ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Μεθυλίωση των T-UCRs (Transcribed-Ultra Conserved Regions) σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Αναστασία Κοττόρου Βιολόγος, MSc Πάτρα, Μάιος 2018

2 2

3 ΜΕΛΗ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Τα μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Γεωργία Στεφάνου Καθηγήτρια Γενετικής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Χαράλαμπος Καλόφωνος Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Συνεπιβλέπων Καθηγητής Γεώργιος Κίλιας Αναπληρωτής Καθηγητής Γενετικής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Τα μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Κωνσταντίνος Θωμόπουλος Αναπληρωτής Καθηγητής Γαστρεντερολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Γεώργιος Πενθερουδάκης Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Μέλος Θωμάς Μακατσώρης Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Άγγελος Κούτρας Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο

4 4

5 Στους ασθενείς: σε αυτούς που τα κατάφεραν, σε αυτούς που δεν τα κατάφεραν, σε αυτούς που δίνουν τη μάχη τους ακόμα 5

6 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος, και μάλιστα, ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένα νόσημα των ανεπτυγμένων κοινωνιών. Ο σύγχρονος τρόπος ζωής έχει κλιμακώσει το πρόβλημα, το οποίο έχει διαστάσεις μάστιγας. Είναι επομένως επιτακτική η ανάγκη για καλύτερη κατανόηση της νόσου και για εξεύρεση κλινικά χρήσιμων εργαλείων που θα καταστήσουν πιο εύκολη τη διάγνωση και την παρακολούθησή της. Την ανάγκη αυτή στόχευε να θεραπεύσει και η παρούσα διδακτορική διατριβή, η οποία έλαβε χώρα χάρη στη συνεργασία του Τμήματος Βιολογίας και του Εργαστηρίου Μοριακής Ογκολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Σίγουρα, τίποτα απ όλα αυτά δεν θα είχε τελεσφορήσει, αν κάποιοι άνθρωποι δεν είχαν συνδράμει αποφασιστικά, στους οποίους οφείλω εγκάρδιες ευχαριστίες. Συγκεκριμένα, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επιβλέπουσα Καθηγήτρια κ. Γεωργία Στεφάνου, αφενός μεν, γιατί μου έδωσε την ευκαιρία να εκπονήσω την παρούσα διδακτορική διατριβή και να εμβαθύνω σε ένα τόσο σημαντικό ζήτημα, το οποίο μελλοντικά μπορεί να οδηγήσει και σε κλινικές εφαρμογές, αφετέρου δε, για την αγαστή συνεργασία που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια. Την ευχαριστώ πολύ και εύχομαι τώρα που αφυπηρετεί να συνεχίσει να στηρίζει με τον δικό της ξεχωριστό τρόπο τους φοιτητές. Επίσης, θερμές ευχαριστίες και ευγνωμοσύνη οφείλω στον Συνεπιβλέποντα Καθηγητή κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο, για τη δυνατότητα που μου έδωσε να ενταχθώ στην ομάδα του Εργαστηρίου του και για την εμπιστοσύνη που έχει δείξει στο πρόσωπό μου τα τελευταία έντεκα χρόνια. Τον ευχαριστώ για την καθοδήγηση και την δυνατότητα που μου παρείχε να υπηρετήσω τη Μεταφραστική Έρευνα, καθώς επίσης και για την υποστήριξή του σε περιόδους δύσκολες. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω για την άψογη συνεργασία και την ουσιαστική συμβολή τους στην πραγματοποίηση της παρούσας διατριβής τον Ομότιμο Καθηγητή Χειρουργικής κ. Μιχάλη Σταυρόπουλο και τον 7

8 Αναπληρωτή Καθηγητή Γαστρεντερολογίας κ. Κωνσταντίνο Θωμόπουλο, οι οποίοι συνεισέφεραν το απαραίτητο βιολογικό υλικό από ασθενείς της Χειρουργικής και της Γαστρεντερολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, αντίστοιχα. Θερμά ευχαριστώ και όλα τα μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Κίλια, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Θωμά Μακατσώρη και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Άγγελο Κούτρα, για τον χρόνο που διέθεσαν και για τη συμβολή τους στην ολοκλήρωση της διατριβής. Ιδιαιτέρως, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων κ. Πενθερουδάκη που δέχτηκε να συμμετάσχει στην Επιτροπή παρά την απόσταση που μας χωρίζει, συμβάλλοντας κι εκείνος στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής με τις γνώσεις και την εμπειρία του. Επίσης, οφείλω θερμές ευχαριστίες στους Γαστρεντερολόγους κ. Γεωργία Διαμαντοπούλου και κ. Θεόδωρο Θεοδωρακόπουλο για την αμέριστη βοήθεια στη συλλογή των δειγμάτων παρά τον μεγάλο φόρτο εργασίας που είχαν. Ακόμα, χρωστώ ευχαριστίες στην κ. Άννα Αντωνακοπούλου, Ερευνήτρια στο Εργαστήριο Μοριακής Ογκολογίας, σε ιδέα της οποίας βασίστηκε η παρούσα διατριβή, για τη συνεργασία που έχουμε όλα αυτά τα χρόνια, για την καθοδήγηση αλλά και την ανεξαρτησία που μου προσέφερε στο εργαστήριο, για την φιλία της και το επιστημονικό της ήθος που αποτέλεσε παράδειγμα στην πορεία μου μέχρι τώρα. Επιπρόσθετα θα ήθελα να ευχαριστήσω και την κ. Χαρούλα Σιρινιάν, Ερευνήτρια στο ανωτέρω Εργαστήριο, τόσο για τη φιλία της και το ευχάριστο περιβάλλον που διαμορφώνει στο Εργαστήριο, όσο και για την ουσιαστική συμβολή της στις λειτουργικές μελέτες της διατριβής. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω από τις ευχαριστίες τον σύζυγό μου Φωτεινό Δημητρακόπουλο για τη συμπαράσταση και την υποστήριξή του σε 8

9 συναισθηματικό και σε επιστημονικό επίπεδο, αφού συνέβαλε ουσιαστικά, τόσο με τη συλλογή των δειγμάτων και των δεδομένων των ασθενών, όσο και με την εύστοχη κριτική και τις ιδέες του. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη και να τους αφιερώσω τη διατριβή, αφού κίνητρο για την εκπόνησή της αλλά και απώτερος σκοπός της, ήταν να προσφέρω ένα λιθαράκι στην έρευνα για τον καρκίνο προς όφελος των ίδιων. 9

10 10

11 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Περίληψη.17 Abstract Εισαγωγή Εμβρυογένεση του παχέος εντέρου Ανατομία του παχέος εντέρου Φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου Πολύποδες Κολοορθικός καρκίνος Επιδημιολογία Παράγοντες κινδύνου Μηχανισμοί καρκινογένεσης Προληπτικός έλεγχος για τον κολοορθικό καρκίνο Σταδιοποίηση Σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ Θεραπευτική αντιμετώπιση Προγνωστικοί και προβλεπτικοί βιοδείκτες Επιγενετική Επιγενετική και καρκίνος Επιγενετική και κολοορθικός καρκίνος Επιγενετικές αλλαγές ως βιοδείκτες Υγρή βιοψία ncrnas (non-coding RNAs, μη κωδικεύοντα RNAs) mirnas (micrornas) lncrnas (Long non- coding RNAs) lncrnas και καρκίνος T-UCRs (Transcribed Ultraconserved Regions, Μεταγραφόμενες υπερσυντηρημένες Περιοχές)

12 Ρυθμιστικοί μηχανισμοί των T-UCRs Αλληλεπίδραση των T-UCRs με τα mirna T-UCRs και επιγενετικές τροποποιήσεις Οι T-UCRs και σήματα στις ιστόνες T-UCRs και καρκίνος Οι T-UCRs στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Οι T-UCRs στον καρκίνο του προστάτη Οι T-UCRs στο νευροβλάστωμα Οι T-UCRs στη λευχαιμία Οι T-UCRs στον κολοορθικό καρκίνο T-UCRs σε άλλους τύπους καρκίνου Σκοπός Υλικά και μέθοδοι Ασθενείς και δείγματα Έκφραση των T-UCRs Απομόνωση RNA από φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Πέψη του DNA Σύνθεση cdna Ποσοτικοποίηση της έκφρασης των T-UCRs Μεθυλίωση των T-UCRs Επιλογή της μεθόδου ανάλυσης της μεθυλίωσης MeDIP (Methylated DNA Immunoprecipitation) Απομόνωση DNA Ανοσοκατακρήμνιση DNA Ανάλυση μεθυλίωσης Διθειώδης μετατροπή Επιλογή της μεθόδου ανάλυσης της μεθυλίωσης Μεθυλίωση των T-UCRs στους ιστούς

13 Μεθυλίωση των T-UCRs στους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Απομόνωση του DNA από τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Διθειώδης μετατροπή του ιστικού DNA Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του DNA Μεθυλίωση των T-UCRs στους FFPE ιστούς Απομόνωση του DNA από τους FFPE ιστούς Διθειώδης μετατροπή του ιστικού DNA Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του DNA Μεθυλίωση των T-UCRs στο πλάσμα Απομόνωση του DNA από το πλάσμα Διθειώδης μετατροπή του κυκλοφορούντος DNA Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA Μεθυλίωση των T-UCRs στα ούρα Απομόνωση του DNA από τα ούρα Διθειώδης μετατροπή του κυκλοφορούντος DNA των ούρων Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA των ούρων Λειτουργική μελέτη των T-UCRs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Κλωνοποίηση των Uc160 και Uc Ενίσχυση των Uc160 και Uc346 με PCR Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Καθαρισμός προϊόντων Πλασμίδιο pcdna 3.1/Hygro ( ) Διπλή πέψη προϊόντων PCR και πλασμιδίου Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και καθαρισμός προϊόντων Σύνδεση προϊόντων PCR και πλασμιδίου

14 Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηρίων Επιλογή αποικίας και καλλιέργεια Απομόνωση πλασμιδίου Έλεγχος πλασμιδίου Καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Κυτταρική σειρά HT Κυτταρική σειρά Caco Κυτταρική σειρά DLD Συντήρηση, ανακαλλιέργεια και πάγωμα κυττάρων Μέτρημα κυττάρων Παροδική διαμόλυνση κυτταρικών σειρών με πλασμίδιο Έλεγχος διαμόλυνσης Πολλαπλασιασμός (MTT assay) Μετακίνηση (Scratch wound healing assay) Μετανάστευση (Transwell assay) Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Έκφραση των T-UCRs Σύγκριση καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού Διερεύνηση της σχέσης με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών Mεθυλίωση των T-UCRs Μεθυλίωση των T-UCRs στους ιστούς Μεθυλίωση των T-UCRs στους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Σύγκριση καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού Διερεύνηση της σχέσης με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών

15 Μεθυλίωση των T-UCRs στους FFPE ιστούς Διερεύνηση της σχέσης με τα Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών Μεθυλίωση των T-UCRs στο πλάσμα Μεθυλίωση των T-UCRs στα ούρα Λειτουργική μελέτη των T-UCRs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Έλεγχος διαμόλυνσης Πολλαπλασιασμός (MTT assay) Μετακίνηση (Scratch wound healing assay) Μετανάστευση (Transwell assay) Συζήτηση Έκφραση και μεθυλίωση των T-UCRs στους ιστούς Mεθυλίωση των T-UCRs στο πλάσμα και στα ούρα Λειτουργική σημασία των Uc160 και Uc346 στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση Βιβλιογραφία Παράρτημα Συντομογραφίες Δημοσίευση

16 16

17 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο κολοορθικός καρκίνος αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου σχετιζόμενου με καρκίνο στους άνδρες και την τρίτη στις γυναίκες παγκοσμίως. Παρόλο που ο έλεγχος με κολονοσκόπηση έχει συμβάλει στη μείωση της θνητότητας, η συμμόρφωση στις οδηγίες προληπτικού ελέγχου παραμένει πολύ χαμηλή. Λιγότερο επεμβατικό τρόπο αποτελεί η μελέτη του κυκλοφορούντος DNA και η ανεύρεση κατάλληλων βιοδεικτών, μεταξύ των οποίων συχνότεροι είναι αυτοί που σχετίζονται με γενετικές και επιγενετικές αλλαγές. Οι μεταγραφόμενες υπερσυντηρημένες περιοχές (Transcribed- Ultraconserved Regions, T-UCRs) είναι περιοχές του γονιδιώματος, οι οποίες είναι μεγαλύτερες των 200 bp και είναι απόλυτα συντηρημένες ανάμεσα στον άνθρωπο, τον μυ και τον επίμυ. Συχνά, η έκφρασή τους είναι απορρυθμισμένη σε διάφορους τύπους καρκίνου και ρυθμίζεται από επιγενετικούς μηχανισμούς. Αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης και της μεθυλίωσης των T-UCRs 160, 283 και 346 σε αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου και ορθού, όπως επίσης και σε παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς, καθώς και η διερεύνηση του ρόλου τους στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επίσης, εκτιμήθηκε η πιθανή διαγνωστική αξία της μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα και στα ούρα για τον κολοορθικό καρκίνο και τα αδενώματα του παχέος εντέρου. Τα επίπεδα έκφρασης των T-UCRs προσδιορίστηκαν σε καρκινικούς και παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς 51 ασθενών, με τη Uc160 να εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (p<0,001). Τα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs προσδιορίστηκαν επίσης σε καρκινικούς και παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς 64 ασθενών, καθώς επίσης και σε 6 αδενώματα, με τους καρκινικούς ιστούς να έχουν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης των τριών T-UCRs, σε σχέση με τους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (p<0,001, p=0,001 και p=0,004). Επιπλέον, αναδείχθηκε η προγνωστική αξία 17

18 των επιπέδων μεθυλίωσης των T-UCRs στους καρκινικούς ιστούς σε συγκεκριμένες ομάδες ασθενών. Πιο συγκεκριμένα, τα χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 ή τα υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 συσχετίστηκαν με μεγαλύτερο διάστημα υποτροπής της νόσου των ασθενών άνω των 66 ετών (p=0,005 και p=0,050 αντίστοιχα). Σε ασθενείς, που είχαν διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων, τα υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc346 συσχετίστηκαν με μεγαλύτερη πενταετή επιβίωση (p=0,016). Τα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs προσδιορίστηκαν επίσης στο πλάσμα 50 ασθενών με κολοορθικό καρκίνο, 59 ασθενών με αδένωμα, 12 ασθενών με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και 40 υγιών ατόμων και στη συνέχεια διερευνήθηκε η διαγνωστική τους αξία. Τα επίπεδα μεθυλίωσης των Uc160 και Uc346 στο πλάσμα διέφεραν ανάμεσα στις τέσσερις ομάδες, με τους ασθενείς με καρκίνο να έχουν τα υψηλότερα επίπεδα (p<0,001 και p=0,039 αντίστοιχα). Διερευνώντας την πιθανή διαγνωστική τους αξία, βρέθηκε ότι η μεθυλίωση της Uc160 και ο συνδυασμός των τριών μεθυλιωμένων T-UCRs είχαν τις μεγαλύτερες τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας (35% και 89% για τη Uc160, p=0,016 και 45% και 74,3% για τις τρεις T-UCRs, p=0,013 αντίστοιχα) για τον κολοορθικό καρκίνο, ενώ για το αδένωμα οι μεθυλιωμένες T-UCRs είχαν χαμηλή διαγνωστική αξία. Οι ίδιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ούρα από 24 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο, 26 ασθενείς με αδένωμα, 10 ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και 26 υγιή άτομα, χωρίς ωστόσο να αναδειχθεί διαγνωστική αξία των T-UCRs για τον κολοορθικό καρκίνο ή τα αδενώματα. Εν συνεχεία, διερευνήθηκε η λειτουργική σημασία της έκφρασης των ανωτέρω T-UCRs στις καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Caco-2, DLD-1 και HT-29. Αρχικά, οι Uc160 και Uc346 υπερεκφράστηκαν και προσδιορίστηκε ο ρυθμός πολλαπλασιασμού, μετακίνησης και μετανάστευσης. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν και σε όλες τις χρονικές στιγμές (24h και 48h), οι ρυθμοί πολλαπλασιασμού ήταν υψηλότεροι στα κύτταρα, τα οποία υπερεξέφραζαν τις Uc160 ή Uc346 18

19 (p=0,050 και p=0,002 αντίστοιχα για τα Caco-2 κύτταρα στις 24 h). Αυξημένοι ρυθμοί παρατηρήθηκαν επίσης και στη μετακίνηση σε όλες τις κυτταρικές σειρές και σε όλες τις χρονικές στιγμές, στα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τις Uc160 ή Uc346 (p=0,017 και p=0,041, στις 24 h και p=0,042 και p=0,043, στις 48h για τα DLD-1). Επιπλέον, περισσότερα κύτταρα DLD-1, τα οποία υπερεξέφραζαν τις Uc160 ή Uc346 μετανάστευσαν σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες (p=0,005 και για τις δύο T-UCRs). Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη δείξαμε, αφενός μεν, πως η έκφραση και η μεθυλίωση των T-UCRs Uc160, Uc283 και Uc346 στον κολοορθικό καρκίνο είναι απορρυθμισμένες, αφετέρου δε, πως επηρεάζουν θεμελιώδη χαρακτηριστικά του καρκινικού κυττάρου, όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η μετακίνηση και η μετανάστευση. Τέλος, βρέθηκε πως η μεθυλίωσή τους έχει προγνωστική αξία και αποτελεί μία υποσχόμενη ελάχιστα επεμβατική δοκιμασία για την ανίχνευση του κολοορθικού καρκίνου, η οποία όμως χρήζει περαιτέρω διερεύνησης και βελτίωσης. 19

20 20

21 ABSTRACT Colorectal cancer is the second leading cause of cancer related deaths for men and third for women worldwide. Although screening through colonoscopy has attributed to decline of cancer mortality, patients do not comply with the examination. Screening through analysis of circulating DNA and especially genetic and epinetic changes provide a minimally invasive method. Transcribed-Ultraconserved Regions (T-UCRs) are genomic regions longer than 200 bp, which are highly conserved among human, mouse and rat genomes. Their transcription is often deregulated in many cancer types and is regulated by epigenetic mechanisms. The aim of this study was the assession of expression and methylation levels of T-UCRs 160, 283 and 346 in colorectal adenocarcinomas and adjacent non neoplastic tissues, the investigation of their role in colorectal cancer progression and the possible diagnostic value of methylated T-UCRs in plasma or urine for colorectal cancer or adenoma detection. T-UCRs expression levels were assessed in cancer and adjacent non neoplastic tissues from 51 patients with colorectal cancer, with non neoplastic tissues having higher levels of Uc160 (p<0.001). T-UCRs methylation levels were assessed in cancer and adjacent non neoplastic tissues from 64 patients with colorectal cancer, as well as in 6 adenomas, with cancer tissues having higher methylation levels of all three T-UCRs (p<0.001, p=0.001 and p=0.004). Moreover, T-UCRs methylation levels seemed to have a prognostic value in specific subgroups of patients. More specifically, low methylation levels of Uc160 or high methylation levels of Uc283 were associated with longer time to disease progression for patients older than 66 yearls old (p=0.005 and p=0.050 respectively). In patients with positive lymph nodes, high methylation levels of Uc346 were associated with longer 5-year survival (p=0.016). 21

22 T-UCRs methylation levels were also assessed in plasma samples from 50 colorectal cancer patients, 59 adenoma patients, 12 patients with bowel inflammation and 40 healthy volunteers and were associated with colorectal cancer or adenoma existence. Uc160 and Uc346 methylation levels differed significantly in the plasma samples of the four groups, with cancer patients having the highest levels (p<0.001 and p=0.039 respectively). Furhter investigating their diagnostic value, methylation of Uc160 and the combination of methylated T-UCRs were found to have the best sensitivity and specificity values for colorectal cancer (35% and 89% for Uc160, p=0.016 and 45% and 74.3% for all T-UCRs, p=0.013, respectively), while their diagnostic value for adenomas was low. The same analyses were performed in urine samples from 24 colorectal cancer patients, 26 adenoma patients, 10 patients with bowel inflammation, and 26 healthy volunteers, without a diagnostic value of T-UCRs for colorectal cancer or adenoma being revealed. Furthermore, the functional role of Uc160 and Uc346 were assessed in colon cancer cells. Uc160 and Uc346 were overexpressed in colon cancer cell lines Caco-2, DLD-1 and HT-29, and proliferation, motility and migration rates were assessed. Proliferation rates were higher in cells overexpressing Uc160 or Uc346 in all cell lines and all different time points studied (24h και 48h) (p=0.050 and p=0.002 respectively in Caco-2 cells in 24 h). Increased rates were also observed in motility of all cell lines in all differents time points in cells overexpressing Uc160 or Uc346 (p=0.017 and p=0.041, in 24 h and p=0.042 and p=0.043, in 48h in DLD-1 cells). Moreover, more DLD-1 cells overexpressing Uc160 or Uc346 migrated compared to control cells (p=0.005 for both T-UCRs). In conclusion, in the present study we showed that T-UCRs 160, 283 and 346 expression and methylation are deregulated in colorectal cancer, while Uc160 and Uc346 affect proliferation and migration rates of the cells. Furthermore, their methylation have prognostic value and is a minimally 22

23 invasive test for colorectal cancer detection, provided that the sensitivity of the method will be improved. 23

24 24

25 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 25

26 26

27 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Εμβρυογένεση του παχέος εντέρου Το πεπτικό σύστημα σχηματίζεται από την ενδοδερμική βλαστική στιβάδα και εξαρτάται από την κεφαλουραία και την πλάγια κάμψη του εμβρύου. Ο σχηματισμός του σωληνώδους εντέρου γίνεται με εγκόλπωση και ενσωμάτωση μέρους του επενδυμένου με ενδόδερμα λεκιθικού ασκού στην κοιλότητα του σώματος. Στο πρόσθιο τμήμα σχηματίζεται το πρόσθιο έντερο, στην περιοχή της ουράς το οπίσθιο έντερο, η δε περιοχή ανάμεσά τους ονομάζεται μέσο έντερο. Το μέσο έντερο παραμένει σε επικοινωνία με τον λεκιθικό ασκό μέσω του λεκιθικού πόρου, ο οποίος αρχικά είναι ευρύς και αργότερα στενεύει, μέχρι να χαθεί τελείως η επικοινωνία. Το οπίσθιο έντερο καταλήγει σε μία μεμβράνη, η οποία ονομάζεται αμαρική μεμβράνη. Το ενδόδερμα σχηματίζει την επιθηλιακή επένδυση του εντέρου και τα υπόλοιπα στοιχεία του τοιχώματος προέρχονται από το σπλαχνικό μεσόδερμα. Η επιμήκυνση του μέσου εντέρου σχηματίζει μία αγκύλη (πρωτογενής εντερική αγκύλη), από το ουραίο τμήμα της οποίας προκύπτει αργότερα ο ειλεός, το τυφλό, το ανιόν και τμήμα του εγκαρσίου. Το υπόλοιπο εγκάρσιο, το κατιόν, το σιγμοειδές και το ορθό προκύπτουν από το οπίσθιο έντερο (Sandler, 2002). Στο σχήμα 1.1 απεικονίζεται σχηματικά οβελιαία τομή εμβρύου κατά τον πρώτο μήνα ανάπτυξης Ανατομία του παχέος εντέρου Η λειτουργική σημασία του παχέος εντέρου έγκειται στην απορρόφηση του ύδατος της τροφής. Έχει μήκος περίπου 1,5 μέτρο και αποτελείται από τα εξής επιμέρους τμήματα: τυφλό, ανιόν, εγκάρσιο, κατιόν και σιγμοειδές. Σε απόσταση 15 cm από τον σφιγκτήρα του πρωκτού ξεκινά το ορθό (Σχ. 1.2). 27

28 Σχήμα 1.1. Σχηματική παράσταση οβελιαίας τομής εμβρύου κατά τον πρώτο μήνα ανάπτυξης (Sandler, 2002). Σχήμα 1.2. Ανατομικές περιοχές του παχέος εντέρου. Η ξεχωριστή λειτουργία του παχέος εντέρου εξασφαλίζεται από 4 διακριτούς χιτώνες (Σχ. 1.3), οι οποίοι από μέσα προς τα έξω είναι: 1) Ο 28

29 βλεννογόνιος χιτώνας (mucosa), από τον οποίο σχεδόν όλοι οι κολοορθικοί καρκίνοι ξεκινούν. Ο βλεννογόνιος χιτώνας περιλαμβάνει τρία υποστρώματα: το επιθήλιο, το χόριο (lamina propria) και μία λεπτή μυϊκή στιβάδα (muscularis mucosa). Το επιθήλιο απορροφά νερό από τα κόπρανα και παράγει βλέννα. Η βλέννα σχηματίζει ένα ενυδατωμένο πηκτώδες επίστρωμα, το οποίο κάνει ολισθηρή την εντερική επιφάνεια και καλύπτει τα βακτηρίδια. Το νερό απορροφάται παθητικά ακολουθώντας την ενεργητική μεταφορά του νατρίου. Το χόριο, το οποίο είναι μία λεπτή στιβάδα συνδετικού ιστού πλούσια σε λεμφοκύτταρα και λεμφοζίδια, λόγω του βακτηριακού πληθυσμού του εντέρου. Τα λεμφοζίδια συχνά εκτείνονται και στον υποβλεννογόνιο χιτώνα. Η μυϊκή στιβάδα είναι μία λεπτή λωρίδα μυϊκού ιστού, διακριτή από τον μυικό χιτώνα που περιγράφεται παρακάτω. 2) Ο υποβλεννογόνιος χιτώνας (submucosa) βρίσκεται κάτω από το μυϊκό στρώμα του βλεννογόνου και χαρακτηρίζεται από την παρουσία αγγείων και νεύρων. 3) Ο μυϊκός χιτώνας (muscularis propria) είναι ένα παχύ μυϊκό στρώμα, το οποίο βοηθά την μετακίνηση των κοπράνων μέσα στο έντερο και αποτελείται από επιμήκεις και κυκλοτερείς ταινίες. 4) Ο ορογόνιος χιτώνας (serosa) ή περιτόναιο, ένα λεπτό εξωτερικό στρώμα συνδετικού ιστού, το οποίο καλύπτει το μεγαλύτερο τμήμα του παχέος εντέρου αλλά όχι του ορθού. Περιλαμβάνει και ένα λεπτό στρώμα από συνδετικό ιστό, τον υποορογόνιο χιτώνα (subserosa), ο οποίος καλύπτεται από μία σειρά κυττάρων που παράγουν υγρό, το οποίο βοηθάει το έντερο να κινείται απαλά ανάμεσα στα υπόλοιπα όργανα. Στα ενδοπεριτοναϊκά τμήματα του εντέρου, ο ορογόνιος χιτώνας χαρακτηρίζεται από μικρές αιωρούμενες προσεκβολές που αποτελούνται από λιπώδη ιστό και ονομάζονται επιπλοιϊκές αποφύσεις. Στο ορθό, το μεγαλύτερο τμήμα καλύπτεται από λίπος και λιγότερο από ορογόνιο χιτώνα (Robbins, 2000). 29

30 Σχήμα 1.3. Σχηματική απεικόνιση των στρωμάτων του παχέος εντέρου Φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου Η ιδιοπαθής φλεγμονώδης νόσος του εντέρου περιλαμβάνει τη νόσο του Crohn και την ελκώδη κολίτιδα. Στα αίτια της ιδιοπαθούς φλεγμονώδους νόσου του εντέρου περιλαμβάνονται η γενετική προδιάθεση και η παρουσία συγκεκριμένων λοιμωδών παραγόντων, οι οποίοι κινητοποιούν συγκεκριμένες ανοσολογικές αντιδράσεις από τον ξενιστή, με τελική κατάληξη τη διαμόρφωση του φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος που τροφοδοτεί την ανάπτυξη της νόσου. Τα προϊόντα της ενεργοποίησης των φλεγμονωδών κυττάρων προκαλούν μη ειδική ιστική βλάβη. Η φλεγμονή διαταράσσει την ακεραιότητα του επιθηλιακού φραγμού του βλεννογόνου, οδηγώντας σε απώλεια της απορροφητικής λειτουργίας των επιθηλιακών κυττάρων και σε ενεργοποίηση των εκκρίσεων των επιθηλιακών κυττάρων και των κρυπτών. Η νόσος του Crohn χαρακτηρίζεται από περιγεγραμμένη και τυπικά διατοιχωματική προσβολή του εντέρου από μία φλεγμονώδη διεργασία με συνοδό βλάβη του βλεννογόνου, την παρουσία μη τυροειδοποιημένων κοκκιωμάτων στο 40%-60% των περιπτώσεων και 30

31 δημιουργία σχισμών με σχηματισμό συριγγίων. Η ελκώδης κολίτιδα είναι μία ελκωτική φλεγμονώδης νόσος, που προσβάλλει το κόλον, αλλά συνήθως περιορίζεται στον βλεννογόνιο και στον υποβλεννογόνιο χιτώνα. Αρχίζει συχνά από το ορθό και επεκτείνεται κεντρικότερα, μερικές φορές καταλαμβάνοντας όλο το κόλον. Συνδεόμενη συχνά με φλεγμονώδεις αντιδράσεις είναι και η εκκολπωμάτωση του παχέος εντέρου, η οποία προκαλείται από επίκτητα εκκολπώματα, στα οποία η μυϊκή στιβάδα απουσιάζει ή είναι ελλιπής. Τα εκκολπώματα είναι τυφλοί θύλακες που προεξέχουν της πεπτικής οδού, είναι επενδυμένοι με βλεννογόνο και επικοινωνούν με τον αυλό του εντέρου. Ενίοτε οι σχηματισμοί αυτοί φλεγμαίνουν, οδηγώντας στη νοσολογική οντότητα, που καλείται εκκολπωματίτιδα Πολύποδες Οι πολύποδες είναι καλοήθεις μάζες που προεξέχουν μέσα στον αυλό του εντέρου και μπορεί να είναι άμισχοι ή έμμισχοι. Είναι δυνατό να σχηματιστούν από παθολογική ωρίμανση, φλεγμονή ή λόγω ξεχωριστής αρχιτεκτονικής του βλεννογόνου. Οι περισσότεροι πολύποδες είναι σποραδικοί και αυξάνονται με την ηλικία. Το 90% των επιθηλιακών πολυπόδων είναι μη νεοπλασματικοί και οι περισσότεροι από αυτούς είναι υπερπλαστικοί πολύποδες. Οι υπερπλαστικοί πολύποδες είναι μικρές, λείες, ημισφαιρικές προεξοχές του βλεννογόνου και εμφανίζονται συχνότερα πολλαπλοί, παρά μεμονωμένοι. Πιο συχνά εντοπίζονται στο σιγμοειδές και στο ορθό και ιστολογικά περιέχουν άφθονες κρύπτες επενδυμένες με καλά διαφοροποιημένα κυπελλοειδή ή απορροφητικά επιθηλιακά κύτταρα, διαχωριζόμενα από ένα υποτυπώδες χόριο (Robbins, 2000). Άλλοι καλοήθεις πολύποδες είναι οι αμαρτωματώδεις (νεανικοί πολύποδες και πολύποδες Peutz-Jegher), οι φλεγμονώδεις και οι λεμφοειδείς 31

32 πολύποδες. Οι νεανικοί πολύποδες είναι αμαρτωματώδεις εκβλαστήσεις, κυρίως του χορίου, που περικλείουν αραιούς και διατεταμένους κυστικούς αδένες και εντοπίζονται συχνότερα σε παιδιά κάτω των 5 ετών. Οι πολύποδες Peutz-Jegher είναι σπάνιοι αμαρτωματώδεις πολύποδες και αποτελούν μέρος του συνδρόμου Peutz-Jegher, το οποίο χαρακτηρίζεται επιπλέον από υπερμελάγχρωση του βλεννογόνου και του δέρματος. Οι αδενωματώδεις πολύποδες ή αδενώματα είναι αποτέλεσμα επιθηλιακού πολλαπλασιασμού και δυσπλασίας και κάποιοι από αυτούς μπορούν να εξελιχθούν σε κακοήθεια. Η συχνότητα εμφάνισης των αδενωμάτων είναι 20%-30% πριν την ηλικία των 40 ετών και αυξάνεται στο 40%-50% μετά την ηλικία των 60. Φαίνεται ότι υπάρχει οικογενής προδιάθεση για τα σποραδικά αδενώματα, η οποία εκτιμάται περίπου σε τέσσερις φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για αδενώματα μεταξύ συγγενών πρώτου βαθμού και σε τέσσερις φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για καρκίνο για έναν ασθενή με αδένωμα. Τα αδενώματα διακρίνονται με βάση την επιθηλιακή δομή στα σωληνώδη, τα θηλώδη και τα σωληνοθηλώδη. Η πλειονότητα των αδενωμάτων είναι σωληνώδη, 5%-10% είναι θηλώδη και το 1% είναι σωληνοθηλώδη. Τα σωληνώδη είναι κυρίως σωληναριακοί αδένες, τις περισσότερες φορές μικροί και έμμισχοι. Τα θηλώδη είναι λαχνώδεις προεκβολές συνήθως μεγάλες και άμισχες. Τα σωληνοθηλώδη αδενώματα είναι συνδυασμός των σωληνωδών και των θηλωδών αδενωμάτων. Ο καρκίνος είναι σπάνιος στα σωληνώδη αδενώματα κάτω του ενός εκατοστού, ενώ η πιθανότητα καρκίνου είναι μεγάλη (περίπου 40%) στα άμισχα θηλώδη αδενώματα διαμέτρου άνω των 4 εκατοστών. Σοβαρή δυσπλασία, όταν υπάρχει, συνήθως παρατηρείται σε λαχνώδεις περιοχές (Robbins, 2000). Τα σύνδρομα οικογενούς πολυποδίασης είναι σπάνιες αυτοσωματικές επικρατείς διαταραχές. Έχουν τάση για κακοήθη εξαλλαγή, η οποία οδηγεί στην κλινική εκδήλωση του κολοορθικού καρκίνου. Στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση οι ασθενείς αναπτύσσουν αδενώματα, με τα περισσότερα να είναι σωληνώδη. Συστήνεται η προφυλακτική 32

33 κολεκτομή, καθώς ο κίνδυνος για την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου μέχρι το μέσον της ζωής είναι 100%. Το γενετικό ελάττωμα, που υποκρύπτεται στο σύνδρομο της οικογενούς πολυποδίασης, έχει εντοπιστεί στη χρωμοσωματική περιοχή 5q21. Ο κληρονομικός μη πολυποδιασικός κολοορθικός καρκίνος (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer) ή σύνδρομο Lynch είναι ένα αυτοσωμικό επικρατές οικογενές σύνδρομο, το οποίο χαρακτηρίζεται από αυξημένο κίνδυνο κολοορθικού καρκίνου και εξωεντερικού καρκίνου, ιδιαίτερα του ενδομητρίου στις γυναίκες. Τα αδενώματα εμφανίζονται σε μικρούς αριθμούς αλλά νωρίτερα από ότι στο γενικό πληθυσμό Κολοορθικός καρκίνος Η πλειονότητα των καρκίνων του παχέος εντέρου είναι αδενοκαρκινώματα (90%), ενώ με μικρότερη συχνότητα εμφανίζονται το αδενοπλακώδες καρκίνωμα, το ατρακτοκυτταρικό καρκίνωμα, το πλακώδες καρκίνωμα και το αδιαφοροποίητο καρκίνωμα. Ιστολογικά, τα αδενoκαρκινώματα ταξινομούνται σε κλασικού τύπου, ηθμοειδούς προτύπου, σε μυελοειδή καρκινώματα, σε μικροθηλώδη καρκινώματα, σε βλεννώδη καρκινώματα, σε οδοντωτά αδενοκαρκινώματα και σε καρκινώματα από κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλιδίου. Στο πλαίσιο αυτό, υπάρχουν ενδείξεις που συσχετίζουν το μυελοειδές καρκίνωμα με τη μικροδορυφορική αστάθεια (microsatellite instability, MSI) και με καλύτερη πρόγνωση, ενώ οι όγκοι με κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου έχουν χειρότερη πρόγνωση. Η ανάπτυξη καρκίνου, στην πλειονότητα των περιπτώσεων, προέρχεται από αδενώματα. Είναι γεγονός ότι πληθυσμοί με υψηλή συχνότητα αδενωμάτων έχουν και υψηλή συχνότητα κολοορθικού καρκίνου και αντίστροφα. Επίσης, η κατανομή των αδενωμάτων στο κόλον και στο ορθό είναι παρόμοια με αυτή του κολοορθικού καρκίνου. Συνήθως, όταν 33

34 ανακαλύπτεται ο διηθητικός καρκίνος, υπάρχει γύρω του αδενωματώδης ιστός. Η ανάπτυξη των αδενωμάτων προηγείται μερικά χρόνια αυτής του κολοορθικού καρκίνου. Ο κίνδυνος καρκίνου είναι ανάλογος με τον αριθμό των αδενωμάτων. Τέλος, η αφαίρεση αδενωμάτων ελαττώνει τη συχνότητα του καρκίνου. Ο κολοορθικός καρκίνος εμφανίζει πολλές μοριακές αλλαγές, ένα γενικότερο χαρακτηριστικό του καρκίνου. Εκτός από το χαρακτηριστικό της ανεξέλεγκτης διαίρεσης, τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να διηθούν παρακείμενους ιστούς. Επίσης, μπορεί να αφήσουν το πρωτοπαθές σημείο, όπου αναπτύσσονται και μέσω της κυκλοφορίας να εγκατασταθούν σε απομακρυσμένο σημείο και να αναπτυχθούν, διαδικασία η οποία καλείται μετάσταση. Ακόμα, τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητα ανοσοδιαφυγής, από την γονιδιωματική αστάθεια και από την αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο. Άλλο θεμελιώδες χαρακτηριστικό του καρκίνου είναι η παρουσία της φλεγμονώδους αντιδράσεως. Συνοπτικά και εποπτικά στο σχήμα 1.4 παρουσιάζονται τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων. Σχήμα 1.4. Τα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Προσαρμογή από (Hanahan & Weinberg, 2011). 34

35 Επιδημιολογία Ο κολοορθικός καρκίνος είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος σε επίπτωση και σε θνητότητα και στα δύο φύλα, μετά τον καρκίνο του πνεύμονα και του προστάτη (για τους άνδρες) και του μαστού (για τις γυναίκες) (Siegel et al., 2018). Στις ΗΠΑ, αναμένονται νέες περιπτώσεις και θάνατοι από κολοορθικό καρκίνο το 2018 (Siegel et al., 2018). Παγκοσμίως, ο κολοορθικός καρκίνος είναι ο τρίτος σε συχνότητα επίπτωσης στους άνδρες και δεύτερος στις γυναίκες, με 1,65 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και θανάτους ετησίως στο σύνολο (Fitzmaurice et al., 2017). Εμφανίζει υψηλότερη συχνότητα σε ΗΠΑ, Καναδά, Αυστραλία και γενικότερα στις αναπτυγμένες χώρες, ενώ είναι σημαντικά χαμηλότερη στην Ινδία, Νότια Αμερική και Αφρική, κυρίως λόγω των διατροφικών συνηθειών και του δυτικού τρόπου ζωής (Σχ. 1.5). Ειδικά στην Ευρώπη, ο κολοορθικός καρκίνος ευθύνεται για το 13% όλων των καρκίνων (εκτός από τους μημελανωματικούς δερματολογικούς καρκίνους) με νέες περιπτώσεις το 2012 (δεύτερος σε συχνότητα) και για το 12,2% των θανάτων από καρκίνο με θανάτους το Μέχρι το 2030 υπολογίζονται 2,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και 1,1 εκατομμύρια θάνατοι (Arnold et al., 2017). Η κορύφωση της συχνότητας του κολοορθικού καρκίνου παρατηρείται στην ηλικία των ετών, ενώ λιγότερο από 20% των περιπτώσεων εμφανίζεται σε ηλικία κάτω των 50 ετών. Είναι όμως γεγονός ότι η επίπτωση στις νεαρότερες ηλικίες, κάτω των 50 ετών, αυξήθηκε 2% ανά έτος, από το 1990 έως το 2014 (Siegel et al., 2018). Η επίπτωση και η θνητότητα έχουν μειωθεί τα τελευταία χρόνια και στα δύο φύλα στη Βόρεια Αμερική, στην Ωκεανία, στις περισσότερες Ευρωπαϊκές χώρες και στην Ασία. Είναι αξιοσημείωτο ότι η θνητότητα μειώθηκε κατά 52% από το 1970 έως το 2015 (Siegel et al., 2018). Η μείωση αυτή αποδίδεται στην πρώιμη διάγνωση και αφαίρεση προκαρκινικών αλλοιώσεων και στη βελτιωμένη αντιμετώπιση του καρκίνου. Αντίθετα, αύξηση στη θνητότητα λόγω του κολοορθικού καρκίνου 35

36 έχει αναφερθεί σε αρκετές χώρες της Λατινικής Αμερικής, της Καραϊβικής και της Ασίας, κυρίως εξαιτίας της μειωμένης πρόσβασης σε πρώιμη διάγνωση και αντιμετώπιση (Arnold et al., 2017). Σχήμα 1.5. Παγκόσμια επίπτωση κολοορθικού καρκίνου και θνητότητας από κολοορθικό καρκίνο (Arnold et al., 2017) Παράγοντες κινδύνου 36

37 Οι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη του κολοορθικού καρκίνου θα μπορούσαν να διακριθούν σε αυτούς που μπορούν να τροποποιηθούν και σε αυτούς που δεν μπορούν (Σχ. 1.6). Ο σημαντικότερος παράγοντας κινδύνου, ο οποίος δεν μπορεί να τροποποιηθεί, είναι η αυξημένη ηλικία. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η πλειονότητα των περιστατικών κολοορθικού καρκίνου συμβαίνει σε ασθενείς άνω των 50 ετών, ενώ μελέτες σε νεκροψίες δείχνουν ότι υπάρχει μία ραγδαία αύξηση στον αριθμό των πολυπόδων μετά τα 50 έτη (Pendergrass et al., 2008). Ένας άλλος παράγοντας είναι το φύλο. Οι γυναίκες τείνουν να έχουν μικρότερη επίπτωση (σε συνάρτηση με την ηλικία) σε σχέση με τους άνδρες, ωστόσο τείνουν να έχουν περισσότερα αδενώματα και καρκινώματα στο δεξιό κόλον. Σε μία πρόσφατη μελέτη, η οποία περιελάμβανε ασθενείς, φάνηκε ότι όγκοι στο δεξιό κόλον εντοπίζονται συχνότερα σε ασθενείς μεγάλης ηλικίας και σε γυναίκες και σχετίζονται με χαμηλή διαφοροποίηση, προχωρημένο στάδιο και βλεννώδη ιστολογία (Yang et al., 2016). Σχετικά με τη φυλή και την εθνικότητα, στις ΗΠΑ, οι Αφρο-Αμερικανοί έχουν αυξημένο κίνδυνο για κολοορθικό καρκίνο και αδενώματα σε σχέση με τους Καυκάσιους, ιδιαίτερα στο εγγύς κόλον, ενώ οι Λατίνοι έχουν μειωμένο κίνδυνο για κολοορθικό καρκίνο και προχωρημένα αδενώματα (Strum, 2016). Σε χώρες χαμηλού εισοδήματος είναι δύσκολο να διαπιστωθεί η επίδραση της εθνικότητας στην επίπτωση του κολοορθικού καρκίνου και στη θνητότητα λόγω της έλλειψης προληπτικού ελέγχου και σύγχρονων θεραπευτικών επιλογών. Σύμφωνα με την Παγκόσμια Τράπεζα, οι χώρες με χαμηλά εισοδήματα, ενώ έχουν χαμηλότερη επίπτωση κολοορθικού καρκίνου, έχουν την υψηλότερη θνητότητα ( 37

38 Σχήμα 1.6. Παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου. Προσαρμογή από (El Bairi et al., 2018). Η γενετική προδιάθεση παίζει επίσης σημαντικό ρόλο ως παράγοντας κινδύνου που δεν μπορεί να μεταβληθεί. Η παρουσία συγγενούς πρώτου βαθμού με διαγνωσμένο κολοορθικό καρκίνο πριν την ηλικία των 60 ετών, αυξάνει τον κίνδυνο για ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου στα συγγενικά μέλη κατά 2 φορές. Στην περίπτωση περισσότερων κρουσμάτων πρώτου βαθμού συγγένειας μπορεί αυξηθεί ο κίνδυνος έως 4 φορές (Lowery et al., 2016). Τα κληρονομικά σύνδρομα (π.χ. το σύνδρομο Lynch και η οικογενής αδενωματώδης πολυποδίαση) σχετίζονται με αυξημένο διά βίου κίνδυνο για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου. Το σύνδρομο Lynch, επίσης γνωστό ως κληρονομούμενος μη πολυποδιακός κολοορθικός καρκίνος (HNPCC, hereditary non-polyposis colorectal cancer), απαντάται σε έναν στους 300 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο. Η οικογενής αδενωματώδης πολυποδίαση (FAP, familial adenomatous polyposis) είναι πολύ λιγότερο 38

39 συχνή και παρατηρείται σε έναν στους 7000 ασθενείς, οι οποίοι προσβάλλονται από κολοορθικό καρκίνο, ενώ η πολυποδίαση σχετιζόμενη με το MYH (MAP, MYH-associated polyposis) παρατηρείται σε έναν στους ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο. Όλες οι οικογενείς περιπτώσεις κολοορθικού καρκίνου, που περιλαμβάνονται σε κάποιο σύνδρομο, αποτελούν το 6% των συνολικών περιπτώσεων. Συγκεκριμένα, το 3% εξ αυτών έχουν το γνωστό σύνδρομο Lynch, το 2% έχει οικογενή κολοορθικό καρκίνο με σύνδρομο διαφορετικό του Lynch και το υπόλοιπο 1% περιλαμβάνει όλα τα υπόλοιπα σύνδρομα, συμπεριλαμβανομένης της απαλοιφής τμήματος του γονιδίου EPCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) και του MSH2 (DNA Mismatch Repair Protein Msh2). Ένας ακόμη σημαντικός και μη τροποποιήσιμος παράγοντας για την ανάπτυξη του κολοορθικού καρκίνου είναι η συννοσηρότητα. Μεταξύ των ασθενειών, που συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου είναι και η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου, η οποία σχετίζεται με τριπλάσιο κίνδυνο για την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου, ο δε κίνδυνος αυξάνει με τη διάρκεια της νόσου (2% στα 10 χρόνια, 18% μέχρι 30 χρόνια), καθώς και με τη σοβαρότητα και την έκταση της φλεγμονής (Johnson et al., 2013). Παρόλο που ο κολοορθικός καρκίνος που σχετίζεται με την φλεγμονώδη νόσο του εντέρου έχει πολλούς κοινούς μοριακούς μηχανισμούς με το σποραδικό καρκίνο και παρόμοιες συχνότητες χρωμοσωματικής και μικροδορυφορικής αστάθειας (85% και 15% αντίστοιχα), ωστόσο υπάρχουν σημαντικές διαφορές σε μοριακό επίπεδο (Itzkowitz & Harpaz, 2004). Εκτός της φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, αυξημένη συχνότητα για την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη και μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 and BRCA2 (Breast And Ovarian Cancer Susceptibility Protein 1 και 2) (Chan & Giovannucci, 2010). Όπως αναφέραμε ανωτέρω, εκτός των μη τροποποιήσιμων παραγόντων για την ανάπτυξη του κολοορθικού καρκίνου, υπάρχουν κι εκείνοι που 39

40 δύνανται να αλλάξουν, μεταξύ των οποίων σημαντικότερος είναι η διατροφή. Δεδομένα δείχνουν ότι ο δυτικός τρόπος διατροφής (όπως η υψηλή πρόσληψη κόκκινου ή επεξεργασμένου κρέατος και η περιορισμένη πρόσληψη φρούτων και λαχανικών) σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο. Τον Οκτώβριο του 2015, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας επίσημα κατέταξε τα επεξεργασμένα κρέατα ως καρκινογόνα και το κόκκινο κρέας ως πιθανό καρκινογόνο, βασισμένοι σε μία ανασκόπηση της βιβλιογραφίας της IARC (International Agency for Research on Cancer) (Bouvard et al., 2015). Τα δεδομένα για τα φρούτα, τα λαχανικά και τις ίνες είναι λιγότερο σταθερά. Μελέτες ελέγχου περιπτώσεων (case-control) δείχνουν ότι η υψηλή πρόσληψή τους σχετίζεται με χαμηλότερο κίνδυνο, αλλά οι μελέτες ομάδας πληθυσμού (cohort study) δεν είναι πολύ υποστηρικτικές. Ωστόσο, τα World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research, βασισμένα σε μία μετα-ανάλυση που περιελάμβανε μελέτες ελέγχου περιπτώσεων και προοπτικές μελέτες ομάδας πληθυσμού, υιοθέτησαν την άποψη ότι υπάρχει συσχέτιση ανάμεσα στην πρόσληψη ινών και το μειωμένο κίνδυνο κολοορθικού καρκίνου (Norat et al., 2014). Η μειωμένη πρόσληψη ινών είναι γνωστό πως συντελεί στην κατακράτηση κοπράνων στο έντερο και στην αλλοίωση της μικροβιακής χλωρίδας. Στην περίπτωση αυτή, τα οξειδωτικά παραπροϊόντα της αποδόμησης των υδατανθράκων από τα βακτήρια του εντέρου παραμένουν σε επαφή με το βλεννογόνο του εντέρου για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, συντελώντας στην διαδικασία της καρκινογένεσης. Άλλοι παράγοντες, οι οποίοι αυξάνουν τον κίνδυνο ανάπτυξης κολοορθικού καρκίνου και θα μπορούσαν να αλλάξουν, είναι η παχυσαρκία, η κατανάλωση αλκοόλ, η έλλειψη φυσικής δραστηριότητας και η πρόσληψη ασβεστίου. Πλέον υπάρχουν αξιόπιστα δεδομένα για την πρόληψη του κολοορθικού καρκίνου μέσω διατήρησης κανονικού δείκτη βάρους σώματος (Calle & Kaaks, 2004), διακοπής καπνίσματος (Haggar & Boushey, 2009), περιορισμένης πρόσληψης αλκοόλ (Wang et al., 2015), φυσικής δραστηριότητας και επαρκούς πρόσληψης ασβεστίου (Song et al., 2015). 40

41 Μηχανισμοί καρκινογένεσης Η κλασική περιγραφή της καρκινογένεσης του κολοορθικού καρκίνου είναι αυτή της εξέλιξης του αδενώματος σε καρκίνωμα, όπου τα πολλαπλά στάδια της ογκογένεσης καθορίζονται από συγκεκριμένα μοριακά μονοπάτια και διαρκούν από χρόνια έως δεκαετίες (Vogelstein et al., 1988) (Σχ. 1.7). Σχήμα 1.7. Εξέλιξη αδενώματος σε καρκίνωμα μέσω μίας πολυσταδιακής διαδικασίας. Προσαρμογή από (Choi et al., 2017). Από γενετικής άποψης, ο κολοορθικός καρκίνος δεν είναι μία ασθένεια, αλλά ένα ετερογενές σύνολο κακοηθειών που δημιουργούνται στο έντερο. Ο κολοορθικός καρκίνος δημιουργείται μέσω ενός από τους τρεις διαφορετικούς μηχανισμούς ή από συνδυασμό τους: τη χρωμοσωματική αστάθεια (chromosomal instability, CIN), το φαινότυπο μεθυλιωμένων CpG νησίδων (CpG island methylator phenotype, CIMP) και της μικροδορυφορικής αστάθειας (microsatellite instability, MSI). Οι μηχανισμοί αυτοί, συχνά, μπορεί να αλληλοεπικαλύπτονται. Στο σχήμα 1.8 φαίνονται οι πιο σημαντικές μοριακές, γενετικές και επιγενετικέςς αλλαγές σε σχέση με την εξέλιξη του όγκου. 41

42 Σχήμα 1.8. Μοριακές, γενετικές και επιγενετικές αλλαγές κατά την εξέλιξη του όγκου. Προσαρμογή από (Tariq & Ghias, 2016). Οι περισσότερες περιπτώσεις σποραδικού καρκίνου (85%) έχουν χρωμοσωματική αστάθεια, μία ανισορροπία στα αλληλόμορφα σε αρκετές χρωμοσωματικές θέσεις (συμπεριλαμβανόμενων των 5q, 8p, 17p, and 18q) και χρωμοσωματική ενίσχυση και μετάθεση, τα οποία συνεισφέρουν στην ανευπλοειδία του όγκου. Σύμφωνα με τη θεωρία των Fearon και Vogelstein, το κλασικό μονοπάτι CIN ξεκινάει με μεταλλάξεις στο γονίδιο της αδενωματώδους πολυποδίασης του εντέρου (APC-adenomatous polyposis coli), ακολουθούν ενεργοποιητικές μεταλλάξεις του ογκογονιδίου KRAS (Kirsten Rat Sarcoma Viral Proto-Oncogene) και απενεργοποιητικές του ογκοκατασταλτικού γονιδίου TP53 (Tumor Protein P53) (Fearon & Vogelstein, 1990). Πρόδρομες αλλοιώσεις σε αυτό το μονοπάτι αποτελούν οι εστιακές, δυσπλαστικές αλλοιώσεις των εντερικών κρυπτών και τα κλασικά αδενώματα. Οι μεταλλάξεις του APC ενεργοποιούν τη σηματοδότηση του μονοπατιού Wnt (Σχ. 1.9), αυξάνοντας τα επίπεδα β-κατενίνης. Η β-κατενίνη 42

43 μετατοπίζεται στον πυρήνα και ενισχύει τη μεταγραφή πολλών ογκογονιδίων (Mann et al., 1999). Η απενεργοποίηση του APC μπορεί να συμβεί λόγω απώλειας ετεροζυγωτίας, σωματικών μεταλλάξεων, μεταλλάξεων γαμετικής σειράς ή υπερμεθυλίωσης του υποκινητή του. Οι μεταλλάξεις γαμετικής σειράς παρατηρούνται συχνά στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση (Familial Adenomatous Polyposis, FAP). Οι σωματικές μεταλλάξεις παρατηρούνται στο 72% των σποραδικών όγκων, 30%-70% των σποραδικών αδενωμάτων και 5% των δυσπλαστικών πρόδρομων εστιακών κρυπτών (Aberrant Crypt foci, ACF). Οι περισσότερες μεταλλάξεις αφορούν τα κωδικόνια Η απενεργοποίηση λόγω μεθυλίωσης παρατηρείται στο 12% των πρωτοπαθών καρκινωμάτων και αδενωμάτων (Esteller et al., 2000; Miyaki et al., 1994). Επίσης και άλλες μεταλλάξεις στο μονοπάτι, όπως μεταλλάξεις στη β-κατενίνη, οι οποίες παρατηρούνται σε ποσοστό 48% των περιπτώσεων κολοορθικού καρκίνου και μπορούν να οδηγήσουν σε χρωμοσωματική αστάθεια (Sparks et al., 1998). Σχήμα 1.9. Σχηματική παράσταση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt Α) απουσία και Β) παρουσία σήματος Wnt (Fodde et al., 2001). 43

44 Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS δεν συμβαίνουν στα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης, όπως συμβαίνει με τις μεταλλάξεις στο APC. Εντοπίζονται σε ποστοστό 30%-40% των κολοορθικών καρκίνων και στο 60%-90% των υπερπλαστικών ή μη δυσπλαστικών πρόδρομων εστιακών κρυπτών (Rosty et al., 2013). Οι σημειακές μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12, 13 και 61 του γονιδίου KRAS ενεργοποιούν την ενζυμική του δράση, αυξάνοντας αφενός τη σηματοδότηση της RAS και ενεργοποιώντας αφετέρου τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος Raf-MEK-ERK και PI3K/AKT/PKB ή τις μικρές GTPάσες Ral (Σχ και 1.11) (Pino & Chung, 2010). Η ενεργοποιημένη PI3K (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3- kinase) ενεργοποιεί τις AKT1 (RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 1) και AKT2 (RAC-alpha serine/threonine-protein kinase), οι οποίες με τη σειρά τους ενισχύουν την ανάπτυξη του όγκου προάγοντας τη μετάπτωση του επιθηλιακού σε μεσεγχυματικό φαινότυπο (epithelial to mesenchymal transition, EMT) (Suman et al., 2014). Οι μεταλλάξεις στο PTEN (Phosphatase And Tensin Homolog), το οποίο είναι ογκοκατασταλτικό και ανταγωνιστής του μονοπατιού PI3K/AKT, οδηγούν σε απώλεια της λειτουργίας της με επακόλουθο την επαγωγή της μετάστασης μέσω της AKT (Chin et al., 2014). Σχήμα Σχηματική παράσταση του μονοπατιού σηματοδότησης RAS-MEK-ERK (Govender & Chetty, 2012). 44

45 Σχήμα Σχηματική παράσταση του μονοπατιού PI3K/AKT και των σχετιζόμενων σηματοδοτικών μονοπατιών. Η ενεργοποίηση των μεμβρανικών κινασών, συμπεριλαμβανομένου του EGFR, από τους αυξητικούς παράγοντες οδηγεί στο διμερισμό των υποδοχέων και σε διαδοχική ενεργοποίηση των ενδοκυττάριων μονοπατιών. Η AKT ενεργοποιείται καθοδικά της PI3K και έχει πολλαπλούς στόχους. Προσαρμογή από (Hennessy et al., 2005). Ο ογκοκατασταλτικός μεταγραφικός παράγοντας ΤP53 ενεργοποιείται σε συνθήκες στρες και στοχεύει τους αναστολείς του κυτταρικού κύκλου, όπως το GADD45 (Growth Arrest And DNA Damage Inducible) και προαποπτωτικούς παράγοντες, όπως οι BAX (BCL2 Associated X, Apoptosis Regulator), KILLER/DR5 (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, Member 10b), FAS (Fas Cell Surface Death Receptor), και PIG3 (Tumor Protein P53 Inducible Protein 3) (Menendez et al., 2009; Vogelstein & Kinzler, 2004). Η p53 είναι δυσλειτουργική στην πλειονότητα των ανθρώπινων όγκων. Οι μεταλλάξεις που παρατηρούνται στο TP53 μπορεί να προκαλούν 45

46 ενίσχυση ή αλλαγή (gain of function mutations) ή απώλεια της δράσης της (loss of function mutations). Στην πρώτη περίπτωση, η μεταλλαγμένη p53 προκαλεί χρόνια ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB σε μοντέλα ποντικών, προάγοντας τη φλεγμονή, επιταχύνοντας την καρκινογένεση και οδηγώντας τελικά σε διηθητικό καρκίνωμα (Cooks et al., 2013). Η δεύτερη περίπτωση παρατηρείται σε ποσοστό 44,9% των αδενωμάτων, 42,22% των μονήρων και 43,75% των πολλαπλών κολοορθικών καρκίνων (Yan et al., 2015). Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του κολοορθικού καρκίνου διαδραματίζει και η κυκλοοξυγενάση 2 (Cyclooxygenase-2, COX-2), η οποία υπερεκφράζεται σε ποσοστό 43% των αδενωμάτων και 86% των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου, όπως επίσης και η προσταγλανδίνη Ε2 (prostaglandin E2, PGE2), η οποία είναι προϊόν της λειτουργίας της COX-2 (Greenhough et al., 2009). Ακόμα, η ανευπλοειδία και η απώλεια ετεροζυγωτίας (loss of heterozygosity, LOH) έχουν κυρίαρχο ρόλο στους όγκους CIN, ωστόσο εμπλέκονται και σε περιπτώσεις οικογενούς αδενωματώδους πολυποδίασης που σχετίζονται, όπως αναφέραμε, με μεταλλάξεις της γαμετικής σειράς στο γονίδιο APC (Smith et al., 2002). Η απώλεια της ετεροζυγωτίας για τη χρωμοσωματική περιοχή 18q έχει συσχετιστεί με χειρότερη επιβίωση ασθενών σταδίου ΙΙ και παρατηρείται συχνότερα σε προχωρημένους καρκίνους (Jen et al., 1994). Μεταλλάξεις στα γονίδια της οικογένειας SMAD (Mothers against decapentaplegic homolog 1, SMAD2, SMAD3, SMAD4 και SMAD7), οι οποίοι είναι ρυθμιστές της οδού σηματοδότησης του TGF-β (transforming growth factor beta 1), έχουν συσχετιστεί με τον κολοορθικό καρκίνο, ενώ η απώλεια της SMAD4 σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση μετά από θεραπεία βασισμένη σε 5- fluorouracil (Kozak et al., 2015). Από την άλλη πλευρά, ο μηχανισμός CIMP χαρακτηρίζεται από υπερμεθυλίωση των υποκινητών πολλών ογκοκατασταλτικών γονιδίων, από τα οποία τα πιο σημαντικά είναι τα MGMT (O-6-Methylguanine-DNA 46

47 Methyltransferase) και MLH1 (DNA Mismatch Repair Protein Mlh1). Η υπερμεθυλίωση αυτή σχετίζεται συχνά με μεταλλάξεις του BRAF (B-Raf Proto-Oncogene, Serine/Threonine Kinase) και με MSI (Weisenberger et al., 2006). Η υπερμεθυλίωση του MLH1 παρατηρείται σε ποσοστό 80% των σποραδικών MSI-H κολοορθικών καρκίνων με απώλεια έκφρασης και χωρίς γνωστή μετάλλαξη γαμετικής σειράς στα γονίδια επιδιόρθωσης και διατήρησης του DNA (mismatch repair system-mmr) (Weisenberger et al., 2008). Η ανίχνευση υπερμεθυλιωμένων υποκινητών και άλλων γονιδίων οδήγησε στον προσδιορισμό μιας ομάδας πέντε γονιδίων (άλλοι ερευνητές έχουν προτείνει περισσότερα γονίδια) που καλείται CIMP, στην οποία περιλαμβάνονται εκτός του MLH1, τα CDKN2A (Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A), MINT1 (Methylated in tumors 1), MINT2 (Methylated in tumors 2), και MINT31 (Methylated in tumors 31), και διαχωρίζει τους όγκους σε CIMP-H (CIMP-high) και σε CIMP-low ανάλογα με τον αριθμό των μεθυλιωμένων γενετικών περιοχών. Άλλες μελέτες προσθέτουν επιπλέον δείκτες, όπως τη μεθυλίωση των CACNA1G (calcium channel voltagedependent T type alpha 1G subunit), CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), IGF2 (insulin-like growth factor-2), NEUROG1 (neurogenin 1), RUNX3 (runt-related transcription factor 3) και SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1) (Lee et al., 2008; Shen et al., 2007; Suzuki et al., 2014). Μία πρόσφατη μελέτη συνδυάζει δείκτες με διαφορετική λειτουργία και αναλύει το φαινότυπο μεθυλίωσης περιλαμβάνοντας γονίδια επιδιόρθωσης του DNA (MGMT), ογκοκατασταλτικά γονίδια [CDKN2A, HLTF (helicaselike transcription factor), GATA5 (GATA Binding Protein 5), ID4 (inhibitor of DNA binding 4), και TSLC1 (cell adhesion molecule 1)], κατασταλτικά της μετάστασης [CDH4 (cadherin 4), CDH13 (cadherin 13), και TIMP3 (TIMP metallopeptidase inhibitor 3)], γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση (CACNA1G, HRK (harakiri, BCL2 interacting protein), και RASSF1A (Ras association domain family member 1)], και αναστολείς αγγειογένεσης [TSP1 (thrombospondin 1)] (Hokazono et al., 2014). Ανάλογα αν περισσότεροι από έξι ή λιγότεροι από έξι ή κανένας από τους δείκτες είναι μεθυλιωμένοι, οι 47

48 όγκοι ταξινομούνται σε CIMP-H, CIMP-low (CIMP-L), και CIMP-normal (CIMPN) αντίστοιχα (Hokazono et al., 2014). Οι όγκοι CIMP αναπτύσσονται από υπερπλαστικούς πολύποδες μέσω οδοντωτών μονοπατιών (serrated pathways) (Rex et al., 2012). Οι οδοντωτές αλλοιώσεις περιλαμβάνουν υπερπλαστικούς πολύποδες καλυκοειδών κυττάρων, μικροφυσαλιδώδεις υπερπλαστικούς πολύποδες, άμισχα οδοντωτά αδενώματα και παραδοσιακά οδοντωτά αδενώματα. Τα άμισχα οδοντωτά αδενώματα αποτελούν πρόδρομους των CIMP κολοορθικών όγκων με μεγάλη συχνότητα μεταλλάξεων στο BRAF και εντόπιση στο εγγύς κόλον (Suzuki et al., 2014). Όπως προαναφέρθηκε, οι υπερμεθυλιωμένοι υποκινητές διαφόρων γονιδίων σχετίζονται με μεταλλάξεις στο BRAF. Συνολικά, έχουν βρεθεί 759 υπερμεθυλιωμένες περιοχές και το 96% αυτών παρατηρούνται σε όγκους με μεταλλαγμένο BRAF. Από αυτές, οι 299 εντοπίζονται στους υποκινητές γονιδίων πέντε διαφορετικών μονοπατιών: της οδού μεταγωγής σήματος Wnt, του μονοπατιού Ηedgehog, της μεταγραφικής ρύθμισης του bzip, του μονοπατιού PI3K/AKT/mTOR pathway, και του μονοπατιού της ινσουλίνης/του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα [Insulin/IGF (Insulin growth factor)] (van Roon et al., 2013). Η πρώιμη ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt έχει συνδεθεί με την παρουσία μεταλλάξεων του APC σε όγκους CIN. Ωστόσο, η υπερμεθυλίωση των ανταγωνιστών Wnt καταδεικνύει τον ρόλο του εν λόγω μονοπατιού σε προχωρημένη νόσο. Είναι επίσης γνωστό πως για την εκτροπή ενός φυσιολογικού εντερικού επιθηλίου σε αδένωμα απαιτείται η υπερμεθυλίωση των υποκινητών επτά γονιδίων (Σχ. 1.8), ενώ η εξέλιξη ενός αδενώματος σε καρκίνωμα προϋποθέτει επιπλέον μεθυλίωση των υποκινητών 4 γονιδίων (Silva et al., 2014). Ακόμα, η μεθυλίωση του TET1 (ten eleven translocation 1), το οποίο ρυθμίζει την απομεθυλίωση, είναι ένα πρώιμο γεγονός που συνδέεται με μεταλλάξεις στο BRAF στους CIMP+ όγκους και σε πολύποδες (Ichimura et al., 2015). 48

