TA Cloning Vector (کیت کلونینگ) شماره کاتالوگ (BP-153) این کیت جهت کلونینگ محصولات PCR با انتهاي da overhang '3 مي باشد. این کیت داراي وکتور

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "TA Cloning Vector (کیت کلونینگ) شماره کاتالوگ (BP-153) این کیت جهت کلونینگ محصولات PCR با انتهاي da overhang '3 مي باشد. این کیت داراي وکتور"

Γοργοφόνη Κρεστενίτης
5 χρόνια πριν
Προβολές:

1 TA Cloning Vector (کیت کلونینگ) شماره کاتالوگ (BP-153) Component Vector PTZ T4 DNA ligaze 5X ligation Buffer Control Fragment Control 1 Control 2 BP-Medium BP-solution وکتور PTZ خطی باز با انتهای محتویات و اجزای کیت مقادیر و غلظت 30 ng/µl 50 µl 5 IU/ µl 30 µl 200 µl 60 µl 60 µl 20 ng/ µl 30 µl 50ml 15 ml 3 overhang Thymine به طول bp ٢٨٨٦ آنزیم متصل کننده بافر برای واکنش لیگیشن محصول PCR پلاسمید حلقوی سوپرکویل حلقوی دست نخورده پلاسمید حلقوی سوپرکویل حلقوی با طول 4000 bp محیط LB سوپلمنت با آمپی سیلین محلول باز کننده دیواره باکتری مشخصات فنی: این کیت جهت کلونینگ محصولات PCR با انتهاي da overhang '3 مي باشد. این کیت داراي وکتور PTZ57 R/T که در هنگام ترانسفورم شدن در سلول هاي مستعد ١ نظیر سویه هاي DH5a و XL1 Blue به تعداد زیادی از پلاسمید های نوترکیب وارد سلول باکتري مي شود و جزء وکتورهاي Number Plasmid محسوب High-Copy مي گردد و و به تعداد کپي از این پلاسمید مي تواند در یك سلول باکتري قرار بگیرد. میزان غلظت بالاي از توالي هدف کلون شده را فراهم آورد. در این سیستم بعد از قراردادن محصول PCR به مدت ٣٠-٢٠ دقیقه در حضور آنزیم Taq Polymerase به دو انتهای 5 از یک رشته و به انتهایی 3 از رشته مکمل آن باز آدنین اضافه می شود. از طرفی به دلیل اینکه در دو سر پلاسمید خطی باز تیمین قرار دارد بنابراین در طی فراینده کلونینگ محصول PCR با مکمل خود در پلاسمید خطی پیوند یافته که در نهایت توسط آنزیم لیگاز دو انتهای پلاسمید با دو انتهای محصول PCR وصل می گردد. در این حالت یک پلاسمید نوترکیب حلقوی سوپرکویل تشکیل می شود. جهت استفاده کارآمد در فرایند کلونینگ و انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتري اشرشیاکولي مستعد این کیت با کیت BPAid Bacterial 1 -Competent Cell

2 transformation kit ادغام گردید. سلول هاي کامپتنت به صورت موازي پیش مي رود. بر اساس این پروتکل الحاق محصول PCR به داخل پلاسمید ٢ و اماده سازي موارد استفاده: انجام کلونینگ و بدست آوردن تعداد کپی های یکسان از توالی موردنظر گرداوری کتابخانه DNA انجام تست های تشخیص حفظ توالی میکروارگانیسم های کمیاب جهت نگهداری در بانک ژنومی -٢-٣ -٤ تعداد واکنش های قابل انجام: ٥- این کیت برای انجام ٣٠ بار انجام کلونینگ کافی است. پروتکل انجام آزمایش: الف مواد و تجهیزات لازم: ٦- باکس حاوي یخ -٧ میکروسانتریفیوژیفیوژ یخچال دار با حداکثر دور RPM ٨- سمپلر هاي اپندروف 10 و 100 ٩- سر سمپلر هاي فیلتر دار مخصوص سمپلر 100 و 10 ٠ ١ ٢ ٣ ٤ لوله هاي فالکون 15 ml استریل آنتي بیوتیك آمپي سیلین با غلظت استوك 100 µg/ml پلیت هاي استریل کشت تریپتون و Nacl از شرکت مرك Yeast extract از شرکت فولکا ٥ لوله هاي شیشه اي سوش هاي باکتري DH5α سوش باکتري XL1Blue ٦ ٧ 2 Ligation

