ΣΧΕΔΙΑΣΜOΣ ΑΜΦIΦΙΛΩΝ ΚΑΤΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΜΕ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΕΣ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗΣ ΩΣ ΒΙΟΣΤΑΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ

Transcript

1 ΣΧΕΔΙΑΣΜOΣ ΑΜΦIΦΙΛΩΝ ΚΑΤΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΜΕ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΕΣ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗΣ ΩΣ ΒΙΟΣΤΑΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Aντώνης Στρατιδάκης, Ζαχαρούλα Ιατρίδη, Γεώργιος Μπόκιας Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πάτρας, ΤΚ 26504, Ρίο-Πάτρα, Ελλάδα Μαρία Τσελεπή, Απόστολος Βανταράκης Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πάτρας, ΤΚ 26504, Ρίο-Πάτρα, Ελλάδα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Παρουσιάζεται η σύνθεση μιας σειράς αμφίφιλων κατιοντικών συμπολυμερών, P(VBCHAM-co-VBCTEAM), τα οποία προέκυψαν μετά από χημική τροποποίηση του πολυ(βινυλοβενζυλοχλωριδίου) (PVBC) με Ν,Νδιμεθυλοδεκαεξυλαμίνη (ΗΑΜ) και τριαιθυλαμίνη (ΤΕΑΜ). Η κατιοντική ομάδα του αζώτου στη δομική μονάδα VBCΗΑΜ αναμένεται να προσδώσει βιοστατική δράση στα υλικά. Προκαταρκτικές μελέτες για τη διερεύνηση της βιοστατικής δράσης των συμπολυμερών P(VBCHAM-co-VBCTEAM) δείχνουν πως διαθέτουν ελαφρά βιοστατική δράση έναντι των πρότυπων στελεχών των βακτηρίων P.aeruginosa και S. Aureus, η οποία φαίνεται να ενισχύεται με την αύξηση της περιεκτικότητάς τους σε μονάδες VBCHAM. Σε επόμενο στάδιο ακολούθησε η μελέτη αλληλεπίδρασης των συμπολυμερών και μιας αντίθετα φορτισμένης επιφανειοδραστικής ένωσης, προκειμένου τα παραπάνω πολυμερικά υλικά να μπορούν να εισαχθούν σε διάφορες μήτρες, όπως για παράδειγμα εκείνες που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία χρωμάτων για υποθαλάσσιες εφαρμογές. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο σχεδιασμός πολυμερών με αντιμικροβιακές ιδιότητες αποτελεί ένα σημαντικό πεδίο έρευνας, το οποίο βρίσκει εφαρμογή σε ποικίλους τομείς όπως σε νοσοκομειακές εγκαταστάσεις και τον εξοπλισμό χειρουργείων, σε συστήματα καθαρισμού νερού, σε «καθαρά» χρώματα (antiouling paints) και άλλα. 1 Ανάμεσα στις πρόσφατες έρευνες πάνω σε υλικά που χαρακτηρίζονται ως αποτρεπτικά βιοαποθέσεων (antiouling), η χρήση πολυμερικών βιοστατικών υλικών είναι εξαιρετικού ενδιαφέροντος, καθώς σε αυτή την περίπτωση επιτυγχάνεται ο συνδυασμός της βιοστατικής δράσης με τα πλεονεκτήματα της πολυμερικής υφής των υλικών. Μια κατηγορία πολυμερών που χρησιμοποιούνται ευρέως ως βιοστατικά είναι τα κατιοντικά πολυμερή που φέρουν τεταρτοταγείς ομάδες αμμωνίου. 2,3 Σε τέτοια πολυμερή, οι βιοστατικές ομάδες μπορούν να είναι είτε προσωρινά προσδεδεμένες πάνω στο πολυμερές, μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, είτε μόνιμα προσδεδεμένες μέσω ομοιοπολικών δεσμών. 