Προϋποθέσεις εφαρμογής των μοριακών τεχνικών

Transcript

1 Προϋποθέσεις εφαρμογής των μοριακών τεχνικών Α. Μεντής ιαγνωστικό Εργαστήριο Λοιμωδών Νοσημάτων Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Γρίπης Νοτίου Ελλάδος Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Ερυθράς/Ιλαράς Ελλάδος, Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Πολιοϊών/Εντεροϊών Ελλάδος Εργαστήριο Ιατρικής Μικροβιολογίας ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ

2 Επιμολύνσεις και πρόληψη αντιμετώπιση Θέματα βιοασφάλειας Βελτιστοποίηση μοριακών μεθόδων Επιβεβαίωση / επικύρωση μεθόδων Control που πρέπει να χρησιμοποιούνται Είδη διαγνωστικών μεθόδων/τεχνικών IVD/CE, FDA RUO ASR In-house

3 Επιμολύνσεις μοριακών μεθόδων Προϊόντα της PCR (> αντίγραφα στόχου / αντίδραση) Από θετικό δείγμα με υψηλό μικροβιακό φορτίο Πλασμιδιακοί κλώνοι Οι μοριακές μέθοδοι για ανίχνευση μικροβιακών παραγόντων είναι ρυθμισμένες για μεγάλη αναλυτική ευαισθησία. Ιδιαίτερος κίνδυνος με nested PCR Συστήματα rt-pcr: Μικρότερος ο κίνδυνος επιμολύνσεων

4 Πρόληψη επιμολύνσεων ιαχωρισμός χώρων πραγματοποιήσεως PCR Καλή εργαστηριακή πρακτική Φυσικές μέθοδοι διαχωρισμού Παρασκευή DNA/RNA σε BSC ή hood ή PCR-workstation Φίλτρα στα tips Yπεριώδης ακτινοβολία Αντιδραστήρια PCR σε μικρές ποσότητες Χρησιμοποίηση μαρτύρων Αδρανοποίηση προϊόντων πολλαπλασιασμού με χημικές/βιοχημικές μεθόδους Κλειστά συστήματα

5 ιαχείριση Προετοιμασία κλινικών δειγμάτων αντιδραστηρίων & μοριακή PCR ανάλυση Κλινικό είγμα Λύση-Καθαρισμός Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος Προετοιμασία των δειγμάτων Προετοιμασία της αντίδρασης Γενωμικό DNA RT-PCR mrna Ιϊκό RNA rrna cdna Επιτέλεση της PCR αντίδρασης Κλωνοποίηση Αλληλούχηση Ανάλυση των προϊόντων Προϊόντα Ηλεκτροφόρηση

6 Diagnostic Molecular Microbiology, 1993

7 ιαχείριση Προετοιμασία κλινικών δειγμάτων αντιδραστηρίων & μοριακή PCR ανάλυση Κλινικό είγμα Λύση-Καθαρισμός Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος Προετοιμασία των δειγμάτων Προετοιμασία της αντίδρασης Γενωμικό DNA RT-PCR mrna Ιϊκό RNA rrna cdna Επιτέλεση της PCR αντίδρασης Κλωνοποίηση Αλληλούχηση Ανάλυση των προϊόντων Προϊόντα Ηλεκτροφόρηση

8 Κλινικό είγμα Λύση-Καθαρισμός Προετοιμασία αντιδραστηρίων PCR Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος Προετοιμασία των δειγμάτων Προετοιμασία της αντίδρασης Γενωμικό DNA RT-PCR mrna Ιϊκό RNA rrna cdna Επιτέλεση της PCR αντίδρασης Κλωνοποίηση Αλληλούχηση Ανάλυση των προϊόντων Προϊόντα Ηλεκτροφόρηση

9 Κλινικό είγμα Λύση-Καθαρισμός Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος Προ PCR mrna Ιϊκό RNA rrna Γενωμικό DNA RT-PCR cdna Κλωνοποίηση Αλληλούχηση PCR Μετά PCR Προϊόντα Ηλεκτροφόρηση

10 ΧΩΡΟΤΑΞΙΚΟΣ ιαχωρισμός των 2 φάσεων Πάγκος Εργασίας Πάγκος Εργασίας 4 C -20 C Θετική πίεση Biosafety cabinet Καταψύκτης -80 C PC PCR PCR Αρνητική πίεση Gel Imaging 4 C -20 C Ηλεκτρο/φ όρηση Real-time PCR Κατεργασία των δειγμάτων Pre-PCR lab Επιτέλεση PCR Ανάλυση προϊόντων Post-PCR lab Ροή δειγμάτων για εκτέλεση PCR

11

12 x x x x x

13 Το PCR του φτωχού Ένας χώρος χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, PCR workstation, χρήση απολυμαντικών και UV Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών! Χρονικός χωρισμός! Core PCR facility!

