ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ - ΟΓΚΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚO ΓΕΝΙΚO ΝΟΣΟΚΟΜΕIO ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ Γ. ΒΑΓΕΝΑΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p27 kip1 ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΙΝAΣΗΣ p34 cdc2 ΣΕ ΕΝΤΟΠΙΣΜEΝΟ ΠΟΡΟΓΕΝEΣ ΔΙΗΘΗΤΙΚΟ ΚΑΡΚIΝΩΜΑ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟY ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΠΙΘΑΝΗΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗΣ ΜΕ ΚΛΑΣΣΙΚΟΥΣ ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΒΑΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΑΓΓΕΛΟΣ Κ. ΚΟΥΤΡΑΣ ΙΑΤΡΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2003

2 1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ - ΟΓΚΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚO ΓΕΝΙΚO ΝΟΣΟΚΟΜΕIO ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ Γ. ΒΑΓΕΝΑΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p27 kip1 ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΙΝAΣΗΣ p34 cdc2 ΣΕ ΕΝΤΟΠΙΣΜEΝΟ ΠΟΡΟΓΕΝEΣ ΔΙΗΘΗΤΙΚΟ ΚΑΡΚIΝΩΜΑ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟY ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΠΙΘΑΝΗΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗΣ ΜΕ ΚΛΑΣΣΙΚΟΥΣ ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΒΑΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΑΓΓΕΛΟΣ Κ. ΚΟΥΤΡΑΣ ΙΑΤΡΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2003

3 2 ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Απόστολος Γ. Βαγενάκης Καθηγητής Παθολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Επιβλέπων Καθηγητής Διονύσιος Σπ. Μπονίκος Καθηγητής Παθολογικής Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Χαράλαμπος Π. Καλόφωνος Επίκ. Καθηγητής Ογκολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Ιωάννης Βαράκης Καθηγητής Ανατομίας Ιστολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής

4 3 Γεωργία Σωτηροπούλου Μπονίκου Αναπλ. Καθηγήτρια Ανατομίας Ιστολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Δημήτριος Κούκουρας Επίκ. Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Μαρία Μελαχροινού Επίκ. Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής

5 4 Στους γονείς μου, τη σύζυγό μου και την κόρη μας

6 5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Ογκολογικό Τμήμα της Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά το χρονικό διάστημα και αποτελεί μέρος μίας μεγαλύτερης μελέτης που έχει σκοπό τη διερεύνηση παραγόντων που συμμετέχουν στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, σε ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνωμα του μαστού. Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί το συχνότερο τύπο καρκίνου στις γυναίκες, ενώ η διήθηση των μασχαλιαίων λεμφαδένων από τη νόσο και ιδιαίτερα ο αριθμός των διηθημένων λεμφαδένων αποτελούν το σημαντικότερο προγνωστικό παράγοντα που καθορίζει τον κίνδυνο για υποτροπή. Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στην κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών της νόσου, οι οδοί και τα μονοπάτια στη διαδικασία της ογκογένεσης στο μαστό εξακολουθούν να παραμένουν ασαφείς. Η αναζήτηση αξιόπιστων προγνωστικών παραγόντων σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και αρνητικούς μασχαλιαίους λεμφαδένες είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς στοχεύει στην εκλεκτική εφαρμογή της συμπληρωματικής θεραπείας στις υποομάδες εκείνες των ασθενών που χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής.

7 6 Τα τελευταία χρόνια έχει εκδηλωθεί έντονο ενδιαφέρον για τον κυτταρικό κύκλο που στηρίζεται στην υπόθεση ότι διαταραχή στο μηχανισμό ελέγχου της αναπαραγωγής των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε νεοπλασματική εξαλλαγή. Κυρίαρχο ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κατέχουν πρωτεϊνικά συμπλέγματα αποτελούμενα από κυκλίνες και κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin-dependent kinases, CDKs). Η δραστικότητα αυτών των συμπλόκων ελέγχεται από μία άλλη κατηγορία πρωτεϊνών, τους αναστολείς των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (CDKIs) στους οποίους συμπεριλαμβάνεται και η p27 kip1. Η πρωτεΐνη p53 παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ακεραιότητας του γονιδιώματος, ενώ η p34 cdc2 αποτελεί την καταλυτική υπομονάδα ενός συμπλέγματος με δραστικότητα πρωτεϊνικής κινάσης, το οποίο ελέγχει την επαγωγή της μίτωσης. Με στόχο να διερευνήσουμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ των πρωτεϊνών p27 kip1, p34 cdc2 και p53 καθώς και την προγνωστική τους σημασία στο εντοπισμένο πορογενές διηθητικό καρκίνωμα του μαστού, μελετήσαμε αναδρομικά την ταυτόχρονη έκφρασή τους σε μία σειρά 94 ασθενών με καρκίνο μαστού και αρνητικούς λεμφαδένες και

8 7 συσχετίσαμε τα ευρήματα με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και με την έκβαση της νόσου. Οφείλω να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Παθολογίας κ. Απόστολο Γ. Βαγενάκη για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και για τη δυνατότητα που μου έδωσε να πραγματοποιήσω την παρούσα διατριβή. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή Παθολογικής Ανατομικής κ. Διονύσιο Σπ. Μπονίκο για τη δυνατότητα που μου παρείχε να χρησιμοποιήσω το Παθολογοανατομικό Εργαστήριο, αλλά και αρχειακό υλικό του Εργαστηρίου για την εκτέλεση της ανοσοϊστοχημείας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή Ογκολογίας κ. Χαράλαμπο Π. Καλόφωνο για την αμέριστη βοήθειά του και τις πολύτιμες συμβουλές του καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μελέτης. Επίσης, η παρούσα διατριβή θα ήταν δύσκολο να σχεδιασθεί και να ολοκληρωθεί χωρίς τη συμβολή της κ. Ελένης Π. Κουρέα, ιατρού Παθολογοανατόμου, η οποία συμμετείχε ουσιαστικά τόσο στην κατανόηση του θεωρητικού τμήματος του θέματος, όσο και στην τεχνική της ανοσοϊστοχημείας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αν. Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής κ. Χρυσούλα Σκόπα και την Επίκ. Καθηγήτρια

9 8 Παθολογικής Ανατομικής κ. Βασιλική Ζολώτα για τη συμμετοχή τους παράλληλα με την κ. Κουρέα στην εκτίμηση των ανοσοϊστοχημικών αποτελεσμάτων, καθώς επίσης τον Καθηγητή Χειρουργικής κ. Ευάγγελο Τζωρακοελευθεράκη και τον Επίκ. Καθηγητή Χειρουργικής κ. Δημήτριο Κούκουρα για τη δυνατότητα που μου έδωσαν να χρησιμοποιήσω υλικό και κλινικές πληροφορίες από το αρχείο τους.

10 9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΕΛ 1. Καρκίνος του μαστού α. Παράγοντες κινδύνου 12 β. Διάγνωση 16 γ. Ιστολογική ταξινόμηση 19 δ. Σταδιοποίηση 21 ε. Αντιμετώπιση 24 στ. Προγνωστικοί παράγοντες Κυτταρικός κύκλος α. Γενικά στοιχεία 38 β. Μετάβαση από τη φάση G1 46 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου γ. Μετάβαση από τη φάση G2 63 στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου 3. Κυτταρικός κύκλος και καρκίνος του μαστού 72

11 10 ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΕΛ 1. Σχεδιασμός της μελέτης Υλικό-μέθοδοι α. Ασθενείς και δείγματα ιστών 76 β. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση 78 γ. Ανοσοϊστοχημική εκτίμηση 85 δ. Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα α. Κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά 89 β. Αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικής εκτίμησης 93 και στατιστικής ανάλυσης 4. Συζήτηση και συμπεράσματα 115 α. p β. p27 kip1 121 γ. p34 cdc2 125 ΙII. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 134 IV. SUMMARY 137 V. BIBΛIOΓΡAΦIA 139

12 11 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

13 12 1. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ α. Παράγοντες κινδύνου Ο καρκίνος του μαστού είναι το συχνότερο καρκίνωμα στις γυναίκες και αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στο γυναικείο πληθυσμό (1). Υπολογίζεται ότι στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής 1 στις 8 γυναίκες θα αναπτύξει καρκίνο του μαστού κατά τη διάρκεια της ζωής της (2). Η πιθανότητα εμφάνισης της νόσου αυξάνει με την ηλικία, με διάμεση ηλικία εμφάνισης τα 60 χρόνια. Σε ότι αφορά τους παράγοντες κινδύνου έχει παρατηρηθεί ότι η πιθανότητα είναι μεγαλύτερη σε γυναίκες με οικογενειακό ιστορικό της νόσου, αν και στην πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο του μαστού δεν αναφέρεται ανάλογο ιστορικό στην οικογένειά τους. Υπολογίζεται ότι ο κίνδυνος για τη νόσο είναι 1.5 έως 3 φορές μεγαλύτερος σε γυναίκες των οποίων η μητέρα ή η αδελφή εμφάνισαν καρκίνο του μαστού (3), ιδιαίτερα σε περιπτώσεις στις οποίες το ιστορικό αφορά δύο ή περισσότερες συγγενείς πρώτου βαθμού, σε εμφάνιση της νόσου προεμμηνοπαυσιακά, καθώς και σε περιπτώσεις αμφοτερόπλευρης ανάπτυξης καρκίνου (4).