4,5,6 Στην παρούσα εργασία εστιάζουμε στην παραπάνω κατηγορία υλικών. Έτσι, αρχικά προχωρήσαμε στη σύνθεση μιας σειράς αμφίφιλων κατιοντικών συμπολυμερών, P(VBCHAM-co-VBCTEAM), τα οποία προέκυψαν μετά από χημική τροποποίηση του πολυ(βινυλοβενζυλοχλωριδίου) (PVBC) με Ν,Νδιμεθυλοδεκαεξυλαμίνη (ΗΑΜ) και τριαιθυλαμίνη (ΤΕΑΜ). Η κατιοντική ομάδα του αζώτου στη δομική μονάδα VBCΗΑΜ είναι αυτή που αναμένεται να προσδώσει βιοστατική δράση στα υλικά. Τα συντεθέντα συμπολυμερή χαρακτηρίστηκαν ως προς τη σύστασή τους με φασματοσκοπία πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού πρωτονίων ( 1 Η-ΝΜR) και ως προς την αυτοοργάνωσή τους σε υδατικό διάλυμα με την τεχνική της ιχνηθέτησης με φθορίζοντα ιχνηθέτη το Nile Red. Προκαταρκτικές μελέτες για τη διερεύνηση της βιοστατικής δράσης των συμπολυμερών P(VBCHAM-co-VBCTEAM) δείχνουν πως διαθέτουν ελαφρά βιοστατική δράση έναντι των πρότυπων στελεχών των βακτηρίων P.aeruginosa και S. Aureus. Η δράση τους φαίνεται να ενισχύεται με την αύξηση της περιεκτικότητάς τους σε μονάδες VBCHAM. Προκειμένου τα παραπάνω πολυμερικά υλικά να εισαχθούν σε διάφορες μήτρες, όπως για παράδειγμα εκείνες που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία χρωμάτων για υποθαλάσσιες εφαρμογές, θα πρέπει να βελτιωθεί η συμβατότητά τους με τις μήτρες και να περιοριστεί η διαλυτότητά τους στο νερό. Για το σκοπό αυτό, σε επόμενο στάδιο διερευνήθηκε η αλληλεπίδρασή τους με την αντίθετα φορτισμένη επιφανειοδραστική ένωση δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS), καθώς αναμένεται πως πάνω από μια αναλογία ανάμιξης θα σχηματιστεί ένα αδιάλυτο σε υδατικό διάλυμα «σύμπλοκο» πολυμερούς/επιφανειοδραστικής ένωσης. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σύνθεση των πολυμερών Η αντίδραση ομοπολυμερισμού του βινυλοβενζυλοχλωριδίου (VBC) πραγματοποιήθηκε στους 90 ο C, υπό ατμόσφαιρα αργού και διήρκησε 24 ώρες. Ο διαλύτης της αντίδρασης ήταν το διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) και ως εκκινητής χρησιμοποιήθηκε το αζωδιισοβουτυρονιτρίλιο (AIBΝ). Η αντίδραση αλκυλίωσης του πολυ(βινυλοβενζυλοχλωριδίου) πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και διήρκησε 72 ώρες. Για την αλκυλίωση χρησιμοποιήθηκε μια μακριάς αλυσίδας αμίνη, η Ν,Ν-διμεθυλοδεκαεξυλαμίνη (ΗΑΜ), η οποία

2 δεσμεύεται ομοιοπολικά πάνω στη μονάδα VBC Ο διαλύτης της αντίδρασης ήταν χλωροφόρμιο (CHCl 3 ). Παρασκευάστηκαν τρία προϊόντα σε διαφορετικό ποσοστό αλκυλίωσης με ΗΑΜ (5, 10 και 33%). Ακολουθώντας όμοια πειραματική πορεία με την αντίδραση αλκυλίωσης του PVBC με ΗΑΜ, πραγματοποιήθηκε αντίδραση αλκυλίωσης των παραπάνω τροποποιημένων πολυμερών PVBCΗΑΜ με προσθήκη τριαιθυλαμίνης (ΤΕΑΜ). Παρασκευή διαλυμάτων για τη μελέτη αλληλεπίδρασης των πολυμερών με επιφανειοδραστική ένωση Για τη φυσικοχημική μελέτη των αλληλεπιδράσεων των θετικά φορτισμένων συμπολυμερών που συντέθηκαν με την αντίθετα φορτισμένη επιφανειοδραστική ένωση δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS) παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα των συμπολυμερών. Στη συνέχεια, τα παραπάνω διαλύματα αραιώνονταν με ορισμένους όγκους καθαρού νερού και υδατικών διαλυμάτων του SDS διαφόρων συγκεντρώσεων. Η τελική συγκέντρωση των πολυμερών στα υπό μελέτη διαλύματα ήταν ίση με 0.1%wt. Τεχνικές χαρακτηρισμού και φυσικοχημικές μελέτες Οι συστάσεις των πολυμερών που συντέθηκαν προσδιορίστηκαν με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού υδρογόνου ( 1 Η-ΝΜR) με φασματοφωτόμετρο Bruker Avance DPX 400MHz. Για τη διάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν δευτεριωμένο νερό D 2 Ο και χλωροφόρμιο CDCl 3. Για τη φυσικοχημική μελέτη των διαλυμάτων των πολυμερών με ιχνηθέτηση, ως φθορίζοντας ιχνηθέτης χρησιμοποιήθηκε το Nile Red. