:ag, Diagnostica Stago, Asnières, France), αντίστοιχα. Το ινωδογόνο πλάσματος προσδιορίστηκε ποσοτικά με τη μέθοδο Clauss (STA Fibrinogen, Diagnostica Stago, Asnières, France). Τα επίπεδα των προαναφερθέντων προθρομβωτικών παραγόντων θεωρήθηκαν φυσιολογικά ή παθολογικά ανάλογα με την ηλικία με βάση δεδομένα μελετών οι οποίες αφορούσαν σε παιδικό πληθυσμό. Συγκεκριμένα, τα ανώτερα όρια φυσιολογικών τιμών για τις ηλικίες 1-5, 6-10 και ετών ήταν για τον PAI-1-Ag 31.2 ng/ml, 48.0 ng/ml και 39.9 ng/ml, αντίστοιχα, για τον vwf-ag 146.4%, 170.3% και 164.5%, αντίστοιχα

71 72 (194) και για το ινωδογόνο 405 mg/dl, 400 mg/dl και 448 mg/dl, αντίστοιχα (195). iii. Η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (glycosylated hemoglobulin, HbA1c) προσδιορίστηκε σε τριχοειδικό αίμα με μία ειδική μέθοδο (DCA Hemoglobin A1c, Siemens, Germany). Ο γλυκαιμικός έλεγχος θεωρήθηκε ικανοποιητικός ή μη σε τιμές HbA1c 7.5% ή >7.5%, αντίστοιχα (180). iv. Οι ορμόνες fτ3, fτ4 και TSH προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας χρησιμοποιώντας τις αντίστοιχες εμπορικές συσκευασίες (Immulite 2000, Siemens Diagnostics Llanberis, Gwynedd, UK). v. Τα αντιθυρεοειδικά αντισώματα anti-tpo και anti-tg προσδιορίστηκαν, επίσης, με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας χρησιμοποιώντας τις αντίστοιχες εμπορικές συσκευασίες (Immulite 2000, Siemens Diagnostics Llanberis, Gwynedd, UK). Θεωρήθηκαν αρνητικά όταν τα επίπεδά τους προσδιορίστηκαν <60 IU/ml. vi. Τα αντισώματα έναντι του ενδομυΐου (endomysial antibodies, EMA) ορού προσδιορίστηκαν ημιποσοτικά με δοκιμασία έμμεσου ανοσοφθορισμού (Endomysial Primate Distal Esophagus, INOVA Diagnostics Inc., San Diego, CA, USA) και θεωρήθηκαν θετικά ή αρνητικά. Τα αντισώματα έναντι της γλιαδίνης τύπου IgA (anti-gliadin antibodies IgA, AGA-IgA), της γλιαδίνης τύπου IgG (anti-gliadin antibodies IgG, AGA-IgG) και της ιστικής τρανγλουταμινάσης (tissue transglutaminase antibodies, TTG) ορού προσδιορίστηκαν με δοκιμασία ELISA (QUANTA Lite Gliadin IgA, QUANTA Lite Gliadin IgG II, QUANTA Lite h-ttg IgA, INOVA Diagnostics Inc., San Diego, CA, USA). Τα AGA-IgA, AGA-IgG και TTG θεωρήθηκαν αρνητικά όταν τα επίπεδά τους προσδιορίστηκαν <20 Units.

72 73 7. Τυποποίηση των HLA-DRB1 και HLA-DQB1 γονιδίων κατά τη διάγνωση του ΣΔ1 ή αργότερα σε ορισμένους ασθενείς. Η τυποποίηση των HLA-DRB1 και HLA-DQB1 γονιδίων έγινε με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης με εκκινητές ειδικούς της ακολουθίας (polymerase chain reaction-sequence specific primers, PCR-SSP). Η απομόνωση του ολικού DNA έγινε με τη χρήση της εμπορικής συσκευασίας (Pel Freez DNA isolation kit, Dynal Biotech, USA) (196, 197). Για την PCR-SSP χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια μέσης ανάλυσης των εταιρειών PROTRANS (GmbH, Germany) και Pel Freez (Dynal Biotech, USA). Για την τυποποίηση των HLA-DRB1 και HLA-DQB1 γονιδίων με αντιδραστήρια της PROTRANS, χρησιμοποιήθηκαν για κάθε δείγμα αίματος 38 μίγματα αφετηριών ειδικών για τα HLA-DRB1 και HLA-DQB1 αλληλόμορφα. Για την τυποποίηση των HLA-DRB1 και HLA-DQB1 γονιδίων με αντιδραστήρια της Pel Freez, χρησιμοποιήθηκαν για κάθε δείγμα αίματος 43 μίγματα αφετηριών ειδικών για τα HLA-DRB1 και HLA-DQB1 αλληλόμορφα. Για την ονομασία των αλληλόμορφων χρησιμοποιήθηκαν οι κανόνες οι οποίοι θεσπίστηκαν από την Επιτροπή Ονοματολογίας για τους παράγοντες του HLA συμπλέγματος του WHO (198). Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε ομάδες ανάλογα με τη θετικότητα ή μη για τα HLA-DRB1*03, HLA- DRB1*04, HLA-DQB1*02, HLA-DQB1*03 και HLA-DQB1*06 αλληλόμορφα, τους HLA-DRB1*03/HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*03/HLA-DRB1*04 και HLA- DQB1*02/HLA-DQB1*03 γονότυπους και τους HLA-DRB1*03/HLA-DQB1*02, HLA-DRB1*03/HLA-DQB1*03 και HLA-DRB1*04/HLA-DQB1*03 απλότυπους. Μεταξύ αυτών μόνο το HLA-DQB1*06 αλληλόμορφο εξετάστηκε για προστατευτική δράση, ενώ τα υπόλοιπα για προδιαθεσική. 8. Προσδιορισμός του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με τη μέθοδο η οποία περιγράφεται αναλυτικά στη συνέχεια. Οι παράμετροι οι οποίες καταγράφηκαν φαίνονται στον πίνακα 3.

73 74 Πίνακας 3. Παράμετροι οι οποίες καταγράφηκαν Ατομικό ιστορικό Κλινική εξέταση Λιπιδαιμικός έλεγχος Ορμονικός έλεγχος Ηλικία εξέτασης ΒΣ TC ft3 Φύλο ΥΣ Trig ft4 Είδος τοκετού ΠΜ HDL TSH ΒΓ ΠΛ LDL ΜΘ ΣΑΠ ApoA1 Έλεγχος αυτοαντισωμάτων Ηλικία διάγνωσης ΔΑΠ ApoB Anti-TPO Στάδιο Tanner διάγνωσης Lp(a) Anti-TG Βαρύτητα διάγνωσης ΗΚΓ EMA Θυρεοειδίτιδα Hashimoto QT Έλεγχος προθρομβωτικών παραγόντων AGA-IgA Κοιλιοκάκη QTc vwf-ag AGA-IgG Αλλεργία σφύξεις PAI-1-Ag TTG Iνωδογόνο Οικογενειακό ιστορικό Βυθοσκόπηση Γονιδιακός έλεγχος ΣΔ1 Γλυκαιμικός έλεγχος PTPN22 C1858T Θυρεοειδίτιδα Hashimoto Μικρολευκωματουρία Γλυκόζη νηστείας HLA-DRB1 Άλλα αυτοάνοσα νοσήματα Mικρολευκωματίνη /κρεατινίνη ούρων Ημερήσια δόση ινσουλίνης/kg ΒΣ HLA-DQB1 HbA1c