14 13 Κληρονομικές μορφές σε οικογένειες με πρώιμη εμφάνιση της νόσου έχουν συνδυασθεί με γονιδιακές μεταλλάξεις όπως αυτές που αφορούν τα ογκοκατασταλτικά γονίδια BRCA 1 και BRCA 2 (5,6). Μεταλλάξεις σε αυτά τα γονίδια συνοδεύονται από πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου του μαστού σε ποσοστό 50-85% (7,8). Ατομικό ιστορικό καρκίνου του μαστού συνοδεύεται από πιθανότητα ανάπτυξης μετάχρονου καρκίνου στον άλλο μαστό σε ποσοστό 5-8%. Ο κίνδυνος αυτός είναι μεγαλύτερος σε οικογενείς μορφές της νόσου, σε γυναίκες με μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2, καθώς επίσης και σε περιπτώσεις λοβιακού καρκίνου (9). Επιδημιολογικές μελέτες έχουν αναδείξει ένα αριθμό παραγόντων κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου μαστού και κάθε ένας από αυτούς σχετίζεται με αυξημένη έκθεση των ασθενών σε ενδογενή ή εξωγενή οιστρογόνα. Τα οιστρογόνα προάγουν την καρκινογένεση στο μαστό μέσω διέγερσης αυξητικών παραγόντων όπως ο TGF-alpha (transforming growth factor). Ο κίνδυνος για ανάπτυξη καρκίνου του μαστού φαίνεται ότι είναι 3 έως 4 φορές μεγαλύτερος σε γυναίκες των οποίων η πρώτη εγκυμοσύνη ήταν μετά την ηλικία των 30 ετών, αλλά και σε αυτές που δεν έχουν τεκνοποιήσει. Επίσης, ο κίνδυνος είναι μεγαλύτερος σε γυναίκες με εμμηναρχή πριν τα 12 χρόνια ζωής και εμμηνόπαυση μετά τα

15 14 50 (10). Αντίθετα, ο μητρικός θηλασμός έχει συνδυασθεί με ελάττωση του κινδύνου (11). Σε μία σειρά από κλινικές μελέτες διαπιστώθηκε ότι η χορήγηση ορμονών για θεραπεία υποκατάστασης συνοδεύεται από σημαντική αύξηση της συχνότητας εμφάνισης της νόσου (12,13) και μάλιστα φάνηκε ότι η πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου εξαρτάται από το χρονικό διάστημα λήψης των ορμονικών σκευασμάτων. Aντίθετα, η χρήση αντισυλληπτικών δεν έχει αποδειχθεί ότι συνδυάζεται με σημαντική αύξηση του κινδύνου για καρκίνο του μαστού (14). Τέλος, έχει διαπιστωθεί με επιδημιολογικές μελέτες ότι η καταστολή της λειτουργίας των ωοθηκών συνοδεύεται από ελάττωση της συχνότητας του καρκίνου του μαστού σε ποσοστό έως και 75% (15). Η ποικιλία που παρουσιάζει η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του μαστού σε διάφορα μέρη του κόσμου αποτελεί πιθανότατα ένδειξη ότι υπάρχουν δυνητικά τροποποιήσιμοι περιβαλλοντικοί παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν την πιθανότητα εμφάνισης της νόσου. Η συχνότητα του καρκίνου του μαστού είναι μεγαλύτερη σε αναπτυγμένες παρά σε αναπτυσσόμενες χώρες. Η αύξηση του σωματικού βάρους μετά την ηλικία των 18 ετών έχει συσχετισθεί με μεγαλύτερο κίνδυνο για ανάπτυξη της νόσου μετεμμηνοπαυσιακά, πιθανά λόγω αυξημένης

16 15 σύνθεσης οιστρογόνων στο λιπώδη ιστό (16). Αντίθετα, στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες υπάρχει αρνητική συσχέτιση του καρκίνου του μαστού με το δείκτη σωματικής μάζας. Η επίδραση των διαιτητικών παραγόντων και συγκεκριμένα της αυξημένης κατανάλωσης λίπους δεν έχει τεκμηριωθεί από τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα (17). Αρκετές μελέτες εισηγούνται την ύπαρξη θετικής συσχέτισης μεταξύ κατανάλωσης αλκοόλ και ανάπτυξης καρκίνου του μαστού (18). Έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία αυξάνει επίσης τον κίνδυνο, ιδιαίτερα σε γυναίκες που εκτέθηκαν σε ακτινοβολία σε νεαρή ηλικία (19). Η ύπαρξη ινοκυστικής μαστοπάθειας δεν συνοδεύεται από μεγαλύτερη πιθανότητα εμφάνισης της νόσου, παρά μόνο στις περιπτώσεις εκείνες στις οποίες συνυπάρχουν υπερπλαστικές αλλαγές ή άτυπη επιθηλιακή υπερπλασία. Ο κίνδυνος της ατυπίας για ανάπτυξη καρκίνου μαστού είναι σημαντικά μεγαλύτερος σε γυναίκες στις οποίες συνυπάρχει οικογενειακό ιστορικό (20).

17 16 β. Διάγνωση Η πρώιμη διάγνωση και η έγκαιρη αντιμετώπιση έχουν καθοριστικό ρόλο στην πρόγνωση των ασθενών. Η τακτική εξέταση (αυτοεξέταση και φυσική εξέταση από το γιατρό), καθώς επίσης και η μαστογραφία αποτελούν αξιόπιστες μεθόδους για την ανεύρεση του καρκίνου του μαστού. Aυτοεξέταση συνιστάται σε μηνιαία βάση για όλες τις γυναίκες ηλικίας άνω των 20 ετών ενώ εξέταση από το γιατρό συνιστάται ανά 3 έτη για γυναίκες μεταξύ 20 και 40 ετών και ετησίως για ηλικίες μεγαλύτερες από 40 χρόνια. Κλινικές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι ο προληπτικός έλεγχος με μαστογραφία μπορεί να ελαττώσει τη θνητότητα από καρκίνο του μαστού. Σε ότι αφορά τις συστάσεις για μαστογραφικό έλεγχο προτείνεται η διενέργεια μαστογραφίας αναφοράς σε γυναίκες ηλικίας 35 έως 39 ετών, κάθε 1 έως 2 χρόνια μεταξύ 40 και 49 ετών και ετησίως μετά την ηλικία των 50 ετών. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων (70%) η ασθενής προσέρχεται αναφέροντας ανώδυνο ογκίδιο στο μαστό διαπιστωμένο συνήθως από την ίδια, ενώ στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών η νόσος διαγιγνώσκεται σε πρώιμα στάδια. Στη φυσική εξέταση, ο καρκίνος του μαστού γίνεται συνήθως αντιληπτός ως μονήρες, συμπαγές, σκληρό στη σύσταση μόρφωμα με ασαφή όρια, χωρίς ευαισθησία στην ψηλάφηση.

18 17 Ήπια εισολκή του δέρματος ή της θηλής αποτελεί ιδιαίτερα σημαντικό εύρημα στην εξέταση. Έκκριμα από τη θηλή μπορεί να συνοδεύει τη νόσο, αν και στο 90% των περιπτώσεων αποτελεί εκδήλωση καλοήθους πάθησης. Βλάβες διαμέτρου μικρότερης του 1 cm μπορεί να είναι δύσκολο ή ακόμα και αδύνατο να ψηλαφηθούν. Ο χρόνος διπλασιασμού κυμαίνεται από 25 έως 200 ημέρες για πρώιμες βλάβες ενώ σε προχωρημένη νόσο μπορεί να υπερβαίνει τις 500 ημέρες. Έτσι, ένας όγκος διαμέτρου 1 cm μπορεί να προϋπάρχει για 2 έως 17 χρόνια πριν από τη διάγνωση. Χρήσιμες δοκιμασίες στη διαγνωστική προσπέλαση της νόσου είναι το υπερηχογράφημα, η μαστογραφία και η βιοψία (με λεπτή βελόνη FNA ή ανοικτή βιοψία) η οποία θα πρέπει να εκτελείται σε όλες τις ύποπτες βλάβες που ανακαλύπτονται από τη φυσική εξέταση ή τη μαστογραφία. Η μαστογραφία ανιχνεύει ποσοστό περίπου 85% του συνόλου των καρκίνων του μαστού. Σε ότι αφορά την FNA, η ευαισθησία της μεθόδου είναι 87% ενώ το ποσοστό των ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων κυμαίνεται από 4 έως 9.6 % (21). Η αδυναμία της FNA να διακρίνει αξιόπιστα το διηθητικό καρκίνωμα από το καρκίνωμα in situ αποτελεί μειονέκτημα της μεθόδου. Η ανοικτή βιοψία πλεονεκτεί της FNA στο ότι παρέχει επιπλέον ιστολογικές πληροφορίες,

19 18 ενώ ταυτόχρονα δίνει τη δυνατότητα του ανοσοϊστοχημικού προσδιορισμού προγνωστικών και προβλεπτικών για τη νόσο παραγόντων, όπως είναι οι οιστρογονικοί και οι προγεστερονικοί υποδοχείς, το c-erbb-2 κ.ά.

