HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

Transcript

1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Κωδικός GM333 4 η έκδοση Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) αποτελεί μια άμεση δοκιμασία φθορίζουσας σήμανσης υβριδοποίησης in situ (FISH) που σχεδιάστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 σε μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) δείγματα καρκινικού ιστού μαστού και δείγματα FFPE από ασθενείς που πάσχουν από μεταστατικά γαστρικά αδενοκαρκινώματα ή αδενοκαρκινώματα της γαστροοισοφαγικής συμβολής. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ενδείκνυται ως επικουρικό μέσο με το HercepTest για την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόμενο υποβολής τους σε θεραπεία με Herceptin. Το φιαλίδιο περιέχει αντιδραστήριο που επαρκεί για 20 εξετάσεις. Συνοδευτικά αντιδραστήρια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν μαζί με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Κωδικός Όνομα προϊόντος GM300 GM301 GM302 GM303 GM304 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) P04125GR_03/GM333 σελ. 1/56

2 Περιεχόμενα Σελίδα Προβλεπόμενη χρήση... 3 Αρχή της διαδικασίας - Μαστός... 4 Αντιδραστήρια - Μαστός... 5 Προφυλάξεις - Μαστός... 6 Αποθήκευση - Μαστός... 7 Προετοιμασία δείγματος - Μαστός... 8 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Μαστός... 8 A. Παρασκευή αντιδραστηρίου - Μαστός... 8 B. Διαδικασία χρώσης - Μαστός Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός Ερμηνεία της χρώσης - Μαστός Περιορισμοί - Μαστός Χαρακτηριστικά απόδοσης Μαστός Αντιμετώπιση προβλημάτων - Μαστός Παράρτημα 1 - Μαστός Παράρτημα 2 - Μαστός Περίληψη και επεξήγηση - Στόμαχος Αρχή της διαδικασίας - Στόμαχος Αντιδραστήρια - Στόμαχος Προφυλάξεις - Στόμαχος Φύλαξη - Στόμαχος Προετοιμασία δείγματος - Στόμαχος ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Στόμαχος A. Παρασκευή αντιδραστηρίου - Στόμαχος B. Διαδικασία χρώσης - Στόμαχος Έλεγχος Ποιότητας - Στόμαχος Ερμηνεία της χρώσης - Στόμαχος Περιορισμοί - Στόμαχος Χαρακτηριστικά απόδοσης Στόμαχος Αντιμετώπιση προβλημάτων - Στόμαχος Παράρτημα 3 - Στόμαχος Παράρτημα 4 - Στόμαχος Παράρτημα 5 - Στόμαχος Βιβλιογραφικές αναφορές Επεξήγηση συμβόλων P04125GR_03/GM333 σελ. 2/56

3 Προβλεπόμενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) είναι ο ιχνηθέτης υβριδοποίησης για την αυτοματοποιημένη άμεση δοκιμασία φθορίζουσας σήμανσης υβριδοποίησης in situ (FISH) που πραγματοποιείται επί του οργάνου Dako Omnis και μαζί με τις συσκευές συνοδευτικών αντιδραστηρίων, έχουν σχεδιαστεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 σε μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) δείγματα καρκινικού ιστού μαστού και δείγματα FFPE από ασθενείς που πάσχουν από αδενοκαρκινώματα του στομάχου ή αδενοκαρκινώματα της γαστροοισοφαγικής συμβολής. Το HER2 IQFISH pharmdx ενδείκνυται ως επικουρικό μέσο με το HercepTest για την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόμενο υποβολής τους σε θεραπεία με Herceptin (τραστουζουμάμπη) (βλ. ένθετο συσκευασίας του Herceptin ). Για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού, τα αποτελέσματα από το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) προορίζονται για χρήση ως συμπλήρωμα στις κλινικοπαθολογικές πληροφορίες που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της πρόγνωσης ασθενών με καρκίνο του μαστού σταδίου ΙΙ και θετικούς λεμφαδένες. Στο παρόν έγγραφο, το γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ή το αδενοκαρκίνωμα της γαστροοισοφαγικής συμβολής αναφέρεται επίσης ως γαστρικός καρκίνος. Για την εφαρμογή στον καρκίνο του μαστού, ανατρέξτε στις σελίδες Για την εφαρμογή στον καρκίνο του στομάχου, ανατρέξτε στις σελίδες Σημαντικό: Σημειώστε τις διαφορές ιστού καρκίνου του μαστού και ιστού καρκίνου του στομάχου, ιδίως στις ενότητες "Ερμηνεία της χρώσης" P04125GR_03/GM333 σελ. 3/56

4 Καρκίνος του μαστού Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό επίσης ως ERBB2 ή NEU) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17 και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι μια κινάση τυροσίνης μεμβρανικού υποδοχέα με ομολογία για τον επιδερμικό υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (EGFR ή HER1) (1-2). Το γονίδιο HER2 υπάρχει σε δύο αντίγραφα σε όλα τα φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα. Σε ένα κλάσμα ασθενών με καρκίνο του μαστού, το γονίδιο HER2 είναι ενισχυμένο ως μέρος της εξεργασίας κακοήθους μετασχηματισμού και προόδου του όγκου (3-8). Η ενίσχυση του γονιδίου HER2 γενικά οδηγεί σε υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 στην επιφάνεια των κυττάρων καρκίνου του μαστού (9). Η ενίσχυση του γονιδίου HER2 ή/και η υπερέκφραση της πρωτεΐνης του έχουν καταδειχθεί στο 20-25% των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού (10). Αυτή η αυξορρύθμιση σχετίζεται με πενιχρή πρόγνωση, αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και μειωμένη επιβίωση. Διάφορες μελέτες έχουν καταδείξει ότι η κατάσταση του HER2 συσχετίζεται με την ευαισθησία ή την ανθεκτικότητα σε ορισμένα σχήματα χημειοθεραπείας (11). Η κατάδειξη της υψηλής υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 ή της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 είναι ουσιώδης για την έναρξη θεραπείας με Herceptin, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης HER2. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι ασθενείς των οποίων οι όγκοι έχουν υψηλή υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 ή/και ενίσχυση του γονιδίου HER2 επωφελούνται ιδιαίτερα από τη θεραπεία με Herceptin (12). Το συγκεκριμένο προϊόν (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) είναι ένα μίγμα ιχνηθετών IQISH για αυτοματοποιημένο άμεσο εντοπισμό μέσω FISH της ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Το προϊόν θα πρέπει να χρησιμοποιείται μαζί με τα καθορισμένα συνοδευτικά αντιδραστήρια επί του οργάνου Dako Omnis και προέρχεται από τη μη αυτόματη δοκιμασία ενίσχυσης του γονιδίου HER2, τη HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731. Αρχή της διαδικασίας - Μαστός Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) είναι ένα μίγμα ιχνηθετών IQISH αποτελούμενο από ένα μίγμα σημασμένων με φυκοερυθρίνη-texas Red ιχνηθετών DNA που καλύπτουν μια περιοχή 218 kb, η οποία περιλαμβάνει το γονίδιο HER2 στο χρωμόσωμα 17, καθώς και ένα μίγμα σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος (PNA) (13) που στοχεύουν στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17 (CEN-17). Η ειδική υβριδοποίηση στους δύο στόχους έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός διακριτού ερυθρού φθορίζοντος σήματος σε κάθε θέση του γονιδίου HER2 και ενός διακριτού πράσινου φθορίζοντος σήματος σε κάθε κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος 17. Η αξιολόγηση της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 με τη χρήση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), αποτελεί μια πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδο στο όργανο Dako Omnis. Υπάρχει δυνατότητα επιλογής τριών διαφορετικών επικυρωμένων πρωτοκόλλων χρώσης FISH του HER2 στο λογισμικό του σταθμού εργασίας Dako Link Omnis. Τα πρωτόκολλα διαφέρουν μόνο ως προς το χρόνο χώνευσης με πεψίνη, οπότε μπορεί να επιλεγεί χώνευση με πεψίνη για 10 λεπτά (Σύντομο πρωτόκολλο), 15 λεπτά (Μεσαίο πρωτόκολλο) ή 20 λεπτά (Παρατεταμένο πρωτόκολλο) (βλ. περισσότερες πληροφορίες παρακάτω). Το Μεσαίο πρωτόκολλο συνίσταται για αρχική ανάλυση. Μετά από τη χρώση επί του οργάνου Dako Omnis, τα δείγματα επικαλύπτονται με Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) που περιέχει 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) και καλύπτονται με καλυπτρίδα. Με χρήση μικροσκοπίου φθορισμού που διαθέτει κατάλληλα φίλτρα (δείτε το παράρτημα 2), εντοπίζονται καρκινικά κύτταρα και διεξάγεται απαρίθμηση των ερυθρών (HER2) και των πράσινων (CEN-17) σημάτων. Κατόπιν, υπολογίζεται η αναλογία HER2/CEN-17. Τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τομή ιστού χρησιμεύουν ως εσωτερικός μάρτυρας θετικής χρώσης. P04125GR_03/GM333 σελ. 4/56

5 Για λεπτομέρειες, δείτε την ενότητα Ερμηνεία της χρώσης. Καρκίνος του μαστού Συμβουλευτείτε τους Οδηγούς χρήσης του Dako Omnis για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τη φόρτωση και αποφόρτωση πλακιδίων, τα ISH Lids (Dako Omnis), τα αντιδραστήρια, το συνολικό όγκο υγρών και τα απόβλητα. Αντιδραστήρια - Μαστός Υπάρχει δυνατότητα παραγγελίας του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και των συνοδευτικών αντιδραστηρίων ως μεμονωμένων αντιδραστηρίων. Παρεχόμενα υλικά HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, έτοιμο προς χρήση, μίγμα σημασμένων με φυκοερυθρίνη-texas Red ιχνηθετών HER2 DNA και μίγμα σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών CEN-17 PNA, που παρέχεται σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης IQISH. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι το αντιδραστήριο δεν έχει εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, κατά την παραλαβή θα πρέπει να υπάρχει ακόμα ξηρός πάγος. Τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων, των οποίων το περιεχόμενο έχει αποψυχθεί, θα πρέπει πάντοτε να αποθηκεύονται και να υποβάλλονται σε χειρισμό ενώ βρίσκονται σε όρθια θέση. Το φιαλίδιο του αντιδραστηρίου περιέχει ένα επίχρυσο μεταλλικό σφαιρίδιο που συμβάλλει στην ανάμιξη του αντιδραστηρίου με τη χρήση της συσκευής ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device (βλ. Οδηγίες χρήσης της συσκευής ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device). Είναι σημαντική η σχολαστική ανάμιξη του αντιδραστηρίου πριν από την τοποθέτησή του στο όργανο Dako Omnis. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Συνοδευτικά αντιδραστήρια Τα ακόλουθα αντιδραστήρια απαιτούνται επί του οργάνου Dako Omnis για τη διενέργεια της ανάλυσης ενίσχυσης του γονιδίου HER2 με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, πυκνό διάλυμα 20x. Προς αραίωση σε αναλογία 1:20 στη φιάλη μεγάλου όγκου Dako Omnis 3,5 L (Κωδικός GC109). Το προϊόν περιέχει αντιμικροβιακό παράγοντα και αδρανές πράσινο χρώμα για εύκολη αναγνώριση και φιλικότητα προς το χρήστη. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml αιθανόλης 96% (έτοιμο προς χρήση). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml διάλυμα πεψίνης (έτοιμο προς χρήση), ph 2,0. Περιέχει σταθεροποιητή και αντιμικροβιακό παράγοντα. Η πεψίνη αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι το αντιδραστήριο δεν έχει εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, κατά την παραλαβή θα πρέπει να υπάρχει ακόμα ξηρός πάγος. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml, πυκνό αλατούχο διάλυμα-κιτρικό νάτριο 20x. Προς αραίωση σε αναλογία 1:20 στη φιάλη μεγάλου όγκου Dako Omnis 3,5 L (Κωδικός GC109). Το προϊόν περιέχει αντιμικροβιακό παράγοντα, απορρυπαντικό και αδρανές κίτρινο χρώμα για εύκολη αναγνώριση και φιλικότητα προς το χρήστη. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml φθορίζοντος μέσου επικάλυψης (έτοιμο προς χρήση) με DAPI. Παρόλο που τα προαναφερθέντα αντιδραστήρια δεν παρέχονται με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), ακολουθεί σύντομη περιγραφή τους. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευτείτε τις Οδηγίες χρήσης για κάθε συσκευή. Επιπλέον αντιδραστήρια και συσκευές Dako Omnis, Κωδικός GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), Κωδικός GC807 Clearify, Κωδικός GC810 P04125GR_03/GM333 σελ. 5/56

6 Dako Omnis Mixing Device, Κωδικός GC116 ISH Lid, Κωδικός GC102 ISH Cleaning Solution, Κωδικός GC207 Γυάλινες καλυπτρίδες για επικάλυψη (24 mm x 50 mm) Καρκίνος του μαστού Ανατρέξτε στους Βασικούς οδηγούς χρήσης και τους Αναλυτικούς οδηγούς αναφοράς του Dako Omnis σχετικά με τη χρήση των επιπλέον αντιδραστηρίων και συσκευών. Εξοπλισμός και παρελκόμενα μικροσκοπίου Φίλτρα για μικροσκόπιο φθορισμού: DAPI και διπλό φίλτρο FITC/Texas Red ή μονά φίλτρα FITC και Texas Red δείτε το Παράρτημα 2 για λεπτομέρειες. Η χρήση φίλτρου DAPI κατά την υψηλή μεγέθυνση επηρεάζει αρνητικά την ένταση του σήματος. Θα πρέπει να αποφεύγεται η παρατεταμένη έκθεση. Θα πρέπει να χρησιμοποιείται μικροσκόπιο φθορισμού που έχει ως πηγή φωτός έναν λαμπτήρα υδραργύρου 100 watt. Δεν συνιστώνται άλλες πηγές φωτός με αυτά τα φίλτρα. Θήκη αντικειμενοφόρων πλακών μικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειμενοφόρους πλάκες με αρθρωτό κάλυμμα ή παρόμοιος δίσκος). Προφυλάξεις - Μαστός 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελματίες χρήστες. 3. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) περιέχει 10-<25% ανθρακικού αιθυλενίου και 3- <5% sodium chloride. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) φέρει την επισήμανση: H319 P280 Προσοχή P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά μετά το χειρισμό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Ως γενικός κανόνας, άτομα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται με το προϊόν αυτό. Πρέπει να δίνονται προσεκτικές οδηγίες στους χρήστες σχετικά με τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Ανατρέξτε στο φύλλο δεδομένων ασφαλείας υλικού για επιπλέον πληροφορίες. 4. Τα δείγματα ιστού, πριν και μετά τη μονιμοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που εκτίθενται σε αυτά, πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισμό ως δυνητικά μετάδοσης λοίμωξης και να απορρίπτονται με κατάλληλες προφυλάξεις (14). Μην αναρροφάτε με πιπέτα τα αντιδραστήρια με το στόμα και αποφεύγετε την επαφή του δέρματος και των βλεννογόνων με αντιδραστήρια και δείγματα. Αν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή με ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε με άφθονες ποσότητες νερού. 5. Ελαχιστοποιήστε τη μικροβιακή μόλυνση των αντιδραστηρίων ώστε να αποφύγετε εσφαλμένα αποτελέσματα. 6. Μέθοδοι μονιμοποίησης ιστών και πάχη δειγμάτων διαφορετικά από εκείνα που καθορίζονται ενδέχεται να επηρεάσουν τη μορφολογία των ιστών ή/και την ένταση του σήματος. 7. Το αντιδραστήριο έχει αραιωθεί με βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσμα απώλεια της απόδοσης. P04125GR_03/GM333 σελ. 6/56

7 Καρκίνος του μαστού 8. Φοράτε κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. Συμβουλευτείτε το δελτίο δεδομένων ασφαλείας υλικού (MSDS) για επιπλέον πληροφορίες. 9. Το αχρησιμοποίητο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται σύμφωνα με τους τοπικούς, κρατικούς και ομοσπονδιακούς κανονισμούς. Αποθήκευση - Μαστός Φυλάξτε το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) σε θερμοκρασία < 18 C ( 18 C έως 25 C είναι οι συνιστώμενες θερμοκρασίες) σε σκοτεινό χώρο. Διατηρείτε πάντοτε το φιαλίδιο του αντιδραστηρίου που έχει αποψυχθεί σε όρθια θέση. Η ψύξη και απόψυξη του αντιδραστηρίου έως και 10 φορές δεν επηρεάζει την επίδοσή του. Μην αφήνετε το συστατικό αυτό σε θερμοκρασία δωματίου. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και τα συνοδευτικά αντιδραστήρια: το ISH pepsin (Dako Omnis) και το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσμενώς αν εκτεθούν σε θερμότητα. Μην αφήνετε τα συστατικά αυτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και το συνοδευτικό αντιδραστήριο Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσμενώς αν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην φυλάσσετε τα συστατικά αυτά και μην εκτελείτε ανάλυση σε έντονο φως, όπως το άμεσο ηλιακό φως. Φυλάξτε τα συνοδευτικά αντιδραστήρια ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) και Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) σε σκοτεινό χώρο, στους 2-8 C. Φυλάξτε το ISH Pepsin (Dako Omnis) στους 18-8 C. Κατά τη φύλαξη, το καπάκι του φιαλιδίου, καθώς και το καπάκι του επάνω μέρους, θα πρέπει να παραμένουν κλειστά για όλα τα αντιδραστήρια. Τα αραιωμένα διαλύματα (διάλυμα εργασίας του ISH Stringent Wash Buffer και διάλυμα εργασίας του ISH Pre-Treatment Solution) μπορούν να αποθηκευτούν στους 2-8 C για 30 ημέρες. Μην χρησιμοποιείτε κανένα αντιδραστήριο μετά την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία του αντιδραστηρίου. Κατά τη φύλαξη, το καπάκι του αντιδραστηρίου καθώς και το καπάκι του επάνω μέρους, θα πρέπει να παραμένουν κλειστά. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που καθορίζονται, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (15). Δεν υπάρχουν ορατά σημάδια που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος. Επομένως, είναι σημαντικό να αξιολογείτε τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τομή ιστού. Σε περίπτωση που παρατηρηθεί μη αναμενόμενη μορφολογία φθορισμού που δεν είναι δυνατό να εξηγηθεί και υπάρχουν υποψίες για πρόβλημα στο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ή στα συνοδευτικά αντιδραστήρια, επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής υποστήριξης της Dako Σταθερότητα επί του οργάνου Dako Omnis Η σταθερότητα επί του οργάνου του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και των συνοδευτικών αντιδραστηρίων ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) και ISH Pepsin (Dako Omnis) είναι 80 ώρες. Η σταθερότητα του αραιωμένου ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) και του ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) είναι 7 μέρες. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis. Η χρήση ληγμένων αντιδραστηρίων θα προκαλέσει τα εξής: θα εμφανιστεί μια προειδοποίηση από το όργανο Dako Omnis, η κατάσταση όλων των αντικειμενοφόρων πλακών που έχουν χρωματιστεί με το ληγμένο αντιδραστήριο θα αλλάξει σε "ύποπτη" και το ημερολόγιο των αντικειμενοφόρων στο Σταθμό εργασίας θα επισημάνει ότι έχει χρησιμοποιηθεί ληγμένο αντιδραστήριο. P04125GR_03/GM333 σελ. 7/56

