ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΜΒΡΥΟΥ ΟΡΝΙΘΑΣ

Transcript

1 Αναπτυξιακή βιολογία και ιστολογία Ενότητα 2: Κύριοι οργανισμοί-μοντέλα ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΜΒΡΥΟΥ ΟΡΝΙΘΑΣ (J.M.W. Slack, Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης, 2007) Δρ. Μαριάννα Χ. Αντωνέλου

2 O πιο αγαπημένος οργανισμός στην επιστήμη της εμβρυολογίας, από πολύ παλιά Εισαγωγή

3 Εισαγωγή «Περί ζώων γενέσεως» Aριστοτέλης (Στάγειρα, πΧ) Ανάπτυξη εμβρύου όρνιθας (3w), Μηχανισμοί (φυσικά φαινόμενα/φυσικά αίτια)

4 Εισαγωγή Κατώτερα σπονδυλωτά - Ομοιότητες με τα θηλαστικά Σπονδυλωτά Ορατές πρώιμες μορφογενετικές κινήσεις - Διαδικασίες σε μοριακό επίπεδο

5 Εισαγωγή Όρνιθα: Αμνιωτά (ερπετά, πτηνά, θηλαστικά) (το έμβρυο αναπτύσσεται μέσα σε ένα μεμβρανώδη σάκο, το άμνιο) Έμβρυο αμνιωτών: εξωεμβρυικές δομές (παρούσες μόνο κατά την εμβρυική περίοδο/ αποβάλλονται μετά τη γέννηση) Χόριο Άμνιο Αλλαντοίδα Λεκιθικός σάκος Εγκλείει όλο το σύστημα Περικλείει το έμβρυο. Γεμάτο με αμνιακό υγρό. Προστασία. Αναπνευστικό όργανο. Αποθήκη μεταβολικών αποβλήτων. Περιέχει τη λέκιθο. Συνδέεται με το έμβρυο με το μέσο έντερο

6 Εισαγωγή Έμβρυο/Ωοτοκία: πρώιμο αναπτυξιακό στάδιο αυλάκωσης = επίπεδο βλαστόδερμα (στιβάδα, δίσκος κυττάρων) Πρόσβαση σε όλα τα στάδια μετά την ωοτοκία (έμβρυο ποντικού?) Σημαντική μεταβολή μεγέθους κατά την εμβρυική ζωή Γονιμοποιημένα αυγά σε εκκολαπτήρια

7 Εισαγωγή Πειραματικοί χειρισμοί (1) Καλλιέργεια πρώιμου βλαστοδέρματος και καταβολών οργάνων in vitro (2) Μικροχειρισμοί in ovo (οπή στο αυγό) (3) Μοσχεύματα: Εκφύτευση μικρών τμημάτων ιστού και μεταφορά στην CAM εμβρύων μεγαλύτερου αναπτυξιακού σταδίου (4) Μοσχεύματα ορτυκιού σε έμβρυα όρνιθας

8 Εισαγωγή Γενετική ανάλυση??? ΔΕΝ ΠΡΟΣΦΕΡΕΤΑΙ Κύκλος ζωής Μεταλλάγματα Διαγονιδιακοί οργανισμοί/στοχευμένη μεταλαξιγένεση (5) Μέθοδοι για υπερέκφραση γονιδίων στο έμβρυο (ενέσιμοι ρετροϊοίολικού ή περιορισμένου εύρους μόλυνσης-ορθοτοπικά μοσχεύματα ανάμεσα σε 2 στελέχη ανθεκτικά ή μη στον ιό) RCAS (Replication competent avian-specific viruses) (6) Ηλεκτροδιάτρηση (DNA - electroporation, ηλεκτρικοί παλμοί χαμηλής τάσης)

9 Εισαγωγή (7) Έκθεση περιοχής εμβρύου σε επαγωγικούς παράγοντες (Εμφύτευση ιζημάτων από (α) κύτταρα καλλιέργειας ιστών ή (β) εμφύτευση παραγόντων προσροφημένων σε σφαιρίδια χρωματογραφίας συγγένειας, αργή απελευθέρωση παράγοντα σε 1-2d) (8) Μέθοδοι αδρανοποίησης γονιδίων (υπερέκφραση παραλλαγών μεταγραφικών παραγόντων)

10 Φυσιολογική ανάπτυξη Αυγό Μεγάλο: συσσώρευση λεκίθου (εμβρυική ανάπτυξη 22d, ευμεγέθες νεογέννητο) προσθήκη εξωκυττάριων περιβλημάτων Ασβεστολιθικό κέλυφος Ασπράδι (αλβουμίνη) (πυκνόρευστη, λεπτόρευστη) Κρόκος Λέκιθος (yolk, τμήμα κυτταροπλάσματος ωοκυττάρου, ώριμο ωοκύτταρο) Τροφικά συστατικά, ενέργεια, νερό Bλαστόδερμα κυττάρων Λεκιθική μεμβράνη (vitelline (yolk) membrane)

11 Φυσιολογική ανάπτυξη Ωοκύτταρο 1-2w πριν την ωορρηξία: μικρό (και θυλακικά κύτταρα: ωοθυλάκιο) Σε λίγες ημέρες: 55g Βλαστοδίσκος 1 Ωοθήκη (ωάριο) Ωορρηξία Ωαγωγός (oviduct) 24h (4h πριν τη μήτρα, 20h στη μήτρα) αλβουμίνη, κέλυφος Μήτρα (περιστροφή κελύφους, όχι κρόκου) Γονιμοποίηση (στο ανώτερο τμήμα ωαγωγού, χωρίς αλβουμίνη, κέλυφος)

12 1) Δισκοειδής αυλάκωση Φυσιολογική ανάπτυξη (στην επιφάνεια του βλαστοδίσκου, μετατροπή βλαστοδίσκου (2-3mm) σε βλαστόδερμα single-layered) 3h μετά τη γονιμοποίηση 15 βλαστομερίδια Κάθετες αυλακώσεις: βλαστομερίδια με κυτταροπλασματική συνέχεια με τη λέκιθο λέκιθος 8 βλαστόδερμα single-layered blastoderm υποβλαστική κοιλότητα h μετά τη γονιμοποίηση tissue five to six cell layers thick Οριζόντιες αυλακώσεις: ανεξάρτητα κύτταρα, χωρισμένα από τη λέκιθο. 2) Μεροβλαστική αυλάκωση (μόνο στο βλαστοδίσκο/τμήμα ζυγωτού/ αδράνεια λεκίθου)

13 Φυσιολογική ανάπτυξη Πρώιμες αυλακωτές διαιρέσεις (ωαγωγός) single-layered blastoderm Κυκλικό μονόστιβο βλαστόδερμα κυτταροπλασματικές γέφυρες Λεκιθική μάζα Μήτρα ωαγωγού (20h), περιστροφές, ασβεστώδες κέλυφος

14 Φυσιολογική ανάπτυξη Έμβρυο σταδίου V (διέλευση μήτρας) Βλαστόδερμα Μερικές εκατοντάδες κύτταρα Χ Χ Χ ΡΑΧΗ ΚΟΙΛΙΑ Καθορισμός ραχαιοκοιλιακής ασυμμετρίας εμβρύου EMBΡΥΟ 1. Διαφανής περιοχή (area pellucida) Κεντρική περιοχή βλαστοδέρματος -Λεπτό, ημιδιαφανές επιθήλιο- Χωρίς επαφή με τη λέκιθο) 2. Αδιαφανής περιοχή (area οpaca) Εξωτερική, αδιαφανής περιοχή βλαστοδέρματος-περιφερικός δακτύλιος- Σε επαφή με τη λέκιθο) 3. Οριακή ζώνη, marginal zone ουσιαστικά ανήκει στη διάφανη περιοχή, σημαντική στον καθορισμό κυτταρικού πεπρωμένου κατά την πρώιμη ανάπτυξη

