Legumenous Seed Born Fungi Producing Cellulase

Transcript

1 مجلة علوم الرافدين المجلد 21 العدد 4 ص الفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز والمحمولة ببذور بعض ا نواع البقوليات فاتن نوري ملا عبد قسم علوم الحياة كلية العلوم جامعة الموصل نديم احمد رمضان (2010 / 7 / 1 / 1 (تاريخ الاستلام 24/ 2010 تاريخ القبول الملخص ا جريت الدراسة بهدف البحث عن الفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز تم ا جراء اختبار نوعي لمعرفة قابلية هذه الفطريات على ا نتاج ا نزيم السليوليز في الا وساط الصلبة والساي لة وكذلك لمقارنة كفاءتها في ا نتاجه. تم ا جراء تقدير كمي لتحديد ا فضل عزلة منتجة لا نزيم السليوليز فكانت عزلة الفطر Alternaria alternata المعزول من بذور اللوبيا والتي قدرت فعاليتها الا نزيمية فكانت 5.26 ملغم كلوكوز /60 دقيقة / سم. سم و الكلوكوز المنتج بكمية 0.15 ملغم/ Legumenous Seed Born Fungi Producing Cellulase Faten N. Mula Abed Nadeem A. Ramadan Department of Biology College of Science Mosul University ABSTRACT This study was conducted for the purpose of finding local isolates which produce the cellulase enzyme. Specific test was conducted to determined the ability of these isolates to produce cellulase on solid and liquid media, also to find out the best isolates producing this enzyme. A quantitative test was carried out find the best cellulose producing isolate, which was Alternaria alternate isolated from cowpea, as it produced 5.26mg glucose/60min /cm and 0.15 mg/cm glucose. 57

2 فاتن نوري ملا عبد و نديم احمد رمضان 58 تنتج العديد من كلوكوز بالفعل الا نزيمي السليلوز تكون بطيي ة نسبي ا الا نزيمات المحللة ماي ي ا المقدمة الا حياء المجهرية ومنها الفطريات ا نزيم السليوليز حيث يحتاج تحول السليلوز ا لى ا لى ا نتاج السليوليز ذي التكاليف المرتفعة وعلى الرغم من ذلك فا ن سرعة تحلل (دلالي 199) وا ن ا غلب الا نتاج العالمي من الا نزيمات يكاد ينحصر في ا نتاج Hydrolyases enzymes منها الا نزيمات المحللة للبروتينات والا نزيمات المحللة للبكتين والسليلوز والاميليزات وا ن هذه الا نزيمات ضرورية للا حياء المنتجة لها ا ذ تساعدها في تحليل المعقدات وتحويلها ا لى وحدات صغيرة كي تستفاد منها في النمو (الخفاجي 2008). وجد Mankarious و ) Friend 1980 ( ا ن ا نزيم السليوليز يحلل السليلوز والهيميسليلوز في جذر الخلايا النباتية وينتج من قبل العديد من الفطريات المسببة لا مراض النبات كما تحلل ا نزيمات الكلوكوسيديز مكوثرات السليلوز ذات الا صرة يستطيع ا ن يحلل السليلوز الطبيعي. 