Διδακτορική Διατριβή

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ-ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΤΑΜΑΤΗΣ- ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΛΙΟΣΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες» Διδακτορική Διατριβή «Μελέτη του ρόλου της σεροτονίνης και της σηματοδότησης μέσω Wnt και BMP μονοπατιών στον έλεγχο της οστεοβλαστικής δραστηριότητας σε ασθενείς με Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα» Καλλιόπη Π. Κλαυδιανού Ιατρός Πάτρα 2016

2 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Σταμάτης-Νικόλαος Λιόσης (επιβλέπων):αναπληρωτής Καθηγητής Ανδρέας Π. Αντωνόπουλος: Ομότιμος Καθηγητής Δημήτριος Δαούσης: Επίκουρος Καθηγητής Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Ανδρέας Π. Αντωνόπουλος: Ομότιμος Kαθηγητής Θεόδωρος Αλεξανδρίδης: Καθηγητής Χαράλαμπος Γώγος : Καθηγητής Σταμάτης-Νικόλαος Λιόσης: Αναπληρωτής Καθηγητής Ιωάννης Χαμπαίος: Αναπληρωτής Καθηγητής Δημήτριος Βελισσάρης: Επίκουρος Καθηγητής Δημήτριος Δαούσης: Επίκουρος Καθηγητής

3 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Γεννήθηκα στην Αθήνα το Αποφοίτησα από το 53 0 Ενιαίο Λύκειο Αθηνών το 2003 και το ίδιο έτος, μετά από Πανελλαδικές Εξετάσεις, εισήχθην στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Πατρών. Έλαβα το πτυχίο μου το Στη διάρκεια της εξαετούς φοίτησής μου έλαβα ισάριθμες υποτροφίες από το Ίδρυμα Ιωάννη Σ. Λάτση. Το 2010 έγινα δεκτή στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών «Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες» της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών για την απόκτηση διδακτορικού διπλώματος στον τομέα της Ρευματολογίας. Από το Νοέμβριο του 2009 μέχρι το Φεβρουάριο του 2011 εκπλήρωσα την υπηρεσία υπαίθρου στο Π.Ι. Νέας Φιγαλείας Κ.Υ. Ζαχάρως Γ.Ν. Πύργου. Από το Νοέμβριο του 2011 μέχρι το Νοέμβριο του 2013 εργάστηκα στο Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο Πύργου ως ειδικευόμενη Παθολογίας με στόχο την απόκτηση τίτλου ειδικότητας στην Ρευματολογία. Η διατριβή μου, το πειραματικό μέρος της οποίας ολοκληρώθηκε τον Ιούλιο του 2015, εκπονήθηκε στο εργαστήριο Ρευματολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Διαφορετικά τμήματα της μελέτης παρουσιάστηκαν στα εξής επιστημονικά συνέδρια: 23 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ρευματολογίας Δεκέμβριος 2012 (1 0 Βραβείο καλύτερης μελέτης, προφορική ανακοίνωση) Αnti-TNFa treatment reduces serum serotonin levels in patients with Αnkylosing spondylitis and downregulates serotonin signaling in an experimental cell line model Kalliopi Klavdianou, Dimitrios Daoussis, Stamatis -Nick C. Liossis, Alexandra Filippopoulou and Andrew P. Andonopoulos Annual European Congress of Rheumatology, Madrid 2013 ( Poster tour ) Αnti-TNFa treatment reduces serum serotonin levels in patients with Ankylosing spondylitis and

4 downregulates serotonin signaling in an experimental cell line model Kalliopi Klavdianou, Dimitrios Daoussis, Stamatis -Nick C. Liossis, Alexandra Filippopoulou and Andrew P. Andonopoulos 4 0 Σεμινάριο Ανοσοπαθολογίας για Ρευματολόγους, Καλάβρυτα, 11/2013 (Προφορική Παρουσίαση) Ο ρόλος της σεροτονίνης στην oστεογένεση-προεκτάσεις στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα Αrthritis Workshop, Leuven 12/2013 (Προφορική Παρουσίαση) Serotonin signaling in Ankylosing spondylitis 6 0 Σεμινάριο Ανοσοπαθολογίας για Ρευματολόγους, Καλάβρυτα, 10/2015 (Προφορική Παρουσίαση) Ο ρόλος της σεροτονίνης στην παθογένεια των σπονδυλοαρθροπαθειών Η μελέτη έχει δημοσιευτεί σε έγκυρο ξενόγλωσσο περιοδικό που λειτουργεί με κριτές: Kalliopi Klavdianou, Stamatis-Nick Liossis, Papachristou DJ, Theocharis G Sirinian C, Kottorou A, Filippopoulou A, Andonopoulos AP 1, Daoussis D Decreased Serotonin Levels and Serotonin-Mediated Osteoblastic Inhibitory Signaling in Patients With Ankylosing Spondylitis. J Bone Miner Res Mar;31(3):630-9

5 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής: Τον επιβλέποντα αναπλ.καθηγητή κ. Σταμάτιο-Νικόλαο Λιόση, και να εκφράσω ιδιαίτερη ευγνωμοσύνη στο πρόσωπό του, καθώς του οφείλω την είσοδό μου στο χώρο της επιστημονικής έρευνας, αφού με τίμησε με την εμπιστοσύνη του αμέσως μετά τη λήψη του πτυχίου μου, ενώ καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας διατριβής πρόσφερε άρτια επιστημονική καθοδήγηση, υποστήριξη και ηθική παρότρυνση. Τον ομότιμο καθηγητή κ. Ανδρέα Αντωνόπουλο, ο οποίος πίστεψε στις δυνατότητές μου και μου έδωσε την ευκαιρία να γίνω μέλος της ευρύτερης οικογένειας του εργαστηρίου Ρευματολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η κλινική του δεινότητα, η επιστημονική του αριστεία, καθώς και το προσωπικό του ήθος, αποτέλεσαν πρότυπο για την ενασχόλησή μου με την έρευνα. Μέσα από τη διδασκαλία του ήρθα πρώτη φορά σε επαφή με το αντικείμενο της ρευματολογίας. Παράλληλα, αποτέλεσε πολύτιμο σύμβουλο και αρωγό στην ολοκλήρωση αυτής της μελέτης και του οφείλω ευγνωμοσύνη για τις πολύτιμες υποδείξεις του κατά την εκπόνηση της διατριβής. Στον επικ.καθηγητή κ. Δημήτριο Δαούση, οφείλω να εκφράσω ιδιαίτερες ευχαριστίες. Η ερευνητική του πρόταση ήταν και η διατύπωση της ιδέας πάνω στην οποία βασίστηκε η διατριβή. Αποτέλεσε τον ενορχηστρωτή της παρούσας μελέτης, της οποίας δεν υπήρξε κανένα στάδιο χωρίς την προσωπική του καθοδήγηση και εργασία. Με ενθάρρυνε και με καθοδήγησε βήμα βήμα με ειλικρινές ενδιαφέρον και υπομονή, μεταδίδοντας τη γνώση του, βοηθώντας με

6 να συγκροτήσω επιστημονική σκέψη. Χωρίς τη συμβολή του θα ήταν αδύνατη η εκπόνηση αυτής της διατριβής. Τον αναπλ.καθηγητή κο Παπαχρήστου Διονύσιο, την κα Μαρία Μακρή, το Γαστρεντερολόγο Επιμελητή του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών κο Θεοχάρη Γεώργιο, την κα Αλεξάνδρα Φιλιπποπούλου και την κα Αναστασία Κοττόρου, για την καθοριστική συμβολή τους στη διεκπεραίωση της παρούσας μελέτης. Τη μεταδιδακτορική ερευνήτρια κα Χάιδω Σιρινιάν, για τη συμβολή της στη διεκπεραίωση της μελέτης και για τις πολύτιμες συμβουλές της στο εργαστήριο. Όλους τους ιατρούς του Ρευματολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, ειδικούς και ειδικευόμενους, των οποίων η συμβολή στην ανεύρεση ασθενών και στη συλλογή των δειγμάτων υπήρξε καθοριστική, καθώς και τους ασθενείς και τους υγιείς εθελοντές που συμμετείχαν στη μελέτη. Όλα τα παρόντα και παρελθόντα μέλη του Ρευματολογικού εργαστηρίου του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, για τη συνεργασία και το ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν. Την ιατρό κα Σοφία Δημουλιά για τη φιλοξενία της, ώστε να διεκπεραιώσω το τελευταίο μέρος των πειραμάτων. Την οικογένειά μου, γιατί χωρίς την υποστήριξη και την αμέριστη συμπαράστασή τους σε κάθε μου απόφαση τίποτε δεν θα είχε γίνει πραγματικότητα.

7 Πίνακας περιεχομένων Περιεχόμενα 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα Η Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα ως πρότυπο Σπονδυλοαρθροπάθειας Κλινική εικόνα της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας Οστικός σχηματισμός στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα Ο ρόλος των γενετικών παραγόντων Ο ρόλος των αναπτυξιακών μονοπατιών Η σχέση της φλεγμονής με το νέο οστικό σχηματισμό Σεροτονίνη (5-ΗΤ) Βιοσύνθεση και δομή της σεροτονίνης Σηματοδότηση και βιολογικές λειτουργίες της σεροτονίνης Κεντρικώς παραγόμενη σεροτονίνη Περιφερική σεροτονίνη Ρύθμιση της οστικής μάζας από τη σεροτονίνη Ρύθμιση της οστεοβλαστογένεσης από την περιφερική σεροτονίνη-προτεινόμενο μοντέλο Ρύθμιση της οστικής μάζας από την κεντρικώς παραγόμενη σεροτονίνη-προτεινόμενο μοντέλο Κλινικά δεδομένα για τη δράση της σεροτονίνης στο σκελετό Κλινικά δεδομένα για τη ρύθμιση της οστικής μάζας από την περιφερική σεροτονίνη Κλινικά δεδομένα για τη ρύθμιση της οστικής μάζας από την κεντρική σεροτονίνη ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ασθενείς Βιοψίες δωδεκαδακτύλου σε ασθενείς με νόσο Crohn Κυτταροκαλλιέργειες και λύση των κυττάρων Ανοσοαποτύπωμα κατά Western Μέτρηση ρυθµού πολλαπλασιασµού και κυτταρικής βιωσιµότητας Ιστολογική εκτίμηση της έκφρασης του Tph1 σε βιοψίες δωδεκαδακτύλου ασθενών με νόσο Crohn Εκτίμηση της έκφρασης του Tph Στατιστική ανάλυση 49

8 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι ασθενείς με Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα έχουν χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε σύγκριση με τους ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και τους υγιείς μάρτυρες Η αντι-tnfα θεραπεία σχετίζεται με χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ, αλλά όχι στους ασθενείς με ΡΑ Η σεροτονίνη σε συγκεντρώσεις παρόμοιες με εκείνες στον ανθρώπινο ορό αναστέλλει σημαντικά τον πολλασιασμό των κυττάρων με οστεοβλαστικούς χαρακτήρες Saos Οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης ορού μεταξύ των ασθενών με AΣ και των υγιών μαρτύρων έχουν λειτουργική επίδραση στη σηματοδότηση της σεροτονίνης Η μεσολαβούμενη από τον ορό των ασθενών με AΣ επαγωγή της έκφρασης του pcreb είναι ειδική για τη σεροτονίνη Η αντι-tnfα θεραπεία μειώνει περαιτέρω τη σηματοδότηση της σεροτονίνης στους ασθενείς με AΣ Η έκφραση της Tph1 είναι κατεσταλμένη στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο του Crohn Η θεραπεία με αντι-tnfα δεν επηρεάζει την έκφραση της Tph ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΧΡΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΑBSTRACT ΆΡΘΡΟ 90

9 1. Εισαγωγή 1

10 1.1 Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα Η Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα ως πρότυπο Σπονδυλοαρθροπάθειας Οι σπονδυλοαρθροπάθειες είναι μια ομάδα παθήσεων που μοιράζονται κοινά κλινικά και γενετικά χαρακτηριστικά. Χαρακτηρίζονται από φλεγμονώδη προσβολή του αξονικού σκελετού (ιερολαγονίων αρθρώσεων και σπονδυλικής στήλης), των περιφερικών αρθρώσεων, αλλά και εξωαρθρικών θέσεων, συμπεριλαμβανομένων των οφθαλμών του εντέρου και του καρδιαγγειακού. Οι περιοχές που προσβάλλονται πρώιμα είναι οι ενθέσεις (τα σημεία όπου οι σύνδεσμοι και οι τένοντες προσφύονται στο οστό). Η Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα (ΑΣ), εμφανίζει κοινά χαρακτηριστικά με τις αρθρίτιδες που σχετίζονται με ψωρίαση, φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και την αντιδραστική αρθρίτιδα. Όλες μαζί οι οντότητες αυτές απαρτίζουν την οικογένεια των σπονδυλοαρθριτίδων, οι οποίες συχνά χαρακτηρίζονται με τον όρο «οροαρνητικές σπονδυλοαρθροπάθειες» («οροαρνητικές» επειδή δε σχετίζονται με το ρευματοειδή παράγοντα) (1,2). Παρότι οι σπονδυλοαρθροπάθειες δε σχετίζονται με το ρευματοειδή παράγοντα, εμφανίζουν ισχυρή γενετική συσχέτιση με το Human leukocyte antigen (HLA)-B27 (3,4). Ο σαφής διαχωρισμός μεταξύ των νοσολογικών οντοτήτων δεν είναι πάντα εφικτός, ειδικά στα αρχικά στάδια της νόσου, λόγω αλληλοεπικαλυπτόμενων κλινικών χαρακτηριστικών. Ωστόσο, η αδυναμία διαφοροποίησης συνήθως δεν επηρεάζει τις θεραπευτικές αποφάσεις (5). Έχουν γίνει προσπάθειες καθιέρωσης κριτηρίων ταξινόμησης για τις σπονδυλοαρθρίτιδες (6 10), όχι για διαγνωστικούς σκοπούς, αλλά για να αποτελέσουν βοήθεια στην ταυτοποίηση άτυπων και αδιαφοροποίητων περιπτώσεων, ώστε να επιτευχθεί πρώιμη αναγνώριση και καλύτερη διαχείριση αυτών των ασθενών. Οι ασθενείς μπορούν αδρά να διακριθούν σε δύο ομάδες, εκείνους με προεξάρχουσα την αξονική σπονδυλοαρθρίτιδα (axial 2

11 SpA), η οποία περιλαμβάνει την Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, και σε εκείνους με προεξάρχουσα την περιφερική αρθρίτιδα (8). Η μαγνητική τομογραφία θεωρείται πολύ χρήσιμο επικουρικό εργαλείο για την πρώιμη αναγνώριση της φλεγμονής στον αξονικό σκελετό, καθώς μπορεί να ανιχνεύσει ενεργές φλεγμονώδεις μεταβολές στις ιερολαγόνιες αρθρώσεις, με ή χωρίς δομικές βλάβες. Αυτό είναι πολύ χρήσιμο στην αναγνώριση της αξονικής σπονδυλοαρθρίτιδας, όταν οι απλές ακτινογραφίες φαίνονται φυσιολογικές (11). Η ΑΣ αποτελεί την πρότυπη σπονδυλο-αρθροπάθεια (5). Προσβάλλει το 0.1%-1% του πληθυσμού (το ποσοστό ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό) (12), με συχνότερη προσβολή των ανδρών σε αναλογία 2:1, αν και πολλοί ερευνητές υποστηρίζουν ότι η αναλογία αυτή προσεγγίζει το 1:1 σε πληθυσμιακά δεδομένα (13) Κλινική εικόνα της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας Παρότι δεν υπάρχουν καθιερωμένα διαγνωστικά κριτήρια για την Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, έχουν φτιαχτει κριτήρια τα οποία διευκολύνουν την ταξινόμηση των ασθενών σε ερευνητικές μελέτες, με πιο δημοφιλή τα modified New York Criteria (14) (Εικόνα1). 3

12 Εικόνα 1: Τροποποιημένα κριτήρια ταξινόμησης της Νέας Υόρκης για την Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα Η νόσος σπάνια εμφανίζεται μετά τα 40 έτη. Το συχνότερα εμφανιζόμενο σύμπτωμα στους ασθενείς με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα είναι η φλεγμονώδης οσφυαλγία, όπως έχει οριστεί (15,16), εμμένουσα πάνω από τρεις μήνες, επιδεινούμενη με την ανάπαυση και βελτιούμενη με την άσκηση, με εναλλασσόμενο άλγος γλουτών, που συχνά αφυπνίζει τον ασθενή και μπορεί να αντανακλά στους μηρούς, αλλά όχι κάτω από το γόνατο. Ένα ποσοστό ασθενών εμφανίζεται με ολιγοαρθρίτιδα ή ενθεσίτιδα κυρίως στους αχίλλειους τένοντες ή με άλγος ισχίων λόγω υμενίτιδας. Η φλεγμονή στις ενθέσεις είναι από τα κυριότερα χαρακτηριστικά της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας (17). Η ευαισθησία και δυσκαμψία της σπονδυλικής στήλης με την πάροδο του χρόνου επεκτείνεται σε όλο το μήκος της, προκαλώντας προοδευτικό περιορισμό της κινητικότητάς της, με την εξαφάνιση της οσφυικής λόρδωσης να είναι ένα από τα πρώτα κλινικά σημεία. Επιπλέον, επηρεάζονται οι πλευροσπονδυλικοί σύνδεσμοι με μείωση της ικανότητας έκπτυξης του θώρακα και η αυχενική μοίρα της σπονδυλικής στήλης, με αποτέλεσμα περιορισμό των κινήσεων του αυχένα. Όσον αφορά τη θωρακική μοίρα, τα συμπτώματα μπορεί να εκδηλωθούν με ευαισθησία στο στέρνο, ενώ αποτελεί και συχνότερη 4

13 εντόπιση για την άσηπτη σπονδυλοδισκίτιδα, που μπορεί να εμφανιστεί στους ασθενείς με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα. Οι ιερολαγόνιες αρθρώσεις προσβάλλονται αρχικά στην κατώτερη πρόσθια επιφάνεια και η προσβολή τους συνοδεύεται από παρααρθρική οστεοπενία και συνεπώς στις ακτινογραφίες αρχικά φαίνεται διεύρυνση του μεσάρθριου διαστήματος. Η ενδοχόνδρινη οστεοποίηση που ακολουθεί την οστεΐτιδα δίνει την εικόνα διαβρώσεων στις ακτινογραφίες, ενώ η ενθεσοπάθεια σε όλο το μήκος της άρθρωσης οδηγεί σε οστεοποίηση που φαίνεται σαν σύντηξη των ιερολαγονίων στις απλές ακτινογραφίες. Χαρακτηριστική κλινικά είναι η ευαισθησία των ασθενών στην πλήξη των ιερολαγονίων αρθρώσεων κατά τη φυσική εξέταση. Περιφερική αρθρίτιδα μπορεί να παρουσιαστεί οποτεδήποτε στην εξέλιξη της νόσου, μπορεί να είναι περιοδική, ασύμμετρη και αφορά κυρίως τις αρθρώσεις των κάτω άκρων. Όσον αφορά τις εξωαρθρικές εκδηλώσεις, φλεγμονώδης νόσος του εντέρου μπορεί να εμφανιστεί σε ασθενείς με προϋπάρχουσα Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, ένω ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα έχουν υποκλινική φλεγμονή στο έντερο (18). Περίπου στο 1/3 των ασθενών μπορεί να εμφανιστεί πρόσθια ραγοειδίτιδα κατά τη διάρκεια της νόσου (19). Διαταραχές της αγωγής του καρδιακού ερεθίσματος έχουν παρατηρηθεί σε μια μειοψηφία ασθενών, ενώ στο 1% των ασθενών με Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα παρατηρείται αορτίτιδα με διάταση και ανεπάρκεια της αορτικής βαλβίδας (20). Πιο πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι η νόσος είναι ανεξάρτητος δείκτης καρδιαγγειακού κινδύνου (21). Όσον αφορά την προσβολή των πνευμόνων, τα συχνότερα ευρήματα είναι ήπιες αλλοιώσεις του διάμεσου ιστού, ενώ σπανιότερα έχει περιγραφεί ίνωση στους άνω πνευμονικούς λοβούς (22). Eξίσου σπάνια είναι και η νεφρική προσβολή, με συχνότερη τη νεφρική αμυλοείδωση, ακολουθούμενη από ΙgA νεφροπάθεια (23). To 10-25% των ασθενών μπορεί να εμφανίσει ψωρίαση κατά τη διάρκεια της νόσου (24). (Εικόνα 2) 5