15 Φυσιολογική ανάπτυξη Κάτοψη βλαστοδέρματος πριν το σχηματισμό της υποβλαστικής κοιλότητας Κάτοψη βλαστοδέρματος μετά το σχηματισμό της υποβλαστικής κοιλότητας Εγκάρσια τομή διαφανής περιοχή υποβλαστική κοιλότητα διαφανής περιοχή αδιαφανής περιοχή αδιαφανής περιοχή οριακή ζώνη

16 Φυσιολογική ανάπτυξη (έμβρυο σταδίου X, διέλευση μήτρας) Πρωτογενής υποβλάστη (από κύτταρα διάφανης περιοχής - νησίδες 5-20 κυττάρων) Τα περισσότερα κύτταρα διάφανης περιοχής μένουν στην επιφάνεια (ΕΠΙΒΛΑΣΤΗ)

17 Φυσιολογική ανάπτυξη (έμβρυο σταδίου XΙΙ, διέλευση μήτρας) Δευτερογενής υποβλάστη (διασκορπισμός κυττάρων από το βάθος της οπίσθιας οριακής ζώνης) Ανώτερη στιβάδα κυττάρων Yποβλάστη (hypoblast) Επιβλάστη (epiblast) Εξωεμβρυικές δομές (Rosenquist 1966, 1972) EMBΡΥΟ (3 βλαστικές στοιβάδες & ένα ποσοστό εξωεμβρυικών μεμβρανών)

18 ΠΡΟΣΘΙΑ ΟΖ ΟΠΙΣΘΙΑ ΟΖ Φυσιολογική ανάπτυξη Σχηματισμός βλαστοδέρματος 2 στοιβάδων στο έμβρυο της όρνιθας (B) Πρωτογενής υποβλάστη Βλαστόκοιλο Υποβλαστική κοιλότητα (C) Δευτερογενής υποβλάστη : κύτταρα από την οπίσθια οριακή ζώνη (πάχυνση του Koller και κύτταρα οπίσθιας οριακής ζώνης πίσω από την πάχυνση) μεταναστεύουν κάτω από την επιβλάστη και ενσωματώνονται με τις νησίδες. Καθώς η υποβλάστη κινείται προς το εμπρόσθιο μέρος, τα κύτταρα της επιβλάστης που συγκεντρώνονται στην περιοχή μπροστά από την πάχυνση του Koller, σχηματίζουν την αρχική λωρίδα (primitive streak). Gilbert SF, Developmental Biology (From Eyal-Giladi et al. 1992, photograph courtesy of H. Eyal-Giladi) (D) Οβελιαία (τοξεοειδής) τομή εμβρύου κοντά στο οπίσθιο όριο. (sc, subgerminal cavity; gwm, germ wall margin.)

19 Φυσιολογική ανάπτυξη Ωοτοκία Έχει μόλις αρχίσει ο σχηματισμός της δευτερογενούς υποβλάστης Βλαστόδερμα: κύτταρα Η γέννηση του αυγού διακόπτει την ανάπτυξη του εμβρύου επειδή μειώνεται η θερμοκρασία (επώαση, φυσική ή τεχνητή)

20 Φυσιολογική ανάπτυξη Πρώιμα αναπτυξιακά στάδια (λατινικοί αριθμοί) Πίνακας Eyal-Giladi και Kochav (Developmental Biology 49:321, 1976) Ι Χ ΧΙΙ Αναπτυξιακό Στάδιο Γονιμοποιημένο αυγό Βλαστόδερμα μιας στιβάδας Όψιμο βλαστόδερμα δύο στιβάδων Χ-ΧΙ: ωοτοκία

21 Φυσιολογική ανάπτυξη Πρώιμα αναπτυξιακά στάδια: 3 αναπτυξιακές περίοδοι 1. Αυλάκωση (Ι-VI) 2. Σχηματισμός διαφανούς περιοχής (VII-X) 3. Σχηματισμός υποβλάστης (XI-XIV) 2,3: Μορφογενετικές περίοδοι που ακολουθούν τον καθορισμό του εμβρυικού άξονα Eyal-Giladi και Kochav, 1976

22 Φυσιολογική ανάπτυξη 1. Αυλάκωση I II III αυλακώσεις προς την περιφέρεια 0-1h (ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΑ): λίγα βλαστομερίδια, όλα ανοιχτά στο κάτω μέρος σε επικοινωνία με τη λέκιθο 2h: 16 κεντρικά κύτταρα (βλαστομερίδια), όχι υποβλαστική κοιλότητα 3-4h: 90 κεντρικά, επιφανειακά κύτταρα, και κάτω από την επιφάνεια. Ίχνη υποβλαστικής κοιλότητας

23 1. Αυλάκωση βλαστομερή Φυσιολογική ανάπτυξη IV V VI βλαστόδερμα 5h: 300 επιφανειακά κύτταρα, και h: Τόσο η πάνω όσο και η κάτω πλευρά 10-11h: Πάρα πολλά κύτταρα σε όλη κάτω από την επιφάνεια. Σαφής του βλαστοδέρματος περιέχουν αρκετά, την επιφάνεια. Πλήρως αυλακωμένο. υποβλαστική κοιλότητα μεγάλα βλαστομερίδια. Αύξηση μεγέθους Κύτταρα σε στρώματα επιθηλίου. υποβλαστικής κοιλότητας

24 Φυσιολογική ανάπτυξη 2. Σχηματισμός διαφανούς περιοχής VII Βλαστόδερμα με area pellucida VIII IX area opaca yolk laden cells 12-14h: Αρχή εμφάνισης διάφανης περιοχής από το πίσω μέρος του βλαστοδέρματος 15-17h: Η διάφανη περιοχή εξαπλώνεται προς τα εμπρός πεταλοειδώς 17-19h: Εξάπλωση της διάφανης περιοχής αλλά τα όριά της με την αδιάφανη περιοχή δεν είναι σαφή

25 Φυσιολογική ανάπτυξη X 2. Σχηματισμός διαφανούς περιοχής 20h: Σαφής διάκριση μεταξύ διάφανης και αδιάφανης περιοχής. Γέννηση αυγού

26 Φυσιολογική ανάπτυξη XI XII Πάχυνση του Kollar (Transparent belt) υποβλάστη 3. Σχηματισμός υποβλάστης (XI-XIV)

27 Φυσιολογική ανάπτυξη 3. Σχηματισμός υποβλάστης XIII XIV Πλήρης σχηματισμός υποβλάστης Πάχυνση του Kollar Transparent belt Δημιουργία κυτταρικής γέφυρας που ενώνει υποβλάστη και αδιαφανή περιοχή

28 Φυσιολογική ανάπτυξη Όψιμη ανάπτυξη εμβρύου Πίνακας αναπτυξιακών σταδίων Hamburger και Hamilton (2 έως 35) Σχηματισμός αρχιτεκτονικού σχεδίου σώματος

29 Φυσιολογική ανάπτυξη Στάδια 1-3 1: Προγραμμικό (0-5h ΕΠΩΑΣΗΣ): Δεν διακρίνεται η αρχική λωρίδα (αρχέγονη γραμμή) Διαφανής περιοχή βλαστοδέρματος αρχική λωρίδα (αρχέγονη γραμμή) T-box transcription factor gene brachyury 3: Μέση γραμμή (12-13h): Η αρχική λωρίδα επιμηκύνεται και φτάνει περίπου στο μέσον της διάφανης περιοχής αλλά δεν έχει εμφανιστεί αρχέγονη αύλακα. 2: Αρχική γραμμή (6-7h): Εμφάνιση αρχέγονης γραμμής ως μικρή κωνική πάχυνση στο πίσω μέρος της διάφανης περιοχής (στην επιβλάστη) Εμφάνιση πρώτου ζεύγους σωματομεριτών εκατέρωθεν του προσθίου άκρου της γραμμής. Ακριβώς μπροστά από τη γραμμή σχηματίζεται η προχορδική πλάκα.