74 Μέθοδος Η μέθοδος περιλαμβάνει τέσσερα στάδια: 1) απομόνωση ολικού DNA, 2) PCR, 3) επώαση των PCR προϊόντων με ένζυμα περιορισμού και 4) ηλεκτροφόρηση. Πραγματοποιήθηκε στο Α Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Ιατρικού Τμήματος της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Απομόνωση ολικού δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) Η διαδικασία απομόνωσης ολικού DNA περιλαμβάνει τη διάσπαση των πρωτεϊνών με πρωτεολυτικά ένζυμα (πρωτεϊνάση Κ), την εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες και την κατακρήμνιση του DNA σε διάλυμα αλκοόλης παρουσία άλατος. Από κάθε ασθενή συλλέχθηκαν δύο δείγματα των 2 ml ολικού περιφερικού αίματος σε αποστειρωμένα φιαλίδια με αντιπηκτικό αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid, EDTA). Τα δείγματα υποβλήθηκαν άμεσα σε διαδικασία απομόνωσης ολικού DNA ή φυλάχθηκαν στους 20 ο C μέχρι την επεξεργασία τους. Για την απομόνωση ολικού DNA από φρέσκο ή συντηρημένο στην κατάψυξη αίμα χρησιμοποιήθηκε η εμπορική συσκευασία QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN Inc, CA, USA). Το πρωτόκολλο το οποίο ακολουθήθηκε ήταν το εξής: 1. προσθήκη 20 μl πρωτεάσης (proteinase K) στον πυθμένα μικροσωλήνα eppendorf χωρητικότητας 1.5 ml 2. προσθήκη 200 μl ολικού αίματος 3. προσθήκη 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος Buffer AL 4. ανάμιξη του μίγματος με ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα 5. επώαση στους 56 ο C για 10 λεπτά 6. σύντομη φυγοκέντρηση για απομάκρυνση σταγονιδίων από το εσωτερικό του πώματος

75 76 7. προσθήκη 200 μl αιθανόλης (96-100%) 8. ανάμιξη του μίγματος με ανάδευση για 15 δευτερόλεπτα και σύντομη φυγοκέντρηση για απομάκρυνση σταγονιδίων από το εσωτερικό του πώματος 9. προσεκτική μεταφορά του μίγματος στη στήλη η οποία παρέχεται από τον κατασκευαστή και τοποθετείται μέσα σε ένα σωλήνα συλλογής χωρητικότητας 2 ml 10. φυγοκέντρηση στις 8000 στροφές ανά λεπτό (round per minute, rpm) για 1 λεπτό 11. μεταφορά και τοποθέτηση της στήλης σε καθαρό σωλήνα συλλογής χωρητικότητας 2 ml και απόρριψη του σωλήνα ο οποίος περιέχει το διήθημα 12. προσθήκη 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος Buffer AW1 13. φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 1 λεπτό 14. μεταφορά και τοποθέτηση της στήλης σε καθαρό σωλήνα συλλογής χωρητικότητας 2 ml και απόρριψη του σωλήνα ο οποίος περιέχει το διήθημα 15. προσθήκη 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος Buffer AW2 16. φυγοκέντρηση στις rpm για 3 λεπτά 17. μεταφορά και τοποθέτηση της στήλης σε καθαρό μικροσωλήνα eppendorf 1.5 ml και απόρριψη του σωλήνα συλλογής ο οποίος περιέχει το διήθημα 18. προσθήκη 60 μl ρυθμιστικού διαλύματος Buffer ΑΕ 19. επώαση σε θερμοκρασία δωματίου (15-25 ο C) για 1 λεπτό 20. φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 1 λεπτό Το DNA το οποίο απομονώθηκε αποθηκεύτηκε στους -20 ο C. Προηγήθηκε έλεγχος ποιότητας του απομονωθέντος DNA με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. Η παρασκευή της πηκτής περιλαμβάνει

76 77 την προσθήκη 1 g αγαρόζης σε κωνική φιάλη η οποία περιέχει 100 ml 1 x ΤΒΕ (10 ml 10 x ΤΒΕ και 90 ml H 2 O). Το TBE είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο αποτελείται από Tris-base, βορικό οξύ (borate) και EDTA. Μετά 4 λεπτά θέρμανσης του μίγματος, ακολουθεί ψύξη του και προσθήκη 5 μl διαλύματος βρωμιούχου εθίδιου 1% σε αιθανόλη 20%. Το συστατικό αυτό προστίθεται λόγω της ιδιότητάς του να παρεμβάλλεται στη διπλή έλικα του DNA και να εκπέμπει φθορίζουσα ακτινοβολία μετά από διέγερση με υπεριώδες φως. Ακολουθεί έκχυση του περιεχομένου της κωνικής φιάλης στο εκμαγείο της ηλεκτροφορητικής συσκευής, πάνω στην οποία έχουν τοποθετηθεί χτένες για τη δημιουργία θέσεων φόρτωσης στην πηκτή. Μετά 10 λεπτά η πηκτή στερεοποιείται και οι χτένες απομακρύνονται. Ακολουθεί τοποθέτηση της πηκτής μέσα την κοιλότητα της ηλεκτροφορητικής συσκευής, η οποία είναι γεμάτη με 1 x ΤΒΕ. Σε κάθε θέση φόρτωσης τοποθετούνται αναμεμιγμένα 5 μl διαλύματος DNA από κάθε δείγμα μαζί με 2 μl διαλύματος φόρτωσης (χρωστική Orange G). Η λειτουργία του διαλύματος φόρτωσης είναι διττή. Αφενός οπτικοποιεί τη σχετική θέση του DNA και αφετέρου βοηθάει στον περιορισμό του μίγματος στις θέσεις φόρτωσης λόγω της γλυκερόλης την οποία περιέχει. Δίπλα στα δείγματα φορτώνονται 5 μl 100 ζευγών βάσεων (base pair, bp) μάρτυρα μοριακών βαρών (ladder). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε τάση ρεύματος 120 V για λεπτά. Στη συνέχεια η πηκτή τοποθετείται σε τράπεζα υπεριώδους φωτός όπου ελέγχεται η επιτυχής ή όχι απομόνωση του DNA. Αν η απομόνωση είναι επιτυχής μπορεί να ακολουθήσει ενίσχυση κάποιας συγκεκριμένης περιοχής του DNA με τη μέθοδο της PCR. Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μία απλή μέθοδος ενίσχυσης του DNA με μεγάλη ακρίβεια και ταχύτητα. Η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1) αποδιάταξης DNA κατά το οποίο το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται σε υψηλή θερμοκρασία, παράγοντας