49 Ο φαινότυπος MSI, όπως αναφέρθηκε ακροθιγώς ανωτέρω, περιλαμβάνει την ενεργοποίηση γενετικών αλλαγών (μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ανάγνωσης και υποκαταστάσεις βάσεων) σε μικρές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (μικροδορυφόροι, microsatellites). Αυτή η ενεργοποίηση συμβαίνει σε γονίδια του συστήματος επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (mismatch repair, MMR) και χαρακτηρίζει τις περιπτώσεις οικογενούς συνδρόμου Lynch, αλλά και περίπου το 15% των σποραδικών κολοορθικών καρκίνων (Kocarnik et al., 2015). Αυτοί οι όγκοι εντοπίζονται συχνότερα στο δεξιό και εγκάρσιο κόλον, χαρακτηρίζονται δε από βλεννώδη ιστολογία, χαμηλή διαφορροποίηση και λεμφοκυτταρική διήθηση. Πρόδρομες αλλοιώσεις σε αυτό το μονοπάτι αποτελούν οι οδοντωτοί πολύποδες για τις σποραδικές περιπτώσεις και τα αδενώματα για τις οικογενείς περιπτώσεις (Zeinalian et al., 2018). To 1997 προσδιορίστηκε μία ομάδα πέντε δεικτών για τον ορισμό της MSI: δύο μονονουκλεοτιδικούς δείκτες, τους BAT25 και BAT26, και τρεις δινουκλεοτιδικούς δείκτες, τους D5S346, D2S123, και D17S250. Όγκοι με υψηλή αστάθεια των δεικτών ( 30%) ονομάζονται MSI-H (MSI-high), όγκοι με χαμηλή αστάθεια των δεικτών (<30%) ονομάζονται MSI-L (MSI-low), ενώ οι όγκοι χωρίς MSI ονομάζονται μικροδορυφορικά σταθεροί όγκοι (MMS, microsatellite stable) (Boland et al., 1998). Τα γονίδια MMR κωδικοποιούν τις ATPάσες hmsh2 (muts homolog 2), hmsh6 (muts homolog 6), hmsh3 (muts homolog 3), hmlh1 (mutl homolog 1), hpms2 (PMS1 homolog 2, mismatch repair system component), hpms1 (PMS1 homolog 1, mismatch repair system component), και hmlh3 (mutl homolog 3) (Bak et al., 2014). Μεταλλάξεις της γαμετικής σειράς στα MLH1, MSH2, MSH6, και PMS2 έχουν συσχετιστεί με τον κίνδυνο ανάπτυξης συνδρόμου Lynch. Ο κλινικός φαινότυπος του συνδρόμου Lynch μπορεί να διαφέρει ανάλογα με τις μεταλλάξεις. Το MSH2 σχετίζεται με αυξημένη συχνότητα εξωεντερικών τύπων καρκίνου και περιλαμβάνουν το σύνδρομο Muir-Torre s. Η έκφραση του MLH1 στον κολοορθικό καρκίνο είναι 49

50 υψηλότερη από αυτή του MSH2, και χαμηλότερη στους εξωεντερικούς όγκους. Το MSH6 δείχνει μειωμένη έκφραση στον κολοορθικό καρκίνο, αλλά αυξάνει στον καρκίνο του ενδομητρίου. Οι μεταλλάξεις στο PMS2 συνεισφέρουν σημαντικά στην ανάπτυξη του συνδρόμου Lynch, παρόλο που η διεισδυτικότητα των μονοαλληλικών μεταλλάξεων του PMS2 φαίνεται να είναι χαμηλότερη σε σχέση με άλλα γονίδια του συστήματος επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων του DNA (Senter et al., 2008). Οι παραπάνω κλινικές και μοριακές γενετικές αλλαγές του Lynch και πολλών άλλων κληρονομικών συνδρόμων καρκίνου έχει οδηγήσει σε μία νέα εποχή για την γενετική συμβουλευτική. Ο κίνδυνος για την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου σε υγιείς με σύνδρομο Lynch μέχρι την ηλικία των 70 ετών υπολογίζεται σε 38% για τους άνδρες και 31% για τις γυναίκες. Ειδικότερα, ο αθροιστικός κίνδυνος για την ανάπτυξη κολοορικού καρκίνου σε φορείς με μεταλλάξεις στα MLH1, MSH2, και MSH6 ήταν 41%, 48% και 12%, αντίστοιχα (Bonadona et al., 2011). Εκτός από τις σημειακές μεταλλάξεις των ανωτέρω γονοδίων, έχουν παρατηρηθεί και διαγραφές τους στο 27% των ασθενών (Gylling et al., 2009). Επίσης, διαγραφή του EPCAM, το οποίο βρίσκεται ανοδικά του MSH2, έχει συσχετιστεί με την υπερμεθυλίωση του MSH2 στους καρκινικούς και παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς (Kuiper et al., 2011). Ακόμα, εκτός των γαμετικών και σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια MMR έχουν συσχετιστεί με τον κολοορθικό καρκίνο, όπως επίσης στα EPCAM, POLE (DNA polymerase epsilon, catalytic subunit) και POLD (DNA polymerase delta 1, catalytic subunit) (Haraldsdottir et al., 2014). Επιπλέον, η υπερμεθυλίωση των γονιδίων MMR μπορεί να οδηγήσει σε MSI. Η υπερμεθυλίωση του υποκινητή του MLH1 παρατηρείται σε ποσοστό 83%-100% των MSI-H όγκων (Herman et al., 1998). Ο μηχανισμός συχνά σχετίζεται με τον μοριακό φαινότυπο CIMP (East et al., 2008). Οι όγκοι με MSI συχνά εντοπίζονται στο δεξιό κόλον και έχουν χαμηλή διαφοροποίηση, αλλά καλύτερη πρόγνωση (Sameer et al., 2014). 50

51 Οι μοριακοί φαινότυποι CIN, MSI και CIMP συχνά αλληλοεπικαλύπτονται. Η πρόγνωση των ασθενών έχει συσχετιστεί με συγκεκριμένα μοριακά πορτρέτα, τα οποία βασίζονται στα MSI, CIMP, και στην κατάσταση των BRAF και KRAS (Phipps et al., 2015). Οι MSI-H όγκοι έχουν την καλύτερη πρόγνωση, ακολουθούμενοι από MSI-L/MSS όγκους χωρίς CIMP ή μεταλλάξεις στα BRAF και KRAS, μετά από MSI-L/MSS όγκους με μεταλλάξεις μόνο στο KRAS και τέλος τη χειρότερη πρόγνωση είχαν οι CIMP όγκοι με μεταλλάξεις στο BRAF (Phipps et al., 2015). Η ταξινόμηση των όγκων σύμφωνα με τις μεταλλάξεις αυτές είναι απαραίτητη για τον καθορισμό της θεραπευτικής αντιμετώπισης. Οι αντι-egfr θεραπείες έχει φανεί ότι είναι αποτελεσματικές σε όγκους που δεν έχουν μεταλλάξεις στα εξώνια 12 και 13 στο KRAS, γι αυτό και σύμφωνα με την Αμερικάνικη Ένωση Κλινικής Ογκολογίας (American Society for Clinical Oncology) οι μεταλλάξεις στο KRAS αποτελούν αντένδειξη για αντι-egfr θεραπείες (Allegra et al., 2009; Lievre et al., 2008). Επίσης, η μετάλλαξη V600E στο BRAF έχει συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση και αντίσταση σε αντι-egfr θεραπείες, ακόμα και όταν το KRAS είναι αγρίου τύπου (Pietrantonio et al., 2015). Το 2015 δημοσιεύθηκε μία νέα ταξινόμηση του κολοορθικού καρκίνου, στην οποία κατέληξαν διεθνείς ομάδες ειδικών [CRC Subtyping Consortium (CRCSC)] (Guinney et al., 2015). Σύμφωνα με αυτή, διακρίνονται τέσσερις μοριακοί υπότυποι (CMSs, consensus molecular subtypes) με διαφορετικό βιολογικό υπόβαθρο: ο CMS1 (MSI-ανοσολογικός, 14%), ο οποίος χαρακτηρίζεται από μεγάλο αριθμό μεταλλάξεων, από μικροδορυφορική αστάθεια και ισχυρή ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού ο CMS2 (κανονικός, 37%), ο οποίος χαρακτηρίζεται από τα επιθηλιακά στοιχεία, έχει ενεργό τη σηματοδότηση των WNT και MYC ο CMS3 (μεταβολικός, 13%), ο οποίος χαρακτηρίζεται από επιθηλιακή και εμφανή μεταβολική δυσλειτουργία και ο CMS4 (μεσεγχυματικός, 23%), ο οποίος χαρακτηρίζεται από την ενεργοποίηση του TGF β (transforming growth factor beta 1), από τον βαθμό διήθησης του στρώματος και την αγγειογένεση όπως επίσης και από 51

52 χειρότερη ολική επιβίωση και επιβίωση ελεύθερη νόσου (Πίνακας 1.1 και Σχ. 1.12). Ωστόσο, προέκυψαν και όγκοι με ανάμεικτα χαρακτηριστικά (13%), τα οποία αντανακλούν την ετερογένεια ενός όγκου ή και φαινότυπο που μεταπίπτει από ένα τύπο σε άλλο. Πίνακας 1.1. Μοριακοί υπότυποι κολοορθικού καρκίνου. Προσαρμογή από (Guinney et al., 2015). CMS1 CMS2 CMS3 CMS4 MSI- Κανονικός Μεταβολικός Μεσεγχυματικός Ανοσολογικός 14% 37% 13% 23% MSI, υψηλό Υψηλό SCNA 2 Ανάμεικτη Υψηλό SCNA CIMP 1, κατάσταση MSI, υπερμεταλλάξεις χαμηλό SCNA, χαμηλό CIMP Μεταλλάξεις Μεταλλάξεις BRAF KRAS Διήθηση και Ενεργοποίηση Μεταβολική Διήθηση του ενεργοποίηση του WNT και απορρύθμιση στρώματος, ανοσοποιητικού MYC ενεργοποίηση του TGF-β, αγγειογένεση Χειρότερη Χειρότερη ολική επιβίωση μετά επιβίωση και από υποτροπή επιβίωση ελεύθερη νόσου 52

53 1: CpG island methylator phenotype, φαινότυπος μεθυλιωμένων CpG νησίδων, 2: somatic copy number alterations, σωματικές αλλαγές στον αριθμό αντιγράφων Σχήμα Καμπύλη Kaplan Meier συνολικής επιβίωσης ασθενών με κολοορθικό καρκίνο σε σχέση με το μοριακό υπότυπο (κίτρινο: CSM1, μπλε: CSM2, ροζ: CSM3, πράσινο: CSM4) (Guinney et al., 2015). Ενσωματώνοντας τις γνώσεις της μοριακής βιολογίας του κολοορθικού καρκίνου, που εξετέθησαν ανωτέρω, έχει προταθεί μία νεώτερη ταξινόμηση των μηχανισμών καρκινογένεσης, η οποία τροποποιεί την κλασική θεώρηση του Vogelstein. Σύμφωνα με την ταξινόμηση αυτή, διακρίνονται τρία μονοπάτια κατά την διαδικασία έναρξης και εξέλιξης του κολοορθικού καρκίνου: το κλασικό μονοπάτι, το μονοπάτι μεταλλάξεων της γαμετικής σειράς και το οδοντωτό μονοπάτι ή μονοπάτι μεθυλίωσης (Σχ. 1.13). Το κλασικό μονοπάτι, όπως περιγράψαμε σύντομα προηγουμένως, ξεκινά με μεταλλάξεις του γονιδίου APC και εξελίσσεται με διαδοχική συσσώρευση γενετικών μεταλλάξεων και χρωμοσωματικής αστάθειας (chromosomal instability, CIN), δημιουργώντας μικροδορυφορικά σταθερούς 53

54 όγκους (microsatellite stable, MSS). Το μονοπάτι των μεταλλάξεων γαμετικής σειράς σχετίζεται με μεταλλάξεις γαμετικής σειράς των γονιδίων του συστήματος επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (mis-match repair, MMR), παρατηρείται στο σύνδρομο Lynch (κληρονομικό, μη πολυποδιασικό) και οδηγεί σε μικροδορυφορική αστάθεια (microsatellite instability, MSI-H). Το οδοντωτό μονοπάτι/μονοπάτι μεθυλίωσης είναι ετερογενές και περιλαμβάνει το παραδοσιακό οδοντωτό μονοπάτι, το οποίο σχετίζεται με μεταλλάξεις στα BRAF και KRAS και οδηγεί σε όγκους μικροδορυφορικά σταθερούς με διαφορετικούς φαινότυπους μεθυλίωσης CpG νησίδων (CpG island methylator phenotype, CIMP) και το άμισχο οδοντωτό μονοπάτι. Αυτό περιλαμβάνει τρεις διακριτές υποομάδες: η πρώτη οδηγεί σε μικροδορυφορικά σταθερούς και CIMP + όγκους, με υπερμεθυλίωση των MGMT και p16, μεταλλαγμένο BRAF και KRAS αγρίου τύπου η δεύτερη και η τρίτη οδηγούν σε μικροδορυφορικά ασταθείς και CIMP + όγκους, με υπερμεθυλίωση του MLH1, και μεταλλαγμένο BRAF και KRAS αγρίου τύπου (η δεύτερη) ή μεταλλαγμένο KRAS και BRAF αγρίου τύπου (η τρίτη). Σχήμα Τα τρία κύρια μονοπάτια καρκινογένεσης του παχέος εντέρου [Προσαρμογή από (Testa et al., 2018). 54

55 Προληπτικός έλεγχος για τον κολοορθικό καρκίνο Τα ποσοστά επιβίωσης ασθενών με κολοορθικό καρκίνο έχουν αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια, πιθανόν ως αποτέλεσμα της πρώιμης διάγνωσης και της βελτιωμένης αντιμετώπισης. Παρόλο που υπάρχουν τεκμηριωμένες πληροφορίες για τους παράγοντες κινδύνου, περίπου το 75% των ασθενών, οι οποίοι διαγιγνώσκονται με κολοορθικό καρκίνο, δεν έχουν κάποιον εμφανή παράγοντα κινδύνου, εκτός από την αυξημένη ηλικία. Η 5- ετής επιβίωση είναι λιγότερο από 60% στις περισσότερες ευρωπαϊκές χώρες. Επομένως ο έλεγχος του πληθυσμού αποτελεί το καλύτερο μέτρο για τη μείωση της θνητότητας. Ο σκοπός του προληπτικού ελέγχου για κολοορθικό καρκίνο είναι η πρόληψη της ανάπτυξης προχωρημένου καρκίνου μέσω ανίχνευσης πρώιμων μορφών καρκίνου ή προκαρκινικών αλλοιώσεων. Για το σκοπό αυτό έχουν χρησιμοποιηθεί διαφορετικές τεχνολογίες. Οι τεχνολογίες που στοχεύουν τον πρώιμο καρκίνο μειώνουν τα ποσοστά θνητότητας, αλλά αυξάνουν προσωρινά την επίπτωση, καθώς οι καρκίνοι διαγιγνώσκονται στον έλεγχο 2-3 χρόνια πριν καταστούν συμπτωματικοί. Αυτές οι δοκιμασίες πρέπει να πραγματοποιούνται τουλάχιστον σε διετή βάση, κάτι που αυξάνει το κόστος και μειώνει τα ποσοστά συμμόρφωσης. Οι δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των αδενωμάτων πραγματοποιούνται λιγότερο συχνά. Η δοκιμασία ανίχνευσης αιμοσφαιρίνης στα κόπρανα (guaiac-based fecal occult blood test, gfobt) έχει μελετηθεί περισσότερο από όλα, αλλά έχει μικρή ευαισθησία. Βασίζεται στην ενεργότητα της υπεροξειδάσης και είναι άμεσος τρόπος ανίχνευσης αιμοσφαιρίνης στα κόπρανα. Πολλές τυχαιοποιημένες μελέτες παρέχουν ενδείξεις ότι, αν πραγματοποιείται κάθε δύο χρόνια, μπορεί να μειώσει τα ποσοστά θνητότητας που σχετίζονται με τον κολοορθικό καρκίνο έως και 22% (Shaukat et al., 2013). Ωστόσο, η δοκιμασία δεν είναι ειδική για την ανθρώπινη αιμοσσφαιρίνη, δίνοντας πολλά ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω των διατροφικών συνηθειών. Πιο συγκεκριμένα, η κατανάλωση κόκκινου κρέατος και συγκεκριμένων φρούτων 55

56 και λαχανικών, όπως το μπρόκολο και το πεπόνι, αυξάνει την πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, ενώ οι υψηλές δόσεις βιταμίνης C μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα (Pignone et al., 2001). Η ανοσοϊστοχημική δοκιμασία αιμοσφαιρίνης (fecal immunochemical test, FIT) έχει πολλά βελτιωμένα χαρακτηριστικά σε σχέση με την κλασική δοκιμασία. Δεν δίνει ψευδώς θετικό αποτέλεσμα, χρειάζονται ένα ή δύο δείγματα κοπράνων και είναι πιο ευαίσθητο στην ανίχνευση κολοορθικών καρκίνων και προχωρημένων αδενωμάτων, αν και έχει μικρότερη ειδικότητα (Whitlock et al., 2008). Η ακτινολογική απεικόνιση του εντέρου μετά από βαριούχο υποκλυσμό είναι μια μέθοδος παλαιότερη, που έχει εγκαταλειφθεί τα τελευταία χρόνια στις αναπτυγμένες χώρες. Η ευαισθησία της μεθόδου στην ανίχνευση μικρότερων των 10 mm αλλοιώσεων είναι χαμηλότερη από αυτή της κολονοσκόπησης (35% vs 99%) και δεν υπάρχει δυνατότητα αφαίρεσης των αλλοιώσεων, όπως στην κολονοσκόπηση (Rockey et al., 2005). Η ορθοσιγμοειδοσκόπηση με εύκαμπτο ενδοσκόπιο γίνεται με ενδοσκόπιο 60cm και επιτρέπει την εξέταση του σιγμοειδούς και του ορθού, όπου εντοπίζονται το 60% των καρκίνων και των αδενωμάτων. Αποτελέσματα από επιδημιολογικές μελέτες αποφαίνονται ότι ο έλεγχος με ορθοσιγμοειδοσκόπηση μειώνει την επίπτωση και τη θνητότητα στον κολοορθικό καρκίνο του αριστερού κόλου περίπου 60 80% (Newcomb et al., 2003). Στην ιταλική μελέτη SCORE ελέγχθηκε η αξία μίας και μόνο σιγμοειδοσκόπησης στα έτη, η οποία ανέδειξε μείωση της επίπτωσης κατά 31% και μείωση της θνητότητας κατά 38% σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (Segnan et al., 2011). Η τεχνική αυτή, όπως κι όλες οι ενδοσκοπικές τεχνικές, παρέχει τη δυνατότητα άμεσης αφαίρεσης πιθανής βλάβης του ορθοσιγμοειδούς. Η κολονοσκόπηση, η οποία επιτρέπει την άμεση εκτίμηση του παχέος εντέρου, το 1988 προτάθηκε ως μέθοδος ελέγχου για τον κολοορθικό καρκίνο 56

57 για ασθενείς ενδιάμεσου κινδύνου και σήμερα αποτελεί το χρυσό κανόνα για τον προληπτικό έλεγχο για κολοορθικό καρκίνο, κυρίως λόγω της άμεσης δυνατότητας που δίνει για την αφαίρεση των προκαρκινικών αλλοιώσεων (Neugut & Forde, 1988). Μελέτες ελέγχου και επιτήρησης έχουν δείξει μείωση της επίπτωσης του κολοορθικού καρκίνου (50%-70%) και της θνητότητας (31%-90%) σε διάστημα 6-22 έτη (Muller & Sonnenberg, 1995; Singh et al., 2006). Η εξέταση αυτή έχει περισσότερες σοβαρές επιπλοκές σε σχέση με άλλες μεθόδους, κυρίως λόγω των πολυπεκτομών (αιμορραγία και αρρυθμία) και η ηλικία και τα συνοδά προβλήματα πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψη πριν την πραγματοποίηση της κολονοσκόπησης. Ο έλεγχος του πληθυσμού με κολονοσκόπηση παρουσιάζει, επίσης, δυσκολίες που πρέπει να ξεπεραστούν, όπως σε σχέση με το εκπαιδευμένο ανθρώπινο δυναμικό και την υποδομή που απαιτείται. Οι κατευθυντήριες οδηγίες του NCCN (National Comprehensive Cancer Network) του 2015 για τον γενικό πληθυσμό είναι η κολονοσκόπηση να πραγματοποιείται για πρώτη φορά στα 50 έτη και αν είναι αρνητική να επαναλαμβάνεται μετά 10 χρόνια ή μετά από 5 χρόνια να πραγματοποιείται σιγμοειδοσκόπηση (Provenzale et al., 2015). Για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου (οικογενειακό ιστορικό, φλεγμονώδης νόσος του εντέρου κτλ) ο έλεγχος γίνεται πολύ πιο πρώιμα η δε ένταση της παρακολούθησης είναι πιο στενή (βλ. αναλυτικά κατωτέρω). Η αξονική κολονογραφία [CT (computed tomography) colonography] είναι το ίδιο ευαίσθητη με την κολονοσκόπηση για την ανίχνευση του καρκίνου και των μεγάλων αδενωμάτων, αλλά περιλαμβάνει έκθεση σε ακτινοβολία, απαιτεί προετοιμασία ολόκληρου του εντέρου και στη συνέχεια απαιτεί την πραγματοποίηση κολονοσκόπησης για την επιβεβαίωση και την απομάκρυνση των αλλοιώσεων. Η CT κολονογραφία υπερτερεί στην ανίχνευση εξωεντερικών αλλοιώσεων, ωστόσο συνολικά αποτελεί μία ακριβή επιλογή για έλεγχο. 57

58 Πολλές έρευνες στοχεύουν στον έλεγχο με βάση την ανίχνευση DNA στο αίμα ή στα κόπρανα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα των δεικτών αυτών χρειάζονται βελτιστοποίηση και στη συνέχεια χρειάζεται ανάπτυξη αυτόματων συστημάτων για τη μείωση του κόστους και την εξασφάλιση της αξιοπιστίας. Το EpiproColon είναι ένα τεστ που βασίζεται στην ανίχνευση της μεθυλιωμένης SΕPT9 στο αίμα και, αν και πήρε έγκριση από τον Αμερικάνικο Οργανισμό Φαρμάκων (US Food and Drug Administration, FDA) το 2016 για τον έλεγχο του κολοορθικού καρκίνου, δε συστήνεται, λόγω της χαμηλής ευαισθησίας (48%) που είχε σε πρόσφατη κλινική μελέτη (Church et al., 2014). Ομοίως, το Cologuard είναι μία δοκιμασία εγκεκριμένη από τον FDA, που βασίζεται επίσης στην ανίχνευση DNA σε δείγμα κοπάνων, η οποία έχει υψηλότερη ευαισθησία σε σχέση με το FIT στην ανίχνευση κολοορθικού καρκίνου (92%) και αδενωμάτων (42%) (Imperiale et al., 2014). Οι οδηγίες για τον έλεγχο για κολοορθικό καρκίνο διαφέρουν στις ομάδες υψηλού κινδύνου. Παρόλες τις διαφορές, οι οποίες υπάρχουν ανάλογα με το φύλο, την εθνικότητα, το δείκτη βάρους σώματος (body mass index, BMI), το ιστορικό σακχαρώδους διαβήτη ή την κατάσταση του γονιδίου BRCA, δεν υπάρχουν εργαλεία διαστρωμάτωσης του κινδύνου που να βασίζονται σε αυτούς τους παράγοντες. Σε άτομα με ιστορικό πολυπόδων ο έλεγχος με κολονοσκόπηση συστήνεται πιο τακτικά, ανάλογα με τον αριθμό, το μέγεθος και τον τύπο των πολυπόδων (Lieberman et al., 2012). Πάνω από 10 πολύποδες κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου εγείρουν υποψίες για κάποιο πολυποδιασικό σύνδρομο και πρέπει να παραπέμπονται για γενετική καθοδήγηση. Επίσης, άτομα με πρώτου βαθμού συγγενή, οποίος εμφάνισε κολοορθικό καρκίνο πριν τα 60 έτη, θεωρούνται υψηλού κινδύνου και πρέπει να υποβάλονται σε έλεγχο με κολονοσκόπηση πριν τα 50 έτη (Qaseem et al., 2012). Στις περιπτώσεις συνδρόμου Lynch συστήνεται η έναρξη ελέγχου με κολονοσκόπηση από τα έτη και η επανάληψή της κάθε 1-2 χρόνια μέχρι την ηλικία των 40 ετών και ετησίως μετά τα 40 έτη εξαιτίας της ραγδαίας καρκινογένεσης που παρατηρείται στο σύνδρομο 58

59 Lynch (Lynch & de la Chapelle, 1999). Παρόμοιες κατευθυντήριες οδηγίες εφαρμόζονται και στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση. Οι γυναίκες με μετάλλαξη στη γαμετική σειρά για το σύνδρομο Lynch συστήνεται να ελέγχονται από την ηλικία των ετών και κάθε χρόνο για καρκίνο ενδομητρίου. Στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση, η έναρξη του ελέγχου συστήνεται να γίνεται από τα χρόνια με ετήσια κολονοσκόπηση ή σιγμοειδοσκόπηση μέχρι να καταστεί ανάγκη για κολεκτομή ή πρωκτοκολεκτομή (Syngal et al., 2015). Επίσης, ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (Inflammatory bowel disease, IBD) θεωρούνται υψηλού κινδύνου και συστήνεται η έναρξη του κολονοσκοπικού ελέγχου 8-10 χρόνια μετά την έναρξη των συμπτωμάτων Σταδιοποίηση Ο κολοορθικός καρκίνος ταυτοποιείται με βιοψία του πρωτοπαθούς όγκου κατά την κολονοσκόπηση ή την σιγμοειδοσκόπηση ή ακόμη και της μεταστατικής εστίας. Η ολοκληρωμένη θεραπευτική αντιμετώπιση ενός ασθενούς με νεοδιαγνωσθέντα κολοορθικό καρκίνο προϋποθέτει πλήρη φυσική εξέταση, πλήρη κολονοσκόπηση για τον αποκλεισμό ενός ταυτόχρονου πρωτοπαθούς νεοπλάσματος και ολοκλήρωση της σταδιοποίησης με αξονικές ή μαγνητικές, όπου απαιτείται, τομογραφίες για την ανεύρεση πιθανής μεταστατικής νόσου. Η αξονική κολονογραφία είναι χρήσιμη για τον ακριβή εντοπισμό του όγκου και βοηθάει στην χειρουργική προσέγγιση, ιδιαίτερα αν η περίπτωση επιτρέπει λαπαροσκοπική εκτομή. Μπορεί ακόμα να χρησιμοποιηθεί για την ανεύρεση άλλων εντερικών αλλοιώσεων που δεν έχουν ανιχνευθεί με την κολονοσκόπηση, για παράδειγμα λόγω κάποιας αλλοίωσης, η οποία εμποδίζει τη διέλευση του ενδοσκοπίου. Η συστηματική χρήση PET (Positron Emission Tomography) με 18-fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG-PET) δε συστήνεται στο στάδιο της αρχικής διάγνωσης. 59

60 Στους ασθενείς με καρκίνο ορθού η εκτίμηση της τοπικής έκτασης του όγκου είναι απαραίτητη για τη βέλτιστη αντιμετώπιση. Η υψηλής ανάλυσης MRI μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ακριβή προσδιορισμό της εξάπλωσης του όγκου στο περιβάλλον μεσοορθό και για την εκτίμηση των χειρουργικών ορίων περιφερειακά ανάμεσα στα όρια του όγκου και το περιτόναιο του ορθού. Ο υπολογισμός του βάθους διείσδυσης στο εντερικό τοίχωμα με ενδοορθικό υπέρηχο είναι ιδιαιτέρως χρήσιμος κυρίως για πρώιμους καρκίνους του ορθού. Σε ασθενείς με υποψία ηπατικών μεταστάσεων από κολοορθικό καρκίνο η έκταση της νόσου καθορίζεται με υπέρηχο, CT, ή MRI (Magnetic Resonance Imaging). Παρόλο που αυτές οι απεικονιστικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση μεταστάσεων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και νέες μέθοδοι για τον καθορισμό των χαρακτηριστικών των ηπατικών μεταστάσεων. Συγκεκριμένα, ο ενισχυμένος ηπατικός υπέρηχος και η ενισχυμένη MRI μπορεί να βοηθήσει στο χαρακτηρισμό ηπατικών οζιδίων. Η FDG-PET είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί για να αποκλεισθεί εξωηπατική εξάπλωση της νόσου, η οποία θα μπορούσε να αλλάξει την αντιμετώπιση. Για την ανίχνευση της περιτοναϊκής καρκινωμάτωσης οι απεικονιστικές και οι διαγνωστικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι ανεπαρκείς. Με βάση τον ανωτέρω πλήρη έλεγχο μετά τη διάγνωση πραγματοποιείται η σταδιοποίηση σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ (Tumor, Node, Metastasis: όγκος, λεμφαδένες μετάσταση) Σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ Κατηγορίες Τ Η ταξινόμηση κατά Τ περιγράφει την έκταση της νόσου στα στρώματα που σχηματίζουν το τοίχωμα του παχέος εντέρου και του ορθού. 60

61 Tx: δεν είναι δυνατή η περιγραφή της έκτασης του όγκου λόγω ανεπαρκούς πληροφορίας, Tis: ο καρκίνος είναι στο πρωιμότερο στάδιο (in situ), δηλαδή εντοπίζεται μόνο στο βλεννογόνιο χιτώνα και δεν έχει αναπτυχθεί στη βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα, T1: ο όγκος έχει αναπτυχθεί στη βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα και εκτείνεται στον υποβλεννογόνιο χιτώνα, T2: ο όγκος έχει αναπτυχθεί στον υποβλεννογόνιο χιτώνα και εκτείνεται στο μυϊκό χιτώνα, T3: ο όγκος έχει αναπτυχθεί στο μυϊκό χιτώνα και στις εξωτερικές στιβάδες του εντέρου ή του ορθού αλλά όχι έξω από αυτές. Δεν έχει φτάσει κοντινά όργανα ή ιστούς, T4a: ο όγκος έχει αναπτυχθεί στον ορογόνιο χιτώνα (ή αλλιώς σπλαχνικό περιτόναιο), την εξωτερική επένδυση του εντέρου, T4b: ο όγκος έχει αναπτυχθεί στο τοίχωμα του παχέος εντέρου ή του ορθού και προσκολλάται ή διεισδύει σε γειτονικά όργανα ή ιστούς. Κατηγορίες Ν Η ταξινόμηση κατά Ν δείχνει αν ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί σε τοπικούς λεμφαδένες και πόσοι από αυτούς έχουν προσβληθεί. Nx: δεν είναι δυνατή η περιγραφή του Ν λόγω ανεπαρκούς πληροφορίας, N0: ο καρκίνος δεν έχει εξαπλωθεί στους τοπικούς λεμφαδένες, N1: καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται κοντά σε 1 μέχρι 3 τοπικούς λεμφαδένες, N1a: καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται σε 1 τοπικό λεμφαδένα, N1b: καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται σε 2 μέχρι 3 τοπικούς λεμφαδένες, N1c: μικρές εναποθέσεις καρκινικών κυττάρων εντοπίζονται σε περιοχές λιπώδους ιστού κοντά σε λεμφαδένες, αλλά όχι μέσα στους λεμφαδένες, N2: καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται σε 4 ή περισσότερους τοπικούς λεμφαδένες, N2a: καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται σε 4 μέχρι 6 τοπικούς λεμφαδένες, N2b: καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται σε 7 ή περισσότερους τοπικούς λεμφαδένες. Κατηγορίες M Η ταξινόμηση κατά M δείχνει αν ο καρκίνος έχει επεκταθεί (μετασταθεί) σε απομακρυσμένα όργανα όπως το ήπαρ, οι πνεύμονες ή απομακρυσμένοι λεμφαδένες. 61

62 M0: δεν φαίνεται επέκταση σε απομακρυσμένα όργανα, M1a: ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί σε 1 απομακρυσμένο όργανο ή ομάδα απομακρυσμένων λεμφαδένων, M1b: ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί σε περισσότερα από 1 απομακρυσμένα όργανα ή ομάδες απομακρυσμένων λεμφαδένων ή έχει εξαπλωθεί σε απομακρυσμένα τμήματα του περιτοναίου. Όπως φαίνεται στον πίνακα 1.2, στο στάδιο 0 (in situ) ο όγκος δεν έχει αναπτυχθεί πέρα από τον βλεννογόνιο χιτώνα του εντέρου. Στο στάδιο Ι ο καρκίνος έχει διηθήσει τον υποβλεννογόνιο χιτώνα ή και το μυϊκό χιτώνα του εντέρου. Στο στάδιο ΙΙ ο όγκος έχει διηθήσει και τον ορογόνιο χιτώνα του εντέρου. Στο στάδιο ΙΙΙ ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί σε γειτονικούς λεμφαδένες ή μπορεί να υπάρχουν εναποθέσεις, δηλαδή μικροί δευτεροπαθείς όγκοι στο έντερο. Στο στάδιο ΙV ο όγκος έχει εξαπλωθεί σε απομακρυσμένα όργανα. Πίνακας 1.2. Σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ (American Joint Committee on Cancer, 7th Edition). Ανατομικό στάδιο/ προγνωστικές ομάδες Στάδιο T N M Dukes MAC 0 Tis N0 M I T1 N0 M0 A A T2 N0 M0 A B1 IIA T3 N0 M0 B B2 IIB T4a N0 M0 B B2 IIC T4b N0 M0 B B3 IIIA T1-T2 N1/N1c M0 C C1 T1 N2a M0 C C1 IIIB T3-T4a N1/N1c M0 C C2 T2-T3 N2a M0 C C1/C2 T1-T2 N2b M0 C C1 IIIC T4a N2a M0 C C2 T3-T4a N2b M0 C C2 62

63 T4b N1-N2 M0 C C3 IVA Οποιοδήποτε T Οποιοδήποτε N M1a IVB Οποιοδήποτε T Οποιοδήποτε N M1b ctnm: κλινική σταδιοποίηση, ptnm: παθολογοανατομική σταδιοποίηση, y: σταδιοποίηση μετά από νεοεπικουρική θεραπεία, r: σταδιοποίηση μετά από υποτροπή. Η σταδιοποίηση γίνεται δύο φορές, μία πριν τη χειρουργική εκτομή του όγκου, αφού έχουν ολοκληρωθεί οι απεικονιστικές εξετάσεις και ονομάζεται κλινικό στάδιο, και μία μετά την εκτομή και την παθολογοανατομική εκτίμηση του όγκου και ονομάζεται παθολογοανατομικό στάδιο. Σχήμα Σχηματική απεικόνιση του όγκου καθώς αυξάνεται το στάδιο της νόσου (ΝCI, National Cancer Institute). 63

64 Θεραπευτική αντιμετώπιση Η θεραπευτική αντιμετώπιση του κολοορθικού καρκίνου περιλαμβάνει κυρίως την χειρουργική εκτομή του όγκου, τη χημειοθεραπεία, τη θεραπεία με στοχευτικούς παράγοντες, την ακτινοθεραπεία, τον καυτηριασμό και τον εμβολισμό. Η χειρουργική εκτομή ποικίλλει ανάλογα με το μέγεθος, την εντόπιση και την έκταση της νόσου και μπορεί να συνδυάζεται με ταυτόχρονη εξαίρεση μεταστατικών αλλοιώσεων (π.χ. ηπατικές), όπου αυτό είναι εφικτό. Σε κάθε περίπτωση η κλινική κατάσταση του ασθενούς και τα συνοδά προβλήματα υγείας λαμβάνονται υπόψη, καθώς επίσης και το στάδιο της νόσου (μεταστατικό vs μη μεταστατικό), πιθανές υποτροπές, ο αριθμός και το είδος των γραμμών θεραπείας που έχει λάβει ο ασθενής, η παρουσία ή όχι πιεστικών φαινομένων σε παρακείμενα όργανα κ.ά. Η χημειοθεραπεία περιλαμβάνει θεραπεία με φάρμακα που διακόπτουν τον κυτταρικό κύκλο των καρκινικών κυττάρων, καταστρέφοντας το DNA τους, διακόπτοντας τη σύνθεση του DNA ή παρεμβαίνοντας στα κυτταρικά μέρη, τα οποία χρειάζονται για τη δημιουργία νέων κυττάρων, που σημαίνει ότι εκτός από τα καρκινκά κύτταρα δρουν, επίσης, και σε φυσιολογικά κύτταρα που διαιρούνται, έχοντας ως αποτέλεσμα διαφόρων ειδών παρενέργειες. Τα χημειοθεραπευτικά, τα οποία χρησιμοποιούνται στον κολοορθικό καρκίνο, είναι: fluorouracil, leucovorin, capecitabine, oxaliplatin, irinotecan, trifluridine/tipiracil και ο συνδυασμός τους. Οι παρενέργειες εξαρτώνται από το φάρμακο, την ποσότητα, το χρόνο θεραπείας και τον ασθενή και μπορεί να περιλαμβάνουν απώλεια μαλλιών, ναυτία, διάρροια, αναιμία, λευκοπενία, θρομβοπενία κ.ά. Οι στοχευτικοί ή βιολογικοί παράγοντες είναι αντισώματα που έχουν παραχθεί έναντι συγκεκριμένων μορίων, τα οποία συμμετέχουν στην ανάπτυξη του κολοορθικού καρκίνου. Τα κύρια μόρια, που χρησιμοποιούνται ως μοριακοί στόχοι, ανήκουν στα μονοπάτια των VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) και EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Ο VEGF παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα και διεγείρει την 64

65 αγγειογένεση, προκειμένου νέα αγγεία να δημιουργηθούν, εξασφαλίζοντας την παροχή των απαραίτητων ουσιών και στοιχείων στον όγκο, για να συνεχίσει να αυξάνεται. Υπάρχουν τέσσερα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη. Tο bevacizumab όπως επίσης και το Ziv -aflibercept δεσμεύουν τον ελεύθερο VEGF, εμποδίζοντας την πρόσδεσή του στον υποδοχέα του, ενώ το ramucirumab προσδένεται στον υποδοχέα 2 του VEGF (VEGFR2), εμποδίζοντας την δέσμευση του VEGF στον υποδοχέα του. Ακόμα, το regorafenib ένας από στόματος αναστολέας πολλών πρωτεϊνικών κινασών, συμπεριλαμβανομένων των κινασών που εμπλέκονται στην αγγειογένεση των όγκων (VEGFR1, -2, -3, TIE2). Το μονοπάτι του EGFR είναι επίσης σημαντικό για την ανάπτυξη του καρκινικού κυττάρου. Δύο αντισώματα χρησιμοποιούνται σήμερα στην καθημερινή κλινική πράξη το cetuximab και το panitumumab, τα οποία δεσμεύονται στον EGFR και δεν επιτρέπουν στον EGF να δεσμευθεί στον υποδοχέα του και να σηματοδοτήσει την ανάπτυξη του κυττάρου. Είναι σίγουρο πως η αναγνώριση των υποομάδων, που θα ωφεληθούν περισσότερο από τη θεραπεία, έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα των συγκεκριμένων παραγόντων και τη μέγιστη οικονομική τους απόδοση. Ο καυτηριασμός του όγκου μπορεί να πραγματοποιηθεί με υγρό άζωτο (κρυοκαυτηριασμός), με ραδιοσυχνότητες ή με μικροκύματα και χρησιμοποιείται κυρίως για την αντιμετώπιση των μεταστάσεων (ηπατικών) παρά του πρωτοπαθούς όγκου στον κολοορθικό καρκίνο. Με τον εμβολισμό αντιμετωπίζονται οι ηπατικές μεταστάσεις, με αρτηριακό καθετηριασμό και έγχυση χημειοθεραπευτικών ή ραδιενεργών σφαιριδίων. Τέλος, η ακτινοθεραπεία έχει ιδιαίτερο ρόλο στην αντιμετώπιση του καρκίνου του ορθού. Μικρότερη ή σχεδόν μηδαμινή είναι η σημασία της για την αντιμετώπιση του καρκίνου του παχέος εντέρου. 65

66 1.6. Προγνωστικοί και προβλεπτικοί βιοδείκτες Όταν αναφερόμαστε σε προγνωστικούς βιοδείκτες, εννοούμε αυτούς που σχετίζονται με την επιβίωση και είναι ανεξάρτητοι από την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, ενώ οι προβλεπτικοί βιοδείκτες σχετίζονται με την ανταπόκριση στην θεραπεία και στο πιθανό όφελος από αυτή. Οι βιοδείκτες μπορεί να είναι και προγνωστικοί και προβλεπτικοί. Η πιο σημαντική από τις εξελίξεις στο πεδίο των βιοδεικτών για τον κολοορθικό καρκίνο υπήρξε η τεκμηρίωση της κατάστασης του KRAS (μεταλλαγμένο ή αγρίου τύπου) ως προβλεπτικού δείκτη για την μη ανταπόκριση σε θεραπείες που στρέφονται εναντίον του EGFR. Στο επίπεδο της επικουρικής θεραπείας, οι προγνωστικοί και προβλεπτικοί μοριακοί δείκτες (μικροδορυφορική αστάθεια και ανισορροπία στο 18q) θα μπορούσαν δυνητικά να χρησιμοποιηθούν, για να διαχωριστούν οι μοριακοί φαινότυποι στη νόσο σταδίου ΙΙ (κλινικά ετερογενής), συμβάλλοντας έτσι στην εκτίμηση του κινδύνου και του οφέλους της επικουρικής θεραπείας. Ωστόσο τα μονοπάτια που εμπλέκονται στην εξέλιξη της νόσου είναι πολύπλοκα και μοναδικοί δείκτες, ίσως, από μόνοι τους δεν είναι αρκετά χρήσιμοι για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας και της έκβασης. Με μεθόδους υψηλής ανάλυσης, οι οποίες καλύπτουν ολόκληρο το γονιδίωμα, αυξάνονται οι προγνωστικές και προβλεπτικές μοριακές υπογραφές, αλλά χρειάζεται τεκμηρίωση για την κλινική εφαρμογή τους. Περίπου το 40% των ασθενών με μεταστατικό κολοορθικό καρκίνο έχει σωματικές ενεργοποιητικές μεταλλάξεις του KRAS. Οι μεταλλάξεις αυτές είναι εξαιρετικά προβλεπτικές της μη ανταπόκρισης στους αναστολείς EGFR, όπως το cetuximab και το panitumumab, γεγονός που καθιστά απαραίτητη την εξέταση για την κατάσταση του KRAS πριν την έναρξη της θεραπείας και παίζει ρόλο στην επιλογή (Bardelli & Siena, 2010). Ωστόσο, από το 40% των ασθενών με αγρίου τύπου KRAS δε θα ανταποκριθούν όλοι σε θεραπείες που στρέφονται εναντίον του EGFR. Επιπλέον, παράγοντες όπως η amphiregulin και η epiregulin συνεισφέρουν στην ανταπόκριση στη θεραπεία. Ακόμα, 66

67 μεταλλάξεις του BRAF και του NRAS, όπως επίσης η απώλεια του PTEN και η ενεργοποίηση της PIK3CA συνεισφέρουν στην αντίσταση στη θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του EGFR. Επιπλέον, μεταλλάξεις στο BRAF βρίσκονται σε ποσοστό 8 10% των μεταστατικών κολοορθικών καρκίνων και σχετίζονται με χειρότερη πρόγνωση των ασθενών, όταν χορηγούνται θεραπείες έναντι του EGFR (Di Nicolantonio et al., 2008). Η MSI είναι ένας επίσης πολύ καλός βιοδείκτης. Σε ασθενείς σταδίου ΙΙ όγκοι με MSI βρίσκονται σε συχνότητα 22%, ενώ στο στάδιο ΙΙΙ με συχνότητα 12%. Ασθενείς που έχουν λάβει επικουρική θεραπεία με fluorouracil και έχουν όγκους με MSI, έχουν καλύτερη πρόγνωση από αυτούς, οι οποίοι έχουν όγκους μικροδορυφορικά σταθερούς (Popat & Houlston, 2005). Από την άλλη πλευρά, η προγνωστική αξία της μικροδορυφορικής αστάθειας είναι αμφιλεγόμενη σε ασθενείς που λαμβάνουν χημειοθεραπεία με βάση την ιρινοτεκάνη, με πιο έντονη διαφορά να παρατηρείται στους ασθενείς σταδίου ΙΙ σε σχέση με τους ασθενείς σταδίου ΙΙΙ, πιθανώς λόγω της συσχέτισης της μικροδορυφορικής αστάθειας με το στάδιο (Bertagnolli et al., 2009). Άλλη μελέτη υποστηρίζει ότι οι ασθενείς με MSI δεν ωφελούνται από την επικουρική θεραπεία με fluorouracil (Ribic et al., 2003). Η ίδια μελέτη έδειξε ότι το ανεπαρκές σύστημα επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (το οποίο είναι δείκτης για την MSI) συσχετίστηκε με βραχύτερη συνολική επιβίωση ασθενών σταδίου ΙΙ που έλαβαν επικουρικά θεραπεία με fluorouracil. Άλλος σημαντικός προγνωστικός δείκτης είναι η απώλεια ετεροζυγωτίας για το 18q, η οποία έχει συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση (Popat & Houlston, 2005). Είναι αξιοσημείωτο ότι απώλεια ετεροζυγωτίας για το 18q σπάνια παρατηρείται σε όγκους με MSI. Η χρωμοσωματική περιοχή 18q περιλαμβάνει σημαντικά γονίδια, όπως τα SMAD7, SMAD4, SMAD2, και DCC (DCC netrin 1 receptor). Σε ασθενείς σταδίου ΙΙΙ, η μειωμένη έκφραση SMAD4 έχει σχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση μετά από χημιοθεραπεία με βάση την fluorouracil (Alazzouzi et al., 2005). Άλλοι πιθανοί προγνωστικοί βιοδείκτες, που έχουν μελετηθεί, είναι οι thymidylate synthase (ο κύριος 67

68 στόχος του ενεργού μεταβολίτη της fluorouracil), excision-repair crosscomplementing-1 (εμπλέκεται στην αντίσταση ή στην ευαισθησία των πλατινούχων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων), VEGF και οι υποδοχείς του, και οι ιντερλευκίνες Επιγενετική Ο όρος επιγενετική εισήχθη από τον C. H. Waddington το 1939, για να ορίσει τις «αιτιώδεις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γονιδίων και των προϊόντων τους, οι οποίες δίνουν υπόσταση στο φαινότυπο» (Waddington, 1939). Αργότερα επαναπροσδιορίστηκε ως εκείνες οι κληρονομήσιμες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, οι οποίες δεν εμπλέκουν αλλαγές στην αλληλουχία του DNA (Holliday, 1987). Οι πιο καλά μελετημένες επιγενετικές τροποποιήσεις περιλαμβάνουν τη μεθυλίωση του DNA και τις αλλαγές των ιστονών. Αυτές οι τροποποιήσεις μπορούν να διαμορφώσουν τη δομή της χρωματίνης και να έχουν κριτικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και της προσβασιμότητας των μεταγραφικών παραγόντων, των συνενεργοποιητών και των συγκαταστολέων. Η μεθυλίωση του DNA έχει πολύ κριτικό ρόλο στον έλεγχο της γονιδιακής δραστηριότητας και την αρχιτεκτονική του πυρήνα των κυττάρων. Στους ανθρώπους, η μεθυλίωση του DNA συμβαίνει στον άνθρακα-5 της κυτοσίνης των CpG δινουκλεοτιδίων. Η αντίδραση αυτή καταλύεται από τις DNA μεθυλοτρανφεράσες (DNMTs). Οι θέσεις CpG δεν είναι τυχαία κατανεμημένες στο γονιδίωμα, αλλά υπάρχουν πλούσιες περιοχές σε CpG, γνωστές ως CpG νησίδες, οι οποίες βρίσκονται στις ρυθμιστικές περιοχές του 40-60% όλων των γονιδίων (Antequera, 2003; Esteller, 2008). Η μεθυλίωση των CpG νησίδων είναι σπάνιο γεγονός στα φυσιολογικά κύτταρα και περιορίζεται στα αμετάγραφα γονίδια του Χ χρωμοσώματος, στα αμετάγραφα λόγω γενετικής αποτύπωσης (genomic imprinting), στα γονίδια της γαμετικής σειράς και κάποια ιστο-ειδικά 68

69 γονίδια. Ωστόσο, η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων είναι κοινό χαρακτηριστικό γνώρισμα στα καρκινικά κύτταρα, το οποίο σχετίζεται με αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (Esteller, 2002; Strahl & Allis, 2000) Επιγενετική και καρκίνος Τα χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης του DNA στους όγκους ήταν από τις πρώτες επιγενετικές αλλαγές που βρέθηκαν στον καρκίνο στον άνθρωπο (Feinberg & Vogelstein, 1983). Η απώλεια μεθυλίωσης οφείλεται κυρίως στην υπομεθυλίωση επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών DNA και στην απομεθυλίωση κωδικευουσών περιοχών και εσωνίων- περιοχών του DNA, που επιτρέπουν εναλλακτικές εκδοχές του mrna, οι οποίες μεταγράφονται από ένα γονίδιο (Feinberg & Tycko, 2004). Κατά την ανάπτυξη ενός νεοπλάσματος, ο βαθμός υπομεθυλίωσης του γονιδιωματικού DNA αυξάνει όσο η βλάβη εξελίσσεται από έναν καλοήθη πολλαπλασιασμό κυττάρων σε έναν διηθητικό καρκίνο (Fraga et al., 2004). Έχουν προταθεί τρεις μηχανισμοί, για να εξηγήσουν τη συνεισφορά της υπομεθυλίωσης του DNA στην ανάπτυξη του καρκινικού κυττάρου: α) δημιουργία χρωμοσωματικής αστάθειας, β) επανενεργοποίηση μεταθετών στοιχείων και γ) απώλεια γονιδιακής αποτύπωσης. Η υπομεθυλίωση του DNA μπορεί να ευνοεί τον μιτωτικό ανασυνδυασμό, οδηγώντας σε διαγραφές και μεταθέσεις και μπορεί επίσης να προάγει τις χρωμοσωματικές αναδιατάξεις. Ο μηχανισμός αυτός έχει παρατηρηθεί σε πειράματα στα οποία στέρηση της μεθυλίωσης του DNA λόγω διαταραχής των DNMTs προκάλεσε ανευπλοειδία (Karpf & Matsui, 2005). Η υπομεθυλίωση του DNA στα καρκινικά κύτταρα είναι δυνατό να επανενεργοποιήσει διαγονιδιωματικό ενδοπαρασιτικό DNA, όπως είναι οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες L1 (long interspersed nuclear elements) και Alu (ανασυνδυαστικογόνα αλληλουχία) (Bestor, 2005). Αυτά τα υπομεθυλιωμένα τρανσποζόνια 69

70 μπορούν να μεταγραφούν ή να μετατεθούν σε άλλες γονιδιωματικές θέσεις, διαταράσσοντας το γονιδίωμα περαιτέρω. Η απώλεια μεθυλικών ομάδων από το DNA μπορεί, επίσης, να διαταράξει τη γονιδιωματική αποτύπωση. Για παράδειγμα, στο κληρονομικό σύνδρομο Beckwith Wiedemann (ένα σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από ομφαλοκήλη, μακρογλωσσία και γιγαντισμό) υπάρχει απώλεια αποτύπωσης του IGF2 και αυξημένος κίνδυνος εμφάνισης καρκίνου (Feinberg, 1999). Η απώλεια της αποτύπωσης αποτελεί, ακόμα, παράγοντα κινδύνου για τον κολοορθικό καρκίνο και η διαταραγμένη γονιδιακή αποτύπωση συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου Wilms (Cui et al., 2003; Feinberg, 1999). Σε ζωικά μοντέλα, ποντίκια με απώλεια αποτύπωσης του IGF2 ή γενικότερα ελαττώματα στην αποτύπωση έχουν αυξημένο κίνδυνο καρκίνου (Sakatani et al., 2005). Φυσιολογικά, συγκεκριμένα γονίδια ιστοειδικά των όρχεων, γονίδια που κωδικοποιούν αντιγόνα του μελανώματος ή ειδικά γονίδια που συνδέονται με τον πολλαπλασιασμό είναι αποσιωπημένα στα σωματικά κύτταρα, επειδή οι CpG νησίδες στην περιοχή του υποκινητή είναι μεθυλιωμένες (Feinberg & Tycko, 2004). Αντίθετα, σε κάποια καρκινικά κύτταρα, αυτές οι περιοχές του υποκινητή υφίστανται απομεθυλίωση με αποτέλεσμα να εκφράζονται γονίδια που συνήθως είναι κατεσταλμένα. Δύο αξιοσημείωτα παραδείγματα μηχανισμού υπομεθυλίωσης αποτελούν η ενεργοποίηση του PAX2 (paired box 2, γονίδιο που κωδικοποιεί ένα μεταγραφικό παράγοντα που εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό και άλλες σημαντικές δραστηριότητες του κυττάρου) και η ενεργοποίηση του γονιδίου του mirna let-7α-3, το οποίο εμπλέκεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του ενδομητρίου (Brueckner et al., 2007; Wu et al., 2005). Η υπομεθυλίωση του DNA μπορεί να έχει απρόβλεπτες επιδράσεις. Ο απόγονος ενός ποντικού με ελλιπή μεθυλίωση του DNA και ενός Min ποντικού, το οποίο έχει γενετικό ελάττωμα στο γονίδιο APC (adenomatous polyposis coli) και είναι επιρρεπές στο αδένωμα του παχέος εντέρου, έχει λιγότερους όγκους από ό,τι θα αναμενόταν (Laird et al., 1995). Αντίθετα, ένα 70

71 άλλο στέλεχος ποντικού με ελαττωματικές DNMTs έχει αυξημένο κίνδυνο για λέμφωμα (Gaudet et al., 2003). Επιπλέον, η υπομεθυλίωση καταστέλλει τα όψιμα στάδια της καρκινογένεσης στο έντερο, αλλά προάγει τις πρώιμες προκαρκινικές βλάβες στο παχύ έντερο και στο ήπαρ μέσω γονιδιωματικών διαγραφών (Yamada et al., 2005) Επιγενετική και κολοορθικός καρκίνος Τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα του κολοορθικού καρκίνου ελέγχονται από πολυάριθμες γενετικές και επιγενετικές αλλαγές που μετατρέπουν το φυσιολογικό επιθήλιο σε διηθητικούς όγκους (Vaiopoulos et al., 2014). Επιπλέον, αυτές οι γενετικές και επιγενετικές αλλαγές αποτελούν την αιτία για τη μετατροπή καλοήθων πολυπόδων σε κακοήθεις όγκους επηρεάζοντας διαφορετικά μονοπάτια. Οι επιγενετικοί μηχανισμοί, όπως η μεθυλίωση του DNA, μπορεί να επηρεάζουν τη γονιδιακή έκφραση χωρίς να αλλάζουν μόνιμα την αλληλουχία του DNA (2012). Αυτό οφείλεται στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων και στον τρόπο ζωής. Επιπλέον, οι αλλαγές στις ιστόνες αποτελούν στοιχείο κλειδί των επιγενετικών αλλαγών, λόγω των αποακετυλασών των ιστονών (HDACs), των μεθυλτρανσφερασών των ιστονών (HMTs) και των απομεθυλασών των ιστονών (HDMs). Αυτές οι τροποποιήσεις αποτελούν τους κυρίαρχους παίκτες στην ισορροπία ανάμεσα στην ευχρωματίνη (ενεργή μορφή του DNA) και στην ετεροχρωματίνη (ανενεργή μορφή του DNA). Ένα άλλο στοιχείο κλειδί, το οποίο σχετίζεται με τη δημιουργία του κολοορθικού καρκίνου και τη διήθηση, είναι τα micrornas. Αυτά τα μικρά non-coding RNAs έχουν δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής ρύθμισης στη βιολογία του κολοορθικού καρκίνου (Schetter et al., 2012). Τα επιγενετικά συμβάματα, η χρωμοσωματική αστάθεια και η MSI είναι τα κύρια βιολογικά γεγονότα, στα οποία αποδίδονται ο σποραδικός και ο κληρονομικός κολοορθικός καρκίνος. Δυστυχώς, η πρόγνωση του 71

72 κολοορθικού καρκίνου είναι ακόμα κακή, η δε ανακάλυψη νέων διαγνωστικών και προγνωστικών βιοδεικτών είναι απαραίτητη για την πρόληψη της θνητότητας λόγω κολοορθικού καρκίνου. Η μεθυλίωση του DNA θεωρείται τυχαίο και δυναμικό μοντέλο στη μοριακή επιγενετική της γονιδιακής έκφρασης (Jeltsch & Jurkowska, 2014). Η ευχρωματίνη (ενεργή και ελαφρά πακεταρισμένη μορφή της χρωματίνης) σχετίζεται με απουσία μεθυλίωσης των CpG νησίδων στην περιοχή του υποκινητή συγκεκριμένων γονιδίων, ενώ η ετεροχρωματίνη (σφιχτά πακεταρισμένη μορφή) σχετίζεται με μεθυλιωμένες περιοχές CpG νησίδων και γονιδιακή αποσιώπηση. Η περιοχή του υποκινητή των γονιδίων στο φυσιολογικό επιθήλιο του εντέρου περιέχει μη μεθυλιωμένες αλληλουχίες που ονομάζονται CpG νησίδες και η αποκλίνουσα μεθυλίωση των περιοχών αυτών είναι χαρακτηριστική της καρκινογένεσης (Sakai et al., 2014). Σήμερα, ο κολοορθικός καρκίνος θεωρείται σημαντικό παράδειγμα καρκίνου, που σχετίζεται με επιγενετικές αλλαγές (Carmona & Esteller, 2010). Αρκετές αναφορές έχουν ερευνήσει το ευρύ φάσμα των επιγενετικών αλλαγών κατά τα πρώτα στάδια ανάπτυξης των πολυπόδων και του κακοήθους αδενοκαρκινώματος. Οι CpG νησίδες είναι συχνά μεθυλιωμένες κατά την ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει τη χαμηλής συχνότητας μεθυλίωση, η οποία δημιουργεί την ετεροχρωματίνη (Bae et al., 2013). Η μεθυλίωση του DNA γίνεται μέσω των DNMT1, DNMT3A και DNMT3B, οι οποίες είναι απαραίτητες στη φυσιολογική ανάπτυξη του οργανισμού, εφόσον ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση (Smith & Meissner, 2013). Συνήθως η μεθυλίωση γίνεται στην περιοχή του υποκινητή ενός γονιδίου, οδηγώντας στη μεταγραφική αποσιώπηση του γονιδίου (Σχ. 1.15) (Ho et al., 2016). Η μεθυλίωση του DNA σχετίζεται με την αρνητική ρύθμιση πολλών αντι-ογκογονιδίων, όπως είναι το CDH1 (cadherin 1), το CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), το TIMP2 (tissue inhibitor of metalloproteinases 2) και το DAPK (death-associated protein kinase 1) (Almeida et al., 2015). 72

73 Σχήμα Σχηματική παράσταση της αποσιώπησης της γονιδιακής έκφρασης λόγω μηχανισμών μεθυλίωσης (El Bairi et al., 2018). Στον κολοορθικό καρκίνο η υπομεθυλίωση του DNA έχει σημαντικό ρόλο, από το σχηματισμό του αδενώματος μέχρι το αδενοκαρκίνωμα (Luo et al., 2014). Φαίνεται ότι η υπομεθυλίωση του DNA αποτελεί το πρώτο βήμα της καρκινογένεσης στον κολοορθικό καρκίνο (Lao & Grady, 2011). Η υπερμεθυλίωση του DNA σε περιοχές υποκινητών οδηγεί στην καταστολή ή απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ενώ η υπομεθυλίωση σχετίζεται με χρωμοσωματική αστάθεια και ενεργοποίηση πρωτοογκογονιδίων (Migheli & Migliore, 2012). Η υπομεθυλίωση του DNA οδηγεί σε ατελή αντιγραφή των προτύπων μεθυλίωσης στη νέα αλυσίδα που συντίθεται, πιθανόν λόγω έλλειψης μεθυλικών ομάδων (Torano et al., 2012). Επιπλεόν, η απώλεια της μεθυλίωσης επηρεάζει τη χρωμοσωματική σταθερότητα και ενισχύει την ανευπλοειδία, συμβάλλοντας στην καρκινογένεση (Lao & Grady, 2011). Στα καρκινικά κύτταρα παρατηρείται στις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που υπάρχουν στις μικροδορυφορικές περιοχές ή κοντά στο κεντρομερίδιο. Αυτό το πρότυπο μεθυλίωσης αδρανοποιεί τα χρωμοσώματα και οδηγεί σε αστάθεια του DNA καθώς επίσης και σε ενεργοποίηση ογκογονιδίων. Η υπομεθυλίωση μπορεί ακόμα να οδηγήσει σε επανενεργοποίηση αποσιωπημένων ρετροτρανσποσονίων και επομένως να προκαλέσει διαταραχή στη φυσιολογική δομή και στη 73

74 λειτουργία συγκεκριμένων γονιδίων, όπως το LINE-1 (long interspersed nuclear element-1), του οποίου η υπομεθυλίωση σχετίζεται με τον κολοορθικό καρκίνο (Solyom et al., 2012). Στο ανθρώπινο γονιδίωμα, περίπου το 50% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες περιέχουν περιοχές πλούσιες σε CG παράλληλα με τους υποκινητές τους ή με CpG νησίδες. Η απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων λόγω υπερμεθυλίωσης του υποκινητή παρατηρείται σε κάθε βήμα κατά την ιστολογική εξέλιξη ενός αδενώματος σε καρκίνωμα (Lao & Grady, 2011). Υπάρχουν δεδομένα που δείχνουν ότι η μεθυλίωση ενός υποκινητή ξεκινάει από 1% των CpG νησίδων και βαθμιαία φτάνει το 10% κατά τη διαδικασία της ογκογένεσης (How Kit et al., 2012). Επιπλέον, σύμφωνα με το μοντέλο Knudson των δύο χτυπημάτων (two-hit), οι επιγενετικές αλλαγές είναι απαραίτητες για την απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, χωρίς την απώλεια ετεροζυγωτίας (Knudson & Strong, 1972). Επομένως, η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων έχει το ίδιο αποτέλεσμα με μεταλλάξεις ή διαγραφές σε κωδικεύουσες περιοχές, οι οποίες μπορεί να επηρεάζουν όλα τα σηματοδοτικά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης, APC, CTNNB1 (catenin beta 1), TP53, TGFβ/SMAD. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη γονιδιωματική αστάθεια, τον κυτταρικό θάνατο, την κυτταρική προσκόλληση, την αγγειογένεση, την μετάπτωση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο και τη διήθηση (Cock-Rada & Weitzman, 2013). Όπως αναφέραμε παραπάνω, στον κολοορθικό καρκίνο, έχει αναγνωριστεί μία υποομάδα με φαινότυπο μεθυλιωμένων CpG νησίδων (CIMP), η οποία χαρακτηρίζεται από μεγάλη συχνότητα μεθυλιωμένων υποκινητών (Jia et al., 2016). Οι όγκοι που έχουν θετικούς τους δείκτες CIMP έχουν μεγαλύτερη συχνότητα σε μεταλλάξεις στο BRAF (61%), ενώ οι υπόλοιποι έχουν συχνότερα μεταλλάξεις στο KRAS (45%) (Yagi et al., 2010). 74

75 Εκτός από την ανάπτυξη της πρωτοπαθούς βλάβης, και στη μετάσταση του όγκου η μεθυλίωση παίζει σημαντικό ρόλο. Πολλά γονίδια έχουν συσχετιστεί με τη μετάσταση, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που αναστέλλουν ή ενεργοποιούν τη μεταστατική διαδικασία, όπως οι laminins, cadherins, αναστολείς της αγγειογένεσης και καταστολείς της μετάστασης (Al-Temaimi et al., 2016). Οι επιγενετικές αλλαγές στα παραπάνω γονίδια παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασής τους και επομένως στην επίδρασή τους στη μεταστατική διαδικασία. Η μεθυλίωση των CpG νησίδων των υποκινητών παρατηρείται συχνότερα στον κολοορθικό καρκίνο σε σχέση με τις μεταλλάξεις στο DNA. Πολλά γονίδια που θεωρούνται καταστολείς της μετάστασης έχουν βρεθεί να είναι μεθυλιωμένα και να επηρεάζεται η έκφρασή τους, όπως το NDRG (N-myc downstream-regulated gene), το E- cahderin (ή cadherin 1), PDLIM1 (PDZ και LIM domain 1), TPM1 (tropomyosin 1), PDCD4 (programmed cell death 4) κ.ά. (Chan & Wang, 2015; Chen et al., 2016; Mi et al., 2017; Semb & Christofori, 1998) Η E-cahderin παίζει ρόλο στη ρύθμιση των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων και οι αποκλίσεις της έκφρασής της έχουν συνδεθεί με αυξημένη διήθηση σε πολλούς επιθηλιακούς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του κολοορθικού καρκίνου (Buda & Pignatelli, 2011). Αντίστοιχα, η PDLIM1 αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο E-cadherin/β-catenin αποτρέποντας τη διήθηση, και η υπερμεθυλίωση του PDLIM1 έχει συσχετιστεί με αυξημένη μετανάστευση, διήθηση και απομακρυσμένη μετάσταση (Chen et al., 2016) Επιγενετικές αλλαγές ως βιοδείκτες Οι βιοδείκτες μεθυλίωσης, όπως η κατάσταση CIMP, είναι ιδιαίτερα σημαντικοί για τη διάγνωση, πρόγνωση και επιλογή των θεραπευτικών προσεγγίσεων. Για την εφαρμογή των βιοδεικτών μεθυλίωσης στην κλινική πράξη, διάφορες επικυρωμένες τεχνικές έχουν εμπορευματοποιηθεί, όπως το ColoVantage [δοκιμασία αίματος, το οποίο ανιχνεύει τη μεθυλιωμένη Septin9 (SEPT9) με ευαισθησία 90%, το Epi procolon 2.0 CE (δοκιμασία 75

76 αίματος, το οποίο ανιχνεύει τη μεθυλιωμένη SEPT9 με ευαισθησία 75 81% και ειδικότητα 96% 99%), το ColoSure (δοκιμασία κοπράνων, σε συνδυασμό με κολονοσκόπηση, το οποίο ανιχνεύει τη μεθυλιωμένη VIM με ευαισθησία 38-88%), και άλλα τεστ που βρίσκονται υπό κλινική δοκιμή (Gyparaki et al., 2013; Lamb & Dhillon, 2017; Ned et al., 2011). Για την κατάσταση του CIMP πολλές κλινικές μελέτες έχουν γίνει στον κολοορθικό καρκίνο χρησιμοποιώντας διάφορους βιοδείκτες μεθυλίωσης. Η υπερμεθυλίωση του SOCS-1, ενός δείκτη που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του CIMP, έχει συσχετιστεί με το στάδιο, τη διήθηση λεμφαδένων και με βραχεία επιβίωση (Kang et al., 2016). Ασθενείς με CIMP, έχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο BRAF και εντόπιση στο δεξιό κόλον, έχουν βραχεία επιβίωση ελεύθερη νόσου (disease-free survival, DFS) (Ahn et al., 2011). Επιπλέον, το CIMP και το υπομεθυλιωμένο LINE-1 αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες του DFS για τους όγκους που εντοπίζονται στο δεξιό κόλον. Αρκετές μελέτες συσχετίζουν το CIMP με μειωμένο DFS και με την κλινική έκβαση μετά από χημειοθεραπεία (Cha et al., 2016). Επίσης, οι CIMP όγκοι έχουν αυξημένη συχνότητα μεταλλάξεων του EGFR (Zhang et al., 2016). Αν και η προγνωστική αξία του CIMP είναι σημαντική και έχει φανεί και σε μετα-αναλύσεις, η επιλογή των δεικτών δεν έχει ακόμα τυποποιηθεί (Juo et al., 2014). Ένας άλλος βιοδείκτης μεθυλίωσης είναι η μεθυλιωμένη SEPT9. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που προσδένει GTP και παίζει σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση, στην κυτταροκίνηση και στην αγγειογένεση (Song & Li, 2015). Σε μεγάλη προοπτική κλινική μελέτη η ειδικότητα της μεθυλιωμένης SEPT9 στο περιφερικό αίμα ήταν 91,5% για τη διάγνωση του κολοορθικού καρκίνου, ενώ η ευαισθησία κυμαίνοταν από 35% έως 77,4%, αυξανομένου του σταδίου της νόσου, ενώ η ευαισθησία για τα αδενώματα ήταν χαμηλή (11,2%) (Church et al., 2014). Ακολούθησαν αρκετές μελέτες και βελτίωση της ευαισθησίας της μεθόδου, ενώ με τη χρήση του Epi procolon test αυξήθηκε η ευαισθησία στο 76

