ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΝΣ ΣΙΔΗΡΟΠΟΥΛΟΥ ΕΛΕΝΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ ΕΣΥ ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΝΣ ΣΙΔΗΡΟΠΟΥΛΟΥ ΕΛΕΝΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ ΕΣΥ ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ

2 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ ΑΜΕΣΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ PCR ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ

3 ΑΜΕΣΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Σηµειώνουµε τους φυσικούς χαρακτήρες του ΕΝΥ. Όψη : φυσιολογικό ΕΝΥ διαυγές, παθολογικό θολερό. Χρώµα :φυσιολογικό ΕΝΥ άχρωµο, παθολογικό ροδόχρουν, αχνό κίτρινο, ξανθοχρωµατικό ή αιµορραγικό.

4 ΑΜΕΣΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Μέτρηση κυττάρων ΕΝΥ Βιοχηµικός έλεγχος. Μικροσκόπηση νωπού και χρωµατισµένου παρασκευάσµατος.

5 Μέτρηση κυττάρων ΕΝΥ Φυσιολογικά λευκοκύτταρα/µl ΕΝΥ: 0-30 (νεογνά) 0-20 (παιδιά) 0-10 (ενήλικες) Εξετάζεται αυτούσιο ΕΝΥ Καλή ανάδευση

6 Μέτρηση κυττάρων ΕΝΥ πλάκα Neubauer

7 Μικροβιακή µηνιγγίτις Συνήθεις µεταβολές κυττάρων ΕΝΥ & τύπος κυττάρων > 1000/µl Πολυµορφοπύρηνα > 50 % Ιογενής (άσηπτος) < 500/µl Αρχικά πολυµορφοπύρηνα & έπειτα λεµφοκύτταρα Μυκητιασική αυξηµένα λεµφοκύτταρα Φυµατιώδης /µl Αρχικά πολυµορφοπύρηνα & έπειτα λεµφοκύτταρα

8 ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Γλυκόζη Λεύκωµα Χλωριούχα Γαλακτικό οξύ Γαλακτική δεϋδρογενάση Η βιοχηµική εξέταση του ΕΝΥ γίνεται από το υπερκείµενο φυγοκεντρηθέντος δείγµατος

9 Βιοχηµική εξέταση ΕΝΥ-Γλυκόζη Φ.Τ.: % της γλυκόζης αίµατος Νεογνά: mg /dl Ενήλικες: mg /dl Λίγο πριν την ΟΝΠ συνιστάται να µετράται η γλυκόζη αίµατος Η µέτρηση πρέπει να γίνεται εντός 2 ωρών από τη λήψη του ΕΝΥ

10 Βιοχηµική εξέταση ΕΝΥ - Λεύκωµα Λεύκωµα Νεογνά: mg/dl Eνήλικες: mg/dl Προσδιορισµός Λευκώµατος µε θολοµετρικές µεθόδους (θειοσουλφοσαλικιλικού οξέος)

11 Μικροσκόπηση νωπού παρασκευάσµατος Αναζήτηση διπλόκοκκων µε µορφολογία µηνιγγιτιδοκόκκου κόκκων µε µορφολογία σταφυλοκόκκου ή στρεπτοκόκκου. Κοκκοβακτηριδίων ή βακτηριδίων µυκήτων παρασίτων

12 Μικροσκόπηση χρωµατισµένου παρασκευάσµατος Χρώση κατά Gram Ziehl Neelsen ή αρνητική χρώση

13 Άµεσο παρασκεύασµα-gram χρώση Gram (-) διπλόκοκκοι Gram (-) βακτηρίδια

14 Άµεσο παρασκεύασµα-gram χρώση Κοκκοβακτηρίδια αιµόφιλου ινφλουέντζας Διπλόκοκκοι πνευµονιόκοκκου

15 The linked image cannot be displayed. The file may have been moved, renamed, or deleted. Verify that the link points to the correct file and location. Άµεσο παρασκεύασµα-gram χρώση

16 Οξεάντοχο βακτήριο µε χρώση Ziehl- Neelsen The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or the image may have been corrupted. Restart your computer, and then open the file again. If the red x still appears, you may have to delete the image and then insert it again.

