ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΛΕΙΟΥ ΜΥΪΚΟΥ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΛΕΙΟΥ ΜΥΪΚΟΥ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ Διατριβή για το Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης στην κατεύθυνση Μοριακή Φαρμακολογία-Κλινική Φαρμακευτική Μυρίσσα Αναστασία Βιολόγος Πάτρα 2012

2 Η παρούσα Διπλωματική εργασία έγινε εφικτή χάρη στην υποστήριξη που έλαβε από την υποτροφία του προγράμματος Κ. Καραθεοδωρή (Παν/μιο Πατρών): C595 «Ο Ρόλος των Άλφα1-Αδρενεργικών Υποδοχέων στον Καθορισμό Του Φαινοτύπου των Λείων Μυϊκών Κυττάρων των Αγγείων» προς τον Επ. Καθηγητή Σταύρο Τοπούζη Η διπλωματική αυτή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Μοριακής Φαρμακολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών με την αρωγή υποτροφίας από πρόγραμμα Κ. Καραθεοδωρή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Σταύρο Τοπούζη για την ευκαιρία που μου έδωσε να συμμετέχω στην ερευνητική του ομάδα. Η βοήθεια που μου έδωσε καθώς επίσης η κατανόηση, η ψυχολογική στήριξη και η εμπιστοσύνη που μου έδειξε σε δυσκολίες και προβλήματα που προέκυπταν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, ήταν πολύ σημαντικά για να μπορέσω να συνεχίσω. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους καθηγητές της τριμελούς μου επιτροπής κ. Α. Παπαπετρόπουλο και κ. Κ. Πουλά. Επιπέον θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα παιδιά του εργαστηρίου για το ευχάριστο κλίμα που διαμόρφωναν καθημερινά και για την πολύ όμορφη συνεργασία που είχαμε στο εργαστήριο. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους δικούς μου ανθρώπους που πάντα είναι δίπλα μου και που πάντα με στηρίζουν... 2

3 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΛΗΨΗ...6 SUMMARY ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το Καρδιαγγειακό Σύστημα Το αγγειακό τοίχωμα Φαινοτυπική πλαστικότητα Ρόλος της πλαστικότητας του ΛΜΦ σε φυσιολογικές καταστάσεις Ρόλος της πλαστικότητας του ΛΜΦ σε παθολογικές καταστάσεις Μεταβολές στο φαινότυπο των ΑΛΜΚ κατά την αθηροσκλήρωση Μεταβολές στο φαινότυπο των ΑΛΜΚ κατά την επαναστένωση Ρύθμιση του φαινοτύπου των ΑΛΜΚ Μηχανισμοί ρύθμισης του φαινοτύπου των ΛΜΚ Ο ρόλος της εξωκυττάριας ύλης στη ρύθμιση του ΛΜΦ Μεταγραφική ρύθμιση του φαινοτύπου των ΑΛΜΚ Συμπαθητική Νεύρωση των αγγείων Η δράση των Αδρενεργικών υποδοχέων Ρόλος των α1-αδρενεργικών υποδοχέων Ρόλος των α2-αδρενεργικών υποδοχέων Ρόλος των β-αδρενεργικών υποδοχέων camp Επιθηλιομεσεγχυματική Μετάβαση (EMT) ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κυτταροκαλλιέργειες Κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη H κυτταρική σειρά Α7r Η κυτταρική σειρά NIH3T Η κυτταρική σειρά DU Η κυτταρική σειρά HUVEC Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για A7r5, NIH3T3 και DU Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC Ανακαλλιέργεια κυττάρων Ανακαλλιέργεια κυττάρων A7r5, NIH3T3 και DU Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC Κατάψυξη κυττάρων Απόψυξη κυττάρων Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Western ανάλυση Πειραματική πορεία για Western Assay Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυμα SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Ανοσοαποτύπωμα (Western blot) Αποδέσμευση αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων πρωτεϊνών με σύστημα ανάλυσης εικόνας Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Καλλιέργειες βακτηρίων

4 3.3.1 Παρασκευή δεκτικών βακτηρίων Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Στερεή καλλιέργεια βακτηρίων E.coli, διαλογή μετασχηματισμένων βακτηρίων και ανακαλλιέργεια τους σε υγρό θρεπτικό υλικό Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Mικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (mini prep) Μεγάλης κλίμακας απομόνωση (midi prep) Ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός του πλασμιδιακού DNA Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού και ανάλυση των αποτελεσμάτων σε πήκτωμα αγαρόζης Αποθήκευση βακτηρίων για μακροπρόθεσμη χρήση Διαμόλυνση κυττάρων Πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα διαμόλυνσης Αδενοϊοί που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα διαμόλυνσης Ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα διαμόλυνσης Παροδική διαμόλυνση σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί, με τα πλασμίδια αναφοράς Παροδική διαμόλυνση με το jetpei σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί Παροδική διαμόλυνση με το jetprime σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί Σταθερή διαμόλυνση κυττάρων και επιλογή των λειτουργικών κλώνων Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μοριακός έλεγχος του ΛΜΦ σε ΛΜΚ A7r Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών α1-αδρενεργικών υποδοχέων σε ΛΜΚ A7r Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα Α7r Μελέτη ΛΜΚ A7r5 που εκφράζουν σταθερά τους α1α-αδρενεργικούς υποδοχείς Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην έκφραση των ΛΜΚ-ειδικών πρωτεϊνών σε κύτταρα A7r Ρόλος των στοιχείων CΑrG στην ενεργοποίηση των γονιδίων του ΛΜΦ από τους α1α-αδρενεργικούς υποδοχείς Επίδραση των α1β-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα Α7r Ρόλος των στοιχείων CΑrG στην ενεργοποίηση των γονιδίων του ΛΜΦ από τους α1β-αδρενεργικούς υποδοχείς Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών β-αδρενεργικών υποδοχέων σε ΛΜΚ A7r Επίδραση των β-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ στα κύτταρα A7r Επίδραση των β-αδρενεργικών υποδοχέων στην έκφραση των ΛΜΚ-ειδικών πρωτεϊνών σε κύτταρα A7r Μοριακός έλεγχος του ΛΜΦ σε NIH3T Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών α1-αδρενεργικών υποδοχέων σε κύτταρα ινοβλαστών NIH3T Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 στην παροδική διαμόλυνση

5 4.2.3 Επίδραση των α1β-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 στην παροδική διαμόλυνση Έλεγχος λειτουργικών κλώνων σε κύτταρα ινοβλαστών NIH3T Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ΛΜΚειδικών υποκινητών σε κύτταρα NIH3T Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην έκφραση των ΛΜΚ-ειδικών πρωτεϊνών σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ Ρόλος των στοιχείων CΑrG στην ενεργοποίηση των γονιδίων του ΛΜΦ από τους α1α-αδρενεργικούς υποδοχείς στα κύτταρα NIH3T Μελέτη λειτουργικών υποδοχέων σε κύτταρα DU Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών υποδοχέων για τον ΤGF-β1 σε κύτταρα DU Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών α1-αδρενεργικών υποδοχέων σε κύτταρα DU Έλεγχος του φαινομένου ΕΜΤ σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 6

7 Ο Λείος Μυϊκός Φαινότυπος (ΛΜΦ) χαρακτηρίζεται από σημαντική πλαστικότητα και παίζει κομβικό λειτουργικό ρόλο τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Στις αρτηρίες, η μεταβολή του ΛΜΦ στο φάσμα από φυσιολογικός-συσταλτός μέχρι συνθετικός-παθολογικός εμπλέκεται αιτιολογικά σε διάφορες ανθρώπινες ασθένειες όπως στην αθηροσκλήρωση, στην υπέρταση και στην επαναστένωση των αγγείων μετά από εγχείρηση. Η έκφραση γονιδίων ΛΜΦ έιναι επίσης μεγάλης σημασίας σε ασθένειες άλλων οργάνων, όπως η ίνωση των νεφρών και του ήπατος και η μετάσταση του καρκίνου. Συνεπώς, η μελέτη των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων επηρεάζεται ο ΛΜΦ είναι πολύ σημαντική για την ανάπτυξη νέων τεχνικών περιορισμού της εξέλιξης αυτών των νόσων. Η λειτουργία πολλών ιστών όπως είναι τα αγγεία ελέγχεται σε σημαντικό βαθμό από το συμπαθητικό νευρικό σύστημα. Σκοπός λοιπόν της παρούσας εργασίας ήταν πρώτα-πρώτα να εξετάσουμε εάν in vitro η διέγερση των α και β αδρενεργικών υποδοχέων πιθανώς ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων ΛΜΦ και προκαταρκτικά να διακριβώσουμε μέσω ποιών μοριακών μηχανισμών οι α1 (υπότυποι α1α και α1β) και οι β-αυς επηρεάζουν και ελέγχουν το ΛΜΦ. Κατά δεύτερο λόγο θελήσαμε να εξετάσουμε εάν η εξωγενής έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Μυοκαρδίνη προκαλεί επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ-Epithelial to Mesenchymal Transition) σε ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro. Για τα πρώτα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς: α) διαφοροποιημένα λεία μυϊκά κύτταρα αορτής αρουραίου της κυτταρικής σειράς A7r5, και β) κύτταρα ινοβλαστών της κυτταρικής σειράς ΝΙΗ3Τ3 προερχόμενα απο ποντικό, προκειμένου να δούμε αντίστοιχα πως η δράση των ΑΥ ελέγχει την έκφραση των γονιδίων αυτών σε διαφοροποιημένα ΛΜΚ (A7r5) και σε αδιαφοροποίητα κύτταρα που όμως μπορούν να μετατραπούν σε «ΛΜΚ» (ΝΙΗ3Τ3). Ως δείκτη για την έκφραση του ΛΜΦ, εξετάσαμε την έκφραση κυτταροσκελετικών, δομικών πρωτεϊνών-δεικτών, όπως η λείου μυϊκού τύπου α-ακτίνη (SM-α-Αctin),, η λείου μυϊκού τύπου βαριά αλυσίδα της Μυοσίνης (SM-MHC), η λείου μυϊκού τύπου Καλπονίνη (SM-Calponin) και η λείου μυϊκού τύπου πρωτεΐνη 22α (τρανσγελίνη) (SM22α), σε δύο επίπεδα: α) είτε χρησιμοποιώντας αντισώματα, είτε β) με την χρήση πλασμιδίων αναφοράς όπου minimal υποκινητές των παραπάνω γονιδίων ελέγχουν την προσμετρούμενη έκφραση λουσιφεράσης. Η ενεργοποίηση της μεταγραφής αυτών των γονιδίων ρυθμίζεται, σε μεγάλο μέρος, από τις αλληλουχίες CArG (CArG boxes) στους υποκινητές τους, στις οποίες προσδένεται ο παράγοντας Serum Response Factor (SRF). Στα ΛΜΚ, ο μεταγραφικός παράγοντας SRF ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών μέσω δημιουργίας ενός απαραίτητου συμπλόκου με έναν μεταγραφικό παράγοντα της οικογένειας των Μυοκαρδινών, η οποία αποτελείται από 3 μέλη : τη Μυοκαρδίνη και τις συγγενείς πρωτεΐνες MRTF-A και MRTF-B. Στη μελέτη που πραγματοποιήσαμε, αρχικά παρατηρήσαμε ότι οι δύο αυτοί κυτταρικοί πληθυσμοί δεν εκφράζουν τους α1-αυς (α1α και α1β υπότυποι) ενδογενώς, αλλά, με εισαγωγή του αντίστοιχου πλασμιδίου των α1α ή α1β ΑΥς, το σύστημα καθίσταται λειτουργικό. Επιπλέον ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα A7r5 εκφράζουν ενδογενώς τους β-αυς. Από τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι υποδοχείς αυτοί επηρεάζουν και καθορίζουν με διαφορετικό τρόπο το ΛΜΦ, ανάλογα με τον υπότυπο των ΑΥς και ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων. 7

8 Πιο αναλυτικά, όσον αφορά στα κύτταρα A7r5 παρατηρήσαμε ότι: α) η ενεργοποίηση των α1α-αυ επάγει την έκφραση και των τεσσάρων γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, β) η ενεργοποίηση του υποκινητή της SM22α από τους α1α-αυς εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG ενώ η ενεργοποίηση του υποκινητή της SM-Calponin δεν εξαρτάται από τα στοιχεία αυτά, γ) η ενεργοποίηση των α1β-αυ επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α και SM-Calponin ενώ δεν επηρεάζει την μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM-α-Αctin και της SM- MHC, δ) η ενεργοποίηση των υποκινητών της SM22α και της SM-Calponin από τους α1β-αυς εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG, ε) οι β-αυς, σε αντίθεση με τους α1-αυς, επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ, κυρίως ελαττώνοντας τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM-Calponin, SM-α-Αctin και SM-MHC ενώ δεν επηρεάζουν τη μεταγραφική ενεργότητα του SM22α. Επίσης, όταν παρόμοια πειράματα έγιναν στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παρατηρήσαμε ότι: α) οι α1α-αυs επάγουν τη μεταγραφή των υποκινητών και των τεσσάρων γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ, β) στα κύτταρα αυτά η ενεργοποίηση των υποκινητών της SM22α και της SM- Calponin από τους α1α-αυς δεν εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG, γ) η ενεργοποίηση των α1β-αυs επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin και SM- MHC ενώ δεν επηρεάζει την ενεργότητα του υποκινητή της SM-α-Αctin. Από τα παραπάνω λοιπόν, καταλήξαμε στα εξής συμπεράσματα: 1) Η διέγερση των α1-αυ οδηγεί σε άυξηση της έκφρασης των γονιδίων-δεικτών του ΛΜΦ, και άρα οι α1-αυς λειτουργούν, τουλάχιστον in vitro, ως παράγοντες προώθησης του ΛΜΦ. 2) Η δράση των α1-αυ εξαρτάται μόνο μερικώς απο την ύπαρξη στοιχείων CArG (SRE), και διαφέρει ανάλογα με τον υποκινητή, άρα οι διάφοροι υποκινητές χρησιμοποιούν διαφορετικά τα στοιχεία CArG που περιέχουν, πράγμα που ενισχύει την υπόθεση συνδυαστικής χρήσης μεταφραφικών παραγόντων για την «πλαστική» έκφραση του λειτουργικού ΛΜΦ. 3) Οι δύο υπότυποι των α1-αυ που εξετάστηκαν, α1α-αυς και α1β-αυς, έχουν προφανείς διαφορές ως πρός την διέγερση της έκφρασης των ΛΜ γονιδίων, και άρα πιθανώς θα παίζουν διαφορετικό λειτουργικό ρόλο στα αγγεία και στους άλλους ιστούς όπου εκφράζονται. 4) Αντίθετα με τους α1-αυς, οι β-αυς λειτουργούν ανασταλτικά στην έκφραση των γονιδίων του ΛΜΦ, και άρα το τελικό προϊόν της συμπαθητικής διέγερσης στα αγγεία θα είναι η συνισταμένη των δράσεων α και β ΑΥ, που θα διαφέρει στα διάφορα αγγεία ανάλογα με την σχετική έκφραση των υποδοχέων αυτών. Παράλληλα, εξετάζοντας ενδοθηλιακά κύτταρα φλέβας ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC), είδαμε ότι η εξωγενής έκφραση της Μυοκαρδίνης προκαλεί αλλαγές στο φαινότυπό τους, τόσο σε μορφολογικό επίπεδο όσο και μέσω de novo έκφρασης της SM-α-Ακτίνης και της SM-Καλπονίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Παρατηρήσαμε δηλαδή αλλαγές που είναι συμβατές με την επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ-Epithelial to Mesenchymal Transition), διαδικασία με πολύ σπουδαίο ρόλο στην εμβρυογένεση, στη διαμόρφωση ιστών και οργάνων, αλλά επίσης και στην ίνωση, στη μετάσταση του καρκίνου και στην παθολογική αγγειογένεση. Συμπερασματικά, τα 8