77 72% και ενισχύθηκε η διαγνωστική του αξία στην ανίχνευση προχωρημένων αδενωμάτων (Song et al., 2017). Σε πρόσφατη μετα-ανάλυση 25 μελετών οι τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας, που προέκυψαν, ήταν 71% και 92%, αντίστοιχα, ενώ η ευαιθησία για την ανίχνευση αδενωμάτων παρέμεινε χαμηλή (Nian et al., 2017). Το γονίδιο VIM κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη ενδιάμεσων ινιδίων τύπου ΙΙΙ του κυτταροσκελετού, η οποία εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα μεσεγχυματικά κύτταρα και θεωρείται δείκτης μετάπτωσης επιθηλιακού φαινοτύπου σε μεσεγχυματικό που χαρακτηρίζει τα καρκινικά κύτταρα (Leduc & Etienne-Manneville, 2015). Η διαταραχή της μεθυλίωσης του υποκινητή του VIM έχει συσχετιστεί με την παθογένεια του κολοορθικού καρκίνου, ενώ η ανίχνευση του μεθυλιωμένου VIM στο αίμα ή στα κόπρανα αποτελεί μη επεμβατική προσέγγιση ανίχνευσης κολοορθικού καρκίνου ή αδενωμάτων (Li et al., 2014). Το ColoSure είναι μία δοκιμασία εμπορικά διαθέσιμη για την ανίχνευση του μεθυλιωμένου VIM, με ευαισθησία και ειδικότητα που κυμαίνονται από 38% έως 88%, όπως έχει φανεί από διάφορες μελέτες, ενώ δεν υπάρχει προοπτική τυχαιοποιημένη μελέτη που να έχει δείξει την ανωτερότητα του τεστ σε σχέση με άλλα (Ahlquist et al., 2008). Υπάρχουν κι άλλοι επιγενετικοί βιοδείκτες, οι οποίοι μπορεί να μην είναι εμπορικά διαθέσιμοι, αλλά δοκιμάζονται σε κλινικές δοκιμές. Σε αναδρομική μελέτη τα γονίδια GATA5 και SFRP2 (secreted frizzled-related protein gene 2) βρέθηκαν μεθυλιωμένα στο πλάσμα ασθενών με κολοορθικό καρκίνο σε ποσοστό 61,4% και 54,39% αντίστοιχα, ενώ τα υπερμεθυλιωμένα GATA5, SFRP2 και ITGA4 (integrin alpha 4) συσχετίστηκαν με το στάδιο της νόσου και τη διαφοροποίηση (Zhang et al., 2015). Ένας άλλος υποσχόμενος διαγνωστικός και προγνωστικός βιοδείκτης είναι το μεθυλιωμένο γονίδιο IGFBP3 (insulin-like growth factor binding protein 3), το οποίο θεωρείται ογκοκατασταλτικό γονίδιο, με ευαισθησία 95,5% και ειδικότητα 90,5% στην ανίχνευση του κολοορθικού καρκίνου (Perez-Carbonell et al., 2014; Sawada et al., 2013). Ως προβλεπτικοί βιοδείκτες, η υπερμεθυλίωση του TFAP2E 77

78 (transcription factor AP-2 epsilon) σχετίζεται με μη ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία, ενώ η υπερμεθυλίωση του MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) σχετίζεται με ανταπόκριση στον αλκυλιωτικό παράγοντα dacarbazine (Sawada et al., 2013) Υγρή βιοψία Κατά την εξέλιξη του καρκίνου και τη διήθηση, μεγάλος αριθμός κυττάρων υφίστανται νέκρωση, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση στην κυκλοφορία του αίματος των συστατικών τους, όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα (Stroun et al., 2000). Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα αποκολλώνται από τον όγκο και μεταναστεύουν μέσω της κυκλοφορίας κατά την μετάπτωσή τους από τον επιθηλιακό στο μεσεγχυματικό φαινότυπο (Micalizzi et al., 2017). Η παρουσία των καρκινικών κυττάρων στο αίμα των ασθενών περιγράφηκε πρώτη φορά το 1869 από τον Αυστραλό παθολογοανατόμο Thomas Ashworth και του κυκλοφορούντος καρκινικού DNA το 1977 από τους Leon et al. (Leon et al., 1977). Η απομόνωσή τους, ο αριθμός τους και ο μοριακός χαρακτηρισμός τους μπορεί να λειτουργήσει ως υγρή βιοψία, ένας όρος που εισήχθη τα τελευταία χρόνια, θέλοντας με αυτόν να περιγράψουν έναν αξιόπιστο ελάχιστα επεμβατικό βιοδείκτη για την κλινική πράξη, για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση της ανταπόκρισης σε μία θεραπεία για πολλούς τύπους καρκίνου (Perakis & Speicher, 2017; Ulz et al., 2017). Ευαίσθητες τεχνολογίες, όπως το CellCollector (GILUPI) και το CellSearch (Veridex) έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση και απομόνωση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (Shen et al., 2017). Η παρακολούθηση της εξέλιξης και της ετερογένειας του όγκου με την εξέταση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, του κυκλοφορούντος καρκινικού DNA, των εξωσωμάτων και των mirnas αποτελεί πλέον κλινική πραγματικότητα (Turajlic & Swanton, 2015). 78

79 Το κυκλοφορούν ελεύθερο DNA (circulating free DNA, cfdna) είναι ένα φυσικό φαινόμενο που παρατηρείται και προέρχεται από φυσιολογικά και καρκινικά κύτταραλόγω απόπτωσης και νέκρωσης ή και έκκρισης (Jahr et al., 2001). Το κυκλοφορούν DNA, το οποίο προέρχεται από τον όγκο (circulating tumor DNA, ctdna) φαίνεται να είναι εμπλουτισμένο σε τμήματα 166 bp, ενδεικτικό του μεγάθους του DNA που είναι διπλωμένο γύρω από τα νουκλεοσώματα (Underhill et al., 2016). Ο μέσος όρος ημιζωής του κυκλοφορούντος εμβρυϊκού DNA έχει βρεθεί ότι είναι περίπου 16,3 λεπτά (εύρος 4 30 λεπτά) και καταστρέφεται μέσα σε δύο ώρες (Lo et al., 1999). Παρομοίως, το ctdna έχει μικρό χρόνο ημιζωής, το οποίο δίνει τη δυνατότητα στους κλινικούς να παρακολουθούν τις αλλαγές που συμβαίνουν μέσα στον όγκο μέσα σε λίγες ώρες (Diehl et al., 2008). Επομένως, το ctdna αποτελεί μία πηγή με μεγάλο όγκο πληροφοριών, τις οποίες μπορούμε να αντλήσουμε για την έρευνα στον καρκίνο. Οι παραδοσιακές μέθοδοι ανίχνευσης, όπως η αλληλούχιση με Sanger και η ποσοτικοποιημένη PCR μπορούν να ανιχνεύσουν μόνο υψηλές συγκεντρώσεις ctdna λόγω της χαμηλής τους ευαισθησίας. Νεώτερες τεχνικές, όπως η BEAMing (beads, emulsion, amplification και magnetics: σφαιρίδια, γαλάκτωμα, ενίσχυση και μαγνητικά) και η digital PCR (ψηφιακή PCR, dpcr), επιτρέπουν την ανίχνευση έως και 0,01% συγκεκριμένου ctdna με ανώμαλη αλληλουχία στην κυκλοφορία (Beije et al., 2016). Από την άλλη μεριά, η τεχνολογία της αλληλούχισης νέας γενιάς (next generation sequencing, NGS) μπορεί να παρακολουθεί όλες τις πιθανές μεταλλάξεις του καρκίνου στην κυκλοφορία, ακόμα και σπάνιες. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα του cfdna είναι υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο σε σχέση με τους υγιείς ή με ασθενείς με καλοήθεις ασθένειες, και αυξάνονται ανάλογα με το στάδιο της νόσου (Frattini et al., 2008). Η ανάλυση του ctdna για τον ιό Epstein Barr virus (EBV) έχει πιστοποιηθεί για τον έλεγχο και την πρώιμη διάγνωση του ρινοφαρυγγικού καρκινώματος (nasopharyngeal carcinoma, NPC) σε ασθενείς χωρίς προηγούμενα συμπτώματα (Chan et al., 2013). Παρόλο που η 79

80 ποσοτικοποίηση του ctdna μπορεί να μη δίνει πολλές πληροφορίες για τη διάγνωση του όγκου, η μείωση ή η αύξησή του μετά από θεραπεία μπορεί να αποτελεί προγνωστικό δείκτη για υπολειπόμενη νόσο και υποτροπή (To et al., 2003). Η πρώτη προοπτική μελέτη για τον έλεγχο για κολοορθικό καρκίνο με cfdna αφορούσε τη μεθυλιωμένη SEPT9 και είχε ευαισθησία 48,2% και ειδικότητα 91,5% (Church et al., 2014). Αν και η πρώιμη διάγνωση και οι στρατηγικές ελέγχου, οι οποίες βασίζονται στο ccfdna είναι υποσχόμενες, χρειάζονται βελτίωση και πρέπει να ξεπεράσουν εμπόδια που αφορούν κυρίως στις τεχνικές (Bettegowda et al., 2014). Στον κολοορθικό καρκίνο η μεθυλίωση στο κυκλοφορούν DNA αποτελεί υποσχόμενο βιοδείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση της νόσου. Η ανίχνευση του μεθυλιωμένου SEPT9 στο κυκλοφορούν DNA αναγνώρισε τους ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο με ευαισθησία 72% και ειδικότητα 93% στη δημοσίευση των devos et al. (devos et al., 2009). Παρόλο που σε συνδυασμό με το μεθυλιωμένο VIM η ευαισθησία αυξήθηκε, δεν συστήνεται ως εξέταση ελέγχου, μολονότι που χρησιμοποιείται σε κάποιους ασθενείς, οι οποίοι αρνούνται να υποβληθούν σε κολονοσκόπηση (Rex et al., 2017). Ο συνδυασμός των μεθυλιωμένων BCAT1 (branched chain amino acid transaminase 1) και IKZF1 (IKAROS family zinc finger 1) ανίχνευσε τον κολοορθικό καρκίνο με ευαισθησία 66% (κυμαινόμενη ανάλογα με το στάδιο της νόσου), σε προοπτική μελέτη του 2015 (Pedersen et al., 2015). Όταν τον συνέκριναν με το εγκεκριμένο ανοσοχημικό τεστ κοπράνων (immunochemical fecal test, FIT), ο συνδυασμός των μεθυλιωμένων BCAT1 και IKZF1 βρέθηκε να υπερέχει σε ειδικότητα, ενώ η ευαισθησία ήταν ίδια με του ανοσοχημικού τεστ κοπράνων και η ευαισθησία αυξάνοταν σε 89,4%, όταν συνδυάζονταν και τα δύο (Symonds et al., 2016). Υποσχόμενος συνδυασμός είναι και αυτός των μεθυλιωμένων IRF4 (interferon regulatory factor 4) και GRASP (general receptor for phosphoinositides 1 associated 80

81 scaffold protein) με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία από 54,5 έως 67,6% (Mitchell et al., 2016). Πολλές μελέτες έχουν επίσης αναδείξει την προγνωστική αξία του μεθυλιωμένου DNA στο κυκλοφορούν καρκινικό DNA. Η μεθυλίωση των HLTF και HPP1 (hyperplastic polyposis 1) στον ορό ασθενών έχει συσχετιστεί τόσο με το μέγεθος, τη διαφοροποίηση του όγκου και την απομακρυσμένη μετάσταση, όσο και με χειρότερη πρόγνωση των ασθενών (Herbst et al., 2017). Η μεθυλίωση του DNA στην υγρή βιοψία μπορεί ακόμα να συνεισφέρει στην παρακολούθηση για ανταπόκριση σε συγκεκριμένη θεραπεία. Το μεθυλιωμένο MGMT στην υγρή βιοψία έχει συσχετιστεί με καλύτερη ανταπόκριση σε θεραπεία με dacarbazine και μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο νόσου, αν και σε μελέτη φάσης ΙΙ απέτυχε να επιβεβαιώσει τη συσχέτιση, όπως το απέδειξε αντίστοιχη μελέτη για το μεθυλιωμένο MGMT στον ιστό (Amatu et al., 2016; Hochhauser et al., 2013). Επίσης, μεθυλίωση του WIF (WNT inhibitory factor 1) και του NPY (neuropeptide Y) έδειξε υποσχόμενα αποτελέσματα για την εφαρμογή τους στην παρακολούθηση της ανταπόκρισης της θεραπείας (Garrigou et al., 2016). Χρησιμοποιώντας τεχνολογία BEAMing για να παρακολουθήσουν τα επίπεδα του ctdna κατά τη διάρκεια συνδυασμένης θεραπείας, οι Diehl et al. έδειξαν ότι τα επίπεδα ctdna ήταν καλύτερος προβλεπτικός δείκτης για την υποτροπή της νόσου σε σχέση με τα επίπεδα ορού του CEA (Carcinoembryonic Antigen, καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο) (Diehl et al., 2008). Σε άλλη μελέτη, η οποία περιελάμβανε χειρουργημένους ασθενείς σταδίου ΙΙ, η ανίχνευση ctdna μετά την εκτομή του όγκου έδειξε υπολειπόμενη νόσο και ταυτοποίησε ασθενείς υψηλού κινδύνου για υποτροπή, υπερέχοντας των άλλων κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων (Tie et al., 2016). Τα ευρήματα αυτά έθεσαν τα θεμέλια για τον προσδιορισμό του ctdna για την παρακολούθηση για υποτροπή και για τη λήψη κλινικών αποφάσεων. 81

82 Μέχρι σήμερα πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ανίχνευση του μεθυλιωμένου ctdna σε ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο. Η υπερμεθυλίωση των WIF1 και NPY ανιχνεύεται σε υψηλότερα επίπεδα στον καρκινικό ιστό σε σχέση με το φυσιολογικο ιστό και η ανίχνευσή της στο ctdna σχετίζεται με το στάδιο και με την εξέλιξη του όγκου (Garrigou et al., 2016). Στα αδενώματα και στο μεθυλιωμένο cfdna ασθενών με κολοορθικό καρκίνο έχουν βρεθεί υψηλότερα ALU83 και ALU244 (Bedin et al., 2017). Επιλέον, τα επίπεδα μεθυλίωσης των OSMR (oncostatin M receptor) και SFRP1 (secreted frizzled related protein 1) στο cfdna είναι υψηλότερα σε ασθενείς με προχωρημένο αδενοκαρκίνωμα σε σχέση με ασθενείς με αδένωμα και υγιείς (Bedin et al., 2017). Οι Misale et al. έδειξαν για πρώτη φορά ότι οι μεταλλάξεις στο KRAS είναι οδηγές μεταλλάξεις για την επίκτητη αντίσταση των ασθενών με κολοορθικό καρκίνο. που υποβάλλονται σε θεραπεία με cetuximab (anti- EGFR) και ότι οι μεταλλαγμένοι κλώνοι KRAS μπορούν να ανιχνευθούν μήνες πριν την ακτινολογική επιδείνωση (Misale et al., 2012). Πρότειναν επίσης ότι πρώιμη έναρξη θεραπείας με αναστολέα ΜΕΚ καθυστερεί ή και αντιστρέφει την αντίσταση στη θεραπεία (Misale et al., 2012). Στο ίδιο συμπέρασμα κατέληξε και άλλη μελέτη, στην οποία βρήκαν ακόμα ότι κάθε σχετικά μεγάλη μεταστατική βλάβη περιείχε έναν υποκλώνο με εκατοντάδες ή χιλιάδες κύτταρα με μία από τις 42 μεταλλάξεις που προσδίδουν αντίσταση στο αντίσωμα, καθιστώντας την αντίσταση ως τετελεσμένο γεγονός (Diaz et al., 2012). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, ο χρόνος της υποτροπής είναι απλά το διάστημα, το οποίο χρειάζεται ο υποκλώνος για να κυριαρχήσει στη μεταστατική βλάβη (Diaz et al., 2012). Η πρώτη τυφλή πολυκεντρική μελέτη που συνέκρινε τις μεταλλάξεις των KRAS και BRAF στον καρκινικό ιστό και στο ctdna, έδειξε 100% ευαισθησία και ειδικότητα για τη μετάλλαξη V600E του BRAF στο ctdna και 96% ειδικότητα και 92% ευαισθησία για μετάλλαξη στο KRAS στο ctdna, σε συμφωνία 92% σε σχέση με τον ιστό (Thierry et al., 2014). Εξαιτίας της κλινικής σημασίας του KRAS, η κατάσταση αγρίου τύπου για το KRAS είναι προαπαιτούμενη για τη θεραπεία με αντίστοιχους 82

83 στοχευτικούς παράγοντες. Η παρακολούθηση των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων KRAS και BRAF, πριν την έναρξη θεραπείας με cetuximab και irinotecan και στην αρχή κάθε κύκλου, έδειξε ότι η εμφάνιση μετάλλαξης KRAS σε ασθενείς με όγκους, αρχικά με αγρίου τύπου KRAS, ήταν ενδεικτική της κακής εξέλιξης, ενώ ασθενείς με όγκο με μεταλλαγμένο KRAS, οι οποίοι είχαν στο πλάσμα αγρίου τύπου KRAS ανταποκρίθηκαν καλύτερα στη θεραπεία (Spindler et al., 2014). Οι περισσότερες μελέτες έχουν εκτιμήσει συγκεκριμένες μεταλλάξεις που εντοπίζονται συχνότερα σε συγκεκριμένους όγκους. Ωστόσο, η ανίχνευση των μεταλλάξεων συγκεκριμένων γονιδίων, οι οποίες ανιχνεύονται στον ίδιο τον όγκο, δεν είναι πάντα εφικτή και στο cfdna. Σε μελέτη που έγινε με τεχνολογία NGS σε cfdna ασθενών με μεταστατικό κολοορθικό καρκίνο που είχαν υποστεί ηπατική μεταστασεκτομή και περιελάμβανε 21 γονίδια, ενώ η ανίχνευση του cfdna ήταν εφικτή, ωστόσο, η ευαισθησία στην ανίχνευση όλων των σωματικών μεταλλάξεων του όγκου ήταν χαμηλή, ιδιαίτερα σε άγνωστες μεταλλάξεις (Beije et al., 2016). Σε άλλη μελέτη συμπεραίνεται ότι η ανάλυση του εξώματος στο ctdna μπορεί να λειτουργήσει συμπληρωματικά στην κλασική βιοψία για την αναγνώριση μεταλλάξεων στην επίκτητη αντίσταση στη θεραπεία στους προχωρημένους καρκίνους (Murtaza et al., 2013) ncrnas (non-coding RNAs, μη κωδικεύοντα RNAs) Η παραγωγή RNA από το γονιδιωματικό DNA κατευθύνεται από αλληλουχίες που καθορίζουν την αρχή και το τέλος των μεταγράφων και το μάτισμά τους σε ώριμα RNAs (Carninci et al., 2005). Παρόλο που το 93% του ανθρώπινου γονιδιώματος μπορεί να μεταγραφεί σε RNA, μόνο το 2% των μεταγράφων αυτών μπορεί να μεταφραστεί σε πρωτεΐνες. Τα υπόλοιπα RNAs έχουν πολύ μικρό ή καθόλου δυναμικό να μεταφραστούν σε πρωτεΐνες, ονομάζονται μη κωδικεύοντα RNAs (non-coding RNAs, ncrnas) και 83

84 περιλαμβάνουν τα rrnas, τα micrornas, τα trnas, τα μιτοχονδριακά ncrnas, τα μικρά πυρηνικά RNAs (snrnas), τα μικρά πυρηνιακά (small nucleolar RNAs, snornas), τα παρεμβαλλόμενα RNAs (RNAi), και πολλά μεγάλου μήκους διαγονιδιακά ncrnas (long intergenic ncrnas, lincrnas (Collins & Penny, 2009; Costa, 2007; Dermitzakis et al., 2005). Μπορούν να διαχωριστούν σε μικρού (short non-coding RNAs) ή μεγάλου μήκους (long non-coding RNAs, lncrnas) μη κωδικεύοντα RNAs ανάλογα με το μέγεθος των μεταγράφων. Στα lncrnas ανήκουν τα ncrnas, τα οποία είναι μεγαλύτερα των 200 nt, αποτελώντας ταυτόχρονα περισσότερο από το 80% των ncrnas των θηλαστικών. Μέχρι πρόσφατα οι επιστήμονες αγνοούσαν τη σημασία των ncrnas και τα θεωρούσαν σκοτεινή ύλη (dark matter). Λόγω της εκτενούς έρευνας και της βαθύτερης κατανόησης της βιολογία τους, η σημασία τους συνεχώς αυξάνεται mirnas (micrornas) Τα πιο καλά μελετημένα ncrnas είναι τα mirnas, τα οποία είναι μικρά ncrnas των 22 περίπου νουκλεοτιδίων, τα οποία όμως ρυθμίζουν το 60% των κωδικευόντων γονιδίων μέσω πρόσδεσης σε mrnas και εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, στη διαφορροποίηση, την απόπτωση και την ανάπτυξη (Bartel, 2009). Μέχρι σήμερα πάνω από 1000 mirnas έχουν αναγνωριστεί. Είναι γνωστό ότι πολλά micrornas έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση μεταστάσεων (Chan & Wang, 2015). Πολλά από αυτά παίζουν ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση, είτε ρυθμίζοντας θετικά προμεταστατικά γονίδια, είτε αναστέλλοντας γονίδια κατασταλτικά της μετάστασης, όπως τα TPM1 (tropomyosin 1) και PDCD4 (programmed cell death 4)(Bretthauer et al., 2016). Στον κολοορθικό καρκίνο, η μεταστατική διαδικασία ρυθμίζεται από πολλά mirnas, τα οποία μπορεί είτε να ρυθμίζονται θετικά (mir-21, fmir cluster, mir-135a/b, mir-471 και mir-675) είτε αρνητικά (mir-143, 84

85 mir-14, let-7 και mir-101) (Chi & Zhou, 2016). Αυτά τα mirnas μπορούν να τροποποιούν μεταγραφικούς παράγοντες, όπως οι c-myc (avian myelocytomatosis virus oncogene cellular homolog), STAT (signal transducer and activator of transcription), OCT4 (octamer-binding transcription factor 4), SOX (Sry-box transcription factors), E2F1 (E2F transcription factor 1), ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1), ZEB2 (zinc finger E-box binding homeobox 2), NFIB (nuclear factor I/B), διάφορες κινάσες (Erk (Extracellular signal-regulated kinase), Yes1 (YES proto-oncogene 1 Src family tyrosine kinase), και γ) άλλα γονίδια, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση των μεταλλοπρωτεϊνασών της εξωκυττάριας ύλης (matrix metalloproteinases, MMP), όπως τα RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) και TIMP3 (TIMP Metallopeptidase Inhibitor 3). Επίσης, το mir-181a έχει βρεθεί να έχει τη μεγαλύτερη έκφραση στον κολοορθικό καρκίνο που συνοδεύεται από ηπατικές μεταστάσεις, καθιστώντας το προγνωστικό παράγοντα για την επιβίωση (Ji et al., 2014). Πολλά mirnas έχουν φανεί ότι ρυθμίζουν τη μετάπτωση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο (Zhou et al., 2014). Η οικογένεια mir-200 (mir-200a, mir-200b, mir-200c, και mir-429) έχει μελετηθεί εκτεταμένα ως προς την παράμετρο αυτή, με τα επίπεδα έκφρασης να μειώνονται στον καρκινικό ιστό σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο (Diaz et al., 2014). Η αρνητική ρύθμιση της οικογένειας mirna-200 έχει συσχετιστεί με καταστροφή της βασικής μεμβράνης, ενισχύοντας ακόμα περισσότερο το ρόλο της στη διαδικασία της μετάπτωσης από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο στον κολοορθικό καρκίνο (Paterson et al., 2013). Επιπλέον, το mir-29a ενισχύει την έκφραση της MMP2 (Matrix Metallopeptidase 2) και αναστέλλει την έκφραση της E-cadherin, ρυθμίζοντας αρνητικά τον Klf4 (Kruppel-like factor 4), έναν παράγοντα που αναστέλλει τη μετάσταση των κυττάρων του κολοορθικού καρκίνου (Tang et al., 2014). Επίσης, η θετική ρύθμιση του mir-21 αυξάνει το αγγειογενετικό και μεταναστευτικό δυναμικό, μειώνοντας τα επιπεδα έκφρασης της TIMP3, η 85

86 οποία είναι υπεύθυνη για την αναστολή της ενεργότητας της MMP (Li & Li, 2013) lncrnas (Long non- coding RNAs) Τα lncrnas περιεγράφησαν ως υποκατηγορία των ncrnas για πρώτη φορά μετά από μεγάλης κλίμακας αλληλούχιση πλήρους μήκους cdna βιβλιοθηκών στον ποντικό. Δεδομένης της μη αναμενόμενης αφθονίας τους, τα lncrnas στην αρχή θεωρούνταν ότι ήταν παρασιτικός μεταγραφικός θόρυβος. Ωστόσο πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι συμμετέχουν σε πολλές σημαντικές ρυθμιστικές διαδικασίες στον άνθρωπο και σε άλλα είδη. Προς διευκόλυση της μελέτης τους, η πληθώρα των καταγεγραμμένων lncrnas έχουν ταξινομηθεί με βάση τη θέση τους στο γονιδίωμα. Γονίδια για τα lncrnas μπορούν να βρεθούν σε περιοχές ανάμεσα σε γονίδια, μέσα σε εσώνια γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ή να αλληλεπικαλύπτονται με εξώνια γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με την ταξινόμηση αυτή, τα lncrnas διακρίνονται σε πέντε κατηγορίες, οι οποίες ονομαστικά είναι τα antisense lncrnas, τα εσωνικά μετάγραφα, τα lincrnas (long intergenic ncrnas), τα lncrnas σχετιζόμενα με υποκινητές, και τα lncrnas που σχετίζονται (Kung et al., 2013). με τα UTRs (Ultra-conserved Regions) Τα lncrnas μπορούν να δρουν ως μοριακοί οδηγοί, κατευθύνοντας τα σύμπλοκα, τα οποία τροποποιούν τη χρωματίνη σε συγκεκριμένες θέσεις στο γονιδίωμα όπου και έχουν κατασταλτική ή ενεργοποιητική δράση στη γονιδιακή έκφραση. Μπορούν επίσης να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μεταγραφικά ή μετα-μεταγραφικά με ποικίλλους μοριακούς μηχανισμούς (Ghosal et al., 2013). Λόγω αυτών των ποικίλλων λειτουργιών, τα lncrnas παίζουν ρυθμιστικό ρόλο κλειδί τόσο σε φυσιολογικές διαδικασίες, όσο και στις κακοήθειες. 86

87 Τα lncrnas είναι απορρυθμισμένα σε διάφορους τύπους καρκίνου και τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων lncrnas συσχετίζονται με την υποτροπή της νόσου, τη μετάσταση και την πρόγνωση. Μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση συγκεκριμένων lncrnas προάγει τη διηθητική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου (Qiu et al., 2013) lncrnas και καρκίνος Παρόλο που τα mirnas αποτελούν τη μεγαλύτερη ομάδα ncrnas, η οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη και στην εξέλιξη του καρκίνου, άλλες ομάδες ncrnas έχουν πρόσφατα ανακαλυφθεί μεταξύ αυτών πολλά lncrnas. Μολονότι η βιολογική τους δράση δεν έχει πλήρως κατανοηθεί, μερικά lncrnas είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Για παράδειγμα, κάποια μεγάλα ncrnas, τα οποία βρίσκονται ανάμεσα σε γονίδια (large intergenic ncrnas, lincrnas), έχει βρεθεί ότι καταστέλλουν τη γονιδιακή έκφραση, στοχεύοντας τα PRC1 και PRC2 (σύμπλεγμα καταστολής polycomb 1 και 2) σε συγκεκριμένα γονίδια. Τα PRCs ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω τροποποιήσεων της χρωματίνης και είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη διατήρηση της πολυδυναμίας των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων καταστέλλοντας αναπτυξιακά γονίδια που απαιτούνται για τη διαφοροποίηση. Μία κεντρική θεωρία της καρκινογένεσης περιλαμβάνει την αποδιαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων σε έναν φαινότυπο, ο οποίος μοιάζει με αυτόν των βλαστικών κυττάρων, πιθανά μέσω μηχανισμών στους οποίους εμπλέκονται τα PRCs. Επομένως η στενή συσχέτιση των απορυθμισμένων lincrnas με τα PRCs υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο τέτοιων lincrnas στον καρκίνο. Ένα από τα πιο δημοσιευμένα παραδείγματα lincrna που σχετίζεται με τον καρκίνο και αλληλεπιδρά με το PRC2 είναι το Hox antisense intergenic RNA (HOTAIR). Το HOTAIR βρίσκεται στο γονίδιο HOXC και 87

88 συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού, στον κολοορθικό καρκίνο και στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Υπερέκφραση του HOTAIR σε κυτταρικές σειρές, που έχουν προέλθει από καρκίνο μαστού, παρουσιάζουν μεγαλύτερο διεισδυτικό δυναμικό σε in vitro δοκιμασίες (matrix invasion assay), όπως επίσης και όταν αυτά ενίονται σε ποντίκια. Αυτές οι παρατηρήσεις πιθανόν εξηγούν τη συσχέτιση υψηλής έκφρασης του HOTAIR σε καρκίνο μαστού, κολοορθικό καρκίνο και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα με τη μετάσταση και την επιβίωση. Το PCAT-1 1 (prostate cancer-associated ncrna transcript) είναι ένα ακόμη lncrna με γνωστή υπερέκφραση στον κολοορθικό καρκίνο. Το PCAT-1, όπως το HOTAIR, αλληλεπιδρά με το PRC2 προκειμένου να ρυθμίσει την έκφραση γονιδίων. Η υπερέκφραση του PCAT-1 έχει συσχετισθεί με την ανάπτυξη κολοορθικού καρκίνου και με χειρότερη συνολική επιβίωση ασθενών με την ίδια νόσο (Xie et al., 2016). Το PCA3 (prostate cancer antigen 3) είναι ένα ncrna, το οποίο μπορεί να βρεθεί σε ούρα ασθενών με καρκίνο προστάτη. Έχει ήδη αναπτυχθεί ως βιοδείκτης για τον καρκίνο του προστάτη και είναι διαθέσιμος εμπορικά. Η κυτταρική δράση του PC3 δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, αλλά αρκετές αναφορές προτείνουν ότι το PC3 ρυθμίζει τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου, στο οποίο βρίσκεται, του BMMCC1/PRUNE2 (Prune homolog 2). Δεδομένα για το ρόλο του στον κολοορθικό καρκίνο δεν είναι διαθέσιμα (Lai et al., 2017). Ένα ακόμη lncrna είναι το GAS5 (growth arrest specific 5), το οποίο είναι γνωστό ότι προσδένεται στον υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών, αποτρέποντας την αλληλεπίδρασή τους με τα στοιχεία απόκρισης γλυκοκορτικοειδών στο γονιδιωματικό DNA. Πρόσφατα, έχει διερευνηθεί κι έχει τεκμηριωθεί ο ρόλος του στον κολοορθικό καρκίνο. Το GAS5 έχει βρεθεί να υποεκφράζεται στον εν λόγω καρκίνο, η δε καταστολή της έκφρασής του συνδέεται με επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τη δημιουργία μεταστάσεων (Li et al., 2017; Xie et al., 2016). 88

89 1.10. T-UCRs (Transcribed Ultraconserved Regions, Μεταγραφόμενες Υπερσυντηρημένες Περιοχές) Τα υπερσυντηρημένα στοιχεία (ultraconserved elements, UCEs) στο ανθρώπινο γονιδίωμα ορίζονται ως τμήματα τουλάχιστον 200 βάσεων στο DNA, τα οποία ταιριάζουν απόλυτα με αντίστοιχες περιοχές στο γονιδίωμα του ποντικού και του επίμυος. Τα περισσότερα υπερσυντηρημένα στοιχεία είναι μη κωδικεύοντα και είναι εξελικτικά συντηρημένα για πάνω από 300 εκατομμύρια χρόνια, χρονική περίοδος που υπολογίζεται ότι οι πρόγονοι των θηλαστικών και των πτηνών απέκλιναν. Ο λόγος γι αυτή την εξαιρετική υπερσυντήρηση παραμένει ένα μυστήριο. Έχει υποτεθεί ότι αποτελούν ψυχρά σημεία για μεταλλάξεις ή περιοχές όπου κάθε σημείο βρίσκεται κάτω από ασθενή αλλά ανιχνεύσιμη αρνητική επιλογή. Ωστόσο, ανάλυση των συχνοτήτων των αλληλομόρφων που προκύπτουν δείχνει ότι αυτές οι περιοχές στην πραγματικότητα βρίσκονται κάτω από αρνητική επιλογή, η οποία είναι πολύ πιο έντονη σε σχέση με περιοχές που κωδικεύουν πρωτεΐνες (Katzman et al., 2007). Τα UCSs (ultraconserved cdna segments, υπερσυντηρημένα τμήματα cdna) διαφέρουν από τα UCEs στο ότι μπορούν να διατρέχουν πολλαπλά εξώνια, μία μικρή διαφορά που μπορεί να εξηγήσει το ρόλο της υπερσυντήρησης στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση. Συγκεκριμένα, βρίσκουμε μετάγραφα UCS να εμπλέκονται στη ρύθμιση κάθε μετα-μεταγραφικού σταδίου. Αυτά τα πολλαπλά επίπεδα ρύθμισης υπογραμμίζουν τη σημασία αυτών των UCS γονιδίων ως ρυθμιστές - κλειδιά της επεξεργασίας του RNA παγκοσμίως, όπως για παράδειγμα, στα μέλη της οικογένειας SR, τα οποία είναι απαραίτητοι ενεργοποιητές του ματίσματος. Οι ενδείξεις αυτές διαφωτίζουν την πολύπλευρη, καλά συντονισμένη και αυστηρή μεταμεταγραφική ρύθμιση γονιδίων οικογενειών συντηρημένων στην πλειονότητα των θηλαστικών (Sathirapongsasuti et al., 2011). 89

90 Τα εξώνια που κωδικεύουν πρωτεΐνες καταλαμβάνουν περίπου το 2% του γονιδιώματος. Το μεγαλύτερο επομένως μέρος των συντηρημένων αλληλουχιών του ανθρώπινου γονιδιώματος φαίνεται να είναι μη εξωνικό. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ενθέσεις κινητών στοιχείων έχουν ως αποτέλεσμα την εισαγωγή στο γονιδίωμα καινούριων, συντηρημένων μη εξωνικών στοιχείων. Οι Lowe et al. έδειξαν ότι τα κινητά στοιχεία έχουν συνεισφέρει στο 5,5% όλων των περιορισμένων μη εξωνικών στοιχείων που είναι μοναδικά στα θηλαστικά, προτείνοντας ότι τα κινητά στοιχεία έχουν παίξει σημαντικότερο ρόλο από αυτόν, που τους είχε αναγνωριστεί στη διαμόρφωση του τοπίου που αφορά στη γονιδιακή ρύθμιση κατά την εξέλιξη των θηλαστικών. Αυτές οι επαναληπτικές περιπτώσεις βρίσκονται κάτω από έντονη επιλογή από τουλάχιστον τον πρόγονο των βοροευθηρίων (100 εκατομμύρια χρόνια πριν). Συνήθως βρίσκονται σε γονιδιακές ερήμους και δείχνουν ισχυρή προτίμηση σε περιοχές που γειτνιάζουν με γονίδια, τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη και στη ρύθμιση της μεταγραφής. (Lowe et al., 2007). Οι υπερσυντηρημένες περιοχές (Ultra Conserved Regions, UCRs) αποτελούν 481 τμήματα DNA μεγαλύτερα των 200 βάσεων, τα οποία είναι 100% συντηρημένα στο γονιδίωμα του ανθρώπου, του μυός και του επίμυος και τα περισσότερα από αυτά έχουν ταυτοποιηθεί, ακόμα και στην όρνιθα και στο σκύλο, σε ποσοστά 95% και 99% αντίστοιχα (Σχ. 1.16) (Bejerano et al., 2004b). Μαζί με περισσότερες από αλληλουχίες άνω των 100 βάσεων, οι οποίες είναι απόλυτα συντηρημένες ανάμεσα στα τρία θηλαστικά που προαναφέρθηκαν, αντιπροσωπεύουν μία ομάδα γενετικών στοιχείων, των οποίων οι λειτουργίες και η εξελικτική τους καταγωγή δεν έχουν καθοριστεί ακόμα, αλλά είναι περισσότερο συντηρημένες ανάμεσα στα είδη σε σχέση με τις πρωτεΐνες και φαίνονται να είναι απαραίτητες για την οντογένεση των θηλαστικών και των σπονδυλωτών (Bejerano et al., 2004a). 90

91 Σχήμα Οι θέσεις για τα 481 υπερσυντηρημένα στοιχεία στα 24 ανθρώπινα χρωμοσώματα. Κάθε στοιχείο, το οποίο είναι μερικώς εξωνικό, αντιπροσωπεύεται από ένα μπλε σημάδι πάνω από το χρωμόσωμα, τα μη εξωνικά στοιχεία από ένα πράσινο σημάδι κάτω από το χρωμόσωμα και τα πιθανώς εξωνικά από ένα μαύρο σημάδι που διαπερνά το χρωμόσωμα. Με μωβ φαίνονται τα κεντρομερή των χρωμοσωμάτων. Όταν ενώσουμε δύο στοιχεία που απέχουν λιγότερο από 675kb σε μία ομάδα, τότε προκύπτουν 89 ομάδες με δύο ή περισσότερα στοιχεία, τα ονόματα των οποίων φαίνονται στο σχήμα. Τα ονόματα έχουν δοθεί από το κυρίαρχο γονίδιο που βρίσκεται στην ομάδα ή από το ορθόλογο της Drosophila ή από την καταχώρηση του mrna, αν δεν υπήρχε διαθέσιμο όνομα στο Human Genome Organization (HUGO). Ανάμεσα στις ομάδες που αντιπροσωπεύονται υπάρχει μία σαφής ενίσχυση των μη εξωνικών στοιχείων και για τα αναπτυξιακά γονίδια, γεγονός που δείχνει ότι πολλές από αυτές τις ομάδες μπορεί να αποτελούν μακρινούς ενισχυτές ή περιοχές παγκόσμιου ελέγχου (global control loci), όπως αντίστοιχα έχουν μελετηθεί σε σχέση με το HOXD και το DACH. Μία τέτοια πιθανή ομάδα κοντά στο ARX γονίδιο φαίνεται πιο αναλυτικά στο κάτω μέρος του σχήματος. Τα γνωστά γονίδια φαίνονται με μπλε (μεγάλα κουτιά για τα εξώνια, μικρά για τις UTRs και διακεκομμένες γραμμές για τα εσώνια) 91

92 και τα υπερσυντηρημένα στοιχεία φαίνονται κάτω από αυτά (Bejerano et al., 2004b). Ο μεγάλος βαθμός συντήρησης των UCRs υποδεικνύει ότι παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη βιολογία των θηλαστικών. Ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες: α) εξωνικά (μεταγραφόμενα), β) μη εξωνικά και γ) πιθανώς εξωνικά. Δύο ανεξάρτητες ομάδες έδειξαν ότι κάποιες UCRs που βρίσκονται σε εξώνια ρυθμίζουν την έκφρασή τους μέσω μη παραγωγικού εναλλακτικού ματίσματος εξωνίων, το οποίο οδηγεί σε αποδόμηση σε ανθρώπους και ποντίκια (Lareau et al., 2007; Ni et al., 2007). Επιπλέον, UCRs που βρίσκονται σε εσώνια (intronic) ή ανάμεσα σε γονίδια (intergenic) μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση άλλων γονιδίων με cis τρόπο, δρώντας ως ενισχυτές (Calin et al., 2007; Pennacchio et al., 2006). Το 2010 οι Mestdagh et al. επαναπροσδιόρισαν τις UCRs χρησιμοποιώντας πιο πρόσφατο χάρτη του ανθρώπινου γονιδιώματος, το hg18. Επανακατηγοριοποίησαν τις UCRs σε πέντε κατηγορίες, τις διαγονιδιακές, εσωνικές, εξωνικές, μερικώς εξωνικές και περιέχουσες εξώνια (Σχ. 1.17). Για μερικές UCRs ο γονιδιωματικός προσδιορισμός τους ποικίλλει εξαιτίας των ισομορφών των γονιδίων που επικαλύπτουν. Αυτές οι UCRs ονομάζονται πολλαπλές (multiple) (Mestdagh, Fredlund et al. 2010). Σχήμα Κατηγοριοποίηση των UCRs σύμφωνα με τη θέση τους στο γονιδίωμα σε σχέση με τα γονίδια που κωδικεύουν πρωτεΐνες. [Προσαρμογή από (Mestdagh et al., 2010). 92

93 Οι UCRs συχνά εντοπίζονται σε εύθραυστες περιοχές και περιοχές του γονιδιώματος που σχετίζονται με τον καρκίνο (cancer-associated genomic regions, CAGRs). Επιπλέον, σ αυτή την εξαιρετική συντήρηση των εν λόγω περιοχών τα τελευταία 400 εκατομμύρια χρόνια, πιθανολογείται ότι οι αναφερόμενες περιοχές θεωρούνται υποψήφια γονίδια που προδιαθέτουν σε καρκινογένεση (Calin, Liu et al. 2007). Παρόλο που μόνο 255 (47%) των UCRs είχαν αρχικά ταξινομηθεί ως μεταγραφόμενα (μέσα σε εξώνια) ή δυνητικά μεταγραφόμενα μέσω της αλληλοεπικάλυψής τους με κωδικεύοντα εξώνια (Bejerano et al., 2004b), οι Calin et al. στη συνέχεια έδειξαν ότι η πλειονότητα (68%) των UCRs μεταγράφονται σε ένα ή περισσότερους ιστούς (Calin et al., 2007). Αυτή η τελευταία κατηγορία των UCRs καθιερώθηκε να ονομάζεται ''Transcribed UCRs" (T-UCRs, Μεταγραφόμενα UCRs), και αποτελούν μία νέα κατηγορία ncrna. Το μήκος των μεταγραφόμενων τμημάτων των T-UCRs συχνά ξεπερνούν τις 2 kb (Calin et al., 2007). Κάποια T-UCRs, όπως το Uc338, μπορεί να μεταγράφονται ανεξάρτητα από τα γονίδια μέσα στα οποία βρίσκονται (Braconi et al., 2011), ενώ σε άλλα μεταγράφεται η μη κωδική αλυσίδα (antisense) του γονιδίου, στο οποίο βρίσκεται (συμβολίζεται με Α) (Calin et al., 2007). Τα επίπεδα έκφρασης των T-UCRs υποδεικνύουν ένα ιστοειδικό πρότυπο. Δεδομένα έκφρασης δείχνουν ότι οι T-UCRs διαφέρουν σε μεταγραφικό επίπεδο στην ογκογένεση και ακόμα ότι τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των T-UCRs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατηγοριοποίηση διαφόρων τύπων καρκίνου (Calin et al., 2007). Η κατανόηση του ρόλου των T-UCRs στον καρκίνο μπορεί να οδηγήσει σε νέες στρατηγικές πρόληψης, πρώιμης ανίχνευσης του καρκίνου και βελτιωμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. 93

94 Ρυθμιστικοί μηχανισμοί των T-UCRs Μέχρι τώρα η διαταραχή της έκφρασης των T-UCRs στον καρκίνο είχε συσχετισθεί με την αλληλεπίδραση με τα mirnas και με την υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων των υποκινητών (Esteller, 2011). Κάποια T-UCRs έχουν μεγάλου βαθμού συμπληρωματικότητα με mirnas, το οποίο οδηγεί στο σχηματισμό ζευγών T-UCR:miRNA. Τα σύμπλοκα αυτά παρεμβαίνουν στη λειτουργία των T-UCRs ενεργώντας σαν παγίδες των T-UCRs (Calin et al., 2007). Επίσης, επιγενετικοί μηχανισμοί ρυθμίζουν την έκφραση των T-UCRs. Κάποιες T-UCRs σχετίζονται με μεθυλίωση των CpG νησίδων στην περιοχή του υποκινητή των γονιδίων που επικαλύπτουν ή που γειτνιάζουν (Lujambio et al., 2010). Η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση των T-UCRs, ομοιάζοντας στην αποσιώπηση έκφρασης των mirnas (Lujambio & Esteller, 2009) Αλληλεπίδραση των T-UCRs με τα mirna Τα Uc160, Uc346A, και Uc348, τα οποία έχουν περισσότερο μελετηθεί, έχει βρεθεί ότι έχουν μεγάλου βαθμού συμπληρωματικότητα με επτά mirnas. Επιπλέον, η έκφραση αυτών των T-UCRs σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση των mirnas. Από τα παραπάνω εξάγεται το συμπέρασμα ότι αυτά τα ζευγάρια mirna:t-ucr μπορεί να αναστέλουν την έκφραση των T- UCRs, κατά τον ίδιο τρόπο που αλληλεπιδρούν τα ζευγάρια mirna mrna. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύθηκε ακόμα περισσότερο από δεδομένα in vitro και in vivo μελετών. In vitro, τα Uc160, Uc346A, και Uc348 κλωνοποιήθηκαν σε φορείς λουσιφεράσης, προκειμένου να προσδιοριστεί η αλληλεπίδρασή τους με τα mir-155, mir-24-1 και mir-29-b. Στα ζευγάρια mirna-t-ucr παρατηρήθηκε μείωση στην έκφραση λουσιφεράσης. In vivo, όταν λευχαιμικά κύτταρα MEG01 διαμολύνθηκαν με mir-155 η έκφραση των Uc346A και Uc160 μειώθηκε σημαντικά μετά από 48 h. Επομένως, τα T-UCRs 94

95 αποτελούν πιθανούς στόχους των mirnas (Calin et al., 2007). Η αλληλεπίδραση των T-UCRs με τα mirnas και κατά συνέπεια η αρνητική ρύθμισή τους έχει δειχθεί και στο νευροβλάστωμα (Scaruffi et al., 2009). Συγκεκριμένα, τα επίπεδα έκφρασης πέντε mirnas βρέθηκε ότι σχετίζονται αρνητικά με την έκφραση εννιά συμπληρωματικών T-UCRs. Αρκετές ενδείξεις υπάρχουν επίσης για τη μετα-μεταγραφική ρύθμιση των mirna από τα UcRNAs. Υπερέκφραση της Uc283A διαταράσσει το μηχανισμό επεξεργασίας του pri-mir-195 και μειώνει την παραγωγή του ώριμου mir-195, το οποίο οδηγεί στην επανακαταστολή πολλών στόχων του mir-195 που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό (Σχ. 1.18) (Liz & Esteller, 2016). Επίσης, στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχει βρεθεί ότι αποσιώπηση της Uc8A αύξησε την έκφραση του mir-596, το οποίο με τη σειρά του μείωσε την έκφραση της Uc283A και μάλιστα ταυτοποιήθηκε η YY1 (polycomb protein Yin Yang 1) ως ο ρυθμιστής της δέσμευσης του mir-596 με τη Uc8A (Terreri et al., 2016). Σχήμα Στα φυσιολογικά κύτταρα η Uc283Α μεταγράφεται (μη μεθυλιωμένη CpG νησίδα) και η συμπληρωματικότητά του με το pri- 95

96 mir195 αποτρέπει τη διάσπαση του mirna από τη Drosha. Με την αποσιώπηση των T-UCRs, που συμβαίνει λόγω υπερμεθυλίωσης των CpG νησίδων των υποκινητών τους και παρατηρείται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, δε ρυθμίζεται η παραγωγή ώριμου mir195 (προσαρμογή από (Liz & Esteller, 2016) T-UCRs και επιγενετικές τροποποιήσεις Όπως είναι γνωστό, η υποέκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, όπως είναι τα ογκοκατασταλτικά γονίδια στους καρκίνους στον άνθρωπο και ορισμένα mirnas με ογκοκατασταλτική δράση, συνδέεται άμεσα με την υπερμεθυλίωση CpG νησίδων στους υποκινητές (Jones & Baylin, 2007) (Lujambio & Esteller, 2007). Κατά τον ίδιο τρόπο οι T-UCRs υφίστανται επίσης επιγενετικές τροποποιήσεις. Οι T-UCRs Uc283A, Uc346 και Uc160 έχουν μία νησίδα CpG σε απόσταση 2000-bp ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής. Στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά κολοορθικού καρκίνου HCT-116, βρέθηκε υψηλού βαθμού μεθυλίωση στις νησίδες CpG, ενώ στους φυσιολογικούς ιστούς είναι μη μεθυλιωμένες. Μετά από επίδραση με απομεθυλιωτικό παράγοντα του DNA οι Uc283A, Uc346 και Uc160 ανέκτησαν τα επίπεδα έκφρασής τους στην κυτταρική σειρά HCT-116, ενώ αρχικά δεν ήταν ανιχνεύσιμα. Τα ίδια αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και στην κυτταρική σειρά HCT116 DKO, μία τροποποιημένη (isogenic) κυτταρική σειρά HCT Επιπλέον, οι Uc283A, Uc346 και Uc160 παρουσιάζουν μία διαμόρφωση χρωματίνης πιο προσπελάσιμη από το ένζυμο RNA πολυμεράση ΙΙ, καταλαμβάνεται επίσης από RNA πολυμεράση ΙΙ και συνοδεύεται από παρουσία τριμεθυλίωσης στη λυσίνη 4 της ιστόνης Η3. Η υπερμεθυλίωση των νησίδων CpG των Uc283A, Uc346 και Uc160 και η μεταγραφική τους αποσιώπηση έχει παρατηρηθεί και σε άλλες κυτταρικές σειρές, όπως του καρκίνου του μαστού (MCF-7, MDA-MB-231, CAMA-1), του καρκίνου του πνεύμονα (H552, H441, H358, EBC1), του λεμφώματος (Ramos, Raji, 96

97 Namalwa), και της λευχαιμίας (HL-60, Jurkat, KG-1a), το οποίο ενισχύει ακόμα περισσότερο τη σύνδεση υπερμεθυλίωσης των νησίδων CpG και της αποσιώπησης των T-UCRs (Lujambio et al., 2010). Υπάρχουν επίσης στοιχεία που δείχνουν ότι οι T-UCRs είναι επιγενετικά αποσιωπημένες και στον καρκίνο του προστάτη. Οι Hudson et al. μελέτησαν την κυτταρική σειρά LNCaP μετά από επίδραση με 5-AzaC, έναν απομεθυλιωτικό παράγοντα του DNA, και/ή TSA, έναν αναστολέα αποακετυλίωσης των ιστονών για 36 h. Ταυτοποίησαν έξι T-UCRs, τα Uc308A, Uc434A, Uc241A, Uc285, και Uc85, οι οποίες ρυθμίζονταν θετικά και στις τρεις ομάδες κυττάρων, στις οποίες είχαν επιδράσει με παράγοντες (στα κύτταρα που έλαβαν μόνο 5-AzaC, στα κύτταρα που έλαβαν μόνο TSA και στα κύτταρα που έλαβαν το συνδυασμό των παραγόντων). Ανάμεσα σε αυτά ήταν και η Uc283A, η οποία όπως αναφέρθηκε παραπάνω βρέθηκε ότι έχει υπερμεθυλιωμένη CpG νησίδα σε ανθρώπινη κυτταρική σειρά κολοορθικού καρκίνου (Hudson et al., 2013) Οι T-UCRs και σήματα στις ιστόνες Στη μελέτη των Mestdagh et al. εκτιμήθηκε ακόμα η κατανομή των αποστάσεων των H3K4me3 των ενδογονιδιακών και διαγονιδιακών T-UCRs. Βρέθηκε ότι και οι ενδογονιδιακές και οι διαγονιδιακές T-UCRs σχετίζονταν σημαντικά με ενεργή τριμεθυλίωση στη λυσίνη 4 των ιστονών H3 (H3K4me3), ένα σημάδι για την έναρξη της μεταγραφής, αλλά με κατανομή διαφορετική από αυτή των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, προτείνοντας διαφορετική οργάνωση της μεταγραφής των T-UCRs σε σχέση με τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επιπλέον, τα mirnas σχετίζονται επίσης με ενεργά σημάδια H3K4me3. Ο γονιδιωματικός τόπος αυτών των σημείων H3K4me3 για τα mirnas και τα T-UCRs είναι παρόμοιος, δείχνοντας τα κοινά χαρακτηριστικά που μοιράζονται αυτές οι 97

98 δύο τάξεις των ncrnas όσον αφορά στην οργάνωση της μεταγραφής (Mestdagh et al., 2010) T-UCRs και καρκίνος Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες ενδείξεις εμπλέκουν τα T- UCRs στον καρκίνο. Πρόσφατα έχει δειχθεί ότι το πρότυπο μεταγραφής των T-UCRs διαφέρει στους ανθρώπινους καρκίνους (Calin et al., 2007), όπως αυτός του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (Braconi et al., 2011), του καρκίνου του προστάτη (Hudson et al., 2013), του νευροβλαστώματος (Mestdagh et al., 2010), της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (Calin et al., 2007) και του κολοορθικού καρκίνου (Calin et al., 2007; Sana et al., 2012) και μάλιστα σχετίζεται και με την πρόγνωση των ασθενών (Mestdagh et al., 2010). Τα διαφορετικά μεταγραφικά επίπεδα στους διαφόρους τύπους καρκίνου καταδεικνύουν τον ρόλο τους στην ανάπτυξη και στην εξέλιξη της νόσου. (Πίνακας 1.3). Πίνακας 1.3. Έκφραση και δράση των T-UCRs και σε συμπαγείς όγκους και αιματολογικές κακοήθειες. Προσαρμογή από (Terracciano et al., 2017). T-UCR Γονιδιωματική θέση Τύπος καρκίνου Έκφραση T- UCR Βιολογική ή μοριακή δράση στον καρκίνο KD σε J82 κύτταρα αναστέλλει τον Uc8 Chr.1p36.22 Ουροδόχου κύστης Υπερέκφραση πολλαπλασιασμό, τη μετακίνηση και τη μετανάστευση, προάγοντας την καρκινογένεση Uc73 Chr.2q22.3 Κολοορθικός καρκίνος Υποέκφραση Σχετίζεται με κακή πρόγνωση Uc73 Chr.2q22.3 Νευροβλάστωμα Υπερέκφραση Μονοπάτι απόκρισης 98

99 της TP53: αποπτωτική δράση KD σε COLO-320 κύτταρα αυξάνει τον Uc73A Chr.2q22.3 Κολοορθικός καρκίνος Υπερέκφραση αριθμό των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G1: αποπτωτική δράση KD οδηγεί σε Uc106 Chr.2q31.1 Καρκίνος προστάτη Υπερέκφραση υποέκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση Εμπλέκεται σον πολλαπλασιασμό, τη διήθηση και την αναστολή Uc300A Chr.10q24.31 Νευροβλάστωμα Υπερέκφραση διαφοροποίησης κυτταρικών σειρών νευροβλαστώματος πριν την επίδραση με ATRA KD μειώνει την αύξηση των Uc338 Chr.12q13.13 Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Υπερέκφραση καρκινικών κυττάρων που εξαρτάται ή όχι από την προσκόλληση των κυττάρων KD αναστέλλει τη μετανάστευση και Uc338 Chr.12q13.13 Κολοορθικός καρκίνος Υπερέκφραση διήθηση των κυττάρων SW480 και HCT116: προάγει τη διήθηση και μετάσταση 99

100 Uc388 Chr.15q21.3 Κολοορθικός καρκίνος Υποέκφραση Σχετίζεται με εντόπιση στο αριστερό κόλον Ενεργοποιημένο από Uc460 Chr.Xp22.11 Νευροβλάστωμα Υπερέκφραση ενισχυμένο MYCN στους όγκους Uc269A Chr.9q33.3 Uc160 Uc215 Uc346A Chr.5q14.1 Chr.7p14.1 Chr.12q23.3 Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Υπερέκφραση Σχετίζονται με πρόγνωση της νόσου Uc348 Chr.13q21.33 Uc58A Uc202A Uc207A Uc223A Chr.2p16.1 Chr.6q16.3 Chr.7p15.3 Chr.7q31.1 Υπερέκφραση Σχετίζονται με την εξέλιξη από φυσιολογικό οισοφάγο σε οισοφάγο Barrett KD οδηγεί σε Uc214 Chr.7p14.3 Υποέκφραση Uc161A Chr.5q14.1 Αδενοκαρκίνωμα Barrett καρκινογένεση του οισοφάγου Barrett Uc165A Chr.5q14.3 Υποέκφραση Uc327A Chr.11p13 Σχετίζονται με την Uc153A Uc158A Chr.5q13.2 Chr.5q14.1 εξέλιξη από πλακώδη οισοφάγο σε καρκινογένεση του Uc206A Chr.7p15.3 Υπερέκφραση οισοφάγου Barrett Uc274A Chr.9q33.3 Uc472A Chr.Xp

101 Uc473A Chr.Xq13.1 Uc347 Chr.13q21.33 Uc350 Chr.13q21.33 Uc279 Chr.9q33.3 Εμπλέκονται σε όγκους Uc460 Chr.Xp22.11 Νευροβλάστωμα Υπερέκφραση με ενισχυμένο MYC (MYCN-amplified, Uc379 Chr.14q32.2 MNA) Uc446 Chr.19q12 Uc364 Chr.14q12 ATRA: all trans-retinoic acid, KD: knock down, A σημαίνει μεταγραφή της T-UCR με αντίθετη κατεύθυνση ως προς το γονιδιωματικό προσανατολισμό (από τα τελομερή προς το κεντρομέρος για το βραχύ βραχίονα και από το κεντρομέρος προς τα τελομερή για το μακρύ βραχίονα του χρωμοσώματος) Οι T-UCRs στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Υπάρχουν 56 T-UCRs, οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί ότι έχουν επηρεασμένο πρότυπο έκφρασης στα καρκινικά κύτταρα HepG2 σε σχέση με τα φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα, με 33 από αυτές να έχουν αυξημένη έκφραση και 23 μειωμένη έκφραση (Πίνακας 1.3). Η πιο σημαντική αλλαγή που παρατηρείται είναι αυτή στη Uc338, της οποίας η έκφραση είναι αυξημένη κατά 7 φορές (Braconi, Valeri et al. 2011). Για να εμβαθύνουν στο λειτουργικό ρόλο της Uc338 οι Braconi et al. πραγματοποίησαν ανάλυση των mrnas, των οποίων η έκφραση άλλαζε μετά από αναστολή της Uc338 με sirna (Braconi et al., 2011). Τα αποτελέσματα δείχνουν κυρίως επίδραση σε γονίδια που μπλέκονται στην μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από τη φάση G1 στη φάση S. Αυτή η επίδραση φάνηκε και σε ανθρώπινα και σε κύτταρα ποντικού. Η αναστολή της Uc338 μείωσε την ανάπτυξη και τον αριθμό των κυττάρων 101

102 ηπατοκυτταρικού καρκινώματος που βρίσκονταν στη φάση S. Είναι γνωστό πως η αναστολή της Uc338 επάγει την αυξημένη έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16ink4a και τη μείωση των CDK4, CDK6 και της κυκλίνης D1, τα οποία συμμετέχουν στη ρύθμιση της εξέλιξης της φάσης S. Επομένως, η Uc338 βρίσκεται αυξημένη στα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και, ίσως, αποτελεί έναν υποσχόμενο βιοδείκτη για το νεόπλασμα αυτό Οι T-UCRs στον καρκίνο του προστάτη Όπως έδειξαν οι Hudson et al., οι T-UCRs έχουν διαφορές στην έκφραση και στον καρκίνο του προστάτη (Πίνακας 1.3). (Hudson et al., 2013). Συστηματική ανάλυση μικροσυστοιχιών έδειξε ότι πολλές T-UCRs έχουν διαφορετική έκφραση στους καρκινικούς σε σχέση με τους μη νεοπλασματικούς ιστούς, σε όγκους με υψηλό Gleason σκορ ( 7) σε σχέση με αυτούς με χαμηλό σκορ ( 6) και σε όγκους με μετάσταση σε σχέση με τους μη μεταστατικούς. Η μελέτη της προβλεπτικής τους αξίας ταυτοποίησε 60 T- UCRs, των οποίων η έκφραση μπορεί με βεβαιότητα να διακρίνει νεοπλασματικούς από μη νεοπλασματικούς ιστούς. Οι Uc363A και Uc 454A ήταν οι σημαντικότερες T-UCRs που ρυθμίζονταν θετικά και αρνητικά αντίστοιχα. Μόνο ορισμένα UcRNAs είχαν διαφορετική έκφραση ανάμεσα στα διαφορετικά στάδια του καρκίνου του προστάτη. Για παράδειγμα, η Uc106A ρυθμίζεται θετικά στους όγκους του προστάτη και αρνητικά σε όγκους με υψηλό Gleason σκορ και εξωπροστατική επέκταση (Hudson et al., 2013). 102

103 Οι T-UCRs στο νευροβλάστωμα Οι ασθενείς με νευροβλάστωμα, στους οποίους υπάρχει ενίσχυση του MYCN (MYCN Proto-Oncogene, BHLH Transcription Factor), έχουν συνήθως επιθετική νόσο με ραγδαία πρόοδο και κακή πρόγνωση. Η έκφραση των T- UCRs σχετίστηκε με την πρόγνωση και με την ενίσχυση του MYCN στο νευροβλάστωμα. Επτά T-UCRs (Uc347, Uc350, Uc279, Uc460, Uc379, Uc446, και Uc364) ρυθμίζονται θετικά στους όγκους που έχουν ενισχυμένο το MYCN (Πίνακας 1.3). Οι Mestdagh et al. βρήκαν ότι τρεις από τις επτά T-UCRs (Uc460, Uc350, και Uc379) αυξάνουν σημαντικά την έκφρασή τους σε σχέση με τις υπόλοιπες τέσσερις, προτείνοντας ότι αποκρίνονται στο MYCN (Mestdagh et al., 2010). Κάποιες T-UCRs έχουν βρεθεί ότι εμπλέκονται στη βλάβη του DNA, τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την ανάπτυξη και την ανοσοαπόκριση. (Mestdagh et al., 2010). Οι Scaruffi et al. έχουν δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης 9 T-UCRs συνδέονται αντίστροφα με την έκφραση 5 συμπληρωματικών micrornas, δείχνοντας μία αρνητική ρύθμιση των T- UCRs λόγω άμεσης αλληλεπίδρασης με τα micrornas (Scaruffi, Stigliani et al. 2009) Οι T-UCRs στη λευχαιμία Οι T-UCRs φαίνεται επίσης να εμπλέκονται στις αιματολογικές κακοήθειες (Calin et al., 2007). Η μοριακή υπογραφή για την χρόνια λεμφογενή λευχαιμία αποτελείται από 19 T-UCRs, με οχτώ από αυτά να ρυθμίζονται θετικά και 11 από αυτά να ρυθμίζονται αρνητικά (Πίνακας 1.3). Ανάμεσα σε αυτά, η έκφραση των Uc291 και Uc73A ήταν σημαντικά υψηλότερη στα φυσιολογικά CD5+/CD19+ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα 103

104 λευχαιμικά κύτταρα, αποτέλεσμα που επιβεβαιώνεται και σε άλλες μελέτες (Calin, Ferracin et al. 2005; Volinia, Calin et al. 2006) Οι T-UCRs στον κολοορθικό καρκίνο Χαρακτηριστικά πρότυπα έκφρασης T-UCRs έχουν επίσης περιγραφεί και για τον στον κολοορθικό καρκίνο (Πίνακας 1.3). Οι Uc73, Uc29A, Uc111, Uc112, Uc134A, Uc206, Uc230, Uc292, Uc339, Uc341, Uc388, Uc399A και Uc420A έχουν βρεθεί ότι υπερεκφράζονται στον κολοορθικό καρκίνο σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (Calin et al., 2007). Η Uc73 φαίνεται να λειτουργεί ως ογκογονίδιο σε κυτταρικές σειρές κολοορθικού καρκίνου, ενώ η αντίθετη απορύθμιση, που παρατηρείται σε δύο διαφορετικούς τύπους καρκίνου, καταδεικνύει μία πιθανή ογκο-ειδική δράση αυτής T-UCR (Fabbri, Garzon et al. 2008). Οι Calin et al. διερεύνησαν την επίδραση της αρνητικής ρύθμισης του Uc73 χρησιμοποιώντας sirna στην κυτταρική σειρά COLO-320 (Calin et al., 2007). Η παραπάνω θεραπεία οδήγησε σε αύξηση του κλάσματος των κυττάρων που βρίσκονταν στη G1 φάση. Επιπλέον, θετικά συσχετίστηκαν ο βαθμός αναστολής της Uc73 με την ένταση των αποτελεσμάτων της κυτταρικής απόπτωσης. Αξιοσημείωτο είναι ότι, σύμφωνα με τη δημοσίευση των Mestdagh et al. που αναφέρθηκε παραπάνω, η Uc73 κατατάσσεται στο μονοπάτι απόκρισης στο TP53, ενισχύοντας ακόμα περισσότερο το ρόλο της στην απόπτωση (Mestdagh, Fredlund et al. 2010). Αντιθέτως, άλλη μελέτη έχει δείξει πως τα επίπεδα των Uc73 και Uc388 είναι χαμηλότερα σε δείγματα κολοορθικού καρκίνου σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Επίσης, τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της Uc73 σχετίστηκαν με τη συνολική επιβίωση των ασθενών, ενώ η χαμηλή έκφραση της Uc388 σχετίστηκε με την εντόπιση του καρκίνου στο αριστερό κόλον (Sana et al., 2012). 104

