ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

Transcript

1 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ «ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ» ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΝΥΧΑΣ 1

2 Περιεχόμενα Σελίδα Εργαστηριακή άσκηση 1 2 Εργαστηριακός εξοπλισμός, μέθοδοι αποστείρωσης Εργαστηριακή άσκηση 2 7 Παρασκευή θρεπτικών υλικών Εργαστηριακή άσκηση 3 13 Προσδιορισμός μικροβιακού φορτίου Εργαστηριακή άσκηση 4 17 Τεχνικές απομόνωσης αποικιών Εργαστηριακή άσκηση 5 20 Χρώση κυττάρων κατά Gram, μακροσκοπική και μικροσκοπική παρατήρηση Εργαστηριακή άσκηση 6 28 Δοκιμή καταλάσης και οξειδάσης Εργαστηριακή άσκηση 7 33 Ταυτοποίηση μικροοργανισμών με βιοχημικές δοκιμές Εργαστηριακή άσκηση 8 44 Προσδιορισμός της παρεμποδιστικής δράσης φυσικών αντιμικροβιακών ουσιών Εργαστηριακή άσκηση 9 47 Μοριακές τεχνικές στη μικροβιολογία τροφίμων 2

3 ΑΣΚΗΣΗ 1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗΣ Α. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Σε ένα μικροβιολογικό εργαστήριο χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές, συσκευές και υλικά έτσι ώστε να είναι δυνατή η απομόνωση, καλλιέργεια και ταυτοποίηση των μικροοργανισμών. Επειδή ο προσδιορισμός των βιολογικών και βιοχημικών ιδιοτήτων των μικροοργανισμών απαιτεί καθαρές καλλιέργειες, οι μέθοδοι και τα υλικά που εφαρμόζονται στη μελέτη των μικροβίων θα πρέπει να διατηρούν την καθαρότητα της υπό εξέταση καλλιέργειας και να εμποδίζουν την επιμόλυνση. Γι αυτό τον λόγο, όλα τα υλικά που χρησιμοποιούνται αποστειρώνονται ενώ κάθε μικροβιολογική ανάλυση ή μεταχείρηση θα πρέπει να διεξάγεται κάτω από ασηπτικές συνθήκες. Αυτό επιτυγχάνεται με την χρήση του λύχνου Bunsen. Ο χώρος όπου λαμβάνει χώρα κάθε μικροβιολογική τεχνική μπορεί να είναι ο μικροβιολογικός πάγκος ή ο θάλαμος νηματικής ροής (laminar flow). Η αρχή λειτουργίας αυτού του θαλάμου είναι ότι καθοδικά ρεύματα αέρα μέσα δεν επιτρέπουν την έξοδο μικροοργανισμών προς το περιβάλλον κι αντίστροφα. Πριν από κάθε μικροβιολογική ανάλυση θα πρέπει να λαμβάνονται υπ όψη τα εξής: Φοράμε πάντα εργαστηριακή ποδιά. Καθαρίζουμε προσεκτικά τον χώρο όπου θα δουλέψουμε με 70% αιθανόλη. Χρησιμοποιούμε αποστειρωμένα γάντια ή πλένουμε τα χέρια μας προσεκτικά. Ανάβουμε τον λύχνο Bunsen. Μερικά από τα υλικά και συσκευές που χρησιμοποιούνται κατά την μικροβιολογική ανάλυση είναι τα παρακάτω: i). Μικροβιολογικός κρίκος: Χρησιμοποιείται για την μεταφορά αποικίας ή υγρής καλλιέργειας από ένα θρεπτικό υλικό σε ένα άλλο. ii). Δοκιμαστικοί σωλήνες: Χρησιμοποιούνται για την διατήρηση υγρών και στερεών θρεπτικών υλικών ή άλλων αντιδραστηρίων. iii). Τρυβλία: Χρησιμοποιούνται για την επίστρωση των στερεών θρεπτικών υλικών iv). Eppendorfs: Είναι μικροί πλαστικοί σωλήνες χωρητικότητας 1,5 ml. 3

4 v). Πιπέττες:. Mπορεί να είναι ρυθμιζόμενου ή σταθερού όγκου. Λαμβάνουν όγκο από 1μl εως 1000μl. Στις πιπέττες προσαρμόζονται ειδικοί υποδοχείς που ονομάζονται tips και χρησιμοποιούνται για την μεταφορά όγκου. Υπάρχουν σε δύο μεγέθη. Τα μικρά tips προσαρμόζονται στην πιπέττα των 100μl ή μικρότερου όγκου και τα μεγάλα tips που προσαρμόζονται στην πιπέττα των 1000μl. vi). Κλίβανοι: Χρησιμοποιούνται για την επώαση τρυβλίων σε κάποια επιθυμητή θερμοκρασία. vii). Υδατόλουτρα: Είναι σαν κλίβανοι με την διαφορά ότι θερμαίνονται με νερό και χρησιμοποιούνται κυρίως για την διατήρηση ενός στερεού θρεπτικού υλικού στην ρευστή του μορφή. viii). Φυγόκεντρος:Χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό στερεών ή υγρών δειγμάτων διαφορετικών πυκνοτήτων. ix). Σπεκτοφωτόμετρο: Χρησιμοποιείται για την μέτρηση οπτικής ικανότητας ή για τον προσδιορισμό ενζυμικών προϊόντων. x). Αποστείρωση: Χρησιμοποιέται για την αποστείρωση διάφορων υλικών. xi). Stomacher: χρησιμοποιείται για την ομογενοποίηση στερεού δείγματος που έχει διαλυθεί σε ένα αραιωτικό διάλυμα. xii). Ζυγός - Πεχάμετρο - Μικροσκόπιο. Β. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗΣ Η διαδικασία της αποστείρωσης γίνεται έτσι ώστε τα θρεπτικά υλικά και όλα τα άλλα μέσα εργαστηριακού εξοπλισμού που θα χρησιμοποιηθούν για τον εμβολιασμό ή για τον προσδιορισμό των φυσικοχημικών και βιολογικών ιδιοτήτων των μικροοργανισμών, να μην έχουν κανένα ζωντανό κύτταρο ή βιώσιμο σπόριο. Οι φυσικές μέθοδοι αποστείρωσης που εφαρμόζονται συχνά σε ένα εργαστήριο μικροβιολογίας είναι οι παρακάτω: 1) Αποστείρωση με θέρμανση: Η θερμότητα αποτελεί το πιο αποτελεσματικό και ασφαλές μέσο αποστείρωσης. Η αποστειρωτική της δράση οφείλεται στη μετουσίωση των μικροβιακών αμινοξέων και νουκλεοξέων. Επίσης, σημαντικά επιζήμια είναι η επίδραση της θερμότητας στα λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών. Οι τύποι της αποστείρωσης με θέρμανση είναι: α). Υγρή αποστείρωση(moist heat). Αφορά έκθεση των υλικών σε υπέρθερμο ατμό θερμοκρασίας 120 ο C. Η πιο ευρείας χρήσης συσκευή για την υγρή αποστείρωση είναι το αυτόκαυστο (autoclave). Υπάρχουν διάφοροι τύποι αυτόκαυστων ανάλογα με την χωρητικότητά τους και τον βαθμό ελέγχου της θερμοκρασίας και πίεσης. Ένα τυπικό παράδειγμα αυτόκαυστου αποτελεί η οικιακή χύτρα ενώ ο τύπος που περιγράφεται στο 4

5 σχήμα 1 είναι ένα αυτόκαυστο με πλήρες μηχανισμό αυτοματισμού και ελέγχου. Χρησιμοποιείται για την αποστείρωση μεταλικών ή γυάλινων υλικών και σχεδόν όλων των υγρών και στερεών θρεπτικών υποστρωμάτων. Η βασική αρχή λειτουργίας της στηρίζεται στην ανάπτυξη υπερθέρμου ατμού με ταυτόχρονη αύξηση της πίεσης. Ο αέρας στο εσωτερικό του αυτόκαυστου είναι κατά δύο φορές πιο βαρύς από τον ατμό σε θερμοκρασία αποστείρωσης (121 ο C). Αφού ο αέρας και ο ατμός δεν αναμειγνύονται, η διαφορά της θερμοκρασίας μεταξύ του πάνω και κάτω στρώματος είναι μεγάλη με αποτέλεσμα να δημιουργηθεί μία επίστρωση στο εσωτερικό του αυτόκαυστου Έτσι θα πρέπει να αντικατασταθεί όλος ο αέρας με ατμό. Αυτό επιτυγχάνεται όταν και η βαλβίδα διαφυγής του ατμού είναι ανοιχτή κι έτσι το εξερχόμενο ρεύμα ατμού, κάτω από μεγάλη πίεση, είναι ικανό να απομακρύνει τον αέρα από το εσωτερικό χώρο του αυτόκαυστου. Η υγρή αποστείρωση λειτουργεί συνήθως σε 15lb/in 2 πίεση σε θερμοκρασία 121 ο C και αποστειρώνει σε λεπτά, ανάλογα με την σχέση επιφάνεια-όγκος. β). Ξηρή αποστείρωση (dry heat). Χρησιμοποιείται όταν η μέθοδος της υγρής αποστείρωσης δεν ενδείκνυται. Σχήμα 1. Βασική δομή ενός αυτόκαυστου. 5

6 2. Ακτινοβολία: Χρησιμοποιείται μή ιονίζουσα και ιονίζουσα ακτινοβολία. Στην πρώτη ανήκουν οι υπεριώδεις ακτίνες. Σε μήκος κύματος γύρω στα 260nm το φάσμα απορρόφησης του DNA είναι μέγιστο κι έτσι η αντιμικροβιακή δράση του υπεριώδους φωτός που παρατηρείται είναι κι αυτή μέγιστη. Έχουν μικρή διεισδυτική ικανότητα με εξαίρεση την χαλαζιακή ύαλο, ενώ εφαρμόζονται για την απολύμανση του αέρα σε κλειστούς χώρους. Οι ιονίζουσες ακτινοβολίες (ακτίνες Χ, ακτίνες γ και καθοδικές ακτίνες) έχουν μεγαλύτερη διεισδυτική ικανότητα και χρησιμοποιούνται για την αποστείρωση κυρίως προσυσκευασμένων υλικών εργαστηριακής χρήσεως (μικροβιολογικοί κρίκοι, σύριγγες, τρυβλία κ.α.) 3. Διήθηση(filtration): Χρησιμοποιείται για την αποστείρωση υγρών θρεπτικών υλικών που περιέχουν ευαίσθητα στην θέρμανση συστατικά, όπως βιταμίνες, αντιβιοτικά και πρωτεΐνες του ορρού. Στο σχήμα 2 φαίνεται μία συσκευή διήθησης. Το υγρό θρεπτικό υλικό περνάει μέσα από ηθμό με μέγεθος πόρων 0,45μm με τη βοήθεια κενού και συλλέγεται σε αποστειρωμένη φιάλη. Σχήμα 2. Συσκαυή διήθησης με φίλτρο 6