20 19 γ. Ιστολογική ταξινόμηση Ιστολογικώς τα καρκινώματα του μαστού διακρίνονται σε πορογενή και λοβιακά, ενώ ο καρκίνος μπορεί να είναι διηθητικός ή in situ. Οι μη διηθητικές βλάβες περιορίζονται από τη βασική μεμβράνη των πόρων. Το πορογενές διηθητικό καρκίνωμα του μαστού αποτελεί το συχνότερο ιστολογικό τύπο και αντιπροσωπεύει ποσοστό 70-80% του συνόλου. Το πορογενές αδενοκαρκίνωμα συνήθως είναι ετερόπλευρο, ενώ το λοβιακό χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερο κίνδυνο για αμφοτερόπλευρη ανάπτυξη. Το λοβιακό καρκίνωμα είναι in situ περίπου στο 50% των περιπτώσεων. Ιστολογικοί τύποι που συνοδεύονται από καλύτερη πρόγνωση θεωρούνται ότι είναι το βλεννώδες, το θηλώδες, το μυελοειδές και το σωληνώδες καρκίνωμα (22). Σπάνια ο μαστός μπορεί να εμφανίσει άλλα κακοήθη νεοπλάσματα όπως τα λεμφώματα, τα σαρκώματα και το μελάνωμα. Δύο ιδιαίτερες κλινικές μορφές καρκίνου του μαστού είναι η νόσος Paget και το φλεγμονώδες καρκίνωμα. Η νόσος Paget εξορμάται από τους πόρους της θηλής και συχνά εκδηλώνεται με κνησμό ή αίσθημα καύσου στην περιοχή, συμπτώματα που μπορούν να οδηγήσουν στην εσφαλμένη διάγνωση δερματίτιδας. Η πρόγνωση της νόσου είναι καλή εάν η διάγνωση τεθεί πριν γίνει αντιληπτή ψηλαφητή μάζα στο μαστό.

21 20 Το φλεγμονώδες καρκίνωμα είναι αποτέλεσμα διήθησης υποδερματικών λεμφαγγείων και χαρακτηρίζεται από δυσμενή πρόγνωση ανεξάρτητα από το στάδιο της νόσου.

22 21 δ. Σταδιοποίηση Tο σύστημα σταδιοποίησης που έχει επικρατήσει για τον καρκίνο του μαστού είναι το ΤΝΜ (23). Τα ποσοστά 5ετούς επιβίωσης των ασθενών ανάλογα με το στάδιο της νόσου φαίνονται στον πίνακα 1. Πρωτοπαθής όγκος (Τ) Τx: Πρωτοπαθής όγκος μη εκτιμήσιμος Τis: Καρκίνωμα in situ ή νόσος Paget της θηλής χωρίς όγκο Τ0: Μη αναδείξιμος όγκος στο μαστό T1: Mέγεθος όγκου 2 cm Τ1mic: Μικροδιήθηση 0.1 cm Τ1a: > 0.1 cm και 0.5 cm Τ1b: > 0.5 cm και 1.0 cm Τ1c: > 1.0 cm και 2.0 cm T2: Mέγεθος όγκου > 2 cm και 5 cm Τ3: Mέγεθος όγκου > 5 cm T4: Όγκος οποιουδήποτε μεγέθους με Τ4a: Επέκταση στο θωρακικό τοίχωμα Τ4b: Εξέλκωση δέρματος, οίδημα ή δορυφορικά οζίδια Τ4c: Τ4a και Τ4b Τ4d: Φλεγμονώδες καρκίνωμα

23 22 Λεμφαδένες (Ν) Νx: Λεμφαδένες μη εκτιμήσιμοι Ν0: Oμόπλευροι μασχαλιαίοι λεμφαδένες χωρίς μεταστάσεις Ν1a: Oμόπλευροι μασχαλιαίοι λεμφαδένες με μικρομεταστάσεις ( 0.2 cm) Ν1b: Oμόπλευροι μασχαλιαίοι λεμφαδένες με μεταστάσεις > 0.2 cm Ν1bi: 1 έως 3 λεμφαδένες διηθημένοι (> 0.2 cm και < 2 cm) Ν1bii: 4 ή περισσότεροι λεμφαδένες διηθημένοι (> 0.2 cm και < 2 cm) Ν1biii: Επέκταση του όγκου πέρα από την κάψα λεμφαδένα < 2 cm Ν1biv: Οποιοσδήποτε λεμφαδένας 2 cm Ν2: Oμόπλευροι μασχαλιαίοι λεμφαδένες με μεταστάσεις, συμφυόμενοι μεταξύ τους ή σε άλλες δομές Ν3: Oμόπλευροι έσω μαστικοί λεμφαδένες με μεταστάσεις Απομακρυσμένες μεταστάσεις (Μ) Μ0: Απούσες Μ1: Παρούσες

24 23 Πίνακας 1. Ταξινόμηση κατά ΤΝΜ και 5ετής επιβίωση των ασθενών. Στάδιο Ταξινόμηση κατά 5ετής επιβίωση (%) ΤΝΜ 0 ΤisN0M0 92 I T1N0M0 87 IIA T0N1M0 T1N1M0, T2N0M0 78 IIB T2N1M0, T3N0M0 68 IIIA IIIB IV T0N2M0 T1N2M0, T2N2M0 T3N1M0, T3N2M0 T4 Oποιοδήποτε Ν Μ0 Oποιοδήποτε Τ Ν3 Μ0 Oποιοδήποτε T Oποιοδήποτε Ν M

25 24 ε. Αντιμετώπιση Ο καρκίνος του μαστού παρουσιάζει διαφορετικούς ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ανάπτυξης ακόμα και σε ασθενείς με το ίδιο στάδιο νόσου. Η θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού περιλαμβάνει συνδυασμούς θεραπευτικών μεθόδων όπως χειρουργικής, χημειοθεραπείας, ακτινοθεραπείας και ορμονικών χειρισμών. Η αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού στα πρώιμα στάδια έχει ως θεραπευτικό στόχο τη ριζική αντιμετώπιση της νόσου, ενώ σε προχωρημένα στάδια την ανακούφιση από τα συμπτώματα και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής. Αρκετοί ερευνητές θεωρούν ότι ο καρκίνος του μαστού αποτελεί συστηματική νόσο από τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης στην πλειοψηφία των ασθενών.

26 25 Aσθενείς με μεταστατική νόσο Η αντιμετώπιση ασθενών με μεταστατική νόσο περιλαμβάνει τη χημειοθεραπεία ή την ορμονοθεραπεία ή συνδυασμό και των δύο μεθόδων. Η χειρουργική αντιμετώπιση ενδείκνυται σε επιλεγμένες μόνο περιπτώσεις. Η ακτινοθεραπεία έχει σημαντικό ρόλο στην ανακούφιση εντοπισμένων συμπτωματικών μεταστάσεων της νόσου. Η διάμεση επιβίωση ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού κυμαίνεται μεταξύ 18 και 24 μηνών (24), αν και υπάρχει ένα μικρό ποσοστό ασθενών που παραμένουν χωρίς υποτροπή της νόσου μετά τη χημειοθεραπεία (25). Ασθενείς με προχωρημένη νόσο και θετικούς οιστρογονικούς και προγεστερονικούς υποδοχείς χωρίς σπλαχνικές μεταστάσεις έχουν αυξημένη πιθανότητα ανταπόκρισης με ορμονοθεραπεία (26). Η ορμονοθεραπεία περιλαμβάνει τα αντιοιστρογόνα (ταμοξιφαίνη, τορεμιφαίνη κ.ά.), τους αναστολείς αρωματάσης (αναστραζόλη, λετροζόλη, εξαμεστάνη), την οξική μεγεστρόλη και τη φαρμακευτική ωοθηκεκτομή με LH-RH αγωνιστές. Χημειοθεραπεία χορηγείται σε ασθενείς με αρνητικούς ορμονικούς υποδοχείς ή με θετικούς υποδοχείς που δεν ανταποκρίθηκαν στην ορμονοθεραπεία, καθώς επίσης και σε ασθενείς με εκτεταμένες

27 26 σπλαχνικές μεταστάσεις της νόσου. Η ύπαρξη σπλαχνικής νόσου, ιδιαίτερα όταν είναι περιορισμένης έκτασης και ασυμπτωματική δεν αποτελεί αντένδειξη για χορήγηση αρχικά ορμονοθεραπείας. Η χημειοθεραπεία για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό κυτταροστατικών με αποδεδειγμένη δραστικότητα στο μεταστατικό καρκίνο του μαστού όπως οι ανθρακυκλίνες, οι ταξάνες, τα αλκαλοειδή της βίνκα, τα παράγωγα της πλατίνης, η κυκλοφωσφαμίδη, η μεθοτρεξάτη, η 5-φθοριοουρακίλη, η καπεσιταμπίνη, η γεμσιταμπίνη, η μιτομυκίνη κ.ά., με τις ανθρακυκλίνες και τις ταξάνες να θεωρούνται τα περισσότερο δραστικά. Τα ποσοστά ανταπόκρισης της νόσου με χημειοθεραπεία κυμαίνονται μεταξύ 25-55% ενώ η διάμεση διάρκεια της ανταπόκρισης είναι μεταξύ 6-12 μηνών. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν επαρκή βιβλιογραφικά δεδομένα που να υποστηρίζουν την υπεροχή κάποιου συγκεκριμένου συνδυασμού φαρμάκων, αν και οι τριπλοί συνδυασμοί που περιλαμβάνουν ανθρακυκλίνη θεωρούνται οι περισσότερο δραστικοί. Σημαντική εξέλιξη στην αντιμετώπιση ασθενών με προχωρημένη νόσο αποτελεί η ανάπτυξη του μονοκλωνικού αντισώματος trastuzumab (Herceptin) που αντιδρά ανοσολογικά με τον υποδοχέα του ογκογονιδίου HER-2. Ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού και υπερέκφραση

28 27 του HER-2 είναι υποψήφιοι για θεραπεία με Herceptin σε συνδυασμό με πακλιταξέλη ή για ένταξη σε κλινικές μελέτες όπου χορηγείται Herceptin σε συνδυασμό με άλλους αντινεοπλασματικούς παράγοντες.

