ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ. «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων»

Transcript

1 Τμήματα Χημείας και Ιατρικής ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» Δείκτες επιθήλιο-μεσεγχυματικής μετατροπής (ΕΜΤ) και καρκινικών βλαστικών κυττάρων στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο Σοφία Καρτέρη Ιατρός - Παθολόγος Επιβλέπουσα : Μπράβου Βασιλική, Επίκουρη Καθηγήτρια Πάτρα,

2 Departments of Chemistry and Medicine MASTER S THESIS POSTGRADUATE PROGRAM Medicinal Chemistry: Drug discovery and design Epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in human colorectal cancer Sofia Karteri Physician Ιnternal Medicine Supervisor : Bravou Vasiliki, Assistant Professor Patras,

3 Επιβλέπουσα : Μπράβου Βασιλική Επίκουρη Καθηγήτρια Τριμελής εξεταστική επιτροπή Μπράβου Βασιλική Επίκουρη Καθηγήτρια Πέτρου-Παπαδάκη Ελένη Βελισσάρης Δημήτρης Καθηγήτρια Επίκουρος Καθηγητής Supervisor: Bravou Vasiliki Assistant Professor Examiner Committee: Bravou Vasiliki Petrou - Papadaki Eleni Velissaris Dimitris Assistant Professor Professor Assistant Professor 3

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί ένα από τα συχνότερα αίτια νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως. Είναι ο 2 ος πιο συχνός καρκίνος στις γυναίκες και ο 3 ος πιο συχνός στους άντρες. H διήθηση μετάσταση και η αντίσταση στην χημειοθεραπεία αποτελούν σημαντικά αίτια νοσηρότητας και θνητότητας στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Η επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) είναι ένα φαινόμενο που χαρακτηρίζεται από μοριακές και φαινοτυπικές αλλαγές που συμβαίνουν στα επιθηλιακά κύτταρα με αποτέλεσμα να χάνουν την πολικότητα και την ισχυρή συνοχή που φυσιολογικά υπάρχει μεταξύ τους και να αποκτούν μεταναστευτικές και διηθητικές ιδιότητες μεσεγχυματικών κυττάρων. Η διεργασία αυτή περιγράφηκε αρχικά στα πλαίσια της εμβρυογένεσης, μελέτες όμως έχουν δείξει πως παίζει σημαντικό ρόλο και σε διαδικασίες καρκινογένεσης όπως η διήθηση - μετάσταση αλλά και σε μηχανισμούς αντίστασης στην χημειοθεραπεία. Επιπλέον η ΕΜΤ θεωρείται πως συμμετέχει στην δημιουργία κυττάρων με ιδιότητες αρχέγονων καρκινικών κυττάρων (Cancer Stem Cells, CSCs). Τα καρκινικά αρχέγονα κύτταρα χαρακτηρίζονται από ιδιότητες παρόμοιες με αυτές των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, ιδίως από ικανότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης σε ποικίλους κυτταρικούς τύπους. Πολλά μάλιστα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα αρχέγονα καρκινικά κύτταρα αποτελούν σημαντικότατο παράγοντα που προάγει την υποτροπή και την αντίσταση στην χημειοθεραπεία. Με βάση τα παραπάνω η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία επικεντρώθηκε στην μελέτη της έκφρασης του δείκτη - ρυθμιστή της ΕΜΤ Snail καθώς και των δεικτών αρχέγονων καρκινικών κυττάρων Lgr5, CD133 και CD44 σε ιστικά δείγματα καρκινώματος παχέος εντέρου 114 ασθενών σταδίου Ι-ΙV με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Εκτιμήθηκε η σχέση της έκφρασης αυτών των δεικτών με παράγοντες προαγωγής των όγκων, ενώ 4

5 μελετήθηκε και ο πιθανός ρόλος τους στην αντίσταση σε χημειοθεραπεία βασισμένη σε 5-φθοριοουρακίλη. Συμπερασματικά αναδείξαμε πως η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Snail αλλά και των δεικτών Lgr5, CD133 και CD44 στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζονται σημαντικά με το βάθος διήθησης, την λεμφαδενική διασπορά και το στάδιο της νόσου. Η έκφραση του δείκτη CD133 επιπλέον φάνηκε να σχετίζεται με τον βαθμό διαφοροποίησης του όγκου (Grade). Παράλληλα επιβεβαιώσαμε την θετική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του παράγοντα Snail και την έκφραση όλων των δεικτών αρχέγονων καρκινικών κυττάρων. Ακόμα δείξαμε ότι στην μεταστατική νόσο η έκφραση του δείκτη CD44 σχετίζεται με κακή ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία, ενώ αντίθετα δεν βρέθηκε κάποια συσχέτιση της αναταπόκρισης των ασθενών στην χημειοθεραπεία με την έκφραση των παραγόντων Snail, Lgr5 και CD133. Τα ευρήματα μας σε συμφωνία με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα υποστηρίζουν τον ρόλο της ΕΜΤ και των CSCs στην διήθηση - μετάσταση και αντίσταση στην χημειοθεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, χρειάζονται περισσότερες μελέτες για την περεταίρω αξιολόγησή τους. Δεδομένου ότι η διήθηση - μετάσταση και η αντίσταση στην χημειοθεραπεία αποτελούν μεγάλα εμπόδια στην επιτυχή θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, η αποσαφήνιση των εμπλεκόμενων μηχανισμών αναμένεται να έχει μεγάλο κλινικό όφελος. Λέξεις κλειδιά : καρκίνος παχέος εντέρου, επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή, αρχέγονα καρκινικά κύτταρα, Snail, Lgr5, CD133, CD44. 5

6 ABSTRACT Colorectal cancer is one of the most common causes of morbidity and mortality worldwide. It ranks as the second most common cancer in women and as the third in men. Both infiltration - metastasis and resistance to chemotherapy are important causes of colorectal cancer-related morbidity and mortality. Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) is characterized by molecular and phenotypic changes that occur in epithelial cells, resulting in gradual loss of polarity and cell-cell adhesion and in acquisition of migratory and invasive properties of mesenchymal cells. This process was originally described in embryogenesis, but studies have also shown its important role in carcinogenesis. EMT is thought to promote invasion and metastasis of carcinoma cells while it also contributes to the formation of cancer cells with properties of stem cells (Cancer Stem Cells, CSCs). Cancer stem cells possess characteristics similar to those of normal stem cells, particularly the capacity of self-renewal and differentiation into various cell types. Current data suggest that cancer stem cells have a leading role in disease relapse and development of resistance to chemotherapy. Based on current knowledge, the present work is focused on the study of the expression of the EMT-regulator Snail and the CSCs markers Lgr5, CD133 and CD44 in 114 human colon carcinoma tissue samples by immunohistochemistry. We evaluated the relation between the expression of these markers and tumor progression parameters such as grade, lymph node metastasis and stage. Moreover we have examined their possible role in resistance to chemotherapy based on 5-fluorouracil. We showed that the expression of the EMT regulator Snail and the CSCs markers Lgr5, CD133 and CD44 significantly correlated with the depth of invasion, nodal spread and stage of disease. The expression of CSC marker CD133 appeared to be also associated with tumor grade. Interestingly the expression of transcription factor Snail and the CSC 6

7 marker CD44 was found to be an independent predictor of lymph node metastasis and disease stage. Furthermore we showed that the expression of the transcription factor Snail correlated significantly with the expression of all CSC markers. In addition we have shown that the expression of CSC marker CD44 in metastatic disease is associated with poor response to chemotherapy, while no association was found with the expression of Snail, Lgr5 and CD133. Our data complement the current knowledge about the role of EMT and CSCs in invasionmetastasis and chemoresistance in human colon cancer. Nevertheless more studies are needed for further evaluation. Since invasion- metastasis and resistance to chemotherapy are major obstacles to the successful treatment of patients with colon cancer, elucidating the underlying mechanisms is expected to have great clinical benefit for the patients. Keywords : Colorectal cancer (CRC), Epithelial-mesenchymal transition (EMT), Cancer stem cells (CSCS), Snail, Lgr5, CD133, CD44. 7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1: Μακροσκοπική-μικροσκοπική και μοριακή ανατομική παχέος εντέρου 11 Κεφάλαιο 2: Καρκίνος παχέος εντέρου 2.1 Επιδημιολογία Αιτιολογία 18 Περιβαλλοντικοί παράγοντες 18 Γενετική προδιάθεση 19 Προκαρκινικές καταστάσεις Παθογένεια 26 Μηχανισμοί γενετικής αστάθειας 26 Oδοί καρκινογένεσης Παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Πρόγνωση-Σταδιοποίηση Θεραπεία 47 Κεφάλαιο 3: Μηχανισμοί αντίστασης στην χημειοθεραπεία 49 Κεφάλαιο 4: Επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) Ορισμός EMT και ΜΕΤ Μοριακά μονοπάτια EMT ΕΜΤ και καρκίνος 62 8

9 Κεφάλαιο 5: Καρκινικά αρχέγονα κύτταρα Ορισμός CSCs Ρόλος στην καρκινογένεση Δείκτες αρχέγονων κυττάρων Ρόλος των CSCs στην υποτροπή νόσου και αντίσταση στην χημειοθεραπεία 69 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 6: Σκοπός μελέτης 72 Κεφάλαιο 7: Υλικά και μέθοδοι Ιστικά δείγματα Ανοσοϊστοχημεία Εκτίμηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης Στατιστική ανάλυση 82 Κεφάλαιο 8: Αποτελέσματα 84 Κεφάλαιο 9: Συζήτηση 119 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 137 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 151 9

10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10

11 Κεφάλαιο 1: Μακροσκοπική-Μικροσκοπική και Μοριακή ανατομική Παχέος Εντέρου Το γαστρεντερικό (ΓΕ) σύστημα αποτελείται από τον κοίλο γαστρεντερικό σωλήνα και τις πρόσθετες συναφείς δομές (οδόντες, σιελογόνοι αδένες, γλώσσα, χοληδόχος κύστη, πάγκρεας). Το παχύ έντερο αποτελεί το τελικό μέρος του ΓΕ συστήματος. Αποτελείται από το τυφλό, ανιόν κόλον, εγκάρσιο κόλον, κατιόν κόλον, σιγμοειδές, ορθό, και τον πρωκτικό σωλήνα. Κύριες λειτουργίες του παχέος εντέρου είναι η επαναρρόφηση ύδατος και ανόργανων αλάτων καθώς και η αποβολή της άπεπτης τροφής και των άχρηστων προϊόντων. Ξεκινώντας από τον οισοφάγο, τα κοίλα όργανα διαθέτουν κοινή γενικότερη οργάνωση. Με ελάχιστες εξαιρέσεις, τα όργανα αυτά διαθέτουν τέσσερις συγκεντρικούς χιτώνες. Ξεκινώντας επιπολής και προχωρώντας εν τω βάθει, οι χιτώνες και τα γενικά χαρακτηριστικά αυτών είναι τα ακόλουθα: 1 Α) Βλεννογόνιος χιτώνας Η δομή των διαφόρων τμημάτων του ΓΕ σωλήνα ποικίλλει πολύ από περιοχή σε περιοχή, με τις περισσότερες διαφορές να εντοπίζονται στον βλεννογόνιο χιτώνα. Ο εντερικός βλεννογόνος έχει τρεις κύριες λειτουργίες: προστασία, απορρόφηση και εκκριτική λειτουργία. Προστασία : Το επιθήλιο του βλεννογόνου λειτουργεί ως φραγμός που διαχωρίζει τον αυλό του ΓΕ συστήματος από τον υπόλοιπο οργανισμό. 11

12 Απορρόφηση : μεταφορά θρεπτικών συστατικών, νερού και ηλεκτρολυτών από τον αυλό του εντέρου στο αιμοφόρο και λεμφικό σύστημα. Εκκριτική λειτουργία : εκκρίνονται ένζυμα πέψης, ορμόνες και αντισώματα στον εντερικό αυλό. Ο βλεννογόνιος χιτώνας του παχέος εντέρου είναι σχετικά λείος όταν συγκριθεί με αυτόν του λεπτού εντέρου, αφού δεν διαθέτει ούτε πτυχές αλλά ούτε και λάχνες. Αποτελείται από το επιθήλιο, το χόριο και την βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα. Επιθήλιο Το επιθήλιο του παχέος εντέρου περιέχει τους ίδιους τύπους κυττάρων με αυτούς που περιέχονται στο λεπτό έντερο (εκτός από τα κύτταρα Paneth), οι οποίοι είναι οι παρακάτω: Εντεροκύτταρα : κύρια λειτουργία τους είναι η επαναρρόφηση ύδατος και ηλεκτρολυτών. Στενές συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων αυτών δημιουργούν ένα φραγμό ανάμεσα στον εντερικό αυλό και τον ενδοκυττάριο χώρο των επιθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον δρουν ως εκκριτικά κύτταρα. Goblet κύτταρα (καλυκοειδή) : μονοκυτταρικοί βλεννοεκκριτικοί αδένες, διάσπαρτοι ανάμεσα στα υπόλοιπα κύτταρα του εντερικού επιθηλίου. Εντεροενδοκρινικά κύτταρα : υπεύθυνα για την παραγωγή διαφόρων παρακρινικών και ενδοκρινικών ορμονών. Μ κύτταρα : μεταφέρουν μικροοργανισμούς και άλλα μακρομόρια από τον εντερικό αυλό στις πλάκες του Peyer. 12

13 Τα απορρροφητικά κύτταρα υπερτερούν έναντι των κυττάρων Goblet (4:1) στο μεγαλύτερο μέρος του παχέος εντέρου, με την αναλογία αυτή όμως να μειώνεται πλησιάζοντας το 1:1 κοντά στο ορθό, όπου αυξάνεται ο αριθμός των goblet κυττάρων. Επιμήκεις, ευθείς αδένες εκτείνονται από την επιφάνεια του επιθηλίου και προς τα κάτω, διαπερνώντας όλο το πάχος του βλεννογόνιου χιτώνα (αδένες του Lieberkuhn). Όλα τα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου προκύπτουν από ένα μόνο πληθυσμό αρχέγονων εντερικών κυττάρων (Ιntestinal Stem Cells, ISCs), ο οποίος εντοπίζεται στον πυθμένα του εντερικού αδένα. Το κατώτερο τριτημόριο του αδένα αποτελεί την φωλεά των εντερικών αρχέγονων κυττάρων. Τα νεοδημιουργηθέντα κύτταρα υφίστανται 2-3 επιπλέον διαιρέσεις καθώς μεταναστεύουν προς την αυλική επιφάνεια, από την οποία αποπίπτουν 5 ημέρες αργότερα. Οι χρόνοι ανανέωσης των επιθηλιακών κυττάρων του παχέος εντέρου είναι παρόμοιοι με εκείνους του λεπτού εντέρου, δηλαδή περίπου 6 ημέρες για τα απορροφητικά και τα καλυκοειδή και έως 4 εβδομάδες για τα εντεροενδοκρινή κύτταρα. Χόριο Το χόριο του παχέος εντέρου εμφανίζει κάποια επιπρόσθετα δομικά χαρακτηριστικά σε σχέση με τον υπόλοιπο πεπτικό σωλήνα : Στιβάδα κολλαγόνου : έχει πάχος έως 5μm στο φυσιολογικό ανθρώπινο κόλον αλλά μπορεί να έχει τριπλάσιο πάχος στους υπερπλαστικούς πολύποδες του παχέος εντέρου. Συμμετέχει στην ρύθμιση της μεταφοράς ύδατος και ηλεκτρολυτών από το μεσοκυττάριο διαμέρισμα του επιθηλίου στο αγγειακό διαμέρισμα. 13

14 Περικρυπτικό έλυτρο ινοβλαστών : αποτελείται από ένα πληθυσμό ινοβλαστών που πολλαπλασιάζονται, διαφοροποιούνται και μεταναστεύουν προς τα πάνω παράλληλα και σύγχρονα με τα επιθηλιακά κύτταρα. Παρ ότι η κατάληξη των κυττάρων αυτών δεν είναι γνωστή, φαίνεται πως τα περισσότερα αφού φτάσουν στο επίπεδο της επιφάνειας του αυλού αποκτούν μορφολογικά και ιστοχημικά χαρακτηριστικά φαγοκυττάρων. GALT : στο παχύ έντερο υπάρχει εκτεταμένη ανάπτυξη του ανοσοποιητικού, με μεγάλα λεμφοζίδια να μεταβάλουν την φυσιολογική διάταξη των εντερικών αδένων και να εκτείνονται έως τον υποβλενογόνιο χιτώνα. Η τόσο μεγάλη ανάπτυξη του ανοσοποιητικού στο κόλον, αντανακλά τον μεγάλο αριθμό και την ποικιλία μικροοργανισμών και βλαπτικών τελικών προϊόντων του μεταβολισμού που υπάρχουν φυσιολογικά στον αυλό του παχέος εντέρου. Λεμφαγγεία : παρατηρείται απουσία λεμφαγγείων στο χόριο ανάμεσα στους εντερικούς αδένες. Η απουσία αυτή είναι σημαντική στην κατανόηση του αργού ρυθμού μετάστασης ορισμένων τύπων καρκίνου του παχέος εντέρου. Καρκινώματα που αναπτύσσονται μέσα σε μεγάλους αδενωματώδεις πολύποδες μπορεί να μεγαλώσουν αρκετά μέσα στο επιθήλιο και στο χόριο προτού αποκτήσουν πρόσβαση σε λεμφαγγεία στο επίπεδο της βλεννογόνιας μυϊκής στιβάδας. Βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα Αποτελεί το όριο μεταξύ βλεννογόνου και υποβλεννογόνιου χιτώνα. Αποτελείται από λεία μυϊκά κύτταρα τοποθετημένα σε μία εσωτερική κυκλοτερή και μία εξωτερική επιμήκη μυϊκή στιβάδα. 14

15 Η συστολή αυτής της στιβάδας προκαλεί κίνηση του βλεννογόνου και διευκολύνει την απορροφητική και εκκριτική διαδικασία. Αυτή η τοπική κινητικότητα του βλεννογόνου είναι ανεξάρτητη από τις περισταλτικές κινήσεις ολόκληρου του τοιχώματος του ΓΕ συστήματος. Β) Υποβλεννογόνιος χιτώνας Αποτελείται από πυκνό, ακανόνιστο συνδετικό ιστό που περιέχει αιμοφόρα αγγεία, λεμφαγγεία, νευρικό πλέγμα και κατά τόπους αδένες. Βρίσκεται στο βάθος αμέσως κάτω από το χόριο και την βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα. Ξεκινά από το επίπεδο του οισοφάγου και ανευρίσκεται σε όλα τα κοίλα όργανα του ΓΕ συστήματος με εξαίρεση τη χοληδόχο κύστη. Γ) Μυϊκός χιτώνας Αποτελείται συνήθως από δυο στιβάδες λείου μυός : έσω κυκλοτερή και έξω επιμήκη μυϊκή στιβάδα. Μεταξύ έσω και έξω στιβάδας εντοπίζεται το μυεντερικό πλέγμα ή πλέγμα του Aüerbach : περιλαμβάνει νευρικά κύτταρα παρασυμπαθητικού και εντερικού νευρικού συστήματος καθώς και αιμοφόρα αγγεία και λεμφαγγεία. Μπορεί επίσης να περιλαμβάνει σπλαχνικό γραμμωτό μυ, όπως αυτός στον οισοφάγο, ή μια τρίτη στιβάδα λείου μυός, όπως αυτή στον στόμαχο. 15