7 ΑΣΚΗΣΗ 2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Α. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται όταν οι συνθήκες που επικρατούν γύρω από το μικροπεριβάλλον τους (υπόστρωμα) είναι ιδανικές για τον πολλαπλασιασμό τους. Στην πράξη, η απομόνωση, διατήρηση και πολλαπλασιασμός των μικροοργανισμών επιτυγχάνεται σε θρεπτικά υποστρώματα τα οποία ονομάζουμε αλλοιώς σαν θρεπτικό υλικό - υλικά (medium - media). Τα θρεπτικά υλικά μπορεί να είναι φυσικά ή συνθετικά. Τα φυσικά θρεπτικά υλικά (natural substrates) μπορεί να είναι τεμάχια ιστών (φυτικών ή ζωικών) ή εκκρίσεις αυτών (π.χ. εκχυλίσμα από κρέας) και χρησιμοποιούνται ως έχουν. Τα συνθετικά ή τεχνικά υλικά (synthetic media) αποτελούνται από διάφορες χημικές ουσίες που διαπιστωμένα είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Στις περιπτώσεις αυτές η σύνθεση τους είναι απόλυτα ακριβής και καθορισμένη. Ένας από τους κύριους παράγοντες που επηρεάζει ή καθορίζει τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών είναι και τα θρεπτικά συστατικά του υποστρώματος. Έτσι, το υπόστρωμα που θα αναπτυχθούν οι μικροοργανισμοί θα πρέπει να περιέχει όλα τα θρεπτικά συστατικά τα οποία τους είναι απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό τους και δεν μπορούν τα ίδια να συνθέσουν. Επίσης, το ph των θρεπικών υλικών θα πρέπει να είναι κοντά σε ουδέτερη τιμή για να επιτευχθεί η άριστη ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Γενικά, τα θρεπτικά υποστρώματα πρέπει να περιλαμβάνουν τα εξής συστατικά για την αύξηση των μικροοργανισμών: 1) Μία ή περισσότερες πηγές άνθρακα (carbon source): Σχεδόν όλοι οι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα τους μονο- και δισακχαρίτες και σπανιότερα ολιγοσακχαρίτες και πολυσακχαρίτες. Σημαντικότερη πηγή άνθρακα αποτελεί η γλυκόζη. 2) Μία πηγή αζώτου (nitrogen source): η οποία μπορεί να είναι οργανική ή ανόργανη. Η ανόργανη πηγή αζώτου περιλαμβάνει αμμωνιακά άλατα και αμμωνία. Στην οργανική πηγή αζώτου ανήκουν οι πρωτεΐνες (πεπτόνη, τρυπτόνη). 3) Βιταμίνες: όπως η βιοτίνη, παντοθενικό οξύ, θειαμίνη, ριβοφλαβίνη, νιασίνη κ.α. και χρησιμοποιούνται ως δομικά συστατικά διάφορων ενζύμων. Γενικά, οι μικροοργανισμοί έχουν ανάγκη από ορισμένες βιταμίνες από είδος σε είδος και κυρίως από υδατοδιαλυτές 7

8 βιταμίνες. 4) Ανόργανα άλατα: Σημαντικά είναι τα φωσφορικά άλατα τα οποία είναι απαραίτητα για τη φωσφορυλίωση των ενδιάμεσων σταδίων της γλυκόλυσης. Επίσης, απαραίτητα για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών είναι τα άλατα του νατρίου, καλίου, ασβεστίου και μαγνησίου. Ορισμένα ανόργανα συστατικά επηρεάζουν την περατότητα της κυτταρικής μεμβράνης ενώ άλλα παίζουν μεγάλο ρόλο στη σύνθεση διάφορων μεταβολιτών ή τοξινών. 5) Ιχνοστοιχεία: Ο σίδηρος, χαλκός, μαγγάνιο, ψευδάργυρος, κοβάλτιο και μολυβδαίνιο είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη ορισμένων μικροοργανισμών. Τα θρεπτικά υποστρώματα μπορεί να είναι υγρά (broths- liquid media) ή στερεά (solid media). Για την παρασκευή στερεού θρεπτικού υλικού πρέπει να χρησιμοποιηθεί ένας πηκτικός παράγοντας. Το πιο συνηθισμένο πηκτικό συστατικό που χρησιμοποείται σε ολα τα εργαστήρια μικροβιολογίας είναι το άγαρ (agar). Το συστατικό αυτό προέρχεται από την εκχύλιση ορισμένων φυκών (ροδοφύκη). Είναι ένας ουδέτερος υδατάνθρακας (πολυμερισμένη γαλακτόζη μέσω του β-1:3 γλυκοζιτικού δεσμού, περιέχει δε θειικό οξύ που είναι εστεροποιημένο στο έκτο υδροξύλιο της γαλακτόζης) ο οποίος έχει πολύ ενδιαφέρουσες υδροφιλικές κολλοειδείς ιδιότητες. Το άγαρ κυκλοφορεί στο εμπόριο σε μορφή σκόνης και παρουσιάζει τις παρακάτω ιδιότητες: 1) Είναι ουδέτερο συστατικό και δεν επιδρά αρνητικά ή θετικά στην φυσιολογία του μικροοργανισμού (δεν αφομειώνεται ούτε είναι παρεμποδιστικός παράγοντας αύξησης). 2) Δεν υδρολύεται από τους μικροοργανισμούς. 3) Χρησιμοποιείται συνήθως σε περιεκτικότητα 1,2-1,5%. Η χρήση του σε μεγαλύτερη περιεκτικότητα έχει σαν αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της ανάπτυξης των μικροοργανισμών λόγω της μείωσης της ενεργότητας του νερού. 4) Ρευστοποιείται σε βραστό νερό ενώ σε θερμοκρασία 40 ο C ή κατώτερη ζελοποιείται. 5) Παραμένει ρευστό σε θερμοκρασία >45 ο C. Όταν χρησιμοποιείται για εμβολιασμό πρέπει να βρίσκεται σε θερμοκρασία ο C, μία θερμοκρασία όπου οι περισσότεροι μικροοργανισμοί αντέχουν. Ένα άλλο συστατικό που χρησιμοποιείται για την παρασκευή στερεών θρεπτικών υλικών είναι η ζελατίνη και έχει τα εξής μειονεκτήματα σε σχέση με το άγαρ: 1) Προστίθεται σε μεγαλύτερη περιεκτικότητα (12-15%). 2) Ρευστοποιείται σε θερμοκρασία >25 ο C. 3) Επηρεάζεται από το χαμηλό ph και συνχά υδρολύεται απο τα πρωτεολυτικά ένζυμα των μικροοργανισμών. Έτσι, ο συνδιασμός χαμηλού ph και μεγάλης θερμοκρασίας μπορεί να προκαλέσει υδρόλυση. 8

9 Εκτός από την ζελατίνη, σε μερικές περιπτώσεις χρησιμοποιείται το κολλοειδές πυρίτιο (silica gel) εναλλακτικά από το άγαρ, ιδιαίτερα για την μελέτη της φυσιολογίας των μικροοργανισμών σχετικά με τις απαιτήσεις τους σε πηγή ανθρακα. Τα θρεπτικά υποστρώματα διακρίνονται σε γενικά (μη επιλεκτικά) και σε εξειδικευμένα υποστρώματα. Τα γενικά υποστρώματα (complex media) περιέχουν όλα τα απαραίτητα συστατικά για την ανάπτυξη όλων σχεδόν των μικροοργανισμών. Τα συστατικά αυτών των υλικών βρίσκονται σε ακατέργαστη μορφή, δηλαδή δεν είναι γνωστό ποιά συγκεκριμένα είναι αυτά τα συστατικά και σε τι ποσότητα. Τα περισσότερα συστατικά στα γενικά υποστρώματα προέρχονται από την ενζυμική διάσπαση διάφορων φυτικών και ζωϊκών ιστών, καζεΐνης και κυττάρων ζύμης τα οποία παρέχουν πλούσιες πηγές πολυπεπτίδιων, αμινοξέων, βιταμινών ή αλάτων. Παράδειγμα τέτοιου υλικού αποτελεί το Nutrient broth ή agar το οποίο αποτελείται από εκχύλισμα κρέατος και πεπτόνη. Το εκχύλισμα κρέατος περιέχει όλες τα υδατοδιαλυτά συστατικά που βρίσκονται στο κρέας, ενώ η πεπτόνη περιέχει μείγμα αμινοξέων, υδατανθράκων, αλάτων και πολυπεπτιδίων. Τα εξειδικευμένα υποστρώματα είναι εκείνα που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση συγκεκριμένων κατηγοριών (οικογένεια, γένος, είδος) μικροοργανισμών. Άρα η σύνθεση τους ενεργεί παρεμποδιστικά στην ανάπτυξη των άλλων μικροοργανισμών. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τους εξής τρόπους: α) με την δίορθωση του ph στο θρεπτικό υπόστρωμα. Ένα τέτοιο παράδειγμα αποτελεί το θρεπτικό υλικό ΜRS Αgar Base (de Man, Rogosa and Sharpe). To ph αυτού του υλικού είναι 5,7 και χρησιμοποιείται για την απαρίθμηση και απομόνωση των γαλακτικών βακτηρίων. Διόρθωση του ph θα έχει σαν αποτέλεσμα την απομόνωση συγκεκριμένων ομάδων και ειδών που ανήκουν στην οικογένεια των γαλακτικών βακτηρίων (πίνακας 1). β) προσθήκη αντιβιοτικών, που αναστέλουν την δράση των μη επιθυμητών μικροοργανισμών (πίνακας 2). γ) προσθήκη ουσιών που επιτρέπουν την διαφοροποίηση διαφορετικών αποικιών μεταξύ τους (πίνακας 3). 9

10 Πίνακας 1. Μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται σε τροποποιημέμο MRS Agar Base. ph διορθωμένο Μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται 8 Carnobacterium spp. 7 Streptococci <5,7 Οξυάντοχα γαλακτικά βακτήρια <5,7 Ζύμες Πίνακας 2. Εξειδικευμένα υποστρώματα που περιέχουν αντιβιοτικά. Υλικό Αντιβιοτικό Μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται Pseudomonas Agar Base Cetrimide Fusidin Cephaloridine Pseudomonads STAA Agar Base Streptomycin sulphate Thallous Acetate Cycloeximide Brochothrix thermosphacta Rose bengal Agar Base Chloramphenicol Ζύμες και Μύκητες 10

11 Πίνακας 3: Εξειδικευμένα υποστρώματα που περιέχουν συγκεκριμένες ουσίες. Υλικό Ουσία Μικρ/σμοι που αναπτύσσονται Μορφολογία αποικιών Violet Bile Salt Dextrose Agar Base Crystal violet Bile salts Enterobacteriaceae Μωβ αποικίες με δακτύλιο Baird-Parker Agar Base Εgg-yolk emulsion Staphylococcus aureus Μicrococcoi Mαύρες αποικίες με δακτύλιο Μαύρες αποικίες χωρίς δακτύλιο Plate Count Agar Base Skim milk powder Πρωτεολυτικοί Λευκές-υποκίτρινες Τributyrin Agar Base Glycerol tributyrate Λιπολυτικοί Αποικίες με δακτύλιο Τα εξειδικευμένα υποστρώματα χωρίζονται σε δυό κατηγορίες: A) Επιλεκτικά (elective): Ονομάζονται εκείνα τα υποστρώματα που ικανοποιούν τις θρεπτικές απαιτήσεις ενός ή περισσοτέρων ομάδων βακτηρίων χωρίς να παρεμποδίζουν τελείως άλλες ομάδες. B) Εκλεκτικά (selective): Ονομάζονται εκείνα τα υποστρώματα που περιέχουν ένα ή περισότερους παρεμποδιστικούς παράγοντες οι οποίοι παρεμποδίζουν την ανάπτυξη άλλων ομάδων μικροοραγνισμών, αλλά επιτρέπουν την ανάπτυξη στην ομάδα που επιθυμούμε να απομονώσουμε. 11

12 Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Παρασκευή γενικού στερεού θρεπτικού υλικού 1. Σε μία φιάλη του 1lt ζυγίστε 22,5g Plate Count Agar Base (Merck). Σε ογκομετερικό κύλινδρο μετρείστε 1000 ml απεσταγμένο νερό (dh 2 O 2 ) και αποχύστε στην φιάλη με την σκόνη. 2. Ανάδευση του υλικού σε μαγνητικό αναδευτήρα υπό θέρμανση έτσι ώστε να διαλυθεί το άγαρ. 3. Αποστείρωση στους 121 ο C για 15 λεπτά. 4. Μετά την αποστείρωση κρυώστε το υλικό μέχρι τους 45 ο C. 5. Αναδεύστε ήπια το υλικό ώστε να ομογενοποιηθεί το άγαρ σε όλη τη μάζα του υλικού. 6. Κάτω από ασηπτικές συνθήκες, μοιράστε το υλικό σε τρυβλία (petri dishes), περίπου 15 ml σε κάθε τρυβλίο 7. Ανοίξτε τα καπάκια από τα τρυβλία ώστε να φύγει η υγρασία. 8. Κλείστε τα τρυβλία και μπορείτε να τα αποθηκεύσετε στους 3-5 ο C μέχρι την επόμενη εργαστηριακή άσκηση. Παρασκευή επιλεκτικού στερεού θρεπτικού υποστρώματος 1. Σε μία φιάλη των 500 ml ζυγίστε 33,1g MRS Agar Base (Merck). Σε ογκομετερικό κύλινδρο μετρείστε 500 ml απεσταγμένο νερό (dh 2 O 2 ) και αποχύστε στην φιάλη με την σκόνη. 2. Αναδεύστε το υλικό σε μαγνητικό αναδευτήρα. 3. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 ο C για 15 λεπτά. 4. Αποθηκεύστε τις φιάλες μέχρι την επόμενη εργαστηριακή άσκηση. 12