9 ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων συμμετέχουν στη μετάβαση αυτή και μπορεί να συμβάλλουν σε διεργασίες κυτταρικής διαφοροποίησης και ιστικής δόμησης. Συμπεραίνουμε ότι η έκφραση της Μυοκαρδίνης επαρκεί για να προκαλέσει ΕΜΤ σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, με πιθανές συνέπειες για τη δυνατότητα trans-διαφοροποίησης και συνεισφοράς αυτών των κυττάρων, σε ανακατασκευή και αναδιοργάνωση ιστών, όπως πχ. στην αθηροσκλήρωση και την καρδιακή ανεπάρκεια. 9

10 SUMMARY 10

11 The Smooth Muscle Cell (SMC) Phenotype is characterized by important plasticity and it plays crucial functional role in physiological and pathological conditions. Modulation of SMC Phenotype in arteries is a key etiological feature of some major human pathologies, including atherosclerosis, hypertension and vessel restenosis. Expression of SMCs marker-genes is also important in chronic diseases of other organs, such as in kidney or hepatic fibrosis and in cancer metastasis. So, study of the molecular mechanisms which affect SMC phenotype is necessary in order to develop new therapeutic approaches to combat to these diseases. Function of many tissues such as the vasculature is regulated by the sympathetic nervous system. The aim of this study was first, to examine in vitro whether the stimulation of alpha (α) and beta (β) adrenergic receptors (ARs) can control the expression of SMCs marker-genes in vitro and in case it did, to probe the molecular mechanisms via which α1-ars (subtypes α1a and α1b) and β-ars affect and regulate SMC Phenotype. Secondly, we wanted to investigate if the exogenous expression of Myocardin can cause Epithelial to Mesenchymal Transition (ΕΜΤ)-like changes in endothelial cells in vitro. For our experiments, we used two different cell populations : a) A7r5, which are differentiated Smooth Muscle Cells isolated from rat embryonic aorta, and b) ΝΙΗ3Τ3, mouse fibroblasts, in order to examine how stimulation of ARs modulates the expression of these marker-genes in differentiated SMCs (A7r5) and in mesenchymal cells which can convert to SMCs (ΝΙΗ3Τ3), respectively. As a marker for the expression of SMC Phenotype, we monitored the expression of cytoskeletal, structural protein-markers, such as Smooth Muscle-α-Actin (SM-α-Actin), SM-Myosin Heavy Chain (SM-MHC), h1-calponin (SM-Calponin) and SM22α (transgelin) at two levels: a) using specific antibodies or b) using reporter plasmids in which the minimal promoters of the above genes drive luciferase gene transcription and hence activity. The coordinate transcriptional activation of these genes is, in major part, regulated by the function of CArG boxes in their promoters, which bind Serum Response Factor (SRF). In SMCs, SRF mediates its transcriptional effects via essential complex formation with members of the Myocardin family, which includes Myocardin (Myocd), Myocardin-Related Transcription Factor-A (MRTF-A) and MRTF-B. In our study, we initially noticed that these two cell populations do not express α1-ars (subtypes α1α and α1β) endogenously, but when we transfect them with the plasmids expressing α1α and α1β ARs, the cells respond to α1-ars agonist stimulation. In addition, we discovered that A7r5 cells express endogenous β-ars. From our experiments, we concluded that these receptors can modulate SMC Phenotype in distinct way. This depends on both the specific subtype of receptor as well as on the cellular background (cell type). More specific, we observed that in A7r5 cells: a) activation of α1a-ars by phenylephrine induces the expression of all four marker-genes at a transcriptional and at a protein level, b) activation of the SM22α minimal promoter by α1a-ars depends on CΑrG boxes, while activation of the SM-Calponin minimal promoter does not depend on the presence of CΑrG boxes, c) activation of α1b-ars induces the transcriptional activity of the minimal promoters of SM22α and SM-Calponin but does not affect the transcriptional activity of the minimal promoter of SM-α-Αctin and SM-MHC, d) activation of both the SM22α and the SM- Calponin minimal promoters by α1b-ars depends on the presence of CΑrG boxes, e) on the contrary, β-ars affect the transcription of SMCs marker-genes in an opposite way to α1-ars 11

12 reducing the transcriptional activity of the minimal promoters of SM-Calponin, SM-α-Αctin and SM- MHC genes, without affecting the transcriptional activity of the SM22α promoter. Additionally, we noticed that in ΝΙΗ3Τ3 cells: a) α1α-ars induce transcriptional activity of minimal promoters of SMC marker-genes, b) activation of minimal promoters of SM22α and SM-Calponin by α1a-ars does not depend on CΑrG boxes, c) activation of α1b-ars induce the transcriptional activity of the minimal promoters of SM22α, SM-Calponin και SM-MHC but does not affect the transcriptional activity of the minimal promoter of SM-α-Αctin. Based on the above findings, we conclude that: 1) Stimulation of α1-ars drives an increased expression of SMC marker genes and consequently α1-ars function, at least in vitro, as factors which have the ability to induce/maintain the SMC Phenotype. 2) The activity of α1-ars depends variably on the presence of CArG boxes (SREs) and differs between these minimal promoters. In essence, different promoters use their CArG boxes in a different way. This is in support of the hypothesis that combinational use of transcriptional factors is essential for «plastic» expression of the SMC Phenotype. 3) The two subtypes of α1-ars examined, α1α and α1β, display obvious differences in stimulating SM-specific gene expression and consequently these subtypes may play different functional role in vessels and in other tissues in which they are expressed. 4) On the contrary, β-ars inhibit the expression of SMC marker-genes. Therefore, the final result of vascular sympathetic stimulation would depend on the combined action of α και β ARs. This action will differ in different vessels, depending on the relative expression of these receptors and their subtypes. In addition, adenoviral expression of Myocardin in human umbilical vein endothelial Cells (HUVECs) induced phenotypic alterations, evidenced by morphological changes and by de novo expression of SM-α-Αctin and SM-Calponin at the protein level. These observations are compatible with an Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), a process which plays an important role in embryogenesis, tissue and organs formation and angiogenesis, but also participates, in fibrosis and cancer metastasis. Consequently, vascular endothelial cells can undergo in EMT and may contribute in cellular differentiation and in tissue formation. We conclude that the expression of Myocardin is sufficient to cause EMT-like changes in human endothelial cells. This may lead to cellular trans-differentiation and contribution of these cells in active tissue remodeling such as in atherosclerosis and in cardiac failure. 12

13 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13

14 1.1 Το Καρδιαγγειακό Σύστημα Το καρδιαγγειακό σύστημα περιλαμβάνει την καρδιά και δύο επιμέρους «κυκλώματα» του αίματος : 1) της πνευμονικής κυκλοφορίας, που μεταφέρει το αίμα από και προς τους πνεύμονες, όπου γίνεται η ανταλλαγή αερίων και 2) της συστηματικής κυκλοφορίας, με το οποίο το αίμα κατανέμεται σε όλους τους ιστούς του σώματος. Τα δύο αυτά κυκλώματα αποτελούνται από αρτηρίες, τριχοειδή αγγεία και φλέβες. Οι αρτηρίες είναι μία σειρά από αιμοφόρα αγγεία, που μεταφέρουν το αίμα από την καρδιά προς την περιφέρεια, συνεχώς διακλαδιζόμενες σε αγγεία μικρότερης διαμέτρου, με τελική διαίρεση τα τριχοειδή που αρδεύουν όλες τις περιοχές του σώματος με αίμα. Τα τριχοειδή είναι τα αγγεία με το λεπτότερο τοίχωμα, τη μικρότερη διάμετρο και σχηματίζουν δίκτυα όπου γίνεται η ανταλλαγή αερίων, θρεπτικών συστατικών, ορμονών, μεταβολικών προϊόντων και σηματοδοτικών μορίων μεταξύ αίματος και ιστών, λειτουργία ουσιώδης για τη διατήρηση της φυσιολογικής μεταβολικής δραστηριότητας και της ομοιόστασης των ιστών. Τέλος, οι φλέβες αποτελούν τα αγγεία, που παροχετεύουν το αίμα από το δίκτυο των τριχοειδών αγγείων σε αγγεία ολοένα και μεγαλύτερης διαμέτρου, επιστρέφοντάς το τελικά στην καρδιά (Junqueira et al., 2005, Pugsley et al., 2000) Το τοίχωμα των αγγείων Σε γενικές γραμμές, τα αγγεία στην πλειοψηφία τους έχουν κοινά χαρακτηριστικά. Ωστόσο, παρατηρούνται ορισμένες διαφοροποιήσεις, οι οποίες αποτελούν και τη βάση για την κατάταξη των αγγείων σε συγκεκριμένες κατηγορίες. Τα τοιχώματα των αγγείων που δέχονται υψηλές πιέσεις (όπως οι υποκλείδιες αρτηρίες) είναι παχύτερα από αυτά που μεταφέρουν αίμα με χαμηλή πίεση (όπως οι υποκλείδιες φλέβες). Η διάμετρος των αρτηριών ελαττώνεται σε κάθε διακλάδωση, η διάμετρος των φλεβών αυξάνει μετά από κάθε σύγκλιση, μεταβάλλοντας επομένως και τα αντίστοιχα στρώματα του τοιχώματος των αγγείων. Συνεπώς, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο το πάχος του τοιχώματος για τη διάκριση συγκεκριμένων αρτηριών από φλέβες, καθώς η σύγκριση δεν είναι απόλυτη. Αντίθετα, τα τοιχώματα των τριχοειδών και των φλεβιδίων παρουσιάζουν ιδιαιτερότητες και είναι λιγότερο πολύπλοκα από αυτά των μεγαλύτερων αγγείων, γεγονός που τα καθιστά εύκολα διακριτά. Γενικά, πάντως, οι αρτηρίες διαθέτουν παχύτερο τοίχωμα και μικρότερη διάμετρο από τις αντίστοιχες φλέβες (Junqueira et al., 2005, Pugsley et al, 2000, Ross et al., 2006). Ιστολογική δομή των αιμοφόρων αγγείων Τα αγγεία αποτελούνται από τρία ξεχωριστά στρώματα (χιτώνες-tunics), (εικόνα 1-1). Στο εσωτερικό του αγγείου βρίσκεται ο έσω χιτώνας (tunica intima), ο οποίος αποτελείται από μονή στοιβάδα πεπλατυσμένων, πλακωδών ενδοθηλιακών κυττάρων που σχηματίζουν ένα σωλήνα ο οποίος επενδύει τον αυλό του αγγείου. Το μεσαίο στρώμα, ο μέσος χιτώνας (tunica media), αποτελείται κυρίως από λεία μυϊκά κύτταρα με ομόκεντρη διάταξη γύρω από τον αυλό του αγγείου. Το εξωτερικό στρώμα, ο έξω χιτώνας (tunica adventitia) αποτελείται κυρίως από ινοελαστικό ιστό με επιμήκη προσανατολισμό. 14

15 Εικόνα 1-1 : Σχηματική απεικόνιση της ιστολογικής δομής των αιμοφόρων αγγείων. 1.2 Φαινοτυπική πλαστικότητα Τα ΑΛΜΚ (αγγειακά λεία μυΐκά κύτταρα) σε ώριμα ζώα είναι πολύ εξειδικευμένα κύτταρα τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη συστολή και στη ρύθμιση του τόνου και της διαμέτρου των αγγείων, στη ρύθμιση της πίεσης του αίματος και της αιματικής ροής. Τα ΛΜΚ στα αιμοφόρα αγγεία των ενηλίκων πολλαπλασιάζονται με εξαιρετικά πολύ αργό ρυθμό, παρουσιάζουν χαμηλή σύνθεση πρωτεϊνών και εκφράζουν ένα μοναδικό σύνολο συσταλτικών πρωτεϊνών, ιοντικών διαύλων και σηματοδοτικών μορίων που είναι απαραίτητα για τη συσταλτική λειτουργία τους. Η πρωτεϊνική έκφραση για τα ΑΛΜΚ είναι μοναδική σε σχέση με τα άλλα είδη κυττάρων. Σε αντίθεση με τα σκελετικά και τα καρδιακά μυϊκά κύτταρα τα οποία είναι πλήρως διαφοροποιημένα, τα ΑΛΜΚ στους ενήλικους ιστούς χαρακτηρίζονται από σημαντική πλαστικότητα και υφίστανται αλλαγές στο φαινότυπο τους ως απόκριση σε χημικά και μηχανικά ερεθίσματα και αλλαγές του τοπικού τους περιβάλλοντος (εικόνα 1-2). Εικόνα 1-2 : Η διαφοροποίηση του αγγειακού λείου μυϊκού κυττάρου (ΑΛΜΚ) εμφανίζει σημαντική 15