77 78 μονόκλωνες αλυσίδες οι οποίες θα χρησιμοποιηθούν ως εκμαγεία για την DNA πολυμεράση και τους εκκινητές, 2) σύνδεσης εκκινητών κατά το οποίο κάθε εκκινητής αλληλεπιδρά με τον αντίστοιχο κλώνο DΝΑ με τον οποίο είναι συμπληρωματικός, 3) επιμήκυνσης κατά το οποίο η θερμοσταθερή DNA πολυμεράση συνθέτει το συμπληρωματικό DΝΑ, χρησιμοποιώντας δεοξυνουκλεοτίδια (deoxynucleotide, dntp), τα οποία βρίσκονται μέσα στο μίγμα της αντίδρασης. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται με σκοπό τον αποχωρισμό των νεοσυντιθέμενων μικρών τμημάτων δίκλωνου DΝΑ, τα οποία θα χρησιμεύσουν ως εκμαγεία για τον επόμενο κύκλο σύνθεσης. Η επανάληψη του κύκλου n φορές έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή 2n δίκλωνων μορίων, πιστών αντίγραφων της ενισχυόμενης αλληλουχίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή ενισχύθηκε ένα τμήμα του ΡΤΡΝ22 γονιδίου το οποίο περιλαμβάνει τον πολυμορφισμό CT στη θέση Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν ειδικά σχεδιασμένοι εκκινητές οι οποίοι αναφέρεται ότι έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στη διεθνή βιβλιογραφία. Η νουκλεοτιδική ακολουθία των εκκινητών είναι η εξής: PTPN22 F: 5 -ACTGATAATGTTGCTTCAACGG-3 PTPN22 R: 5 -TCACCAGCTTCCTCAACCAC-3 Τα συστατικά του μίγματος της PCR αντίδρασης ήταν: ολικό DΝΑ 2 μl 10 x ρυθμιστικό διάλυμα (PCR buffer) 5 μl 10 mmol dntps 1 μl 10 pmol/μl εκκινητή F 1 μl 10 pmol/μl εκκινητή R 1 μl 5 u/μl Taq DNA πολυμεράση 0.3 μl αποστειρωμένο Η 2 Ο 15.7 μl Οι ποσότητες οι οποίες αναφέρονται αντιστοιχούν σε μίγμα αντίδρασης τελικού όγκου 25 μl ανά δείγμα. Το MgCl 2 περιεχόταν στο PCR buffer.

78 79 Στη συνέχεια όλα τα δείγματα και ένα τυφλό δείγμα χωρίς DNA, προκειμένου να διαπιστωθεί ενδεχόμενη επιμόλυνση της PCR αντίδρασης, τοποθετήθηκαν στον αυτόματο κυκλοποιητή θερμοκρασίας για την πραγματοποίηση της PCR αντίδρασης. Χρησιμοποιήθηκε η PCR συσκευή Creacon TCY η οποία προγραμματίστηκε ως εξής: 1. αρχική ενεργοποίηση 94 o C για 5 λεπτά 2. αποδιάταξη 94 o C για 30 δευτερόλεπτα 3. σύνδεση εκκινητών 60 o C για 30 δευτερόλεπτα 4. επιμήκυνση 72 o C για 60 δευτερόλεπτα 5. επανάληψη των βημάτων 2 ως 4 για 30 κύκλους 6. τελική επιμήκυνση 72 o C για 5 λεπτά. Μετά το τέλος του προγράμματος τα δείγματα φυλάχθηκαν στους 4 o C. Ο έλεγχος της επιτυχημένης ενίσχυσης της επιθυμητής αλληλουχίας έγινε με ηλεκτροφόρηση 5 μl από το μίγμα της PCR αντίδρασης σε πηκτή αγαρόζης όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μόνη διαφορά στη συγκέντρωση της πηκτής (2%). Επώαση των PCR προϊόντων με ένζυμο περιορισμού Για τον προσδιορισμό του γονότυπου πρέπει το PCR προϊόν κάθε δείγματος να υποβληθεί σε πέψη με ένζυμo περιορισμού. Γνωρίζοντας την αλληλουχία την οποία περιέχει το σημείο πολυμορφισμού επιλέχθηκε το κατάλληλο ένζυμο το οποίο έχει ως θέση αναγνώρισης το σημείο πολυμορφισμού, στο οποίο συνδέεται και διασπά τη διπλή έλικα DNA. Η θέση αναγνώρισης παραμένει ανέπαφη στην περίπτωση ύπαρξης του ενός αλληλομόρφου, ενώ χάνεται στην περίπτωση ύπαρξης του άλλου και, έτσι, το ένζυμο, μη αναγνωρίζοντας θέση κοπής, δεν μπορεί να πραγματοποιήσει πέψη. Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία επιλέχθηκε το ένζυμο περιορισμού RsaI (Fermentas, Germany) το οποίο αναγνωρίζει τη θέση:

79 80 5 G T A C 3 3 C A T G 5 Το PCR προϊόν το οποίο υποβλήθηκε σε πέψη έχει συνολικό μήκος 218 bp. Η ύπαρξη του C αλληλομόρφου επιτρέπει τη δημιουργία της θέσης αναγνώρισης του RsaI και, συνεπώς, το προϊόν πέπτεται σε δύο κομμάτια μήκους 172 bp και 46 bp. Εάν υπάρχει το Τ αλληλόμορφο, η θέση αναγνώρισης χάνεται και το προϊόν παραμένει ανέπαφο (218 bp) παρά την επώαση με το ένζυμο. Τα συστατικά του μίγματος επώασης με το ένζυμο ήταν: PCR προϊόν 10 μl RsaI 1 μl 10 x ρυθμιστικό διάλυμα (Buffer Tango TM ) 2 μl αποστειρωμένο Η 2 Ο 12 μl Οι ποσότητες οι οποίες αναφέρονται αντιστοιχούν σε μίγμα επώασης τελικού όγκου 25 μl ανά δείγμα. Ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για τουλάχιστον 6 ώρες. Ηλεκτροφόρηση Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης σε πηκτή αγαρόζης 2.3% με προσθήκη βρωμιούχου εθίδιου για οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων Χρηματοδότηση Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε με την οικονομική υποστήριξη της Διαβητολογικής Εταιρείας Βορείου Ελλάδος Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα Statistical Package for Social Science software for Windows, version 21.0 (SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA).

80 81 Αρχικά υπολογίστηκαν τα περιγραφικά χαρακτηριστικά του δείγματος. Για τις ποσοτικές μεταβλητές υπολογίστηκαν τα μέτρα κεντρικής τάσης (μέση τιμή και διάμεσος) και τα μέτρα διασποράς των δειγμάτων (τυπική απόκλιση, standard deviation, SD, και εύρος τιμών), ανάλογα με το αν οι μεταβλητές ήταν κανονικά ή μη κανονικά κατανεμημένες, αντίστοιχα. Για τις ποιοτικές μεταβλητές υπολογίστηκαν οι συχνότητες εκφρασμένες σε απόλυτες τιμές και ποσοστά %. Για τον έλεγχο της κανονικότητας των ποσοτικών μεταβλητών εφαρμόστηκαν οι δοκιμασίες Kolmogorov-Smirnov σε πλήθος παρατηρήσεων ίσο ή μεγαλύτερο του 50 και Shapiro-Wilk στην αντίθετη περίπτωση. Για τον έλεγχο των διαφορών στις συχνότητες των αλληλόμορφων και γονότυπων μεταξύ ομάδας ασθενών και ομάδας ελέγχου καθώς και μεταξύ των υποομάδων ασθενών εφαρμόστηκε η δοκιμασία x 2 (Pearson Chi-square test). Όταν προέκυπτε πίνακας συνάφειας 2 2, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία x 2 μετά από διόρθωση συνέχειας (Yates correction for continuity). Στην περίπτωση κατά την οποία ο αναμενόμενος αριθμός συχνοτήτων ήταν μικρότερος του 5, χρησιμοποιήθηκε η ακριβής δοκιμασία Fisher s (Fisher s exact test). Για τη σύγκριση των ποσοτικών μεταβλητών μεταξύ των δύο ομάδων ασθενών ανάλογα με το γονότυπο χρησιμοποιήθηκαν η παραμετρική μέθοδος ανάλυσης Student s t-test στην περίπτωση στην οποία τα δεδομένα των μεταβλητών ακολουθούσαν την κανονική καμπύλη και η μη παραμετρική μέθοδος ανάλυσης Mann Whitney test στην περίπτωση στην οποία τα δεδομένα των μεταβλητών δεν ακολουθούσαν την κανονική καμπύλη. Για τη διερεύνηση της επίδρασης του υπό μελέτη πολυμορφισμού στην εκδήλωση ΣΔ1 καθώς και σε συγκεκριμένες ποιοτικές μεταβλητές χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον και οι OR με τα 95% CIs οι οποίες υπολογίστηκαν με βάση το λογαριθμιστικό μοντέλο (logistic regression). Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε το p<0.05.