13 ΑΣΚΗΣΗ 3 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ Την πιο συνηθισμένη μέθοδο προσδιορισμού του μικροβιακού φορτίου ενός προϊόντος αποτελεί η απαρίθμηση των αποικιών (colony count) που σχηματίζονται σε εμβολιασμένο στερεό θρεπτικό υλικό. Στηρίζεται στη θεωρία ότι ένα βακτηριακό κύτταρο ή μία ομάδα κυττάρων δημιουργούν μία αποικία. Έτσι, ο αριθμός των αποικιών που αναπτύσσονται σε ένα ήδη εμβολιασμένο θρεπτικό υλικό, αντιπροσωπεύει τον πραγματικό μικροβιακό πληθυσμό. Για πρακτικούς λόγους, η απαρίθμηση των αποικιών εκφράζεται ως μονάδα σχηματιζόμενων αποικιών (colony forming units, cfu). Επειδή, κάθε καλλιέργεια μικροοργανισμών ή τρόφιμο μπορεί να περιέχει από χίλια εώς εκατοντάδες εκατομμύρια βακτηριακά κύτταρα ανά όγκο, ο προσδιορισμός του μικροβιακού φορτίου χρειάζεται μία διαδικασία διαχωρισμού των βακτηρίων, ώστε όταν καλλιεργηθούν σε ένα στερεό θρεπτικό υλικό, να σχηματίζουν μεμωνομένες και ευκρινείς αποικίες. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται διαδικασία διαδοχικών αραιώσεων (σχήμα 1). Σχήμα 1: Βήματα των διαδοχικών αραιώσεων food Ο εμβολιασμός ενός βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα γίνεται με δύο ποσοτικές τεχνικές: με την τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης και με την τεχνική της ενσωμάτωσης. Η τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης (spread plate technique) αφορά την εξάπλωση γνωστού όγκου βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό 13

14 θρεπτικό υλικό. Εφαρμόζεται, γενικά, στους αερόβιους μικροοργανισμούς. Η τεχνική της ενσωμάτωσης (pour plate technique) αποτελείται από τα εξής στάδια: α) τοποθέτηση γνωστού όγκου βακτηριακού εναιωρήματος σε τρυβλίο και β) απόχυση θρεπτικού υλικού που περιέχει άγαρ και είναι σε θερμοκρασία ο C (ρευστή κατάσταση). Αυτή η τεχνική εφαρμόζεται στους μικροαερόφιλους και προαιρετικά αναερόβιους μικροοργανισμούς. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά 1. Δοκιμαστικοί σωλήνες με 9 ml ορρού Ringer. Το τελευταίο χρησιμοποιείται ως αραιωτικό μέσο. 2. Πιπέττα του 1 ml και τα αντίστοιχα tips. 3. Πιπέττα του 0,1ml και τα αντίστοιχα tips. 4. Μικροβιολογικό τριγωνάκι 5. Ποτήρι ζέσεως με 95% αλκοόλη για την αποστείρωση του μικροβιολογικού τριγωνάκι 6. Τρυβλία 7. Ποτήρι για την τοποθέτηση των χρησιμοποιούμενων tips. 8. Τα θρεπτικά υλικά της προηγούμενης άσκησης. 9. Λύχνος Bunsen. Διαδικασία Θα σας δωθεί υγρό τρόφιμο. Ο αρχικός πληθυσμός του τροφίμου θεωρείται ότι είναι γνωστός και εκτιμάται σε 10 8 cfu/ml. *Στην περίπτωση που το τρόφιμο είναι στερεό, η διαδικασία τροποποιείται ως εξής: ζυγίζετε ασηπτικά μέσα σε στείρα σακούλα Stomacher, 25 g του τροφίμου, χρησιμοποιώντας λαβίδα και νυστέρι τα οποία έχουν στειρωθεί με τη βοήθεια της αλκοόλης και της φλόγας. Στη συνέχεια προσθέτετε 225 ml Ringer (ασηπτικά), ώστε η αραίωση του τροφίμου να είναι 1/10. Τοποθετείτε τη σακούλα στον ομογενοποιητή Stomacher για 1min. Η σακούλα πλέον περιέχει την πρώτη αραίωση του τροφίμου. Πριν από την εκτέλεση της εργασίας θα πρέπει να: 1. Λυώστε το στερεό θρεπτικό υλικό (Agar Base) σε φούρνο μικροκυμάτων (θερμοκρασία απόψυξης για 20 λεπτά). Κρυώστε σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 45 ο C. 2. Σημειώσετε τους δοκιμαστικούς σωλήνες και τα τρυβλία που θα χρησιμοποιήσετε με τις απαραίτητες αραιώσεις. 14

15 Παρασκευή διαδοχικών αραιώσεων 1. Θα κάνετε 8 διαδοχικές αραιώσεις, δηλ. μέχρι την Σημειώστε τους δοκιμαστικούς σωλήνες με το Ringer από 10-1 εώς Ο κάθε αριθμός στον δοκιμαστικό σωλήνα αντιπροσωπεύει την αντίστοιχη αραίωση. 3. Παρασκευάστε διαδοχικές αραιώσεις με μεταφορά 1 ml δείγματος ή προηγούμενης αραίωσης σε 9 ml ορρού Ringer. 4. Διατηρείστε ασηπτικές συνθήκες. Γι αυτό το λόγο, κάθε φορά που ανοίγετε τον δοκιμαστικό σωλήνα, περάστε το στόμιο του από το λύχνο Bunsen. Κάντε το ίδιο κάθε φορά που κλείνετε. 5. Μετά από κάθε αραίωση τοποθετώ καθαρό tip στην πιπέττα. Tεχνική της επιφανειακής επίστρωσης 1. Θα χρησιμοποιήσετε δύο τρυβλία γενικού θρεπτικού υλικού (π.χ. PCA) για την αραίωση 10-5, δύο τρυβλία PCA για την 10-6 και δύο τρυβλία PCA για την 10-7 αραίωση. 2. Σημειώστε στο κάτω μέρος και στις άκρες του τρυβλίου το όνομα σας ή τα αρχικά σας, την ημερομηνία και την αραίωση που θα εμβολιάσεται. 3. Πάρτε 0,1 μl από την 10-7 αραίωση και εμβολιάστε τα τρυβλίο με την αντίστοιχη αναγραφόμενη αραίωση. 4. Τοποθετείστε το τριγωνάκι στο ποτήρι ζέσεως με 95% αλκοόλη. Περάστε το από την φλόγα του λύχνου Bunsen. Απομακρύνετε αμέσως και διατηρήστε το τριγωνάκι σε μία κάθετη θέση για μερικά δευτερόλεπτα ώστε να σβήσει η φωτιά. ΠΡΟΣΟΧΗ: ΜΗΝ ΤΟΠΟΘΕΤΕΙΣΤΕ ΤΟ ΦΛΕΓΟΜΕΝΟ ΤΡΙΓΩΝΑΚΙ ΜΕΣΑ ΣΤΟ ΠΟΤΗΡΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΚΟΟΛΗ. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΦΩΤΙΑΣ ΜΕΙΝΕΤΕ ΨΥΧΡΑΙΜΟΙ. ΣΚΕΠΑΣΤΕ ΤΗ ΦΩΤΙΑ ΜΕ ΕΝΑ ΚΑΠΑΚΙ ΑΠΟ ΤΡΥΒΛΙΟ ΚΑΙ KAΛΕΣΤΕ ΤΟΝ ΥΠΕΥΘΥΝΟ. 5. Ανοίξτε το τρυβλίο και κρατήστε το καπάκι. Μην το αφήνετε στον πάγκο! 6. Κρυώστε το τριγωνάκι σε μία περιοχή του θρεπτικού υποστρώματος που δεν έχει εμβόλιο. Εξαπλώστε το βακτηριακό εναιώρημα σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού υλικού κάνοντας κυκλικές κινήσεις. Κλείστε το τρυβλίο με το καπάκι του. 7. Επαναλάβετε τα στάδια 3 εως 6 για την 10-6 και 10-5 αραίωση. 8. Αναποδογυρίστε τα τρυβλία και επωάστε τα σε κλίβανο κατάλληλης θερμοκρασίας (π.χ. για PCA: 25 o C για 2-5 ημέρες). Τεχνική της ενσωμάτωσης 1. Θα χρησιμοποιήσετε δύο τρυβλία για την αραίωση 10-8, δύο τρυβλία για την 10-7 και δύο τρυβλία για την 10-6 αραίωση. 15

16 d 1 C 2 είναι το συνολικό άθροισμα των αποικιών στα n 2 τρυβλία της επόμενης 2. Σημειώστε στο κάτω μέρος και στις άκρες του τρυβλίου το όνομα σας ή τα αρχικά σας, την ημερομηνία και την αραίωση που θα εμβολιάσεται. 3. Τοποθετείστε 1ml από την 10-8 αραίωση στα τρυβλία με την αντίστοιχη αναγραφόμενη αραίωση. 4. Επαναλάβετε ομοίως για την 10-7 και 10-6 αραίωση μεταφέροντας στα τρυβλία με την αντίστοιχη αναγραφόμενη αραίωση. 5. Αποχύστε ποσότητα MRS στα τρυβλία με το εμβόλιο. 6. Αναδεύστε ήπια. Δεν πρέπει να διαφύγει υλικό έξω από το τρυβλίο ή να καλύψει το καπάκι του. 7. Αφού πήξει το υλικό επαναλάβετε το στάδιο 5, προσθέτοντας τόση ποσότητα ώστε να καλυφθεί η επιφάνεια του τρυβλίου. ΜΗΝ ΑΝΑΔΕΥΕΤΕ. 8. Μετά την πήξη του υλικού, αναποδογυρίστε τα τρυβλία και επωάστε τα σε κλίβανο κατάλληλης θερμοκρασίας (π.χ., για VRBGA: 37 ο C για 24 h). Έκφραση αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εκφράζονται με τον εξής τρόπο: Όπου: Ν = cfu/ml C C N n 1 ( n 2 / 10) V d 1 C 1 είναι το συνολικό άθροισμα των αποικιών (cfu) στα n 1 τρυβλία της αραίωσης αραίωσης V ο όγκος του εμβολίου (ml) 16

17 ΑΣΚΗΣΗ 4 TΕΧΝΙΚΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ Η τεχνική της γραμμωτής ράβδωσης μίας αποικίας (streaking) σε ένα στερεό θρεπτικό υλικό αποτελεί μία από τις σημαντικότερες τεχνικές για την απομόνωση βακτηρίων. Χρησιμοποιείται για την απομόνωση μίας και μόνο αποικίας, ενώ οι συνεχείς διαδικασίες streaking έχουν σαν αποτέλεσμα τον καθαρισμό αυτής της καλλιέργειας (pure culture). Η τεχνική του streaking μπορεί να θεωρηθεί σαν μία διαδικασία αραίωσης κυττάρων σε ένα στερεό θρεπτικό υλικό έτσι ώστε, μετά την επώαση, να σχηματιστούν μεμονωμένες και ευκρινείς αποικίες. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά 1. PCA και MRS τρυβλία επωασμένα από την προηγούμενη άσκηση. 2. Τρυβλία με Νutrient Agar Base για streaking. 3. Μικροβιολογικός κρίκος και λύχνος Bunsen. Α. Streaking από τρυβλίο που εμβολιάστηκε με την τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης. 1. Σημειώστε τα τρυβλιά με το Nutrient Agar Base με τα αρχικά σας, την ημερομηνία και τον μικροοργανισμο που θα καλλιεργήσετε. 2. Από το τρυβλίο του PCA διαλέξτε μία αποικία και σημειώστε τα μορφολογικά της χαρακτηριστικά (μέγεθος, χρώμα,κ.α.). Συμβουλευτείτε το σχήμα 1 για την μακροσκοπική παρατήρηση των αποικιών. 3. Αποστειρώστε τον μικροβιολογικό κρίκο με τη φωτιά του λύχνου Bunsen. 4. Κρυώστε τον μικροβιολογικό κρίκο σε μία άκρη του PCA όπου δεν υπάρχουν αποικίες και πάρτε την αποικία που διαλέξατε. 5. Ανοίξτε το καπάκι του τρυβλίου με το Nutrient Agar, χωρίς να το αφήσετε στον πάγκο και ακολουθήστε τα βήματα που περιγράφονται στο σχήμα 2. 17