29 28 Aσθενείς με πρώιμη νόσο Η χειρουργική αντιμετώπιση έχει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία ασθενών με καρκίνο μαστού σε πρώιμα στάδια. Τα τελευταία χρόνια διαπιστώθηκε ότι η τροποποιημένη ριζική μαστεκτομή έχει παρόμοια θεραπευτικά αποτελέσματα με την περιορισμένη χειρουργική αντιμετώπιση που περιλαμβάνει αφαίρεση του όγκου και στη συνέχεια ακτινοθεραπεία και επιτρέπει τη διατήρηση του μαστού (27,28). Έτσι, η συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού με λεμφαδενικό καθαρισμό της μασχάλης ακολουθούμενη από ακτινοθεραπεία (45 Gy έως 50 Gy), αποτελεί πλέον τη θεραπεία εκλογής ασθενών με καρκίνο μαστού σε πρώιμο στάδιο οι οποίες πληρούν τα κριτήρια για συντηρητική επέμβαση (29). Σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένη νόσο εφαρμόζεται επίσης χειρουργική αντιμετώπιση μετά από προεγχειρητική χημειοθεραπεία με στόχο να καταστεί ο όγκος εξαιρέσιμος και να αντιμετωπισθούν απομακρυσμένες μικροσκοπικές μεταστάσεις της νόσου και ακολουθεί ακτινοθεραπεία. Η ακτινοθεραπεία μετά από μαστεκτομή σε ομάδες ασθενών υψηλού κινδύνου ελαττώνει τη συχνότητα τοπικής υποτροπής της νόσου αντιμετωπίζοντας την πιθανή υπολειμματική μικροσκοπική νόσο που

30 29 παραμένει πέρα από τα όρια της χειρουργικής εκτομής (30). Στις ομάδες ασθενών υψηλού κινδύνου για τοπική υποτροπή της νόσου με ένδειξη για μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία, περιλαμβάνονται ασθενείς με 4 ή περισσότερους διηθημένους μασχαλιαίους λεμφαδένες, μεγάλο μέγεθος πρωτοπαθούς όγκου (άνω των 4 cm) και χειρουργικά όρια πλησίον του όγκου (31). Παρά το δεδομένο όφελος της συμπληρωματικής ακτινοθεραπείας στον τοπικό έλεγχο της νόσου, η βελτίωση της επιβίωσης δεν είναι τεκμηριωμένη, αν και τα αποτελέσματα μίας σειράς πρόσφατων μελετών συνηγορούν για όφελος στην επιβίωση με την εφαρμογή μετεγχειρητικής ακτινοθεραπείας (31), ιδιαίτερα σε ασθενείς με θετικούς λεμφαδένες και μικρό νεοπλασματικό φορτίο (32). Συμπληρωματική θεραπεία μετά τη χειρουργική αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού χορηγείται στην πλειοψηφία των ασθενών. Ο στόχος της συμπληρωματικής θεραπείας είναι να εξαλείψει πιθανές μικροσκοπικές εστίες της νόσου. Η χορήγηση μετεγχειρητικά ταμοξιφαίνης για 5 χρόνια σε ασθενείς με θετικούς ορμονικούς υποδοχείς συνοδεύεται από ελάττωση της συχνότητας υποτροπής της νόσου κατά 50% έως 60% και της πιθανότητας ανάπτυξης καρκίνου στον υγιή μαστό κατά 50%, ενώ βελτιώνει σημαντικά την επιβίωση των ασθενών ανεξάρτητα από την ηλικία, την ύπαρξη ή μη εμμήνου ρύσεως και τη

31 30 χορήγηση χημειοθεραπείας (33). Τα οφέλη της συμπληρωματικής ορμονοθεραπείας είναι μεγαλύτερα σε ασθενείς με διηθημένους λεμφαδένες και έντονα θετικούς οιστρογονικούς υποδοχείς, ενώ στις ασθενείς με αρνητικούς υποδοχείς το όφελος είναι ελάχιστο. H χορήγηση ταμοξιφαίνης για 5 χρόνια υπερέχει σημαντικά της χορήγησης για 1 έως 2 χρόνια (33), ενώ η συνέχιση της αγωγής για περισσότερο από 5 χρόνια δε φαίνεται να προσφέρει μεγαλύτερο όφελος (34). Η χορήγηση συμπληρωματικής χημειοθεραπείας ελαττώνει τη συχνότητα υποτροπής της νόσου κατά 35% σε γυναίκες ηλικίας μικρότερης των 50 ετών και κατά 20% σε γυναίκες ηλικίας 50 έως 69 ετών παράλληλα δε, βελτιώνει σημαντικά την επιβίωση των ασθενών. Η ελάττωση του κινδύνου υποτροπής μετά από χορήγηση χημειοθεραπείας είναι παρόμοια σε ασθενείς με θετικούς και αρνητικούς λεμφαδένες, ενώ η ελάττωση της πιθανότητας ανάπτυξης ετερόπλευρου καρκίνου του μαστού υπολογίζεται σε ποσοστό περίπου 20%. Τα οφέλη της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας είναι ανεξάρτητα από την ύπαρξη ή μη εμμήνου ρύσεως, την κατάσταση των οιστρογονικών υποδοχέων και τη χορήγηση ταμοξιφαίνης (35). Ο συνδυασμός της χημειοθεραπείας με ταμοξιφαίνη έχει αποδειχθεί αποτελεσματικότερος της ταμοξιφαίνης

32 31 μόνο και μάλιστα το όφελος του συνδυασμού έναντι της ταμοξιφαίνης αυξάνει αναλογικά με τον κίνδυνο υποτροπής. Οι σημαντικότεροι παράγοντες που καθορίζουν τον κίνδυνο για υποτροπή παραμένουν η διήθηση από τη νόσο των μασχαλιαίων λεμφαδένων και ο αριθμός των διηθημένων λεμφαδένων (36). Σε ασθενείς χωρίς διήθηση των λεμφαδένων, σημαντικοί προγνωστικοί παράγοντες είναι το μέγεθος του όγκου, ο βαθμός διαφοροποίησης (grade) και η ηλικία (Πίνακας 2). Οι συστάσεις της διεθνούς συνάντησης για συναίνεση με θέμα τη συμπληρωματική θεραπεία στον καρκίνο του μαστού που πραγματοποιήθηκε το Φεβρουάριο του 2001, συνοψίζονται στον πίνακα 3 (37). Στις ομάδες ασθενών που δε θεωρείται αναγκαία η χορήγηση συμπληρωματικής θεραπείας περιλαμβάνονται γυναίκες με μη διηθητικό καρκίνωμα (in situ), καθώς επίσης ασθενείς με όγκους μικρού μεγέθους (<1cm) και αρνητικούς λεμφαδένες, ανεξάρτητα από την κατάσταση των ορμονικών υποδοχέων.

33 32 Πίνακας 2. Προγνωστικές ομάδες ασθενών με καρκίνο μαστού και αρνητικούς μασχαλιαίους λεμφαδένες. Προγνωστικές ομάδες Ελάχιστου / χαμηλού κινδύνου Μετρίου / υψηλού κινδύνου ER- και/ή PR-θετικοί και όλα από τα ακόλουθα: Τ 2 cm Grade 1 Ηλικία 35 χρόνια ER- και/ή PR-θετικοί και τουλάχιστον ένα από τα ακόλουθα: Τ > 2 cm ή Grade 2-3 ή Ηλικία < 35 χρόνια ER- και PR-αρνητικοί

34 33 Πίνακας 3. Συμπληρωματική θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο μαστού. ER- και/ή PR-θετικοί ER- και PR-αρνητικοί Προεμ/κές Μετεμ/κές Προεμ/κές Μετεμ/κές Αρνητικοί λεμφαδένες Ελάχιστου/ χαμηλού κινδύνου Αρνητικοί λεμφαδένες Μετρίου/ υψηλού κινδύνου Θετικοί λεμφαδένες Ταμοξιφαίνη (ΤΑΜ) ή μόνο παρακολούθηση Φαρμ/κή ωοθηκεκ/μή + ΤΑΜ (±Χημ/πεία) ή Χημ/πεία + ΤΑΜ (± Φαρμ/κή ωοθηκεκ/μή) ή ΤΑΜ ή Φαρμ/κή ωοθηκεκ/μή Χημ/πεία + ΤΑΜ (± Φαρμ/κή ωοθηκεκ/μή) ΤΑΜ ή μόνο παρακολούθηση ΤΑΜ ή Χημ/πεία + ΤΑΜ Χημ/πεία + ΤΑΜ ή ΤΑΜ Χημειοθεραπεία Χημειοθεραπεία Χημειοθεραπεία Χημειοθεραπεία