81 Έλεγχος αντιπροσωπευτικότητας δείγματος με τη χρήση του θεωρήματος Hardy-Weinberg Συμπληρωματικά με τον υπολογισμό των συχνοτήτων των αλληλόμορφων και των γονοτύπων στις ομάδες ασθενών και ελέγχου ελέγχθηκε αν τα δείγματα των δύο ομάδων είχαν στατιστικά σημαντικές αποκλίσεις από την ισορροπία Hardy-Weinberg. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αυτής αποτελούν ένδειξη υπέρ ή κατά της αντιπροσωπευτικότητας των δειγμάτων τα οποία μελετήθηκαν, καθώς ο μικρός αριθμός και η μη αντιπροσωπευτικότητα ενός δείγματος είναι μία από τις αιτίες ανισορροπίας του πληθυσμού. Το θεώρημα Hardy-Weinberg χρησιμοποιείται για να περιγράψει γονιδιακές συχνότητες σε στατικούς από πλευράς εξέλιξης πληθυσμούς. Τέτοιοι πληθυσμοί ονομάζονται «πληθυσμοί οι οποίοι βρίσκονται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg». Σύμφωνα με το θεώρημα αυτό, οι συχνότητες των αλληλόμορφων σε έναν πληθυσμό παραμένουν σταθερές κατά τις διάφορες γενιές, αν δεν επιδράσουν άλλοι παράγοντες εκτός από την ανακατανομή των γονιδίων κατά τη διαδικασία της γαμετογένεσης. Για την περίπτωση ενός χαρακτηριστικού το οποίο καθορίζεται από δύο αλληλόμορφα (A και α) ενός γονιδίου, το θεώρημα ορίζει ότι: (1) p+q=1, όπου p η συχνότητα του ενός αλληλόμορφου (Α) και q η συχνότητα του άλλου αλληλόμορφου (α) και (2) p 2 +2pq+q 2 =1, όπου p 2 η συχνότητα των ΑΑ ατόμων, 2pq η συχνότητα των Αα και αα ατόμων και q 2 η συχνότητα των αα ατόμων. Με τον τρόπο αυτό είναι εφικτός ο υπολογισμός της συχνότητας των αλληλόμορφων σε ένα πληθυσμό, αν γνωρίζουμε τη συχνότητα των γονότυπων και αντίστροφα. Με βάση τα παραπάνω, οι αναμενόμενες συχνότητες γονότυπων του υπό μελέτη πολυμορφισμού, οι οποίες αναμένονται εφόσον τα δείγματα (ομάδες ασθενών και ελέγχου) βρίσκονται σε ισορροπία Hardy-Weinberg

82 83 υπολογίσθηκαν από τον τύπο (2) με βάση τις παρατηρούμενες συχνότητες αλληλόμορφων των δειγμάτων. Οι αναμενόμενες και οι παρατηρούμενες συχνότητες γονότυπων συγκρίθηκαν μεταξύ τους για να επιβεβαιωθεί ότι τα δείγματα βρίσκονται σε ισορροπία Hardy-Weinberg. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το κριτήριο x 2 ως δοκιμασία καλής προσαρμογής (goodness-offit test).

83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ευρήματα γονοτύπισης Απομόνωση ολικού DΝΑ Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού DΝΑ -για τον προσδιορισμό του PTPN22 C1858T πολυμορφισμού- από 130 παιδιά και εφήβους με ΣΔ1 και από 135 υγιή άτομα. Η απομόνωση ήταν επιτυχής για όλα τα δείγματα τα οποία εξετάστηκαν. Εκλεκτική ενίσχυση του ΡΤΡΝ22 γονιδίου με την PCR Μετά την απομόνωση ολικού DNA ακολούθησε εκλεκτική ενίσχυση της αλληλουχίας η οποία περιέχει τον PTPN22 C1858T πολυμορφισμό. Ενζυμική πέψη των PCR προϊόντων Για τον προσδιορισμό του γονότυπου κάθε δείγματος πραγματοποιήθηκε πέψη με ένζυμο περιορισμού και ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης σε πηκτή αγαρόζης. Κατά την παρατήρηση της πηκτής αγαρόζης σε τράπεζα υπεριώδους φωτός εμφανίστηκε η ακόλουθη εικόνα, χαρακτηριστική για τον PTPN22 C1858T πολυμορφισμό (Εικόνα 12). Εικόνα 12. Αποτέλεσμα πέψης για τον PTPN22 C1858T πολυμορφισμό

84 Χαρακτηριστικά ομάδας ασθενών Την ομάδα ασθενών αποτέλεσαν 130 παιδιά και έφηβοι με ΣΔ1. Συμπεριλήφθηκαν 73 (56.2%) άρρενα και 57 (43.8%) θήλεα άτομα. Σε όλους τους ασθενείς η διάγνωση είχε τεθεί πριν την ηλικία των 15 ετών και συγκεκριμένα σε 44 (33.8%) σε ηλικία μικρότερη των 5 ετών, σε 42 (32.3%) σε ηλικία μεγαλύτερη ή ίση των 5 ετών αλλά μικρότερη των 10 ετών και σε 44 (33.8%) σε ηλικία μεγαλύτερη ή ίση των 10 ετών. Αναφορικά με το στάδιο Tanner κατά τη διάγνωση, από τους ασθενείς 101 (77.7%) ήταν προεφηβικοί και 29 (22.3%) ήταν έφηβοι. Σε ό,τι αφορά τη βαρύτητα της αρχικής εκδήλωσης σε 103 (79.2%) ασθενείς διαπιστώθηκε διαβητική κετοξέωση (ΔΚΟ), ενώ στους υπόλοιπους 27 (20.8%) υπεργλυκαιμία χωρίς ΔΚΟ. Μεταξύ των ασθενών διαπιστώθηκε συννοσηρότητα και συγκεκριμένα θυρεοειδίτιδα Hashimoto σε 28 (21.5%), κοιλιοκάκη σε 4 (3.1%) και ανεπάρκεια IgA σε 5 (3.8%). Σε κανέναν από τους ασθενείς δε διαπιστώθηκαν επιπλοκές του ΣΔ1 (μικρολευκωματινουρία, διαβητική αμφιβληστροπάθεια, διαβητική νευροπάθεια). Η ηλικία διάγνωσης καθώς και οι κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ασθενών ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο καταγράφονται στους Πίνακες 4 και 5. Για την περιγραφή του ΔΜΣ εκτός από τις απόλυτες τιμές χρησιμοποιήθηκαν οι ΕΘ και οι βαθμολογίες των τυπικών αποκλίσεων (standard deviation score, SDS) του WHO. Για τον υπολογισμό των ΕΘ και των SDS χρησιμοποιήθηκαν τα υπολογιστικά προγράμματα του WHO, WHO Anthro και WHO Anthro Plus για βρέφη και νήπια ως 5 ετών καθώς και παιδιά και έφηβους 5-19 ετών, αντίστοιχα. Η ημερήσια δόση ινσουλίνης/kg ΒΣ καταγράφηκε για τους ασθενείς οι οποίοι βρίσκονταν υπό αγωγή με εντατικοποιημένο σχήμα ινσουλίνης.