105 Επιπλέον, οι Lujambio et al. αναγνώρισαν πέντε T-UCRs (Uc283A, Uc346, Uc160, Uc282A, Uc469A και Uc392A), οι οποίες είναι αποσιωπημένες λόγω μεθυλίωσης στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου (Lujambio et al., 2010). Προσδιορίζοντας τα επίπεδα μεθυλίωσης στο φυσιολογικό ιστό έδειξαν ότι οι Uc283A, Uc346 και Uc160 είναι μεθυλιωμένες μόνο στον καρκινικό ιστό (Lujambio et al., 2010) T-UCRs σε άλλους τύπους καρκίνου Δαταραχές της έκφρασης T-UCRs έχουν επίσης περιγραφεί και σε άλλες κακοήθειες (Πίνακας 1.3). Υπερέκφραση των Uc283 και Uc63 έχουν περιγραφεί στα γλοιώματα και σε καρκινώματα μαστού μοριακού υποτύπου Α, αντιστοίχως (Galasso et al., 2014) (Marini et al., 2016). Μάλιστα, στον καρκίνο του μαστού η υπερέκφραση της Uc63 έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση (Marini, Lena et al. 2016). Επιπρόσθετα, οι T-UCRs φαίνεται να εμπλέκονται και στην παθογένεια του οισοφάγου Barrett και του αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου. Για τις T-UCRs Uc58, Uc202, Uc207 και Uc223 έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζονται, σε αντίθεση με την Uc214, η οποία φαίνεται ότι ρυθμίζεται αρνητικά (Fassan et al., 2014). Διαταραχές στην έκφραση και την λειτουργία διαφόρων T-UCRs έχουν περιγραφεί και για άλλους συμπαγείς όγκους, όπως ο καρκίνος του παγκρέατος, της ουροδόχου κύστεως και του στομάχου. Συγκεκριμένα, οι Uc190, Uc233 και Uc270 έχουν βρεθεί να υπερεκφράζονται στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος, ενώ η αποσιώπησή τους μειώνει τον πολλαπλασιασμό έως και 60% (Jiang et al., 2016b). Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, μία άλλη T-UCRs, η Uc8 έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται, αλληλεπιδρά με το mir596, συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου και οδηγεί στην υπερέκφραση της MMP9 (Olivieri et al., 2016). Τέλος, στον καρκίνο του στομάχου, έχει δειχθεί πως η έκφραση της Uc416A αυξάνει (Goto et al., 2016). 105

106 106

107 ΣΚΟΠΟΣ Οι T-UCRs Uc160, Uc283 και Uc346 έχουν βρεθεί ότι είναι αποσιωπημένες στον καρκίνο παχέος εντέρου λόγω μεθυλίωσης. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν: α) ο προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των T- UCRs σε καρκινικούς και παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς ασθενών με κολοορθικό καρκίνο και η διερεύνηση της σχέσης τους με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, β) ο προσδιορισμός των επιπέδων μεθυλίωσης των T-UCRs σε καρκινικούς και παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς ασθενών με κολοορθικό καρκίνο και η διερεύνηση της σχέσης τους με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, το χρόνο μέχρι την πρόοδο της νόσου και την επιβίωση, γ) ο προσδιορισμός των επιπέδων μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα και στα ούρα υγιών ατόμων και ασθενών με αδενώματα ή φλεγμονή στο παχύ έντερο, η σύγκριση με αυτά των ασθενών με κολοορθικό καρκίνο, προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή διαγνωστική τους αξία και δ) η λειτουργική μελέτη T-UCRs της υπερέκφρασης των T-UCRs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου στον πολλαπλασιασμό, τη μετακίνηση και τη μετανάστευση των κυττάρων, προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος τους στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. 107

108 108

109 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 109

110 110

111 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στο παρακάτω σχήμα φαίνεται διαγραμματικά ο σχεδιασμός της μελέτης που αφορά το μεταφραστικό μέρος της διατριβής. Σχήμα 2.1. Ο σχεδιασμός της μελέτης που περιγράφει το μεταφραστικό μέρος της διατριβής. 111

112 2.1. Ασθενείς και δείγματα Οι συμμετέχοντες στη μελέτη ήταν ασθενείς ή υγιείς, οι οποίοι εξετάστηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών από το Νοέμβριο του 2012 ως τον Απρίλιο του 2014, και πιο συγκεκριμένα στο Γαστρεντερολογικό Τμήμα, στη Χειρουργική Κλινική και στο Ογκολογικό Τμήμα της Παθολογικής Κλινικής. Οι ασθενείς που συμμετείχαν είχαν επιβεβαιωμένο ιστολογικά αδενοκαρκίνωμα ή αδένωμα παχέος εντέρου ή ορθού, ενώ οι υγιείς είχαν υποστεί κολονοσκοπικό έλεγχο, ο οποίος απέκλειε την ύπαρξη αδενώματος ή αδενοκαρκινώματος. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Έρευνας, Ηθικής και Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών (Παράρτημα Ι). Όλοι οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν σχετικά με τη μελέτη και έδωσαν γραπτή συγκατάθεση (Παράρτημα IΙ). Συνολικά συμμετείχαν στη μελέτη 64 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου ή ορθού, 59 ασθενείς με αδενώματα παχέος εντέρου ή ορθού, 40 υγιή άτομα και 12 ασθενείς με φλεγμονή του εντέρου ή εκκολπωματίτιδα. Τα δείγματα αυτά συνελέγησαν προοπτικά. Από τους 64 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο ελήφθησαν δείγματα καρκινικού ιστού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού, τα οποία εμβαπτίσθησαν σε υγρό προστασίας από ένζυμα διάσπασης RNA, RNA later (Sigma Aldrich, Austria) και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 C. Δείγματα από αδενώματα ελήφθησαν από 6 ασθενείς με αδενώματα, τα οποία επίσης εμβαπτίσθησαν σε RNA later και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 C. Όλοι οι συμμετέχοντες φλεβοκεντήθηκαν και το αίμα συλλέχθηκε σε σωληνάρια K2EDTA Vacuette (Greiner BioOne, Germany). Τα δείγματα συλλέχθηκαν πριν την κολονοσκόπηση (Γαστρεντερολογικό Τμήμα) ή πριν τη χειρουργική εκτομή του όγκου (Χειρουργική Κλινική) ή πριν την έναρξη της θεραπείας (Ογκολογικό Τμήμα). Μέσα σε 2 ώρες από τη συλλογή τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν για 20 λεπτά στις 3000 g στους 4 C, το 112

113 πλάσμα αφαιρέθηκε και μοιράστηκε σε κατάλληλα σημασμένα σωληνάρια και αποθηκεύτηκε στους -80 C. Επιπλέον του αίματος, ούρα συνελέγησαν ταυτόχρονα (μέχρι 100 ml) και φυγοκεντρήθηκαν για 20 λεπτά στις 3000 g στους 4 C εντός δύο ωρών από τη συλλογή, το υπερκείμενο αφαιρέθηκε προκειμένου να είναι ελεύθερο κυττάρων, μοιράστηκε σε κατάλληλα σημασμένα σωληνάρια και αποθηκεύτηκε στους -80 C. Για όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη συνελέγησαν δημογραφικά δεδομένα (Πίνακας 2.1) και κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά (για τους ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο) (Πίνακας 2.2) (Παράρτημα ΙΙI). Πίνακας 2.1. Δημογραφικά χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων (προοπτική συλλογή δειγμάτων). Δημογραφικά χαρακτηριστικά Ασθενείς με Ασθενείς με καρκίνο αδένωμα Ασθενείς με φλεγμονή Υγιείς Άνδρας 33 (66%) 38 (64,4%) 6 (50%) 12 (30%) Φύλο Γυναίκα 17 (34%) 21 (35,6%) 6 (50%) 28 (70%) (32%) 20 (33,9%) 4 (33,3%) 24 (60%) Ηλικία (68%) 39 (66,1%) 8 (66,6%) 16 (40%) Όχι 16 (32%) 30 (50,8%) 6 (50%) 32 (80%) Κάπνισμα Οικογενειακό ιστορικό καρκίνου Κατανάλωση Ναι 9 (18%) 23 (39%) 5 (41,7%) 8 (20%) Όχι 7 (14%) 25 (42,4%) 5 (41,7%) 19 (47,5%) Ναι 13 (26%) 26 (44,1%) 6 (50%) 17 (42,5%) Όχι 7 (14%) 9 (15,3%) 1 (8,3%) 6 (15%) 113

114 καφέ Ναι 13 (26%) 43 (72,9%) 10 (83,3%) 34 (85%) Κατανάλωση αλκοόλ Όχι 16 (32%) 26 (44,1%) 5 (41,7%) 22 (55%) Ναι 8 (16%) 29 (49,1%) 6 (50%) 18 (45%) <2 φορές/εβδ 6 (3%) 9 (15,3%) 2 (16,7%) 7 (17,5%) Κατανάλωση κρέατος >2 και<4/εβδ 3 (96%) 31 (52,5%) 3 (25%) 14 (35%) >4/εβδ 11 (22%) 11 (18,6%) 5 (41,7%) 18 (45%) Λίγη 13 (26%) 36 (61%) 7 (58,3%) 22 (55%) Άσκηση Καθόλου- Μέτρια- Έντονη 11 (22%) 18 (30,5%) 4 (33,3%) 18 (45%) Πίνακας 2.2. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών με κολοορθικό καρκίνο (προοπτική συλλογή δειγμάτων). Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών (%) Άνδρες 35 (54,7%) Φύλο Γυναίκες 29 (45,3%) (20,3%) Ηλικία (79,7%) I 3 (4,7%) II 25 (39,1%) Στάδιο III 26 (40,1%) 114

115 IV 6 (9,4%) Υψηλή 7 (10,9%) Βαθμός διαφοροποίησης Μέτρια 48 (78,5%) Χαμηλή 1 (1,6%) Δεξιό κόλον 27 (42,2%) Εντόπιση Αριστερό κόλον και σιγμοειδές 12 (18,8%) Ορθό 21 (32,8%) Διήθηση λεμφαδένων Απομακρυσμένη μετάσταση Όχι 29 (45,3%) Ναι 31 (48,4%) Όχι 50 (78,1) Ναι 6 (9,4%) Επιπλέον των προοπτικά συλλεγέντων δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκαν 97 δείγματα κολοορθικών αδενοκαρκινωμάτων από το αρχείο του Παθολογοανατομικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Αυτά τα δείγματα ιστού ήταν μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (formalin fixed- paraffin embedded, ffpe). Τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα

116 Πίνακας 2.3. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά ασθενών με κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα (αναδρομική συλλογή ffpe δειγμάτων). Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών (%) Άνδρες 59 (60,8%) Φύλο Γυναίκες 38 (39,2%) (20,6%) Ηλικία (79,4%) II 43 (44,3%) III 48 (49,5%) Στάδιο IV 6 (6,2%) Υψηλή 17 (17,5%) Βαθμός διαφοροποίησης Μέτρια 71 (73,2%) Χαμηλή 9 (9,3%) Δεξιό κόλον 27 (27,8%) Εντόπιση Αριστερό κόλον και σιγμοειδές 41 (42,3%) Ορθό 29 (29,9%) Διήθηση λεμφαδένων Όχι 43 (44,3%) Ναι 54 (55,7%) Απομακρυσμένη μετάσταση Όχι 91 (93,8%) Ναι 6 (6,2%) 116

117 2.2. Έκφραση των T-UCRs Απομόνωση RNA από φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Ολικό RNA απομονώθηκε από 80 mg καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού από 51 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο, καθώς επίσης και από 2 αδενώματα χρησιμοποιώντας το σύστημα αντιδραστηρίων PerfectPure RNA Tissue Kit (5Prime, Hamburg, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αρχικά, ο φρεσκοκατεψυγμένος ιστός (fresh frozen, ff) κονιορτοποιήθηκε σε γουδί με υγρό άζωτο. Ογδόντα mg κονιορτοποιημένου ιστού προστέθηκαν σε σωληνάριο 1,5 ml (epp) που περιείχε 800 μl διάλυμα λύσης και 8 μl TCEP (0,5 M), προκειμένου να λυθούν τα κύτταρα και να περιοριστεί η δράση της ενδογενούς RNάσης. Ακολούθησε ανάμειξη με vortex και προσθήκη 20 μl πρωτεϊνάσης K. Τα δείγματα επωάστηκαν στον πάγο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια φορτώθηκαν σε στήλες (PRECLEAR column) και φυγοκεντρήθηκαν για 1 λεπτό στα 400 g, προκειμένου το διάλυμα λύσης να απαλλαχθεί από κομμάτια ιστού. Το διήθημα φορτώθηκε σε καινούρια στήλη που συγκρατεί τα νουκλεϊκά οξέα (Purification column) και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g. Στη στήλη προστέθηκαν 400 μl διαλύματος Wash 1 και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g. Ακολούθησε πέψη του DNA πάνω στη στήλη προσθέτοντας 50 μl διαλύματος DNάσης για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πέρας των 15 λεπτών η DNάση απενεργοποιήθηκε με διάλυμα DNase Wash και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 1 λεπτό στα g. Στη στήλη προστέθηκαν 200 μl διαλύματος Wash 2 και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g. Το βήμα αυτό πραγματοποιήθηκε 2 φορές και τη δεύτερη φορά η φυγοκέντρηση διήρκεσε 2 λεπτά. Στο τελευταίο βήμα η στήλη μεταφέρθηκε σε καθαρό και κατάλληλα σημασμένο epp και το RNA εκλούστηκε με 50 μl Elution Buffer και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. 117

118 Πέψη του DNA Αμέσως μετά την απομόνωση του RNA, ακολούθησε επιπλέον πέψη του DNA με DNase (Ambion, Austin, TX, USA). Επειδή οι T-UCRs που μεταγράφονται δεν περιέχουν εξώνια, είναι σημαντικό τα δείγματα RNA να είναι πλήρως απαλλαγμένα από DNA, ώστε στην qpcr να ποσοτικοποιήσουμε την έκφραση και όχι τυχόν DNA. Για το σκοπό αυτό, στα 50 μl RNA προστέθηκαν 5,66 μl Dnase I Buffer (1/10 του όγκου της αντίδρασης) και 1 μl (2 U) Dnase I και τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 C για 20 λεπτά. Μετά την επώαση η αντίδραση απενεργοποιήθηκε με την προσθήκη 6.29 μl DNase inactivation reagent (1/10 του τελικού όγκου) για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με συχνή ανάμειξη και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 2 λεπτά στα g. Το υπερκείμενο RNA μεταφέρθηκε σε νέο epp κατάλληλα σημασμένο και ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση φασματοφωτόμετρου Nanodrop-1000 (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA). Στη συνέχεια τα δείγματα RNA αποθηκεύτηκαν τους -80 C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία τους Σύνθεση cdna Για τη σύνθεση cdna χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ολοκληρωμένων αντιδραστηρίων αντίστροφης μεταγραφής Superscript III Reverse Transcriptase (Life Technologies). Αρχικά, 5 μg RNA επωάστηκαν μαζί με 300 ng τυχαίους εκκινητές (Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας, Κρήτη) και 5 nm dntps (Stratagene) στους 65 C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε πάγο για 10 λεπτά και σε κάθε δείγμα προστέθηκε 1Χ first strand buffer, 5 mm DTT, 20 U αναστολέας Rnασών (Rnasin Ribonuclease Inhibitor, Promega) και 100 U Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκε σε συνολικό όγκο 50 μl. 118

119 Ως αρνητικό δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε αντίδραση χωρίς ένζυμο, το οποίο σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) θα πρέπει να είναι αρνητικό, για να επιβεβαίωσει ότι τα δείγματα δεν περιείχαν DNA. Χρησιμοποιήθηκε επίσης θετικό δείγμα ελέγχου RNA αναφοράς (Human Reference RNA, Stratagene, La Jolla, CA, USA), για το οποίο γίνεται η ίδια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής και χρησιμοποιήθηκε αργότερα για ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων των PCR ανάμεσα σε διαφορετικές ομάδες αντιδράσεων αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription, RT) (calibrator). Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στο θερμικό κυκλοποιητή C1000 Touch (Biorad) αρχικά στους 25 C για 5 λεπτά, ακολούθως στους 50 C για 60 λεπτά και τέλος στους 70 C για 15 λεπτά, για να σταματήσει η αντίδραση. Τα δείγματα cdna που συντέθηκαν αραιώθηκαν με H2O σε τελική συγκέντρωση 30 ng/μl και φυλάχθηκαν στους -20 C Ποσοτικοποίηση της έκφρασης των T-UCRs Για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των T-UCRs χρησιμοποιήθηκε η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qrt- PCR, Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction) με χρήση διπλά σημασμένων ιχνηθετών. Η μέθοδος καλείται Real-Time PCR (PCR πραγματικού χρόνου), γιατί δίνεται η δυνατότητα παρακολούθησης της αύξησης του φθορισμού, άρα και του προϊόντος της αντίδρασης, σε κάθε κύκλο, μέσω μιας καμπύλης ενίσχυσης (amplification plot), η οποία δείχνει την αλλαγή στο φθορισμό ανά κύκλο. Ο κύκλος της PCR, στον οποίο αυξάνεται ο φθορισμός πάνω από έναν ουδό, εξαρτάται από την αρχική ποσότητα του στόχου που υπήρχε στην αντίδραση PCR. Οπότε η πληροφορία αυτή χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση του αρχικού αριθμού αντιγράφων. Ο ιχνηθέτης για κάθε T-UCR είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο σχεδιασμένο να προσδένεται σε συγκεκριμένη αλληλουχία ανάμεσα από τους δύο εκκινητές και είναι σημασμένος με ένα φθοριόχρωμα στο 5 άκρο του (6-119

120 FAM) και με ένα μόριο απόσβεσης (BHQ1) στο 3 άκρο, ώστε να μη φθορίζει, όταν είναι ακέραιος. Αυτό συμβαίνει, διότι τα δύο μόρια στα άκρα του, δότης στο 5 άκρο και μόριο απόσβεσης στο 3 άκρο, βρίσκονται κοντά. Αντίθετα, όταν το μόριο δότης απομακρυνθεί από το μόριο απόσβεσης μέσω της δράσης εξωνουκλεάσης της πολυμεράσης DNA κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, φθορίζει έντονα (Σχ. 2.2 ). Αυξανομένων των κύκλων της αντίδρασης, η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη του προϊόντος της PCR που παράγεται. (Σχ. 2.3). Σχήμα 2.2. Σχηματική αναπαράσταση του τρόπου λειτουργίας των διπλά σημασμένων ιχνηθετών κατά τους επαναλαμβανόμενους κύκλους της PCR. 120

121 Σχήμα 2.3. Καμπύλες ενίσχυσης (amplification plots) κατά τη qrt-pcr. Calibrator: RNA αναφοράς - θετικό δείγμα ελέγχου της αντίστροφης μεταγραφής και της PCR, No RT: αρνητικό δείγμα ελέγχου της αντίστροφης μεταγραφής για ύπαρξη DNA (χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση), NTC: αρνητικό δείγμα ελέγχου της PCR (χωρίς υπόστρωμα). Για τις αντιδράσεις του γονιδίου αναφοράς πραγματοποιήθηκε qrt- PCR με χρήση της SYBR Green I, μια χρωστική η οποία προσδένεται μη ειδικά σε δίκλωνο DNA (ds DNA) (Σχ. 2.4 ). Επειδή η SYBR Green I συνδέεται και στα μη ειδικά προϊόντα, στο τέλος της αντίδρασης πραγματοποιείται μια καμπύλη αποδιάταξης όπου το προϊόν της PCR υποβάλλεται σε σταδιακά αυξανόμενη θερμοκρασία μέχρι την πλήρη αποδιάταξή του. Η θερμοκρασία αποδιάταξης (όπου δηλαδή έχει αποδιαταχθεί το 50% του προϊόντος) είναι χαρακτηριστική για κάθε προϊόν PCR και εξαρτάται από το μήκος του και το ποσοστό GC. Έτσι, χρησιμοποιώντας τις καμπύλες αποδιάταξης, επιτυγχάνεται διαφοροποίηση μεταξύ των ειδικών και μη ειδικών προϊόντων (Σχ. 2.5). 121

122 Σχήμα 2.4. Σχηματική αναπαράσταση του τρόπου λειτουργίας της χρωστικής SYBR Green I κατά τους επαναλαμβανόμενους κύκλους της PCR. F: φθορίζουσα χρωστική SYBR Green I, Taq: πολυμεράση DNA. calibrator NTC δείγματα Σχήμα 2.5. Καμπύλες αποδιάταξης (dissociation curves) κατά τη RT-PCR. Calibrator: RNA αναφοράς- θετικό δείγμα ελέγχου της αντίστροφης μεταγραφής και της PCR, NTC: αρνητικό δείγμα ελέγχου της PCR (χωρίς υπόστρωμα). 122

123 Ο προσδιορισμός της έκφρασης των T-UCRs πραγματοποιήθηκε με ειδικούς εκκινητές της εταιρείας Primer Design (Primer-Design Ltd, Hants, UK). Η μέθοδος τροποποιήθηκε με τη χρήση διπλά σημασμένων ιχνηθετών, οι οποίοι σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία των προϊόντων που παράγονταν με τη χρήση των εκκινητών της Primer Design. Στον Πίνακα 2.4 φαίνονται οι θέσεις των t-ucrs στο γονιδίωμα και στον Πίνακα 2.5 φαίνονται οι αλληλουχίες των εκκινητών και των ιχνηθετών, καθώς επίσης και το μήκος των προϊόντων και η θερμοκρασία σύνδεσης. Για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν τρεις ίδιες αντιδράσεις, ώστε να υπάρχουν 3 μετρήσεις (triplicates) για κάθε T-UCR. Η αντίδραση έγινε σε όγκο 20μl και αποτελούνταν από: 1x TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 150 nm από κάθε μείγμα εκκινητών και 5μl cdna (150ng αρχική ποσότητα RNA). Οι συνθήκες των αντιδράσεων ήταν: 95 C για 10 λεπτά, 45 κύκλους στους 95 C για 15 δευτερόλεπτα και στους 60 C για 1 λεπτό. Οι αντιδράσεις έγιναν στον κυκλοποιητή MX3000P (Stratagene, La Jolla, USA). Πίνακας 2.4. Τα T-UCRs που μελετήθηκαν και οι θέσεις τους σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Ucbase 2.0 ( T- UCR Χρωμό -σωμα Uc160 5 Uc Uc Τύπος Μη εξωνική Μη εξωνική Πιθανώ ς εξωνική Έναρξη Λήξη Γονίδιο Έναρξη Γονίδιο Λήξη hg18 καθοδι hg18 ανοδικά κά AK AP3B AJ ERCC RPC2 RFX4 Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε η μεταγραφόμενη επαναλαμβανόμενη αλληλουχία Alu-sq, καθώς έχει αποδειχθεί κατάλληλο 123

124 γονίδιο αναφοράς σε πειράματα με καρκινικά δείγματα και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είναι δημοσιευμένοι από τους Rihani et al. (Rihani et al., 2013). Οι εκκινητές συντέθηκαν από τη Eurofins Genomics (Bayern, Germany) και οι αλληλουχίες τους φαίνονται στον Πίνακα 2.5. Οι αντιδράσεις έγιναν σε όγκο 20μl και αποτελούνταν από: 1x KAPA Sybr Fast Master Mix (KAPA BIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA), 300 nm από κάθε εκκινητή, 1Χ χρωστική αναφοράς ROX (KAPA BIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA), και 5μl cdna (150ng cdna). Οι συνθήκες των αντιδράσεων ήταν: 95 C για 3 λεπτά, 40 κύκλους στους 95 C για 3 δευτερόλεπτα και στους 57 C για 30 δευτερόλεπτα και στο τέλος ένα στάδιο αυξανομένων θερμοκρασιών προκειμένου να παραχθεί η καμπύλη αποδιάταξης των προϊόντων. Οι αντιδράσεις έγιναν στον κυκλοποιητή MX3000P (Stratagene, La Jolla, USA). Πίνακας 2.5. Αλληλουχίες εκκινητών και ιχνηθετών που χρησιμοποιήθηκαν στην qrt-pcr. Εκκινητές/ Ιχνηθέτες Αλληλουχία (5-3 ) Μήκος προϊόντος (bp) Θερμοκρασία Σύνδεσης ( o C) Alu-sq FRW Alu-sq REV Uc160 FRW Uc160 REV Uc160 probe Uc283 FRW Uc283 REV Uc283 probe Uc346 FRW Uc346 REV Uc346 probe CATGGTGAAACCCCGTCTCTA GCCTCAGCCTCCCGAGTAG AGTAAATGAGGCGAGTGTGC GGCGGTGGATGGATGAGAT ACTCCTTTCTGAACCAAACGGCAT GATTGGATCAAATCACATAAACTGC GTACGGGCTATTATCCTGGTG TTACAGAACCAATTATGCGCCATTAGACTTG CTT CGTTGCTAATGCTATAATAGAAGGG GAAAAGCCGCCTCCGAAAA AGGGCTGGGATTGCGTCGCTCTGA Το πρόγραμμα, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της ποσοτικής PCR και τον υπολογισμό των αρχικών ποσοτήτων των δειγμάτων, είναι το LinRegPCR (v. 11.0) και διατίθεται 124

125 δωρεάν στο διαδίκτυο ( (Ramakers et al., 2003). Το πρόγραμμα χρησιμοποιεί δεδομένα φθορισμού ανά κύκλο για κάθε δείγμα και υπολογίζει την απόδοση της αντίδρασης για κάθε δείγμα (Σχ. 2.6). Για τον υπολογισμό της αρχικής συγκέντρωσης κάθε δείγματος χρησιμοποιείται ο μέσος όρος των αποδόσεων όλων των δειγμάτων και η τιμή Ct (Cycle threshold, κατώφλιος κύκλος) κάθε δείγματος, σύμφωνα με τον τύπο Ν0=threshold/(Eff_mean^Ct), όπου Ν0 η αρχική συγκέντρωση για κάθε δείγμα, εκφρασμένη σε αυθαίρετες μονάδες φθορισμού, threshold ο ουδός φθορισμού που χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί ο Ct κάθε δείγματος, Eff_mean ο μέσος όρος των αποδόσεων των αντιδράσεων των δειγμάτων και Ct ο αριθμός των κύκλων που χρειάζεται κάθε δείγμα για να φτάσει τον κατώφλιο φθορισμό. Σχήμα 2.6. Παράθυρο ανάλυσης των δεδομένων Real Time PCR του προγράμματος LinRegPCR. Στο γράφημα φαίνεται η ευθεία του λογάριθμου των τιμών φθορισμού ανά κύκλο, η κλίση της οποίας δίνει την απόδοση της αντίδρασης. Στο ίδιο παράθυρο δίνονται η απόδοση για κάθε δείγμα, ο βαθμός συσχέτισης (R) για τη γραμμική παλινδρόμηση καθώς και τα σημεία που περιλαμβάνει κάθε ευθεία, αυτά που θα δώσουν την απόδοση της αντίδρασης. 125

126 Κάθε ομάδα αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής (RT) αναλύθηκε με το λογισμικό LinRegPCR και υπολογίστηκε η αρχική ποσότητα cdna (άρα και mrna) του κάθε γονιδίου σε κάθε δείγμα. Η τιμή της αρχικής ποσότητας που προέκυψε ομαλοποιήθηκε ως προς την αντίστοιχη τιμή του calibrator, ώστε να ομαλοποιηθούν διαφορές μεταξύ των διαφορετικών αντιδράσεων RT. Τέλος, η ομαλοποιημένη ως προς το calibrator τιμή που προέκυψε για κάθε δείγμα για κάθε T-UCR ομαλοποιήθηκε με την αντίστοιχη τιμή της αρχικής ποσότητας για το γονίδιο αναφοράς Alu-sq του δείγματος Μεθυλίωση των T-UCRS Επιλογή της μεθόδου ανάλυσης της μεθυλίωσης MeDIP (Methylated DNA Immunoprecipitation) Μία από τις πολλές μεθόδους ανάλυσης του μεθυλιωμένου DNA είναι η MeDIP (Methylated DNA Immunoprecipitation), δηλαδή η ανοσοκατακρήμνιση του μεθυλιωμένου DNA. Η μέθοδος αυτή είναι μία μέθοδος ανοσοδέσμευσης, στην οποία χρησιμοποιείται ένα αντίσωμα έναντι της μεθυλιωμένης 5-κυτοσίνης του DNA για να ανοσοκατακρημνίσει τμήματα μεθυλιωμένου γονιδιωματικού DNA. Το αντίσωμα είναι ακινητοποιημένο πάνω σε σφαιρίδια (Σχ. 2.7). Η μεθυλίωση συγκεκριμένων γονιδίων ανιχνεύεται στη συνέχεια με PCR, χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους εκκινητές. Εναλλακτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ευρείας γονιδιωματικής ανάλυσης τεχνικές ή ακόμα και τεχνικές αλληλούχισης επόμενης γενιάς. 126

127 Σχήμα 2.7. Συνοπτική περιγραφή της μεθόδου MeDIP (Active Motif) Απομόνωση DNA Προκειμένου να δοκιμάσουμε τη συγκεκριμένη μέθοδο, χρησιμοποιήσαμε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων MeDIP της Active Motif. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται συνοπτικά στο σχήμα 2.8. Πιο συγκεκριμένα, προηγήθηκε απομόνωση DNA από ολικό αίμα με το σύστημα αντιδραστηρίων της Qiagen, Qiamp DNA Blood Mini kit σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρείας. Αρχικά, 400 μl ολικού αίματος ασθενή αναμείχθηκαν με 40 μl Qiagen protease και 400 μl AL buffer και επωάστηκαν στους 56 o C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 400 μl αιθανόλης και αναμείχθηκαν. Το μείγμα φορτώθηκε σε στήλη, η οποία ήταν τοποθετημένη σε σωληνάκι συλλογής και περιέχει μεμβράνη, η οποία δεσμεύει τα νουκλεϊκά οξέα. Οι στήλες φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 g για 1 λεπτό και το διήθημα 127

128 απορρίφθηκε. Οι στήλες εκπλύθηκαν με 500 μl AW1 buffer και φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 g για 1 λεπτό. Ακολούθησε άλλη μία έκπλυση με 500 μl AW2 buffer και φυγοκέντρηση στις g για 3 λεπτά. Η έκλουση του DNA έγινε με προσθήκη 200 μl buffer AE, επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό και φυγοκέντρηση στις 6000 g για 1 λεπτό. Το DNA ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση του φασματοφωτόμετρου Nanodrop-1000 (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA). Το DNA που απομονώθηκε στη συνέχεια κατατμήθηκε σε τμήματα βάσεων, όπως απαιτούσε η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης. Για την κατάτμηση του DNA πραγματοποιήθηκε κατεργασία με υπερήχους 8 παλμών για 10 δευτερόλεπτα ο καθένας με εύρος 3, αφού πρώτα δοκιμάστηκαν διαφορετικός αριθμός παλμών, διάρκειας και εύρους. Τα τμήματα DNA ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης, ώστε να ελεγχθούν τα μεγέθη. Το πήκτωμα παρασκευάστηκε με SB buffer (70,7 mm βορικό οξύ και 10 mm NaOH) και είχε 1% περιεκτικότητα σε αγαρόζη (Invitrogen) και 0,01% v/v βρωμιούχο αιθίδιο. Το πήκτωμα ηλεκτροφορήθηκε στα 100 V για 45 λεπτά Ανοσοκατακρήμνιση DNA Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν 500 ng DNA, τα οποία αναμείχθηκαν με 10 μl buffer C και επωάστηκαν στους 95 o C για 10 λεπτά. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε πάγο και επωάστηκαν για άλλα 10 λεπτά. Προστέθηκαν 1 μl PIC, 2 μl αντισώματος 5-μεθυλκυτοσίνης και 2 μl αντισώματος - γέφυρας σε τελικό όγκο 100 μl. Τέλος, προστέθηκαν 25 μl μαγνητικών σφαιριδίων πρωτεΐνης G και τα δείγματα επωάστηκαν ολονύκτια στους 4 o C με παράλληλη συνεχόμενη περιστροφή. Παράλληλα με τα δείγματα, η διαδικασία πραγματοποιήθηκε για αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες. Στον αρνητικό μάρτυρα προστέθηκαν όλα τα αντιδραστήρια, εκτός από το αντίσωμα 5-μεθυλκυτοσίνης, και στο θετικό μάρτυρα χρησιμοποιήθηκαν όλα τα αντιδραστήρια και το DNA, το οποίο παρέχεται ως θετικός μάρτυρας από 128

129 το σύστημα αντιδραστηρίων. Την επόμενη μέρα, τα σφαιρίδια εκπλύθηκαν 3 φορές με 200 μl παγωμένου buffer C και 2 φορές με 200 μl παγωμένου buffer D, με τη βοήθεια μιας μαγνητικής βάσης, για να συγκρατήσει τα μαγνητικά σφαιρίδια με τα δεσμευμένα τμήματα μεθυλιωμένου DNA. Η έκλουση έγινε με 50 μl elution buffer AM2 με επώαση στους 4 o C με παράλληλη συνεχόμενη περιστροφή. Στο έκλουμα τελικά προστέθηκαν 50 μl neutralization buffer. Τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -20 o C μέχρι τη χρήση τους Ανάλυση μεθυλίωσης Η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση της μεθυλίωσης του DNA έγινε με qpcr. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν κατάλληλοι εκκινητές για τις τρεις T- UCRs και χρησιμοποιήθηκαν και άλλοι από τη βιβλιογραφία για αντιδράσεις - θετικών (H19 ICR) και αρνητικών (UBE2B) μαρτύρων ως προς την απομόνωση του DNA και την ανοσοκατακρήμνιση του μεθυλιωμένου DNA (Mohn et al., 2009). Οι εκκινητές καθώς και οι θερμοκρασίες σύνδεσης φαίνονται στον Πίνακα 2.6. Πίνακας 2.6. Αλληλουχίες και πληροφορίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR μετά τη MeDIP. Εκκινητές Αλληλουχία (5-3 ) Μήκος προϊόντος (bp) Θερμοκρασία Σύνδεσης ( o C) Uc160 FRW Uc160 REV Uc283 FRW Uc283 REV GAGTTACACCGAGTCAACGC TGGAGACTTGGGTCCCTC AAACGAGCGGAAGTTTCC ΑAGTCAGGATCTATTCCAGTG AAG C C Uc346 FRW GGGGTAATCCGCCTTTCTC C 129

130 Uc346 REV H19ICR FRW H19ICR REV UBE2B FRW UBE2B REV AGCAAGCTGCGTCTCCTG GAGCCGCACCAGATCTTCAG TTGGTGGAACACACTGTGATC A CTCAGGGGTGGATTGTTGAC TGTGGATTCAAAGACCACGA C C Οι εκκινητές συντέθηκαν από τη Eurofins Genomics (Bayern, Germany). Οι αντιδράσεις έγιναν σε όγκο 20 μl και αποτελούνταν από: 1x KAPA Sybr Fast Master Mix (KAPA BIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA), 300 nm από κάθε εκκινητή, 1Χ χρωστική αναφοράς ROX (KAPA BIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA) και 1 μl DNA. Οι συνθήκες των αντιδράσεων ήταν: 95 C για 3 λεπτά, 40 κύκλους στους 95 C για 3 δευτερόλεπτα και στους 57 C για 30 δευτερόλεπτα και στο τέλος ένα στάδιο αυξανομένων θερμοκρασιών προκειμένου να παραχθεί η καμπύλη αποδιάταξης των προϊόντων. Οι αντιδράσεις έγιναν στον κυκλοποιητή MX3000P (Stratagene, La Jolla, USA). Παράλληλα με τις αντιδράσεις για τα δείγματα, το θετικό και τον αρνητικό μάρτυρα, για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε μία επιπλέον αντίδραση με υπόστρωμα εισαγωγικό DNA, δηλαδή DNA που προέκυψε από την απομόνωση, πριν την ανοσοκατακρήμνιση. Συμπεριλήφθηκε, επίσης, καμπύλη αναφοράς με συγκεντρώσεις 3,3, 0,33, 0,033 και 0,0033 ng/μl. Η τελική ποσότητα υπολογίστηκε ως ποσοστό σε σχέση με το εισαγωγικό DNA, δηλαδή πόσο εμπλουτισμένο ήταν τελικά το δείγμα σε μεθυλιωμένο DNA των περιοχών ενδιαφέροντος. 130

131 Διθειώδης μετατροπή Μία άλλη μέθοδος ευρέως χρησιμοποιούμενη για την ανάλυση της μεθυλίωσης είναι μέσω διθειώδους μετατροπής (bisulfite conversion). Η αρχή της διθειώδους μετατροπής βασίζεται στη διαφορετική αντίδραση μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων κυτοσινών με το διθειώδες νάτριο, ώστε μετά την αντίδραση μόνο οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες μετατρέπονται σε ουρακίλες (Σχ. 2.8). Η μετατροπή μπορεί να ανιχνευθεί με πληθώρα μεθόδων, από απλούστερες, όπως είναι η MSP (Methylation Specific PCR), έως μικροσυστοιχίες και αλληλούχιση επόμενης γενιάς. Τα πλεονεκτήματα της μεθοδολογίας αυτής περιλαμβάνουν την ποσοτικοποίηση, την ανάλυση ενός συγκεκριμένου CpG και την ανίχνευση της μεθυλίωσης που είναι ειδική ως προς συγκεκριμένη αλυσίδα (sense ή anti-sense, νοηματική ή μη νοηματική). Λεπτομέρειες για τη μέθοδο αυτή περιγράφονται στα , και Σχήμα 2.8. Σχηματική περιγραφή της διθειώδους μετατροπής. 131

132 Επιλογή της μεθόδου ανάλυσης της μεθυλίωσης Στο σχήμα 2.9 φαίνονται οι καμπύλες ενίσχυσης για τη Uc283 του DNA της κυτταρικής σειράς H358 («εισαγωγικό DNA») και μετά από την ανοσοκατακρήμνιση του μεθυλιωμένου DNA των H358. Οι δύο καμπύλες φαίνονται σχεδόν παρόμοιες, κάτι που δείχνει ότι σχεδόν όλα τα τμήματα της Uc283, που υπάρχουν στο γονιδίωμα των H358 κυττάρων και τα ενισχύουν οι εκκινητές είναι μεθυλιωμένα. Σχήμα 2.9. Καμπύλες ενίσχυσης για τη Uc283 του «εισαγωγικού DNA» και του μεθυλιωμένου DNA των H358 κυττάρων. Στο σχήμα 2.10 φαίνονται οι αντίστοιχες καμπύλες ενίσχυσης για τη Uc283 του DNA περιφερικού αίματος ασθενή με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου («εισαγωγικό DNA») και μετά από την ανοσοκατακρήμνιση του μεθυλιωμένου DNA του ίδιου δείγματος. Η καμπύλη για τη Uc283 του μεθυλιωμένου DNA ξεκινάει να ανεβαίνει σχεδόν 4 κύκλους αργότερα από το «εισαγωγικό DNA», το οποίο δείχνει ότι βρίσκεται σε πολύ μικρή αναλογία η μεθυλιωμένη Uc283 στο αίμα του ασθενή σε σχέση με τη μη μεθυλιωμένη. Το εύρημα αυτό είναι αναμενόμενο, εφόσον στο δείγμα του περιφερικού αίματος είναι πολύ μεγαλύτερη η ποσότητα του DNA των 132

133 λευκοκυττάρων, παρά του κυκλοφορούντος DNA, το οποίο θεωρητικά περιλαμβάνει και το DNA που εκλύεται από τον όγκο και είναι μεθυλιωμένο. Ωστόσο, είναι πολύ θετικό για την ευαισθησία της μεθόδου, το ότι η μεθυλιωμένη Uc283 ανιχνεύεται πολύ νωρίς κατά τη Real Time PCR. Οι καμπύλες ενίσχυσης για τις Uc160 και Uc346 ήταν αντίστοιχες με αυτές της Uc283. Σχήμα Καμπύλες ενίσχυσης για τη Uc283 του «εισαγωγικού DNA» και του μεθυλιωμένου DNA ασθενή με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου. Κατά την επιλογή της μεθόδου που θα ακολουθείτο για την ανάλυση της μεθυλίωσης, αναδείχθησαν τα παρακάτω μειονεκτήματα της μεθόδου MeDIP σε σχέση με τη διθειώδη μετατροπή: Α) Υπάρχει η πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, εξαιτίας της τυχόν μη ειδικής δέσμευσης του αντισώματος στο μη μεθυλιωμένο DNA, ενώ στη διθειώδη μετατροπή δεν υπάρχει αυτή η πιθανότητα, γιατί δεν χρησιμοποιείται αντίσωμα. 133

134 Β) Δεν υπάρχει η δυνατότητα ποσοτικοποίησης, τουλάχιστον με μεγάλη ακρίβεια, λόγω της αναγωγής σε ποσοστό του 10% του «εισαγωγικού DNA», το οποίο είναι αυθαίρετο, ενώ στη διθειώδη μετατροπή υπάρχει η δυνατότητα ακριβούς ποσοτικοποίησης. Γ) Η μέθοδος MeDIP απαιτεί μονόκλωνο DNA, το οποίο επιτυγχάνεται δύσκολα σε περιοχές με υψηλό ποσοστό σε CG βάσεις, οι οποίες είναι οι περισσότερες περιοχές που μελετώνται, μειώνοντας την απόδοση της μεθόδου, ενώ στη διθειώδη μετατροπή δεν υπάρχει ο περιορισμός για μονόκλωνο DNA, καθιστώντας δυνατή τη μελέτη οποιασδήποτε περιοχής, ακόμα και με υψηλό ποσοστό σε CG βάσεις. Για όλους τους παραπάνω λόγους, η μέθοδος που επιλέχθηκε για την ανάλυση της μεθυλίωσης είναι η μέθοδος της διθειώδους μετατροπής Μεθυλίωση των T-UCRs στους ιστούς Μεθυλίωση των T-UCRs στους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Απομόνωση του DNA από τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Για την απομόνωση του DNA από τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων Nucleospin Tissue (Macherey-Nagel, Düren, Germany), το οποίο χρησιμοποιεί στήλες με μεμβράνη σιλικόνης που συγκρατούν το DNA. Οι νεοπλασματικοί και παρακείμενοι στον όγκο μη νεοπλασματικοί ιστοί που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από 64 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο, στους οποίους είχε πραγματοποιηθεί χειρουργική αφαίρεση του όγκου. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν 6 αδενώματα, τα οποία είχαν αφαιρεθεί κατά τη διάρκεια κολονοσκόπησης και είχαν αποσταλεί για παθολογοανατομική διάγνωση. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν σύμφωνη με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συγκεκριμένα, 25 mg ιστού (κονιορτοποιημένου σε γουδί με 134

135 υγρό άζωτο) αναμείχθηκαν με 180 μl Buffer T1 (διάλυμα λύσης που περιέχει SDS αποδιατακτικό) και 25 μl proteinase K και επωάστηκαν στους 56 C για 3 ώρες. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 200 μl Buffer B3, ακολούθησε ανάμειξη του μείγματος και επώαση για 10 λεπτά στους 70 C. Μετά την επώαση προστέθηκαν 210 μl αιθανόλη (100%) και το δείγμα, αφού αναμείχθηκε, φορτώθηκε σε στήλη και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g. Ακολούθησαν 2 εκπλύσεις της στήλης με 500 μl Buffer BW και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και με 600 μl Buffer B5 και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Ακολούθησε μία ακόμα φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g, προκειμένου η μεμβράνη της στήλης να στεγνώσει καλά. Η έκλουση του DNA έγινε με 30 μl προθερμασμένου στους 70 C Buffer BE, επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Η ποσότητα του DNA που εκλούστηκε προσδιορίστηκε με τη χρήση του φασματοφωτόμετρου Nanodrop-1000 (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA) και αποθηκεύθηκε στους -20 C Διθειώδης μετατροπή του ιστικού DNA Για τη διθειώδη μετατροπή του ιστικού DNA χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων Qiagen Epitect DNA bisulfite (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συγκεκριμένα, η αντίδραση έγινε στον κυκλοποιητή MX3000P (Stratagene, La Jolla, USA) σε τελικό όγκο 140 μl και περιείχε 1 μg ιστικό DNA, 85 μl bisulfite mix (το μείγμα για τη μετατροπή των αμεθυλίωτων κυτοσινών), 35 μl DNA protect buffer (διάλυμα για την προστασία του DNA) και H2O. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν 5 λεπτά στους 95 C (αποδιάταξη), 25 λεπτά στους 60 C, 5 λεπτά στους 95 C, 1 ώρα και 25 λεπτά στους 60 C, 5 λεπτά στους 95 C και 2 ώρες και 55 λεπτά στους 60 C. Μετά την επώαση στον κυκλοποιητή, η αντίδραση μεταφέρθηκε σε 1,5 ml epp και προστέθηκαν 560 μl buffer BL. Το μείγμα φορτώθηκε σε στήλη Epitect και φυγοκεντρήθηκε στις g για 1 λεπτό. Ακολούθησε έκπλυση 135

136 της στήλης με 500 μl buffer BW και φυγοκέντρηση στις g για 1 λεπτό. Με προσθήκη 500 μl buffer BD και επώαση 15 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου έγινε η αποθειοποίηση (desulfonation) του DNA. Η στήλη φυγοκεντρήθηκε στις g για 1 λεπτό και εκπλύθηκε 2 φορές με 500 μl buffer BW και φυγοκέντρηση στις g για 1 λεπτό. Ακολούθησε άλλη μία φυγοκέντρηση στις g για 1 λεπτό προκειμένου η μεμβράνη στη στήλη να στεγνώσει καλά. Η έκλουση του τροποποιημένου DNA έγινε με 40 μl ΕΒ buffer και φυγοκέντρηση στις g για 1 λεπτό. Το τροποποιημένο DNA αραιώθηκε στη συνέχεια σε συνολικό όγκο 200 μl και αποθηκεύτηκε στους - 20 C Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του DNA Για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης των T-UCRs 160, 283 and 346 χρησιμοποιήθηκε η ποσοτική και πραγματικού χρόνου PCR ειδική για μεθυλίωση (quantitative Methylation Specific PCR, qmsp) με χρήση διπλά σημασμένων ιχνηθετών. Οι εκκινητές και οι ιχνηθέτες σχεδιάστηκαν με βάση τις αλληλουχίες που δίνονται στο NCBI ( αφού πρώτα τροποποιήθηκαν με το πρόγραμμα MethPrimer (Li & Dahiya, 2002), το οποίο προσομοιάζει το DNA μετά τη διθειώδη μετατροπή και τη μετατροπή των αμεθυλίωτων κυτοσινών σε ουρακίλες. Χρησιμοποιώντας το Ucbase 2.0 ( ελέγχθηκαν οι αλληλουχίες των εκκινητών και ιχνηθετών, ώστε να μην προσδένονται σε αλληλουχία που περιέχει μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) με συχνότητα ελάσσονος αλληλομόρφου μεγαλύτερη από 0,01 (Lomonaco et al., 2014). Οι ιχνηθέτες σχεδιάστηκαν με την τεχνολογία Locked Nucleic Acid (LNA) νουκλεοσιδίων, προκειμένου να αυξηθεί η εξειδίκευση στην πρόσδεση των κυτοσινών και να ανιχνεύουν μόνο το μεθυλιωμένο. Τα LNA είναι ανάλογα νουκλεοσιδίων, στα οποία ο δακτύλιος ριβόζης «κλειδώνει» από μία γέφυρα μεθυλενίου, η οποία συνδέει το 2 -O με το 4 -C, κάνοντας τη σύνδεση με το συμπληρωματικό νουκλεοτίδιο πιο 136

137 γρήγορη και το διμερές πιο σταθερό. Η θερμοκρασία αποδιάταξης για τους ιχνηθέτες, στους οποίους έχουν ενσωματωθεί LNA βάσεις, είναι υψηλότερη. Οι εκκινητές και οι ιχνηθέτες σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να προσδένονται σε τουλάχιστον δύο CGs και ανάμεσα στους εκκινητές και τον ιχνηθέτη για κάθε T-UCR να μην υπάρχει CG, με αποτέλεσμα το προϊόν να είναι πλήρως μεθυλιωμένο. Οι θερμοκρασίες υβριδισμού και η συμπληρωματικότητα των εκκινητών και των ιχνηθετών ελέγχθηκαν με τη χρήση του OligoAnalyzer, έκδοση 3.1 της IDT. Αφού σχεδιάστηκαν οι εκκινητές και οι ιχνηθέτες, ελέγχθηκε η ειδικότητα των αλληλουχιών για τα συγκεκριμένα T-UCRs με τη διαδικτυακή πλατφόρμα bisearch (Aranyi & Tusnady, 2007). Όλοι οι εκκινητές συντέθηκαν από την εταιρεία Eurofins Genomics (Bayern, Germany), ενώ οι ιχνηθέτες συντέθηκαν από την εταιρεία Sigma- Aldrich (Taufkirchen, Germany) Στον Πίνακα 2.7 φαίνονται οι αλληλουχίες των εκκινητών και των ιχνηθετών που χρησιμοποιήθηκαν. Οι αντιδράσεις qpcr έγιναν εις τριπλούν για κάθε δείγμα σε τελικό όγκο 20 μl, και περιείχαν 5μl τροποποιημένου DNA, 1 TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 300 nm κάθε εκκινητή και 75 nm κάθε ιχνηθέτη. Κάθε σετ qpcr περιελάμβανε τρία δείγματα ελέγχου: ένα αρνητικό δείγμα ελέγχου της PCR, ένα μη μεθυλιωμένο δείγμα (DNA από αίμα υγιή δότη που είχε υποστεί διθειώδη μετατροπή) και ένα πλήρως μεθυλιωμένο δείγμα (DNA από αίμα υγιή δότη που είχε μεθυλιωθεί in vitro με το ένζυμο SsI methylase, NEB Ipswich, MA και είχε υποστεί διθειώδη μετατροπή: IVD- in vitro methylated DNA). Με διαδοχικές αραιώσεις του IVD (100%, 10%, 1%, and 0,1%) κατασκευάστηκε καμπύλη αναφοράς για τον έλεγχο της μεθόδου σε κάθε PCR. Επιπλέον, για την ομαλοποίηση των δεδομένων, πραγματοποιήθηκε μία επιπλέον αντίδραση για τη β-ακτίνη για κάθε δείγμα με εκκινητές και ιχνηθέτη που έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν σε αντίστοιχες μελέτες μεθυλίωσης (devos et al., 2009) (βλ. Πίνακα 2.7). 137

138 Πίνακας 2.7. Αλληλουχίες εκκινητών και ιχνηθετών για τη qmsp. Εκκινητές/ Ιχνηθέτες Αλληλουχία (5-3 ) Μήκος προϊόντος Θερμοκρασία σύνδεσης ( o C) Uc160 FRW ACGTTTATTCGGCGTC Uc160 REV Uc160 probe Uc283 FRW Uc283 REV Uc283 probe Uc346 FRW Uc346 REV Uc346 probe b-actin FRW b-actin REV b-actin probe CAACCCAAACTACGACC FAM/TTG +CGGTTT +CGTTTTA+CGA/BHQ1 ATTCGTTTTCGGGATTTGTTAG CAAAACCACCGACTCCG FAM/T+CGTTTTTTT+CGGGT +CGGTTGTT/BHQ1 ACGGCGTTAGGGATTTCG CGAATTACCCCGAATACTTTAACC FAM/TTT +CGTTTT +CGT +CG+CGGT T/BHQ1 GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA FAM/ACCACCACCCAACACACAATAAC AAACACA/BHQ C: βάση LNA (Locked Nucleic Acid) Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν στους 95 C για 10 λεπτά, 50 κύκλοι στους 95 C για 15 δευτερόλεπτα και στους 60 C για 1 λεπτό (στον παραπάνω Πίνακα φαίνονται οι θερμοκρασίες σύνδεσης για κάθε T-UCR). Κάθε ομάδα αντίδρασης αναλύθηκε με το λογισμικό LinRegPCR, προκειμένου να υπολογιστούν τα επίπεδα μεθυλίωσης κάθε T-UCR σε κάθε δείγμα. Οι τιμές που προέκυψαν ομαλοποιήθηκαν ως προς την αντίστοιχη τιμή του IVD στο συγκεκριμένο σετ, ώστε να ομαλοποιηθούν διαφορές μεταξύ των διαφορετικών αντιδράσεων διθειώδους μετατροπής. Τέλος, η ομαλοποιημένη ως προς το IVD τιμή που προέκυψε για κάθε δείγμα για κάθε T-UCR ομαλοποιήθηκε με την αντίστοιχη τιμή β-ακτίνης του δείγματος. 138

139 Μεθυλίωση των T-UCRs στους FFPE ιστούς Προκειμένου να μελετηθεί η σχέση της μεθυλίωσης των T-UCRs με την υποτροπή της νόσου και την επιβίωση των ασθενών, συλλέχθηκαν 97 FFPE δείγματα κολοορθικού καρκίνου από το Παθολογοανατομικό Τμήμα του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών και τα δεδομένα των ασθενών αναζητήθηκαν στο Ογκολογικό Τμήμα του Νοσοκομείου Απομόνωση του DNA από τους FFPE ιστούς Για την απομόνωση του DNA από τους FFPE ιστούς ακολουθήθηκε με μικρές διαφορές ένα δημοσιευμένο πρωτόκολλο, στο οποίο η απομόνωση του DNA και η διθειώδης μετατροπή γίνονται σε ένα σωληνάριο με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων, αυξάνοντας έως και 5 φορές την απόδοση σε DNA και ελαχιστοποιώντας την ποσότητα που χάνεται (methylation on beads- ΜΟΒ) σε σχέση με αντίστοιχες διαδικασίες, κατά τις οποίες ακολουθούνται 2 ξεχωριστά πρωτόκολλα (Bailey et al., 2010). Συγκεκριμένα, για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 2 τομές πάχους 10 μm. Η αποπαραφίνωση έγινε με 1 ml ξυλόλης σε epp 1,5 ml για 10 λεπτά με συχνή ανάμειξη. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις g, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το βήμα της αποπαραφίνωσης επαναλήφθηκε μία φορά ακόμα, για να διαλυθούν και να απομακρυνθούν εντελώς τυχόν υπολείμματα παραφίνης. Στη συνέχεια, προστέθηκε 1 ml αιθανόλης 100% στο ίζημα για 10 λεπτά με συχνή ανάμειξη, προκειμένου να εκχυλιστούν τα υπολείμματα ξυλόλης. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις g, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το βήμα επαναλήφθηκε μία φορά ακόμα. Τα σωληνάκια έμειναν σε θερμοκρασία δωματίου με ανοιχτά καπάκια για 10 λεπτά, για να εξατμιστεί η εναπομείνουσα αιθανόλη. Το ίζημα αναδιαλύθηκε σε 80 μl Buffer AL (Qiagen, Hilden, Germany) και η λύση του ιστού έγινε με την προσθήκη 20 μl πρωτεϊνάσης Κ (Qiagen, Hilden, Germany) και επώαση στους 56 C για 16 ώρες. Μετά τη λύση, σε κάθε δείγμα προστέθηκαν 300 μl ισοπροπανόλη 100%, το δείγμα αναμείχθηκε και προστέθηκαν 150 μl μαγνητικά σφαιρίδια (Promega, Madison, WI, USA). Τα δείγματα 139

140 επωάστηκαν για 10 λεπτά με συνεχή κυκλική ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου, προκειμένου το DNA να προσδεθεί στα σφαιρίδια και, αφού προστέθηκαν 5 μl φορέα RNA (Qiagen, Hilden, Germany), επωάστηκαν για 5 λεπτά ακόμα. Τα σωληνάκια τοποθετήθηκαν σε μαγνητική βάση, τα σφαιρίδια με το προσδεδεμένο DNA προσκολλήθηκαν στο μαγνήτη και το υγρό αφαιρέθηκε. Τα σφαιρίδια εκπλύθηκαν με προσθήκη 700 μl Buffer AW1 (Qiagen, Hilden, Germany), τοποθέτηση των σωληναρίων στη μαγνητική βάση και αφαίρεση του υγρού. Με τον ίδιο τρόπο έγινε έκπλυση με 500 μl Buffer AW2 (Qiagen, Hilden, Germany) δύο φορές. Αφού αφαιρέθηκε το υγρό, τα σωληνάκια στέγνωσαν στους 90 o C για 10 λεπτά, για να εξατμιστούν τα υπολείμματα της αιθανόλης. Στα σωληνάκια προστέθηκαν 45 μl Buffer AE (Qiagen, Hilden, Germany) και ακολούθησε αμέσως η διθειώδης μετατροπή του DNA Διθειώδης μετατροπή του ιστικού DNA H διθειώδης μετατροπή πραγματοποιήθηκε στο ίδιο epp ως συνέχεια του παραπάνω πρωτοκόλλου απομόνωσης DNA (MOB) από τους ιστούς σε παραφίνη (Bailey et al., 2010). Στα epps με το DNA προστέθηκαν 5 μl M- Dilution Buffer (Zymo Research Corporation, Orange, CA) και τα δείγματα επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 C. Μετά την επώαση, προστέθηκαν 100 μl CT conversion reagent (Zymo Research Corporation) για τη διθειώδη μετατροπή και ακολούθησε επώαση στους 98 C για 10 λεπτά και στους 64 C για 2,5 ώρες. Μετά την επώαση προστέθηκαν 400 μl M-Binding Buffer (Zymo Research Corporation) και τα δείγματα έμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Προστέθηκαν 2 μl φορέα RNA (Qiagen) και τα σωληνάκια τοποθετήθηκαν στη μαγνητική βάση και αφαιρέθηκε το υγρό. Τα σφαιρίδια εκπλύθηκαν με 400 μl M-Wash Buffer (Zymo Research Corporation) και ακολούθησε αποθειοποίηση με 200 μl M-Desulfonation Buffer (Zymo Research Corporation) και επώαση 13 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Προστέθηκαν 2 μl φορέα RNA και τα σωληνάκια τοποθετήθηκαν στη 140

141 μαγνητική βάση και αφαιρέθηκε το υγρό. Τα σφαιρίδια εκπλύθηκαν με 400 μl M-Wash Buffer δύο φορές και την τελευταία φορά, αφού αφαιρέθηκε το υγρό, αφέθηκαν στους 90 C για 15 λεπτά μέχρι να εξατμιστεί τελείως η αιθανόλη. Η έκλουση του τροποποιημένου DNA έγινε με 50 μl M-Elution Buffer (Zymo Research Corporation), διαδοχική επώαση στους 90 C για 10 λεπτά, τοποθέτηση των δειγμάτων στη μαγνητική βάση και αφαίρεση του τροποποιημένου DNA σε νέο κατάλληλα σημασμένο σωληνάκι. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε δύο φορές, προκειμένου να εκλουστεί όσο το δυνατό μεγαλύτερη ποσότητα τροποποιημένου DNA από τα σφαιρίδια. Το τροποποιημένο DNA φυλάχθηκε στους -20 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του DNA Για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης των T-UCRs πραγματοποιήθηκε qmsp, όπως και για τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς (οι εκκινητές και οι ιχνηθέτες φαίνονται στον Πίνακα 2.7). Το μείγμα της αντίδρασης περιγράφεται από τους Herman et al. και περιείχε 16,6 mm ammonium sulfate, 67 mm Tris ph8,8, 6,7 mm MgCl2 και 10 mm 2-μερκαπτοαιθανόλης, τους εκκινητές σε συγκέντρωση 300 nm, τον ιχνηθέτη σε συγκέντρωση 100 nm, τα dntps σε συγκέντρωση 1,25 mm το καθένα και 2 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (Herman et al., 1996). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν στους 95 C για 5 λεπτά, 50 κύκλοι στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα, στους 60 C (λεπτομέρειες για τις θερμοκρασίες σύνδεσης φαίνονται στον Πίνακα 2.7) για 30 δευτερόλεπτα και στους 72 C για 1 λεπτό. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό LinRegPCR και οι ομαλοποιήσεις ως προς το IVD και τη β-ακτίνη έγιναν όπως περιγράφεται και για τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς στην παράγραφο

142 Μεθυλίωση των T-UCRs στο πλάσμα Προκειμένου να ανιχνευθούν οι μεθυλιωμένες T-UCRs στο περιφερικό αίμα, συλλέχθηκε πλάσμα από 40 υγιείς δότες, 12 ασθενείς με φλεγμονή στο παχύ έντερο ή εκκολπωματίτιδα, 59 ασθενείς με αδενώματα στο παχύ έντερο ή στο ορθό και 50 ασθενείς με καρκίνο στο παχύ έντερο ή στο ορθό, των οποίων οι ιστοί είχαν ήδη αναλυθεί ως προς τη μεθυλίωση των T-UCRs Απομόνωση του DNA από το πλάσμα Για την απομόνωση του κυκλοφορούντος DNA χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen, Hilden, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο αρχικός όγκος πλάσματος που χρησιμοποιήθηκε ήταν 4 ml. Η λύση του δείγματος έγινε σε σωληνάριο όγκου 50 ml, όπου προστέθηκαν 400 μl proteinase K και 3,2 ml Buffer ACL, το οποίο περιείχε 1 μg φορέα RNA. Το μείγμα αναμείχθηκε με vortex και επωάστηκε στους 60 C για 1 ώρα. Μετά την επώαση προστέθηκαν 7,2 ml Buffer ACB, το μείγμα αναμείχθηκε με vortex και τοποθετήθηκε σε πάγο για 5 λεπτά. Στη συνέχεια φορτώθηκε στις ειδικές στήλες που παρέχονταν, οι οποίες ήταν συνδεδεμένες σε σύστημα κενού, όπου με την εφαρμογή αρνητικής πίεσης το μείγμα πέρασε από τη στήλη και το DNA συγκρατήθηκε στη μεμβράνη της κάθε στήλης. Με τον ίδιο τρόπο έγιναν διαδοχικές εκπλύσεις της μεμβράνης με 600 μl Buffer ACW1, 750 μl ACW2 και 750 μl αιθανόλης 100%. Οι στήλες αφαιρέθηκαν από τη συσκευή κενού, τοποθετήθηκαν σε σωληνάκια των 2 ml και φυγοκεντρήθηκαν για 3 λεπτά στις g. Μεταφέρθηκαν στη συνέχεια σε νέα σωληνάκια και αφέθηκαν με ανοιχτό καπάκι για 10 λεπτά στους 56 C προκειμένου να εξατμιστούν υπολείμματα αιθανόλης. Η έκλουση του DNA έγινε σε epp 1,5 ml με προσθήκη 50μl Buffer AVE στην κάθε στήλη, επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά και φυγοκέντρηση στις g για 1 λεπτό. Το DNA φυλάχθηκε στους -20 C μέχρι τη διθειώδη μετατροπή του. 142

143 Διθειώδης μετατροπή του κυκλοφορούντος DNA Για τη διθειώδη μετατροπή του κυκλοφορούντος DNA χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αρχικά, 40 μl DNA αναμείχθηκε με 110 μl CT Conversion Reagent και επωάστηκε στους 98 C για 10 λεπτά και στη συνέχεια στους 64 C για 2,5 ώρες. Μετά την επώαση, σε στήλη με 600 μl M- Binding Buffer προστέθηκε το δείγμα και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g. Η στήλη εκπλύθηκε με 100 μl M-Wash Buffer και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και ακολούθησε αποθειοποίηση με 200 μl M- Desulfonation Buffer και επώαση 20 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, τα σωληνάκια φυγοκεντρήθηκαν και οι στήλες εκπλύθηκαν με 200 μl M-Wash Buffer δύο φορές. Η έκλουση του τροποποιημένου DNA έγινε με 30 μl M-Elution Buffer και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g σε νέο κατάλληλα σημασμένο σωληνάκι. Το τροποποιημένο DNA φυλάχθηκε στους -20 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA Για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA εφαρμόστηκε η ίδια μέθοδος, όπως και στον προσδιορισμό της μεθυλίωσης του DNA από φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς, με τη διαφορά ότι ακολουθήθηκε nested qmsp. Η nested PCR είναι μία αντίδραση που γίνεται με «εξωτερικούς» εκκινητές σχεδιασμένους λίγες δεκάδες βάσεις εκτός του προϊόντος που θέλουμε να ενισχύσουμε και στη συνέχεια το προϊόν αυτής της PCR χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα για την PCR με «εσωτερικούς» εκκινητές που παράγει το επιθυμητό προϊόν. Με τον τρόπο αυτό ενισχύεται πολύ η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, επειδή το καρκινικό DNA βρίσκεται σε μικρή ποσότητα στην κυκλοφορία 143

144 των ασθενών και επειδή οι αντιδράσεις PCR που θα πραγματοποιούνταν χρειάζονταν αρκετή ποσότητα DNA (3 T-UCRs και το γονίδιο αναφοράς εις τριπλούν) επιλέχθηκε η μέθοδος αυτή προκειμένου να αυξηθεί η ευαισθησία. Οι «εξωτερικοί» εκκινητές σχεδιάστηκαν να προσδένονται στο τροποποιημένο DNA, λίγες βάσεις εκτός του προϊόντος που δίνουν οι «εσωτερικοί» εκκινητές για την qmsp και σε περιοχές που δεν περιείχαν καθόλου CGs, έτσι ώστε να ενισχυθεί και το μεθυλιωμένο και το μη μεθυλιωμένο DNA. Οι αντιδράσεις περιείχαν 1x Mg-free KAPA Taq HotStart Buffer (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA), 400nM από κάθε «εξωτερικό» εκκινητή, 800 nm dntps, 1,25 nm MgCl2, 1,5 U KAPA Taq HotStart DNA Polymerase (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA) και 6μl του τροποποιημένου DNA. Οι συνθήκες της nested PCR με τους «εξωτερικούς» εκκινητές ήταν στους 95 C για 3 λεπτά και 15 κύκλοι στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα, στους 56 C για 30 δευτερόλεπτα και στους 72 C για 1 λεπτό. Στον Πίνακα 2.8 φαίνονται οι αλληλουχίες των «εξωτερικών» εκκινητών καθώς επίσης και οι θερμοκρασίες σύνδεσης για κάθε T-UCR. Πίνακας 2.8. Αλληλουχίες «εξωτερικών εκκινητών» για τη nested PCR. Εκκινητές Αλληλουχία (5-3 ) Μήκος προϊόντος Θερμοκρασία σύνδεσης ( o C) Uc160 FRW Uc160 REV GAGGGATTTAAGTTTTTATTTTA TCACCCTACCCAAATAC Uc283 FRW GGTTTTTAGTTTTTTTGGTATG Uc283 REV Uc346 FRW Uc346 REV AAAAAAAAATCACAAAAAACTT C GGGGTTAGAGATTTTTATTT CTATAATTAAAATATAAATAAA ACCC