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με το φασματοφωτόμετρο LS45 (Luminescence Spectrometer) της PERKIN ELMER. Σε όγκο 3mL των προς μελέτη δειγμάτων προσθέσαμε με τη βοήθεια μικροπιπέτας 5μl διαλύματος Nile Red 10-3 Μ. Η σάρωση πραγματοποιούνταν από τα 570nm έως τα 700 nm με ταχύτητα (scan speed) 400nm/min, ενώ το μήκος κύματος διέγερσης ήταν 550 nm. Η οπτική πυκνότητα των διαλυμάτων των πολυμερών προσδιορίστηκε με τη χρήση του φασματοφωτομέτρου υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) U-1800 της HITACHI, το οποίο ήταν εφοδιασμένο με κατάλληλη υποδοχή κυψελίδας χαλαζία (Quartz). Οι μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας πραγματοποιήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος, 500nm. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων θολομετρίας, η θερμοκρασία ήταν σταθερή στους 25 ο C. Mέθοδος ποσοτικού ελέγχου της βιοστατικής δράσης των πολυμερών Τα πρότυπα στελέχη βακτηρίων (P. aeruginosa, S. aureus), τα οποία βρίσκονται σε λυοφιλιωμένη μορφή, αρχικά ανακτήθηκαν σε 10ml Peptone Saline για 20 λεπτά. Ύστερα προστέθηκαν 40ml Tryptic Soy Broth και η καλλιέργεια επωάστηκε για ώρες στους 37±1 ο C. Από το εναιώρημα της κάθε καλλιέργειας βακτηρίου τοποθετήθηκαν 20μl με μορφή σταγόνας στο κέντρο της επιφάνειας μιας καλυπτρίδας που έχει μια λεπτή επίστρωση του υπό μελέτη πολυμερούς υλικού. Επιπλέον, εμβολιάστηκε και η επιφάνεια μίας καλυπτρίδας (control) που δεν έχει επιστρωθεί με κάποιο πολυμερές για λόγους σύγκρισης. Τόσο τα πολυμερή όσο και τα control τοποθετήθηκαν σε θερμοκρασία 22±2 ο C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα δείγματα καλυπτρίδων με τα πολυμερή μεταφέρθηκαν σε 10ml Phosphate Buered Saline και προστέθηκαν γυάλινα σφαιρίδια στο καθένα. Ακολούθησε ανάδευση με τη χρήση vortex για 30 δευτερόλεπτα. Με τη διαδικασία αυτή ξεπλένονται τα βακτήρια από την επιφάνεια της καλυπτρίδας. Πραγματοποιήθηκαν 4 διαδοχικές δεκαδικές αραιώσεις του διαλύματος που περιέχει το εναιώρημα βακτηρίων. Από το αρχικό διάλυμα και από την κάθε αραίωση επιστρώθηκαν 100μl σε τριβλία με στερεό θρεπτικό υλικό Nutrient Agar με τη μέθοδο spread, εις διπλούν. Τα τριβλία επωάστηκαν για ώρες στους 37±1 ο C. Τελικά, ακολούθησε καταμέτρηση των αποικιών που αναπτύχθηκαν στο κάθε τριβλίο. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σύνθεση και χαρακτηρισμός των πολυμερών Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η σύνθεση του τροποποιημένου πολυ(βινυλοβενζυλοχλωριδίου) (PVBC) με αμίνες όπως η Ν,Ν-διμεθυλοδεκαεξυλαμίνη (ΗΑΜ) και η τριαιθυλαμίνη (ΤΕΑΜ), το οποίο τελικά θα φέρει τεταρτοταγείς ομάδες αζώτου που παρουσιάζουν βιοστατική δράση. Οι αμίνες εισάχθηκαν στις αλυσίδες του PVBC ομοιοπολικά με αντίδραση εμβολιασμού των ΗΑΜ ή ΤΕΑΜ επί του PVBC. Στο Σχήμα 1 παρουσιάζεται η αντίδραση ομοπολυμερισμού του VBC ενώ στα Σχήματα 2 και 3 δίνονται οι αντιδράσεις παρασκευής των PVBCHAM και P(VBCHAM-co-VBCTEAM), αντίστοιχα.