16 Η αργή, ρυθμική συστολή αυτών των μυϊκών στιβάδων υπό τον έλεγχο του εντερικού νευρικού συστήματος έχει ως αποτέλεσμα την περίσταλση του παχέος εντέρου και άρα την προώθηση του εντερικού περιεχομένου κατά μήκος του ΓΕ σωλήνα. Στο παχύ έντερο τμήμα της εξωτερικής επιμήκους μυϊκής στιβάδας εμφανίζει πάχυνση με αποτέλεσμα τον σχηματισμό τριών ανεξάρτητων ταινιών, των κολικών ταινιών, οι οποίες διαπερνούν την έσω κυκλοτερή μυϊκή στιβάδα σε ακανόνιστα διαστήματα κατά μήκος και κατά την περίμετρο του παχέος εντέρου. Αυτή η ασυνέχεια του μυϊκού χιτώνα επιτρέπει στα τμήματα του παχέος εντέρου να συστέλλονται ανεξάρτητα, οδηγώντας στο σχηματισμό των κολικών κυψελών. Δ) Ορογόνος χιτώνας Αποτελείται από μεσοθήλιο και συνδετικό ιστό ή μόνο συνδετικό ιστό (όπως στον οισοφάγο). Σχηματίζει το σπλαγχνικό περιτόναιο το οποίο καλύπτει πλήρως την σκωληκοειδή απόφυση, το τυφλό, το εγκάρσιο και το σιγμοειδές κόλον, ενώ αφήνει ακάλυπτο το οπίσθιο τμήμα του ανιόντος καθώς και το κατιόν κόλον. 16

17 Κεφάλαιο 2: Καρκίνος παχέος εντέρου 2.1 Επιδημιολογία Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί ένα από τα συχνότερα αίτια νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως. Υπολογίζεται ότι περίπου νέες περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου θα διαγνωσθούν στις ΗΠΑ κατά το έτος 2017, ενώ οι αναμενόμενοι θάνατοι κατά το ίδιο έτος θα ανέρθουν σε περίπου Είναι ο 2 ος πιο συχνός καρκίνος στις γυναίκες (μετά από το νεόπλασμα του μαστού) και ο 3 ος πιο συχνός στους άντρες (μετά από το νεόπλασμα του προστάτη και του πνεύμονα). Περίπου 55% των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται σε αναπτυγμένες χώρες. Υπάρχει μεγάλη γεωγραφική διακύμανση όσον αφορά στην επίπτωση της νόσου ( παρόμοια κατανομή όμως και στα 2 φύλα), με την υψηλότερη επίπτωση να παρατηρείται στην Αυστραλία/Νέα Ζηλανδία και την χαμηλότερη στην Δυτική Αφρική. 3 Η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου κατά τα έτη 2004 έως 2013 παρουσίασε μείωση κατά περίπου 3% ανά έτος (με παρόμοια αποτελέσματα και στα 2 φύλα). 2 Ενώ αυτή η μείωση πριν το 2000 αποδίδεται εξίσου σε τροποποίηση των παραγόντων κινδύνου και στην εισαγωγή του screening, η πιο πρόσφατη και ταχύτερη μείωση φαίνεται να αντικατοπτρίζει κυρίως την αυξημένη διενέργεια κολονοσκόπησης σε συνδυασμό με την αφαίρεση προκαρκινικών πολυπόδων. Η χρήση της κολονοσκόπησης ως μεθόδου screening από ενήλικες άνω των 50 ετών έχει τριπλασιαστεί τα τελευταία χρόνια, από 21% το 2000 σε 60% το Σε αντίθεση όμως με την ταχεία μείωση στη συχνότητα εμφάνισης νεοεξεργασιών του παχέος εντέρου σε ενήλικες άνω των 50 ετών που υποβάλλονται σε screening, σε άτομα κάτω των 50 ετών δεν παρατηρήθηκαν το ίδιο ευνοϊκά αποτελέσματα αλλά αντίθετα αύξηση κατά περίπου 2% ανά έτος, από το 1993 έως το Tα ποσοστά θνησιμότητας 17

18 από καρκίνο παχέος εντέρου συνολικά παρουσίασαν μείωση κατά 51%, από το 1976 έως το Αιτιολογία Δεν υπάρχει σαφής γνωστή αιτιολογία, αλλά όπως τα περισσότερα νεοπλάσματα έτσι και ο καρκίνος του παχέος εντέρου θεωρείται πολυπαραγοντικό νόσημα. Ορισμένοι από τους πλέον πιθανούς παράγοντες είναι οι ακόλουθοι: 4 Περιβαλλοντικοί παράγοντες Στις περισσότερες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου φαίνεται ότι υπάρχει συμμετοχή περιβαλλοντικών παραγόντων. Η νόσος εκδηλώνεται πιο συχνά στις ανώτερες κοινωνικοοικονομικές τάξεις που ζουν σε αστικές περιοχές. Οι γεωγραφικές διακυμάνσεις της συχνότητας φαίνεται να μην έχουν σχέση με γενετικές διαφορές, π.χ. οι μετανάστες έχει βρεθεί πως αποκτούν την συχνότητα του καρκίνου παχέος εντέρου της νέας τους πατρίδας. Διατροφή : έχουν προταθεί τουλάχιστον 2 υποθέσεις για να εξηγήσουν την σχέση του καρκίνου του παχέος εντέρου με την διατροφή, καμία από τις οποίες όμως δεν είναι πλήρως ικανοποιητική. 1. Η πρόσληψη ζωϊκών λιπών (κόκκινο και επεξεργασμένο κρέας) οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού των αναερόβιων μικροοργανισμών στην μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου με αποτέλεσμα την μετατροπή των κανονικών χολικών οξέων σε καρκινογόνα. 2. Ο αυξημένος αριθμός θερμίδων (δίαιτες δυτικού τύπου) σε συνδυασμό με έλλειψη φυσικής δραστηριότητας συνδέονται με υψηλά ποσοστά παχυσαρκίας και 18

19 επομένως με ανάπτυξη ανοχής στην ινσουλίνη, αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης και υψηλότερες συγκεντρώσεις IGF-1 στην κυκλοφορία, ο οποίος φαίνεται να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό του εντερικού βλεννογόνου. Χαρακτηριστικά, η συχνότητα καρκίνου του παχέος εντέρου έχει αυξηθεί στην Ιαπωνία από τότε που το έθνος αυτό έχει υιοθετήσει δίαιτα «δυτικού τύπου». Σε αντίθεση με προηγούμενη υπόθεση, τα αποτελέσματα τυχαιοποιημένων μελετών δεν έδειξαν καμία αξία στις δίαιτες με φυτικές ίνες ή πολλά φρούτα και λαχανικά ως προς την πρόληψη υποτροπής ορθοκολικών αδενωμάτων ή καρκινωμάτων. Κάπνισμα : το κάπνισμα συνδέεται με την ανάπτυξη ορθοκολικών αδενωμάτων, ιδίως μετά από 35 χρόνια χρήσης καπνού. Δεν έχει προταθεί καμία βιολογική ερμηνεία για την σχέση αυτή προς το παρόν. Streptococcus bovis : για άγνωστο λόγο τα άτομα με ενδοκαρδίτιδα ή σηψαιμία από αυτά τα εντερικά βακτήρια παρουσιάζουν υψηλή επίπτωση λανθανόντων όγκων του κόλου και του ορθού. 4 Γενετική προδιάθεση Έως και 25% των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου έχει οικογενειακό ιστορικό της νόσου, χωρίς όμως να πληρούνται οι προϋποθέσεις για την διάγνωση κάποιου σαφώς καθορισμένου κληρονομούμενου συνδρόμου. Άτομα με ένα πρώτου βαθμού συγγενή με καρκίνο παχέος εντέρου έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου κατά 1.7 σε σύγκριση με τον γενικό πληθυσμό (μικρότερος κίνδυνος σε σχέση με τα κληρονομούμενα σύνδρομα). 19

20 Τα κληρονομούμενα νεοπλάσματα του παχέος εντέρου διαιρούνται σε 2 κύριες ομάδες: τα καλά μελετημένα αλλά σπάνια σύνδρομα πολυποδίασης και τα πιο συχνά μη πολυποειδή σύνδρομα. 4 Οικογενής πολυποδίαση παχέος εντέρου (Familial Adenomatous Polyposis, FAP) Σπάνια κατάσταση που χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση χιλιάδων αδενωματωδών πολυπόδων σε όλο το παχύ έντερο. Μεταδίδεται με τον αυτοσωμικό επικρατή τύπο κληρονομικότητας, ενώ ελάχιστοι ασθενείς δεν έχουν οικογενειακό ιστορικό και αναπτύσσουν τη νόσο λόγω κάποιας αυτόματης μετάλλαξης. Υποομάδα της οικογενούς πολυποδίασης είναι το σύνδρομο Gardner το οποίο χαρακτηρίζεται από την παρουσία όγκων των μαλακών μορίων και των οστών (συχνότερα κρανίου και κάτω γνάθου),συγγενή υπερτροφία του μελαγχρωματικού επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς, δεσμοειδείς όγκους μεσεντερίου και νεοπλάσματα της ληκύθου του Vater. H εμφάνιση κακοήθων όγκων του ΚΝΣ που συνοδεύουν την πολυποδίαση του κόλου χαρακτηρίζει το σύνδρομο Turcot. Εξασθενημένη αδενωματώδης πολυποδίαση παχέος εντέρου (attenuated adenomatous polyposis coli, AAPC) : υποομάδα που χαρακτηρίζεται από μικρότερο αριθμό πολυπόδων (30-35) σε σύγκριση με την κλασική FAP, οι οποίοι τείνουν να αναπτύσσονται σε μεγαλύτερη ηλικία και προσβάλουν συνήθως το εγγύς τμήμα του παχέος εντέρου. Η οικογενής πολυποδίαση του κόλου σχετίζεται με μία εξάλειψη στο μακρύ σκέλος του χρωμοσώματος 5 (συμπεριλαμβανομένου του γονιδίου APC) τόσο στα νεοπλασματικά (σωματική μετάλλαξη) όσο και στα φυσιολογικά (μετάλλαξη βλαστικής σειράς) κύτταρα. Το APC γονίδιο είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο το προϊόν του οποίου ρυθμίζει έμμεσα την μεταγραφή ενός αριθμού γονιδίων κρίσιμων για τον πολλαπλασιασμό των 20

21 κυττάρων, μέσω της αλληλεπίδρασης με τον μεταγραφικό παράγοντα β-κατενίνη. Απώλεια του APC εμποδίζει την αποικοδόμηση της β-κατενίνης με συνέπεια την συσσώρευσή της και τελικό αποτέλεσμα τον υπέρμετρο πολλαπλασιαμό των κυττάρων και την ανάπτυξη αδενωμάτων. Εάν η πολυποδίαση δεν αντιμετωπισθεί χειρουργικά σε νεαρή ηλικία θα αναπτυχθεί καρκίνος παχέος εντέρου σε όλους τους ασθενείς πριν από την ηλικία των 40 ετών. Τα παιδιά των ασθενών με FΑΡ έχουν πιθανότητες 50% να αναπτύξουν την εν λόγω προκαρκινική διαταραχή και πρέπει να ελέγχονται ετησίως με εύκαμπτο σιγμοειδοσκόπιο μέχρι την ηλικία των 35 ετών. Εναλλακτική μέθοδος για την αναγνώριση των φορέων είναι η εξέταση DNA από κύτταρα του περιφερικού αίματος για την ανεύρεση του μεταλλαγμένου γονιδίου APC. Η ανίχνευση τέτοιας μετάλλαξης της βλαστικής σειράς μπορεί να οδηγήσει σε οριστική διάγνωση πριν από την ανάπτυξη των πολυπόδων Κληρονομικός μη πολυποειδής καρκίνος παχέος εντέρου (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC) Αυτοσωμική επικρατής νόσος, γνωστή και ως σύνδρομο Lynch, που χαρακτηρίζεται από: την ύπαρξη 3 ή περισσότερων συγγενικών ατόμων με ιστολογικά τεκμηριωμένο καρκίνο παχέος εντέρου ο ένας εκ των οποίων είναι συγγενής 1 ου βαθμού με τους άλλους 2. τουλάχιστον 1 περίπτωση καρκίνου παχέος εντέρου που διαγνώστηκε πριν από την ηλικία των 50 ετών στην οικογένεια. προσβολή από τη νόσο για τουλάχιστον 2 γενιές. Σε αντίθεση με την FΑΡ, ο HNPCC σχετίζεται με ασυνήθιστα υψηλή συχνότητα εντόπισης στο εγγύς τμήμα του παχέος εντέρου. Η μέση ηλικία εμφάνισης είναι έτη νωρίτερα από τη μέση ηλικία για το γενικό πληθυσμό. Σε οικογένειες με HNPCC συχνά υπάρχουν 21

22 άτομα με πολλαπλούς πρωτοπαθείς καρκίνους (ιδιαίτερα στενή συσχέτιση σε γυναίκες με καρκινώματα ωοθήκης και ενδομητρίου). Ο HNPCC συνδέεται με μεταλλάξεις της βλαστικής σειράς αρκετών γονιδίων (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EpCAM ) ιδίως του MSH2 στο χρωμόσωμα 2 και του MLH1 στο χρωμόσωμα 3. Οι μεταλλάξεις αυτές προκαλούν σφάλματα στoν μηχανισμό επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων DNA (Mismatch Repair, MMR) και πιστεύεται ότι συντελούν σε μικροδορυφορική αστάθεια του DNA με αποτέλεσμα την πρόκληση ανώμαλου κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επομένως νεοπλασματικής ανάπτυξης. Ο έλεγχος των κυττάρων του όγκου για μικροδορυφορική αστάθεια σε ασθενείς κάτω των 50 ετών με καρκίνο παχέος εντέρου και θετικό οικογενειακό ιστορικό για νεόπλασμα παχέος εντέρου ή ενδομητρίου, μπορεί να αναγνωρίσει τον υπεύθυνο πρόγονο με HNPCC Σύνδρομο υπερπλαστικής πολυποδίασης (Hyperplastic Polyposis Syndrome, HPS) Το σύνδρομο υπερπλαστικής πολυποδίασης είναι μία σχετικά σπάνια κατάσταση που χαρακτηρίζεται από την παρουσία πολλαπλών υπερπλαστικών πολυπόδων με κατανομή σε όλο το παχύ έντερο, μερικοί από τους οποίους μπορεί να έχουν διάμετρο >1cm. Διαφέρουν από τους κλασσικούς υπερπλαστικούς πολύποδες, οι οποίοι αποτελούν συνήθως μικρές βλάβες στο περιφερικό κόλον και το ορθό. Διαγνωστικά κριτήρια HPS (WHO): 7 Πέντε ή περισσότεροι υπερπλαστικοί πολύποδες εγγύς στο σιγμοειδές με δύο πολύποδες μεγαλύτερους από 10 mm διάμετρο ή 22

23 Οποιοσδήποτε αριθμός υπερπλαστικών πολυπόδων εγγύς στο σιγμοειδές σε ένα άτομο με συγγενή 1 ου βαθμού ο οποίος έχει υπερπλαστικό σύνδρομο πολυποδίασης ή Περισσότεροι από 30 υπερπλαστικοί πολύποδες με οποιοδήποτε μέγεθος σε όλη την επιφάνεια του παχέος εντέρου και του ορθού. Είναι πολύ πιθανό ότι υπάρχουν διαφορετικοί υπότυποι του συνδρόμου υπερπλαστικής πολυποδίασης αλλά περεταίρω κλινικές και μοριακές μελέτες απαιτούνται για την αποσαφήνισή τους. Αν και αρχικά θεωρούνταν καλοήθεις, από τα τέλη της δεκαετίας του 1980 άρχισαν να ανακαλύπτονται περιστατικά καρκίνου του παχέος εντέρου σε έδαφος HPS. 8 Πλέον έχει αποδειχθεί ότι οι υπερπλαστικοί πολύποδες του παχέος εντέρου μπορεί να εμφανίσουν κακοήθη εξαλλαγή. Προκαρκινικές καταστάσεις Φλεγμονώδης νόσος εντέρου (ΦΝΕ) Η ΦΝΕ είναι μία ιδιοπαθής και χρόνια φλεγμονή του εντέρου. Η ελκώδης κολίτιδα και η νόσος Crohn είναι οι 2 κύριες μορφές ΦΝΕ. Η επίπτωση της ΦΝΕ ποικίλλει στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές, με τις βόρειες χώρες να παρουσιάζουν τα υψηλότερα ποσοστά. Η ηλικιακή αιχμή έναρξης της ΦΝΕ είναι μεταξύ 15 και 30 ετών, ενώ μία δεύτερη αιχμή εμφανίζεται μεταξύ 60 και 80 ετών. 4 Η ελκώδης κολίτιδα προσβάλλει κυρίως το βλεννογόνο του παχέος εντέρου (κόλον και ορθό) ενώ η νόσος Crohn είναι δυνατό να προσβάλλει οποιοδήποτε τμήμα του πεπτικού σωλήνα από το στόμα μέχρι τον πρωκτό και η φλεγμονή είναι διατοιχωματική. 23

24 Μολονότι η ΦΝΕ έχει περιγραφεί ως κλινική οντότητα εδώ και πάνω από 100 έτη, η αιτιολογία και η παθογένειά της δεν έχουν σαφώς προσδιοριστεί. Μία ομόφωνη υπόθεση είναι ότι σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα τόσο εξωγενείς παράγοντες (λοιμώδεις, φυσιολογική χλωρίδα του αυλού) όσο και ενδογενείς (λειτουργία εντερικού επιθηλιακού φραγμού, αιμάτωση, νευρωνική δραστηριότητα) προκαλούν χρόνια ανοσολογική δυσλειτουργία του βλεννογόνου, η οποία επιδεινώνεται περαιτέρω από περιβαλλοντικές επιδράσεις (κάπνισμα, διατροφή, stress). Ο κίνδυνος εμφάνισης νεοπλασίας σε ασθενείς με ΦΝΕ (περισσότερο στην ΕΚ απ ότι στη ΝC) σχετίζεται με την διάρκεια και την έκταση της νόσου. Ο κίνδυνος καρκίνου του παχέος εντέρου σε ασθενείς με ΦΝΕ είναι σχετικά μικρός κατά την διάρκεια των 10 πρώτων ετών της νόσου αλλά στη συνέχεια ανέρχεται με συχνότητα 0.5-1% ανά έτος, ενώ αυξάνεται σε 8-30% των ασθενών μετά από 25 έτη. Της εμφάνισης του καρκίνου προηγείται, σε αρκετές περιπτώσεις, η εμφάνιση επιθηλιακής δυσπλασίας του βλεννογόνου του παχέος εντέρου. Η επιτήρηση για ανάπτυξη καρκίνου σε ασθενείς με ΦΝΕ δεν είναι ικανοποιητική αφού συμπτώματα όπως η αιματηρή διάρροια, οι κοιλιακές κράμπες και η απόφραξη που μπορεί να σηματοδοτούν την παρουσία του όγκου είναι όμοια με τα ενοχλήματα που προκαλούνται από μια έξαρση της υποκείμενης νόσου. 4 Πολύποδες παχέος εντέρου-αδενώματα Ο πολύποδας είναι μια ευδιάκριτη προσεκβολή της επιφάνειας του βλεννογόνου και παθολογοανατομικώς διακρίνεται σε Αμαρτωματώδη πολύποδα (νεανικό) Υπερπλαστικό πολύποδα και Αδενωματώδη πολύποδα 24

25 Οι αδενωματώδεις πολύποδες είναι σαφώς προκαρκινικοί αλλά μόνο μικρό μέρος αυτών των βλαβών θα εξελιχθεί τελικά σε καρκίνο. Αδενωματώδεις πολύποδες του κόλου απαντώνται σε ποσοστό >30% των ατόμων μέσης ή μεγάλης ηλικίας, ωστόσο λιγότεροι από το 1% θα υποστούν κακοήθη εξαλλαγή. Οι περισσότεροι δεν προκαλούν συμπτώματα και παραμένουν κλινικώς αδιάγνωστοι. Υπάρχει σαφής οικογενής προδιάθεση στην ανάπτυξή τους. 4 Τα αδενώματα χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας, η οποία ιστολογικά χαρακτηρίζεται από κυτταροβρίθεια, μεγάλους υπερχρωματικούς πυρήνες, ποικίλου βαθμού στιβαδοποίηση των πυρήνων και απώλεια της πολικότητας του επιθηλίου. Βάσει των μακροσκοπικών τους χαρακτηριστικών τα αδενώματα διακρίνονται σε επίπεδα (flat), «εμβυθιζόμενα» (depressed) και υπερυψωμένα (elevated). Τα υπερυψωμένα αδενώματα μπορεί να φέρουν ή όχι μίσχο. Ο όρος αδένωμα δεν αφορά μόνο σε πολυποδοειδή μορφώματα, καθώς το καθοριστικό χαρακτηριστικό των αδενωμάτων είναι η ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (δυσπλασία). Βάσει των ιστολογικών χαρακτηριστικών τους τα αδενώματα διακρίνονται επιπλέον σε σωληνώδη (tubular), θηλώδη (villous) και σωληνοθηλώδη (tubulovillous). Σωληνώδη : συνήθως σφαιρικά και έμμισχα ή επίπεδα, μικροσκοπικά χαρακτηρίζονται από δυσπλαστικές σωληνώδεις αδενικές δομές που καταλαμβάνουν τουλάχιστον το 80% της αυλικής επιφάνειας. Θηλώδη : συνήθως μεγαλύτερα άμισχα, μικροσκοπικά χαρακτηρίζονται από την παρουσία φυλλοειδών προεκβολών του βλεννογόνου που καλύπτονται από δυσπλαστικό αδενικό επιθήλιο και καταλαμβάνουν περισσότερο από το 80% της αυλικής επιφάνειας. 25