14 Α Β Γ Δ Εικόνα 2: Κλινική εικόνα της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας Α:Μειωμένο εύρος κάμψης οσφυικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης B:Προχωρημένη νόσος. Κατάργηση οσφυικής λόρδωσης, θωρακική κύφωση, αυχενική κάμψη Γ:Ραγοειδίτιδα Δ:Ενθεσίτιδα αχιλλειου τένοντα (από emedicine.medscape.com/, Hochberg et al eds, painphysiotherapist.com 2009 American College of Rheumatology) Οστικός σχηματισμός στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα Μεταξύ των φλεγμονωδών νοσημάτων των αρθρώσεων η Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, ξεχωρίζει λόγω της ευρείας προσβολής του αξονικού σκελετού και λόγω της χαρακτηριστικής ακτινολογικής εξέλιξης της νόσου (25). Οι διαβρωτικές βλάβες σε αρθρώσεις και σπονδύλους είναι σχετικά περιορισμένες, αλλά κυριαρχεί ο οστικός σχηματισμός με ανάπτυξη συνδεσμόφυτων για παράδειγμα στη σπονδυλική στήλη. Αυτή η διαδικασία νέου οστικού σχηματισμού, μπορεί να οδηγήσει σε προοδευτική αγκύλωση των αρθρώσεων ή της σπονδυλικής στήλης (Εικόνα 3), με αποτέλεσμα απώλεια της λειτουργικότητας και αναπηρία ειδικά σε ασθενείς με χρόνια νόσο (26). Η παθογένειά της νόσου δεν έχει κατανοηθεί καλά, ωστόσο, φαίνεται να συμμετέχουν γενετικοί, μηχανικοί και ανοσολογικοί παράγοντες (27,28). Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα και οι TNFα αναστολείς είναι αποτελεσματικά στην μείωση του 6

15 πόνου και της δυσκαμψίας των ασθενών με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα και βελτιώνουν την ποιότητα ζωής τους. Παρ όλα αυτά, δεν υπάρχει διαθέσιμη θεραπεία που να μπορεί να επηρεάσει εμφανώς την ακτινολογική εξέλιξη στους ασθενείς αυτούς. Υπάρχουν στοιχεία που εισηγούνται ότι η χορήγηση TNFα αναστολέων για 2 χρόνια, δεν επιβραδύνει το σχηματισμό οστεόφυτων στους ασθενείς με Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα (29,30). Επιπλέον, οι μελέτες που εκτιμούν την επίδραση της μακροχρόνιας χορήγησης της αντι-τnfα θεραπείας στην ακτινολογική πρόοδο, έχουν δείξει μέτρια αποτελέσματα (31,32). Η έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών, ικανών να αναστείλουν ξεκάθαρα την ακτινολογική εξέλιξη, θέτει την ανάγκη να εξερευνηθούν τα μοριακά μονοπάτια και οι μεσολαβητές που οδηγούν στο σχηματισμό νέου οστού στην Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα. Υπάρχουν δύο μεγάλοι περιορισμοί στην έρευνα για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών οστεοπαραγωγής στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα. Αρχικά, σπανιότατα λαμβάνονται βιοψίες από ιστούς των ασθενών. Επιπλέον τα ζωικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται έχουν μειονεκτήματα (26). Τα ποντίκια έχουν ένα ενδογενές σύστημα επιδιόρθωσης κι ένα δυναμικό remodeling στις αρθρώσεις το οποίο δεν είναι ακριβώς ίδιο με το ανθρώπινο. Στα περισσότερα μοντέλα με παροδική φλεγμονή των αρθρώσεων, η βλάβη που ακολουθεί πυροδοτεί μια απάντηση επιδιόρθωσης που δε σέβεται την ανατομία της άρθρωσης, αλλά έχει στόχο να σταθεροποιήσει την προσβεβλημένη άρθρωση. Επομένως, τα μοντέλα με φλεγμονή που δεν είναι συνεχόμενη, εμφανίζουν συχνότερο remodeling της άρθρωσης. Ένας άλλος περιορισμός είναι ότι τα περισσότερα χαρακτηριστικά της αγκύλωσης, ιδιαίτερα στην αυτόματη αγκυλοποιητική ενθεσίτιδα, σε μοντέλα που τους έχει χορηγηθεί ορός ή αντισώματα, μελετώνται στις περιφερικές αρθρώσεις και όχι στη σπονδυλική στήλη ή στις ιερολαγόνιες. Σε άλλα μοντέλα, όπως στην επαγόμενη από πρωτεογλυκάνες 7

16 αρθρίτιδα στα ποντίκια ή στα HLA-B27 διαγονιδιακά ποντίκια, έχει περιγραφεί το remodeling, αλλά παραμένουν άγνωστοι οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί. Εικόνα 3: Συνδεσμόφυτα ΑΜΣΣ, ΟΜΣΣ, σύντηξη ιερολαγονίων αρθρώσεων (εικόνες από radiopaedia.org, aafp.org, emedicine.medscape.com) Ο ρόλος των γενετικών παραγόντων Η γενετική συσχέτιση του HLA-B27 με την Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα είναι γνωστή από παλιά (4). Ωστόσο, ποιος είναι ο παθογενετικός του ρόλος δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Πολλές μελέτες έχουν θέσει το ερώτημα με ποικίλα αποτελέσματα. Το HLA-B27 δεν έχει αποδειχτεί ότι επηρεάζει την ακτινολογική πρόοδο στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα. Μόνο η CRP ήταν σημαντικός προγνωστικός δείκτης ακτινολογικής εξέλιξης σε ασθενείς που είχαν ακτινολογική επιδείνωση 10% κάθε 2 χρόνια (33). Συσχέτιση του HLAB27 με την 8

17 ακτινολογική επιδείνωση στην σπονδυλική στήλη δε βρέθηκε και σε άλλες μελέτες (34,35), ενώ άλλες γενετικές περιοχές του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας ταυτοποιήθηκαν επί ακτινολογικής επιδείνωσης στην Αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα (36,37). Μελέτες ολόκληρου του γονιδιώματος έχουν ταυτοποιήσει μερικούς γενετικούς συσχετισμούς με την Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, με κάποια από τα γονίδια όπως το ANTXR2 (anthrax toxin receptor 2) και το PTGER4 (prostaglandin E receptor 4, EP4) πιο ενδιαφέροντα, να σχετίζονται με κάποιον τρόπο με τον οστικό σχηματισμό (38,39), αλλά δεν έχουν ταυτοποιηθεί ειδικοί για τα οστά βιοδείκτες που εμπλέκονται άμεσα στο σχηματισμό συνδεσμόφυτων. Σε μια μελέτη ολόκληρου του γονιδιώματος βρέθηκαν συσχετισμοί με τα γονίδια HAPLN1, EDIL3 και ANO6 (40). Tο HAPLN1 κωδικοποιεί την hyaluronan και proteoglycan link protein 1, που σταθεροποιεί μακρομόρια στο χόνδρο και έχει σημασία στην ενδοχόνδρινη οστεοποιήση (41). Το EDIL3 είναι σημαντικό καθώς έχει βρεθεί ότι απουσία του σε ποντικίσια μοντέλα περιοδοντίτιδας οδήγησε σε αύξηση της ΙL-17, η οποία είναι σημαντική στην παθογένεια της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας, κι επίσης θεωρείται σημαντικό στην οργανογένεση και το σχηματισμό χόνδρου καθώς παρεμβαίνει στη σηματοδότηση μέσω Wnt και BMP πρωτεϊνών (42,43). Τέλος, το ΑΝΟ6 εκφράζεται στους οστεοβλάστες και η απόσβεσή του οδηγεί σε σκελετικές ανωμαλίες (44). Για κανένα ωστόσο από τα ανωτέρω γονίδια δεν έχει αποδειχθεί παθογενετικός ρόλος στο σχηματισμό συνδεσμόφυτων. Σε μια πρόσφατη γονιδιακή μελέτη που περιλάμβανε περισσότερους από 1000 ασθενείς, βρέθηκαν συσχετισμοί με την ακτινολογική βλάβη στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα με 2 SNPs(single-nucleotide polymorphisms) (35). Ο ένας εκ των δύο, ο rs , βρίσκεται μέσα στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον RANK (Receptor Activator of Nuclear Factor kb), υποδοχέα απαραίτητο για την ανάπτυξη των οστεοκλαστών, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι ο νέος 9

18 οστικός σχηματισμός και η ακτινολογική πρόοδος της νόσου είναι συνδεδεμένα με την οστική απώλεια. Ο έτερος πολυμορφισμός rs ήταν στο γονίδιο PTGS1 (prostaglandinendoperoxide synthase 1, cyclooxygenase 1), γεγονός που φέρνει στο προσκήνιο το ρόλο των προσταγλανδινών στον οστικό σχηματισμό στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα. Όλα τα ανωτέρω χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης Ο ρόλος των αναπτυξιακών μονοπατιών Η έρευνα για την κατανόηση των μονοπατιών που εμπλέκονται στο νέο οστικό σχηματισμό στην AΣ έχει επικεντρωθεί κυρίως στο Wnt,το BMP και το Hedgehog, καθώς γνωρίζουμε πλέον ότι η οστεοβλαστογένεση ελέγχεται κατά βάση από αναπτυξιακά μονοπάτια (45,46). Τα αναπτυξιακά μονοπάτια είναι ενεργά κυρίως κατά την εμβρυογένεση και η κύρια λειτουργία τους είναι να συντονίζουν την αύξηση και ανάπτυξη (47,48). Παρ όλα αυτά, μπορεί να ενεργοποιηθούν στην ενήλικο ζωή σαν αντίδραση στον ιστικό τραυματισμό. Συνεπώς το προτεινόμενο μοντέλο είναι ότι ένα αρχικό φλεγμονώδες ερέθισμα πυροδοτεί μοριακά μονοπάτια που ελέγχουν την οστεοπαραγωγή. Οι Wnt πρωτεΐνες είναι μια οικογένεια 19 εκκρινόμενων παραγόντων που δρουν ως συνδέτες για την ενεργοποίηση του μονοπατιού. Στο «κανονικό» Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι, η β-κατενίνη δρα ως μεταγραφικός συνενεργοποιητής της T-cell factor (TCF) οικογένειας των προσδενόμενων στο DNA πρωτεϊνών και προωθεί σήματα από διάφορες Wnt πρωτεΐνες τροποποιώντας την μεταγραφή γονιδίων. Συγκεκριμένα, οι Wnt συνδέτες προσδένονται στους επιφανειακούς υποδοχείς, Frizzled (Fz) και LRP5/6 για να ενεργοποιήσουν το Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι. Απουσία Wnt σημάτων, ένα σύμπλεγμα «καταστροφής», αποτελούμενο από την ΑPC, την αξίνη, την glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) και την καζεϊνική κινάση (CK), 10

19 φωσφορυλιώνει τη β-κατενίνη οδηγώντας στην αποδόμησή της. Η πρόσδεση των Wnts στο σύμπλεγμα υποδοχέων που αποτελείται από την LRP5/6 και ένα μέλος της οικογένειας των frizzled πρωτεϊνών, αποσταθεροποιεί το σύμπλεγμα «καταστροφής» και αποτρέπει την αποδόμηση της β-κατενίνης. Τότε, η μη φωσφορυλιωμένη β-κατενίνη συσσωρεύεται και μετακινείται στον πυρήνα, όπου προσδένεται στην οικογένεια των TCF πρωτεϊνών και διεγείρει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (49 51) (Εικόνα 4). Το μονοπάτι ρυθμίζεται από ανασταλτικά μόρια όπως το Dickkopf-1 (Dkk-1) και η σκληροστίνη. Η κυρίαρχη άποψη είναι ότι το Dkk-1 προσδένεται στα LRP5/6 και Kremen, οδηγώντας σε ταχεία ενδοκυττάρωση του συμπλέγματος, «απογυμνώνει» ουσιαστικά την κυτταρική μεμβράνη από LRP5/6 υποδοχείς και αναστέλλει το μονοπάτι (52). Ωστόσο, υπάρχουν επίσης δεδομένα που εισηγούνται ότι το Dkk-1 ανταγωνίζεται απευθείας με τις Wnt πρωτεΐνες για την πρόσδεση στο LRP6, διαταράσσοντας έτσι τον επαγόμενα από αυτές σχηματισμό του Fz-LRP6 συμπλέγματος (53,54). Το Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι άρχισε να μελετάται στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, όταν το Dkk-1, βρέθηκε να είναι χαμηλότερο στον ορό των ασθενών με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες και τους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα (55). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει στο παρελθόν ότι τα επίπεδα του Dkk-1 είναι αυξημένα στον ορό των ασθενών με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, ωστόσο το μόριο είναι δυσλειτουργικό στους ασθενείς αυτούς, ενισχύοντας την υπόθεση ότι ελαττωματική αναστολή της σηματοδότησης του Wnt μονοπατιού, μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη οστεοβλαστική δραστηριότητα (56). Σε διάφορες μελέτες, η αναστολή του Dkk-1 οδήγησε σε σχηματισμό συνδεσμόφυτων και σύντηξη των ιερολαγονιων αρθρώσεων σε TNF-διαγονιδιακά ποντίκια (55,57). Τέλος, χαμηλότερα επίπεδα Dkk-1 έχουν βρεθεί σε ασθενείς με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα που αναπτύσσουν 11

20 νέα συνδεσμόφυτα σε διαδοχικές ακτινογραφίες, σε σύγκριση με εκείνους που δεν αναπτύσσουν (58). Eικόνα 4: Το Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι ανενεργό (πάνω) και ενεργό (κάτω) (D.Daoussis, AP Andonopoulos Seminars in Arthritis and Rheumatism, 2011 Oct;41(2):170-7) Ένας άλλος πιθανός μεσολαβητής του οστικού σχηματισμού στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα είναι το BMP (Bone Morphοgenetic Proteins) μονοπάτι. Οι BMPs αποτελούν μια ομάδα σηματοδοτικών μορίων, που ανήκουν στην υπεροικογένεια των Transforming Growth Factor-β (TGF-β) πρωτεϊνών. Στο «κανονικό μονοπάτι», οι BMPs εκκινούν το σηματοδοτικό καταρράκτη με την πρόσδεσή τους στους υποδοχείς κινασών 12

21 σερίνης/θρεονίνης τύπου Ι και ΙΙ, και σχηματίζουν ένα ετεροτετραμερές σύμπλεγμα. Τότε ο ενεργός υποδοχέας τύπου ΙΙ, μεταφωσφορυλιώνει τον υποδοχέα τύπου Ι και εκείνος με τη σειρά του φωσφορυλιώνει τα ρυθμίζόμενα από τους υποδοχείς Smads (receptor-regulated Smads, R-Smads) Smad1/5/8. Το φωσφορυλιωμένο Smad 1/5/8 συνδέεται με το Smad 4 και το σύμπλεγμα μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου αλληλεπιδρά με συνυποδοχείς ή συγκαταστολείς, ώστε να ρυθμίσει τη γονιδιακή έκφραση. Η BMP σηματοδότηση ελέγχεται εξωκυττάρια (Noggin), ενδοκυττάρια (FKBP12, micrornas, φωσφατάσες και-smads), και από συνυποδοχείς στην πλασματοκυτταρική μεμβράνη (Endoglin) (59,60) Εικόνα 5. Τα επίπεδα των BMPs έχει βρεθεί ότι είναι υψηλότερα στους ασθενείς με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, και η μεσολαβούμενη από κυτταροκίνες ενεργοποίηση των BMPs ήταν υψηλότερη στους ασθενείς με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα με μεγαλύτερη ακτινολογική πρόοδο, σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες και με ασθενείς με Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα με ηπιότερη νόσο (61,62). Επίσης, η σηματοδότηση μέσω BMPs έχει δειχτεί ότι επηρεάζει τόσο την έναρξη, όσο και την πρόοδο της ενδοχόνδρινης οστεοποίησης που ξεκινά από το περιόστεο και την ένθεση, σε ένα ποντικίσιο μοντέλο ενθεσίτιδας και σπονδυλοαρθροπάθειας. Η υπερέκφραση του noggin, ενός ανταγωνιστή του μονοπατιού, ήταν αποτελεσματική προληπτικά και θεραπευτικά στο συγκεκριμένο μοντέλο (63). Στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα τα συνδεσμόφυτα σχηματίζονται κυρίως μέσω της διαδικασίας της ενδοχόνδρινης οστεοποίησης (64,65) και το Hedgehog (HH) μονοπάτι είναι ο κύριος ρυθμιστής της διαδικασίας αυτής (66). Επιπλέον, υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του σχηματισμού οστεόφυτων και της ενεργοποίησης του μονοπατιού. Το HH μονοπάτι έχει βρεθεί ότι είναι ενεργό στα οστεόφυτα στην οστεοαρθρίτιδα, σε ζωικά μοντέλα και ανθρώπους (67). Η φαρμακευτική αναστολή του μονοπατιού αναστέλει το σχηματισμό 13

22 οστεόφυτων σε πειραματικά μοντέλα φλεγμονώδους αρθρίτιδας χωρίς επίδραση στη φλεγμονή (68). Η έκτοπη οστεοποίηση στην προοδευτική οστική ετεροπλασία, ένα σπάνιο γενετικό νόσημα, βρέθηκε ότι εξαρτάται από την ΗΗ σηματοδότηση. H αναστολή του μονοπατιού σε πειραματικά μοντέλα αναστέλλει σημαντικά την έκτοπη οστεοποίηση (69). Η ομάδα μας έδειξε πρόσφατα ότι τα επίπεδα του Indian Hedgehog (IHH), του κύριου συνδέτη του μονοπατιού στο σκελετό, είναι αυξημένα στους ασθενείς με Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα και ότι η χορήγηση αντι-tnfα σχετίζεται με μειωμένα επίπεδα ΙHH στους ασθενείς αυτούς και καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων στόχων του μονοπατιού σε ένα πειραματικό κυτταρικό μοντέλο (70). Συνεπώς πολλά πιθανά μονοπάτια εμπλέκονται στον οστικό σχηματισμό και κάποια από αυτά μπορεί να συνδέονται με την Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα ή κάποιο σχετικό ζωικό μοντέλο, ωστόσο μας διαφεύγει κάποιο πιθανό κοινό τελικό μονοπάτι που οδηγεί στον οστικό σχηματισμό στη νόσο, καθώς και ο σύνδεσμος μεταξύ φλεγμονής και οστικού σχηματισμού. 14

23 Εικόνα 5: Το κανονικό BMP σηματοδοτικό μονοπάτι (τροποποιημένη από Wang et al.. Genes Dis. 2014;1(1):87 105) Η σχέση της φλεγμονής με το νέο οστικό σχηματισμό Καθώς οι θεραπείες με αντι-tnfα και μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη, παρά την αποτελεσματικότητά τους στην καταστολή της φλεγμονής στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, δεν αποδείχτηκαν ικανές να αναστείλουν ξεκάθαρα την ακτινολογική εξέλιξη της νόσου (29 32), αναπτύχθηκαν διάφορες υποθέσεις για να εξηγήσουν τη σχέση φλεγμονής οστεοπαραγωγής. Η σχέση μεταξύ TNFα και Dkk-1 κέρδισε περισσότερη προσοχή. Δεδομένα από πειραματικά μοντέλα υποδηλώνουν ότι ο TNFα είναι ένας από τους κύριους διεγέρτες του Dkk- 15

24 1 (55). Στην πραγματικότητα, έχει προταθεί ότι η φλεγμονή γενικά και ο TNFα ειδικά, πιθανόν ενεργούν ως μοριακό φρένο, αναστέλλοντας το σχηματισμό νέου οστού και η πρόταση αυτή είναι η επονομαζόμενη TNF brake hypothesis (71,72). Με βάση τα ευρήματα αυτά, μπορεί να υποθέσει κανείς ότι η λύση της φλεγμονής ακολουθούμενη από φαρμακευτική αναστολή του TNFα μπορεί στην πραγματικότητα να ενισχύσει προσωρινά το σχηματισμό νέου οστού στην Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα. Οι αυξήσεις στα κυκλοφορούντα επίπεδα του Dkk-1 που ακολουθούν τη χορήγηση αντι-tnfα (56) μπορεί να αντανακλούν έναν πιθανό αντισταθμιστικό μηχανισμό, για να μετριάσει την Wnt σηματοδότηση, ο οποίος ενεργοποιείται μετά τη λύση της φλεγμονής στην AΣ. Έχει προταθεί ότι η φλεγμονή στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα είναι περιοδική, παρά εμμένουσα, δίνοντας παράθυρο ευκαιρίας για ιστική επιδιόρθωση, μια διαδικασία που δεν ελέγχεται σωστά, οδηγώντας σε ιστική βλάβη (73). Ο Lories και η ομάδα του πρότειναν ότι η φλεγμονή και ο νέος οστικός σχηματισμός είναι γενικά συνδεδεμένα αλλά μοριακά ανεξάρτητα φαινόμενα, και θα μπορούσαν να πυροδοτηθούν και τα δύο από βλάβη ή σήματα κινδύνου στην ένθεση (65). Πιο πρόσφατα, στις ποντικίσιες ενθέσεις έχει ανακαλυφθεί ένας πληθυσμός Τ κυττάρων, θετικών για τον υποδοχέα της ΙL23. Τα συγκεκριμένα κύτταρα απαντούν στη διέγερση της ΙL23 με αύξηση της έκφρασης των προφλεγμονωδών κυττοκινών TNFa, IL17 και IL22. Επιπλέον η ΙL23 διεγείρει την BMP σηματοδότηση στην ένθεση. Ιn vivo στα ποντίκια, η υπερέκφραση της IL23 προκαλεί ενθεσίτιδα και αρθρίτιδα, με χαρακτηριστικά που μοιάζουν με σπονδυλοαρθρίτιδα, φλεγμονή και οστικό σχηματισμό. Το ΗLA-B27, η εντερική φλεγμονή και το μηχανικό stress, έχουν προταθεί ως ερεθίσματα για την τοπική ή συστηματική ενεργοποίηση στη ΙL23 (74). Οι κλινικές μελέτες επίσης, δίνουν κάποιες ενδείξεις για τη σχέση φλεγμονής οστικού σχηματισμού στη νόσο. Οι δείκτες φλεγμονής όπως η CRP και η ταχύτητα καθίζησης ερυθρών, θεωρούνται προγνωστικοί δείκτες ακτινολογικής εξέλιξης 16