35 34 στ. Προγνωστικοί παράγοντες Η διήθηση των μασχαλιαίων λεμφαδένων από τη νόσο αποτελεί επί του παρόντος τον ισχυρότερο προγνωστικό παράγοντα στον καρκίνο του μαστού (36). Οι ασθενείς ταξινομούνται ανάλογα με την ανεύρεση αρνητικών λεμφαδένων, 1 έως 3 διηθημένων λεμφαδένων, 4 έως 9 και άνω των 10. Με την αύξηση του αριθμού των προσβεβλημένων λεμφαδένων, αυξάνεται παράλληλα και η συχνότητα υποτροπής της νόσου (38). Στις περιπτώσεις όπου η νόσος εντοπίζεται στο μαστό χωρίς εξάπλωση στους επιχώριους λεμφαδένες το ποσοστό ίασης μετά από κατάλληλη θεραπευτική αντιμετώπιση ανέρχεται σε 75-90%. Τα ποσοστά 5ετούς και 10ετούς επιβίωσης των ασθενών ανάλογα με την προσβολή των μασχαλιαίων λεμφαδένων είναι τα εξής: Μασχαλιαίοι λεμφαδένες 5ετής επιβίωση 10ετής επιβίωση (%) (%) Αρνητικοί λεμφαδένες λεμφαδένες > 3 λεμφαδένες 30 15

36 35 Η ύπαρξη οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων αποτελεί έναν ακόμα προγνωστικό παράγοντα καθώς ασθενείς με θετικούς υποδοχείς έχουν ευνοϊκότερη πρόγνωση (39). Ο προσδιορισμός των ορμονικών υποδοχέων έχει κυρίως κλινική εφαρμογή για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στην ορμονική θεραπεία των ασθενών με μεταστατική νόσο καθώς επίσης των ασθενών μετά τη χειρουργική αφαίρεση του πρωτοπαθούς όγκου. Το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου αποτελεί παράγοντα με ανεξάρτητη προγνωστική σημασία, ιδιαίτερα σε ασθενείς με αρνητικούς λεμφαδένες (40). Η 10ετής επιβίωση για ασθενείς με όγκους μεγέθους μικρότερου από 1 cm ανέρχεται σε 80% ενώ μειώνεται σε 55% και 45% για όγκους 3-4 cm και cm αντίστοιχα. Άλλοι παράγοντες με προγνωστική αξία στον καρκίνο του μαστού είναι ο βαθμός διαφοροποίησης (grade), η αγγειακή και λεμφαγγειακή διήθηση. Η μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού αποτελεί έναν ακόμα χώρο αναζήτησης προγνωστικών παραγόντων (μιτωτικός δείκτης, Ki-67, MIB-1, Proliferating Cell Nuclear Antigen, κλάσμα S φάσης). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει επίσης τα τελευταία χρόνια η διερεύνηση του προγνωστικού ρόλου αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, όπως είναι ο HER-2/neu (41).

37 36 Σε ότι αφορά κλινικούς παράγοντες, η νεαρή ηλικία (< 35 χρόνια) έχει αναφερθεί ως δυσμενής προγνωστικός παράγοντας αν και δεν υπάρχει ομοφωνία μεταξύ των ερευνητών (42). Παρ όλη την πρόοδο που έχει σημειωθεί στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία της νόσου, παραμένουν ακόμα άγνωστοι οι παράγοντες που καθορίζουν την αρνητική έκβασή της στις ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του μαστού. Ως εκ τούτου, η πρόγνωση της κλινικής συμπεριφοράς της νόσου αποτελεί έναν ιδιαίτερα σημαντικό παράγοντα στην αντιμετώπιση των ασθενών. Σε ασθενείς με αρνητικούς μασχαλιαίους λεμφαδένες, η συνολική δεκαετής επιβίωση μετά από χειρουργική αντιμετώπιση ανέρχεται σε ποσοστό περίπου 60% (43). Η έρευνα για αξιόπιστους προγνωστικούς παράγοντες σε αυτή την κατηγορία ασθενών είναι ιδιαίτερα σημαντική καθώς στοχεύει στην αναζήτηση εκείνων των ασθενών που χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής. Η ανεύρεση τέτοιων ισχυρών προγνωστικών δεικτών θα επιτρέψει την εκλεκτική εφαρμογή της συμπληρωματικής θεραπείας, συμβάλλοντας έτσι στη βελτίωση της θεραπευτικής αγωγής και του ποσοστού των ασθενών με μακροχρόνια επιβίωση. Η απόφαση για χορήγηση συμπληρωματικής θεραπείας θα πρέπει να εξατομικεύεται και να λαμβάνεται μετά από σχολαστική ενημέρωση των ασθενών σχετικά

38 37 με τον κίνδυνο υποτροπής, την αναμενόμενη ελάττωση του κινδύνου αυτού με τη θεραπεία, αλλά και την τοξικότητα της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας.

39 38 2. ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ α. Γενικά στοιχεία Η ικανότητα ενός κυττάρου να πολλαπλασιάζεται και να δημιουργεί ακριβή αντίγραφά του αποτελεί μία ιδιαίτερα πολύπλοκη διαδικασία η οποία απαιτεί υψηλή πιστότητα για κάθε οργανισμό. Ο μοριακός μηχανισμός ελέγχου που χρησιμοποιούν τα κύτταρα για αναδιπλασιασμό χαρακτηρίζεται από οργάνωση και σημαντικού βαθμού διατήρηση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Την τελευταία δεκαετία έχει εκδηλωθεί έντονο ενδιαφέρον για τον κυτταρικό κύκλο που στηρίζεται στην υπόθεση ότι διαταραχή στη ρύθμιση της κυτταρικής αναπαραγωγής οδηγεί σε κατάσταση γενετικής αστάθειας η οποία προδιαθέτει σε νεοπλασματική εξαλλαγή (44). Μελέτες σε καλλιέργειες ιστών και πειραματόζωα προσδιόρισαν το ρόλο ρυθμιστικών πρωτεϊνών, των κυκλινών και των αναστολέων των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKIs) καθώς και ενζύμων, των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (cyclindependent kinases, CDKs) και φωσφατασών στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Ο κυτταρικός κύκλος προχωρά με τη δράση πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων αποτελούμενων από κυκλίνες και CDKs (κινάσες σερίνης

40 39 / θρεονίνης) τα οποία ελέγχουν τη φωσφορυλίωση παραγόντων του κύκλου, όπως είναι η πρωτεΐνη prb. Οι κυκλίνες είναι πρωτεΐνες που συντίθενται σε καθορισμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου και αποδομούνται γρήγορα (Σχήμα 1). Εκτός από τον έλεγχο της σύνθεσης των κυκλινών, λειτουργεί επίσης μηχανισμός ρύθμισης της αποδόμησής τους. Οι κυκλίνες αποτελούν τη ρυθμιστική υπομονάδα του συμπλέγματος ενώ οι CDKs, η συγκέντρωση των οποίων παραμένει σταθερή κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, αποτελούν τις καταλυτικές υπομονάδες. Η δραστικότητα των συμπλεγμάτων ελέγχεται από τα αυστηρώς ρυθμιζόμενα επίπεδα των κυκλινών. Η ενεργοποίηση του συμπλόκου απαιτεί τη φωσφορυλίωση της CDK σε θέση θρεονίνης από το σύμπλεγμα κυκλίνη Η - Cdk7 (CDK-activating kinase/cak) (45). Επιπρόσθετα, άλλα αμινοξέα (τυροσίνη, θρεονίνη) πρέπει να αποφωσφορυλιωθούν και αυτό πραγματοποιείται είτε με αναστολή κινασών (Wee1/Myt1), είτε με ενεργοποίηση φωσφατασών (Cdc25 A, B, C). Τέλος, η δραστικότητα των συμπλεγμάτων ελέγχεται και από μία άλλη κατηγορία πρωτεϊνών, τους αναστολείς των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (CDKIs).

41 40 Σχήμα 1. Συσχέτιση της έκφρασης των κυκλινών με τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου.

42 41 Όλα τα παραπάνω σημεία ελέγχου της ενεργότητας των συμπλόκων κυκλινών-cdks αποτελούν δυνητικά θεραπευτικούς στόχους (Σχήμα 2) και περιλαμβάνουν: (a) άμεση αναστολή της δραστικότητας της CDK, (b) αναστολή της αλληλεπίδρασης κυκλίνης- CDK, (c) ενίσχυση της λειτουργίας των CDKIs με αύξηση των επιπέδων τους ή (d) αναστολή της αποδόμησής τους, (e) αναστολή της σύνθεσης κυκλινών ή (f) επαγωγή της αποδόμησής τους, (g) αναστολή των CAKs ή (h) των Cdc25 φωσφατασών και τέλος (i) ενεργοποίηση των ανασταλτικών κινασών. Ο αναδιπλασιασμός του γονιδιώματος και η διαίρεση του κυττάρου σε δύο πανομοιότυπα θυγατρικά κύτταρα (Σχήμα 3) περιλαμβάνει 4 ξεχωριστές φάσεις (G1: 1 st gap phase, S: DNA synthesis phase, G2: 2 nd gap phase, M: mitosis), ενώ η απουσία αυξητικών παραγόντων απαραίτητων για την είσοδο του κυττάρου στην G1 οδηγεί σε μία φάση ηρεμίας (G0), η παραμονή στην οποία μπορεί να είναι μόνιμη ή αναστρέψιμη (46). Τα περισσότερα κύτταρα σε ένα ενήλικο ανθρώπινο οργανισμό βρίσκονται σε φάση ηρεμίας και με εξαίρεση εκείνα τα οποία έχουν φθάσει σε κατάσταση τελικής διαφοροποίησης, διατηρούν τη δυνατότητα εισόδου στον κυτταρικό κύκλο.