26 Σωληνοθηλώδη : εμφανίζουν και σωληνώδη και θηλώδη αρχιτεκτονική (αναλογία από 80%/20% έως 20%/80%). 7 Η πιθανότητα να εξελιχθεί ένας αδενωματώδης πολύποδας σε καρκίνο εξαρτάται από τρία ανεξάρτητα χαρακτηριστικά : το μέγεθος του αδενώματος, τα ιστολογικά χαρακτηριστικά του (τα θηλώδη αδενώματα γίνονται κακοήθη τρεις φορές πιο συχνά από τα σωληνώδη) και τον βαθμό της επιθηλιακής δυσπλασίας. Η πιθανότητα κάποια πολυποειδής βλαβη του παχέος εντέρου να περιέχει διηθητικό καρκίνο είναι αμελητέα (<2%) για βλάβες <1.5cm, ενδιάμεση (2-10%) για βλάβες cm και σημαντική (>10%) για βλάβες >2.5cm. Μετά την ανακάλυψη ενός αδενωματώδους πολύποδα πρέπει να ελέγχεται όλο το παχύ έντερο αφού σύγχρονες βλάβες ανευρίσκονται στο 1/3 των περιπτώσεων. Οι ασθενείς έχουν πιθανότητα 30-50% να αναπτύξουν και άλλο αδένωμα. Οι αδενωματώδεις πολύποδες πιστεύεται ότι χρειάζονται >5 έτη ανάπτυξης προτού δημιουργήσουν κλινικά συμπτώματα. 2.3 Παθογένεια Μηχανισμοί γενετικής αστάθειας Η απώλεια της γονιδιωματικής σταθερότητας φαίνεται πως είναι ένα βασικό μοριακό βήμα κατά την διαδικασία της καρκινογένεσης. Τουλάχιστον τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία έχουν περιγραφεί, η χρωμοσωμική αστάθεια, η μικροδορυφορική αστάθεια και η υπερμεθυλίωση. Ορισμένα νεοπλάσματα μπορεί να παρουσιάζουν μικτά χαρακτηριστικά αυτών των μηχανισμών, χωρίς η φύση αυτής της αλληλοεπικάλυψης να είναι τελείως κατανοητή. 26

27 Ένα σημαντικό ερώτημα που παραμένει ακόμα υπό μελέτη είναι αν η γενετική αστάθεια αποτελεί εναρκτήριο γεγονός ή αν προκύπτει σε κάποιο σημείο στην πορεία της καρκινογένεσης προωθώντας την εξέλιξη του καρκινώματος. 9 Τα μέχρι τώρα υπάρχοντα δεδομένα υποστηρίζουν την συμμετοχή της γενετικής αστάθειας νωρίς στην διαδικασία της καρκινογένεσης. 10 Χρωμοσωμική αστάθεια (Chromosomal Instability, CIN) Η χρωμοσωμική αστάθεια χαρακτηρίζεται από δύο κύριους μηχανισμούς: Απώλεια ή προσθήκη ολόκληρων χρωμοσωμάτων με αποτέλεσμα αλλαγή στον αριθμό τους (ανευπλοειδία) και Ανώμαλες δομικές μεταβολές (εξαλείψεις, προσθήκες, μεταθέσεις κ.α.) που οδηγούν σε απώλεια ή προσθήκη χρωμοσωμικών περιοχών. Αυτές οι χρωμοσωμικές μεταβολές αποτελούν βασικό χαρακτηριστικό της πλειοψηφίας των νεοπλασμάτων που προκύπτουν από την κλασσική αλληλουχία αδενώματοςκαρκινώματος : CIN ανευρίσκεται σε περίπου 80%-85% των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου Με την διαδικασία της χρωμοσωμικής αστάθειας έχει συσχετισθεί ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που εμπλέκονται σε ποικίλες διαδικασίες, όπως η δομή και λειτουργία του κινητοχώρου, ο σχηματισμός και λειτουργία των μικροσωληνίσκων, η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων, η συνοχή των αδελφών χρωματίδων και ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου. Παρ όλα αυτά μόνο ένας περιορισμένος αριθμός γονιδίων υπεύθυνων για χρωμοσωμική αστάθεια έχει ταυτοποιηθεί σε όγκους στον άνθρωπο. Από όλα τα γονίδια για τα οποία έχουν βρεθεί μεταλλάξεις στον καρκίνο του παχέος εντέρου στενή συσχέτιση έχει βρεθεί μόνο με τα γονίδια APC και TP53. 27

28 Εναρκτήριο γεγονός στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, πιστεύεται πως είναι η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt, μέσω μετάλλαξης του γονιδίου APC (5q21). Η μετάλλαξη του γονιδίου APC ανευρίσκεται στο 85% των σποραδικών καρκινωμάτων καθώς και σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις οικογενούς αδενωματώδους πολυποδίασης (FAP),ενώ ανευρίσκεται ήδη από στάδιο των ανώμαλων εστιών στις κρύπτες του εντέρου (Aberrant Crypt Foci, ΑCF). Η φυσιολογική πρωτεΐνη APC παίζει ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως: ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική μετανάστευση, απόπτωση, κυτταρική προσκόλληση, οργάνωση των μικροσωληνίσκων και συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων. Η ογκοκατασταλτική δράση της φαίνεται να σχετίζεται ιδιαίτερα με την ικανότητά της να ρυθμίζει τα ενδοκυττάρια επίπεδα της β-κατενίνης. Η μετάλλαξη του γονιδίου APC οδηγεί επομένως σε αύξηση των ενδοκυττάριων επιπέδων της β-κατενίνης η οποία μετατοπίζεται στη συνέχεια στον πυρήνα όπου οδηγεί στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα TCF, με αποτέλεσμα την συνεχή έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ογκογένεση Μικροδορυφορική αστάθεια (Microsatellite Instability, MSI) Μικροδορυφορική αστάθεια ανευρίσκεται ποσοστό >95% στον κληρονομούμενο μη πολυποειδή καρκίνο του παχέος εντέρου (HNPCC) αλλά και σε περίπου 10-20% των σποραδικών περιπτώσεων ορθοκολικού καρκίνου. Προκαλείται λόγω αδρανοποίησης ενζύμων που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων του DNA (Μismatch Repair, MMR), ως αποτέλεσμα μεταλλάξεων της βλαστικής σειράς (HNPCC) ή σωματικών επιγενετικών αλλοιώσεων (σποραδικό CRC) σε ένα ή περισσότερα γονίδια του συστήματος MMR. 28

29 Το βιολογικό αποτύπωμα αυτών των μεταλλάξεων είναι η συσσώρευση ανωμαλιών σε μικρές αλληλουχίες νουκλεοτιδικών βάσεων που επαναλαμβάνονται δεκάδες έως εκατοντάδες φορές μέσα στο γονιδίωμα. Αυτές ονομάζονται μικροδορυφoρικές αλληλουχίες και οι όγκοι περιγράφονται ως μικροδορυφορικά ασταθείς. Το σύστημα DNA MMR περιλαμβάνει μία σειρά πρωτεϊνών οι οποίες επιδιορθώνουν τυχόν νουκλεοτιδικές αναντιστοιχίες που έχουν διαφύγει από την DNA πολυμεράση. Τουλάχιστον έξι γονίδια (MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS1, PMS2) τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο σύστημα αυτό έχουν ταυτοποιηθεί, τόσο στον σποραδικό όσο και στον κληρονομούμενο μη πολυποειδή ορθοκολικό καρκίνο (HNPCC). Στο HNPCC έχουν βρεθεί μεταλλάξεις στα γονίδια MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, αλλά όχι στο MSH3. Αντίθετα στα σποραδικά καρκινώματα ο βασικός μηχανισμός είναι η υπερμεθυλίωση του MLH1 γονιδίου. Από το National Cancer Institute (NCI) έχει προταθεί η χρήση μίας ομάδας πέντε μικροδορυφoρικών αλληλουχιών (BAT25, BAT26, D5S346, D2S123, D17S250) με βάση τις οποίες οι όγκοι ταξινομούνται ως μικροδορυφορικά σταθεροί ή ασταθείς, ως εξης: MSI-H (High) : μικροδορυφορική αστάθεια σε 2 ή παραπάνω από τους δείκτες. MSI-L (Low) : μικροδορυφορική αστάθεια σε 1 μόνο δείκτη. MSS (Stable) : χωρίς μικροδορυφορική αστάθεια Αν χρησιμοποιούνται πάνω από 5 δείκτες τα κριτήρια τροποποιούνται ώστε να αντικατοπτρίζουν το ποσοστό των δεικτών που εμφανίζουν MSI (τότε φαινότυπος MSI-H : όταν υπάρχει μικροδορυφορική αστάθεια σε περισσότερο από 30-40% των δεικτών που ελέγχθηκαν). Διάφορα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά διαχωρίζουν τα νεοπλάσματα με φαινότυπο MSI-Η από αυτά με φαινότυπο CIN. Συγκεκριμένα οι όγκοι με φαινότυπο MSI-H: 29

30 τείνουν να εντοπίζονται στο δεξιό κόλον είναι συνήθως διπλοειδείς έχουν υψηλό ποσοστό μεταλλάξεων (Ηypermutated) έχουν βλεννώδη ιστολογικά χαρακτηριστικά παρουσιάζουν ανοσολογικού τύπου λεμφοκυτταρική αντίδραση γύρω από τον όγκο («Crohn s-like») έχουν μετάλλαξη του γονιδίου BRAF σε ποσοστό >40%, ενώ λιγότερο συχνές είναι οι μεταλλάξεις των γονιδίων TP53 και ΑPC έχουν καλύτερη συνολικά επιβίωση παρουσιάζουν αντίσταση στην θεραπεία με 5-FU Το προφίλ MSI στο καρκίνο του παχέος εντέρου γενικά παρέχει χρήσιμες προγνωστικές πληροφορίες για την συνολική επιβίωση των ασθενών και την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον εξατομικευμένο σχεδιασμό θεραπευτικών πρωτοκόλλων. Η χρήση της 5-FU, που αποτελεί ένα από τα φάρμακα πρώτης γραμμής για την θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου, έχει βρεθεί πως είναι αναποτελεσματική σε όγκους με μικροδορυφορική αστάθεια αφού η 5-FU καταστρέφει επιλεκτικά κύτταρα με ακέραιο σύστημα MMR Υπερμεθυλίωση (CpG Island hypermethylation Phenotype, CIMP) Εκτός από τις παραπάνω γενετικές μεταβολές, διάφοροι επιγενετικοί μηχανισμοί παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η μεθυλίωση του CpG είναι η πιο καλά μελετημένη επιγενετική μεταβολή στο γονιδίωμα των θηλαστικών. Περίπου 50-60% των ανθρώπινων γονιδίων περιέχουν περιοχές πλούσιες σε CpG που αναφέρονται ως «νησίδια» CpG (CpG islands), οι οποίες φυσιολογικά διατηρούνται σε μη μεθυλιωμένη κατάσταση. 30

31 Ο φαινότυπος CIMP χαρακτηρίζει την προδιάθεση που έχουν ορισμένα άτομα για πρόκληση επιγενετικής αστάθειας μέσω υπερμεθυλίωσης των υποκινητών και επομένως «αποσιώπησης» ενός εύρους ογκοκατασταλτικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων διαφόρων γονιδίων ΜΜR. 15 Η ομάδα CIMP χωρίζεται σε 2 υποκατηγορίες, υψηλού και χαμηλού βαθμού, ανάλογα με τον αριθμό των δεικτών που είναι θετικοί για υπερμεθυλίωση (3-5 και 0-2 για υψηλού και χαμηλού βαθμού αντίστοιχα). CIMP High: ανευρίσκεται σε 20% των σποραδικών καρκινωμάτων αποτελεί την πλειοψηφία της ομάδας MSI-H (95%) εμφανίζει υψηλό ποσοστό μεταλλάξεων (Hypermutated) έχει μεταλλάξεις κυρίως στο γονίδιο BRAF συμμετέχει στην οδό των άμισχων οδοντωτών αδενωμάτων εντοπίζεται συχνότερα κοντά στην σπληνική καμπή σχετίζεται με υπερμεθυλίωση κυρίως του MLH1 CIMP Low: ανευρίσκεται σε 20% των σποραδικών καρκινωμάτων δεν έχει μικροδορυφορική αστάθεια (MSS) έχει χαμηλό ποσοστό μεταλλάξεων (Νonhypermutable) έχει μεταλλάξεις κυρίως στο γονίδιο KRAS συμμετέχει στην οδό των παραδοσιακών οδοντωτών αδενωμάτων Τα καρκινώματα με φαινότυπο CIMP παρουσιάζουν σημαντική αλληλεπικάλυψη μηχανισμών με τα MSI-H και CIN καρκινώματα. Παρ ότι η ξεχωριστή ταξινόμηση CIMP είναι χρήσιμη για την κατανόηση της παθογένειας ορισμένων νεοπλασμάτων του παχέος εντέρου δεν έχει ακόμα ευρεία εφαρμογή στην κλινική πράξη

32 Εικόνα 1. Μηχανισμοί γενετικής αστάθειας εμπλεκόμενοι στην παθογένεια του CRC. Τροποποίηση από Carethers et al, Οδοί καρκινογένεσης Κλασσική αλληλουχία αδενώματος-καρκινώματος Οι περισσότεροι ορθοκολικοί καρκίνοι θεωρείται ότι δημιουργούνται στο έδαφος αδενωματωδών πολυπόδων μέσα από μία πολυσταδιακή διαδικασία η οποία περιλαμβάνει την πρόοδο από δυσπλαστικές κρύπτες σε μικρά αδενώματα και τελικά σε καρκινώματα του παχέος εντέρου. 32

33 Ο φυσιολογικός πολλαπλασιασμός των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων συμβαίνει στις βάσεις των κρυπτών. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταναστεύουν προς την επιφάνεια του αυλού όπου σταματούν να πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται οριστικά σε ώριμα εντεροκύτταρα. Όταν τα διαφοροποιημένα κύτταρα φθάσουν στην κορυφή της κρύπτης, υφίστανται απόπτωση. Αδενωματώδεις πολύποδες δημιουργούνται στο κόλον όταν διαταράσσονται οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την φυσιολογικοί ανανέωση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων. H υπόθεση ότι τα διηθητικά καρκινώματα αναπτύσσονται στο έδαφος αδενωματωδών πολυπόδων στηρίζεται σε διάφορες παρατηρήσεις όπως: Πρώιμα καρκινώματα παρατηρούνται συχνά μέσα σε μεγάλους αδενωματώδεις πολύποδες. Τα αδενώματα και τα καρκινώματα έχουν παρόμοια κατανομή στο παχύ έντερο. Τα αδενώματα τυπικά παρουσιάζονται χρόνια νωρίτερα από την εμφάνιση κακοήθειας και στις σποραδικές και στις οικογενείς περιπτώσεις. Έχει παρατηρηθεί μείωση της επίπτωσης του ορθοκολικού καρκίνου λόγω της πρώιμης αφαίρεσης πολυπόδων. Το 1990, οι Fearon και Vogelstein περιέγραψαν την μοριακή βάση του καρκινώματος σαν μία πολυσταδιακή διαδικασία η οποία βασίζεται στην συσσώρευση μεταλλάξεων της βλαστικής σειράς καθώς και σωματικών μεταλλάξεων. Σε κυτταρικό επίπεδο ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι αποτέλεσμα συσσώρευσης γενετικών και επιγενετικών αλλοιώσεων, που οδηγούν στην μετατροπή των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα Η απώλεια του APC θεωρείται πως αποτελεί το καθοριστικό εναρκτήριο γεγονός και ακολουθείται από ενεργοποίηση πρωτοογκογονιδίων (π.χ. K-ras, BRAF, SMAD4), απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων (π.χ. p53, DCC) καθώς και από άλλες 33

34 χρωμοσωμικές μεταβολές που δεν είναι ακόμα πλήρως ξεκαθαρισμένες. Περισσότερα από 80% των αδενωμάτων και των καρκινωμάτων έχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο APC με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt/β-catenin. Η πιο πρώιμα αναγνωρίσιμη βλάβη στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι οι ανώμαλες εστίες στις βάσεις των κρυπτών (Aberrant Crypt Foci, ACF). Το πραγματικό νεοπλασματικό δυναμικό αυτής της βλάβης δεν είναι ακόμα γνωστό αλλά έχει βρεθεί ότι κάποιες από αυτές τις εστίες έχουν μεταλλάξεις στα γονίδια KRAS ή APC και επομένως μπορούν να εξελιχθούν σε αληθή αδενοκαρκινώματα. 11 Οδός οδοντωτών αδενωμάτων (Serrated Pathway) Ενώ η πλειοψηφία των καρκίνων του παχέος εντέρου θεωρείται ότι προκύπτει μέσω της κλασσικής αλληλουχίας αδενώματος-καρκινώματος, πρόσφατα δεδομένα στηρίζουν την ύπαρξη μίας διαφορετικής οδού καρκινογένεσης σε 10-20% περίπου των CRCs, μέσω οδοντωτών πολυπόδων. Η ομάδα των οδοντωτών πολυπόδων (μορφολογικός όρος) περιλαμβάνει τους υπερπλαστικούς πολύποδες, τα οδοντωτά αδενώματα καθώς και μικτούς υπερπλαστικούς πολύποδες/αδενώματα. Χαρακτηριστικό γνώρισμα όλων των οδοντωτών πολυπόδων είναι η οδοντωτή («saw-toothed») πτύχωση του επιθηλίου της κρύπτης. Η πλειοψηφία των οδοντωτών πολυπόδων (80-90%) αποτελείται από υπερπλαστικούς πολύποδες οι οποίοι θεωρούνταν αρχικά καλοήθεις, πλέον όμως έχει βρεθεί πως κάποιοι από αυτούς μπορούν να εξελιχθούν σε καρκινώματα του παχέος εντέρου. Δύο προκαρκινικές αλλοιώσεις έχουν περιγραφεί, τα κλασσικά οδοντωτά αδενώματα (Traditional Serrated Adenomas, TSAs) και τα άμισχα οδοντωτά αδενώματα/πολύποδες (Sessile Serrated Adenomas/Polyps, SSA/Ps). 34