3 Σχήμα 1. Ομοπολυμερισμός του VBC. Σχήμα 2. Αντίδραση αλκυλίωσης του ΡVBC με ΗΑΜ. + CHCl 3 TEAM PVBCHAM PVBCHAMTEAM Σχήμα 3. Αντίδραση αλκυλίωσης του ΡVBCΗΑΜ με ΤΕΑΜ. Ο χαρακτηρισμός των πολυμερών πραγματοποιήθηκε με φασματοσκοπία 1 H-NMR. Στο Σχήμα 4 παρουσιάζονται τα φάσματα των PVBC, PVBCHAM5% και PVBCHAM10% σε διαλύτη CDCl 3 ενώ στο Σχήμα 5 παρουσιάζεται το φάσμα του P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) σε διαλύτη D 2 O. (a) (b) () PVBC (a) (b) (a) (b) () (i) PVBCHAM () (i) (i) (e) PVBCHAM10% PVBCHAM5% PVBC d c i d c i d c a, b a, b a, b e e δ (ppm) Σχήμα 4. Φάσματα 1 H-NMR των PVBC και PVBCHAM.

4 a b a b c c c c a,b d d d d i,m m,k i i m,k i e m,k PVBCHAMTEAM d c δ (ppm) Σχήμα 5. Φάσμα 1 H-NMR του P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM). Στον Πίνακα 1 συνοψίζονται τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού των πολυμερών PVBCHAM και P(VBCHAM-co-VBCΤΕΑΜ). Πίνακας 1. Αποτελέσματα από τον χαρακτηρισμό 1 Η-NMR για τα συμπολυμερή PVBCHAM και P(VBCHAM-co-VBCΤΕΑΜ). Συμπολυμερές Σύσταση τροφοδοσίας Σύσταση από 1 H-NMR (% mol HAM) (% mol HAM) PVBCHAM5% P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) PVBCHAM10% P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) PVBCHAM33% P(VBCHAM33%-co-VBCTEAM) Έλεγχος της βιοστατικής δράσης των πολυμερών Στο Σχήμα 6 δίνονται φωτογραφίες όπου στο κέντρο της επιφάνειας της καλυπτρίδας που έχει μια λεπτή επίστρωση των υπό μελέτη πολυμερών τοποθετείται μια σταγόνα από το εναιώρημα της κάθε καλλιέργειας βακτηρίου. Σχήμα 6. Εμβόλιο καλλιέργειας επάνω σε πολυμερές υλικό. Στο Σχήμα 7 παρατηρούμε τα αποτελέσματα της βιοστατικής δράσης των συμπολυμερών P(VBCHAM5%- co-vbcteam) και P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) για τους δύο μικροοργανισμούς

5 Absorbance at 500nm (a.u.) 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, Σχήμα 7. Η βιοστατική δράση των συμπολυμερών έναντι των πρότυπων στελεχών των βακτηρίων P.aeruginosa και S. Aureus, όπου D13: P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) και D14: P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM). Οι μπάρες (λογαριθμική μείωση και τυπική απόκλιση) προκύπτουν από το μέσο όρο (average) τεσσάρων τιμών κάθε πειράματος. Συμπερασματικά, για τα υλικά P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) και P(VBCHAM10%- co-vbcteam) παρατηρείται πως έχουν πολύ μικρή βιοστατική δράση έναντι των πρότυπων στελεχών P.aeruginosa και S. aureus. Συγκεκριμένα, το υλικό P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) μείωσε την ανάπτυξη του P. aeruginosa κατά 0.45 log (μέσος όρος πειραμάτων), ενώ στην ανάπτυξη του S. aureus δεν είχε καμία βιοστατική δράση. Το υλικό P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) εμφανίζει ελαφρά βελτίωση της βιοστατικής δράσης που αντιστοιχεί σε 0.53 log για το P. aeruginosa και σε 0.49 για το S. aureus. Μελέτη αλληλεπίδρασης των πολυμερών με επιφανειοδραστική ένωση Η φυσικοχημική μελέτη των αλληλεπιδράσεων των θετικά φορτισμένων συμπολυμερών που συντέθηκαν με την αντίθετα φορτισμένη επιφανειοδραστική ένωση δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της θολομετρίας και της ιχνηθέτησης με φθορίζοντα ιχνηθέτη το Nile Red. Στο Σχήμα 8 δίνεται η μεταβολή της οπτικής πυκνότητας υδατικών διαλυμάτων των συμπολυμερών P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) και P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) κατά την προσθήκη της επιφανειοδραστικής ένωσης SDS. 