16 πλαστικότητα και εξαρτάται από διάφορα ερεθίσματα που δέχεται το τοπικό τους περιβάλλον. Μετά την ωρίμανση των αιμοφόρων αγγείων, τα ΑΛΜΚ αποκτούν ένα «συσταλτό» (φυσιολογικό), διαφοροποιημένο φαινότυπο, που χαρακτηρίζεται από την έκφραση ειδικών για τα λεία μυϊκά κύτταρα γονιδίων-δεικτών. Αυτά περιλαμβάνουν τις διάφορες λείες μυϊκές ισομορφές των πρωτεϊνών της συσταλτικής συσκευής λείου μυϊκού τύπου άλφα ακτίνη (SM-α-Actin), λείου μυϊκού τύπου βαριά αλυσίδα της μυοσίνης (SM-Myosin Heavy Chain), καλπονίνη (SM-Calponin), και SM22α και άλλες πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού όπως είναι η καλδεσμόνη (h-caldesmon), η ACLP (Aortic Carboxypeptidase-Like Protein), η δεσμίνη (desmin), η smoothelin, η μεταβινκουλίνη (metavinkulin) και η τελοκίνη (telokin). Οι παραπάνω πρωτεΐνες είναι πολύ σημαντικές για τη ρύθμιση της συστολής. Τα γονίδια-δείκτες που έχουν μελετηθεί περισσότερο όσον αφορά στον καθορισμό του λείου μυϊκού φαινότυπου είναι τα SM-α-Actin, SM-Calponin, SM22α και SM-MHC (Owens et al., 2004). Όταν τα αγγεία υποστούν βλάβη, όπως μετά από αγγειοπλαστική, τοποθέτηση ενδοπροθέσεων (stents) ή εγχειρήσεις παράκαμψης (bypass), τα ΑΛΜΚ αποδιαφοροποιούνται και εισέρχονται ξανά στον κυτταρικό κύκλο. Στην περίπτωση αυτή παρατηρείται αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης τους, καθώς επίσης και αύξηση της σύνθεσης συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας από τα ΑΛΜΚ. Παράλληλα παρατηρείται μείωση της έκφρασης των γονιδίων-δεικτών που χαρακτηρίζουν το συσταλτό-φυσιολογικό λείο μυϊκό φαινότυπο. O αποδιαφοροποιημένος αυτός συνθετικός φαινότυπος των ΑΛΜΚ παίζει σπουδαίο παθοφυσιολογικό ρόλο στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης και της επαναστένωσης μετά από αγγειοπλαστική, αλλά και της αρτηριακής υπέρτασης (Owens et al., 2004, Owens et al., 1995) Ρόλος της πλαστικότητας του ΛΜΦ σε φυσιολογικές καταστάσεις Χαρακτηριστικό παράδειγμα της πλαστικότητας των ΛΜΚ παρατηρείται κατά τη διάρκεια της αγγειακής ανάπτυξης όπου τα ΛΜΚ παίζουν σημαντικό ρόλο στην μορφογένεση των αιμοφόρων αγγείων. Στην περίπτωση αυτή, αρχικά τα ΑΛΜΚ βρίσκονται σε λιγότερο διαφοροποιημένη κατάσταση και παρατηρείται αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού και μετανάστευσής τους και αύξηση της σύνθεσης εξωκυττάριου υλικού όπως κολλαγόνου, ελαστίνης και πρωτεογλυκανών τα οποία αποτελούν σημαντικό μέρος του αγγειακού τοιχώματος. Αφού ολοκληρωθεί η ανάπτυξη των αγγείων, τα ΛΜΚ διαφοροποιούνται στο «συσταλτό» φαινότυπο και αναλαμβάνουν τη δυνατότητα και τη λειτουργία της συστολής. Ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των ΑΛΜΚ θεωρούνταν μέχρι πρόσφατα αντιτιθέμενες και αλληλοεξαρτώμενες διαδικασίες, κυρίως διότι μία τέτοια εξάρτηση παρατηρείται συχνά σε καλλιέργειες ΛΜΚ in vitro. Πολλοί θεωρούσαν (και ακόμα και σήμερα λανθασμένα θεωρούν) ότι για τον πολλαπλασιασμό των ΑΛΜΚ απαραίτητη προϋπόθεση ήταν η αρχική απώλεια των δεικτών διαφοροποίησης των ΑΛΜΚ. Παρόλα αυτά όμως, με σύγχρονα δεδομένα η διαφοροποίηση και ο πολλαπλασιασμός δε θεωρούνται πλέον αναγκαστικά αντιτιθέμενες διαδικασίες. Για παράδειγμα, κατά την όψιμη εμβρυογένεση και τη μεταγεννητική ανάπτυξη, παρατηρείται αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των ΑΛΚΜ και παράλληλη επαγωγή πολλών γονιδίων-δεικτών διαφοροποίησης των ΑΛΜΚ. Επίσης, σε αθηρωματικές βλάβες στα ΑΛΜΚ σε ανθρώπινα δείγματα η σε ανώτερα ζωικά πρότυπα (χοίροι, μαϊμούδες) παρατηρείται πολύ χαμηλός ρυθμός πολλαπλασιασμού, όπως συμβαίνει και στην περίπτωση των πλήρως διαφοροποιημένων ΑΛΜΚ, αλλά τα κύτταρα αυτά έχουν υποστεί σημαντική φαινοτυπική τροποποίηση, όπως φαίνεται από τη μειωμένη έκφραση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το συσταλτό-φυσιολογικό ΛΜΦ. Επομένως, η αναστολή του πολλαπλασιασμού και μόνο δεν είναι αρκετή για να προωθήσει τη διαφοροποίηση των ΑΛΜΚ 16

17 (Cook et al., 1994, Au et al., 1993, O Brien et al., 1993, Owens et al., 2004) Ρόλος της πλαστικότητας του ΛΜΦ σε παθολογικές καταστάσεις Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως τα ΑΛΜΚ ανταποκρίνονται σε περιβαλλοντικές αλλαγές προσαρμόζοντας το φαινότυπό τους από συσταλτό-φυσιολογικό σε συνθετικό-παθολογικό, φαινόμενο που είναι γνωστό ως μετατροπή του λείου μυϊκού φαινότυπου. Τα ΑΛΜΚ πολλαπλασιάζονται σπάνια κάτω υπό φυσιολογικές συνθήκες σε ενήλικους ιστούς αλλά μπορούν να υποστούν φαινοτυπικές αλλαγές (αύξηση των ρυθμών πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης και αυξημένη παραγωγή εξωκυττάριας ύλης) από το συσταλτό στο συνθετικό φαινότυπο σε περιπτώσεις ασθενειών όπως της υπέρτασης, της αθηροσκλήρωσης και της επαναστένωσης του αγγείου μετά από αγγειοπλαστική Μεταβολές στο φαινότυπο των ΑΛΜΚ κατά την αθηροσκλήρωση Η αθηροσκλήρωση είναι μία πολύπλοκη ασθένεια του αγγειακού τοιχώματος, η οποία χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση λιπιδικών αποθεμάτων και αποθεμάτων χοληστερόλης μέσα στα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων. Επιπλέον, χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό και εναπόθεση της εξωκυττάριας ύλης από φαινοτυπικώς διαφοροποιημένα ΛΜΚ σε σημεία που εκδηλώνεται η βλάβη (Schwarz and Murry, 1998). Κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης επάγεται λοιπόν ο αποδιαφοροποιημένος φαινότυπος των ΑΛΜΚ. Η αποδιαφοροποίηση των ΑΛΜΚ συμβαίνει μετά την έκθεση σε διάφορους αυξητικούς παράγοντες και φλεγμονώδεις μεσολαβητές που απελευθερώνονται από ενεργοποιημένα μακροφάγα ως αποτέλεσμα της έκθεσης σε οξειδωμένη LDL. Η δημιουργία αθηρωματικών πλακών περιλαμβάνει τη μετακίνηση των ΑΛΜΚ από το μέσο χιτώνα στον έσω χιτώνα. Κατά την αθηρογένεση τα ΑΛΜΚ που μεταναστεύουν στο εσωτερικό στρώμα του αρτηριακού τοιχώματος (tunica intima) πολλαπλασιάζονται ως απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες, όπως πχ. στον αυξητικό παράγοντα PDGF (platelet-derived growth factor). Στη θέση αυτή πλεόν τα ΑΛΜΚ παράγουν μόρια εξωκυττάριου υλικού όπως κολλαγόνο και ελαστίνη και δημιουργούν μία ινώδη κάψα η οποία καλύπτει την αθηρωματική πλάκα (Libby et al., 2011). Η IFN-γ (φλεγμονώδης διαμεσολαβητής) η οποία απελευθερώνεται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα που βρίσκονται στην περιοχή της αθηρωματικής πλάκας, επίσης επάγει τη σύνθεση κολλαγόνου από τα ΑΛΜΚ, γεγονός πολύ σημαντικό για τη σταθεροποίηση της ινώδους κάψας. Εκτός από αυτά, τα ΑΛΜΚ, αλλά και τα μακροφάγα, απελευθερώνουν και ένζυμα όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας ουσίας (MMPs), μόρια τα οποία είναι ικανά να αποσταθεροποιήσουν την πλάκα, με αποτέλεσμα τη ρήξη της ινώδους κάψας και την αρτηριακή θρόμβωση (Shah, 1995, Owens, 2004). 17

18 Εικόνα 1-3 : Διαδικασία δημιουργίας αθηρωματικών πλακών (Libby et al., 2011) Μεταβολές στο φαινότυπο των ΑΛΜΚ κατά την επαναστένωση Κατά τη διαδικασία της επαναστένωσης, όπως παρατηρείται και στην αθηροσκλήρωση, μετά από τη βλάβη του αγγειακού τοιχώματος τα ΑΛΜΚ αποδιαφοροποιούνται με αποτελέσμα ο φαινότυπός τους να μετατρέπεται από το συσταλτό-φυσιολογικό σε συνθετικό-παθολογικό. Στους παράγοντες που επάγουν τον αποδιαφοροποιημένο φαινότυπο των ΑΛΜΚ συμπεριλαμβάνονται η απογύμνωση του ενδοθηλίου, ο άμεσος τραυματισμός των ΑΛΜΚ και η επακόλουθη απελευθέρωση πολλών αυξητικών παραγόντων. Μετά την αποδιαφοροποίηση, τα ΛΜΚ μεταναστεύουν στον υποενδοθηλιακό χώρο, όπου πολλαπλασιάζονται και εκκρίνουν άφθονες ποσότητες εξωκυττάριας ουσίας. Τα φαινοτυπικώς τροποποιημένα ΛΜΚ που ευθύνονται κυρίως για την επαναστένωση, αποτελούν στόχο ενδοπροθέσεων (stents) οι οποίες είναι εμποτισμένες με μόρια που καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων αυτών (Owens et al., 2004). Εικόνα 1-4 : Επαναστένωση αυλού μετά από επέμβαση αγγειοπλαστικής. 18

19 1.3 Ρύθμιση του φαινοτύπου των ΑΛΜΚ Μηχανισμοί ρύθμισης του φαινοτύπου των ΛΜΚ Ο ρόλος της εξωκυττάριας ύλης στη ρύθμιση του ΛΜΦ Τα στοιχεία του εξωκυττάριου υλικού των αιμοφόρων αγγείων είναι γνωστά ως συστατικά του συνδετικού ιστού και περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τις ίνες κολλαγόνου και τις ελαστικές ίνες. Τα στοιχεία αυτά συνεισφέρουν σε σημαντικό βαθμό στη διατήρηση της αγγειακής ομοιόστασης. Τα μακρομόρια του κολλαγόνου και της ελαστίνης ασκούν πολλαπλές δράσεις, όπως για παράδειγμα διαμορφώνουν το σκελετό πάνω στον οποίο εναποτίθενται τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα λεία μυϊκά κύτταρα, χρησιμεύουν στη μεταφορά σημάτων, δεσμεύουν και κατακρατούν λιποπρωτεΐνες και αποτελούν δεξαμενή αυξητικών παραγόντων. Επιπλέον το κολλαγόνο και η ελαστίνη συμβάλλουν στη δύναμη και τη δομική ακεραιότητα του αγγειακού τοιχώματος. Σε φυσιολογικούς ιστούς, η έκφραση και αναδιοργάνωση του εξωκυττάριου υλικού αποτελεί μία καλά ρυθμισμένη δυναμική ισορροπία. Αντίθετα σε παθολογικές καταστάσεις, όπως στην αθηροσκλήρωση και στην ίνωση η παραπάνω ισορροπία διαταράσσεται ευνοώντας έτσι την εξέλιξη και την κλινική εκδήλωση των παραπάνω διαταραχών. Ο φαινότυπος λοιπόν των ΑΛΜΚ μπορεί να επηρεαστεί από συστατικά της εξωκυττάριας ύλης. Η πρόσδεση συγκεκριμένων μορίων της εξωκυττάριας ύλης μπορεί να έχει κάποιο βιοχημικό αποτέλεσμα στη λειτουργία του κυττάρου εξαιτίας της σηματοδότησης μέσω ιντεγκρινών. Εκτός από αυτό, η παρουσία βιοχημικών ερεθισμάτων στο περιβάλλον του κύτταρου μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία του. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι υποδοχείς διαλυτών προσδεμάτων (π.χ. υποδοχείς αυξητικών παραγόντων όπως EGF, TGF-β) αλληλεπιδρούν με ιντεγκρίνες που συνδέονται με την εξωκυττάρια ύλη, με αποτέλεσμα τη συνομιλία (crosstalk) μεταξύ σηματοδοτικών μονοπατιών και την επακόλουθη τροποποίηση της απόκρισης του κυττάρου (Ross et al., 2004). Σε μελέτες που πραγματοποιήθηκαν πρόσφατα αποδείχθηκε πως πολλά συστατικά της εξωκυττάριας ύλης εμπλέκονται στις αλλαγές του φαινότυπου των ΛΜΚ. Υποστρώματα που περιέχουν φιμπρονεκτίνη (fibronectin) και κολλαγόνο τύπου Ι επάγουν τη μετατροπή προς το συνθετικό φαινότυπο και τον πολλαπλασιασμό των ΛΜΚ, ενώ η υμενίνη και το κολλαγόνο τύπου ΙV προκαλεί το αντίθετο αποτέλεσμα, επάγοντας το συσταλτό φαινότυπο, δηλ., το διαφοροποιημένο φαινότυπο των ΛΜΚ (Mack, 2011). Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω κατά τη μετατροπή του φυσιολογικού-συσταλτού φαινότυπου των ΛΜΚ σε συνθετικό παρατηρούνται μορφολογικές αλλαγές, αλλαγές στην έκφραση ειδικών για τα ΛΜΚ γονιδίων-δεικτών, αλλαγές στην παραγωγή εξωκυττάριας ύλης αλλά και αλλαγές στην έκφραση πρωτεϊνών απαραίτητων για την προσκόλληση και την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων. Οι υποδοχείς προσκόλλησης της εξωκυττάριας ύλης στα κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στη σύνδεση του κυτταροσκελετού με τα συστατικά της εξωκυττάριας ύλης κάτι το οποίο επηρεάζεται άμεσα κατά τη διαφοροποίηση των ΛΜΚ (εικόνα 1-5), (Moiseeva, 2001). 19