35 Τα καρκινώματα που προκύπτουν από αυτές τις προκαρκινικές αλλοιώσεις είναι ετερογενή από μορφολογικής και μοριακής πλευράς. Από μοριακής πλευράς υπάρχει σημαντική αλληλεπικάλυψη με τους μηχανισμούς γενετικής αστάθειας CIN και MSI. Σχετίζονται με συνολική χειρότερη πρόγνωση (με εξαίρεση τα MSI-Η καρκινώματα) και αντίσταση στην χημειοθεραπεία Οδός άμισχων οδοντωτών αδενωμάτων (Sessile Serrated Adenomas, SSAs) Γενικά μορφολογικά χαρακτηριστικά των SSAs : ανώμαλη μορφολογία των κρυπτών ( boot, inverted - anchor, J, L, inverted T), οριζόντια ανάπτυξη κατά μήκος της βλεννογόνιας μυϊκής στιβάδας, διάταση και οδοντωτές αλλοιώσεις μέχρι την βάση των κρυπτών. Δεν έχουν αληθή δυσπλασία (ορισμένα SSAs βέβαια έχουν περιοχές με συμβατική δυσπλασία και σχετίζονται με πιο επιθετική συμπεριφορά). Πιο συχνά εντοπίζονται στο δεξιό κόλον. Σχετίζονται κυρίως με μεταλλάξεις του γονιδίου BRAF, το οποίο αποτελεί πρώιμο γεγονός κατά την καρκινογένεση. Όλα έχουν φαινότυπο CIMP-H, αλλά είναι είτε μικροδορυφορικά ασταθή (MSI) (προκύπτουν από υπερμεθυλίωση του MLH1 γονιδίου), είτε μικροδορυφορικά σταθερά (MSS) (προκύπτουν πιθανώς από υπερμεθυλίωση άλλων μορίων στόχων). 8 Κλασσική οδός οδοντωτών αδενωμάτων (Tradiotional Serrated Adenomas, TSAs) Τα TSAs αποτελούν μία ετερογενή ομάδα αδενωμάτων που παρουσιάζουν μερικώς κοινά χαρακτηριστικά με την οδό των άμισχων οδοντωτών αδενωμάτων και με την κλασσική αλληλουχία αδενώματος-καρκινώματος. Δύο κύριες μορφές δυσπλασίας έχουν παρατηρηθεί στα TSAs, η οδοντωτή δυσπλασία και η κλασσική αδενωματώδης δυσπλασία. 35

36 Γενικά μορφολογικά χαρακτηριστικά των TSAs : έχουν μία ομοιογενή ομάδα δυσπλαστικών κυττάρων με ηωσινοφιλικό κυτταρόπλασμα και κεντρικούς, επιμηκυσμένους, υπερχρωματικούς πυρήνες. Επίσης έχουν σχισμοειδείς («slit-like») επιθηλιακές οδοντωτές προεξοχές, συχνά λαχνωτή μορφολογία, ενώ το κύριο διαχωριστικό χαρακτηριστικό τους από τα SSAs είναι ο έκτοπος σχηματισμός κρυπτών. Πιο συχνά εντοπίζονται στο αριστερό κόλον. Τα TSAs με οδοντωτή δυσπλασία σχετίζονται κυρίως με μεταλλάξεις του γονιδίου BRAF οι οποίες ανευρίσκονται ήδη από το στάδιο των ανώμαλων εστιών στις κρύπτες, ενώ τα TSAs με κλασσική αδενωματώδη δυσπλασία σχετίζονται κυρίως με μεταλλάξεις του γονιδίου ΚRAS. Και οι δύο υπότυποι είναι μικροδορυφορικά σταθεροί (MSS) και CIMP-L. 8 Εικόνα 2. Κλασσική οδός καρκινογένεσης και οδός οδοντωτών αδενωμάτων. Τροποποίηση από Leggett et al,

37 2.4 Παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Μακροσκοπικά χαρακτηριστικά Τα μακροσκοπικά χαρακτηριστικά των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου ποικίλουν αρκετά. Ο όγκος μπορεί να είναι: Εξωφυτικός, με ενδοαυλική κυρίως αύξηση Ενδοφυτικός, με ενδοτοιχωματική κυρίως αύξηση Διάχυτα διηθητικός (πλαστική λινίτιδα) Δακτυλιοειδής, με κυκλοτερή αύξηση και απόφραξη του αυλού Η αλληλοεπικάλυψη μεταξύ αυτών των τύπων είναι αρκετά συχνή. Τα καρκινώματα που αναπτύσσονται στο εγγύς τμήμα του παχέος εντέρου είναι συνήθως εξωφυτικά, ενώ εκείνα που αναπτύσσονται στο εγκάρσιο ή το κατιόν κόλον είναι συνήθως δακτυλιοειδή. Καρκινώματα με υψηλά επίπεδα μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI-H) είναι συνήθως καλά περιγεγραμμένα και στο 20% περίπου των περιπτώσεων είναι βλεννώδη. 7 Ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά (WHO) Ο συχνότερος ιστολογικός τύπος καρκίνου του παχέος εντέρου είναι το αδενοκαρκίνωμα. Καθοριστικό χαρακτηριστικό του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου είναι ότι διεισδύει στον υποβλεννογόνιο χιτώνα μέσω της υποβλεννογόνιας μυϊκής στιβάδας. Βλάβες με μορφολογικά χαρακτηριστικά αδενοκαρκινώματος που περιορίζονται στο επιθήλιο ή διηθούν το χόριο αλλά χωρίς να διαπερνούν την υποβλεννογόνιο μυϊκή στιβάδα δεν συνοδεύονται από αυξημένο κίνδυνο μεταστάσεων. 37

38 Τα περισσότερα αδενοκαρκινώματα σχηματίζουν αδενικούς σχηματισμούς, οι οποίοι εμφανίζουν ποικιλία ως προς το μέγεθος και την δομή τους. Σε καλά και μέτρια διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα τα επιθηλιακά κύτταρα είναι συνήθως μεγάλα και ψηλά και ο αδενικός αυλός συχνά περιέχει κυτταρικά υπολείμματα. Οι κύριοι ιστολογικοί τύποι κατά WHO είναι οι ακόλουθοι: 7 Βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα Περισσότερο από το 50% της βλάβης αποτελείται από βλέννη. Οι περισσότεροι όγκοι με υψηλής συχνότητας μικροδορυφορική αστάθεια (MSI-H) ανήκουν σε αυτή την κατηγορία. Καρκίνωμα με κύτταρα Signet-ring Περισσότερο από το 50% των καρκινικών κυττάρων έχουν άφθονη κυτταροπλασματική βλέννη. Τα τυπικά signet-ring κύτταρα έχουν ένα μεγάλο κυστίδιο βλέννης που καταλαμβάνει όλο το κυτταρόπλασμα και παρεκτοπίζει τον πυρήνα. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να εντοπίζονται είτε σε περιοχές βλέννης ενός βλεννώδους αδενοκαρκινώματος είτε σε διάχυτα διηθητικές εξεργασίες με την παρουσία ελάχιστης εξωκυττάριας βλέννης. Αδενοπλακώδες καρκίνωμα Ασυνήθεις όγκοι με χαρακτηριστικά τόσο πλακώδους καρκινώματος όσο και αδενοκαρκινώματος. Για να χαρακτηριστεί ένα καρκίνωμα αδενοπλακώδες θα πρέπει να εμφανίζει αρκετές εστίες πλακώδους διαφοροποίησης. Μυελώδες καρκίνωμα Σπάνιος ιστολογικός τύπος που χαρακτηρίζεται από την παρουσία κακοήθων κυττάρων με κενοτοπιώδη πυρήνα, έντονο πυρηνίσκο και άφθονο ηωσινόφιλο 38

39 κυτταρόπλασμα καθώς και από την παρουσία έντονης ενδοεπιθηλιακής διήθησης από λεμφοκύτταρα. Σχετίζεται πάντα με φαινότυπο MSI-H και έχει καλύτερη πρόγνωση συγκριτικά με τα κακώς διαφοροποιημένα ή αδιαφοροποίητα αδενοκαρκινώματα. Αδιαφοροποίητο καρκίνωμα Δεν εμφανίζει καμία μορφολογική ένδειξη διαφοροποίησης πέραν αυτής ενός επιθηλιακού όγκου και έχει διάφορα ιστολογικά χαρακτηριστικά. Παρά την έλλειψη διαφοροποίησης, αυτοί οι όγκοι είναι γενετικά διακριτοί και τυπικά σχετίζονται με φαινότυπο MSI-H. Σπανιότεροι ιστολογικοί τύποι : πλειόμορφο (γιγαντοκυτταρικό), χοριοκαρκίνωμα, pigmented, clear-cell, stem-cell, Paneth cell-rich, spindle-cell και καρκινοσάρκωμα. 7 Βαθμός διαφοροποίησης (Grading) Η διαβάθμιση των καρκινωμάτων βασίζεται στον βαθμό σχηματισμού αδενικών δομών. Διακρίνονται σε καλώς, μετρίως και κακώς διαφοροποιημένα ή σε χαμηλού βαθμού κακοήθειας (καλώς και μετρίως διαφοροποιημένα) και υψηλού βαθμού κακοήθειας (κακώς διαφοροποιημένα και αδιαφοροποίητα) καρκινώματα. Όταν ένα καρκίνωμα εμφανίζει ετερογένεια ως προς την διαφοροποίηση η διαβάθμισή του πρέπει να βασίζεται στο λιγότερο καλά διαφοροποιημένο στοιχείο του, πλην της περιοχής του «μετώπου» διήθησης, το οποίο συχνά εμφανίζει μικρές εστίες κακής διαφοροποίησης (χωρίς αυτό το στοιχείο να δικαιολογεί την ταξινόμηση του όγκου ως κακώς διαφοροποιημένου). Για τον καθορισμό του βαθμού διαφοροποίησης χρησιμοποιείται το ποσοστό του όγκου που εμφανίζει αδενικές δομές: 39

40 Grade I (καλώς διαφοροποιημένα) : >95% Grade II (μετρίως διαφοροποιημένα) : 50-95% Grade III (κακώς διαφοροποιημένα) : 5-50% Grade IV (αδιαφοροποίητα) : <5% Τα βλεννώδη και τα signet-ring cell καρκινώματα θεωρούνται εξ ορισμού κακώς διαφοροποιημένα (Grade III) ενώ τα μυελώδη καρκινώματα με φαινότυπο MSI-H θεωρούνται αδιαφοροποίητα Πρόγνωση - Σταδιοποίηση Προγνωστικοί παράγοντες Πολλαπλοί παράγοντες έχουν συσχετισθεί μέχρι σήμερα με την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Σημαντικότερη για την κλινική πράξη παραμένει η σταδιοποίηση κατά AJCC/TNM, στην οποία το Τ αντιπροσωπεύει το βάθος διείσδυσης του όγκου, το Ν την παρουσία διηθημένων λεμφαδένων και το Μ την ύπαρξη ή όχι απομακρυσμένων μεταστάσεων. 40

41 Πίνακας 1. Σταδιοποίηση κατά AJCC/ΤΝΜ. 21 Πρωτοπαθής όγκος (Τ) Τx T0 Tis T1 T2 T3 T4a T4b Ο πρωτοπαθής όγκος δεν μπορεί να εκτιμηθεί Δεν υπάρχει ένδειξη πρωτοπαθούς εστίας Καρκίνωμα in situ : ενδοεπιθηλιακό ή ενδοβλεννογόνιο καρκίνωμα Ο όγκος διηθεί τον υποβλεννογόνιο χιτώνα Ο όγκος διηθεί αλλά δεν διαπερνά τον μυϊκό χιτώνα Ο όγκος διηθεί και διαπερνά τον μυϊκό χιτώνα προς τους περικολικούς ιστούς Ο όγκος διεισδύει στην επιφάνεια του σπλαγχνικού περιτοναίου Ο όγκος διηθεί ή συμφύεται στερεά με γύρω ιστούς και όργανα Νχ N0 Ν1 Ν1a N1b N1c N2 N2a N2b Περιοχικοί λεμφαδένες (Ν) Δεν μπορούν να αξιολογηθούν Δεν υπάρχει μετάσταση σε επιχώριους λεμφαδένες Μετάσταση σε 1-3 περιοχικούς λεμφαδένες Μετάσταση σε 1 περιοχικό λεμφαδένα Μετάσταση σε 2-3 περιοχικούς λεμφαδένες Εστίες καρκινικών κυττάρων σε υπορογόνιο, μεσόκολο, εξωπεριτοναικούς περικολικούς/περιορθικούς ιστούς χωρίς μετάσταση σε περιοχικούς λεμφαδένες Μετάσταση σε 4 ή περισσότερους περιοχικούς λεμφαδένες Μετάσταση σε 4-6 περιοχικούς λεμφαδένες Μετάσταση σε 7 ή περισσότερους περιοχικούς λεμφαδένες Απομακρυσμένες μεταστάσεις (Μ) M0 M1 M1a M1b Απουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων Απομακρυσμένες μεταστάσεις Μεταστατική νόσος σε ένα όργανο ή μία περιοχή (ήπαρ, πνεύμονες, ωοθήκες, διήθηση απόμακρυσμένων λεμφαδένων) Μεταστατική νόσος σε περισσότερα από ένα όργανα ή μία περιοχή ή περιτοναϊκές εμφυτεύσεις 41

42 Στάδιο Τ Ν Μ 0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 T2 N0 M0 IIA T3 N0 M0 IIB T4a N0 M0 IIC T4b N0 M0 IIIA T1-T2 N1/N1c M0 T1 N2a M0 T3-T4a N1/N1c M0 IIIB T2-T3 N2a M0 T1-T2 N2b M0 T4a N2a M0 IIIC T3-T4a N2b M0 T4b N1-N2 M0 IVA Any T Any N M1a IVB Any T Any N M1b Άλλοι προγνωστικοί παράγοντες Χαρακτηριστικά του πρωτοπαθούς όγκου : έκταση περιφερικής συμμετοχής, απόφραξη εντέρου, διάτρηση τοιχώματος εντέρου, πρότυπο διήθησης, βαθμός διαφοροποίησης. Διήθηση αγγείων : εξωτοιχωματική διήθηση φλεβών, συμμετοχή λεμφαγγείων ή περινευρικού χώρου, αντιδραστικές αλλαγές περιοχικών λεμφαδένων. Αντίδραση του ξενιστή : αγγειογένεση, τοπική φλεγμονώδης και δεσμοπλαστική απάντηση στην διήθηση. 42

43 Μετεγχειρητικά αποτελέσματα : απόσταση μεταξύ εγχειρητικών ορίων και νεοπλάσματος, παραμονή υπολλειπόμενου νεοπλασματικού ιστού. Γενετικοί παράγοντες-bιοδείκτες Για τον σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου υπολογίζεται ότι από τα περίπου γονίδια του ανθρώπινου γονιδιώματος, 138 σχετίζονται με την έναρξη της καρκινογένεσης («driver genes»), 74 από τα οποία είναι ογκοκατασταλτικά και 64 πρωτοογκογονίδια. Ένα τυπικό σποραδικό καρκίνωμα του παχέος εντέρου μπορεί να περιλαμβάνει 2-8 μεταβολές σε «driver genes», ενώ τα υπόλοιπα αποτελούν «passenger genes» δηλαδή αλλοιώσεις χωρίς επίδραση στην νεοπλασματική διαδικασία. Το τοπίο των γενετικών μεταλλάξεων για τον σποραδικό CRC εμφανίζει μεγάλη ετερογένεια λόγω κλωνικότητας. Ετερογένεια μπορεί να παρουσιάζεται σε πολλά επίπεδα όπως, ανάμεσα σε : διαφορετικούς ασθενείς, διαφορετικούς κλώνους στο ίδιο νεόπλασμα, διαφορετικές μεταστάσεις και διαφορετικούς κλώνους στην ίδια μετάσταση. Μία σημαντική υπόθεση είναι πως η αλλοίωση που είναι υπεύθυνη για την έναρξη της ογκογένεσης διαφέρει από ασθενή σε ασθενή τόσο ώστε ο κάθε ασθενής να έχει ουσιαστικά ένα μοριακά μοναδικό καρκίνωμα. Με βάση τα δεδομένα αυτά είναι σαφές ότι υπάρχει σημαντική ανάγκη αναγνώρισης νεών προγνωστικών παραγόντων εκτός από το σύστημα σταδιοποίησης ΤΝΜ, με βάση τους οποίους να καθορίζονται εξατομικευμένες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Αρκετοί γενετικοί παράγοντες έχουν κατά καιρούς συσχετισθεί με την πρόγνωση του ορθοκολικού καρκινώματος, λίγοι όμως έχουν αποκτήσει χρησιμότητα στην κλινική πράξη μέχρι σήμερα. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι: 43

44 MSI-H : σχετίζεται με καλύτερη συνολική πρόγνωση αλλά και αντίσταση στην θεραπεία με 5-FU (5-Φθοριοουρακίλη). 16 Μεταλλάξεις KRAS, BRAF : σχετίζονται με αντίσταση στην θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του EGFR (Epidermoid Growth Factor Receptor). 16 Μεθυλίωση NDRG4 και BMP3 : μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως screening test (δείγμα κοπράνων) σε ασθενείς μέτριου κινδύνου, προς το παρόν όμως όχι εύκολα εφαρμόσιμο ατην κλινική πράξη. 16 Άλλοι πιθανοί βιοδείκτες όπως πολυμορφισμοί του EGFR και αντι-αγγειογενετικοί δείκτες (π.χ. epiregulin, amphiregulin, μεταλλάξεις PI3KCA, PTEN, VEGF-isoforms, έκφραση VEGFR-1/VEGFR-2) βρίσκονται υπό μελέτη. Επίσης μέχρι σήμερα δεν έχουν ταυτοποιηθεί γενετικοί παράγοντες που να διαχωρίζουν σαφώς τα μεταστατικά από τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα Μοριακή ταξινόμηση Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, κλασσικά ο καρκίνος του παχέος εντέρου ταξινομείται με βάση κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά (ιστολογικά χαρακτηριστικά, στάδιο νόσου κατά ΤΝΜ), ενώ σήμερα χρησιμοποιούνται επιπλέον νέοι δείκτες στην κλινική πράξη όπως η μικροδορυφορική αστάθεια (MSI) και οι μεταλλάξεις των γονιδίων ΚRAS και BRAF. Με βάση λοιπόν ποικίλες γενετικές και επιγενετικές μεταβολές διάφορα συστήματα μοριακής ταξινόμησης του ορθοκολικού καρκίνου έχουν κατά καιρούς προταθεί. Παρ όλα αυτά καμία από τις υπάρχουσες ταξινομήσεις δεν αντανακλά την πολυπλοκότητα της νεοπλασματικής ετερογένειας και καμία δεν αποτελεί από μόνη της οδηγό για την εξατομικευμένη θεραπεία των ασθενών με νεοπλάσματα του παχέος εντέρου

45 Consensus molecular subtypes (2016) Η πιο πρόσφατη προσπάθεια μοριακής ταξινόμησης του καρκίνου του παχέος εντέρου έγινε από μία ομάδα μελετητών που ανέλυσε έξι προηγούμενα συστήματα μοριακής ταξινόμησης, (το καθένα από τα οποία περιελάμβανε 3-6 υπότυπους), με βάση τα αποτελέσματα της οποίας προέκυψαν 4 νέες κατηγορίες. 24 Τα κύρια χαρακτηριστικά αυτών των κατηγοριών περιγράφονται στον πίνακα 2. Πίνακας 2. Mοριακή ταξινόμηση CRC (Consensus Μolecular Subtypes, CMS). 24 CMS1 CMS2 CMS3 CMS4 MSI-ανοσολογικός Κανονικός Μεταβολικός Μεσυγχυματικός 14% 37% 13% 23% MSI MSS Μικτό MSI MSS CIN(-) CIN (SCNA High) CIN (SCNA Low) CIN (SCNA High) CIMP High CIMP(-) CIMP Low CIMP(-) Ηypermutated Μεταλλάξεις BRAF Μεταλλάξεις KRAS Ανοσολογική διήθηση και ενεργοποίηση, μεγαλύτερος βαθμός διαφοροποίησης Ενεργοποίηση Wnt και Μyc Μεταβολική απορρύθμιση Διήθηση στρώματος, ενεργοποίηση TGF-β, αγγειογένεση Πιο συχνά σε γυναίκες, δεξιά εντόπιση Πιο συχνά αριστερή εντόπιση Χειρότερη πρόγνωση μετά από υποτροπή Αριστερή εντόπιση καλή πρόγνωση Πιθανότερη υποτροπή, χειρότερη συνολική επιβίωση 45