25 της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας (75). Επίσης οι σπονδυλικές γωνίες με φλεγμονή στη μαγνητική τομογραφία είναι πιο πιθανές θέσεις για ανάπτυξη συνδεσμοφύτων (71), και η λύση της φλεγμονής που συνοδεύεται με εναπόθεση λίπους οδηγεί στο σχηματισμό συνδεσμοφυτων(76,77). Το ότι πολλά συνδεσμόφυτα αναπτύσσονται σε περιοχές που δεν εμφάνιζαν σημεία φλεγμονής στη μαγνητική τομογραφία, ενδεχομένως οφείλεται στο γεγονός ότι η φλεγμονή στην Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα είναι μια δυναμική διαδικασία. 17

26 1.2 Σεροτονίνη (5-ΗΤ) Βιοσύνθεση και δομή της σεροτονίνης Η σεροτονίνη (5-υδροξυτρυπταμίνη, 5-ΗΤ) ταυτοποιήθηκε το 1948 ως μόριο που υπάρχει στον ορό (serum, sero-) ικανό να προκαλέσει αγγειοσυστολή (-tonin) (78). Eίναι μία βιοαμίνη που παράγεται στους ραχιαίους και κοιλιακούς νευρώνες του στελέχους και στα εντεροχρωμαφινικά κύτταρα του δωδεκαδακτύλου (79). Συντίθεται από το αμινοξύ L-τρυπτοφάνη μέσω ενός μεταβολικού μονοπατιού που αποτελείται από δύο ένζυμα, την υδροξυλάση της τρυπτοφάνης (tryptophan hydroxylase, Tph) και το αρωματικό αμινοξύ αποκαρβοξυλάση (decarboxylase,ddc) (80). Η αντίδραση που διαμεσολαβείται από την Tph αποτελεί το περιοριστικό βήμα του μονοπατιού. Συγκεκριμένα η L-τρυπτοφάνη μετατρέπεται σε L-5- τρυπτοφάνη μέσω της Tph. Έπειτα, το ενδιάμεσο προϊόν μετατρέπεται σε σεροτονίνη από την DDC. (σχήμα 1). Συνεπώς, η Tph αποτελεί το δείκτη της σύνθεσης σεροτονίνης. Υπάρχουν δύο γονίδια που κωδικοποιούν την Tph, το ΤPH1 και το TPH2. To TPH1 εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά στα κύτταρα του δωδεκαδακτύλου και το προϊόν του είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση της περιφερικής σεροτονίνης, η οποία αντιπροσωπεύει το 95% της συνολικής σεροτονίνης. Η έκφραση του TPH1 σε άλλους ιστούς είναι τουλάχιστον φορές χαμηλότερη, κι έτσι το ΤPΗ1 θεωρείται ειδικό για το δωδεκαδάκτυλο γονίδιο και η παραγωγή της περιφερικής σεροτονίνης, ως ειδική για το δωδεκαδάκτυλο διαδικασία. Το έτερο ΤPH γονίδιο, το TPH2, εκφράζεται αποκλειστικά στους νευρώνες του κεντρικού νευρικού συστήματος, και έτσι το προϊόν του είναι υπεύθυνο για την παραγωγή της κεντρικής σεροτονίνης μόνο (81). Συνεπώς αν και η υδροξυλάση της τρυπτοφάνης έχει βρεθεί ότι είναι 18

27 παρούσα σε τέσσερις δομές, τον αδένα της υπόφυσης, τους σεροτονινεργικούς νευρώνες στους πυρήνες του στελέχους που επεκτείνονται σε όλες τις περιοχές του εγκεφάλου, στα εντεροχρωμαφινικά κύτταρα και στους μυεντερικούς νευρώνες του εντέρου (82,83), το ένζυμο υπάρχει σε δύο ισομορφές: την Tph1, η οποία ανευρίσκεται σε διάφορους ιστούς (αλλά κυρίως στο δωδεκαδάκτυλο) και την Tph2, η οποία αποτελεί την ειδική για το νευρικό σύστημα ισομορφή Σχήμα 1: Βιοσύνθεση της σεροτονίνης 19

28 1.2.2 Σηματοδότηση και βιολογικές λειτουργίες της σεροτονίνης Η σεροτονίνη δε διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (79), λόγω του θετικού φορτίου της σε φυσιολογικό ph, συνεπώς είναι ένα μόριο με διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες, ανάλογα με το σημείο σύνθεσής της. Ενώ η παραγόμενη στον εγκέφαλο σεροτονίνη (brain derived serotonin, BDS), σχετίζεται με τις γνωστικές λειτουργίες (84), οι δράσεις της σεροτονίνης που συντίθεται στο έντερο (gut-derived serotonin, GDS), αποτελούν ακόμα σημείο συζήτησης. Η φυσιολογία της σεροτονίνης είναι περίπλοκη και περιλαμβάνει τη σύνθεση, τη μεταφορά την επαναπρόσληψη και την ενεργοποίηση των υποδοχέων (81). Οι υποδοχείς για τη σεροτονίνη αποτελούνται από τουλάχιστον 7 κύριες οικογένειες και τουλάχιστον 14 υποτύπους, και έχουν βρεθεί σε πολλούς ιστούς τόσο κεντρικά όσο και περιφερικά (85) Κεντρικώς παραγόμενη σεροτονίνη Στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα η σεροτονίνη συντίθεται και απελευθερώνεται από τους σεροτονινεργικούς νευρώνες, οι οποίοι βρίσκονται κυρίως στους ραχιαίους διάμεσους και ουραίους πυρήνες του στελέχους (85,86). Η κεντρικώς συντιθέμενη σεροτονίνη επηρεάζει ένα φάσμα συμπεριφορικών και γνωστικών λειτουργιών. Οι δράσεις αυτές μεσολαβούνται μέσω επτά οικογενειών διαμεμβρανικών 5-HT υποδοχέων (5-HT1 ως 5- HT7) (87). Η χωροχρονική σηματοδότηση της σεροτονίνης ρυθμίζεται στενά μέσω ενός 5-ΗΤ μεταφορέα πλασματικής μεμβράνης (5-HT transporter,5-htt) γνωστού και ως SERT. O 5-HTT ρυθμίζει τις δράσεις της σεροτονίνης μεταφέροντας ενεργά τη 20

29 σεροτονίνη μέσα στα κύτταρα μεσω διαμεμβρανικής κλίσης ιόντων και ενός εσωτερικού μεμβρανικού αρνητικού δυναμικού (Σχήμα 2A). Συγκεκριμένα, η σεροτονίνη συντίθεται στους προσυναπτικούς νευρώνες και αποθηκεύεται σε κυστίδια. Η σεροτονίνη που απελευθερώνεται από τα κυστίδια ενεργοποιεί τους μετασυναπτικούς υποδοχείς, ώστε να διεγείρουν τους μετασυναπτικούς νευρώνες. Οι συνδεδεμένοι στη μεμβράνη μεταφορείς (5-ΗΤΤ) επαναπροσλαμβάνουν την απελευθερωμένη σεροτονίνη για να ελέγξουν τη διάρκεια δράσης της και την ανακυκλώνουν ή την αποδομούν. Η σηματοδότηση της κεντρικής σεροτονίνης αποτελεί συχνό θεραπευτικό στόχο, καθώς φαίνεται να παίζει ρόλο κλειδί στη μείζονα καταθλιπτική διαταραχή και άλλες συναισθηματικές διαταραχές (88). Φαρμακευτικοί αναστολείς του 5-ΗΤΤ, όπως οι εκλεκτικοί αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης (SSRIs) είναι εξαιρετικά δημοφιλείς στην κλινική πράξη καθώς δίνουν την ευκαιρία στη σεροτονίνη να παραμείνει περισσότερο χρόνο στο χάσμα μεταξύ των συνάψεων και με αυτόν τον τρόπο ενισχύουν τη δράση της και έχει δειχθεί ότι ανακουφίζουν τα καταθλιπτικά συμπτώματα (Σχήμα 2B) (87,89). Ένα από τα μονοπάτια σηματοδότησης της σεροτονίνης είναι μέσω των συνδεδεμένων με G πρωτεΐνες διαμεμβρανικών υποδοχέων. Mετά την πρόσδεση της σεροτονίνης στον υποδοχέα, ενεργοποιείται η G πρωτεΐνη. Με τον τρόπο αυτό ενεργοποιείται η παραγωγή αδενυλικής κυκλάσης, η οποία καταλύει το σχηματισμό κυκλικού ΑΜP (camp). H αύξηση του camp ενεργοποιεί μία camp-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (protein kinase Α, PKA). Μέρος της ενεργοποιημένης PKA μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου φωσφορυλιώνει και με αυτόν τον τρόπο ενεργοποιεί την πρωτεΐνη CREB-1 (camp Response Element Binding protein-1), η οποία προσδένεται στο camp Response 21

30 Element (μια αλληλουχία DNA στους εκκινητές πολλών γονιδίων, οδηγώντας στη μεταγραφή τους). (Σχήμα 3) Σχήμα 2: Σηματοδότηση της σεροτονίνης στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (Warden SJ et al, Bone. 2010;46(1):4 12) 22

31 Σχήμα 3: Ενδοκυττάρια σηματοδότηση της σεροτονίνης (από biologypages.info) Περιφερική σεροτονίνη Απ όσο γνωρίζαμε ως τώρα, οι περιφερικές δράσεις της σεροτονίνης συμβαίνουν μέσω τοπικής σύνθεσης στα εντεροχρωμαφινικά κύτταρα του εντέρου όπου δρα ως παρακρινής παράγοντας με 23

32 κύρια λειτουργία τη ρύθμιση του περισταλτισμού του εντέρου και την έκκριση βλέννης, ενώ η έκκρισή της πυροδοτείται μεταγευματικά από την τροφή (81). Στο έντερο ο διαμεμβρανικός μεταφορέας 5-ΗΤΤ βρίσκεται στα επιθηλιακά κύτταρα και όπως και στο κεντρικό νευρικό σύστημα η λειτουργία του είναι να απενεργοποιεί την τοπικά παραγόμενη σεροτονίνη μέσω επαναπρόσληψης. Μετά τη σύνθεσή της η περιφερική σεροτονίνη απελευθερώνεται στην κυκλοφορία, όπου στο μεγαλύτερο μέρος της προσλαμβάνεται από τα αιμοπετάλια μέσω του ειδικού μεταφορέα 5-HTT (90). Τα αιμοπετάλια δεν μπορούν να συνθέσουν σεροτονίνη γιατί δε διαθέτουν υδροξυλάση της τρυπτοφάνης. Αποθηκεύουν τη σεροτονίνη σε πυκνά κοκκία και την απελευθερώνουν μετά από ενεργοποίηση για να διεγείρουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων και το σχηματισμό θρόμβου μετά από ιστικό τραυματισμό, καθώς και άλλες φυσιολογικές δράσεις όπως η αγγειοσυστολή ή αγγειοδιαστολή (αναλόγως με τους υποδοχείς σεροτονίνης που ενεργοποιούνται κάθε φορά), και την υπερτροφία και υπερπλασία των λείων μυικών κυττάρων, (86,91,92). Ένα μικρό ποσοστό της σεροτονίνης ωστόσο, που δεν προσλαμβάνεται από τα αιμοπετάλια (περίπου 5%, της συνολικής) παραμένει ελεύθερο στο πλάσμα, και παρότι η λειτουργία αυτής της εξωκυττάριας σεροτονίνης είναι άγνωστη, πιθανολογείται ότι δρα ως ορμόνη μετά την πρόσδεσή της σε υποδοχείς της που υπάρχουν σε κύτταρα στόχους (93) Ρύθμιση της οστικής μάζας από τη σεροτονίνη Πρόσφατα κλινικά και πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι η σεροτονίνη αποτελεί ισχυρό ρυθμιστή της οστικής μάζας (94 96) τόσο μέσω κεντρικών όσο και περιφερικών μηχανισμών. Αρχικά, υποδοχείς σεροτονίνης έχουν ανιχνευθεί σε οστεοβλάστες, οστεοκύτταρα και οστεοκλάστες και η διέγερση των υποδοχέων αυτών επηρεάζει τις δραστηριότητες των ανωτέρω κυττάρων. Ομοίως, κάθε οστικός κυτταρικός τύπος διαθέτει 5-HTT ειδικό για την πρόσληψη 24

33 της σεροτονίνης στα κύτταρα αυτά. Τα παραπάνω υποδεικνύουν ότι τα οστικά κύτταρα διαθέτουν λειτουργικά σηματοδοτικά μονοπάτια, τόσο για να ρυθμίζουν την πρόσληψη σεροτονίνης όσο και για να απαντούν σε αυτή (97 101) Ρύθμιση της οστεοβλαστογένεσης από την περιφερική σεροτονίνη-προτεινόμενο μοντέλο Ο Yadav και οι συνεργάτες του έκαναν μια σειρά πειραμάτων καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι η κυκλοφορούσα στον ορό σεροτονίνη αναστέλει τον οστεοβλαστικό πολλαπλασιασμό με ενδοκρινή τρόπο (94). O αρχικός τους στόχος ήταν να μελετήσουν καλύτερα το πώς διαμεσολαβεί η LRP5 πρωτεΐνη ( LDL-receptor related protein 5) τις δράσεις της στο σκελετό. Η LRP5 αποτελεί έναν από τους πιο καλά μελετημένους ρυθμιστές του remodeling του οστού (102). Το ενδιαφέρον για τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη πηγάζει από το γεγονός ότι διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο που την κωδικοποιεί, προκαλούν δύο αντιδιαμετρικές οστικές νόσους, γεγονός που καθιστά σημαντικά για τη ρύθμιση του οστικού σχηματισμού τα μονοπάτια τα οποία ελέγχονται από αυτήν. Συγκεκριμένα, μεταλλάξεις απώλειας της λειτουργικότητας του γονιδίου, προκαλούν το σύνδρομο οστεοπόρωσης ψευδογλοιώματος (OPPG syndrome), ένα σπάνιο νόσημα που χαρακτηρίζεται από βαριά οστεοπόρωση, παραμονή της εμβρυικής οφθαλμικής κυκλοφορίας και τύφλωση (103). Από την άλλη μεριά μεταλλάξεις αυξημένης λειτουργικότητας στο LRP5 προκαλούν το σύνδρομο υψηλής οστικής μάζας (high bone mass syndrome, HBM) (104). Η LRP5 θεωρείται συνυποδοχέας για το Wnt μονοπάτι (105), το οποίο είναι σημαντικό για την οστεοβλαστογένεση και η αρχική υπόθεση ήταν ότι τα ανωτέρω νοσήματα είναι αποτέλεσμα αυξημένης ή μειωμένης σηματοδότησης του Wnt μονοπατιού. Υπήρχαν όμως κάποιες παρατηρήσεις που δικαιολογούσαν περαιτέρω διερεύνηση του τρόπου δράσης του συγκεκριμένου γονιδίου στους οστεοβλάστες. Αρχικά τα Lrp5 -/- ζωικά μοντέλα δεν 25

34 παρουσίαζαν εμφανές σκελετικό έλλειμμα. Δεύτερον, μεταλλάξεις ενισχυτικές για το LRP5 δεν προκαλούν οστικούς όγκους, όπως κάνει σε άλλα όργανα η αύξηση της Wnt σηματοδότησης (106). Και τρίτον, ειδικές για τους οστεοβλάστες μεταλλάξεις αύξησης ή απώλειας της λειτουργικότητας της β-κατενίνης, του κύριου μορίου για τη Wnt σηματοδότηση, δεν επηρεάζουν ούτε τον οστικό σχηματισμό όυτε την έκφραση γονιδίων που απορυθμίζονται μετά την απενεργοποίηση του LRP5 (107). Μέσα από μια σειρά πειραμάτων, παρατήρησαν ότι το TPH1 είναι το πιο υψηλά εκφραζόμενο γονίδιο στα Lrp5 - / - οστά και ότι τα Lrp5 - / - ποντίκια εμφάνιζαν επίσης υπερέκφραση του TPH1 στο δωδεκαδάκτυλο, ταυτόχρονα με αυξημένα επίπεδα σεροτονίνης ορού (94). Επιπλέον, η σεροτονίνη σε μια συγκέντρωση της τάξης των 50μΜ (πολλαπλάσια από εκείνη που ανευρίσκεται στον ανθρώπινο ορό) ανέστειλε ex vivo τον πολλαπλασιασμό οστεοβλαστών, τόσο από Lrp5 - / -, όσο και από wild type ποντίκια. Τα Lrp5 - / - ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε δίαιτα χαμηλή σε τρυπτοφάνη ή αναστολέας της σύνθεσης τρυπτοφάνης μείωσαν τα επίπεδα σεροτονίνης ορού παράλληλα με αποκατάσταση του σκελετικού τους φαινότυπου. Τα ανωτέρω ευρήματα αποτέλεσαν ένδειξη ότι τα υψηλά επίπεδα κυκλοφορούσας σεροτονίνης συμβάλουν στο μειωμένο οστικό σχηματισμό και οστική μάζα που παρατηρείται στα Lrp5 - / - ποντίκια. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη σχέση μεταξύ LRP5, σεροτονίνης και οστού, έφτιαξαν ποντίκια με μεταλλάξεις απώλειας ή αύξησης της λειτουργικότητας του LRP5 ειδικές είτε για το έντερο ή για το οστό. Η ειδική για το έντερο απόσβεση του LRP5 οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα κυκλοφορούσας σεροτονίνης και στο σκελετικό φαινότυπο των Lrp5 - / - ποντικών, ενώ η ειδική για τους οστεοβλάστες απόσβεση του LRP5 όχι. Αντίστοιχα η υπερέκφραση του LRP5 στο έντερο, είχε αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων κυκλοφορούσας σεροτονίνης και φαινότυπο υψηλής οστικής μάζας, ενώ η ειδική για τους οστεοβλάστες υπερέκφραση του LRP5, όχι. Τα παραπάνω υποδεικνύουν ότι το LRP5 26

35 ρυθμίζει τον οστικό σχηματισμό έμμεσα μέσω του εντέρου, παρά με απευθείας δράση στους οστεοβλάστες. Τέλος προσπάθησαν να ταυτοποιήσουν το μηχανισμό μέσω του οποίου η σεροτονίνη επηρεάζει τους οστεοβλάστες. Βρήκαν ότι τρεις υποδοχείς σεροτονίνης Σχήμα 4: Μοντέλο LRP5 εξαρτώμενου οστικού σχηματισμού (Yadav VK et al Cell. 2008;135(5):825 37) εκφράζονται στους οστεοβλάστες οι 5-HTR1B, 2A, and 2B, ωστόσο τα ποντίκια με απόσβεση στους 2 τελευταίους δεν εμφάνιζαν συγκεκριμένο σκελετικό φαινότυπο, σε αντίθεση με τα ποντίκια με πλήρη ή ειδική για τους οστεοβλάστες απόσβεση ενός μόνο αλληλίου του HTR1B, τα οποία εμφάνιζαν High Bone Mass φαινότυπο, υποδεικνύοντας ότι ο συγκεκριμένος υποδοχέας διαμεσολαβεί τις δράσεις της σεροτονίνης στους οστεοβλάστες. Με περαιτέρω 27

36 πειράματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της σεροτονίνης στον HTR1B των οστεοβλαστών οδηγεί σε μειωμένη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα CREB από την πρωτεϊνική κινάση Α, με αποτέλεσμα μειωμένη μεταγραφή των γονιδίων των κυκλινών (συγκεκριμένα της CycD1) και μειωμένο οστεοβλαστικό πολλαπλασιασμό. Από τα παραπάνω δειχθηκε ότι η κυκλοφορούσα σεροτονίνη έχει ενδοκρινή ρόλο. Συγκεκριμένα, το προτεινόμενο μοντέλο φαίνεται στο Σχήμα 4. Η LRP5 ευοδώνει τον οστικό σχηματισμό και την αύξηση της οστικής μάζας αναστέλλοντας την έκφραση της Τph1 και της σύνθεσης της σεροτονίνης στα εντεροχρωμαφινικά κύτταρα. Η παραγόμενη από το έντερο σεροτονίνη προσδένεται στον υποδοχέα της Htr1b που βρίσκεται στην κυτταρική επιφάνεια των οστεοβλαστών, οδηγώντας σε μειωμένη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα CREB και τελικά σε αναστολή του οστεοβλαστικού πολλαπλασιασμού. Η επόμενη σκέψη ήταν ότι αφού η περιφερική σεροτονίνη αναστέλει τον οστικό σχηματισμό ενδεχομένως ένας αναστολέας της σύνθεσής της στο έντερο θα μπορούσε να θεραπεύσει την οστεοπόρωση μέσω αναβολικού μηχανισμού. Έτσι η ίδια ομάδα χρησιμοποίησε το LP533401, ένα μικρό μόριο αναστολέα τόσο της Τph1 όσο και της Tph2, το οποίο ωστόσο δε διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και συνεπώς δεν επηρεάζει τη σύνθεση της κεντρικής σεροτονίνης, παρά μόνο την TPH1 στην περιφέρεια. To LP αναστέλλει την ενζυμική δραστηριότητα του Tph1, αλληλεπιδρώντας με τα αμινοξέα Tyr235 and Phe241, τα οποία βρίσκονται κοντά στο καταλυτικό του κέντρο (108). Το συγκεκριμένο μόριο έχει συντεθεί για να δοκιμαστεί στην αντιμετώπιση του Συνδρόμου Ευερέθιστου Εντέρου (109). Η από του στόματος χορήγηση του LP533401, μία φορά την ημέρα για διάστημα ως έξι εβδομάδες σε ποντίκια, μείωσε τα επίπεδα της παραγόμενης από το έντερο σεροτονίνης, προλαμβάνοντας την οστική απώλεια και 28