17 Cryptococcus neoformans

18 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΝΥ Κοινά βακτήρια και µύκητες Μηνιγγιτιδόκοκκος Πνευµονιόκοκκος Αιµόφιλος Εντεροβακτηριοειδή

19 Ειδικές καλλιέργειες ΕΝΥ Για φυµατιώδη µηνιγγίτιδα σε Löwenstein- Jensen Για κρυπτοκοκκική µηνιγγίτιδα σε Sabouraud agar Για ιούς σε εµβρυοφόρα αυγά ή κυτταροκαλλιέργειες (ειδικά ερευνητικά κέντρα).

20 Αναζήτηση µικροβιακών αντιγόνων Άµεση ποιοτική ανίχνευση Ag µε συγκολλητινοαντιδράσεις βακτήρια Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis E.coli K1 µύκητες Cryptococcus neoformans Χαµηλή ευαισθησία, Ειδικότητα???

21 Εφαρµογές µοριακών µεθόδων Polymerase Chain Reaction (PCR) Ανίχνευση ιού ή µυκοβακτηριδίου Μέτρηση ιικού φορτίου Ανίχνευση αντοχής στα αντιικά φάρµακα Τυποποίηση στελεχών-ανίχνευση µεταλλάξεων

22 ΛΗΨΗ ΚΑΙ ΑΠΟΣΤΟΛΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ PCR Η ΟΝΠ και η αιµοληψία δεν πρέπει να γίνεται µε γάντια που έχουν ταλκ Το δέρµα πρέπει να στεγνώσει καλά από το οινόπνευµα που χρησιµοποιήσαµε πριν την ΟΝΠ, αιµοληψία Η ηπαρίνη απαγορεύεται ως αντιπηκτικό Είναι αναστολείς της PCR

23 ΛΗΨΗ ΚΑΙ ΑΠΟΣΤΟΛΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ PCR Τα δείγµατα που προορίζονται για µοριακό έλεγχο αποστέλλονται αυθηµερόν, διαφορετικά πρέπει να καταψύχονται.

24 Μοριακές τεχνικές Στάδια: Βιολογικό υγρό ή ιστός Αποµόνωση DNA του στόχου από το δείγµα (εκχύλιση) Πολλαπλασιασµός συγκεκριµένου τµήµατος DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) Ανάγνωση αποτελέσµατος συγκριτικά µε τον µάρτυρα

25 Βιολογικό υγρό ή ιστός Αποµόνωση RNA του στόχου από το δείγµα (εκχύλιση) Μετατροπή του RNA σε συµπληρωµατικό DNA (cdna) Ανάστροφη µεταγραφή (Reverse Transcription) Πολλαπλασιασµός συγκεκριµένου τµήµατος DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) Ανάγνωση αποτελέσµατος συγκριτικά µε τον µάρτυρα

26 Πλεονεκτήµατα µοριακών τεχνικών Ταχεία διάγνωση Υψηλή ευαισθησία Ανίχνευση στόχου ακόµα και σε πολύ χαµηλή συγκέντρωση Μεγάλη ειδικότητα Ελάχιστη απαιτούµενη ποσότητα δείγµατος Ανίχνευση ιών ενσωµατωµένων στο DNA του κυττάρου (π.χ. HIV)

27 Μειονεκτήµατα µοριακών τεχνικών Ανίχνευση ακόµα και νεκρών µικροοργανισµών-ανίχνευση ιών σε λανθάνουσα µορφή Kόστος Ειδικός εργαστηριακός εξοπλισµός Ανάγκη εξειδικευµένου προσωπικού Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα (επιµολύνσεις) Ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα (µεταλλάξεις)

28 Ιοί, βακτήρια και παράσιτα που ανιχνεύονται µε µοριακές τεχνικές στο εργαστήριό µας CMV EBV HSV1/2 VZV JCV/BK M.TUBERCULOSΙS TOXOPLASMA GONDII

29 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΤΟ ΕΝΥ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΟΡΟ Με ανοσοενζυµικές µεθόδους (ELISA) Mε κροκυδωτικές δοκιµασίες Με συγκολλητινοαντιδράσεις Με έµµεσο ανοσοφθορισµό (IIF)