18 Β. Streaking από τρυβλίο που εμβολιάστηκε με την τεχνική της ενσωμάτωσης 1. Σημειώστε τα τρυβλιά με το Nutrient Agar Base με τα αρχικά σας, την ημερομηνία και τον μικροοργανισμο που θα καλλιεργήσετε. 2. Από το τρυβλίο του PCA διαλέξτε μία αποικία και σημειώστε τα μορφολογικά της χαρακτηριστικά (μέγεθος, χρώμα,κ.α.) 3. Αποστειρώστε τον μικροβιολογικό κρίκο με τη φωτιά του λύχνου Bunsen. 4. Κρυώστε τον μικροβιολογικό κρίκο σε μία άκρη του MRS όπου δεν υπάρχουν αποικίες. Σκάψτε το υλικό γύρω από την αποικία, ανασηκώστε το και πάρτε την αποικία. 5. Ανοίξτε το καπάκι του τρυβλίου με το Nutrient Agar, χωρίς να το αφήσετε στον πάγκο και ακολουθήστε τα βήματα που περιγράφονται στο σχήμα 1. Σχήμα 1: Οδηγός μορφολογικών χαρακτηριστικών αποικίας 18

19 Σχήμα 2: Διαδικασία streaking 19

20 ΑΣΚΗΣΗ 5 ΧΡΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΤΑ GRAM ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ & ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ Α. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ Ένα από τα σημαντικότερα εργαλεία για τη μελέτη των μικροοργανισμών αποτελεί το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (bright-field microscope). Τα κυριότερα μέρη ενός μικροσκοπίου φαίνονται στο σχήμα 1. Η βασική αρχή λειτουργίας του μικροσκοπίου είναι η εξής: ένας οπτικά συγκεντρωτικός φακός (πυκνωτής) και κατοπτρικός φακός, συνήθως με μία ξεχωριστή πηγή φωτός, προσφέρει φωτισμό στο αντικείμενο προς εξέταση (παρασκεύασμα). Η τελική εικόνα που βλέπει ο παρατηρητής είναι το αποτέλεσμα της συνεργιστικής μεγέθυνσης πρώτα από τον αντικειμενικό φακό και ύστερα από τον προσοφθάλμιο φακό. Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενοι αντικειμενικοί φακοί σε ένα μικροσκόπιο έχουν 10Χ, 40 ή 44Χ και 95 ή 100Χ μεγεθυντικής ικανότητας, ενώ ο προσοφθάλμιος έχει 10Χ. Έτσι, με έναν αντικειμενικό φακό μεγεθυντικής ικανότητας 40Χ και έναν προσοφθάλμιο 10Χ, η ολική μεγέθυνση θα είναι 400Χ. Σχήμα 1: Τα κυριότερα μέρη ενός μικροσκοπίου 20

21 Στόχος της λειτουργίας του μικροσκοπίου είναι να δίνει τη δυνατότητα στον παρατηρητή να διακρίνει δομές και σημεία που διαχωρίζονται μεταξύ τους σε κοντινές και μικρές αποστάσεις. Αυτή η λειτουργία ονομάζεται διακριτική ικανότητα (resolution power). Η διακριτική ικανότητα εξαρτάται: α) από το μήκος κύματος της φωτεινής πηγής, β) από την γωνία ανοίγματος του συστήματος των φακών που χρησιμοποιούνται και γ) από το δείκτη διαθλάσεως του μέσου όπου περνάει το φως πριν εισέλθει στο υπό εξέταση παρασκεύασμα. Η σχέση αυτών των παραγόντων μπορεί να συνδυαστεί με τον παρακάτω τύπο: αριθμητικό άνοιγμα (ΑΑ)=μ ημ θ όπου, μ είναι ο δείκτης διαθλάσεως του μέσου όπου περνάει το φως πριν εισέλθει στον αντικειμενικό φακό και θ το ήμισυ της γωνίας του μέγιστου φωτεινού κώνου που προέρχεται από τον συγκεντρωτικό φακό (πυκνωτής). Το αριθμητικό άνοιγμα αναγράφεται πάνω σε κάθε αντικειμενικό φακό. Μικροσκόπιο με 100Χ αντικειμενικό φακό έχει συνήθως 1,25 αριθμητικό άνοιγμα. Όσο μεγαλύτερο είναι το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού τόσο πιο πολύ αυξάνει η μεγεθυνση κι άρα η διακριτική ικανότητα. Για να επιτευχθεί η καλλύτερη δυνατή διακριτική ικανότητα χρησιμοποιείται ο ελαιοκαταδυτικός φακός. Κατά τη χρήση αυτού του φακού τοποθετείται μία σταγόνα ελαίου καταδύσεως (συνήθως κεδρέλαιο) στο υπό εξέταση παρασκεύασμα και ο ελαιοκαταδυτικός φακός εμβαπτίζεται στο κεδρέλαιο. Η αντικατάσταση του αέρα με κεδρέλαιο αυξάνει το αριθμητικό άνοιγμα του φακού και επομένως βελτιώνει τη διακριτική του ικανότητα. Τέλος, σημαντικό είναι να προσδιοριστεί και η απόσταση που απαιτείται για την εστίαση του παρασκευάσματος. Η απόσταση μεταξύ του παρασκευάσματος και του αντικειμενικού φακού ονομάζεται απόσταση εργασίας (working distance). Όταν η μεγεθυντική ικανότητα αυξάνεται, η απόσταση αυτή μειώνεται. Έτσι, χρειάζεται περισσότερο φως για την ακριβέστερη παρατήρηση του παρασκευάσματος. Στο σχήμα 2 φαίνεται η σχέση μεταξύ της απόστασης εργασίας και της διευθέτησης του διαφράγματος (iris diaphragm) που χρειάζεται ώστε να παρέχει τον καλύτερο φωτισμό του παρασκευάσματος. 21

22 Σχήμα 2: Σχέση μεταξύ της απόστασης εργασίας (working distance) και του διαφράγματος (iris diaphragm). Όσο μικρότερη είναι η απόσταση εργασίας τόσο πιο πολύ πρέπει να ανοιχτεί το διάφραγμα. Β. ΧΡΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΤΑ GRAM Η χρώση κατά Gram ανακαλύφθηκε από τον Δανό επιστήμονα Christian Gram το 1883 και αποτελεί μία από τις σημαντικότερες χρώσεις στην μικροβιολογία. Ανήκει στις λεγόμενες διαφορικές χρώσεις επειδή τα κύτταρα δεν χρωματίζονται κατά τον ίδιο τρόπο. Αποτελεί έναν από τους σημαντικούς ταξινομικούς παράγοντες των μικροοργανισμών. Κι αυτό γιατί, ανάλογα με την αντίδραση που παρουσιάζουν τα βακτήρια στη χρώση Gram διακρίνονται σε δύο μεγάλες ομάδες: α) τα Gram- θετικά και β) τα Gram-αρνητικά βακτήρια. 22

23 Αυτή η διαφοροποίηση οφείλεται στην διαφορετική δομή του κυτταρικού τοιχώματος στις δυο ομάδες βακτηρίων. Για να εφαρμοστεί η χρώση Gram χρειάζονται τέσσερα διαλύματα: μία βασική χρωστική, μία ουσία εδραίωσης, ένα αντιδραστήριο αποχρωματισμού και μία χρωστική αντιθέσεως. Η βασική χρωστική (basic dye) που χρησιμοποιείται κατά το πλείστον στη χρώση Gram είναι το κρυσταλλικό ιώδες (crystal violet) το οποίο έχει ιώδες χρώμα. Bασικές χρωστικές είναι αυτές οι χρωστικές που η χρωματοφόρος τους ρίζα είναι φορτισμένη θετικά. Τα βακτηριακά κύτταρα έχουν ένα αρνητικό φορτίο όταν το ph γύρω από το περιβάλλον τους είναι ουδέτερο. Όταν το αρνητικά φορτισμένο βακτηριακό κύτταρο αντιδράσει με την θετικά φορτισμένη χρωστική τότε το κύτταρο βάφεται με το χρώμα της χρωστικής. Η ουσία εδραίωσης (mordant) είναι μία ουσία που βοηθάει να παραμείνει και να συγκρατηθεί η βασική χρωστική στο βακτηριακό κύτταρο. Συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα ιωδίου (lugol). Έτσι, σχηματίζεται το σύμπλοκο ιώδιο-βασική χρωστική που είναι διαλυτό σε οργανικό διαλύτη. Το αντιδραστήριο αποχρωματισμού (decolorizing agent) είναι οργανικός διαλύτης (συνήθως αλκοόλη) και βοηθάει στην έκπλυση της περίσσειας ή όλης της χρωστικής. Τέλος, η χρωστική αντιθέσεως (counterstain) είναι μία βασική χρωστική διαφορετικού, όμως, χρώματος από την αρχική. Συνήθως, χρησιμοποιείται η σαφρανίνη ή φουξίνη η οποία έχει κόκκινο χρώμα. Έτσι, τα κύτταρα που είχαν βαφεί με την αρχική χρωστική έχουν το αρχικό χρώμα (ιώδες), ενώ τα αποχρωματισμένα κύτταρα βάφονται με το χρώμα της χρωστικής αντιθέσεως (κόκκινα). Η διαφορετική χρώση των κυττάρων των μικροοργανισμών οφείλεται στην διαφορετική δομή του κυτταρικού τοιχώματος των θετικά και αρνητικά κατά Gram βακτηρίων. Μεταχείρηση των κυττάρων πρώτα με το κρυσταλλικό ιώδες και μετά με το διάλυμα ιωδίου έχει σαν αποτέλεσμα τον σχηματισμό συμπλόκου χρωστικής-ιωδίου, ιώδες, σχεδόν μαύρου χρώματος. Αυτό το σύμπλοκο σταθεροποιείται στα θετικά κατά Gram βακτήρια, ακόμα και μετά την έκπλυση με αλκοόλη, λόγω της ύπαρξης παχιάς στρώσης πεπτιδογλυκάνης στο κυτταρικό τους τοίχωμα. Αντίθετα, στα αρνητικά κατά Gram βακτήρια το σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδες-ιωδίου ελευθερώνεται με την έκπλυση με αλκοόλη, λόγω της λεπτής στρώσης της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τους τοιχώματος. 23

24 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ 1. Τρυβλία με streaking από προηγούμενη άσκηση 2. Λύχνος Bunsen 3. Αντικειμενοφόρες πλάκες 4. Μικροβιολογικός κρίκος 5. Διαλύματα για χρώση Gram 6. Μικροσκόπιο Α. Μακροσκοπική παρατήρηση Εξετάστε μακροσκοπικά την μορφολογία της αποικίας σύμφωνα με τον οδηγό του σχήματος 1 της προηγούμενης άσκησης. Β. Χρώση Gram Προετοιμασία παρασκευάσματος 1. Τοποθετείστε μία σταγόνα απεσταγμένου νερού σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα. 2. Αποστειρώστε τον μικροβιολογικό κρίκο κρατώντας τον πάνω από τον λύχνο Bunsen σε γωνία 60ο. 3. Αφήστε να κρυώσει για μερικά δευτερόλεπτα και πάρετε ποσότητα κυττάρων από το τρυβλίο. 4. Αναμείξτε τα κύτταρα με το νερό στην αντικειμενοφόρο πλάκα και εξαπλώστε γύρω από μία μικρή περιοχή της αντικειμενοφόρου πλάκας. 5. Προσηλώστε το παρασκεύασμα με την βοήθεια του λύχνου Bunsen χωρίς, όμως, να το κάψετε. Η προσήλωση προκαλεί αδρανοποίηση των ενζυμικών συστημάτων και σκλήρυνση των κυτταρικών δομών. Χρώση κυττάρων (σχήμα 3) 1. Βάψτε το προσηλωμένο παρασκεύασμα με τη χρωστική του κρυσταλλικού ιώδες για 30sec. 2. Ξεπλύνετε με dh2o. 3. Καλύψτε την αντικειμενοφόρο πλάκα με το διάλυμα ιωδίου και αφήστε να δράσει για 30sec. 4. Ξεπλύνετε με dh2o. 24