43 42 Σχήμα 2. Ρύθμιση της δραστικότητας των συμπλεγμάτων κυκλινών- CDKs και δυνατότητες θεραπευτικής παρέμβασης.

44 Σχήμα 3. Σχηματική παράσταση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. 43

45 44 Έως σήμερα έχουν αναγνωρισθεί 13 CDKs οι οποίες κωδικοποιούνται στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Εκτός από το ρόλο των CDKs στον κυτταρικό κύκλο τα τελευταία χρόνια αναγνωρίσθηκε η σημασία τους και σε άλλες λειτουργίες όπως η απόπτωση, η κυτταρική διαφοροποίηση και η μεταγραφή. Τα σημαντικότερα γνωστά ρυθμιστικά συμπλέγματα κυκλινών- CDKs που συμμετέχουν στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου είναι της κυκλίνης D1-cdk4, το οποίο ελέγχει την πρόοδο της φάσης G1, της κυκλίνης Ε-cdk2, το οποίο καθορίζει την είσοδο στη φάση S, της κυκλίνης Α-cdk2, το οποίο ρυθμίζει τη διέλευση από τη φάση S και της κυκλίνης Β-cdc2, το οποίο ελέγχει την είσοδο στη φάση Μ (Σχήμα 4). Από τα προηγούμενα γίνεται κατανοητό ότι η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ελέγχεται από τη λειτουργία ρυθμιστικών πρωτεϊνών, μεταλλάξεις ή διαταραχή στη δράση των οποίων συνοδεύονται από σημαντικές επιπτώσεις στην κυτταρική διαίρεση. Οι πολύπλοκες διαντιδράσεις μεταξύ των παραπάνω πρωτεϊνών και ενζύμων καθώς και με τα προϊόντα των ογκογονιδίων και των ογκοκατασταλτικών γονιδίων δεν έχουν πλήρως διευκρινισθεί (47-50).

46 45 Σχήμα 4. Σχηματική παράσταση των μεταβολών των συμπλεγμάτων κυκλινών/cdks κατά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

47 46 β. Μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου p53 Δύο ιδιαίτερα σημαντικοί ρυθμιστικοί παράγοντες είναι η πρωτεΐνη p53 και το προϊόν του ογκοκατασταλτικού γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (prb). Ο έλεγχος της ακεραιότητας του γονιδιώματος αποτελεί σημαντική διαδικασία στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και πραγματοποιείται σε μεγάλο βαθμό από την πρωτεΐνη p53. Μετά από βλάβη του DNA, η φυσιολογική μορφή της p53 (wild type) διακόπτει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και προκαλεί παραμονή του κυττάρου στη φάση G1, εξασφαλίζοντας έτσι το απαιτούμενο χρονικό διάστημα για επιδιόρθωση του γενετικού υλικού πριν τον αναδιπλασιασμό του. Η διακοπή του κυτταρικού κύκλου επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της p21 waf1/cip1 η οποία αναστέλλει τη δραστικότητα συμπλεγμάτων κυκλινών / κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (Σχήμα 5). Εάν η επιδιόρθωση του γενετικού υλικού δεν είναι δυνατή, η p53 κινητοποιεί διαδικασία κυτταρικού θανάτου μέσω αποπτωτικών μηχανισμών (51,52). Απώλεια της λειτουργίας της p53 οδηγεί σε γενετική αστάθεια και διαταραχή της απόπτωσης και συμβάλλει στη

48 47 διαδικασία της κακοήθους εξαλλαγής. Εκτός από τη σημασία της πρωτεΐνης p53 στην καταστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1, πρόσφατες μελέτες εισηγούνται ανάλογο ρόλο της p53 και στην παραμονή του κυττάρου στη φάση G2 μετά από βλάβη του γενετικού υλικού (53). Σχήμα 5. Καταστολή του κυττάρου στη φάση G1 μέσω της πρωτεΐνης p53 μετά από βλάβη του DNA.

49 48 Το γονίδιο (ΤΡ53) το οποίο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p53 εμφανίζει τη μεγαλύτερη συχνότητα μεταλλάξεων στα ανθρώπινα κακοήθη νεοπλάσματα, ενώ το φάσμα των μεταλλάξεων ποικίλλει μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου (54). Yπολογίζεται ότι τουλάχιστον το 50% των όγκων συνοδεύονται από διαταραχές του γονιδίου ΤΡ53, ενώ το 95% των μεταλλάξεων αφορά στην κεντρική περιοχή δέσμευσης του DNA (core DNA-binding domain) (Σχήμα 6). Η φυσιολογική πρωτεΐνη p53 (wild type) έχει μικρό χρόνο ημιζωής, γεγονός που δεν επιτρέπει την ανίχνευσή της στους ιστούς κατά τον ανοσοϊστοχημικό έλεγχο. Αντίθετα, μεταλλαγμένες μορφές έχουν μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής με αποτέλεσμα κατά την ανοσοϊστοχημική μελέτη να δίνουν θετικά αποτελέσματα στην έκφραση της p53. Σχήμα 6. Συχνότητα και κατανομή των μεταλλάξεων της πρωτεΐνης p53.

50 49 Eκτός όμως από την παρουσία μεταλλάξεων, η λειτουργία της p53 επηρεάζεται και από μία άλλη πρωτεΐνη, την mdm2 (hdm2 στον άνθρωπο). Η μεταγραφή του γονιδίου mdm2 βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο της φυσιολογικής p53. Η πρωτεΐνη mdm2 δεσμεύει τη φυσιολογική p53, αναστέλλει τη ρυθμιστική μεταγραφική δραστηριότητά της, ενώ παράλληλα ευοδώνει την αποδόμησή της από το σύστημα της ουβικιτίνης (ubiquitin) με τελικό αποτέλεσμα η υπερέκφραση της mdm2 να αδρανοποιεί την p53 (55). Η βλάβη του γενετικού υλικού ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Αtm η οποία εμποδίζει τη δέσμευση της mdm2 στην p53 μέσω φωσφορυλίωσης της τελευταίας σε θέσεις σερίνης από την κινάση Chk2. Σε μερικά νεοπλάσματα όπως τα σαρκώματα έχει διαπιστωθεί απενεργοποίηση της p53 μέσω υπερέκφρασης της mdm2, ενώ στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έχει παρατηρηθεί δέσμευση της p53 και αύξηση της αποδόμησής της από την πρωτεΐνη Ε6 του ιού Human Papilloma Virus (HPV). Η προγνωστική αξία της p53 σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και αρνητικούς λεμφαδένες παραμένει ακόμη αμφίβολη, καθώς οι μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί καταλήγουν σε αντικρουόμενα μεταξύ τους αποτελέσματα (56-59).

51 50 prb Κυρίαρχο ρόλο στη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση αναδιπλασιασμού του DNA (S) διαδραματίζει η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης prb, η οποία οδηγεί σε απενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικού αυτού μορίου (60). Τα επίπεδα της prb παραμένουν σταθερά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ενώ η ενεργότητά της καθορίζεται από την κατάσταση φωσφορυλίωσής της. Η prb βρίσκεται στην ενεργό, υποφωσφορυλιωμένη μορφή της κατά τη φάση G0 και έως το μέσο της G1, ενώ φωσφορυλιώνεται και αδρανοποιείται προς το τέλος της G1 και κατά τη φάση S, παραμένοντας σε υψηλό βαθμό φωσφορυλίωσης κατά τη διάρκεια της φάσης G2 (61). Ο μηχανισμός μέσω του οποίου η prb αποτρέπει την είσοδο στη φάση S σχετίζεται άμεσα με την αλληλεπίδρασή της με το μεταγραφικό παράγοντα E2F-1 και τη συνοδό του υπομονάδα DP (62). Ο παράγοντας αυτός αποτελεί το βασικό μέλος μίας οικογένειας τουλάχιστον 6 μεταγραφικών παραγόντων και λειτουργεί ενεργοποιώντας τη μεταγραφή ποικιλίας γονιδίων, τα προϊόντα των οποίων συμμετέχουν στη διαδικασία σύνθεσης του DNA. Η υποφωσφορυλιωμένη prb σχηματίζει σύμπλοκα με αυτούς τους παράγοντες και τους αδρανοποιεί, καταστέλλοντας έτσι την έκφραση γονιδίων. Η αναστολή της ενεργοποίησης αυτών των

52 51 γονιδίων μέσω της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης prb με τον E2F-1 ερμηνεύει την κατασταλτική δράση της prb στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (63). Αντίθετα, φωσφορυλίωση της prb οδηγεί σε απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι με τη σειρά τους ενεργοποιούν τη μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στη μετάβαση από τη φάση G1 στην S όπως το γονίδιο της κυκλίνης Ε, της κυκλίνης Α, της prb, της p107, του myc αλλά και γονιδίων που συμμετέχουν στον αναδιπλασιασμό του DNA όπως το γονίδιο της κινάσης της θυμιδίνης, της αναγωγάσης του διυδροφυλικού, της θυμιδιλικής συνθάσης, της DNA-πολυμεράσης, του PCNA και της cdc6 (64). Επιπρόσθετα της ικανότητάς της να αναστέλλει τη μετάπτωση στη φάση S, η prb θεωρείται ότι συμμετέχει στη ρύθμιση μίας ποικιλίας λειτουργιών όπως είναι η επιδιόρθωση του γενετικού υλικού, η απόπτωση, η κυτταρική διαφοροποίηση κ.ά. (Σχήμα 7). Υποστηρίζεται ότι σε περίπτωση αναστολής της δράσης της prb, η φυσιολογική λειτουργία της p53 αντισταθμίζει μέσω απόπτωσης την απορρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και αποτρέπει τη νεοπλασματική εξαλλαγή (48). Μεταλλάξεις του γονιδίου Rb έχουν διαπιστωθεί σε νεοπλάσματα, οι περισσότερες από τις οποίες αφορούν

53 52 στην περιοχή δέσμευσης των πρωτεϊνών (pocket region) της prb με συνέπειες στη λειτουργικότητά της. Σχήμα 7. Συμμετοχή της πρωτεΐνης prb στον έλεγχο της μετάπτωσης της φάσης G1 στην S και άλλες πιθανές λειτουργίες της.