145 Στη συνέχεια, 5 μl από το προϊόν της «εξωτερικής» PCR χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για την «εσωτερική» αντίδραση της qmsp, όπως περιγράφεται στην αντίστοιχη παράγραφο για τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγιναν επίσης με τον ίδιο τρόπο. Εκτός από την qmsp για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το προϊόν της «εξωτερικής» PCR, πραγματοποιήθηκε επιπλέον qpcr με «εσωτερικούς» εκκινητές (Πίνακας 2.9) που προσδένονται στα μη μεθυλιωμένα προϊόντα της «εξωτερικής» PCR, προκειμένου να εξασφαλίσουμε ότι η «εξωτερική» PCR πραγματοποιήθηκε με επιτυχία και το αρνητικό αποτέλεσμα της qmsp για τις μεθυλιωμένες T-UCRs οφείλονταν σε μη μεθυλίωση και όχι σε αποτυχία της nested PCR. Οι αντιδράσεις περιείχαν 16,6 mm ammonium sulfate, 67 mm Tris ph8,8, 6,7 mm MgCl2 και 10 mm 2-μερκαπτοαιθανόλης (Herman et al., 1996). Το μείγμα περιείχε ακόμα τους εκκινητές σε συγκέντρωση 300 nm, τα dntps σε συγκέντρωση 1,25 mm το καθένα, 1Χ Evagren (Biotium) και 2 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν στους 95 C για 5 λεπτά, 40 κύκλοι στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα, στους 64 C για 30 δευτερόλεπτα και στους 72 C για 1 λεπτό και στο τέλος ένα στάδιο αυξανομένων θερμοκρασιών, προκειμένου να παραχθεί η καμπύλη αποδιάταξης των προϊόντων. Οι αντιδράσεις έγιναν στον κυκλοποιητή MX3000P (Stratagene, La Jolla, USA). Πίνακας 2.9. Αλληλουχίες εκκινητών της PCR για τις μη μεθυλιωμένες T-UCRs. Εκκινητές Αλληλουχία (5-3 ) Μήκος προϊόντος Uc160un FRW Uc160un REV GGTGTTGTGGTTTTGTTTTAT AAATCCCCAACCCAAACTACA 57 Uc283un FRW GAGAGAGTTTGGGGTGTTATTTTT

146 Uc283un REV Uc346un FRW Uc346un REV CTCACCCACCTTCAAAACCTA TTGTATGGTGTTAGGGATTTTGT AAATTACCCCAAATACTTTAACCA 91 Εκτός από τα ποσοτικά δεδομένα που προέκυψαν, τα δεδομένα της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA χρησιμοποιήθηκαν και ως ποιοτικά, δηλαδή μεθυλιωμένη ή μεθυλιωμένη T-UCR. Έγκυρα θεωρήθηκαν τα δείγματα που έδωσαν στις αντιδράσεις της ακτίνης Ct 35. Μεθυλιωμένες θεωρούνταν οι T-UCRs αν είχαν Ct 40 για τις Uc160 και Uc283, και 42 για τη Uc346, σε τουλάχιστον μία από τις τριπλές αντιδράσεις. Όλες οι αναλύσεις των PCR έγιναν τυφλά ως προς τα χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων, δηλαδή αν το συγκεκριμένο δείγμα ανήκε σε υγιή δότη ή ασθενή Μεθυλίωση των T-UCRs στα ούρα Επόμενο βήμα ήταν ο προσδιορισμός της μεθυλίωσης των T-UCRs στα ούρα των ασθενών, στους οποίους είχε μελετηθεί η μεθυλίωση στο πλάσμα (για όσους από αυτούς είχαν συλλεγεί ούρα). Συνολικά αναλύθηκαν ούρα από 26 υγιείς δότες, 10 ασθενείς με φλεγμονή στο παχύ έντερο ή εκκολπωματίτιδα, 26 ασθενείς με αδενώματα στο παχύ έντερο ή στο ορθό και 24 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο Απομόνωση του DNA από τα ούρα Η απομόνωση του κυκλοφορούντος DNA από τα ούρα (είχαν φυγοκεντρηθεί πριν καταψυχθούν και ήταν ελεύθερα από κύτταρα) πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας το ίδιο πρωτόκολλο απομόνωσης του DNA που χρησιμοποιήθηκε για τους FFPE ιστούς, όπως αυτό περιγράφεται στην αντίστοιχη παράγραφο, με κάποιες διαφοροποιήσεις λόγω διαφορετικού αρχικού όγκου. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν 15 ml 146

147 ούρων, τα οποία αναμείχθηκαν με 12 ml Buffer AL (Qiagen, Hilden, Germany) και 1 ml πρωτεϊνάση Κ (Qiagen, Hilden, Germany). Η λύση έγινε με επώαση στους 56 C για 1,5 ώρα. Μετά τη λύση σε κάθε δείγμα προστέθηκαν 12 ml ισοπροπανόλη 100%, το δείγμα αναμείχθηκε και προστέθηκαν 150 μl μαγνητικά σφαιρίδια (Promega, Madison, WI, USA). Η συνέχεια του πρωτοκόλλου είναι ακριβώς ίδια με την παράγραφο Διθειώδης μετατροπή του κυκλοφορούντος DNA των ούρων Η διθειώδης μετατροπή πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά την απομόνωση του DNA και χρησιμοποιήθηκε ακριβώς το ίδιο πρωτόκολλο με το πρωτόκολλο διθειώδους μετατροπής του DNA από FFPE ιστούς, όπως αυτό περιγράφεται στην παράγραφο , με τη μόνη διαφορά ότι η επώαση των δειγμάτων έγινε για 16 ώρες στους 55 C, αντί για 10 λεπτά στους 98 C και στους 64 C για 2,5 ώρες. Το τροποποιημένο DNA φυλάχθηκε στους - 20 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του κυκλοφορούντος DNA των ούρων Για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης των T-UCRs χρησιμοποιήθηκε η ίδια μέθοδος όπως περιγράφεται στην παράγραφο για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα (nested qmsp με ίδιους εκκινητές και ίδιους ιχνηθέτες). Το μείγμα και οι συνθήκες της αντίδρασης της qmsp ήταν ακριβώς ίδια και οι αναλύσεις των PCR έγιναν με τον ίδιο τρόπο όπως και στο πλάσμα. 147

148 2.4. Λειτουργική μελέτη των T-UCRs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Στο σχήμα 2.11 φαίνεται διαγραμματικά ο σχεδιασμός της λειτουργικής μελέτης της διατριβής. Σχήμα Διάγραμμα με το σχεδιασμό της λειτουργικής μελέτης της διατριβής. 148

149 Κλωνοποίηση των Uc160 και Uc Ενίσχυση των Uc160 και Uc346 με PCR Για την ενίσχυση των Uc160 και Uc346 πραγματοποιήθηκαν δύο διαδοχικές απλές PCR. Για την πρώτη χρησιμοποιήθηκαν τα ζεύγη των εκκινητών που αναφέρονται ως «εξωτερικοί» (Πίνακας 2.10), ενώ για τη δεύτερη χρησιμοποιήθηκαν οι «εσωτερικοί» εκκινητές και υπόστρωμα από το προϊόν της πρώτης PCR. Στις αλληλουχίες των «εσωτερικών» εκκινητών (Πίνακας 2.10) της δεύτερης PCR προστέθηκαν στο 5 άκρο επιπλέον βάσεις, ώστε να κόβουν τα περιοριστικά ένζυμα XhoI (πρόσθιος εκκινητής) και BamHI (ανάστροφος εκκινητής) και για τις δύο T-UCRs. Επιπλέον των βάσεων αυτών προστέθηκαν 2 βάσεις (ΑΑ) ακόμα στο 5 άκρο, προκειμένου να διευκολυνθεί η αντίδραση της πέψης. Οι αντιδράσεις περιείχαν 1x Mgfree KAPA Taq HotStart Buffer (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA), 400nM από κάθε εκκινητή, 800 nm dntps, 1,25 nm MgCl2, 1,5 U of KAPA Taq HotStart DNA Polymerase (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA) και 1μl DNA από την κυτταρική σειρά DLD-1. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε DNA και όχι cdna, παρόλο που ο στόχος είναι η υπερέκφραση των T-UCRs, γιατί οι T-UCRs δεν έχουν εσώνια, με αποτέλεσμα η αλληλουχία του cdna να είναι ίδια με αυτή του DNA. Οι συνθήκες της PCR ήταν στους 95 C για 3 λεπτά και 15 κύκλοι για την πρώτη PCR και 30 κύκλοι για τη δεύτερη PCR στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα, στους 66 C για 30 δευτερόλεπτα και στους 72 C για 1 λεπτό. Οι αλληλουχίες των εκκινητών, το μήκος των προϊόντων και η θερμοκρασία αποδιάταξης φαίνονται στον Πίνακα Πίνακας Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση των Uc160 και Uc346. Εκκινητές Αλληλουχία (5-3 ) Μήκος προϊόντος Θερμοκρασία σύνδεσης ( o C) 149

150 (bp) Uc160 εξωτερικός FRW Uc160 εξωτερικός REV Uc160 εσωτερικός FRW Uc160 εσωτερικός REV Uc346 εξωτερικός FRW Uc346 εξωτερικός REV Uc346 εσωτερικός FRW Uc346 εσωτερικός REV CCCTGCTCCTCGCCTTCC CGCGCTCCCTCCAGGATG AActcgagAGTAAATGAGGC GAGTGTG AAggatccAGCATCCTTAATA TTTCCTTCC CCCAGGCTCCAGGAGTTC GCGGATGTTTCATGGGAAA AAG AActcgagAAGGCTGGAGAA GGCCT AAggatccGGCCTGATGAATG GCCG Mε πεζά γράμματα περιοχή πέψης περιοριστικού ενζύμου, με πλάγια γράμματα επιπρόσθετες βάσεις για την πέψη Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Τα προϊόντα της δεύτερης PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Το πήκτωμα παρασκευάστηκε με SB buffer (70,7 mm boric acid και 10 mm NaOH) και είχε 2% περιεκτικότητα σε αγαρόζη (Invitrogen) και 0,01% v/v βρωμιούχο αιθίδιο. Το πήκτωμα ηλεκτροφορήθηκε στα 100 V για 45 λεπτά. Στην ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε επίσης μάρτυρας των 100 bp (Nippon Genetics). Με τη βοήθεια του μάρτυρα, και αφού το πήκτωμα εξετέθηκε σε υπεριώδες φως, κόπηκαν οι ζώνες που αντιστοιχούσαν στα προϊόντα των PCR για τις Uc160 και Uc346, δηλαδή 338 bp και 218 bp αντίστοιχα. 150

151 Καθαρισμός προϊόντων Οι ζώνες με τα προϊόντα της PCR που κόπηκαν καθαρίστηκαν με το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πιο συγκεκριμένα, για κάθε 100 mg πηκτώματος αγαρόζης (ζώνη που κόπηκε) προστέθηκαν 200 μl buffer NT1 και επωάστηκαν στους 50 o C για 10 λεπτά. Το διάλυμα φορτώθηκε σε στήλη και φυγοκεντρήθηκε για 30 δευτερόλεπτα στα 8000 g, ώστε να προσδεθεί το DNA στη μεμβράνη της στήλης. Το διήθημα απορρίφθηκε και η μεμβράνη εκπλύθηκε με 700 μl buffer NT3 και ακόλουθη φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα 8000 g. Ακολούθησε άλλη μία φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g, προκειμένου να στεγνώσει η μεμβράνη. Τέλος, το DNA εκλούστηκε από τη μεμβράνη με 17 μl buffer NE, με τα οποία επωάστηκε για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου και ακόλουθη φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Η συγκέντρωση του DNA υπολογίστηκε με φωτομέτρηση στο φασματοφωτόμετρο Nanodrop-1000 (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA) Πλασμίδιο pcdna 3.1/Hygro ( ) Ο φορέας που χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση των Uc160 και Uc346 ήταν το πλασμίδιο pcdna 3.1/Hygro ( ) (Invitrogen). Το pcdna 3.1/Hygro ( ) έχει μέγεθος 5,6 kb και είναι σχεδιασμένο για παροδική και σταθερή έκφραση υψηλών επιπέδων σε ξενιστές θηλαστικά (Σχήμα 2.12). Το πλασμίδιο αυτό περιέχει πολλαπλά σημεία κλωνοποίησης, τα οποία φαίνονται στο σχήμα 2.13, καθώς επίσης και τον υποκινητή του ανθρώπινου κυτταρομεγαλοϊού (CMV), ο οποίος επιτρέπει τη συνεχή και σε υψηλά επίπεδα έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών. Το σημείο XbaI περιέχει ένα εσωτερικό κωδικόνιο λήξης (TCTAGA) (στη συγκεκριμένη περίπτωση δε μας ενδιαφέρει, καθώς οι T-UCRs μεταγράφονται αλλά δε μεταφράζονται). 151

152 Σχήμα Συνοπτικός χάρτης του πλασμιδίου pcdna 3.1 Σχήμα Πολλαπλά σημεία κλωνοποίησης του πλασμιδίου pcdna 3.1/Hygro ( ). 152

153 Διπλή πέψη προϊόντων PCR και πλασμιδίου Στη συνέχεια της διαδικασίας της κλωνοποίησης, ακολούθησε διπλή πέψη του πλασμιδίου και των καθαρισμένων προϊόντων PCR Uc160 και Uc346, με τα ένζυμα XhoI και BamHI. Η αντίδραση της πέψης περιελάμβανε 1 μl XhoI (New England Biosystems, UK), 1 μl BamHI (New England Biosystems, UK) σε 1X K buffer (New England Biosystems, UK) (συμβατό και με τα δύο ένζυμα) σε τελικό όγκο 20 μl. Η αντίδραση της πέψης του πλασμιδίου περιείχε 1 μg πλασμιδίου pcdna 3.1/Hygro ( ) και των T-UCRs περιείχε 12 μl από το καθαρισμένο προϊόν των PCRs. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 37 o C για 2 ώρες Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και καθαρισμός προϊόντων Μετά την πέψη, τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν, ώστε να διαχωριστούν από τα υποπροϊόντα της πέψης, οι αντίστοιχες ζώνες του πλασμιδίου και των ενθέτων T-UCRs κόπηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται στις παραγράφους και Η συγκέντρωση του DNA υπολογίστηκε με φωτομέτρηση στο φασματοφωτόμετρο Nanodrop-1000 (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA) Σύνδεση προϊόντων PCR και πλασμιδίου Τα κομμένα προϊόντα της PCR- ένθετα (Uc160 και Uc346) συνδέθηκαν με το πλασμίδιο με το σύστημα της Takara DNA Ligation. Η συνιστώμενη ποσότητα πλασμιδίου για τη σύνδεση ήταν 0,03 pmol και η συνιστώμενη αναλογία φορέα : ενθέματος ήταν 1 : 10. Αναγάγοντας τη μοριακότητα του φορέα σε μάζα (με βάση το μήκος του φορέα, 5,6 kb), υπολογίσαμε ότι χρειάζονται 110 ng πλασμιδίου. Επομένως, αναγάγοντας και τη μοριακότητα των ενθεμάτων σε μάζα (με βάση το μήκος των ενθεμάτων), υπολογίσαμε ότι χρειάζονται 63,3 ng για το ένθεμα Uc160 και 39,7 ng για το 153

154 ένθεμα Uc346. Οι ανωτέρω ποσότητες πλασμιδίου - ενθέματος αναμείχθηκαν με 5 μl solution I του συστήματος αντιδραστηρίων και επωάστηκαν για 30 λεπτά στου 16 o C και στη συνέχεια ολονύκτια στους 4 o C Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηρίων Στη συνέχεια, τα πλασμίδια με τα ενσωματωμένα ενθέματα, τα οποία προέκυψαν από τις αντιδράσεις σύνδεσης, εισήχθησαν σε δεκτικά κύτταρα (competent cells). Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν βακτήρια Escherichia coli και συγκεκριμένα το στέλεχος DH5α (Invitrogen), ένα στέλεχος που χρησιμοποιείται ευρέως για κλωνοποίηση, ευπροσάρμοστο και προσφέρει σταθερότητα του ενθέματος που εισάγεται, βελτιώνοντας την ποιότητα του πλασμιδιακού DNA κατά την απομόνωσή του στη συνέχεια. Για το μετασχηματισμό των δεκτικών βακτηρίων χρησιμοποιήθηκε το παρακάτω πρωτόκολλο: Αποψύχθηκαν 2 epps με βακτήρια από τους -80 o C τοποθετώντας τα σε πάγο. Σε κάθε ένα από αυτά προστέθηκαν 5 μl από το μείγμα της σύνδεσης (στο ένα το Uc160 και στο άλλο το Uc346) και έμειναν στον πάγο για 30 λεπτά. Στη συνέχεια υπέστησαν θερμικό σοκ για 20 δευτερόλεπτα στους 42 o C και μετά τοποθετήθηκαν στον πάγο για 2 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκαν 50 μl θρεπτικού υγρού LB (Sigma-Aldrich) και επωάστηκαν στους 37 o C για 1 ώρα υπό συνεχή ανάδευση. Μετά την επώαση, φυγοκεντρήθηκαν για 1 λεπτό στις g και αφαιρέθηκαν 500 μl, με σκοπό τη συμπύκνωση του διαλύματος των μετασχηματισμένων βακτηρίων. Τα βακτήρια αναδιαλύθηκαν στα υπόλοιπα 500 μl LB και 250 μl από αυτά απλώθηκαν σε τρυβλίο petri με LB agar (Sigma-Aldrich) και αμπικιλλίνη (100 μg/ml) (Millipore) κάτω από φλόγα και χρησιμοποιώντας γυάλινη πιπέτα Pasteur, η οποία είχε αποστειρωθεί στη φλόγα. Παράλληλα με το μετασχηματισμό των βακτηρίων με το πλασμίδιο με τα ενθέματα, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία και για το κομμένο και καθαρισμένο πλασμίδιο (αρνητικός μάρτυρας), ώστε να εξασφαλίσουμε ότι δεν υπήρχε 154

155 επιμόλυνση με άκοπο πλασμίδιο, το οποίο θα έδινε αποικίες σε θρεπτικό υλικό με αμπικιλλίνη). Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 37 o C για 16 ώρες Επιλογή αποικίας και καλλιέργεια Μετά τις 16 ώρες, τα τρυβλία ελέγχθηκαν για σχηματισμό αποικιών. Επιλέχθηκαν 4 μεμονωμένες αποικίες για κάθε ένθετο και καλλιεργήθηκαν χωριστά σε πλαστικό δοκιμαστικό σωληνάριο των 15 ml που περιείχε 4 ml LB (Sigma-Aldrich) με αμπικιλλίνη (100 μg/ml) (Millipore). Οι υγρές καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 o C για 16 ώρες Απομόνωση πλασμιδίου Μετά τις 16 ώρες, χρησιμοποιήθηκαν 2 ml από κάθε καλλιέργεια των 4 ml για την απομόνωση του πλασμιδίου με το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων Nucleospin Plasmid (Macherey- Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πιο συγκεκριμένα, οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν στα g για 30 δευτερόλεπτα και, αφού απομακρύνθηκε το υπερκείμενο, τα βακτήρια αναδιαλύθηκαν σε 250 μl buffer A1. Στη συνέχεια προστέθηκαν 250 μl buffer A2, τα δείγματα αναδεύθηκαν και επωάστηκαν για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, προστέθηκαν 300 μl buffer A3, αναδεύθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και φορτώθηκε σε στήλη που παρέχεται με τα αντιδραστήρια. Οι στήλες φυγοκεντρήθηκαν στα g για 1 λεπτό, προκειμένου να δεσμευθεί το πλασμιδιακό DNA στη μεμβράνη και να διαχωρισθεί από το υπόλοιπο διάλυμα. Ακολούθησε έκπλυση της μεμβράνης με 450 μl buffer AQ και φυγοκέντρηση στα g για 3 λεπτά. Τέλος το πλασμιδιακό DNA εκλούστηκε με 50 μl buffer AE, επώαση για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό σε καινούριο σωληνάκι των 1,5 ml. Η συγκέντρωση του DNA υπολογίστηκε με φωτομέτρηση στο 155

156 φασματοφωτόμετρο Nanodrop-1000 (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA) Έλεγχος πλασμιδίου Στη συνέχεια έπρεπε να εξακριβωθεί ότι τα πλασμίδια που απομονώθηκαν από κάθε υγρή καλλιέργεια περιείχαν τα ενθέματα Uc160 και Uc346. Για το σκοπό αυτό, έγινε διπλή πέψη 1 μg των πλασμιδίων με τα ένζυμα XhoI και BamHI, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μετά την πέψη, τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν, όπως περιγράφεται στην παράγραφο , ώστε να αναλυθούν τα μεγέθη των τμημάτων DNA και να επιβεβαιωθεί ότι τα πλασμίδια περιείχαν τα ένθετα (Σχ. 2.14). Επιπλέον, τα πλασμίδια, στα οποία επιβεβαιώθηκε ότι περιείχαν το αντίστοιχο ένθετο, εστάλησαν για αλληλούχιση σε εξωτερικό εργαστήριο (CEMIA, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας) (Παράρτημα ΙV-V). Σχήμα Φωτογραφία πηκτώματος αγαρόζης, στο οποίο έχουν ηλεκτροφορηθεί: 1: μάρτυρας 100 bp, 2-5: κομμένα πλασμίδια τα οποία απομονώθηκαν από υγρές καλλιέργειες για το ένθεμα Uc160, 6-9: κομμένα πλασμίδια τα οποία απομονώθωκαν από υγρές καλλιέργειες για το ένθεμα Uc

157 Καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Προκειμένου να μελετηθούν τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης των Uc160 και Uc346 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, οι κυτταρικές σειρές HT-29, Caco-2 και DLD-1 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια που περιείχαν τις Uc160 ή Uc346. Οι κυτταρικές σειρές αυτές είναι καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου με διαφορετικά χαρακτηριστικά και μεταναστευτικό δυναμικό Κυτταρική σειρά HT-29 Η κυτταρική σειρά HT-29 (ATCC HTB-38) προέρχεται από αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου Καυκάσιας γυναίκας 44 ετών και απομονώθηκε από τον πρωτοπαθή όγκο το 1964 από τον J. Fogh. Η μορφολογία των κυττάρων είναι επιθηλιακή (Σχήμα 2.15). Στα γενικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, όπως αυτά δίνονται από την εταιρεία, περιλαμβάνονται η έκφραση των ογκογονιδίων c-myc, K-ras, H-ras, N-ras, Myb, sis και fos. Επιπλέον, παρατηρείται υπερπαραγωγή του p53 και υπάρχει μία G -> A μετάλλαξη του p53 στο κωδικόνιο 273, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την υποκατάσταση Arg -> His, ενώ δεν ανιχνεύεται έκφραση του ογκογονιδίου N-myc. Σε ανοσοκατασταλμένα ποντίκια, τα κύτταρα HT-29 είναι ικανά να σχηματίσουν αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου καλά διαφοροποιημένο. 157

158 Σχήμα Μικροφωτογραφία HT-29 κυττάρων σε μικρή και μεγάλη πυκνότητα (ATCC). Οι συνθήκες καλλιέργειας των HT-29 είναι θερμοκρασία 37 ο C, διοξείδιο του άνθρακα 5% και υγρασία 95%. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργειά τους ήταν το RPMI 1640 (FG1235, Biochrom) εμπλουτισμένο με 1 mm πυροσταφυλικό νάτριο, 1,5 mg/ml διττανθρακικό νάτριο, 4,5 g/l γλυκόζη και 10% v/v βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, Fetal Bovine Serum) (Biosera). Για την προστασία των καλλιεργειών από μικροβιακούς παράγοντες χρησιμοποιήθηκαν τα αντιβιοτικά πενικιλίνης/ στρεπτομυκίνης (Biochrom) σε τελική συγκέντρωση 500 μg/ml, 50 μg/ml γενταμυκίνη (Biochrom) και 7,5 μg/ml αμφοτερικίνη B (Biosera) Κυτταρική σειρά Caco-2 Η κυτταρική σειρά Caco-2 (ATCC HTB-37) προέρχεται από αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου Καυκάσιου άνδρα 72 ετών. Η μορφολογία των κυττάρων είναι επιθηλιακή (Σχήμα 2.16). Ο χρόνος διπλασιασμού τους, όπως δίνεται από την εταιρεία, είναι 62 ώρες. Σε ανοσοκατασταλμένα ποντίκια είναι ικανά να σχηματίσουν αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου 158

159 ενδιάμεσης διαφοροποίησης. Στα γενικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, όπως αυτά δίνονται από την εταιρεία, περιλαμβάνονται η έκφραση κερατίνης, retinoic acid binding protein 1 και retinol binding protein 2. Όταν φτάσουν σε μεγάλη πυκνότητα και καλύψουν πλήρως το τρυβλίο μπορεί να εκφράζουν χαρακτηριστικά εντεροκυτταρικής διαφοροποίησης. Οι συνθήκες καλλιέργειας των Caco-2 είναι θερμοκρασία 37 ο C, διοξείδιο του άνθρακα 5% και υγρασία 95%. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργειά τους ήταν το EMEM (F0315, Biochrom) εμπλουτισμένο με 1 mm πυροσταφυλικό νάτριο (Merck Millipore), 645 μg/ml διττανθρακικό νάτριο (Merck Millipore), 1X μη απαραίτητα αμινοξέα (Merck Millipore), 2 mm L-γλουταμίνη (σταθερό ανάλογο) (Merck Millipore) και 10% v/v βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, Fetal Bovine Serum) (Biosera). Για την προστασία των καλλιεργειών από μικροβιακούς παράγοντες χρησιμοποιήθηκαν τα αντιβιοτικά πενικιλίνης/ στρεπτομυκίνης (Biochrom) σε τελική συγκέντρωση 500 μg/ml, 50 μg/ml γενταμυκίνη (Biochrom) και 7,5 μg/ml αμφοτερικίνη B (Biosera). Σχήμα Μικροφωτογραφία caco-2 κυττάρων σε μικρή και μεγάλη πυκνότητα (ATCC). 159

160 Κυτταρική σειρά DLD-1 Η κυτταρική σειρά DLD-1 (ATCC CCL-221) προέρχεται από κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα σταδίου C κατά Dukes ενήλικου άνδρα και απομονώθηκε από τον πρωτοπαθή όγκο το από τον D.L. Dexter. Η μορφολογία των κυττάρων είναι επιθηλιακή (Σχ. 2.17). Στα γενικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, όπως αυτά δίνονται από την εταιρεία, περιλαμβάνονται η έκφραση των ογκογονιδίων myc, ras, Myb, sis και fos. Επιπλέον, υπάρχει μία C -> T μετάλλαξη του p53 στη θέση 241, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την υποκατάσταση Ser -> Phe. Οι συνθήκες καλλιέργειας των DLD-1 είναι θερμοκρασία 37 ο C, διοξείδιο του άνθρακα 5% και υγρασία 95%. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργειά τους ήταν το ίδιο με αυτό που περιγράφεται παραπάνω για τα HT-29 κύτταρα. Σχήμα Μικροφωτογραφία DLD-1 κυττάρων σε μικρή και μεγάλη πυκνότητα (φωτογραφία αρχείου) Συντήρηση, ανακαλλιέργεια και πάγωμα κυττάρων Τα κύτταρα φυλάσσοναν διαιρεμένα σε υποπολλαπλάσια σε ειδικά σωληνάρια σε δοχείο με υγρό άζωτο. Τα κύτταρα αποψύχθηκαν ελαφρά σε υδατόλουτρο στους 37oC και αναμείχθηκαν με 10 ml θρεπτικού που περιέχονταν σε πλαστικό στείρο τρυβλίο των 100 mm (Thermo Fischer Scientific). Τα τρυβλία μεταφέρθηκαν σε κλίβανο 37 o C (Hera Cell 150, 160

161 Thermo Scientific). Για τη συντήρηση των κυττάρων το αντίστοιχο θρεπτικό αλλαζόταν κάθε 2 ημέρες (για τα HT-29 και DLD-1 κύτταρα) ή κάθε 3 ημέρες (για τα Caco-2 κύτταρα). Όταν τα κύτταρα έφταναν να καλύπτουν περισσότερο από 80% του τρυβλίου, γινόταν η ανακαλλιέργειά τους. Η συχνότητα διέφερε ανάμεσα στις κυτταρικές σειρές (στα Caco-2 κύτταρα η συχνότητα ήταν μικρότερη σε σχέση με τα άλλα, καθώς πολλαπλασιάζονται με αργότερο ρυθμό) και με τον αρχικό αριθμό κυττάρων της ανακαλλιέργειας, ανάλογα με τις απαιτήσεις των πειραμάτων κάθε φορά. Για την ανακαλλιέργεια, πρώτα γινόταν αναρρόφηση του θρεπτικού, στη συνέχεια έκπλυση με 5 ml PBS (Phosphatebuffered saline, Biosera), αναρρόφηση και προσθήκη 1 ml θρυψίνης και επώαση στους 37 o C για 3 λεπτά, για να δράσει η θρυψίνη και να ξεκολλήσουν τα κύτταρα από το τρυβλίο. Για την απενεργοποίηση της θρυψίνης προστίθεντο 5 ml θρεπτικού υλικού, τα κύτταρα ξεκολλούσαν και φυγοκεντρούνταν σε σωλήνα των 15 ml για 4 λεπτά στις 1600 g. Το υπερκείμενο θρεπτικό απομακρυνόταν και τα κύτταρα αναδιαλύονταν εκ νέου σε 5-8 ml θρεπτικό υλικό (ανάλογα με τον αριθμό των κυττάρων). Σε τρυβλίο, το οποίο περιείχε 9 ml κατάλληλο θρεπτικό, προστίθετο 1 ml κύτταρα και τα τρυβλία μεταφέρονταν στους 37 o C. Για το πάγωμα των κυττάρων ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία με αυτή της ανακαλλιέργειας, αλλά μετά τη φυγοκέντρηση τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε 950 μl FBS και φυλάχθηκαν σε cryovial με 50 μl DMSO στους -80 o C Μέτρημα κυττάρων Όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη παράγραφο, η ανακαλλιέργεια των κυττάρων γινόταν με αραίωση 1:5 έως 1:8, ανάλογα με την κυτταρική σειρά και το ίζημα των κυττάρων μετά τη φυγοκέντρηση. Ωστόσο, σε κάθε πείραμα που ακολουθούσε έπρεπε να υπάρχει συγκεκριμένος αριθμός 161

162 κυττάρων. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα μετρούνταν σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer. Το αιμοκυτταρόμετρο Neubauer είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα με δύο επιφάνειες, κάθε μια από τις οποίες έχει ένα τετράγωνο πλέγμα, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1mm (Σχ. 2.18). Ανάμεσα στις επιφάνειες αυτές και στην καλυπτρίδα δημιουργείται μια κοίλη επιφάνεια, στην οποία μεταφέρεται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Για τη μέτρηση των κυττάρων μετρώνται στο μικροσκόπιο τα κύτταρα που βρίσκονται σε 2 ή σε 4 τετράγωνα (πάνω, κάτω, δεξιά ή αριστερά του κεντρικού τετραγώνου), και ο μέσος όρος ανά τετράγωνο ανάγεται στην 10 4 για να υπολογιστεί η συγκέντρωση των κυττάρων ανά ml. Σχήμα Σχηματική απεικόνιση των μεγενθυμένων τετραγώνων του αιμοκυτταρόμετρου Neubauer, όπως φαίνονται στο μικροσκόπιο. 162

163 Παροδική διαμόλυνση κυτταρικών σειρών με πλασμίδιο Προκειμένου να μελετηθούν τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης των Uc160 και Uc346 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, οι κυτταρικές σειρές HT-29, Caco-2 και DLD-1 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια που περιείχαν τις Uc160 ή Uc346. Για τη διαμόλυνση των κυττάρων με τα πλασμίδια που κατασκευάστηκαν, όπως περιγράφεται σε προηγούμενες παραγράφους, χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο διαμόλυνσης TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το TurboFect Transfection Reagent είναι ένα διάλυμα κατιονικών πολυμερών σε νερό. Τα πολυμερή και το DNA του πλασμιδίου σχηματίζουν συμπαγή, σταθερά και θετικά φορτισμένα σύμπλοκα, τα οποία προστατεύουν το DNA από την αποικοδόμηση και διευκολύνουν τη μεταφορά γονιδιωματικού υλικού στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Για τα πειράματα του πολλαπλασιασμού διαμολύνθηκαν κύτταρα σε τρυβλία 24 πηγαδιών (Corning Inc., NY, USA), ενώ για τα πειράματα της μετακίνησης και της μετανάστευσης χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία 6 πηγαδιών (Corning Inc., NY, USA). Για κάθε κυτταρική σειρά έγιναν τρεις διαφορετικές διαμολύνσεις: με το πλασμίδιο χωρίς κανένα ένθετο (αρνητικός μάρτυρας), με το πλασμίδιο με το ένθετο Uc160 και με το πλασμίδιο με το ένθετο Uc346. Το μείγμα της διαμόλυνσης που χρησιμοποιήθηκε στα τρυβλία 24 πηγαδιών περιείχε 50 μl κατάλληλο θρεπτικό μέσο χωρίς ορό, turbofect reagent 1 μl και 250 ng πλασμίδιο. Οι αντίστοιχοι όγκοι για τα τρυβλία 6 πηγαδιών ήταν 200 μl κατάλληλο θρεπτικό χωρίς ορό, turbofect reagent 3 μl και 1 μg πλασμίδιο. Αφού αναμείχθηκαν τα μείγματα με vortex, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκαν 50 μl ή 200 μl (ανάλογα αν ήταν τρυβλία 6 ή 24 πηγαδιών) στα κύτταρα και επωάστηκαν στους 37 C για 20 ώρες. Στη συνέχεια έγινε αλλαγή του θρεπτικού υλικού που περιείχε διαμολυντικό διάλυμα με το θρεπτικό υλικό, το οποίο χρειάζεται κάθε κυτταρική σειρά. 163

164 Έλεγχος διαμόλυνσης Για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα της διαμόλυνσης, έπρεπε να απομονωθεί RNA από τις κυτταρικές σειρές και να γίνει qrt-pcr για την αναγνώριση της έκφρασης των 2 Τ-UCR. Για το σκοπό αυτό, 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση, αναρροφήθηκε το θρεπτικό, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και χρησιμοποιώντας θρυψίνη (όπως κατά τη διαδικασία της ανακαλλιέργειας) τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωληνάριο των 15 ml και σε μία ακόλουθη φυγοκέντρηση ξεπλύθηκαν με PBS. Για την απομόνωση του RNA χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για κύτταρα από κυτταροκαλλιέργεια. Πιο συγκεκριμένα, για τη λύση των κυττάρων προστέθηκαν στο ίζημα των κυττάρων 350 μl Buffer RA1 και 3,5 μl β-μερκαπτοαιθανόλης και αναμείχθηκαν. Το διάλυμα φορτώθηκε σε μία στήλη και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g, ώστε διηθούμενο να μειωθεί το ιξώδες του. Στο διήθημα προστέθηκαν 350 μl αιθανόλης 70% και αναμείχθηκαν. Το μείγμα φορτώθηκε σε στήλη που περιέχει μεμβράνη, στην οποία προσδένονται τα νουκλεϊκά οξέα, και φυγοκεντρήθηκε για 30 δευτερόλεπτα στα g. Μετά τη φυγοκέντρηση, για την αφαλατοποίηση της μεμβράνης, προστέθηκαν 350 μl MDB (Membrane Desalting Buffer) στη στήλη DNA και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα g. Ακολούθησε πέψη του DNA πάνω στη στήλη με 10 μl rdnase σε 90 μl Reaction Buffer και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Μετά την επώαση, προστέθηκαν στη στήλη 200 μl Buffer RAW2 και φυγοκεντρήθηκε για 30 δευτερόλεπτα στα g. Ακολούθησε δεύτερη πλύση της μεμβράνης με 600 μl Buffer RA3 και φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα g και τρίτη πλύση με 250 μl Buffer RA3 και φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα g, προκειμένου να στεγνώσει η μεμβράνη. Η έκλουση του RNA έγινε με 40 μl Rnase-free H2O και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. 164

165 Ακολούθησε επιπλέον πέψη του DNA, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 2.2.2, σύνθεση cdna (παράγραφος 2.2.3) και ποσοτικοποίηση της έκφρασης των T-UCRs 160 και 346 (παράγραφος 22.4) Πολλαπλασιασμός (MTT assay) Η επίδραση της υπερέκφρασης των Uc160 και Uc346 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ελέγχθηκε με τη μέθοδο MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dephenyltetrazolium-bromide). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στο ότι το διαλυτό σε νερό κίτρινο MTT, όταν προστίθεται στα κύτταρα, ανάγεται από τις αφυδρογονάσες των μιτοχονδρίων σε μωβ αδιάλυτους κρυστάλλους φορμαζάνης (Σχ ). Οι κρύσταλλοι αυτοί διαλυτοποιούνται με ισοπροπανόλη και το διάλυμα φωτομετρείται, προκειμένου να υπολογιστεί η συγκέντρωση της χρωστικής, η οποία είναι ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων. Σχήμα Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου ΜΤΤ. 165

166 Αρχικά, τα κύτταρα Caco-2, HT-29 και DLD-1 καλλιεργήθηκαν με πυκνότητα κύτταρα/πηγάδι σε τρυβλία 24 πηγαδιών με πλήρες θρεπτικό μέσο και παροδικά διαμολύνθηκαν με 250 ng πλασμίδιο άδειο (μάρτυρας) ή πλασμίδιο που περιείχε τη Uc160 ή τη Uc346 για 20 ώρες. Μετά από 20 ώρες, το θρεπτικό αλλάχθηκε και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μετρήθηκε στις χρονικές στιγμές 0, 24 και 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Για τη μέτρηση, προστίθεντο σε κάθε πηγαδάκι 50 μl MTT διαλύματος (5 mg/ml in PBS) (1/10 του συνολικού όγκου) και επωάζονταν για 4 ώρες στους 37 C. Μετά τις 4 ώρες το θρεπτικό υλικό απομακρύνονταν και οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλυτοποιούνταν σε 100 μl οξινισμένης ισοπροπανόλης (0,33% v/v HCl). Το διάλυμα μεταφέρονταν σε 96-well πλάκες ανάγνωσης και οι πλάκες τοποθετούνταν σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Tecan, Sunrise, Magellan 2). Η απορρόφηση που μετρούνταν ήταν σε μήκος κύματος 570 nm και ως μήκος κύματος αναφοράς χρησιμοποιούνταν τα 620 nm. Ο αριθμός των κυττάρων υπολογίζονταν κάθε φορά με βάση την πρότυπη καμπύλη, η οποία είχε δημιουργηθεί με διαδοχικές αραιώσεις, για κάθε κυτταρική σειρά (500000, , , 62500, 31250, 15625, 7812,5 και 0 κύτταρα). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές Μετακίνηση (Scratch wound healing assay) Η επίδραση της υπερέκφρασης των Uc160 και Uc346 στη μετακίνηση των κυττάρων ελέγχθηκε με τη μέθοδο σχηματισμού και επούλωσης τομής (scratch wound healing assay) (Σχ. 2.20). Στη μέθοδο αυτή, όταν τα τρυβλία καλυφθούν πλήρως με μονή στιβάδα κυττάρων, χαράσσεται μία γραμμή με ένα ρύγχος δημιουργώντας ένα κενό ανάμεσα στα κύτταρα. Τα κύτταρα φωτογραφίζονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, ώσπου να κλείσει το κενό ανάμεσα στα κύτταρα. 166

167 Για τη μελέτη της μετακίνησης των κυττάρων Caco-2, HT-29 και DLD-1, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 6 πηγαδίων, ώσπου να καλύπτουν κατά 90% την επιφάνεια του τρυβλίου και διαμολύνθηκαν παροδικά με 1 μg πλασμίδιο (μάρτυρας) ή πλασμίδιο που περιείχε τη Uc160 ή τη Uc346 για 20 ώρες. Μετά από 20 ώρες, το θρεπτικό αλλάχθηκε και με ένα ρύγχος χαράχθηκε η στιβάδα των κυττάρων σε ευθεία γραμμή. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρες θρεπτικό μέσο. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε πολλαπλά σημεία του κενού σε μεγέθυνση 5x τη χρονική στιγμή 0, 24 ώρες και 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση (μετά την αλλαγή του θρεπτικού). Σχήμα Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου scratch wound healing. Για τη φωτογράφηση των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η φωτογραφική μηχανή Axiocam ERc 5s (Carl Zeiss Microscopy LLC), η οποία ήταν στερεωμένη σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Axiovert 40 CFL, Carl Zeiss Microscopy LLC). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν πέντε φορές. Το 167

168 πρόγραμμα ΙmageJ ( χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των εικόνων, ώστε να υπολογιστεί με ακρίβεια η κάλυψη της επιφάνειας του κενού σε κάθε περίπτωση. Στη συνέχεια, έγινε αναγωγή των τιμών σε ποσοστό επί της αρχικής επιφάνειας του κενού και οι τιμές αυτές ανά χρονική στιγμή (24 ώρες, 48 ώρες) για τα κύτταρα, τα οποία διαμολύνθηκαν με τη Uc160 ή τη Uc346, συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες τιμές του μάρτυρα Μετανάστευση (Transwell assay) Προκειμένου να μελετηθούν τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης των Uc160 και Uc346 στη μετανάστευση των κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της διαπηγαδικής μετανάστευσης (transwell migration). Η μέθοδος αυτή εφευρέθηκε από τον Dr. Stephen Boyden το 1961, ο οποίος τη χρησιμοποίησε για να μελετήσει τη μετανάστευση των λευκοκυττάρων, γι αυτό και ονομάζεται επίσης μέθοδος Boyden chamber. Στη μέθοδο αυτή, μέσα σε ένα πηγαδάκι από τρυβλίο 24 πηγαδιών τοποθετείται άλλο πηγαδάκι (transwell), το οποίο φτάνει μέχρι λίγο πιο κάτω από τη μέση του εξωτερικού πηγαδιού (Σχ. 2.21) και έχει μία πολυανθρακική μεμβράνη με πόρους συγκεκριμένου μεγέθους. Στο εξωτερικό πηγαδάκι υπάρχει θρεπτικό μέσο χημειοελκυστικό και στο εσωτερικό πηγαδάκι εισάγονται τα κύτταρα σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό και επωάζονται για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Τα κύτταρα που προσκολλώνται και είναι μεταναστευτικά (ανάλογα με την κυτταρική σειρά ή την επεξεργασία που τους έχει γίνει) κατευθύνονται προς το χημειοελκυστικό μέσο μέσω των πόρων της μεμβράνης με αποτέλεσμα να εγκλωβίζονται στη μεμβράνη και μετά από μονιμοποίηση και χρώση να μπορούν να παρατηρηθούν και να μετρηθούν. 168

169 Σχήμα Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου transwell migration. Η μετανάστευση μελετήθηκε στα DLD-1 κύτταρα, καθώς ήταν τα πιο μεταναστευτικά σε σχέση με τις άλλες δύο κυτταρικές σειρές. Αρχικά, τα κύτταρα DLD-1 διαμολύνθηκαν παροδικά με 1 μg πλασμίδιο άδειο (μάρτυρας) ή πλασμίδιο που περιείχε τη Uc160 ή τη Uc346 για 20 ώρες. Μετά από 20 ώρες, το θρεπτικό αλλάχθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν όπως κατά τη διαδικασία της ανακαλλιέργειας σε σωληνάριο των 15 ml και επαναιωρήθηκαν σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό. Αφού μετρήθηκαν στο αιμοκυτταρόμετρο, κύτταρα σε όγκο 300 μl φορτώθηκαν σε Transwell chamber, το οποίο είχε πολυανθρακική μεμβράνη με μέγεθος πόρων 8.0 µm (Corning Inc., NY, USA) και είχε προηγουμένως επωαστεί με θρεπτικό μέσο χωρίς ορό σε θερμοκρασία 37 C για 2 ώρες. Το εξωτερικό πηγαδάκι είχε θρεπτικό μέσο με 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 C. Μετά από 24 ώρες το θρεπτικό αναρροφήθηκε και το Transwell chamber ξεπλύθηκε 2 φορές με PBS και μονιμοποιήθηκε σε διάλυμα Carson για 10 λεπτά. Στη συνέχεια ξεπλύθηκε 2 φορές με PBS και επωάστηκε για 20 λεπτά με μεθανόλη. Τέλος, ξεπλύθηκε 2 φορές με PBS και χρωματίστηκε για 5 λεπτά με Giemsa. Αφού ξεπλύθηκε 2 φορές με PBS, για να φύγει η περίσσεια της χρωστικής, με μία μπατονέττα 169

170 απομακρύνθηκαν τα κύτταρα που βρίσκονταν στο πάνω μέρος της μεμβράνης και δεν είχαν μεταναστεύσει και η μεμβράνη παρατηρήθηκε σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Axiovert 40 CFL, Carl Zeiss Microscopy LLC). Με μία φωτογραφική μηχανή Axiocam ERc 5s (Carl Zeiss Microscopy LLC) ελήφθησαν φωτογραφίες σε μεγέθυνση 40x. Μετρώντας τα κύτταρα, τα οποία μετανάστευσαν σε πέντε διαφορετικά οπτικά πεδία, υπολογίστηκε ο μέσος όρος σε κάθε περίπτωση και συγκρίθηκε με τον αριθμό των κυττάρων του μάρτυρα Στατιστική ανάλυση Η επεξεργασία των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα στατιστικής ανάλυσης SPSS 21.0 (IBM SPSS Statistics for Windows, Version Armonk, NY: IBM Corp.). Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 0,05. Για την ανάλυση των επιπέδων mrna και μεθυλίωσης των T-UCRs σε σχέση με τα Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, εφαρμόστηκαν τα μη παραμετρικά Mann-Whitney U-test (σύγκριση δύο ομάδων ως προς τη μεταβλητή) και Kruskal-Wallis test (σύγκριση 3 ομάδων). Κατά τη σύγκριση επιπέδων mrna και μεθυλίωσης των καρκινικών και παρακείμενων μη νεοπλασματικών δειγμάτων των ίδιων ασθενών χρησιμοποιήθηκε τo Wilcoxon test για ζεύγη δειγμάτων. Προκειμένου να αναδειχθούν σχέσεις ανάμεσα στα επίπεδα mrna και μεθυλίωσης των T-UCRs, στα επίπεδα μεθυλίωσης στους ιστούς και στο πλάσμα και στα επίπεδα μεθυλίωσης και στο μέγεθος των όγκων, χρησιμοποιήθηκε το τεστ συσχέτισης Pearson. Για τα ποιοτικά δεδομένα, όπως για παράδειγμα την κατάσταση μεθυλίωσης ανάμεσα σε διαφορετικές ομάδες ασθενών, οι συγκρίσεις έγιναν με τη δοκιμασία χ2, διορθωμένη για ασυμμετρία κατά Fisher. Για τη διερεύνηση της συσχέτισης της μεθυλίωσης των T-UCRs με την επιβίωση ή με 170

171 το χρόνο ως την υποτροπή, έγινε διβάθμια (χαμηλά και υψηλά επίπεδα) ή τριβάθμια (χαμηλά, ενδιάμεσα και υψηλά επίπεδα) κατηγοριοποίηση των δεδομένων και στη συνέχεια εφαρμόστηκε το Log-Rank test και καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier. Προκειμένου να υπολογιστούν η ευαισθησία και η ειδικότητα για κάθε T-UCR ή για συνδυασμό αυτών για την ανίχνευση αδενώματος ή αδενοκαρκινώματος, και να αναδειχθεί ο καλύτερος βιοδείκτης πραγματοποιήθηκε ROC curve ανάλυση (Receiver Operating Characteristics), η οποία απέδωσε και την AUC (area under the curve). Τέλος, για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πολλαπλασιασμού, μετακίνησης και μετανάστευσης των κυττάρων εφαρμόστηκε το Wilcoxon Signed Ranks test. 171

172 172

173 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 173

174 174

175 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην πρώτη φάση της διατριβής προσδιορίστηκε η έκφραση και η μεθυλίωση των T-UCRs σε ιστικά δείγματα ασθενών (καρκινικά και παρακείμενα μη νεοπλασματικά), τα δε αποτελέσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους και συσχετίστηκαν με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και την πρόγνωση των ασθενών. Επιπλέον, η μεθυλίωση των T-UCRs προσδιορίστηκε στο ελεύθερο κυττάρων κυκλοφορούν DNA του πλάσματος και των ούρων ασθενών με κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα, ασθενών με αδένωμα παχέος εντέρου και υγιών της ομάδας ελέγχου και εκτιμήθηκε η διαγνωστική τους αξία Έκφραση των T-UCRs ιστού Σύγκριση καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού Για τον προσδιορισμό της ιστικής έκφρασης των T-UCRs χρησιμοποιήθηκαν δείγματα καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού από 51 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου και ορθού. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν 2 δείγματα αδενώματος, στα οποία προσδιορίστηκε η έκφραση μόνο της Uc160, λόγω της μικρής ποσότητας των δειγμάτων και της μεγάλης ποσότητας υποστρώματος cdna (άρα RNA) που απαιτούνταν για την κάθε αντίδραση PCR (Πίνακας 3.1). Συγκρίνοντας τα επίπεδα έκφρασης της Uc160 στους καρκινικούς και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς, παρατηρήθηκε ότι διέφεραν σημαντικά (p<0,001) (Πίνακας 3.1, Σχ. 3.1). Πιο συγκεκριμένα, οι παρακείμενοι μη νεοπλασματικοί ιστοί είχαν υψηλότερα, σχεδόν υπερτριπλάσια επίπεδα mrna της Uc160 σε σχέση με τους καρκινικούς ιστούς. Τα δύο αδενώματα που αναλύθηκαν είχαν ακόμα χαμηλότερα 175

176 επίπεδα από τους καρκινικούς ιστούς, ωστόσο, δεν συμπεριλήφθησαν στην στατιστική επεξεργασία των δεδομένων λόγω του πολύ μικρού αριθμού τους. Πίνακας 3.1. Σχετική έκφραση των T-UCRs στα αδενοκαρκινώματα, στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς και στα αδενώματα. Ιστός Αριθμός δειγμάτων Σχετική έκφραση Uc160 p Σχετική έκφραση Uc283 p Σχετική έκφραση Uc346 p Παρακείμενος μη νεοπλασματικός ιστός 51 Αδενοκαρκίνωμα 51 1,30 (0,14-4,50) 0,56 (0,14-3,51) <0,001 0,94 (0-16,03) 0,52 (0-15,63) 0,182 0,21 (0-6,14) 0,20 (0-5,86) 0,639 Αδένωμα 2 0,36 (0,15-0,57) N/A N/A Σχήμα 3.1. Σχετική έκφραση της Uc160 στα αδενοκαρκινώματα, στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς και στα αδενώματα. 176

177 Τα επίπεδα έκφρασης της Uc283 διέφεραν ανάμεσα στους καρκινικούς και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς, χωρίς ωστόσο αυτή η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντική (p=0,182) (Πίνακας 3.1, Σχ. 3.2). Πιο συγκεκριμένα, οι παρακείμενοι μη νεοπλασματικοί ιστοί είχαν υψηλότερα, σχεδόν υπερδιπλάσια, επίπεδα mrna της Uc283 σε σχέση με τους καρκινικούς ιστούς. Τα επίπεδα έκφρασης της Uc346, σε αντίθεση με τις άλλες δύο T-UCRs, δε διέφεραν ανάμεσα στους καρκινικούς και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (Πίνακας 3.1, Σχ. 3.3). Σχήμα 3.2. Σχετική έκφραση της Uc283 στα αδενοκαρκινώματα και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς. 177

178 Σχήμα 3.3. Σχετική έκφραση της Uc346 στα αδενοκαρκινώματα και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς Διερεύνηση της σχέσης με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών Συνεχίζοντας την ανάλυση των δεδομένων της έκφρασης στα δείγματα ιστών, διερευνήθηκε η σχέση της έκφρασης των T-UCRs στον καρκινικό ιστό με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών (Πίνακας 3.2). Όπως φαίνεται στον παρακάτω Πίνακα, ενώ παρατηρούνται κάποιες διαφορές στην έκφραση των T-UCRs ανάμεσα σε κάποια χαρακτηριστικά των ασθενών, όπως για παράδειγμα το στάδιο, οι διαφορές αυτές δεν είναι στατιστικά σημαντικές. 178

179 Πίνακας 3.2. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και σχετική έκφραση RNA των Uc160, Uc283 και Uc346 στα κολοορθικά αδενοκαρκινώματα. Κλινικοπαθολογοανατομ ικά χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών (%) Σχετική έκφραση Uc160 p Σχετική έκφραση Uc283 p Σχετική έκφρασ η Uc346 p Άνδρες 32 (62,7%) 0,57 (0,04-3,48) 0,45 (0-15,6) 0,11 (0-5,86) Φύλο Γυναίκες 19 (37,3%) 0,41 (0,05-1,7) 0,459 0,62 (0-5,61) 0,601 0,31 (0-2,65) 0, (19,6%) 0,63 (0,14-1,3) 0,57 (0,06-5,61) 0,13 (0-1,11) Ηλικία (80,4%) 0,49 (0,04-3,5) 0,38 0,52 (0-15,6) 1 0,20 (0-5,86) 0,706 I 3 (5,9%) 0,38 (0,14-,0,62) 2,87 (0,13-5,61) 0,78 (0-5,86) II 20 (39,2%) 0,75 (0,05-2,82) 0,62 (0-6,15) 0,16 (0-2,65) Στάδιο III 20 (39,2%) 0,54 (0,04-3,48) 0,248 0,45 (0-15,63) 0,887 0,01 (0-1,81) 0,366 IV 6 (11,8%) 0,16 (0,04-0,92) 0,94 (0,17-4,46) 0,31 (0-1,06) Υψηλή 6 (11,8%) 0,21 (0,05-2,81) 0,52 (0,13-2,41) 0,75 (0-5,86) Βαθμός διαφοροποίησης Μέτρια 39 (76,5%) 0,66 (0,04-3,48) 0,410 0,70 (0-15,6) 0,696 0,16 (0-2,65) 0,667 Χαμηλή 1 (2%) 0,32 0,22 0,46 Δεξιό 21 (41,2%) 0,32 0,46 0,08 179

180 Εντόπιση κόλον (0,04-1,59) (0-6,15) (0-1,06) Αριστερό κόλον και σιγμοειδέ 13 (25,5%) 0,66 (0,06-3,48) 0,209 0,70 (0-15,630 0,415 0,16 (0-5,86) 0,762 ς Ορθό 15 (29,4%) 0,66 (0,04-2,81) 0,43 (0-5,61) 0,21 (0-2,65) Διήθηση λεμφαδένων Όχι 24 (47,1%) Ναι 25 (49%) 0,62 (0,05-2,81) 0,53 (0,04-3,48) 0,328 0,56 (0-6,150 0,54 (0-15,63) 0,965 0,18 (0-5,86) 0,02 (0-1,81) 0,176 Μετάσταση Όχι 39 (76,5%) Ναι 6 (11,8%) 0,62 (0,04-3,48) 0,37 (0,05-0,92) 0,293 0,59 (0-15,63) 0,66 (0,12-4,46) 0,958 0,08 (0-5,860 0,45 (0-1,06) 0,160 Μία άλλη παράμετρος, η οποία διερευνήθηκε σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης των T-UCRs σε επίπεδο mrna, ήταν η ταυτόχρονη παρουσία στον ίδιο ασθενή τόσο αδενοκαρκινώματος, όσο και τουλάχιστον ενός ιστολογικά επιβεβαιωμένου αδενώματος όπως αυτό τεκμηριώθηκε, είτε κατά την χειρουργική εξαίρεση του αδενοκαρκινώματος, είτε κατά τη διάρκεια της κολονοσκόπησης. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της Uc346 στον καρκινικό ιστό ασθενών, οι οποίοι δεν είχαν αδένωμα στο παχύ έντερο ή στο ορθό ταυτόχρονα με την παρουσία της κακοήθους εξεργασίας (p=0,011, Σχ. 3.4). 180

181 Σχήμα 3.4. Σχετική έκφραση της Uc346 στα αδενοκαρκινώματα και συσχέτιση με συνύπαρξη όγκου και αδενώματος Mεθυλίωση των T-UCRs Μεθυλίωση των T-UCRs στους ιστούς Μεθυλίωση των T-UCRs στους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς Για τον προσδιορισμό της μεθυλίωσης των T-UCRs στους ιστούς χρησιμοποιήθηκαν δείγματα καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού από 64 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν 6 δείγματα αδενώματος, στα οποία επίσης προσδιορίστηκε η μεθυλίωση των T-UCRs. Ωστόσο, λόγω του μικρού αριθμού των αδενωμάτων, τα αποτελέσματά τους δε συμπεριλήφθηκαν στις στατιστικές αναλύσεις (Πίνακας 3.3). Από τα 64 δείγματα καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού που αναλύθηκαν, η μεθυλίωση της Uc283 ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα, η μεθυλίωση της Uc160 σε όλα τα 181

182 δείγματα παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού και σε 58 δείγματα καρκινικού ιστού και η μεθυλίωση της Uc346 σε 56 δείγματα καρκινικού ιστού και 54 δείγματα παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού Σύγκριση καρκινικού και παρακείμενου μη νεοπλασματικού ιστού Συγκρίνοντας τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 στους καρκινικούς και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς, παρατηρήθηκε ότι διέφεραν σημαντικά (p<0,001) (Πίνακας 3.3, Σχ. 3.5). Πιο συγκεκριμένα, οι καρκινικοί ιστοί είχαν πολύ υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης σε σχέση με τους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς, οι οποίοι είχαν σχεδόν μηδενικά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160. Επίσης, υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 παρατηρήθηκαν και στα αδενώματα που αναλύθηκαν, αν και δεν αξιολογήθηκαν, λόγω του μικρού αριθμού τους. Πίνακας 3.3. Σχετική μεθυλίωση των T-UCRs στα αδενοκαρκινώματα, στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς και στα αδενώματα. Αριθμός Σχετική p Σχετική p Σχετική p Ιστός δειγμάτων μεθυλίωση μεθυλίωση μεθυλίωση Uc160 Uc283 Uc346 Παρακείμενος μη 64 0,03 0,13 0,002 νεοπλασματικός ιστός (0-6,22) (0-1,08) (0-0,93) Αδενοκαρκίνωμα 64 0,59 (0-11,0) <0, 001 0,27 (0-1,85) 0,001 0,005 (0-1,80) 0,004 Αδένωμα 6 0,55 (0,31-7,82) 0,46 (0,24-2,34) 0,11 (0-1,82) 182

183 Σχήμα 3.5. Σχετική μεθυλίωση της Uc160 στα αδενοκαρκινώματα, στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς και στα αδενώματα. Τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 στους καρκινικούς διέφεραν, επίσης, σημαντικά από τους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (p=0,001) (Πίνακας 3.3, Σχ. 3.6). Πιο συγκεκριμένα, τα αδενοκαρκινώματα είχαν διπλάσια επίπεδα μεθυλίωσης σε σχέση με τους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς. Είναι αξιοσημείωτο ότι υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 παρατηρήθηκαν και στα αδενώματα που αναλύθηκαν, και μάλιστα σχεδόν διπλάσια από αυτά των καρκινικών ιστών. Τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc346, επίσης, διέφεραν σημαντικά ανάμεσα στους καρκινικούς και στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (p=0,001) (Πίνακας 3.3, Σχ. 3.7). Πιο συγκεκριμένα, οι καρκινικοί ιστοί είχαν σχεδόν διπλάσια επίπεδα μεθυλίωσης σε σχέση με τους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς. Στα αδενώματα που αναλύθηκαν παρατηρήθηκαν ακόμα υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc346, διπλάσια από αυτά των καρκινικών ιστών. 183

184 Σχήμα 3.6. Σχετική μεθυλίωση της Uc283 στα αδενοκαρκινώματα, στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς και στα αδενώματα. 184

185 Σχήμα 3.7. Σχετική μεθυλίωση της Uc346 στα αδενοκαρκινώματα, στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς και στα αδενώματα Διερεύνηση της σχέσης με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών Συνεχίζοντας την ανάλυση των δεδομένων της ιστικής μεθυλίωσης, διερευνήθηκε η σχέση της μεθυλίωσης των T-UCRs στον καρκινικό ιστό με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών (Πίνακας 3.4). Όπως φαίνεται στον παρακάτω Πίνακα, παρατηρούνται κάποιες διαφορές στα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs ανάμεσα σε κάποια χαρακτηριστικά των ασθενών, αν και οι περισσότερες από αυτές τις διαφορές δεν είναι στατιστικά σημαντικές. Στατιστικά σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μόνο ως προς τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 και την παρουσία απομακρυσμένης μετάστασης, με τους ασθενείς που είχαν απομακρυσμένη μετάσταση να εμφανίζουν πολύ χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 σε σχέση με τους μη μεταστατικούς (Σχ. 3.8). Άλλη διαφορά που παρατηρήθηκε, χωρίς ωστόσο να είναι στατιστικά σημαντικη, ήταν αυτή των ασθενών μικρότερης ηλικίας, οι οποίοι είχαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 (p=0,06). Επίσης, ασθενείς με καλά διαφοροποιημένους όγκους εμφάνιζαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε σχέση με ασθενείς που είχαν όγκους ενδιάμεσης διαφοροποίησης (p=0,052). Πίνακας 3.4. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών με κολοορθικό καρκίνο που εντάχθηκαν στη μελέτη μας και η σχετική μεθυλίωση των Uc160, Uc283 και Uc346 στα κολοορθικά αδενοκαρκινώματα. Κλινικά και Αριθμός Σχετική Σχετική Σχετική παθολογοανατομικά ασθενών μεθυλίωση p μεθυλίωση p μεθυλίωση p χαρακτηριστικά (%) Uc160 Uc283 Uc346 Άνδρες 35 (54,7%) 0,71 0,27 0,01 185

186 Φύλο (0-7,92) 0,846 (0-0,74) 0,973 (0-0,54) 0,586 Γυναίκες 29 (45,3%) 0,45 (0-11) 0,27 (0-2,34) 0 (0-1,83) (20,3%) 1,45 (0-11) 0,28 (0,04-2,34) 0 (0-1,83) Ηλικία (79,7%) 0,50 (0-8,11) 0,06 0,27 (0-1,09) 0,707 0,01 (0-1,78) 0,764 I 3 (4,7%) 0,91 (0,26-1,57) 0,39 (0,28-0,740 0,14 (0-0,29) II 25 (39,1%) 0,82 (0-7,92) 0,25 (0-0,98) 0,01 (0-0,54) Στάδιο III 26 (40,1%) 0,64 (0-11) 0,991 0,27 (0-1,85) 0,205 0 (0-1,78) 0,896 IV 6 (9,4%) 0,47 (0-3,88) 0,16 (0,04-0,29) 0,01 (0-0,11) Υψηλή 7 (10,9%) 1,4 (0-7,92) 0,43 (0-0,74) 0 (0-0,43) Βαθμός διαφοροποίη σης 0,59 0,25 0,01 48 Μέτρια (78,5%) (0-11) (0,04-1,85) (0-1,78) 0,807 0,052 Χαμηλή 1 (1,6%) 0, ,249 Δεξιό 27 0,81 0,25 0,02 κόλον (42,2%) (0-11) (0-1,85) (0-0,92) Εντόπιση Αριστερό κόλον και σιγμοειδές 12 (18,8%) 1,45 (0-8,110 0,29 (0,06-1,090 0 (0-1,78) Ορθό 21 0,35 0,295 0,21 0, ,

187 (32,8%) (0-7,92) (0-0,74) (0-0,51) Διήθηση Όχι 29 (45,3%) 0,77 (0-7,92) 0,26 (0-0,980 0,01 (0-0,540 λεμφαδένων Ναι 31 (48,4%) 0,63 (0-11) 0,579 0,27 (0-1,86) 0,520 0 (0-1,78) 0,415 Απομακρυσμένη μετάσταση Όχι 50 (78,1) Ναι 6 (9,4%) 0,82 (0-11) 0,34 (0-3,88) 0,390 0,26 (0-1,85) 0,06 (0-0,29) 0,021 0,01 (0-0,92) 0 (0,02) 0,152 Σχήμα 3.8. Σχετική μεθυλίωση της Uc283 στα αδενοκαρκινώματα και συσχέτιση με απομακρυσμένη μετάσταση. 187

188 Μεθυλίωση των T-UCRs στους FFPE ιστούς Εκτός από τους φρεσκοκατεψυγμένους ιστούς που συνελέγησαν προοπτικά, χρησιμοποιήθηκαν 97 FFPE δείγματα ασθενών με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου από το αρχείο του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Για τους ασθενείς αυτούς, εκτός των κλινικοπαθολογοανατομιικών χαρακτηριστικών, αναζητήθηκαν τα δεδομένα υποτροπής και πενταετούς επιβίωσης και στη συνέχεια έγιναν οι αντίστοιχες συσχετίσεις με τα δεδομένα ιστικής μεθυλίωσης των T-UCRs. Από τα 97 δείγματα καρκινικού ιστού που αναλύθηκαν, η μεθυλίωση της Uc160 ανιχνεύθηκε σε 82 δείγματα, μεθυλίωση της Uc283 ανιχνεύθηκε σε 95 δείγματα και η μεθυλίωση της Uc346 ανιχνεύθηκε σε 73 δείγματα Διερεύνηση της σχέσης με τα Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.5, έχουν αναδειχθεί στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της σχετικής μεθυλίωσης των Uc160, Uc283 και της Uc346 και των επιμέρους χαρακτηριστικών των 97 ασθενών με κολοορθικό καρκίνο παχέος εντέρου που εντάχθηκαν αναδρομικά στη μελέτη μας, οι οποίες δεν έφτασαν σε στατιστική σημαντικότητα στα προοπτικά συλλεγέντα φρεσκοκατεψυγμένα δείγματα. Πιο συγκεκριμένα, τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 συσχετίστηκαν με την ηλικία και με την πρωτοπαθή εντόπιση του όγκου, με ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας ή όγκους με εντόπιση στο δεξιό κόλον να εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης, αντιστοίχως (p=0,013 και p=0,036 αντίστοιχα, Σχ. 3.9 και Σχ. 3.10, αντίστοιχα). Επίσης, τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc346 συσχετίστηκαν με το βαθμό διαφοροποίησης, με τους όγκους χαμηλής διαφοροποίησης να έχουν πολύ υψηλότερα επίπεδα, σε σχέση με τους όγκους υψηλής ή μέτριας διαφοροποίησης (p=0,035, Σχ. 3.11). 188

189 Πίνακας 3.5. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και σχετική μεθυλίωση των Uc160, Uc283 και Uc346 των 97 ασθενών με κολοορθικό καρκίνο που εντάχθηκαν αναδρομικά στη μελέτη. Κλινικά και παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών (%) Σχετική μεθυλίωση Uc160 p Σχετική μεθυλίωση Uc283 p Σχετική μεθυλίωση Uc346 p Φύλο Άνδρες 59 (60,8%) Γυναίκες 38 (39,2%) 0,28 (0-57,58) 0,62 (0-96,36) 0,108 1,03 (0-5,28) 0,77 (0-19,3) 0,473 0,02 (0-1,96) 0,02 (0-1,8) 0,667 Ηλικία (20,6%) (79,4%) 0,25 (0-2,52) 0,49 (0-96,35) 0,257 0,56 (0-5,02) 1,03 (0-19,3) 0,013 0,00 (0-0,85) 0,04 (0-1,96) 0,119 II 43 (44,3%) 0,35 (0-2,57) 0,83 (0-5,02) 0,04 (0-1,28) Στάδιο III 48 (49,5%) 0,49 (0-57,58) 0,551 1,04 (0,01-19,3) 0,357 0,02 (0-1,96) 0,362 IV 6 (6,2%) 0,43 (0-96,35) 0,54 (0-4,21) 0,00 (0-0,56) Υψηλή 17 (17,5%) 0,45 (0-3,76) 1,03 (0-5,28) 0,04 (0-1,28) Βαθμός διαφορο- Μέτρια 71 (73,2%) 0,46 (0-96,35) 0,563 0,84 (0-4,21) 0,070 0,01 (0-1,96) 0,035 ποίησης Χαμηλή 9 (9,3%) 0,78 (0-5,48) 1,56 (0,19-19,3) 0,25 (0-1,8) Δεξιό κόλον 27 0,51 0,318 1,40 0,036 0,17 0,