20 Εικόνα 1-5 : Μεταβολές στην έκφραση των υποδοχέων προσκόλλησης της εξωκυττάριας ύλης στα κύτταρα κατά τη μετατροπή του φαινότυπου των ΛΜΚ από το συσταλτό στο συνθετικό (Moiseeva, 2001). Οι ιντεγκρίνες είναι οι κυριότεροι υποδοχείς της εξωκυττάριας ύλης και λειτουργούν ως διαμεμβρανικοί σύνδεσμοι μεταξύ εξωκυττάριας ύλης και κυτταροσκελετού της ακτίνης. Αποτελούναι από τις υπομονάδες α και β. Οι ιντεγκρίνες α1β1 και α7β1 σχετίζονται με το διαφοροποιημένο φαινότυπο των ΛΜΚ. Επιπλέον και στις δύο αυτές ιντεγκρίνες προσδένεται η υμενίνη η οποία εμπλέκεται στη διατήρηση του συσταλτού φαινότυπου. Αντίθετα η ιντεγκρίνη α4β1, στην οποία προσδένεται η φιμπρονεκτίνη, εκφράζεται στο συνθετικό φαινότυπο. Εκτός από τις ιντεγκρίνες βασικό ρόλο στη σταθερότητα της κυυταρικής μεμβράνης κατά τη συστολή των ΑΛΜΚ παίζει το μόριο DGPC (Dystrophin Glycoprotein Complex). Στις συνδεκάνες προσδένονται παράγοντες όπως οι EGF, FGF και VEGF και μέσω αυτών, σηματοδοτούν μονοπάτια ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού των ΛΜΚ. Τέλος η έκφραση των υποδοχέων προσκόλλησης VCAM και ICAM παρατηρείται μόνο σε παθολογικές καταστάσεις όπως στην περίπτωση της αθηροσκλήρωσης (Moiseeva, 2001) Μεταγραφική ρύθμιση του φαινοτύπου των ΑΛΜΚ Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω τα ΑΛΜΚ προσφέρουν ρόλο «στήριξης» στα αιμοφόρα αγγεία του αγγειακού συστήματος και ελέγχουν την πίεση του αίματος και την αιματική ροή. Τα διαφοροποιημένα ΛΜΚ εκφράζουν πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού όπως η SM-α-Ακτίνη, η SM- Καλπονίνη, η SM22α και η βαριά αλυσίδα της Μυοσίνης (SM-MHC), πρωτεΐνες οι οποίες χαρακτηρίζουν το συσταλτό-φυσιολογικό ΛΜΦ. Ένα σημαντικό βήμα για την έκφραση των γονιδίων που χαρακτηρίζουν το ΛΜΦ είναι η πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα SRF (Serum Response Factor) σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA που βρίσκονται στους υποκινητές και ονομάζονται στοιχεία CArG. Ο παράγοντας SRF εκφράζεται παντού. Ονομάστηκε έτσι λόγω της ικανότητάς του να μεταβιβάζει την ανταπόκριση του γονιδίου c- fos στον ορό. Το πρότυπο της ακολουθίας των στοιχείων CArG είναι το CC(A/T-rich) 6 GC και είναι αρκετά συντηρημένο (Mack, 2011). Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ είναι παρόμοια μεταξύ των διαφόρων υποτύπων ΛΜΚ. Παρόλα αυτά όμως τα ΑΛΜΚ διακρίνονται σε μοριακό επίπεδο από το πλεονέκτημα της ύπαρξης διακριτών cis-ρυθμιστικών στοιχείων και αποτελούμενων από υπομονάδες ρυθμιστικών περιοχών για τον έλεγχο της έκφρασης αυτών των γονιδίων. Επομένως η έκφραση τουλάχιστον ορισμένων από τους δείκτες διαφοροποίησης των ΛΜΚ ελέγχεται από διαφορετικούς μηχανισμούς σε διαφορετικούς υποτύπους ΛΜΚ (Yoshida et al., 20

21 2005). Η πλειονότητα των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ που αναφέρονται παραπάνω ρυθμίζονται από αυτές τις αλληλουχίες CArG και συνεπώς και από τον SRF, και μετάλλαξη αυτών των αλληλουχιών του υποκινητή μειώνει ή καταστέλλει την έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων τόσο in vivo όσο και in vitro. Σε διάφορα συστήματα διαφοροποίησης των ΛΜΚ που έχουν μελετηθεί, τα επίπεδα του SRF από μόνα τους δε φαίνεται να είναι ικανός παράγοντας για την επαγωγή ή τη διατήρηση της έκφρασης των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ. Αυτό ρυθμίζεται από την ικανότητα του SRF να δημιουργεί σύμπλοκα με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες (ειδικούς για τα ΛΜΚ) και στη συνέχεια τα σύμπλοκα αυτά να προσδένονται στα στοιχεία CArG και να ενεργοποιούν τη μεταγραφή των υποκινητών των ειδικών για τα ΛΜΚ γονιδίων-δεικτών (Owens et al., 2004). Η μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων-δεικτών που εμπλέκονται στον έλεγχο του φαινότυπου των ΑΛΜΚ δεν είναι απόλυτα γνωστή. Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες και ρυθμιστικά στοιχεία έχει αποδειχθεί πως συμβάλλουν στη ρύθμιση του φαινοτύπου των ΑΛΜΚ. Εικόνα 1-6 : Χαρακτηριστικά φυσιολογικού-συσταλτού και συνθετικού Λείου Μυϊκού Φαινότυπου. Η οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων GATA αποτελείται από μέλη που περιέχουν περιοχές πρόσδεσης στο DNA τύπου δακτυλίου ψευδαργύρου. Οι παράγοντες GATA-4/5/6 παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του καρδιαγγειακού συστήματος. Ο παράγοντας GATA-6 είναι το μόνο μέλος αυτής της οικογένειας που εκφράζεται στα διαφοροποιημένα ΑΛΜΚ και παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του φαινότυπου μετά από τραυματισμό του αγγείου (Yin et al., 2004). Ο παράγοντας αυτός έχει αποδειχθεί ότι σχηματίζει ένα διακριτό και σταθερό σύμπλοκο με τον παράγοντα SRF και με τα στοιχεία CArG (Owens et al., 2004). Για παράδειγμα δύο πρωτεΐνες πλούσιες σε κυστεΐνες, οι Crp1 και Crp2, λειτουργούν ως πρωτεΐνες-γέφυρες που προωθούν τη δημιουργία του συμπλόκου GATA-SRF και ακολούθως την πρόσδεσή του στα στοιχεία CArG. Συνεπώς ο παράγοντας GATA επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ (Mark W. Majesky, 2003). Επίσης σε πείραμα που πραγματοποιήθηκε σε αρουραίους, ως απόκριση σε αγγειακό τραυματισμό, μειώθηκε η έκφραση του παράγοντα GATA-6 επιτρέποντας τα ΑΛΜΚ να αποδιαφοροποιηθούν και να πολλαπλασιαστούν έτσι ώστε να επιδιορθωθεί το αγγείο (Iyemere et al., 2006). Σε πειραματόζωα (αρουραίους), μετά από βλάβη της καρωτίδας από καθετήρα με μπαλόνι, τα ΑΛΜΚ αποδιαφοροποιούνται στο συνθετικό φαινότυπο, κατάσταση που σχετίζεται με 21

22 μειωμένη έκφραση του παράγοντα GATA-6 και ελαττωμένη πρόσδεση του στο DNA. Υπερέκφραση του παράγοντα με αδενοϊούς προλαμβάνει την αποδιαφοροποίηση ενώ περιορίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αυξάνει την έκφραση πρωτεϊνικών δεικτών διαφοροποίησης των ΛΜΚ, ενώ επηρεάζει θετικά την αναδιαμόρφωση του αρτηριακού τοιχώματος (Lepore, 2004). Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω για να μπορέσει να δράσει ο μεταγραφικός παράγοντας SRF χρειάζεται οπωσδήποτε τη συνέργεια άλλων μεταγραφικών παραγόντων. Ένας μεταγραφικός παράγοντας που γνωρίζουμε ότι συμπλοκοποιείται με τον SRF είναι η Μυοκαρδίνη και δύο ακόμη μέλη της οικογένειας των Μυοκαρδινών, τα MRTF-A και MRTF-B (Parmacek et al., 2007, Chen et al., 2002). Η Μυοκαρδίνη είναι ένας εξαιρετικά ισχυρός συν-ενεργοποιητής του SRF και εκφράζεται στα ΛΜΚ in vivo και βρίσκεται στο εσωτερικό του πηρύνα. Έμβρυα ποντικών ομόζυγα για μετάλλαξη στη Μυοκαρδίνη οδηγεί σε έλλειψη της λειτουργίας της και τα ποντικάκια αυτά πεθαίνουν μέχρι την εμβρυική μέρα 10,5 και δεν παρουσιάζουν κανένα σημάδι διαφοροποίησης των ΑΛΜΚ (Mack, 2011, Li et al., 2003,). Τα άλλα 2 μέλη της οικογένειας των Μυοκαρδινών, MRTF- A και MRTF-B, εκφράζονται σε διάφορα είδη κυττάρων και βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Για να επάγουν όμως τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ απαιτείται η μεταφορά τους στο εσωτερικό του πηρύνα μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού που καθορίζεται απο την κινάση Rho και την ισορροπία μεταξύ F και G ακτίνης (Miralles et al., 2003). Στην περίπτωση του συσταλτού-φυσιολογικού ΛΜΦ ο παράγοντας SRF συμπλοκοποιείται με τη Μυοκαρδίνη και στη συνέχεια το σύμπλοκο αυτό προσδένεται σε cis-ρυθμιστικά στοιχεία του DNA που ονομάζονται στοιχεία CArG τα οποία βρίσκονται στους υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που χαρακτηρίζουν το συσταλτό φαινότυπο των ΑΛΜΚ και επάγεται η μεταγραφή τους (Mack, 2011, 2011, Owens et al., 2004, Chen et al., 2002). Επίσης ο SRF προσδένεται στα στοιχεία CArG που βρίσκονται στους υποκινητές γονιδίων που επάγονται από τον ορό και ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως το γονίδιο c-fos. Με την ανακάλυψη της Μυοκαρδίνης ως βασικού συμπαράγοντα για τα ΑΛΜΚ, κατέστη σαφές πως ο SRF και τα CArG στοιχεία είναι δυνατό να μεσολαβούν στην εκδήλωση δύο διαφορετικών προτύπων γονιδιακής έκφρασης (εικόνα 1-7), (Parmacek et al., 2007, Yoshida et al., 2005). Εικόνα 1-7 : Απλοποιημένο μοντέλο που δείχνει τους πιθανούς μηχανισμούς ενεργοποίησης και καταστολής γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ που εξαρτώνται από το σύμπλεγμα CArG-SRF-Μυοκαρδίνης που συμβάλλει μέσω διαφόρων διαδικασιών στη φαινοτυπική ποικιλότητα των ΛΜΚ και στη φαινοτυπική μετατροπή ως 22

23 απάντηση σε αγγειακή βλάβη ή πάθηση. (Α) Η αγγειοτενσίνη ΙΙ και άλλοι αγωνιστές της συστολής μπορούν να ενεργοποιήσουν την έκφραση γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ μέσω αύξησης της συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου Ca 2+ και ακόλουθης αύξησης στην έκφραση της Μυοκαρδίνης. Ακόμη, η επαγόμενη από την αγγειοτενσίνη ΙΙ ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ εξαρτάται και από την πρωτεΐνη Prx1, η οποία αυξάνει την πρόσδεση του SRF στα συντηρημένα στοιχεία CArG στους υποκινητές των περισσότερων γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ. (Β) Η επαγόμενη από τον PDGF-BB φαινοτυπική μετατροπή των ΑΛΜΚ πραγματοποιείται με τη μεσολάβηση πολλών μηχανισμών, που περιλαμβάνουν ενεργοποίηση των Εlk-1 και εξαρτώμενη από τον KLF4, ελάττωση της έκφρασης της Μυοκαρδίνης. O αυξητικός παράγοντας PDGF-BB (παράγοντας αύξησης που παράγεται από τα αιμοπετάλια) αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της πρώιμης αγγειακής ανάπτυξης. Εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και είναι απαραίτητος παράγοντας για τον πολλαπλασιασμό των περικυττάρων και των ΛΜΚ τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και κατά την ωρίμανση του αγγειακού συστήματος. Έχει αποδειχθεί ότι επάγει τη μετατροπή του φυσιολογικού ΛΜΦ αφού αναστέλλει ισχυρά την έκφραση των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ και ταυτόχρονα ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ΛΜΚ (Mack, 2011). Ο παράγοντας PDGF-BB φαίνεται να παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του ΛΜΦ αφού έρευνες έχουν δείξει ότι η έκφραση του PDGF-BB αυξάνεται σε περίπτωση βλάβης αγγείου μετά από τραυματισμό του, ενώ αναστολή του προκαλεί μείωση της ανάπτυξης της στοιβάδας neointima. Ενεργοποίηση των υποδοχέων PDGF-β οδηγεί σε διαδοχικές φωσφορυλιώσεις των ERK1/2 και Elk-1, στη δημιουργία συμπλόκου SRF-Elk-1 και στην πρόσδεση αυτού του συμπλόκου στις ίδιες περιοχές στις οποίες προσδένεται ο SRF (CArG boxes). Η φωσφορυλίωση της Elk-1, δηλ., αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων-δεικτών του ΛΜΦ αφού αποτρέπει τη συμπλοκοποίηση της Μυοκαρδίνης με τον SRF (Mack, 2011). Για τους λόγους αυτούς το σήμα μέσω του υποδοχέα PDGF και των κινασών ERK1/2 θεωρείται βασικός μεσολαβητής της φαινοτυπικής μετατροπής των ΛΜΚ σε παθολογικές καταστάσεις (Wang et al., 2004, Mack, 2011, Owens et al., 2004, Thomas et al.). Με το μηχανισμό αυτό, η Μυοκαρδίνη και ο Εlk-1 δρούν ως απλοί μεταγραφικοί διακόπτες που μπορούν να ρυθμίσουν το διαφοροποιημένο φαινότυπο των ΛΜΚ έναντι του πολλαπλασιασμού τους (Mack, 2011). Ο ΛΜΦ καθορίζεται και από τη δημιουργία άλλων παράλληλων μεταγραφικών συμπλόκων, η δημιουργία των οποίων εξαρτάται, πχ. από το σηματοδοτικό μονοπάτι του αυξητικού παράγοντα TGF-β (Transforming Growth Factor-β). Ο TGF-β είναι μία κυτταροκίνη που ελέγχει την ανάπτυξη και τη διατήρηση των αγγείων, ρυθμίζοντας την αύξηση, τη διαφοροποίηση και τη σύνθεση του εξωκυττάριου υλικού στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα ΛΜΚ και στα λευκοκύτταρα. Επίσης επάγει την έκφραση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το συσταλτό φαινότυπο των ΛΜΚ σε διάφορους κυτταρικούς τύπους συμπεριλαμβανομένων των μεσεγχυματικών, εμβρυϊκών, ινοβλαστών και ΛΜΚ αορτής (Mack, 2011). Ο TGF-β in vitro δρώντας μέσω των TGF-β-Control Elements (TCE), τα οποία είναι αλληλουχίες που βρίσκονται στους υποκινητές των γονιδίων-δεικτών, αυξάνει την έκφραση των γονιδίωνδεικτών της διαφοροποίησης των ΛΜΚ. Αυτό πραγματοποείται μέσω ενεργοποίησης των σηματοδοτικών μορίων Smad2 και Smad3 (Lagna et al., 2007). Επομένως τα στοιχεία αυτά είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος αφού μπορούν να διαδραματίσουν ένα βασικό ρόλο στη ρύθμιση των αλλαγών της έκφρασης των γονιδίων των ΛΜΚ, στα πλαίσια των τραυματισμών των αγγείων ή της αθηροσκλήρωσης. Ο παράγοντας αυτός επάγει την πλειονότητα των δράσεών του στα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων της έκφρασης των γονιδίων των ΛΜΚ, μέσω της ενεργοποίησης των σηματοδοτικών μορίων Smad2 και Smad3, τα οποία μπορούν επίσης να δημιουργούν σύμπλοκα με τον παράγοντα της Μυοκαρδίνης (Qiu et al., 2005, Mack, 2011). Επίσης ο TGF-β μπορεί να ενισχύσει την ικανότητα του SRF να προσδεθεί στα στοιχεία CArG (Owens et al., 2004). Εκτός από αυτά, ο παράγοντας TGF-β επάγει την έκφραση των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ και μέσω ενεργοποίησης του μονοπατιού Rho-ROCK. Στην περίπτωση αυτή αρχικά, η μονομερής ακτίνη, G- 23