54 53 Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης prb σε θέσεις σερίνης / θρεονίνης απαιτεί την παρουσία κυκλινών οι οποίες σχηματίζουν συμπλέγματα με CDKs. Οι κυκλίνες οι οποίες συμμετέχουν στη μετάβαση από τη φάση G1 στην S είναι οι κυκλίνες D (D1, D2 και D3) και η κυκλίνη Ε (65) (Σχήμα 8). Κατά τη μετάβαση από τη φάση G0 στην G1 αρχίζει υπό την επίδραση μιτογόνων η σύνθεση των κυκλινών τύπου D, τα επίπεδα των οποίων φθάνουν στο μέγιστο κοντά στη μετάπτωση από τη φάση G1 στην S. Η σύνδεση της κυκλίνης τύπου D με την CDK οδηγεί σε ενεργοποίηση του ενζύμου (66). Στο μέσο και έως το τέλος της φάσης G1 παρατηρείται αύξηση της ενεργότητας του συμπλέγματος της κινάσης cdk4 με την κυκλίνη D1 που επάγει τη φωσφορυλίωση της prb (67). Η μερική φωσφορυλίωση της prb από το σύμπλεγμα κυκλίνη D1- cdk4 επιτρέπει στο μεταγραφικό παράγοντα E2F να επάγει κατά το τέλος της φάσης G1 την ενεργοποίηση του γονιδίου της κυκλίνης Ε και τη σύνθεση της αντίστοιχης πρωτεΐνης (68). Η σύνθεση του συμπλέγματος κυκλίνη Ε-cdk2 αρχίζει κατά το τέλος της φάσης G1 και συνεχίζεται σε μέγιστο βαθμό κατά τη μετάβαση G1-S. Το σύμπλεγμα αυτό είναι ο αναγκαίος και καθοριστικός του ρυθμού παράγοντας για τη μετάβαση στη φάση S μέσω περαιτέρω φωσφορυλίωσης της prb και

55 54 απελευθέρωσης του μεταγραφικού παράγοντα E2F (69). Mετά την είσοδο στη φάση S η κυκλίνη Ε αποδομείται και η cdk2 σχηματίζει σύμπλοκο με την κυκλίνη Α. Γονιδιακή ενίσχυση και υπερέκφραση της κυκλίνης D1 καθώς επίσης υπερέκφραση της κυκλίνης Ε έχει παρατηρηθεί σε αρκετούς τύπους καρκίνου. Γονιδιακή ενίσχυση και υπερέκφραση της cdk4 και cdk6 αλλά και μεταλλάξεις των αντίστοιχων γονιδίων που οδηγούν σε αδυναμία δέσμευσης CDKIs έχουν επίσης διαπιστωθεί σε αρκετές περιπτώσεις καρκίνου, ενώ αντίθετα μεταλλάξεις της cdk2 και των μεταγραφικών παραγόντων E2F σπάνια έχουν περιγραφεί.

56 55 Σχήμα 8. Ρύθμιση της φάσης G1 και της μετάβασης G1/S.

57 56 CDKIs Η δραστικότητα των συμπλεγμάτων κυκλίνης / CDK ελέγχεται επίσης από μία κατηγορία ανασταλτικών πρωτεϊνών, τους αναστολείς των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKIs). Έως σήμερα έχουν αναγνωρισθεί δύο ομάδες CDKIs (Σχήμα 9). Η μία (CIP/KIP family) περιλαμβάνει τις p21 waf1/cip1, p27 kip1 και p57 kip2, ενώ η δεύτερη ομάδα (INK 4 family) αποτελείται από τις p16 ink4a, p15 ink4b, p18 ink4c και p19 ink4d. Η πρώτη ομάδα CDKIs έχει την ιδιότητα να δεσμεύει σύμπλοκα κυκλινών με CDKs που ελέγχουν τη μετάβαση από τη φάση G1 στην S (70), ενώ η δεύτερη αναστέλλει εκλεκτικά τη δημιουργία συμπλόκων της κυκλίνης D με τις κινάσες cdk4 και cdk6 (71). Αν και τα μέλη της οικογένειας CIP/KIP δεσμεύουν συμπλέγματα της κυκλίνης D, Ε και Α με τις αντίστοιχες CDKs, θεωρείται ότι ο κύριος στόχος αυτής της ομάδας CDKIs είναι το σύμπλοκο κυκλίνη Ε-cdk2 (72). Οι πρωτεΐνες αυτές μέσω αυστηρού ελέγχου των επιπέδων τους συμβάλλουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου αδρανοποιώντας τα συμπλέγματα κυκλινών-cdks, εμποδίζοντας έτσι την ανεξέλεγκτη φωσφορυλίωση της prb και την απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων E2F.

58 57 Σχήμα 9. Αναστολείς των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (cyclindependent kinase inhibitors, CDKIs).

59 58 p21 waf1/cip1 Η p21 waf1/cip1 δεσμεύει και αναστέλλει τη δράση των συμπλεγμάτων κυκλίνη D1-cdk4, κυκλίνη Ε-cdk2, κυκλίνη Α-cdk2 καθώς και κυκλίνη Β-cdc2 αποτελώντας έτσι καθολικό αναστολέα CDKs (70). Τα συμπλέγματα κυκλινών-cdks που περιέχουν 1 μόριο p21 waf1/cip1 είναι ενεργά, ενώ αυτά που περιέχουν πολλαπλά μόρια καθίστανται ανενεργά, γεγονός που υπογραμμίζει τη σημασία της στοιχειομετρίας της p21 waf1/cip1 για τη δράση της (73). Mεταλλάξεις του γονιδίου p21/waf1 δεν ανιχνεύονται συχνά, ενώ ο κύριος μηχανισμός ρύθμισης της p21 waf1/cip1 φαίνεται να είναι σε επίπεδο μεταγραφής. Η μεταγραφή του p21/waf1 ελέγχεται από την p53. Έχει ήδη αναφερθεί ότι σε περίπτωση βλάβης του DNA η φυσιολογική p53 επάγει την έκφραση της p21 waf1/cip1 με συνέπεια την αναστολή της δράσης των CDKs, αποφυγή της φωσφορυλίωσης της prb και απελευθέρωσης των παραγόντων E2F, με τελικό αποτέλεσμα την παραμονή στη φάση G1 (74). Eπιπλέον έχει βρεθεί ότι λειτουργεί και ανεξάρτητος της p53 μηχανισμός επαγωγής της πρωτεΐνης p21 waf1/cip1.

60 59 p27 kip1 Η p27 kip1 (kinase inhibitory protein-1) εμφανίζει σημαντικού βαθμού ομοιότητα αλληλουχίας με την p21 waf1/cip1 και αναστέλλει την ενζυμική δραστικότητα των συμπλεγμάτων κυκλίνη Ε-cdk2 και κυκλίνη Α-cdk2 με αποτέλεσμα την καταστολή των κυττάρων στη φάση G1. Η p27 kip1 δεσμεύει επίσης το σύμπλοκο κυκλίνη D1-cdk4 χωρίς όμως να το αδρανοποιεί. Όπως αναφέρθηκε και για την p21 waf1/cip1, η στοιχειομετρία της p27 kip1 καθορίζει εάν η πρωτεΐνη θα δράσει σαν αναστολέας ή όχι. Η p27 kip1 όχι μόνο αναστέλλει συμπλέγματα κυκλινών-cdks αλλά επιπλέον παρεμποδίζει και την ενεργοποίησή τους μπλοκάροντας τη φωσφορυλίωση της cdk2 στη θέση Τhr160 (75,76). Εκτός από το ρόλο της σαν CDKI η p27 kip1 θεωρείται ότι πιθανά συμμετέχει και σε άλλες λειτουργίες όπως η απόπτωση, ο έλεγχος της κυτταρικής διαφοροποίησης, αλλά και η ρύθμιση της αντίστασης συμπαγών νεοπλασμάτων σε φάρμακα. Η p27 kip1 επάγεται από το κυκλικό ΑΜΡ, τη λοβαστατίνη, τη ραπαμυκίνη, την ταμοξιφαίνη, ενώ η ιντερλευκίνη 2 καταστέλλει την έκφρασή της (75,76). Επίσης, έχει διαπιστωθεί ότι η πρωτεΐνη p27 kip1 αποτελεί βασικό στόχο της ενεργοποίησης των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης όπως είναι οι EGFRs, οι οποίοι προκαλούν ελάττωση των