85 Πίνακας 4. Η ηλικία διάγνωσης καθώς και οι κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ασθενών με ΡΤΡΝ22 C1858C γονότυπο 86 Μέση τιμή±sd Διάμεσος (εύρος) Ηλικία διάγνωσης (έτη) 7.33± ( ) ΒΓ (g) ± ( ) ΔΜΣ (ΕΘ) 69.22± ( ) ΔΜΣ (SDS) 0.72± [(-2.55)-3.69] ΠΜ (cm) 71.81± ( ) ΠΛ (cm) 31.27± ( ) ΣΑΠ (mmhg) ± (90-162) ΔΑΠ (mmhg) 66.74± (50-97) QT (msec) ± ( ) QTc (msec) 405.0± ( ) TC (mg/dl) ± ( ) Trig (mg/dl) 62.78± (27-430) HDL (mg/dl) 59.04± (33-87) LDL (mg/dl) 99.14± (59-217) ApoA1 (mg/dl) ± (86-177) ApoB (mg/dl) 63.79± (28-128) Lp(a) (mg/dl) 18.30± (1-124) ApoB/ApoA1 0.50± ( ) vwf-ag (%) ± (20-302) PAI-1-Ag (Av/ml) 31.34± ( ) Ινωδογόνο (mg/dl) ± ( ) Γλυκόζη νηστείας (mg/dl) ± (52-457) Δόση ινσουλίνης (IU/kg/μέρα) 0.81± ( ) HbA1c (%) 7.87± ( ) ft3 (pg/ml) 4.23± ( ) ft4 (mg/dl) 1.20± ( ) TSH (μiu/ml) 2.53± ( ) Anti-TPO (IU/ml) ± ( ) Anti-TG (IU/ml) 76.47± ( ) AGA-IgA (Units) 6.90± (0.8-65) AGA-IgG (Units) 8.10± (2-17) TTG (Units) 8.05± (0.5-67) Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή.

86 Πίνακας 5. Η ηλικία διάγνωσης καθώς και οι κλινικές και εργαστηριακές παράμετροι των ασθενών με ΡΤΡΝ22 C1858T και T1858T γονότυπους 87 Μέση τιμή±sd Διάμεσος (εύρος) Ηλικία διάγνωσης (έτη) 7.68± ( ) ΒΓ (g) ± ( ) ΔΜΣ (ΕΘ) 62.75± ( ) ΔΜΣ (SDS) 0.44± [(-0.70)-1.93] ΠΜ (cm) 72.73± ( ) ΠΛ (cm) 31.98± ( ) ΣΑΠ (mmhg) ± (96-137) ΔΑΠ (mmhg) 68.92± (55-90) QT (msec) ± ( ) QTc (msec) ± ( ) TC (mg/dl) ± ( ) Trig (mg/dl) 68.92± (36-135) HDL (mg/dl) 55.14± (37-73) LDL (mg/dl) ± (53-212) ApoA1 (mg/dl) ± (58-152) ApoB (mg/dl) 62.71± (25-117) Lp(a) (mg/dl) 10.94± ( ) ApoB/ApoA1 0.58± ( ) vwf-ag (%) ± (62-177) PAI-1-Ag (Av/ml) 27.58± ( ) Ινωδογόνο (mg/dl) ± ( ) Γλυκόζη νηστείας (mg/dl) ± (66-325) Δόση ινσουλίνης (IU/kg/μέρα) 0.80± ( ) HbA1c (%) 8.22± ( ) ft3 (pg/ml) 3.87± ( ) ft4 (mg/dl) 1.16± ( ) TSH (μiu/ml) 3.13± ( ) Anti-TPO (IU/ml) ± ( ) Anti-TG (IU/ml) 85.02± (15-489) AGA-IgA (Units) 4.87± ( ) AGA-IgG (Units) 6.02± ( ) TTG (Units) 6.50± ( ) Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή.

87 Συγκρίσεις μεταξύ ομάδας ασθενών και ομάδας ελέγχου ως προς τους γονότυπους και τα αλληλόμορφα του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού Αρχικά ακολουθώντας τον κύριο σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναζητήθηκε διαφορά στη συχνότητα των PTPN22 C1858T γονότυπων και αλληλόμορφων ανάμεσα στους ασθενείς και την ομάδα ελέγχου. Ο PTPN22 C1858Τ γονότυπος ήταν σαφώς πιο συχνός στους ασθενείς (10.0%) συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (5.9%). Ο PTPN22 Τ1858Τ γονότυπος εντοπίστηκε σε ένα μόνο ασθενή (0.8%) αλλά όχι στην ομάδα ελέγχου. Εξαιτίας της σπανιότητας των φορέων του ΡΤΡΝ22 Τ1858Τ γονότυπου, οι PTPN22 C1858T και PTPN22 Τ1858Τ γονότυποι ομαδοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση και αυτή η ομαδοποίηση ακολουθήθηκε και στη συνέχεια. Έτσι, η ομάδα των ασθενών με PTPN22 C1858C γονότυπο θα αναφέρεται ως ομάδα Α και η ομάδα των ασθενών με PTPN22 C1858Τ και PTPN22 Τ1858Τ γονότυπους θα αναφέρεται ως ομάδα Β. Οι PTPN22 C1858Τ και PTPN22 Τ1858Τ γονότυποι εντοπίστηκαν συχνότερα στους ασθενείς (10.8%) συγκριτικά με τα υγιή άτομα (5.9%) αλλά όχι σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο. Εξάλλου, και το PTPN T αλληλόμορφο εντοπίστηκε πιο συχνά στους ασθενείς (5.8%) συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (3.0%), αλλά η διαφορά στη συχνότητα δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 6). Στα γραφήματα τα οποία ακολουθούν απεικονίζεται η κατανομή ασθενών και των υγιών ατόμων ανάλογα με τους ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπους αρχικά και μετά την ομαδοποίηση των PTPN22 C1858T και PTPN22 Τ1858Τ γονότυπων καθώς και ανάλογα με τα ΡΤΡΝ22 C1858T αλληλόμορφα (Γραφήματα 1-3).

88 Πίνακας 6. Η κατανομή των ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπων και των αλληλόμορφων στις ομάδες ασθενών και ελέγχου 89 Γονότυπος Ασθενείς Ομάδα ελέγχου (N=130) (N=135) x 2 Λογαριθμιστικό μοντέλο p OR (CI) p CC 116 (89.2) 127 (94.1) CT 13 (10.0) 8 (5.9) TT 1 (0.8) 0 CT+TT 14 (10.8) 8 (5.9) ( ) Αλληλόμορφο C 245 (94.2) 262 (97.0) ( ) T 15 (5.8) 8 (3.0) OR των φορέων προς τους μη φορείς του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου και OR του ΡΤΡΝ T αλληλόμορφου προς το ΡΤΡΝ C αλληλόμορφο Γράφημα 1. Η κατανομή των ασθενών και των υγιών ατόμων ανάλογα με τον PTPN22 C1858T γονότυπο

89 90 Γράφημα 2. Η κατανομή των ασθενών και των υγιών ατόμων ανάλογα με τον PTPN22 C1858T γονότυπο μετά την ομαδοποίηση των PTPN22 C1858T και PTPN22 Τ1858Τ γονότυπων Γράφημα 3. Η κατανομή των ασθενών και των υγιών ατόμων ανάλογα με τα PTPN22 C1858T αλληλόμορφα