3 X-Gal و IPTG ماده DMSO از شرکت مرك اتوکلاو مدل تامي ژاپن پیپت پاستور فیلتر 0.2 میلي پور سواپ هاي استریل ٨ ٩-٢٠ -٢١-٢٢ -٢٣ مقدار ب ( تهیه محیط : LB Agar & LB Broth ١٠ گرم تریپتون ٥ گر پودر Yeast Extract و میلی لیتر بریزید سپس مقدار 800mL 5 گرم Nacl توزین کنید و در یک ارلن مایر به حجم ١٠٠٠ آب دیونایز به آن اضافه کرده و حجم آن را ٨٠٠ میلی لیتر برسانید و PH آن را با کمک سود به ٥ برسانید و در نهایت حجم آن با آب دیونیزه به 1000mL برسانید. و در پایان 500mL از آن در درون ارلن جدیدي تهیه محیط LB براث ریخته شد. به ارلن حاوي LB آگار 7.5 گرم ماده آگار اضافه گردید و در روي شعله بصورت ملایم حرارت داده شد تا اینکه شفاف شد و در پایان هر دو ارلن مربوط به محیط LB براث اتوکلاو کنید. بعد از اتمام اتوکلاو به هر کدام از محیط ها در دماي حدودا 50 مقدار 500 µl از محلول آنتي بیوتیك به غلظت 100 mg/ml اضافه شد( تا غلظت نهاي انتي بیوتیك در آن به 50 µg/ml برسد) و به آرامي مخلوط کنید و سپس در پلیت هاي محیط کشت استریل بریزید. پ ( تهیه :Ligation Mixture مطابق جدول زیر نسبت به تهیه مخلوط لیگیشن اقدام کنید: Component Vector PTZ 5X ligation Buffer PCR Product آ ب مقطر تزریقی T4 DNA ligaze حجم کلی محتویات 3µL 6 µl 3 µl 16 µl 2 µl 30 µl سپس مخلوط فوق به مدت 5 ثانیه در دور 5000RPM سانتریفیوژ کنید و بصورت Overnight در یخچال ٤ درجه سانتیگراد انکوباسیون کنید به این میکروتیوب Ligation Mixture می گویم.

4 نکته: ٢٠ دقیقه قبل از کشت سلول هاي ترانسفورم شده (مرحله ٨) -X از هریك از محلول هاي اماد ه شده 40 µl Gal و IPTG به محیط کشت LB آگار اضافه کرد و با یك سواپ استریل به صورت یکسان در سرتاسر سطح پلیت پخش گردید و به مدت 20 دقیقه در در انکوباتور ٣٧ قرار داده تا محیط براي کشت باکتري اماده گردد و IPTH و -X Gal جذب محیط کشت گردد. روش کار: ابتدا 300 µl از باکتري سویه هاي DH5α و EL1Blue در ٢ لوله جداگانه از محیط LB Broth تلقیح کرده و بصورت Overnight بشرح ذیل انجام گرفت: در انکوباتور شیکر دار با دور 50RPM بصورت گردشي قرار داده شد. فردا صبح سایر مراحل آماده سازي : BP-solution ابتدا 500 µl از محلول BP-solution به یك میکروتیوب 1.5 استریل اضافه شد و بر روي یخ انکوبه گردید. ٢- محیط BP-Medium را در درون انکوباتور قرار داده شد تا یخ آن ذوب گردیده و دماي آن به 37 برسد. 150-٣ سپس µl از باکتري هاي سویه هاي DH5α و یا به یک میکروتیوب جداگانه اضافه کنید و مقدار RPM به آن اضافه کنید و به مدت 20 دقیقه در یك انکوباتور شیکر دار با دور BP-Medium از محیط ml شیک کنید. -٤ سپس میکروتیوب بالا را به مدت 1 دقیقه در دماي 4 و دور 5000RPM سانتریفیوژ کنید و سپس مایع رویي( سوپرناتانت) آن دور دور بریزید. -٥ بر روی یخ مقدار 300 µl از محلول BP-solution به پلت اضافه کنید و با کمک پیپت کردن پلت را حل و سپس در دماي 4 و بمدت 1 دقیقه در دور 5000RPM سانتریفیوژ گردید سوپرناتانت را دور بریزید. -٦ پلت حاصله درµL یخ انکوبه گردید. 120 از محلول BP-solution بصورت سوسپانسیون در آمده و به مدت 5 دقیقه بر روي -٧ سپس 2.5 µl از محلول شد و به مدت 2 دقیقه بر روي یخ سرد شد( همچنین 1 µl Ligation Mixture تهیه شده در بند پ به یك میکروتیوب 1.5 جدید ریخته از 1 Control و 2 Control داخل ٢ میکروتیوب جداگانه ریخته شد و به مدت 2 دقیق بر روي یخ سرد شد. ٨- سپس 50 µl از سلول هاي آماده فوق( ٧ اضافه و مخلوط گردید و براي مدت 5 دقیقه بر روي یخ انکوباسیون گردید. موجود در کیت در DH5α و ( XL1Blue به تیوب هاي آماده سازی شده در مرحله