4-1 β كلوكان ولكن بالرغم من الطبيعة الا نزيمية لهذا النوع فانه لا ا شارت الدراسات المبكرة ا لى ا ن الا نزيمات التي تنتجها الا حياء المجهرية تستطيع ا ن تحلل المكونات الذاي بة للسليلوز مثل كاربوكسي مثيل السليلوز ولكن ا ثبتت عدم قدرتها على تحليل السليلوز الطبيعي ا قترح (1956) Reese تجزي ة سلسلة الكلوكان ا لى لذلك وجود نوعين من ا نزيمات السليوليز الا ول : يحلل السليلوز الطبيعي من خلال 4-1 β اندوكلوكاينيز وا طلق عليه ا نزيم السليوليز C1. فيما يعمل الثاني على الكاربوكسي مثيل السليلوز ويحللها ا لى سليبايوز Cellobiose وقد ا شير ا ليه باسم كاربوكسي مثيل السليوليز ) Cx ) وهذا ما ذكره كل من دلالي (199) و الخفاجي (2008). التقدير النوعي (اللوني) للسليوليز المواد وطراي ق العمل اعتمدت طريقة ) 1985 al., ( Yeoh et والتي ا خذت من 1984) al., ( El-Refai et للاستدلال على ا نتاج الا نزيم باستخدام المحلول الكاشف يود حامض الهيدروكلوريك ) I ) HCl والمكون من 100 سم حامض الهيدروكلوريك 0.1) (HCl 500 سم 1) % وزن / حجم 2 % KI وزن / حجم.( ا ضيف المحلول الكاشف دقاي ق ثم سكب تحول الكاربوهيدرات المعقدة ا لى الطبق الحاوي على المستعمرة الفطرية النقية بعمر ستة ا يام وترك لعشرة وترك الطبق لدقاي ق فلوحظ ظهور هالة فاتحة اللون حول المستعمرة الفطرية تدل على ا لى سكريات بسيطة وذلك في حالة ا نتاج الفطر لا نزيم محلل للسليلوز ويزداد عرض الهالة بزيادة فعالية ا نتاج السليوليز. اعتمدت طريقة ا خرى للكشف عن ا نتاج ا نزيم السليوليز.

3 ع 2 59 الفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز والمحمولة ببذور... التقدير الكمي للسليوليز تم توزيع وسط الا نتاج في دوارق مخروطية حجم 250 سم وبمقدار 50 سم لكل دورق وبمعدل ثلاث مكررات لكل معاملة سدت الدوارق با حكام بسدادات قطنية وغلفت برقاي ق الا لمنيوم ثم عقمت بجهاز المعقام 2 عند الضغط 1 كغم/سم ودرجة حرارة 120 م ولمدة 25 دقيقة. بعد التعقيم تركت الدوارق لتبرد ثم لقحت في ظروف معقمة بعالق سبورات الفطريات التي عزلت من بذور البقوليات سابق ا وبعمر ا سبوع وبتركيز 5 10 بوغ/ سم بعد التلقيح وضعت الدوارق في حاضنة هزازة عند درجة ± 28 1 م وبمعدل 100 /دقيقة ولمدة (8) ا يام. وسط ا نتاج الا نزيم ا ستخدم الوسط التالي لتنمية الفطريات المعزولة من بذور بعض المحاصيل المخزونة للتعرف على قابليتها في ا نتاج ا نزيم السليوليز وتكون الوسط من (غم/لتر) كبريتات الامونيوم 1.4 فوسفات البوتاسيوم 2.0 اليوريا كلوريد الكالسيوم 0. كبريتات المغنيسيوم الماي ية 0. كبريتات الحديدوز الماي ية 0.5 كبريتات المنغنيز الماي ية 0.16 كبريتات الخارصين الماي ية 0.14 كلوريد الكوبلت 0.2 السليلوز 15 الببتون 1 التوين 2 Tween 80 سم ثم ا كمل الحجم ا لى اللتر بالماء المقطر تم ا ذابة كل مكونات الوسط عدا السليلوز في الماء المقطر وضبط الا س الهيدروجيني عند 6 بعدها وزع الوسط في دوارق مخروطية حجم 250 سم بمقدار 50 سم لكل دورق مع 0.5 غم من السليلوز سدت الدوارق با حكام بسدادات قطنية وغلقت برقاي ق الا لمنيوم ثم عقمت بجهاز المعقام ) 1976 Mandels, ). Strenbery and قياس فعالية الا نزيم تم قياس فعالية ا نزيم السليوليز اعتماد ا على قياس ا حدى نواتج التفاعل وهو سكر الكلوكوز حسب الطريقة الموصوفة من