90 91 Στη συνέχεια εξετάστηκε αν υπάρχει επίδραση του φύλου στη συχνότητα των ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπων και αλληλόμορφων. Καταγράφηκε τάση υψηλότερης συχνότητας των ΡΤΡΝ22 C1858Τ και Τ1858Τ γονότυπων στα άρρενα άτομα. Η συχνότητα των ΡΤΡΝ22 C1858Τ και Τ1858Τ γονότυπων στους άρρενες ασθενείς ήταν 12.3% έναντι 6.9% στα άρρενα υγιή άτομα (Πίνακας 7). Πίνακας 7. Η κατανομή του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού στις ομάδες ασθενών και ελέγχου ανάλογα με το φύλο Άρρεν Θήλυ Ασθενείς Ομάδα p Ασθενείς Ομάδα p Γονότυπος (N=73) ελέγχου (N=72) (N=57) ελέγχου (N=63) CC 64 (87.7) 67 (93.1) (91.2) 60 (95.2) CT 8 (11.0) 5 (6.9) 5 (8.8) 3 (4.8) TT 1 (1.4) CT+TT 9 (12.3) 5 (6.9) (8.8) 3 (4.8) Αλληλόμορφο C 136 (93.2) 139 (96.5) (95.6) 123 (97.6) T 10 (6.8) 5 (3.5) 5 (4.4) 3 (2.4) OR (CI) ΡΤΡΝ22 C1858T+Τ1858T/C1858C μεταξύ των αρρένων ( ), p= OR (CI) ΡΤΡΝ22 C1858T+Τ1858T/C1858C μεταξύ των θηλέων ( ), p= OR (CI) ΡΤΡΝ T/1858C μεταξύ των αρρένων ( ), p= OR (CI) ΡΤΡΝ T/1858C μεταξύ των θηλέων ( ), p=0.394

91 Ευρήματα ως προς την ισορροπία Hardy-Weinberg Όπως προαναφέρθηκε, οι αναμενόμενες συχνότητες των γονότυπων του PTPN22 C1858T πολυμορφισμού στον υπό μελέτη πληθυσμό, εφόσον αυτός βρίσκεται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg, μπορούν να υπολογιστούν χρησιμοποιώντας τις παρατηρούμενες συχνότητες των αλληλόμορφων. Στον Πίνακα 8 καταγράφονται οι αναμενόμενες και οι παρατηρούμενες συχνότητες των γονότυπων τόσο στην ομάδα ασθενών όσο και στην ομάδα ελέγχου καθώς και η μεταξύ τους σύγκριση με τη δοκιμασία x 2 καλής προσαρμογής. Πίνακας 8. Σύγκριση παρατηρούμενων και αναμενόμενων με βάση την ισορροπία Hardy-Weinberg συχνοτήτων των PTPN22 C1858T γονότυπων Ασθενείς (Ν=130) x 2 Ομάδα ελέγχου (Ν=135) Γονότυπος CC CT TT CC CT TT Παρατηρούμενη p= p=0.930 συχνότητα Αναμενόμενη συχνότητα x 2 Οι αναμενόμενες συχνότητες δε διέφεραν στατιστικά σημαντικά από τις παρατηρούμενες τόσο στην ομάδα ασθενών (p=0.605) όσο και στην ομάδα ελέγχου (p=0.930), γεγονός το οποίο επιβεβαιώνει ότι τα δείγματα τόσο των ασθενών όσο και των υγιών ατόμων βρίσκονται σε ισορροπία Hardy-Weinberg και συνηγορεί υπέρ της αντιπροσωπευτικότητας του δείγματος Έλεγχος γενετικού αποτελέσματος μεταλλαγμένου αλληλόμορφου Εξετάστηκε κατά πόσο το γενετικό αποτέλεσμα του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου είναι επικρατούν (φορείς της μετάλλαξης έναντι ομοζυγωτών

92 93 άγριου τύπου), υπολειπόμενο (ομοζυγώτες της μετάλλαξης έναντι φορέων άγριου τύπου), αθροιστικό (ομοζυγώτες της μετάλλαξης έναντι ομοζυγωτών άγριου τύπου) ή συνεπικρατούν (ετεροζυγώτες έναντι ομοζυγωτών). Η ανάλυση κατέληξε υπέρ του επικρατούντος μοντέλου κληρονόμησης, χωρίς, ωστόσο, να φτάνει σε επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας (p=0.184) (Πίνακας 9). Το επικρατούν μοντέλο κληρονόμησης υιοθετήθηκε σε όλη τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων λόγω και της ανίχνευσης ενός μόνο ατόμου με ΡΤΡΝ22 Τ1858Τ γονότυπο στην ομάδα των ασθενών. Πίνακας 9. Το μοντέλο συσχέτισης των ΡΤΡΝ22 C1858T γονοτύπων με το ΣΔ1 Μοντέλο Ασθενείς Ομάδα ελέγχου p Επικρατούν CC CT+TT CC CT+TT 116 (89.2) 14 (10.8) 127 (94.1) 8 (5.9) Υπολειπόμενο CC+CT TT CC+CT TT 129 (99.2) 1 (0.8) 135 (100) Αθροιστικό CC TT CC TT 116 (99.1) 1 (0.9) 127 (100) Συνεπικρατούν CC+TT CT CC+TT CT 118 (90.8) 12 (9.2) 127 (94.1) 8 (5.9) OR (CI) ( ), p= OR (CI) ( ), p= Συγκρίσεις ασθενών φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς δημογραφικά στοιχεία Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς το φύλο και την ηλικία εξέτασης ως συνεχή και κατηγορική μεταβλητή. Το ηλικιακό όριο τέθηκε στα 10 έτη. Η ηλικία εξέτασης Βρέθηκε στατιστικά

93 σημαντικά αυξημένη στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α [14.67 ( ) έτη έναντι ( ) έτη, p=0.027] (Πίνακας 10, Γράφημα 4). 94 Πίνακας 10. Η κατανομή της ηλικίας εξέτασης και του φύλου ανάλογα με τον PTPN22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p Φύλο Άρρενα Θήλεα Άρρενα Θήλεα 64 (55.2) 52 (44.8) 9 (64.3) 5 (35.7) Ηλικία εξέτασης (έτη) <10 10 < (27.6) 84 (72.4) 1 (7.1) 13 (92.9) ( ) ( ) Η μεταβλητή αυτή δεν ακολουθεί την κανονική κατανομή Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς στοιχεία από το περιγεννητικό ιστορικό Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς παραμέτρους του περιγεννητικού ιστορικού (είδος τοκετού, ΜΘ, ΒΓ). Το ΒΓ εξετάστηκε τόσο ως συνεχής όσο και ως κατηγορική μεταβλητή με όριο τα 3500 g. Το όριο αυτό επιλέχθηκε σύμφωνα με τα δεδομένα της διεθνούς βιβλιογραφίας με βάση τα οποία έχει χρησιμοποιηθεί ως κατώτερο όριο για την εκτίμηση του ενδεχόμενου συσχέτισης του αυξημένου ΒΓ με το ΣΔ1 (199). Προκειμένου να εκτιμηθεί και η διάρκεια του ΜΘ, καταγράφηκαν η διακοπή του ΜΘ και η χορήγηση εξανθρωποποιημένου γάλατος πριν την ηλικία των 6 μηνών. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε παρόμοιες συχνότητες καισαρικής τομής και ΒΓ 3500 g στις δύο ομάδες ασθενών. Όταν το ΒΓ εξετάστηκε ως συνεχής μεταβλητή, η μέση τιμή ήταν παρόμοια και στις δύο ομάδες και βρισκόταν κάτω από το όριο των 3500 g ( ± g έναντι ±43.84 g αντίστοιχα,