5 ٩- فورا 30 µl از مخلوط قسمت ٨ س بر روي محیط LB Agar حاوي Supplement شده با 40 µl از -X Gal و xl1blue برده شد و با کمك پیپت پاستور استریل خنك شده در تمام سطح پلیت حاوي آمپي سلین پخش گردید. در نهایت پلیت محیط کشت براي مدت ٢٤ ساعت در دماي 37 انکوباسیون کنید. نتیجه: کلوني هاي سفید که در واقع کلوني هاي نوترکیب هستند کلوني هاي آبي که فاقد پلاسمید نوترکیب هستند -٢

6 کیت : BP TA-Cloning Vector مواد مورد نیاز وکتور PTZ آنزیم محدود کننده خریداری می شود -٢-٣ -٤-٥ باکتری اکولای سویه مهندسی شده XL1 Blue انزیم ترمینال ترانسفراز 5X ligation Buffer -٦-٧ -٨ کلرید کلسیم پلی اتیلن گلیکول IPTG& X-Gal -٩ ٠ ١ پلیت محیط کشت اتوکلاو تریپتون Mgcl2 ٢ Kcl ٣ Mgso4 ٤ Spin culumn ٥ محتویات کیت: Component Vector PTZ T4 DNA ligaze 5X ligation Buffer Control Fragment Control 1 Control 2 BP-Medium BP-solution مشخصات وکتور PTZ خطی باز با انتهای 3 overhang Thymine به طول bp ٢٨٨٦ آنزیم متصل کننده بافر برای واکنش لیگیشن محصول PCR پلاسمید حلقوی سوپرکویل حلقوی دست نخورده پلاسمید حلقوی سوپرکویل حلقوی با طول 4000 bp محیط LB سوپلمنت با آمپی سیلین محلول باز کننده دیواره باکتری