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1E-4 1E-3 0,01 0, concentration o SDS (mm) Σχήμα 8. Μεταβολή της οπτικής πυκνότητας υδατικών διαλυμάτων των συμπολυμερών P(VBCHAM5%-co- VBCTEAM) ( ) και P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) ( ) κατά την προσθήκη SDS, ως συνάρτηση της συγκέντρωσης SDS. Παρατηρούμε ότι σε μικρές συγκεντρώσεις SDS, που κυμαίνονται από 10-4 mm έως 2 mm, η οπτική πυκνότητα των διαλυμάτων παραμένει σταθερή σε σχεδόν μηδενικές τιμές, που σημαίνει ότι τα διαλύματα είναι διαυγή. Σε συγκεντρώσεις SDS μεγαλύτερες του 2 mm, η οπτική πυκνότητα των διαλυμάτων του SDS με τα πολυμερή παρουσιάζει μία απότομη αύξηση, καθώς τα διαλύματα αυτά θολώνουν λόγω του σχηματισμού του συμπλόκου πολυμερούς/sds, το οποίο διαχωρίζεται από το υδατικό διάλυμα. Στο Σχήμα 9 παρουσιάζεται συγκριτικά η μεταβολή της έντασης εκπομπής του Nile Red στο μέγιστο της κορυφής εκπομπής, σε διαλύματα που περιέχουν τα συμπολυμερή P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) και P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) και το SDS. Παρατηρούμε ότι σε συγκεντρώσεις SDS μικρότερες των 0.1 mm, η εκπομπή είναι μικρή για όλα τα διαλύματα, υποδηλώνοντας ότι το Νile Red, ανιχνεύει αποκλειστικά υδρόφιλο περιβάλλον. Ωστόσο, σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις SDS, η μέγιστη ένταση εκπομπής για όλα τα διαλύματα, αυξάνεται απότομα, λαμβάνοντας ιδιαίτερα υψηλές τιμές, λόγω του εξαιρετικά υδρόφοβου περιβάλλοντος που ανιχνεύει το Nile Red. Αυτή η αύξηση της έντασης υποδηλώνει το σχηματισμό συμπλόκου του συστήματος πολυμερές/sds.

6 Intensity (a.u.) 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, E-4 1E-3 0,01 0,1 1 concentration o SDS (mm) Σχήμα 9. Μεταβολή της έντασης εκπομπής του Nile Red σε υδατικά διαλύματα SDS παρουσία των συμπολυμερών P(VBCHAM5%-co-VBCTEAM) ( ) και P(VBCHAM10%-co-VBCTEAM) ( ), ως συνάρτηση της συγκέντρωσης SDS. EYXAΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΘΑΛΗΣ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. Τίτλος Έργου: «Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Νέων Λειτουργικών Συμπολυμερών Συσταδικής Αρχιτεκτονικής - Ικανότητες Αυτοοργάνωσης και Ελεγχόμενη Δέσμευση/Αποδέσμευση Ουσιών με Βιοστατική Δράση» (MIS: ). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Guo L., Yuan W., Lu Z., Li G.M., Colloids and Suraces A: Physicochem. Eng. Aspects. 439:69 (2013). [2]. Gilbert P., Moore L.E., Appl. Microbiol. 99(4):703 (2005). [3]. Sai M.J., Anwar J., Munawar M.A., Langmuir. 25(1):377 (2009). [4]. Kenawy E.R., Abdel-Hay F.I., El-Shanshoury A.E.R.R., El-Newehy M.H., J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem., 40:2384 (2002). [5]. Koromilas N.D., Lainioti G.Ch., Oikonomou E.K., Bokias G., Kallitsis J.K., Eur. Polym. J. 54:39 (2014). [6]. Guo A., Wang F., Lin W., Xu X., Tang T., Shen Y., et al. Int. J. o Biol. Macromol. 67:163 (2014).