قبل (1976 Mandels ( Strenbery and والتي تسمى ورقة الترشيح Filter Paper Assay بعد انتهاء مدة الحضانة ا خرجت الدوارق من الحاضنة وتم ترشيح الوسط الغذاي ي الحاوي على الفطر بوساطة قمع بخبز Bauchner Funel وباستخدام ا وراق ترشيح (1 No. (Whatman مجففة تحت درجة حرارة 60 م ولمدة 24 ساعة. تم قياس فعالية ا نزيم السليوليز وذلك با خذ 0.5 سم من الراشح (محلول الا نزيم) في ا نبوبة اختبار (حجم 18 سم ( يضاف ا ليها 1 سم من المحلول المنظم Na-Citrate ph 4.8 (يحضر المحلول با خذ 25 مل من سترات الصوديوم ويكمل الحجم بالماء المقطر المعقم ا لى 250 سم ) يضاف ا ليها شريط من ورق الترشيح (1 No. (Whatman بطول (1 6) سم ذات وزن 50 ملغم تمزج بشكل جيد باستخدام المازجة بدرجة حرارة 50 م بعدها يضاف ) DNS (Vortex) لغرض غمر الورقة في المحلول تحضن لمدة ساعة واحدة سم من كاشف (DNS) Dinitrosalicylic Acid المحضر من 5.5 غم ( يضاف ا ليها 150 غم ترترات الصوديوم البوتاسيوم ويكمل الحجم بالماء المقطر ا لى 500 سم

4 فاتن نوري ملا عبد و نديم احمد رمضان 60 بعدها نضع ا نبوبة اختبار في حمام ماي ي مغلي لمدة 5 دقاي ق ثم يقدر السكر المختزل (الكلوكوز) للمقارنة تم تحضير ا نبوبة اختبار قياسية Blank غير حاوية على ورقة الترشيح بعد اكتمال التفاعل تقاس الكثافة الضوي ية ا و( معامل الامتصاص) عند الطول الموجي 550 نانوميتر باستخدام جهاز المطياف الضوي ي Ultra Violet / Visible Spectrophotometer من نوع SP 8000 من شركة Unicam) (Pye وتم حساب سكر الكلوكز الناتج بالمقارنة مع منحني قياسي لهذه المادة. تقدير كمية السكر.( Dubois et al., تم تقدير كمية السكر في الوسط بعد التخمر باستخدام طريقة (1956 المنحني القياسي للكلوكوز لعمل المنحني القياسي للكلوكوز تم ا ذابة 1 غم من سكر كلوكوز في لتر ماء مقطر للحصول على تركيز 1000 جزء بالمليون ومنها تم تحضير التراكيز الا تية : من % 5 فينول و 5 سم 1 سم 0.07 ملغم/ سم. ا ضيف ذات فوهة عريضة رجت الا نابيب بقوة ثم وضعت في حمام ماي ي بدرجة من حامض الكبريتيك المركز بواسطة ماصة 0-25 م لمدة 0 دقيقة. بعدها تم قياس الكثافة الضوي ية عند طول موجي 488 نانوميتر. بجهاز المطياف الضوي ي بنفس الطريقة الا نفة الذكر ثم رسم المنحني القياسي للكلوكوز لتقدير كمية السكر في راشح الوسط الغذاي ي. المنحني القياسي للكلوكوز لاختبار ورقة الترشيح لعمل المنحني القياسي للكلوكوز ا ذيب 1 غم من سكر الكلوكوز في لتر من ماء مقطر للحصول على تركيز 1000 جزء بالمليون ومنه تم تحضير التراكيز الا تية : ملغم / سم ا ضيف ا ليها 1 سم من المحلول المنظم Na Citrate ph 4.8 ثم يضاف ا ليها مل من كاشف (DNS) بعدها نضع ا نابيب الاختبار في حمام ماء مغلي لمدة 5 دقاي ق قيست الكثافة الضوي ية عند طول موجي 550 نانوميتر بجهاز المطياف الضوي ي ثم رسم المنحنى القياسي للكلوكوز في المحلول لقياس النشاط الانزيمي للسليوليز. مقارنة النشاط الا نزيمي للعزلات وتحديد الا كفا في الا نتاج تم الحصول على عزلات نقية للفطريات بطريقة السبور المنفرد وتم بعدها تحضير عالق سبوري بتركيز سبور / سم ا و القمة الهايفا من المصادر المختلفة من كل عزلة ثم ا ضافته ا لى وسط ا نتاج