24 ακτίνη, πολυμερίζεται σε F-ακτίνη. Στη συνέχεια η MRTF-A ή η MRTF-B εισέρχεται στον πυρήνα και συμπλοκοποιείται με τον παράγοντα SRF. Το σύμπολοκο αυτό επάγει τη μεταγραφή των ειδικών για τα ΛΜΚ γονιδίων-δεικτών. Αυτός ο μηχανισμός παρατηρείται στην περίπτωση του έμφραγματος του μυοκαρδίου όπου ο παράγοντας MRTF-A αφού εισέλθει στον πυρήνα και δημιουργήσει σύμπλοκο με τον SRF στοχεύει στην μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών και στην έκφραση των γονιδίων-δεικτών ειδικών για ΛΜΚ, σε μυοϊνοβλάστες (ίνωση, εικόνα 1-8), (Small et al., 2010). Εικόνα 1-8 : Δράση του παράγοντα TGF-β μέσω του μονοπατιού Rho-ROCK στην περίπτωση του έμφραγματος του μυοκαρδίου (Small et al., 2010). Ένα άλλο μόριο που παίζει ρόλο στη συμπλοκοποίηση SRF-Μυοκαρδινών και την ενεργοποίηση των υποκινητών των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ είναι η κινάση RhoA. Από τη βιβλιογραφία γνωρίζουμε ότι η κινάση RhoA επάγει τον πολυμερισμό της ακτίνης (F-ακτίνη) ενώ ελαττώνει τη μονομερή ακτίνη (G-ακτίνη) προκαλώντας έτσι την είσοδο του MRTF-A από το κυτταρόπλασμα στον πηρύνα προκειμένου να δημιουργήσει σύμπλοκο με τον παράγοντα SRF. Στη συνέχεια το σύμπλοκο αυτό προσδένεται στα στοιχεία CArG στους υποκινητές των γονιδίωνδεικτών του ΛΜΦ. Ουσίες οι οποίες αναστέλλουν τον πολυμερισμό της ακτίνης ή το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω της κινάσης RhoA προκαλούν την παραμονή του MRTF-A στο κυτταρόπλασμα και επομένως την αναστολή της μεταγραφής των γονιδίων του ΛΜΦ. Για παράδειγμα, ο αναστολέας της κινάσης RhoA, Υ-27632, μειώνει την έκφραση των γονιδίων-δεικτών του ΛΜΦ (Mack, 2011). Αντίθετα λειτουργικό μονοπάτι σηματοδότησης μέσω της RhoA και πολυμερισμός της ακτίνης μπορεί να ενισχύσει το συσταλτό φαινότυπο των ΛΜΚ (Parmacek, 2007). Ένας άλλος παράγοντας που μπορεί να επάγει την έκφραση των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ μέσω ενεργοποίησης του μονοπατιού Rho-ROCK και της δημιουργίας του συμπλόκου SRF- MRTF-A, είναι ο TGF-β, κάτι το οποίο παρατηρείται στις περιπτώσεις της ίνωσης αλλά και της ΕΜΤ (Small et al., 2010). Η ενεργοποίηση του SRF εξαρτάται από τις πρωτεΐνες G 12 και G q καθώς επίσης και από τη δράση του μονοπατιού Rho-ROCK (Mack, 2011, Mao et al., 1998). Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι η διαφοροποίηση του φαινότυπου των ΛΜΚ καθορίζεται από το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch. Υπάρχουν 4 διαμεμβρανικοί υποδοχείς Notch (Notch 1 έως 4) αλλά μόνο ο υποδοχέας Notch 3 εκφράζεται στα ΛΜΚ (Mack, 2011). Ενεργοποίηση του υποδοχέα Notch 3 από κάποιο μόριο-πρόσδεμα (Delta-like 1,3 και 5, Jagged 1 και 2) προκαλεί την αποκοπή της ενδοκυττάριας περιοχής του υποδοχέα Notch, NICD, η οποία στη συνέχεια εισέρχεται στον 24

25 πηρύνα, συμπλοκοποιείται με τους παράγοντες CSL and Mastermind και ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γονιδίου HRT2 (HRT οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων με δομή έλικαςθηλιάς-έλικας, helix-loop-helix). Το γονίδιο HRT2 με τη σειρά του αναστέλλει την δράση της Μυοκαρδίνης (ίσως μέσω αναστολής της έκφρασης ενός άλλου, μη ταυτοποιημένου, συμπαράγοντα που δρά με τη Μυοκαρδίνη) και επομένως δεν μπορεί να επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ, (εικόνα 1-9), (Proweller et al., 2005). Εικόνα 1-9 : Πιθανός μηχανισμός δράσης του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch στη ρύθμιση του φαινότυπου των ΛΜΚ (Proweller et al., 2005). 1.4 Συμπαθητική Νεύρωση των αγγείων Η σύσπαση των λείων μυϊκών ινών ελέγχεται από μεταγαγγλιακούς νευρώνες του αυτόνομου νευρικού συστήματος. Μάλιστα οι περισσότεροι λείοι μύες νευρώνονται απευθείας από συμπαθητικά και παρασυμπαθητικά νεύρα. Ακόμα και απουσία νευρικών ερεθισμάτων, ο λείος μυϊκός ιστός εμφανίζει αυτόματη συσταλτική δραστηριότητα. Συνεπώς η νεύρωση παίζει κυρίως ρυθμιστικό ρόλο στη λειτουργία των λείων μυϊκών ινών, παρά στην εκκίνηση αυτών, όπως συμβαίνει στους σκελετικούς μύες. Ο βαθμός της νεύρωσης είναι απόλυτα συνυφασμένος με τη λειτουργία των εκάστοτε λείων μυϊκών κυττάρων. Τα νεύρα σπανίως εισέρχονται στο μέσο χιτώνα των αγγείων, επομένως δε σχηματίζουν συνάψεις άμεσα με τα ΛΜΚ. Αντίθετα, απελευθερώνουν τους νευροδιαβιβαστές όπως αυτόν της νορεπινεφρίνης και της επινεφρίνης, οι οποίες φτάνουν στο μέσο χιτώνα με διάχυση και δρούν στα παρακείμενα λεία μυϊκά κύτταρα. Οι ώσεις διαδίδονται σε όλα τα λεία μυϊκά κύτταρα μέσω των χασματικών συνδέσεών τους, παράγοντας μια συντονισμένη συστολή όλων των μυϊκών κυττάρων του αγγειακού τοιχώματος, με αποτέλεσμα την ελάττωση της διαμέτρου του αυλού του (Pugsley et al., 2000, Ross et al., 2006). Οι λείοι μύες δέχονται αδρενεργικές αλλά και χολινεργικές νευρικές απολήξεις. Οι νευρικές απολήξεις παρατηρούνται μόνο στο συνδετικό ιστό μεταξύ των δεματίων των λείων μυϊκών ινών, 25

26 σχηματίζοντας διογκώσεις κοντά στα μυϊκά κυττάρα που νευρώνουν. Οι διογκώσεις αυτές περιέχουν συναπτικά κυστίδια με νευροδιαβιβαστές. Απόσταση της τάξης των 10-20μm (και σε μερικές περιπτώσεις έως 200 μm) ενδέχεται να χωρίζει τη νευρική απόληξη από το λείο μυ, απόσταση που πρέπει να καλύψει ο νευροδιαβιβαστής διαχεόμενος, προκειμένου να φτάσει και να διεγείρει τις λείες μυϊκές ίνες. Επειδή όλα τα λεία μυϊκά κύτταρα δεν είναι άμεσα εκτεθειμένα στις νευροδιαβιβαστικές ουσίες, οι πολυάριθμες χασματικές συνάψεις μεταξύ των ινών διευκολύνουν τη διάδοση της συστολής από κύτταρο σε κύτταρο, παράγοντας συντονισμένη συστολική δραστηριότητα εντός ενός δεματίου ή μιας στοιβάδας λείων μυϊκών ινών. Το συμπαθητικό νευρικό σύστημα παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και τη λειτουργία των αγγείων καθώς επίσης και των ΛΜΚ. Οι επιδράσεις του συμπαθητικού νευρικού συστήματος στη διαφοροποίηση των ΛΜΚ δεν έχει ακόμα πλήρως μελετηθεί και διευκρινιστεί αλλά υπάρχουν ενδείξεις ότι οι νευρώνες του ΣΝΣ επάγουν ή διατηρούν τη διαφοροποίηση των ΛΜΚ. Έχει παρατηρηθεί ότι σε απονευρωμένες αρτηρίες τα ΑΛΜΚ αλλάζουν μορφολογικά και αποκτούν χαρακτηριστικά αποδιαφοροποιημένων ΑΛΜΚ. Επίσης τα κύτταρα αυτά εκφράζουν την βιμεντίνη, πρωτεΐνη που χαρακτηρίζει τα αποδιαφοροποιημένα ΑΛΜΚ. Παρόλα αυτά οι μηχανισμοί με τους οποίους γίνεται κάτι τέτοιο παραμένουν ακόμα σε μεγάλο μέρος άγνωστοι (Damon, 2004) Η δράση των Αδρενεργικών υποδοχέων Οι αδρενεργικοί υποδοχείς παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του σώματος, συνεπώς και στην ομοιόσταση των αγγείων, τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Η αδρενεργική απόκριση και σηματοδότηση ρυθμίζεται από πολλά φάρμακα. Οι αδρενεργικοί υποδοχείς είναι διαμεμβρανικοί υποδοχείς οι οποίοι διαπερνούν επτά φορές την κυτταρική μεμβράνη (εικόνα 1-10) και ανήκουν στην οικογένεια των G-coupled υποδοχέων (υποδοχείς που προσδένονται σε G-πρωτεΐνες), αποκρίνονται σε αυτά τα φάρμακα-ουσίες και ελέγχουν τις διάφορες λειτουργίες του οργανισμού (Philip and Hein, 2004). Εικόνα 1-10 : Δομή των αδρενεργικών υποδοχέων (Zhong and Minneman, 1999). Υπάρχουν 9 γονίδια που κωδικοποιούν υποτύπους αυτών των υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί αποκρίνονται στην επινεφρίνη και τη νορεπινεφρίνη του συμπαθητικού νευρικού συστήματος. Με τη χρήση ειδικών φαρμάκων-αναταγωνιστών, και ειδικών τεχνικών για την κλωνοποίηση γονιδίων βρέθηκαν αρκετές υποκατηγορίες, που κατηγοριοποιήθηκαν σε σχέση με το σηματοδοτικό μονοπάτι και τη συγγένεια για συγκεκριμένους αγωνιστές και ανταγωνιστές (δηλ. φαρμακολογικά) και μελετήθηκε η μοριακή τους δομή (εικόνα 1-11). Δύο μεγάλες κατηγορίες διακρίνονται, οι α και οι β αδρενεργικοί υποδοχείς. 26

27 Εικόνα 1-11 : Υποκατηγορίες των αδρενεργικών υποδοχέων (Woodcock et al., 2007) Ρόλος των α1-αδρενεργικών υποδοχέων Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς αποκρίνονται στις κατεχολαμίνες, επινεφρίνη και νορεπινεφρίνη, οι οποίες εκλύονται από τα νεύρα του συμπαθητικού συστήματος. Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς παρουσιάζουν διάφορους φυσιολογικούς ρόλους όπως είναι η συστολή των λείων μυών των αγγείων, η επαγωγή της γλυκονεογένεσης και της γλυκογενόλυσης στο ήπαρ, η διέγερση της καρδιάς και ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση των κυττάρων. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούνται από τις ενδογενείς κατεχολαμίνες νοραδρεναλίνη (νορεπινεφρίνη) και αδρεναλίνη (επινεφρίνη). Η πρόσδεση των κατεχολαμινών στους υποδοχείς προκαλεί την ενεργοποίηση των G-πρωτεϊνών και την πρόσδεσή τους στη φωσφολιπάση C (PLC). Στη συνέχεια η φωσφολιπάση C επάγει τη δημιουργία της τριφωσφορικής ινοσιτόλης (IP 3 ) και του μορίου (DAG). Η τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP 3 ) απελευθερώνει το Ca 2+ από τις ενδοκυττάριες αποθήκες και έτσι αυξάνεται η συγκέντρωση του Ca 2+ στο κυτταρόπλασμα και η ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από το ασβέστιο κινασών. Η διάκυλο-γλυκερόλη (DAG) από την πλευρά του ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC), η οποία ενεργοποιεί διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια. Ένα από αυτά τα σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκεται σε διάφορες διαδικασίες σχετικές με απελευθέρωση ενδοκυττάριου Ca 2+ είναι αυτό της MAP κινάσης σημαντικό για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω των α1- αδρενεργικών υποδοχέων (Akiyama et al., 2003). 27

28 Εικόνα 1-12 : Μονοπάτι σηματοδότησης των α1-αδρενεργικών υποδοχέων (Zhong and Minneman, 1999). Έχουν κλωνοποιηθεί τρείς υπότυποι των υποδοχέων αυτών, οι α1α, α1β και α1d στους ιστούς. Ανάλογα με την κατανομή τους στα αιμοφόρα αγγεία, τους οργανισμούς στους οποίους εκφράζονται, τους διαφορετικούς σηματοδοτικούς μηχανισμούς που υπάγονται στα σηματοδοτικά μονοπάτια τους και τις διαφορετικές G-πρωτεΐνες που προσδένονται στους υποδοχείς αυτούς μετά την ενεργοποίησή τους από την επινεφρίνη και τη νορεπινεφρίνη, κάθε υπότυπος των α1- αδρενεργικών υποδοχέων συμβάλλει στην αγγειακή συστολή. Για παράδειγμα, η ουραία αρτηρία επίμυων συστέλλεται μέσω της λειτουργίας του α1α υποτύπου, η αορτή κυνοειδών μέσω του α1β υποτύπου και η αορτή επίμυων μέσω του υποτύπου α1d (Hein et al., 2006). Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς εκφράζονται σε υψηλό βαθμό στα αγγεία και θεωρούνται σημαντικοί ρυθμιστές της συσταλτικότητας, του πολλαπλασιασμού και της αύξησης των ΛΜΚ. Στα θηλαστικά υπάρχουν και οι 3 υπότυποι των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, οι α1α, α1β και α1d. Όταν ΛΜΚ τρωκτικών τεθούν από τον ιστό σε καλλιέργεια, μόνο οι υπότυποι α1β και α1d εκφράζονται (Faber et al., 2001) στις πρώτες διαιρέσεις αυτών των κυττάρων (passages), και συνήθως η έκφραση των α-αυ χάνεται με τις διαδοχικές διαιρέσεις (passages). Είναι γνωστό ότι όλοι οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς επάγουν με διαφορετική ισχύ, και ίσως με έμμεσο τρόπο, τα συστήματα MAPK/ERK και RhoA/ROCK (Zhong and Minneman, 1999, Piascik and Peter, 2001), τα οποία μεταβάλλουν τη μεταγραφή των ΛΜΚ-ειδικών γονιδίων. Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς μεσολαβούν σε μια πληθώρα λειτουργιών στο αγγειακό σύστημα με πιο γνωστή τη σύσπαση, με άμεσες επιδράσεις στο συσταλτικό μηχανισμό. Οι επιδράσεις αυτές έχουν μελετηθεί σχετικά κυρίως ως προς τη σηματοδότηση μέσω κλασσικών μονοπατιών όπως είναι τα ιόντα ασβεστίου, η φωσφολοπάση C και η τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP 3 ). Όμως οι α1- αδρενεργικοί υποδοχείς έχουν μακροπρόθεσμες επιδράσεις στην υπερπλασία-υπερτροφία των αγγειακών ΛΜΚ (Zhang and Faber, 2001). Για παράδειγμα, υπέρμετρη διέγερση των υποδοχέων αυτών στα ΛΜΚ μπορεί να προκαλέσει σημαντικές αλλαγές στην οργάνωση και στη διάταξη των ΛΜΚ στη μεσαία στοιβάδα των αρτηριών (arterial remodeling), σύμφωνα με μελέτες σε πειραματικά μοντέλα ζώων με αθηρωμάτωση ή με επαναστένωση μετά από αρτηριακό τραυματισμό (Erami et al., 2005, Zhang and Faber, 2001). Είναι εξίσου σημαντικό να σημειωθεί ότι οι in vivo προσεγγίσεις δεν επιτρέπουν το διαχωρισμό των έμμεσων επιδράσεων των αγωνιστών και ανταγωνιστών των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, που εκδηλώνονται μέσω αιμοδυναμικών μεταβολών που επιφέρουν στις συγκεκριμμένες δόσεις (αλλαγές σε αρτηριακές αντιστάσεις και 28