37 μπορούσε ακόμη και να θεραπεύσει την εγκατεστημένη οστεοπόρωση σε ποντίκια που είχαν υποστεί ωοθηκεκτομή, μέσω αύξησης της οστικής μάζας, υποδεικνύοντας έναν πανίσχυρο ρόλο για την σεροτονίνη ως μοριακό φρένο για την οστεοβλαστογένεση/νέο οστικό σχηματισμό (108). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι τα ανωτέρω αποτελέσματα επιτυγχάνονταν με μέτρια μείωση των επιπέδων σεροτονίνης ορού (της τάξης κάτω του 50%), χωρίς να προκαλείται αιμόσταση ή εντεροκινητικές διαταραχές. Aυτά τα ενδιαφέροντα νέα δεδομένα, εισηγούνται την ύπαρξη ενός προηγουμένως αγνωστου άξονα εντέρου-οστού με σημαντικές βιολογικές προεκτάσεις (110,111) Ρύθμιση της οστικής μάζας από την κεντρικώς παραγόμενη σεροτονίνη-προτεινόμενο μοντέλο Το γεγονός ότι η περιφερική σεροτονίνη επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών, έγειρε το ερώτημα αν η σεροτονίνη που παράγεται στον εγκέφαλο, επίσης έχει ρόλο στη ρύθμιση της οστικής μάζας. Η ίδια ομάδα ερευνητών διερεύνησε την αλληλεπίδραση μεταξύ λεπτίνης και σεροτονίνης στη ρύθμιση της οστικής μάζας, στην κατανάλωση ενέργειας και στην όρεξη (112). H λεπτίνη είναι μια ορμόνη η οποία ρυθμίζει ευρύ φάσμα ομοιοστατικών λειτουργιών μετά την πρόσδεσή της στον υποδοχέα της ObRb, στους νευρώνες του κεντρικού νευρικού συστήματος. Μια από τις ομοιοστατικές λειτουργίες που ελέγχει στους ανθρώπους, είναι το οστικό remodeling (113,114). Eπηρεάζει το remodeling του οστού μέσω του τόνου του συμπαθητικού, που αναστέλει τον οστικό σχηματισμό και ευοδώνει την οστική απορρόφηση μέσω των β2 αδρενεργικών υποδοχέων (β2 adrenergic receptor, Adrβ2) στους οστεοβλάστες (115). Ενώ οι νευρώνες που διαμεσολαβούν τη ρύθμιση της οστικής μάζας από τη λεπτίνη 29

38 φαίνεται να είναι εκείνοι των μεσοκοιλιακών πυρήνων του υποθαλάμου (ventromedial hypothalamic, VMH), οι οποίοι επηρεάζουν τη δραστηριότητα του συμπαθητικού (116), η απόσβεση του υποδοχέα ObRb της λεπτίνης στους νευρώνες των VMH πυρήνων σε ποντίκια, δε φάνηκε, να επηρεάζει την οστική μάζα (117). Το εύρημα αυτό υποδείκνυε ότι η λεπτίνη είτε σηματοδοτεί πρώτα σε κάποιο άλλο σημείο του εγκεφάλου, είτε ότι αναστέλλει τη σύνθεση ενός ή περισσότερων νευροπεπτιδίων τα οποία με τη σειρά τους επηρεάζουν τους VMH νευρώνες. Έτσι ο Yadav και οι συνεργάτες του αναλύοντας τη συγκέντρωση νευροδιαβιβαστών σε ποντίκια που είχε αποσβεθεί το ObRb ανίχνευσαν μεγάλη αύξηση σεροτονίνης στο στέλεχος, ενώ η ενδοπαρεγκεφαλιδοκοιλιακή έγχυση λεπτίνης σε wild type ποντίκια, βρήκαν ότι μείωσε τη συγκέντρωση σεροτονίνης στον εγκέφαλο. Ακολούθησε μια σειρά πειραμάτων, μέσω της οποίας κατέληξαν στο παρακάτω μοντέλο για τη δράση της σεροτονίνης στο σκελετό. Η προερχόμενη από το λιπώδη ιστό λεπτίνη, καταστέλλει την έκφραση της Tph2 στο στέλεχος, οδηγώντας σε μειωμένα επίπεδα σεροτονίνης στον εγκέφαλο. Η σεροτονίνη που παράγεται στο στέλεχος του εγκεφάλου μέσω του ενζύμου Tph2, προσδένεται στον υποδοχέα της Htr2c, στους μεσοκοιλιακούς σεροτονινεργικούς νευρώνες του υποθαλάμου, αναστέλει τη σύνθεση της νορεπινεφρίνης κι έτσι μειώνει τον τόνο του συμπαθητικού νευρικού συστήματος. Αυτή η μείωση αναμεταδίδεται στους οστεοβλάστες ως μειωμένη σηματοδότηση μέσω του β2 αδρενεργικού υποδοχέα. Η σηματοδότηση μέσω του β2 αδρενεργικού υποδοχέα αναστέλλει τον οστεοβλαστικό πολλαπλασιασμό μέσω ενός καταρράκτη molecular clock γονιδίων/κυκλίνης D1 (Cyc D1) και ρυθμίζει την οστική απορρόφηση μέσω ενεργοποίησης ενός PKA/ATF4-εξαρτώμενου μονοπατιού, οδηγώντας σε αύξηση της σύνθεσης του RANKL, το οποίο ενεργοποιεί τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των οστεοκλαστών. Άρα η αναστολή του συμπαθητικού από την κεντρικά παραγόμενη σεροτονίνη αυξάνει την οστεοβλαστογένεση και 30

39 μειώνει την οστική απορρόφηση. (Σχήμα 5) Η λεπτίνη καταστέλοντας τη σύνθεση της σεροτονίνης στον εγκέφαλο, εμποδίζει την ευεργετική δράση της στη ρύθμιση της οστικής μάζας. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι σε αντίθεση με την περιφερική σεροτονίνη η οποία αναστέλλει τον οστικό σχηματισμό μέσω αναστολής της οστεοβλαστογένεσης, η κεντρικώς παραγόμενη σεροτονίνη ευοδώνει την οστική μάζα επιδρώντας και στα δύο σκέλη του remodeling του οστού (118). Σχήμα 5: Δράσεις της κεντρικής και περιφερικής σεροτονίνης στους οστεοβλάστες (από Ducy P Karsenty G, J Cell Biol. 2010;191(1):

40 Κλινικά δεδομένα για τη δράση της σεροτονίνης στο σκελετό Eκτός από τα in vitro και προκλινικά δεδομένα που δείχνουν ότι η σεροτονίνη διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της οστικής μάζας, υπάρχουν και κλινικές ενδείξεις για την ύπαρξη μιας τέτοιας σχέσης τόσο για την περιφερική όσο και για την κεντρικώς παραγόμενη σεροτονίνη (96) Κλινικά δεδομένα για τη ρύθμιση της οστικής μάζας από την περιφερική σεροτονίνη Kλινικά και επιδημιολογικά δεδομένα εισηγούνται ότι η GDS ενδεχομένως έχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της οστικής μάζας και στους ανθρώπους. Για παράδειγμα, αυτιστικά παιδιά τα οποία έχουν αυξημένα επίπεδα σεροτονίνης ορού, εμφανίζουν σημαντική μείωση στο πάχος του φλοιού των οστών (119,120). Το 2010 μια ομάδα ερευνητών μέτρησε τα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε ένα πληθυσμιακό δείγμα 275 γυναικών (121) και τα συσχέτισε με σκελετικές παραμέτρους που μετρήθηκαν με DXA (dual-energy x-ray absorptiometry), ποσοτικοποιημένη αξονική τομογραφία (QCT), και υψηλής ευκρίνειας περιφερική QCT. Βρέθηκε ότι τα επίπεδα σεροτονίνης ορού των γυναικών αυτών, σχετίζονταν αντίστροφα με την συνολική και τη σχετιζόμενη με την πυκνότητα των οστικών δοκίδων, οστική πυκνότητα του αυχένα του μηριαίου και το πάχος των οστικών δοκίδων σε όλες τις γυναίκες, με την οστική πυκνότητα των δοκίδων του αυχένα του μηριαίου στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες και με το λόγο BV/TV (bone volume/tissue volume) και την πυκνότητα των οστικών δοκίδων της κερκίδας στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, οι οποίες δεν βρίσκονταν υπό ορμονοθεραπεία. Οι συσχετισμοί αυτοί παρέμεναν στατιστικά σημαντικοί και κατόπιν πολυπαραμετρικής ανάλυσης που περιλάμβανε την ηλικία και το BMI (Βody Μass Ιndex), με τα επίπεδα της κυκλοφορούσας σεροτονίνης να αποτελούν ανεξάρτητο δείκτη για την οστική μάζα/δομή σε εκείνα τα σημεία. Συνεπώς η μελέτη έδειξε ότι μείωση της οστικής πυκνότητας σε συγκεκριμένα σημεία του 32

41 σκελετού, θα μπορούσε να συσχετιστεί με αύξηση των επιπέδων σεροτονίνης ορού. To 2010 τα επίπεδα σεροτονίνης σε platelet-poor plasma σε ασθενείς με ΗΒΜ σύνδρομο μετρήθηκαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με εκείνα των υγιών μαρτύρων (122), ενισχύοντας την υπόθεση ότι τα επίπεδα της κυκλοφορούσας σεροτονίνης διαμεσολαβούν την αυξημένη οστική μάζα, που απαντάται στους ανθρώπους που φέρουν ενισχυτικές μεταλλάξεις του LRP5. Το 2011 η ίδια ομάδα μελέτησε τη σχέση μεταξύ συνολικών επιπέδων σεροτονίνης ορού και φαινοτυπου των ανθρώπων με HBM (123). Η σεροτονίνη ορού ήταν χαμηλότερη στους ασθενείς με HBM σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Επίσης βρέθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ της σεροτονίνης ορού και της BMD και του πάχους του οστικού φλοιού. Μελέτες όπως οι παραπάνω, υποστηρίζουν την άποψη ότι η GDS αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή της οστικής μάζας στους ανθρώπους, όπως συμβαίνει και στα ποντίκια, και ενδεχομένως εισηγούνται ότι η αναστολή της σύνθεσής της θα μπορούσε να αποτελεί νέα θεραπευτική προσέγγιση για την οστεοπόρωση Κλινικά δεδομένα για τη ρύθμιση της οστικής μάζας από την κεντρική σεροτονίνη Μείωση της οστικής μάζας έχει παρατηρηθεί σε σχιζοφρενείς οι οποίοι λαμβάνουν ψυχοτρόπες ουσίες (124). Οι ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν αντιψυχωσική αγωγή έχει βρεθεί ότι έχουν υψηλότερο κίνδυνο για κάταγμα του ισχίου (125). Καθώς τα δεύτερης γενιάς αντιψυχωσικά [second-generation antipsychotics (SGAs)], δρουν μπλοκάροντας τον 5-HT2A υποδοχέα της σεροτονίνης θεωρήθηκε λογικό, ότι το να μπλοκάρεις τη σηματοδότηση της κεντρικής σεροτονίνης θα μπορούσε να έχει αρνητική επίδραση στην οστική μάζα. Ωστόσο, καθώς τα SGAs αναστέλλουν ασθενέστερα και τον D2 υποδοχέα της ντοπαμίνης, γεγονός το οποίο οδηγεί σε υπερπρολακτιναιμία (126) με συνέπεια επιτάχυνση της οστικής απορρόφησης, θεωρείται ότι η οστική απώλεια εξαιτίας των συγκεκριμένων φαρμάκων είναι πολυπαραγοντική και σχετίζεται 33

42 με αλλαγές τόσο στη σεροτονίνη όσο και στην προλακτίνη και τις γοναδοτροπίνες. Οι SSRIs, oι οποίοι έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την καταθλιπτική και άλλες ψυχιατρικές διαταραχές έχουν συσχετιστεί με οστική απώλεια και αυξημένο κίνδυνο κατάγματος σε ποντίκια ( ), αλλά και στους ανθρώπους ( ). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι SSRIs είναι αναστολείς του 5HTT και αυξάνουν τη συγκέντρωση σεροτονίνης στο περικυττάριο διάστημα, αν και η χρόνια χρήση τους έχει βρεθεί ότι μειώνει τη συγκέντρωση της σεροτονίνης στα αιμοπετάλια κατά 80-90% (141). Οι SSRIS θα μπορούσαν να αναστείλουν τον 5HTT σε πολλαπλά επίπεδα, όπως το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, τα αιμοπετάλια ή και το σκελετικό μικροπεριβάλλον, καθώς έχει ήδη αναφερθεί ότι οι οστεοβλάστες και οστεοκλάστες εκφράζουν και υποδοχείς σεροτονίνης και 5ΗΤΤ (97 101). Πιο πιθανή εξήγηση για τη μείωση της οστικής μάζας στους ασθενείς που λαμβάνουν αυτή την αγωγή, είναι ότι λόγω της αναστολής επαναπρόσληψής της από τους οστεοβλάστες, αυξάνεται η συγκέντρωση της σεροτονίνης στο σκελετικό μικροπεριβάλλον με αποτέλεσμα ο οστεοβλάστης να μένει για μεγαλύτερο διάστημα εκτεθειμένος στην δράση της σεροτονίνης (96). 34

43 2. Στόχοι της παρούσας ιατριβής 35

44 Ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του ρόλου της σεροτονίνης στην παθογένεια της Αγκυλοποιητικής Σπονδυλίτιδας. Τα νέα δεδομένα ότι η κυκλοφορούσα σεροτονίνη έχει ενδοκρινή ρόλο, οδηγώντας σε αναστολή του οστεοβλαστικού πολλαπλασιασμού (94) και ότι η φαρμακευτική αναστολή του ενζύμου Tph1 σε ποντίκια μειώνει τα επίπεδα της περιφερικής σεροτονίνης και και αυξάνει την οστική μάζα, καθιστούν τη σεροτονίνη σημαντικό αναστολέα του νέου οστικού σχηματισμού (108). Δεν υπάρχουν δεδομένα για τον πιθανό ρόλο της σεροτονίνης στην ΑΣ, μία νόσο που χαρακτηρίζεται από σχηματισμό νέου οστού. Λαμβάνοντας υπόψιν το σημαντικό ρόλο της σεροτονίνης ως αναστολέα της οστεοβλαστογένεσης, υποθέσαμε ότι οι ασθενείς με ΑΣ, ενδεχομένως έχουν χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης, γεγονός που θα μπορούσε να ερμηνεύει τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό την τάση για σχηματισμό νέου οστού στους ασθενείς αυτούς. Στόχος μας ήταν να εκτιμήσουμε: i) τα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε ασθενείς με ΑΣ και να τα συγκρίνουμε με τα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ) και υγιείς μάρτυρες, ii) την επίδραση των TNFα αναστολέων στα επίπεδα σεροτονίνης σε ασθενείς με ΑΣ και ΡΑ και τέλος iii) την επίδραση των ορών από ασθενείς με ΑΣ (που λαμβάνουν ή όχι αντι-tnfα) και ορών από υγιείς μάρτυρες στη σηματοδότηση της σεροτονίνης σε μια κυτταρική σειρά που προσομοιάζει με οστεοβλάστες. 36

45 3. Ασθενείς και Μέθοδοι 37

46 3.1 Ασθενείς Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 47 ασθενείς με διαγνωσμένη ΑΣ σύμφωνα με τα κριτήρια κατάταξης της Νέας Υόρκης (14), 28 ασθενείς με ΡΑ που πληρούσαν τα αναθεωρημένα κριτήρια του 1987 ACR (142) και 40 υγιείς εθελοντές (19 άνδρες). Οι ασθενείς στρατολογήθηκαν κατά τη διάρκεια των τακτικών ραντεβού για επανεκτίμηση στα εξωτερικά ιατρεία του Ρευματολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Επιπλέον, 12 ασθενείς με νόσο Crohn επιστρατεύτηκαν από τα εξωτερικά ιατρεία του Γαστρεντερολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Κλινικά και δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών της μελέτης φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι περισσότεροι ασθενείς με νόσο Crohn (n=8) ήταν ταυτόχρονα διαγνωσμένοι με εντεροπαθητική αξονική σπονδυλοαρθροπάθεια. Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείο της Πάτρας ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης και όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν έγγραφη πληροφορημένη συγκατάθεση. Ακολούθως της ένταξης στη μελέτη, όλοι οι ασθενείς εκτιμήθηκαν εκτενώς, έγινε ανασκόπηση ιατρικού τους φακέλου, πλήρης φυσική εξέταση και παραγγέλθηκε βασικός εργαστηριακός έλεγχος που περιλάμβανε δείκτες φλεγμονής (ΤΚΕ και CRP). Δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στη συνυπάρχουσα φαρμακευτική αγωγή. Ασθενείς που ελάμβαναν οποιοδήποτε από τα ακόλουθα φάρμακα, τα οποία είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τα επίπεδα σεροτονίνης: αντικαταθλιπτικά (συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων επαναπρόσληψης σεροτονίνης, των αναστολέων επαναπρόσληψης σεροτονίνης και νοραδρεναλίνης και των τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών), οποιασδήποτε κατηγορίας αντιψυχωσικά, φάρμακα κατά της ημικρανίας (τρυπτάνες), αντιπηκτικά, αντιπαρκινσονικά, οπιοειδή και τραμαδόλη, αποκλείστηκαν από τη μέλετη. Κανένας από τους συμμετέχοντες στη μελέτη ασθενείς δεν είχε διάγνωση κατάθλιψης. Η ενεργότητα της νόσου εκτιμήθηκε με τη 38

47 χρήση του BASDAI (143) και του DAS28 (144) για τους ασθενείς με ΑΣ και ΡΑ αντίστοιχα. Σε μια υποομάδα ασθενών με ΑΣ (n=30), για τους οποίους ήταν διαθέσιμες ακτινογραφίες αυχενικής και οσφυικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης των τελευταίων 12 μηνών, υπολογίστηκε το msasss (modified Stoke Ankylosing Spondylitis Spine Score) (145). Ως ενεργός νόσος, ορίστηκε DAS28 score>2.6 και BASDAI>4 για τους ασθενείς με ΡΑ και ΑΣ αντίστοιχα. Εικοσιτρείς ασθενείς με ΑΣ και 14 ασθενείς με ΡΑ βρίσκονταν υπό αντι-tnfα θεραπεία. Δείγματα ορού ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη μετά από ολονύκτια νηστεία και αποθηκεύτηκαν στους -70 o C σε aliquots. Τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 x g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, όπως έχει ήδη περιγραφεί (121). Όλες οι μετρήσεις ορού έγιναν σε προηγουμένως μη αποψυγμένα aliquots. Στους ασθενείς υπό αντι- TNFα θεραπεία τα δείγματα ορού ελήφθησαν την ημέρα πριν τη χορήγηση θεραπείας. 39

48 Πίνακας 1 Δημογραφικά, κλινικά χαρακτηριστικά, θεραπεία και δείκτες φλεγμονής των ασθενών της μελέτης ΑΣ ΡΑ ν.crohn Υγιείς n=47 n=28 n=12 μάρτυρες n=40 Ηλικία (έτη) 42.5 ± ± ± ± 4.1 [mean ± SEM] Γυναίκες [n (%)] 12 (25.5) 20 (71.4) 4 (36.3) 21 (52.5) Βάρος (kg) 76.2 ± ± ± ± 5.0 [mean ± SEM] Διάρκεια νόσου(έτη) 12 (3-18) 11 (3-16) 8.5 ( ) NA [median (quartiles)] Θεραπεία Αντι-TNFα 23(48.9) 14 (50) 8 (66.6) NA ΜΣΑΦ 25 (53.2) 10 (35.7) 0 (0) 0 (0) Ενεργότητα νόσου DAS28[mean ± SEM] NA 3.8 ± 0.3 NA NA BASDAI [mean ± SEM] 3.3 ± 0.4 NA NA NA Δείκτες φλεγμονής CRP(mg/dl) 1.1 ( ) 1.6 ( ) 1.4 ( ) NA [median (quartiles)] ΤΚΕ(mm/hour) 20 (10-35) 30 (20-52) 36.5 ( ) NA [median(quartiles)] 40