5 61 الفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز والمحمولة ببذور... السليوليز ك لا على انفراد حيث تمت مقارنة النشاط الا نزيمي للعزلات المختلفة وتقدير كمية الكلوكوز المنتج في الوسط وملاحظة نمو الفطر واستهلاك المصدر الكربوني خلال فترة مدة التخمير سجلت البيانات للعينات التي ا خذت بعد فترة تحضين 8 ا يام من تلقيح الوسط الغذاي ي ولعزلات الفطر المختلفة. النتاي ج والمناقشة ا نزيم السليوليز يوضح الجدول (1) كفاءة الفطريات المنتجة لا نزيم السليلوز فقد ا عطت 22 عزلة كشف ا موجب ا من 2 عزلة فيما كانت عزلة الفطر Ulocldium botrytis سالبة وكان هناك عزلتين متميزتين في نشاطها في تكسير مادة الكاربوكسي مثل السليلوز CMC هما (21) alternata () Alternaria و (50) (). Stemphylium botryosum لوحظ ظهور الهالة الراي قة حول الفطر في اليوم الثاني من التحضين وزادت مساحة التحلل في اليوم السادس. ا ما بقية الفطريات فتباين نشاطها الانزيمي بين الكفاءة المتوسطة و الضعيفة (الجدول 1). تقوم الفطريات بدور مهم في الطبيعة في تحليل السليلوز لذا فا نزيم السليوليز له دور مهم في النشاط الحيوي للفطريات ويو ثر بشكل واضح على انتشارها في بيي ات خاصة كمزارع العرهون وا كداس الخشب وا كوام التبن وا عشاش الطيور وروث الحيوانات التي تمتاز جميعها بوفرة السليلوز في مكوناتها وبالرغم من عدم تمكن الفطريات من هضم السليلوز غير الذاي ب الموجود في الطبيعة ا لا ا ن ذلك لا يلغي دورها في تحليل السليلوز المترابط مع نشاط الا نواع ذات القدرة على تحليل السليلوز غير الذاي ب ).(Campbell,1952 وقد لوحظ با ن المعاملات التي يتعرض لها القش ا ثناء تحضير وسط زراعة العرهون يمكن ا ن يغير من تركيب السليلوز ا لى ما يسمى بالسليلوز المحور( ( Modified Cellulose الذي يمكن للعديد من الفطريات غير المحللة لسليلوز القش با ن تحلله ) 1979 Trigiano,.(Fergus and وجد Merchant and ) 198 Margaritis, ( عند اختبارها الفعالية الا نزيمية للفطر Sporotrichum thermophile المعزول من وسط زراعة العرهون في ا نتاج الزايلينيز والسليوليز والاميليز ولاحظا ترابط ا في فعالية الا نزيمين الا ول والثاني في تحليل قش الحنطة المستخدم في وسط الزرع. النشاط الا نزيمي للفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز في الوسط الصلب والساي ل ا ظهرت نتاي ج دراسة النشاط الا نزيمي للسليوليز بين العزلات المحلية المختلفة التي تم عزلها من بذور البقوليات بعد تنميتها على وسط الا نتاج ا ن نشاط ا نزيم السليوليز المنتج من العزلة المحلية Alternaria alternata فاقت بدرجة كبيرة واختلفت معنوي ا عن باقي العزلات في ا نتاجها لا نزيم السليوليز (الجدول 2) وان هذه العزلة من الفطر بلغ ا قصى ا نتاجها لا نزيم السليوليز مقدر ا بالوحدة الا نزيمية بعد 8 ا يام من