8 Καρκίνος του μαστού Προετοιμασία δείγματος - Μαστός Δείγματα από βιοψίες, εκτομές ή εξαιρέσεις πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισμό έτσι ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανάλυση FISH. Για όλα τα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρότυπες μέθοδοι επεξεργασίας ιστού για ανοσοκυτταροχημική χρώση (16). Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη Κατάλληλος για χρήση είναι μόνον ιστός που διατηρείται σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης και είναι εγκλεισμένος σε παραφίνη. Τα δείγματα πρέπει π.χ. να τεμαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm και να μονιμοποιούνται επί ώρες σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης. Κατόπιν οι ιστοί αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά διαλυμάτων αιθανόλης και ξυλενίου και στη συνέχεια εμποτίζονται σε τηγμένη παραφίνη που διατηρείται σε θερμοκρασία που δεν ξεπερνά τους 60 C. Κατάλληλα μονιμοποιημένοι και εγκλεισμένοι ιστοί που φυλάσσονται σε δροσερό χώρο (15-25 C) (16-17)μπορούν να διατηρηθούν επ' άπειρον, προτού τεμαχιστούν και τοποθετηθούν σε αντικειμενοφόρους. Άλλα μονιμοποιητικά δεν είναι κατάλληλα. Τα δείγματα ιστού πρέπει να κόβονται σε τομές 4-6 µm. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες που απαιτούνται για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2 και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Συνιστώνται τουλάχιστον δύο διαδοχικές τομές, μία τομή για παρουσία όγκου κεχρωσμένη με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (χρώση H&E) και μία τομή για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2. Συνιστάται η στερέωση των τομών ιστού σε Dako FLEX IHC Microscope Slides, Κωδικός K8020. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες Superfrost Plus (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) είναι επίσης κατάλληλες. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης των γυάλινων αντικειμενοφόρων πλακών. Τα δείγματα πρέπει να αναλύονται εντός διαστήματος < 6 μηνών από την εκτέλεση της τομής, όταν φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2-25 C. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα δείγματα ιστού πρέπει να τοποθετούνται στο γυαλί και συγκεκριμένα στην καθορισμένη περιοχή χρώσης της αντικειμενοφόρου. Συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για τις διαστάσεις της περιοχή χρώσης της αντικειμενοφόρου. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Μαστός A. Παρασκευή αντιδραστηρίου - Μαστός A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Το φιαλίδιο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) περιέχει ένα επίχρυσο μεταλλικό σφαιρίδιο που συμβάλλει στην ανάμιξη. Προτού φορτώσετε το φιαλίδιο στο Dako Omnis, το αντιδραστήριο θα πρέπει να έχει αποψυχθεί και αναμιχθεί σχολαστικά, καθώς κατά την ψύξη διαχωρίζεται σε φάσεις. Χρησιμοποιήστε τη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device για ανάμιξη των ιχνηθετών. Ακολουθήστε τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω για την ανάμιξη των ιχνηθετών στη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device και συμβουλευτείτε τις Οδηγίες χρήσης της συσκευής ανάμιξης για περισσότερες λεπτομέρειες. 1. Βγάλτε το φιαλίδιο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) από την κατάψυξη. 2. Τοποθετήστε το φιαλίδιο στη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device. 3. Συνδέστε τη συσκευή ανάμιξης και βεβαιωθείτε ότι είναι αναμμένη η πράσινη λυχνία ένδειξης κατάστασης Επιλέξτε το πρόγραμμα ''Απόψυξη + μίξη''. Σημαντικό: Φιαλίδια που φυλάσσονται σε θερμοκρασίες μικρότερες των -25 C θα πρέπει να αποψύχονται (μόλις) πριν τοποθετήσετε το φιαλίδιο στη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device και θα πρέπει να χρησιμοποιείται το πρόγραμμα ''Μίξη''. 4. Αφαιρέστε το φιαλίδιο από τη συσκευή ανάμιξης. P04125GR_03/GM333 σελ. 8/56

9 Καρκίνος του μαστού 5. Ανοίξτε το καπάκι του επάνω μέρους, σπρώξτε το πλήρως προς τα πίσω και αφήστε το σε αυτή τη θέση (συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για λεπτομέρειες). 6. Τοποθετήστε άμεσα το φιαλίδιο στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Σε περίπτωση που κατά την εκτέλεση χρώσης, χρησιμοποιηθεί η δυνατότητα διαδοχικής τοποθέτησης αντιδραστηρίων, βεβαιωθείτε ότι ο χρόνος από την ανάμιξη έως την αναρρόφηση του φιαλιδίου στο Dako Omnis θα είναι τουλάχιστον 10 λεπτά. Ο ιχνηθέτης HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) μπορεί να αποψυχθεί εκ νέου και να χρησιμοποιηθεί έως και 10 φορές. Αναμιγνύετε πάντοτε το μίγμα ιχνηθετών HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) λίγο πριν την τοποθέτησή του στο όργανο. Μην ανακινείτε. Ο συνολικός χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard) για το ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ανέρχεται στις 80 ώρες, όταν αποθηκεύεται στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) θα πρέπει, μετά την περίοδο παραμονής επί του οργάνου Dako Omnis, να μεταφερθεί άμεσα σε θερμοκρασία < 18 C (συνιστάται θερμοκρασία από 18 C έως 25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Παρασκευάστε ένα διάλυμα εργασίας, αραιώνοντας το πυκνό διάλυμα ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) σε αναλογία 1:20 ως εξής: 1. Γεμίστε μια φιάλη μεγάλου όγκου 3,5 L Dako Omnis, η οποία φέρει την επισήμανση PTB (μπλε ετικέτα), μέχρι τη γραμμή πλήρωσης με απιονισμένο νερό (3,325 L). Βεβαιωθείτε ότι η φιάλη μεγάλου όγκου έχει τοποθετηθεί σε οριζόντια επιφάνεια, προτού τη γεμίσετε. 2. Αδειάστε μία φιάλη πυκνού διαλύματος ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 175 ml στη φιάλη μεγάλου όγκου. 3. Μεταφέρετε την αυτοκόλλητη ετικέτα από τη φιάλη πυκνού διαλύματος στη φιάλη μεγάλου όγκου. Κλείστε το καπάκι της φιάλης μεγάλου όγκου και αναστρέψτε μαλακά τη φιάλη μεγάλου όγκου 2-3 φορές. 4. Χρησιμοποιήστε το σαρωτή γραμμωτού κώδικα χειρός Dako Omnis για να αναγνωρίσετε το αντιδραστήριο (σαρώστε την αυτοκόλλητη ετικέτα και τη φιάλη μεγάλου όγκου). 5. Τοποθετήστε αμέσως τη φιάλη μεγάλου όγκου στο όργανο Dako Omnis. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί εντός 7 ημερών όταν φυλάσσεται επί του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C για 30 ημέρες. Μετά τη φύλαξη σε ψυγείο, βεβαιωθείτε ότι θα αφήσετε το αραιωμένο διάλυμα να ισορροπήσει σε θερμοκρασία τουλάχιστον 18 C προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Απορρίψτε το αραιωμένο διάλυμα αν έχει νεφελώδη εμφάνιση. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Παρασκευάστε ένα διάλυμα εργασίας, αραιώνοντας το πυκνό διάλυμα ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) σε αναλογία 1:20 ως εξής: 1. Γεμίστε μια φιάλη μεγάλου όγκου 3,5 L Dako Omnis, η οποία φέρει την επισήμανση PTB (μπλε ετικέτα), μέχρι τη γραμμή πλήρωσης με απιονισμένο νερό (3,325 L). Βεβαιωθείτε ότι η φιάλη μεγάλου όγκου έχει τοποθετηθεί σε οριζόντια επιφάνεια, προτού τη γεμίσετε. 2. Αδειάστε μία φιάλη πυκνού διαλύματος ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 175 ml στη φιάλη μεγάλου όγκου. 3. Μεταφέρετε την αυτοκόλλητη ετικέτα από τη φιάλη πυκνού διαλύματος στη φιάλη μεγάλου όγκου. Κλείστε το καπάκι της φιάλης μεγάλου όγκου και αναστρέψτε μαλακά τη φιάλη μεγάλου όγκου 2-3 φορές. 4. Χρησιμοποιήστε το σαρωτή γραμμωτού κώδικα χειρός Dako Omnis για να αναγνωρίσετε το αντιδραστήριο (σαρώστε την αυτοκόλλητη ετικέτα και στη συνέχεια τη φιάλη μεγάλου όγκου). P04125GR_03/GM333 σελ. 9/56

10 5. Αμέσως, τοποθετήστε τη φιάλη μεγάλου όγκου στο όργανο Dako Omnis. Καρκίνος του μαστού Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί εντός 7 ημερών όταν φυλάσσεται επί του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C για 30 ημέρες. Μετά τη φύλαξη σε ψυγείο, βεβαιωθείτε ότι θα αφήσετε το αραιωμένο διάλυμα να ισορροπήσει σε θερμοκρασία τουλάχιστον 18 C προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Απορρίψτε το αραιωμένο διάλυμα αν έχει νεφελώδη εμφάνιση. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) Το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) είναι ένα αντιδραστήριο έτοιμο προς χρήση. Προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis, ανοίξτε το καπάκι του επάνω μέρους, σπρώξτε το πλήρως προς τα πίσω και αφήστε το σε αυτή τη θέση. Ο συνολικός χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard) για το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ανέρχεται στις 80 ώρες όταν αποθηκεύεται στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Μετά την ολοκλήρωση του κύκλου ανάλυσης, το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) μπορεί να μεταφερθεί σε θερμοκρασία φύλαξης (2-8 C) προκειμένου να διατηρηθεί ο χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard). A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) Το ISH Pepsin (Dako Omnis) είναι ένα αντιδραστήριο έτοιμο προς χρήση. Προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis, βεβαιωθείτε ότι έχει γίνει απόψυξη του αντιδραστηρίου, ανοίξτε το καπάκι του επάνω μέρους του φιαλιδίου, σπρώξτε το πλήρως προς τα πίσω και αφήστε το σε αυτή τη θέση. Ο συνολικός χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard) για το ISH Pepsin (Dako Omnis) ανέρχεται στις 80 ώρες, όταν αποθηκεύεται στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Μετά την ολοκλήρωση του κύκλου ανάλυσης, το ISH Pepsin (Dako Omnis) πρέπει να μεταφερθεί σε θερμοκρασία φύλαξης 18-8 C προκειμένου να διατηρηθεί ο χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard). A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) είναι ένα έτοιμο προς χρήση μέσο επικάλυψης που χρησιμοποιείται εκτός του οργάνου Dako Omnis. Μεταφέρετε το Fluorescence Mounting Medium σε θερμοκρασία φύλαξης (2-8 C) αμέσως μετά τη χρήση. A.7 Πρόσθετα εξαρτήματα Τα ακόλουθα εξαρτήματα θα πρέπει επίσης να τοποθετούνται στο Dako Omnis: απιονισμένο νερό, αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Wash Buffer 20x (Dako Omnis), Κωδικός GC807, Clearify, Κωδικός GC810, ISH Cleaning Solution, Κωδικός GC207 και ISH Lid (Dako Omnis), Κωδικός GC102 όπως διευκρινίζεται στις Οδηγίες χρήσης Dako Omnis. B. Διαδικασία χρώσης - Μαστός B.1 Σημειώσεις σχετικά με τη διαδικασία Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) είναι ο ιχνηθέτης υβριδοποίησης για την αυτοματοποιημένη άμεση δοκιμασία φθορίζουσας σήμανσης υβριδοποίησης in situ (FISH) που πραγματοποιείται επί του οργάνου Dako Omnis και μαζί με τα συνοδευτικά αντιδραστήρια GM300, GM301, GM302, GM303 και GM304 (GM304 εκτός του οργάνου), έχουν σχεδιαστεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Ο χρήστης θα πρέπει να διαβάσει προσεκτικά όλες τις οδηγίες και να εξοικειωθεί με όλα τα συστατικά στοιχεία και τις προφυλάξεις που πρέπει να λαμβάνονται, πριν από τη χρήση τους. P04125GR_03/GM333 σελ. 10/56

11 Καρκίνος του μαστού Η αυτοματοποιημένη διαδικασία χρώσης FISH στο Dako Omnis περιλαμβάνει αποπαραφίνωση των τομών ιστού, ανάκτηση στόχου, χώνευση με πεψίνη, υβριδοποίηση και ισχυρή πλύση. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αποφορτώνονται στο στεγνό σταθμό αποφόρτωσης. Όλα τα βήματα πρωτοκόλλου έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο λογισμικό του Dako Omnis. Συμβουλευτείτε τους Οδηγούς χρήσης του Dako Omnis για οδηγίες σχετικά με την τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών, του ISH Lid, των αντιδραστηρίων, κλπ. Τρία επικυρωμένα πρωτόκολλα HER2 IQFISH: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium και HER2 IQFISH Pepsin Long τα οποία διαφέρουν μόνο ως προς το χρόνο χώνευσης με πεψίνη, έχουν εκ των προτέρων προγραμματιστεί στο λογισμικό Dako Omnis και μπορούν να επιλεγούν για καθεμία από τις πέντε αντικειμενοφόρους του υποδοχέα. Αυτό επιτρέπει τη βελτιστοποίηση της χώνευσης του ιστού, η οποία μπορεί να εξαρτάται από τις συνθήκες πριν από την ανάλυση. Το πρωτόκολλο HER2 IQFISH Pepsin Medium θεωρείται το τυπικό πρωτόκολλο. Τα διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης εμφανίζονται στο σταθμό εργασίας Dako Link Omnis. Επιπλέον, ο χρήστης μπορεί να επιλέξει να χρησιμοποιήσει ένα Template IQFISH protocol. Οι βέλτιστες συνθήκες ενδέχεται να ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο δείγματος και τη μέθοδο προετοιμασίας και θα πρέπει να επικυρώνονται ξεχωριστά από το κάθε εργαστήριο. B.2. Διαδικασία που προηγείται της χρώσης 1. Επιλέξτε το πρωτόκολλο HER2 IQFISH που θα εφαρμοστεί σε κάθε αντικειμενοφόρο από το λογισμικό του σταθμού εργασίας Dako Link Omnis, βάσει των πρωτοκόλλων IQFISH. 2. Εκτυπώστε ετικέτες αντικειμενοφόρων και κολλήστε τις στις γυάλινες αντικειμενοφόρους. 3. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους στον υποδοχέα. Συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για λεπτομέρειες. Ένας υποδοχέας αντικειμενοφόρων μπορεί να χωρέσει από μία έως πέντε αντικειμενοφόρους. Συνιστάται η χρώση τουλάχιστον δύο αντικειμενοφόρων κατά τη διάρκεια μιας εκτέλεσης χρώσης IQFISH του HER2. 4. Τοποθετήστε τον υποδοχέα αντικειμενοφόρων στο Dako Omnis. 5. Τοποθετήστε το ISH Lid (ένα ISH Lid ανά υποδοχέα αντικειμενοφόρων) στο Dako Omnis. 6. Βεβαιωθείτε ότι οι φιάλες μεγάλου όγκου με υγρά βρίσκονται επί του οργάνου και έχουν καταχωρηθεί στο όργανο Dako Omnis. Φιάλες μεγάλου όγκου με υγρά: Clearify (παράγοντας διαύγασης), αραιωμένο ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), αραιωμένο ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) και αραιωμένο Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Τοποθετήστε το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) και το ISH Pepsin (Dako Omnis), το πρόσφατα αναμεμιγμένο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και ISH Cleaning Solution στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι όλα τα καπάκια στο επάνω μέρος των φιαλιδίων είναι ανοιχτά. 8. Ακολουθήστε τις οδηγίες που εμφανίζονται στην οθόνη αφής και επιλέξτε Done για να ξεκινήσετε τη διαδικασία χρώσης. B.3. Διαδικασία χρώσης Μπορείτε να παρακολουθείτε τη διαδικασία χρώσης του HER2 IQFISH στο όργανο Dako Omnis (συνοπτική παρουσίαση στον Πίνακα 1) στο σταθμό εργασίας Dako Link Omnis: Πίνακας 1. Απλοποιημένη επισκόπηση των βημάτων του πρωτοκόλλου IQFISH του HER2. Βήμα Αντιδραστήριο Χρόνος και θερμοκρασία Αποπαραφίνωση Clearify (παράγοντας 10 λεπτά, 38 C διαύγασης) Ανάκτηση στόχου ISH Pre-Treatment Solution 15 λεπτά, 97 C (Dako Omnis) Έκπλυση ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 λεπτά, 32 C (Dako Omnis) Χώνευση* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 λεπτά, 15 λεπτά ή 20 λεπτά Ξήρανση 15 λεπτά, 45 C Μετουσίωση 10 λεπτά, 66 C P04125GR_03/GM333 σελ. 11/56

12 Υβριδοποίηση Ισχυρή πλύση HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 75 λεπτά, 45 C 10 λεπτά, 61 C Καρκίνος του μαστού * Υπάρχει δυνατότητα επιλογής τριών επικυρωμένων χρόνων χώνευσης με πεψίνη μέσω της χρήσης των πρωτοκόλλων HER2 IQFISH που αναφέρθηκαν παραπάνω. Σε περίπτωση που δεν επίκεινται άλλες χρώσεις ISH, μεταφέρετε όλα τα αντιδραστήρια στις συνιστώμενες θερμοκρασίες φύλαξης. B.4. Διαδικασία μετά τη χρώση Αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρους και εφαρμόστε έως 30 µl από το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) που περιέχει DAPI στην περιοχή-στόχο της αντικειμενοφόρου. Η τομή ιστού πρέπει να καλυφθεί εντελώς από το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Τοποθετήστε μια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειμενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν μετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ημερών μετά την επικάλυψη. Ωστόσο, εάν οι αντικειμενοφόροι πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερμοκρασίες θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε σκοτεινό χώρο σε θερμοκρασία 18-8 C. Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός 1. Τα σήματα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Τα φυσιολογικά κύτταρα επιτρέπουν τον εσωτερικό έλεγχο της εκτέλεσης χρώσης. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν 1-2 σαφώς ορατά πράσινα σήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης CEN-17 PNA έχει υβριδοποιηθεί με επιτυχία στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν επίσης 1-2 σαφώς ορατά ερυθρά σήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης HER2 DNA έχει υβριδοποιηθεί με επιτυχία στα γονίδια HER2. Λόγω του τεμαχισμού του ιστού, ορισμένα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να παρουσιάζουν λιγότερα από τα αναμενόμενα δύο σήματα κάθε χρώματος. Αδυναμία εντοπισμού σημάτων σε φυσιολογικά κύτταρα αποτελεί ένδειξη αποτυχίας της δοκιμασίας και τα αποτελέσματα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 3. Κατά την αξιολόγηση με χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική μορφολογία πρέπει να είναι άθικτη. Πολυάριθμα ίχνη κυττάρων και μια γενική πενιχρή πυρηνική μορφολογία υποδηλώνουν υπερβολική πέψη του δείγματος, με αποτέλεσμα απώλεια ή κατατεμαχισμό των σημάτων. Τέτοια δείγματα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 4. Τουλάχιστον 20 καρκινικά κύτταρα θα πρέπει να είναι κατάλληλα για εκτίμηση. 5. Τυχόν διαφορές στη μονιμοποίηση, την επεξεργασία και την ενσωμάτωση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σημαντική μεταβλητότητα στα αποτελέσματα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική αξιολόγηση των εσωτερικών ελέγχων. Ερμηνεία της χρώσης - Μαστός Ιστός κατάλληλος για εκτίμηση Μόνο δείγματα από ασθενείς με διηθητικό καρκίνωμα πρέπει να εξετάζονται. Σε περιστατικά με καρκίνωμα in situ και διηθητικό καρκίνωμα στο ίδιο δείγμα, μόνον το διηθητικό συστατικό πρέπει να βαθμολογείται. Αποφεύγετε περιοχές νέκρωσης και περιοχές όπου τα πυρηνικά όρια είναι αμφίβολα. Μην συμπεριλαμβάνετε πυρήνες που απαιτούν υποκειμενική κρίση. Παραβλέψτε πυρήνες με ασθενή ένταση σήματος και μη ειδικό ή υψηλό υπόβαθρο. Απαρίθμηση σήματος Εντοπίστε τον όγκο εντός του πλαισίου της κεχρωσμένης με H&E αντικειμενοφόρου πλάκας και αξιολογήστε την ίδια περιοχή στην κεχρωσμένη με FISH αντικειμενοφόρο πλάκα. Σαρώστε αρκετές P04125GR_03/GM333 σελ. 12/56

13 Καρκίνος του μαστού περιοχές των καρκινικών κυττάρων έτσι ώστε να λάβετε υπόψη πιθανή ετερογένεια. Επιλέξτε μια περιοχή που έχει καλή κατανομή πυρήνων. Αρχίστε την ανάλυση στο άνω αριστερό τεταρτημόριο της επιλεγμένης περιοχής και, σαρώνοντας από αριστερά προς τα δεξιά, καταμετρήστε τον αριθμό των σημάτων εντός των ορίων κάθε πυρήνα που αξιολογείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες παρακάτω (δείτε επίσης το παράρτημα 2). - Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω, ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήματα στο μεμονωμένο πυρήνα - Καταμετρήστε δύο σήματα που έχουν το ίδιο μέγεθος και διαχωρίζονται από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του σήματος, ως μόνον ένα σήμα - Σε πυρήνες με υψηλά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου HER2 τα σήματα HER2 είναι δυνατό να είναι τοποθετημένα πολύ κοντά μεταξύ τους, σχηματίζοντας μια συστάδα σημάτων. Στις περιπτώσεις αυτές, ο αριθμός των σημάτων HER2 δεν είναι δυνατό να καταμετρηθεί, αλλά πρέπει να εκτιμάται. Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στα πράσινα σήματα, καθώς είναι δυνατό να καλυφθούν από συστάδες σημάτων HER2 καθιστώντας αδύνατη την παρατήρησή τους. Σε περίπτωση αμφιβολίας, παρακαλούμε ελέγξτε τα πράσινα σήματα με χρήση ειδικού φίλτρου FITC. Μην βαθμολογείτε πυρήνες χωρίς σήματα ή με σήματα ενός μόνο χρώματος. Βαθμολογείτε μόνον εκείνους τους πυρήνες με ένα ή περισσότερα σήματα FISH κάθε χρώματος. Οδηγός καταμέτρησης σημάτων 1 Μην καταμετράτε. Οι πυρήνες επικαλύπτονται μεταξύ τους, δεν είναι ορατές όλες οι περιοχές των πυρήνων 2 Δύο πράσινα σήματα, μην βαθμολογείτε τους πυρήνες με σήματα ενός μόνο χρώματος 3 Καταμετρήστε ως 3 πράσινα και 12 ερυθρά σήματα (εκτίμηση συστάδων) 4 Καταμετρήστε ως 1 πράσινο και 1 ερυθρό σήμα. Δύο σήματα του ιδίου μεγέθους και διαχωρισμένα από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του ενός σήματος καταμετρούνται ως ένα 5 Μην καταμετράτε (πυρήνες που έχουν υποστεί ή υπερβολικά υψηλή ή υπερβολικά χαμηλή πέψη). Ελλείποντα σήματα στο κέντρο των πυρήνων (εμφάνιση τύπου donut). 6 Καταμετρήστε ως 2 πράσινα και 3 ερυθρά σήματα. Δύο σήματα του ιδίου μεγέθους και διαχωρισμένα από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του ενός σήματος καταμετρούνται ως ένα 7 Καταμετρήστε ως 1 πράσινα και 5 ερυθρά σήματα 8 Καταμετρήστε ως 3 πράσινα (1 πράσινο εκτός εστίασης) και 3 ερυθρά σήματα 9 Συστάδα ερυθρών σημάτων που αποκρύπτουν πράσινα σήματα, ελέγξτε τα πράσινα σήματα με ειδικό φίλτρο FITC ή μην καταμετράτε Καταγράψτε τις καταμετρήσεις σε έναν πίνακα, όπως παρουσιάζεται στο παράρτημα 1. P04125GR_03/GM333 σελ. 13/56