46 Από την ανάλυση αυτή προέκυψε και μία πέμπτη κατηγορία (σε ποσοστό 13% ) με μικτά χαρακτηριστικά, που πιθανώς αντιπροσωπεύουν είτε ένα μεταβατικό φαινότυπο είτε ενδονεοπλασματική ετερογένεια. Η κατηγορία CMS1 περιλαμβάνει ουσιαστικά τα περισσότερα νεοπλάσματα με μικροδορυφορική αστάθεια (MSI), ενώ η πλειοψηφία των όγκων που προηγουμένως περιγράφονταν ως CIN χωρίστηκε σε τρεις κατηγορίες (CMS2, CMS3, CMS4). Παρ όλη την πρόοδο των τελευταίων ετών περισσότερες μελέτες χρειάζονται προτού μπορέσουν τα μοριακά συστήματα ταξινόμησης να χρησιμοποιηθούν με ευκολία στην κλινική πράξη για τον σχεδιασμό θεραπευτικών στρατηγικών. Ακόμα παραμένουν αναπάντητα διάφορα ερωτήματα όπως: αν οι μεταστάσεις έχουν το ίδιο μοριακό προφίλ με τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα και επίσης κατά πόσον οι διάφορες εφαρμοζόμενες θεραπείες (χημειοθεραπεία, στοχευμένη θεραπεία, ανοσοθεραπεία) μπορούν να επηρεάσουν την εξέλιξη των μοριακών προφίλ στην πορεία της νόσου. 23 Εκτεταμένη έρευνα έχει γίνει τα τελευταία χρόνια σχετικά με την ανοσολογική απάντηση του ξενιστή εναντίον των καρκινικών κυττάρων και φάνηκε η προγνωστική σημασία του βαθμού ανοσολογικής διήθησης στα νεοπλάσματα. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε για την εκτίμηση και ποσοτικοποίηση αυτών των διηθήσεων ονομάζεται «Immunoscore» και έχει φανεί ότι αποτελεί καλύτερο προγνωστικό παράγοντα από το ΤΝΜ σύστημα

47 2.6 Θεραπεία Η θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου εξαρτάται κυρίως από το στάδιο της νόσου Στάδιο 0, Στάδιο Ι : θεραπεία εκλογής είναι η χειρουργική επέμβαση, χωρίς συμπληρωματική θεραπεία. Στάδιο ΙΙ : χειρουργική επέμβαση και πιθανώς συμπληρωματική χημειοθεραπεία, βάση μικροσκοπικών και μακροσκοπικών χαρακτηριστικών του όγκου κατά το χειρουργείο (βαθμός διαφοροποίησης, διήθηση αιμοφόρων αγγείων/λεμφαγγείων, απόφραξη εντέρου, διάτρηση τοιχώματος εντέρου, στενά χειρουργικά όρια). Συχνά χρησιμοποιούμενα φάρμακα είναι : 5-FU,oxaliplatin, leucovorin, capecitabine. Στάδιο ΙΙΙ : χειρουργική επέμβαση και πάντα συμπληρωματική χημειοθεραπεία, ενώ μπορεί να γίνει και συμπληρωματική ακτινοθεραπεία. Συχνά χρησιμοποιούμενα χημειοθεραπευτικά σχήματα είναι : FOLFOX (5-FU, leucovorin, και oxaliplatin) και CapeOx (capecitabine and oxaliplatin). Στάδιο IV : ο καρκίνος έχει επεκταθεί σε γειτονικά ή και απομακρυσμένα όργανα όπως ήπαρ, πνεύμονες, περιτόναιο, ή σε απομακρυσμένους λεμφαδένες. Χειρουργική θεραπεία μπορεί να εφαρμοστεί ανάλογα με την έκταση και τον αριθμό των μεταστάσεων ή για συμπτωματική αντιμετώπιση (π.χ. επικείμενη απόφραξη παχέος εντέρου). Οι περισσότεροι ασθενείς όμως θα αντιμετωπιστούν μόνο με χημειοθεραπεία ή/και στοχευμένες θεραπείες. Ακτινοθεραπεία μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για συμπτωματική κυρίως ανακούφιση (π.χ. αναλγητική δράση). Η στοχευμένη θεραπεία δρα σε ειδικά γονίδια, πρωτεΐνες, ή στο μικροπεριβάλλον που συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου. Ορισμένα παραδείγματα στοχευμένης θεραπείας είναι τα παρακάτω: 47

48 Anti-EGFR (μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του υποδοχέα του επιδερμοειδούς αυξητικού παράγοντα) : Cetuximab, Panitumumab. Οι θεραπείες αυτές όμως είναι αναποτελεσματικές σε ασθενείς που έχουν μετάλλαξη σε κάποιο γονίδιο, όπως K- RAS, N-RAS ή BRAF. Anti-VEGF (μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα) : Bevacizumab, Ramucirumab, Ziv-aflibercept. Regorafenib : αναστολέας τυροσινικών κινασών με αντιαγγειογενετικές ιδιότητες

49 Κεφάλαιο 3: Μηχανισμοί αντίστασης στην χημειοθεραπεία H χημειοθεραπεία είναι μία από τις βασικές μεθόδους αντιμετώπισης των κακοήθων νοσημάτων, αλλά η πρόγνωση των ασθενών παραμένει μέχρι σήμερα μη ικανοποιητική. Τα καρκινικά κύτταρα σταδιακά αναπτύσσουν αντίσταση σε όλα σχεδόν τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα μέσω μίας ποικιλίας διακριτών μηχανισμών και μονοπατιών, ενώ η πλειοψηφία των ασθενών θα αναπτύξει αντίσταση σε κάποιο σημείο της θεραπείας. Με βάση την ανταπόκριση του όγκου στην αρχική θεραπεία, η αντίσταση μπορεί αδρά να διακριθεί σε δύο κατηγορίες, πρωτογενή και επίκτητη. Η πρωτογενής αντίσταση υπάρχει εγγενώς πριν από την έναρξη οποιασδήποτε θεραπείας, ενώ η επίκτητη προκύπτει μόνο μετά από την χορήγηση του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου. Σε ορισμένους ασθενείς η παρατεταμένη έκθεση σε ένα μόνο χημειοθεραπευτικό παράγοντα μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη αντίστασης σε πολλαπλούς δομικά μη συναφείς παράγοντες, δηλαδή διασταυρούμενη αντίσταση (ΜultiDrug Resistance- MDR). Οι βασικοί μηχανισμοί επίκτητης αντίστασης είναι οι εξης: 26 Μεταβολές στην δράση ενζύμων Ορισμένα από τα κύρια ένζυμα που συμμετέχουν στον μεταβολισμό των αντικαρκινικών φαρμάκων είναι: Ένζυμα του κυτοχρώματος Ρ450 (φάσης Ι) : καταλύουν την οξείδωση πολλών αντικαρκινικών φαρμάκων. 49

50 Ένζυμα φάσης ΙΙ : συζευκτικά ένζυμα που περιλαμβάνουν τα UGTs (UDP glucuronosyltransferases), GSTs (glutathione S-tranferases), methyltransferases, N-acetyltransferases, sulfotransferases. Άλλα ένζυμα : carboxylesterases, epoxide hydrolase, cytidine deaminase, deoxycytidine kinase. Τα περισσότερα αντικαρκινικά φάρμακα μεταβολίζονται από ένζυμα φάσης Ι/ΙΙ στο ήπαρ, στο έντερο και πιθανώς στους νεοπλασματικούς ιστούς. Ορισμένα χημειοθεραπευτικά φάρμακα πρέπει πρώτα να υποστούν μεταβολική ενεργοποίηση για να μπορέσουν να αναπτύξουν κυτταροτοξική δράση (προφάρμακα). Γενετικές μεταβολές που οδηγούν είτε σε μείωση της ενδοκυττάριας ενεργοποίησης προφαρμάκων είτε σε ενίσχυση της απενεργοποίησης δραστικών φαρμάκων από οποιοδήποτε από τα παραπάνω ενζυμικά συστήματα συμβάλλει στην ανάπτυξη αντίστασης στην χημειοθεραπεία. 27 Μεταβολές σε μηχανισμούς μεμβρανικής μεταφοράς Η εγγενής αλλά και η επίκτητη αντίσταση μπορεί να προκληθούν από μεταβολές στον μηχανισμό μεταφοράς των αντικαρκινικών φαρμάκων μέσα από την μεμβράνη, η οποία διαμεσολαβείται από μία ποικιλία ενεργών μεταφορέων. Η πλειοψηφία αυτών των πρωτεϊνών ανήκουν στην οικογένεια των ΑΤΡ-Binding Cassette (ABC) μεταφορέων, η οποία περιλαμβάνει 49 λειτουργικά μέλη στον άνθρωπο με 7 υπεροικογένειες (από ABCA έως ABCG). Οι ABC μεταφορείς μέσω ενός ΑΤΡ-εξαρτώμενου μηχανισμού οδηγούν στην διαμεμβρανική μεταφορά των υποστρωμάτων ενάντια στην κλίση συγκέντρωσης και αποτελούν ένα σημαντικό στοιχείο των αμυντικών μηχανισμών που χρησιμοποιούν τα φυσιολογικά και τα καρκινικά κύτταρα εναντίον διαφόρων κυτταροτοξικών συστατικών. 50

51 Οι πιο σημαντικοί από τους μεταφορείς αυτούς είναι : Ρ-γλυκοπρωτεΐνες (P-gp/ MDR1/ ABCB1), πρωτεΐνες σχετιζόμενες με πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR-associated: MRPs, ABCCs) και πρωτεΐνη σχετιζόμενη με αντίσταση στον καρκίνο του μαστού (mitoxantrone resistance protein: BCRP/ABCG2). Γενετικές μεταβολές που οδηγούν σε υπερέκφραση αυτών των μεταφορέων στα καρκινικά κύτταρα σχετίζονται με αντίσταση στην χημειοθεραπεία προκαλώντας είτε ελαττωμένη ενδοκυττάρια συγκέντρωση είτε αυξημένη εκροή του φαρμάκου από το κύτταρο Αποφυγή απόπτωσης Η απόπτωση, δηλαδή η προγραμματισμένη διαδικασία κυτταρικού θανάτου συμμετέχει στην ρύθμιση πληθώρας σημαντικών φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών. Υπάρχουν δύο κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια απόπτωσης, το εξωγενές (death receptor) και το ενδογενές (μιτοχονδριακό) που καταλήγουν και τα δύο στον καταρράκτη ενεργοποίησης κασπασών (caspace activation cascade). Οι κασπάσες είναι μία οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης με καίριο ρόλο στην απόπτωση και στην φλεγμονή, οι οποίες προκαλούν την διάσπαση μίας ποικιλίας κυτταροπλασματικών και πυρηνικών υποστρωμάτων. Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποφύγουν την διαδικασία της απόπτωσης είτε μέσω υπερέκφρασης αντι-αποπτωτικών μορίων (π.χ. Bcl-2) είτε μέσω μείωσης/δυσλειτουργίας διαφόρων προ-αποπτωτικών πτωτεινών (π.χ. Bax, Bad, Bim) Απορρύθμιση «αυτοφαγίας» Η αυτοφαγία (ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου ΙΙ), είναι ένα αρχαίο μονοπάτι κυτταρικής επιβίωσης που επιτρέπει στα κύτταρα να χρησιμοποιούν δικά τους συστατικά για βιοσύνθεση όταν βρίσκονται σε συνθήκες «ασιτίας» (starvation) ή υποξίας, 51

52 συνθήκες δηλαδή που αποτελούν κύρια χαρακτηριστικά του νεοπλασματικού μικροπεριβάλλοντος. H αυτοφαγία φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες όπως, η ρύθμιση της ομοιοστασίας του κυττάρου, ο κυτταρικός θάνατος, η καταστολή της νεοπλασματικής ανάπτυξης, το γήρας, και η αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στην χημειοθεραπεία. Ενώ ένα χαμηλό επίπεδο αυτοφαγίας είναι μάλλον απαραίτητο για την κυτταρική επιβίωση, η συνεχής ενεργοποίηση αυτού του μηχανισμού μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο μέσω σταδιακής «αυτo-αποδόμησης». 31 Eπομένως η αυτοφαγία έχει ένα παράδοξο και όχι πλήρως κατανοητό ρόλο στην νεοπλασματική ανάπτυξη, μετάσταση και αντίσταση στην χημειοθεραπεία. Υπάρχει η θεωρία ότι η αντίσταση στην χημειοθεραπεία προκαλείται από ενεργοποίηση της αυτοφαγίας με ακόλουθη απενεργοποίηση της απόπτωσης. 26 Κύριο ρόλο φαίνεται πως παίζει το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/Akt/mTOR το οποίο αποτελεί στόχο νέων θεραπευτικών στρατηγικών. 31 Εκτός από τους μηχανισμούς που ήδη αναφέρθηκαν, άλλοι παράγοντες μπορεί να συμβάλλουν στην ανάπτυξη αντίστασης όπως η αυξημένη επιδιόρθωση των φαρμακο-επαγόμενων βλαβών στο DNA, η παραμονή της δεξαμενής των αρχέγονων καρκινικών κυττάρων μετά την χημειοθεραπεία, το νεοπλασματικό μικροπεριβάλλον, το στρώμα καθώς και διάφοροι επιγενετικοί παράγοντες. H αντίσταση στην χημειοθεραπεία, είτε εγγενής είτε επίκτητη, περιορίζει σημαντικά την αποτελεσματικότητά της και έχει ως αποτέλεσμα την πτωχή πρόγνωση των ασθενών. Kαλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών στόχων. Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί η πολυπαραγοντκή φύση της χημειοθεραπευτικής αντίστασης δημιουργεί ακόμα σημαντικό εμπόδιο στην ανάπτυξη αποτελεσματικών και ασφαλών στρατηγικών χημειοευαισθητοποίησης

53 Εικόνα 3. Κύριοι μηχανισμοί αντίστασης στην χημειοθεραπεία. Τροποποίηση από Kruh et al, Μεταβολή μηχανισμών μεμβρανικής μεταφοράς 2. Μεταβολή στην δράση ενζυμικών συστημάτων 3. Αλλαγές στον μηχανισμό επιδιόρθωσης βλαβών 4. Αποφυγή απόπτωσης - απορρύθμιση μηχανισμού «αυτοφαγίας» 53

54 Κεφάλαιο 4: Επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή 4.1 Ορισμός ΕΜΤ και ΜΕΤ Η επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) είναι ένα φαινόμενο που χαρακτηρίζεται από μοριακές και φαινοτυπικές αλλαγές που συμβαίνουν στο επιθηλιακό κύτταρο με στόχο την μετατροπή του σε κύτταρο μεσεγχυματικού τύπου. Ως αποτέλεσμα τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν την πολικότητα και την ισχυρή συνοχή που φυσιολογικά υπάρχει μεταξύ τους και αποκτούν μεταναστευτικές και διηθητικές ιδιότητες αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων. Στον πίνακα 3 φαίνονται τα κύρια φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των επιθηλιακών και των μεσεγχυματικών κυττάρων. Πίνακας 3. Κύρια χαρακτηριστικά επιθηλιακών και μεσεγχυματικών κυττάρων. 34 Επιθηλιακά κύτταρα Διάταξη σε στρώσεις ή στιβάδες Πολύ στενές διακυτταρικές συνδέσεις Έχουν πολικότητα Στερεή προσκόλληση σε ινώδη βασικό υμένα Έκφραση υψηλών επιπέδων επιθηλιακών δεικτών (Ε-cadherin) Μεσεγχυματικά κύτταρα Ατρακτοειδής μορφολογία Μικρότερη συνοχή μεταξύ τους Δεν έχουν πολικότητα Κινούνται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο Έκφραση μεσεγχυματικών δεικτών (Ncadherin, fibronectin, vimentin) 54

55 Η αρχική ιδέα πως τα επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να χάσουν ορισμένα από τα χαρακτηριστικά τους και να αποκτήσουν ιδιότητες μεσεγχυματικών κυττάρων προέκυψε στις αρχές της δεκαετίας του 1980, από πειραματικές παρατηρήσεις της Elizabeth Hay. Το φαινόμενο αυτό αρχικά αναγνωρίστηκε ως βασικό χαρακτηριστικό της εμβρυογένεσης, όπου φαίνεται να συμμετέχει σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες (μετανάστευση κυττάρων νευρικής ακρολοφίας, σχηματισμός γαστριδίου, δημιουργία οργάνων ή ιστών). Η ΕΜΤ ανευρίσκεται στα πλαίσια τριών διακριτών βιολογικών διαδικασιών με πολύ διαφορετικά λειτουργικά επακόλουθα μεταξύ τους, με βάση τα οποία ταξινομείται σε 3 κύριους τύπους: 35 Τύπος 1 ΕΜΤ σχετιζόμενη με φυσιολογικές διαδικασίες της εμβρυογένεσης Δεν οδηγεί σε ίνωση ούτε διήθηση Προκύπτουν μεσεγχυματικά κύτταρα ικανά να υποστούν και την αντίστροφη διαδικασία (Mesenchymal to Epithelial Transition, ΜΕΤ) Τύπος 2 ΕΜΤ σχετιζόμενη με επούλωση τραυμάτων, αναγέννηση ιστών και ίνωση οργάνων Σχετίζεται με την διαδικασία της φλεγμονής και σταματάει όταν αυτή υποχωρήσει Σε επίμονη φλεγμονή οδηγεί σε ίνωση Τύπος 3 ΕΜΤ σχετιζόμενη με νεοπλασματικά κύτταρα που έχουν προηγουμένως υποστεί γενετικές και επιγενετικές αλλαγές Τα κύτταρα αποκτούν ικανότητα διήθησης και μετάστασης Παρ ότι οι παραπάνω τρεις τύποι αποτελούν διακριτές βιολογικές διαδικασίες, φαίνεται πως προκύπτουν στο έδαφος μίας κοινής ομάδας γενετικών και βιοχημικών μεταβολών που προωθούν αυτά τα φαινοτυπικά διαφορετικά προγράμματα. 55

56 Στο πλαίσιο της ΕΜΤ τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα υφίστανται ποικίλες λειτουργικές και μορφολογικές μετατροπές, που οδηγούν σε αύξηση της κινητικότητάς τους και τους προσδίδουν μεταστατικό δυναμικό, όπως : απώλεια των κυτταρικών συνδέσεων, αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού, απόκτηση ατρακτοειδούς μορφολογίας, απώλεια πολικότητας, σχηματισμός ψευδοποδίων, αποφυγή απόπτωσης, νεοαγγειογένεση, αλληλεπίδραση με κύτταρα του στρώματος, απώλεια έκφρασης Ε-cadherin κ.α. 36 Ανάλογα με τον ιστό και τα σηματοδοτικά μονοπάτια τα επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να χάσουν ένα μέρος μόνο των χαρακτηριστικών τους και να έχουν έτσι μικτές ιδιότητες (μερική ΕΜΤ). Για την αντίστροφη της ΕΜΤ διαδικασίας, δηλαδή την μετατροπή από μεσεγχυματικά σε επιθηλιακά κύτταρα (Mesenchymal to Epithelial Transition, ΜΕΤ) λίγα είναι γνωστά. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις συμμετοχής της ΜΕΤ σε διαδικασίες όπως η επούλωση τραυμάτων, η αναγέννηση ιστών, η ίνωση και η μετάσταση, αλλά ακόμα η διαδικασία αυτή δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί Μοριακά μονοπάτια ΕΜΤ Ένα πλήθος διαφορετικών μοριακών μονοπατιών συμμετέχουν στην έναρξη και ολοκλήρωση της διαδικασίας της ΕΜΤ. Σε αυτά περιλαμβάνονται : η ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων (π.χ. TGF-β), η αναδιοργάνωση και έκφραση πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού (π.χ. ιντεγκρινών), η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt/β-catenin, η ενεργοποίηση υποδοχέων κινάσης τυροσίνης κ.α. Η ολοκληρωμένη διαδικασία της ΕΜΤ θεωρείται ότι προκύπτει από αλληλεπίδραση του επιθηλιακού κυττάρου με το ενεργοποιημένο στρώμα που το περιβάλλει. Στο πεδίο του ορθοκολικού καρκίνου τα πρώτα δεδομένα για την ΕΜΤ δημοσιεύτηκαν το 1995 ενώ πάνω από 400 δημοσιεύσεις έχουν γίνει μέχρι σήμερα. 36 Παρ ότι πολλαπλοί δείκτες έχουν περιγραφεί από τότε, η μοριακή βάση της ΕΜΤ δεν είναι ακόμα ξεκάθαρη. 56