25 5. Aποχρωματίστε με 95% αλκοόλη. 6. Ξεπλύνετε με dh2o. 7. Τοποθετείστε τη χρωστική σαφρανίνη για sec. 8. Ξεπλύνετε με dh2o. 9. Στεγνώστε το παρασκεύασμα με την βοήθεια του λύχνου Bunsen. 10. Εξετάστε το παρασκεύασμα στο μικροσκόπιο. Μικροσκοπική παρατήρηση με τον ελαιοκαταδυτικό φακό 1. Τοποθετείστε μία σταγόνα κεδρέλαιου στο παρασκεύασμα. 2. Βάλτε σε λειτουργία το μικροσκόπιο και ανάψτε την φωτεινή πηγή. 3. Τοποθετείστε την αντικειμενοφόρο πλάκα στην τράπεζα. 4. Χρησιμοποιείστε τον ελαιοκαταδυτικό φακό. 5. Με την βοήθεια κοχλία ανασηκώστε την τράπεζα μέχρι να εμβαπτιστεί ο ελαιοκαταδυτικός φακός στο κεδρέλαιο. 6. Κοιτάξτε μέσα από τους προσοφθάλμιους φακούς και εντοπίστε το παρασκεύασμα. 7. Χρησιμοποιείστε το μικρομετρικό για καλύτερη εστίαση. 8. Παρατηρείστε το παρασκεύασμα και σημειώστε τα αποτελέσματά σας σύμφωνα με το σχήμα 4. 25

26 Σχήμα 3: Βήματα χρώσης Gram. 26

27 Σχήμα 4: Μορφολογικά χαρακτηριστικά βακτηριακών κυττάρων 27

28 ΑΣΚΗΣΗ 6 ΔΟΚΙΜΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΚΑΙ ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ Στον αναπνευστικό καταβολισμό τα οργανικά συστατικά οξειδώνονται σε διοξείδιο του άνθρακα μέσω διάφορων οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων, με ταυτόχρονη απελευθέρωση ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρονία μεταφέρονται σε ένα τελικό δέκτη ηλεκρονίων. Αν ο τελικός δέκτης ηλεκτρονίων είναι το οξυγόνο, τότε η διαδικασία αυτή αποτελεί την αερόβια αναπνοή. Αντίθετα, αν ο τελικός δέκτης είναι ένα μη οργανικό συστατικό τότε αυτή η διαδικασία αποτελεί την αναερόβια αναπνοή. Τα μεταβολικά μονοπάτια που παίρνουν μέρος στην αναπνευστική αλυσίδα των μικροοργανισμών είναι η γλυκόλυση (EmbdenMeyerhoff-Parnas) και ο κύκλος του Κrebs (ή TCA cycle). Σε αυτά τα οξειδωτικά μονοπάτια τα ηλεκτρόνια περνάνε από το ένα κυτόχρωμα στο άλλο μέσω της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Σε κάθε στάδιο τα ηλεκτρόνια μεταφέρουν ενέργεια για την φωσφορυλίωση της διφωσφορικής αδενοσίνης (ADP) προς τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤP). Η σημερινή άσκηση αφορά την μελέτη του κυτοχρώματος c και της καταλάσης, δύο ενζύμων που παίρνουν μέρος στην αναπνευστική αλυσίδα των αερόβιων μικροοργανισμών. Δοκιμή της καταλάσης: Η καταλάση είναι ένα ένζυμο που παράγεται από τα περισσότερα βακτήρια και καταλύει την διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο: 2Η2Ο2 2Η2Ο + Ο2 (αφρισμός) Το ένζυμο καταλάση περιέχει την αιμοπορφυρίνη της οποίας η δομή φαίνεται στο σχήμα 1. Αυτή η δομή είναι χαρακτηριστική όχι μόνο για την καταλάση αλλά και για το κυτόχρωμα. Το τελευταίο αποτελεί μέρος της αλυσίδας μεταφοράς των ηλεκτρονίων σε όλους τους αερόβιους μικροοργανισμούς. Αρνητικά ως προς την καταλάση είναι τα περισσότερα αναερόβια βακτήρια, όπως αυτά που ανήκουν στα γένη Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus και Clostridium. 28

29 Σχήμα 1: Δομή της αιμοπορφυρίνης Δοκιμή της οξειδάσης: Με την δοκιμή της οξειδάσης προσδιορίζεται αν ένας μικροοργανισμός μπορεί να οξειδώνει κάποιες αρωματικές αμίνες, όπως την τετραμέθυλη τετραμέθυληπαρά-φαινυλενεδιαμίνη. φαινυλενεδιαμίνη. Αυτή η οξείδωση συσχετίζεται με τη δραστηριότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c μερικών μικροοργανισμών. Η αρωματική αμίνη, η οποία συμπεριφέρεται ως δότης ηλεκτρονίων, δίνει ηλεκτρόνια στην οξειδωμένη μορφή του κυτοχρώματος c. Αυτή η οξειδωμένη ξειδωμένη μορφή παρουσιάζει ένα ιώδες χρώμα (θετική αντίδραση) ενώ η αναγωγική μορφή είναι άχρωμη (αρνητική αντίδραση). Τα βακτήριαο που ανήκουν στο γένος Pseudomonas παρουσιάζουν θετική αντίδραση στην δοκιμή της οξειδάσης, ενώ τα βακτήρια που ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae είναι αρνητικά ως προς την οξειδάση. 29

30 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά 1. Θα σας δωθούν τρυβλία με streaking που προετοιμάσατε σε προηγούμενη άσκηση. 2. Αποστειρωμένες οδοντογλυφίδες 3. Διηθητικό χαρτί 4. Ένα άδειο τρυβλίο 5. Διάλυμα Η2Ο2 10% 6. Aντιδραστήριο οξειδάσης Δοκιμή της καταλάσης 1. Σε ένα άδειο τρυβλίο ρίξτε μερικές σταγόνες Η2Ο2 10%. 2. Κάτω από ασηπτικές συνθήκες, πάρτε ποσότητα κυττάρων από το επωασμένο τρυβλίο με τη βοήθεια οδοντογλυφίδας. 3. Εμβαπτίστε την οδοντογλυφίδα με τα κύτταρα σε μία σταγόνα Η2Ο2. 4. Παρατηρείστε αφρισμό ή όχι και σημειώστε το αποτέλεσμα. Δοκιμή της οξειδάσης 1. Σε ένα άδειο τρυβλίο τοποθετείστε διηθητικό χαρτί και αποχύστε μικρή ποσότητα από το αντιδραστήριο της οξειδάσης. 2. Κάτω από ασηπτικές συνθήκες, πάρτε ποσότητα κυττάρων από το επωασμένο τρυβλίο με τη βοήθεια οδοντογλυφίδας. 3. Εξαπλώστε το δείγμα κυττάρων στην εμποτισμένη περιοχή με οξειδάση 4. Μετά από σχεδόν δευτερόλεπτα, παρατηρείστε την εμβολιασμένη περιοχή για τυχόν αλλαγή χρώματος. 5. Σημειώστε τα αποτελέσματα. 30

31 ΑΣΚΗΣΗ 7 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ Σε προηγούμενη εργαστηριακή άσκηση εξετάσθηκε η μορφολογία των βακτηρίων με τη βοήθεια του μικροσκοπίου και μέρος της φυσιολογίας τους μέσω των δοκιμών της οξειδάσης και της καταλάσης. Η χρώση και η μικροσκοπική παρατήρηση μας παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη δομή του κυττάρου του βακτηρίου και μας επιτρέπουν να εντάξουμε το βακτήριο σε κάποια γενική ομάδα όπως αυτή των βακίλλων ή κόκκων, κατά Gram αρνητική ή θετική. Ωστόσο είναι λίγες οι πληροφορίες που έχουμε ώστε να μπορέσουμε να ταυτοποιήσουμε το μικροοργανισμό που εξετάζουμε και να το εντάξουμε σε συγκεκριμένη οικογένεια, ή/και γένος, ή/και είδος. Προκειμένου να ταυτοποιηθούν τα βακτήρια χρησιμοποιούμε τις βιοχημικές δοκιμές. Mέσω της αντίδρασης των μικροοργανισμών σε αυτές καταγράφεται ένα «αποτύπωμα» χαρακτηριστικό για την κάθε κατηγορία μικροοργανισμών. Μάλιστα κάθε είδος βακτηρίων έχει διαφορετικό μόριο DNA (το οποίο αποτελείται από μία μοναδική αλληλουχία νουκλεοτιδίων). Βασιζόμενοι στην ικανότητα αυτή τα διαφορετικά είδη συνθέτουν και διαφορετικά πρωτεϊνικά ένζυμα, μέσω των οποίων καταλύουν ένα εύρος χημικών αντιδράσεων για τις οποίες είναι ικανός ο κάθε μικροοργανισμός. Με άλλα λόγια, θα μπορούσαμε να πούμε πως τα διαφορετικά είδη των βακτηρίων δίνουν διαφορετικό συνολικό «αποτύπωμα» μετά από τη εξέτασή τους σε ένα σύνολο βιοχημικών αντιδράσεων-δοκιμών. Όταν πρόκειται να ταυτοποιήσουμε ένα μικροοργανισμό, χρησιμοποιούμε μία σειρά από διαφορετικά μέσα ανάπτυξης της καλλιέργειας και τα εμβολιάζουμε με τον προς εξέταση μικροοργανισμό. Κατόπιν, παρατηρούμε σε κάθε μέσο εάν οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται και εάν παράγονται συγκεκριμένα μεταβολικά προιόντα. Ένας τρόπος για να παρατηρήσουμε κάποια από τα προϊόντα αυτά είναι η προσθήκη δεικτών στα μέσα καλλιέργειας. Οι δείκτες αντιδρούν με κάποιο στοχευμένο μεταβολικό προϊόν, γεγονός που από εμάς γίνεται αισθητό λ.γ. με την αλλαγή του χρώματος. Άλλοι τρόποι παρατήρησης των μεταβολικών προϊόντων είναι η παραγωγή αερίου, η διαύγαση των υλικών, κτλ. Τα αποτελέσματα που συγκεντρώνονται συγκρίνονται με τα γνωστά δεδομένα για τον υπό εξέταση μικροοργανισμό ώστε να καταστεί δυνατή η ταυτοποίησή του. Κατά τη διάρκεια αυτής της εργαστηριακής άσκησης θα 31