30 Φυσιολογική ανάπτυξη Aρχική λωρίδα (primitive streak): το κύριο δομικό χαρακτηριστικό της γαστριδίωσης πτηνών, ερπετών και θηλαστικών (Α). Είσοδος προγόνων κυττάρων ενδοδέρματος από την επιβλάστη στο βλαστόκοιλο (Β) Μετανάστευση κυττάρων από την πλευρική περιοχή της οπίσθιας επιβλάστης προς το κέντρο της επιβλάστης Η λωρίδα επιμηκύνεται με κατεύθυνση προς τη μελλοντική περιοχή της κεφαλής του εμβρύου Μετακινήσεις κυττάρων αρχικής λωρίδας στο έμβρυο της όρνιθας. (A) 3 4 hours (B) 7 8 hours Ταυτόχρονα, τα κύτταρα της δευτερογενούς υποβλάστης συνεχίζουν τη μετανάστευσή τους προς τα εμπρός, προερχόμενα από το οπίσθιο όριο του βλαστοδέρματος (Adapted from several sources, especially Spratt 1946 and Smith and Schoenwolf

31 Φυσιολογική ανάπτυξη Η αρχική λωρίδα (primitive streak): καθορίζει τη συμμετρία στο έμβρυο 1. Η λωρίδα εκτείνεται από πίσω προς μπροστά h 2. Τα μεταναστεύοντα κύτταρα εισέρχονται από τη ραχιαία της πλευρά και κινούνται προς την κοιλιακή πλευρά 3. Η λωρίδα ξεχωρίζει το αριστερό από το δεξί τμήμα του εμβρύου h 4. Όποια στοιχεία είναι κοντά στη λωρίδα θα γίνουν μελλοντικά οι «μεσαίες» δομές ενώ όσα στοιχεία βρίσκονται πιο μακρυά από αυτήν θα γίνουν οι ακραίες/πλευρικές/περιφερικές δομές του εμβρύου h

32 Φυσιολογική ανάπτυξη Μετανάστευση κυττάρων επιβλάστης διαμέσου της αρχικής λωρίδας αρχική αύλακα Καθώς τα κύτταρα συγκλίνουν για να σχηματίσουν την αρχική λωρίδα, σχηματίζεται ένα βαθούλωμα/κοίλωμα μέσα στη λωρίδα, η αρχική αύλακα. Αυτή χρησιμοποιείται ως άνοιγμα διαμέσου του οποίου τα μεταναστεύοντα κύτταρα εισέρχονται στο βλαστόκοιλο. Έτσι, η αρχική αύλακα είναι ανάλογο του βλαστοπόρου των αμφιβίων.

33 Φυσιολογική ανάπτυξη Αλλαγή σχήματος διαφανούς περιοχής (απιοειδές) Πάχυνση (κόμβος του Ηensen) Κίνηση (οπισθοδρόμηση) κόμβου προς τα πίσω C-goosecoid C-not FoxA2 (HNF3β) ΜΓΦ παράγοντες που χαρακτηρίζουν την περιοχή του οργανωτή στα έμβρυα κατώτερων σπονδυλωτών αρχική λωρίδα Κεφαλική (νωτοχορδική) προβολή: μάζα μεσοδερμικών κυττάρων μπροστά από κόμβο. Πρόδρομος νωτιαίας χορδής. 4: Τελική γραμμή (18-19h): Απιοειδής διαφανής περιοχή. Η αρχική λωρίδα καταλαμβάνει τα ¾ του μήκους της διάφανης περιοχής (μέγιστο μήκος). Εμφάνιση κόμβου Hensen (εκατέρωθεν: 2 ο ζεύγος σωματομεριτών). 5: Κεφαλική προβολή/απόφυση (19-22h): Πρώτη εμφάνιση της κεφαλικής (νωτοχορδικής) προβολής (μετανάστευση κυττάρων μπροστά) αλλά όχι της κεφαλικής πτυχής. (εκατέρωθεν κόμβου Hensen: 3 ο ζεύγος σωματομεριτών).

34 Mετανάστευση ενδοδερμικών και μεσοδερμικών κυττάρων διαμέσου της αρχικής λωρίδας (primitive streak) (Α) Μικρογραφία από SEM: κύτταρα επιβλάστης εισέρχονται στο βλαστόκοιλο (καθώς εκτείνουν το μπροστινό άκρο τους μετασχηματίζονται σε φυαλοκύτταρα) Gilbert SF, Developmental Biology (A from Solursh and Revel 1978, courtesy of M. Solursh; B after Balinsky 1975.) (Β) Γαστριδίωση στο έμβρυο της όρνιθας. Αυτή είναι η σχέση ανάμεσα στην αρχική λωρίδα, τα μεταναστεύοντα κύτταρα και τα δύο αρχικά στρώματα του βλαστοδέρματος. Το κατώτερο στρώμα γίνεται ένα μωσαικό υποβλάστης και ενδοδερμικών κυττάρων. Τα κύτταρα της υποβλάστης διαλέγονται τελικά για να δώσουν ένα στρώμα κάτω από το ενδόδερμα και συνεισφέρουν στο σχηματισμό του λεκιθικού σάκου.

35 Mετανάστευση ενδοδερμικών και μεσοδερμικών κυττάρων διαμέσου της αρχικής λωρίδας (primitive streak) 1. Κύτταρα που εισέρχονται στο βλαστόκοιλο από κόμβο Hensen: μετακινούνται μπροστά και σχηματίζουν μελλοντικά κεφαλική χορδή, κεφαλικό μεσόδερμα και νωτοχορδή. 2. Κύτταρα που εισέρχονται στο βλαστόκοιλο από πλευρικά τμήματα αρχικής λωρίδας: δίνουν γέννηση στην πλειονότητα των ενδοδερμικών και μεσοδερμικών ιστών (Schoenwolf et al. 1992). Gilbert SF, Developmental Biology (A from Solursh and Revel 1978, courtesy of M. Solursh; B after Balinsky 1975.)

36 Mετανάστευση ενδοδερμικών και μεσοδερμικών κυττάρων διαμέσου της αρχικής λωρίδας (primitive streak) 1. Κύτταρα που εισέρχονται στο βλαστόκοιλο: ως μεμονωμένα, ανεξάρτητα κύτταρα (θραύση βασικού ελάσματος και μετασχηματισμός κυττάρων epithelial-to-mesenchymal). 2. Ο μετασχηματισμός των κυττάρων μεσολαβείται από τον παράγοντα διασκορπισμού (scatter factor, 190kD) ο οποίος εκκρίνεται από τα κύτταρα καθώς αυτά εισέρχονται στην αρχική λωρίδα ή στον κόμβο του Ηensen. Αυτός ο παράγοντας καταστέλλει την έκφραση και τη δράση της E-cadherin (Stern et al. 1990; DeLuca et al. 1999). Gilbert SF, Developmental Biology (A from Solursh and Revel 1978, courtesy of M. Solursh; B after Balinsky 1975.)