57 Τουλάχιστον 11 ΕΜΤ-σχετιζόμενα μοριακά μονοπάτια έχουν περιγραφεί στην βιβλιογραφία μέχρι σήμερα. 36 Παρακάτω αναφέρονται ορισμένοι από τους κύριους παράγοντες που εμπλέκονται στον πολύπλοκο μηχανισμό της ΕΜΤ. Εικόνα 4. Μοριακά μονοπάτια εμπλεκόμενα στον μηχανισμό της ΕΜΤ. Τροποποίηση από Gurzu et al, Το σηματοδοτικό μονοπάτι TGF-β Η οικογένεια TGF-β αποτελείται από μία ομάδα πρωτεϊνών οι οποίες δρουν μέσω διμερών σχηματισμών διαμεμβρανικών υποδοχέων κινάσης. Ο παράγοντας TGF-β φυσιολογικά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων και άρα εμποδίζει την διαδικασία της πρωτοπαθούς καρκινογένεσης. Παρ όλα αυτά φαίνεται πως σε ορισμένα πλαίσια μπορεί να λειτουργεί ως θετικός ρυθμιστής της νεοπλασματικής ανάπτυξης αλλά και μετάστασης. 57

58 Δύο πιθανά σηματοδοτικά μονοπάτια έχουν αναγνωριστεί ως μεσολαβητές στην TGFβεπαγόμενη ΕΜΤ. Το πρώτο μονοπάτι περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Smad. Η σύνδεση των πρωτεϊνών TGF-β σε τετραμερή συμπλέγματα της κυτταρικής επιφάνειας οδηγεί (μέσω των τύπου ΙΙ υποδοχέων) σε φωσφωρυλίωση και άρα ενεργοποίηση των (τύπου Ι) διαμεμβρανικών κινασών, οι οποίες ακολούθως φωσφορυλιώνουν το καρβοξυτελικό άκρο ενδοκυττάριων σηματοδοτικών παραγόντων, δηλαδή των Smads. Oι πρωτεΐνες Smad σχηματίζουν τριμερή συμπλέγματα τα οποία αφού μετακινηθούν στον πυρήνα οδηγούν σε ενεργοποίηση της έκφρασης αλλά και ενίσχυση της δραστηριότητας διαφόρων ΕΜΤ- σχετιζόμενων μεταγραφικών παραγόντων. Συμπληρωματικά προς την σηματοδότηση μέσω των πρωτεϊνών Smads, ο TGF-β μπορεί επίσης να μεταδώσει σήματα μέσω των RHO-like GTPases, PI3K, και MAPK μονοπατιών. 34 Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-catenin Η οικογένεια Wnt αποτελείται από μια μεγάλη ομάδα γλυκοζυλιομένων πρωτεϊνών που εκφράζεται σε ποικίλους ιστούς. Η β-catenin είναι ένα μόριο με δομικό κυρίως ρόλο, συγκεκριμένα συμμετέχει στην ένωση της E cadherin με τα ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού. Στα φυσιολογικά κύτταρα η ελεύθερη β-catenin που υπάρχει στο κυτταρόπλασμα ενώνεται σε ένα σύμπλοκο (το οποίο αποτελείται από τους παράγοντες axin, APC, PP2A και GSK-3β) και ακολούθως απομακρύνεται μέσω ενός συστήματος ουβικουϊτίνης πρωτεασώματος. Κατά τη διαδικασδία της ΕΜΤ ο παράγοντας Wnt συνδέεται με τον διαμεμβρανικό υποδοχέα FRZ, ο οποίος μέσω των Dvl πρωτεϊνών οδηγεί σε απώλεια της δομικής σχέσης μεταξύ των παραγόντων axin και GSK-3β. Ως αποτέλεσμα η GSK-3β αδυνατεί να φωσφορυλιώσει την β-catenin, η οποία παραμένει ελεύθερη μέσα στο κυτταρόπλασμα. Η ελεύθερη β-catenin ακολούθως υπό ορισμένα ερεθίσματα μεταφέρεται στον πυρήνα όπου 58

59 συνδέεται με την οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων TCF με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων (π.χ. c-myc, cyclin D1 κ.α.) που σχετίζονται με την ΕΜΤ και την προώθηση της νεοπλασματικής διαδικασίας. 34 Απώλεια Ε- cadherin Η E-cadherin είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία παίζει κύριο ρόλο στην διατήρηση των κυτταρικών συνδέσεων ανάμεσα σε γειτονικά επιθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, εξωκυτταρίως ενώνεται με τις E-cadherins των γειτονικών επιθηλιακών κυττάρων και ενδοκυτταρίως με τα ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού. Τα επιθηλιακά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την παρουσία της Ε-cadherin ενώ τα μεσεγχυματικά κύτταρα από την παρουσία της Ν- cadherin. Απώλεια των E-cadherins από την κυτταρική μεμβράνη μπορεί να προκύψει από διάφορους μηχανισμούς όπως : μεταλλάξεις του γονιδίου CDH1 που την κωδικοποιεί, υπερμεθυλίωση και «αποσιώπηση» του προαγωγέα του γονιδίου της, αναστολή του υποκινητή του γονιδίου της λόγω δράσης μεταγραφικών παραγόντων (Snail, Slug, Twist), μεταμεταγραφική φωσφορυλίωση και πρωτεολυτική διάσπαση της ίδιας της πρωτεΐνης. Η απώλεια των E cadherins θεωρείται πως παίζει κύριο ρόλο κατά τη διαδικασδία της ΕΜΤ, οδηγώντας σε απελευθέρωση β catenins στο κυτταρόπλασμα και τελικά σε υπερέκφραση μεταγραφικών παραγόντων που συμμετέχουν στην διαδικασία της καρκινογένεσης. Η ελαττωμένη έκφραση της Ε-cadherin αντιρροπείται από την αύξηση στην έκφραση της Ν-cadherin (mesenchymal neural cadherin), που έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του τύπου των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων («cadherin switch»). Μέσω αυτής της διαδικασίας τα μεταβαλλόμενα κύτταρα χάνουν την ισχυρή σύνδεσή τους με τα γειτονικά επιθηλιακά και αποκτούν συγγένεια με μεσεγχυματικά κύτταρα μέσω ομότυπων Ν- cadherin αλληλεπιδράσεων. Αυτές οι δυνάμεις είναι ασθενέστερες από τις ομότυπες Ε- 59

60 cadherin αλληλεπιδράσεις και επομένως διευκολύνουν σημαντικά την κινητικότητα των κυττάρων και άρα την ικανότητα διήθησης και μετάστασης. 34 Μεταγραφικοί παράγοντες Οι αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που συμβάλλουν στην καταστολή του επιθηλιακού φαινότυπου και στην ενεργοποίηση του μεσεγχυματικού φαινότυπου ρυθμίζονται από διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, η έκφραση των οποίων ενεργοποιείται νωρίς στην διαδικασία της ΕΜΤ και έτσι έχουν κύριο ρόλο στην ανάπτυξη, ίνωση και καρκινογένεση. Η συμβολή τους στην ΕΜΤ εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου ή ιστού που εμπλέκεται και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούν την διαδικασία. Συχνά ελέγχουν ο ένας την έκφραση του άλλου, και επιπλέον οι ίδιοι παράγοντες μπορεί να συντονίζουν και την καταστολή αλλά και την ενεργοποίηση της ΕΜΤ. Οι κύριοι μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή είναι oι παρακάτω: Snail : από τις 3 πρωτεΐνες Snail, οι Snail1 (ή αλλιώς Snail) και Snail2 ( ή αλλιώς Slug) ενεργοποιούν την ΕΜΤ κατά την ανάπτυξη, ίνωση και καρκινογένεση. Καταστέλλουν επιθηλιακά γονίδια μέσω δέσμευσης του καρβοξυ-τελικού τμήματός τους (zinc-finger) σε Ε-box αλληλουχίες DNA και ενεργοποιούν γονίδια που συμβάλλουν στην έκφραση μεσεγχυματικού φαινότυπου. Διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια όπως TGF-β, Wnt, Notch καθώς και αυξητικοί παράγοντες (GFs) ενεργοποιούν την έκφραση του Snail. Ο Snail έχει ισχυρή κατασταλτική δράση στην έκφραση της Ε-cadherin και είναι ένας από τους κύριους ενεργοποιητές της ΕΜΤ. Έχει βρεθεί συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του Snail και το στάδιο του όγκου, την υποτροπή, την μετάσταση καθώς και την πτωχή πρόγνωση διαφόρων νεοπλασμάτων

61 Επίσης ο Snail φαίνεται να συμμετέχει στην διαδικασία απόκτησης χαρακτηριστικών αρχέγονων καρκινικών κυττάρων. bhlh : ομοδιμερείς και ετεροδιμερείς basic helix-loop-helix (bhlh) μεταγραφικοί παράγοντες που λειτουργούν σαν βασικοί ρυθμιστές διαφοροποίησης κυττάρων. Ανάμεσα σε αυτούς οι Ε12 και Ε47, Τwist1 και Τwist2, ανασταλτικές της διαφοροποίησης πρωτεΐνες (ID proteins) έχουν κύριο ρόλο στην ΕΜΤ. Στα καρκινικά κύτταρα ο twist1 καταστέλλει την έκφραση της Ε-cadherin και προωθεί την έκφραση της Ν- cadherin ανεξάρτητα από τον παράγοντα Snail και πιθανώς σε συνεργασία με άλλες πρωτεΐνες. 34 ΖΕΒ (Zinc-finger E-box Binding): οι ZEB1 και ΖΕΒ2 δεσμεύουν ρυθμιστικές αλληλουχίες γονιδίων στα Ε-boxes ενεργοποιώντας ή καταστέλλοντας την μεταγραφική μηχανή. Η έκφραση του ΖΕΒ συχνά ακολουθεί την ενεργοποίηση του Snail. Επίσης ο Twist1 συχνά συνεργάζεται με τον Snail για την ενεργοποίηση της έκφρασης του ΖΕΒ1. 34 Πίνακας 4. Παράγoντες ενεργοποίησης και αναστολής των μεταγραφικών παραγόντων Snail, bhlh και ZEB. 34 Snail factors bhlh factors ZEB factors Repression Activation Repression Activation Repression Activation Claudins Fibronectin Claudins Fibronectin ZO1 Vitronectin Occluding Vitronectin Occluding Vitronectin E-cadherin N-cadherin E-cadherin N-cadherin E-cadherin N-cadherin Plakophilin MMPs Desmoplakin Collagen Desmoplakin SPARC Crumbs3 Crumbs3 MMPs Plakoglobin a5 integrin PALS1 Twist, IDs PATJ ZEB1, ZEB2 Cytokeratins 61

62 4.3 ΕΜΤ και καρκίνος Τα καρκινικά κύτταρα για να μπορέσουν να δημιουργήσουν κάποια μετάσταση πρέπει να ολοκληρώσουν μία πολυσταδιακή διαδικασία, που αναφέρεται ως «καταρράκτης διήθησης-μετάστασης» (invasion-metastasis cascade). Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τα εξης βήματα: Τα πρωτοπαθή καρκινικά κύτταρα διαπερνούν την βασική μεμβράνη και φτάνουν στους γύρω ιστούς (διήθηση). Ακολούθως εισέρχονται σε ένα λεμφαγγείο ή αιμοφόρο αγγείο (intravasation). Τα κύτταρα που είναι ικανά να επιβιώσουν στην κυκλοφορία μεταφέρονται σε απομακρυσμένα όργανα. Στο νέο όργανο προσκολλώνται αρχικά στο ενδοθήλιο και μετά εξαγγειώνονται στους γύρω ιστούς όπου παραμένουν κρυφά ή δημιουργούν μικρομεταστάσεις αποτελούμενες από πολύ λίγα κύτταρα. Το τελευταίο στάδιο αφορά στην εξέλιξη μιας μικρομετάστασης σε μακροσκοπικό όγκο και είναι το πιο απαιτητικό, ενώ συχνά πραγματοποιείται μετά από μακρά περίοδο αδράνειας. Η ΕΜΤ παίζει ουσιαστικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία εφόσον επιτρέπει στα κύτταρα να χάσουν τις ισχυρές διακυτταρικές συνδέσεις τους και να αποκτήσουν μεγαλύτερη κινητικότητα με αποτέλεσμα την διήθηση των γύρω ιστών και την είσοδο σε αιμοφόρα αγγεία. Πολλές πειραματικές μελέτες σε ποντίκια και κυτταροκαλλιέργειες έχουν δείξει ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν μεσεγχυματικό φαινότυπο και να εκφράσουν μεσεγχυματικούς δείκτες όπως a-sma, FSP1, vimentin, desmin κ.α. Αυτά τα κύτταρα τυπικά απαντώνται στο διηθητικό μέτωπο των πρωτοπαθών νεοπλασμάτων και θεωρείται ότι αποτελούν τα βασικά κύτταρα που ακολουθούν τα βήματα του «καταρράκτη διήθησης-μετάστασης»

63 Σε επίπεδο ανοσοϊστοχημείας η ΕΜΤ εκφράζεται με αρνητική ρύθμιση επιθηλιακών μορίων κυτταρικής προσκόλλησης όπως, E-cadherin, claudins, α-catenin, γ-catenin, occludin, desmoplakin και plakoglobin, και θετική ρύθμιση δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων όπως, vimentin, Twist1, Twist2, β-catenin, VSIG, N-cadherin, ZEB1, SMA, desmin, Sox, Snail1/Snail, Snail2/Slug, Axl, Notch-1, ETS1, FLT1, stromelysin-3, FOXC2, HOXB7, ACTA2, PDGF, integrin αvβ6. 36 Η ιστολογική ομοιότητα ανάμεσα στα πρωτοπαθή και μεταστατικά νεοπλάσματα δεν έχει ακόμα σαφώς εξηγηθεί. Μία πιθανή εξήγηση είναι ότι η μεταστατική διασπορά που ξεκινάει από την ΕΜΤ ακολουθείται από την αντίστροφη διαδικασία ΜΕΤ (μετατροπή από μεσεγχυματικό σε επιθηλιακό ιστό) για τον αποικισμό των δευτεροπαθών εστιών. 35 Έχει βρεθεί ότι μεταστάσεις από όγκους που αρχικά είχαν έκφραση πυρηνικής β- κατενίνης, επανεκφράζουν Ε-cadherin και κυτταροπλασματική β-κατενίνη. 37 Εναλλακτική πιθανή εξήγηση είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα που έχουν υποστεί ΕΜΤ διατηρούν τον μεσεγχυματικό φαινότυπο στις μεταστατικες εστίες αλλά μέσω ασύμμετρων διαιρέσεων δημιουργούνται περισσότερο διαφοροποιημένοι απόγονοι. 39 Ενώ είναι σχετικά καλά αποδεδειγμένο ότι η ΕΜΤ στα πρώιμα νεοπλάσματα αυξάνει την κινητικότητα των κυττάρων και τον κίνδυνο μετάστασης δεν υπάρχουν πολλά δεδομένα που να συγκρίνουν το προφίλ των δεικτών ΕΜΤ ανάμεσα σε πρωτοπαθή και μεταστατικά νεοπλάσματα. Μέχρι τώρα υπάρχουν λίγα δεδομένα όπως: Ενώ η έκφραση της Ε-cadherin είναι μειωμένη στον πρωτοπαθή όγκο, φαίνεται να επανεκφράζεται σε μεταστατικούς λεμφικούς ιστούς ενώ έχει αρνητική συσχέτιση με την πυρηνική και/ή κυτταροπλασματική β-catenin και τον πυρηνικό Slug. Ενώ η έκφραση του APC είναι χαμηλή στα καρκινικά κύτταρα, βρέθηκε να εκφράζεται πάλι στις ηπατικές μεταστάσεις. 63

64 Η εκτεταμένη αγγειογένεση θεωρείται δείκτης επιθετικότητας των καρκινικών κυττάρων και πτωχής πρόγνωσης. Έχει αποδειχθεί από το 1970 ότι σε συνθήκες υποξίας τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να εκκρίνουν προ-αγγειογενετικούς παράγοντες όπως VEGF-a και HIF-1a. 36 Η πυκνότητα και ο τύπος των νεοσχηματιζόμενων αγγείων αποτελούν προγνωστικούς παράγοντες για τους ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο και δείκτες ανταπόκρισης στην αντι-αγγειογενετική θεραπεία. 40 Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΕΜΤ επηρεάζεται σε καταστάσεις υποξίας, όπου έχει παρατηρηθεί αυξημένη έκφραση των παραγόντων Snail, Slug, Twist, integrin, avβ6. 35 Διάφοροι δείκτες ΕΜΤ έχουν συσχετισθεί με κακή πρόγνωση των ασθενών και αυξημένο κίνδυνο μετάστασης όπως, Slug, Twist, SATB1, CD44, CD133, CD166, ALDH1. Αντίθετα λίγες πληροφορίες υπάρχουν για την σχέση ανάμεσα στο επίπεδο μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI) και την ΕΜΤ. Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα κύτταρα που υφίστανται ΕΜΤ αποκτούν ιδιότητες αρχέγονων κυττάρων (CSCs) και επομένως έχουν μεγαλύτερη ικανότητα αυτοανανέωσης, δημιουργίας μεταστάσεων και επιπλέον είναι πιο ανθεκτικά στα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα Η ΕΜΤ φαίνεται να εμπλέκεται επίσης με την αντίσταση στην χημειοθεραπεία. Οι σηματοδοτικοί μηχανισμοί μέσω των οποίων η ΕΜΤ συμμετέχει στην αντίσταση δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένοι. Πιθανώς η ΕΜΤ προστατεύει τα κύτταρα από την διαδιακασία της απόπτωσης. Εκτός από την αντίσταση στα κλασσικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα, έχει περιγραφεί ήδη αντίσταση και σε στοχευμένες θεραπείες, όπως τα αντι EGFR αντισώματα. Θεωρείται ότι προκύπτει μέσω των Akt/STAT3 γονιδίων ανεξάρτητα από τον EGFR. 42 Μία άλλη πλευρά είναι η φαρμακο-επαγόμενη ΕΜΤ (drug-induced EMT). Η ΕΜΤ σχετιζόμενη με oxaliplatin διαμεσολαβείται από διάφορες ουσίες όπως αντιδραστικά προϊόντα οξυγόνου. 43 Η 5-Fu μπορεί να ενεργοποιήσει την αντίστροφη σηματοδότηση 64

65 c-ephrin-b2 και σαν αποτέλεσμα η EMT και ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων να προωθείται μέσω Src-FAK, and Src-ERK αντίστοιχα. 44 Μία σχετικά καινούρια θεωρία που επιχειρεί να εξηγήσει την αντίσταση στην χημειοθεραπεία, την φαρμακο-επαγόμενη ΕΜΤ και τον κίνδυνο υποτροπής είναι η λεγόμενη «γήρανση των κυττάρων» (cellular senescence), η οποία αναφέρεται σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου που μπορεί να προκληθεί από την ενεργοποίηση τελομερασών Τα κύτταρα που έχουν πολλαπλασιαστεί δεν πεθαίνουν αλλά μπορούν να παραμείνουν σε αδρανή κατάσταση για πολύ καιρό προτού επανενεργοποιηθούν. Η ανακάλυψη των μηχανισμών που επιτρέπουν στα καρκινικά κύτταρα να μεταναστεύουν από την αρχική εστία σε δευτεροπαθείς είναι καίριας σημασίας αφού αυτά τα κύτταρα μπορεί να αποτελέσουν κύριους θεραπευτικούς στόχους για την αναστολή της ανάπτυξης του πρωτοπαθούς όγκου, την πρόληψη υποτροπής και την πρόληψη δημιουργίας μεταστάσεων. 65