14 Καρκίνος του μαστού Καταμετρήστε 20 πυρήνες ανά δείγμα ιστού, όταν είναι δυνατό από διακριτές περιοχές όγκων(18). Υπολογίστε την αναλογία HER2/CEN-17 διαιρώντας το συνολικό αριθμό ερυθρών σημάτων HER2 δια του συνολικού αριθμού πράσινων σημάτων CEN-17. Δείγματα με αναλογία HER2/CEN-17 μεγαλύτερη από ή ίση με 2 πρέπει να θεωρούνται ότι φέρουν ενισχυμένο γονίδιο HER2 (3, 18-20). Αποτελέσματα ίσα με ή πλησίον της τιμής αποκλεισμού (1,8-2,2) πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Αν η αναλογία είναι οριακή (1,8-2,2), καταμετρήστε 20 πυρήνες επιπλέον και υπολογίστε εκ νέου την αναλογία για τους 40 πυρήνες. Σε περίπτωση αμφιβολίας, η αντικειμενοφόρος πλάκα του δείγματος πρέπει να βαθμολογείται εκ νέου. Για οριακές περιπτώσεις, είναι απαραίτητη η διαβούλευση μεταξύ του παθολόγου και του θεράποντος ιατρού. Περιορισμοί - Μαστός 1. Για αυτοματοποιημένη χρήση μόνο σε όργανα Dako Omnis. 2. Απαιτείται ειδικευμένη εκπαίδευση για την επιλογή και μονιμοποίηση ιστού, καθώς και για την προετοιμασία των αντικειμενοφόρων, αλλά και για την ερμηνεία χρώσης IQFISH. Η ερμηνεία των χρώσεων του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) δεν θα πρέπει να πραγματοποιείται από άτομα που πάσχουν από αχρωματοψία. 3. Τα αποτελέσματα της μεθόδου FISH εξαρτώνται από το χειρισμό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλμένη μονιμοποίηση, πλύση, στέγνωμα, θέρμανση, σχηματισμός τομών ή μόλυνση με άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να επηρεάσει την υβριδοποίηση των ιχνηθετών. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσματα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των μεθόδων μονιμοποίησης και ενσωμάτωσης ή σε εγγενείς ανωμαλίες εντός του ιστού. 4. Η απόδοση της δοκιμασίας του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) δεν έχει αξιολογηθεί σε δείγματα μαστού με μικροασβεστώσεις. 5. Η επικύρωση του Template IQFISH protocol, αποτελεί ευθύνη του χρήστη. Χαρακτηριστικά απόδοσης Μαστός Αποτελεσματικότητα υβριδοποίησης Η αποτελεσματικότητα της υβριδοποίησης του HER2 IQFISH pharmdx διερευνήθηκε με χρήση 180 τομών ιστού μονιμοποιημένων σε φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη που εξετάστηκαν σε τρία κέντρα μελέτης. Η απαρίθμηση και των 180 τομών ιστών διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες απαρίθμησης του προϊόντος. Η αποτελεσματικότητα της υβριδοποίησης ήταν 100%. Οι αναλογίες HER2/CEN-17 που υπολογίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στις μελέτες χαρακτηριστικών απόδοσης βασίζονται στην καταμέτρηση σημάτων σε 20 πυρήνες, με χρήση των οδηγιών βαθμολόγησης που παρέχονται στην ενότητα "Ερμηνεία της χρώσης" αυτών των Οδηγιών χρήσης. Αναλυτική ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) διερευνήθηκε με χρήση 20 διαφορετικών δειγμάτων ιστού καρκινώματος του μαστού (10 δείγματα με ενισχυμένο γονίδιο HER2 και 10 μη ενισχυμένα δείγματα). Η αναλογία μεταξύ του αριθμού των σημάτων HER2 και των σημάτων CEN-17 υπολογίστηκε με βάση την καταμέτρηση σημάτων σε 20 πυρήνες φυσιολογικών κυττάρων εντός του δείγματος ιστού. Η αναλογία HER2/CEN-17 για τα φυσιολογικά κύτταρα που αναγνωρίστηκε στα 20 δείγματα ιστού καρκινώματος του μαστού ήταν μεταξύ 0,97-1,11. P04125GR_03/GM333 σελ. 14/56

15 Καρκίνος του μαστού Αναλυτική ειδικότητα Οι ιχνηθέτες HER2 DNA στο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) έχουν υποβληθεί σε προσδιορισμό της αλληλουχίας του άκρου τους και χαρτογραφηθεί για την επιβεβαίωση μιας συνολικής κάλυψης 218 kb, συμπεριλαμβανομένου του γονιδίου HER2. Οι ιχνηθέτες CEN-17 PNA στο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) έχουν εξεταστεί με τη μέθοδο FISH, ατομικά και σε συνδυασμό, για την επιβεβαίωση της ειδικής υβριδοποίησής τους στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Για την εξαίρεση της διασταυρούμενης υβριδοποίησης σε χρωμοσώματα εκτός του χρωμοσώματος 17, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε διασπορές μετάφασης σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου της Dako. Αξιολογήθηκαν συνολικά 275 διασπορές μετάφασης με διακριτά σήματα για ειδική υβριδοποίηση των μιγμάτων ιχνηθετών HER2 DNA και CEN-17 PNA. Και στις 275 περιπτώσεις, η υβριδοποίηση ήταν ειδική για το χρωμόσωμα 17. Σε καμία από τις 275 περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκε διασταυρούμενη υβριδοποίηση σε θέσεις σε άλλα χρωμοσώματα. Επομένως, η ειδικότητα του ιχνηθέτη ήταν 100% (275 από 275). Προκειμένου να μετρηθεί η δυνατότητα της δοκιμασίας IQFISH να αναγνωρίζει αποκλειστικά τις ουσίες στόχο HER2 και CEN-17 χωρίς παρεμβολή από άλλες ουσίες, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε δείγματα ιστού καρκινώματος του μαστού, παραλείποντας τους ιχνηθέτες HER2 και CEN-17 από το μίγμα υβριδοποίησης και χρησιμοποιώντας μόνο το ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης. Αξιολογήθηκαν συνολικά 20 δείγματα για παρουσία σημάτων που δεν σχετίζονται με το μίγμα ιχνηθετών. Σε κανένα από τα 20 δείγματα δεν εντοπίστηκαν άλλοι χρωμοσωμικοί στόχοι ούτε παρατηρήθηκε παρεμβολή με στενά σχετιζόμενες ουσίες. Μελέτες ευστάθειας Η ευστάθεια της δοκιμασίας HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε με μεταβολή της συγκέντρωσης ιχνηθέτη PNA, του χρόνου ανάκτησης στόχου, του χρόνου επώασης της πεψίνης, του χρόνου μετουσίωσης, του χρόνου υβριδοποίησης, καθώς και του χρόνου και της θερμοκρασίας ισχυρής πλύσης. Οι διάφορες παράμετροι εξετάστηκαν σε πέντε δείγματα ιστού καρκίνου του μαστού FFPE (αντιπροσωπεύτηκαν τόσο ενισχυμένα όσο και μη ενισχυμένα δείγματα ιστού). Όλες οι παράμετροι εξετάστηκαν σε τιμές μικρότερες και μεγαλύτερες από τις τυπικές ρυθμίσεις πρωτοκόλλων, με εξαίρεση τη συγκέντρωση ιχνηθέτη PNA και τη θερμοκρασία ισχυρής πλύσης στις οποίες η τυπική ρύθμιση πρωτοκόλλου συμπεριλήφθηκε κατά την ανάπτυξη. Οι παράμετροι ελέγχου ήταν: Συγκέντρωση ιχνηθέτη PNA: Εξετάστηκε στο 100% και σε +/-17%. Χρόνος ανάκτησης στόχου: Εξετάστηκε στα 13 λεπτά 45 δευτ. και στα 16 λεπτά 15 δευτ. Χρόνος επώασης της πεψίνης: Εξετάστηκε στα 14 λεπτά 45 δευτ. και στα 16 λεπτά 15 δευτ. Χρόνος μετουσίωσης: Εξετάστηκε στα 9 λεπτά 45 δευτ. και στα 10 λεπτά 45 δευτ. Χρόνος υβριδοποίησης: Εξετάστηκε στα 70 λεπτά και στα 80 λεπτά. Χρόνος ισχυρής πλύσης: Εξετάστηκε στα 8 λεπτά 45 δευτ. και στα 11 λεπτά 15 δευτ. Θερμοκρασία ισχυρής πλύσης: Εξετάστηκε στους 59 C, στους 61 C και στους 63 C. Οι τρεις συγκεντρώσεις ιχνηθέτη PNA αξιολογήθηκαν σε τμηματικό Σχέδιο πειράματος (εργαλείο JMP, SAS), το οποίο διεξήχθη με 12 διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 2. P04125GR_03/GM333 σελ. 15/56

16 Καρκίνος του μαστού Πίνακας 2. Στη μελέτη ευστάθειας χρησιμοποιήθηκαν δώδεκα διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης. Αρ. πρωτοκόλλου ευστάθειας Χρόνος ανάκτησης στόχου (λεπτά) Χρόνος πεψίνης (λεπτά) Χρόνος μετουσίωσης (λεπτά) Παράμετρος ελέγχου Χρόνος υβριδοποίησης (λεπτά) Χρόνος ισχυρής πλύσης (λεπτά) Θερμ. ισχυρής πλύσης ( 0 C) Συγκ. PNA σε μίγμα ιχνηθετών 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Και τα πέντε δείγματα ιστού χρωματίστηκαν και με τα 12 πρωτόκολλα. Η ένδειξη για τη μελέτη ευστάθειας ήταν η ένταση σήματος και η ποιότητα μορφολογίας. Όλα τα πρωτόκολλα παρήγαν χρώση σε όλα τα δείγματα ιστού (60 συνολικά) με σήματα που ήταν έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση, επομένως κατάλληλα για απαρίθμηση σήματος. Επιπλέον, εξετάστηκε η επίπτωση του πάχους του ιστού στα αποτελέσματα της δοκιμασίας HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με μεταβολή του πάχους τομής των δειγμάτων ιστού καρκίνου του μαστού FFPE. Συνολικά πέντε διαδοχικές τομές πέντε δειγμάτων ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού με διαφορετικό πάχος (3, 4, 5, 6 και 7 µm) εξετάστηκαν με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης της αναλογίας HER2/CEN-17 ήταν 5,8% (κυμαίνεται από 4,3% έως 7,1%). Αναπαραγωγιμότητα Εξετάστηκε η εντός εργαστηρίου αναπαραγωγιμότητα από ημέρα σε ημέρα και από παρτίδα σε παρτίδα με χρήση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Η μελέτη σχεδιάστηκε ως εσωτερική, τυφλή, τυχαιοποιημένη μελέτη των αναλογιών του HER2/CEN-17 με χρήση τομών από οκτώ διαφορετικά μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα καρκίνου του μαστού με διαφορετικά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Τα οκτώ δείγματα είχαν εξεταστεί με HercepTest και αντιπροσώπευαν δύο δείγματα με HER2 IHC 0/1+, δύο δείγματα με HER2 IHC 2+, δύο δείγματα με HER2 IHC 3+ και δύο δείγματα προκαθορισμένης αναλογίας FISH HER2/CEN-17 μεταξύ 1,5 και 2,5 που ελήφθη με χρήση του HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731). Κάθε δείγμα χρωματίστηκε με τρεις διαφορετικές παρτίδες HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) επί πέντε μη διαδοχικές ημέρες. Έγινε επεξεργασία 240 χρώσεων ιστού για ολόκληρη τη μελέτη, καθώς έγινε χρώση κάθε συνδυασμού εις διπλούν. Η διακύμανση στις αναλογίες μεταξύ ημερών και παρτίδων απεικονίζεται στην Εικόνα 1. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με χρήση μετασχηματισμού Box-Cox, μέσω ενός μοντέλου τυχαίων επιδράσεων για ομοιογένεια της διασποράς δεδομένων. Ο συνολικός συντελεστής διακύμανσης εκτιμήθηκε στο 4,3% και προσδιορίστηκε ότι η διακύμανση ημέρας και παρτίδας συνέβαλε με 1,5% και 0%, αντίστοιχα. P04125GR_03/GM333 σελ. 16/56

17 Καρκίνος του μαστού Εικόνα 1. Αναλογίες HER2/CEN-17 από μελέτη αναπαραγωγιμότητας εντός εργαστηρίου σε HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), συμπεριλαμβανομένων των τελικών σημείων αναπαραγωγιμότητας από παρτίδα σε παρτίδα και από ημέρα σε ημέρα. Επιπλέον, η αναπαραγωγιμότητα από ημέρα σε ημέρα και από κέντρο σε κέντρο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε εξωτερικά σε μια στρωματοποιημένη, τυφλή μελέτη σε τομές ιστού από 12 διαφορετικά μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα καρκίνου του μαστού, σε τρία κέντρα (ένα κέντρο στις ΗΠΑ και δύο στην Ευρώπη). Τρία δείγματα ήταν HER2 IHC 0/1+, τρία δείγματα ήταν HER2 IHC 2+, τρία δείγματα ήταν HER2 IHC 3+ και τρία δείγματα είχαν προκαθορισμένη αναλογία FISH HER2/CEN-17 μεταξύ 1,5 και 2,5 που ελήφθη με χρήση του HercepTest και του HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731), αντίστοιχα. Η χρώση και η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν στα κέντρα μελέτης. Κάθε δείγμα χρωματίστηκε τουλάχιστον πέντε φορές, σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες, και βαθμολογήθηκε από έναν παρατηρητή σε κάθε κέντρο. 192 τομές υποβλήθηκαν σε χρώση και συμπεριλήφθηκαν στη στατιστική ανάλυση. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με χρήση μετασχηματισμού Box-Cox και υπολογίστηκαν τα στοιχεία διασποράς. Ο συνολικός συντελεστής διακύμανσης με βάση το ανώτερο όριο εμπιστοσύνης 95% ήταν 15%. Η διακύμανση της αναλογίας HER2/CEN-17 για την ημέρα και το κέντρο παρουσιάζεται στην Εικόνα 2. Εικόνα 2. Διάγραμμα μεταβλητότητας των αναλογιών HER2/CEN-17 σε μη μετασχηματισμένες μονάδες από τη μελέτη αναπαραγωγιμότητας από ημέρα σε ημέρα και από κέντρο σε κέντρο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) σε δείγματα ιστού καρκίνου του μαστού. Η δοκιμασία HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε για αναπαραγωγιμότητα από παρατηρητή σε παρατηρητή ως μέρος της συγκριτικής μελέτης μεθόδων που διεξήχθη εσωτερικά με χρήση τριών παρατηρητών για την ανεξάρτητη βαθμολόγηση των δειγμάτων με χρώση. Η αναπαραγωγιμότητα εξετάστηκε σε 140 διαφορετικά δείγματα ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού με μη ενισχυμένο ή με ενισχυμένο γονίδιο HER2. Η ανάλυση των δεδομένων P04125GR_03/GM333 σελ. 17/56

18 Καρκίνος του μαστού πραγματοποιήθηκε με χρήση μετασχηματισμού Box-Cox. Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης από παρατηρητή σε παρατηρητή ήταν 9%. Επαναληψιμότητα Η εντός εργαστηρίου επαναληψιμότητα του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε με χρήση διαδοχικών τομών οκτώ δειγμάτων ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού με μη ενισχυμένο ή με ενισχυμένο γονίδιο HER2. Οι ιστοί εξετάστηκαν εις διπλούν σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες, με τρεις διαφορετικές παρτίδες σε συνολικά 240 αντικειμενοφόρους πλάκες (120 τομές εις διπλούν). Το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων είχε ως αποτέλεσμα μια διασπορά που αποδίδεται στις ημέρες και στις παρτίδες (όπως υποδεικνύεται στην εσωτερική μελέτη αναπαραγωγιμότητας). Η υπολειπόμενη διασπορά είναι ίση με τη διασπορά μεταξύ των επαναλήψεων και επομένως με την επαναληψιμότητα. Το ανώτερο όριο εμπιστοσύνης 95% για το συντελεστή διακύμανσης της επαναληψιμότητας ήταν 4,4%. Συγκριτικές μελέτες μεθόδων Σύγκριση αποτελεσμάτων του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με τα αποτελέσματα του HER2 IQFISH pharmdx Έγινε σύγκριση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με το HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) σε μια συγκριτική μελέτη με 140 δείγματα ιστού ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού. Τα δείγματα απαρτίζονταν από 77 περιστατικά μη ενίσχυσης HER2 και 63 περιστατικά ενίσχυσης HER2 με γνωστή βαθμολογία HercepTest, όπως φαίνεται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Η κατανομή των δειγμάτων με βάση τη βαθμολογία HercepTest και τη βαθμολογία HER2 FISH (κατάσταση γονιδίου HER2) παρήχθη με το HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731). Βαθμολογία χρώσης Σύνολο HercepTest n Κατάσταση HER2 με FISH Ενισχυμένο Μη ενισχυμένο Σύνολο δειγμάτων που εξετάστηκαν με FISH Τα αποτελέσματα της σταυρωτής πινακοποίησης της κατάστασης του γονιδίου HER2 ελήφθησαν από τις δύο δοκιμασίες με υπολογισμό της επί τοις εκατό συνολικής συμφωνίας (OPA), της επί τοις εκατό θετικής συμφωνίας (PPA) και της επί τοις εκατό αρνητικής συμφωνίας (NPA), όπως φαίνεται στον Πίνακα 4. Η συσχέτιση μεταξύ των αναλογιών HER2/CEN-17 με τη χρήση των δύο δοκιμασιών απεικονίζεται στην Εικόνα 3. Πίνακας 4. Σταυρωτή πινακοποίηση της κατάστασης του γονιδίου HER2 που ελήφθη με τη χρήση HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) και HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Κατάσταση γονιδίου HER2 (K5731) Μη ενισχυμένο Ενισχυμένο Σύνολο Κατάσταση γονιδίου Μη ενισχυμένο HER2 (Dako Omnis) Ενισχυμένο Σύνολο OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% P04125GR_03/GM333 σελ. 18/56

19 Καρκίνος του μαστού Εικόνα 3. Συσχέτιση μεταξύ των αναλογιών HER2/CEN-17 με χρήση των HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) σε 140 δείγματα καρκίνου του μαστού (γραμμική προσαρμογή: y = 0,11 + 0,95*x, R 2 = 0,97. Σταθμισμένη με αντίστροφη διασπορά ώστε να είναι δυνατή η γραμμική προσαρμογή). Οι αναλογίες HER2/CEN-17 μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά για ανάλυση. Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% για τη μέση διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων χρώσης σε αναλογία HER2/CEN-17 = 2 ήταν [0,002, 0,031]. Αυτό σημαίνει ότι με εμπιστοσύνη 95% δεν αναμένεται διαφορά υψηλότερη του 3%. Το ενεργό σφάλμα (RMSE) ήταν 9%, υποδεικνύοντας το μέγεθος της μέσης διακύμανσης κοντά στη μέση τιμή. Σύγκριση αποτελεσμάτων του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με τα αποτελέσματα του κιτ ιχνηθετών PathVysion HER-2 DNA Έγινε σύγκριση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με το κιτ ιχνηθετών PathVysion HER- 2 DNA σε μια συγκριτική μελέτη με 140 δείγματα ιστού ανθρώπινου καρκινώματος μαστού. Τα δείγματα απαρτίζονταν από 80 περιστατικά μη ενίσχυσης HER2 και 80 περιστατικά ενίσχυσης HER2 με γνωστή βαθμολογία HercepTest, όπως φαίνεται στον Πίνακα 5. Πίνακας 5. Η κατανομή των δειγμάτων με βάση τη βαθμολογία HercepTest και τη βαθμολογία HER2 FISH (κατάσταση γονιδίου HER2) παρήχθη με το HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731). Βαθμολογία χρώσης Σύνολο HercepTest n Κατάσταση HER2 με FISH Ενισχυμένο Μη ενισχυμένο Σύνολο δειγμάτων που εξετάστηκαν με FISH Τα αποτελέσματα της σταυρωτής πινακοποίησης της κατάστασης του γονιδίου HER2 ελήφθησαν από τις δύο δοκιμασίες με υπολογισμό της επί τοις εκατό συνολικής συμφωνίας (OPA), της επί τοις εκατό θετικής συμφωνίας (PPA) και της επί τοις εκατό αρνητικής συμφωνίας (NPA), όπως φαίνεται στον Πίνακα 6. Η συσχέτιση μεταξύ των αναλογιών HER2/CEN-17 με τη χρήση των δύο δοκιμασιών απεικονίζεται στην Εικόνα 4. P04125GR_03/GM333 σελ. 19/56