29 πίεση), από τις άμεσες επιδράσεις στα κύτταρα του τοιχώματος των αρτηριών. Τα τελευταία χρόνια έχει γινει αρκετή πρόοδος στην κατανόηση της ρύθμισης της έκφρασης των ΛΜΚ-ειδικών γονιδίων που είναι χαρακτηριστικά για το συσταλτό φαινότυπο. Η μεταγραφή των γονιδίων αυτών ρυθμίζεται και επηρεάζεται από τους α1-αδρενεργικούς υποδοχείς ενώ σε αυτόν τον έλεγχο εμπλέκονται διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια. Τα κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια που παίζουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό του φαινότυπου των ΛΜΚ και μπορούν να ενεργοποιηθούν από τους α1-αδρενεργικούς υποδοχείς είναι τα εξής : τα συστήματα MAPK/ERK και RhoA/ROCK (Zhong and Minneman, 1999, Piascik and Peter, 2001). Σε περίπτωση αγγειακής βλάβης η σηματοδότηση των α1-αδρενεργικών υποδοχέων συνδυάζεται με αυτή από άλλα συστήματα υποδοχέων τα οποία είναι αρκετά γνωστά ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης των παθήσεων των αρτηριών όπως τα συστήματα των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων PDGF-BB και TGF-β1. Εκτός από τον καθαρά αποδεκτό ρόλο τους σε παθήσεις όπως η αθηροσκλήρωση και η επαναστένωση, τα δύα αυτά συστήματα έχουν ένα επιπλέον σημαντικό πλεονέκτημα στις μελέτες ρύθμισης του φαινότυπου των ΛΜΚ. Έχει βρεθεί ότι μπορούν εύκολα να χρησιμοποιηθούν in vitro είτε για να διατηρήσουν και να επάγουν έναν «ώριμο» διαφοροποιημένο φαινότυπο των ΛΜΚ ή για να καθυστερήσουν την "αποδιαφοροποίηση" των ΛΜΚ (αυτά επιτυγχάνονται με την προσθήκη του TGF-β1), είτε για να επάγουν έναν "αποδιαφοροποιημένο" φαινότυπο των ΛΜΚ (αυτό επιτυγχάνεται με την προσθήκη του PDGF-BB). Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς είναι υπεύθυνοι για τη δράση των συμπαθητικών νευρικών απολήξεων στα αγγειακά τοιχώματα. Παίζουν καθοριστικό ρόλο σε διάφορες ασθένειες των αγγείων, στην παθοφυσιολογία του αγγειακού τοιχώματος και στην υπερτροφία και τον πολλαπλασιασμό των ΛΜΚ. Παρόλα αυτά όμως οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους δρουν, επηρεάζουν και καθορίζουν το φαινότυπο των ΛΜΚ παραμένουν ακόμη σε μεγάλο μέρος άγνωστοι Ρόλος των α2-αδρενεργικών υποδοχέων Οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς κατανέμονται ευρέως και ενεργοποιούνται από τη νορεπινεφρίνη και την επινεφρίνη. Οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς είναι προ-συναπτικοί υποδοχείς αλλά βρίσκονται και σε μετασυναπτικές μεμβράνες (Philipp et al., 2004). Οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς δεν εμπλέκονται μόνο στη ρύθμιση του αγγειακού τόνου στους ενήλικους οργανισμούς αλλά είναι επίσης απαραίτητοι για την ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος του πλακούντα κατά την εμβρυογένεση. Επίσης παίζουν σημαντικό ρόλο στη συστολή των λείων μυών, στην αναστολή της έκκρισης ινσουλίνης από το πάγκρεας και στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Εκτός από τα παραπάνω οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς δεν αναστέλλουν την απελευθέρωση μόνο των δικών τους νευροδιαβιβστών αλλά ελέγχουν την απελευθέρωση και άλλων νευροδιαβιβαστών στο κεντρικό και το περιφερειακό σύστημα. Με την ανάπτυξη νέων φαρμακολογικών προσδεμάτων και τεχνικών βρέθηκε ότι υπάρχουν τρεις υπότυποι των α2-αδρενεργικών υποδοχέων, οι α2α, α2b και α2c. Οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς πραγματοποιούν τις διάφορες λειτουργίες τους με τη μεσολάβηση διαφόρων σηματοδοτικών μονοπατιών όπως μέσω ενεργοποίησης GIRK-Κ + καναλιών, κινασών της οικογένειας MAPK και της φωσφολιπάσης D, όπως επίσης μέσω αναστολής των καναλιών Ca 2+ και της αδενυλικής κυκλάσης. Οι υποδοχείς αυτοί είναι απαραίτητοι σε ρυθμιστικούς μηχανισμούς μέσω ανάδρασης της απελευθέρωσης των νευροδιαβιβαστών. Σε απομονωμένους ιστούς, οι α2α-αδρενεργικοί υποδοχείς αποτελούν το βασικότερο ρυθμιστικό μηχανισμό μέσω ανάδρασης της απελευθέρωσης 29

30 της νοραδρεναλίνης αλλά οι α2c και πιθανώς και οι α2β συμμετέχουν στον προ-συναπτικό έλεγχο των ακραίων νευρικών τμημάτων του συμπαθητικού νευρικού συστήματος (Brede et al., 2004). Εικόνα 1-13 : Σχηματική απεικόνιση ρύθμισης της πίεσης του αίματος (Philipp et al., 2004). Ο έλεγχος της πίεσης του αίματος από τους α2-αδρενεργικούς υποδοχείς γίνεται και από τους τρεις υποτύπους αυτών των υποδοχέων. Ενεργοποίηση των α2α αδρενεργικών υποδοχέων οδηγεί σε μείωση της πίεσης του αίματος μέσω αναστολής της συμπαθητικής εκροής όπως επίσης και μέσω αναστολής της απελευθέρωσης της νορεπινεφρίνης από τα συμπαθητικά νεύρα. Οι α2βαδρενεργικοί υποδοχείς με τη σειρά τους ίσως αντιδρούν σε αυτή την ενέργεια προκαλώντας άμεση συστολή του αγγείου και αυξάνοντας την πίεση του αίματος. Οι α2c αδρενεργικοί υποδοχείς συμβάλλουν στη ρύθμιση της πίεσης του αίματος διατηρώντας για λίγο τη θερμοκρασία του σώματος κάτω από 37 0 C (εικόνα 1-13), (Philipp et al., 2004) Ρόλος των β-αδρενεργικών υποδοχέων Η διέγερση που προκαλούν οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς είναι διαφορετικού τύπου από τη διέγερση που προκαλούν οι α-αδρενεργικοί υποδοχείς. Οι υποδοχείς αυτοί χαρακτηρίζονται από ισχυρή απόκριση στην ισοπροτερενόλη (ή ισοπρεναλίνη) και από μικρότερη ευαισθησία στην επινεφρίνη και τη νορεπινεφρίνη. Οι πιο σημαντικές φυσιολογικές λειτουργίες τους είναι : η χαλάρωση των λείων μυών των αγγείων, της ουροδόχου κύστης και των βρόγχων, η διέγερση του καρδιακού τόνου, η ενεργοποίηση της έκκρισης ινσουλίνης από το πάγκρεας και της έκκρισης ρενίνης από τους νεφρούς, η ενίσχυση της λιπόλυσης από το λιπώδες ιστό και η επαγωγή της γλυκονεογένεσης και της γλυκογενόλυσης στο ήπαρ. Οι υποδοχείς αυτοί μελετήθηκαν κυρίως στο καρδιαγγειακό σύστημα και στη ρύθμιση του μεταβολισμού του λιπώδους ιστού (Philipp et al., 2004). Τα σηματοδοτικά μονοπάτια των β- αδρενεργικών υποδοχέων παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της καρδιακής λειτουργίας, της πίεσης του αίματος και του τόνου των λείων μυών των αγγείων (Chruscinski et al., 2001). Η χαλάρωση των λείων μυών που προκαλείται μέσω της δράσης των υποδοχέων αυτών παίζουν ρόλο στη ρύθμιση του αγγειακού τόνου και του τόνου των βρόγχων (Hoffmann et al., 2003). Με τη χρήση τεχνικών κλωνοποίησης διαπιστώθηκε η ύπαρξη 3 διακριτών υποτύπων β- αδρενεργικών υποδοχέων, οι : β1, β2 και β3. Ο υπότυπος β1 κυριαρχεί στην καρδιά των θηλαστικών, ο υπότυπος β2 βρίσκεται περισσότερο στα ΛΜΚ των αγγείων και των βρόγχων και ο 30

31 υπότυπος β3 βρίσκεται κυρίως στο λευκό και φαιό λιπώδη ιστό (Hoffmann et al., 2003). Και οι 3 υπότυποι προκαλούν υπόταση μέσω απόκρισή τους στην Ισοπροτερενόλη. Όλες οι μορφές συνδέονται με τις πρωτεΐνες Gs, οι οποίες στη συνέχεια επάγουν με την αδενυλική κυκλάση (Adenylyl Cyclase). Η πρόσδεση αγωνιστών λοιπόν προκαλεί αρχικά τη σύνδεση των Gsπρωτεϊνών με την αδενυλική κυκλάση και στη συνέχεια την αύξηση των επιπέδων της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του δευτερογενούς σηματοδοτικού μορίου camp (εικόνα 1-14). Εικόνα 1-14 : Το σηματοδοτικό μονοπάτι των β-αδρενεργικών υποδοχέων. Οι β1 αδρενεργικοί υποδοχείς παρουσιάζουν περίπου την ίδια συγγένεια για την επινεφρίνη και τη νορεπινεφρίνη ενώ οι β2 περισσότερο για την επινεφρίνη. Η κατανομή των β1 και β2 διαφέρει από αγγείο σε αγγείο αλλά όλοι προκαλούν αγγειοδιαστολή. Στους ανθρώπους και οι δύο υπότυποι in vivo επάγουν την υπόταση μέσω απόκρισής τους στη Ισοπροτερενόλη (Chruscinski et al., 2001) camp Το κυκλικό νουκλεοτίδιο AMP (camp, 3-5 -κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη) είναι το πρώτο δευτερογενές αγγελιοφόρο μόριο το οποίο ανακαλύφθηκε. Μέσω αύξησης ή μείωσης της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σήματος και συνεπώς διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας των κυττάρων και των ιστών. Το camp συμμετέχει στην σηματοδότηση των β-αδρενεργικών υποδοχέων στο καρδιαγγειακό σύστημα και στο λιπώδη ιστό, συμβάλλει στη διάσπαση της γλυκόζης, ρυθμίζει την αναπαραγωγική λειτουργία, ελέγχει την εξωκυττάρωση στα επιθηλιακά κύτταρα και συντονίζει τις ανοσολογικές αποκρίσεις (Hancock et al., 2005). To camp συντίθεται από το ATP μέσω της αδενυλικής κυκλάσης (adenylyl cyclase) η οποία βρίσκεται εσωτερικά της κυτταρικής μεμβράνης και ενεργοποιείται από μία G-πρωτεΐνη. Το camp διασπάται σε AMP μέσω φωσφοδιεστερασών του camp (Phosphodiesterases, PDEs). Η ενδοκυττάρια συγκέντρωση του camp είναι αποτέλεσμα της ισορροπίας μεταξύ της σύνθεσής του, μέσω του ενζύμου της αδενυλικής κυκλάσης, και της αποδόμησης του, μέσω των φωσφοδιεστερασών του camp. Τις περισσότερες φορές οι δράσεις του αυξημένου camp διαμεσολαβούνται μέσω της κινάσης PKΑ, η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει κατάλληλα υποστρώματα και έτσι ρυθμίζονται σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως ο κυτταρικός κύκλος, ο μεταβολισμός και η μεταγραφή γονιδίων (Dremier et al., 2003). 31

32 Εικόνα 1-15 : Το μονοπάτι σηματοδότησης του camp. Η μεταβολή της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του camp φαίνεται να επηρεάζεται και από άλλους δευτερογενείς αγγελιοφόρους. Για παράδειγμα, στην περίπτωση του ασβέστιο-εξαρτώμενου μονοπατιού μεταγωγής σήματος, το Ca 2+ μπορεί να αυξήσει τη συγκέντρωση του camp μετά από διέγερση της αδενυλικής κυκλάσης από την καλδομουλίνη ή να αναστείλλει τη δράση του συγκεκριμένου ενζύμου μέσω του Ca 2+ και της ενεργοποίησης των μελών της οικογένειας της φωσφοδιεστεράσης, που διασπούν το camp του κυττάρου. Παρόλα αυτά οι ακριβείς μηχανισμοί και η σημασία της αλληλεπίδρασης των δύο μονοπατιών παραμένουν ακόμη άγνωστοι (Cooper et al., 2003). 1.5 Επιθηλιομεσεγχυματική Μετάβαση (EMT) Εκτός από το ρόλο που παίζουν οι Μυοκαρδίνες στα ΛΜΚ, οι Μυοκαρδίνες εκφράζονται de novo σε επιθηλιακά κύτταρα και μπορούν να ελέγξουν σημαντικές διαδικασίες όπως είναι η ανάπτυξη, η οργάνωση του κυτταροσκελετού, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και η κυτταροκίνηση. Αυτές οι διαδικασίες αναφέρονται ως επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (EMT-Epithelial to Mesenchymal Transition), διαδικασία κατά την οποία ένα επιθηλιακό κύτταρο αποκτά φαινότυπο μεσεγχυματικού κυττάρου. Η επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση εμφανίζεται σε υγιείς καταστάσεις όπως στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, στη διαμόρφωση ιστών, στην επούλωση τραυμάτων και στην αγγειογένεση. Εμφανίζεται όμως και σε παθολογικές καταστάσεις όπως στην ίνωση, στη μετάσταση και στην παθολογική αγγειογένεση. Κατά την επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση το επιθηλιακό κύτταρο χάνει την πολικότητα του, τις ζώνες πρόσφυσης, τις στεγανές συνδέσεις, τα δεσμοσωμάτια και τα ενδιάμεσα νημάτια κερατίνης με αποτέλεσμα να τροποποιείται ο κυτταροσκελετός και να αποκτά δομές που δίνουν στο κύτταρο δυνατότητα κίνησης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να μειώνεται η ικανότητα προσκόλλησης του ενός κυττάρου από το άλλο. Το κύτταρο πλέον αποκτά μεσεγχυματικό φαινότυπο και έτσι αυξάνεται η ικανότητα μετανάστευσης, διήθησης και αυξάνεται η παραγωγή εξωκυττάριου υλικού. Επίσης παρατηρούνται αλλαγές στην έκφραση πρωτεϊνών όπως μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών E- Καντερίνης και VE-Καντερίνης και ταυτόχρονη αύξηση των πρωτεϊνών SM-α-Aκτίνης, Βιμεντίνης/Δεσμίνης και N-Καντερίνης (Morita et al., 2007). 32