66 Κεφάλαιο 5: Καρκινικά αρχέγονα κύτταρα 5.1 Ορισμός CSCs-Ρόλος στην καρκινογένεση Τα καρκινικά αρχέγονα κύτταρα (Cancer stem cells, CSCs) είναι καρκινικά κύτταρα τα οποία χαρακτηρίζονται από ιδιότητες παρόμοιες με αυτές των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, ιδίως από ικανότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης σε ποικίλους κυτταρικούς τύπους. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί μία πολυπαραγοντική διαδικασία που απαιτεί τη συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών μεταβολών. Υπάρχουν ακόμα αρκετά αναπάντητα ερωτήματα που αφορούν στην διαδικασία της καρκινογένεσης, όπως ποιο είναι τα αρχικό κύτταρο υπεύθυνο για την καρκινογένεση και ποιος ο τύπος των κυττάρων που πρωοθούν την περεταίρω νεοπλασματική ανάπτυξη. Με βάση αυτά τα ερωτήματα έχουν αναπτυχθεί δύο κύρια μοντέλα νεοπλασματικής ανάπτυξης. 47 Στοχαστικό μοντέλο : σύμφωνα με το μοντέλο αυτό οποιοδήποτε κύτταρο είναι ικανό για την έναρξη και συνέχιση της ανάπτυξης της νεοπλασματικής εξεργασίας. Ιεραρχικό μοντέλο : προτείνεται ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι ιεραρχικά ταξινομημένα μέσα στον όγκο και σύμφωνα με αυτό μόνο τα αρχέγονα καρκινικά κύτταρα έχουν κακόηθες δυναμικό, πράγμα που τα καθιστά πιθανό θεραπευτικό στόχο. Το εντερικό επιθήλιο αποτελείται από δύο δεξαμενές εντερικών αρχέγονων κυττάρων (ΙSCs), τα βασικά χαρακτηριστικά των οποίων περιγράφονται στον πίνακα 4. 66

67 Πίνακας 5. Χαρακτηριστικά ενεργών και αποθεματικών εντερικών αρχέγονων κυττάρων 48 Eνεργά ΙSCs Aποθεματικά ISCs Κύρια εντόπιση Βασική μεμβράνη κρύπτης Θέση +4 κρύπτης Κυτταρικός κύκλος Ενεργός Αργός Κύρια λειτουργία Ικανότητα διαφοροποίησης Κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι Διατήρηση της επιθηλιακής ομοιόστασης σε φυσιολογικές συνθήκες Ναι Wnt/β-catenin Αναγέννηση του επιθηλίου μετά από τραυματισμό Ναι Άγνωστο (ανεξάρτητο όμως από Wnt/β-catenin) Συχνά γονίδια Lgr5 Bmi1, HopX, Lrig1, mtert Τα κύτταρα των δύο δεξαμενών θεωρείται ότι μπορούν να μετατρέπονται το ένα στο άλλο, διατηρώντας όμως ποσοτική ισορροπία μεταξύ τους. Παρ ότι ο ρόλος των εντερικών αρχέγονων κυττάρων στην ομοιόσταση και αναγέννηση του επιθηλίου έχει διερευνηθεί αρκετά, δεν έχουν βρεθεί ευρέως αποδεκτοί μοριακοί δείκτες που να ξεχωρίζουν σαφώς τα φυσιολογικά εντερικά (ISCs) από τα καρκινικά αρχέγονα (CSCs) κύτταρα

68 5.2 Δείκτες αρχέγονων κυττάρων Στον πίνακα 6 αναφέρονται ορισμένοι δείκτες που εκφράζονται σε φυσιολογικά και καρκινικά αρχέγονα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου. Πίνακας 6. Δείκτες φυσιολογικών και καρκινικών αρχέγονων εντερικών κυττάρων. 49 Δείκτες SCs σε φυσιολογικό εντερικό επιθήλιο Msi-1 Hes-1 Integrin-β1(CD29) Eph-B receptors Mbi-1 Lgr-5 ALDH-1 DCAMKL-1 CD133 (Prominin-1) Tert Ascl-2 Δείκτες SCs σε καρκίνο του παχέος εντέρου CD133 (Prominin-1) CD44 CD166 (ALCAM) CD24 ALDH-1 CD29 (β1-integrin) Msi-1 Wnt pathway activity, β-catenin Lgr-5 EpCAM (ESA) CD26 Oct-4,Sox-2, Nanog, Lin-28, Klf-4, c-myc Mbi-1, CDX-2 68

69 5.3 Ρόλος των CSCs στην υποτροπή νόσου και στην αντίσταση στην χημειοθεραπεία Tα καρκινικά αρχέγονα κύτταρα έχουν ιδιότητες που τα καθιστούν ιδανικά για τη νεοπλασματική ανάπτυξη, την υποτροπή της νόσου αλλά και την αντίσταση στην χημειοθεραπεία. Είναι πολυδύναμα κύτταρα με: ικανότητα αυτοανανέωσης απεριόριστη δυνατότητα πολλαπλασιασμού αγγειογενετικές ιδιότητες και ικανότητα αποφυγής του ανοσοποιητικού συστήματος Πιο συγκεκριμένα τα CSCs θεωρείται πως παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση των νεοπλασματικών κυττάρων στην χημειοθεραπεία, με διάφορους τρόπους: 39 Αποτελούν ξεχωριστή δεξαμενή κυττάρων μέσα στον όγκο που δεν καταστρέφεται από την συμβατική χημειοθεραπεία. Έχουν αργό ρυθμό πολλαπλασιασμού ενώ πολλά από αυτά βρίσκονται σε δεδομένη στιγμή σε φάση ηρεμίας. Τα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σκευάσματα στοχεύουν μόνο ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Εκφράζουν πρωτεΐνες που σχετίζονται με πολυανθεκτικότητα στην χημειοθεραπεία (MDR proteins) και πρωτεΐνες της ATP-Binding Cassette οικογένειας μεταφορέων (ABC) που διευκολύνουν την απομάκρυνση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων από τα κύτταρα. Πειραματικά δεδομένα επίσης υποστηρίζουν την θεωρία ότι τα καρκινικά αρχέγονα κύτταρα είναι υπεύθυνα για την αντίσταση στην χημειοθεραπεία και την υποτροπή νόσου Έχει βρεθεί π.χ. ότι ο πληθυσμός των CD133+ κυττάρων στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται με αντίσταση στην αντι-αγγειογενετική θεραπεία. 69

70 Σε όλη τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου τα CSCs παραμένουν περίπου σε ποσοστό 1% του συνολικού αριθμού των νεοπλασματικών κυττάρων. 47 Με τις υπάρχουσες τεχνικές υποστηρίζεται πως υποεκτιμάται σημαντικά ο πληθυσμός των κυκλοφορούντων καρκινικών κυτταρων (Circulating Tumor Cells, CTCs) που έχουν χαρακτηριστικά αρχέγονων κυττάρων και επιθήλιο-μεσεγχυματικής μετατροπής Η σχεδίαση στοχευμένων παρεμβάσεων στα αρχέγονα καρκινικά κύτταρα μπορεί να ενισχύσει τη θεραπευτική ανταπόκριση και να μειώσει την πιθανότητα τοπικής υποτροπής αλλά και μετάστασης. 47 Παρ ότι μία θεραπεία στοχευμένη στα CSCs δεν θα οδηγήσει σε συρρίκνωση του όγκου βραχυπρόθεσμα, θα αποτρέψει όμως πιθανώς μελλοντική υποτροπή και μετάσταση. Οι νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις για να είναι επιτυχείς πρέπει να μπορούν να καταστρέψουν όλα τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, να ξεριζώσουν την δεξαμενή των CSCs και να εξαφανίσουν όλα τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCs) συμπεριλαμβανομένων και αυτών που βρίσκονται σε αδρανή κατάσταση. 70

71 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 71

72 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 6: Σκοπός μελέτης Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την 2 η συχνότερη αιτία θανάτου στην Ευρώπη από καρκίνο (μετά από τον καρκίνο του πνεύμονα). H διήθηση μετάσταση και η αντίσταση στην χημειοθεραπεία αποτελούν σημαντικά αίτια νοσηρότητας και θνητότητας στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Σύμφωνα με μελέτες η διεργασία της επιθήλιο - μεσεγχυματικής μετατροπής (ΕΜΤ) παίζει σημαντικό ρόλο στην διήθηση και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων επιθηλιακής αρχής και επιπλέον φαίνεται να εμπλέκεται και στην δημιουργία κυττάρων με ιδιότητες αρχέγονων καρκινικών κυττάρων (Cancer Stem Cells -CSCs). Πολλά μάλιστα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα αρχέγονα καρκινικά κύτταρα αποτελούν σημαντικότατο παράγοντα που προάγει την υποτροπή και αντίσταση στην χημειοθεραπεία. Με βάση τα παραπάνω υποθέτουμε ότι η ΕΜΤ και τα αρχέγονα καρκινικά κύτταρα (CSCs) μπορεί να εμπλέκονται στην διήθηση, μετάσταση αλλά και στην αντίσταση στην χημειοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Για να δοκιμάσουμε αυτήν την υπόθεση μελετήσαμε την έκφραση τoυ δείκτη-ρυθμιστή της ΕΜΤ Snail και την έκφραση των δεικτών αρχέγονων καρκινικών κυττάρων Lgr5, CD133 και CD44 με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας σε ιστικά δείγματα καρκινώματος παχέος εντέρου. Ακολούθως εκτιμήσαμε την σχέση αυτών των δεικτών με κλινικές και παθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου όπως: ο βαθμός διαφοροποίησης το βάθος διήθησης η παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων το στάδιο της νόσου και 72

73 η ανταπόκριση των ασθενών με μεταστατική νόσο στην χημειοθεραπεία βασισμένη σε 5-φθοριοουρακίλη 73

74 Κεφάλαιο 7: Υλικά και μέθοδοι 7.1 Ιστικά δείγματα Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τους κανόνες ηθικής και δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε στην μελέτη ήταν αρχειακό υλικό παρασκευασμάτων καρκινώματος παχέος εντέρου μονιμοποιημένων σε φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη από το αρχεία των Εργαστηρίων Παθολογικής Ανατομίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών και του Γενικού Νομαρχιακού Νοσοκομείου Πατρών «Άγιος Ανδρέας». Τα ιστικά παρασκευάσματα (κύβοι παραφίνης) προέρχονται από 114 καρκινώματα παχέος εντέρου. Από αυτά τα περιστατικά 31 αφορούσαν σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική χειρουργική επέμβαση ή διαγνωστική βιοψία για καρκίνωμα παχέος εντέρου σταδίου IV (απομακρυσμένες μεταστάσεις) και ακολούθως έλαβαν χημειοθεραπεία με σχήματα βασισμένα στην 5-φθοριοουρακίλη (FOLFOX ή FOLFIRI). Η σταδιοποίηση των όγκων έγινε σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ (7η έκδοση). Οι πληροφορίες για τα παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά, όπως ο βαθμός διαφοροποίησης του όγκου, οι παράμετροι Τ (βάθος διήθησης) και Ν (λεμφαδενικές μεταστάσεις) κατεγράφησαν από τις διαθέσιμες πληροφορίες των παθολογοανατομικών εκθέσεων των ασθενών, μετά από την επανεκτίμηση των ιστικών παρασκευασμάτων. Οι κλινικές πληροφορίες για την πορεία της νόσου και την ανταπόκριση στην θεραπεία συνελέγησαν από τους φακέλους των ιστορικών των ασθενών του Ογκολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Τα κλινικά και παθολογονατομικά χαρακτηριστικά των όγκων παρουσιάζονται στον πίνακα 7. Για τους σκοπούς της στατιστικής ανάλυσης οι ασθενείς με μεταστατική νόσο (σταδίου AJCC IV) χωρίσθηκαν σε δυο ομάδες σύμφωνα με την ανταπόκρισή τους στη 74

75 χημειοθεραπεία. Η πρώτη ομάδα περιελάμβανε 17 ασθενείς που έδειξαν ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία (ύφεση νόσου στους 6 μήνες) και η δεύτερη ομάδα περιελάμβανε 14 περιστατικά ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία (πρόοδος νόσου ή υποτροπή στους 6 μήνες). Πίνακας 7. Κλινικά-παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου. Ν Grade I 9 Grade Grade II 64 Grade III 54 Depth of invasion LN T1 + T2 31 T3 + T4 82 Cases with (-) LN 54 Cases with (+) LN 59 AJCC I 31 Stage AJCC II 21 AJCC III 31 AJCC IV 31 75

76 Πίνακας 8. Κλινικά-παθολογονατομικά χαρακτηριστικά των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου Σταδίου IV. Καρκινώματα παχέος εντέρου (n=31) n%) Φύλο Άνδρες 15/31(48.4%) Γυναίκες 16/31 (51.6%) Εντόπιση Δεξιό κόλον 11/31 (35.5%) Αριστερό κόλον 17/31 (54.8%) Ορθό 3 (9.7%) pt pt3 23/30 (74.2) pt4 7/30 (22.6%) pn pno 2/30 (6.5%) pn1 11/30 (35.5%) pn2 17/30 (54.8%) Grade ΙΙ 19/31 (61.3%) ΙΙΙ 12/31 (38.7%) Ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία Ναι 17 (54.8) Όχι 14 (45.2) 76

77 7.2 Ανοσοϊστοχημεία Βασικές Αρχές της Ανοσοϊστοχημείας Η ανοσοϊστοχημεία είναι μια τεχνική ανάδειξης αντιγόνων σε τομές ιστών με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων η οποία βασίζεται στην αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος. Η εντόπιση των αντιγόνων γίνεται ορατή με τη χρήση ειδικών δεικτών (π.χ. φθορίζον χρώμα, ένζυμο, ραδιενεργό στοιχείο) κάτω από παρατήρηση με φωτονικό ή ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Η βάση της ανοσοϊστοχημείας αποτελεί τη γέφυρα ανάμεσα σε τρία επιστημονικά πεδία : την ανοσολογία, την ιστολογία και τη χημεία. H ανοσοϊστοχημεία αφορά στην ειδική αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος και υπερτερεί έναντι των άλλων παραδοσιακών τεχνικών χρώσης οι οποίες αναγνωρίζουν μόνο ένα περιορισμένο αριθμό πρωτεϊνών, ενζύμων και δομών του ιστού. Πρόκειται για μια τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλά ερευνητικά εργαστήρια. Τα κύρια βήματα της μεθόδου αναφέρονται συνοπτικά παρακάτω: Προετοιμασία του ιστού Για να παραμείνει αναλλοίωτη η αρχιτεκτονική του ιστού και η μορφολογία του κυττάρου, απαιτείται άμεση και επαρκής μονιμοποίηση. Η λανθασμένη ή καθυστερημένη μονιμοποίηση μπορεί να ελαττώσει σημαντικά την ικανότητα πρόσδεσης του αντισώματος. Ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα μονιμοποιητικά είναι η φορμαλδεΰδη. Το τελικό αποτέλεσμα της μονιμοποίησης με φορμαλδεΰδη είναι μια έντονη αλλαγή στη τριτοταγή και τεταρτοταγή δομή των πρωτεϊνών η οποία μπορεί να δυσκολέψει ιδιαίτερα την αναγνώριση των αντιγόνων από τα αντισώματα. Η πρωτοταγής και η δευτεροταγής δομή των πρωτεϊνών επηρεάζονται ελάχιστα. 77

78 Ανάκτηση αντιγόνου Για την βελτίωση της ανάδειξης των αντιγόνων που δεν είναι εμφανή μετά από την διαδικασία της μονιμοποίησης με φορμαλδεΰδη γίνεται επεξεργασία με παράγοντες ανάκτησης αντιγονικών επιτόπων, οι οποίοι διασπούν τα διασταυρούμενα πολυμερή των πρωτεϊνών που έχουν σχηματιστεί και αποκαλύπτουν τις κρυμμένες αντιγονικές θέσεις. Μία συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η «Θερμοεπαγώμενη ανάκτηση επιτόπου» (HIER). Η τεχνική αυτή περιλαμβάνει την εφαρμογή υψηλών θερμοκρασιών σε κάποιο υδάτινο διάλυμα (διάλυμα ανάκτησης) για ορισμένο χρονικό διάστημα. Μία λιγότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος που βασίζεται στην ενζυμική πέψη είναι η «Πρωτεολυτική επαγωγή ανάκτησης επιτόπων» (PIER). Μείωση των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος Η ανεπαρκής ή καθυστερημένη μονιμοποίηση του ιστού είναι δυνατόν να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω μη επιθυμητής διάχυσης των αντιγόνων. Η μη ειδική χρώση background είναι η μη ανοσολογική πρόσδεση του ειδικού ανοσοορού εξαιτίας υδροφοβικών και ηλεκτροστατικών δυνάμεων σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στις τομές. Απαλοιφή της ενεργότητας της ενδογενούς υπεροξειδάσης Οι περισσότεροι ιστοί έχουν ενδογενή υπεροξειδάση. Για την μείωση των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων είναι απαραίτητη η απαλοιφή της ενδογενούς υπεροξειδάσης με την χρήση διαλύματος υπεροξειδίου πριν την επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα. Επώαση των τομών ιστού με το πρωτογενές αντίσωμα Η ειδικότητα της μεθόδου εξασφαλίζεται με την χρήση αρνητικών μαρτύρων, δηλαδή τομών ιστού που δεν έχουν επωαστεί με το πρωτογενές αντίσωμα αλλά με φυσιολογικό ορό. Έμμεση Ανοσοϊστοχημική Μέθοδος Η έμμεση μέθοδος περιλαμβάνει αρχικά την εφαρμογή ενός μη σημασμένου πρωτογενούς αντισώματος το οποίο αντιδρά με το αντιγόνο του ιστού. Ακολουθεί η εφαρμογή ενός σημασμένου δευτερογενούς αντισώματος το οποίο αντιδρά με το πρωτογενές. Το δεύτερο 78

79 αντίσωμα πρέπει να είναι αντί του IgG του ζωικού είδους στο οποίο το αντίσωμα δημιουργήθηκε. Αυτή η μέθοδος είναι περισσότερο ευαίσθητη σε σχέση με την άμεση λόγω του ενισχυμένου σήματος που προκύπτει. Υπάρχουν διάφορες έμμεσες τεχνικές που χρησιμοποιούνται όπως η μέθοδος με πολυμερή EnVision που εφαρμόστηκε στην παρούσα μελέτη. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται σε πολυμερή δεξτράνης που υπάρχουν δεσμευμένα στα δευτερογενή αντισώματα και τα οποία φέρουν μεγάλο αριθμό ενζύμων όπως υπεροξειδάση ή αλκαλική φωσφατάση. Η ανάδειξη του αποτελέσματος πραγματοποιείται με τη χρήση χρωμογόνου-υποστρώματος (3,3 διαμινοβενζίδινο/dab) που θα διαντιδράσει με το ένζυμο που φέρεται στα πολυμερή και θα δώσει χαρακτηριστική χρώση στον ιστό. Το πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι η εξοικονόμηση χρόνου, η μεγαλύτερη ευαισθησία και η ελάττωση του μη ειδικού σήματος. Η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας ολοκληρώνεται με εμβάπτιση των πλακιδίων που φέρουν τους ήδη σημασμένους ιστούς σε αιματοξυλίνη ώστε να αποκτήσουν οι πυρήνες των κυττάρων μία χαρακτηριστική μπλε χρώση για να μπορούν να διακρίνονται μεταξύ τους. Η εκτίμηση του αποτελέσματος γίνεται με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε στην παρούσα μελέτη ήταν συνοπτικά το ακόλουθο: Η μελέτη της έκφρασης των δεικτών Snail, Lgr5, CD44 και CD133 στα πρωτοπαθή καρκινώματα του παχέος εντέρου πραγματοποιήθηκε με την ανοσοενζυμική ανοσοϊστοχημική μέθοδο υπεροξειδάσης DAB με πολυμερή δεξτράνης σε τομές παραφίνης (Envision detection system, DAKO). Πραγματοποιήθηκε αποπαραφίνωση των τομών στους 60 C με διάλυμα ξυλόλης, ακολουθούμενη από ενυδάτωση των τομών σε κατιούσα σειρά αλκοολών. Η ανάδειξη των αντιγονικών επιτόπων έγινε με θέρμανση των τομών σε 10mM κιτρικό νάτριο ph 6.0 σε φούρνο μικροκυμάτων. 79