49 3.2 Μέτρηση σεροτονίνης και οστεοκαλσίνης Τα επίπεδα σεροτονίνης προσδιορίστηκαν στον ορό με ραδιοανοσομέτρηση, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (DIAsource ImmunoAssays, Louven-la-Neuve, Belgium). Οι intraassay και inter-assay συντελεστές προσδιoρισμού διακύμανσης ήταν 4.2% and 7.3%, αντίστοιχα. Τα επίπεδα οστεοκαλσίνης ορού μετρήθηκαν με ηλεκτροχημειοφθορισμό (E170 Module for Modular Analytics, Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany). Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη χρήση του N-MID Osteocalcin reagent pack (Roche Diagnostics). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν. 3.3 Βιοψίες δωδεκαδακτύλου σε ασθενείς με νόσο Crohn Δώδεκα ασθενείς με νόσο Crohn υποβλήθηκαν σε βιοψίες δωδεκαδακτύλου. Τα ιστοτεμάχια ελήφθησαν από μη πάσχουσες μακροσκοπικά περιοχές (2-4 βιοψίες από κάθε ασθενή) κατά τη διάρκεια της συνηθισμένης ενδοσκόπησης για την παρακολούθηση. Ένα δείγμα βιοψίας από κάθε ασθενή τοποθετήθηκε σε παραφίνη για χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (H&E ) και ιστολογική εκτίμηση, ενώ τα υπόλοιπα χρησιμοποιήθηκαν για εξαγωγή ολικού RNA. Oχτώ ασθενείς βρίσκονταν υπό αντι-tnfα θεραπεία. Με τον ίδιο τρόπο, ελήφθησαν βιοψίες δωδεκαδακτύλου από 5 υγιείς μάρτυρες, για να έχουμε ομάδα ελέγχου. 41

50 3.4 Κυτταροκαλλιέργειες και λύση των κυττάρων Οι διαδικασίες που σχετίζονταν µε τη διενέργεια κυτταροκαλλιεργειών έγιναν σε άσηπτες συνθήκες σε εστία νηµατικής ροής (hood). Τα κύτταρα καταµετρήθηκαν µε τη χρήση αιµοκυττοµέτρου Neubauer και επωάστηκαν σε κλίβανο σε περιβάλλον 37 C και 5% CO2. Η επίδραση του ορού στη σηματοδότηση της σεροτονίνης εκτιμήθηκε με τη χρήση της κυτταρικής σειράς που προσομοιάζει με οστεοβλάστες, Saos-2 (προσφορά από το εργαστήριο Κλινικής και Μοριακής Ογκολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών). Την ημέρα 1, 2X10 6 Saos-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε EMEM, στο οποίο είχαν προστεθεί 10% FBS και αντιβιοτικά [πενικιλλίνη (100 U/ml), στρεπτομυκίνη (100 mg/ml)]. Την ημέρα 2, προστέθηκε στην καλλιέργεια σε αναλογία 10% του όγκου, ορός από ασθενείς με ΑΣ που λάμβαναν (n=5), ή δε λάμβαναν αντι-tnfα θεραπεία (n=6) και από υγιείς μάρτυρες (n=8). Σε μερικά πειράματα, προστέθηκε στα κατάλληλα πηγάδια ο ανταγωνιστής των υποδοχέων σεροτονίνης μεθυσεργίδη σε συγκέντρωση 10 μm. Tην ημέρα 3, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, φυγοκεντρήθηκαν και λύθηκαν και έγινε εξαγωγή πρωτεΐνης (Σχήμα 6). Σχήμα 6: Διαδικασία κυτταροκαλλιεργείων 42

51 Συγκεκριμένα, για την απομόνωση πρωτεϊνών ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Μετά την προσθήκη stop buffer 1ml (Πίνακας 2) στα δείγματα, ακολούθησε φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 60 δευτερόλεπτα, σε θερμοκρασία 4 C 2. Αναρρόφηση του υπερκειμένου με την βοήθεια αυτόματης πιπέτας 3. Eπώαση των κυττάρων με 50μl ανά δείγμα με ειδικό διάλυμα λύσης κυττάρων (lysis buffer) το οποίο περιείχε αναστολείς πρωτεασών και φωσφατασών (Πίνακας 2). Η επώαση των δειγμάτων γινόταν σε πάγο και διαρκούσε συνολικά 45 λεπτά, με παράλληλη ανατάραξη των δειγμάτων διάρκειας 1 λεπτού σε μηχάνημα vortex ανά 15 λεπτά, ώστε να επιτευχθεί λύση του καθιζήματος 4. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις στροφές ανά λεπτό για 15 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C, ώστε να απαλλαχθούν από το μη-διαλυτό τους περιεχόμενο (κυτταροσκελετός) και φύλαξη ολικής πρωτεΐνης σε βαθιά κατάψυξη (-70 C) Η συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης στα κυτταρικά διαλύματα με φωτομέτρηση στα 595nm προσδιορίστηκε με τη χρήση ενός protein assay kit (Bio-Rad). 43

52 Πίνακας 2 Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση πρωτεϊνών από τα Saos2 και τα Jurkat κύτταρα Stop Buffer Tris base 1Μ EDTA (ph = 8.0) 0.5Μ NaCl 0.5Μ NaF 1Μ Na3VO4 100mM Νa4P2O7 0.3Μ PMSF 50mM Aprotinin 10μg/ml Leupeptin 5μg/m 10mM 5mM 50mM 50mM 1mM 30mM 1mM 2mg/ml 2mg/ml Lysis Buffer Προσθήκη στο stop buffer Triton X-100 σε τελική συγκέντρωση 0.02% Τα Jurkat T κύτταρα αλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που είχε εμπλουτιστεί με 15% heatinactivated FBS και αντιβιοτικά [πενικιλλίνη (100 U/ml), στρεπτομυκίνη (100 mg/ml)] σε πλακέτες 12 πηγαδιών, σε συγκέντρωση /ml. Στα κατάλληλα πηγάδια προστέθηκαν, 50 44

53 μμ σεροτονίνης (Sigma Aldrich), με και χωρίς τον ανταγωνιστή υποδοχέων σεροτονίνης μεθυσεργίδη (σε συγκεντρώσεις 1nM, 10nM, 1μM και 10μM) 3.5 Ανοσοαποτύπωμα κατά Western Μετά τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης στα διαλύματα, ακολούθησε προετοιμασία δειγμάτων με προσθήκη loading buffer (αρχικό διάλυμα 2X) και reducing agent (αρχικό διάλυμα 10X) σε τελική συγκέντρωση 1Χ. Κατόπιν έγινε γρήγορη φυγοκέντρηση ( στροφές για 15 δευτερόλεπτα). Ακολούθησε βρασμός δειγμάτων στους 95 C για 5 λεπτά και εκ νέου γρήγορη φυγοκέντρηση ( στροφές για 15 δευτερόλεπτα). Δέκα μg ολικής πρωτεΐνης για κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (10%) SDSπολυακρυλαμιδίου σε Running Buffer 1X στα 125V για περίπου 1.5 ώρα. Κατόπιν, έγινε πλύση του πηκτώματος σε Transfer Buffer για περίπου 10 λεπτά και διαπότιση μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με Transfer buffer 1X. Έγινε ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (semi-dry transfer), σε συνθήκες 15V για 20 λεπτά. Oι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε TBS-5% Tween20 (TBST) που περιείχε 5% BSA (Πίνακας 3) για 4 ώρες, ώστε να καλυφθούν οι μη ειδικές θέσεις δέσμευσης και επωάστηκαν ολονύκτια με 2 μg/ml anti-phospho-creb (Millipore, clone 10E9) σε blocking buffer. Έπειτα οι μεμβράνες πλύθηκαν 5 φορές με TBST και 5 φορές με TBS, επωάστηκαν με ένα a goat anti-mouse, HRP-conjugated δεύτερο αντίσωμα (διάλυση 1/5000, Millipore) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν ξανά όπως προηγουμένως και οπτικοποιήθηκαν (έγινε ανίχνευση σήματος) με τη χρήση χημειοφωταύγειας (ECL plus, Amersham). Τέλος έγινε έκθεση των μεμβρανών σε φιλμ αυτορραδιογραφίας. Ακολούθως έγινε stripping των μεμβρανών και επωάστηκαν με antiglyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase [(GAPDH), 1/5000 dilution, Santa Cruz Biotechnology)] σαν αντίσωμα για τον έλεγχο της φόρτωσης. Τα πειράματα έγιναν εις 45

54 τριπλούν. Σκανναρίστηκαν τα φιλμ και έγινε πυκνομετρία με τη χρήση του λογισμικού Image J. Υπολογίστηκε ο λόγος (σχετική ένταση) της οπτικής πυκνότητας (OD) που είχαν οι μπάντες του phospho-creb προς την OD των αντίστοιχων για το GAPDH (αφυδρογονάση της 3 φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης), μιας πρωτεΐνης η οποία εκφράζεται σταθερά και σε υψηλά επίπεδα στα περισσότερα κύτταρα του οργανισμού. Πίνακας 3 Σύσταση διαλυμάτων που παρασκευάστηκαν κατά τη διενέργεια ανοσοαποτυπώματος κατά Western Loading Buffer 2X 10ml Tris-base 0.5M 10ml Glycerol 1gr SDS 0.5ml Bromophenol Blue 2% Διάλυση σε 50ml απιονισμένου ύδατος Running Buffer 10X 29 gr/lt Tris-base 144gr/lt Glykine 10gr/lt SDS Διάλυση σε απιονισμένο ύδωρ Transfer Buffer 25X 48.5gr/lt Tris-base 180gr/lt Glykine Διάλυση σε απιονισμένο ύδωρ TBS 1X 2.42gr/lt Tris-base 8gr NaCl 3.8ml HCl 1N για τελικό διάλυμα όγκου 1lt 46

55 Διάλυση σε απιονισμένο ύδωρ TBS-T 0.25% Προσθήκη Τween-20 (250μl σε 100ml TBS 1X) TBS-T 0.05% Προσθήκη Tween-20 (50μl σε 100ml TBS 1X) 3.6 Μέτρηση ρυθµού πολλαπλασιασµού και κυτταρικής βιωσιµότητας H επίδραση της σεροτονίνης στον πολλαπλασιασμό των Saos-2 κυττάρων εκτιμήθηκε με το MTT assay. Την ημέρα 0, 10 4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε πηγάδι που περιείχε 250 μl καλλιεργητικού υλικού, σε πλακέτες των 48 πηγαδιών. Την ημέρα 1, προστέθηκε στα κατάλληλα πηγάδια σεροτονίνη σε συγκεντρώσεις 75 ng/ml και 150 ng/ml εις τετραπλούν και την ημέρα 2 προστέθηκε MTT. Μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 570nm και για κάθε δείγμα υπολογίστηκε ο μέσος όρος. Έγινε επιπλεόν ένα BrdU proliferation assay με τον ίδιο πειραματικό σχεδιασμό για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα. Κύτταρα Saos-2 αναπτύχθηκαν σε καλυμμένες με poly-lysine καλυπτρίδες. Το καλλιεργητικό υλικό αντικαταστάθηκε με διάλυμα σήμανσης BrdU σε συγκέντρωση 10μΜ (Mol. Probes B23151) για 2h στους 37 o C. Το διάλυμα σήμανσης αφαιρέθηκε και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε παραφολμαδεΰδη 4% για 10 λεπτά, πλύθηκαν δις με phosphate-buffered saline (PBS), έγιναν διαπερατά με 0.3% Triton X- 100 σε PBS, πλύθηκαν δις με PBS, 0.1% Tween κι ακολούθως έγινε επώαση για μία ώρα με 2N HCl, έγινε πλύση με 0.1 m Tris-HCl, ph 8.8 και μπλοκάρισμα για 1 ώρα. Οι καλυπτρίδες τότε επωάστηκαν με anti-brdu συζευγμένο με Alexa Fluor 488(1:100) (Molecular Probes, B35130) σε διάλυμα μπλοκαρίσματος για ολονύκτια στους 4 C και πλύθηκαν με PBS, 0.1% Tween. Το 47

56 DNA χρωματίστηκε με Hoechst και χρησιμοποιήθηκε μικροσκόπιο φθορισμού για να εκτιμηθεί η ενσωμάτωση του BrdU. Και οι δύο προσδιορισμοί έγιναν εις τριπλούν. 3.7 Ιστολογική εκτίμηση της έκφρασης του Tph1 σε βιοψίες δωδεκαδακτύλου ασθενών με νόσο Crohn Mετά την αποπαραφίνωση σε ξυλένιο και την επανυδάτωση σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις αιθανόλης έγινε ανοσοϊστοχημεία. Συνοπτικά, τα slides επωάστηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων σε διάλυμα κιτρικού 0.001M (ph 6), ώστε να ενισχυθεί η ανάκτηση αντισώματος. Κατόπιν, αποσβέστηκε η δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης με επώαση με 0.03% υπεροξείδιο του υδρογόνου για 20 λεπτά, που ακολουθήθηκε από επώαση με protein blocking solution. Οι τομές επωάστηκαν ολονύκτια με Anti-Tryptophan Hydroxylase rabbit monoclonal antibody (ab52954, dilution 1:50. Abcam, Cambridge, UK). Η ειδική πρόσδεση ανιχνεύτηκε με το σύστημα ανίχνευσης Novolink Max Polymer και η χρωστική αντίδραση οπτικοποιήθηκε με διαμινοβενζόλιο. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη και μονιμοποιήθηκαν. 3.8 Εκτίμηση της έκφρασης του Tph1 Οι βιοψίες δωδεκαδακτύλου που είχαν ψυχθεί, ομογενοποιήθηκαν με γουδί και γουδοχέρι με τη βοήθεια υγρού αζώτου. Έγινε εξαγωγή του RNA σύμφωνα με συγκεκριμένο πρωτόκολλο 48

57 (RNeasy Mini Kit, Qiagen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με τη χρήση NanoDrop φασματοφωτόμετρου (Thermo Scientific). Η σύνθεση του cdna πραγματοποιήθηκε με τη χρήση iscript cdna synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) από 1μg ολικού RNA. Η σχετική έκφραση των επιπέδων του mrna του TPH1 και του Alu-sq mrna,εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας το itaq Universal SYBR Green supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) με CFX96 Touch Real- time System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ειδικοί εκκινητές για το ανθρώπινο γονίδιο TPH1, KiCqStartTM (FH1: 5 - AAAGAGCGTACAGGTTTTTC και RH1: 5 - GTCTCACATATTGAGTGCAG)αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich Co. Οι εκκινητές για την Alu-Sq επαναλαμβανόμενα εκφραζόμενη αλληλουχία σχεδιάστηκαν από Dr. J. Vandesompele et al.στο Ghent University Hospital, Belgium και συντέθηκαν από τη Metabion International AG (Martinsried, Germany). Τα επίπεδα σχετικής έκφρασης του κάθε γονιδίου υπολογίστηκαν με τη χρήση του προγράμματος LinReg (146). Τα επίπεδα mrna διορθώθηκαν ως προς τα επίπεδα Alu-Sq, ώστε να ληφθούν υπόψιν πιθανές αποκλίσεις στην ποσότητα και ποιότητα του RNA μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων. Η ειδικότητα της ενίσχυσης επιβεβαιώθηκε με Sanger sequencing. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα εις διπλούν τρεις φορές, κάθε φορά χρησιμοποιώντας 100ng πρότυπου cdna. 3.9 Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό SPSS (SPSS Inc, Chicago, Illinois), version 20. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως mean ± SEM, median (25-75 th percentile values) ή ποσοστά κατα το δοκούν. Οι συσχετίσεις μεταξύ σεροτονίνης και άλλων μεταβλητών 49

58 αναλύθηκαν με Pearson ή Spearman test, κατά πώς πρέπει και η πολυπαραμετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση linear regression. Για τις συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιήθηκε το t-test. Το στατιστικά σημαντικό ορίστηκε ως p < 0.05 (two-tailed). 50

59 4. Αποτελέσματα 51

60 4.1 Οι ασθενείς με Aγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα έχουν χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε σύγκριση με τους ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα και τους υγιείς μάρτυρες Λαμβάνοντας υπόψιν το σημαντικό ρόλο της σεροτονίνης ως αναστολέα της οστεοβλαστογένεσης, αρχικά διερευνήσαμε αν τα επίπεδα σεροτονίνης ορού εκφράζονται διαφορετικά στους ασθενείς με ΑΣ, μία νόσο που χαρακτηρίζεται από οστικό σχηματισμό, σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΡΑ, μια νόσο που χαρακτηρίζεται τυπικά από διαβρώσεις/οστική απώλεια. Τα επίπεδα σεροτονίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερα στους ασθενείς με ΑΣ σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (mean ± SEM ng/ml: ± 11.6 vs ± για τους ασθενείς με AΣ και τους υγιείς αντίστοιχα,, p=0.038) και τους ασθενείς με ΡΑ (mean ± SEM ng/ml: ± 37.5, p=0.0004). (Εικόνα 6). Λαμβάνοντας υπόψιν ότι η σεροτονίνη αποθηκεύεται κυρίως στα αιμοπετάλια και απελευθερώνεται μετά την ενεργοποίησή τους, διερευνήσαμε περαιτέρω αν οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης μεταξύ των ασθενών με ΑΣ και ΡΑ, θα μπορούσαν να αποδοθούν σε διαφορές στον αριθμό των αιμοπεταλίων. Βρήκαμε ότι οι ασθενείς με ΑΣ και ΡΑ είχαν παρόμοιο αριθμό αιμοπεταλίων (mean ± SEM x10 3 /μl: ± 8.21 vs ± για τους ασθενείς με ΑΣ και ΡΑ αντίστοιχα, p=0.25). Καθώς οι άνδρες αποτελούσαν την πλειοψηφία στην ομάδα των ασθενών με ΑΣ (n=35) και οι γυναίκες στην ομάδα των ΡΑ (n=18), αναζητήσαμε στη συνέχεια πιθανές σχετιζόμενες με το φύλο διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης. Oι άνδρες ασθενείς με ΑΣ είχαν παρόμοια επίπεδα σεροτονίνης με τις γυναίκες ασθενείς (mean ± SEM ng/ml: ± 13.3 vs ± για τους άνδρες και τις γυναίκες ασθενείς αντίστοιχα, p=ns). Το ίδιο ίσχυε και για τους ασθενείς με ΡΑ (mean ± SEM ng/ml: ± 58.1 vs ± για τους άνδρες και τις γυναίκες ασθενείς αντίστοιχα, p=ns) και για τους υγιείς μάρτυρες (mean ± SEM ng/ml: ± 35.2 vs ± 34.9). 52

61 Εικόνα 6: Τα επίπεδα σεροτονίνης ορού είναι στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα στους ασθενείς με ΑΣ, σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΡΑ (p=0.0004) και τους υγιείς μάρτυρες (p=0.038) 4.2 Η αντι-tnfα θεραπεία σχετίζεται με χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ, αλλά όχι στους ασθενείς με ΡΑ Κατόπιν αξιολογήσαμε αν οι TNFα αναστολείς επηρεάζουν τα επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ και ΡΑ. Οι ασθενείς με ΑΣ υπό TNFα αναστολείς είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΑΣ που δε λάμβαναν αντι-tnfα (mean ± SEM ng/ml: 95.8 ± 14.9 vs ± 16.0 για τους ασθενείς που λάμβαναν ή όχι TNFα αναστολείς αντίστοιχα, p=0.019). Αντιθέτως, οι ασθενείς με ΡΑ υπό TNFα αναστολείς έιχαν παρόμοια επίπεδα σεροτονίνης με τους ασθενείς με ΡΑ που δε λάμβαναν αντι-tnfα (mean ± 53

62 SEM ng/ml: ± 43.8 vs ± 27.2 για τους ασθενείς που δε λάμβαναν ή λάμβαναν TNFα αναστολείς αντίστοιχα, p=ns). Όταν βγάλαμε από την ανάλυση τους ασθενείς που λαμβάνουν TNFα αναστολείς, οι ασθενείς με ΑΣ εμφάνιζαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης σε σύγκριση με τους ασθενέις με ΡΑ (p=0.0024) (Εικόνα 7). Εικόνα 7: Χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ που λαμβάνουν αντι-tnfa (n=23) σε σύγκριση με τους ασθενεις με ΑΣ που δε λαμβάνουν(n=24) (p=0.019). Αντίθετα οι ασθενείς με ΡΑ υπό αντι-τνfα (n=14), είχαν παρόμοια επίπεδα σεροτονίνης σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΡΑ, οι οποίοι δεν ελάμβαναν τέτοια θεραπεία (n=14) Δε βρήκαμε καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων σεροτονίνης και της ηλικίας, διάρκειας νόσου, σωματικού βάρους, BASDAI, δεικτών φλεγμονής, χρήσης μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ) και msasss στους ασθενείς με ΑΣ. Έπειτα, αξιολογήσαμε αν η αντι-tnfα θεραπεία αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη των 54