20 Καρκίνος του μαστού Πίνακας 6. Σταυρωτή πινακοποίηση της κατάστασης του γονιδίου HER2 που ελήφθη με τη χρήση του κιτ ιχνηθετών PathVysion HER-2 DNA και του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Κατάσταση γονιδίου HER2 (PathVysion) Μη ενισχυμένο Ενισχυμένο Σύνολο Κατάσταση γονιδίου Μη ενισχυμένο HER2 (Dako Omnis) Ενισχυμένο Σύνολο OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Εικόνα 4. Συσχέτιση μεταξύ των αναλογιών HER2/CEN-17 με χρήση των HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και PathVysion σε 140 δείγματα καρκίνου του μαστού (γραμμική προσαρμογή: y = 0,01 + 0,98*x, R 2 = 0,96. Σταθμισμένη με αντίστροφη διασπορά ώστε να είναι δυνατή η γραμμική προσαρμογή). Οι αναλογίες HER2/CEN-17 μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά για ανάλυση. Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% για τη μέση διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων χρώσης σε αναλογία HER2/CEN-17 = 2 ήταν [0,001, 0,031]. Αυτό σημαίνει ότι με εμπιστοσύνη 95% δεν αναμένεται διαφορά υψηλότερη του 3%. Το ενεργό σφάλμα (RMSE) ήταν 10%, υποδεικνύοντας το μέγεθος της μέσης διακύμανσης κοντά στη μέση τιμή. Κλινική χρησιμότητα κατά την επιλογή ασθενών που θα υποβληθούν σε θεραπεία με Herceptin (τραστουζουμάμπη) Το κιτ HER2 FISH pharmdx διερευνήθηκε σε συγκριτικές μελέτες τόσο με το κιτ ιχνηθετών PathVysion HER-2 DNA όσο και με το Dako HercepTest. Διατίθενται αποτελέσματα της δοκιμής FISH του HER2 για συνολικά 940 δείγματα καρκίνου του μαστού. Σύγκριση αποτελεσμάτων του κιτ HER2 FISH pharmdx με τα αποτελέσματα της δοκιμής του κιτ ιχνηθετών PathVysion HER-2 DNA Πραγματοποιήθηκαν τρεις μελέτες που συγκρίνουν τα αποτελέσματα της δοκιμής του κιτ HER2 FISH pharmdx με τα αποτελέσματα της δοκιμής του κιτ ιχνηθετών PathVysion HER-2 DNA (βλ. Πίνακα 7). Οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν σε γεωγραφικά απομακρυσμένες θέσεις και δεν υπήρξε επικάλυψη στη χρήση των δειγμάτων. Εξετάστηκαν συνολικά 328 δείγματα. P04125GR_03/GM333 σελ. 20/56

21 Πίνακας 7. Συνοπτικά δεδομένα συγκριτικών μελετών μεθόδων FISH. Χαρακτηρισμός μελέτης Συμφωνία (διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Επί τοις εκατό θετική συμφωνία (διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία (διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Μελέτη συμφωνίας (δείγματα από Δανία, N=190) 93,68% (90,22% - 97,14%) 86% (77,34% - 95,08%) 97% (94,05% - 99,89%) Μελέτη συμφωνίας (δείγματα από Ιαπωνία, N=52) Καρκίνος του μαστού Μελέτη συμφωνίας (δείγματα από Γαλλία, N=86) (21)* 96,15% Δ/Ε 97% Δ/Ε 96% Δ/Ε * Παρασχέθηκαν συγκριτικά δεδομένα στο άρθρο, αλλά δεν αναγνωρίστηκε η δοκιμασία HER2 FISH. Συνολικά, παρατηρήθηκαν 12 αντιφατικά αποτελέσματα δοκιμής μεταξύ της δοκιμής του κιτ HER2 FISH pharmdx και της δοκιμής του ιχνηθέτη PathVysion HER-2 DNA για τα κλινικά δείγματα από τη Δανία (βλ. Πίνακα 8). Πίνακας 8. Συνοπτικά δεδομένα για τα 12 αντιφατικά αποτελέσματα δοκιμής. HER2 FISH(θετικό)/PathVysion(αρνητικό) #ID Αναλογία HER2 FISH 160 2,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) Αναλογία PathVysion 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) Βαθμολογία HercepTest #ID Αναλογία HER2 FISH ,68 (1,38-1,83) ,44 (1,07-1,83) ,7 (1, ) ,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) HER2 FISH(αρνητικό)/PathVysion(θετικό) Αναλογία PathVysion 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) Βαθμολογία HercepTest 2+ * Το Δ.Ε. των μέσων λογαριθμικών αναλογιών περιλάμβανε την τιμή 2,0. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις είναι το Δ.Ε. 95% Σε αυτήν την ανάλυση ασυμφωνίας χρησιμοποιήθηκαν λογαριθμικές αναλογίες. Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκε για τις 60 λογαριθμικές αναλογίες από τους πυρήνες που είχαν χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της αναλογίας του ιχνηθέτη PathVysion HER-2 DNA. Για τις 4 περιστάσεις στις οποίες το κιτ HER2 FISH pharmdx ήταν θετικό και ο ιχνηθέτης PathVysion HER-2 DNA ήταν αρνητικός, κανένα διάστημα δεν περιλάμβανε την κρίσιμη τιμή 2. Από τις 8 περιστάσεις στις οποίες το κιτ HER2 FISH pharmdx ήταν αρνητικό και ο ιχνηθέτης PathVysion HER-2 DNA ήταν θετικός, το Δ.Ε. 95% σε 3 από αυτές (#234, 284 και 735) περιλάμβανε την κρίσιμη τιμή 2. Παρόμοια, το διάστημα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκε για τις λογαριθμικές αναλογίες από τους πυρήνες που είχαν χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της αναλογίας του κιτ HER2 FISH pharm Dx. Για τις 4 περιστάσεις στις οποίες το κιτ HER2 FISH pharmdx ήταν θετικό και ο ιχνηθέτης PathVysion HER-2 DNA ήταν αρνητικός, οι 2 περιλάμβαναν την κρίσιμη τιμή 2 (#160 και 306). Από τις οκτώ περιστάσεις στις οποίες το κιτ HER2 FISH pharmdx ήταν αρνητικό και ο ιχνηθέτης PathVysion HER-2 DNA ήταν θετικός, το Δ.Ε. 95% σε 1 από αυτές (#881) περιλάμβανε την κρίσιμη τιμή 2. Σύγκριση αποτελεσμάτων του κιτ HER2 FISH pharmdx με τα αποτελέσματα του HercepTest Έχουν διεξαχθεί τέσσερις μελέτες για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων του κιτ HER2 FISH pharmdx και του HercepTest. Έγινε σύγκριση 940 δειγμάτων συνολικά, χρησιμοποιώντας το P04125GR_03/GM333 σελ. 21/56

22 Καρκίνος του μαστού αποτέλεσμα της βαθμολογίας χρώσης 3+ ως θετικό αποτέλεσμα IHC στη δοκιμασία HercepTest (βλ. Πίνακα 9). Πίνακας 9. Σύνοψη των αποτελεσμάτων σύγκρισης του κιτ HER2 FISH pharmdx και του IHC (HercepTest ). Χαρακτηρισμός μελέτης Συμφωνία (διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Επί τοις εκατό θετική συμφωνία (διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία (διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Κλινικά δείγματα από Δανία(N=682) 93,11% (91,21% - 95,01%) 91% (87,39% - 94,57%) 94% (92,12% - 96,46%) Δείγματα από Ιαπωνία (N=52) Γαλλική μελέτη (N=86) (31) Δανική πιλοτική μελέτη (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% Τα δεδομένα κατανομής των αποτελεσμάτων των δοκιμών HercepTest και HER2 FISH για τα κλινικά δείγματα από τη Δανία παρουσιάζονται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Κατανομή της κατάστασης HER2 σύμφωνα με HercepTest και με κιτ HER2 FISH pharmdx. Βαθμολογία χρώσης Σύνολο HercepTest n % % Κατάσταση HER2 με FISH Ενισχυμένο Μη ενισχυμένο Σύνολο δειγμάτων που εξετάστηκαν με FISH P04125GR_03/GM333 σελ. 22/56

23 Καρκίνος του μαστού Αντιμετώπιση προβλημάτων - Μαστός Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 1. Δεν παρουσιάζονται σήματα ή είναι ασθενή 1α. Τα αντιδραστήρια έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς ή της φύλαξης 1β. Το μικροσκόπιο δε λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Ακατάλληλος λαμπτήρας - Ο λαμπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Ακάθαρτοι ή/και ραγισμένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1α. Ελέγξτε τις συνθήκες φύλαξης. Βεβαιωθείτε ότι υπήρχε ξηρός πάγος κατά την παραλαβή της αποστολής του μίγματος ιχνηθετών IQISH και της πεψίνης. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια αποθηκεύτηκαν όπως διευκρινίζεται. 1β. Ελέγξτε το μικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα χρησιμοποιημένα φίλτρα είναι κατάλληλα για χρήση με τα φθοριοχρώματα του μίγματος ιχνηθετών και ότι ο λαμπτήρας υδραργύρου είναι σωστός και δεν έχει χρησιμοποιηθεί πέρα από την αναμενόμενη διάρκεια ζωής του (βλ. Παράρτημα 2). Σε περίπτωση αμφιβολίας, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον τοπικό προμηθευτή του μικροσκοπίου σας. 1γ. Εξασθενημένα σήματα 1γ. Αποφύγετε τη μικροσκοπική εξέταση μακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρές πηγές φωτός. 1δ. Εσφαλμένη αναγνώριση των ρυθμιστικών διαλυμάτων 1δ. Αντικαταστήστε το συνολικό όγκο ρυθμιστικών διαλυμάτων και βεβαιωθείτε για τη σωστή καταχώριση (στο σταθμό εργασίας) και την αναγνώριση (στην οθόνη αφής) των ρυθμιστικών διαλυμάτων. Συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για περισσότερες λεπτομέρειες. Προσοχή: Το ISH Pre-Treatment Solution είναι πράσινο και το ISH Stringent Wash Buffer είναι κίτρινο. P04125GR_03/GM333 σελ. 23/56

24 Καρκίνος του μαστού Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 2. Περιοχές χωρίς σήμα 2. Έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα κατά τη διάρκεια της επικάλυψης 2. Αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα. Αν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε τις ελαφρά με μια λαβίδα ώστε να απομακρυνθούν. 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 4. Πενιχρή μορφολογία ιστού 5. Υψηλό επίπεδο πράσινου αυτοφθορισμού στην αντικειμενοφόρο συμπεριλαμβανομέ νων περιοχών χωρίς ιστό FFPE 3α. Ακατάλληλη μονιμοποίηση ιστού 3β. Παρατεταμένη έκθεση της υβριδιωμένης τομής σε ισχυρό φως 4α. Εσφαλμένη επεξεργασία με διάλυμα πεψίνης 4β. Πάρα πολύ μακρά επεξεργασία με διάλυμα Pepsin ή πάρα πολύ λεπτό πάχος τομής ενδέχεται να προκαλέσει την εμφάνιση κυττάρων-φαντασμάτων ή σχήματος donut 5. Χρήση ληγμένων ή μη συνιστώμενων γυάλινων αντικειμενοφόρων 3α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε αποκλειστικά τομές ιστών μονιμοποιημένες με φορμόλη και εγκλεισμένες σε παραφίνη. 3β. Αποφύγετε τη μικροσκοπική εξέταση μακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρό φως. 4α. Αλλαγή σε κάποιο άλλο από τα τρία διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης. Βεβαιωθείτε ότι το ISH Pepsin (Dako Omnis) φυλάσσεται στη σωστή θερμοκρασία. 4β. Δοκιμάστε ένα πρωτόκολλο χρώσης με συντομότερη διάρκεια επώασης πεψίνης. Βεβαιωθείτε ότι το πάχος των τομών είναι 4-6 µm. 5. Επιλέξτε γυάλινες αντικειμενοφόρους όπως διευκρινίζεται. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης των γυάλινων αντικειμενοφόρων πλακών. Σημείωση: Αν το πρόβλημα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε κάποιο από τα παραπάνω αίτια ή αν η προτεινόμενη διορθωτική ενέργεια δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβλημα, επικοινωνήστε με την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. P04125GR_03/GM333 σελ. 24/56

25 Καρκίνος του μαστού Παράρτημα 1 - Μαστός HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), Κωδικός GM333 Σχήμα βαθμολόγησης Κωδικός αριθμός ημερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Ημερομηνία εκτέλεσης χρώσης: Παρτίδα HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Κωδικός αριθμός δείγματος: Αρ. πυρήνων Βαθμολογία HER2 (ερυθρά) Καταμέτρηση σημάτων σε 20 πυρήνες Βαθμολογία CEN-17 (πράσινα) Αρ. πυρήνων Σύνολο (1-10) Σύνολο (11-20) Βαθμολογία HER2 (ερυθρά) Βαθμολογία CEN-17 (πράσινα) Για τον προσδιορισμό της αναλογίας HER2/CEN-17, καταμετρήστε τον αριθμό σημάτων HER2 και τον αριθμό σημάτων CEN-17 στους ίδιους 20 πυρήνες και διαιρέστε τον συνολικό αριθμό των σημάτων HER2 δια του συνολικού αριθμού των σημάτων CEN-17. Αν η αναλογία HER2/CEN- 17είναι οριακή (1,8-2,2), καταμετρήστε 20 πυρήνες επιπλέον και υπολογίστε εκ νέου την αναλογία για τους 40 πυρήνες. Αναλογία ίση με ή πλησίον της τιμής αποκλεισμού (1,8-2,2) πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή (δείτε τον οδηγό καταμέτρησης). Σύνολο βαθμολογίας (1-20) HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 P04125GR_03/GM333 σελ. 25/56

26 Καρκίνος του μαστού Καταμέτρηση σημάτων σε 20 επιπλέον πυρήνες Αρ. πυρήνων Βαθμολογία HER2 (ερυθρά) Βαθμολογία CEN-17 (πράσινα) Αρ. πυρήνων Σύνολο (21-30) Σύνολο (31-40) Βαθμολογία HER2 (ερυθρά) Βαθμολογία CEN-17 (πράσινα) Υπολογίστε την αναλογία HER2/CEN-17 βάσει των 40 πυρήνων που καταμετρήθηκαν Σύνολο βαθμολογίας (1-40) HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 Αναλογία < 2: δεν παρατηρήθηκε ενίσχυση του γονιδίου HER2 Αναλογία 2: παρατηρήθηκε ενίσχυση του γονιδίου HER2 Ημερομηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ημερομηνία και υπογραφή, Παθολόγος: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθμολόγησης: Βλ. Ερμηνεία χρώσεων. P04125GR_03/GM333 σελ. 26/56

27 Καρκίνος του μαστού Παράρτημα 2 - Μαστός HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), Κωδικός GM333 Προδιαγραφές μικροσκοπίου φθορισμού Η Dako συνιστά τον ακόλουθο εξοπλισμό για χρήση με το HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Τύπος μικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισμού 2. Λαμπτήρας Λαμπτήρας υδραργύρου 100 W (διατηρείτε αρχείο του χρόνου λειτουργίας του λαμπτήρα) 3. Αντικειμενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισμού 16X ή 20X Για μεγέθυνση υψηλής ισχύος και απαρίθμηση των σημάτων, συνιστώνται μόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειμενικοί φακοί φθορισμού, π.χ. 100x 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατομικά για ειδικά φθοριοχρώματα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Η Dako συνιστά τη χρήση ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασμό με διπλό φίλτρο Texas Red/FITC υψηλής ποιότητας. Φίλτρο DAPI Διπλό φίλτρο Texas Red/FITC Για επιβεβαίωση και απαρίθμηση είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν μονά φίλτρα Texas Red και FITC Φθοριόχρωμα Μήκος κύματος διέγερσης Μήκος κύματος εκπομπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο μικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι κρίσιμης σημασίας για την ερμηνεία. Εάν θέλετε λεπτομερείς πληροφορίες, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον προμηθευτή του μικροσκοπίου σας ή με τον αντιπρόσωπο της Dako. 5. Έλαιο Μη φθορίζον έλαιο Προφυλάξεις Δεν συνιστάται χρήση λαμπτήρα υδραργύρου 50 W Δεν είναι δυνατή η χρήση φίλτρων ροδαμίνης Δεν συνιστώνται τριπλά φίλτρα Ένα μη βελτιστοποιημένο μικροσκόπιο είναι δυνατό να προκαλέσει προβλήματα κατά την ανάγνωση των σημάτων φθορισμού. Είναι σημαντικό να μην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραμμιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να ακολουθούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαμπτήρα υδραργύρου. Το μικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται και ο λαμπτήρας υδραργύρου πρέπει να είναι σε ευθυγράμμιση πριν από την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγματος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισμού. Συνιστούμε να συζητήσετε την εγκατάσταση του συγκεκριμένου μικροσκοπίου σας με τον κατασκευαστή πριν από την έναρξη της φθορίζουσας σήμανσης υβριδοποίησης in situ ή να ανατρέξετε στη βιβλιογραφία. P04125GR_03/GM333 σελ. 27/56

28 Γαστρικός καρκίνος Περίληψη και επεξήγηση - Στόμαχος Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό επίσης ως ERBB2 ή NEU) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17 και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι μια κινάση τυροσίνης μεμβρανικού υποδοχέα με ομολογία για τον επιδερμικό υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (EGFR ή HER1) (1-2). Το γονίδιο HER2 υπάρχει σε δύο αντίγραφα σε όλα τα φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα. Πολλές μελέτες έδειξαν ότι υπάρχει υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 και ενίσχυση του γονιδίου HER2 στις περιπτώσεις καρκίνου του στομάχου (ανασκόπηση στο (23)). Η θετικότητα σχετικά με το HER2 μπορεί να ανιχνευθεί σε περίπου 20% των ασθενών είτε με IHC είτε με FISH (23). Οι προκλινικές μελέτες in vitro και in vivo έδειξαν ότι η τραστουζουμάμπη (Herceptin ) είναι αποτελεσματική σε διάφορους τύπους καρκίνου του στομάχου, δίνοντας έτσι αφορμή για την έναρξη κλινικών μελετών (23-27). Όλοι οι ασθενείς στη μελέτη φάσης III BO18255 (ToGA "Τυχαιοποιημένη, πολυκεντρική μελέτη φάσης III ανοικτής επισήμανσης της τραστουζουμάμπης σε συνδυασμό με μια φθοριοπυριμιδίνη και σισπλατίνη έναντι χημειοθεραπείας μόνο, ως πρώτη γραμμή θεραπείας σε HER2 θετικό προχωρημένο καρκίνο του στομάχου") που χρηματοδοτείται από τη Hoffmann-La Roche AG επελέγησαν χρησιμοποιώντας το Dako HercepTest (IHC) και το κιτ Dako HER2 FISH pharmdx (FISH) με τη θετικότητα σε HER2 να ορίζεται ως IHC 3+ ή FISH+ (HER2/CEN 17 2,0). Η μελέτη δείχνει την κλινική χρησιμότητα τόσο του HercepTest (IHC) όσο και του κιτ HER2 FISH pharmdx (FISH) για την αξιολόγηση της κατάστασης του HER2 σε ασθενείς με προχωρημένο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ή αδενοκαρκίνωμα της γαστροοισοφαγικής συμβολής για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόμενο θεραπείας με τραστουζουμάμπη (28). Δεν εντάχθηκαν ασθενείς με όγκους που δεν παρουσίαζαν ενίσχυση του γονιδίου αλλά αμυδρή ή ισχυρή υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 [FISH(-)/IHC 2+]. Ως εκ τούτου παραμένει ασαφές το εάν ασθενείς με όγκους που δεν παρουσιάζουν ενίσχυση γονιδίου αλλά υπερέκφραση πρωτεΐνης HER2 [δηλ., FISH(-), IHC 2+ ή 3+] μπορούν να ωφεληθούν από μια θεραπεία με Herceptin. Η μελέτη δείχνει επίσης ότι η ενίσχυση γονιδίου (FISH) και η υπερέκφραση πρωτεΐνης (IHC) δεν παρουσιάζουν τον ίδιο βαθμό συσχέτισης όπως στις περιπτώσεις καρκίνου του μαστού, επομένως δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται μία και μόνη μέθοδος για τον προσδιορισμό της κατάστασης του HER2. Το συγκεκριμένο προϊόν (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) είναι ένα μίγμα ιχνηθετών IQISH για αυτοματοποιημένο άμεσο εντοπισμό μέσω FISH της ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Το προϊόν θα πρέπει να χρησιμοποιείται μαζί με τα καθορισμένα συνοδευτικά αντιδραστήρια επί του οργάνου Dako Omnis και προέρχεται από τη μη αυτόματη δοκιμασία ενίσχυσης του γονιδίου HER2, τη HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός K5731. Αρχή της διαδικασίας - Στόμαχος Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) είναι ένας ιχνηθέτης IQISH αποτελούμενος από ένα μίγμα σημασμένων με φυκοερυθρίνη-texas Red ιχνηθετών DNA που καλύπτουν μια περιοχή 218 kb η οποία περιλαμβάνει το γονίδιο HER2 στο χρωμόσωμα 17 καθώς και ένα μίγμα σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών πεπτιδικού νουκλεϊκού οξέος (PNA) (13) που στοχεύουν στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17 (CEN-17). Η ειδική υβριδοποίηση στους δύο στόχους έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός διακριτού ερυθρού φθορίζοντος σήματος σε κάθε θέση γονιδίου HER2 και ενός διακριτού πράσινου φθορίζοντος σήματος σε κάθε κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος 17. Η αξιολόγηση της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 με τη χρήση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), αποτελεί μια πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδο στο όργανο Dako Omnis. Υπάρχει δυνατότητα επιλογής τριών διαφορετικών επικυρωμένων πρωτοκόλλων χρώσης FISH του HER2 στο λογισμικό του σταθμού εργασίας Dako Link Omnis. Τα πρωτόκολλα διαφέρουν μόνο ως προς το χρόνο χώνευσης με πεψίνη, οπότε μπορεί να επιλεγεί χώνευση με πεψίνη για 10 λεπτά (Σύντομο πρωτόκολλο), 15 λεπτά (Μεσαίο πρωτόκολλο) ή 20 λεπτά (Παρατεταμένο P04125GR_03/GM333 σελ. 28/56