6 فاتن نوري ملا عبد و نديم احمد رمضان 62 التحضين وبكمية 5.26 ملغم كلوكوز/ 60 دقيقة / سم ثم توالت بقية العزلات في الوحدة الا نزيمية وكمية الكلوكوز المنتج يليها الفطر Stemphylium botryosum ثم Rhizoctonia solani و Cladosporium cladosporioides و Fusarium graminearrum و المنتجة 0.4 ملغم كلوكوز 60 دقيقة / سم. / ا ذ بلغت ا على ا نتاجية للكلوكوز في وسط مستخلص عزلة الفطر Ulocladium botrytis حيث كانت الوحدة الا نزيمية وتطابقت النتاي ج بالنسبة للكلوكوز المنتج في وسط نمو العزلة 0.15 ملغم / سم وهذه A. alternata القيمة اختلفت معنوي ا عن بقية العزلات في حين كان الا نتاج للعزلات المحلية السليوليز ولكمية الكلوكوز المنتج ا قل وان ا نتاج عزلة ملغم كلوكوز / 60 دقيقة / / 60 دقيقة / Stemphylium botryosum (50) الا خرى بالنسبة لا نتاج ا نزيم 4.0 للا نزيم بلغ سم وكمية الكلوكوز المنتج في وسط مستخلص هذه العزلة ملغم كلوكوز سم والقيمتين اختلفت معنوي ا عن باقي العزلات وكانت ا قلها ا نتاج ا العزلة (16) botrytis التي ا ثبتت التقدير النوعي Ulocladium للكشف عن ا نزيم السليوليز في الوسط الصلب ا ن هذه العزلة غير المنتجة لا نزيم السليوليز ا ذ لم نلاحظ ظهور هالة راي قة حول المستعمرة الفطرية كلا وباستخدام الطريقتين الا ولى التي ا ستخدمها 1985) al., ( Yeoh et والثانية التي ا ستخدمها 1984) al.,.( El-Refai et ا ثبت التقدير الكمي لا نزيم السليوليز ا ثبت ا ن للعزلة Ulocladium botrytis قابلية ا نتاج ا نزيم السليوليز حيث كانت قيمة الوحدة الكلوكوز المنتج فكانت ملغم / الا نزيمية 0.4 ملغم كلوكوز / 60 دقيقة / ضعيفة جدا على سم ا ما كمية سم ولهذا فقد تم ا ختبار العزلة المحلية Alternaria alternata المعزولة من بذور اللوبيا المخزونة لكفاءتها العالية بوصفها ا فضل عزلة محلية لا نتاج ا نزيم السليوليز وتعد هذه ا ول دراسة يتم فيها ا نتاج ا نزيم السليوليز من قبل هذا الفطر فان عملية ا نتاج السليوليز تختلف باختلاف العزلات الفطرية المختلفة التي تم عزلها من بعض محاصيل الحبوب والبذور المخزونة وهذا ما ا كده (1975 Mandels, ( لذلك فا ن ظروف الوسط الزرعي وعوامل النمو المختلفة تختلف من عزلة فطرية ا لى ا خرى فالا س الهيدروجيني الابتداي ي له دور فعال في عملية ا نتاج ا نزيم السليوليز وا ن الا س الهيدروجيني الذي يكون ملاي م لعزلة قد لا يكون ملاي م لعزلة ا خرى (دنحا والخزرجي 1990) وا ن قيم الا س الهيدروجيني تو ثر في فعالية الا نزيمات التي تعمل على تحلل مادة التفاعل ا و تو ثر على نفاذية جدار الخلية للا نزيم ) 1979 Sinclair, ). Kristiansen and كما ا ن فترة التحضين اللازمة لا نتاج ا نزيم السليوليز ا يضا تختلف في كفاءتها وا نتاجها ) باختلاف عزلات الفطريات المختلفة واختلاف ظروف التخمر تو دي ا لى تباين العزلات الفطرية al., 1989 (Yoshigi et al., 1988 ; Kurosaw et. حيث ا ن الظروف الملاي مة لعزلة معينة لرفع كفاءة ا نتاجها من ا نزيم السليوليز قد تكون غير ملاي مة لعزلة قبل العزلات المحلية ا ختلف ا يضا باختلاف العزلات تبع ا للنشاط الا نزيمي وتميزت العزلة وا نتاجها العالي لكمية الكلوكوز وهذا يدل على ا نه كلما زاد النشاط ا خرى. ا ما ا نتاج الكلوكوز من A. alternata الا نزيمي للعزلة المحلية زاد الكلوكوز