37 Φυσιολογική ανάπτυξη Τα πρώτα κύτταρα που εισέρχονται από τον κόμβο του Hensen στο βλαστόκοιλο: Ενδοδερμικά κύτταρα που μεταναστεύουν μπροστά (για να γίνουν το φαρυγγικό ενδόδερμα του πεπτικού σωλήνα (foregut). Στην μετακίνησή τους αυτή, τελικά εκτοπίζουν τα κύτταρα της υποβλάστης περιορίζοντάς τα στην πλέον εμπρόσθια περιοχή της διαφανούς περιοχής. τα αρχέγονα γαμετικά κύτταρα εμφανίζονται στο ακραίο εμπρόσθιο όριο της διαφανούς περιοχής (εμπρόσθια εξωεμβρυική θέση, έξω από το ίδιο το έμβρυο) και εισέρχονται στη γεννητική ακρολοφία μετά από μακρά μετανάστευση

38 Φυσιολογική ανάπτυξη Πλήρης έκταση αρχικής λωρίδας και ανύψωση βλαστοδέρματος Τα επόμενα κύτταρα που εισέρχονται από τον κόμβο του Hensen στο βλαστόκοιλο: μεταναστεύουν μπροστά, αλλά όχι τόσο κοιλιακά όσο τα ενδοδερμικά κύτταρα του ανώτερου τμήματος του πεπτικού σωλήνα. Αντίθετα, μένουν μεταξύ ενδοδέρματος και επιβλάστης για να σχηματίσουν το κεφαλικό μεσέγχυμα. Στην μετακίνησή τους αυτή, τελικά πιέζουν την μπροστινή/μέση περιοχή της επιβλάστης, σχηματίζοντας έτσι την Κεφαλική πτυχή Ετσι η κεφαλή στο έμβρυο των πτηνών σχηματίζεται μπροστά από τον κόμβο του Hensen.

39 Φυσιολογική ανάπτυξη Κεφαλική πτυχή Πλήρης έκταση αρχικής λωρίδας και ανύψωση βλαστοδέρματος κόμβος του Ηensen 6: Κεφαλική πτυχή (23-25h): Κεφαλική πτυχή (αναδίπλωση των εμβρυικών μεμβρανών μπροστά και κάτω από την κεφαλική περιοχή) αλλά ακόμα δεν έχει εμφανιστεί κανένας σωμίτης. Τέλος πρώτης μέρας

40 Φυσιολογική ανάπτυξη διαδοχική εμφάνιση πρωταρχικών δομών του αρχιτεκτονικού σχεδίου σώματος σωμίτες

41 Φυσιολογική ανάπτυξη Ανύψωση βλαστοδέρματος 7: Ένας σωμίτης (25-26h): Κεφαλική πτυχή και εμφάνιση πρώτου ζεύγους σωμιτών (και νευρικές πτυχές).

42 Φυσιολογική ανάπτυξη ΣΥΝΟΨΗ

43 Φυσιολογική ανάπτυξη Προοδευτικός διαχωρισμός εμβρύου από περιβάλλοντα εξωεμβρυϊκό ιστό 8: Τέσσερις σωμίτες (28-29h): Αρχίζουν και κλείνουν οι νευρικές πτυχές. Εμφανίζονται οι πρώτες νησίδες αίματος (εξωτ. εξωεμβρυϊκό τμήμα βλαστοδέρματος). Πτυχώσεις (και των 3 βλαστικών στιβάδων) γύρω από το έμβρυο έτσι ώστε αρχικά το κεφάλι και ύστερα ο κορμός να προβάλουν πάνω από την επιφάνεια του εξωεμβρυϊκού ιστού

44 Φυσιολογική ανάπτυξη Στο μεταξύ, κύτταρα εξακολουθούν να εισέρχονται στο βλαστόκοιλο από τα πλευρικά τμήματα της αρχικής λωρίδας. Αυτά τα κύτταρα διαχωρίζονται σε δύο στρώματα: 1. Κύτταρα που εισέρχονται βαθύτερα στο βλαστόκοιλο: συναντούν τα κύτταρα στο μέσον της υποβλάστης και τη μετατοπίζουν στα δύο άκρα. Από αυτά τα κύτταρα «μεγαλύτερου βάθους» θα προκύψουν όλα τα ενδοδερμικά όργανα του εμβρύου και οι περισσότερες εξωεμβρυικές μεμβράνες. Η υποβλάστη θα σχηματίσει τις υπόλοιπες. 2. Κύτταρα που διαχέονται μεταξύ αυτού του ενδοδέρματος και της επιβλάστης: σχηματίζουν ένα χαλαρό στρώμα κυττάρων. Από αυτά θα προκύψουν τα μεσοδερμικά τμήματα του εμβρύου και εξωεμβρυικές μεμβράνες.

45 Φυσιολογική ανάπτυξη Υποστροφή/υποχώρηση αρχικής λωρίδας Καθώς η είσοδος των μεσοδερμικών κυττάρων συνεχίζεται, η αρχική λωρίδα αρχίζει να υποχωρεί μετακινώντας τον κόμβο του Hensen από το κέντρο σχεδόν της διαφανούς περιοχής σε περισσότερο οπίσθια θέση. Στη θέση της, σχηματίζεται ο ραχιαίος άξονας του εμβρύου και η νωτοχορδή. Μπροστινό τμήμα νωτοχορδής: σχηματίζεται από την είσοδο κυττάρων από τον κόμβο του Hensen Οπίσθιο τμήμα νωτοχορδής (μετά τον 17 ο σωμίτη): σχηματίζεται από τη συμπύκνωση του μεσοδερμικού ιστού/κυττάρων που εισήλθαν από την αρχική λωρίδα (δηλ. όχι από τον κόμβο). Αυτό το τμήμα της νωτοχορδής εκτείνεται προς τα πίσω για να σχηματίσει την ουρά του εμβρύου (Le Douarin et al. 1996).

46 ΣΥΝΟΨΗ

47 Φυσιολογική ανάπτυξη 8: Τέσσερις σωμίτες (27h) Υποστροφή/υποχώρηση αρχικής λωρίδας 28h Υποστροφή/υποχώρηση αρχικής λωρίδας στο ουραίο τμήμα του εμβρύου

48 Φυσιολογική ανάπτυξη Ως συνέπεια αυτής της αλληλουχίας γεγονότων με την οποία «εγκαθιδρύεται» το μεσόδερμα της κεφαλής και η νωτοχορδή στα έμβρυα πτηνών και θηλαστικών: anterior-to-posterior gradient of developmental maturity Κύτταρα στα οπίσθια τμήματα του εμβρύου: υφίστανται γαστριδίωση Κύτταρα στα εμπρόσθια τμήματα του εμβρύου: έχουν ήδη ξεκινήσει να σχηματίζουν όργανα (Darnell et al. 1999).

49 Φυσιολογική ανάπτυξη 9: Επτά σωμίτες (29-33h): Εμφανίζονται τα οπτικά κυστίδια. Αρχίζουν να ενώνονται οι καρδιακοί σωλήνες. Αρχέγονη καρδιά (σύντηξη καταβολών της στο εμπρόσθιο μεσόδερμα ) Αρχή 2 ης ημέρας 10: Δέκα σωμίτες (33-38h): Υπάρχουν τρία πρωτογενή εγκεφαλικά κυστίδια. Δεν έχει εμφανιστεί ακόμα ο οφθαλμικός μίσχος.

50 Φυσιολογική ανάπτυξη Ο νευρικός σωλήνας κλείνει πρώτα πάνω από το διάμεσο εγκέφαλο κι ύστερα προοδευτικά μπροστά και πίσω. Από το παραξονικό μεσόδερμα εκατέρωθεν της νωτοχορδής: εξακολουθούν να σχηματίζονται οι σωμίτες. Μπροστά Πίσω 36h: 10 σωμίτες. Ο νευρικός σωλήνας έχει κλείσει: κυστίδια πρόσθιου, διάμεσου και οπίσθιου εγκέφαλου

51 Φυσιολογική ανάπτυξη Υποδιαίρεση μεσοδέρματος πλευρικού πετάλου: Σωματική στιβάδα Νευρικός σωλήνας κοίλωμα Σπλαχνική στιβάδα Νεφροί Επινεφρίδια Γονάδες

52

53 Φυσιολογική ανάπτυξη Οπισθοδρόμηση κόμβου, σχηματισμός οπίσθιου τμήματος σώματος Οριοθέτηση μετάβασης στην Όψιμη φάση ανάπτυξης Γενικό αρχιτεκτονικό σχέδιο Επίκειται ο σχηματισμός επιμέρους οργάνων

54 Φυσιολογική ανάπτυξη Εξωεμβρυικές μεμβράνες Εξωτερική παροχή τροφής σε έμβρυο

55 Φυσιολογική ανάπτυξη Καθώς τα μελλοντικά μεσοδερμικά και ενδοδερμικά κύτταρα μεταναστεύουν προς τα μέσα, οι πρόδρομοι των εξωδερμικών κυττάρων πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν για να περικλείσουν τη λέκιθο. epiboly Η περισσότερο ταχεία και εκτεταμένη επιθηλιακή μετακίνηση. Η επιβλάστη «αποικεί» ολόκληρη τη λέκιθο. Ολοκληρώνεται σε 4 ημέρες. Το μέτωπο μετακινείται με μία ταχύτητα 500μm/h, δηλ. περίπου 8 φορές πιο μεγάλη από την ταχύτητα μετακίνησης ινοβλαστών!!!