190 Εντόπιση (27,8%) (0-3,76) (0-3,82) (0-1,31) Αριστερό κόλον και σιγμοειδές 41 (42,3%) 0,39 (0-57,58) 0,83 (0-5,28) 0,02 (0-1,96) Ορθό 29 (29,9%) 0,17 (0-96,35) 0,67 (0-19,3) 0.01 (0-1,8) Διήθηση λεμφαδένων Όχι 43 (44,3%) 54 Ναι (55,7%) 0,35 (0-2,57) 0,49 (0-96,35) 0,286 0,83 (0-5,02) 1,03 (0-19,3) 0,459 0,04 (0-1,28) 0,02 (0-1,96) 0,825 Απομακρυσμένη μετάσταση Όχι Ναι 91 (93,8%) 6 (6,2%) 0,47 (0-96,35) 0,18 (0-1,17) 0,203 0,97 (0-19,3) 0,54 (0-1,14) 0,092 0,02 (0-1,96) 0,00 (0-0,56) 0,495 Επίσης, τα δεδομένα μεθυλίωσης των T-UCRs αναλύθηκαν ως προς τη μέγιστη διάμετρο και τους χαρακτήρες ανάπτυξης της αλλοίωσης (ελκωτικός, εξωφυτικός κτλ.), χωρίς ωστόσο να αναδειχθεί κάποια συσχέτιση. 190

191 Σχήμα 3.9. Σχετική μεθυλίωση της Uc283 στα αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου ως προς την ηλικία. Σχήμα Σχετική μεθυλίωση της Uc283 στα αδενοκαρκινώματα ως προς την πρωτοπαθή εντόπιση του όγκου. 191

192 Σχήμα Σχετική μεθυλίωση της Uc346 στα αδενοκαρκινώματα ως προς το βαθμό διαφοροποίησης. Επιπλέον, διερευνήθηκε η σχέση της μεθυλίωσης των T-UCRs στους καρκινικούς ιστούς και το χρόνο μέχρι την πρόοδο της νόσου (Time to Progression-TTP) και με τη συνολική επιβίωση, τόσο στο συνολικό πληθυσμό των ασθενών, όσο και στις υποομάδες αυτών. Η μεθυλίωση της Uc160 σχετίστηκε με το διάστημα μέχρι την υποτροπή της νόσου, σε ασθενείς ηλικίας άνω των 66 ετών. Πιο συγκεκριμένα, ασθενείς με χαμηλή μεθυλίωση της Uc160 είχαν μεγαλύτερο TTP, σε σχέση με αυτούς που είχαν μέση ή υψηλή μεθυλίωση (p=0,005, Σχ. 3.12). Η αντίθετη συσχέτιση παρατηρήθηκε στην ίδια ηλικιακή ομάδα για τη μεθυλίωση της Uc283, με τους ασθενείς που είχαν υψηλή μεθυλίωση να εμφανίζουν μεγαλύτερο TTP (p=0,050, Σχ. 3.13). Η μεθυλίωση της Uc346 σε ασθενείς με διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων σχετίστηκε με την πενταετή επιβίωση, με τους ασθενείς που είχαν υψηλή μεθυλίωση να παρουσιάζουν μεγαλύτερη επιβίωση (p=0,016, Σχ. 3.14). Στην υποομάδα των ασθενών που είχαν υψηλή μεθυλίωση της Uc283, οι ασθενείς, 192

193 οι οποίοι είχαν υψηλή μεθυλίωση Uc346, είχαν μεγαλύτερη επιβίωση σε σχέση με αυτούς που είχαν χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc346 (p=0,020, Σχ. 3.15). Σχήμα Διάγραμμα Kaplan Meier TTP σε σχέση με τη μεθυλίωση της Uc160 στα αδενοκαρκινώματα ασθενών ηλικίας άνω των 66 ετών. Σχήμα Διάγραμμα Kaplan Meier TTP σε σχέση με τη μεθυλίωση της Uc283 στα αδενοκαρκινώματα ασθενών ηλικίας άνω των 66 ετών. 193

194 Σχήμα Διάγραμμα Kaplan Meier πενταετούς επιβίωσης σε σχέση με τη μεθυλίωση της Uc346 στα αδενοκαρκινώματα ασθενών με διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων. Σχήμα Διάγραμμα Kaplan-Meier πενταετούς επιβίωσης ασθενών με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου και υψηλή μεθυλίωση της Uc283 σε σχέση με τη μεθυλίωση της Uc

195 Μεθυλίωση των T-UCRs στο πλάσμα Στη συνέχεια, τα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs προσδιορίστηκαν σε δείγματα πλάσματος από 40 υγιείς, 12 ασθενείς με φλεγμονώδεις αλλοιώσεις παχέος εντέρου (φλεγμονώδη νόσο του εντέρου, εκκολπωματίτιδα ή χρόνια φλεγμονή) 50 ασθενείς με ιστολογικά τεκμηριωμένο κολοορθικό καρκίνο και 59 ασθενείς με αδένωμα παχέος εντέρου ή ορθού. Επιπλέον, τα επίπεδα μεθυλίωσης προσδιορίστηκαν στο πλάσμα 11 ασθενών με κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα και 1 ασθενή με αδένωμα, των οποίων τα δείγματα είχαν συλλεγεί μετεγχειρητικά και αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση. Από την ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα των συμμετεχόντων (p=0,042). Πιο συγκεκριμένα, τα επίπεδα β-ακτίνης ήταν υψηλότερα στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο σε σχέση με τους υγιείς, τους ασθενείς με αδενώματα και τους ασθενείς με φλεγμονώδεις αλλοιώσεις, υποδεικνύοντας τη μεγαλύτερη συγκέντρωση κυκλοφορούντος DNA στο πλάσμα ασθενών με καρκίνο (σχετικές διάμεσες τιμές 0,20, 0,12, 0,06 και 0,04 αντίστοιχα, Σχ. 3.16). Σχήμα Επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα στις διαφορετικές κατηγορίες των συμμετεχόντων. 195

196 Επιπλέον, τα επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα διέφεραν ανάμεσα σε καπνιστές και μη καπνιστές, με τους μη καπνιστές να έχουν διπλάσια συγκέντρωση σε σχέση με τους καπνιστές (p=0,046). Ανάλογες με άλλους παράγοντες του τρόπου ζωής (κατανάλωση αλκοόλ, κρέατος και καφέ, άσκηση), ενώ οριακή συσχέτιση βρέθηκε με το BMI των συμμετεχόντων, με τους λιποβαρείς (BMI<18,5) να έχουν αυξημένα επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα σε σχέση με τους νορμοβαρείς (BMI 18,6-24,9) ή τους υπέρβαρους και παχύσαρκους (ΒΜΙ >25) (p=0,050) (Πίνακας 3.6). Επίσης, δεν ανευρέθηκαν συσχετίσεις με παθολογοανατομικές παραμέτρους, όπως το στάδιο της νόσου, την αρχική εντόπιση, το βαθμό διαφοροποίησης κ.ά. (Πίνακας 3.7). Πίνακας 3.6. Δημογραφικά χαρακτηριστικά και χαρακτηριστικά του τρόπου ζωής των συμμετεχόντων στη μελέτη μας και επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα τους. Δημογραφικά χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών Επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα p Φύλο Άνδρας 89 (55,3%) 0,50 (0,01-9,92) Γυναίκα 72 (44,7%) 0,46 (0,00-4,40) 0,412 Ηλικία (39,8%) 0,37 (0,00-3,90) (60,2%) 0,56 (0,00-9,92) 0,572 Κάπνισμα Όχι 84 (52,2%) 0,54 (0,00-9,92) Ναι 45 (28%) 0,35 (0,00-4,54) 0,046 Οικογενειακό ιστορικό καρκίνου Όχι 56 (34,8%) 0,42 (0,00-4,86) Ναι 62 (38,5%) 0,44 (0,00-9,92) 0,695 Κατανάλωση Όχι 23 (14,3%) 0,51 (0,00-9,92) 0,

197 καφέ Ναι 100 (62,1%) 0,35 (0,00-4,04) Κατανάλωση αλκοόλ Όχι 69 (42,9%) 0,54 (0,00-4,18) Ναι 61 (37,9%) 0,42 (0,00-9,92) 0,192 <2 φορές/εβδ 24 (14,9%) 0,25 (0,00-1,74) Κατανάλωση κρέατος >2 και <4/εβδ 51 (31,7%) 0,41 (0-3,92) >4/εβδ 45 (28%) 0,60 (0-9,92) 0,709 Άσκηση Καθόλου-Λίγη 78 (48,4%) 0,46 (0-9,92) Μέτρια-Έντονη 51 (31,7%) 0,41 (0-1,74) 0,474 <18,5 30 (18,6%) 0,81 (0-4,19) BMI 18,6-24,9 42 (26,1%) 0,47 (0-4,00) 0,50 >25 59 (36,6%) 0,23 (2,08) Πίνακας 3.7. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών με κολοορθικό καρκίνο και επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα τους. Κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Αριθμός ασθενών (%) Επίπεδα β- ακτίνης p Φύλο Άνδρες 30 (60%) 0,74 (0-9,92) Γυναίκες 20 (40%) 0,63 (0-2,93) 0,678 Ηλικία (28%) 0,49 (0-2,45) (72%) 0,83 (0-9,92) 0, (6%) 0,05 (0-0,12) Ι 2 (4%) 4,97 (0-9,92) 0,377 Στάδιο II 20 (40%) 0,21 (0-0,59) 197

198 III 20 (40%) 0,84 (0-2,61) IV 6 (12%) 0,13 (0-0,44) Υψηλή 6 (12%) 0,92 (0-9,92) Βαθμός διαφοροποίησης Μέτρια 43 (86%) 0,33 (0-1,57) Χαμηλή 1 (2%) 0,788 Δεξιό κόλον 23 (46%) 0,39 (0-1,57) Αριστερό Εντόπιση κόλον και σιγμοειδές 6 (12%) 1,81 (0-9,92) 0,819 Ορθό 21 (42%) 0,48 (0-2,75) Διήθηση λεμφαδένων Όχι 25 (50%) 0,77 (0-9,92) Ναι 25 (50%) 0,66 (0-2,89) 0,379 Απομακρυσμένη μετάσταση Όχι 44 (88%) 0,85 (0-9,92) Ναι 6 (12%) 0,48 (0,03-1,34) 0,860 Από την άλλη πλευρά, η συχνότητα μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα ήταν μεγαλύτερη στους ασθενείς με καρκίνο και μικρότερη στους υγιείς (Πίνακας 3.8). Τα επίπεδα μεθυλίωσης των Uc160 και Uc346 διέφεραν σημαντικά ανάμεσα στις διαφορετικές κατηγορίες συμμετεχόντων (p<0,001 και p=0,039 αντίστοιχα). Πιο συγκεκριμένα, οι ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο είχαν τις υψηλότερες σχετικές διάμεσες τιμές σε σχέση με τους ασθενείς με αδενώματα, ασθενείς με φλεγμονή και υγιείς δότες (Πίνακας 3.9). 198

199 Πίνακας 3.8. Συχνότητα μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα στις διάφορες ομάδες των ασθενών και των υγιών δοτών. T-UCR Uc160 Uc283 Uc346 Κατάσταση μεθυλίωσης Μη μεθυλιωμένη Υγιείς Ασθενείς *Ασθενείς: ασθενείς με φλεγμονώδεις αλλοιώσεις Κατηγορία Σύνολο Πίνακας 3.9. Επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα στις διάφορες ομάδες των ασθενών και των υγιών δοτών. με αδενώματ α Ασθενείς με καρκίνο Ασθενείς* 38 (95%) 52 (89,7%) 26 (66,7%) 9 (75%) 125 Μεθυλιωμένη 2 (5%) 6 (10,3%) 13 (33,3%) 3 (25%) 24 Μη μεθυλιωμένη 38 (95%) 54 (93,1%) 34 (87,2%) 10 (83,3%) 135 Μεθυλιωμένη 2 (5%) 4 (6,7%) 5 (12,8%) 2 (16,7%) 13 Μη μεθυλιωμένη 37 (92,5) 50 (86,2%) 30 (76,9%) 12 (100%) 129 Μεθυλιωμένη 3 (7,5%) 8 (13,8%) 9 (23,1%) 0 (0%) 20 Σύνολο Επίπεδα μεθυλίωσης Υγιείς Κατηγορία Ασθενείς με Ασθενείς με αδενώματα καρκίνο Ασθενείς* p Uc160 0,005 (0-0,1) 0,02 (0-0,31) 0,08 (0-0,34) 0,04 (0-0,26) <0,001 Uc283 0,01 (0-0,29) 0,02 (0-0,34) 0,04 (0-0,5) 0,04 (0-0,33) 0,439 Uc346 0,01 (0-0,24) 0,02 (0-0,28) 0,04 (0-0,29) 0 0,039 *Ασθενείς: ασθενείς με φλεγμονώδεις αλλοιώσεις. 199

200 Σχήμα Συσχέτιση των επιπέδων μεθυλίωσης της Uc160 στο πλάσμα με το μέγεθος του αδενώματος ή του αδενοκαρκινώματος. Στους ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα ή αδένωμα τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 στο πλάσμα συσχετίστηκαν θετικά με το μέγεθος της αλλοίωσης (του όγκου ή του αδενώματος) (p<0,001, Σχ. 3.17). Επιπλέον, τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 στο πλάσμα ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς που είχαν διήθηση των λεμφαδένων (p=0,024). Επίσης, μία άλλη συσχέτιση, η οποία προέκυψε ήταν με την ηλικία και το φύλο των ασθενών. Πιο συγκεκριμένα, η συχνότητα της μεθυλιωμένης Uc160 στο πλάσμα ήταν υψηλότερη στους άνδρες ασθενείς και σε ασθενείς άνω των 60 ετών (p=0,023 και p=0,040, Πίνακας 3.10). Στον Πίνακα 3.10 φαίνονται αναλυτικότερα τα χαρακτηριστικά των ατόμων που είχαν μεθυλιωμένη Uc160 στο πλάσμα τους. 200

201 Πίνακας Χαρακτηριστικά ασθενών με μεθυλιωμένη Uc160 στο πλάσμα. Κωδικός ασθενούς Φύλο Ηλικία Κατηγορία Βαθμός διαφοροποίησης του όγκου Διήθηση λεμφαδένων Στάδιο Μέγεθος όγκου/ αδενώματος 045 Α 64 Αδ 0,5 ΑΚ 049 Α 80 Αδ 2 Ο 053 Γ 59 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 5,5 ΔΚ 062 Γ 67 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 4,5 ΑΚ 064 Γ 49 Υ 066 Α 72 ΚΟΑ Χαμηλή Όχι I 2,8 ΑΚ 077 Α 40 Φ 079 Γ 86 ΚΟΑ Όχι II 5,5 ΔΚ 084 Α 61 Αδ 4 ΔΚ 090 Α 73 Αδ 0,3 ΔΚ 095 Α 80 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,8 ΔΚ 102 Α 75 Ε 104 Α 63 Αδ 0,15 ΑΚ Εντόπιση όγκου/ αδενώ- ματος 113 Γ 83 Αδ 0,2 ΑΚ και 130 Α 63 Φ 131 Α 77 ΚΟΑ Μέτρια Όχι II 5,3 Ο 138 Α 82 ΚΟΑ Ναι III 8 Ο 147 Α 64 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 3,3 ΑΚ 148 Α 9 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 2,5 ΔΚ 156 Α 43 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,5 Ο 165 Α 64 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 6,5 ΑΚ 198 Α 80 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 5 Ο 224 Γ 66 Υ 229 Α 62 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,5 ΑΚ 230 Γ 73 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,5 Ο 243 Α 69 ΚΟΑ Μέτρια Όχι II 5,8 ΔΚ Α: άνδρας, Γ: γυναίκα, ΚΟΑ: κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα, Αδ: αδένωμα, Υ: υγιείς, Φ: φλεγμονή, Ε: εκκολπωμάτωση, ΔΚ: τυφλό, ανιόν, δεξιό ημιμόριο του εγκαρσίου, ΑΚ: αριστερό ημιμόριο του εγκαρσίου, κατιόν, σιγμοειδές, Ο: ορθό. Ο Αν και τα δείγματα αίματος που συνελέγησαν μετεγχειρητικά δεν επεξεργάστηκαν στατιστικά, ωστόσο, προκύπτουν ορισμένες αξιοσημείωτες διαπιστώσεις, οι οποίες απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση και μελέτη. Μία 201

202 εντυπωσιακή παρατήρηση είναι πως όλα τα δείγματα των ανωτέρω ασθενών ήταν μη μεθυλιωμένα για την Uc160. Εξαίρεση απετέλεσε ένας ασθενής, ο οποίος είχε ενεργή νόσο μετεγχειρητικά και στον οποίο η Uc160 στο πλάσμα παρέμεινε μεθυλιωμένη. Ο ασθενής αυτός (#062) ήταν σταδίου D με δευτεροπαθείς εναποθέσεις ήπατος, ο οποίος υπεβλήθη σε κολεκτομή χωρίς όμως να υποβληθεί μεταστασεκτομή. Ομοίως, μεθυλιωμένη ανιχνεύθηκε η Uc160 στον ασθενή (#077) με ισχαιμική κολίτιδα, στον οποίο ο περαιτέρω κλινικοεργαστηριακός έλεγχος ανέδειξε καρκίνωμα νεφρού με δευτεροπαθείς εναποθέσεις ήπατος. Επίσης, σε αντίθεση με τα προηγούμενα ευρήματα, ο ασθενής #134, ο οποίος είχε οικογενειακό ιστορικό κολοορθικού καρκίνου, διατήρησε αρνητική μεθυλίωση της Uc160 στο πλάσμα σε τρεις διαφορετικές χρονικές στιγμές, για τις οποίες υπήρχαν διαθέσιμα δείγματα (πριν την κολονοσκόπηση, πριν το χειρουργείο και πριν την έναρξη της θεραπείας, μετεγχειρητικά). Με αφορμή την παρατήρηση αυτή, περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής σχέσης της μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα των ασθενών της ομάδας μελέτης με το οικογενειακό ιστορικό για κακοήθεις νεοπλασίες, οδήγησε στην διαπίστωση πως ασθενείς με σποραδικό καρκίνο εμφάνιζαν συχνότερα μεθυλιωμένη την Uc160 (57,1%) και την Uc346 (25%) στο πλάσμα τους, σε σχέση με τους ασθενείς, οι οποίοι είχαν οικογενειακό ιστορικό με τουλάχιστον έναν πρώτου βαθμού συγγενή με οποιοδήποτε τύπο καρκίνου (Uc160 15,4% και Uc346 7,7%) (p=0,052 και p=0,015, αντίστοιχα). Η διαφορά αυτή παρέμεινε για τη μεθυλιωμένη Uc160, όταν στην ομάδα των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου συμπεριλήφθησαν και ασθενείς με αδένωμα (25% στο γενικό πληθυσμό vs 7,9% στους ασθενείς με οικογενειακό ιστορικό καρκίνου, p=0,050). Εκτός από την κατάσταση μεθυλίωσης (μεθυλιωμένη ή όχι), διέφεραν επίσης και τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 μεταξύ των δύο ομάδων, με τους ασθενείς με σποραδικό κολοορθικό καρκίνωμα ή αδένωμα να έχουν υψηλότερα επίπεδα σε σχέση με τους ασθενείς με οικογενειακό ιστορικό (p= 0,049). 202

203 Τα επίπεδα μεθυλίωσης των τριών T-UCRs που αναλύθηκαν στο πλάσμα ήταν ανεξάρτητα από τους παράγοντες του τρόπου ζωής και τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, οι οποίες περιγράφονται παραπάνω. Στον Πίνακα 3.11 και στον Πίνακα 3.10 φαίνονται αναλυτικότερα τα χαρακτηριστικά των ατόμων που είχαν μεθυλιωμένη Uc283 και Uc346 αντίστοιχα στο πλάσμα τους. Πίνακας Χαρακτηριστικά ασθενών με μεθυλιωμένη Uc283 στο πλάσμα. Κωδικός ασθενούς Φύλο Ηλικία Εστία Βαθμός διαφοροποίησης του όγκου Διήθηση λεμφαδένων Στάδιο Μέγεθος Εντόπιση TU-050 Α 67 Ε TU-055 Α 49 Υ TU-062 TU-066 TU-073 Γ 67 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 4,5 ΑΚ Α 72 ΚΟΑ Υψηλή Όχι I 2,8 ΑΚ Α 55 Αδ 0,15 ΔΚ TU-090 Α 73 Αδ 0,3 ΑΚ και ΔΚ TU-137 Α 92 Ε TU-147 TU-148 TU-161 TU-186 TU-209 TU-212 TU-215 TU-244 TU-245 Α 64 ΚΟΑ Υψηλή Ναι III 2,5 ΔΚ Α 61 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 3,3 ΔΚ Γ 71 Υ Γ 61 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 3 ΑΚ Γ 65 Αδ 3 ΑΚ Α 73 Αδ 4 ΑΚ Α 76 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV Ο Γ 75 ΚΟΑ Μέτρια Όχι II 3 Ο Α 67 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 5 ΑΚ Α: άνδρας, Γ: γυναίκα, ΚΟΑ: κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα, Αδ: αδένωμα, Υ: υγιείς, Φ: φλεγμονή, Ε: εκκολπωμάτωση, ΔΚ: τυφλό, ανιόν, δεξιό ημιμόριο του εγκαρσίου, ΑΚ: αριστερό ημιμόριο του εγκαρσίου, κατιόν, σιγμοειδές, Ο: ορθό. 203

204 Πίνακας Χαρακτηριστικά ασθενών με μεθυλιωμένη Uc346 στο πλάσμα. Κωδικός ασθενούς Φύλο Ηλικία Κατηγορία Βαθμός διαφοροποίησης του όγκου Διήθηση λεμφαδένων Στάδιο Μέγεθος Εντόπιση TU-037 Γ 49 Υ TU-045 TU-048 TU-053 TU-071 TU-088 TU-090 TU-094 Α 64 Αδ 0,15 ΑΚ Γ 69 Αδ 1 ΑΚ Γ 59 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 5,5 ΔΚ Γ 58 Αδ 0,5 ΑΚ Α 86 Αδ 0,1 ΔΚ Α 73 Αδ 0,3 ΔΚ Α 50 Υ 9 TU-097 Α 70 Αδ 0,15 ΑΚ, ΔΚ και Ο TU-110 TU-125 TU-131 TU-147 TU-149 TU-151 TU-156 TU-198 TU-210 TU-215 TU-230 Α 65 ΚΟΑ Μέτρια Όχι II 5 Ο Γ 62 Αδ 0,8 ΔΚ Α 77 ΚΟΑ Μέτρια Όχι II 5,3 Ο Α 64 ΚΟΑ Υψηλή Ναι III 2,5 ΔΚ Α 81 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,8 ΔΚ Γ 58 Υ Α 43 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,5 Ο Α 80 ΚΟΑ Μέτρια Ναι III 5 Ο Γ 62 Αδ 0,5 Ο Α 76 ΚΟΑ Μέτρια IV 9 Ο Γ 73 ΚΟΑ Μέτρια Ναι IV 5,5 Ο Α: άνδρας, Γ: γυναίκα, ΚΟΑ: κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα, Αδ: αδένωμα, Υ: υγιείς, Φ: φλεγμονή, Ε: εκκολπωμάτωση, ΑΚ: αριστερό κόλον, ΔΚ: δεξιό κόλον, Ο: ορθό. 204

205 Στη συνέχεια, αναλύθηκαν όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί των μεθυλιωμένων T-UCRs στο πλάσμα με σκοπό να αναγνωριστεί ο συνδυασμός με τις υψηλότερες τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας για την ανίχνευση αδενοκαρκινώματος παχέος εντέρου (Πίνακας 3.13, Σχ ). Βρέθηκε ότι η μεθυλίωση της Uc160 είναι αρκετά υποσχόμενος βιοδείκτης για τον κολοορθικό καρκίνο, με ευαισθησία και ειδικότητα 35% και 89% αντίστοιχα (p=0,016, AUC=0,628). Επίσης, ο συνδυασμός της μεθυλιωμένης Uc160 με τη μεθυλιωμένη Uc283 ή Uc346 αυξάνουν την ευαισθησία (40% και 42,5% αντίστοιχα), μειώνοντας όμως τις τιμές της ειδικότητας (82,6% και 80,7%, p=0,018 και p=0,009, AUC=0,627 και AUC=0,639 αντίστοιχα). Το ίδιο παρατηρείται και στο συνδυασμό και των τριών μεθυλιωμένων T-UCRs, όπου παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη ευαισθησία (45%), αλλά με μειωμένη ειδικότητα (74,3%, AUC=0,633, p=0,013). Πίνακας Τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας της μεθυλίωσης των T- UCRs στο πλάσμα για το κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα. Επίπεδα μεθυλίωσης στο πλάσμα Ευαισθησία Ειδικότητα AUC* p Uc160 35% 89% 0,628 0,016 Uc283 12,5% 92,7% 0,529 0,591 Uc346 22,5% 77,5% 0,566 0,221 Uc160 + Uc283 40% 82,6% 0,627 0,018 Uc160 + Uc346 42,5% 80,7% 0,639 0,009 Uc283 + Uc346 30% 83,5% 0,577 0,151 Uc160 + Uc283 + Uc346 45% 74,3% 0,633 0,013 *AUC: Area under ROC curve, επιφάνεια κάτω από την καμπύλη 205

206 Σχήμα Καμπύλες ROC ευαισθησίας και ειδικότητας όλων των συνδυασμών των μεθυλιωμένων T-UCRs στο πλάσμα για το κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα. Σχήμα Καμπύλες ROC ευαισθησίας και ειδικότητας της μεθυλιωμένης Uc160 στο πλάσμα για το κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα. 206

207 Σχήμα Καμπύλες ROC ευαισθησίας και ειδικότητας των μεθυλιωμένων Uc160 και Uc283 στο πλάσμα για το κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα. Σχήμα Καμπύλες ROC ευαισθησίας και ειδικότητας των μεθυλιωμένων Uc160 και Uc346 στο πλάσμα για το κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα. 207

208 Σχήμα Καμπύλες ROC ευαισθησίας και ειδικότητας των μεθυλιωμένων T- UCRs στο πλάσμα για το κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα. Οι παραπάνω συνδυασμοί και οι αναλύσεις των μεθυλιωμένων T-UCRs στο πλάσμα έγιναν, επίσης, για την αναγνώριση των υψηλότερων τιμών ευαισθησίας και ειδικότητας για την ανίχνευση αδενοκαρκινώματος ή αδενώματος. Δηλαδή στην ομάδα των ασθενών με καρκίνο προστέθηκαν και οι ασθενείς με αδένωμα (Πίνακας 3.14, Σχ. 3.23). Όπως αναγράφεται στον Πίνακα 3.11, ο συνδυασμός των μεθυλιωμένων Uc160 και Uc346 φαίνεται να έχει υψηλές τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας (30,2% και 83% αντίστοιχα, AUC=0,570), καθώς επίσης και ο συνδυασμός και των τριών T-UCRs (34,4% και 75,5% αντίστοιχα, AUC=0,581), χωρίς ωστόσο να είναι στατιστικά σημαντικά τα αποτελέσματα (p=0,160 και p=0,252). 208

209 Πίνακας Τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας της μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα για το κολοορθικό αδένωμα ή αδενοκαρκίνωμα. Επίπεδα μεθυλίωσης στο πλάσμα Ευαισθησία Ειδικότητα AUC* p Uc160 20,8% 88,7% 0,554 0,276 Uc283 9,4% 92,5% 0,511 0,826 Uc346 17,1% 94,3% 0,562 0,210 Uc160 + Uc283 26% 81,1% 0,557 0,252 Uc160 + Uc346 30,2% 83% 0,570 0,160 Uc283 + Uc346 24% 86,8% 0,548 0,332 Uc160 + Uc283 + Uc346 34,4% 75,5% 0,581 0,252 *AUC: Area under ROC curve, επιφάνεια κάτω από την καμπύλη Σχήμα Καμπύλες ROC ευαισθησίας και ειδικότητας όλων των συνδυασμών των μεθυλιωμένων T-UCRs στο πλάσμα για το κολοορθικό αδένωμα ή αδενοκαρκίνωμα. 209

210 Μεθυλίωση των T-UCRs στα ούρα Στη συνέχεια, τα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs προσδιορίστηκαν σε δείγματα ούρων ασθενών ή υγιών δοτών, για τους οποίους είχε μελετηθεί η μεθυλίωση στο πλάσμα και είχαν συλλεγεί ούρα. Πιο συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε η μεθυλίωση σε δείγματα ούρων από 26 υγιείς, 10 ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο εντέρου ή εκκολπωματίτιδα, 24 ασθενείς με κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα (προεγχειρητικά δείγματα) και 26 ασθενείς με αδένωμα παχέος εντέρου. Από τα 86 δείγματα που αναλύθηκαν, τα 80 δείγματα αναλύθηκαν περαιτέρω, καθώς τα υπόλοιπα 6 είχαν Ct για τη β-ακτίνη πάνω από 40, επομένως χαμηλή συγκέντρωση κυκλοφορούντος DNA. Οι τιμές Ct για τη β- ακτίνη των δειγμάτων που αναλύθηκαν, ήταν αρκετά χαμηλές (ξεκινούσαν από 27,05), και δεδομένου ότι τα ούρα είχαν φυγοκεντρηθεί, ώστε να είναι ελεύθερα κυττάρων, υποδεικνύουν ότι μετά την απομόνωση επιτεύχθηκαν υψηλά επίπεδα κυκλοφορούντος DNA στα ούρα, τα οποία διατηρήθηκαν μετά τη διθειώδη μετατροπή (δεδομένου ότι οι εκκινητές προσδένονταν στο τροποποιημένο DNA). Ωστόσο, λίγα δείγματα είχαν μεθυλιωμένες τις Uc160 και Uc283, ενώ κανένα δεν είχε μεθυλιωμένη τη Uc346. Ειδικότερα, 14 δείγματα είχαν μεθυλιωμένη Uc160, από τα οποία 5 ανήκαν σε υγιείς δότες, 3 σε ασθενείς με καρκίνο και 6 σε ασθενείς με αδένωμα, ενώ μόνο 2 από τα δείγματα που ήταν μεθυλιωμένα στο πλάσμα ανιχνεύθηκαν μεθυλιωμένα στα ούρα (Πίνακας ). Για τη Uc283, 3 δείγματα είχαν μεθυλιωμένη Uc283, από τα οποία το 1 ανήκε σε υγιή δότη, 1 σε ασθενή με καρκίνο και 1 σε ασθενή με αδένωμα, ενώ 2 από τα τρία δείγματα ήταν μεθυλιωμένα και στο πλάσμα (Πίνακας 3.15, 3.17). 210

211 Πίνακας Συχνότητα μεθυλίωσης των T-UCRs στα ούρα στις διαφορετικές κατηγορίες συμμετεχόντων (μόνο προεγχειρητικά δείγματα). Κατηγορία Κατάσταση T-UCR μεθυλίωσης στα ούρα Υγιείς Ασθενείς με αδένωμα Ασθενείς με καρκίνο Ασθενείς* Σύνολο Uc160 Μη μεθυλιωμένη 20 (80%) 20 (76,9%) 17 (85%) 9 (100%) 66 Μεθυλιωμένη 5 (20%) 6 (23,1%) 3 (15%) 0 (0%) 14 Uc283 Μη μεθυλιωμένη 24 (96%) 25 (96,2%) 19 (95%) 9 (100%) 77 Μεθυλιωμένη 1 (4%) 1 (3,8%) 1 (5%) 0 (0%) 3 Uc346 Μη μεθυλιωμένη 25 (100%) 26 (100%) 20 (100%) 9 (100%) 80 Μεθυλιωμένη 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 Σύνολο *Ασθενείς: ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου ή εκκολπωματίτιδα. Πίνακας Χαρακτηριστικά ασθενών με μεθυλιωμένη Uc160 στα ούρα. Κωδικός ασθενούς TU-048 Φύλο Ηλικία Βαθμός Κατηγορίποίησης στο πλάσμα διαφορο- Μεθυλίωση Στάδιο Μέγεθος Εντόπιση του όγκου Γ 69 Αδ 1 ΑΚ Όχι TU-064 Γ 49 Υ Ναι TU-067 TU-094 Γ 80 Αδ 1 ΑΚ Όχι Α 50 Υ Όχι TU-097 Α 70 Αδ 0,15 ΑΚ, ΔΚ και Ο Όχι TU-113 Γ 83 Αδ 0,2 ΑΚ και Ο Ναι 211

212 TU-121 TU-125 TU-151 TU-161 TU-163 TU-164 TU-169 TU-186 Α 66 ΚΟΑ Μέτρια II 3,7 ΑΚ και Ο Όχι Γ 62 Αδ 0,8 ΔΚ Όχι Γ 58 Υ Όχι Γ 71 Υ Όχι Α 76 Υ Όχι Γ 55 Αδ 0,8 ΑΚ Όχι Γ 78 ΚΟΑ Μέτρια II 2,5 Ο Όχι Γ 61 ΚΟΑ Μέτρια III 3 ΑΚ Όχι Α: άνδρας, Γ: γυναίκα, ΚΟΑ: κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα, Αδ: αδένωμα, Υ: υγιείς, Φ: φλεγμονή, Ε: εκκολπωμάτωση, ΑΚ: αριστερό κόλον, ΔΚ: δεξιό κόλον, Ο: ορθό. Πίνακας Χαρακτηριστικά ασθενών με μεθυλιωμένη Uc283 στα ούρα. Κωδικός ασθενούς TU-067 TU-161 TU-186 Φύλο Ηλικία Τύπος Βαθμός διαφοροποίησης του όγκου Στάδιο Μέγεθος Εντόπιση Μεθυλίωσ η στο πλάσμα Γ 80 Αδ 1 ΑΚ Όχι Γ 71 Υ Ναι Γ 61 ΚΟΑ Μέτρια III 3 ΑΚ Ναι Α: άνδρας, Γ: γυναίκα, ΚΟΑ: κολοορθικό αδενοκαρκίνωμα, Αδ: αδένωμα, Υ: υγιείς, Φ: φλεγμονή, Ε: εκκολπωμάτωση, ΑΚ: αριστερό κόλον, ΔΚ: δεξιό κόλον, Ο: ορθό. 212

213 3.3. Λειτουργική μελέτη των T-UCRs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, διερευνήθηκε ο ρόλος των Uc160 και Uc346, οι οποίες φάνηκαν να είναι οι πιο υποσχόμενοι βιοδείκτες. Για το σκοπό αυτό οι Uc160 και Uc346 υπερεκφράστηκαν στις καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου, HT-29, Caco-2 και DLD-1 και μελετήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης στον πολλαπλασιασμό, τη μετακίνηση και τη μετανάστευση των κυττάρων Έλεγχος διαμόλυνσης Μετά τη διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών με τις Uc160 και Uc346, έγινε έλεγχος για την επιτυχία της διαμόλυνσης των κυττάρων. Ο έλεγχος αυτός έγινε προσδιορίζοντας τα επίπεδα έκφρασης των Uc160 και Uc346 στα κύτταρα. Πράγματι, μετά τη διαμόλυνση, τα επίπεδα έκφρασης των Uc160 και Uc346 ήταν έως και 1000 φορές υψηλότερα σε όλες τις υπό μελέτη κυτταρικές σειρές, σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες, δηλαδή κύτταρα της ίδιας σειράς, τα οποία είχαν διαμολυνθεί με πλασμίδιο που δεν έφερε τη μία ή την άλλη T-UCR (Σχ ). Σχήμα Διάγραμμα σχετικής έκφρασης της Uc160 στις κυτταρικές σειρές μετά από 213

214 υπερέκφραση της Uc160 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες. Σχήμα Διάγραμμα σχετικής έκφρασης της Uc346 στις κυτταρικές σειρές μετά από υπερέκφραση της Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες Πολλαπλασιασμός (MTT assay) Εφόσον επιβεβαιώθηκε η απόδοση της διαμόλυνσης, προσδιορίστηκε ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων 24 και 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Στα Caco-2 κύτταρα που υπερεξέφραζαν τη Uc160, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερος στις 24 ώρες και ακόμα πιο υψηλός στις 48 ώρες (p=0,050 και p=0,008 αντίστοιχα, Σχ. 3.26). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και για τα κύτταρα, τα οποία υπερεξέφραζαν τη Uc346, με το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων να είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερος στις 24 ώρες (p=0,002). 214

215 Στα DLD-1 κύτταρα παρατηρήθηκε υψηλότερος ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τα οποία υπερεξέφραζαν τη Uc160 ή τη Uc346 στις 48 ώρες, ενώ ήταν στατιστικά σημαντικός μόνο για τη Uc346 (p=0,131 και p=0,033 αντίστοιχα, Σχ. 3.27). Σχήμα Διάγραμμα πολλαπλασιασμού των Caco-2 κυττάρων μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες. *p<0,05 και **p<0,01 Σχήμα Διάγραμμα πολλαπλασιασμού των DLD-1 κυττάρων μετά από υπερέκφραση των 215

216 Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες. *p<0,05 Στα ΗΤ-29 κύτταρα παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα, με τα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τη Uc160 ή τη Uc346 στις 48 ώρες να εμφανίζουν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα, χωρίς όμως οι σχέσεις αυτές να είναι στατιστικά σημαντικές (p=0,173 και p=0,767 αντίστοιχα) (Σχ. 3.28). Σχήμα Διάγραμμα πολλαπλασιασμού των HT-29 κυττάρων μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες Μετακίνηση (Scratch wound healing assay) Στη μελέτη μετακίνησης, η οποία πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια, τα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί παροδικά με το πλασμίδιο, το οποίο έφερε τη Uc160 ή τη Uc346, εμφάνιζαν αυξημένους ρυθμούς μετακίνησης σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν και σε όλες τις διαφορετικές χρονικές στιγμές σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες. Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα Caco-2 που υπερεξέφραζαν τη Uc346 στις 48 ώρες είχαν καλύψει το 99,01% της αρχικής επιφάνειας, σε σχέση με τα 216

217 κύτταρα - μάρτυρες που είχαν καλύψει το 79,28% της αρχικής επιφάνειας (μέση τιμή, p=0,028, Σχ ). Αυξημένοι ρυθμοί παρατηρήθηκαν και στις 24 ώρες, χωρίς να είναι στατιστικά σημαντική η διαφορά (p=0,260 για τη Uc160 και p=0,678 για τη Uc346). Σχήμα Διάγραμμα μετακίνησης των Caco-2 κυττάρων μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες, υπολογισμένης ως προς το ποσοστό της καλυφθείσας επιφάνειας σε σχέση με την αρχική. *p<0,05 217

218 Σχήμα Μικροφωτογραφίες των κυττάρων Caco-2 και της μετακίνησής τους μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες (μέθοδος scratch wound healing). Στα κύτταρα ΗΤ-29 παρατηρήθηκαν επίσης αυξημένοι ρυθμοί μετακίνησης. Παρόλο που οι διαφορές ήταν μικρές, κυρίως λόγω του χαμηλού μεταναστευτικού δυναμικού των κυττάρων, η υψηλή επαναληψιμότητα τις κατέστησε στατιστικά σημαντικές (Σχ ). Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τη Uc160 στις 24 ώρες είχαν καλύψει το 14,95% και στις 48 ώρες το 28,19% της αρχικής επιφάνειας, σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές 11,14% και 21,80% των κυττάρων μάρτυρα (p=0,023 και p=0,039, αντίστοιχα). Παρόμοια αποτελέσματα έδωσαν και τα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τη Uc346, τα οποία στις 24 ώρες είχαν καλύψει το 14,64% και στις 48 ώρες το 26,28% της αρχικής επιφάνειας (p=0,011 και p=0,017, αντίστοιχα). Σχήμα Διάγραμμα μετακίνησης των HT-29 κυττάρων μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες, υπολογισμένης ως προς το ποσοστό της 218

219 καλυφθείσας επιφάνειας σε σχέση με την αρχική. *p<0,05 και **p<0,01 Σχήμα Μικροφωτογραφίες των κυττάρων ΗΤ-29 και της μετακίνησής τους μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα -μάρτυρα (μέθοδος scratch wound healing). Στα κύτταρα DLD-1 οι διαφορές στους ρυθμούς μετακίνησης ήταν επίσης στατιστικά σημαντικές (Σχ ). Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα, τα οποία υπερεξέφραζαν τη Uc160, είχαν καλύψει το 65,76% και το 84,64% της αρχικής επιφάνειας στις 24 ώρες και στις 48 ώρες αντίστοιχα, σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές 55,16% και 80,55% των κυττάρων μαρτύρων (p=0,017 και p=0,042, αντίστοιχα). Παρόμοια αποτελέσματα έδωσαν και τα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τη Uc346, τα οποία στις 24 ώρες είχαν καλύψει το 60,20% και στις 48 ώρες το 86,91% της αρχικής επιφάνειας (p=0,041 και p=0,043, αντίστοιχα). 219

220 Σχήμα Διάγραμμα μετακίνησης των DLD-1 κυττάρων μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα-μάρτυρα, υπολογισμένης ως προς το ποσοστό της καλυφθείσας επιφάνειας σε σχέση με την αρχική. *p<0,05 Σχήμα Μικροφωτογραφίες των κυττάρων DLD-1 και της μετακίνησής τους μετά από υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε σχέση με τα κύτταρα- μάρτυρα (μέθοδος scratch wound healing). 220

221 Μετανάστευση (Transwell assay) Τα κύτταρα DLD-1 επιλέχθηκαν να μελετηθούν περαιτέρω, όσον αφορά στις επιπτώσεις που θα είχε η υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 στη μετανάστευσή τους. Έτσι, παρατηρήθηκαν διαφορές στον αριθμό κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει, με περισσότερα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τη Uc160 ή τη Uc346 να μεταναστεύουν σε σχέση με τα κύτταρα - μάρτυρες. Ειδικότερα, η μέση τιμή κυττάρων, τα οποία μετανάστευσαν ανά οπτικό πεδίο που μετρήθηκε ήταν 54,7 κύτταρα για τα κύτταρα μάρτυρα, 92,65 κύτταρα για τη Uc160 και 77,95 κύτταρα για τη Uc346 (p=0.005 και για τις δύο T-UCRs, Σχ. 3.35). Σχήμα Μικροφωτογραφίες των κυττάρων DLD-1, τα οποία μετανάστευσαν μέσω των πόρων της μεμβράνης του transwell: τα κύτταρα μάρτυρες (Α) και μετά από υπερέκφραση των Uc160 (B) ή Uc346 (C). 221

222 222

223 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 223

224 224

225 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Όπως σημειώθηκε στην εισαγωγή, οι UCRs έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του κολοορθικού καρκίνου. Τα τελευταία λίγα έτη μια σειρά δημοσιεύσεων και πειραματικών δεδομένων υποστηρίζουν όλο και πιο σθεναρά αυτή τη σχέση. Διαταραχές στα επίπεδα έκφρασης και μεθυλίωσης, όπως περιγράφουμε στην παρούσα μελέτη, καθώς επίσης και η παρουσία συγκεκριμένων πολυμορφισμών έχουν συσχετισθεί με την απορρύθμιση της λειτουργίας των UCRs στον κολοορθικό καρκίνο (Braconi et al., 2011; Calin et al., 2007; Fassan et al., 2014; Galasso et al., 2014; Hudson et al., 2013; Jiang et al., 2016a; Lin et al., 2012a; Lin et al., 2012b; Lujambio et al., 2010; Sana et al., 2012; Scaruffi, 2011; Scaruffi et al., 2009; Yang et al., 2008). Παρά την ολοένα αυξανόμενη γνώση σχετικά με την βιολογία των UCRs, ο ρόλος τους στον καρκίνο και ειδικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου απαιτεί διεξοδικότερη διερεύνηση και ερευνητική αποσαφήνιση Έκφραση και μεθυλίωση των T-UCRs στους ιστούς Ένα από τα σημαντικότερα ευρήματα της παρούσας μελέτης είναι η μεθυλίωση των Τ-UCR που παρατηρήσαμε, όχι μόνο σε δείγματα καρκινικών ιστών ασθενών με κολοορθικό καρκίνο, αλλά και των παρακείμενων μη νεοπλασματικών ιστών, καθώς και σε μικρό αριθμό αδενωμάτων. Η διαπίστωση αυτή διαφοροποιείται συγκριτικά με τα ευρήματα των Lujambio και συνεργατών όπου οι Uc160, Uc283 και Uc346 ήταν μη μεθυλιωμένες σε δείγματα φυσιολογικού παχέος εντέρου, ενώ στους καρκινικούς ιστούς οι ίδιες Τ-UCRs ήταν μεθυλιωμένες σε ποσοστά 72,29%, 65,85% και 46,91%, αντίστοιχα, και στα αδενώματα τα ποσοστά μεθυλίωσης ήταν αντίστοιχα (Lujambio et al., 2010). Αυτή η διαφορά στα αποτελέσματα αντικατοπτρίζει αφενός μεν την διαφορετική ευαισθησία των μεθοδολογικών προσεγγίσεων που χρησιμοποιήθηκαν στις δύο μελέτες (qmsp vs MSP) και αφετέρου τον 225

226 μεγαλύτερο αριθμό φυσιολογικών δειγμάτων που αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη (64 vs 5). Σε συμφωνία πάντως με την παρατήρησή μας πως τα αδενοκαρκινώματα και τα αδενώματα είχαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς, οι ίδιοι ερευνητές καταλήγουν στο ίδιο συμπέρασμα (Lujambio et al., 2010). Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς, οι οποίοι δεν είχαν μεταστατική νόσο, είχαν αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους ασθενείς που ήταν σταδίου IV κατά τη διάγνωση. Σε προηγούμενη μελέτη, οι ερευνητές είχαν εστιάσει στη σχέση της μεθυλίωσης της εν λόγω Τ-UCR με τη διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων και όχι με την απομακρυσμένη μετάσταση. Συγκεκριμένα, ανέφεραν μία θετική συσχέτιση ανάμεσα στην κατάσταση μεθυλίωσης και στην ύπαρξη διηθημένων επιχώριων λεμφαδένων σε μία ετερογενή ομάδα ασθενών με λέμφωμα, λευχαιμία, καρκίνο πνεύμονα, μαστού και παχέος εντέρου (Lujambio et al., 2010). Η παρατήρηση αυτή συμβαδίζει με τη διαπίστωσή μας πως η μεθυλίωση των T-UCRs σχετίζεται με το διάστημα ως την υποτροπή της νόσου, με τους ασθενείς που ανήκαν στην ηλικιακή ομάδα άνω των 66 ετών και είχαν υψηλή μεθυλίωση της Uc283 να εμφανίζουν μεγαλύτερο διάστημα ως την υποτροπή της νόσου. Αντίθετα με ό,τι παρατηρήθηκε για τη Uc283, τα υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 συσχετίσθηκαν αρνητικά με το διάστημα ως την υποτροπή της νόσου στην ηλικιακή ομάδα άνω των 66 ετών. Λόγω της μη ύπαρξης σχετικής γνώσης για την Uc160, χρησιμοποιήσαμε την ανοικτή στο Διαδίκτυο πλατφόρμα «KMplotter», εστιάζοντας στο γονίδιο AP3B1 (Adaptor-Related Protein Complex 3 Subunit Beta-1), ένα γονίδιο που γειτονεύει με την Uc160 και το οποίο ενδεχομένως να ακολουθεί το ίδιο πρότυπο έκφρασης με την γειτονική Uc160, βρίσκοντας μία θετική σχέση μεταξύ της έκφρασής του και του χρόνου μέχρι την πρώτη πρόοδο σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο (Σχ. 4.1) (Lanczky et al., 2016) (Σχ. 4.1). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4.1, οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του AP3B1 έχουν 226

227 μεγαλύτερο διάστημα έως την πρώτη υποτροπή του γαστρικού καρκίνου. Η σχέση αυτή φαίνεται να υποστηρίζει και τη σχέση της μεθυλίωσης της Uc160 με τον χρόνο μέχρι την πρόοδο της νόσου μιας και υψηλή μεθυλίωση της Uc160 έχει δειχθεί να σχετίζεται με μειωμένη έκφραση της Uc160 (Honma et al., 2017). Σχήμα 4.1. Καμπύλη Kaplan - Meier επιβίωσης μέχρι την πρώτη πρόοδο της νόσου ασθενών με γαστρικό καρκίνο σε σχέση με την έκφραση του γονιδίου AP3B1 (Lanczky et al., 2016). Μία ακόμη ενδιαφέρουσα και λιγότερο κατανοητή παρατήρηση της μελέτης μας είναι η σχέση της υψηλότερης μεθυλίωσης της Uc283 σε όγκους του δεξιού κόλου σε σύγκριση με αυτούς του αριστερού, η οποία δεν συνοδεύτηκε όμως από αντίστροφη διαφορά στην έκφρασή της, αν και παρατηρήθηκε η τάση, όγκοι του δεξιού κόλου να έχουν χαμηλότερη έκφραση σε σχέση με αυτούς του δεξιού. H σχέση της μεθυλίωσης της Uc283 με την εντόπιση του κολοορθικού καρκίνου ενδεχομένως να αντικατοπτρίζει 227

228 το διαφορετικό μοριακό υπόβαθρο μεταξύ δεξιού και αριστερού κόλου και την διαφορετική εμβρυογένεση, κάτι που έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας τα τελευταία λίγα χρόνια (Lee et al., 2017). Είναι γνωστό πως ο ρόλος της Uc283 στον κολοορθικό καρκίνο σχετίζεται μεταξύ των άλλων και με τη λειτουργία του mir-195, την οποία κι επηρεάζει, ρυθμίζοντας προς τα κάτω την παραγωγή του (Liz et al., 2014). Όπως έχει δειχθεί από τον Guo και τους συνεργάτες η καταστολή του mir-195 στον κολοορθικό καρκίνο είναι ανεξάρτητη από την εντόπιση, την ηλικία, το φύλο και το στάδιο της νόσου, προτείνοντας πως η καταστολή της mir-195 είναι κοινό και πρώιμο γεγονός στην ανάπτυξη του κολοορθικού καρκίνου, παρατήρηση συμβατή με το γεγονός πως η έκφραση της Uc283 ήταν ανεξάρτητη της εντόπισης του όγκου (Guo et al., 2013). Η διαφοροποίηση αυτή θα μπορούσε να εξηγηθεί, αν η καταστολή της έκφρασης της Uc283, που είναι αποτέλεσμα επιγενετικής αποσιώπησης και όπως φαίνεται είναι ανεξάρτητη από τον βαθμό (ποσοστό) μεθυλίωσης της περιοχής που μελετήσαμε, ήταν εξαρτημένη από το επιγενετικό status συγκεκριμένων και μόνο CpGs. Είναι φανερό πως απαιτούνται περισσότερα πειράματα για την κατανόηση του υποκείμενου μηχανισμού. Επιπλέον, άξια ενδιαφέροντος ήταν και η διαφορά, η οποία παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της Uc160 σε κολοορθικά αδενοκαρκινώματα και σε παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς. Αν και τα δεδομένα στη βιβλιογραφία είναι πολύ περιορισμένα, η διαφορά στην έκφραση Τ-UCRs είναι φαινόμενο που έχει ξαναπεριγραφεί στον κολοορθικό καρκίνο. Για παράδειγμα, ο Hankeova και οι συνεργάτες έχουν δείξει πως τα επίπεδα έκφρασης της Uc73 και της Uc388 είναι χαμηλότερα στον κολοορθικό καρκίνο σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, ενώ συνάμα τα επίπεδα έκφρασης όπως Uc73 συσχετίσθηκαν ακόμη και με τη συνολική επιβίωση των ασθενών (Sana et al., 2012). Ειδικότερα, για τις T-UCRs που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία (Uc160, Uc283 και Uc346) έχει αναγνωριστεί ένα καρκινο-ειδικό πρότυπο μεθυλίωσης στα καρκινικά κύτταρα του εντέρου, ενώ επίσης έχει τεκμηριωθεί πως η απομεθυλίωση του 228

229 DNA αντέστρεψε την αποσιώπηση των T-UCRs (Lujambio et al., 2010). Όπως έχει δειχθεί, εφόσον οι T-UCRs είναι μεθυλιωμένες στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς, αναμένονται υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των T-UCRs σε σχέση με τους καρκινικούς ιστούς. Πράγματι, υψηλότερα επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν, τόσο για την Uc160, όσο και για την Uc283 (παρόλο που δεν ήταν στατιστικά σημαντική διαφορά για τη Uc283), αλλά όχι για τη Uc346. Αυτή η παρέκκλιση μπορεί να προέρχεται εν μέρει από την πολύπλοκη μεταγραφική ρύθμιση των T-UCRs, η οποία περιλαμβάνει την πρόσδεση mirna (Peng et al., 2013). Ιδιαίτερα οι Uc160 και Uc346 έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν σημαντική συμπληρωματικότητα με mirnas, δημιουργώντας πέντε πιθανά αλληλεπιδρώντα ζευγάρια (η Uc160 με τα mir-155, mir-146a, mir-24 και mir-223, ενώ η Uc346 με το mir-155) (Calin et al., 2007) Mεθυλίωση των T-UCRs στο πλάσμα και στα ούρα Όπως σημειώθηκε ανωτέρω, τα υψηλότερα επίπεδα β-ακτίνης στο πλάσμα ασθενών με κολοορθικό καρκίνο σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες ασθενών και υγιών που μελετήθηκαν είναι δηλωτική της μεγαλύτερης συγκέντρωσης ελεύθερου κυττάρων κυκλοφορούντος DNA και βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (Herrera et al., 2005; Perkins et al., 2012; Schwarzenbach et al., 2011; Stroun et al., 2001). Επίσης, τα υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης των Uc160 και Uc346 στους ασθενείς με καρκίνο σε σχέση με τις υπόλοιπες υποομάδες, οι οποίες μελετήθηκαν, συμφωνεί με τις αντίστοιχες διαφορές στη μεθυλίωση που παρατηρήθηκαν στους ιστούς. Φαίνεται πως η υγρή βιοψία δίνει μία αξιόπιστη εικόνα της μεθυλίωσης των Uc160 και Uc346 στον όγκο και επομένως δίνει ευκαιρίες για την μεταφραστική αξιοποίησή της. Επιπλέον, τα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 στο πλάσμα σχετίστηκαν θετικά με τη διήθηση των λεμφαδένων και με το μέγεθος του όγκου (του 229

230 αδενοκαρκινώματος ή του αδενώματος). Τα ευρήματα αυτά πιθανά εξηγούνται από τη μεγαλύτερη ποσότητα DNA που εκλύεται όσο μεγαλύτερος είναι ο όγκος ή όσο πιο προχωρημένο είναι το στάδιο της νόσου, αυξάνοντας έτσι και την ευαισθησία της ανίχνευσης του μεθυλιωμένου DNA του όγκου, όπως έχει παρατηρηθεί και για άλλα μόρια (Philipp et al., 2014). Στο ίδιο μήκος κύματος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον προκαλεί η παρατήρηση ότι κανένας από τους ασθενείς των οποίων τα δείγματα συνελέγησαν μετεγχειρητικά δεν είχαν μεθυλιωμένη την Uc160 στο πλάσμα τους. Εξαίρεση απετέλεσε ένας ασθενής σταδίου D (μεταστατική νόσος ήπατος), ο οποίος υπεβλήθη σε χειρουργική εξαίρεση του πρωτοπαθούς όγκου, αλλά όχι σε μεταστασεκτομή, θέτοντας ισχυρή υποψία για σχέση της ανίχνευσης της μεθυλίωσης της Uc160 στο πλάσμα με την ενεργότητα της νόσου. Υποστηρικτική της ανωτέρω επισήμανσης είναι και το γεγονός πως ασθενής σταδίου C, ο οποίος είχε μεθυλιωμένη την Uc160 στο πλάσμα του προεγχειρητικά, μετά την χειρουργική εξαίρεση του όγκου η μεθυλίωση της Uc160 ήταν μη ανιχνεύσιμη. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, η ανίχνευση άλλων μεθυλιωμένων δεικτών μετεγχειρητικά, όπως του TFPI2 στον ορό, σχετίζεται με το χειρουργείο R2, το οποίο αφήνει υπολειπόμενη ενεργή νόσο (Hibi et al., 2012). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει, επίσης, η περίπτωση ενός ασθενή με οικογενειακό ιστορικού κολοορθικού καρκίνου, του οποίου αναλύθηκαν δείγματα πλάσματος, τα οποία ελήφθησαν σε τρεις διαφορετικές χρονικές στιγμές (πριν την κολονοσκόπηση, πριν το χειρουργείο και πριν την έναρξη της θεραπείας μετεγχειρητικά) και του οποίου τα δείγματα ήταν αρνητικά για τη μεθυλίωση της Uc160 και τις τρεις φορές. Αυτή η παρατήρηση, όχι μόνο ενισχύει την αξιοπιστία της μεθόδου που ακολουθήθηκε, αλλά εγείρει το ερώτημα αν ο ρόλος των T-UCRs διαφέρει ανάμεσα στον οικογενή και στο σποραδικό καρκίνο, αν ληφθεί υπόψη και η αρνητική συσχέτιση που βρέθηκε ανάμεσα στην κατάσταση μεθυλίωσης των Uc160 και Uc346 στο πλάσμα και του οικογενειακού ιστορικού καρκίνου. Τέτοιες διαφορές έχουν αναφερθεί 230

231 στο παρελθόν για τα επίπεδα μεθυλίωσης των mirnas, όπου υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης mirnas έχουν παρατηρηθεί σε σποραδικούς κολοορθικούς καρκίνους, σε σχέση με ασθενείς με το σύνδρομο Lynch (Pavicic et al., 2011). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω ευρήματα, διερευνήθηκε για πρώτη φορά, η πιθανότητα η κατάσταση μεθυλίωσης των τριών T-UCRs στο πλάσμα να μπορεί να αποτελέσει ελάχιστα επεμβατικό διαγνωστικό βιοδείκτη για τον κολοορθικό καρκίνο ή αδένωμα. Η μεθυλίωση της Uc160 καθώς επίσης και των τριών T-UCRs βρέθηκαν ότι είναι οι πιο υποσχόμενοι βιοδείκτες, με ευαισθησία και ειδικότητα 35% και 89% (AUC 0,628), και 45% και 74,3% (AUC 0,633) αντίστοιχα. Τη μεγαλύτερη τιμή AUC έδωσε ο συνδυασμός μεθυλιωμένης Uc160 και Uc346 (AUC 0,639) με ευαισθησία και ειδικότητα 42,5% και 80,7% αντίστοιχα. Μέχρι τώρα, οι υψηλότερες τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας βιοδείκτη για τον κολοορθικό καρκίνο έχουν περιγραφεί για τη μεθυλιωμένη SEPT9 (Septin 9) στο πλάσμα (μέχρι και 95,6% και 84,8% αντίστοιχα), αν και σε περιπτώσεις αδενώματος η τιμή της ευαισθησίας μειώνεται σε 9,6% (Church et al., 2014; Toth et al., 2012). Παρόλο που αυτά τα θεαματικά αποτελέσματα οδήγησαν στην ανάπτυξη εμπορικού συστήματος ανίχνευσης της μεθυλιωμένης SEPT9 στο πλάσμα για κλινική χρήση, αναδρομικές μελέτες ανέφεραν αντικρουόμενα αποτελέσματα, με την ευαισθησία της μεθόδου να μειώνεται μέχρι 50,9% (Church et al., 2014; Payne, 2010; Toth et al., 2012; Warren et al., 2011). Σχετικά με τους μεθυλιωμένους βιοδείκτες για την ανίχνευση των αδενωμάτων, η πλειονότητα των δημοσιευμένων μελετών αναφέρουν χαμηλές τιμές ειδικότητας (Cassinotti et al., 2012; Zhang et al., 2015). Ωστόσο, υπάρχει μία πρωθύστερη μελέτη για τη μεθυλίωση των RASSF2A, APC, MGMT και Wif-1 στο πλάσμα, τα οποία αποτελούν υποσχόμενους βιοδείκτες, καθώς η ευαισθησία τους και η ειδικότητά τους φτάνει έως και 86,5% και 92,1%, αντίστοιχα (Lee et al., 2009). Ωστόσο, θα ήταν περισσότερο χρήσιμο αν τα ευρήματα αυτά είχαν κλινική εφαρμογή, καθώς δεν υπήρξε μετέπειτα 231

232 αντίστοιχη μελέτη δημοσιευμένη. Στην παρούσα μελέτη, η ένταξη μεγαλύτερου αριθμού ασθενών με αδενώματα, πιθανόν, να αναδείκνυε αντίστοιχο ρόλο των μεθυλιωμένων Uc160 και Uc346 στο πλάσμα. Ο προσδιορισμός κυκλοφορούντος DNA στα ούρα ήταν επιτυχημένος στα περισσότερα δείγματα που μελετήθηκαν, καθώς τα δείγματα είχαν φυγοκεντρηθεί και ήταν ελεύθερα κυττάρων, επομένως, το DNA που ανιχνεύθηκε δεν προήλθε από τα κύτταρα που υπήρχαν στα ούρα. Το γεγονός αυτό αποκτά ιδιαίτερη σημασία για την ανεύρεση βιοδεικτών στα ούρα, καθώς οι λίγες μελέτες που υπάρχουν περιλαμβάνουν αναλύσεις μεταβολιτών στα ούρα, ενώ ακόμα λιγότερες αναφέρουν την ανίχνευση μεθυλιωμένου DNA στα ούρα ως βιοδείκτη (Deng et al., 2017; Kamada et al., 2016; Lalmahomed et al., 2016; Xiao et al., 2015). Ο προσδιορισμός των μεθυλιωμένων T-UCRs στα ούρα δεν είχε την αναμενόμενη διαγνωστική αξία όπως στο πλάσμα, αλλά δεδομένης της μεγάλης συγκέντρωσης DNA που ανιχνεύθηκε, δίνει τη δυνατότητα ανεύρεσης καρκινικού DNA στο ούρα, με την προϋπόθεση να βελτιωθεί η μέθοδος. Συνολικά μπορούμε να πούμε πως αν και οι τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας δεν είναι ιδανικές, ωστόσο θα μπορούσαν να αποτελέσουν τον θεμέλιο λίθο πάνω στον οποίο μπορεί να διαμορφωθεί ένα κατάλληλο διαγνωστικό κιτ. Είναι φανερή η ανάγκη ενσωμάτωσης επιπλέον παραμέτρων και βιοδεικτών στο υπάρχον σετ, προκειμένου να επιτευχθεί βελτίωση τόσο της ευαισθησίας όσο και της ειδικότητας της μεθόδου. Επίσης, είναι αναγκαία και η αξιολόγηση της μεθόδου σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών. 232

233 4.3. Λειτουργική σημασία των Uc160 και Uc346 στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση Εδραζόμενοι στα συμπεράσματα, τα οποία παρουσιάσθηκαν ανωτέρω, προχωρήσαμε στη λειτουργική μελέτη των δύο πιο υποσχόμενων T-UCRs, των Uc160 και Uc346. Η υπερέκφραση των Uc160 ή Uc346 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου οδήγησε σε αυξημένους ρυθμούς πολλαπλασιασμού και μετακίνησης των κυττάρων, αναδεικνύοντας έναν σημαντικό ρόλο αυτών των T-UCRs στην ανάπτυξη και μετάσταση του κολοορθικού καρκίνου, όπως έχει περιγραφεί άλλωστε και για άλλες T-UCRs (Wang et al., 2017). Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν με τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της Uc346 και τα χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 και της Uc346 στους καρκινικούς ιστούς ασθενών που έτειναν να έχουν απομακρυσμένες μεταστάσεις συχνότερα, σε σχέση με αυτούς που είχαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης Uc346 ή υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι αν και η υπερέκφραση in vitro των συγκεκριμένων T- UCRs οδήγησε σε αυξημένους ρυθμούς πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης, στους καρκινικούς ιστούς ή σε κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου η έκφρασή τους παραμένει σε χαμηλά επίπεδα οδηγώντας σε ένα λογικό παράδοξο. Παρόμοια αντικρουόμενα ευρήματα έχουν παρατηρηθεί και για την Uc73, της οποίας η υπερέκφραση σχετίζεται με την καρκινογένεση του παχέος εντέρου (Calin et al., 2007). Από την άλλη πλευρά, σε άλλη μελέτη αναφέρεται μία θετική συσχέτιση της Uc73 με τη συνολική επιβίωση των ασθενών, προσδίδοντας ένα ρόλο ογκοκατασταλτικό στη Uc73 για τον κολοορθικό καρκίνο (Sana et al., 2012). Οι διαφορές αυτές αναδεικνύουν ακόμα περισσότερο τον πολύπλοκο ρόλο των T-UCRs στην εξέλιξη του κολοορθικού καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, η Uc160 έχει βρεθεί πως υποεκφράζεται λόγω μεθυλίωσης στο γαστρικό καρκίνο και η υπερέκφρασή της ανέστειλε τη φωσφορυλίωση της Akt, υποδηλώνοντας επίσης έναν ογκοκατασταλτικό ρόλο (Honma et al., 2017). Στη μελέτη των Lujambio et al. παρατήρησαν ότι η 233

234 έκφραση των γονιδίων AP3B1, ERCC6 και RFX-4, τα οποία γειτονεύουν με τις Uc160, Uc283 και Uc346 αντίστοιχα, δεν αλλάζει μετά την υπερέκφραση των αντίστοιχων T-UCRs, υποθέτωντας ότι οι T-UCRs ασκούν τη δράση τους με άλλο τρόπο (Lujambio et al., 2010). Στην ίδια μελέτη η μεθυλίωση των Uc160, Uc283 και Uc346 δεν σχετίστηκε με μεταλλάξεις των k-ras και p53, ούτε με μικροδορυφορική αστάθεια (Lujambio et al., 2010). Περαιτέρω διερέυνηση των mirnas, με τα οποία αλληλεπιδρούν οι Uc160 και Uc346, ανέδειξε ότι εμπλέκονται στην καρκινική ανάπτυξη (π.χ. το mir-155, το οποίο αλληλεπιδρά και με τις δύο T-UCRs) ή έχουν ως στόχους γονίδια τα οποία εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο (π.χ. το mir-24), ενισχύοντας ακόμα περισσότερο τη σημασία της αλληλεπίδρασής τους με τα mirnas στον τρόπο δράσης των T-UCRs (Calin et al., 2007). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι: η έκφραση και η μεθυλίωση των υποκινητών των υπερσυντηρημένων περιοχών Uc160, Uc283 και Uc346 είναι διαφοροποιημένη στον κολοορθικό καρκίνο οι Uc160 και Uc346 εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του κολοορθικού καρκίνου αν και περισσότερες μελέτες και ενσωμάτωση περισσότερων βιοδεικτών είναι αναγκαίες για τη βελτιστοποίηση της διαγνωστικής αξίας της μεθυλίωσης των Uc160, Uc283 και Uc346 στο πλάσμα ασθενών με κολοορθικό καρκίνο στα πλαίσια υγρής βιοψίας, η συγκεκριμένη δοκιμασία μπορεί να αποτελέσει ελάχιστα επεμβατικό διαγνωστικό μέσο για τον κολοορθικό καρκίνο και τα αδενώματα. Είναι κοινός τόπος πως στην εποχή των υγρών βιοψιών και της μοριακής στόχευσης, είναι επιτακτική ανάγκη να αναδειχθούν κατάλληλοι βιοδείκτες και δοκιμασίες με διαγνωστική, προγνωστική και προβλεπτική σημασία. 234