7 6 الفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز والمحمولة ببذور... المنتج ويو كد ذلك وجود ارتباط معنوي موجب بينهما وبمقدار ذكر (1984 al., ( El-Refai et با ن الفعالية السليلوزية تغايرت من كاي ن ا لى ا خر وهذا التغاير تتم ملاحظته بين ا نواع من نفس الجنس وحتى بين السلالات المختلفة في النوع الواحد. فالعزلة المحلية (21) alternata.a تميز في نموها بظروف التخمر واختلفت معنوي ا في ا نتاجها لا نزيم السليوليز والكلوكوز المنتج عن بقية العزلات نعرف ا ن الوحدة الا نزيمية التي ذكرها الجلبي وعز الدين وا خيرا لابد ا ن (1982) على ا نها كمية الا نزيم التي تسبب تحوير 1 مايكرومول ) مول ( من المادة الا ساس خلال دقيقة واحدة عند 25 م تحت ظروف مثالية للقياس. الجدول 1 : دراسة كفاءة الفطريات المنتجة لانزيم السليوليز Cellulase والمعزولة من بذور بعض المحاصيل المخزونة. البذور الفطريات الكشف عن ا نزيم السليوليز * الطريقة الا ولى ** الطريقة الثانية *** سم. Alternaria alternata حمص Chickpea Fusarium graminerrum Fusarium sp. Cicer arietinum Aspergillus niger Lentil عدس Rhizoctonia solani Lens esculenta فاصوليا Cladosporium Bean cladosporiodes Phaseolus vulgaris Stemphylium botryosum فول الصويا Soybean Glycine max A. alternata A. alternata A. niger Cowpea لوبيا A. niger Vigna unguicutata - - Ulocladium botrytis غير منتج لانزيم السليوليز عدم تكون هالة راي قة حول المستعمرة الفطرية. - * منتج لانزيم السليوليز تكون هالة راي قة حول المستعمرة الفطرية بقطر (-1) سم. منتج لانزيم السليوليز تكون هالة راي قة حول المستعمرة الفطرية بقطر (7-4) سم. منتج لانزيم السليوليز تكون هالة راي قة حول المستعمرة الفطرية بقطر (11-8) سم. منتج لانزيم السليوليز تكون هالة راي قة حول المستعمرة الفطرية بقطر ا كثر من (12) طريقة( al., 1984 (El-Refai et. طريقة 1985) al., (Yeoh et. *** **

8 فاتن نوري ملا عبد و نديم احمد رمضان 64 الجدول 2: النشاط الانزيمي للفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز Cellulase في الوسطين الصلب والساي ل. الفطريات النشاط الا نزيمي للفطريات على الوسط الصلب على الوسط الساي ل (الكلوكوز ملغم/ سم ( الوحدة الا نزيمية ملغم كلوكوز / 60 دقيقة / سم ا * Alternaria alternata ا الكلوكوز المنتج (ملغم / سم ( 0.15 ا 0.8 Aspergillus niger ه 1.66 ه Cladosporium cladosporioides د 2.0 د Fusarium graminerrum 0.10 ز 0.82 ز 1.50 Rhizoctonia solani ج.0 ج Stemphylium botryosum ب 4.0 ب Ulocladium botrytis ح 0.4 ح ج ج ه ج ب و معامل الارتباط (0.854) * الا رقام المتبوعة با حرف مختلفة عمودي ا تدل على وجود فروق معنوية بينها عند مستوى احتمال 