56 Φυσιολογική ανάπτυξη epiboly Ταυτόχρονα με γαστριδίωση Ανακατασκευή/Μορφογένεση Ταχύτατα διαιρούμενη ομάδα κυττάρων γύρω από μία άλλη ομάδα που διαιρείται με πιο αργούς ρυθμούς. «Λέπτυνση (αύξηση S) και επέκταση κυτταρικών στρωμάτων».

57 Φυσιολογική ανάπτυξη Για αυτή τη μετακίνηση απαιτείται μία ακέραια λεκιθική μεμβράνη, η οποία λειτουργεί ως το υπόστρωμα πάνω στο οποίο προσδένεται και εξαπλώνεται η επιβλάστη. Μόνο τα κύτταρα της εξωτερικής άκρης της αδιαφανούς περιοχής προσκολλώνται ισχυρά στη λεκιθική μεμβράνη.

58 Φυσιολογική ανάπτυξη Αυτά τα κύτταρα είναι διαφορετικά από τα υπόλοιπα κύτταρα του βλαστοδέρματος: εκτείνουν τεράστιες (500 μm) κυτταροπλασματικές προεκβολές μέσα στο λεκιθικό σάκο. Τα επιμήκη φιλοπόδια πιθανώς δρουν ως κινητήριες συσκευές/μηχανισμοί των απομακρυσμένων κυττάρων, διαμέσου των οποίων ωθούνται τα υπόλοιπα εξωδερμικά κύτταρα γύρω από τη λέκιθο (Schlesinger 1958). Τα φιλοπόδια προσδένουν φιμπρονεκτίνη, κύρια πρωτεΐνη του λεκιθικού φακέλου

59 Σχηματισμός εξωεμβρυϊκών δομών στο έμβρυο της όρνιθας. Φυσιολογική ανάπτυξη Σωματ. Μεσόδερμα Εξώδερμα Πεπτικό όργανο Σπλαχν. μεσόδερμα Αιμοποιητικός ιστός Ενδόδερμα Εσωτ. εξωεμβρ. στιιβάδα (Alfred Hildebrand Analysis of Vertebrate Structure. New York: Wiley.)

60 Φυσιολογική ανάπτυξη

61 Φυσιολογική ανάπτυξη

62 Φυσιολογική ανάπτυξη 3 ημέρες Χόριο (Εξωτερική) Άμνιο (Εσωτερική)

63 Φυσιολογική ανάπτυξη Άμνιο: αποτελείται από εξώδερμα (πλευρά εμβρύου) και μεσόδερμα (πλευρά χορίου)

64 Φυσιολογική ανάπτυξη Αλλαντοϊδα 1. Δεξαμενή ουρικού οξέος 2. Κύριο αναπνευστικό όργανο εμβρύου Σωματ. Μεσόδερμα Ενδόδερμα Χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (σύντηξη, κάτω από το κέλυφος) Αιμοφόρα αγγεία (in ovo καλλιιέργειες καταβολών οργάνων ) (Alfred Hildebrand Analysis of Vertebrate Structure. New York: Wiley.)

65 Φυσιολογική ανάπτυξη 1. Το εξώδερμα έχει περικλείσει τη λέκιθο. 2. Το ενδόδερμα έχει αντικαταστήσει την υποβλάστη 3. Το μεσόδερμα έχει τοποθετηθεί ανάμεσα σε αυτές τις δύο περιοχές. 4. Μηχανισμοί????? Παρότι η πρώιμη επιβλάστη φαίνεται ομοιογενής, τα κύτταρά της είναι διαφορετικά μεταξύ τους. Επιφανειακοί δείκτες? Έτσι κάποια από αυτά παραμένουν στην επιβλάστη και άλλα μεταναστεύουν στο έμβρυο.

66 Φυσιολογική ανάπτυξη Χάρτης πεπρωμένου πρώιμου εμβρύου Βλαστόδερμα 1. Εξωεμβρυικές δομές 2. Έμβρυο Σήμανση κυττάρων (Dil, DiO) και εντοπισμός τους σε όψιμα στάδια

67 Φυσιολογική ανάπτυξη Παρότι ο σχηματισμός των αξόνων συμμετρίας του εμβρύου ολοκληρώνεται κατά τη γαστριδίωση, η εξειδίκευσή τους συμβαίνει νωρίτερα, στο στάδιο της αυλάκωσης. Η αρχική λωρίδα προέρχεται από το πλέον οπίσθιο τμήμα της διαφανούς περιοχής και την ΟΟΖ 2 στιβάδες κυττάρων ΟΟΖ: Πάνω: συμβάλει στο εξώδερμα αρχικής λωρίδας Κάτω: συμβάλει στο δευτερογενή υποβλάστη

68 Φυσιολογική ανάπτυξη Ενεργή διάταση Συνεχής ροή, διέλευση κυττάρων διαμέσου της αρχικής λωρίδας και κόμβου Μεσόδερμα Ενδόδερμα Τα κύτταρα της αρχικής υποβλάστης ωθούνται προς την περιφέρεια

69 Φυσιολογική ανάπτυξη Υποστροφή/υποχώρηση αρχικής λωρίδας Καθώς η είσοδος των μεσοδερμικών κυττάρων συνεχίζεται, η αρχική λωρίδα αρχίζει να υποχωρεί μετακινώντας τον κόμβο του Hensen από το κέντρο σχεδόν της διαφανούς περιοχής σε περισσότερο οπίσθια θέση. Στη θέση της, σχηματίζεται ο ραχιαίος άξονας του εμβρύου και η νωτοχορδή.

70 Φυσιολογική ανάπτυξη Επιβλάστη Νευρική πλάκα Προκύπτει από την επιβλάστη που βρίσκεται γύρω από τον κόμβο

71 Έμβρυο πριν την ανάπτυξη της αρχικής λωρίδας Μπροστινό ήμισυ πάχυνσης Kollar (πράσινη χρωστική, επιβλάστη και ενδιάμεσο στρώμα): Κόμβος Hensen και παράγωγά του (νωτοχορδή) Όπίσθιο ήμισυ πάχυνσης Kollar (κόκκινη χρωστική, επιβλάστη και ενδιάμεσο στρώμα): Οπίσθια περιοχή αρχικής λωρίδας Developmental Biology. 6th edition. Gilbert SF.