32 παρατηρήσουμε ότι τα διαφορετικά βακτήρια, εξαιτίας των μοναδικών τους ενζύμων, είναι ικανά να παράγουν διαφορετικές βιοχημικές αντιδράσεις. Γενικά τα ένζυμα κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες αυτήν των έξω-ενζύμων (exoenzymes) και αυτήν των ένδο-ενζύμων (endoenzymes). Τα έξω-ένζυμα βρίσκονται στο εξωτερικό περιβάλλον του κυττάρου και χρησιμοποιούνται για τη διάσπαση μεγάλων μορίων θρεπτικών ουσιών ώστε αυτές να μπορέσουν να εισέλθουν στο εσωτερικό του κυττάρου. Εφόσον εισέλθουν τα θρεπτικά συστατικά στο εσωτερικό του μικροοργανισμού, κάποια διασπώνται περαιτέρω ώστε να παραχθεί ενέργεια ή να χρησιμοποιηθούν ως δομικά στοιχεία για την σύνθεση κυτταρικών δομών. Η δεύτερη αυτή αντίδραση καταλύεται από τα ενδοένζυμα τα οποία βρίσκονται στο εσωτερικό του κυττάρου. Α. ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΑΜΥΛΟΥ (STARCH HYDROLYSIS) Το άμυλο (Starch) είναι ένας πολυσακχαρίτης ο οποίος εμφανίζεται ως ένα διακλαδισμένο πολυμερές του απλού σακχάρου της γλυκόζης. GLU ( ---GLU-GLU-GLU-GLU-GLU-GLU-GLU--- )n Κάποια βακτήρια είναι ικανά να χρησιμοποιήσουν το άμυλο ως πηγή υδατανθράκων αλλά πρώτα πρέπει να υδρολύσουν ή να διασπάσουν το άμυλο ώστε να μπορεί να εισέλθει εντός του κυττάρου. Αυτό επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενός εξωενζύμου το οποίο υδρολύει το άμυλο, με το να σπάει τους δεσμούς μεταξύ των μορίων της γλυκόζης. Το ένζυμο αυτό ονομάζεται διαστάση (diastase). ( ---GLU GLU GLU GLU GLU GLU GLU--- )n Μετά από την επίδραση του ενζύμου τα μόρια της γλυκόζης μπορούν να εισέλθουν στο βακτηριακό κύτταρο και να μεταβολισθούν. ΥΛΙΚΑ: Starch agar ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: Bacillus subtilis και Escherichia coli σε Trypticase Soy broth ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ : 1.Χρησιμοποιόντας αδιάβροχο μαρκαδόρο χωρίστε τη βάση του τρυβλίου σε δύο μέρη με μία γραμμή. Ονομάστε τη μία B. subtilis και την άλλη E. coli. 2. Κάντε μια απλή εξάπλωση του κάθε μικροοργανισμού στο αντίστοιχο μισό μέρος του τρυβλίου, όπως φαίνεται στο σχήμα παρακάτω. 32

33 3. Επωάστε σε θερμοκρασία 37 οc για 5-7 ημέρες. 4. Προσθέστε ιώδιο για να παρατηρήσετε εάν το άμυλο παραμένει ακέραιο μέσα στο άγαρ, ή έχει υδρολυθεί. Στην περίπτωση που δεν έχει υδρολυθεί, το ιώδιο αντιδρά με το άμυλο και παρατηρείται σκούρο καφέ ή μπλε/μαύρο χρώμα Ενώ στην περίπτωση εκείνη που το άμυλο έχει υδρολυθεί, παρατηρείται μία καθαρή ζώνη γύρω από την αναπτυγμένη καλλιέργεια, αφού δεν υπάρχει το άμυλο πλέον για να αντιδράσει με το ιώδιο. 33

34 5. Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας. Β. ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (PROTEIN HYDROLYSIS) Οι πρωτεϊνες αποτελούνται από αμινοξέα τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς, δημιουργώντας μακριές αλυσίδες. Πολλά βακτήρια μπορούν να υδρολύσουν μεγάλο εύρος πρωτεινών και να παράγουν πεπτίδια, τα οποία είναι μικρότερου μήκους αλυσίδες αμινοξέων και κατόπιν αυτά με τελικά μεταβολικά προϊόντα τα αμινοξέα. Κατόπιν μπορούν να χρησιμοποιήσουν τα αμινοξέα αυτά προκειμένου να συνθέσουν τις πρωτεϊνες τους, άλλα κυτταρικά μόρια ή και να παράγουν ενέργεια από την αφομείωσή τους. Η υδρόλυση των πρωτεϊνών ονομάζεται πρωτεόλυση και το ένζυμο που εμπλέκεται, πρωτεάση. Σε αυτήν την εργαστηριακή άσκηση θα μελετηθεί η υδρόλυση από βακτήρια της πρωτείνης του γάλακτος, καζεϊνης,η οποία δίνει στο γάλα το λευκό, αδιαφανές χρώμα. ΥΛΙΚΑ: Skim Milk agar ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: Bacillus subtilis και Escherichia coli σε Trypticase Soy broth ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: 1.Χρησιμοποιώντας αδιάβροχο μαρκαδόρο χωρίστε τη βάση του τρυβλίου σε δύο μέρη με μία γραμμή. Ονομάστε τη μία B. subtilis και την άλλη E. coli. 2. Κάντε μια απλή εξάπλωση του κάθε μικροοργανισμού στο αντίστοιχο μισό μέρος του τρυβλίου, όπως φαίνεται στο σχήμα παρακάτω. 34

35 3. Επωάστε σε θερμοκρασία 37 οc για 5-7 ημέρες. 4. Aν η καζεϊνη έχει υδρολυθεί από τον μικροοργανισμό, τότε θα παρατηρηθεί μία διαγής καθαρή ζώνη περιμετρικά της ανάπτυξής του. Εάν δεν έχει υδρολυθεί, το άγαρ παραμένει λευκό και αδιαφανές. 35

36 5. Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας. Γ.ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΚΙΝΗΣΗΣ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Πολλά βακτήρια διαθέτουν την ικανότητα να κινούνται. Στα περισσότερα από αυτά υπάρχουν ειδικά όργανα που ονομάζονται μαστίγια (flagella). Αυτά μπορεί να βρίσκονται στο βακτηριακό κύτταρο ως εξής: 36

37 Για τον προσδιορισμό της ικανότητας κίνησης από τους μικροοργανισμούς μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τρεις μεθόδους:1) άμεση παρατήρηση σε μικροσκόπιο (αντίθεσης φάσεων και σκοτεινού πεδίου), 2) χρώση των μαστιγίων και 3) με μέσα ανάπτυξης που επιτρέπουν την παρατήρηση της κίνησης. Σε ότι αφορά στα μέσα ανάπτυξης, χρησιμοποιούνται ημι-στερεά υλικά (Semi-solid Motility Test media), στα οποία τα άγαρ προστίθεται σε μικρή συγκέντρωση (0.3%) ώστε να επιτρέπεται η παρατήρηση της κίνησης. Όταν ένας μικροοργανισμός που δεν διαθέτει την ικανότητα να κινείται (non-motile organism) τοποθετείται με βακτηριολογική βελόνα κάθετα στο υλικό αυτό, αναπτύσσεται μόνο κατά μήκος της γραμμής ενοφθαλμισμού. Η αύξησή του είναι σχηματισμένη και ευδιάκριτη. Όταν αντίστοιχα ο μικροοργανισμός που ενοφθαλμίζεται μπορεί να κινηθεί (motile organisms), «κολυμπά» μέσα στο μαλακό άγαρ και απομακρύνεται από την αρχική γραμμή ενοφθαλμισμού, καταλαμβάνοντας όλο το διαθέσιμο χώρο ή/και συχνά σχηματίζοντας ομπρέλες. Δίχως κίνηση (Non-motile) Με κίνηση (motile) 37

38 ΥΛΙΚΑ: 2 δοκιμαστικοί σωλήνες με Motility medium ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ: Pseudomonas aeruginosa και Staphylococcus aureus σε Trypticase Soy agar. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: 1.Σημάνετε τον κάθε σωλήνα με το όνομα του μικροοργανισμού που πρόκειται να εμβολιάσετε. 2. Εμβολιάστε κάθε ένα δοκιμαστικό σωλήνα με το κάθε ένα βακτήριο. 3. Επωάστε όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες σε θερμοκρασία 37 οc για 5-7 ημέρες. 4. Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας. Τι παρατηρείτε σχετικά με την ικανότητα κίνησης των μικροοργανισμών? Δ. ΟΞΕΙΔΩΣΗ/ ΖΥΜΩΣΗ ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΩΝ (OXIDATION/ FERMENTATION OF CARBOHYDRATES) Οι υδατάνθρακες είναι σύνθετες χημικές ουσίες οι οποίες χρησιμεύουν ως πηγή ενέργειας όταν καταβολίζονται από τα βακτήρια και άλλα κύτταρα. Αποτελούνται από άτομα άνθρακα, υδρογόνου και οξυγόνου (το υδρογόνο και το οξυγόνο βρίσκονται σε αναλογία αντίστοιχη με αυτή του νερού [Η2Ο]ν) και συχνά καλούνται ως σάκχαρα ή άμυλα. Μεγάλο εύρος υδατανθράκων μπορεί να αφομειωθεί από διαφορετικά βακτήρια προκειμένου να παραχθεί ενέργεια και τα είδη αυτών των υδατανθράκων καθώς και ο τρόπος με τον οποίο οι μικροοργανισμοί τους αφομειώνουν, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικό εργαλείο για την ταυτοποίησή τους. Προκειμένου να μελετηθεί λοιπόν ο τρόπος αφομείωσης των σακχάρων από τους μικροοργανισμούς, θα χρησιμοποιηθεί η τροποποιημένη μορφή του μέσου καλλιέργειας των Hugh και Leifson. Σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει αποστειρωμένο ημιστερεό μέσο καλλιέργειας (soft agar) των Hugh και Leifson, στο οποίο έχει προστεθεί γλυκόζη (1 % w/v glucose) ή οποιοδήποτε άλλο σάκχαρο επιλέξουμε, θα ενοφθαλμιστεί ο κάθε ένας μικροοργανισμός με βακτηριολογική βελόνα και κάθετη φορά. Η επώαση θα γίνει σε θερμοκρασία 25 oc για 2-7 ημέρες. Το ph του μέσου είναι 7,1±0,2 και στην τιμή αυτή οι δείκτες (bromthymol blue και bromcresol purple) αποδίδουν στο μέσο καλλιέργειας χρώμα πράσινο. Επιπρόσθετα, κάθε ένας μικροοργανισμός θα ελεχθεί υπό αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες οι οποίες επιτυγχάνονται με την προσθήκη 1 ml παραφινέλαιου, μετά τον ενοφθαλμισμό των μέσων. Οι παρατηρήσεις που προκύπτουν έχουν ως εξής: 38

39 Μεταβολισμός σακχάρου: -Οξειδωτικός μεταβολισμός. Η μεταβολή του αρχικού πράσινου χρώματος του δείκτη, σε πορτοκαλοκίτρινο, στην επιφάνεια του σωλήνα, αποτελεί την ένδειξη για την παραγωγή οξέων από το σάκχαρο υπό αερόβιες συνθήκες. -Ζυμωτικός μεταβολισμός. Η ίδια χρωματική μεταβολή θα συμβεί, αλλά κατά μήκος όλου του σωλήνα και συχνά ξεκινά από το κάτω μέρος. Η ένδειξη αυτή σηματοδοτεί τον ζυμωτικό μεταβολισμό των κυττάρων δηλαδή την παραγωγή των οξέων από το σάκχαρο υπό αναερόβιες συνθήκες. -Αλκαλική ή καμία μεταβολή. Η μεταβολή του αρχικού χρώματος του δείκτη σε μπλε ή αμελητέα, αντίστοιχα. Στην περίπτωση της αλκαλικής μεταβολής του δείκτη, παράγονται ουσίες από τον μεταβολισμό της πεπτόνης που περιέχεται και οι οποίες ανεβάζουν τις τιμές του ph με αποτέλεσμα ο δείκτης να μεταβάλλεται σε μπλε. Παραγωγή αερίου: Σε ορισμένες περιπτώσεις οι μικροοργανισμοί κατά την ανάπτυξή τους εκτός από οξέα παράγουν και CO2. Στην περίπτωση αυτή παρατηρείται ράγισμα ή και διάρηξη της συνεκτικότητας του μέσου ανάπτυξης. 39