14

15 Ζητήματα βιοασφάλειας (CMR) Σε ποιά φάση της επεξεργασίας του δείγματος αυτό γίνεται μη μολυσματικό? Πολλά kit περιέχουν άλατα γουανιδίνης, τα οποία διασπούν την κυτταρική ακεραιότητα και εξουδετερώνει τις ανασταλτικές ουσίες. Work in BSC Αυτόκαυστο

16 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ PCR Αντιδραστήρια PCR συγκέντρωση Mg συγκεντρώσεις εκκινητών και ανιχνευτών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα θερμοκρασίες πρόσδεσης (annealing) πολυμεράση

17 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ PCR

18 Multiplex Nested RT-PCR για την ανίχνευση και τυποποίηση του αναπνευστικού ιού J Clin Microbiol 1998; 36: Γονίδιο στόχος: Nουκλεοπρωτεΐνη (Ν) και Φωσφοπρωτεΐνη (P), N 1 ος Κύκλος PCR 2 ος Κύκλος PCR

19

20 Προετοιμασία δειγμάτων 1. Σε μικροσωληνάρια (0,5ml) της PCR τοποθετούνται τα εξής αντιδραστήρια: Αντιδραστήρια Όγκος (μl) Τελική συγκέντρωση 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα PCR 10 1X dntp μίγμα (10mM) 2 0,2mM MgCl 2 3 1,5mM Primer 1 (20μΜ) 2,5 0,5μΜ Primer 2 (20μΜ) 2,5 0,5μΜ DNA 4 Taq πολυμεράση (1/10 Dilution) 4 1U/μl dh 2 O 72 Συνολικός όγκος 100μl Το ποσό του H 2 O προστίθεται ανάλογα με τον όγκο του DNA που πρέπει να χρησιμοποιηθεί. 2. Σύντομη φυγοκέντρηση για λίγα sec ώστε τα αντιδραστήρια να συγκεντρωθούν στον πάτο του σωλήνα. Ανάδευση. Σύντομη φυγοκέντρηση. 3. Τοποθέτηση του δείγματος και του αρνητικού μάρτυρα στη συσκευή PCR. 4. Η συσκευή προγραμματίζεται ως εξής: 5min x 1 φορά 30sec: μετουσίωση 30sec: σύνδεση των primers 45sec: σύνθεση DNA x 35 κύκλους 8min: extension DNA Διαρκώς (Hold) 4ºC Θα ακολουθήσει ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή αγαρόζης (2%) που περιέχει EtBr (0,5μg/ml).

21 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ PCR Επιλογή συγκεντρώσεων Mg Επιλογή συγκεντρώσεων εκκινητών Βελτιστοποίηση θερμοκρασιών

22 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ PCR Επιλογή συγκεντρώσεων Mg Επιλογή συγκεντρώσεων εκκινητών Βελτιστοποίηση θερμοκρασιών

23 Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην 1 η PCR. Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mm ως και 3mM πριν L 1 1,5 2 2,5 3 L 1 1,5 2 2,5 3 L

24 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ PCR Επιλογή συγκεντρώσεων Mg Επιλογή συγκεντρώσεων εκκινητών Βελτιστοποίηση θερμοκρασιών

25 Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών Stock of primers: 100pmol/μl Υποδιπλάσιες αραιώσεις: 50pmol/μl, 25pmol/μl, 12,5pmol/μl, 6,25pmol/μl και 3,125pmol/μl για κάθε έναν από τους εκκινητές.