0.05 والعكس صحيح حسب تركيز السليوليز اختبار دنكن كل قيمة تمثل معدل لثلاث مكررات. حضنت لمدة 8 ا يام وكان 10 غم/لتر والا س الهيدروجيني الابتداي ي التحضين للنشاط الا نزيمي 60 دقيقة وحجم المستخلص الفطري ودرجة حرارة التحضين سم. 2.8 م ومدة المصادر العربية الجلبي قصي عبد القادر فاي زة عز الدين ) 1982). "الوجيز في الكيمياء الحياتية" دار الكتب للطباعة والنشر مطبعة جامعة الموصل الموصل. الخفاجي زهرة محمود (2008 )." التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيي ية)". رقم الا يداع في دار الكتب و الوثاي ق ببغداد 8 لسنة دلالي باسل كامل (199 ). موضوعات مختارة في التكنولوجيا الحيوية دار الكتب للطباعة والنشر مطبعة الموصل الموصل.

9 65 الفطريات المنتجة لا نزيم السليوليز والمحمولة ببذور....( 1990) دنحا رياض فرنسيس طالب عويد الخزرجي تغذية وعلم وظاي ف الفطريات مطبعة جامعة الموصل. صفحة 544. المصادر الا جنبية Campbell, W.G. (1952). In Wood Chemistry. Vol. 2 eds., L. E. Wise and E.C. John. Reinhold publ., Co., New York. Dubois, M.; Gilles, K.A.; Hamilton, J.K.; Robers, P.A. ; Smith, F. (1956). Colorimetric method for the detemination of sugars. Anal. Chem. 28 (), El-Refai, A. M. H.; Atalla, M. M. ; El-Safty, H.A. (1984). Microbial formation of cellulases and proteins from some cellulosic residues. Agricultural Wastes. 11, Kristiansen, B. ; Sinclair, C.G. (1979). Production of citric acid in continous culture. Biotechnol. Bioeng. 21, Kurosawa, K.; Hosoguchi, M.; Hariantono. J.; Sasaki, H. ; Takao, S. (1989). Degradation of tough materials from Corticium rolfsii. Agric. Biol. Chem. 5 (4), Mandels, M. (1975). Microbial sources of cellulase. Biotechnol and Bioeng. Symp. 5, Mandels, M. ; Strnbery, D. (1976). Recent advances in cellulase technology. J. Ferment. Technol. 54 (4), Mankarios, A.T. ; Friend, J. (1980). Polysaccharide degrading enzymes of Botrytis allii and Sclerotium cepivorum. Enzyme production in culture and the effect of the enzymes on isolated onion cell walls. Physiol. Plant. Pathol. 17, Margaritis, A. ; Merchant, R.( 198). Xylanase, CM Cellulase and Avicelase production by the thermophilic fungus, Sporotrichum thermophile. Biotechnol. Letters. 5 (4), Reese, E.T.(1956). Enzymatic hydrolysis of Cellulose, Appl. Microbiol. 4, Trigiano, R. N. ; Fergus, C. L. (1979). Extracellular enzymes of some fungi associated with mushroom culture. Mycologia. 71, Yeoh, H.H. ; Khew, E. ; Lin, G. (1985). A simple method for screening cellulytic fungi. Mycologia. 77, Yoshigi, N. ; Taniguchi, H. ; Sasaki, T.(1988). Purification and properties of a new endocellulase from Robillarda sp. Y. 20 Agric. Biol. Chem. 52 (6),