33 Εικόνα 1-16 : Αλλαγές στο φαινότυπο και την έκφραση πρωτεϊνών στο φαινόμενο EMT. Εικόνα 1-17 : Ρόλος του παράγοντα TGF-β1 στο φαινόμενο ΕΜΤ. Το πλέον μελετημένο σημαντικό σηματοδοτικό μονοπάτι που ενεργοποιεί το φαινόμενο ΕΜΤ είναι αυτό που επάγεται από τον πολυπεπτιδικό παράγοντα TGF-β1. Αρχικά, ο αυξητικός παράγοντας TGF-β1 προκαλεί την είσοδο των Μυοκαρδινών μέσα στον πηρύνα εξαιτίας των σηματοδοτικών μορίων Smads. Από τη μία πλευρά, η Μυοκαρδίνη δημιουργεί σύμπλοκα με τα μόρια Smad τα οποία προσδένονται σε μοτίβα-gccg στο DNA και ενεργοποιούν την έκφραση διαφόρων γονιδίων, υπεύθυνων για το ΕΜΤ, όπως τα Slug και Snail αλλά και τα Wnt, Twist κ.ά.. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τον αποχωρισμό των κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, η Μυοκαρδίνη δημιουργεί σύμπλοκο με το μεταγραφικό παράγοντα SRF το οποίο στη συνέχεια προσδένεται στις αλληλουχίες CArG και ενεργοποιείται η μεταγραφή γονιδίων υπεύθυνων για την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. 33

34 2. ΣΚΟΠΟΣ 34

35 Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που καθορίζουν την έκφραση του Λείου Μυϊκού Φαινοτύπου (ΛΜΦ) σε αγγειακά κύτταρα. Ο Φαινότυπος των Λείων Μυϊκών Κυττάρων (ΛΜΚ) των αγγείων χαρακτηρίζεται από σημαντική πλαστικότητα, απαντά στις φυσιολογικές συνθήκες και τα χημικά φαρμακολογικά ερεθίσματα στα οποία τα κύτταρα είναι εκτεθειμένα, και συμβάλλει μεταξύ άλλων στη συστολή και τη ρύθμιση του τόνου των αιμοφόρων αγγείων, της αρτηριακής πίεσης και της αιματικής ροής. Η μετατροπή του ΛΜΦ από φυσιολογικό-συσταλτό σε συνθετικό-παθολογικό παίζει πολύ σημαντικό ρόλο σε διάφορες αγγειακές ασθένειες όπως στην αθηροσκλήρωση και στην υπέρταση. Ο συσταλτόςφυσιολογικός ΛΜΦ είναι απόρροια της έκφρασης χαρακτηριστικών γονιδίων-δεικτών όπως η SM-α- Ακτίνη (SM-α-Actin), η SM22α, η SM-Καλπονίνη (SM-Calponin) και η βαριά αλυσίδα της Μυοσίνης (SM-MHC) και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη δημιουργία συμπλόκου μεταξύ δύο μεταγραφικών παραγόντων : του Serum Response Factor (SRF) και της Μυοκαρδίνης. Στον οργανισμό, ο φαινότυπος των ΛΜΚ των αγγείων καθορίζεται, μεταξύ άλλων, απο την δράση του συμπαθητικού, που διαμεσολαβείται απο τους α και β αδρενεργικούς υποδοχείς στα κύτταρα αυτά. Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς, που έχει δειχθεί ότι παίζουν βασικό ρόλο στον καθορισμό των ΛΜΚ, περιλαμβάνουν 3 υποτύπους, τους : α1a, α1b και α1d. Κύριος σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς (α1α-αυς, υπότυποι α1α και α1β) και οι β-αυςs επηρεάζουν και ελέγχουν τον ΛΜΦ όπως αυτός διαπιστώνεται με την έκφραση των γονιδίων SM-α-Actin, SM22α, SM-Calponin και SM-MHC. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς : α) διαφοροποιημένα λεία μυϊκά κύτταρα αορτής αρουραίου της κυτταρικής σειράς A7r5 και β) κύτταρα ινοβλαστών της κυτταρικής σειράς ΝΙΗ3Τ3, για να δούμε αντίστοιχα πώς η δράση των α1-αυ ελέγχει την έκφραση των γονιδίων αυτών σε διαφοροποιημένα ΛΜΚ και σε αδιαφοροποίητα κύτταρα που όμως μπορούν να μετατραπούν σε ΛΜΚ. Επιπροσθέτως, θελήσαμε να εξετάσουμε, σε ενδοθηλιακά κύτταρα φλέβας ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC), εάν η εξωγενής έκφραση της Μυοκαρδίνης αρκεί για να οδηγήσει σε αλλαγή στην μορφολογία τους και στον φαινότυπό τους. Εξετάσαμε το πρωτεϊνικό προφίλ των ΛΜ γονιδίων, που είναι συμβατό με επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ-Epithelial to Mesenchymal Transition). Αυτή η μετάβαση θεωρείται φυσιολογικά πολύ σημαντική, δεδομένου ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων δύνανται να μετέχουν στο φαινόμενο ΕΜΤ και έτσι να συμβάλλουν σε διεργασίες κυτταρικής διαφοροποίησης και ιστικής δόμησης. 35

36 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 36

37 3.1 Κυτταροκαλλιέργειες Κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη H κυτταρική σειρά Α7r5 Η κυτταρική σειρά A7r5 προέρχεται από εμβρυϊκά λεία μυϊκά κύτταρα απομονωμένα από την θωρακική αορτή του είδους Rattus norvegicus (επίμυς strain DB1X). Είναι κύτταρα τα οποία προσκολλώνται σε ειδικές επιφάνειες για να αναπτυχθούν. Καθώς τα κύτταρα αυτά εισέρχονται στη στατική φάση ανάπτυξης παρουσιάζουν σημαντική αύξηση στην ενεργότητα της μυοκινάσης και της φωσφοκινάσης της κρεατίνης (CPK). Μετά τη διακοπή της κυτταρικής διαίρεσης συντίθεται η μυϊκή ισομορφή του ενζύμου CPk. Είναι κατάλληλα για μελέτη αφού παρουσιάζουν βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες. Εικόνα 3-1 : Η κυτταρική σειρά Α7r5. Οι λόγοι που υπαγορεύουν την επιλογή του συγκεκριμένου τύπου κυττάρων είναι οι εξής: 1) Επιδεικνύει τον συσταλτό φαινότυπο σε καλλιέργεια, όπως αποδεικνύεται μεταξύ άλλων από την έκφραση της α-ακτίνης των ΛΜΚ (SM-α-Αctin), της βαριάς αλυσίδας μυοσίνης των ΛΜΚ (SΜ MHC), της h1 Καλπονίνης και της SM-22α (Owens et al., 2004, Wang et al., 2004). 2) Το επίπεδο έκφρασης αυτών των γονιδίων είναι τέτοιο ώστε μπορούν να ανταποκρίνονται σε καταστάσεις οι οποίες είτε αυξάνουν (TGF-β1) ή μειώνουν (PDGF-BB) την έκφραση και την ενεργοποίηση των ειδικών γονιδίων των ΛΜΚ, τα κύτταρα δηλ, μπορούν να ανταποκριθούν με θετικό ή αρνητικό τρόπο σε παράγοντες που επηρεάζουν τον φαινοτυπό τους (Owens et al., 2004, Wang et al., 2004). 3) Ο πληθυσμός αυτός εκφράζει λειτουργικά στην επιφάνεια του και τα τρία συστήματα υποδοχέων που ενδιαφέρουν αυτή την μελέτη, δηλαδή α1 αδρενεργικούς, υποδοχείς TGF-β τύπου Ι και ΙΙ και PDGF-β υποδοχείς (Owens et al., 2004, Wang et al., 2004, Faber et al., 2001). 4) Η κυτταρική σειρά A7r5 περιλαμβάνει τα σημαντικότερα λειτουργικά συστήματα και μόρια τα οποία έχουν περιγραφεί ότι ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τη συσταλτικότητα, δηλαδή τη Μυοκαρδίνη, την MRTF-A, τον SRF, τα συστήματα RhoA/ROCK, MAPK/MEK και τα μόρια Smads, στα οποία επικεντρώνεται η προτεινόμενη μελέτη (Owens GM 2004, Mack CP 2001). 37

38 Η κυτταρική σειρά NIH3T3 Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά προέρχεται από ινοβλάστες απομονωμένοι από έμβρυο του είδους Μus musculus (μυς strain NIH/Swiss). Προσκολλώνται σε ειδικές επιφάνειες για να αναπτυχθούν όπως φαίνεται και στην εικόνα 3-2. Είναι κύτταρα κατάλληλα για πειράματα διαμόλυνσης για γενετική μελέτη αφού παρουσιάζουν βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες. Εικόνα 3-2 : Η κυτταρική σειρά ΝΙΗ3Τ Η κυτταρική σειρά DU145 Η κυτταρική σειρά DU145 προέρχεται από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη. Προσκολλώνται σε ειδικές επιφάνειες για να αναπτυχθούν όπως φαίνεται και στην εικόνα 3-3. Εικόνα 3-3 : Η κυτταρική σειρά DU Η κυτταρική σειρά HUVEC Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία απομονώνονταν από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC). Οι ομφάλιοι λώροι προμηθεύονταν από ιδιωτική κλινική της Πάτρας και προέρχονταν από καισαρικές επεμβάσεις, oι οποίες πραγματοποιούνταν 1-5 ώρες πριν από την έναρξη της απομόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Μετά το τέλος της καισαρικής, κάθε ομφάλιος λώρος εμβαπτίζεται σε αποστειρωμένο ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS 1x) και μεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο, όπου και πραγματοποιείται η απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. 38

39 Εικόνα 3-4 : Κύτταρα HUVEC Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για A7r5, NIH3T3 και DU145 Πειραματική πορεία 1. Ανοίγεται η σφραγισμένη φιάλη των 500 ml θρεπτικού μέσου DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium). 2. Τοποθετούνται τα αντιβιoτικά: πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (5 ml). Σε θρεπτικά μέσα DMEM με ένδειξη ότι στερούνται γλουταμίνης (w/o glutamine) προσθέτουμε και γλουταμίνη (5 ml). Η πενικιλίνη στρεπτομυκίνη έχει δράση ενάντια σε βακτήρια. Σε αυτό το στάδιο έχουμε το θρεπτικό μέσο DMEM. 3. Παρασκευάζεται το πλήρες θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα (50 ml). Αυτό αποτελείται από 45 ml θρεπτικό μέσο DMEM και 5 ml ορό νεογέννητου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS). 4. Το θρεπτικό μέσο φυλάσσεται στους 4 o C. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό µέσο DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): DMEM 500 ml NαΗCO3 3,7 g/l Πενικιλίνη-στρεπτοµυκίνη 100 ΙU/ml L-γλουταµίνη 2,5 mm D- γλυκόζη 4,5 g/l Nα-Πυροσταφυλικό οξύ Πλήρες θρεπτικό µέσο DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): DMEM Ορός βοός (fetal bovine serum, FBS) 45 ml 5 ml 39

40 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC Πειραματική πορεία 1. Ανοίγεται η σφραγισμένη φιάλη των 500 ml θρεπτικού μέσου DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium). 2. Τοποθετούνται τα αντιβιoτικά: πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (5 ml). Σε θρεπτικά μέσα DMEM με ένδειξη ότι στερούνται γλουταμίνης (w/o glutamine) προσθέτουμε και γλουταμίνη (5 ml). Η πενικιλίνη στρεπτομυκίνη έχει δράση ενάντια σε βακτήρια. Σε αυτό το στάδιο έχουμε το θρεπτικό μέσο DMEM. 3. Παρασκευάζεται το πλήρες θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα (50 ml). Αυτό αποτελείται από 45 ml θρεπτικό μέσο DMEM και 5 ml ορό νεογέννητου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS). 4. Το θρεπτικό μέσο φυλάσσεται στους 4 o C. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό µέσο DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): DMEM 500 ml NαΗCO3 3,7 g/l Πενικιλίνη-στρεπτοµυκίνη 100 ΙU/ml L-γλουταµίνη 2,5 mm D- γλυκόζη 4,5 g/l Nα-Πυροσταφυλικό οξύ Πλήρες θρεπτικό µέσο DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): DMEM Ορός βοός (fetal bovine serum, FBS) 45 ml 5 ml Ανακαλλιέργεια κυττάρων Ανακαλλιέργεια κυττάρων A7r5, NIH3T3 και DU145 Πειραματική πορεία 1. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισμός του βαθμού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά τα οποία είναι προσκολλημένα στο δάπεδο του τρυβλίου. 2. Μεταφορά του τρυβλίου με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας και ξέπλυμα των κυττάρων μία φορά με PBS (1X). Με την διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. 40

41 4. Προσθήκη 1ml τρυψίνης ανά τρυβλίο 100mm. Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη. 5. Μετά την αποκόλληση των κυττάρων, προστίθενται 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου έτσι ώστε να ανασταλλεί η δράση της τρυψίνης. 6. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα falcon των 15ml. 7. Προσθήκη PBS και συλλογή των κυττάρων που έχουν εναπομείνει μέσα σε τρυβλίο. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στους 25 o C στις 1660 rpm. 8. Απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου και προσθήκη 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Επαναιώρηση των κυττάρων με την βοήθεια πιπέτας. 9. Προσθήκη 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρόμετρου και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 10. Για κάθε ανακαλλιέργεια κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα. Υλικά και διαλύματα Τρυψίνη EDTA (ethelenediaminetetraacetic acid) PBS (Phosphate Buffered Saline) Πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM Αιματοκυτταρόμετρο Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC Πειραματική πορεία 1. Για την καλλιέργεια των κυτταρων HUVEC απαιτείται να έχει προηγηθεί επίστρωση των τρυβλίων με διάλυμα ζελατίνης 1% κ.β. 2. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται είναι πλήρες Μ199. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ζελατίνης 1% κ.β. σε PBS. Τρυψίνη EDTA. Θρεπτικό μέσο Μ199 Πλήρες θρεπτικό μέσο Αιματοκυτταρόμετρο Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευση τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες μεταξύ -135 o C και -175 o C. Για την επιτυχή διατήρηση τους είναι απαραίτητο να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό κατά γενικό κανόνα η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Επιπλέον, η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται 41