61 60 επιπέδων της p27 kip1 μέσω αύξησης της αποδόμησης αλλά και μέσω μετακίνησης της πρωτεΐνης από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (77). Μεταλλάξεις στο γονίδιο p27/kip1 σπάνια έχουν περιγραφεί σε νεοπλάσματα (78). Μελέτες σε κυτταρικά συστήματα έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της p27 kip1 ρυθμίζονται σε μεταγραφικό, μεταφραστικό ή μεταμεταφραστικό επίπεδο. Μέσα από σημαντικό αριθμό μελετών έχει δειχθεί ότι κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης η έκφραση της p27 kip1 ελαττώνεται (79-84). Η απενεργοποίηση της p27 kip1 κατά τη διαδικασία της καρκινογένεσης στον ανθρώπινο οργανισμό επιτελείται κυρίως με πρωτεόλυση από το σύστημα της ουβικιτίνης (ubiquitin-proteasome pathway) στον πυρήνα των κυττάρων, ενώ έχει διαπιστωθεί ότι το σύμπλεγμα κυκλίνη Ε-cdk2 επάγει την καταστροφή της p27 kip1 από το σύστημα πρωτεόλυσης φωσφορυλιώνοντάς την (85). Εναλλακτικά, η ενεργοποίηση των πρωτεϊνικών κινασών hkis και PKB/Akt προκαλεί φωσφορυλίωση της p27 kip1 και μετακίνησή της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα με αποτέλεσμα τη λειτουργική αδρανοποίησή της (86). Aπό την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας προκύπτουν αρκετά στοιχεία τα οποία εισηγούνται ότι η πυρηνική έκφραση της p27 kip1 αποτελεί χρήσιμο προγνωστικό παράγοντα σε ποικιλία όγκων,

62 61 συμπεριλαμβανομένου του μαστού, αν και όλες οι σχετικές μελέτες δε βρίσκονται σε συμφωνία μεταξύ τους (79,80,82,83,87-93).

63 62 p16 ink4a Η πρωτεΐνη p16 ink4a σχηματίζει ετεροδιμερή σύμπλοκα με τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες cdk4 και cdk6 και αναστέλλει εκλεκτικά τη δημιουργία συμπλεγμάτων με την κυκλίνη D. Σημαντικού βαθμού ομοιότητα παρατηρείται μεταξύ της p16 ink4a και της πρωτεΐνης p15 ink4b, ενώ μικρότερου βαθμού ομοιότητα παρατηρείται με την p18 ink4c. Μεταλλάξεις του γονιδίου της p16 ink4a διαπιστώνονται συχνά σε ποικιλία νεοπλασμάτων, όπως είναι ο καρκίνος του παγκρέατος. Τα τελευταία χρόνια πιστεύεται ότι σχεδόν όλες οι περιπτώσεις καρκίνου στον άνθρωπο συνοδεύονται από κάποιου είδους διαταραχή στην οδό p16 ink4a κυκλίνη D prb.

64 63 γ. Μετάβαση από τη φάση G2 στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου Η πρωτεΐνη cdc2 ή p34 cdc2 ή cdk1 αποτελεί το προϊόν του γονιδίου cdc2 το οποίο περιγράφηκε για πρώτη φορά στο Schizosaccharomyces pombe. Η p34 cdc2 είναι η καταλυτική υπομονάδα ενός συμπλέγματος με δραστικότητα πρωτεϊνικής κινάσης, του MPF (Maturation or mitosis promoting factor) (94). O παράγοντας MPF αποτελεί σύμπλοκο της p34 cdc2 με την κυκλίνη Β (95). Είναι πλέον τεκμηριωμένο ότι ο MPF παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της μίτωσης από το μύκητα έως τον άνθρωπο, καθώς η πρωτεΐνη p34 cdc2 εμφανίζει σημαντικού βαθμού δομική και λειτουργική διατήρηση κατά την εξέλιξη. Μελέτες έδειξαν ότι το σύμπλοκο κυκλίνη Β-cdc2 διεγείρει την έναρξη μιτωτικών γεγονότων όπως είναι ο σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου, η διάσπαση της πυρηνικής μεμβράνης και η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων (96). Έχει διαπιστωθεί ότι η p34 cdc2 φωσφορυλιώνει πολλαπλά υποστρώματα και ότι αυτή η δράση κινάσης είναι μέγιστη κατά τη μετάφαση (Σχήμα 10). Στο σημείο αυτό το σύμπλοκο κυκλίνη Β- cdc2 ενεργοποιεί τον παράγοντα APC (anaphase promoting complex) ο οποίος επιτρέπει στις αδελφές χρωματίδες να αποχωριστούν μεταξύ τους,

65 64 ενώ παράλληλα συμβάλλει στην αποδόμηση της κυκλίνης Β μέσω σύνδεσής της με την πρωτεΐνη ουβικιτίνη (ubiquitin). Cdk1 + MPF, phosphorylates, activates proteins of mitosis cyclin B Cdk1 cyclin B Cyclin B G 1 S G 2 M Σχήμα 10: O παράγοντας MPF αποτελεί σύμπλοκο της p34 cdc2 με την κυκλίνη Β και διεγείρει την έναρξη μιτωτικών γεγονότων μέσω φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών.

66 65 Η p34 cdc2 εντοπίζεται ανοσοϊστοχημικά στα ανθρώπινα κύτταρα τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Κλάσμα της πρωτεΐνης σχετίζεται με τα κεντροσώματα και αυτό δείχνει ότι η p34 cdc2 πιθανά φωσφορυλιώνει κεντροσωμικές πρωτεΐνες οδηγώντας στη δημιουργία της μιτωτικής ατράκτου. Αύξηση της κεντροσωμικής έκφρασης της p34 cdc2 παρατηρείται κατά τη φάση G2, είναι μέγιστη κατά τη μετάφαση, ενώ δραματική ελάττωση διαπιστώνεται στην έναρξη της ανάφασης (97). Η σύνθεση της κυκλίνης Β αρχίζει στο τέλος της φάσης S ενώ η έκφρασή της είναι μέγιστη κατά τη μετάπτωση της G2 στη φάση Μ. Το σύμπλοκο κυκλίνη B-cdc2 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της μεσόφασης, ενώ μετακινείται προς τον πυρήνα κατά την έναρξη της μίτωσης. Η μετακίνηση του συμπλόκου στον πυρήνα απαιτεί τη φωσφορυλίωση της κυκλίνης Β στο τμήμα CRS (cytoplasmic retention sequence). Το γονίδιο WEE1Ηu κωδικοποιεί μία πρωτεϊνική κινάση (p49) η οποία φωσφορυλιώνει το σύμπλοκο κυκλίνη B-cdc2 στη θέση Tyr 15 απενεργοποιώντας το. Φωσφορυλίωση στη θέση Thr 14 από την κινάση Μyt 1 προκαλεί επίσης απενεργοποίηση του συμπλέγματος (98). Η αναστολή της δραστικότητας του συμπλόκου αναστρέφεται με τη δράση της Cdc25C φωσφατάσης η οποία προκαλεί αποφωσφορυλίωση των

67 66 θέσεων Τyr 15 και Τhr 14 (99). Η ενεργός p34 cdc2 ασκεί θετικό feedback φωσφορυλιώνοντας τη Cdc25C, ενισχύοντας έτσι τη δράση της σαν φωσφατάση. Από το άλλο μέρος, η p34 cdc2 ασκεί αρνητικό feedback σε κινάσες της οικογένειας WEE1 φωσφορυλιώνοντάς τες. Οι παραπάνω μηχανισμοί ερμηνεύουν την περαιτέρω αύξηση της δραστικότητας της p34 cdc2 μετά από την αρχική της ενεργοποίηση. Από τα προηγούμενα γίνεται αντιληπτό ότι η ισορροπία μεταξύ της Cdc25C φωσφατάσης και των κινασών της οικογένειας WEE1, η οποία πριν από την είσοδο στη μίτωση είναι προς το μέρος των κινασών, καθορίζει την έναρξη της φάσης Μ προκαλώντας την αρχική ενεργοποίηση της p34 cdc2. Eκτός από την αποφωσφορυλίωση στις θέσεις Tyr 15 και Thr 14 η ενεργοποίηση της p34 cdc2 απαιτεί επίσης φωσφορυλίωση της κινάσης στη θέση Thr 161 από την CAK cyclin H/cdk7/mat1 compex (100) (Σχήμα 11). Πρωτεόλυση της κυκλίνης Β κατά τη μετάπτωση από τη μετάφαση στην ανάφαση οδηγεί σε απενεργοποίηση του MPF, ενώ η αποδόμηση της κυκλίνης θεωρείται απαραίτητη για την έξοδο από τη μίτωση. H πρωτεόλυση της κυκλίνης γίνεται μέσω σύζευξης με την πρωτεΐνη ουβικιτίνη (ubiquitin) (101). Η εμφάνιση και εξαφάνιση του MPF κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ερμηνεύεται από τη σύνθεση και