72 Κόμβος Hensen: (1) Η θέση από την οποία ξεκινάει η γαστριδίωση (2) Τα κύτταρα αυτής της περιοχής γίνονται μεσόδερμα νωτιαίας χορδής (3) Τα κύτταρα αυτής της περιοχής μπορούν να οργανώσουν ένα δεύτερο εμβρυικό άξονα όταν μεταμοσχευθούν σε άλλες θέσεις γαστριδίου. Μεταμόσχευση σε επιβλάστη εμβρύου όρνιθας. Επαγωγή σχηματισμού νέου εμβρύου (όπως φαίνεται από το σχηματισμό νευρικού σωλήνα) από ιστούς του δέκτη στη θέση του μοσχεύματος Πάχυνση Κοllar: (1) H μεταμόσχευσή της επάγει σχηματισμό νέων εμβρυικών αξόνων. (2) Τα ενδιάμεσα κύτταρα της πάχυνσης εκφράζουν το γονίδιο goosecoid το οποίο είναι γνωστό από άλλους οργανωτές

73 Φυσιολογική ανάπτυξη Η αρχική λωρίδα δε χαρτογραφείται με αντιστοίχιση σημείου προς σημείο με το μελλοντικό εμπροσθοπίθιο σχέδιο του σώματος αλλά: Εμπρόσθια λωρίδα Μέση γραμμή Ο εμπροσθοπίσθιος άξονας της λωρίδας χαρτογραφείται στο μεσοπλευρικό άξονα του όψιμου εμβρύου Οπίσθια λωρίδα Εξωεμβρυϊκοί ιστοί Πλευρικά τμήματα Τα επίπεδα της αρχικής λωρίδας από τα οποία αναπτύσσεται το ενδόδερμα και το μεσόδερμα.

74 Φυσιολογική ανάπτυξη εμβρύου (1) Το έμβρυο της όρνιθας είναι αμνιωτό Μορφολογία παρόμοια με θηλαστικά (2) Πρώιμη ανάπτυξη: = επίπεδο βλαστόδερμα Αρχική λωρίδα: επάγεται στο οπίσθιο όριο και επιμηκύνεται προς το εμπρόσθιο Γαστριδίωση: διαρκής κυτταρική μετακίνηση μέσω της αρχικής λωρίδας. (3) Εξω-εμβρυικές μεμβράνες: Λεκιθικός σάκος-χόριο-άμνιο-αλλαντοίδα: Υποστήριξη εμβρύου με οξυγόνο και θρεπτικά υλικά (4) Χάρτης πεπρωμένου: ο ΕΟ άξονας αρχικής λωρίδας αντιστοιχεί στο μεσοπλευρικό άξονα του πρωτογενούς αρχιτεκτονικού σχεδίου του σώματος Τοπική εξειδίκευση πρώιμου εμβρύου

75 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Πολικότητα εμπροσθοπίσθιου άξονα Von Baer (1828) Το έμβρυο αναπτύσσεται έτσι ώστε ο επιμήκης άξονά του να είναι σχεδόν κάθετος στον επιμήκη άξονα του αυγού (η ουρά του εμβρύου βρίσκεται προς τον παρατηρητή)

76 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Το οπίσθιο άκρο σχηματίζεται στο ανώτερο άκρο βλαστοδέρματος Προσανατολισμός (γέρνει, δεν περιστρέφεται) Προσανατολισμός (όχι περιστροφή) Δημιουργία πολικότητας κατά μήκος του εμπροσθοπίσθιου άξονα στο βλαστόδερμα του εμβρύου της όρνιθας ως αποτέλεσμα της ενδομήτριας περιστροφής του αυγού (14-16h). Ε=εμπρόσθιο, Ο=οπίσθιο

77 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Περιστροφή αυγού (10-12 περιστροφές/h) τα ελαφρύτερα συστατικά της λεκίθου τοποθετούνται κάτω από τη μία πλευρά του βλαστοδέρματος και την πιέζουν ελαφρώς προς τα πάνω. Αυτή η πιο υπερυψωμένη περιοχή γίνεται ο οπίσθιος πόλος του εμβρύου (από εδώ θα ξεκινήσει ο σχηματισμός της αρχικής λωρίδας). (Developmental Biology. 6th edition. Gilbert SF. Sunderland (MA): Sinauer Associates; Copyright 2000, Sinauer Associates)

78 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Προσανατολισμός (όχι περιστροφή) chalaza σπειροειδής δομή σα σκοινί η οποία προσδένει τη λέκιθο στην αλβουμίνη (μία στο οξύ και μία στο αμβλύ άκρο αυγού).

79 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Ποιες αλληλεπιδράσεις καθορίζουν ένα τμήμα του βλαστοδέρματος να γίνει ΟΠΙΣΘΙΟ ΑΚΡΟ και να ξεκινήσει τη ΓΑΣΤΡΙΔΙΩΣΗ? Η ικανότητα δημιουργίας αρχικής λωρίδας βρίσκεται σε ΟΛΟΚΛΗΡΗ ΤΗΝ ΟΡΙΑΚΗ ΖΩΝΗ Αν χωριστεί ένα ΠΡΩΙΜΟ βλαστόδερμα σε 4 μέρη, καθένα από τα οποία έχει τη δική του οριακή ζώνη, τότε κάθε τμήμα θα σχηματίσει τη δική του αρχική λωρίδα (Spratt and Haas 1960). (Developmental Biology. 6th edition. Gilbert SF. Sunderland (MA): Sinauer Associates; Copyright 2000, Sinauer Associates)

80 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Σημαντικότητα πρώιμης πολικότητας Αλλά: από τη στιγμή που έχει σχηματιστεί (καθοριστεί) μία περιοχή της Οριακής ζώνης ως ΟΠΙΣΘΙΑ ΟΡΙΑΚΗ ΖΩΝΗ τότε: Μόνο από αυτήν την περιοχή θα ξεκινήσει η αρχική λωρίδα/γαστριδίωση (έλεγχος υπόλοιπης περιοχής Οριακής Ζώνης) (Khaner and Eyal-Giladi 1989; Eyal-Giladi et al. 1992).

81 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Πρώιμες επαγωγικές αλληλεπιδράσεις (1η) Επαγωγή της αρχικής λωρίδας από την οπίσθια οριακή ζώνη. brachyury

82 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου (1) Επαγωγή της αρχικής λωρίδας από την οπίσθια οριακή ζώνη ή από ένα ίζημα κυττάρων που εκκρίνει την πρωτεΐνη vg1 (nodal-like) σε συνδυασμό με τον παράγοντα Wnt (επιβλάστη ΟΟΖ: έως στάδιο ΧΙ) ΧΙ ΧΙ ΧΙ στάδιο ΧΙ (πάχυνση Kollar, αρχίζει ο σχηματισμός δευτερογενούς υποβλάστης ) Ανασυνδυασμός: Το μόσχευμα απλώς επάγει, δεν συνεισφέρει δικά του κύτταρα στην επαγόμενη αρχική λωρίδα και στον κόμβο του Ηensen. (Bachvarova et al. 1998; Khaner 1998) Η οπίσθια οριακή ζώνη είναι η μόνη περιοχή του εμβρύου που εκκρίνει Vg1.

83 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Εμπρόσθιο ήμισυ βλαστοδέρματος + vg1 πλευρικά σχηματισμός αρχικής λωρίδας πλευρικά και καταστολή αρχικής λωρίδας δέκτη (2) Ο σχηματισμός μιας αρχικής λωρίδας καταστέλλει το σχηματισμό άλλων κοντά σε αυτήν Εμπρόσθιο ήμισυ βλαστοδέρματος + ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΑ (<5h) 2x vg1 σχηματισμός 2 αρχικών λωρίδων Εμπρόσθιο ήμισυ βλαστοδέρματος + vg1 + vg1 (5h later) σχηματισμός 1 αρχικής λωρίδας Παραγωγή κατασταλτικού σήματος από την πρώτη αρχική λωρίδα

84 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου (3) Επαγωγική αλληλεπίδραση οργανωτή (κόμβος Hensen τοπική εξειδίκευση εξωδέρματος και μεσοδέρματος) Επαγωγικό σήμα κόμβου Hensen Η μεταμόσχευση ενός κόμβου Hensen στη διάφανη περιοχή (κοντά στην αρχική λωρίδα) επάγει τη δημιουργία ενός δεύτερου, μερικώς ανεπτυγμένου άξονα στον οποίο η νωτοχορδή προέρχεται από το μόσχευμα και ο νευρικός σωλήνας και οι σωμίτες προέρχονται από τον δέκτη.