26 Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών F primer R primer 50pmol/μl 50pmol/μl 25pmol/μl 12,5pmol/μl 6,25pmol/μl 25pmol/μl 12,5pmol/μl 6,25pmol/μl 3,125pmol/μl 3,125pmol/μl

27 Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών για την 1 η PCR Reverse pmol/μl ,5 6,25 3,125 6,25pmol/μl F:50 pmol/μl F:25 pmol/μl F:12,5 pmol/μl F:6,25 pmol/μl F:3,125 pmol/μl

28 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ PCR Επιλογή συγκεντρώσεων Mg Επιλογή συγκεντρώσεων εκκινητών Βελτιστοποίηση θερμοκρασιών

29 Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των εκκινητών στην 1 η PCR. Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC 50 C 56 C

30 Σύγκριση πριν και μετά την βελτιστοποίηση Μονάδες Πριν Μετά Primers pmol/μl 3,125 6,25 Annealing Temperature ºC MgCl2 mm 1 2,5 dntps mm 0,2 0,2

31

32 Ποιοτικός Έλεγχος (Οκτώβριος 2006) είγμα 1: Τύπος Α είγμα 2: Τύπος Α και Β είγμα 3: Τύπος Α είγμα 4: Αρνητικό είγμα 5: Τύπος Β είγμα 6: Τύπος Α και Β είγμα 7: Τύπος Α είγμα 8: Τύπος Α είγμα 9: Τύπος Β είγμα 10: Τύπος Α

33

34 Bελτιστοποίηση rt-pcr

35 Επικύρωση/Επιβεβαίωση ΝΑΤ μεθόδων IVD/CE, FDA Επιβεβαίωση (Verification) RUO ASR In-house Επικύρωση (Validation)

36 ιαδικασία επικύρωσης μεθόδων ΝΑΤ 1. Επιλογή αλληλουχιών στόχων, εκκινητών και ανιχνευτών 2. Επιβεβαίωση της ταυτότητας του προϊόντος 3. Προτυποποίηση αντιδραστηρίων και πρωτοκόλλων 4. Προσδιορισμός του cut-off 5. Προσδιορισμός Πιστότητας (Precision), Ορθότητας (Τrueness), Ακρίβειας (Accuracy) 6. Ευαισθησία και ειδικότητα 7. Έλεγχος διασταυρούμενων αντιδράσεων

37 2. Επιβεβαίωση της ταυτότητας του προϊόντος Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης μίας μεθόδου, το προϊόν που παράγεται από μία ΝΑΤ ελέγχεται για την αυθεντικότητά του με αλληλούχηση, ειδικό υβριδισμό, διπλή (nested) PCR, ή με πέψη με περιοριστικό ένζυμο.

38 Οδηγίες ελάχιστων απαιτήσεων για επικύρωση/επιβεβαίωση rt-pcr Sloan, Clin Microbiol Newsletter, 2007 Προσδιορισμός FDA In-house Aκρίβεια-ποιοτικές Aκρίβεια -ποσοτικές Πιστότητα - ποιοτικές 50 (+) δείγματα 50 (-) 20 (+) δείγματα 50 (-) Θετικός και αρνητικός μάρτυρας 50 (+) δείγματα 50 (-) 40 (+) δείγματα 50 (-) Θετικός και αρνητικός μάρτυρας Πιστότητα - ποσοτικές 3 επαναλήψεις σε 2 συγκεντρώσεις (within run and between day) Αναλυτική ευαισθησία -LOD (-) 60 μετρήσεις 2 συγκεντρώσεις εις διπλούν, 2 φορές την ημέρα Αναλυτική ειδικότητα (-) Προσδιορισμός όλων των μορίων που μπορεί να επιδρούν (όμοια χημική ή γενετική δομή) Φάσμα μετρήσεων 3-4 συγκεντρώσεις εις διπλούν 3-4 συγκεντρώσεις εις διπλούν Φυσιολογικές τιμές 20 δείγματα ανά κατηγορία 120 δείγματα ανά κατηγορία

39 Eξασφάλιση θετικών δειγμάτων Κλινικά δείγματα Εμπορικά διαθέσιμα Από εξωτερικό ποιοτικό έλεγχο (NEQAS, QCMD) Από άλλο εργαστήριο Spiked δείγματα Από εμβόλια

40 Σύγκριση μοριακής (NASBA) -Κ/Α για ανίχνευση εντεροϊών από κόπρανα από επιδημία άσηπτης μηνιγγίτιδας 2007 είγματα κοπράνων NASBA

41 Σύγκριση μοριακής (NASBA) -Κ/Α για ανίχνευση εντεροϊών από κόπρανα από επιδημία άσηπτης μηνιγγίτιδας 2007 είγματα κοπράνων NASBA K/A