63 επιπέδων σεροτονίνης. Πραγματοποιήσαμε πολυ-παραμετρική ανάλυση με τη σεροτονίνη εξαρτημένη μεταβλητή, και οι μεταβλητές που εισήχθησαν στο μοντελο ήταν: η ηλικία, η διάρκεια νόσου, η αντι-tnfα θεραπεία (ναι/όχι), το BASDAI, οι δείκτες φλεγμονής, η χρήση ΜΣΑΦ και το msasss. Μόνο η αντι-tnfα θεραπεία αποτελούσε ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη των επιπέδων σεροτονίνης (Beta coefficient=-0.318, p=0.031). Στους ασθενείς με ΡΑ δε βρήκαμε κάποια συσχέτιση των επιπέδων σεροτονίνης με την ηλικία, το βάρος και την ενεργότητα νόσου (DAS28 και δείκτες φλεγμονής ), αλλά βρέθηκε σημαντική θετική συσχέτιση με τη διάρκεια νόσου (r=0.528, p=0.029). 4.3 Η σεροτονίνη σε συγκεντρώσεις παρόμοιες με εκείνες στον ανθρώπινο ορό αναστέλλει σημαντικά τον πολλασιασμό των κυττάρων με οστεοβλαστικούς χαρακτήρες Saos-2 Είναι γνωστό ότι η σεροτονίνη στην υψηλή «φαρμακευτική» συγκέντρωση των 50μΜ (που αντιστοιχεί σε ng/ml) είναι πολύ αποτελεσματική στην αναστολή του οστεοβλαστικού πολλαπλασιασμού (94). Στόχος μας ήταν να εκτιμήσουμε αν οι χαμηλότερες φυσιολογικές συγκεντρώσεις σεροτονίνης έχουν παρόμοιο αποτέλεσμα. Για να θέσουμε αυτό το ερώτημα αξιολογήσαμε με τη χρήση ΜΤΤ assay την επίδραση της σεροτονίνης (στις συγκεντρώσεις των 75 και 150 ng/ml, που είναι παρόμοιες με εκείνες που βρέθηκαν στον ανθρώπινο ορό) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Saos-2, που έχουν χαρακτήρες οστεοβλαστών. Kαι οι δύο συγκεντρώσεις σεροτονίνης που μελετήθηκαν, ήταν αποτελεσματικές στο να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των Saos-2 κυττάρων (mean ± SEM of OD: ± για τα κύτταρα που δεν επωάστηκαν με σεροτονίνη vs ± και ± 0.017, για τα κύτταρα με προσθήκη σεροτονίνης 75 ng/ml, 150ng/ml αντίστοιχα, p<0.01 και για τις δύο συγκρίσεις με σκέτα κύτταρα). Τα ανωτέρω απεικονίζονται διαγραμματικά στην Εικόνα 8. 55

64 Εικόνα 8: O πολλαπλασιασμός των κυττάρων Saos2, όπως εκτιμάται με το ΜΤΤ assay, αναστέλλεται στατιστικά σημαντικά με προσθήκη δύο διαφορετικών συγκεντρώσεων σεροτονίνης παρόμοιων με εκείνες στον ανθρώπινο ορό Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με ένα BrdU assay πολλαπλασιασμού. Τα Saos-2 κύτταρα που επωάστηκαν με 150ng/ml και 75ng/ml σεροτονίνης παρουσίασαν μείωση στην ενσωμάτωση των κυττάρων στο BrdU σε σύγκριση με τα κύτταρα στα οποία δεν επωάστηκαν με σεροτονίνη, όπως φαίνεται στην Εικόνα 9. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι φυσιολογικές δόσεις σεροτονίνης μπορεί να αναστείλουν in vitro τoν πολλαπλασιασμό των κυττάρων Saos-2, τα οποία έχουν χαρακτήρες οστεοβλαστών. 56

65 Εικόνα 9: Τα Saos-2 κύτταρα που επωάστηκαν με 150ng/ml (Α+Β) και 75ng/ml σεροτονίνης (C+D), εμφανίζουν μείωση των κυττάρων που ενσωματώνονται στο BrdU, σε σύγκριση με τα κύτταρα που δεν επωάστηκαν με σεροτονίνη(e+f). 4.4 Οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης ορού μεταξύ των ασθενών με AΣ και των υγιών μαρτύρων έχουν λειτουργική επίδραση στη σηματοδότηση της σεροτονίνης Έπειτα εκτιμήσαμε αν οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης ορού μεταξύ των ασθενών με AΣ και των υγιών μαρτύρων έχουν λειτουργική επίδραση στη σηματοδότηση της σεροτονίνης στα κύτταρα με χαρακτήρες οστεοβλαστών, Saos-2. Επωάσαμε κύτταρα Saos-2 με ορούς από 11 ασθενείς με AΣ και 8 υγιείς μάρτυρες. Η σεροτονίνη προσδένεται στον υποδοχέα Htr1B και 57

66 αναστέλει τη φωσφορυλίωση του CREB, επομένως, η επαγωγή του phospho-creb σχετίζεται αντίστροφα με την ένταση της σηματοδότησης της σεροτονίνης. Τα κύτταρα που επωάστηκαν με ορούς ασθενών με AΣ, εμφάνισαν 2.3 φορές υψηλότερη έκφραση του phospho-creb (υποδεικνύοντας εξασθενημένη σηματοδότηση σεροτονίνης), σε σύγκριση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με ορούς υγιών μαρτύρων (mean±sem του λόγου πυκνομετρικής έντασης pcreb/gapdh: ± vs ± 0.074, αντίστοιχα, p=0.046) (Εικόνες 10Α και 10Β). Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι οι οροί των ασθενών με AS και των υγιών μαρτύρων έχουν διαφορετική επίδραση στη σηματοδότηση της σεροτονίνης στα κύτταρα με χαρακτήρες οστεοβλαστών, Saos-2. Saos2 κύτταρα Α Β Εικόνα 10:Διαφορετική επίδραση του ορού των ασθενών με ΑΣ και των υγιών μαρτύρων στην έκφραση του PCREB στα SAOS2 κύτταρα. Εικόνες από ανοσοαποτύπωμα κατά Western (Α). Τα κύτταρα που έχουν επωαστεί με ορό ασθενών με ΑΣ (n=11) εμφανίζουν σημαντικότερη έκφραση του PCREB σε σύγκριση με τα κύτταρα που έχουν επωαστεί με ορό υγιών μαρτύρων (n=8) (p=0.046) (Β) 4.5 Η μεσολαβούμενη από τον ορό των ασθενών με AΣ επαγωγή της έκφρασης του pcreb είναι ειδική για τη σεροτονίνη Αρχικά αξιολογήσαμε αν η σεροτονίνη αναστέλει το pcreb σε Jurkat T κύτταρα. Βρήκαμε ότι η σεροτονίνη σε συγκέντρωση 50 μm μειώνει αποτελεσματικά την έκφραση του pcreb. Mε 58

67 την προσθήκη μεθυσεργίδης, ενός αναστολέα υποδοχέων σεροτονίνης, η έκφραση του pcreb αποκαθίσταται. Για να αξιολογήσουμε αν η επίδραση του ορού των ασθενών με ΑΣ στην έκφραση του phospho-creb είναι ειδικό αποτέλεσμα της σεροτονίνης, κάναμε ένα επιπλέον πείραμα. Επωάσαμε κύτταρα Saos-2 με ορό ασθενών με ΑΣ με και χωρίς την προσθήκη του αναστολεα υποδοχέων σεροτονίνης, μεθυσεργίδη, σε συγκέντρωση 10μM. Η συγκέντρωση αυτή της μεθυσεργίδης επιλέχθηκε με βάση πειράματα ανταπόκρισης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της, σε Jurkat T κύτταρα (Εικόνα 11). Βρήκαμε ότι η αναστολή της σηματοδότησης της σεροτονίνης με την προσθήκη 10 μm μεθυσεργίδης, οδηγησε σε σημαντική αύξηση της έκφρασης του phospho-creb(mean±sem του λόγου πυκνομετρικής έντασης pcreb/gapdh: ± 0.02 vs ± 0.123, χωρίς και με την προσθήκη μεθυσεργίδης αντίστοιχα, p=0.042, (Εικόνα 12), υποδεικνύοντας ότι οι αλλαγές στην έκφραση του phospho- CREB στα Saos-2 κύτταρα μετά την επώαση με ανθρώπινο ορό είναι ειδικό αποτέλεσμα της σεροτονίνης. Εικόνα 11: H επώαση κυττάρων Jurkat με σεροτονίνη αναστέλλει την έκφραση του pcreb. Η έκφραση του pcreb από τα κύτταρα Jurkat αποκαθίσταται με την προσθήκη μεθυσεργίδης σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις 1nM,10nM, 1μM, 10μM 59

68 Εικόνα 12: Η μεσολαβούμενη από τον ορό των ασθενών με ΑΣ αύξηση της έκφρασης του pcreb είναι ειδική για τη σεροτονίνη. Η προσθήκη του αναστολέα υποδοχέων της σεροτονίνης, μεθυσεργίδη, ενισχύει σημαντικά την έκφραση του pcreb 4.6 Η αντι-tnfα θεραπεία μειώνει περαιτέρω τη σηματοδότηση της σεροτονίνης στους ασθενείς με AΣ Αξιολογήσαμε περαιτέρω αν η διαφορετική έκφραση της σεροτονίνης στους ασθενείς με AΣ που δε λαμβάνουν και σε εκείνους που λαμβάνουν αντι-tnfα, επηρεάζει τη σηματοδότιση της σεροτονίνης στο ίδιο πειραματικό κυτταρικό μοντέλο. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα που έχουν επωαστεί με ορό ασθενών με AΣ υπό αντι-tnfα θεραπεία (n=5) παρουσίαζαν 2.3-φορές υψηλότερη έκφραση phospho-creb σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν επωαστεί με ορό ασθενών με AΣ που δε λάμβαναν τέτοια θεραπεία (n=6) (mean±sem του λόγου πυκνομετρικής έντασης pcreb/gapdh: ± vs ± 0.136, αντίστοιχα, p=0.047). Αυτά απεικονίζονται διαγραμματικά στην Εικόνα 13. Συνοπτικά, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης μεταξύ των ασθενών με AΣ που λαμβάνουν ή όχι TNFα αναστολείς έχουν λειτουργική επίδραση στη σηματοδότηση της σεροτονίνης ex vivo. 60

69 Εικόνα 13: Η θεραπεία με αντι-τνfα μειώνει τη σηματοδότηση της σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ. Τα Saos-2 κύτταρα που έχουν επωαστέι με ορούς ασθενών με ΑΣ υπό αντι-tnfα (n=5) εμφανίζουν υψηλότερη έκφραση του pcreb σε σύγκριση με τα κύτταρα που έχουν επωαστεί με ορούς ασθενών με ΑΣ που δε βρίσκονταν υπό αντι-tnfα (n=6) (p=0.047) 4.7 Η έκφραση της Tph1 είναι κατεσταλμένη στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο του Crohn Στην προσπάθεια να αποσαφηνίσουμε γιατί οι ασθενείς με ΑΣ έχουν χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, εκτιμήσαμε την έκφραση της Tph1 στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο του Crohn και υγιών μαρτύρων. Ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών με AΣ, έχουν υποκλινική εντερική φλεγμονή (18). Επιπλέον, οι ασθενείς με νόσο Crohn, μπορεί να αναπτύξουν σπονδυλοαρθροπάθεια που μπορέι να μη διακρίνεται κλινικά από την ΑΣ (147,148). Η πλειοψηφία των ασθενών είχε κλινικά ενεργό νόσο (n=11), ωστόσο, δεν υπήρχαν ενδοσκοπικά στοιχεία φλεγμονής στο δωδεκαδάκτυλο σε όλους τους ασθενείς. Η ανοσοϊστοχημική εκτίμηση των βιοψιών δωδεκαδακτύλου έδειξε ότι η έκφραση της Tph1 στους ασθενείς με νόσο του Crohn ήταν σημαντικά κατεσταλμένη σε σύγκριση με τους υγιείς 61

70 μάρτυρες (Εικόνα 14 Α-Δ). Επιπλέον, η έκφραση του TPH1 σε επίπεδο γονιδίου αξιολογήθηκε με RT-PCR, χρησιμοποιώντας ολικό RNA, που εξήχθη από τις βιοψίες δωδεκαδακτύλου. Βρήκαμε μείωση της έκφρασης του γονιδίου του TPH1 κατά 9.5-φορές στο δωδεκαδάκτυλο των ασθενών με νόσο του Crohn σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (p=0.002) (Εικόνα 14Ε). Επιπλέον, αναζητήσαμε αν οι συγκεκριμένοι ασθενείς με νόσο του Crohn είχαν στοιχεία αυξημένου οστικού σχηματισμού, όπως εκτιμώνται από κυκλοφορούντες δείκτες. Για να γίνει αυτό, κάναμε μετρήσεις οστεοκαλσίνης στους ασθενείς με CD (Crohn s Disease) (n=12) σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες συζευγμένους ως προς την ηλικία και το φύλο (n=12). Βρήκαμε μια μη στατιστικά σημαντική τάση προς υψηλότερα επίπεδα οστεοκαλσίνης στους ασθενείς με νόσο του Crohn σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (mean ± SEM ng/ml: ± 5.98 vs ± 1.29 για τους ασθενείς με νόσο Crohn και τους υγιείς μάρτυρες αντίστοιχα, p=ns). Α Β Ε Γ Δ Εικόνα 14: Καταστολή της έκφρασης του Tph1 στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο Crohn. Οι βιοψίες από δωδεκαδάκτυλο υγιών μαρτύρων, δείχνουν ότι τα αδενικά επιθηλιακά κύτταρα 62

71 εμφανίζουν έντονη κυτταροπλασματική ανοσοθετικότητα για το Tph1 (Α και Β). Οι βιοψίες δωδεκαδακτύλου ασθενών με νόσο Crohn (n=12) παρουσιάζουν αδύναμη Τph1 ανοσοαντίδραση (Γ και Δ) Όλες οι μεγεθύνσεις είναι Χ400. Η γονιδιακή ανάλυση έδειξε μείωση της έκφρασης του TPH1 κατά 9.5 φορές στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο Crohn σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (Ε). 4.8 Η θεραπεία με αντι-tnfα δεν επηρεάζει την έκφραση της Tph1 Για να διερευνήσουμε γιατί η αντι-tnfα θεραπεία σχετίζεται με χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με AΣ, εκτιμήσαμε την έκφραση της Tph1 στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο Crohn που ελάμβαναν ή όχι TNFα αναστολείς. Η αξιολόγηση με ανοσοϊστοχημεία των βιοψιών δωδεκαδακτύλου δεν ανέδειξε διαφορές στην έκφραση της Tph1, ανάμεσα στους ασθενείς που λάμβαναν ή δε λάμβαναν TNFα αναστολείς (Εικόνες 15 A-Δ). Επιπλέον, η έκφραση του TPH1 σε επίπεδο γονιδίου αξιολογήθηκε με RT-PCR με τη χρήση ολικού RNA που εξάγαμε από βιοψίες δωδεκαδακτύλου. Ομοίως δεν ανευρέθησαν διαφορές στην έκφραση του TPH1 (Εικόνα 15 E). 63

72 Α Β Ε Γ Δ Εικόνα 15: Η θεραπεία με αντιτνfα δεν επηρεάζει την έκφραση της Tph1 στο δωδεκαδάκτυλο. Βιοψίες δωδεκαδακτύλου ασθενών με νόσο Crohn που βρίσκονται (n=8) ή δε βρίσκονται (n=4) υπό αντιtnfa θεραπεία. Και στις δύο περιπτώσεις τα επιφανειακά και αδενικά επιθήλια παρουσιάζουν αδύναμη, κυρίως κυτταροπλασματική ανοσοαντίδραση για Τph-1. Όλες οι μεγεθύνσεις είναι X400. Ομοίως, δεν υπάρχουν διαφορές στη γονιδιακή έκφραση του TPH1 (E) 64

73 5. Συζήτηση 65

74 Η παραπάνω μελέτη διεξήχθη με στόχο να διερευνήσουμε τον πιθανό ρόλο της σεροτονίνης στο νέο οστικό σχηματισμό στους ασθενείς με ΑΣ. Η σεροτονίνη είναι γνωστό ότι είναι ένα μόριο με ποικίλες βιολογικές λειτουργίες. Η GDS αποτελεί έναν πανίσχυρο αγγειοσυσπαστικό παράγοντα και ρυθμίζει την κινητικότητα του εντέρου, ενώ η BDS είναι ένας νευροδιαβιβαστής που συμμετέχει στη διαδικασια του πόνου και στη ρύθμιση ενός συνόλου λειτουργιών, όπως η όρεξη και η διάθεση. H παρατήρηση ότι το LRP5 δεν είναι ειδικό για τους οστεοβλάστες γονίδιο (149), απέκτησε ιδιαίτερη σημασία όταν πειράματα μικροσυστοιχιών που σύγκριναν τα οστά από Lrp5 / και wild-type ποντίκια μας έφεραν μπροστά στο απρόσμενο εύρημα ότι το πιο υψηλά εκφραζόμενο γονίδιο στα οστά, στα οποία απουσιάζει το LRP5, είναι το TPH1 και μέσω μιας σειράς πειραμάτων δείχθηκε ότι η GDS μπορεί να προσδεθεί στους Htr1b υποδοχείς στους οστεοβλάστες και να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό τους, δρώντας ως αναστολέας της οστεοβλαστογένεσης (94). Η γνώση αυτή, οδήγησε στην ανακάλυψη ενός προηγουμένως αγνωστου άξονα εντέρου-οστού, ο οποίος συμμετέχει ενεργά στη ρύθμιση της οστεοβλαστικής δραστηριότητας (111). Έκτοτε κλινικά και πειραματικά δεδομένα ήρθαν για να τεκμηριώσουν περαιτέρω το ρόλο της σεροτονίνης στον οστικό μεταβολισμό. Αρχικά τα δεδομένα προήλθαν από ζωικά μοντέλα. Η χορήγηση του LP533401, ενός Τph1 αναστολέα σε ποντίκια με οστεοπόρωση από ωοθηκεκτομή, οδήγησε σε αύξηση της οστικής τους μάζας παράλληλα με μείωση των επιπέδων σεροτονίνης, υποδεικνύοντας ότι τουλάχιστον στα ποντίκια, η σεροτονίνη εμπλέκεται στη ρύθμιση της οστικής μάζας (108). Επιπλέον, κλινικά και επιδημιολογικά δεδομένα εισηγούνται ότι η GDS ενδεχομένως έχει παρόμοια βιολογική λειτουργία στους ανθρώπους. Κατ αρχάς, πολλά στοιχεία αναδεικνύουν μια σύνδεση μεταξύ των επιπέδων της GDS και της οστικής μάζας. Υψηλά επίπεδα GDS φαίνεται να αυξάνουν την πιθανότητα ανάπτυξης οστεοπόρωσης (121). Επίσης, πολλά επιδημιολογικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα 66

75 ευρέως χρησιμοποιούμενα SSRI s μπορεί να σχετιζονται με αυξημένο κίνδυνο οστεοπόρωσης και καταγμάτων. Παρότι ο μηχανισμός μέσω του οποίου συμβαίνει αυτό δεν είναι εντελώς γνωστός, προτείνεται ότι οι SSRI s πιθανώς αυξάνουν τα επίπεδα σεροτονίνης στο μικροπεριβάλλον του οστού και αναστέλλουν έτσι την οστεοβλαστογένεση (130,135, ). Η μελέτη της ρύθμισης της οστικής μάζας από τη σεροτονίνη, ανέδειξε την πολλαπλή φύση του μορίου, παρέχοντας έτσι ένα παράδειγμα ενός μορίου που επιτελεί αντίθετες λειτουργίες στην ίδια διαδικασία, ανάλογα με το σημείο σύνθεσής του. Όλες οι προηγηθείσες μελέτες έχουν θέσει τη GDS στο επίκεντρο πιθανών νέων αναβολικών θεραπειών, για μια κοινή νόσο όπως η οστεοπόρωση, και αναδεικνύουν πως μια διαταραχή σε ένα όργανο (το οστό), μπορεί να αντιμετωπιστεί στοχεύοντας ένα άλλο (το έντερο). Αν και παραμένουν πολλά ερωτήματα, η γνώση ότι ο οστικός σχηματισμός με το ένετρο συνδέονται με κάποιον τρόπο, συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του οστού. Η ΑΣ είναι μία νόσος που χαρακτηρίζεται από υπερβολικό οστικό σχηματισμό με τη μορφή έκτοπης οστεοποίησης, ειδικά σε περιοχές που δέχονται μεγάλη μηχανική φόρτιση. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη που διερευνά τον πιθανό ρόλο της σεροτονίνης, ενός αναστολέα της οστεοβλαστογένεσης, στην ΑΣ. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι οι ασθενείς με ΑΣ έχουν χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης από τους ασθενείς με ΡΑ και τους υγιείς μάρτυρες και αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στην καταστολή της έκφρασης του TPH1 στο δωδεκαδάκτυλο. Το πιο σημαντικό είναι ότι παρέχουμε στοιχεία ότι αυτές οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης στον ορό έχουν λειτουργική επίδραση στη σηματοδότηση της σεροτονίνης ex vivo. Λαμβάνοντας υπόψιν το ρόλο της σεροτονίνης ως αναστολέα της οστεοβλαστογένεσης, το εύρημα αυτό ενδεχομένως παρέχει μια επιπλέον μοριακή συσχέτιση με την τάση για νέο οστικό σχηματισμό στους ασθενείς με ΑΣ. Τα μοριακά μονοπάτια που εμπλέκονται στο σχηματισμό νέου οστού 67