29 Γαστρικός καρκίνος πρωτόκολλο) (βλ. περισσότερες πληροφορίες παρακάτω). Το Μεσαίο πρωτόκολλο συνίσταται για αρχική ανάλυση. Μετά από τη χρώση επί του οργάνου Dako Omnis, τα δείγματα επικαλύπτονται με Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) που περιέχει 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) και καλύπτονται με καλυπτρίδα. Με χρήση μικροσκοπίου φθορισμού που διαθέτει κατάλληλα φίλτρα (δείτε το παράρτημα 5), εντοπίζονται καρκινικά κύτταρα και διεξάγεται απαρίθμηση των ερυθρών (HER2) και των πράσινων (CEN-17) σημάτων. Κατόπιν, υπολογίζεται η αναλογία HER2/CEN-17. Τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τομή ιστού χρησιμεύουν ως εσωτερικός θετικός μάρτυρας της αποτελεσματικότητας της προεπεξεργασίας και της υβριδοποίησης. Για λεπτομέρειες, δείτε την ενότητα Ερμηνεία της χρώσης. Συμβουλευτείτε τους Οδηγούς χρήσης του Dako Omnis για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τη φόρτωση και αποφόρτωση των αντικειμενοφόρων πλακών, τα ISH Lids (Dako Omnis), Κωδικός GC102, τα αντιδραστήρια, τα υγρά μεγάλου όγκου και τα απόβλητα. Αντιδραστήρια - Στόμαχος Υπάρχει δυνατότητα παραγγελίας του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και των συνοδευτικών αντιδραστηρίων ως μεμονωμένων αντιδραστηρίων. Παρεχόμενα υλικά HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, έτοιμο προς χρήση, μίγμα σημασμένων με φυκοερυθρίνη-texas Red ιχνηθετών HER2 DNA και μίγμα σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ιχνηθετών CEN-17 PNA, που παρέχεται σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης IQISH. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι το αντιδραστήριο δεν έχει εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, κατά την παραλαβή θα πρέπει να υπάρχει ακόμα ξηρός πάγος. Τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων, των οποίων το περιεχόμενο έχει αποψυχθεί, θα πρέπει πάντοτε να αποθηκεύονται και να υποβάλλονται σε χειρισμό ενώ βρίσκονται σε όρθια θέση. Το φιαλίδιο του αντιδραστηρίου περιέχει ένα επίχρυσο μεταλλικό σφαιρίδιο που συμβάλλει στην ανάμιξη του αντιδραστηρίου με τη χρήση της συσκευής ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device (βλ. Οδηγίες χρήσης της συσκευής ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device). Είναι σημαντική η σχολαστική ανάμιξη του αντιδραστηρίου πριν από την τοποθέτησή του στο όργανο Dako Omnis. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Συνοδευτικά αντιδραστήρια Τα ακόλουθα αντιδραστήρια απαιτούνται επί του οργάνου Dako Omnis για τη διενέργεια της ανάλυσης ενίσχυσης του γονιδίου HER2 με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, πυκνό διάλυμα 20x. Προς αραίωση σε φιάλη μεγάλου όγκου Dako Omnis 3,5 L (Κωδικός GC109). Το προϊόν περιέχει αντιμικροβιακό παράγοντα και αδρανές πράσινο χρώμα για εύκολη αναγνώριση και φιλικότητα προς το χρήστη. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml αιθανόλης 96% (έτοιμο προς χρήση). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml διάλυμα πεψίνης (έτοιμο προς χρήση), ph 2,0. Περιέχει σταθεροποιητή και αντιμικροβιακό παράγοντα. Η πεψίνη αποστέλλεται σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι το αντιδραστήριο δεν έχει εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, κατά την παραλαβή θα πρέπει να υπάρχει ακόμα ξηρός πάγος. ISH Stringent Wash Buffer ISH (20x) (Dako Omnis): 175 ml, πυκνό αλατούχο διάλυμα-κιτρικό νάτριο 20x. Προς αραίωση σε αναλογία 1:20 σε φιάλη μεγάλου όγκου Dako Omnis 3,5 L (GC109). Το προϊόν περιέχει αντιμικροβιακό παράγοντα, απορρυπαντικό και αδρανές κίτρινο χρώμα για εύκολη αναγνώριση και φιλικότητα προς το χρήστη. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml φθορίζοντος μέσου επικάλυψης (έτοιμου προς χρήση) με DAPI. P04125GR_03/GM333 σελ. 29/56

30 Γαστρικός καρκίνος Παρόλο που τα προαναφερθέντα αντιδραστήρια δεν παρέχονται με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), ακολουθεί σύντομη περιγραφή τους. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευτείτε τις Οδηγίες χρήσης για κάθε συσκευή. Επιπλέον αντιδραστήρια και συσκευές Dako Omnis, Κωδικός GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), Κωδικός GC807 Clearify TM, Κωδικός GC810 Dako Omnis Mixing Device, Κωδικός GC116 ISH Lid, Κωδικός GC102 ISH Cleaning Solution, Κωδικός GC207 Γυάλινες καλυπτρίδες για επικάλυψη (24 mm x 50 mm) Ανατρέξτε στους Βασικούς οδηγούς χρήσης και τους Αναλυτικούς οδηγούς αναφοράς του Dako Omnis σχετικά με τη χρήση των επιπλέον αντιδραστηρίων και συσκευών. Εξοπλισμός και παρελκόμενα μικροσκοπίου Φίλτρα για μικροσκόπιο φθορισμού: DAPI και διπλό φίλτρο FITC/Texas Red, ή FITC και μονά φίλτρα Texas Red - βλ. Παράρτημα 5 για λεπτομέρειες. Η χρήση φίλτρου DAPI κατά την υψηλή μεγέθυνση επηρεάζει αρνητικά την ένταση του σήματος. Θα πρέπει να αποφεύγεται η παρατεταμένη έκθεση. Θα πρέπει να χρησιμοποιείται μικροσκόπιο φθορισμού που έχει ως πηγή φωτός έναν λαμπτήρα υδραργύρου 100 watt. Δεν συνιστώνται άλλες πηγές φωτός με αυτά τα φίλτρα. Θήκη αντικειμενοφόρων πλακών μικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειμενοφόρους πλάκες με αρθρωτό κάλυμμα ή παρόμοιος δίσκος) Προφυλάξεις - Στόμαχος 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελματίες χρήστες. 3. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) περιέχει 10-<25% ανθρακικού αιθυλενίου και 3- <5% sodium chloride. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) φέρει την επισήμανση: Προσοχή H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά μετά το χειρισμό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Ως γενικός κανόνας, άτομα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται με το προϊόν αυτό. Πρέπει να δίνονται προσεκτικές οδηγίες στους χρήστες σχετικά με τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Ανατρέξτε στο φύλλο δεδομένων ασφαλείας υλικού για επιπλέον πληροφορίες. P04125GR_03/GM333 σελ. 30/56

31 Γαστρικός καρκίνος 4. Τα δείγματα ιστού, πριν και μετά τη μονιμοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που εκτίθενται σε αυτά, πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισμό ως δυνητικά μετάδοσης λοίμωξης και να απορρίπτονται με κατάλληλες προφυλάξεις (14). Μην αναρροφάτε με πιπέτα τα αντιδραστήρια με το στόμα και αποφεύγετε την επαφή του δέρματος και των βλεννογόνων με αντιδραστήρια και δείγματα. Αν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή με ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε με άφθονες ποσότητες νερού. 5. Ελαχιστοποιήστε τη μικροβιακή μόλυνση των αντιδραστηρίων ώστε να αποφύγετε εσφαλμένα αποτελέσματα. 6. Μέθοδοι μονιμοποίησης ιστών και πάχη δειγμάτων διαφορετικά από εκείνα που καθορίζονται ενδέχεται να επηρεάσουν τη μορφολογία των ιστών ή/και την ένταση του σήματος. 7. Το αντιδραστήριο έχει αραιωθεί με βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσμα απώλεια της απόδοσης. 8. Φοράτε κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. Παρακαλούμε ανατρέξτε στο δελτίο δεδομένων ασφαλείας υλικού (MSDS) για επιπλέον πληροφορίες. 9. Το αχρησιμοποίητο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται σύμφωνα με τους τοπικούς, κρατικούς και ομοσπονδιακούς κανονισμούς. 10. Εξαιτίας της ετερογενούς φύσης των δειγμάτων του καρκίνου του στομάχου, είναι σημαντικό να εκτελείται λεπτομερής σάρωση ολόκληρου του δείγματος για να εκτιμηθεί η διανομή του σήματος προτού επιλεγεί η περιοχή για την απαρίθμηση των σημάτων. 11. Δεν συνιστάται η εκτίμηση πολύ μικρών δειγμάτων (δηλαδή τα δείγματα πρέπει να έχουν άθικτη μορφολογία και επαρκείς πυρήνες για την απαρίθμηση). 12. Αν γίνει ανάλυση FISH του HER2 σε ένα δείγμα βιοψίας, πρέπει να αναλυθούν πολλαπλές βιοψίες (7-8) από διαφορετικές περιοχές του όγκου για να διασφαλιστεί ο αξιόπιστος προσδιορισμός της κατάστασης HER Για την αναγνώριση όλων των πυρήνων ιστού σε ένα δείγμα βιοψίας είναι σημαντικό να επιθεωρείται η κεχρωσμένη με H&E αντικειμενοφόρος πλάκα. 14. Η ενίσχυση του γονιδίου HER2 και η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, στην περίπτωση του γαστρικού καρκίνου δεν παρουσιάζουν τον ίδιο βαθμό συσχέτισης όπως στις περιπτώσεις καρκίνου του μαστού. Επομένως δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται μία και μόνη μέθοδος για τον καθορισμό της κατάστασης του HER2. Φύλαξη - Στόμαχος Φυλάξτε το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) σε θερμοκρασία < 18 C ( 18 C έως 25 C είναι οι συνιστώμενες θερμοκρασίες) σε σκοτεινό χώρο. Διατηρείτε πάντοτε το φιαλίδιο του αντιδραστηρίου που έχει αποψυχθεί σε όρθια θέση. Η ψύξη και απόψυξη του αντιδραστηρίου έως και 10 φορές δεν επηρεάζει την επίδοσή του. Μην αφήνετε το συστατικό αυτό σε θερμοκρασία δωματίου. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και τα συνοδευτικά αντιδραστήρια ISH pepsin (Dako Omnis) και Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσμενώς αν εκτεθούν σε θερμότητα. Μην αφήνετε τα συστατικά αυτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και τα συνοδευτικά αντιδραστήρια Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ενδέχεται να επηρεαστούν δυσμενώς αν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην φυλάσσετε τα συστατικά αυτά και μην εκτελείτε ανάλυση σε έντονο φως, όπως το άμεσο ηλιακό φως. Φυλάξτε τα συνοδευτικά αντιδραστήρια ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) και Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) σε σκοτεινό χώρο, στους 2-8 C. Φυλάξτε το ISH Pepsin (Dako Omnis) στους 18-8 C. Κατά τη φύλαξη, το καπάκι του φιαλιδίου, καθώς και το καπάκι του επάνω μέρους, θα πρέπει να παραμένουν κλειστά για όλα τα αντιδραστήρια. P04125GR_03/GM333 σελ. 31/56

32 Γαστρικός καρκίνος Τα αραιωμένα διαλύματα (διάλυμα εργασίας του ISH Stringent Wash Buffer και διάλυμα εργασίας του ISH Pre-Treatment Solution) μπορούν να αποθηκευτούν στους 2-8 C για 30 ημέρες. Μην χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια μετά την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία του αντιδραστηρίου. Κατά τη φύλαξη, το καπάκι καθώς και το καπάκι του επάνω μέρους θα πρέπει να παραμένουν κλειστά. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που καθορίζονται, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (15). Δεν υπάρχουν ορατά σημάδια που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος. Επομένως, είναι σημαντικό να αξιολογείτε τα φυσιολογικά κύτταρα στην αναλυθείσα τομή ιστού. Σε περίπτωση που παρατηρηθεί μη αναμενόμενη μορφολογία φθορισμού που δεν είναι δυνατό να εξηγηθεί και υπάρχουν υποψίες για πρόβλημα στο HER2 IQFISH pharmdx επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής υποστήριξης της Dako. Σταθερότητα επί του οργάνου Dako Omnis Η σταθερότητα του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και των συνοδευτικών αντιδραστηρίων: ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) και ISH Pepsin (Dako Omnis) είναι 80 ώρες. Η σταθερότητα του αραιωμένου ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) και του ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) είναι 7 μέρες. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis. Η χρήση ληγμένων αντιδραστηρίων θα προκαλέσει τα εξής: θα εμφανιστεί μια προειδοποίηση από το όργανο Dako Omnis, η κατάσταση όλων των αντικειμενοφόρων πλακών που έχουν χρωματιστεί με το ληγμένο αντιδραστήριο θα αλλάξει σε "ύποπτη" και το ημερολόγιο των αντικειμενοφόρων στο Σταθμό εργασίας θα επισημάνει ότι έχει χρησιμοποιηθεί ληγμένο αντιδραστήριο. Προετοιμασία δείγματος - Στόμαχος Δείγματα από βιοψίες, εκτομές ή εξαιρέσεις από γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ή αδενοκαρκίνωμα της γαστροοισοφαγικής συμβολής πρέπει να υποβάλλονται σε χειρισμό έτσι ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανάλυση FISH. Για όλα τα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρότυπες μέθοδοι επεξεργασίας ιστού για ανοσοκυτταροχημική χρώση (16). Για τις δοκιμές σε μικρά δείγματα βιοψίας, βεβαιωθείτε ότι η μορφολογία του όγκου είναι άθικτη και ότι υπάρχουν αρκετά κύτταρα του όγκου για απαρίθμηση. Αν γίνει ανάλυση FISH του HER2 σε ένα δείγμα βιοψίας, πρέπει να αναλυθούν πολλαπλές βιοψίες (7-8) από διαφορετικές περιοχές του όγκου για να διασφαλιστεί ο αξιόπιστος προσδιορισμός της κατάστασης HER2. Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη Κατάλληλος για χρήση είναι μόνον ιστός που διατηρείται σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης και είναι εγκλεισμένος σε παραφίνη. Τα δείγματα πρέπει π.χ. να τεμαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm και να μονιμοποιούνται επί ώρες σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης. Δείγματα βιοψίας μονιμοποιήθηκαν για 6-8 ώρες κατά τη δοκιμή ToGA [για βιβλιογραφικές αναφορές της μελέτης, ανατρέξτε στο (28)]. Κατόπιν οι ιστοί αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά διαλυμάτων αιθανόλης και ξυλενίου και στη συνέχεια εμποτίζονται σε τηγμένη παραφίνη που διατηρείται σε θερμοκρασία που δεν ξεπερνά τους 60 C. Κατάλληλα μονιμοποιημένοι και εγκλεισμένοι ιστοί που φυλάσσονται σε δροσερό χώρο (15-25 C) (16 17)μπορούν να διατηρηθούν επ' άπειρον, προτού τεμαχιστούν και τοποθετηθούν σε αντικειμενοφόρους. Άλλα μονιμοποιητικά δεν είναι κατάλληλα. Τα δείγματα ιστού πρέπει να κόβονται σε τομές 3-6 µm. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες που απαιτούνται για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2 και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Συνιστώνται τουλάχιστον δύο διαδοχικές τομές, μία τομή για παρουσία όγκου κεχρωσμένη με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (χρώση H&E) και μία τομή για την ανάλυση ενίσχυσης γονιδίου HER2. Συνιστάται η στερέωση των τομών ιστού σε Dako FLEX IHC Microscope Slides, Κωδικός K8020. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες Superfrost Plus (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) είναι επίσης κατάλληλες. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης των γυάλινων P04125GR_03/GM333 σελ. 32/56

33 Γαστρικός καρκίνος αντικειμενοφόρων πλακών. Τα δείγματα πρέπει να αναλύονται εντός διαστήματος < 6 μηνών από την εκτέλεση της τομής, όταν φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2-25 C. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα δείγματα ιστού πρέπει να τοποθετούνται στο γυαλί, στην καθορισμένη περιοχή χρώσης της αντικειμενοφόρου. Συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για τις διαστάσεις της περιοχή χρώσης της αντικειμενοφόρου. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Στόμαχος A. Παρασκευή αντιδραστηρίου - Στόμαχος A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Το φιαλίδιο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) περιέχει ένα επίχρυσο μεταλλικό σφαιρίδιο που συμβάλλει στην ανάμιξη. Προτού φορτώσετε το φιαλίδιο στο Dako Omnis, το αντιδραστήριο θα πρέπει να έχει αποψυχθεί και αναμιχθεί σχολαστικά, καθώς κατά την ψύξη διαχωρίζεται σε φάσεις. Χρησιμοποιήστε τη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device για ανάμιξη των ιχνηθετών. Ακολουθήστε τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω για την ανάμιξη των ιχνηθετών στη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device και συμβουλευτείτε τις Οδηγίες χρήσης της συσκευής ανάμιξης για περισσότερες λεπτομέρειες. 1. Βγάλτε το φιαλίδιο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) από την κατάψυξη 2. Τοποθετήστε το φιαλίδιο στη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device 3. Συνδέστε τη συσκευή ανάμιξης και βεβαιωθείτε ότι είναι αναμμένη η πράσινη λυχνία ένδειξης κατάστασης 4. Επιλέξτε το πρόγραμμα ''Απόψυξη + μίξη''. Σημαντικό: Φιαλίδια που φυλάσσονται σε θερμοκρασίες μικρότερες των -25 C θα πρέπει να αποψύχονται (μόλις) πριν τοποθετήσετε το φιαλίδιο στη συσκευή ανάμιξης Dako Omnis Mixing Device και θα πρέπει να χρησιμοποιείται το πρόγραμμα ''Μίξη''. 5. Αφαιρέστε το φιαλίδιο από τη συσκευή ανάμιξης. 6. Ανοίξτε το καπάκι του επάνω μέρους, σπρώξτε το πλήρως προς τα πίσω και αφήστε το σε αυτή τη θέση (συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για λεπτομέρειες). 7. Τοποθετήστε άμεσα το φιαλίδιο στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Σε περίπτωση που κατά την εκτέλεση χρώσης, χρησιμοποιηθεί η δυνατότητα διαδοχικής τοποθέτησης αντιδραστηρίων, βεβαιωθείτε ότι ο χρόνος από την ανάμιξη έως την αναρρόφηση του φιαλιδίου στο Dako Omnis θα είναι τουλάχιστον 10 λεπτά. Ο ιχνηθέτης HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) μπορεί να αποψυχθεί εκ νέου και να χρησιμοποιηθεί έως και 10 φορές. Αναμιγνύετε πάντοτε το μίγμα ιχνηθετών HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) λίγο πριν την τοποθέτησή του στο όργανο. Μην ανακινείτε. Ο συνολικός χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard) για το ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ανέρχεται στις 80 ώρες, όταν αποθηκεύεται στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) θα πρέπει, μετά την περίοδο παραμονής επί του οργάνου Dako Omnis, να μεταφερθεί άμεσα σε θερμοκρασία < 18 C (συνιστάται θερμοκρασία από 18 C έως 25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Παρασκευάστε ένα διάλυμα εργασίας, αραιώνοντας το πυκνό διάλυμα ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) σε αναλογία 1:20 ως εξής: P04125GR_03/GM333 σελ. 33/56