40 Παρατηρήσεις: 1: Αρχικό μέσο αμέσως μετά τον ενοφθαλμισμό δίχως (αριστερά) και με (δεξιά) την προσθήκη ελαίου για τη δημιουργία αναερόβιων συνθηκών. 2: οξειδωτικός μεταβολισμός του σακχάρου υπό αερόβιες συνθήκες (αριστερά)και αδυναμία ανάπτυξης υπό αναερόβιες συνθήκες (δεξιά). 3: ζυμωτικός μεταβολισμός του σακχάρου υπό αερόβιες (αριστερά)και αναερόβιες συνθήκες(δεξιά). 4: αλκαλική μεταβολή του δείκτη υπό αερόβιες συνθήκες (αριστερά) και αδυναμία ανάπτυξης υπό αναερόβιες συνθήκες (δεξιά). ΥΛΙΚΑ: 3 δοκιμαστικοί σωλήνες με Hugh and Leifson για αερόβια επώαση των μικροοργανισμών και 3 αντίστιχοι δοκιμαστικοί σωλήνες στους οποίους θα προστεθεί παραφινέλαιο μετά τον ενοφθαλμισμό τους, για την επίτευξη αναερόβιων συνθηκών επώασης. ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli και Shewanella putrefaciens σε Trypticase Soy agar. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ: 1.Σημάνετε τον κάθε σωλήνα με το όνομα του σακχάρου που περιέχεται και του μικροοργανισμού που πρόκειται να εμβολιάσετε. 2. Εμβολιάστε 2 δοκιμαστικoύς σωλήνες με το κάθε ένα βακτήριο. 3. Στο δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα κάθε ζεύγους προσθέστε 1 ml παραφινέλαιο. 5. Επωάστε όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες σε θερμοκρασία 25 οc για 5-7 ημέρες. 6. Καταγράψτε τα αποτελέσματά σας. Τι παρατηρείτε σχετικά με την παραγωγή αερίου? Και τη σχετικά με την ικανότητα κίνησης των μικροοργανισμών? 40

41 Growth Microorganisms Motility Gas from H&L glucose aerobic anaerobic Escherichia coli + F Pseudomonas fluorescens + O Shewanella putrefaciens + -/A + +/- - (+ = θετικό; - = αρνητικό). 41

42 ΑΣΚΗΣΗ 8 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Ένας από τους παρεμποδιστικούς παράγοντες στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών αποτελεί και η χρήση φυσικών αντιμικροβιακών ουσιών στα τρόφιμα. Έχει αποδειχτεί ότι τα αιθέρια έλαια περιέχουν συστατικά που αναστέλουν την ανάπτυξη διάφορων μικροοργανισμών. Μάλιστα, τα Gram - αρνητικά βακτήρια είναι πιο ανθεκτικά από ότι τα Gram θετικά λόγω της της ύπαρξης των λιποπολυσακχαρίδιων στο κυτταρικό τους τοίχωμα, χωρίς όμως να σημαίνει ότι ισχύει αυτό πάντα. Ο μηχανισμός δράσης των αντιμικροβιακών ουσιών οφείλεται: 1. στην επίδραση στην κυτταρική μεμβράνη της οποίας αυξάνει την περατότητα με αποτέλεσμα την απώλεια κυτταρικών συστατικών. 2. στην αδρανοποίηση ενζύμων 3. καταστροφή ή λειτουργική αδρανοποίηση γενετικού υλικού. Ένα από τα φυσικά αντιμικροβιακά συστήματα αποτελεί το αιθέριο έλαιο της ρίγανης. Η αντιμικροβιακή δράση του εκχυλίσματος ρίγανης οφείλεται σε διάφορες φαινολικές ουσίες από τις οποίες πιο αποτελεσματική δράση παρουσιάζουν η καρβακρόλη και η θυμόλη. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά 1. Θα σας δωθεί καλλιέργεια που εμβολιάστηκε την προηγούμενη. 2. Λαβίδα 3. Αποστειρωμένα χάρτινα δίσκια 4. Φιαλίδιο με το εκχύλισμα ρίγανης 5. Ποτήρι ζέσεως με 95% αλκοόλη 6. Τριγωνάκι 7. Πιπέττα του 1 ml και τα αντίστοιχα tips. 42

43 8. Πιπέττα του 0,1μl και τα αντίστοιχα tips. 9. PCA τρυβλία 10. Ποτήρι για την τοποθέτηση των χρησιμοποιούμενων tips. Α. Εμβολιασμός. Εμβολιάστε το βακτηριακό εναιώρημα σε τρυβλία PCA με την τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης. Β. Ποιοτικός προσδιορισμός της αντιμικροβιακής δράσης με την τεχνική των χάρτινων δισκίων 1. Ακολουθήστε τα βήματα της τεχνικής των χάρτινων δισκίων όπως φαίνεται στο σχήμα Επωάστε τα τρυβλία στην επιθυμητή για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού θερμοκρασία. 3. Μετά την επώαση παρατηρείστε τις ζώνες αναστολής που προκάλεσε το αιθέραιο έλαιο της ρίγανης στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού. 43

44 Σχήμα 1: Διαδικασία της τεχνικής των χάρτινων δισκίων 44

45 ΑΣΚΗΣΗ 9 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η ανάπτυξη και η απλοποίηση των μοριακών μεθόδων που αφορούν στη μελέτη του γενετικού υλικού έχει οδηγήσει σε μια νέα προσέγγιση στην ταυτοποίηση και τη μελέτη των μικροοργανισμών που βρίσκονται στα τρόφιμα. Η προσέγγιση αυτή βασίζεται στην ανίχνευση, καταγραφή και αξιολόγηση των διαφορών του γενετικού υλικού των μικροοργανισμών, καθώς υπάρχουν γενετικοί δείκτες που θα μπορούσαν να διαχωρίσουν τους μικροοργανισμούς σε επίπεδο είδους ή στελέχους και να προσδώσουν διαφορετικές ιδιότητες σε κάθε μικροοργανισμό, ακόμα και του ιδίου είδους. Με την εφαρμογή των τεχνικών αυτών, αποφεύγονται οι περιορισμοί των φαινοτυπικών μεθόδων και συγκεκριμένα: η μικρή διακριτική ικανότητα, η αβεβαιότητα των αποτελεσμάτων η διαφοροποίηση των αποτελεσμάτων από το τρόφιμο στις εργαστηριακές συνθήκες και η υποκειμενικότητα του αναλυτή η πληθώρα διαφορετικών δοκιμών που απαιτούνται για την λήψη του αποτελέσματος. Τα τελευταία χρόνια, η ανάπτυξη τεχνικών που δεν απαιτούν τη χρήση της καλλιέργειας των μικροοργανισμών σε τρυβλία για την λήψη αποτελέσματος αποτέλεσε ένα ακόμα πλεονέκτημα των μοριακών μεθόδων. Οι τεχνικές αυτές ονομάζονται μέθοδοι που δεν εξαρτώνται από την καλλιέργεια (culture independent methods). Η επιλογή της τεχνικής που θα εφαρμοστεί εξαρτάται επίσης από τη φύση του δείγματος αλλά και το στόχο της ανάλυσης. Μερικοί από τους βασικούς στόχους της εφαρμογής των μοριακών μεθόδων στη μικροβιολογία τροφίμων είναι: η σύγκριση του γενετικού υλικού και ανάδειξη των γενετικών σχέσεων των μικροοργανισμών που απαντούν σε ένα τρόφιμο η παρακολούθηση και περιγραφή της μικροχλωρίδας ή των ειδικών αλλοιογόνων μικροοργανισμών ενός τροφίμου η ανίχνευση του γενετικού υλικού ενός αλλοιογόνου ή και παθογόνου μικροοργανισμού ακόμα και όταν αυτό βρίσκεται σε πολύ μικρή ποσότητα. η παρατήρηση των αλλαγών στην έκφραση γονιδίων ενός μικροοργανισμού σε διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης (θερμοκρασία και καλλιέργειας, συνθήκες ανταγωνισμού, καταπόνηση, κλπ) 45 μέσο ανάπτυξης της

46 ανίχνευση γονιδίων με σημαντικές τεχνολογικές ιδιότητες όπως πρωτεόλυση, γλυκόλυση, παραγωγή βακτηριοσινών. Με βάση τους παραπάνω στόχους, οι μοριακές τεχνικές μπορούν να διαχωριστούν σε τρία βασικά πεδία έρευνας. Γονιδιωματική (Genomics) I. II. III. Τρανσκριπτομική (Transcriptomics) Πρωτεομική (Proteomics) Τα πεδία αυτά βασίζονται στο κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας (Σχήμα 1) και στον τύπο της ανάλυσης από τα ερωτήματα που τίθενται. Κάποιες τεχνικές που ανήκουν στην τρανσκριπτομική μπορεί να εφαρμοστούν και σαν τεχνικές γονιδιωματικής καθώς μπορεί να αναλύσουν και τα δύο μόρια (DNA, RNA). Η εξειδίκευση, ο κατάλληλος εξοπλισμός καθώς και το κόστος σε συνδυασμό με την ύπαρξη πλήθους διαφορετικών τεχνικών πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη για την επιλογή της κατάλληλης τεχνικής. Ακολουθεί περιγραφή μερικών από τις τεχνικές που βρίσκουν εφαρμογή στην μικροβιολογία τροφίμων. Η ταξινόμηση τους έγινε με βάση τα προαναφερθέντα πεδία έρευνας. DNA Γονιδιωματική RNA ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Τρανσκριπτομική Πρωτεομική Σχήμα 1. Κεντρικό δόγμα μοριακής βιολογίας και πεδία έρευνας. I. Γονιδιωματική Στην κατηγορία αυτή ανήκουν πλήθος διαφορετικών τεχνικών που θα μπορούσαν να διαχωριστούν σε δυο υποκατηγορίες, (α) σε αυτές που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction) και (β) σε αυτές που δεν απαιτούν την τεχνική αυτή. Οι περισσότερες από αυτές τις τεχνικές απαιτούν προηγούμενη απομόνωση του γενετικού υλικού, ενώ για την εμφάνιση των αποτελεσμάτων απαιτείται ηλεκτροφόρηση. Για 46

47 το λόγο αυτό, τα παραπάνω βήματα αναφέρονται ξεχωριστά και ακολουθούν στη συνέχεια οι μοριακές τεχνικές. Απομόνωση DNA Για την απομόνωση του DNA θα πρέπει να γίνει συλλογή των κυττάρων μιας καλλιέργειας, είτε από το σύνολο των αποικιών που αναπτύχθηκαν σε ένα τρυβλίο, είτε κατευθείαν από το τρόφιμο (μέθοδοι που δεν εξαρτώνται από την καλλιέργεια). Μετά την συλλογή των κυττάρων, ακολουθεί λύση του κυτταρικού τοιχώματος και της μεμβράνης. Η λύση αυτή μπορεί να γίνει με διαφορετικούς χειρισμούς. Μερικοί από αυτούς είναι: χρήση χλωροφορμίου και φαινόλης χρήση λυσοζύμης εφαρμογή διαλυμάτων διαφορετικών συγκεντρώσεων και ph, συνήθως με ταυτόχρονη εναλλαγή θερμοκρασίας βρασμός χρήση Δωδεκανοθειικού Νατρίου (SDS) εφαρμογή υπερήχων χρήση εμπορικών σκευασμάτων για την απομόνωση DNA. Έπειτα για το διαχωρισμό του DNA από τα υπόλοιπα συστατικά του κυττάρου χρησιμοποιείται αλκοόλη ή ισοπροπανόλη. Με την εφαρμογή αντίστοιχων πρωτοκόλλων μπορεί να γίνει απομόνωση του RNA. Ηλεκτροφόρηση DNA ή προϊόντων PCR Ο έλεγχος της παρουσίας DNA σε ένα δείγμα είτε στα προϊόντα της PCR, ελέγχεται με τη μεταφορά ποσότητας δείγματος σε πηκτή αγαρόζης (agarose gel). Η ταχύτητα με την οποία κινείται το DNA σε μια πηκτή εξαρτάται από το μέγεθός του. Έτσι τα μικρότερα τμήματα/θραύσματα κινούνται πιο γρήγορα στην πηκτή κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Η οπτικοποίηση του αποτελέσματος γίνεται μετά από χρώση της πηκτής με βρωμιούχο αιθίδιο ή άλλης χρωστικής (πχ. SYBR Green I) και έκθεση σε κάμερα με λάμπες UV (Σχήμα 2). Ο προσδιορισμός του μεγέθους του προϊόντος γίνεται με τη χρήση του κατάλληλου δείκτη μοριακών βαρών (DNA Ladder) ο οποίος υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση ηλεκτροφορείται ταυτόχρονα. Στην περίπτωση που απαιτείται διαχωρισμός πολύ μικρών τμημάτων DNA, χρησιμοποιείται πηκτή πολυακριλαμιδίου. 47