76 στην ΑΣ είναι πολύπλοκα και δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως. Δεν είναι πολύ πιθανον τα χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης να αποτελούν την κύρια αιτία εκσεσημασμένης οστεοπαραγωγής στην AΣ, ωστόσο, τα χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης θα μπορούσαν να ενισχύσουν τον οστικό σχηματισμό σε περιοχές, όπου ο σχηματισμός νέου οστού έχει ήδη πυροδοτηθεί από ανοσολογικούς ή μηχανικούς παράγοντες. Τα δεδομένα μας εισηγούνται ότι η σεροτονίνη θα έπρεπε να θεωρηθεί, ένας συμπληρωματικός «παίκτης» που εμπλέκεται στη διαδικασία νέου οστικού σχηματισμού στην AΣ. Η σεροτονίνη είναι ένα μόριο, το οποιο εμπλέκεται επίσης στη διαδικασία του πόνου, και θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι οι μετρούμενες τιμές στον ορό σχετίζονται με τον πόνο που βιώνουν οι ασθενείς. Ωστόσο, τα χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ δεν μπορούν να αποδοθούν στο χρόνιο πόνο, καθώς οι ασθενείς με ΡΑ, οι οποίοι βιώνουν συγκρίσιμα επίπεδα πόνου και δυσφορίας, δεν εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης, αντίθετα έχουν τάση προς υψηλότερα επίπεδα σεροτονίνης. Αυξημένα επίπεδα σεροτονίνης σε ασθενείς με ΡΑ έχουν ήδη αναφερθεί στη βιβλιογραφία (153) και ενδεχομένως σχετίζονται με εκσεσημασμένη οστική απώλεια στη νόσο αυτή. Οι ασθενείς με ινομυαλγία, μία νόσο, η οποία σχετίζεται τυπικά με χρόνιο πόνο, δεν παρουσιάζουν αλλαγές στα επίπεδα της σεροτονίνης κλινικά σημαντικές (154). Τα ανωτέρω δεδομένα οδηγούν προς την κατεύθυνση ότι τα χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης στην ΑΣ, αποτελούν ενδεχομένως ειδικό εύρημα στη συγκεκριμένη φλεγμονώδη ρευματική νόσο και δε σχετίζονται με τα επίπεδα του πόνου ή της φλεγμονής. Η διαδικασία του remodeling του οστού στην ΑΣ είναι εξαιρετικά σύνθετη. Παρότι το ορόσημο της νόσου είναι ο νέος οστικός σχηματισμός σε περιοχές ευάλωτες στην αυξημένη μηχανική καταπόνηση, όπως οι ενθέσεις, οι ασθενείς με ΑΣ, εμφανίζουν επίσης οστεοπόρωση (155). Οι TNFα αναστολείς έχει ξεκάθαρα δειχθεί ότι αυξάνουν την οστική μάζα (bone mass density- 68

77 BMD) στους ασθενείς με ΑΣ ( ). Η αύξηση αυτή στην BMD σχετίζεται με αύξηση τους δείκτες οστικού σχηματισμού (159) όπως η οστική αλκαλική φωσφατάση (160) ή η οστεοκαλσίνη (161). Ένα άλλο εύρημα της μελέτης μας αποτελεί το ότι αντι-tnfα θεραπεία σχετίζεται με ακόμα χαμηλότερα απίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ. Λαμβάνοντας υπόψιν ότι η σεροτονίνη δρα σα μοριακό φρένο για την οστεοβλαστογένεση, αυτό θα μπορούσε να αποτελεί μια πιθανή βλαπτική επίδραση. Εξελίσσεται από καιρό μια συζήτηση για το αν η φλεγμονή και ο νέος οστικός σχηματισμός στην ΑΣ είναι ανεξάρτητα ή συνδεδεμένα (162). Αν οι διαδικασίες αυτές ήταν έστω σε ένα βαθμό συνδεδεμένες, θα ανέμενε κανείς ότι η χορήγηση αντι-tnfα θεραπείας, θα κατέστειλε αποτελεσματικά το σχηματισμό νέου οστού. Ωστόσο, κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι ακόμη και η μακροχρόνια χορήγηση TNFα αναστολέων δεν έχει εμφανή επίδραση στην ακτινολογική πρόοδο στην ΑΣ. Με βάση τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ, θα μπορούσε κάποιος να υποθέσει ότι τα χαμηλά επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν TNFα αναστολείς θα μπορούσαν να ανταγωνιστούν κάθε κατασταλτική επίδραση των παραγόντων αυτών στο σχηματισμό νέου οστού. Επομένως, αυτό θα μπορούσε να αποτελεί μια εξήγηση γιατί οι TNFα αναστολείς δεν επηρεάζουν εμφανώς το σχηματισμό οστεόφυτων στην ΑΣ. Η μελέτη μας δεν απαντά στο ερώτημα με ποιον τρόπο οι TNFα αναστολείς εηρεάζουν τα επίπεδα της σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ. Προσπαθήσαμε να θέσουμε αυτό το θέμα μέσω της εκτίμησης της έκφρασης του Tph1 στο δωδεκαδάκτυλο ασθενών με νόσο Crohn, καθώς οι ασθενείς με ΑΣ δεν υποβάλλονται τακτικά σε ενδοσκοπήσεις. Από τα δεδομένα μας προκύπτει ότι οι TNFα αναστολείς δεν επηρεάζουν την έκφραση του Tph1 σε ασθενείς με νόσο Crohn, παρότι από τα δεδομένα αυτά δεν μπορούμε να κάνουμε άμεση προέκταση στην AS. Επομένως, τα χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης στους ασθενείς με ΑΣ, οι οποίοι λαμβάνουν TNFα 69

78 αναστολείς, θα μπορούσαν να ερμηνευτούν με άλλους μηχανισμούς, όπως για παράδειγμα ο ενισχυμένος καταβολισμός της σεροτονίνης ή/και η αυξημένη κατακράτηση της σεροτονίνης στα αιμοπετάλια. Τελικά, στην παρούσα μελέτη, παρότι αξολογήσαμε την έκφραση του Tph1, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης, όσο και σε επίπεδο mrna, δεν αξιολογήσαμε τη λειτουργική του ακεραιότητα. Πιθανή αδυναμία της μελέτης μας αποτελεί το μικρό μέγεθος του πληθυσμού μας. Χρειάζεται να αναλυθουν μεγαλύτεροι πληθυσμοί. Επιπλέον, λόγω του cross-sectional σχεδιασμού της μελέτης, δεν είχαμε τη δυνατότητα να διερευνήσουμε πιθανή συσχέτιση μεταξύ χαμηλών επιπέδων σεροτονίνης και επιταχυνόμενου σχηματισμού νέου οστού. Το παραπάνω θα έπρεπε να αξιολογηθεί σε μεγαλύτερης κλίμακας, προοπτικές μελέτες. Συμπερασματικά, στη μελέτη μας αναφέρουμε ότι τα κυκλοφορούντα επίπεδα σεροτονίνης είναι χαμηλά σε ασθενείς με AS και μειώνονται περαιτέρω μετά τη χορήγηση TNFα αναστολέων. Ίσως πιο σημαντικό εύρημα αποτελεί ότι οι περιγραφόμενες διαφορές των επιπέδων σεροτονίνης ορού, επηρεάζουν τη σηματοδότηση της σεροτονίνης σε μιά ανθρώπινη κυτταρική σειρά με χαρακτήρες οστεοβλαστών, προτείνοντας ότι αυτό θα μπορούσε να είναι βιολογικά σημαντικό και in vivo. 70

79 6. Χρηματοδότηση 71

80 Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Ελληνική Ρευματολογική Εταιρεία και Επαγγελματική Ένωση Ρευματολόγων Ελλάδος 72

81 7. Βιβλιογραφία 73

82 1. Khan MA. An overview of clinical spectrum and heterogeneity of spondyloarthropathies. Rheum Dis Clin North Am 1992;18(1): Poddubnyy D, Rudwaleit M. Early Spondyloarthritis. Rheum Dis Clin North Am 2012;38(2): Khan MA, Mathieu A, Sorrentino R, Akkoc N. The pathogenetic role of HLA-B27 and its subtypes. Autoimmun Rev 2007;6(3): Brewerton DA, Hart FD, Nicholls A, Caffrey M, James DC SR. Ankylosing spondylitis and HL-A 27. Lancet. 1973;1(7809): Khan MA. Update on Spondyloarthropathies. Ann Intern Med 2002;136(12): Amor B, Dougados M, Mijiyawa M. [Criteria of the classification of spondylarthropathies]. Rev du Rhum des Mal oste o-articulaires 1990;57(2): Dougados M, van der Linden S, Juhlin R, Huitfeldt B, Amor B, Calin A, et al. The European Spondyloarthropathy Study Group preliminary criteria for the classification of spondyloarthropathy. Arthritis Rheum. 1991;34(10): Rudwaleit M, van der Heijde D, Landewé R, Listing J, Akkoc N, Brandt J, et al. The development of Assessment of SpondyloArthritis international Society classification criteria for axial spondyloarthritis (part II): validation and final selection. Ann Rheum Dis. 2009;68(6): Zeidler H, Amor B. The Assessment in Spondyloarthritis International Society (ASAS) classification criteria for peripheral spondyloarthritis and for spondyloarthritis in general: the spondyloarthritis concept in progress. Ann Rheum Dis. 2011;70(1): Rudwaleit M, van der Heijde D, Landewé R, Akkoc N, Brandt J, Chou CT, et al. The Assessment of SpondyloArthritis International Society classification criteria for peripheral spondyloarthritis and for spondyloarthritis in general. Ann Rheum Dis. 2011;70(1): Rudwaleit M, Sieper J. Referral strategies for early diagnosis of axial spondyloarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8(5): Stolwijk C, van Onna M, Boonen A, van Tubergen A. The global prevalence of spondyloarthritis: A systematic review and meta-regression analysis. Arthritis Care Res (Hoboken) 2015 Dec 29. doi: /acr [Epub ahead of print] 13. Kidd B, Mullee M, Frank A, Cawley M. Disease expression of ankylosing spondylitis in males and females. J Rheumatol. 1988;15(9): van der Linden S, Valkenburg H a, Cats a. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis. A proposal for modification of the New York criteria. Arthritis Rheum. 1984;27(4): Rudwaleit M, Metter A, Listing J, Sieper J, Braun J. Inflammatory back pain in ankylosing spondylitis: A reassessment of the clinical history for application as classification and diagnostic criteria. Arthritis Rheum. 2006;54(2): Sieper J, van der Heijde D, Landewé R, Brandt J, Burgos-Vagas R, Collantes-Estevez E, 74

83 et al. New criteria for inflammatory back pain in patients with chronic back pain: a real patient exercise by experts from the Assessment of SpondyloArthritis international Society (ASAS). Ann Rheum Dis. 2009;68 (6 ): Ball J. Enthesopathy of rheumatoid and ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 1971;30: Rudwaleit M1 BD. Ankylosing spondylitis and bowel disease. Best Pr Res Clin Rheumatol. 2006;20(3): Zeboulon N, Dougados M, Gossec L. Prevalence and characteristics of uveitis in the spondyloarthropathies: a systematic literature review. Ann Rheum Dis ;67 (7 ): O Neill TW, Bresnihan B. The heart in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 1992;51(6): Haroon NN, Paterson JM, Li P, Inman RD, Haroon N. Patients With Ankylosing Spondylitis Have Increased Cardiovascular and Cerebrovascular MortalityA Population- Based StudyIncreased Cardiovascular and Cerebrovascular Mortality in Ankylosing Spondylitis. Ann Intern Med. 2015;163(6): El Maghraoui A, Dehhaoui M. Prevalence and characteristics of lung involvement on high resolution computed tomography in patients with ankylosing spondylitis: A systematic review. Pulm Med. 2012;2012: Mercieca C, Van Der Horst-Bruinsma IE, Borg AA. Pulmonary, renal and neurological comorbidities in patients with ankylosing spondylitis; implications for clinical practice. Curr Rheumatol Rep. 2014;16(8). 24. El Maghraoui A. Extra-articular manifestations of ankylosing spondylitis: Prevalence, characteristics and therapeutic implications. Eur J Intern Med. European Federation of Internal Medicine.; 2011;22(6): Dougados M, Baeten D. Spondyloarthritis. Lancet. 2011;377(9783): Lories RJ, Haroon N. Bone formation in axial spondyloarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol.; 2014;28(5): Lories RJ1 SG. Pathophysiology of new bone formation and ankylosis in spondyloarthritis. Rheum Dis Clin North Am. 2012;38(3): Jacques P, Lambrecht S, Verheugen E, Pauwels E, Kollias G, Armaka M, et al. Proof of concept: enthesitis and new bone formation in spondyloarthritis are driven by mechanical strain and stromal cells. Ann Rheum Dis. 2014;73(2): Van Der Heijde D, Landewé R, Baraliakos X, Houben H, Van Tubergen A, Williamson P, et al. Radiographic findings following two years of infliximab therapy in patients with ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2008;58(10): Van Der Heijde D, Landewé R, Einstein S, Ory P, Vosse D, Ni L, et al. Radiographic progression of ankylosing spondylitis after up to two years of treatment with etanercept. 75

84 Arthritis Rheum. 2008;58(5): Baraliakos X, Haibel H, Listing J, Sieper J, Braun J. Continuous long-term anti-tnf therapy does not lead to an increase in the rate of new bone formation over 8 years in patients with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2014;73 (4 ): Haroon N, Inman RD, Learch TJ, Weisman MH, Lee M, Rahbar MH, et al. The impact of tumor necrosis factor α inhibitors on radiographic progression in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum.2013;65(10): Poddubnyy D, Rudwaleit M, Haibel H, Listing J, Märker-Hermann E, Zeidler H, et al. Rates and predictors of radiographic sacroiliitis progression over 2 years in patients with axial spondyloarthritis. Ann Rheum Dis. 2011;70(8): Poddubnyy D, Haibel H, Listing J, Märker-Hermann E, Zeidler H, Braun J, et al. Baseline radiographic damage, elevated acute-phase reactant levels, and cigarette smoking status predict spinal radiographic progression in early axial spondylarthritis. Arthritis Rheum. 2012;64(5): Cortes A, Maksymowych WP, Wordsworth BP, Inman RD, Danoy P, Rahman P, et al. Association study of genes related to bone formation and resorption and the extent of radiographic change in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2015;74(7): Ward MM, Hendrey MR, Malley JD, Learch TJ, Davis JC, Reveille JD, et al. Clinical and immunogenetic prognostic factors for radiographic severity in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2009;61(7): Bartolomé N, Szczypiorska M, Sánchez A, Sanz J, Juanola-Roura X, Gratacós J, et al. Genetic polymorphisms inside and outside the MHC improve prediction of AS radiographic severity in addition to clinical variables. Rheumatology (Oxford) 2012;51(8): Wei W1, Lu Q, Chaudry GJ, Leppla SH CS. The LDL receptor-related protein LRP6 mediates internalization and lethality of anthrax toxin. Cell. 2006;124(6): Minamizaki T1, Yoshiko Y, Kozai K, Aubin JE MN. EP2 and EP4 receptors differentially mediate MAPK pathways underlying anabolic actions of prostaglandin E2 on bone formation in rat calvaria cell cultures. Bone. 2009;44(6): Lin Z, Bei J-X, Shen M, Li Q, Liao Z, Zhang Y, et al. A genome-wide association study in Han Chinese identifies new susceptibility loci for ankylosing spondylitis. Nat Genet. 2012;44(1): Watanabe H, Yamada Y. Mice lacking link protein develop dwarfism and craniofacial abnormalities. Nat Genet. 1999;21(2): Eskan MA, Jotwani R, Abe T, Chmelar J, Lim J-H, Liang S, et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nat Immunol. 2012;13(5): Takai A, Inomata H, Arakawa A, Yakura R, Matsuo-Takasaki M, Sasai Y. Anterior neural development requires Del1, a matrix-associated protein that attenuates canonical Wnt 76

85 signaling via the Ror2 pathway. Development. 2010;137(19): Ehlen HWA, Chinenkova M, Moser M, Munter H-M, Krause Y, Gross S, et al. Inactivation of anoctamin-6/tmem16f, a regulator of phosphatidylserine scrambling in osteoblasts, leads to decreased mineral deposition in skeletal tissues. J Bone Miner Res. 2013;28(2): Lories RJU, Luyten FP. Bone morphogenetic proteins in destructive and remodeling arthritis. Arthritis Res Ther. 2007;9(2): Lories RJ, Corr M, Lane NE. To Wnt or not to Wnt: the bone and joint health dilemma. Nat Rev Rheumatol 2013;9(6): Grotewold L, Rüther U. Bmp, Fgf and Wnt signalling in programmed cell dead and chondrogenesis during vertebrate limb development: the role of Dickkopf-1. Int J Dev Biol. 2002;46(7): Miller JR, Moon RT. Signal transduction through beta-catenin and specification of cell fate during embryogenesis. Genes Dev. 1996;10(20): van Amerongen R, Nusse R. Towards an integrated view of Wnt signaling in development. Development. 2009;136(19): MacDonald BT, Tamai K, He X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell 2009;17(1): Miller JR, Hocking AM, Brown JD, Moon RT. Mechanism and function of signal transduction by the Wnt/beta-catenin and Wnt/Ca2+ pathways. Oncogene.1999 Dec 20;18(55): Mao B, Wu W, Davidson G, Marhold J, Li M, Mechler BM, et al. Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/[beta]-catenin signalling. Nature ;417(6889): Semënov M V, Tamai K, Brott BK, Kühl M, Sokol S, He X. Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6. Curr Biol 2001;11(12): Semënov M V, Zhang X, He X. DKK1 antagonizes Wnt signaling without promotion of LRP6 internalization and degradation. J Biol Chem. 2008;283(31): Diarra D, Stolina M, Polzer K, Zwerina J, Ominsky MS, Dwyer D, et al. Dickkopf-1 is a master regulator of joint remodeling. Nat Med. Nature Publishing Group; 2007 ;13(2): Daoussis D, Liossis SNC, Solomou EE, Tsanaktsi A, Bounia K, Karampetsou M, et al. Evidence that Dkk-1 is dysfunctional in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2010;62(1): Uderhardt S, Diarra D, Katzenbeisser J, David J-P, Zwerina J, Richards W, et al. Blockade of Dickkopf (DKK)-1 induces fusion of sacroiliac joints. Ann Rheum Dis. 2010;69 (3 ): Heiland GR, Appel H, Poddubnyy D, Zwerina J, Hueber a., Haibel H, et al. High level of 77

86 functional dickkopf-1 predicts protection from syndesmophyte formation in patients with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2012;71(4): Chen G, Deng C, Li Y-P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation. Int J Biol Sci. 2012;8(2): Wang RN, Green J, Wang Z, Deng Y, Qiao M, Peabody M, et al. Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in development and human diseases. Genes Dis. 2014;1(1): Chen M-H, Chen H-A, Chen W-S, Chen M-H, Tsai C-Y, Chou C-T. Upregulation of BMP-2 expression in peripheral blood mononuclear cells by proinflammatory cytokines and radiographic progression in ankylosing spondylitis. Mod Rheumatol. 2015;25(6): Chen H-A, Chen C-H, Lin Y-J, Chen P-C, Chen W-S, Lu C-L, et al. Association of bone morphogenetic proteins with spinal fusion in ankylosing spondylitis. J Rheumatol. 2010;37(10): Lories RJU, Derese I, Luyten FP. Modulation of bone morphogenetic protein signaling inhibits the onset and progression of ankylosing enthesitis. J Clin Invest. 2005;115(6): Benjamin M, Toumi H, Suzuki D, Hayashi K, McGonagle D. Evidence for a distinctive pattern of bone formation in enthesophytes. Ann Rheum Dis. 2009;68(6): Lories RJU, Luyten FP, de Vlam K. Progress in spondylarthritis. Mechanisms of new bone formation in spondyloarthritis. Arthritis Res Ther. 2009;11(2): Rockel JS, Alman BA. Don t hedge your bets: hedgehog signaling as a central mediator of endochondral bone development and cartilage diseases. J Orthop Res. 2011;29(6): Lin AC, Seeto BL, Bartoszko JM, Khoury MA, Whetstone H, Ho L, et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat Med. 2009;15(12): Ruiz-Heiland G, Horn A, Zerr P, Hofstetter W, Baum W, Stock M, et al. Blockade of the hedgehog pathway inhibits osteophyte formation in arthritis. Ann Rheum Dis. 2012;71(3): Regard JB, Malhotra D, Gvozdenovic-Jeremic J, Josey M, Chen M, Weinstein LS, et al. Activation of Hedgehog signaling by loss of GNAS causes heterotopic ossification. Nat Med. 2013;19(11): Daoussis D, Filippopoulou A, Liossis SN, Sirinian C, Klavdianou K, Bouris P, et al. Anti- TNFa treatment decreases the previously increased serum Indian Hedgehog levels in patients with ankylosing spondylitis and affects the expression of functional Hedgehog pathway target genes. Semin Arthritis Rheum; 2015;44(6): Maksymowych WP, Chiowchanwisawakit P, Clare T, Pedersen SJ, Østergaard M, Lambert RGW. Inflammatory lesions of the spine on magnetic resonance imaging predict the development of new syndesmophytes in ankylosing spondylitis: evidence of a 78