42 Σύγκριση μοριακής (NASBA) -Κ/Α για ανίχνευση εντεροϊών από κόπρανα από επιδημία άσηπτης μηνιγγίτιδας 2007 είγματα κοπράνων NASBA K/A K/A-PCR

43 rt PCR IgM (+) IgM (-) Total Αναπν (+) Αναπν (-) Σύνολο Ιλαρά: Αξιολόγηση μεθόδου real time RT-PCR Αίμα (+) Αίμα (-) Σύνολο Ούρα (+) Ούρα (-) Σύνολο Total number of specimens rt PCR IgM(+) IgM(-) Total (+) (-)

44 ΘΕΤΙΚΟΙ ΚΑΙ ΑΡΝΗΤΙΚΟΙ ΜΑΡΤΥΡΕΣ (CONTROL) ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ ΜΕΘΟ Ο PCR

45 Μάρτυρες (control) που είναι απαραίτητοι κατά τη διενέργεια διαγνωστικής PCR (Anonymous 2002, AFNOR) Eσωτερικός μάρτυρας (Internal Amplification Control) Θετικός μάρτυρας της διαδικασίας (Processing positive control) Αρνητικός μάρτυρας της διαδικασίας (Processing negative control) Αρνητικός μάρτυρας Περιέχει χιμαιρικό μη σχετικό DNA που προστίθεται στο master mix και δύναται να πολλαπλασιάσει με τους ιδίους εκκινητές όπως το DNA στόχος. Η διαφοροποίηση από το προϊόν της PCR θα γίνεται από τη διαφορά στο μέγεθος του προϊόντος του DNA στόχου από το προϊόν του IAC. Αρνητικά δείγματα εμβολιασμένα με επαρκή ποσότητα παθογόνου μικροβίου, τα οποία υφίστανται τη συνολική διαδικασία του πρωτοκόλλου. Αρνητικά δείγματα εμβολιασμένα με επαρκή ποσότητα συγγενικού, αλλά μη-στόχου παθογόνου μικροβίου, τα οποία υφίστανται τη συνολική διαδικασία του πρωτοκόλλου. Περιέχει όλα τα αντιδραστήρια, αλλά όχι DNA στόχο ή IAC Contemplate control (blank) Μάρτυρας των εγκαταστάσεων (Premise control) Σωληνάριο που περιέχει το master mix και το οποίο αφήνεται ανοικτό στο χώρο της PCR (PCR setup room) για να ανιχνεύσει πιθανή μόλυνση από DNA στο περιβάλλον. Swab-test

46 Θετικός μάρτυρας Ασθενώς θετικά control!

47 ιαχείριση κλινικών δειγμάτων & μοριακή ανάλυση Κλινικό είγμα Λύση-Καθαρισμός Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος mrna Ιϊκό RNA rrna Γενωμικό DNA RT-PCR cdna PCR Κλωνοποίηση Αλληλούχηση Προϊόντα Ηλεκτροφόρηση

48 Μάρτυρας εκχυλίσεως και ανασταλτικών ουσιών Ανασταλτικές ουσίες Χολικά άλατα Ουρία Αίμη Ηπαρίνη IgG

49 Μάρτυρας εκχυλίσεως και ανασταλτικών ουσιών ΜΑΡΤΥΡEΣ (Ενδογενείς) Housekeeping genes ΓΟΝΙ ΙA albumin, β-globin, actin, α-tubulin 1. Hep ΑΙΜΑ 3. ΕΝΥ

50 Μάρτυρας SPUD Αναστολή

51 Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Γρίπης Ν. Ελλάδος Α. Κοσσυβάκης Α. Καλλιαρόπουλος Β. Πόγκα Α. Μουτούση Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Ερυθράς/Ιλαράς Ε. Χορευτή Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Εντεροϊών/Πολιοϊών Μ. Λογοθέτη Ε. Αφεντάκη ιαγνωστικό τμήμα Μ. Παπαϊωάννου Ε. Χορευτή Β. Μαρτίνεζ Π. Στέφου Σ. Στέφου Β. Λαμπροπούλου Α. Τζίφα Ε. Παναγιωτίδου Μ. Καψάλη Εργαστήριο Ιατρικής Μικροβιολογίας. Σγούρας Ε. Παναγιωτοπούλου Κ. Παπαδάκος