34 Γαστρικός καρκίνος 1. Γεμίστε μια φιάλη μεγάλου όγκου 3,5 L Dako Omnis, η οποία φέρει την επισήμανση PTB (μπλε ετικέτα), μέχρι τη γραμμή πλήρωσης με απιονισμένο νερό (3,325 L). Βεβαιωθείτε ότι η φιάλη μεγάλου όγκου έχει τοποθετηθεί σε οριζόντια επιφάνεια, προτού τη γεμίσετε. 2. Αδειάστε μία φιάλη πυκνού διαλύματος ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 175 ml στη φιάλη μεγάλου όγκου. 3. Μεταφέρετε την αυτοκόλλητη ετικέτα από τη φιάλη πυκνού διαλύματος στη φιάλη μεγάλου όγκου. Κλείστε το καπάκι της φιάλης μεγάλου όγκου και αναστρέψτε μαλακά τη φιάλη μεγάλου όγκου 2-3 φορές. 4. Χρησιμοποιήστε το σαρωτή γραμμωτού κώδικα χειρός Dako Omnis για να αναγνωρίσετε το αντιδραστήριο (σαρώστε την αυτοκόλλητη ετικέτα και τη φιάλη μεγάλου όγκου). 5. Τοποθετήστε αμέσως τη φιάλη μεγάλου όγκου στο όργανο Dako Omnis. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί εντός 7 ημερών όταν φυλάσσεται επί του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C για 30 ημέρες. Μετά τη φύλαξη σε ψυγείο, βεβαιωθείτε ότι θα αφήσετε το αραιωμένο διάλυμα να ισορροπήσει σε θερμοκρασία τουλάχιστον 18 C προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Απορρίψτε το αραιωμένο διάλυμα αν έχει νεφελώδη εμφάνιση. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Παρασκευάστε ένα διάλυμα εργασίας, αραιώνοντας το πυκνό διάλυμα ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) σε αναλογία 1:20 ως εξής: 1. Γεμίστε μια φιάλη μεγάλου όγκου 3,5 L Dako Omnis, η οποία φέρει την επισήμανση PTB (μπλε ετικέτα), μέχρι τη γραμμή πλήρωσης με απιονισμένο νερό (3,325 L). Βεβαιωθείτε ότι η φιάλη μεγάλου όγκου έχει τοποθετηθεί σε οριζόντια επιφάνεια, προτού τη γεμίσετε. 2. Αδειάστε μία φιάλη πυκνού διαλύματος ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 175 ml στη φιάλη μεγάλου όγκου. 3. Μεταφέρετε την αυτοκόλλητη ετικέτα από τη φιάλη πυκνού διαλύματος στη φιάλη μεγάλου όγκου. Κλείστε το καπάκι της φιάλης μεγάλου όγκου και αναστρέψτε μαλακά τη φιάλη μεγάλου όγκου 2-3 φορές. 4. Χρησιμοποιήστε το σαρωτή γραμμωτού κώδικα χειρός Dako Omnis για να αναγνωρίσετε το αντιδραστήριο (σαρώστε την αυτοκόλλητη ετικέτα και στη συνέχεια τη φιάλη μεγάλου όγκου). 5. Αμέσως, τοποθετήστε τη φιάλη μεγάλου όγκου στο όργανο Dako Omnis. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί εντός 7 ημερών όταν φυλάσσεται επί του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Το μη χρησιμοποιημένο αραιωμένο διάλυμα μπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C έως και για 30 ημέρες. Μετά τη φύλαξη σε ψυγείο, βεβαιωθείτε ότι θα αφήσετε το αραιωμένο διάλυμα να ισορροπήσει σε θερμοκρασία τουλάχιστον 18 C προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Απορρίψτε το αραιωμένο διάλυμα αν έχει νεφελώδη εμφάνιση. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) Το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) είναι ένα αντιδραστήριο έτοιμο προς χρήση. Προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis, ανοίξτε το καπάκι του επάνω μέρους, σπρώξτε το πλήρως προς τα πίσω και αφήστε το σε αυτή τη θέση. Ο συνολικός χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard) για το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ανέρχεται στις 80 ώρες όταν αποθηκεύεται στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Μετά την ολοκλήρωση του κύκλου ανάλυσης, το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) μπορεί να μεταφερθεί σε θερμοκρασία φύλαξης (2-8 C) προκειμένου να διατηρηθεί ο χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard). P04125GR_03/GM333 σελ. 34/56

35 Γαστρικός καρκίνος A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) Το ISH Pepsin (Dako Omnis) είναι ένα αντιδραστήριο έτοιμο προς χρήση. Προτού το τοποθετήσετε στο Dako Omnis, βεβαιωθείτε ότι έχει γίνει απόψυξη του αντιδραστηρίου, ανοίξτε το καπάκι του επάνω μέρους του φιαλιδίου, σπρώξτε το πλήρως προς τα πίσω και αφήστε το σε αυτή τη θέση. Ο συνολικός χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard) για το ISH Pepsin (Dako Omnis) ανέρχεται στις 80 ώρες, όταν αποθηκεύεται στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων του οργάνου Dako Omnis. Ο εναπομείνας χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου ανιχνεύεται από το λογισμικό του Dako Omnis (βλ. παραπάνω). Μετά την ολοκλήρωση του κύκλου ανάλυσης, το ISH Pepsin (Dako Omnis) πρέπει να μεταφερθεί σε θερμοκρασία φύλαξης 18-8 C προκειμένου να διατηρηθεί ο χρόνος σταθερότητας επί του οργάνου (onboard). A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) είναι ένα έτοιμο προς χρήση μέσο επικάλυψης που χρησιμοποιείται εκτός του οργάνου Dako Omnis. Μεταφέρετε το Fluorescence Mounting Medium σε θερμοκρασία φύλαξης (2-8 C) αμέσως μετά τη χρήση. A.7 Πρόσθετα εξαρτήματα Τα ακόλουθα εξαρτήματα θα πρέπει επίσης να τοποθετούνται στο Dako Omnis: απιονισμένο νερό, αραιωμένο Wash Buffer 20x (Dako Omnis), Κωδικός GC807, Clearify, Κωδικός GC810, ISH Cleaning Solution, Κωδικός GC207 και ISH Lid (Dako Omnis), Κωδικός GC102 όπως διευκρινίζεται στις Οδηγίες χρήσης Dako Omnis. B. Διαδικασία χρώσης - Στόμαχος B.1 Σημειώσεις σχετικά με τη διαδικασία Το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) είναι ο ιχνηθέτης υβριδοποίησης για την αυτοματοποιημένη άμεση δοκιμασία φθορίζουσας σήμανσης υβριδοποίησης in situ (FISH) που πραγματοποιείται επί του οργάνου Dako Omnis και μαζί με τα συνοδευτικά αντιδραστήρια GM300, GM301, GM302, GM303 και GM304 (GM304 εκτός του οργάνου), έχουν σχεδιαστεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Ο χρήστης θα πρέπει να διαβάσει προσεκτικά όλες τις οδηγίες και να εξοικειωθεί με όλα τα συστατικά στοιχεία και τις προφυλάξεις που πρέπει να λαμβάνονται, πριν από τη χρήση τους. Η αυτοματοποιημένη διαδικασία στο Dako Omnis περιλαμβάνει αποπαραφίνωση των τομών ιστού, ανάκτηση στόχου, χώνευση με πεψίνη, υβριδοποίηση και ισχυρή πλύση. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αποφορτώνονται στο στεγνό σταθμό αποφόρτωσης. Όλα τα βήματα πρωτοκόλλου έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο λογισμικό του Dako Omnis. Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης του Dako Omnis για οδηγίες σχετικά με την τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών, του ISH Lid, των αντιδραστηρίων, κλπ. Τρία επικυρωμένα πρωτόκολλα HER2 IQFISH: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium και HER2 IQFISH Pepsin Long τα οποία διαφέρουν μόνο ως προς το χρόνο χώνευσης με πεψίνη, έχουν εκ των προτέρων προγραμματιστεί στο λογισμικό Dako Omnis και μπορούν να επιλεγούν για καθεμία από τις πέντε αντικειμενοφόρους του υποδοχέα. Αυτό επιτρέπει τη βελτιστοποίηση της χώνευσης του ιστού, η οποία μπορεί να εξαρτάται από τις συνθήκες πριν από την ανάλυση. Το πρωτόκολλο HER2 IQFISH Pepsin Medium θεωρείται το τυπικό πρωτόκολλο. Τα διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης εμφανίζονται στο σταθμό εργασίας Dako Link Omnis. Επιπλέον, ο χρήστης μπορεί να επιλέξει να χρησιμοποιήσει ένα Template IQFISH protocol. Οι βέλτιστες συνθήκες ενδέχεται να ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο δείγματος και τη μέθοδο προετοιμασίας και θα πρέπει να επικυρώνονται ξεχωριστά από το κάθε εργαστήριο. B.2. Διαδικασία που προηγείται της χρώσης 1. Επιλέξτε το πρωτόκολλο HER2 IQFISH που θα εφαρμοστεί σε κάθε αντικειμενοφόρο από το λογισμικό του σταθμού εργασίας Dako Link Omnis, βάσει των πρωτοκόλλων IQFISH. P04125GR_03/GM333 σελ. 35/56

36 Γαστρικός καρκίνος 2. Εκτυπώστε ετικέτες αντικειμενοφόρων και κολλήστε τις στις γυάλινες αντικειμενοφόρους. 3. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους στον υποδοχέα. Συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για λεπτομέρειες. Ένας υποδοχέας αντικειμενοφόρων μπορεί να χωρέσει από μία έως πέντε αντικειμενοφόρους. Συνιστάται η χρώση τουλάχιστον δύο αντικειμενοφόρων κατά τη διάρκεια μιας εκτέλεσης χρώσης IQFISH του HER2. 4. Τοποθετήστε τον υποδοχέα αντικειμενοφόρων στο Dako Omnis. 5. Τοποθετήστε το ISH Lid (ένα ISH Lid ανά υποδοχέα αντικειμενοφόρων) στο Dako Omnis. 6. Βεβαιωθείτε ότι οι φιάλες μεγάλου όγκου με υγρά βρίσκονται επί του οργάνου και έχουν καταχωρηθεί στο όργανο Dako Omnis. Φιάλες μεγάλου όγκου με υγρά: Clearify (παράγοντας διαύγασης), αραιωμένο ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), αραιωμένο ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) και αραιωμένο Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Τοποθετήστε το ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) και το ISH Pepsin (Dako Omnis), το πρόσφατα αναμεμιγμένο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) και ISH Cleaning Solution στη μονάδα φύλαξης αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι όλα τα καπάκια στο επάνω μέρος των φιαλιδίων είναι ανοιχτά. 8. Ακολουθήστε τις οδηγίες που εμφανίζονται στην οθόνη αφής και επιλέξτε Done για να ξεκινήσετε τη διαδικασία χρώσης. B.3. Διαδικασία χρώσης Μπορείτε να παρακολουθείτε τη διαδικασία χρώσης του HER2 IQFISH στο όργανο Dako Omnis (συνοπτική παρουσίαση στον Πίνακα 11) στο σταθμό εργασίας Dako Link Omnis: Πίνακας 11. Απλοποιημένη επισκόπηση των βημάτων του πρωτοκόλλου IQFISH του HER2. Βήμα Αντιδραστήριο Χρόνος και θερμοκρασία Αποπαραφίνωση Ανάκτηση στόχου Clearify (παράγοντας διαύγασης) ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 10 λεπτά, 38 C 15 λεπτά, 97 C Έκπλυση ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 λεπτά, 32 C (Dako Omnis) Χώνευση* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 λεπτά, 15 λεπτά ή 20 λεπτά Ξήρανση 15 λεπτά, 45 C Μετουσίωση 10 λεπτά, 66 C Υβριδοποίηση Ισχυρή πλύση HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 75 λεπτά, 45 C 10 λεπτά, 61 C * Υπάρχει δυνατότητα επιλογής τριών επικυρωμένων χρόνων χώνευσης με πεψίνη μέσω της χρήσης των πρωτοκόλλων HER2 IQFISH που αναφέρθηκαν παραπάνω. Σε περίπτωση που δεν επίκεινται άλλες χρώσεις ISH, μεταφέρετε όλα τα αντιδραστήρια στις συνιστώμενες θερμοκρασίες φύλαξης. B.4. Διαδικασία μετά τη χρώση Αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρους και εφαρμόστε έως 30 µl από το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) που περιέχει DAPI στην περιοχή-στόχο της αντικειμενοφόρου. Η τομή ιστού πρέπει να καλυφθεί εντελώς από το Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Τοποθετήστε μια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειμενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν μετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ημερών μετά την επικάλυψη. Ωστόσο, εάν οι αντικειμενοφόροι πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερμοκρασίες θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της P04125GR_03/GM333 σελ. 36/56

37 Γαστρικός καρκίνος εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε σκοτεινό χώρο σε θερμοκρασία 18-8 C. Έλεγχος Ποιότητας - Στόμαχος 1. Τα σήματα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Τα φυσιολογικά κύτταρα επιτρέπουν τον εσωτερικό έλεγχο της εκτέλεσης χρώσης. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν 1-2 σαφώς ορατά πράσινα σήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης CEN-17 PNA έχει υβριδοποιηθεί με επιτυχία στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν επίσης 1-2 σαφώς ορατά ερυθρά σήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ιχνηθέτης HER2 DNA έχει υβριδοποιηθεί με επιτυχία στα γονίδια HER2. Λόγω του τεμαχισμού του ιστού, ορισμένα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να παρουσιάζουν λιγότερα από τα αναμενόμενα δύο σήματα κάθε χρώματος. Αδυναμία εντοπισμού σημάτων σε φυσιολογικά κύτταρα αποτελεί ένδειξη αποτυχίας της δοκιμασίας και τα αποτελέσματα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 3. Κατά την αξιολόγηση με χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική μορφολογία πρέπει να είναι άθικτη. Πολυάριθμα ίχνη κυττάρων και μια γενική πενιχρή πυρηνική μορφολογία υποδηλώνουν υπερβολική πέψη του δείγματος, με αποτέλεσμα απώλεια ή κατατεμαχισμό των σημάτων. Τέτοια δείγματα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 4. Τουλάχιστον 20 καρκινικά κύτταρα θα πρέπει να είναι κατάλληλα για εκτίμηση. 5. Τυχόν διαφορές στη μονιμοποίηση, την επεξεργασία και την ενσωμάτωση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σημαντική μεταβλητότητα στα αποτελέσματα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική αξιολόγηση των εσωτερικών ελέγχων. Ερμηνεία της χρώσης - Στόμαχος Ιστός κατάλληλος για εκτίμηση Εντοπίστε τον όγκο εντός του πλαισίου της κεχρωσμένης με H&E αντικειμενοφόρου πλάκας και αξιολογήστε την ίδια περιοχή στην κεχρωσμένη με FISH αντικειμενοφόρο πλάκα (στο φίλτρο DAPI). Μόνο δείγματα από ασθενείς που πάσχουν από γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ή αδενοκαρκίνωμα της γαστροοισοφαγικής συμβολής πρέπει να αναλύονται. Σε περιστατικά εντερικής μεταπλασίας in situ και γαστρικού αδενοκαρκινώματος στο ίδιο δείγμα, μόνον το συστατικό του καρκινώματος πρέπει να βαθμολογείται. Αποφεύγετε περιοχές βαριάς φλεγμονής, νέκρωσης και περιοχές όπου τα πυρηνικά όρια είναι αμφίβολα. Μην συμπεριλαμβάνετε πυρήνες που απαιτούν υποκειμενική κρίση. Μην συμπεριλαμβάνετε πυρήνες με ασθενή ένταση σήματος και μη ειδικό ή υψηλό υπόβαθρο. Ξεκινήστε με μια αξιολόγηση μέσω μικροσκοπίου ολόκληρης της κεχρωσμένης με FISH περιοχής και της περιοχής που αντιστοιχεί στην ενότητα H&E, αντίστοιχα. Πριν την απαρίθμηση της κεχρωσμένης με FISH περιοχής, σημειώστε τη συνολική διανομή του σήματος (ομογενής ή ετερογενής) στο φύλλο απαρίθμησης σημάτων. Σε περίπτωση ετερογενούς διανομής, σημειώστε αν υπάρχει εστιακή ενίσχυση ή μεμονωμένη κυτταρική ενίσχυση (μωσαϊκό). 1) Ομογενής διανομή σήματος Σε περίπτωση που η διανομή του σήματος είναι ομοιογενής, σημειώστε τον αριθμό των κεντρομεριδίων χρωμοσώματος (πράσινα σήματα) και τον αριθμό των γονιδίων HER2 (ερυθρά σήματα), αντίστοιχα, από 20 κύτταρα σε 1-2 αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου. 2) Ετερογενής διανομή σήματος P04125GR_03/GM333 σελ. 37/56

38 Γαστρικός καρκίνος Σε περίπτωση που η διανομή σήματος είναι ετερογενής, αριθμήστε συνολικά 20 κύτταρα από επιλεγμένες περιοχές, όπως διευκρινίζεται παρακάτω: Α) Αν υπάρχει εστιακή ενίσχυση, πρέπει να επιλεχθούν περιοχές με ενισχυμένα κύτταρα. Β) Αν υπάρχει διανομή μωσαϊκού ή ενισχυμένα, πολυσωματικά ή δισωματικά κύτταρα, μετρήστε τις περιοχές με ενισχυμένα κύτταρα. Εντός αυτών των περιοχών, στο σύνολο των 20 κυττάρων θα πρέπει να προσμετρηθούν όχι μόνο τα ενισχυμένα αλλά και τα παρακείμενα μη ενισχυμένα κελιά. Αν είναι δυνατόν, μην επιλέγετε περιοχές που επικαλύπτουν η μία την άλλη. Αγνοήστε τη χρώση του βακτηριακού DNA Ένας αριθμός εξειδικευμένων κυττάρων (κύτταρα μαστού και μακροφάγα κύτταρα), που είναι κατανεμημένα στο γαστρικό ιστό, παρουσιάζουν υψηλό επίπεδο χρώσης από τον ανιχνευτή HER2 εξαιτίας της παρουσίας του βακτηριακού DNA. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παρουσία έντονα ερυθρών φθοριζόντων κυττάρων που διακρίνονται ξεκάθαρα από τα κύτταρα του όγκου με υψηλή ενίσχυση γονιδίων HER2. Απαρίθμηση σήματος Όταν μια περιοχή έχει επιλεχθεί για εκτίμηση σήματος, ξεκινήστε ανάλυση σε έναν από τους επιλεγμένους 20 πυρήνες και έπειτα μετρήστε κύτταρο προς κύτταρο, αγνοώντας μόνο τους πυρήνες που δεν πληρούν τα κριτήρια ποιότητας. Εντοπίστε τον όγκο εντός του πλαισίου της κεχρωσμένης με H&E αντικειμενοφόρου πλάκας και αξιολογήστε την ίδια περιοχή στην κεχρωσμένη με FISH αντικειμενοφόρο πλάκα. Σαρώστε την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο στο σύνολό της προκειμένου να εντοπίσετε πιθανές ετερογένειες. Επιλέξτε μια περιοχή που έχει καλή κατανομή πυρήνων. Αρχίστε την ανάλυση στο άνω αριστερό τεταρτημόριο της επιλεγμένης περιοχής και, σαρώνοντας από αριστερά προς τα δεξιά, καταμετρήστε τον αριθμό των σημάτων εντός των ορίων κάθε πυρήνα που αξιολογείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες παρακάτω (βλ. επίσης το παράρτημα 5). - Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω, ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήματα στο μεμονωμένο πυρήνα - Καταμετρήστε δύο σήματα που έχουν το ίδιο μέγεθος και διαχωρίζονται από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του σήματος, ως μόνον ένα σήμα. Η απόσταση πρέπει να είναι τουλάχιστον ίση με τη διάμετρο ενός σήματος κανονικού μεγέθους προκειμένου να μετρηθούν δύο ξεχωριστά σήματα. Όταν η απόσταση μεταξύ δύο σημάτων είναι μικρότερη από τη διάμετρο ενός σήματος, πρέπει να μετρηθεί ως ένα. - Σε πυρήνες με υψηλά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου HER2 τα σήματα HER2 είναι δυνατό να είναι τοποθετημένα πολύ κοντά μεταξύ τους, σχηματίζοντας μια συστάδα σημάτων. Στις περιπτώσεις αυτές, ο αριθμός των σημάτων HER2 δεν είναι δυνατό να καταμετρηθεί, αλλά πρέπει να εκτιμάται. Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στα πράσινα σήματα, καθώς είναι δυνατό να καλυφθούν από συστάδες ερυθρών σημάτων HER2 που καθιστούν αδύνατη την παρατήρησή τους. Σε περίπτωση αμφιβολίας, παρακαλούμε ελέγξτε τα πράσινα σήματα με χρήση ειδικού φίλτρου FITC. Μην βαθμολογείτε πυρήνες χωρίς σήματα ή με σήματα ενός μόνο χρώματος. Βαθμολογείτε μόνον εκείνους τους πυρήνες με ένα ή περισσότερα σήματα FISH κάθε χρώματος. P04125GR_03/GM333 σελ. 38/56