87 relationship between inflammation and new bone formation. Arthritis Rheum ;60(1): Maksymowych WP. What do biomarkers tell us about the pathogenesis of ankylosing spondylitis? Arthritis Res Ther. 2009;11(1): Sieper J, Appel H, Braun J, Rudwaleit M. Critical appraisal of assessment of structural damage in ankylosing spondylitis: implications for treatment outcomes. Arthritis Rheum. 2008;58(3): Lories RJ, McInnes IB. Primed for inflammation: enthesis-resident T cells. Nat Med. 2012;18(7): Ramiro S, van der Heijde D, van Tubergen A, Stolwijk C, Dougados M, van den Bosch F, et al. Higher disease activity leads to more structural damage in the spine in ankylosing spondylitis: 12-year longitudinal data from the OASIS cohort. Ann Rheum Dis. 2014;73(8): Chiowchanwisawakit P, Lambert RGW, Conner-Spady B, Maksymowych WP. Focal fat lesions at vertebral corners on magnetic resonance imaging predict the development of new syndesmophytes in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2011;63(8): Pedersen SJ, Chiowchanwisawakit P, Lambert RGW, Østergaard M, Maksymowych WP. Resolution of inflammation following treatment of ankylosing spondylitis is associated with new bone formation. J Rheumatol. 2011;38(7): RAPPORT MM, GREEN AA, PAGE IH. Serum vasoconstrictor, serotonin; isolation and characterization. J Biol Chem. 1948;176(3): Mann J, McBride P, RP B, al et. RElationship between central and peripheral serotonin indexes in depressed and suicidal psychiatric inpatients. Arch Gen Psychiatry ;49(6): Côté F, Thévenot E, Fligny C, Fromes Y, Darmon M, Ripoche M-A, et al. Disruption of the nonneuronal tph1 gene demonstrates the importance of peripheral serotonin in cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(23): Gershon MD1 TJ. The serotonin signaling system: from basic understanding to drug development for functional GI disorders. Gastroenterology. 2007;132(1): Lovenberg W, Jequier E, Sjoerdsma A. Tryptophan hydroxylation: measurement in pineal gland, brainstem, and carcinoid tumor. Science. 1967;155(3759): Legay C1, Faudon M, Héry F TJ. 5-HT metabolism in the intestinal wall of the rat-ii. The nerves plexuses-interactions between 5-HT containing cells. Neurochem Int. 1983;5(5): Serotonin receptors. Genetic insights into serotonin function. Curr Biol. 1995; 1;5(9): Gaspar P, Cases O, Maroteaux L. The developmental role of serotonin: news from mouse molecular genetics. Nat Rev Neurosci. 2003;4(12):

88 86. Berger M, Gray JA, Roth BL. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 2009;60: Warden SJ, Robling AG, Haney EM, Turner CH, Bliziotes MM. The emerging role of serotonin (5-hydroxytryptamine) in the skeleton and its mediation of the skeletal effects of low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5). Bone. 2010;46(1): aan het Rot M, Mathew SJ, Charney DS. Neurobiological mechanisms in major depressive disorder. CMAJ. 2009;180(3): Arroll B, Macgillivray S, Ogston S, Reid I, Sullivan F, Williams B, et al. Efficacy and tolerability of tricyclic antidepressants and SSRIs compared with placebo for treatment of depression in primary care: a meta-analysis. Ann Fam Med;3(5): Jonnakuty C, Gragnoli C. What do we know about serotonin? J Cell Physiol. 2008;217(2): Ni W, Watts SW. 5-hydroxytryptamine in the cardiovascular system: focus on the serotonin transporter (SERT). Clin Exp Pharmacol Physiol 2006;33(7): Côté F1, Fligny C, Fromes Y, Mallet J VG. Recent advances in understanding serotonin regulation of cardiovascular function. Trends Mol Med. 2004;10(5): RAND M, REID G. Source of serotonin in serum. Nature. 1951;168(4270): Yadav VK, Ryu JH, Suda N, Tanaka KF, Gingrich JA, Schutz G, et al. Lrp5 Controls Bone Formation by Inhibiting Serotonin Synthesis in the Duodenum. Cell. 2008;135(5): Bliziotes M. Update in serotonin and bone. J Clin Endocrinol Metab ;95(9): Kawai M, Rosen CJ. Minireview: A skeleton in serotonin s closet? Endocrinology. 2010;151(9): Battaglino R, Fu J, Späte U, Ersoy U, Joe M, Sedaghat L, et al. Serotonin regulates osteoclast differentiation through its transporter. J Bone Miner Res. 2004;19(9): Bliziotes M1, Eshleman A, Burt-Pichat B, Zhang XW, Hashimoto J, Wiren K CC. Serotonin transporter and receptor expression in osteocytic MLO-Y4 cells. Bone. 2006;39(6): Gustafsson BI, Thommesen L, Stunes AK, Tommeras K, Westbroek I, Waldum HL, et al. Serotonin and fluoxetine modulate bone cell function in vitro. J Cell Biochem. 2006;98(1): Bliziotes MM1, Eshleman AJ, Zhang XW WK. Neurotransmitter action in osteoblasts: expression of a functional system for serotonin receptor activation and reuptake. Bone. 2001;29(5): Westbroek I, van der Plas A, de Rooij KE, Klein-Nulend J, Nijweide PJ. Expression of serotonin receptors in bone. J Biol Chem. 2001;276(31):

89 102. Baron R, Rawadi G. Targeting the Wnt/beta-catenin pathway to regulate bone formation in the adult skeleton. Endocrinology. 2007;148(6): Gong Y, Slee RB, Fukai N, Rawadi G, Roman-Roman S, Reginato AM, et al. LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell. 2001;107(4): Boyden LM, Mao J, Belsky J, Mitzner L, Farhi A, Mitnick MA, et al. High bone density due to a mutation in LDL-receptor-related protein 5. N Engl J Med. 2002;346(20): Tamai K1, Zeng X, Liu C, Zhang X, Harada Y, Chang Z HX. A mechanism for Wnt coreceptor activation. Mol Cell. 2004;Jan 16;13(1): Moon RT, Kohn AD, De Ferrari G V, Kaykas A. WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies. Nat Rev Genet. 2004;5(9): Glass DA 2nd1, Bialek P, Ahn JD, Starbuck M, Patel MS, Clevers H, Taketo MM, Long F, McMahon AP, Lang RA KG. Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiation. Dev Cell. 2005; 8(5): Yadav VK, Balaji S, Suresh PS, Liu XS, Lu X, Li Z, et al. Pharmacological inhibition of gut-derived serotonin synthesis is a potential bone anabolic treatment for osteoporosis. Nat Med. 2010;16(3): Shi Z-C, Devasagayaraj A, Gu K, Jin H, Marinelli B, Samala L, et al. Modulation of peripheral serotonin levels by novel tryptophan hydroxylase inhibitors for the potential treatment of functional gastrointestinal disorders. J Med Chem. 2008;51(13): Karsenty G, Yadav VK. Regulation of bone mass by serotonin: molecular biology and therapeutic implications. Annu Rev Med. 2011;62: Long F1. When the gut talks to bone. Cell. 2008;135(5): Yadav VK1, Oury F, Suda N, Liu ZW, Gao XB, Confavreux C, Klemenhagen KC, Tanaka KF, Gingrich JA, Guo XE, Tecott LH, Mann JJ, Hen R, Horvath TL KG. A serotonin-dependent mechanism explains the leptin regulation of bone mass, appetite, and energy expenditure. Cell. 2009;138(5): Friedman JM, Halaas JL. Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature. 1998;395(6704): Shi Y, Yadav VK, Suda N, Liu XS, Guo XE, Myers MG, et al. Dissociation of the neuronal regulation of bone mass and energy metabolism by leptin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(51): Takeda S1, Elefteriou F, Levasseur R, Liu X, Zhao L, Parker KL, Armstrong D, Ducy P KG. Leptin regulates bone formation via the sympathetic nervous system. Cell. 2002;111(3): Mercer JG1, Hoggard N, Williams LM, Lawrence CB, Hannah LT TP. Localization of leptin receptor mrna and the long form splice variant (Ob-Rb) in mouse hypothalamus 81

90 and adjacent brain regions by in situ hybridization. FEBS Lett. 1996;387.(2-3): Balthasar N1, Coppari R, McMinn J, Liu SM, Lee CE, Tang V, Kenny CD, McGovern RA, Chua SC Jr, Elmquist JK LB. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 2004;42(6): Ducy P, Karsenty G. The two faces of serotonin in bone biology. J Cell Biol. 2010;191(1): Hanley HG, Stahl SM, Freedman DX. Hyperserotonemia and amine metabolites in autistic and retarded children. Arch Gen Psychiatry. 1977;34(5): Hediger ML, England LJ, Molloy CA, Yu KF, Manning-Courtney P, Mills JL. Reduced bone cortical thickness in boys with autism or autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 2008;38(5): Mödder UI, Achenbach SJ, Amin S, Riggs BL, Melton LJ, Khosla S. Relation of serum serotonin levels to bone density and structural parameters in women. J Bone Miner Res. 2010;25(2): Frost M, Andersen TE, Yadav V, Brixen K, Karsenty G, Kassem M. Patients with highbone-mass phenotype owing to Lrp5-T253I mutation have low plasma levels of serotonin. J Bone Miner Res 2010;25(3): Frost M, Andersen T, Gossiel F, Hansen S, Bollerslev J, van Hul W, et al. Levels of serotonin, sclerostin, bone turnover markers as well as bone density and microarchitecture in patients with high-bone-mass phenotype due to a mutation in Lrp5. J Bone Miner Res. 2011;26(8): Halbreich U, Palter S. Accelerated osteoporosis in psychiatric patients: possible pathophysiological processes. Schizophr Bull. 1996;22(3): Howard L, Kirkwood G, Leese M. Risk of hip fracture in patients with a history of schizophrenia. Br J Psychiatry. 2007;190: Bostwick JR, Guthrie SK, Ellingrod VL. Antipsychotic-induced hyperprolactinemia. Pharmacotherapy. 2009;29(1): Warden SJ, Nelson IR, Fuchs RK, Bliziotes MM, Turner CH. Serotonin (5- hydroxytryptamine) transporter inhibition causes bone loss in adult mice independently of estrogen deficiency. Menopause 2008.;15(6): Warden SJ, Robling AG, Sanders MS, Bliziotes MM, Turner CH. Inhibition of the serotonin (5-hydroxytryptamine) transporter reduces bone accrual during growth. Endocrinology. 2005;146(2): Westbroek I, Waarsing JH, van Leeuwen JPTM, Waldum H, Reseland JE, Weinans H, et al. Long-term fluoxetine administration does not result in major changes in bone architecture and strength in growing rats. J Cell Biochem. 2007;101(2): Warden SJ1, Hassett SM, Bond JL, Rydberg J, Grogg JD, Hilles EL, Bogenschutz ED, Smith HD, Fuchs RK, Bliziotes MM TC. Psychotropic drugs have contrasting skeletal 82

91 effects that are independent of their effects on physical activity levels. Bone. 2010; 46(4): Bonnet N1, Bernard P, Beaupied H, Bizot JC, Trovero F, Courteix D BC. Various effects of antidepressant drugs on bone microarchitectecture, mechanical properties and bone remodeling. Toxicol Appl Pharmacol. 2007; 221(1): Zolkowska D, Baumann MH, Rothman RB. Chronic fenfluramine administration increases plasma serotonin (5-hydroxytryptamine) to nontoxic levels. J Pharmacol Exp Ther. 2008;324(2): Ziere G, Dieleman JP, van der Cammen TJM, Hofman A, Pols HAP, Stricker BHC. Selective serotonin reuptake inhibiting antidepressants are associated with an increased risk of nonvertebral fractures. J Clin Psychopharmacol. 2008;28(4): Vestergaard P, Rejnmark L, Mosekilde L. Selective serotonin reuptake inhibitors and other antidepressants and risk of fracture. Calcif Tissue Int. 2008;82(2): Diem SJ, Blackwell TL, Stone KL, Yaffe K, Haney EM, Bliziotes MM, et al. Use of antidepressants and rates of hip bone loss in older women: the study of osteoporotic fractures. Arch Intern Med. 2007;167(12): Liu B1, Anderson G, Mittmann N, To T, Axcell T SN. Use of selective serotonin-reuptake inhibitors or tricyclic antidepressants and risk of hip fractures in elderly people. Lancet. 1998;351(9112): Lewis CE, Ewing SK, Taylor BC, Shikany JM, Fink HA, Ensrud KE, et al. Predictors of non-spine fracture in elderly men: the MrOS study. J Bone Miner Res. 2007;22(2): Bolton JM, Metge C, Lix L, Prior H, Sareen J, Leslie WD. Fracture risk from psychotropic medications: a population-based analysis. J Clin Psychopharmacol. 2008;28(4): Richards JB, Papaioannou A, Adachi JD, Joseph L, Whitson HE, Prior JC, et al. Effect of selective serotonin reuptake inhibitors on the risk of fracture. Arch Intern Med 2007;167(2): Calarge CA, Zimmerman B, Xie D, Kuperman S, Schlechte JA. A cross-sectional evaluation of the effect of risperidone and selective serotonin reuptake inhibitors on bone mineral density in boys. J Clin Psychiatry.2010;71(3): Maurer-Spurej E, Pittendreigh C, Solomons K. The influence of selective serotonin reuptake inhibitors on human platelet serotonin. Thromb Haemost. 2004;91(1): Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1988;31(3): Garrett S, Jenkinson T, Kennedy LG, Whitelock H, Gaisford P, Calin A. A new approach to defining disease status in ankylosing spondylitis: the Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index. J Rheumatol. 1994;21(12):

92 144. Prevoo ML, van t Hof MA, Kuper HH, van Leeuwen MA, van de Putte LB, van Riel PL. Modified disease activity scores that include twenty-eight-joint counts. Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1995;38(1): Wanders AJB, Landewé RBM, Spoorenberg A, Dougados M, van der Linden S, Mielants H, et al. What is the most appropriate radiologic scoring method for ankylosing spondylitis? A comparison of the available methods based on the Outcome Measures in Rheumatology Clinical Trials filter. Arthritis Rheum. 2004;50(8): Ramakers C1, Ruijter JM, Deprez RH MA. Assumption-free analysis of quantitative realtime polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett. 2003;339(1): Peluso R, Di Minno MND, Iervolino S, Manguso F, Tramontano G, Ambrosino P, et al. Enteropathic spondyloarthritis: from diagnosis to treatment. Clin Dev Immunol 2013;2013: Colombo E, Latiano A, Palmieri O, Bossa F, Andriulli A, Annese V. Enteropathic spondyloarthropathy: a common genetic background with inflammatory bowel disease? World J Gastroenterol. 2009;15(20): Kato M, Patel MS, Levasseur R, Lobov I, Chang BH-J, Glass DA, et al. Cbfa1- independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. J Cell Biol. 2002;157(2): Bab I, Yirmiya R. Depression, selective serotonin reuptake inhibitors, and osteoporosis. Curr Osteoporos Rep. 2010;8(4): Haney EM, Chan BKS, Diem SJ, Ensrud KE, Cauley JA, Barrett-Connor E, et al. Association of low bone mineral density with selective serotonin reuptake inhibitor use by older men. Arch Intern Med. 2007;167(12): Verdel BM1, Souverein PC, Egberts TC, van Staa TP, Leufkens HG de VF. Use of antidepressant drugs and risk of osteoporotic and non-osteoporotic fractures. Bone. 2010;47(3): Kopp S, Alstergren P. Blood serotonin and joint pain in seropositive versus seronegative rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2002;11(4): Jaschko G, Hepp U, Berkhoff M, Schmet M, Michel BA, Gay S, et al. Serum serotonin levels are not useful in diagnosing fibromyalgia. Ann Rheum Dis. 2007;66(9): Klingberg E, Lorentzon M, Mellström D, Geijer M, Göthlin J, Hilme E, et al. Osteoporosis in ankylosing spondylitis - prevalence, risk factors and methods of assessment. Arthritis Res Ther. 2012;14(3):R Kang KY1, Lee KY, Kwok SK, Ju JH, Park KS, Hong YS, Kim HY PS. The change of bone mineral density according to treatment agents in patients with ankylosing spondylitis. Jt Bone Spine. 2011;78(2): Kang KY, Ju JH, Park S-H, Kim H-Y. The paradoxical effects of TNF inhibitors on bone 84

93 mineral density and radiographic progression in patients with ankylosing spondylitis. Rheumatology (Oxford). 2013;52(4): Durnez A, Paternotte S, Fechtenbaum J, Landewé RBM, Dougados M, Roux C, et al. Increase in bone density in patients with spondyloarthritis during anti-tumor necrosis factor therapy: 6-year followup study. J Rheumatol. 2013;40(10): Barnabe C1 HD. Effect of tumor necrosis factor alpha inhibition on bone density and turnover markers in patients with rheumatoid arthritis and spondyloarthropathy. Semin Arthritis Rheum. 2009;39(2): Visvanathan S, van der Heijde D, Deodhar A, Wagner C, Baker DG, Han J, et al. Effects of infliximab on markers of inflammation and bone turnover and associations with bone mineral density in patients with ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2009;68(2): Allali F, Breban M, Porcher R, Maillefert JF, Dougados M, Roux C. Increase in bone mineral density of patients with spondyloarthropathy treated with anti-tumour necrosis factor alpha. Ann Rheum Dis. 2003;62(4): Maksymowych WP, Elewaut D, Schett G. Motion for debate: the development of ankylosis in ankylosing spondylitis is largely dependent on inflammation. Arthritis Rheum. 2012;64(6):

94 8. Περίληψη 86

95 Υπάρχουν δεδομένα που εισηγούνται ότι η σεροτονίνη είναι αναστολέας του οστικού σχηματισμού. Στόχος μας ήταν να εκτιμήσουμε: i) τα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε ασθενείς με αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα (AΣ), μια πρότυπη νόσο οστικού σχηματισμού, σε σύγκριση με ασθενείς με ρευματειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) και υγιείς μάρτυρες ii) την επίδραση (επιδράσεις) των TNFα αναστολέων στα επίπεδα σεροτονίνης ορού στα επίπεδα σεροτονίνης ορού σε ασθενείς με ΑΣ και ΡΑ και iii) την επίδραση (επιδράσεις) του ορού των ασθενών με ΑΣ στη σηματοδοτηση της σεροτονίνης. Τα επίπεδα σεροτονίνης ορού μετρήθηκαν σε 47 ασθενείς με ΑΣ, 28 ασθενείς με ΡA και 40 υγιείς μάρτυρες με RIA. Έγινε t-test για να εκτιμήσουμε τις διαφορές ανάμεσα στις ομάδες. Η επίδραση του ορού στη σηματοδότηση της σεροτονίνης εκτιμήθηκε με τη χρήση μιας ανθρώπινης οστεοβλαστικής σειράς, των Saos2, ενώ η εκτίμηση των επιπέδων του phospho-creb με western immunoblots. Τα επίπεδα σεροτονίνης ορού ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα στους ασθενείς με AΣ σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (mean ± SEM ng/ml: ± 11.6 vs ± 24.58, p=0.038) και τους ασθενείς με ΡΑ (mean ± SEM ng/ml: ± 37.5, p=0.0004). Οι ασθενείς με ΑΣ που λάμβαναν TNFα αναστολείς είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα σεροτονίνης σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΑΣ που δε λάμβαναν τέτοια θεραπεία (mean ± SEM ng/ml: 95.8 ± 14.9 vs ± 16.0, p=0.019). Τα επίπεδα σεροτονίνης ορού σχετίζονταν αντίστροφα με την επαγωγή της έκφρασης του pcreb στα κύτταρα Saos-2, που προσομοιάζουν με οστεοβλάστες. Τα επίπεδα σεροτονίνης ορού είναι χαμηλά σε ασθενείς με ΑΣ και μειώνονται περαιτέρω κατα τη διαρκεια της θεραπείας με anti- TNFα. Οι διαφορές στα επίπεδα σεροτονίνης φαίνεται να έχουν λειτουργική επίδραση στα ομοιάζοντα με οστεοβλάστες κύτταρα Saos-2. Συνεπώς, η σεροτονίνη μπορεί να εμπλέκεται στο σχηματισμό νέου οστού στην ΑΣ. 87

96 9. Αbstract 88

97 Evidence suggests that serotonin is an inhibitor of bone formation. We aimed to assess i) serum serotonin levels in patients with ankylosing spondylitis (AS), a prototype bone forming disease, compared to patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthy subjects ii) the effect(s) of TNFα blockers on serum serotonin levels in patients with AS and RA and iii) the effect(s) of serum of AS patients on serotonin signaling. Serum serotonin levels were measured in 47 patients with AS, 28 patients with RA and 40 healthy subjects by RIA; t-test was used to assess differences between groups. The effect of serum on serotonin signaling was assessed using the human osteoblastic cell line Saos2, evaluating levels of phospho-creb by western immunoblots. Serotonin serum levels were significantly lower in patients with AS compared to healthy subjects (mean ± SEM ng/ml: ± 11.6 vs ± 24.58, p=0.038) and patients with RA (mean ± SEM ng/ml: ± 37.5, p=0.0004). Patients with AS receiving TNFα blockers had significantly lower serotonin levels compared to patients with AS not on such treatment (mean ± SEM ng/ml: 95.8 ± 14.9 vs ± 16.0, p=0.019). Serotonin serum levels were inversely correlated with pcreb induction in osteoblast-like Saos-2 cells. Serotonin levels are low in patients with AS and decrease even further during anti-tnfα treatment. Differences in serotonin levels are shown to have a functional impact on osteoblast-like Saos-2 cells. Therefore, serotonin may be involved in new bone formation in AS. 89

98 10. Άρθρο 90

99