94 95 p=0.911). Ο ΜΘ αναφέρθηκε συχνότερα αλλά όχι στατιστικά σημαντικά στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α (78.6% έναντι 69.1% αντίστοιχα, p=0.549), αλλά διακοπή ΜΘ αναφέρθηκε σε ήπια υψηλότερη συχνότητα στην ομάδα Β έναντι της ομάδας Α (84.6% έναντι 77.2% αντίστοιχα, p=0.729) (Πίνακας 11). Πίνακας 11. Η κατανομή παραμέτρων του περιγεννητικού ιστορικού ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p Τοκετός Φυσιολογικός Καισαρική τομή Φυσιολογικός Καισαρική τομή 77 (66.4) 39 (33.6) 10 (71.4) 4 (28.6) ΜΘ Ναι Όχι Ναι Όχι 65 (69.1) 29 (30.9) 11 (78.6) 3 (21.4) Διακοπή ΜΘ πριν ηλικία 6 μηνών Ναι Όχι Ναι Όχι 71 (77.2) 21 (22.8) 11 (84.6) 2 (15.4) ΒΓ (g) < < (63.8) 42 (36.2) 8 (57.1) 6 (42.9) ± ± Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς στοιχεία από το ατομικό ιστορικό Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς παραμέτρους του ατομικού αναμνηστικού του ΣΔ1 (ηλικία, στάδιο Tanner και βαρύτητα διάγνωσης) και συνύπαρξης άλλων αυτοάνοσων νοσημάτων (θυρεοειδίτιδα Hashimoto, κοιλιοκάκη) ή αλλεργίας. Η ηλικία διάγνωσης εξετάστηκε τόσο ως συνεχής όσο και ως διχότομη ή τριχότομη κατηγορική μεταβλητή με όριο τα 10 έτη ή τα 5 και 10 έτη, αντίστοιχα. Σε ό,τι αφορά την

95 96 ηλικία διάγνωσης αυτή δε διέφερε στις δύο ομάδες ασθενών ούτε ως συνεχής ούτε ως κατηγορική μεταβλητή. Διαπιστώθηκε υψηλότερη συχνότητα σταδίου Tanner κατά τη διάγνωση II-V στην ομάδα B συγκριτικά με την ομάδα A (35.7% έναντι 20.7%) αλλά όχι σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο (p=0.304). Η συχνότητα της ΔΚΟ ήταν ήπια αυξημένη στην ομάδα B συγκριτικά με την ομάδα A (85.7% έναντι 78.4%) αλλά όχι σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο (p=0.733). Ομοίως, και η θυρεοειδίτιδα Hashimoto, αν και απαντήθηκε συχνότερα στους ασθενείς της ομάδας Β συγκριτικά με τους ασθενείς της ομάδας Α (28.6% έναντι 20.7%), δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p=0.499). Η συχνότητα της κοιλιοκάκης ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες ασθενών και όλα τα περιστατικά του υπό μελέτη πληθυσμού εντοπίστηκαν στην ομάδα Α. Από την άλλη πλευρά, ιστορικό αλλεργίας καταγράφηκε λιγότερο συχνά μεταξύ των ασθενών της ομάδας Β συγκριτικά με τους ασθενείς της ομάδας Α (15.4% έναντι 31.9%), αλλά δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p=0.336) (Πίνακας 12).

96 Πίνακας 12. Η κατανομή παραμέτρων του ατομικού ιστορικού ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο 97 Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p Διάγνωση Ηλικία (έτη) 7.00 ( ) 7.23 ( ) < < (34.5) 39 (33.6) 37 (31.9) 4 (28.6) 5 (35.7) 5 (35.7) <10 10 < (68.1) 37 (31.9) 9 (64.3) 5 (35.7) Στάδιο Tanner Ι II-V I II-V 92 (79.3) 24 (20.7) 9 (64.3) 5 (35.7) Βαρύτητα ΔΚΟ Υπεργλυκαιμία ΔΚΟ Υπεργλυκαιμία 91 (78.4) 25 (21.6) 12 (85.7) 2 (14.3) Συνυπάρχουσες παθήσεις Θυρεοειδίτιδα Hashimoto Ναι Όχι Ναι Όχι 24 (20.7) 82 (79.3) 4 (28.6) 10 (71.4) Κοιλιοκάκη Ναι Όχι Ναι Όχι 4 (3.4) 112 (96.6) 0 14 (100) Αλλεργία Ναι Όχι Ναι Όχι 30 (31.9) 64 (68.1) 2 (15.4) 11 (84.6) Η μεταβλητή αυτή δεν ακολουθεί την κανονική κατανομή.

97 Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς το οικογενειακό ιστορικό ΣΔ1 και άλλων αυτοάνοσων νοσημάτων Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς το οικογενειακό ιστορικό ΣΔ1, θυρεοειδίτιδας Hashimoto και άλλων, πλην των προαναφερθέντων, αυτοάνοσων νοσημάτων αλλά οι συχνότητες οι οποίες καταγράφηκαν ήταν παρόμοιες στις δύο ομάδες ασθενών, με αποτέλεσμα να μην ανιχνευθούν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις (Πίνακας 13). Πίνακας 13. Η κατανομή παραμέτρων του οικογενειακού ιστορικού ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p Οικογενειακό ιστορικό ΣΔ1 Ναι Όχι Ναι Όχι 18 (15.5) 98 (84.5) 2 (14.3) 12 (85.7) Θυρεοειδίτιδας Hashimoto Ναι Όχι Ναι Όχι 56 (49.6) 57 (50.4) 5 (41.7) 7 (58.3) Άλλων αυτοάνοσων Ναι Όχι Ναι Όχι νοσημάτων 12 (10.3) 104 (89.7) 1 (7.7) 13 (92.9) Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς κλινικές παραμέτρους και στοιχεία του ηλεκτροκαρδιογραφήματος (ΗΚΓ) Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς τις παραμέτρους της κλινικής εξέτασης και τα QT/QTc διαστήματα του ΗΚΓ. Η ΠΜ εξετάστηκε τόσο ως συνεχής όσο και ως κατηγορική μεταβλητή ανάλογα με το αν ταξινομούνταν <90 η ΕΘ ή 90 η ΕΘ. Δε βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές

98 99 διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων ως προς τις υπό μελέτη παραμέτρους. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν τάση μειωμένης ΕΘ ΔΜΣ [64.25 ( ) έναντι ( ), p=0.308] και αυξημένων QT και QTc διαστημάτων στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α (383.16±7.72 έναντι ±3.02, p=0.308, και ±4.27 έναντι 405.0±1.73, p=0.293, αντίστοιχα) (Πίνακας 14). Πίνακας 14. Η κατανομή παραμέτρων της κλινικής εξέτασης και του ΗΚΓ ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p Στάδιο Tanner I II-V I II-V 34 (29.3) 82 (70.7) 2 (14.3) 12 (85.7) ΔΜΣ (kg/m 2 ) 20.06± ± ΔΜΣ (ΕΘ) ( ) ( ) ΔΜΣ (SDS) 0.72± ± ΠΜ (cm) 73.0 ( ) ( ) ΠΜ (ΕΘ) <90 η ΕΘ 90 η ΕΘ <90 η ΕΘ 90 η ΕΘ 91 (90.1) 10 (9.9) 12 (100) ΠΛ (cm) 31.27± ± ΣΑΠ (mmhg) ± ± ΔΑΠ (mmhg) 66 (50-97) 68 (55-90) QT (msec) ± ± QTc (msec) 405.0± ± Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς παραμέτρους του λιπιδαιμικού ελέγχου Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς παραμέτρους του λιπιδαιμικού ελέγχου. Τα επίπεδα TC, LDL και ApoB ήταν