48 Σχήμα 2. Πηκτή αγαρόζης με προϊόντα PCR διαφόρων μεγεθών. Οι Θέσεις Μ αφορούν τους δείκτες μοριακών βαρών Μέθοδοι που βασίζονται στην Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μια γρήγορη, αξιόπιστη και ευαίσθητη μέθοδος. Βασίζεται στον πολλαπλασιασμό τμημάτων του γενετικού υλικού από το ένζυμο DNA πολυμεράση (Taq polymerase), το οποίο έχει την ιδιότητα να μην αποσυντίθεται σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες. Η αντίδραση της PCR αποτελείται από τρία στάδια (Σχήμα 3): 1. Αποδιάταξη της έλικας του DNA (denaturation) ~94 C 2. Επικόλληση των εκκινητών (primer) στο DNA εκμαγείο (annealing) ~54 C 3. Ενίσχυση του επιλεγμένου τμήματος του DNA (extension) ~72 C Τα παραπάνω στάδια επαναλαμβάνονται για έναν αριθμό κύκλων (30-40) που εξαρτάται από την αρχική ποσότητα του γενετικού υλικού στο δείγμα για τον γεωμετρικό πολλαπλασιασμό του DNA. Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης απαιτείται προηγούμενη απομόνωση του DNA, ενώ η εμφάνιση των αποτελεσμάτων γίνεται μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Η επιλεκτικότητα της μεθόδου εξαρτάται από την επιλογή των εκκινητών και τις συνθήκες που πραγματοποιείται η αντίδραση. 48

49 Σχήμα 3. Στάδια αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) Οι απλούστερες μέθοδοι αυτής της κατηγορίας βασίζονται στη χρήση ενός τυχαίου εκκινητή, που δεν στοχεύει σε κάποια συγκεκριμένη αλληλουχία του DNA. Μια από αυτές τις τεχνικές είναι η RAPD (random amplified polymorphic DNA), η οποία εφαρμόζεται για την ομαδοποίηση μικροοργανισμών σε επίπεδο είδους. Τα στάδια που περιλαμβάνει είναι η απομόνωση των μικροοργανισμών από τρυβλία, η απομόνωση του DNA για κάθε μικροοργανισμό, η αντίδραση PCR και ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR. Πρόκειται για τεχνικές με μικρό κόστος, ταχύτητα και ευκολία στην εφαρμογή τους, αλλά με πολύ χαμηλή επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. Μια ευρέως διαδεδομένη μέθοδος που χρησιμοποιεί συνδυασμό της αντίδρασης PCR και πέψης του DNA με ένζυμα περιορισμού (restriction enzymes) είναι η RFLP (restriction fragment length polymorphism). Τα στάδια που περιλαμβάνει είναι η απομόνωση των μικροοργανισμών από τρυβλία, η απομόνωση του DNA για κάθε μικροοργανισμό και τέλος η αντίδραση PCR. Έπειτα, στην συγκεκριμένη τεχνική, το προϊόν της PCR πέπτεται και προκύπτουν πολυάριθμα θραύσματα, τα οποία διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Χρησιμοποιείται για την ομαδοποίηση των μικροοργανισμών σε επίπεδο είδους ή και στελέχους, καθώς και για τη χαρτογράφηση γονιδίων. Πρόκειται για τεχνική με σχετικά μικρό κόστος και μεγάλη επαναληψιμότητα. Τα τελευταία χρόνια, για τη μελέτη της μικροχλωρίδας των τροφίμων πολύ συχνά χρησιμοποιείται η PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Για την ομαδοποίηση των μικροοργανισμών, δεν απαιτείται προηγούμενη απομόνωσή τους σε 49

50 τρυβλίο, καθώς μπορεί να γίνει απομόνωση του DNA κατευθείαν από το τρόφιμο ((cultureindependent method)) ή από το σύνολο των αποικιών που αναπτύσσονται σε ένα τρυβλίο. Με αυτήν την τεχνική, τα προϊόντα της PCR διαχωρίζονται σε πηκτή ακρυλαμιδίου παρουσία αποδιατακτικού παράγοντα με βάση την νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου (Σχήμα 4). Συγκεκριμένα, τα διαφορετικά ιαφορετικά είδη βακτηρίων θα εμφανιστούν σαν διαφορετική ζώνη στην πηκτή ακρυλαμιδίου με κατακόρυφα αυξανόμενη συγκέντρωση φορμαμιδίου ουρίας. Σχήμα 4. Προϊόντα PCR σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με βαθμιδωτή συγκέντρωση φορμαμιδίου ουρίας (PCR-DGGE). Η ανάπτυξη τεχνικών που βασίζονται στον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γενετικού υλικού, αποτέλεσε σημαντικό παράγοντα για την ομαδοποίηση, σύγκριση αλλά και ταυτοποίηση των μικροοργανισμών. Ο γενετικός τόπος που χρησιμοποιείται ευρέως για την ταυτοποίηση των μικροοργανισμών με τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας (sequencing)) είναι το γονίδιο 16S 16 rrna. Σε βάσεις δεδομένων όπως GenBank GenBank, EMBL και DBJ υπάρχουν εκατομμύρια νουκλεοτιδικές αλληλουχίες όπου είναι προσβάσιμες για την σύγκριση αλληλουχιών ουχιών μεταξύ τους. Πρόκειται για ένα βασικό εργαλείο ((BLAST-Basic Local Alignment Search Tool) Tool) για τον εντοπισμό αλληλουχιών όμοιων μεταξύ τους και τον υπολογισμό του ποσοστού ομοιότητας. Μέθοδοι που δεν βασίζονται στην PCR Η συμβατική ηλεκτροφόρηση, που χρησιμοποιείται στις παραπάνω τεχνικές για το διαχωρισμό των προϊόντων της PCR ή των θραυσμάτων που προκύπτουν από ένζυμα περιορισμού, δεν είναι δυνατόν να διαχωρίσει πολύ μεγάλα θραύσματα. Αντίθετα, η ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου όμενου πεδίου (PFGE ( Pulsed field gel electrophoresis) επιτρέπει το διαχωρισμό πολύ μεγάλων τμημάτων DNA (>1000 kbp). ). Τα τμήματα αυτά μπορεί να προκύψουν από πέψη του γονιδιώματος με ένζυμο περιορισμού, μετά από ενσωμάτωση των κυττάρων σε αγαρόζη και λύση τους με τη χρήση διαφόρων διαλυμάτων. Τα 50

51 κομμάτια της αγαρόζης που περιέχουν τα θραύσματα DNA ενσωματώνονται σε αγαρόζη και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση με PFGE (Σχήμα 5). Πρόκειται για τεχνική που απαιτεί μεγάλο χρόνο για την λήψη αποτελέσματος, ακριβό εξοπλισμό και αναλώσιμα, καθώς και άρτια εκπαιδευμένο προσωπικό. Παρόλα αυτά, αποτελεί πρότυπη μέθοδο για την ομαδοποίηση μικροοργανισμών σε επίπεδο στελέχους, λόγω της επαναληψιμότητάς της και της υψηλότερης διακριτικής ικανότητας σε σχέση με τις άλλες τεχνικές. Η χρήση της στις επιδημιολογικές μελέτες, έχει οδηγήσει στη δημιουργία βάσεων δεδομένων όπως η Pulse-NET ( που βασίζονται στη σύγκριση εικόνων ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων DNA. Σχήμα 5. Διαδικασία προετοιμασία δείγματος για ανάλυση (Α) και αποτέλεσμα ηλεκτροφόρησης (Β) σε PFGE. Στις περιπτώσεις, που απαιτείται ανίχνευση των κυττάρων απευθείας στο φυσικό τους περιβάλλον μπορεί να εφαρμοστεί η τεχνική FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation). Με αυτή την τεχνική, είναι δυνατόν να καθορισθεί η μορφολογία του κυττάρου, ο πληθυσμός αλλά και η κατανομή του στο χώρο in situ - (φυλογενετική ταυτότητα, αριθμός και χωροταξική κατανομή των μικροοργανισμών, στο υπό εξέταση δείγμα). Στηρίζεται στη χρήση ολιγονουκλεοτίδιων ανιχνευτών (probes) σημασμένων με φθορίζον μόριο που στοχεύουν σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο (για τα βακτήρια συνήθως χρησιμοποιείται το γονίδιο 16S rrna). Η παρατήρηση του αποτελέσματος του υβριδισμού γίνεται με μικροσκόπιο φθορισμού. Πρόκειται για αξιόπιστη τεχνική με σχετικά μεγάλη διακριτική ικανότητα, αρκετά ευαίσθητη, με ικανότητα διαχωρισμού σε επίπεδο γένους έως και είδους. Παράλληλα, με ποσοτικοποίηση του σήματος μπορεί να πραγματοποιηθεί εκτίμηση του ρυθμού αύξησης των βακτηριακών κυττάρων in situ. 51

52 II. Τρανσκριπτομική Η συνεχής πρόοδος της τεχνολογίας στην ανάπτυξη μοριακών τεχνικών, συνέβαλε στη δημιουργία μιας μοριακής μεθόδου που βασίζεται στην αρχή της PCR, τη λεγόμενη PCR πραγματικού χρόνου (Real time PCR). Η διαφορά της με την συμβατική PCR είναι ότι ενώ σ εκείνη εμφανίζεται μόνο το τελικό προϊόν σε πηκτή αγαρόζης με ηλεκτροφόρηση, στην Real time PCR γίνεται παρατήρηση των προϊόντων της PCR σε κάθε κύκλο ξεχωριστά (πραγματικό χρόνο) λόγω της εμφάνισης φθορισμού από τους φθορισμομετρικούς δείκτες που χρησιμοποιούνται. Η αύξηση του φθορισμού των χρωστικών αυτών, προκύπτει από την ταυτόχρονη αύξηση της ποσότητας του δίκλωνου DNA. Μπορεί να επιτευχθεί και ποσοτικοποίηση του αρχικού δείγματος, με ικανότητα ανίχνευσης ακόμα και ενός μορίου DNA. Πρόκειται για πολύ αξιόπιστη μέθοδο που βρίσκει εφαρμογή και σαν μέθοδος που δεν εξαρτάται από την καλλιέργεια. Χρησιμοποιείται για, τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης γονιδίων ή τις διαφορές στην έκφραση γονιδίων σε διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης του περιβάλλοντος ή μεταξύ διαφορετικών μικροοργανισμών. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, απαιτείται προηγούμενη απομόνωση RNA, μετατροπή σε cdna (copy DNA) με το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (Σχήμα 6) και χρήση αυτού στην Real time PCR. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται ευρέως για τον έλεγχο παρουσίας/απουσίας ενός μικροοργανισμού (κυρίως παθογόνου) σε ένα τρόφιμο όπου απαιτείται απομόνωση DNA κατευθείαν από το τρόφιμο. Στην περίπτωση αυτή η τεχνική θα μπορούσε να αναφέρεται σαν τεχνική της Γονιδιωματικής. Σχήμα 6. Απομόνωση RNA και διαδικασία παραλαβής cdna Μια τεχνική παρόμοιας φιλοσοφίας είναι οι μικροσυστοιχίες (microarrays), εφόσον χρησιμοποιούνται για τον ποιοτικό ή/και ποσοτικό έλεγχο της έκφρασης γονιδίων, καθώς και για τον προσδιορισμό της μικροβιακής ποικιλότητας ενός δείγματος (το τελευταίο δεν βρίσκει εφαρμογή στα τρόφιμα). Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι γίνεται ταυτόχρονος έλεγχος πολύ μεγάλου αριθμού γονιδίων ή μικροοργανισμών. Αυτό επιτυγχάνεται με την απομόνωση του RNA και μετατροπή του σε cdna ή απομόνωση του DNA και εφαρμογή του δείγματος μετά από σήμανση σε στερεή επιφάνεια (γυάλινη ή σιλικόνης) που περιέχει σε 52