39 Γαστρικός καρκίνος Οδηγός καταμέτρησης σημάτων 1 Μην καταμετράτε. Οι πυρήνες επικαλύπτονται μεταξύ τους, δεν είναι ορατές όλες οι περιοχές των πυρήνων 2 Δύο πράσινα σήματα, μην βαθμολογείτε τους πυρήνες με σήματα ενός μόνο χρώματος 3 Καταμετρήστε ως 3 πράσινα και 12 ερυθρά σήματα (εκτίμηση συστάδων) 4 Καταμετρήστε ως 1 πράσινο και 1 ερυθρό σήμα. Δύο σήματα του ιδίου μεγέθους και διαχωρισμένα από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του ενός σήματος καταμετρούνται ως ένα 5 Μην καταμετράτε (πυρήνες που έχουν υποστεί υπερβολικά ή υψηλή ή υπερβολικά χαμηλή πέψη). Ελλείποντα σήματα στο κέντρο των πυρήνων (εμφάνιση τύπου donut). 6 Καταμετρήστε ως 2 πράσινα και 3 ερυθρά σήματα. Δύο σήματα του ιδίου μεγέθους και διαχωρισμένα από απόσταση ίση με ή μικρότερη από τη διάμετρο του ενός σήματος καταμετρούνται ως ένα 7 Καταμετρήστε ως 1 πράσινα και 5 ερυθρά σήματα 8 Καταμετρήστε ως 3 πράσινα (1 πράσινο εκτός εστίασης) και 3 ερυθρά σήματα 9 Συστάδα ερυθρών σημάτων που αποκρύπτουν πράσινα σήματα, ελέγξτε τα πράσινα σήματα με ειδικό φίλτρο FITC ή μην καταμετράτε Καταγράψτε τις καταμετρήσεις σε έναν πίνακα όπως παρουσιάζεται στα Παραρτήματα 3 και 4. Καταμετρήστε 20 πυρήνες ανά δείγμα ιστού, όταν είναι δυνατό, από διακριτές περιοχές όγκων. Υπολογίστε την αναλογία HER2/CEN-17 διαιρώντας το συνολικό αριθμό ερυθρών σημάτων HER2 δια του συνολικού αριθμού πράσινων σημάτων CEN-17. Δείγματα με αναλογία HER2/CEN-17 μεγαλύτερη από ή ίση με 2 πρέπει να θεωρούνται ότι φέρουν ενισχυμένο γονίδιο HER2 (29). Αποτελέσματα ίσα με ή πλησίον της τιμής αποκλεισμού (1,8-2,2) πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Εάν η αναλογία είναι οριακή (1,8-2,2), καταμετρήστε 40 πυρήνες επιπλέον και υπολογίστε την αναλογία για τους 40 πυρήνες. Αν η απαρίθμηση συνεχίσει να κινείται στα όρια, το αποτέλεσμα της δεύτερης απαρίθμησης θα θεωρείται έγκυρο. Αν είναι διαθέσιμη, πρέπει να συμπεριλαμβάνεται μια ανοσοϊστοχημική χρώση HER2 για καλύτερο προσανατολισμό κατά τη δεύτερη απαρίθμηση. Σε περίπτωση αμφιβολίας, η αντικειμενοφόρος πλάκα του δείγματος πρέπει να βαθμολογείται εκ νέου. Για οριακές περιπτώσεις, είναι απαραίτητη η διαβούλευση μεταξύ του παθολόγου και του θεράποντος ιατρού. P04125GR_03/GM333 σελ. 39/56

40 Γαστρικός καρκίνος Περιορισμοί - Στόμαχος 1. Για αυτοματοποιημένη χρήση μόνο σε όργανα Dako Omnis. 2. Απαιτείται ειδικευμένη εκπαίδευση για την προετοιμασία ιστού και αντικειμενοφόρων, καθώς και για την ερμηνεία χρώσης IQFISH. Η ερμηνεία των χρώσεων του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) δεν θα πρέπει να πραγματοποιείται από άτομα που πάσχουν από αχρωματοψία. 3. Τα αποτελέσματα της μεθόδου FISH εξαρτώνται από το χειρισμό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλμένη μονιμοποίηση, πλύση, στέγνωμα, θέρμανση, σχηματισμός τομών ή μόλυνση με άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να επηρεάσει την υβριδοποίηση των ιχνηθετών. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσματα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των μεθόδων μονιμοποίησης και ενσωμάτωσης ή σε εγγενείς ανωμαλίες εντός του ιστού. 4. Η επικύρωση του Template IQFISH protocol, αποτελεί ευθύνη του χρήστη. Χαρακτηριστικά απόδοσης Στόμαχος Αποτελεσματικότητα υβριδοποίησης Η αποτελεσματικότητα της υβριδοποίησης του HER2 IQFISH pharmdx διερευνήθηκε με χρήση 180 τομών ιστού μονιμοποιημένων σε φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη που εξετάστηκαν σε τρία κέντρα μελέτης. Η απαρίθμηση και των 180 τομών ιστών διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες απαρίθμησης του προϊόντος. Η αποτελεσματικότητα της υβριδοποίησης ήταν 100%. Οι αναλογίες HER2/CEN-17 που υπολογίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στις μελέτες χαρακτηριστικών απόδοσης βασίζονται στην καταμέτρηση σημάτων σε 20 πυρήνες, με χρήση των οδηγιών βαθμολόγησης που παρέχονται στην ενότητα "Ερμηνεία της χρώσης" αυτών των Οδηγιών χρήσης. Αναλυτική ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) διερευνήθηκε με χρήση 20 διαφορετικών δειγμάτων αδενοκαρκινώματος καρκίνου του στομάχου (10 δείγματα με ενισχυμένο γονίδιο HER2 και 10 μη ενισχυμένα δείγματα). Η αναλογία μεταξύ του αριθμού των σημάτων HER2 και των σημάτων CEN-17 υπολογίστηκε με βάση την καταμέτρηση σημάτων σε 20 πυρήνες φυσιολογικών κυττάρων εντός του δείγματος ιστού. Η αναλογία HER2/CEN-17 για τα 20 δείγματα ιστού αδενοκαρκινώματος καρκίνου του στομάχου ήταν μεταξύ 0,94 και 1,19. Αναλυτική ειδικότητα Οι ιχνηθέτες HER2 DNA στο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) έχουν υποβληθεί σε προσδιορισμό της αλληλουχίας του άκρου τους και χαρτογραφηθεί για την επιβεβαίωση μιας συνολικής κάλυψης 218 kb, συμπεριλαμβανομένου του γονιδίου HER2. Οι ιχνηθέτες CEN-17 PNA στο HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) έχουν εξεταστεί ατομικά και σε συνδυασμό, για την επιβεβαίωση της ειδικής υβριδοποίησής τους στην κεντρομεριδιακή περιοχή του χρωμοσώματος 17. Για την εξαίρεση της διασταυρούμενης υβριδοποίησης σε χρωμοσώματα εκτός του χρωμοσώματος 17, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε διασπορές μετάφασης σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου της Dako. Αξιολογήθηκαν συνολικά 275 διασπορές μετάφασης με διακριτά σήματα για ειδική υβριδοποίηση των μιγμάτων ιχνηθετών HER2 DNA και CEN-17 PNA. Και στις 275 περιπτώσεις, η υβριδοποίηση ήταν ειδική για το χρωμόσωμα 17. Σε καμία από τις 275 περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκε διασταυρούμενη υβριδοποίηση σε θέσεις σε άλλα χρωμοσώματα. Έτσι, η ειδικότητα του ιχνηθέτη ήταν 100% (275 από 275). Προκειμένου να μετρηθεί η δυνατότητα της δοκιμασίας IQFISH να αναγνωρίζει αποκλειστικά τις ουσίες στόχο HER2 και CEN-17 χωρίς παρεμβολή από άλλες ουσίες, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε δείγματα γαστρικού αδενοκαρκινώματος, παραλείποντας τους ιχνηθέτες HER2 και P04125GR_03/GM333 σελ. 40/56

41 Γαστρικός καρκίνος CEN-17 από το μίγμα υβριδοποίησης και χρησιμοποιώντας μόνο το ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης. Αξιολογήθηκαν συνολικά 20 δείγματα για παρουσία σημάτων που δεν σχετίζονται με το μίγμα ιχνηθετών. Σε κανένα από τα 20 δείγματα δεν εντοπίστηκαν άλλοι χρωμοσωμικοί στόχοι ούτε παρατηρήθηκε παρεμβολή με στενά σχετιζόμενες ουσίες. Μελέτες ευστάθειας Η ευσταθεια της δοκιμασίας HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε με μεταβολή της συγκέντρωσης ιχνηθέτη PNA, του χρόνου ανάκτησης στόχου, του χρόνου επώασης της πεψίνης, του χρόνου μετουσίωσης, του χρόνου υβριδοποίησης, καθώς και του χρόνου και της θερμοκρασίας ισχυρής πλύσης. Οι διάφορες παράμετροι εξετάστηκαν σε τρία διαφορετικά δείγματα ιστού αδενοκαρκινώματος γαστρικού καρκίνου και σε δύο δείγματα ιστού FFPE από τη γαστροοισοφαγική συμβολή (GEJ) (σε κάθε ομάδα αντιπροσωπεύτηκαν δείγματα ιστού με ενίσχυση και χωρίς ενίσχυση). Όλες οι παράμετροι εξετάστηκαν σε τιμές μικρότερες και μεγαλύτερες από τις τυπικές ρυθμίσεις πρωτοκόλλων, με εξαίρεση τη συγκέντρωση ιχνηθέτη PNA και τη θερμοκρασία ισχυρής πλύσης στις οποίες η τυπική ρύθμιση πρωτοκόλλου συμπεριλήφθηκε κατά την ανάπτυξη. Οι παράμετροι ελέγχου ήταν: Συγκέντρωση ιχνηθέτη PNA: Εξετάστηκε στο 100% και σε +/-17%. Χρόνος ανάκτησης στόχου: Εξετάστηκε στα 13 λεπτά 45 δευτ. και στα 16 λεπτά 15 δευτ. Χρόνος επώασης της πεψίνης: Εξετάστηκε στα 14 λεπτά 45 δευτ. και στα 16 λεπτά 15 δευτ. Χρόνος μετουσίωσης: Εξετάστηκε στα 9 λεπτά 45 δευτ. και στα 10 λεπτά 45 δευτ. Χρόνος υβριδοποίησης: Εξετάστηκε στα 70 λεπτά και στα 80 λεπτά. Χρόνος ισχυρής πλύσης: Εξετάστηκε στα 8 λεπτά 45 δευτ. και στα 11 λεπτά 15 δευτ. Θερμοκρασία ισχυρής πλύσης: Εξετάστηκε στους 59 C, στους 61 C και στους 63 C. Οι τρεις συγκεντρώσεις ιχνηθέτη PNA αξιολογήθηκαν σε τμηματικό Σχέδιο πειράματος (εργαλείο JMP, SAS), το οποίο διεξήχθη με 12 διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 12. P04125GR_03/GM333 σελ. 41/56

42 Γαστρικός καρκίνος Πίνακας 12. Στη μελέτη ευστάθειας χρησιμοποιήθηκαν δώδεκα διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης. Αρ. πρωτοκόλλου ευστάθειας Χρόνος ανάκτησης στόχου (λεπτά) Χρόνος πεψίνης (λεπτά) Χρόνος μετουσίωσης (λεπτά) Παράμετρος ελέγχου Χρόνος υβριδοποίησης (λεπτά) Χρόνος ισχυρής πλύσης (λεπτά) Θερμ. ισχυρής πλύσης ( 0 C) Συγκ. PNA σε μίγμα ιχνηθετών 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Και τα πέντε δείγματα ιστού χρωματίστηκαν και με τα 12 πρωτόκολλα. Η ένδειξη για τη μελέτη ευστάθειας ήταν η ένταση σήματος και η ποιότητα μορφολογίας. Όλα τα πρωτόκολλα παρήγαν χρώση σε όλα τα δείγματα ιστού (60 συνολικά) με σήματα που ήταν έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση, επομένως κατάλληλα για απαρίθμηση σήματος. Επιπλέον, εξετάστηκε η επίπτωση του πάχους του ιστού στα αποτελέσματα της δοκιμασίας HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με μεταβολή του πάχους τομής των δειγμάτων ιστού καρκίνου του στομάχου FFPE. Συνολικά πέντε διαδοχικές τομές δειγμάτων γαστρικού αδενοκαρκινώματος με διαφορετικό πάχος (2, 3, 4, 5, 6 και 7 µm) εξετάστηκαν με το HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης της αναλογίας HER2/CEN-17 ήταν 3,9% (κυμαίνεται από 3,2% έως 5,0%). Αναπαραγωγιμότητα Εξετάστηκε η εντός εργαστηρίου αναπαραγωγιμότητα από ημέρα σε ημέρα και από παρτίδα σε παρτίδα με χρήση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Η μελέτη σχεδιάστηκε ως εσωτερική, τυφλή, τυχαιοποιημένη μελέτη των αναλογιών του HER2/CEN-17 με χρήση τομών από οκτώ διαφορετικά μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα καρκίνου του στομάχου συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων της γαστροοισοφαγικής συμβολής (GEJ) με διαφορετικά επίπεδα ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Τα οκτώ δείγματα είχαν εξεταστεί με HercepTest και αντιπροσώπευαν δύο δείγματα με HER2 IHC 0/1+, δύο δείγματα με HER2 IHC 2+, δύο δείγματα με HER2 IHC 3+ και δύο δείγματα προκαθορισμένης αναλογίας FISH HER2/CEN-17 μεταξύ 1,5 και 2,5 που ελήφθη με χρήση του HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731). Κάθε δείγμα χρωματίστηκε με τρεις διαφορετικές παρτίδες HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) επί πέντε μη διαδοχικές ημέρες. Έγινε επεξεργασία 240 χρώσεων ιστού για ολόκληρη τη μελέτη, καθώς έγινε χρώση κάθε συνδυασμού εις διπλούν. Οι διακυμάνσεις στην αναλογία μεταξύ ημερών και παρτίδων απεικονίζονται στην Εικόνα 8. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με χρήση μετασχηματισμού Box-Cox, μέσω ενός μοντέλου τυχαίων επιδράσεων για ομοιογένεια της διασποράς δεδομένων. Ο συνολικός συντελεστής διακύμανσης εκτιμήθηκε στο 6,5% και προσδιορίστηκε ότι η διακύμανση ημέρας και παρτίδας συνέβαλε με 0,7% και 0,8%, αντίστοιχα. P04125GR_03/GM333 σελ. 42/56

43 Γαστρικός καρκίνος Εικόνα 8. Αναλογίες HER2/CEN-17 από μελέτη αναπαραγωγιμότητας εντός εργαστηρίου σε HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), συμπεριλαμβανομένων των τελικών σημείων αναπαραγωγιμότητας από παρτίδα σε παρτίδα και από ημέρα σε ημέρα. Η μέση τιμή για κάθε δείγμα ιστού απεικονίζεται με μια οριζόντια γραμμή. Επιπλέον, η αναπαραγωγιμότητα από ημέρα σε ημέρα και από κέντρο σε κέντρο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε εξωτερικά σε μια στρωματοποιημένη, τυφλή μελέτη σε τομές ιστού από 12 διαφορετικά μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα γαστρικού αδενοκαρκινώματος, συμπεριλαμβανομένης της γαστροοισοφαγικής συμβολής (GEJ), σε τρία κέντρα (ένα κέντρο στις ΗΠΑ και δύο στην Ευρώπη). Τρία δείγματα ήταν HER2 IHC 0/1+, τρία δείγματα ήταν HER2 IHC 2+, τρία δείγματα ήταν HER2 IHC 3+ και τρία δείγματα είχαν προκαθορισμένη αναλογία HER2/CEN-17 FISH μεταξύ 1,5 και 2,5 που ελήφθη με χρήση του HercepTest και του HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731), αντίστοιχα. Η χρώση και η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν στα κέντρα μελέτης. Κάθε δείγμα χρωματίστηκε τουλάχιστον επτά φορές, σε επτά μη διαδοχικές ημέρες, και βαθμολογήθηκε από έναν παρατηρητή σε κάθε κέντρο. 314 τομές υποβλήθηκαν σε χρώση και συμπεριλήφθηκαν στη στατιστική ανάλυση. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με χρήση μετασχηματισμού Box-Cox και υπολογίστηκαν τα στοιχεία διασποράς. Ο συνολικός συντελεστής διασποράς με βάση το ανώτερο όριο εμπιστοσύνης 95% ήταν 24%. Η διακύμανση της αναλογίας HER2/CEN- 17 για την ημέρα και το κέντρο παρουσιάζεται στην Εικόνα 9. Εικόνα 9. Διάγραμμα μεταβλητότητας των αναλογιών HER2/CEN-17 σε μη μετασχηματισμένες μονάδες από τη μελέτη αναπαραγωγιμότητας από ημέρα σε ημέρα και από κέντρο σε κέντρο του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) σε δείγματα ιστού καρκίνου του στομάχου. Η δοκιμασία HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε για αναπαραγωγιμότητα από παρατηρητή σε παρατηρητή ως μέρος της συγκριτικής μελέτης μεθόδων που διεξήχθη εσωτερικά με χρήση τριών παρατηρητών για την ανεξάρτητη βαθμολόγηση των δειγμάτων με χρώση. Η P04125GR_03/GM333 σελ. 43/56

44 Γαστρικός καρκίνος αναπαραγωγιμότητα εξετάστηκε σε 139 διαφορετικά δείγματα γαστρικού αδενοκαρκινώματος με μη ενισχυμένο ή με ενισχυμένο γονίδιο HER2. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με χρήση μετασχηματισμού Box-Cox. Ο μέσος συντελεστής διακύμανσης από παρατηρητή σε παρατηρητή ήταν 18%. Τα δείγματα γαστρικού αδενοκαρκινώματος αποτελούνταν κατά 96,4% από δείγματα εξαίρεσης και κατά 5,6% από δείγματα βιοψίας. Το 81,3% των δειγμάτων ελήφθη από το στομάχι και το 18,7% από τη γαστροοισοφαγική συμβολή. Επαναληψιμότητα Η εντός εργαστηρίου επαναληψιμότητα του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) εξετάστηκε με χρήση διαδοχικών τομών οκτώ δειγμάτων γαστρικού αδενοκαρκινώματος με μη ενισχυμένο ή με ενισχυμένο γονίδιο HER2. Οι ιστοί εξετάστηκαν εις διπλούν σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες, με τρεις διαφορετικές παρτίδες σε συνολικά 240 αντικειμενοφόρους πλάκες (120 τομές εις διπλούν). Χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων για την ανάλυση των δεδομένων και είχε ως αποτέλεσμα μια διασπορά που αποδίδεται στις ημέρες και στις παρτίδες (βλ. εσωτερική μελέτη αναπαραγωγιμότητας παραπάνω). Η υπολειπόμενη διασπορά αντιπροσωπεύει τη διασπορά μεταξύ των επαναλήψεων και επομένως την επαναληψιμότητα. Το ανώτερο όριο εμπιστοσύνης 95% για το συντελεστή διακύμανσης της επαναληψιμότητας ήταν 7,1%. Συγκριτική μελέτη μεθόδων Σύγκριση του HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) με το HER2 IQFISH pharmdx (K5731) Η μελέτη περιελάμβανε 140 δείγματα καρκίνου του στομάχου που αποτελούνταν από διαφορετικούς τύπους ιστού γαστρικού αδενοκαρκινώματος, δηλαδή στόμαχος ή γαστροοισοφαγική συμβολή (GEJ) και εξαιρέσεις ή βιοψίες με ομοιογενή ή ετερογενή (εστιακή ή μωσαϊκό) διανομή σήματος, όπως φαίνεται στον Πίνακα 13. Πίνακας 13. Κατανομή δειγμάτων σε τύπους καρκίνου του στομάχου (στόμαχος ή GEJ), κατηγορία διανομής σήματος (ομοιογενής ή ετερογενής) και τύπο ιστού (εξαίρεση ή βιοψία). Τύπος καρκίνου το στομάχου Αριθμός δειγμάτων Διανομή σήματος Αριθμός δειγμάτων Τύπος ιστού Αριθμός δειγμάτων Στόμαχος 113 Ομοιογενής 58 Εκτομή 134 Γαστροοισοφ γική συμβολή (GEJ) 27 Ετερογενής εστιακή Ετερογενής μωσαϊκό Βιοψία 6 Σύνολο 140 Σύνολο 140 Σύνολο 140 Τα δείγματα απαρτίζονταν από 76 περιστατικά μη ενίσχυσης HER2 και 64 περιστατικά ενίσχυσης HER2 με γνωστή βαθμολογία HercepTest, όπως φαίνεται στον Πίνακας 14. Πίνακας 14. Η κατανομή των δειγμάτων με βάση τη βαθμολογία HercepTest και τη βαθμολογία HER2 FISH ελήφθη με το κιτ HER2 FISH pharmdx (K5731). Βαθμολογία χρώσης Σύνολο HercepTest n Κατάσταση HER2 με FISH Ενισχυμένο Μη ενισχυμένο Σύνολο δειγμάτων που εξετάστηκαν με FISH Τα αποτελέσματα της σταυρωτής πινακοποίησης της κατάστασης του HER2 ελήφθησαν από τις δύο δοκιμασίες με υπολογισμό της επί τοις εκατό συνολικής συμφωνίας (OPA), της επί τοις εκατό θετικής συμφωνίας (PPA) και της επί τοις εκατό αρνητικής συμφωνίας (NPA), όπως φαίνεται στον Πίνακας 15. Η συσχέτιση μεταξύ των αναλογιών HER2/CEN 17 με τη χρήση των δύο δοκιμασιών απεικονίζεται στην Εικόνα 10. P04125GR_03/GM333 σελ. 44/56