235 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 235

236 236

237 (2012). Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature 487, Ahlquist, D.A., Sargent, D.J., Loprinzi, C.L., Levin, T.R., Rex, D.K., Ahnen, D.J., Knigge, K., Lance, M.P., Burgart, L.J., Hamilton, S.R., et al. (2008). Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Annals of internal medicine 149, , W481. Ahn, J.B., Chung, W.B., Maeda, O., Shin, S.J., Kim, H.S., Chung, H.C., Kim, N.K., and Issa, J.P. (2011). DNA methylation predicts recurrence from resected stage III proximal colon cancer. Cancer 117, Al-Temaimi, R.A., Tan, T.Z., Marafie, M.J., Thiery, J.P., Quirke, P., and Al-Mulla, F. (2016). Identification of 42 Genes Linked to Stage II Colorectal Cancer Metastatic Relapse. International journal of molecular sciences 17. Alazzouzi, H., Alhopuro, P., Salovaara, R., Sammalkorpi, H., Jarvinen, H., Mecklin, J.P., Hemminki, A., Schwartz, S., Jr., Aaltonen, L.A., and Arango, D. (2005). SMAD4 as a prognostic marker in colorectal cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 11, Allegra, C.J., Jessup, J.M., Somerfield, M.R., Hamilton, S.R., Hammond, E.H., Hayes, D.F., McAllister, P.K., Morton, R.F., and Schilsky, R.L. (2009). American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 27, Almeida, F.G., de Aquino, P.F., de Souza, A.D., de Souza, A.Q., do Carmo Vinhote, S., Mac- Cormick, T.M., da Mota Silva, M.S., Chalub, S.R., de Saldanha da Gama Fischer, J., Carvalho, P.C., et al. (2015). Colorectal cancer DNA methylation patterns from patients in Manaus, Brazil. Biological research 48, 50. Amatu, A., Barault, L., Moutinho, C., Cassingena, A., Bencardino, K., Ghezzi, S., Palmeri, L., Bonazzina, E., Tosi, F., Ricotta, R., et al. (2016). Tumor MGMT promoter hypermethylation changes over time limit temozolomide efficacy in a phase II trial for metastatic colorectal cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology 27, Antequera, F. (2003). Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cellular and molecular life sciences : CMLS 60, Aranyi, T., and Tusnady, G.E. (2007). BiSearch: epcr tool for native or bisulfite-treated genomic template. Methods Mol Biol 402, Arnold, M., Sierra, M.S., Laversanne, M., Soerjomataram, I., Jemal, A., and Bray, F. (2017). Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut 66, Bae, J.M., Kim, J.H., and Kang, G.H. (2013). Epigenetic alterations in colorectal cancer: the CpG island methylator phenotype. Histology and histopathology 28, Bailey, V.J., Zhang, Y., Keeley, B.P., Yin, C., Pelosky, K.L., Brock, M., Baylin, S.B., Herman, J.G., and Wang, T.H. (2010). Single-tube analysis of DNA methylation with silica superparamagnetic beads. Clinical chemistry 56, Bak, S.T., Sakellariou, D., and Pena-Diaz, J. (2014). The dual nature of mismatch repair as antimutator and mutator: for better or for worse. Frontiers in genetics 5, 287. Bardelli, A., and Siena, S. (2010). Molecular mechanisms of resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 28, Bartel, D.P. (2009). MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136,

238 Bedin, C., Enzo, M.V., Del Bianco, P., Pucciarelli, S., Nitti, D., and Agostini, M. (2017). Diagnostic and prognostic role of cell-free DNA testing for colorectal cancer patients. International journal of cancer 140, Beije, N., Helmijr, J.C., Weerts, M.J.A., Beaufort, C.M., Wiggin, M., Marziali, A., Verhoef, C., Sleijfer, S., Jansen, M., and Martens, J.W.M. (2016). Somatic mutation detection using various targeted detection assays in paired samples of circulating tumor DNA, primary tumor and metastases from patients undergoing resection of colorectal liver metastases. Molecular oncology 10, Bejerano, G., Haussler, D., and Blanchette, M. (2004a). Into the heart of darkness: largescale clustering of human non-coding DNA. Bioinformatics 20 Suppl 1, i Bejerano, G., Pheasant, M., Makunin, I., Stephen, S., Kent, W.J., Mattick, J.S., and Haussler, D. (2004b). Ultraconserved elements in the human genome. Science 304, Bertagnolli, M.M., Niedzwiecki, D., Compton, C.C., Hahn, H.P., Hall, M., Damas, B., Jewell, S.D., Mayer, R.J., Goldberg, R.M., Saltz, L.B., et al. (2009). Microsatellite instability predicts improved response to adjuvant therapy with irinotecan, fluorouracil, and leucovorin in stage III colon cancer: Cancer and Leukemia Group B Protocol Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 27, Bestor, T.H. (2005). Transposons reanimated in mice. Cell 122, Bettegowda, C., Sausen, M., Leary, R.J., Kinde, I., Wang, Y., Agrawal, N., Bartlett, B.R., Wang, H., Luber, B., Alani, R.M., et al. (2014). Detection of circulating tumor DNA in early- and latestage human malignancies. Science translational medicine 6, 224ra224. Boland, C.R., Thibodeau, S.N., Hamilton, S.R., Sidransky, D., Eshleman, J.R., Burt, R.W., Meltzer, S.J., Rodriguez-Bigas, M.A., Fodde, R., Ranzani, G.N., et al. (1998). A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer research 58, Bonadona, V., Bonaiti, B., Olschwang, S., Grandjouan, S., Huiart, L., Longy, M., Guimbaud, R., Buecher, B., Bignon, Y.J., Caron, O., et al. (2011). Cancer risks associated with germline mutations in MLH1, MSH2, and MSH6 genes in Lynch syndrome. Jama 305, Bouvard, V., Loomis, D., Guyton, K.Z., Grosse, Y., Ghissassi, F.E., Benbrahim-Tallaa, L., Guha, N., Mattock, H., and Straif, K. (2015). Carcinogenicity of consumption of red and processed meat. The Lancet Oncology 16, Braconi, C., Valeri, N., Kogure, T., Gasparini, P., Huang, N., Nuovo, G.J., Terracciano, L., Croce, C.M., and Patel, T. (2011). Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, Bretthauer, M., Kaminski, M.F., Loberg, M., Zauber, A.G., Regula, J., Kuipers, E.J., Hernan, M.A., McFadden, E., Sunde, A., Kalager, M., et al. (2016). Population-Based Colonoscopy Screening for Colorectal Cancer: A Randomized Clinical Trial. JAMA internal medicine 176, Brueckner, B., Stresemann, C., Kuner, R., Mund, C., Musch, T., Meister, M., Sultmann, H., and Lyko, F. (2007). The human let-7a-3 locus contains an epigenetically regulated microrna gene with oncogenic function. Cancer research 67, Buda, A., and Pignatelli, M. (2011). E-cadherin and the cytoskeletal network in colorectal cancer development and metastasis. Cell communication & adhesion 18, Calin, G.A., Liu, C.G., Ferracin, M., Hyslop, T., Spizzo, R., Sevignani, C., Fabbri, M., Cimmino, A., Lee, E.J., Wojcik, S.E., et al. (2007). Ultraconserved regions encoding ncrnas are altered in human leukemias and carcinomas. Cancer cell 12, Calle, E.E., and Kaaks, R. (2004). Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature reviews Cancer 4,

239 Carmona, F.J., and Esteller, M. (2010). Epigenomics of human colon cancer. Mutation research 693, Carninci, P., Kasukawa, T., Katayama, S., Gough, J., Frith, M.C., Maeda, N., Oyama, R., Ravasi, T., Lenhard, B., Wells, C., et al. (2005). The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science 309, Cassinotti, E., Melson, J., Liggett, T., Melnikov, A., Yi, Q., Replogle, C., Mobarhan, S., Boni, L., Segato, S., and Levenson, V. (2012). DNA methylation patterns in blood of patients with colorectal cancer and adenomatous colorectal polyps. International journal of cancer 131, Cha, Y., Kim, K.J., Han, S.W., Rhee, Y.Y., Bae, J.M., Wen, X., Cho, N.Y., Lee, D.W., Lee, K.H., Kim, T.Y., et al. (2016). Adverse prognostic impact of the CpG island methylator phenotype in metastatic colorectal cancer. British journal of cancer 115, Chan, A.T., and Giovannucci, E.L. (2010). Primary prevention of colorectal cancer. Gastroenterology 138, e2010. Chan, K.C., Hung, E.C., Woo, J.K., Chan, P.K., Leung, S.F., Lai, F.P., Cheng, A.S., Yeung, S.W., Chan, Y.W., Tsui, T.K., et al. (2013). Early detection of nasopharyngeal carcinoma by plasma Epstein-Barr virus DNA analysis in a surveillance program. Cancer 119, Chan, S.H., and Wang, L.H. (2015). Regulation of cancer metastasis by micrornas. Journal of biomedical science 22, 9. Chen, H.N., Yuan, K., Xie, N., Wang, K., Huang, Z., Chen, Y., Dou, Q., Wu, M., Nice, E.C., Zhou, Z.G., et al. (2016). PDLIM1 Stabilizes the E-Cadherin/beta-Catenin Complex to Prevent Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastatic Potential of Colorectal Cancer Cells. Cancer research 76, Chi, Y., and Zhou, D. (2016). MicroRNAs in colorectal carcinoma--from pathogenesis to therapy. Journal of experimental & clinical cancer research : CR 35, 43. Chin, Y.R., Yuan, X., Balk, S.P., and Toker, A. (2014). PTEN-deficient tumors depend on AKT2 for maintenance and survival. Cancer discovery 4, Choi, Y., Sateia, H.F., Peairs, K.S., and Stewart, R.W. (2017). Screening for colorectal cancer. Seminars in oncology 44, Church, T.R., Wandell, M., Lofton-Day, C., Mongin, S.J., Burger, M., Payne, S.R., Castanos- Velez, E., Blumenstein, B.A., Rosch, T., Osborn, N., et al. (2014). Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer. Gut 63, Cock-Rada, A., and Weitzman, J.B. (2013). The methylation landscape of tumour metastasis. Biology of the cell 105, Collins, L.J., and Penny, D. (2009). The RNA infrastructure: dark matter of the eukaryotic cell? Trends in genetics : TIG 25, Cooks, T., Pateras, I.S., Tarcic, O., Solomon, H., Schetter, A.J., Wilder, S., Lozano, G., Pikarsky, E., Forshew, T., Rosenfeld, N., et al. (2013). Mutant p53 prolongs NF-kappaB activation and promotes chronic inflammation and inflammation-associated colorectal cancer. Cancer cell 23, Costa, F.F. (2007). Non-coding RNAs: lost in translation? Gene 386, Cui, H., Cruz-Correa, M., Giardiello, F.M., Hutcheon, D.F., Kafonek, D.R., Brandenburg, S., Wu, Y., He, X., Powe, N.R., and Feinberg, A.P. (2003). Loss of IGF2 imprinting: a potential marker of colorectal cancer risk. Science 299, Deng, L., Fang, H., Tso, V.K., Sun, Y., Foshaug, R.R., Krahn, S.C., Zhang, F., Yan, Y., Xu, H., Chang, D., et al. (2017). Clinical validation of a novel urine-based metabolomic test for the detection of colonic polyps on Chinese population. International journal of colorectal disease 32,

240 Dermitzakis, E.T., Reymond, A., and Antonarakis, S.E. (2005). Conserved non-genic sequences - an unexpected feature of mammalian genomes. Nature reviews Genetics 6, devos, T., Tetzner, R., Model, F., Weiss, G., Schuster, M., Distler, J., Steiger, K.V., Grutzmann, R., Pilarsky, C., Habermann, J.K., et al. (2009). Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer. Clinical chemistry 55, Di Nicolantonio, F., Martini, M., Molinari, F., Sartore-Bianchi, A., Arena, S., Saletti, P., De Dosso, S., Mazzucchelli, L., Frattini, M., Siena, S., et al. (2008). Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 26, Diaz, L.A., Jr., Williams, R.T., Wu, J., Kinde, I., Hecht, J.R., Berlin, J., Allen, B., Bozic, I., Reiter, J.G., Nowak, M.A., et al. (2012). The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature 486, Diaz, T., Moreno, I., and Monzo, M. (2014). mir-200 family in CRC primary tumors and metastases. Journal of surgical oncology 110, 486. Diehl, F., Schmidt, K., Choti, M.A., Romans, K., Goodman, S., Li, M., Thornton, K., Agrawal, N., Sokoll, L., Szabo, S.A., et al. (2008). Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nature medicine 14, East, J.E., Saunders, B.P., and Jass, J.R. (2008). Sporadic and syndromic hyperplastic polyps and serrated adenomas of the colon: classification, molecular genetics, natural history, and clinical management. Gastroenterology clinics of North America 37, 25-46, v. El Bairi, K., Tariq, K., Himri, I., Jaafari, A., Smaili, W., Kandhro, A.H., Gouri, A., and Ghazi, B. (2018). Decoding colorectal cancer epigenomics. Cancer genetics 220, Esteller, M. (2002). CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene 21, Esteller, M. (2008). Epigenetics in cancer. The New England journal of medicine 358, Esteller, M. (2011). Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews Genetics 12, Esteller, M., Sparks, A., Toyota, M., Sanchez-Cespedes, M., Capella, G., Peinado, M.A., Gonzalez, S., Tarafa, G., Sidransky, D., Meltzer, S.J., et al. (2000). Analysis of adenomatous polyposis coli promoter hypermethylation in human cancer. Cancer research 60, Fassan, M., Dall'Olmo, L., Galasso, M., Braconi, C., Pizzi, M., Realdon, S., Volinia, S., Valeri, N., Gasparini, P., Baffa, R., et al. (2014). Transcribed ultraconserved noncoding RNAs (T- UCR) are involved in Barrett's esophagus carcinogenesis. Oncotarget 5, Fearon, E.R., and Vogelstein, B. (1990). A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61, Feinberg, A.P. (1999). Imprinting of a genomic domain of 11p15 and loss of imprinting in cancer: an introduction. Cancer research 59, 1743s-1746s. Feinberg, A.P., and Tycko, B. (2004). The history of cancer epigenetics. Nature reviews Cancer 4, Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983). Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 301, Fitzmaurice, C., Allen, C., Barber, R.M., Barregard, L., Bhutta, Z.A., Brenner, H., Dicker, D.J., Chimed-Orchir, O., Dandona, R., Dandona, L., et al. (2017). Global, Regional, and National Cancer Incidence, Mortality, Years of Life Lost, Years Lived With Disability, and Disability- Adjusted Life-years for 32 Cancer Groups, 1990 to 2015: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study. JAMA oncology 3, Fodde, R., Smits, R., and Clevers, H. (2001). APC, signal transduction and genetic instability in colorectal cancer. Nature reviews Cancer 1,

241 Fraga, M.F., Herranz, M., Espada, J., Ballestar, E., Paz, M.F., Ropero, S., Erkek, E., Bozdogan, O., Peinado, H., Niveleau, A., et al. (2004). A mouse skin multistage carcinogenesis model reflects the aberrant DNA methylation patterns of human tumors. Cancer research 64, Frattini, M., Gallino, G., Signoroni, S., Balestra, D., Lusa, L., Battaglia, L., Sozzi, G., Bertario, L., Leo, E., Pilotti, S., et al. (2008). Quantitative and qualitative characterization of plasma DNA identifies primary and recurrent colorectal cancer. Cancer letters 263, Galasso, M., Dama, P., Previati, M., Sandhu, S., Palatini, J., Coppola, V., Warner, S., Sana, M.E., Zanella, R., Abujarour, R., et al. (2014). A large scale expression study associates uc.283-plus lncrna with pluripotent stem cells and human glioma. Genome medicine 6, 76. Garrigou, S., Perkins, G., Garlan, F., Normand, C., Didelot, A., Le Corre, D., Peyvandi, S., Mulot, C., Niarra, R., Aucouturier, P., et al. (2016). A Study of Hypermethylated Circulating Tumor DNA as a Universal Colorectal Cancer Biomarker. Clinical chemistry 62, Gaudet, F., Hodgson, J.G., Eden, A., Jackson-Grusby, L., Dausman, J., Gray, J.W., Leonhardt, H., and Jaenisch, R. (2003). Induction of tumors in mice by genomic hypomethylation. Science 300, Ghosal, S., Das, S., and Chakrabarti, J. (2013). Long noncoding RNAs: new players in the molecular mechanism for maintenance and differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cells Dev 22, Goto, K., Ishikawa, S., Honma, R., Tanimoto, K., Sakamoto, N., Sentani, K., Oue, N., Teishima, J., Matsubara, A., and Yasui, W. (2016). The transcribed-ultraconserved regions in prostate and gastric cancer: DNA hypermethylation and microrna-associated regulation. Oncogene 35, Govender, D., and Chetty, R. (2012). Gene of the month: BRAF. Journal of clinical pathology 65, Greenhough, A., Smartt, H.J., Moore, A.E., Roberts, H.R., Williams, A.C., Paraskeva, C., and Kaidi, A. (2009). The COX-2/PGE2 pathway: key roles in the hallmarks of cancer and adaptation to the tumour microenvironment. Carcinogenesis 30, Guinney, J., Dienstmann, R., Wang, X., de Reynies, A., Schlicker, A., Soneson, C., Marisa, L., Roepman, P., Nyamundanda, G., Angelino, P., et al. (2015). The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nature medicine 21, Guo, S.T., Jiang, C.C., Wang, G.P., Li, Y.P., Wang, C.Y., Guo, X.Y., Yang, R.H., Feng, Y., Wang, F.H., Tseng, H.Y., et al. (2013). MicroRNA-497 targets insulin-like growth factor 1 receptor and has a tumour suppressive role in human colorectal cancer. Oncogene 32, Gylling, A., Ridanpaa, M., Vierimaa, O., Aittomaki, K., Avela, K., Kaariainen, H., Laivuori, H., Poyhonen, M., Sallinen, S.L., Wallgren-Pettersson, C., et al. (2009). Large genomic rearrangements and germline epimutations in Lynch syndrome. International journal of cancer 124, Gyparaki, M.T., Basdra, E.K., and Papavassiliou, A.G. (2013). DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer. J Mol Med (Berl) 91, Haggar, F.A., and Boushey, R.P. (2009). Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clinics in colon and rectal surgery 22, Hanahan, D., and Weinberg, R.A. (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144, Haraldsdottir, S., Hampel, H., Tomsic, J., Frankel, W.L., Pearlman, R., de la Chapelle, A., and Pritchard, C.C. (2014). Colon and endometrial cancers with mismatch repair deficiency can arise from somatic, rather than germline, mutations. Gastroenterology 147, e1301. Hennessy, B.T., Smith, D.L., Ram, P.T., Lu, Y., and Mills, G.B. (2005). Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery. Nature reviews Drug discovery 4,

242 Herbst, A., Vdovin, N., Gacesa, S., Ofner, A., Philipp, A., Nagel, D., Holdt, L.M., Op den Winkel, M., Heinemann, V., Stieber, P., et al. (2017). Methylated free-circulating HPP1 DNA is an early response marker in patients with metastatic colorectal cancer. International journal of cancer 140, Herman, J.G., Graff, J.R., Myohanen, S., Nelkin, B.D., and Baylin, S.B. (1996). Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, Herman, J.G., Umar, A., Polyak, K., Graff, J.R., Ahuja, N., Issa, J.P., Markowitz, S., Willson, J.K., Hamilton, S.R., Kinzler, K.W., et al. (1998). Incidence and functional consequences of hmlh1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, Herrera, L.J., Raja, S., Gooding, W.E., El-Hefnawy, T., Kelly, L., Luketich, J.D., and Godfrey, T.E. (2005). Quantitative analysis of circulating plasma DNA as a tumor marker in thoracic malignancies. Clinical chemistry 51, Hibi, K., Goto, T., Shirahata, A., Saito, M., Kigawa, G., Nemoto, H., and Sanada, Y. (2012). Methylation of TFPI2 no longer detected in the serum DNA of colorectal cancer patients after curative surgery. Anticancer research 32, Ho, V., Ashbury, J.E., Taylor, S., Vanner, S., and King, W.D. (2016). Genetic and epigenetic variation in the DNMT3B and MTHFR genes and colorectal adenoma risk. Environmental and molecular mutagenesis 57, Hochhauser, D., Glynne-Jones, R., Potter, V., Gravalos, C., Doyle, T.J., Pathiraja, K., Zhang, Q., Zhang, L., and Sausville, E.A. (2013). A phase II study of temozolomide in patients with advanced aerodigestive tract and colorectal cancers and methylation of the O6- methylguanine-dna methyltransferase promoter. Molecular cancer therapeutics 12, Hokazono, K., Ueki, T., Nagayoshi, K., Nishioka, Y., Hatae, T., Koga, Y., Hirahashi, M., Oda, Y., and Tanaka, M. (2014). A CpG island methylator phenotype of colorectal cancer that is contiguous with conventional adenomas, but not serrated polyps. Oncology letters 8, Holliday, R. (1987). The inheritance of epigenetic defects. Science 238, Honma, R., Goto, K., Sakamoto, N., Sekino, Y., Sentani, K., Oue, N., and Yasui, W. (2017). Expression and function of Uc.160+, a transcribed ultraconserved region, in gastric cancer. Gastric cancer : official journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association 20, How Kit, A., Nielsen, H.M., and Tost, J. (2012). DNA methylation based biomarkers: practical considerations and applications. Biochimie 94, Hudson, R.S., Yi, M., Volfovsky, N., Prueitt, R.L., Esposito, D., Volinia, S., Liu, C.G., Schetter, A.J., Van Roosbroeck, K., Stephens, R.M., et al. (2013). Transcription signatures encoded by ultraconserved genomic regions in human prostate cancer. Molecular cancer 12, 13. Ichimura, N., Shinjo, K., An, B., Shimizu, Y., Yamao, K., Ohka, F., Katsushima, K., Hatanaka, A., Tojo, M., Yamamoto, E., et al. (2015). Aberrant TET1 Methylation Closely Associated with CpG Island Methylator Phenotype in Colorectal Cancer. Cancer Prev Res (Phila) 8, Imperiale, T.F., Ransohoff, D.F., Itzkowitz, S.H., Levin, T.R., Lavin, P., Lidgard, G.P., Ahlquist, D.A., and Berger, B.M. (2014). Multitarget stool DNA testing for colorectal-cancer screening. The New England journal of medicine 370, Itzkowitz, S.H., and Harpaz, N. (2004). Diagnosis and management of dysplasia in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 126, Jahr, S., Hentze, H., Englisch, S., Hardt, D., Fackelmayer, F.O., Hesch, R.D., and Knippers, R. (2001). DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer research 61,

243 Jeltsch, A., and Jurkowska, R.Z. (2014). New concepts in DNA methylation. Trends in biochemical sciences 39, Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., and Ward, E. (2010). Cancer statistics, CA Cancer J Clin 60, Jen, J., Kim, H., Piantadosi, S., Liu, Z.F., Levitt, R.C., Sistonen, P., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., and Hamilton, S.R. (1994). Allelic loss of chromosome 18q and prognosis in colorectal cancer. The New England journal of medicine 331, Ji, D., Chen, Z., Li, M., Zhan, T., Yao, Y., Zhang, Z., Xi, J., Yan, L., and Gu, J. (2014). MicroRNA- 181a promotes tumor growth and liver metastasis in colorectal cancer by targeting the tumor suppressor WIF-1. Molecular cancer 13, 86. Jia, M., Gao, X., Zhang, Y., Hoffmeister, M., and Brenner, H. (2016). Different definitions of CpG island methylator phenotype and outcomes of colorectal cancer: a systematic review. Clinical epigenetics 8, 25. Jiang, J., Azevedo-Pouly, A.C., Redis, R.S., Lee, E.J., Gusev, Y., Allard, D., Sutaria, D.S., Badawi, M., Elgamal, O.A., Lerner, M.R., et al. (2016a). Globally increased ultraconserved noncoding RNA expression in pancreatic adenocarcinoma. Oncotarget. Jiang, J., Azevedo-Pouly, A.C., Redis, R.S., Lee, E.J., Gusev, Y., Allard, D., Sutaria, D.S., Badawi, M., Elgamal, O.A., Lerner, M.R., et al. (2016b). Globally increased ultraconserved noncoding RNA expression in pancreatic adenocarcinoma. Oncotarget 7, Johnson, C.M., Wei, C., Ensor, J.E., Smolenski, D.J., Amos, C.I., Levin, B., and Berry, D.A. (2013). Meta-analyses of colorectal cancer risk factors. Cancer causes & control : CCC 24, Jones, P.A., and Baylin, S.B. (2007). The epigenomics of cancer. Cell 128, Juo, Y.Y., Johnston, F.M., Zhang, D.Y., Juo, H.H., Wang, H., Pappou, E.P., Yu, T., Easwaran, H., Baylin, S., van Engeland, M., et al. (2014). Prognostic value of CpG island methylator phenotype among colorectal cancer patients: a systematic review and meta-analysis. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology 25, Kamada, Y., Murayama, Y., Ota, U., Takahashi, K., Arita, T., Kosuga, T., Konishi, H., Morimura, R., Komatsu, S., Shiozaki, A., et al. (2016). Urinary 5-Aminolevulinic Acid Concentrations as a Potential Tumor Marker for Colorectal Cancer Screening and Recurrence. Anticancer research 36, Kang, X.C., Chen, M.L., Yang, F., Gao, B.Q., Yang, Q.H., Zheng, W.W., and Hao, S. (2016). Promoter methylation and expression of SOCS-1 affect clinical outcome and epithelialmesenchymal transition in colorectal cancer. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie 80, Karpf, A.R., and Matsui, S. (2005). Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Cancer research 65, Katzman, S., Kern, A.D., Bejerano, G., Fewell, G., Fulton, L., Wilson, R.K., Salama, S.R., and Haussler, D. (2007). Human genome ultraconserved elements are ultraselected. Science 317, 915. Knudson, A.G., Jr., and Strong, L.C. (1972). Mutation and cancer: a model for Wilms' tumor of the kidney. Journal of the National Cancer Institute 48, Kocarnik, J.M., Shiovitz, S., and Phipps, A.I. (2015). Molecular phenotypes of colorectal cancer and potential clinical applications. Gastroenterology report 3, Kozak, M.M., von Eyben, R., Pai, J., Vossler, S.R., Limaye, M., Jayachandran, P., Anderson, E.M., Shaffer, J.L., Longacre, T., Pai, R.K., et al. (2015). Smad4 inactivation predicts for worse prognosis and response to fluorouracil-based treatment in colorectal cancer. Journal of clinical pathology 68,

244 Kuiper, R.P., Vissers, L.E., Venkatachalam, R., Bodmer, D., Hoenselaar, E., Goossens, M., Haufe, A., Kamping, E., Niessen, R.C., Hogervorst, F.B., et al. (2011). Recurrence and variability of germline EPCAM deletions in Lynch syndrome. Human mutation 32, Kung, J.T., Colognori, D., and Lee, J.T. (2013). Long noncoding RNAs: past, present, and future. Genetics 193, Lai, J., Moya, L., An, J., Hoffman, A., Srinivasan, S., Panchadsaram, J., Walpole, C., Perry- Keene, J.L., Chambers, S., Australian Prostate Cancer, B., et al. (2017). A microsatellite repeat in PCA3 long non-coding RNA is associated with prostate cancer risk and aggressiveness. Scientific reports 7, Laird, P.W., Jackson-Grusby, L., Fazeli, A., Dickinson, S.L., Jung, W.E., Li, E., Weinberg, R.A., and Jaenisch, R. (1995). Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation. Cell 81, Lalmahomed, Z.S., Broker, M.E., van Huizen, N.A., Coebergh van den Braak, R.R., Dekker, L.J., Rizopoulos, D., Verhoef, C., Steyerberg, E.W., Luider, T.M., and JN, I.J. (2016). Hydroxylated collagen peptide in urine as biomarker for detecting colorectal liver metastases. American journal of cancer research 6, Lamb, Y.N., and Dhillon, S. (2017). Epi procolon((r)) 2.0 CE: A Blood-Based Screening Test for Colorectal Cancer. Molecular diagnosis & therapy 21, Lanczky, A., Nagy, A., Bottai, G., Munkacsy, G., Szabo, A., Santarpia, L., and Gyorffy, B. (2016). mirpower: a web-tool to validate survival-associated mirnas utilizing expression data from 2178 breast cancer patients. Breast cancer research and treatment 160, Lao, V.V., and Grady, W.M. (2011). Epigenetics and colorectal cancer. Nature reviews Gastroenterology & hepatology 8, Lareau, L.F., Inada, M., Green, R.E., Wengrod, J.C., and Brenner, S.E. (2007). Unproductive splicing of SR genes associated with highly conserved and ultraconserved DNA elements. Nature 446, Leduc, C., and Etienne-Manneville, S. (2015). Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Current opinion in cell biology 32, Lee, B.B., Lee, E.J., Jung, E.H., Chun, H.K., Chang, D.K., Song, S.Y., Park, J., and Kim, D.H. (2009). Aberrant methylation of APC, MGMT, RASSF2A, and Wif-1 genes in plasma as a biomarker for early detection of colorectal cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 15, Lee, M.S., Menter, D.G., and Kopetz, S. (2017). Right Versus Left Colon Cancer Biology: Integrating the Consensus Molecular Subtypes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network : JNCCN 15, Lee, S., Cho, N.Y., Yoo, E.J., Kim, J.H., and Kang, G.H. (2008). CpG island methylator phenotype in colorectal cancers: comparison of the new and classic CpG island methylator phenotype marker panels. Archives of pathology & laboratory medicine 132, Leon, S.A., Shapiro, B., Sklaroff, D.M., and Yaros, M.J. (1977). Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer research 37, Li, L., and Li, H. (2013). Role of microrna-mediated MMP regulation in the treatment and diagnosis of malignant tumors. Cancer biology & therapy 14, Li, L.C., and Dahiya, R. (2002). MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 18, Li, Y., Li, Y., Huang, S., He, K., Zhao, M., Lin, H., Li, D., Qian, J., Zhou, C., Chen, Y., et al. (2017). Long non-coding RNA growth arrest specific transcript 5 acts as a tumour suppressor in colorectal cancer by inhibiting interleukin-10 and vascular endothelial growth factor expression. Oncotarget 8, Li, Y.W., Kong, F.M., Zhou, J.P., and Dong, M. (2014). Aberrant promoter methylation of the vimentin gene may contribute to colorectal carcinogenesis: a meta-analysis. Tumour biology 244

245 : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 35, Lieberman, D.A., Rex, D.K., Winawer, S.J., Giardiello, F.M., Johnson, D.A., and Levin, T.R. (2012). Guidelines for colonoscopy surveillance after screening and polypectomy: a consensus update by the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Gastroenterology 143, Lievre, A., Bachet, J.B., Boige, V., Cayre, A., Le Corre, D., Buc, E., Ychou, M., Bouche, O., Landi, B., Louvet, C., et al. (2008). KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 26, Lin, M., Eng, C., Hawk, E.T., Huang, M., Greisinger, A.J., Gu, J., Ellis, L.M., Wu, X., and Lin, J. (2012a). Genetic variants within ultraconserved elements and susceptibility to right- and left-sided colorectal adenocarcinoma. Carcinogenesis 33, Lin, M., Eng, C., Hawk, E.T., Huang, M., Lin, J., Gu, J., Ellis, L.M., and Wu, X. (2012b). Identification of polymorphisms in ultraconserved elements associated with clinical outcomes in locally advanced colorectal adenocarcinoma. Cancer 118, Liz, J., and Esteller, M. (2016). lncrnas and micrornas with a role in cancer development. Biochimica et biophysica acta 1859, Liz, J., Portela, A., Soler, M., Gomez, A., Ling, H., Michlewski, G., Calin, G.A., Guil, S., and Esteller, M. (2014). Regulation of pri-mirna processing by a long noncoding RNA transcribed from an ultraconserved region. Molecular cell 55, Lo, Y.M., Zhang, J., Leung, T.N., Lau, T.K., Chang, A.M., and Hjelm, N.M. (1999). Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. American journal of human genetics 64, Lomonaco, V., Martoglia, R., Mandreoli, F., Anderlucci, L., Emmett, W., Bicciato, S., and Taccioli, C. (2014). UCbase 2.0: ultraconserved sequences database (2014 update). Database (Oxford) Lowe, C.B., Bejerano, G., and Haussler, D. (2007). Thousands of human mobile element fragments undergo strong purifying selection near developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, Lowery, J.T., Ahnen, D.J., Schroy, P.C., 3rd, Hampel, H., Baxter, N., Boland, C.R., Burt, R.W., Butterly, L., Doerr, M., Doroshenk, M., et al. (2016). Understanding the contribution of family history to colorectal cancer risk and its clinical implications: A state-of-the-science review. Cancer 122, Lujambio, A., and Esteller, M. (2007). CpG island hypermethylation of tumor suppressor micrornas in human cancer. Cell Cycle 6, Lujambio, A., and Esteller, M. (2009). How epigenetics can explain human metastasis: a new role for micrornas. Cell Cycle 8, Lujambio, A., Portela, A., Liz, J., Melo, S.A., Rossi, S., Spizzo, R., Croce, C.M., Calin, G.A., and Esteller, M. (2010). CpG island hypermethylation-associated silencing of non-coding RNAs transcribed from ultraconserved regions in human cancer. Oncogene 29, Luo, Y., Wong, C.J., Kaz, A.M., Dzieciatkowski, S., Carter, K.T., Morris, S.M., Wang, J., Willis, J.E., Makar, K.W., Ulrich, C.M., et al. (2014). Differences in DNA methylation signatures reveal multiple pathways of progression from adenoma to colorectal cancer. Gastroenterology 147, e418. Lynch, H.T., and de la Chapelle, A. (1999). Genetic susceptibility to non-polyposis colorectal cancer. Journal of medical genetics 36, Mann, B., Gelos, M., Siedow, A., Hanski, M.L., Gratchev, A., Ilyas, M., Bodmer, W.F., Moyer, M.P., Riecken, E.O., Buhr, H.J., et al. (1999). Target genes of beta-catenin-t cellfactor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96,

246 Marini, A., Lena, A.M., Panatta, E., Ivan, C., Han, L., Liang, H., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Di Daniele, N., Calin, G.A., Candi, E., et al. (2016). Ultraconserved long non-coding RNA uc.63 in breast cancer. Oncotarget. Menendez, D., Inga, A., and Resnick, M.A. (2009). The expanding universe of p53 targets. Nature reviews Cancer 9, Mestdagh, P., Fredlund, E., Pattyn, F., Rihani, A., Van Maerken, T., Vermeulen, J., Kumps, C., Menten, B., De Preter, K., Schramm, A., et al. (2010). An integrative genomics screen uncovers ncrna T-UCR functions in neuroblastoma tumours. Oncogene 29, Mi, L., Zhu, F., Yang, X., Lu, J., Zheng, Y., Zhao, Q., Wen, X., Lu, A., Wang, M., Zheng, M., et al. (2017). The metastatic suppressor NDRG1 inhibits EMT, migration and invasion through interaction and promotion of caveolin-1 ubiquitylation in human colorectal cancer cells. Oncogene 36, Micalizzi, D.S., Haber, D.A., and Maheswaran, S. (2017). Cancer metastasis through the prism of epithelial-to-mesenchymal transition in circulating tumor cells. Molecular oncology 11, Migheli, F., and Migliore, L. (2012). Epigenetics of colorectal cancer. Clinical genetics 81, Misale, S., Yaeger, R., Hobor, S., Scala, E., Janakiraman, M., Liska, D., Valtorta, E., Schiavo, R., Buscarino, M., Siravegna, G., et al. (2012). Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-egfr therapy in colorectal cancer. Nature 486, Mitchell, S.M., Ho, T., Brown, G.S., Baker, R.T., Thomas, M.L., McEvoy, A., Xu, Z.Z., Ross, J.P., Lockett, T.J., Young, G.P., et al. (2016). Evaluation of Methylation Biomarkers for Detection of Circulating Tumor DNA and Application to Colorectal Cancer. Genes 7. Miyaki, M., Konishi, M., Kikuchi-Yanoshita, R., Enomoto, M., Igari, T., Tanaka, K., Muraoka, M., Takahashi, H., Amada, Y., Fukayama, M., et al. (1994). Characteristics of somatic mutation of the adenomatous polyposis coli gene in colorectal tumors. Cancer research 54, Mohn, F., Weber, M., Schubeler, D., and Roloff, T.C. (2009). Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). Methods Mol Biol 507, Muller, A.D., and Sonnenberg, A. (1995). Prevention of colorectal cancer by flexible endoscopy and polypectomy. A case-control study of 32,702 veterans. Annals of internal medicine 123, Murtaza, M., Dawson, S.J., Tsui, D.W., Gale, D., Forshew, T., Piskorz, A.M., Parkinson, C., Chin, S.F., Kingsbury, Z., Wong, A.S., et al. (2013). Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature 497, Ned, R.M., Melillo, S., and Marrone, M. (2011). Fecal DNA testing for Colorectal Cancer Screening: the ColoSure test. PLoS currents 3, RRN1220. Neugut, A.I., and Forde, K.A. (1988). Screening colonoscopy: has the time come? The American journal of gastroenterology 83, Newcomb, P.A., Storer, B.E., Morimoto, L.M., Templeton, A., and Potter, J.D. (2003). Longterm efficacy of sigmoidoscopy in the reduction of colorectal cancer incidence. Journal of the National Cancer Institute 95, Ni, J.Z., Grate, L., Donohue, J.P., Preston, C., Nobida, N., O'Brien, G., Shiue, L., Clark, T.A., Blume, J.E., and Ares, M., Jr. (2007). Ultraconserved elements are associated with homeostatic control of splicing regulators by alternative splicing and nonsense-mediated decay. Genes & development 21, Nian, J., Sun, X., Ming, S., Yan, C., Ma, Y., Feng, Y., Yang, L., Yu, M., Zhang, G., and Wang, X. (2017). Diagnostic Accuracy of Methylated SEPT9 for Blood-based Colorectal Cancer Detection: A Systematic Review and Meta-Analysis. Clinical and translational gastroenterology 8, e

247 Norat, T., Aune, D., Chan, D., and Romaguera, D. (2014). Fruits and vegetables: updating the epidemiologic evidence for the WCRF/AICR lifestyle recommendations for cancer prevention. Cancer treatment and research 159, Olivieri, M., Ferro, M., Terreri, S., Durso, M., Romanelli, A., Avitabile, C., De Cobelli, O., Messere, A., Bruzzese, D., Vannini, I., et al. (2016). Long non-coding RNA containing ultraconserved genomic region 8 promotes bladder cancer tumorigenesis. Oncotarget 7, Paterson, E.L., Kazenwadel, J., Bert, A.G., Khew-Goodall, Y., Ruszkiewicz, A., and Goodall, G.J. (2013). Down-regulation of the mirna-200 family at the invasive front of colorectal cancers with degraded basement membrane indicates EMT is involved in cancer progression. Neoplasia 15, Pavicic, W., Perkio, E., Kaur, S., and Peltomaki, P. (2011). Altered methylation at micrornaassociated CpG islands in hereditary and sporadic carcinomas: a methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA)-based approach. Mol Med 17, Payne, S.R. (2010). From discovery to the clinic: the novel DNA methylation biomarker (m)sept9 for the detection of colorectal cancer in blood. Epigenomics 2, Pedersen, S.K., Symonds, E.L., Baker, R.T., Murray, D.H., McEvoy, A., Van Doorn, S.C., Mundt, M.W., Cole, S.R., Gopalsamy, G., Mangira, D., et al. (2015). Evaluation of an assay for methylated BCAT1 and IKZF1 in plasma for detection of colorectal neoplasia. BMC cancer 15, 654. Pendergrass, C.J., Edelstein, D.L., Hylind, L.M., Phillips, B.T., Iacobuzio-Donahue, C., Romans, K., Griffin, C.A., Cruz-Correa, M., Tersmette, A.C., Offerhaus, G.J., et al. (2008). Occurrence of colorectal adenomas in younger adults: an epidemiologic necropsy study. Clinical gastroenterology and hepatology : the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 6, Peng, J.C., Shen, J., and Ran, Z.H. (2013). Transcribed ultraconserved region in human cancers. RNA biology 10, Pennacchio, L.A., Ahituv, N., Moses, A.M., Prabhakar, S., Nobrega, M.A., Shoukry, M., Minovitsky, S., Dubchak, I., Holt, A., Lewis, K.D., et al. (2006). In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature 444, Perakis, S., and Speicher, M.R. (2017). Emerging concepts in liquid biopsies. BMC medicine 15, 75. Perez-Carbonell, L., Balaguer, F., Toiyama, Y., Egoavil, C., Rojas, E., Guarinos, C., Andreu, M., Llor, X., Castells, A., Jover, R., et al. (2014). IGFBP3 methylation is a novel diagnostic and predictive biomarker in colorectal cancer. PloS one 9, e Perkins, G., Yap, T.A., Pope, L., Cassidy, A.M., Dukes, J.P., Riisnaes, R., Massard, C., Cassier, P.A., Miranda, S., Clark, J., et al. (2012). Multi-purpose utility of circulating plasma DNA testing in patients with advanced cancers. PloS one 7, e Pfister, D.G., Benson, A.B., 3rd, and Somerfield, M.R. (2004). Clinical practice. Surveillance strategies after curative treatment of colorectal cancer. N Engl J Med 350, Philipp, A.B., Nagel, D., Stieber, P., Lamerz, R., Thalhammer, I., Herbst, A., and Kolligs, F.T. (2014). Circulating cell-free methylated DNA and lactate dehydrogenase release in colorectal cancer. BMC cancer 14, 245. Phipps, A.I., Limburg, P.J., Baron, J.A., Burnett-Hartman, A.N., Weisenberger, D.J., Laird, P.W., Sinicrope, F.A., Rosty, C., Buchanan, D.D., Potter, J.D., et al. (2015). Association between molecular subtypes of colorectal cancer and patient survival. Gastroenterology 148, e72. Pietrantonio, F., Petrelli, F., Coinu, A., Di Bartolomeo, M., Borgonovo, K., Maggi, C., Cabiddu, M., Iacovelli, R., Bossi, I., Lonati, V., et al. (2015). Predictive role of BRAF mutations in 247

248 patients with advanced colorectal cancer receiving cetuximab and panitumumab: a metaanalysis. Eur J Cancer 51, Pignone, M., Campbell, M.K., Carr, C., and Phillips, C. (2001). Meta-analysis of dietary restriction during fecal occult blood testing. Effective clinical practice : ECP 4, Pino, M.S., and Chung, D.C. (2010). The chromosomal instability pathway in colon cancer. Gastroenterology 138, Popat, S., and Houlston, R.S. (2005). A systematic review and meta-analysis of the relationship between chromosome 18q genotype, DCC status and colorectal cancer prognosis. Eur J Cancer 41, Provenzale, D., Jasperson, K., Ahnen, D.J., Aslanian, H., Bray, T., Cannon, J.A., David, D.S., Early, D.S., Erwin, D., Ford, J.M., et al. (2015). Colorectal Cancer Screening, Version Journal of the National Comprehensive Cancer Network : JNCCN 13, ; quiz 968. Qaseem, A., Denberg, T.D., Hopkins, R.H., Jr., Humphrey, L.L., Levine, J., Sweet, D.E., and Shekelle, P. (2012). Screening for colorectal cancer: a guidance statement from the American College of Physicians. Annals of internal medicine 156, Qiu, M.T., Hu, J.W., Yin, R., and Xu, L. (2013). Long noncoding RNA: an emerging paradigm of cancer research. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 34, Ramakers, C., Ruijter, J.M., Deprez, R.H., and Moorman, A.F. (2003). Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett 339, Rex, D.K., Ahnen, D.J., Baron, J.A., Batts, K.P., Burke, C.A., Burt, R.W., Goldblum, J.R., Guillem, J.G., Kahi, C.J., Kalady, M.F., et al. (2012). Serrated lesions of the colorectum: review and recommendations from an expert panel. The American journal of gastroenterology 107, ; quiz 1314, Rex, D.K., Boland, C.R., Dominitz, J.A., Giardiello, F.M., Johnson, D.A., Kaltenbach, T., Levin, T.R., Lieberman, D., and Robertson, D.J. (2017). Colorectal cancer screening: Recommendations for physicians and patients from the U.S. Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Gastrointestinal endoscopy 86, Ribic, C.M., Sargent, D.J., Moore, M.J., Thibodeau, S.N., French, A.J., Goldberg, R.M., Hamilton, S.R., Laurent-Puig, P., Gryfe, R., Shepherd, L.E., et al. (2003). Tumor microsatelliteinstability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. The New England journal of medicine 349, Rihani, A., Van Maerken, T., Pattyn, F., Van Peer, G., Beckers, A., De Brouwer, S., Kumps, C., Mets, E., Van der Meulen, J., Rondou, P., et al. (2013). Effective Alu repeat based RT-Qpcr normalization in cancer cell perturbation experiments. PloS one 8, e Robbins, K., Cotran (2000). Βασική Παθολογοανατομία. Rockey, D.C., Paulson, E., Niedzwiecki, D., Davis, W., Bosworth, H.B., Sanders, L., Yee, J., Henderson, J., Hatten, P., Burdick, S., et al. (2005). Analysis of air contrast barium enema, computed tomographic colonography, and colonoscopy: prospective comparison. Lancet 365, Rosty, C., Young, J.P., Walsh, M.D., Clendenning, M., Walters, R.J., Pearson, S., Pavluk, E., Nagler, B., Pakenas, D., Jass, J.R., et al. (2013). Colorectal carcinomas with KRAS mutation are associated with distinctive morphological and molecular features. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 26, Sakai, E., Nakajima, A., and Kaneda, A. (2014). Accumulation of aberrant DNA methylation during colorectal cancer development. World journal of gastroenterology 20, Sakatani, T., Kaneda, A., Iacobuzio-Donahue, C.A., Carter, M.G., de Boom Witzel, S., Okano, H., Ko, M.S., Ohlsson, R., Longo, D.L., and Feinberg, A.P. (2005). Loss of imprinting of Igf2 alters intestinal maturation and tumorigenesis in mice. Science 307,

249 Sameer, A.S., Nissar, S., and Fatima, K. (2014). Mismatch repair pathway: molecules, functions, and role in colorectal carcinogenesis. Eur J Cancer Prev 23, Sana, J., Hankeova, S., Svoboda, M., Kiss, I., Vyzula, R., and Slaby, O. (2012). Expression levels of transcribed ultraconserved regions uc.73 and uc.388 are altered in colorectal cancer. Oncology 82, Sandler, T. (2002). Langman's Ιατρική Εμβρυολογία (Ιατρικές Εκδόσεις Λίτσας). Sathirapongsasuti, J.F., Sathira, N., Suzuki, Y., Huttenhower, C., and Sugano, S. (2011). Ultraconserved cdna segments in the human transcriptome exhibit resistance to folding and implicate function in translation and alternative splicing. Nucleic acids research 39, Sawada, T., Yamamoto, E., Suzuki, H., Nojima, M., Maruyama, R., Shioi, Y., Akasaka, R., Kamimae, S., Harada, T., Ashida, M., et al. (2013). Association between genomic alterations and metastatic behavior of colorectal cancer identified by array-based comparative genomic hybridization. Genes, chromosomes & cancer 52, Scaruffi, P. (2011). The transcribed-ultraconserved regions: a novel class of long noncoding RNAs involved in cancer susceptibility. ScientificWorldJournal 11, Scaruffi, P., Stigliani, S., Moretti, S., Coco, S., De Vecchi, C., Valdora, F., Garaventa, A., Bonassi, S., and Tonini, G.P. (2009). Transcribed-Ultra Conserved Region expression is associated with outcome in high-risk neuroblastoma. BMC cancer 9, 441. Schetter, A.J., Okayama, H., and Harris, C.C. (2012). The role of micrornas in colorectal cancer. Cancer J 18, Schwarzenbach, H., Hoon, D.S., and Pantel, K. (2011). Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature reviews Cancer 11, Segnan, N., Armaroli, P., Bonelli, L., Risio, M., Sciallero, S., Zappa, M., Andreoni, B., Arrigoni, A., Bisanti, L., Casella, C., et al. (2011). Once-only sigmoidoscopy in colorectal cancer screening: follow-up findings of the Italian Randomized Controlled Trial--SCORE. Journal of the National Cancer Institute 103, Semb, H., and Christofori, G. (1998). The tumor-suppressor function of E-cadherin. American journal of human genetics 63, Senter, L., Clendenning, M., Sotamaa, K., Hampel, H., Green, J., Potter, J.D., Lindblom, A., Lagerstedt, K., Thibodeau, S.N., Lindor, N.M., et al. (2008). The clinical phenotype of Lynch syndrome due to germ-line PMS2 mutations. Gastroenterology 135, Shaukat, A., Mongin, S.J., Geisser, M.S., Lederle, F.A., Bond, J.H., Mandel, J.S., and Church, T.R. (2013). Long-term mortality after screening for colorectal cancer. The New England journal of medicine 369, Shen, L., Toyota, M., Kondo, Y., Lin, E., Zhang, L., Guo, Y., Hernandez, N.S., Chen, X., Ahmed, S., Konishi, K., et al. (2007). Integrated genetic and epigenetic analysis identifies three different subclasses of colon cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, Shen, Z., Wu, A., and Chen, X. (2017). Current detection technologies for circulating tumor cells. Chemical Society reviews 46, Siegel, R.L., Miller, K.D., and Jemal, A. (2018). Cancer statistics, CA: a cancer journal for clinicians 68, Silva, A.L., Dawson, S.N., Arends, M.J., Guttula, K., Hall, N., Cameron, E.A., Huang, T.H., Brenton, J.D., Tavare, S., Bienz, M., et al. (2014). Boosting Wnt activity during colorectal cancer progression through selective hypermethylation of Wnt signaling antagonists. BMC cancer 14, 891. Singh, H., Turner, D., Xue, L., Targownik, L.E., and Bernstein, C.N. (2006). Risk of developing colorectal cancer following a negative colonoscopy examination: evidence for a 10-year interval between colonoscopies. Jama 295,

250 Smith, G., Carey, F.A., Beattie, J., Wilkie, M.J., Lightfoot, T.J., Coxhead, J., Garner, R.C., Steele, R.J., and Wolf, C.R. (2002). Mutations in APC, Kirsten-ras, and p53--alternative genetic pathways to colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, Smith, Z.D., and Meissner, A. (2013). DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews Genetics 14, Solyom, S., Ewing, A.D., Rahrmann, E.P., Doucet, T., Nelson, H.H., Burns, M.B., Harris, R.S., Sigmon, D.F., Casella, A., Erlanger, B., et al. (2012). Extensive somatic L1 retrotransposition in colorectal tumors. Genome research 22, Song, L., and Li, Y. (2015). SEPT9: A Specific Circulating Biomarker for Colorectal Cancer. Advances in clinical chemistry 72, Song, L., Peng, X., Li, Y., Xiao, W., Jia, J., Dong, C., Gong, Y., Zhou, G., and Han, X. (2017). The SEPT9 gene methylation assay is capable of detecting colorectal adenoma in opportunistic screening. Epigenomics 9, Song, M., Garrett, W.S., and Chan, A.T. (2015). Nutrients, foods, and colorectal cancer prevention. Gastroenterology 148, e1216. Sparks, A.B., Morin, P.J., Vogelstein, B., and Kinzler, K.W. (1998). Mutational analysis of the APC/beta-catenin/Tcf pathway in colorectal cancer. Cancer research 58, Spindler, K.L., Pallisgaard, N., Andersen, R.F., and Jakobsen, A. (2014). Changes in mutational status during third-line treatment for metastatic colorectal cancer--results of consecutive measurement of cell free DNA, KRAS and BRAF in the plasma. International journal of cancer 135, Strahl, B.D., and Allis, C.D. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature 403, Stroun, M., Lyautey, J., Lederrey, C., Olson-Sand, A., and Anker, P. (2001). About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta 313, Stroun, M., Maurice, P., Vasioukhin, V., Lyautey, J., Lederrey, C., Lefort, F., Rossier, A., Chen, X.Q., and Anker, P. (2000). The origin and mechanism of circulating DNA. Annals of the New York Academy of Sciences 906, Strum, W.B. (2016). Colorectal Adenomas. The New England journal of medicine 374, Suman, S., Kurisetty, V., Das, T.P., Vadodkar, A., Ramos, G., Lakshmanaswamy, R., and Damodaran, C. (2014). Activation of AKT signaling promotes epithelial-mesenchymal transition and tumor growth in colorectal cancer cells. Molecular carcinogenesis 53 Suppl 1, E Suzuki, H., Yamamoto, E., Maruyama, R., Niinuma, T., and Kai, M. (2014). Biological significance of the CpG island methylator phenotype. Biochemical and biophysical research communications 455, Symonds, E.L., Pedersen, S.K., Baker, R.T., Murray, D.H., Gaur, S., Cole, S.R., Gopalsamy, G., Mangira, D., LaPointe, L.C., and Young, G.P. (2016). A Blood Test for Methylated BCAT1 and IKZF1 vs. a Fecal Immunochemical Test for Detection of Colorectal Neoplasia. Clinical and translational gastroenterology 7, e137. Syngal, S., Brand, R.E., Church, J.M., Giardiello, F.M., Hampel, H.L., and Burt, R.W. (2015). ACG clinical guideline: Genetic testing and management of hereditary gastrointestinal cancer syndromes. The American journal of gastroenterology 110, ; quiz 263. Tang, W., Zhu, Y., Gao, J., Fu, J., Liu, C., Liu, Y., Song, C., Zhu, S., Leng, Y., Wang, G., et al. (2014). MicroRNA-29a promotes colorectal cancer metastasis by regulating matrix metalloproteinase 2 and E-cadherin via KLF4. British journal of cancer 110, Tariq, K., and Ghias, K. (2016). Colorectal cancer carcinogenesis: a review of mechanisms. Cancer biology & medicine 13,

251 Terracciano, D., Terreri, S., de Nigris, F., Costa, V., Calin, G.A., and Cimmino, A. (2017). The role of a new class of long noncoding RNAs transcribed from ultraconserved regions in cancer. Biochimica et biophysica acta 1868, Terreri, S., Durso, M., Colonna, V., Romanelli, A., Terracciano, D., Ferro, M., Perdona, S., Castaldo, L., Febbraio, F., de Nigris, F., et al. (2016). New Cross-Talk Layer between Ultraconserved Non-Coding RNAs, MicroRNAs and Polycomb Protein YY1 in Bladder Cancer. Genes 7. Testa, U., Pelosi, E., and Castelli, G. (2018). Colorectal cancer: genetic abnormalities, tumor progression, tumor heterogeneity, clonal evolution and tumor-initiating cells. Med Sci (Basel) 6. Thierry, A.R., Mouliere, F., El Messaoudi, S., Mollevi, C., Lopez-Crapez, E., Rolet, F., Gillet, B., Gongora, C., Dechelotte, P., Robert, B., et al. (2014). Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA. Nature medicine 20, Tie, J., Wang, Y., Tomasetti, C., Li, L., Springer, S., Kinde, I., Silliman, N., Tacey, M., Wong, H.L., Christie, M., et al. (2016). Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer. Science translational medicine 8, 346ra392. To, E.W., Chan, K.C., Leung, S.F., Chan, L.Y., To, K.F., Chan, A.T., Johnson, P.J., and Lo, Y.M. (2003). Rapid clearance of plasma Epstein-Barr virus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 9, Torano, E.G., Petrus, S., Fernandez, A.F., and Fraga, M.F. (2012). Global DNA hypomethylation in cancer: review of validated methods and clinical significance. Clinical chemistry and laboratory medicine 50, Toth, K., Sipos, F., Kalmar, A., Patai, A.V., Wichmann, B., Stoehr, R., Golcher, H., Schellerer, V., Tulassay, Z., and Molnar, B. (2012). Detection of methylated SEPT9 in plasma is a reliable screening method for both left- and right-sided colon cancers. PloS one 7, e Turajlic, S., and Swanton, C. (2015). Gastrointestinal cancer: Tracking tumour evolution through liquid biopsy. Nature reviews Clinical oncology 12, Ulz, P., Heitzer, E., Geigl, J.B., and Speicher, M.R. (2017). Patient monitoring through liquid biopsies using circulating tumor DNA. International journal of cancer 141, Underhill, H.R., Kitzman, J.O., Hellwig, S., Welker, N.C., Daza, R., Baker, D.N., Gligorich, K.M., Rostomily, R.C., Bronner, M.P., and Shendure, J. (2016). Fragment Length of Circulating Tumor DNA. PLoS genetics 12, e Vaiopoulos, A.G., Athanasoula, K., and Papavassiliou, A.G. (2014). Epigenetic modifications in colorectal cancer: molecular insights and therapeutic challenges. Biochimica et biophysica acta 1842, van Roon, E.H., Boot, A., Dihal, A.A., Ernst, R.F., van Wezel, T., Morreau, H., and Boer, J.M. (2013). BRAF mutation-specific promoter methylation of FOX genes in colorectal cancer. Clinical epigenetics 5, 2. Vogelstein, B., Fearon, E.R., Hamilton, S.R., Kern, S.E., Preisinger, A.C., Leppert, M., Nakamura, Y., White, R., Smits, A.M., and Bos, J.L. (1988). Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine 319, Vogelstein, B., and Kinzler, K.W. (2004). Cancer genes and the pathways they control. Nature medicine 10, Waddington, C.H. (1939). Preliminary Notes on the Development of the Wings in Normal and Mutant Strains of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 25, Wang, C., Wang, Z., Zhou, J., Liu, S., Wu, C., Huang, C., and Ding, Y. (2017). TUC.338 promotes invasion and metastasis in colorectal cancer. International journal of cancer 140,

252 Wang, Y., Duan, H., Yang, H., and Lin, J. (2015). A pooled analysis of alcohol intake and colorectal cancer. International journal of clinical and experimental medicine 8, Warren, J.D., Xiong, W., Bunker, A.M., Vaughn, C.P., Furtado, L.V., Roberts, W.L., Fang, J.C., Samowitz, W.S., and Heichman, K.A. (2011). Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer. BMC medicine 9, 133. Weisenberger, D.J., Siegmund, K.D., Campan, M., Young, J., Long, T.I., Faasse, M.A., Kang, G.H., Widschwendter, M., Weener, D., Buchanan, D., et al. (2006). CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. Nature genetics 38, Weisenberger, D.J., Trinh, B.N., Campan, M., Sharma, S., Long, T.I., Ananthnarayan, S., Liang, G., Esteva, F.J., Hortobagyi, G.N., McCormick, F., et al. (2008). DNA methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital MethyLight. Nucleic acids research 36, Whitlock, E.P., Lin, J.S., Liles, E., Beil, T.L., and Fu, R. (2008). Screening for colorectal cancer: a targeted, updated systematic review for the U.S. Preventive Services Task Force. Annals of internal medicine 149, Wu, H., Chen, Y., Liang, J., Shi, B., Wu, G., Zhang, Y., Wang, D., Li, R., Yi, X., Zhang, H., et al. (2005). Hypomethylation-linked activation of PAX2 mediates tamoxifen-stimulated endometrial carcinogenesis. Nature 438, Xiao, W., Zhao, H., Dong, W., Li, Q., Zhu, J., Li, G., Zhang, S., and Ye, M. (2015). Quantitative detection of methylated NDRG4 gene as a candidate biomarker for diagnosis of colorectal cancer. Oncology letters 9, Xie, X., Tang, B., Xiao, Y.F., Xie, R., Li, B.S., Dong, H., Zhou, J.Y., and Yang, S.M. (2016). Long non-coding RNAs in colorectal cancer. Oncotarget 7, Yagi, K., Akagi, K., Hayashi, H., Nagae, G., Tsuji, S., Isagawa, T., Midorikawa, Y., Nishimura, Y., Sakamoto, H., Seto, Y., et al. (2010). Three DNA methylation epigenotypes in human colorectal cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 16, Yamada, Y., Jackson-Grusby, L., Linhart, H., Meissner, A., Eden, A., Lin, H., and Jaenisch, R. (2005). Opposing effects of DNA hypomethylation on intestinal and liver carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, Yan, W.F., Wu, G., Sun, P.C., and Qiu, D. (2015). P53 mutations occur more commonly than KRAS mutations in colorectal adenoma. International journal of clinical and experimental medicine 8, Yang, J., Du, X.L., Li, S.T., Wang, B.Y., Wu, Y.Y., Chen, Z.L., Lv, M., Shen, Y.W., Wang, X., Dong, D.F., et al. (2016). Characteristics of Differently Located Colorectal Cancers Support Proximal and Distal Classification: A Population-Based Study of 57,847 Patients. PloS one 11, e Yang, R., Frank, B., Hemminki, K., Bartram, C.R., Wappenschmidt, B., Sutter, C., Kiechle, M., Bugert, P., Schmutzler, R.K., Arnold, N., et al. (2008). SNPs in ultraconserved elements and familial breast cancer risk. Carcinogenesis 29, Zeinalian, M., Hashemzadeh-Chaleshtori, M., Salehi, R., and Emami, M.H. (2018). Clinical Aspects of Microsatellite Instability Testing in Colorectal Cancer. Advanced biomedical research 7, 28. Zhang, X., Shimodaira, H., Soeda, H., Komine, K., Takahashi, H., Ouchi, K., Inoue, M., Takahashi, M., Takahashi, S., and Ishioka, C. (2016). CpG island methylator phenotype is associated with the efficacy of sequential oxaliplatin- and irinotecan-based chemotherapy and EGFR-related gene mutation in Japanese patients with metastatic colorectal cancer. International journal of clinical oncology 21,

253 Zhang, X., Song, Y.F., Lu, H.N., Wang, D.P., Zhang, X.S., Huang, S.L., Sun, B.L., and Huang, Z.G. (2015). Combined detection of plasma GATA5 and SFRP2 methylation is a valid noninvasive biomarker for colorectal cancer and adenomas. World journal of gastroenterology 21, Zhou, J.J., Zheng, S., Sun, L.F., and Zheng, L. (2014). MicroRNA regulation network in colorectal cancer metastasis. World journal of biological chemistry 5,

254 254

255 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 255

256 256

257 I. Έγκριση ερευνητικού πρωτοκόλλου από το Επιστημονικό Συμβούλιο του ΠΓΝΠ. 257

258 258

259 IΙ. Πληροφοριακό έντυπο συγκατάθεσης για δωρεά βιολογικού υλικού. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ ΚΑΙ ΣΥΓΚΑΤΑΘΕΣΗ ΑΣΘΕΝΟΥΣ Ή ΥΓΙΟΥΣ ΑΤΟΜΟΥ ΓΙΑ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ. ΤΙΤΛΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Καρκίνος παχέος εντέρου: Διερεύνηση διαγνωστικών παραγόντων και παραγόντων κινδύνου εμφάνισης της νόσου. ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ Χ. Καλόφωνος ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο τρίτος πιο συχνός καρκίνος που διαγιγνώσκεται στους άνδρες και δεύτερος πιο συχνός στις γυναίκες, με πάνω από 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις καρκίνου και θανάτους να έχουν συμβεί το 2008 (Jemal et al., 2010). Η 5-ετής επιβίωση για ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου με εντοπισμένη νόσο είναι περίπου 90%, όταν αντιμετωπίζεται χειρουργικά, ενώ είναι περίπου 60% όταν υπάρχει μετάσταση στους λεμφαδένες (Pfister et al., 2004). Οι περισσότεροι καρκίνοι του παχέος εντέρου προκύπτουν από αδενωματώδεις πολύποδες. Οι πολύποδες μπορούν να ανιχνευθούν και να αφαιρεθούν κατά τη διάρκεια της κολονοσκόπησης, μειώνοντας κατά 80% τον κίνδυνο θανάτου. Ωστόσο, η μέθοδος της κολονοσκόπησης είναι δυσάρεστη για τον ασθενή. Η ανεύρεση διαγνωστικών παραγόντων που θα μπορούν να προσδιοριστούν με απλούστερη διαδικασία, όπως εξέταση αίματος ή ούρων, αποτελεί σημαντική παράμετρο για τη διάγνωση της ασθένειας. Επιπλέον, η εύρεση παραγόντων που να προδιαθέτουν σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι σημαντική. ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανεύρεση: 1. μοριακών παραγόντων κινδύνου εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου και 2. μοριακών διαγνωστικών παραγόντων του καρκίνου του παχέος εντέρου. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η μελέτη αυτή χρειαζόμαστε βιολογικό υλικό από ασθενείς με 259

260 καρκίνο του παχέος εντέρου, ασθενείς με πολύποδες παχέος εντέρου και από υγιή άτομα. Το βιολογικό υλικό που χρειαζόμαστε είναι αίμα και πιθανά σάλιο και ούρα. Η λήψη αίματος πραγματοποιείται από τον ιατρό ή το νοσηλευτικό προσωπικό του Νοσοκομείου (όπως για μια απλή εξέταση αίματος). Η λήψη σάλιου γίνεται αφήνοντας το σάλιο να κυλήσει μέσα σε ειδικό δοχείο που σας δίνεται. Η λήψη ούρων γίνεται σε κλασσικό ουροσυλλέκτη. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Baira, E., Greshock, J., Coukos, G. and Zhang, L.: Ultraconserved elements: genomics, function and disease. RNA Biol 5 (2008) Calin, G.A., Liu, C.G., Ferracin, M., Hyslop, T., Spizzo, R., Sevignani, C., Fabbri, M., Cimmino, A., Lee, E.J., Wojcik, S.E., Shimizu, M., Tili, E., Rossi, S., Taccioli, C., Pichiorri, F., Liu, X., Zupo, S., Herlea, V., Gramantieri, L., Lanza, G., Alder, H., Rassenti, L., Volinia, S., Schmittgen, T.D., Kipps, T.J., Negrini, M. and Croce, C.M.: Ultraconserved regions encoding ncrnas are altered in human leukemias and carcinomas. Cancer Cell 12 (2007) devos, T., Tetzner, R., Model, F., Weiss, G., Schuster, M., Distler, J., Steiger, K.V., Grutzmann, R., Pilarsky, C., Habermann, J.K., Fleshner, P.R., Oubre, B.M., Day, R., Sledziewski, A.Z. and Lofton-Day, C.: Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer. Clin Chem 55 (2009) Lujambio, A., Portela, A., Liz, J., Melo, S.A., Rossi, S., Spizzo, R., Croce, C.M., Calin, G.A. and Esteller, M.: CpG island hypermethylation-associated silencing of non-coding RNAs transcribed from ultraconserved regions in human cancer. Oncogene 29 (2010) Mohn, F., Weber, M., Schubeler, D. and Roloff, T.C.: Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). Methods Mol Biol 507 (2009) Scaruffi, P., Stigliani, S., Moretti, S., Coco, S., De Vecchi, C., Valdora, F., Garaventa, A., Bonassi, S. and Tonini, G.P.: Transcribed-Ultra Conserved Region expression is associated with outcome in high-risk neuroblastoma. BMC Cancer 9 (2009) 441. Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V.K., Mukherjee, S., Ebert, B.L., Gillette, M.A., Paulovich, A., Pomeroy, S.L., Golub, T.R., Lander, E.S. and Mesirov, J.P.: Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (2005) Thomas, J.W., Touchman, J.W., Blakesley, R.W., Bouffard, G.G., Beckstrom-Sternberg, S.M., Margulies, E.H., Blanchette, M., Siepel, A.C., Thomas, P.J., McDowell, J.C., Maskeri, B., Hansen, N.F., Schwartz, M.S., Weber, R.J., Kent, W.J., Karolchik, D., Bruen, T.C., Bevan, R., Cutler, D.J., Schwartz, S., Elnitski, L., Idol, J.R., Prasad, A.B., Lee-Lin, S.Q., Maduro, V.V., Summers, T.J., Portnoy, M.E., Dietrich, N.L., Akhter, N., Ayele, K., Benjamin, B., Cariaga, K., Brinkley, C.P., Brooks, S.Y., Granite, S., Guan, X., Gupta, J., 260