99 100 παρόμοια στις δύο ομάδες ασθενών με αποτέλεσμα να μη διαπιστωθεί στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.933, p=0.929 και p=0.535, αντίστοιχα). Δεν αναδείχτηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση και όταν η ApoB θεωρήθηκε κατηγορική μεταβλητή (p=0.518). Διαπιστώθηκε τάση υψηλότερων επιπέδων Trig στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α αλλά σε μη στατιστικά σημαντικό επίπεδο (p=0.252). Από την άλλη πλευρά, διαπιστώθηκε τάση χαμηλότερων επιπέδων HDL, ApoA1 και Lp(a) στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α αλλά σε μη στατιστικά σημαντικό επίπεδο, αν και η σχέση του ΡΤΡΝ22 C1858T πολυμορφισμού με τα επίπεδα των ApoA1 και Lp(a) προσέγγισε τα επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας (p=0.221, p=0.098 και p=0.094, αντίστοιχα). Επίσης, καταγράφηκε τάση μεγαλύτερου αριθμού ατόμων με παθολογικά επίπεδα ApoA1 στους φορείς έναντι των μη φορέων του ελάσσονος αλληλόμορφου (p=0.088). Από την άλλη πλευρά, αν και περισσότερα άτομα διαπιστώθηκαν με παθολογικά επίπεδα Lp(a) στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α, δε διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (p=0.456). Σε ό,τι αφορά το λόγο ApoB/ApoA1 η μέση τιμή του ήταν υψηλότερη στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α (0.58±0.11 και 0.50±0.02 αντίστοιχα) αλλά σε μη στατιστικά σημαντικό επίπεδο (p=0.881). Όταν συγκρίθηκε ο αριθμός των ατόμων με παθολογικά επίπεδα, βρέθηκε στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερος αριθμός ατόμων στην ομάδα Β έναντι της ομάδας Α (p=0.045) (Πίνακας 15, Γραφήματα 4-7).

100 101 Πίνακας 15. Η κατανομή παραμέτρων του λιπιδαιμικού ελέγχου ανάλογα με τον PTPN22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p TC (mg/dl) ± ± Trig (mg/dl) 53 (27-430) 61 (36-135) HDL (mg/dl) 59.04± ± LDL (mg/dl) 99.14± ± ApoA1 (mg/dl) ± ± φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 82 (89.1) 10 (10.9) 10 (71.4) 4 (28.6) ApoB (mg/dl) 61 (28-128) 58.5 (25-117) φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 87 (95.6) 4 (4.4) 13 (92.9) 1 (7.1) Lp(a) (mg/dl) 6.85 (1-124) 3.8 ( ) φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 73 (81.1) 17 (18.9) 12 (92.3) 1 (7.7) ApoB/ApoA ( ) 0.43 ( ) φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 91 (98.9) 1 (1.1) 12 (85.7) 2 (14.3) Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή. 2 OR (CI) παθολογικής/φυσιολογικής ApoB/ApoA1 αναλογίας φορέων έναντι μη φορέων του ΡΤΡΝ Τ αλληλόμορφου ( ), p=0.031

101 102 Γράφημα 4. Η κατανομή των επιπέδων ApoA1 ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Γράφημα 5. Η κατανομή ασθενών με φυσιολογικά και παθολογικά επίπεδα ApoA1 ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο

102 103 Γράφημα 6. Η κατανομή των επιπέδων Lp(a) ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Γράφημα 7. Η κατανομή ασθενών με φυσιολογικά και παθολογικά επίπεδα ApoB/ApoA1 ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο

103 Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς προθρομβωτικούς παράγοντες Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς προθρομβωτικούς παράγοντες χωρίς να αναδειχτούν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Ωστόσο, στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α διαπιστώθηκαν τάση υψηλότερων επιπέδων vwf-ag (p=0.300 και p=0.189, αντίστοιχα) καθώς και ήπια χαμηλότερα επίπεδα ινωδογόνου(p=0.441) (Πίνακας 16). Πίνακας 16. Η κατανομή των προθρομβωτικών παραγόντων ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p vwf-ag (%) 105 (20-302) (62-177) φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 102 (91.1) 10 (8.9) 12 (85.7) 2 (14.3) PAI-1-Ag (Av/ml) ( ) ( ) φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 76 (70.4) 32 (29.6) 11 (78.6) 3 (21.4) ινωδογόνο (mg/dl) ± ± φυσιολογικό παθολογικό φυσιολογικό παθολογικό 110 (97.3) 3 (2.7) 14 (100) Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς το γλυκαιμικό έλεγχο Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς το γλυκαιμικό έλεγχο με βάση τα επίπεδα γλυκόζης νηστείας, την ημερήσια

104 105 δόση ινσουλίνης/kg ΒΣ και την ΗbΑ1c. Κατά τη σύγκριση δε βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων (Πίνακας 17). Πίνακας 17. Η κατανομή των παραγόντων του γλυκαιμικού ελέγχου ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p Γλυκόζη νηστείας (mg/dl) 157 (52-457) (66-325) Ινσουλίνη (IU/kg/μέρα) 0.81± ± ΗbΑ1c (%) 7.7 ( ) 7.95 ( ) Γλυκαιμικός έλεγχος Ικανοποιητικός Ναι Όχι Ναι Όχι 52 (45.2) 63 (54.8) 6 (42.9) 8 (57.1) Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς τον ορμονικό έλεγχο της θυρεοειδικής λειτουργίας Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς τα επίπεδα των θυρεοειδικών ορμονών. Τα επίπεδα των ft4 και TSH ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες ασθενών και δεν αναδείχτηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση. Ωστόσο, τα επίπεδα της ft3 ήταν χαμηλότερα στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α [3.86 ( ) pg/ml έναντι 4.21 ( ) pg/ml] (p=0.070) (Πίνακας 18, Γράφημα 8).

105 106 Πίνακας 18. Η κατανομή των επιπέδων των θυρεοειδικών ορμονών ανάλογα με τον ΡΤΡΝ22 C1858T γονότυπο Ασθενείς CC Ασθενείς CT+TT p ft3 (pg/ml) 4.21 ( ) 3.86 ( ) ft4 (mg/dl) 1.14 ( ) 1.20 ( ) TSH (μiu/ml) 2.28 ( ) 2.31 ( ) Οι μεταβλητές αυτές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή. Γράφημα 8. Η κατανομή των επιπέδων ft3 ανάλογα με τον PTPN22 C1858T γονότυπο Συγκρίσεις μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς τα αυτοαντισώματα της θυρεοειδικής αυτοανοσίας και της κοιλιοκάκης Έγινε σύγκριση μεταξύ φορέων και μη του ελάσσονος αλληλόμορφου ως προς τα αυτοαντισώματα της θυρεοειδικής αυτοανοσίας και της κοιλιοκάκης. Σχετικά με τα αντιθυρεοειδικά αντισώματα, οι τίτλοι των anti-tpo και anti-tg ήταν υψηλότεροι στην ομάδα Β συγκριτικά με την ομάδα Α όπως αποτυπώνεται