45 Γαστρικός καρκίνος Πίνακας 15. Σταυρωτή πινακοποίηση της κατάστασης του γονιδίου HER2 που ελήφθη με τη χρήση HER2 IQFISH pharmdx (K5731) και HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Κατάσταση γονιδίου HER2 (Dako Omnis) Μη ενισχυμένο Κατάσταση γονιδίου HER2 (K5731) Μη ενισχυμένο Ενισχυμένο Σύνολο Ενισχυμένο Σύνολο OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% Εικόνα 10. Συσχέτιση μεταξύ των αναλογιών HER2/CEN-17 από τα HER2 FISH pharmdx (Dako Omnis) και HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731) σε 140 δείγματα καρκίνου του στομάχου (γραμμική προσαρμογή: y = 0,06 + 0,97*x, R2 = 0,97. Σταθμισμένη με αντίστροφη διασπορά ώστε να είναι δυνατή η γραμμική προσαρμογή). Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% για τη μέση διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων χρώσης σε αναλογία HER2/CEN-17 = 2 ήταν [0,007, 0,022]. Αυτό σημαίνει ότι δεν αναμένεται διαφορά υψηλότερη του 2%. Κλινικά δεδομένα Η κλινική ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα της τραστουζουμάμπης (Herceptin ) αποδείχθηκε στη μελέτη BO18255 (η δοκιμή ToGA "Τυχαιοποιημένη, πολυκεντρική μελέτη φάσης III ανοικτής επισήμανσης της τραστουζουμάμπης σε συνδυασμό με σισπλατίνη και μια φθοριοπυριμιδίνη (καπεσιταβίνη ή 5-φθοριοουρακίλη) (FC+H) έναντι χημειοθεραπείας (FC) μόνο, ως πρώτη γραμμή θεραπείας σε ασθενείς με HER2 θετικό προχωρημένο καρκίνο του στομάχου") (28). Η μελέτη σχεδιάστηκε ως μελέτη ανοιχτής επισήμανσης, φάσης III, τυχαιοποιημένη, πολυκεντρική, σε ασθενείς που ανιχνεύθηκαν με θετικό HER2 και με προχωρημένο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου ή αδενοκαρκίνωμα της γαστροοισοφαγικής συμβολής. Στη μελέτη BO18255, η θετικότητα σε HER2 ορίστηκε ως θετική με IHC (3+) χρησιμοποιώντας το HercepTest (Dako) ή/και ως θετική με FISH (HER2/CEN-17 2,0) χρησιμοποιώντας το κιτ HER2 FISH pharmdx (Dako). Αφού συμπεριλήφθησαν στη μελέτη, οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν για να υποβληθούν σε P04125GR_03/GM333 σελ. 45/56

46 Γαστρικός καρκίνος χημειοθεραπεία (5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη) ή χημειοθεραπεία σε συνδυασμό με τραστουζουμάμπη. Το κύριο μέτρο της αποτελεσματικότητας ήταν η συνολική επιβίωση (OS) αναλυμένη με στρωματοποιημένη δοκιμή λογαριθμικής κατάταξης. Η τελική ανάλυση OS που βασίστηκε σε 351 θανάτους ήταν στατιστικά σημαντική (επίπεδο ονομαστικής σημασίας 0,0193). Μια ενημερωμένη ανάλυση OS πραγματοποιήθηκε ένα χρόνο μετά την τελική ανάλυση. Η διάμεση συνολική επιβίωση των 13,5 μηνών στο σκέλος Herceptin συν χημειοθεραπεία ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σύγκριση με τη διάμεση συνολική επιβίωση των 11,0 μηνών στο σκέλος μόνο χημειοθεραπείας. Τα αποτελέσματα της αποτελεσματικότητας τόσο για την τελική όσο και για την ενημερωμένη ανάλυση συνοψίζονται στον Πίνακα 16 και στην Εικόνα 11. Πίνακας 16. Συνολική επιβίωση σε πληθυσμό με πρόθεση θεραπείας (ITT). Τελική συνολική επιβίωση Αρ. θανάτων (%) Διάμεσος 95% Δ.Ε. (μήνες) Αναλογία κινδύνου 95% Δ.Ε. τιμή p*, αμφίπλευρη Ενημερωμένη συνολική επιβίωση Αρ. θανάτων (%) Διάμεσος 95% Δ.Ε. (μήνες) Αναλογία κινδύνου 95% Δ.Ε. Σκέλος FC N= (62,2%) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3, 13,0) *Σε σύγκριση με το επίπεδο ονομαστικής σημασίας 0,0193 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) Σκέλος FC + H N= (56,0%) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9, 15,1) Εικόνα 11. Ενημερωμένη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του στομάχου P04125GR_03/GM333 σελ. 46/56

47 Γαστρικός καρκίνος Μια ερευνητική ανάλυση OS με βάση τη δοκιμή ενίσχυσης γονιδίου (FISH) και υπερέκφρασης πρωτεΐνης (IHC) συνοψίζεται στον Πίνακα 17. Πίνακας 17. Ερευνητικές αναλύσεις κατά κατάσταση HER2 με αποτελέσματα ενημερωμένης συνολικής επιβίωσης. FISH+ / IHC 0, 1+ υποομάδα (N=133) Αρ. θανάτων / n (%) Διάρκεια διάμεσης συνολικής επιβίωσης (μήνες) 95% Δ.Ε. (μήνες) FC N=296 α 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4, 11,7) Αναλογία κινδύνου (95% Δ.Ε.) 1,33 (0,92 1,92) FISH+ / IHC2+ υποομάδα (N=160) Αρ. θανάτων / n (%) 65/80 (81%) Διάρκεια διάμεσης συνολικής επιβίωσης 10,8 (μήνες) (6,8, 12,8) 95% Δ.Ε. (μήνες) Αναλογία κινδύνου (95% Δ.Ε.) 0,78 (0,55, 1,10) FISH+ ή FISH-/IHC3+ γ υποομάδα (N=294) Αρ. θανάτων / n (%) 104/143 (73%) Διάρκεια διάμεσης συνολικής επιβίωσης 13,2 (μήνες) (11,5. 15,2) 95% Δ.Ε. (μήνες) Αναλογία κινδύνου (95% Δ.Ε.) 0,66 (0,5, 0,87) FC+H N=298 β 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2, 10,7) 64/80 (80%) 12,3 (9,5, 15,7) 96/151 (64%) 18,0 (15,5, 21,2) Η διάμεση επιβίωση υπολογίστηκε από τις καμπύλες Kaplan-Meier. α Δύο ασθενείς στο σκέλος FC με FISH+ αλλά με άγνωστη κατάσταση IHC, αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις. β Πέντε ασθενείς στο σκέλος Herceptin με FISH+ αλλά με άγνωστη κατάσταση IHC, αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις. γ Περιλαμβάνει 6 ασθενείς από το σκέλος χημειοθεραπείας, 10 ασθενείς από το σκέλος Herceptin με FISH-, IHC3+ και 8 ασθενείς από το σκέλος χημειοθεραπείας, 8 ασθενείς από το σκέλος Herceptin με άγνωστη κατάσταση FISH, IHC3+. P04125GR_03/GM333 σελ. 47/56

48 Γαστρικός καρκίνος Αντιμετώπιση προβλημάτων - Στόμαχος Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 1. Δεν παρουσιάζονται σήματα ή είναι ασθενή 1α. Τα αντιδραστήρια έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς ή της φύλαξης 1β. Το μικροσκόπιο δε λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Ακατάλληλος λαμπτήρας - Ο λαμπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Ακάθαρτοι ή/και ραγισμένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1α. Ελέγξτε τις συνθήκες φύλαξης. Βεβαιωθείτε ότι υπήρχε ξηρός πάγος κατά την παραλαβή της αποστολής του μίγματος ιχνηθετών IQISH και της πεψίνης. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια αποθηκεύτηκαν όπως διευκρινίζεται. 1β. Ελέγξτε το μικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα χρησιμοποιημένα φίλτρα είναι κατάλληλα για χρήση με τα φθοριοχρώματα του μίγματος ιχνηθετών και ότι ο λαμπτήρας υδραργύρου είναι σωστός και δεν έχει χρησιμοποιηθεί πέρα από την αναμενόμενη διάρκεια ζωής του (βλ. Παράρτημα 5). Σε περίπτωση αμφιβολίας, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον τοπικό προμηθευτή του μικροσκοπίου σας. 1γ. Εξασθενημένα σήματα 1γ. Αποφύγετε τη μικροσκοπική εξέταση μακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρές πηγές φωτός. 1δ. Εσφαλμένη αναγνώριση των ρυθμιστικών διαλυμάτων 1δ. Αντικαταστήστε το συνολικό όγκο ρυθμιστικών διαλυμάτων και βεβαιωθείτε για τη σωστή καταχώριση (στο σταθμό εργασίας) και την αναγνώριση (στην οθόνη αφής) των ρυθμιστικών διαλυμάτων. Συμβουλευτείτε το Βασικό οδηγό χρήσης του Dako Omnis για περισσότερες λεπτομέρειες. Προσοχή: Το ISH Pre-Treatment Solution είναι πράσινο και το ISH Stringent Wash Buffer είναι κίτρινο. P04125GR_03/GM333 σελ. 48/56

49 Γαστρικός καρκίνος Πρόβλημα Πιθανή αιτία Προτεινόμενη ενέργεια 2. Περιοχές χωρίς σήμα 2. Έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα κατά τη διάρκεια της επικάλυψης 2. Αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα. Αν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε τις ελαφρά με μια λαβίδα ώστε να απομακρυνθούν. 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 4. Πενιχρή μορφολογία ιστού 5. Υψηλό επίπεδο πράσινου αυτοφθορισμού στην αντικειμενοφόρο συμπεριλαμβανομέ νων περιοχών χωρίς ιστό FFPE 3α. Ακατάλληλη μονιμοποίηση ιστού 3β. Παρατεταμένη έκθεση της υβριδιωμένης τομής σε ισχυρό φως 4α. Εσφαλμένη επεξεργασία με διάλυμα πεψίνης 4β. Ιδιαίτερα παρατεταμένη επεξεργασία με διάλυμα πεψίνης ή πάρα πολύ λεπτό πάχος τομής ενδέχεται να προκαλέσει την εμφάνιση κυττάρων-φαντασμάτων ή σχήματος donut. 5. Χρήση ληγμένων ή μη συνιστώμενων γυάλινων αντικειμενοφόρων. 3α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε αποκλειστικά τομές ιστών μονιμοποιημένες με φορμόλη και εγκλεισμένες σε παραφίνη. 3β. Αποφύγετε τη μικροσκοπική εξέταση μακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρό φως. 4α. Αλλαγή σε κάποιο άλλο από τα τρία διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης. Βεβαιωθείτε ότι το ISH Pepsin φυλάσσεται στη σωστή θερμοκρασία. 4β. Δοκιμάστε ένα πρωτόκολλο χρώσης με συντομότερη διάρκεια επώασης πεψίνης. Βεβαιωθείτε ότι το πάχος των τομών είναι 3-6 µm. 5. Επιλέξτε γυάλινες αντικειμενοφόρους όπως διευκρινίζεται. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης των γυάλινων αντικειμενοφόρων πλακών. Σημείωση: Αν το πρόβλημα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε κάποιο από τα παραπάνω αίτια ή αν η προτεινόμενη διορθωτική ενέργεια δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβλημα, επικοινωνήστε με την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. P04125GR_03/GM333 σελ. 49/56

50 Γαστρικός καρκίνος Παράρτημα 3 - Στόμαχος HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), Κωδικός GM333 Σχήμα βαθμολόγησης Ημερομηνία εκτέλεσης χρώσης: Παρτίδα HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Κωδικός αριθμός ημερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Κωδικός αριθμός δείγματος: Χαρακτηρισμός διανομής σήματος στον ιστό: Ομοιογενής: Ετερογενής Εστιακή: ή Ετερογενής Μωσαϊκό: Αρ. πυρήνων Καταμέτρηση σημάτων σε 20 πυρήνες Βαθμολογία HER2 (ερυθρά) Βαθμολογία CEN-17 (πράσινα) Αρ. πυρήνων Βαθμολογία HER2 (ερυθρά) Βαθμολογία CEN-17 (πράσινα) Σύνολο (1-10) Σύνολο (11-20) Για τον προσδιορισμό της αναλογίας HER2/CEN-17, καταμετρήστε τον αριθμό σημάτων HER2 και τον αριθμό σημάτων CEN-17 στους ίδιους 20 πυρήνες και διαιρέστε τον συνολικό αριθμό των σημάτων HER2 δια του συνολικού αριθμού των σημάτων CEN-17. Σε περίπτωση που η αναλογία HER2/CEN-17 είναι οριακή (1,8 2,2), καταμετρήστε 40 διαφορετικούς πυρήνες και υπολογίστε εκ νέου την αναλογία για τους 40 πυρήνες (ανατρέξτε στην Ανακαταμέτρηση σχήματος βαθμολόγησης, Παράρτημα 4). Αναλογία ίση με ή πλησίον της τιμής αποκλεισμού (1,8-2,2) πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή (δείτε τον οδηγό καταμέτρησης). P04125GR_03/GM333 σελ. 50/56

51 Γαστρικός καρκίνος HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 Σύνολο βαθμολογίας (1-20) Αναλογία < 2: δεν παρατηρήθηκε ενίσχυση του γονιδίου HER2 Αναλογία 2: παρατηρήθηκε ενίσχυση του γονιδίου HER2 Ημερομηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ημερομηνία και υπογραφή, Παθολόγος: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθμολόγησης: Βλ. Ερμηνεία χρώσεων. P04125GR_03/GM333 σελ. 51/56

52 Γαστρικός καρκίνος Παράρτημα 4 - Στόμαχος HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός GM333 Ανακαταμέτρηση σχήματος βαθμολόγησης Ημερομηνία εκτέλεσης χρώσης: Παρτίδα HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Κωδικός αριθμός ημερολογίου εκτέλεσης χρώσης: Κωδικός αριθμός δείγματος: Σήματα σε 40 επιπρόσθετους πυρήνες (1-40) Αρ. πυρήνων HER2 (κόκκινο) CEN17 (πράσινο) Αρ. πυρήνων HER2 (κόκκινο) CEN-17 (πράσινο) Αρ. πυρήνων HER2 (κόκκινο) CEN-17 (πράσινο) Αρ. πυρήνων HER2 (κόκκινο) CEN-17 (πράσινο) Σύνολο Σύνολο Σύνολο Σύνολο (1-10) (11-20) (21-30) (31-40) Για τον προσδιορισμό της αναλογίας HER2/CEN-17, καταμετρήστε τον αριθμό σημάτων HER2 και τον αριθμό σημάτων CEN-17 στους ίδιους 40 πυρήνες και διαιρέστε τον συνολικό αριθμό των σημάτων HER2 δια του συνολικού αριθμού των σημάτων CEN-17. Βλ. Συνολική Βαθμολόγηση από τους 1-40 πυρήνες στον ακόλουθο πίνακα. Σύνολο βαθμολογίας (1-40) HER2 CEN-17 Αναλογία HER2/CEN-17 Αναλογία < 2: δεν παρατηρήθηκε ενίσχυση του γονιδίου HER2 Αναλογία 2: παρατηρήθηκε ενίσχυση του γονιδίου HER2 Ημερομηνία και υπογραφή, Τεχνικός: Ημερομηνία και υπογραφή, Παθολόγος: Για κατευθυντήριες οδηγίες βαθμολόγησης: Βλ. Ερμηνεία χρώσεων. P04125GR_03/GM333 σελ. 52/56

53 Γαστρικός καρκίνος Παράρτημα 5 - Στόμαχος HER2 IQFISH pharmdx, Κωδικός GM333 Προδιαγραφές μικροσκοπίου φθορισμού Η Dako συνιστά τον ακόλουθο εξοπλισμό για χρήση με το HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Τύπος μικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισμού 2. Λαμπτήρας Λαμπτήρας υδραργύρου 100 W (διατηρείτε αρχείο του χρόνου λειτουργίας του λαμπτήρα) 3. Αντικειμενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισμού 16X ή 20X Για μεγέθυνση υψηλής ισχύος και απαρίθμηση των σημάτων, συνιστώνται μόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειμενικοί φακοί φθορισμού, π.χ. 100x 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατομικά για ειδικά φθοριοχρώματα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Η Dako συνιστά τη χρήση ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασμό με διπλό φίλτρο Texas Red/FITC υψηλής ποιότητας. Φίλτρο DAPI Διπλό φίλτρο Texas Red/FITC Για επιβεβαίωση και απαρίθμηση είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν μονά φίλτρα Texas Red και FITC Φθοριόχρωμα Μήκος κύματος διέγερσης Μήκος κύματος εκπομπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο μικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι κρίσιμης σημασίας για την ερμηνεία. Εάν θέλετε λεπτομερείς πληροφορίες, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον προμηθευτή του μικροσκοπίου σας ή με τον αντιπρόσωπο της Dako. 5. Έλαιο Μη φθορίζον έλαιο Προφυλάξεις Δεν συνιστάται χρήση λαμπτήρα υδραργύρου 50 W Δεν είναι δυνατή η χρήση φίλτρων ροδαμίνης Δεν συνιστώνται τριπλά φίλτρα Ένα μη βελτιστοποιημένο μικροσκόπιο είναι δυνατό να προκαλέσει προβλήματα κατά την ανάγνωση των σημάτων φθορισμού. Είναι σημαντικό να μην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραμμιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να ακολουθούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαμπτήρα υδραργύρου. Το μικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται και ο λαμπτήρας υδραργύρου πρέπει να είναι σε ευθυγράμμιση πριν από την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγματος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισμού. Συνιστούμε να συζητήσετε την εγκατάσταση του συγκεκριμένου μικροσκοπίου σας με τον κατασκευαστή πριν από την έναρξη της φθορίζουσας σήμανσης υβριδοποίησης in situ ή να ανατρέξετε στη βιβλιογραφία. P04125GR_03/GM333 σελ. 53/56

54 Βιβλιογραφικές αναφορές 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: P04125GR_03/GM333 σελ. 54/56

55 19. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3): Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2- positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, openlabel, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: P04125GR_03/GM333 σελ. 55/56

56 Επεξήγηση συμβόλων Αριθμός καταλόγου Περιορισμοί θερμοκρασίας Ημερομηνία λήξης Ιατρική συσκευή in vitro διαγνωστικών εξετάσεων Φυλάξτε το μακριά από το ηλιακό φως (συμβουλευθείτε το εδάφιο αποθήκευσης) Κατασκευαστής Συμβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης Κωδικός παρτίδας Εικονοσύμβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Αναθεώρηση Κατασκευάζεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Τηλ Φαξ Διανέμεται στις ΗΠΑ από την: Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Τηλ. 805/ , Χωρίς χρέωση: 800/ Πληροφορίες για παραγγελίες: Τηλ. 800/ Φαξ 805/ Τεχνική υποστήριξη: Τηλ. 800/ P04125GR_03/GM333 σελ. 56/56