261 Haghighi, P., Ho, S.L., Huang, M.C., Karlins, E., Laric, P.L., Legaspi, R., Lim, M.J., Maduro, Q.L., Masiello, C.A., Mastrian, S.D., McCloskey, J.C., Pearson, R., Stantripop, S., Tiongson, E.E., Tran, J.T., Tsurgeon, C., Vogt, J.L., Walker, M.A., Wetherby, K.D., Wiggins, L.S., Young, A.C., Zhang, L.H., Osoegawa, K., Zhu, B., Zhao, B., Shu, C.L., De Jong, P.J., Lawrence, C.E., Smit, A.F., Chakravarti, A., Haussler, D., Green, P., Miller, W. and Green, E.D.: Comparative analyses of multi-species sequences from targeted genomic regions. Nature 424 (2003) ΔΗΛΩΣΗ Συμφωνώ να δωρίσω βιολογικό υλικό (αίμα, σάλιο, ούρα) προκειμένου να μελετηθούν διαγνωστικοί δείκτες για τον καρκίνο του παχέος εντέρου καθώς και μοριακοί παράγοντες κινδύνου εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου. ΝΑΙ ΟΧΙ Συμφωνώ να χρησιμοποιηθεί αυτό το βιολογικό υλικό και για άλλους παρόμοιους ερευνητικούς σκοπούς. ΝΑΙ ΟΧΙ ΟΝΟΜΑ (κεφαλαία) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΥΠΟΓΡΑΦΗ 261

262 ΙII. Έντυπο καταγραφής στοιχείων των ασθενών και υγιών δοτών. ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ Α/Α ΑΣΘΕΝΟΥΣ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: ΑΜ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ: ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΣΘΕΝΟΥΣ ΟΝΟΜΑ: ΕΠΩΝΥΜΟ: ΟΝΟΜΑ ΠΑΤΡΟΣ: ΗΛΙΚΙΑ: ΔΙΕΥΘΥΝΣΗ: ΤΗΛΕΦΩΝΟ: ΚΑΠΝΙΣΜΑ: ΝΑΙ ΟΧΙ Packet years: ΤΡΕΧΟΥΣΑ ΚΥΗΣΗ ΝΑΙ ΟΧΙ ΑΣΚΗΣΗ ΛΙΓΟ ΜΕΤΡΙΑ ΕΝΤΟΝΗ ΣΥΓΓΕΝΕΙΣ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ; ΝΑΙ ΟΧΙ 262

263 ΒΑΘΜΟΣ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ ΕΙΔΟΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΙΚΟ ΙΣΤΟΡΙΚΟ: ΔΙΑΙΤΗΤΙΚΕΣ ΣΥΝΗΘΕΙΕΣ: ΚΑΦΕΣ: ΑΛΚΟΟΛ: ΚΡΕΑΣ: ΒΜΙ: ΒΙΟΨΙΑ-ΧΕΙΡΟΥΡΓΕΙΟ ΒΙΟΨΙΑ ΝΑΙ ΟΧΙ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΒΙΟΨΙΑΣ: ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ: ΙΑΤΡΟΣ: ΧΕΙΡΟΥΡΓΕΙΟ: ΝΑΙ ΟΧΙ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΧΕΙΡΟΥΡΓΕΙΟΥ: ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ: ΧΕΙΡΟΥΡΓΟΣ: ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΑΡΙΘΜΟΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗΣ: ΣΤΑΔΙΟ 263

264 ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΛΕΜΦΑΔΕΝΕΣ ΘΕΤΙΚΟΙ ΑΡΝΗΤΙΚΟΙ ΑΡΙΘΜΟΣ ΜΕΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΝΑΙ ΟΧΙ ΘΕΣΗ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΑΚΤΙΝΟΘΕΡΑΠΕΙΑ ΝΑΙ ΟΧΙ ΧΗΜΕΙΟΘΕΡΑΠΕΙΑ 264

265 IV. Αποτελέσματα αλληλούχισης του πλασμιδίου που απομονώθηκε από την καλλιέργεια με το ένθετο Uc160. Με κίτρινο έχει επισημανθεί η περιοχή Uc160 που κλωνοποιήθηκε. CCRGCAKRACAWGCGTTACGGGCCTCTAGACTCGAGAGTA AATGAGGCGAGTGTGCAAAATGACTCCTTTCTGAACCAAA CGGCATGCTCCGTGCTGGGGAAATGAGATGCACATTTAAAT CTCATCCATCCACCGCCTGCGGCCACCGCCATGTACCTGCC TACTTAGCCCAAGGGTTAATTAATTGAGGCTTCAATGCACT ATTGCAAGAGCATTATTGCATTTGATACTCTACATCTGTGAT TTAAAACTCTTTCAGTCCCTTGTCAGCAAGGGAGGGTTTTTA ACTAGGAAATTAGCATTCAGATAAGGGAACGCTCTATTTGC TTCTGAAAGGAAGGAAATATTAAGGATGCTGGATCCGAGC TCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGAC TGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCC CGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCT TTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTA GGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGG GATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCA GCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGC GCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGA CCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTT TCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCA AGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTG CTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAACTTGATTAGGGTGATG GTTCACGTAGTGGGCCATCGSCCTGATAGACGGTTTTCGCC CTTGACGTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTC CAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTT GATTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATGGTTAAAAA ATGRCCTGATTTAAMMAAAATTAACSCTACTAATCCTGTGG ATGCGKYCAGTAGGGTGWGAAAGTCCTCAGCTCCCCAKM WGCGGAAG 265

266 V. Αποτελέσματα αλληλούχισης του πλασμιδίου που απομονώθηκε από την καλλιέργεια με το ένθετο Uc346. Με γαλάζιο έχει επισημανθεί η περιοχή Uc346 που κλωνοποιήθηκε. GSRRSCWTRRCWRCGTTTACGGGCCCTCTAGACTCGAGAAGG CTGGAGAAGGCCTCTGGAACTTTAAATAAGAAAAACGTTGC TAATGCTATAATAGAAGGGGGAAGTCGGAGGGCTGGGATTG CGTCGCTCTGAGCCCCCCTTTTCGGAGGCGGCTTTTCTTATTC AAAACAGGCCCACAATGGGCTTCACAGTGCGCCTCGCCACG GCCCCATCTGACGAGCGGCCATTCATCAGGCCGGATCCGAG CTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGAC TGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCC GTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTT CCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGT GTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAG GGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGC GGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGG GCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAA GCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACA CTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTT CCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAA TCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCAC CTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGT GGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGG AGTCCACGTTCTTTATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACA ACACTCAACCCTATCTCGKTCTATCTTTTGAYYAWAAGGGAT TT 266

267 7. ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 267

268 268

269 ACF: Aberrant Crypt foci AKT1: RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 1 AKT2: RAC-alpha serine/threonine-protein kinase APC:-adenomatous polyposis coli ATRA: all-trans-retinoic acid BAX: BCL2 Associated X, Apoptosis Regulator BCAT1: branched chain amino acid transaminase 1 BMI: body mass index BMMCC1/PRUNE2: Prune homolog 2 BRAF: B-Raf Proto-Oncogene, Serine/Threonine Kinase BRCA2: Breast And Ovarian Cancer Susceptibility Protein 2) CACNA1G: calcium channel voltage-dependent T type alpha 1G subunit CAGRs: cancer-associated genomic regions CDH1: cadherin 1 CDH4: cadherin 4 CDH13: cadherin 13 CDKN2A: Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A CEA: Carcinoembryonic Antigen CIN: chromosomal instability CMSs: consensus molecular subtypes C-MYC: avian myelocytomatosis virus oncogene cellular homolog COX-2: Cyclooxygenase-2 CRABP1: cellular retinoic acid binding protein 1 CT: computed tomography ctdna: circulating tumor DNACIMP: CpG island methylator phenotype DAPK: death-associated protein kinase 1 269

270 DCC: DCC netrin 1 receptor DFS: disease-free survival E2F1: E2F transcription factor 1 E-cahderin: cadherin 1 EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor EMT: epithelial to mesenchymal transition EPCAM: Epithelial Cell Adhesion Molecule Erk: Extracellular signal-regulated kinase FAP: familial adenomatous polyposis FAS: Fas Cell Surface Death Receptor FDA: Food and Drug Administration FIT: fecal immunochemical test GADD45: Growth Arrest And DNA Damage Inducible GATA5: GATA Binding Protein 5 gfobt: guaiac-based fecal occult blood test GRASP: general receptor for phosphoinositides 1 associated scaffold protein HLTF: helicaselike transcription factor hmlh1: mutl homolog 1 hmlh3: mutl homolog 3 hmsh2: muts homolog 2 hmsh3: muts homolog 3 hmsh6: muts homolog 6 HNPCC: hereditary non-polyposis colorectal cancer HOTAIR: Hox antisense intergenic RNAcfDNA: circulating free DNA hpms1: PMS1 homolog 1, mismatch repair system component 270

271 hpms2: PMS1 homolog 2, mismatch repair system component HPP1: (hyperplastic polyposis 1) HRK: harakiri, BCL2 interacting protein ID4: inhibitor of DNA binding 4 IGF: Insulin growth factor IGF2: insulin-like growth factor-2 IGFBP3: insulin-like growth factor binding protein 3 IKZF1: IKAROS family zinc finger 1 IRF4: interferon regulatory factor 4 ITGA4: integrin alpha 4 KILLER/DR5: Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, Member 10b Klf4: Kruppel-like factor 4 KRAS: Kirsten Rat Sarcoma Viral Proto-Oncogene lincrnas: long intergenic ncrnas LOH: loss of heterozygosity MAP: MYH-associated polyposis MGMT: O-6-Methylguanine-DNA Methyltransferase MINT1: Methylated in tumors 1 MINT2: Methylated in tumors 2 MINT31: Methylated in tumors 31 mirnas: micrornas MLH1: DNA Mismatch Repair Protein Mlh1 MMR: mismatch repair MMS: microsatellite stable MRI: Magnetic Resonance Imaging MSH: DNA Mismatch Repair Protein Msh2 271

272 MSI: microsatellite instability high MSI-H: microsatellite instability MSI-L: microsatellite instability low NCCN: National Comprehensive Cancer Network) ncrnas: non-coding RNAs NDRG: N-myc downstream-regulated gene NEUROG1: neurogenin 1 NFIB: nuclear factor I/B NPY: neuropeptide Y OCT4: octamer-binding transcription factor 4 OSMR: oncostatin M receptor PAX2: paired box 2 PCAT-1: prostate cancer-associated ncrna transcript PCA3: prostate cancer antigen 3 PDCD4: programmed cell death 4 PDLIM1: PDZ και LIM domain 1 PET: Positron Emission Tomography PI3K: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PIG3: Tumor Protein P53 Inducible Protein 3 POLD: DNA polymerase delta 1, catalytic subunit POLE: DNA polymerase epsilon, catalytic subunit PTEN: Phosphatase And Tensin Homolog RASSF1A: Ras association domain family member 1 RECK: reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs RNAi: RNA interference RUNX3: runt-related transcription factor 3 272

273 SFRP1: secreted frizzled related protein 1 SFRP2: secreted frizzled-related protein gene 2 SMAD: Mothers against decapentaplegic homolog 1 snornas: small nucleolar RNAs STAT: signal transducer and activator of transcription SOCS1: suppressor of cytokine signaling 1 SOX: Sry-box transcription factors TET1: ten eleven translocation 1 TFAP2E: transcription factor AP-2 epsilon TGF-β: transforming growth factor beta 1 TIMP2: tissue inhibitor of metalloproteinases 2 TIMP3: TIMP metallopeptidase inhibitor 3 ΤΝΜ: Tumor, Node, Metastasis TP53: Tumor Protein P53 TPM1: tropomyosin 1 TSLC1: cell adhesion molecule 1 TSP1: thrombospondin 1 T-UCRs: Transcribed Ultraconserved Regions UCEs: ultraconserved elements UCSs: ultraconserved cdna segments VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor vrnas: vault ncrnas WIF: WNT inhibitory factor 1 Yes1: YES proto-oncogene 1 Src family tyrosine kinase ZEB1: zinc finger E-box binding homeobox 1 273

274 ZEB2: zinc finger E-box binding homeobox 2 274

275 8. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ 275

276 276

277 Oncotarget, 2018, Vol. 9, (No. 30), pp: Deregulation of methylation of transcribed-ultra conserved regions in colorectal cancer and their value for detection of adenomas and adenocarcinomas Anastasia E. Kottorou 1, Anna G. Antonacopoulou 1, Foteinos-Ioannis D. Dimitrakopoulos 1,3, Georgia Diamantopoulou 2, Chaido Sirinian 1, Melpomeni Kalofonou 1,6, Theodoros Theodorakopoulos 2, Chrysa Oikonomou 3, Evangelos C. Katsakoulis 2, Angelos Koutras 1,3, Thomas Makatsoris 1,3, Nikos Demopoulos 4, Georgia Stephanou 4, Michalis Stavropoulos 5, Konstantinos C. Thomopoulos 2 and Haralabos P. Kalofonos 1,3 1 Clinical and Molecular Oncology Laboratory, Division of Oncology, Medical School, University of Patras, Patras, Greece 2 Division of Gastroenterology, University Hospital of Patras, Patras, Greece 3 Division of Oncology, University Hospital of Patras, Patras, Greece 4 Division of Genetics, Cell and Developmental Biology, Department of Biology, University of Patras, Patras, Greece 5 Department of Surgery, Medical School, University of Patras, Patras, Greece 6 Institute of Biomedical Engineering, Imperial College London, London, UK Correspondence to: Haralabos P. Kalofonos, kalofonos@upatras.gr Research Paper Keywords: transcribed-ultra conserved regions; colorectal cancer and adenomas; tissue and plasma methylation; screening biomarker; expression levels Received: January 12, 2017 Accepted: March 02, 2018 Published: April 20, 2018 Copyright: Kottorou et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 3.0 (CC BY 3.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. ABSTRACT Expression of Transcribed Ultraconserved Regions (T-UCRs) is often deregulated in cancer. The present study assesses the expression and methylation of three T-UCRs (Uc160, Uc283 and Uc346) in colorectal cancer (CRC) and explores the potential of T-UCR methylation in circulating DNA for the detection of adenomas and adenocarcinomas. Expression levels of Uc160, Uc283 and Uc346 were lower in neoplastic tissues from 64 CRC patients (statistically significant for Uc160, p<0.001), compared to nonmalignant tissues, while methylation levels displayed the inverse pattern (p<0.001, p=0.001 and p=0.004 respectively). In colon cancer cell lines, overexpression of Uc160 and Uc346 led to increased proliferation and migration rates. Methylation levels of Uc160 in plasma of 50 CRC, 59 adenoma patients, 40 healthy subjects and 12 patients with colon inflammation or diverticulosis predicted the presence of CRC with 35% sensitivity and 89% specificity (p=0.016), while methylation levels of the combination of all three T-UCRs resulted in 45% sensitivity and 74.3% specificity (p=0.013). In conclusion, studied T-UCRs expression and methylation status are deregulated in CRC while Uc160 and Uc346 appear to have a complicated role in CRC progression. Moreover their methylation status appears a promising non-invasive screening test for CRC, provided that the sensitivity of the assay is improved Oncotarget

278 INTRODUCTION Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer-related deaths for men and third for women worldwide, with 50,260 cases estimated for 2017 in United States [1]. A long-term decline in CRC incidence rates has been noted since the mid-1980s, which has been attributed mostly to early screening through colonoscopy and removal of precancerous lesions [2, 3]. However, screening is not routinely performed for persons younger than 50 years, resulting in increased incidence rates by 2% per year from 1993 through 2013 in this age group [1]. Furthermore, it has been established that early detection of malignant bowel lesions can significantly improve survival, but many CRCs are diagnosed at later stages, when the disease becomes symptomatic [4]. Screening for CRC through analysis of genetic or epigenetic markers in circulating cell-free DNA (ccfdna), isolated from plasma or serum specimens, can provide a minimally invasive and low-cost method with higher probability of patient adherence compared to colonoscopy. CcfDNA originates from apoptotic and necrotic cells [5, 6] and is found at higher levels in cancer patients compared to healthy individuals [7, 8]. An increasing number of studies have investigated the role of ccfdna as a cancer biomarker, identifying tumour-derived genetic and epigenetic characteristics in serum/plasma samples [9 18]. Especially for CRC, identification of DNA mutations or methylated genetic regions, offers a clinically useful biomarker for CRC screening and monitoring response to therapy [15, 19 24]. Ultraconserved regions (UCRs) were first identified in 2004 as 481 segments longer than 200 bp, absolutely conserved between orthologous regions of the human, rat, and mouse genomes, that may have played an important role in shaping the landscape of gene regulation during mammalian evolution [25, 26]. Most UCRs are noncoding and are under negative selection that is much stronger than that in protein coding genes [27]. Specific groups of UCRs are differentially expressed or methylated in various tumor types and have been associated with disease outcome [28 40]. The majority of UCRs are transcribed (T-UCRs), while their transcription is in part regulated by methylation. In particular, Uc160, Uc283 and Uc346 in CRC cells have been found to undergo specific CpG island hypermethylation-associated silencing compared with normal tissues, while DNA hypomethylation reversed this effect [40]. The aim of this study was to compare the expression and methylation levels of Uc160, Uc283 and Uc346 in colorectal adenocarcinomas, adenomas and non-malignant colonic tissues, explore their role in CRC progression and investigate the use of their methylation status in circulating DNA as a biomarker for CRC and colorectal adenomas. RESULTS Tissue T-UCR expression Expression levels of Uc160, Uc283 and Uc346 were assessed in 51 adenocarcinomas and paired non-malignant tumor adjacent tissues. Additionally, Uc160 expression levels were assessed in 2 fresh frozen (FF) adenoma tissue specimens. Differences in expression levels were noted among adenocarcinomas and non-malignant tumor adjacent tissues. Non-malignant tissues demonstrated higher expression levels of Uc160, Uc283 and Uc346 compared to adenocarcinomas, although the difference was statistically significant only for Uc160 (p<0.001, p=0.182 and p=0.639 respectively, Table 1, Figure 1). T-UCRs expression levels in adenocarcinomas were not associated with sex, age, tumor type (ulcerative or exophytic), location (left or right colon or rectum), stage, lymph node infiltration, differentiation and distant metastasis (Supplementary Table 1). Similarly, T-UCR levels were also independent of lifestyle factors i.e. alcohol, meat or coffee consumption, smoking and exercise. However, lower levels of tumor Uc346 (p=0.011, Figure 2) was noted in patients who at the time of surgery presented with adenocarcinomas and adenomas concomitantly. Tissue T-UCR methylation Methylation levels of Uc160, Uc283 and Uc346 were assessed in 64 adenocarcinomas and paired, non- Figure 1: Relative expression of Uc160 (A), Uc283 (B) and Uc346 (C) in adenocarcinomas and non-malignant tumor adjacent tissues Oncotarget

279 Table 1: Relative expression of T-UCRs in adenocarcinomas, non-malignant tumor adjacent tissues and adenomas Tissue Number of samples Uc160 relative expression P value Uc283 relative expression P value Uc346 relative expression P value Non-malignant ( ) 0.94 ( ) 0.21 (0-6.14) tumor adjacent < Adenocarcinoma ( ) 0.52 ( ) 0.20 (0-5.86) Adenoma ( ) N/A N/A malignant, tumor-adjacent tissues, as well as in 6 FF adenomas. Methylation levels of Uc160, Uc283 and Uc346 were significantly different among adenocarcinomas, nonmalignant tumor adjacent tissues and adenomas (p<0.001, p=0.001 and p=0.004 respectively, Table 2, Figure 3). Interestingly, the highest Uc160 methylation levels were noted in adenocarcinomas while Uc283 and Uc346 methylation levels reached the highest values in adenomas. T-UCR methylation levels in adenocarcinomas were not correlated with expression levels in both adenocarcinomas and non-malignant tumor-adjacent tissues. Moreover, they were not associated with most clinicopathological characteristics (Supplementary Table 2) or lifestyle characteristics (Data not shown). However, methylation of Uc283 in adenocarcinomas was higher in patients without distant metastasis compared to patients with distant metastasis (p=0.021, Figure 4). Furthermore, a trend was noted for decreasing levels of Uc283 methylation in grade II compared to grade I tumors. Notably, grade I tumors exhibited almost double median value compared to grade II tumors (p=0.052). Plasma T-UCR methylation T-UCR methylation levels were assessed in plasma samples from 40 healthy participants, 12 participants with colon inflammation, 50 CRC patients and 59 adenoma patients. Plasma samples from 11 CRC patients and 1 adenoma patient were collected postoperatively and were excluded from further analysis. Notably, β-actin plasma levels were higher in cancer patients compared to healthy controls, adenoma patients and inflammation Figure 2: Relative expression of Uc346 in adenocarcinomas and adenocarcinoma and adenoma coexistence Oncotarget

280 Table 2: Relative methylation of T-UCRs in adenocarcinomas, non-malignant tumor adjacent tissues and adenomas Tissue Number of samples Uc160 relative methylation P value Uc283 relative methylation P value Uc346 relative methylation P value Non-malignant (0-6.22) 0.13 (0-1.08) (0-0.93) tumor adjacent < Adenocarcinoma (0-11.0) 0.27 (0-1.85) (0-1.80) Adenoma ( ) 0.46 ( ) 0.11 (0-1.82) Figure 3: Relative methylation of Uc160 (A), Uc283 (B) and Uc346 (C) in adenocarcinomas, non-malignant tumor adjacent tissues and adenomas. Figure 4: Relative methylation of Uc283 in adenocarcinomas and association with distant metastasis Oncotarget

281 Table 3: Frequency of plasma T-UCR methylation in different groups of participants (preoperative samples only) Methylation in Plasma Methylation status Healthy controls Category Adenoma Ca Patients Patients Other Patients Uc160 Unmethylated 38 (95%) 52 (89.7%) 26 (66.7%) 9 (75%) 125 Methylated 2 (5%) 6 (10.3%) 13 (33.3%) 3 (25%) 24 Uc283 Unmethylated 38 (95%) 53 (91.4%) 34 (87.2%) 10 (83.3%) 135 Methylated 2 (5%) 5 (8.6%) 5 (12.8%) 2 (16.7%) 14 Uc346 Unmethylated 37 (92.5) 50 (86.2%) 30 (76.9%) 12 (100%) 129 Methylated 3 (7.5%) 8 (13.8%) 9 (23.1%) 0 (0%) 20 Total Other patients: patients with inflammation or diverticulosis Total patients (p=0.042, median values 0.20, 0.12, 0.06 and 0.04 respectively). Moreover, they were double in nonsmokers compared to smokers (p=0.046) but were not associated with other lifestyle factors (alcohol, meat and coffee consumption and exercise), patients BMI, tumor or adenoma size, adenoma location, grade of dysplasia or type. The plasma T-UCR methylation frequency was the highest in CRC patients and lowest in healthy controls (Table 3). Plasma Uc160 and Uc346 methylation levels differed significantly among the four groups of participants (p<0.001 and p=0.039 respectively). More specifically, cancer patients had the highest mean values respectively (0.08 and 0.04) compared to adenoma patients (0.02 and 0.02), inflammation patients (0.04 and 0) and healthy controls (0.005 and 0.001). In cancer and adenoma patients, Uc160 plasma methylation levels were positively correlated with lesion size (tumor or adenoma) (p<0.001, Figure 5). Moreover they were considerably higher in patients with lymph node infiltration (p=0.024). In addition, the frequency of methylated Uc160 in plasma was higher in male patients and in patients over 60 years (p=0.023 and p=0.040) (Table 4). With regard to Uc346 plasma methylation levels, these were correlated with tissue methylation levels (p=0.011). For all T-UCRs, plasma methylation levels were not associated with the life style and clinicopathological parameters mentioned above. Combinations of the three methylated T-UCRs in plasma were investigated to identify one with the highest sensitivity and specificity for adenocarcinomas (Table 5 and Figure 6A) and for adenocarcinomas or adenomas (Table 6 and Figure 6B). When taking into consideration both specificity and sensitivity, Uc160 and the sum of the three T-UCRs seem to be the most promising biomarkers for CRC, with sensitivity and specificity 35% and 89%, and 45% and 74.3% respectively (p=0.016 and p=0.013). With regard to the detection of adenomas or adenocarcinomas, Uc160 and Uc346 had 30.2% sensitivity and 80.7% specificity although statistical significance was not achieved possibly due to the small number of patients (p=0.160). It is worth mentioning that all CRC patients whose samples were collected postoperatively had negative plasma Uc160 methylation. Exceptions were two patients who had postoperative active disease and their Uc160 levels remained positive: a stage D CRC patient (#062), who did not undergo metastasectomy, and an initially characterized as inflammation patient (#077), who was found to harbor liver metastasis from renal cancer. On the contrary, patient #134, who had a family history of CRC, maintained negative Uc160 plasma methylation status in three different time points (before undergoing colonoscopy, preoperatively and postoperatively). Further investigation into the association between the methylation status of these T-UCRs in plasma and family history of cancer revealed that a greater percentage of sporadic CRC patients presented with methylated Uc160 (57.1%) and Uc346 (25%), compared to CRC patients with a first degree relative with any type of cancer (Uc % and Uc %) (p=0.052 and p=0.015, respectively). This difference in Uc160 methylation status remained the same when patients with adenomas (25% in general population vs 7.9% in patients with first degree relatives with cancer) were included in the CRC cohort (p=0.050). Additionally, the methylation levels of Uc160 were higher in sporadic CRC and adenoma patients (p= 0.049) compared to CRC patients with a first degree relative with cancer. Cell proliferation The role of Uc160 and Uc346, which appeared to be the most promising biomarkers, was further evaluated by overexpressing these two T-UCRs in HT-29, Caco- 2 and DLD-1 colon cancer cell lines. Cell proliferation rate was higher at 48h post transfection in all cell lines transfected with Uc160 and Uc346 compared to the control (Figure 7), reaching statistical significance for Uc160 in Caco-2 (p=0.008) and for Uc346 in DLD-1 cells (p=0.033) Oncotarget

282 Cell migration In the scratch wound healing assay, colon cancer cells that transiently overexpressed Uc160 or Uc346 displayed increased motility rates compared to the control at all time points and all cell lines (Figure 8). Although differences appeared small, the high reproducibility of the assay revealed that they were statistically significant. More specifically, Uc160 and Uc346 overexpressing HT-29 cells had increased motility rates at 24h compared to control cells (p=0.017 and p=0.041 respectively, Figure 8B and 8E), as well as DLD-1 cells (p=0.023 and p=0.004 respectively, Figure 8C and 8F). Differences in motility rates were also observed in Caco-2 cells at 24h, however without reaching statistical significance (p=0.260 and p=0.678 respectively, Figure 8A and 8D). Further analysis of DLD-1 cells with transwell migration assay confirmed the above results, with an increased number of Uc160 or Uc346 transfected cells migrating compared to control cells (p=0.005 for both T-UCRs overexpression) (Figure 9). DISCUSSION UCRs have been associated with development and progression of many cancer types including CRC through aberrations in expression levels, methylation and even single nucleotide frequencies [28 40]. For example, expression levels of Uc73 and Uc388 in CRC are significantly decreased in tumor tissues while Uc73 levels have been correlated with overall survival [31]. Moreover, a cancer specific Uc160, Uc283 and Uc346 methylation pattern has been identified in colon cancer cells while DNA demethylation reversed T-UCR silencing [40]. In the present study, expression and methylation levels of Uc160, Uc283 and Uc346 were assessed in colorectal adenocarcinomas, paired non-malignant tumoradjacent tissues and adenomas. Interestingly, we found that not only all CRC cases were methylated but also most normal tissues too. These findings provide a new insight on the presence of methylation in normal CRC tissue compared to previously reported findings whereby none of the normal colon tissues and only some of the colonic tumor tissue samples had methylated Uc160, Uc283 and Uc346 (72.29%, 65.85% and 46.91% respectively) [40]. This discrepancy in the results could be attributed possibly to differences in the sensitivity of the methodological approaches chosen (qmsp vs MSP) and the larger number of normal tissue samples used in our study (64 vs 5). Moreover, adenocarcinomas and adenomas exhibited higher levels compared to non-malignant tissues, in concordance with previous publications [40]. Surprisingly, methylation levels were highest in adenomas, probably due to the small number of adenoma tissue samples analyzed. Figure 5: Correlation of plasma Uc160 methylation levels with adenocarcinoma or adenoma size Oncotarget

283 Figure 6: ROC curve analyses for plasma T-UCR methylation levels and colorectal adenocarcinomas (A) and colorectal adenocarcinomas or adenomas (B) Oncotarget

284 Table 4: Characteristics of the patients with positive plasma Uc160 methylation Patient code Sex Age Category Tumor Differentiation Lymph Node infiltration Stage (Duke s) Tumor/ Adenoma Size Tumor/Adenoma Position 045 M 64 Ad 0.5 Left colon 049 M 80 Ad 2.5 Rectum 053 F 59 CRC Intermediate Yes C 5.5 Right colon 062 F 67 CRC Intermediate Yes D 4.5 Left colon 064 F 49 H 066 M 72 CRC Low No A 2.8 Left Colon 077 M 40 In 079 F 86 CRC No B 5.5 Right colon 084 M 61 Ad 4 Right colon 090 M 73 Ad 0.6 Right colon 095 M 80 CRC Intermediate Yes D 5.8 Right colon 102 M 75 Div 104 M 63 Ad 0.15 Left colon 113 F 83 Ad 0.4 Left colon and rectum 130 M 63 In 131 M 77 CRC Intermediate No B 5.3 Rectum 138 M 82 CRC Yes C 8 Rectum 147 M 64 CRC Intermediate Yes C 3.3 Left colon 148 M 9 CRC Intermediate Yes C 2.5 Right colon 156 M 43 CRC Intermediate Yes D 5.5 Rectum 165 M 64 CRC Intermediate Yes C 6.5 Left colon 198 M 80 CRC Intermediate Yes C 5 Rectum 224 F 66 H 229 M 62 CRC Intermediate Yes D 5.5 Left colon 230 F 73 CRC Intermediate Yes D 5.5 Rectum 243 M 69 CRC Intermediate No B 5.8 Right colon M: male, F: female, Ad: adenoma, H: healthy, In: inflammation, Div: diverticulosis Table 5: Sensitivity and specificity values of plasma T-UCR methylation for colorectal adenocarcinoma Plasma methylation levels Sensitivity Specificity AUC P value Uc160 35% 89% Uc % 92.7% Uc % 77.5% Uc160 + Uc283 40% 82.6% Uc160 + Uc % 80.7% Uc283 + Uc346 30% 83.5% Uc160 + Uc283 + Uc346 45% 74.3% Oncotarget

285 Table 6: Sensitivity and specificity values of plasma T-UCR methylation for colorectal adenoma or adenocarcinoma Plasma methylation levels Sensitivity Specificity AUC P value Uc % Uc % 92.5% Uc % 94.3% Uc160 + Uc283 26% 81.1% Uc160 + Uc % 83% Uc283 + Uc346 24% 86.8% Uc160 + Uc283 + Uc % 75.5% Furthermore, patients without metastasis displayed increased levels of Uc283 CRC tissue methylation compared to patients with metastasis. To our knowledge previous publications have focused only at lymph node and not distant metastases and reported a positive correlation between methylation status and positive lymph nodes for a pool of cancer patients with lymphoma, leukemia, colon, breast and lung cancer [40]. Since T-UCRs are highly methylated in CRC tissues compared to normal colon, higher levels of T-UCR expression were anticipated for non-malignant colon samples compared to CRC tissues. This was indeed observed for Uc160 and Uc283 (although not statistically significant for Uc283) but not for Uc346. This discrepancy may originate partly from the complex transcriptional regulation of T-UCRs that involves mirna binding. Notably, Uc160 and Uc346 have been reported to have significant antisense complementarity to mirnas, giving rise to six possible interacting pairs [28]. Another interesting observation was that b-actin levels were higher in CRC patients compared to healthy controls, adenoma patients or inflammation patients, reflecting the presence of a higher concentration of ccfdna in accordance with previous publications, [7, 8, 41, 42]. Similarly, methylation levels of Uc160 and Uc346 were higher in the plasma of CRC patients compared to adenoma patients, inflammation patients or healthy controls as expected from the differences in methylation levels noted in the tissues. In addition, plasma Uc160 methylation levels were positively correlated with lymph node infiltration and lesion size (tumor or adenoma), possibly due to the higher levels of tumor DNA being released from the neoplastic lesion, which increases the detection sensitivity of ccfdna, as has been observed for other molecules [43]. Along the same line, it is of great interest that none of the patients whose samples were collected postoperatively was positive for plasma Uc160 methylation, with the exception of a stage D patient without metastasectomy, reflecting active disease. Supportive to this observation is the case of a stage C patient who had positive plasma Uc160 methylation preoperatively and which turned to negative after the surgical removal of the tumor and the infiltrated lymph nodes. In accordance with our results, postoperative detection of other methylated markers such as serum TFPI2 have been associated with R2 surgery, where active disease is present [44]. Of special interest is the negative plasma Uc160 methylation status observed in all 3 samples collected at different time points, preoperatively (from 2 different Figure 7: MTT proliferation assay for Caco-2 (A) HT-29 (B), and DLD-1 (C) transiently transfected cells with Uc160 and Uc346 expressed in percentage of control cells (mean ±SEM) Oncotarget

286 Departments) and postoperatively for a patient with CRC family history. This not only reinforces the reliability of the methodology but also raises the question of whether the role of T-UCRs differs between sporadic and familial CRC, since there was also a negative correlation between the methylation status of Uc160 and Uc346 and a family history of cancer. Such differences have been observed before in mirna methylation levels, where higher methylation levels were noted in sporadic CRC cases compared to Lynch syndrome patients [45]. Considering the aforementioned findings, we explored the possibility of whether the methylation status of these three T-UCRs in plasma could constitute a minimally invasive biomarker for CRC or adenomas. Uc160 and the sum of the three T-UCRs were identified as the most promising biomarkers, with sensitivity and specificity 35% and 89%, and 45% and 74.3% respectively. So far, plasma methylation of SEPT9 seems to have the highest sensitivity and specificity (reaching 95.6% and 84.8% respectively) for CRC, although these Figure 8: Scratch wound healing assay in HT-29, Caco-2 and DLD-1 cells transiently transfected with Uc160 and Uc346. Wound closure in Caco-2 (A), HT-29 (B) and DLD-1 (C) cells in 24h and 48h as expressed in percentage of the surface at 0h (mean ±SEM). Representative images of Caco-2 (D), HT-29 (E) and DLD-1 (F) cells at 0h and 24h at a magnification of 5x Oncotarget

287 values drop to 9.6% for adenomas [46, 47]. Although these results led to the development of SEPT9 plasma methylation kits for clinical use, retrospective studies reported conflicting results, with the sensitivity of the kit dropping to as low as 50.9% [46 49]. With regard to plasma methylation biomarkers for adenoma detection, the majority of published reports state relatively low specificities [50, 51]. Nevertheless there is an earlier study on plasma methylation of RASSF2A, APC, MGMT and Wif-1 that suggested a more promising biomarker panel for adenoma with sensitivity of 86.5% and specificity of 92.1% [52]. It remains an interesting question whether this will be transferred to the clinic as a follow up study has not yet been published. In our study, inclusion of a larger cohort of adenoma patients could potentially uncover a similar role for Uc160 and Uc346 plasma methylation. Since Uc160 and Uc346 seem to have a good potential as biomarkers, we aimed to assess their significance in tumor progression. Overexpression of Uc160 or Uc346 in CRC cell lines resulted to an increase in the proliferation as well as in the migration rate of the cells, supporting an oncogenic role for these long noncoding RNAs in the metastatic process of CRC, as it has been reported for other T-UCRs [53]. These findings are in line with the higher expression of Uc346 and lower methylation levels of Uc346 and Uc160 in CRC patients who tended to have distant metastasis more often compared to patients with lower Uc346 expression and higher methylation levels. It is of note that, although these T-UCRs are downregulated in CRC and CRC cell lines, overexpression led to increased proliferation and migration rate. Similar contrasting observations have been noted also for Uc73, whose upregulation associates with colon tumorigenesis [28]. On the contrary a positive correlation of Uc73 with overall survival was noted elsewhere, suggesting a potential role of Uc73 as a tumor suppressor in CRC [31]. These discrepancies further highlight the complicated role of T-UCRs in CRC evolution. In conclusion, methylation and expression of Uc160, Uc283 and Uc346 are deregulated in CRC while Uc160 and Uc346 may participate in the metastatic process of CRC. Plasma methylation of Uc160, Uc283 and Uc346 is a promising biomarker for both CRC and adenomas mainly due to the good specificity observed. However, improvements in the methodological approach are necessary to increase the sensitivity of this assay. Figure 9: Migration of DLD-1 cells transiently transfected with Uc160 and Uc346 towards 10% FBS in comparison to control cells. Representative images of control (A), Uc160 (B) and Uc346 (C) at a magnification of 40x. Number of migrated cells per field (D) represented as mean ±SEM Oncotarget

288 Table 7: Demographic and life style characteristics of the participants Demographic characteristics Cancer Patients Adenoma Patients Inflammation patients Healthy individuals Gender Male 33 (66%) 38 (64.4%) 6 (50%) 12 (30%) Female 17 (34%) 21 (35.6%) 6 (50%) 28 (70%) Age Group (32%) 20 (33.9%) 4 (33.3%) 24 (60%) >60 34 (68%) 39 (66.1%) 8 (66.6%) 16 (40%) Smoking No 16 (32%) 30 (50.8%) 6 (50%) 32 (80%) Yes 9 (18%) 23 (39%) 5 (41.7%) 8 (20%) Cancer Family No 7 (14%) 25 (42.4%) 5 (41.7%) 19 (47.5%) History Yes 13 (26%) 26 (44.1%) 6 (50%) 17 (42.5%) Coffee No 7 (14%) 9 (15.3%) 1 (8.3%) 6 (15%) consumption Yes 13 (26%) 43 (72.9%) 10 (83.3%) 34 (85%) Alcohol No 16 (32%) 26 (44.1%) 5 (41.7%) 22 (55%) consumption Yes 8 (16%) 29 (49.1%) 6 (50%) 18 (45%) Meat <2 times/wk 6 (3%) 9 (15.3%) 2 (16.7%) 7 (17.5%) consumption >2 &<4/wk 3 (6%) 31 (52.5%) 3 (25%) 14 (35%) >4/wk 11 (22%) 11 (18.6%) 5 (41.7%) 18 (45%) Exercise Occasionally 13 (26%) 36 (61%) 7 (58.3%) 22 (55%) Often 11 (22%) 18 (30.5%) 4 (33.3%) 18 (45%) Figure 10: Workflow of the study Oncotarget

289 MATERIALS AND METHODS The outline of the workflow of our study is shown in Figure 10. Patients and samples This study was approved by the local Research Ethics Committee of the University Hospital of Patras, Greece and informed consent was obtained from all participants. Sixty four patients with CRC, 59 patients with adenomas, 40 control subjects and 12 patients with colon inflammation were enrolled in the study at the University Hospital of Patras (Departments of Gastroenterology, Surgery and Medical Oncology) between November 2012 and April Clinical diagnosis was determined on the basis of colonoscopic findings and histological assessment. Control subjects underwent colonoscopy as part of a screening routine. Sixty four tumor and paired non-malignant specimens were obtained from the CRC patients and 6 adenoma specimens were obtained from the adenomas-only patients. Specimens were stored in RNAlater RNA Stabilization Reagent (Sigma Aldrich, Austria) at -80 C. Blood samples were collected by phlebotomy prior to colonoscopy (Department of Gastroenterology) or prior to surgical excision of the tumor (Department of Surgery) or postoperatively (Department of Oncology) in K 2 EDTA Vacuette tubes (Greiner BioOne, Germany). Plasma was prepared within 2 hours of blood collection by centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes at 4 C and was stored at -80 C until testing. Participants characteristics are shown in Table 7. RNA preparation and cdna synthesis Total RNA was extracted from 80 mg neoplastic and paired non-malignant tumor adjacent FF tissue specimens from 51 CRC patients, as well as from 2 FF adenoma tissue specimens using the PerfectPure RNA Tissue Kit (5Prime, Hamburg, Germany), according to the manufacturers instructions. RNA samples were then incubated with DNase (Ambion, Austin, TX, USA) and quantified using a Nanodrop-1000 spectrophotometer (NanoDrop, Fisher Thermo, Wilmington, DE, USA). RNA integrity was checked by electrophoresis on 1% (w/v) agarose gels and the RNA was stored at -80 C. A total of 3 μg of RNA was reverse transcribed into cdna using 100 U of Superscript III Reverse Transcriptase (Life Technologies), 300 ng of random primers (Foundation for Research and Technology-Hellas, Crete, Greece) and 5 nm dntps (Stratagene) in a total volume of 50 μl. A no enzyme control was used to ensure that the RNA samples were DNA-free. The mixture was incubated in a C1000 Touch thermal cycler (Bio-Rad) at 25 C for 5 minutes, 50 C for 60 minutes, and 70 C for 15 minutes. CDNA was diluted to 30 ng/μl and stored at -20 C. Quantification of T-UCRs expression Expression levels of T-UCRs 160, 283 and 346 were quantified by pre-optimized real-time PCR (qpcr) assays (Primer-Design Ltd, Hants, UK) modified to allow the use of dual labeled hydrolysis probes (Supplementary Table 3). The qpcr reactions were carried out in triplicate in a total volume of 20 μl, containing 5μl of cdna, 2 TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA) and 150 nm of the specific T-UCR primer mix. A no template control was used in all reactions. Cycling conditions were as follows: 95 C for 10 minutes, 45 cycles at 95 C for 15 seconds and at 60 C for 1 minute. Expressed Alu-Sq repeats were used as a reference gene, as it was validated to be a stably expressed repeat sequence in normal and tumor tissues of different grades and stages [54, 55]. Primers for the Alu-Sq were synthesized by Metabion International AG (Martinsried, Germany) [56]. The relative expression levels of each T-UCR were calculated using the LinReg Program [57] and were normalized to the Alu-Sq levels. DNA isolation and bisulfite conversion of tissue DNA DNA was extracted from 25 mg neoplastic and paired non-malignant tumor adjacent FF tissue specimens from 64 CRC patients, as well as from 6 FF adenomas using the Nucleospin Tissue Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany) according to the manufacturer s instructions. DNA was eluted in 30 μl elution buffer. A total of 1 μg DNA was bisulfite converted and recovered using the Qiagen Epitect DNA bisulfite kit (Qiagen, Hilden, Germany). Bisulfite converted DNA was eluted in 40 μl elution buffer diluted in a total volume of 200 μl and stored at -20 C. DNA isolation and bisulfite conversion of ccfdna DNA was extracted from 4 ml plasma from 40 healthy participants, 12 patients with colon inflammation, 50 CRC patients and 59 adenoma patients using the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer s instructions. DNA was eluted in 50μl elution buffer. Sodium bisulfite conversion of DNA was performed by the EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA) according to the manufacturer's protocol. Bisulfite converted DNA was eluted in 30μl elution buffer and stored at -20 C. DNA methylation analysis of tissue and ccfdna The methylation status of T-UCRs 160, 283 and 346 in tissue and ccfdna samples was detected by real-time quantitative Methylation Specific PCR (qmsp). Bisulfite Oncotarget

290 treated-based methylation-specific primers and relevant Locked Nucleic Acid (LNA) dual labeled hydrolysis probes specific for methylated T-UCRs 160, 283 and 346 were designed using MethPrimer [58], following the NCBI library sequences ( UCbase 2.0 ( was also used for the identification of possible SNPs in Uc160, Uc283 and Uc346 promoter regions so that primers were designed outside regions with SNPs with known minor allele frequency of more than 0.01 [59] (Supplementary Table 4). Each primer and LNA probe was designed to bind to 2-3 CGs while assuring that no CGs were present in the region between the primers and the probe, so that the detected amplicons were fully methylated. Primers sequences were then subjected to BiSearch web-based primer analysis tool to ensure specificity of the bisulfite converted designed primers [60]. All primers and probes were synthesized by Metabion International AG (Martinsried, Germany) (sequences are shown in Supplementary Table 3). The qpcr reactions were carried out in triplicate, in a total volume of 20 μl, containing 5 μl of bisulfite converted DNA, 2 TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 300 nm of each primer and 75 nm of each probe. In all reactions three controls were used: a no template control, an unmethylated control (healthy donor blood DNA, bisulfite converted) and a fully methylated control (healthy donor blood DNA, in vitro methylated with SsI methylase, NEB Ipswich, MA and bisulfite converted). Serial dilutions of in vitro methylated DNA (100%, 10%, 1%, and 0.1%) were used to establish a standard curve. Methylation levels were finally normalized to β-actin levels, which was used as a reference gene, using previously reported primers and probe [61]. Cycling conditions were as follows: 95 C for 10 minutes and 50 cycles at 95 C for 15 seconds and at 60 C for 1 minute (Supplementary Table 3). When analyzing ccfdna samples, a first round of PCR was also performed for each T-UCR, with external primers that bind to CpGs-free bisulfite converted DNA. The qpcr reactions were carried out in a total volume of 20 μl, containing 6 μl of bisulfite converted DNA, 5x Mg-free KAPA Taq HotStart Buffer (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA), 400nM of each primer, 800 nm dntps, 1.25 nm MgCl 2 and 1.5 U KAPA Taq HotStart DNA Polymerase (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Cycling conditions were 95 C for 3 minutes, 15 cycles at 95 C for 30 seconds, 56 C for 30 seconds and 72 C for 1 minute (see Supplementary Table 3 for detailed annealing temperatures). All samples were considered positive if at least one of the three replicates demonstrated amplification and depending on the amplification efficiency if the Cycle threshold (Ct) value for methylated Uc160 and Uc283 was 40, for methylated Uc and for B-actin was 35. Blind experimental design and analysis was performed with respect to the participants identities and data. Statistical analysis IBM SPSS Statistics for Windows, Version 21.0 (Armonk, NY: IBMCorp) was used for all the analyses performed. Intergroup comparisons for the association of clinicopathological parameters with mrna and methylation levels of Uc160, Uc283 and Uc346 were performed using Kruskal Wallis and Mann Whitney nonparametric tests. Comparisons between related groups were performed using Wilcoxon paired samples test for mrna and methylation levels. Pearson correlation was used to detect potential correlations between T-UCRs methylation and mrna levels, tumor size and methylation levels in plasma and tumors. Receiver Operating Characteristics (ROC) curve analysis and the area under the curve (AUC) were determined to define markers with highest sensitivity and specificity. Cell culture Caco-2, HT-29 and DLD-1 colon cancer cell lines were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). DLD-1 and HT-29 cells were cultured in RPMI 1640 medium with 10% fetal bovine serum (FBS) and Caco-2 cells were cultured in Eagle s Minimum Essential medium (EMEM) with 10% FBS. Cells were cultured at 37 C, 5% CO2 and 100% humidity. Cloning and transfection Lujambio et al. [40] showed that Uc160 and Uc346 are methylated in colon cancer cell lines. Therefore Uc160 and Uc346 were overexpressed in colon cancer cell lines and proliferation and migration were defined. Uc160 and Uc346 transcribed regions were amplified using two sets of primers for each T-UCR, one outer set and one inner set which included the restriction sites for XhoI and BamHI (Supplementary Table 5). PCR products as well as pcdna3.1/hygro(-) plasmid (Invitrogen) were digested with XhoI and BamHI, cleaned and ligated using DNA ligation kit (Takara). DH5a competent cells were transformed with the ligated products and plasmids were isolated from the cultures grown the selected colonies with Nucleospin Plasmid (Macherey Nagel, Germany). Cell transfections were performed using TurboFect in vitro Transfection Reagent (Fermentas GmbH, Germany) for 20h according to the manufacturer's instructions. Transfection efficiency was confirmed before performing the proliferation and motility experiments (Supplementary Figure 1). Cell proliferation The effect of Uc160 and Uc346 overexpression on proliferation of cells was determined using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dephenyltetrazoliumbromide (MTT) assay. Briefly, Caco-2, HT-29 and DLD Oncotarget

291 1 cells were seeded at a density of cells/well in 24-well plates with full growth media and transiently transfected with 250 ng empty vector or plasmid with Uc160 or Uc346 for 20h. Cell proliferation was measured at 0h, 24h and 48h after transfection. MTT solution (5 mg/ ml in PBS) was added to each well (1/10 of the volume) and incubated for 4 h at 37 C. Medium was removed and formazan crystals were solubilized in 100 μl acidified isopropanol. The solution was transferred to 96-well plates and read in a microplate reader (Tecan, Sunrise, Magellan 2) at a wavelength of 570 nm using reference wavelength 620 nm. Cell numbers were calculated using standard curves that were generated for each cell line using an increasing number of cells plated per well. The experiments were performed three times in triplicate. Scratch wound healing assay Motility of Caco-2, HT-29 and DLD-1 cells was evaluated using the scratch wound healing assay. Briefly, cells were grown in 6-well plates in 90% confluency and transiently transfected with 1μg vector or plasmid with Uc160 or Uc346 for 20h. After transfection the cells were then wounded with a plastic pipette tip, rinsed with PBS and incubated with growth media. Images were captured at time 0h, 24h and 48h at a magnification of 5x using an Axiocam ERc 5s camera (Carl Zeiss Microscopy LLC) mounted on an inverted microscope (Axiovert 40 CFL, Carl Zeiss Microscopy LLC). The experiments were performed five times. Transwell migration assay Cell migration of DLD-1 was further evaluated using the transwell migration assay. Cells were transiently transfected with Uc160 or Uc346 or vector for 20h and left in full growth medium post-transfectionally for 24h. Cells were suspended in serum-free culture medium and cells were loaded onto the top of Transwell chambers equipped with 8.0 μm pore-size polycarbonate membranes (Corning Inc., NY, USA) and allowed to migrate towards 10% FBS medium for 24h. Migrated cells were fixed with Carson s buffer and stained with Giemsa. Images were captured at a magnification of 40x using an Axiocam ERc 5s camera (Carl Zeiss Microscopy LLC) mounted on an inverted microscope (Axiovert 40 CFL, Carl Zeiss Microscopy LLC) and the average number of migrated cells was calculated using five different fields. Abbreviations CRC: Colorectal cancer, UCRs: Ultraconserved regions, T-UCRs: Transcribed Ultraconserved regions, ccfdna: circulating cell-free DNA, FF: fresh frozen, qpcr: quantitative PCR, qmsp: quantitative Methylation Specific PCR, LNA: Locked Nucleic Acid, MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- dephenyltetrazolium-bromide. Author contributions AA conceived the project idea, AEK and AA designed the study, FD, GD and TT collected the patients samples, FD, GD, TT and CO collected the patients data, AEK performed the experiments and analyzed the results, AA supervised the experiments with the patients samples, CS supervised the cell culture experiments, AA, ND, GS and HK supervised the project, EK, AK, TM, MS, KT and HK examined the patients in their departments, AA and AEK wrote the manuscript, AA, AEK, FD, CS, MK and HK contributed to the final version of the manuscript. ACKNOWLEDGMENTS We thank Dr Anastasios Papanastasiou for helpful advice on cloning experiments. CONFLICTS OF INTEREST The authors report no conflicts of interest. REFERENCES 1. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, CA Cancer J Clin. 2017; 67: caac Cress RD, Morris C, Ellison GL, Goodman MT. Secular changes in colorectal cancer incidence by subsite, stage at diagnosis, and race/ethnicity, Cancer. 2006; 107: Siegel RL, Ward EM, Jemal A. Trends in colorectal cancer incidence rates in the united states by tumor location and stage, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2012; 21: EPI Levin B, Lieberman DA, McFarland B, Smith RA, Brooks D, Andrews KS, Dash C, Giardiello FM, Glick S, Levin TR, Pickhardt P, Rex DK, Thorson A, et al. Screening and surveillance for the early detection of colorectal cancer and adenomatous polyps, 2008: a joint guideline from the american cancer society, the us multi-society task force on colorectal cancer, and the american college of radiology. CA Cancer J Clin. 2008; 58: CA Jahr S, Hentze H, Englisch S, Hardt D, Fackelmayer FO, Hesch RD, Knippers R. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res. 2001; 61: Rykova EY, Morozkin ES, Ponomaryova AA, Loseva EM, Zaporozhchenko IA, Cherdyntseva NV, Vlassov VV, Laktionov PP. Cell-free and cell-bound circulating nucleic acid complexes: mechanisms of generation, concentration Oncotarget

292 and content. Expert Opin Biol Ther. 2012; 12:S Perkins G, Yap TA, Pope L, Cassidy AM, Dukes JP, Riisnaes R, Massard C, Cassier PA, Miranda S, Clark J, Denholm KA, Thway K, Gonzalez De Castro D, et al. Multi-purpose utility of circulating plasma DNA testing in patients with advanced cancers. PLoS One. 2012; 7:e Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat Rev Cancer. 2011; 11: Lavon I, Refael M, Zelikovitch B, Shalom E, Siegal T. Serum DNA can define tumor-specific genetic and epigenetic markers in gliomas of various grades. Neuro Oncol. 2010; 12: nop Weiss L, Hufnagl C, Greil R. Circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med. 2013; 369: Tanaka H, Tsuda H, Nishimura S, Nomura H, Kataoka F, Chiyoda T, Tanaka K, Iguchi Y, Susumu N, Aoki D. Role of circulating free alu DNA in endometrial cancer. Int J Gynecol Cancer. 2012; 22: IGC.0b013e c Zhou J, Shi YH, Fan J. Circulating cell-free nucleic acids: promising biomarkers of hepatocellular carcinoma. Semin Oncol. 2012; 39: seminoncol Melnikov AA, Scholtens D, Talamonti MS, Bentrem DJ, Levenson VV. Methylation profile of circulating plasma DNA in patients with pancreatic cancer. J Surg Oncol. 2009; 99: Tomita H, Ichikawa D, Ikoma D, Sai S, Tani N, Ikoma H, Fujiwara H, Kikuchi S, Okamoto K, Ochiai T, Otsuji E. Quantification of circulating plasma dna fragments as tumor markers in patients with esophageal cancer. Anticancer Res. 2007; 27: da Silva Filho BF, Gurgel AP, Neto MA, de Azevedo DA, de Freitas AC, Silva Neto Jda C, Silva LA. Circulating cellfree DNA in serum as a biomarker of colorectal cancer. J Clin Pathol. 2013; 66: jclinpath Fischer JR, Ohnmacht U, Rieger N, Zemaitis M, Stoffregen C, Manegold C, Lahm H. Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation on survival of nonsmall cell lung cancer patients treated with gemcitabine. Lung Cancer. 2007; 56: lungcan Sunami E, Shinozaki M, Higano CS, Wollman R, Dorff TB, Tucker SJ, Martinez SR, Mizuno R, Singer FR, Hoon DS. Multimarker circulating DNA assay for assessing blood of prostate cancer patients. Clin Chem. 2009; 55: clinchem Mussolin L, Burnelli R, Pillon M, Carraro E, Farruggia P, Todesco A, Mascarin M, Rosolen A. Plasma cell-free DNA in paediatric lymphomas. J Cancer. 2013; 4: doi.org/ /jca Schmidt K, Diehl F. A blood-based dna test for colorectal cancer screening. Discov Med. 2007; 7: Flamini E, Mercatali L, Nanni O, Calistri D, Nunziatini R, Zoli W, Rosetti P, Gardini N, Lattuneddu A, Verdecchia GM, Amadori D. Free DNA and carcinoembryonic antigen serum levels: an important combination for diagnosis of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2006; 12: Kin C, Kidess E, Poultsides GA, Visser BC, Jeffrey SS. Colorectal cancer diagnostics: Biomarkers, cell-free DNA, circulating tumor cells and defining heterogeneous populations by single-cell analysis. Expert Rev Mol Diagn. 2013; 13: Wallner M, Herbst A, Behrens A, Crispin A, Stieber P, Goke B, Lamerz R, Kolligs FT. Methylation of serum DNA is an independent prognostic marker in colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2006; 12: org/ / ccr Herbst A, Wallner M, Rahmig K, Stieber P, Crispin A, Lamerz R, Kolligs FT. Methylation of helicase-like transcription factor in serum of patients with colorectal cancer is an independent predictor of disease recurrence. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009; 21: org/ /meg.0b013e328318ecf Misale S, Yaeger R, Hobor S, Scala E, Janakiraman M, Liska D, Valtorta E, Schiavo R, Buscarino M, Siravegna G, Bencardino K, Cercek A, Chen CT, et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-egfr therapy in colorectal cancer. Nature. 2012; 486: Bejerano G, Pheasant M, Makunin I, Stephen S, Kent WJ, Mattick JS, Haussler D. Ultraconserved elements in the human genome. Science. 2004; 304: org/ /science Lowe CB, Bejerano G, Haussler D. Thousands of human mobile element fragments undergo strong purifying selection near developmental genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104: pnas Katzman S, Kern AD, Bejerano G, Fewell G, Fulton L, Wilson RK, Salama SR, Haussler D. Human genome ultraconserved elements are ultraselected. Science. 2007; 317: Calin GA, Liu CG, Ferracin M, Hyslop T, Spizzo R, Sevignani C, Fabbri M, Cimmino A, Lee EJ, Wojcik SE, Shimizu M, Tili E, Rossi S, et al. Ultraconserved regions encoding ncrnas are altered in human leukemias and carcinomas. Cancer Cell. 2007; 12: org/ /j.ccr Oncotarget

293 29. Braconi C, Valeri N, Kogure T, Gasparini P, Huang N, Nuovo GJ, Terracciano L, Croce CM, Patel T. Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108: org/ /pnas Galasso M, Dama P, Previati M, Sandhu S, Palatini J, Coppola V, Warner S, Sana ME, Zanella R, Abujarour R, Desponts C, Teitell MA, Garzon R, et al. A large scale expression study associates uc.283-plus lncrna with pluripotent stem cells and human glioma. Genome Med. 2014; 6: Sana J, Hankeova S, Svoboda M, Kiss I, Vyzula R, Slaby O. Expression levels of transcribed ultraconserved regions uc.73 and uc.388 are altered in colorectal cancer. Oncology. 2012; 82: Hudson RS, Yi M, Volfovsky N, Prueitt RL, Esposito D, Volinia S, Liu CG, Schetter AJ, Van Roosbroeck K, Stephens RM, Calin GA, Croce CM, Ambs S. Transcription signatures encoded by ultraconserved genomic regions in human prostate cancer. Mol Cancer. 2013; 12:13. doi.org/ / Scaruffi P. The transcribed-ultraconserved regions: a novel class of long noncoding rnas involved in cancer susceptibility. Sci World J. 2011; 11: org/ /tsw Jiang J, Azevedo-Pouly AC, Redis RS, Lee EJ, Gusev Y, Allard D, Sutaria DS, Badawi M, Elgamal OA, Lerner MR, Brackett DJ, Calin GA, Schmittgen TD. Globally increased ultraconserved noncoding RNA expression in pancreatic adenocarcinoma. Oncotarget. 2016; 7: doi.org/ /oncotarget Fassan M, Dall'Olmo L, Galasso M, Braconi C, Pizzi M, Realdon S, Volinia S, Valeri N, Gasparini P, Baffa R, Souza RF, Vicentini C, D'Angelo E, et al. Transcribed ultraconserved noncoding RNAs (T-UCR) are involved in barrett's esophagus carcinogenesis. Oncotarget. 2014; 5: Scaruffi P, Stigliani S, Moretti S, Coco S, De Vecchi C, Valdora F, Garaventa A, Bonassi S, Tonini GP. Transcribedultra conserved region expression is associated with outcome in high-risk neuroblastoma. BMC Cancer. 2009; 9: Lin M, Eng C, Hawk ET, Huang M, Greisinger AJ, Gu J, Ellis LM, Wu X, Lin J. Genetic variants within ultraconserved elements and susceptibility to right- and leftsided colorectal adenocarcinoma. Carcinogenesis. 2012; 33: Lin M, Eng C, Hawk ET, Huang M, Lin J, Gu J, Ellis LM, Wu X. Identification of polymorphisms in ultraconserved elements associated with clinical outcomes in locally advanced colorectal adenocarcinoma. Cancer. 2012; 118: Yang R, Frank B, Hemminki K, Bartram CR, Wappenschmidt B, Sutter C, Kiechle M, Bugert P, Schmutzler RK, Arnold N, Weber BH, Niederacher D, Meindl A, et al. SNPs in ultraconserved elements and familial breast cancer risk. Carcinogenesis. 2008; 29: Lujambio A, Portela A, Liz J, Melo SA, Rossi S, Spizzo R, Croce CM, Calin GA, Esteller M. CpG island hypermethylation-associated silencing of non-coding RNAs transcribed from ultraconserved regions in human cancer. Oncogene. 2010; 29: onc Stroun M, Lyautey J, Lederrey C, Olson-Sand A, Anker P. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta. 2001; 313: Herrera LJ, Raja S, Gooding WE, El-Hefnawy T, Kelly L, Luketich JD, Godfrey TE. Quantitative analysis of circulating plasma DNA as a tumor marker in thoracic malignancies. Clin Chem. 2005; 51: org/ /clinchem Philipp AB, Nagel D, Stieber P, Lamerz R, Thalhammer I, Herbst A, Kolligs FT. Circulating cell-free methylated dna and lactate dehydrogenase release in colorectal cancer. BMC Cancer. 2014; 14: org/ / Hibi K, Goto T, Shirahata A, Saito M, Kigawa G, Nemoto H, Sanada Y. Methylation of tfpi2 no longer detected in the serum DNA of colorectal cancer patients after curative surgery. Anticancer Res. 2012; 32: Pavicic W, Perkio E, Kaur S, Peltomaki P. Altered methylation at microrna-associated CPG islands in hereditary and sporadic carcinomas: a methylationspecific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA)-based approach. Mol Med. 2011; 17: Toth K, Sipos F, Kalmar A, Patai AV, Wichmann B, Stoehr R, Golcher H, Schellerer V, Tulassay Z, Molnar B. Detection of methylated SEPT9 in plasma is a reliable screening method for both left- and right-sided colon cancers. PLoS One. 2012; 7:e pone Church TR, Wandell M, Lofton-Day C, Mongin SJ, Burger M, Payne SR, Castanos-Velez E, Blumenstein BA, Rosch T, Osborn N, Snover D, Day RW, Ransohoff DF. Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer. Gut. 2014; 63: Payne SR. From discovery to the clinic: the novel dna methylation biomarker (m)sept9 for the detection of colorectal cancer in blood. Epigenomics. 2010; 2: Warren JD, Xiong W, Bunker AM, Vaughn CP, Furtado LV, Roberts WL, Fang JC, Samowitz WS, Heichman KA. Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer. BMC Med. 2011; 9: doi.org/ / Oncotarget

294 50. Cassinotti E, Melson J, Liggett T, Melnikov A, Yi Q, Replogle C, Mobarhan S, Boni L, Segato S, Levenson V. DNA methylation patterns in blood of patients with colorectal cancer and adenomatous colorectal polyps. Int J Cancer. 2012; 131: ijc Zhang X, Song YF, Lu HN, Wang DP, Zhang XS, Huang SL, Sun BL, Huang ZG. Combined detection of plasma GATA5 and SFRP2 methylation is a valid noninvasive biomarker for colorectal cancer and adenomas. World J Gastroenterol. 2015; 21: wjg.v21.i Lee BB, Lee EJ, Jung EH, Chun HK, Chang DK, Song SY, Park J, Kim DH. Aberrant methylation of APC, MGMT, RASSF2A, and Wif-1 genes in plasma as a biomarker for early detection of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2009; 15: CCR Wang C, Wang Z, Zhou J, Liu S, Wu C, Huang C, Ding Y. TUC.338 promotes invasion and metastasis in colorectal cancer. Int J Cancer. 2017; 140: org/ /ijc Antonacopoulou AG, Grivas PD, Skarlas L, Kalofonos M, Scopa CD, Kalofonos HP. POLR2F, ATP6V0A1 and PRNP expression in colorectal cancer: New molecules with prognostic significance? Anticancer Res. 2008; 28: Kottorou AE, Antonacopoulou AG, Dimitrakopoulos FI, Tsamandas AC, Scopa CD, Petsas T, Kalofonos HP. Altered expression of NFY-C and RORA in colorectal adenocarcinomas. Acta Histochem. 2012; 114: Rihani A, Van Maerken T, Pattyn F, Van Peer G, Beckers A, De Brouwer S, Kumps C, Mets E, Van der Meulen J, Rondou P, Leonelli C, Mestdagh P, Speleman F, et al. Effective alu repeat based RT-Qpcr normalization in cancer cell perturbation experiments. PLoS One. 2013; 8:e Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett. 2003; 339: Li LC, Dahiya R. Methprimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002; 18: Lomonaco V, Martoglia R, Mandreoli F, Anderlucci L, Emmett W, Bicciato S, Taccioli C. Ucbase 2.0: ultraconserved sequences database (2014 update). Database (Oxford). 2014; 2014:bau Aranyi T, Tusnady GE. Bisearch: epcr tool for native or bisulfite-treated genomic template. Methods Mol Biol. 2007; 402: org/ / _ devos T, Tetzner R, Model F, Weiss G, Schuster M, Distler J, Steiger KV, Grutzmann R, Pilarsky C, Habermann JK, Fleshner PR, Oubre BM, Day R, et al. Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer. Clin Chem. 2009; 55: doi.org/ /clinchem Oncotarget

295 Oncotarget, Supplementary Materials Deregulation of methylation of transcribed-ultra conserved regions in colorectal cancer and their value for detection of adenomas and adenocarcinomas SUPPLEMENTARY MATERIALS Supplementary Figure 1: Fold change expression of Uc160 (A) and Uc346 (B) upon transfection in Caco-2, HT-29 and DLD-1 colon cancer cells.