80 Για την κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης των ιστών οι τομές επωάστηκαν με διάλυμα 0.3% H2O2 σε απιονισμένο H2O επί 20 min. Για την αποφυγή της μη ειδικής δέσμευσης των αντισωμάτων έγινε επώαση των τομών με κατάλληλο διάλυμα πρωτεϊνικής δέσμευσης (protein blocking solution). Ακολούθως, οι τομές επωάστηκαν με τα ειδικά αντισώματα στην κατάλληλη αραίωση για 12 ώρες (overnight) σε θερμοκρασία 4 C. Η αραίωση και οι συνθήκες επώασης των αντισωμάτων ήταν αυτές που συνδύαζαν το βέλτιστης έντασης σήμα με το μικρότερο δυνατό βαθμό μη-ειδικής χρώσης (background staining) (πίνακας 9). H δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων ανιχνεύθηκε κατά περίπτωση με το σύστημα Envision Detection Kit (DAKO) και χρωμογόνο το DAB. Ακολούθησε χρώση αντίθεσης των πυρήνων με αιματοξυλίνη, εμβάπτιση σε ξυλόλη και επικόλληση καλυπτρίδων. Για τον έλεγχο της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες (negative control), τομές ιστού που επεξεργάστηκαν σύμφωνα με την μέθοδο χωρίς όμως την προσθήκη πρωτογενούς αντισώματος καθώς και τομές που περιείχαν φυσιολογικό ιστό παρακείμενα του όγκου (ενδογενές αρνητικό control). 80

81 Πίνακας 9. Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας (αραίωση-βέλτιστες συνθήκες επώασης). Antibody Type Source Dilution Snail P Acris 1:40 Protein blocking TBS/ΒSA 2% Detection Envision Lgr5 M Sigma 1:2000 TBS/ΒSA 2% Envision CD44 M Novocastra 1:100 TBS/ΒSA 2% Envision CD133 M Millipore 1:80 TBS/ΒSA 2% Envision P= polyclonal rabbit; M=monoclonal mouse; TBS: tris-buffered saline; BSA: bovine serum albumin. Πίνακας 10. Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στην μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Tris-buffer 0.05 M (ph 7.6) Tris-buffer saline (TBS) (ph 7.6) TBS/BSA 2% Κιτρικό Νάτριο 0.01M (ph 6.00) 6.1 gr Tris σε 1000ml απιονισμένο H 2 O - Ρύθμιση ph με 1N HCL 100ml Tris και 900ml δ/τος NaCl 0.1gr Bovine Serum Albumin (BSA) (Serva) σε 1 ml TBS 2.1 gr κιτρικού νατρίου σε 1000ml απιονισμένο H 2 O 0.3% H 2 O 2 3ml 30% H2O2 σε 97 ml απιονισμένο H 2 O 81

82 7.3 Εκτίμηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης Η εκτίμηση της έντασης της ανοσοχρώσης και του ποσοστού των θετικών κυττάρων του όγκου (κατανομή της ανοσοχρώσης) έγινε με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου. Για όλες τις πρωτεΐνες η πυρηνική, κυτταροπλασματική και μεμβρανική ανοσοχρώση όπου παρατηρήθηκαν, βαθμονομήθηκαν ξεχωριστά. Έγινε ημιποσοτική εκτίμηση της έκφρασης βασιζόμενη στην εκτίμηση τόσο της έντασης της χρώσης (κλίμακα από 0 έως 3 ως εξής 0: απουσία χρώσης, 1: χρώση ασθενούς έντασης, 2: χρώση μέτριας έντασης και 3: έντονη χρώση) όσο και του ποσοστού των θετικών κυττάρων (κατανομή) σε μία κλίμακα από ως ακολούθως: Histoscore (H-score) = (1 ποσοστό κυττάρων όγκου με ασθενή ένταση χρώσης)+(2 ποσοστό κυττάρων όγκου με μέτρια ένταση χρώσης)+(3 ποσοστό κυττάρων όγκου με έντονη χρώση). 7.4 Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS v.21 για Windows. Για τον έλεγχο της σημαντικότητας των διαφορών μεταξύ των διαφόρων ομάδων των κλινικών και παθολογοανατομικών παραμέτρων όπως ο ιστολογικός τύπος, ο βαθμός διαφοροποίησης, το βάθος διήθησης, η παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων, το στάδιο της νόσου και η ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία ως προς την έκφραση των δεικτών Snail, Lgr5, CD133 και CD44, οι μεταβλητές διάταξης αναλύθηκαν με τα μη παραμετρικά τεστ Kruskal-Wallis (για k ανεξάρτητα δείγματα) και Mann Whitney (για 2 ανεξάρτητα δείγματα). Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των διαφόρων πρωτεϊνών (Η-scores) ελέγχτηκε με Spearman Rank Order Correlation test. Για το έλεγχο της προβλεπτικής σημασίας 82

83 των πρωτεϊνών αυτών σχετικά με το στάδιο, τις λεμφαδενικές μεταστάσεις και την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία (ταυτοποίηση ανεξάρτητων προβλεπτικών παραγόντων) χρησιμοποιήθηκε Multivariate regression analysis με την χρήση της μεθόδου Enter. Οι παράμετροι που συμπεριελήφθησαν στην ανάλυση multivariate regression ως μεταβλητές πρόβλεψης (predictor variables) ήταν αυτές που έδειξαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την εξαρτώμενη μεταβλητή στα μη-παραμετρικά τεστ. Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις οι τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. 83

84 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 84

85 Κεφάλαιο 8: Αποτελέσματα 8.1 Δείκτες ΕΜΤ Η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Snail στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με παραμέτρους προαγωγής των όγκων Η ανσοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail μελετήθηκε σε 92 καρκινώματα παχέος εντέρου. Στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο η ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα Snail ήταν αρνητική. Αντιθέτως 80/92 (87%) περιστατικά καρκινώματος παχέος εντέρου εμφάνισαν θετική χρώση για τον Snail με πυρηνική ή πυρηνική και κυτταροπλασματική εντόπιση, με τιμές Η-score από και μέση τιμή έκφρασης (72.6±6.9). Η ανοσοϊστοχημική έκφραση ήταν εντονότερη στο διηθητικό μέτωπο του όγκου. Επιπλέον θετική ανοσοχρώση για τον Snail παρατηρήθηκε και σε κύτταρα του στρώματος. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανoσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail (Hscore) διαφέρει στατιστικώς σημαντικά σε σχέση με το βάθος διήθησης (Kruskal-Wallis, p<0.001), την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (Mann-Whitney, p<0.001) και το στάδιο της νόσου (Kruskal-Wallis, p<0.001) ενώ δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων (Kruskal-Wallis, p=0.582). Όπως φαίνεται από τον πίνακα 11 και τα διαγράμματα 1,2,3 η έκφραση του παράγοντα Snail είναι σημαντικά μεγαλύτερη όσο αυξάνεται το βάθος διήθησης, και το στάδιο και επιπλέον είναι σημαντικά μεγαλύτερη στους ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις. 85

86 Διάγραμμα 1. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail σε σχέση με το βαθος διήθησης των όγκων. Διάγραμμα 2. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail σε σχέση με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. 86

87 Διάγραμμα 3. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail σε σχέση με το στάδιο της νόσου. 87

88 Πίνακας 11. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail (H-score) στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με τις παθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου. Grade Depth of invasion LN Stage Snail (H-score) Mean Standard Media Error of n Mean grade I grade II grade III T1 + T T3 + T cases with (-) LN cases with (+) LN AJCC I AJCC II AJCC III AJCC IV

89 Εικόνα 5. Ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail στον καρκίνο του παχέος εντέρου Α. Αρνητική χρώση στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο Β. Αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος με ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση στα κύτταρα του όγκου Γ. Αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου με πυρηνική χρώση στα κύτταρα του όγκου 89

90 Η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Snail στην μεταστατική νόσο δεν σχετίζεται με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Ακολούθως εξετάσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Snail σε ιστικά δείγματα καρκίνου παχέος εντέρου 31 ασθενών με νόσο σταδίου IV (απομακρυσμένες μεταστάσεις) που έλαβαν χημειοθεραπεία βασισμένη στην 5- φθοριουρακίλη (FOLFOX ή FOLFIRI). Θετική πυρηνική ανοσοδραστικότητα για τον παράγοντα βρέθηκε σε 31/31 (100%) περιστατικά με τιμές H-score από 10 έως 250 και μέση τιμή (118.7 ±12). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail δεν διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ ασθενών που ανταποκρίθηκαν και δεν ανταποκρίθηκαν στην χημειοθεραπεία (p=0.339). Πίνακας 12. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail (H-score) σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Snail (H-score) Mean Standard Error of Mean Median Response Responders Non-responders

91 Διάγραμμα 4. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Snail σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. 91

92 8.2 Δείκτες CSCs Η έκφραση του παράγοντα Lgr5 στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με παραμέτρους προαγωγής των όγκων Η ανσοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 μελετήθηκε σε 114 καρκινώματα παχέος εντέρου. Στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο η ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα Lgr5 ήταν αρνητική. Αντιθέτως 99/114 (87%) περιστατικά καρκινώματος παχέος εντέρου εμφάνισαν θετική χρώση για τον Lgr5 με κυτταροπλασματική (+/- πυρηνική) εντόπιση, με τιμές Η-score από και μέση τιμή έκφρασης (56.8±5.6). Η ανοσοϊστοχημική έκφραση ήταν εντονότερη στο διηθητικό μέτωπο του όγκου. Επιπλέον θετική ανοσοχρώση για τον Lgr5 παρατηρήθηκε και σε κύτταρα του στρώματος ιδιαίτερα σε λιποκύτταρα. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανσοσοϊστοχημική έκφραση του Lgr5 (H-score) διαφέρει στατιστικώς σημαντικά σε σχέση με το βάθος διήθησης (Kruskal-Wallis, p<0.001), την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (Mann-Whitney, p<0.001) και το στάδιο της νόσου (Kruskal-Wallis, p<0.001), ενώ δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων (Kruskal-Wallis, p=0.081). Όπως φαίνεται από τον πίνακα 13 και τα διαγράμματα 5,6,7 η έκφραση του Lgr5 είναι σημαντικά μεγαλύτερη όσο αυξάνεται το βάθος διήθησης και το στάδιο και επιπλέον είναι σημαντικά μεγαλύτερη στους ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις. 92

93 Πίνακας 13. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 (H-score) στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με τις παθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου. Grade Depth of invasion LN Stage Mean Lgr5 (H-score) Standard Error of Mean Median grade I grade II grade III T1 + T T3 + T cases with (-) LN cases with (+) LN AJCC I AJCC II AJCC III AJCC IV

94 Διάγραμμα 5. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 σε σχέση με το βαθος διήθησης των όγκων. Διάγραμμα 6. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 σε σχέση με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. 94

95 Διάγραμμα 7. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 σε σχέση με το στάδιο της νόσου. 95

96 Εικόνα 6. Ανοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη Lgr5 στον καρκίνο του παχέος εντέρου Α. Αρνητική χρώση στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο Β. Ισχυρή κυτταροπλασματική και πυρηνική ανοσοχρώση σε λιποκύτταρα Γ. Ασθενής χρώση σε ένα αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου Σταδίου Ι 96

97 Εικόνα 7. Ανοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη Lgr5 στον καρκίνο του παχέος εντέρου Δ. Αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου με ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση στα κύτταρα του όγκου και σε ινοβλάστες στο στρώμα Ε. Αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου με πυρηνική ανοσοχρώση ΣΤ. Ισχυρή ανοσοϊστοχημική έκφραση στο διηθητικό μέτωπο του όγκου 97

98 Η έκφραση του παράγοντα Lgr5 στην μεταστατική νόσο δεν σχετίζεται με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Ακολούθως εξετάσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Lgr5 σε 31 ιστικά δείγματα καρκίνου παχέος εντέρου ασθενών με νόσο σταδίου IV που έλαβαν χημειοθεραπεία βασισμένη στην 5-φθοριοουρακίλη (FOLFOX ή FOLFIRI). Θετική ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα Lgr5 με κυτταροπλασματική κυρίως εντόπιση βρέθηκε σε 28/31 (90.3%) περιστατικά με τιμές H-score από 0 έως 190 και μέση τιμή (59.8 ±10.3). Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του Lgr5 σύμφωνα με την στατιστική ανάλυση δεν διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ ασθενών που ανταποκρίθηκαν και δεν ανταποκρίθηκαν στην χημειοθεραπεία (p=0.215). Πίνακας 14. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 (H-score) σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Lgr5 (H-score) Respo nse Respond ers Nonresponde rs Mean Median Standard Minim Maxim p- Error of um um value Mean

99 Διάγραμμα 8. Ραβδόγραμμα που απεικονίζει την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 (H-score) σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Διάγραμμα 9. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα Lgr5 σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. 99

100 Η έκφραση του δείκτη CD133 στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με παραμέτρους προαγωγής των όγκων. Η ανσοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD133 μελετήθηκε σε 92 καρκινώματα παχέος εντέρου. Στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο η ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη CD133 ήταν αρνητική. Αντιθέτως 68/92 (74%) περιστατικά καρκινώματος παχέος εντέρου εμφάνισαν θετική χρώση για τον δείκτη CD133 με κυτταροπλασματική (+/- πυρηνική) εντόπιση, με τιμές Η-score από και μέση τιμή έκφρασης (50+/-5.5). Επιπλέον θετική ανοσοχρώση για τον δείκτη CD133 παρατηρήθηκε και σε κύτταρα του στρώματος. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανσοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD133 (Hscore) διαφέρει στατιστικώς σημαντικά σε σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης (Kruskal- Wallis, p=0.004) το βάθος διήθησης (Kruskal-Wallis, p<0.001), την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (Mann-Whitney, p<0.001) και το στάδιο της νόσου (Kruskal-Wallis, p<0.001). Όπως φαίνεται από τον πίνακα 15 και τα διαγράμματα 10,11,12 η έκφραση του CD133 είναι σημαντικά μεγαλύτερη όσο αυξάνεται ο βαθμός διαφοροποίησης, το βάθος διήθησης, και το στάδιο και επιπλέον είναι σημαντικά μεγαλύτερη στους ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις. 100

101 Πίνακας 15. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 (H-score) στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με τις παθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου. Grade Depth of invasion LN Stage CD133 (H-score) Mean Standard Error of Mean Median grade I grade II grade III T1 + T T3 + T cases with (-) LN cases with (+) LN AJCC I AJCC II AJCC III AJCC IV

102 Διάγραμμα 10. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 σε σχέση με τoν βαθμό διαφοροποίησης. Διάγραμμα 11. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 σε σχέση με το βάθος διήθησης. 102

103 Διάγραμμα 12. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 σε σχέση με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. Διάγραμμα 13. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 σε σχέση με το στάδιο της νόσου. 103

104 Εικόνα 8. Ανοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD133 στον καρκίνο του παχέος εντέρου Α. Αρνητική χρώση στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο Β. Ασθενής κυτταροπλασματική και πυρηνική ανοσοχρώση σε ένα αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου Γ. Αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου με ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση στα κύτταρα του όγκου 104

105 Η έκφραση του δείκτη CD133 στην μεταστατική νόσο δεν σχετίζεται με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Ακολούθως εξετάσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία βασισμένη στην 5-φθοριοουρακίλη στους ασθενείς με μεταστατική νόσο (n=31). Θετική ανοσοϊστοχημική χρώση με κυτταροπλασματική κυρίως εντόπιση βρέθηκε σε 26/31 (83.9%) περιστατικά με τιμές H-score από 0 έως 220 και μέση τιμή (60 ±10). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανοσοϊστοχημική έκφραση του CD133 δεν διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ ασθενών που ανταποκρίθηκαν και δεν ανταποκρίθηκαν στην χημειοθεραπεία (p=0.444). Πίνακας 16. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 (H-score) σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. CD133 (H-score) Respo nse Responder s Nonresponders Mean Standard Media Minim Error of n um Mean Maxim um p- value

106 Διάγραμμα 14. Ραβδόγραμμα που απεικονίζει την ανοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD133 (H-score) σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Διάγραμμα 15. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD133 σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. 106

107 Η έκφραση του δείκτη CD44 στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με παραμέτρους προαγωγής των όγκων. Η ανσοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD44 μελετήθηκε σε 92 καρκινώματα παχέος εντέρου. Η έκφραση του CD44 στο παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο περιοριζόταν στη βάση των κρυπτών όπου και εντοπίζονται τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα του εντερικού επιθηλίου. Συνολικά 45/92 (49%) περιστατικά καρκινώματος παχέος εντέρου εμφάνισαν θετική χρώση για τον δείκτη CD44 με μεμβρανική κυρίως εντόπιση, με τιμές Η-score από και μέση τιμή έκφρασης (32.9±6). Επιπλέον θετική ανοσοχρώση για τον δείκτη CD44 παρατηρήθηκε και σε κύτταρα του στρώματος ιδιαίτερα φλεγμονώδη κύτταρα καθώς και στο εντερικό νευρικό σύστημα. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανοσοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 ( H-score) διαφέρει στατιστικώς σημαντικά σε σχέση με το βάθος διήθησης (Kruskal-Wallis, p<0.001), την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (Mann-Whitney, p<0.001) και το στάδιο της νόσου (Kruskal-Wallis, p<0.001) ενώ δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων (Kruskal-Wallis, p=0.132). Όπως φαίνεται από τον πίνακα 17 και τα διαγράμματα 16,17,18 η έκφραση του δείκτη CD44 είναι σημαντικά μεγαλύτερη όσο αυξάνεται το βάθος διήθησης και το στάδιο και επιπλέον είναι σημαντικά μεγαλύτερη στους ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις. 107

108 Πίνακας 17. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 (H-score) στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με τις παθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου. Grade Depth of invasion LN Stage CD44 (H-score) Mean Standard Error of Mean Median grade I grade II grade III T1 + T T3 + T cases with (-) LN cases with (+) LN AJCC I AJCC II AJCC III AJCC IV

109 Διάγραμμα 16. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 σε σχέση με τo βάθος διήθησης. Διάγραμμα 17. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 σε σχέση με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. 109

110 Διάγραμμα 18. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 σε σχέση με το στάδιο της νόσου. 110

111 Εικόνα 9. Ανοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD44 στον καρκίνο του παχέος εντέρου Α. Παρακείμενο μη νεοπλασματικό εντερικό επιθήλιο με θετική μεμβρανική χρώση στην βάση των κρυπτών Β. Θετική ανοσοχρώση στο εντερικό νευρικό συστήμα Γ. Αρνητική χρώση σε κύτταρα του όγκου και θετική χρώση σε κύτταρα του στρώματος Δ. Αντιπροσωπευτικό περιστατικό καρκινώματος παχέος εντέρου με ισχυρή μεμβρανική χρώση στα κύτταρα του όγκου και σε ινοβλάστες 111

112 Η έκφραση του δείκτη CD44 στην μεταστατική νόσο σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με κακή ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Ακολούθως εξετάσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση του δείκτη CD44 σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία βασισμένη στην 5-φθοριοουρακίλη στους ασθενείς με μεταστατική νόσο (n=31). Θετική ανοσοϊστοχημική χρώση με μεμβρανική και κυτταροπλασματική εντόπιση βρέθηκε σε 29/31 (93.5%) περιστατικά με τιμές H-score από 0 έως 230 και μέση τιμή (82,9 ±13). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η ανοσοϊστοχημική έκφραση του CD44 διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ ασθενών που ανταποκρίθηκαν και δεν ανταποκρίθηκαν στην χημειοθεραπεία (p=0.002) και μάλιστα όπως φαίνεται από τον πίνακα 18 και το διάγραμμα 17 η έκφραση του CD44 είναι στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στους όγκους ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν στην θεραπεία. Πίνακας 18. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 (H-score) σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Respon se Responder s Nonresponders CD44 (H-score) Mean Standard Minim Maxim p- Error of Median um um value Mean

113 Διάγραμμα 19. Διαγράμματα (Boxplots) που δείχνουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. 113

114 Εικόνα 10. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του παράγοντα CD44 σε σχέση με την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία Α. Αρνητική ανοσοχρώση στα καρκινικά κύτταρα ασθενών που ανταποκρίθηκαν στην χημειοθεραπεία Β. Στους ασθενείς που δεν ανταποκρίθηκαν στην θεραπεία παρατηρείται έντονη μεμβρανική ανοσοχρώση για τον δείκτη CD44 114