85 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Επαγωγικότητα κόμβου Hensen Δεκτικότητα επιβλάστης μέχρι: Η&Η 8 Η&Η 4 (4 σωμίτες) (οριστική λωρίδα)

86 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Πρώιμα στάδια + αφαίρεση κόμβου Hensen φυσιολογικός σχηματισμός προτύπου στο έμβρυο επανασχηματισμός κόμβου (αρκεί να υπάρχει αρχική λωρίδα σε μέση ανάπτυξη) καταστολή σχηματισμού άλλων κόμβων

87 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Η επίδραση του οργανωτή οφείλεται στην καταστολή του μονοπατιού ΒΜΡ??? Περιφέρεια βλαστοδέρματος: παράγοντες ΒΜΡ Κόμβος Hensen: noggin, chordin, nodal (καταστολείς ΒΜΡ)

88 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Παρότι παρατηρείται μείωση σηματοδότησης BMP (φωσφορυλιωμένη smad1) στην περιοχή της μελλοντικής νευρικής πλάκας Πείραμα: έκτοπη έκφραση καταστολέων BMP (πχ. Chordin) σε non-neural περιοχές της επιβλάστης δεν προκαλεί επαγωγή νευρικού ιστού (Streit and Stern 1999). Ο ανταγωνισμός της σηματοδότησης BMP δεν αρκεί για την επαγωγή νευρικών δομών

89 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Μάλλον οι παράγοντες FGFs (fibroblast growth factors) φαίνεται να επάγουν νευρωνικούς φαινοτύπους στα κύτταρα της επιβλάστης. (Alvarez et al. 1998; Storey et al. 1998). FGFs παράγονται σε κόμβο Hensen και αρχική λωρίδα. FGF, Wnt πιθανή επαγωγή νευρικού ιστού Καταστολείς FGF παρεμπόδιση επαγωγής νευρικού ιστού

90 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Εμπροσθοπίσθιος άξονας νευρικού σωλήνα Παράγοντες FGF (αρχικής λωρίδας) (Xenopus, zebrafish) Cdx* Hox* (οπίσθια γονίδια) Σφαιρίδια FGF + επιβλάστη σχηματισμός δομών οπίσθιου νευρικού σωλήνα από τμήματα της επιβλάστης Οι παράγοντες που ρυθμίζουν παραγωγή δομών πρόσθιου νευρικού σωλήνα είναι άγνωστοι.

91 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Ασυμμετρία δεξιά-αριστερά (μεσοπλευρική) Τα έμβρυα των σπονδυλωτών είναι λίγο ως πολύ αμφιπλευροσυμμετρικά Ωστόσο, η αμφίπλευρη συμμετρία δεν είναι απόλυτη Το αριστερό ήμισυ διαφέρει από το δεξί (καρδιά, σπλήνας συκώτι)

92 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Ασυμμετρία στο έμβρυο της όρνιθας 15: (50-55h): Κρανιακή κάμψη μεγαλύτερη των 90 ο C. Σχηματίζεται ο οφθαλμικός κάλυκας. Κλίση κόμβου Hensen προς τα αριστερά Κάμψη εμβρύου (κεφαλή δεξιά) Στομάχι και έντερο Μορφολογική ασυμμετρία καρδιάς και σπλάχνων

93 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Ασυμμετρικό πρότυπο έκφρασης πολλών πρωτεϊνών στο έμβρυο της όρνιθας (διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης εκατέρωθεν της μέσης γραμμής) Μεσόδερμα: στιβάδα ιστού που εμπλέκεται περισσότερο στο σχηματισμό των ασύμμετρων οργάνων (πχ. καρδιά)

94 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Η διάκριση αριστερά-δεξιά στο σώμα των σπονδυλόζωων ρυθμίζεται από 2 κύριες πρωτεΐνες: τον παρακρινή παράγοντα Nodal (εκφράζεται στην αριστερή πλευρά όλων των σπονδυλωτών, τοπική δράση/γειτονικά κύτταρα) το μεταγραφικό παράγοντα Pitx2 (εκφράζεται στην αριστερή πλευρά όλων των σπονδυλωτών) Nodal: κύριο σηματοδοτικό μόριο κυτταρικής διαφοροποίησης Pitx2: τελικός τελεστής κυτταρικής διαφοροποίησης

95 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Whole mount in situ hybridization με σημασμένους ανιχνευτές του mrna του γονιδίου nodal της όρνιθας (μωβ χρωστική): Έκφραση στο πλευρικό μεσόδερμα της αριστερής μόνο πλευράς του εμβρύου Πώς ενεργοποιείται η έκφραση του nodal στην αριστερή πλευρά? Οι μηχανισμοί διαφέρουν στα διάφορα σπονδυλόζωα.

96 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Levin et al., Cell 82:803, 1995 Nodal sonic hedgehog activin receptor IIA: ασύμμετρα πρότυπα έκφρασης στο πρώιμο έμβρυο όρνιθας και ρυθμίζουν το ένα το άλλο σχηματίζοντας μονοπάτια

97 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Πειραματική προσέγγιση: τοπική εφαρμογή παραγόντων Ιοί RCAS (Replication competent avian-specific viruses) Παράγοντες δεσμευμένοι σε σφαιρίδια Επίδραση στην έκφραση άλλων παραγόντων

98 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Ασύμμετρη έκφραση: nodal (αριστερά στα σπονδυλωτά) Ποικιλότητα στα διάφορα είδη σπονδυλωτών

99 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Πείραμα: Δεξιά πλευρά αναπτυσσόμενου εμβρύου + nodal τυχαιοποίηση θέσης πολλών οργάνων που κανονικά χαρακτηρίζονται από ασυμμετρία (A) Φυσικού-τύπου έκφραση του γονιδίου nodal της όρνιθας: έκφραση στην αριστερή πλευρά (σκουρόχρωμη περιοχή). Ασύμμετρη μορφολογία στην καρδιά των εμβρύων. Το ίδιο πρότυπο προκύπτει όταν ένα ίζημα κυττάρων που εκκρίνει Shh μεταμοσχεύεται στην αριστερή πλευρά, εκεί που συνήθως εκφράζεται. Όταν ένα ίζημα κυττάρων που εκκρίνει Shh μεταμοσχεύεται στα δεξιά του κόμβου, η έκφραση του γονιδίου nodal γίνεται αμφιπλευρο-συμμετρική (Levin et al. 1995) και η αναδίπλωση της καρδιάς γίνεται με τρόπο τυχαίο.

100 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου nodal Πρώιμα γεγονότα (1) Αρχικά: σε μία μικρή επικράτεια αριστερής πλευράς κόμβου Hensen, ο οποίος υποχωρεί

101 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Όψιμα γεγονότα Εξάπλωση έκφρασης του nodal σε ευρύτερη περιοχή στο μεσόδερμα αριστερής πλευράς αυτοκαταλυτικός βρόχος ΜΓΦ σηματοδότηση καταστολέας Nodal ΚΥΡΙΟ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΡΙΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ Τελικός τελεστής κυτταρικής διαφοροποίησης Δ Ε Ξ Ι Α

102 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου sonic hedgehoc (shh) lefty-1 caronte (car) bone morphogenetic proteins Activin activin receptor IIa caronte (car) Κύριο σηματοδοτικό μόριο κυτταρικής διαφοροποίησης Τελικός τελεστής κυτταρικής διαφοροποίησης Developmental Biology. 6th edition. Gilbert SF. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000.

103 Τοπική εξειδίκευση του πρώιμου εμβρύου Blocking of activin (by follistatin): κατάργηση ασύμμετρης έκφρασης shh Activin-beads placed to the left of Hensen s node: καταστολή έκφρασης shh (και nodal) Μεταμόσχευση κυττάρων που εκφράζουν shh στη δεξιά πλευρά του κόμβου του Hensen: συμμετρική έκφραση nodal στο πλευρικό μεσόδερμα Developmental Biology. 6th edition. Gilbert SF. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000.