7 پروسه: تهیه وکتور PTZ با دنباله های overhang Thymine 3 ابتدا وکتور PTZ حلقوی سوپرکویل بداخل باکتری اکولای سویه XL1 Blue در مجاورت کلرید کلسیم سرد انتقال داده می شود. و بروی محیط LB جامد حاوی ٥٠ میکروگرم آمپی سیلین XGAL وIPTG کشت داده می شوند و به مدت ٢٤ ساعت در انکوباتور قرار می گیرند. آنگاه کلون های جدا سازی شده و این باردر محیط LB مایع حاوی ٥٠ میکروگرم آمپی سیلین کشت داده می شوند. سپس استخراج پلاسمید با کمک کیت فرمنتاز انجام می شود. سپس وکتور PTZ با کمک آنزیم محدود کننده Blunt end ایجاد می گردد. مقداری از وکتور در این مرحله در حضور مقدار مناسبی از آنزیم ترمینال ترانسفراز و در حضور ddttp به انتهای دنباله خارجی وکتور باز تیمین اضافه کرده و دنباله های overhang Thymine 3 ایجاد می کند. طرز تهیه :5X Ligation Buffer مقدار مناسبی از تریس HCL کلرید منیزیم DTT ATP و پلی اتیلن گلیکول ٨٠٠٠ و به عنوان 5X Ligation Buffer در ویال مربوطه ریخته می شود. -٢-٣ تهیه محیط : BP- Medium مقدار مناسبی از تریپتون عصاره مخمر کلرید سدیم کلرید منیزیم سولفت منیزیم با یکدیگر مخلوط کرده و اتوکلاو می کنیم سپس در شرایط استریل مقداری امپی سیلین به آن اضافه کمی شود. تهیه :BP Solution مقدار مناسبی از کلرید کلسیم پلی اتیلن گلیکول و گلسیرول اضافه می شود. طرز تهیه : control 1 مقدار مناسبی از وکتور خطی PTZ در یک واکنش آنزیمی در حضور انزیم لیگاز به فرم حلقوی درامده و بعد از انتقال به سلول باکتری در میزان بالا تکثیر شده و بعد از استخراج پلاسمید و تخلیص شدن به عنوان کنترل ١ مورد استفاده قرار می گیرد. طرز تهیه Cintrol 2

8 محصول PCR حاصل از یک واکنش به طول 1114 bp بدرون پلاسمید کلون شده و به عنوان کنترل ٢ جهت مقایسه فرایند کلونینگ مورد استفاده قرار می گیرد. ستون جاذب Spin column توصیف: این کیت جهت کلونینگ محصولات PCR با انتهاي da overhang '3 مي باشد. این کیت داراي وکتور PTZ57 R/T ٣ که در هنگام ترانسفورم شدن در سلول هاي مستعد نظیر سویه هاي DH5a و XL1 Blue به تعداد زیادی از پلاسمید های نوترکیب وارد سلول باکتري مي شود و جزء وکتورهاي Number Plasmid محسوب High-Copy مي گردد و و به تعداد کپي از این از این پلاسمید مي تواند در یك سلول باکتري قرار بگیرد. میزان غلظت بالاي از توالي هدف کلون شده را فراهم آورد. در این سیستم بعد از قراردادن محصول PCR به مدت انتهای 5 از یک رشته و به انتهایی سر پلاسمید خطی باز تیمین قرار دارد ٣٠-٢٠ دقیقه در حضور آنزیم Taq Polymerase به دو 3 از رشته مکمل آن باز آدنین اضافه می شود. از طرفی به دلیل اینکه در دو بنابراین در طی فراینده کلونینگ محصول PCR با مکمل خود در پلاسمید خطی پیوند یافته که در نهایت توسط آنزیم لیگاز دو انتهای پلاسمید با دو انتهای محصول PCR وصل می گردد. در این حالت یک پلاسمید نوترکیب حلقوی سوپرکویل تشکیل می شود جهت استفاده کارآمد در فرایند کلونینگ و انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتري اشرشیاکولي مستعد این کیت با کیت PCR BPAid Bacterial transformation kit ادغام گردید. پلاسمید ٤ و اماده سازي سلول هاي کامپتنت به صورت موازي پیش مي رود. بر اساس این پروتکل الحاق محصول به داخل موارد استفاده: ٢٤- انجام کلونینگ و بدست آوردن تعداد کپی های یکسان از توالی موردنظر ٢٥- گرداوری کتابخانه DNA انجام تست های تشخیص حفظ توالی میکروارگانیسم های کمیاب جهت نگهداری در بانک ژنومی -٢٦-٢٧ 3 -Competent Cell 4 Ligation

Σχετικά έγγραφα

محاسبه ی برآیند بردارها به روش تحلیلی

محاسبه ی برآیند بردارها به روش تحلیلی برای محاسبه ی برآیند بردارها به روش تحلیلی باید توانایی تجزیه ی یک بردار در دو راستا ( محور x ها و محور y ها ) را داشته باشیم. به بردارهای تجزیه شده در راستای محور