30 Παραλλαγές ανοσοενζυµικών µεθόδων Αυτοµατοποιηµένα συστήµατα Μικροσωµατιδιακή Ανοσοενζυµική Τεχνική (Microparticle Enzyme Immumoassay - MEIA). Ανοσοενζυµική µε τελική ανίχνευση φθορισµού (Enzyme Linked Fluorescent Assay ELFA). Μικροσωµατιδιακή µε χηµειοφωταύγεια

31 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΟΡΟΥ ΕΝΥ αντισώµατα IgG και IgM Ερπητα I-II (HSV) Ερπητα ζωστ.-ανεµοβλογιάς (VZV) Anti-CMV Epstein- Barr (EBV)VCA

32 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΟΡΟΥ ΕΝΥ Αντισ. Ιλαράς (Measles) Αντισώµατα Ερυθράς (Rubella) Αντισ.Ιού Παρωτίτιδας (Mumps) Αντισ. Αδενοιών IgG IgM IgA HIV Αντισ. Μυκοπλάσµατος πνευµονίας IgG IgΜ IgΑ Αντισ.Ιού αναπν. συγκυτίου (RSV) IgG, IgM, IgΑ Αντισ.Chlamydia pneum IgG, IgM. IgA

33 Aνίχνευση αντισωµάτων µε έµµεσο ανοσοφθορισµό (IFA) Αντισ.Coxiella burnetii IgG, IgM phase I Αντισ.Coxiella burnetii IgG, IgM phase II Αντισ. Rickettsia typhi IgG, IgM Αντισ. Rickettsia rickettsii IgG, IgM

34 Aνίχνευση αντισωµάτων µε έµµεσο ανοσοφθορισµό (IFA) FTA Abs (Fluorescent Treponemal Ab Absorption) Anti-ΤΟΧΟ IgG, IgM

35 Aνίχνευση αντισωµάτων µε κροκυδωτικές δοκιµασίες R.P.R. (Rapid Plasma Reagin) V.D.R.L.(Veneral Disease Research Laboratory)

36 Aνίχνευση αντισωµάτων µε συγκολλητινοαντιδράσεις Wright (Brucella spp.)

37 Αξιολόγηση ανίχνευσης αντισωµάτων Ανίχνευση IgM στο ΕΝΥ σηµαίνει λοίµωξη του ΚΝΣ. Τα IgM αντισώµατα δεν περνούν τον αιµατεγκεφαλικό φραγµό. Λόγος IgG ENY : IgG ορού > 1 σηµαίνει επιτόπια παραγωγή αντισωµάτων στο ΚΝΣ

38 Εργαστηριακά κριτήρια για τη διάγνωση λοίµωξης ΚΝΣ Αποµόνωση του υπεύθυνου παθογόνου µικροοργανισµού από φυσιολογικά άσηπτο κλινικό δείγµα (ΕΝΥ, αίµα) Ανίχνευση νουκλεϊνικού οξέος του υπεύθυνου παθογόνου µικροοργανισµού σε φυσιολογικά άσηπτο κλινικό δείγµα. Σύνθεση αντισωµάτων στο ΚΝΣ

39 Συµπεράσµατα Η έγκαιρη διάγνωση των λοιµώξεων του ΚΝΣ είναι σηµαντική για την έκβαση της νόσου. έκβαση. κλινική υποψία είναι απαραίτητη για την έγκαιρη µικροβιολογική διάγνωση. Η άµεση εξέταση του ΕΝΥ και οι µοριακές τεχνικές είναι πολύ σηµαντικές µέθοδοι.

40 Συµπεράσµατα Οι καλλιέργειες του ΕΝΥ είναι σηµαντικές για την επιβεβαίωση της διάγνωσης. Πρέπει να ζητούνται οι ειδικές καλλιέργειες Οι ορολογικές µέθοδοι µπορούν να επιβεβαιώσουν τη διάγνωση όταν δείχνουν σύνθεση αντισωµάτων στο ΚΝΣ.

41 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