104 Οργανογένεση στο έμβρυο της όρνιθας

105 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Πρόσβαση και γνώση όψιμων σταδίων ανάπτυξης εμβρύου όρνιθας: πιο παλιά και κύρια πηγή γνώσης της ΟΡΓΑΝΟΓΕΝΕΣΗΣ ΣΠΟΝΔΥΛΩΤΩΝ Κύρια μορφολογικά γεγονότα οργανογένεσης

106 ΠΡΟΣΘΙΟ εξώδερμα βλαστοδέρματος νευρική αύλακα πρόσθιο έντερο εξωεμβρυικό μεσόδερμα νευρική πτυχή νευρική πλάκα ενδόδερμα Η οργανογένεση αρχίζει από το κεφάλι και προχωρεί βαθμιαία προς την ουρά σωμίτης ενδιάμεσο μεσόδερμα σωματικό μεσόδερμα σπλαχνικό μεσόδερμα κόμβος του Hensen μεσόδερμα Προσθιοπίσθια εξέλιξη σε έμβρυο 24h αρχική λωρίδα ΟΠΙΣΘΙΟ

107 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Το έμβρυο 2 η ημέρα (33-38h) Τρία πρωτογενή εγκεφαλικά κυστίδια Οπτικά κυστίδια Κλίση στα δεξιά

108 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Κεφαλή: στρέφεται προς τα δεξιά 13: Δεκαεννέα σωμίτες (49-52h): Η αμνιακή πτυχή καλύπτει το κεφάλι έως τον οπισθεγκέφαλο. Εμπρόσθια εξωεμβρυική πτύχωση (σε περιοχή κεφαλής) Μετακινείται προς τα πίσω και αργότερα αναπτύσσεται σε χόριο, άμνιο

109 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας 2.5 ημέρες (52-64h) Έμβρυο στην αμνιακή κοιλότητα 17: (52-64h): Εμφανίζονται η καταβολή των άκρων, η επίφυση και τα ρινικά βοθρία.

110 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας 3-3.5d Οπίσθιο άκρο: Καταβολή ουράς 18: (3d): Το φύτρο των οπίσθιων άκρων είναι λίγο μεγαλύτερο από αυτό των πρόσθιων. Εμφανίζεται η αλλαντοίδα. 19: (3-3.5d): Εμφανείς άνω και κάτω γναθικές προβολές. Το μάτι δεν έχει ακόμα χρωστική. (αποτελείται από: νωτοχορδή, νευρικός σωλήνας, σωμίτες, οπίσθιο έντερο)

111 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας 20: (3-3.5d): Ο κορμός είναι ευθύς. 21: (3.5d): Τα φύτρα των άκρων είναι ασύμμετρα και εκτείνονται προς τα πίσω 4 ημέρες (Εκκόλαψη: 20η-21η ημέρα)

112 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Νευρικό σύστημα Πρωτογενή κυστίδια πρόσθιου, διάμεσου και οπίσθιου ΠΡΩΙΜΟΥ εγκεφάλου ( παρεγκεφαλίδα) ( τετράδυμα) ( οπτικά κυστίδια) ( εγκεφαλικά ημισφαίρια) π π ο ο δ (υποδοχείς οπτικών νεύρων) δ Αλλαγή σχήματος του πρώιμου εγκεφάλου του εμβρύου της όρνιθας από την ημέρα 2 ως την ημέρα 4,5 της ανάπτυξης. (μύες, αισθητήρια όργανα) ΖΕΥΓΗ ΝΩΤΙΑΙΩΝ ΝΕΥΡΩΝ

113 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας 3.5. Μεσόδερμα Σωμιτογένεση (μεταμερισμός) Οι σωμίτες σχηματίζονται διαδοχικά από εμπρός (Ε) προς τα πίσω (Ο) από το τέλος της ημέρας 1. Μετάβαση (συμπύκνωση) κυττάρων από χαλαρή μεσεγχυματική μορφολογία και οργάνωση (χαλαρά συνδεδεμένες ομάδες κυττάρων, σωμιτομερή) σε συμπαγή επιθηλιακή (στενή σύνδεση κυττάρων, σωμίτες). (κυτταρική συνάφεια, αύξηση έκφρασης φιμπρονεκτίνης και καδερίνης Ν) Σε τομή

114 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Συσσωματώματα κυττάρων οργανωμένα γύρω από μία κοιλότητα Σωμιτογένεση 4d, 45 σωμίτες

115 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Σε επόμενο στάδιο: σχηματίζονται 3 τύποι δομών από κάθε σωμίτη: (Σ) Μελλοντικός σχηματισμός σπονδύλων (εκτός φάσης σε σχέση με τους σωμίτες!!!!) (Μ) Μελλοντικός σχηματισμός γραμμωτών μυών (μεταμερικής οργάνωσης) (Δ) Συμβάλει στο σχηματισμό της δερμίδας του δέρματος Χ Χ Χ Χ Ινιακοί σωμίτες (ινιακό τμήμα κρανίου)

116 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Ανάπτυξη νεφρού, γονάδων και επινεφριδίων από το ενδιάμεσο μεσόδερμα. (Witschi Development of Vertebrates. Saunders). εκφυλίζεται 2-3d (3-4d, επίπεδο 16-27σωμ) (σπειράματα και σωληνάρια) Μεσονεφρός: Λειτουργικός νεφρός πτηνών κατά την εμβρυική ζωή

117 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Εκκόλαψη: μετανεφρός (5-8d)

118 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας Ενδιάμεσο μεσόδερμα (μεσοκοιλιακά προς τον νεφρό) Επινεφρίδιο: 1) φλοιός: ενδιάμεσο μεσόδερμα 2) μυελός: νευρική ακρολοφία Γονάδες: από μεσέγχυμα και υπερκείμενο κοιλωματικό επιθήλιο Γεννητική ακρολοφία

119 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας καταβολή ποδιού (3d) ΑΚΡΑ: από μεσόδερμα πλευρικού πετάλου και υπερκείμενη επιδερμίδα του

120 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας επιμήκυνση 4d: διαφοροποίηση (από το κέντρο προς τη περιφέρεια ) Καταβολές Ε-Ο άκρων: Πτέρυγες - Πόδια

121 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας

122 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας 9d

123 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας

124 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας

125 Περιγραφή της οργανογένεσης στο έμβρυο της όρνιθας

126 ΣΥΝΟΨΗ (1) Το έμβρυο της όρνιθας είναι αμνιωτό Μορφολογία παρόμοια με θηλαστικά (2) Πρώιμη ανάπτυξη: = επίπεδο βλαστόδερμα Αρχική λωρίδα: επάγεται στο οπίσθιο όριο και επιμηκύνεται προς το εμπρόσθιο Γαστριδίωση: διαρκής κυτταρική μετακίνηση μέσω της αρχικής λωρίδας. (3) Εξω-εμβρυικές μεμβράνες: Λεκιθικός σάκος-χόριο-άμνιο-αλλαντοίδα: Υποστήριξη εμβρύου με οξυγόνο και θρεπτικά υλικά (4) Χάρτης πεπρωμένου: ο ΕΟ άξονας αρχικής λωρίδας αντιστοιχεί στο μεσοπλευρικό άξονα του πρωτογενούς αρχιτεκτονικού σχεδίου του σώματος (5) Επαγωγικές αλληλεπιδράσεις κατά τη γαστριδίωση εν μέρει συγκρίσιμες με αυτές του Xenopus (6) Ασυμμετρία εμβρύου στον άξονα ΔΑ, βασίζεται στην έκφραση των γονιδίων nodal και pitx2 στην αριστερή πλευρά του εμβρύου (7) Το έμβρυο της όρνιθας είναι πολύ σημαντικό για τη μελέτη της οργανογένεσης