42 βαθμιαία (περίπου 1 o C ανά ώρα) μέχρι η θερμοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιμο σημείο (-20 o C), προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού. Επίσης, για να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό των κυττάρων, καταψύχονται παρουσία διμέθυλου-σουλφοξύδιου (DMSO) ή γλυκερόλης. Πειραματική πορεία 1. Αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται, όπως περιγράφτηκε παραπάνω. 2. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στους 25 o C στις 1660 rpm. 3. Ενώ πραγματοποιείται η φυγοκέντρηση, προστίθενται σε ένα cryovial 100 μl DMSO. Σημειώνεται στο cryovial ο κυτταρικός τύπος, η ημερομηνία ψύξης, ο αριθμός των κυττάρων καθώς και η γενιά τους από τη στιγμή που ξεπαγώνουν. 4. Όταν ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση, αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. 5. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 900 μl ορού. 6. Προσθήκη του εναιωρήματος των κυττάρων στα 50 μl DMSO και πολύ γρήγορη ανάδευσή τους προκειμένου να επιτευχθεί η ομοιογενής κατανομή του DMSO. Η τελική συγκέντρωση του DMSO είναι 10% (δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% καθώς αυξάνεται η τοξική του επίδραση στα κύτταρα) και χρησιμοποιείται προκειμένου να αμβλυνθεί η επίδραση της δημιουργίας κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων. 7. Τοποθέτηση των κυττάρων σε κατάλληλες υποδοχές σε δοχείο ψύξης κυττάρων που περιέχει παγωμένη ισοπροπανόλη, στους -200C για ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας των κυττάρων (περίπου 10C ανά ώρα). Η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας συμβάλλει στη μεγαλύτερη βιωσιμότητα τους. 8. Τοποθέτηση των κυττάρων για διατήρηση σε καταψύκτη -80 o C. Υλικά και διαλύματα DMSO (dimethylsulfoxide, διμέθυλο-σουλφοξύδιο). Πλήρες θρεπτικό μέσο Ορός νεογέννητου βοός (fetal bovine serum, FBS). Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials). Ειδικό δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη. Δοχείο ψύξης κυττάρων (υγρό άζωτο) το οποίο περιέχει ισοπροπανόλη και επιτρέπει την ήπια αρχική ψύξη των κυττάρων Απόψυξη κυττάρων Κατά τη διαδικασία αυτή κύτταρα τα οποία έχουν παραμείνει παγωμένα ακόμα και για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατό να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία γίνεται και αυτή υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου τα κύτταρα να μην εκτεθούν στο DMSO, το οποίο πιθανώς να δράσει τοξικά. Πειραματική πορεία 1. Σε αποστειρωμένο σωληνάκι των 15 ml προστίθενται 9 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 2. Αφαίρεση των κυττάρων από τον καταψύκτη των -80 o C. 3. Ξεπάγωμα των κυττάρων όσο το δυνατόν πιο γρήγορα, με ανακίνηση σε υδατόλουτρο 37 o C. 42

43 4. Μεταφορά των κυττάρων στα 9 ml του θρεπτικού μέσου που είναι ήδη έτοιμο και ανάμιξη με γρήγορες κινήσεις. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο οποίο βρίσκονται τα κύτταρα, που σε θερμοκρασία δωματίου είναι πολύ τοξικό για αυτά. 5. Φυγοκέντρηση για για 4 λεπτά στους 25 o C στις 1660 rpm. 6. Αφαίρεση του υπερκείμενου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 8. Προσθήκη επιπλέον 4ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 9. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στους 25 o C στις 1660 rpm. 10. Αφαίρεση του υπερκείμενου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 11. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Προσθήκη επιπλέον πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι τελικού όγκου 10 ml. 12. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. 13. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 14. Καλλιέργεια των κυττάρων, ανανεώνοντας το θρεπτικό μέσο κάθε 3-4 ημέρες, μέχρι να φτάσουν σε ένα βαθμό 80-90% κάλυψης του τρυβλίου Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο (εικόνα Μ1) είναι μια τροποποιημένη και διαβαθμισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα, που περιέχει δυο κατάλληλα κατεργασμένες, λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια απ αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (συνεπάγεται ότι το εμβαδόν του τετραγώνου είναι 1mm 2 ). Το καθένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους μόλις 2,5 μm και χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων (το αν αυτά βρίσκονται μέσα ή έξω από το πλέγμα). Το κάθε τετράγωνο εμφανίζει διαβαθμίσεις (χωρίζεται σε μικρότερα τετράγωνα) που εξυπηρετούν την ευκολότερη μέτρηση των κυττάρων. 1.0 mm Πρώτο τετράγωνο περιοχή βάθος όγκος = μετρήσιμα = μη μετρήσιμα Εικόνα 3-5 : Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Το αιματοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο 43

44 παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0,1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης γυαλισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια (αυλάκωση). Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 x 0,1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα (σε κύτταρα / ml) είναι: Μέτρηση στο ένα από τα κύρια τετράγωνα Χ Western ανάλυση Πειραματική πορεία για Western Assay Πειραματική πορεία 1. Το πρώτο τμήμα της μεθόδου αποτελεί η διαδικασία της ανακαλλιέργειας των κυττάρων, που περιγράφηκε προηγούμενα. Συγκεκριμένα, ακολουθούνται τα βήματα της ανακαλλιέργειας, και η διαφοροποίηση της διαδικασίας εμφανίζεται μετά τη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο Neubauer. 2. Καθορίζουμε τις αραιώσεις του διαλύματος των κυττάρων, ώστε σε ένα μικροπλακίδιο που έχει 6 μικροκυψελίδες να προστεθούν κύτταρα ανά μικροκυψελίδα σε τελικό όγκο 2 ml πλήρους θρεπτικού μέσου 3. Αφήνουμε τα κύτταρα να αναπτυχθούν στους 37 ο C για 24 ώρες αναμένοντας το ποσοστό των κυττάρων που θα έχει κολλήσει στην επιφάνεια του τρυβλίου να φτάνει περίπου στο 80 %. 4. Την επόμενη μέρα αφαιρούμε το πλήρες θρεπτικό μέσο από τις μικροκυψελίδες του πλακιδίου και προσθέτουμε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό που περιέχει 0,1% BSA. Το πλακίδιο επανατοποθετείται στον επωαστή στους 37 ο C για 24 ώρες. 5. Στη συνέχεια προσθέτουμε τις υπό μελέτη ουσίες στις επιθυμητές συγκεντρώσεις στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και οι μικροκυψελίδες τοποθετούνται στον επωαστή, όπου επωάζονται για το επιθυμητό χρονικό διάστημα σε απόλυτη θερμοκρασία 37 ο C. 6. Μετά τη συμπλήρωση των ωρών απομακρύνεται το θρεπτικό μέσο των κυττάρων με πιπέτα Pasteur υπό κενό και ακολουθεί πλύσιμο (2 φορές) με κρύο PBS. Προσθήκη 100 μl/μικροκυψελίδα διαλύματος λύσης των κυττάρων RIPA παρουσία αναστολέων, επώασή τους για 20 λεπτά στον πάγο και αποκόλληση των κυττάρων με ειδική ελαστική ξύστρα (cell scraper). 7. Συλλογή των δειγμάτων σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρου, καλή ανάδευση (vortex) έτσι ώστε τα δείγματα να είναι ομοιογενή και έπειτα ποσοτικός προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης για περαιτέρω ανάλυση των δειγμάτων κατά Western. Τα δείγματα διατηρούνται στους - 20 ο C. Yλικά και Διαλύματα o Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer 44

45 o Μικροπλακίδιο που έχει 6 μικροκυψελίδες o DMEM o BSA o Ορό o Διάλυμα λύσης RIPA το οποίο περιέχει : 98 ml PBS, 1 ml Triton, 1 ml SDS 10% o Αναστολείς φωσφατασών : 200 mm Νa3VO4 (1:200), 500 mm ΝaF (1:10), Αναστολείς πρωτεασών : 100 PMSF (1:100), Leupeptin (1:1000) o Ελαστική ξύστρα (cell scraper) o PBS o Σωληνάρια μικροφυγοκέντρου Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυμα Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυμα γίνεται με βάση το Κit Micro BCA Protein Assay Kit της εταιρείας Τhermo scientific, Pierce Protein Research Products. Πειραματική πορεία 1. Ετοιμάζουμε 8 διαλύματα BSA (Bovine Serum Alboumin) με γνωστές πρότυπες συγκεντρώσεις 0 έως 6,4 mg/ml. Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς πρέπει πάντα να ετοιμάζεται πριν από κάθε μέτρηση και μάλιστα είναι πολύ σημαντικό να είναι στο ίδιο διάλυμα λύσης με τα υπό εξέταση ως προς την πρωτεΐνη δείγματα. 2. Προετοιμασία τελικού διαλύματος : αναμειγνύονται καλά σε σωλήνα falcon των 15 ml 1250 μl από το Micro BCA Reagent A (MA), 1200 μl από το Micro BCA Reagent Β (MΒ) και 50 μl από το Micro BCA Reagent C (MC). Αυτό είναι το τελικό διάλυμα και ετοιμάζεται ακριβώς πριν από την εκάστοτε χρήση. 3. Με τη χρήση πολλαπλής πιπέτας καλύπτουμε τις απαιτούμενες μικροκυψελίδες ενός 96 - πλακιδίου με 45 μl απιονισμένο νερό. 4. Στη συνέχεια μεταφέρουμε 5 μl από τα 8 διαλύματα πρωτεΐνης BSA γνωστής συγκέντρωσης σε κάθε μικροκυψελίδα του πλακιδίου αντίστοιχα (κάθε συγκέντρωση σε δυο μικροκυψελίδες για πιο αξιόπιστα αποτελέσματα) και την ίδια ποσότητα από τα προς μέτρηση δείγματα (ομοίως). Φροντίζουμε τα δείγματά μας να βρίσκονται στον πάγο κατά τη διάρκεια της όλης διαδικασίας. 5. Έπειτα με τη χρήση της πολλαπλής πιπέτας προσθέτουμε 50 μl από το τελικό διάλυμα σε κάθε μικροκυψελίδα. 6. Κάνουμε ήπια ανάδευση του πλακιδίου για 30 δευτερόλεπτα προσεκτικά ώστε να μην αναμειχθούν τα δείγματα και να αποφύγουμε το σχηματισμό φυσαλίδων. 7. Καλύπτουμε το πλακίδιο με διάφανη μεμβράνη και επωάζουμε το πλακίδιο στους 37 o C για 2 ώρες. 8. Κατόπιν αφήνουμε το πλακίδιο να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου, ελέγχουμε τυχόν παρουσία φυσαλίδων τις οποίες και αφαιρούμε και μετράμε την απορρόφηση σε μήκος κύματος 560 nm SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Η ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Το SDS είναι ένα ιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία βάρους (1,4 gr SDS / gr πρωτεΐνης). Η επιπλέον 45

46 χρήση αναγωγικών παραγόντων, όπως είναι η διθειοθρεϊτόλη (DTT) ή η β-μερκαπτοαιθανόλη, έχει ως αποτέλεσμα την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών των πρωτεϊνών. Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων για 10 λεπτά στους 100 o C, παρουσία όλων των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων. Εξαιτίας του SDS, οι πρωτεΐνες που περιέχονται στα δείγματα έχουν φορτιστεί αρνητικά και είναι δυνατή η κίνησή τους όταν βρεθούν εντός ηλεκτρικού πεδίου. Η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του μοριακού τους βάρους. Πειραματική πορεία 1. Διαμορφώνεται ειδική υάλινη μήτρα διαστάσεων 9,5 cm X 7,5 cm X 0,1 cm, μέσα στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός των πηκτωμάτων διαχωρισμού και συμπυκνώσεως. 2. Πραγματοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωμα διαχωρισμού. 3. Απόχυση των υγρών ακόμα συστατικών του πηκτώματος διαχωρισμού στην υάλινη μήτρα και επικάλυψη με απεσταγμένο νερό. Παρατηρούμε τον πολυμερισμό του πηκτώματος έτσι ώστε να βεβαιωθούμε ότι πραγματοποιείται φυσιολογικά (2-15 λεπτά, ανάλογα με τη σύσταση του πηκτώματος ή/και τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος). 4. Απόχυση του απεσταγμένου νερού από την επιφάνεια του πηκτώματος. 5. Πραγματοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωμα συμπυκνώσεως. 6. Απόχυση των υγρών ακόμα συστατικών του πηκτώματος συμπυκνώσεως στην υάλινη μήτρα, πάνω από την επιφάνεια του πηκτώματος διαχωρισμού. Προσθήκη κατάλληλης ελαστικής μήτρας, η οποία είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία των φρεατίων στο πήκτωμα συμπυκνώσεως. Παρατηρούμε τον πολυμερισμό του πηκτώματος για να βεβαιωθούμε ότι πραγματοποιείται φυσιολογικά (5-15 λεπτά ανάλογα με τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος). 7. Ανάμιξη των δειγμάτων που θα ηλεκτροφορηθούν με ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων 10x σε αναλογία 9:1. 8. Θέρμανση των δειγμάτων για 5 λεπτά στους 100 o C και άμεση τοποθέτησή τους στον πάγο. 9. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 1 λεπτό στα g σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Προσθήκη των δειγμάτων στις ειδικές υποδοχές του πηκτώματος συμπύκνωσης. 11. Πραγματοποίηση της ηλεκτροφόρησης σε θερμοκρασία δωματίου με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης 35 ma, μέχρι η χρωστική μπλε της βρωμοφαινόλης να φθάσει 0,5 cm πριν το άκρο του πηκτώματος της ηλεκτροφόρησης. 12. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF (Western Blot). Υλικά και διαλύματα 1,5 M Tris-HCl ph 8,8: Τris-base 45,4 gr Απεσταγμένο H 2 O 180 ml Το διάλυμα ρυθμίζεται σε ph=8,8 με τη χρήση διαλύματος HCl 37% και συμπληρώνεται απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 250 ml. Διατηρείται στους 4 o C. 0,5 M Tris-HCl ph 6,8: Τris-base 6,05 gr 46

47 Απεσταγμένο H 2 O 80 ml Το διάλυμα ρυθμίζεται σε ph=6,8 με τη χρήση διαλύματος HCl 37% και συμπληρώνεται απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διατηρείται στους 4 o C. Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% της Applichem Διάλυμα SDS 10% κ.β.: SDS Απεσταγμένο H 2 O 10 gr 100 ml Διάλυμα υπερθεϊικού αμμωνίου 20% κ.β.: Υπερθεϊικό αμμώνιο Απεσταγμένο H 2 O 2 gr μέχρι τελικού όγκου 1 ml TEMED Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (4x) Tris 0,5 M ph 6,8 Γλυκερόλη SDS Bromophenol blue 1% Μερκαπτοαιθανόλη 5 ml 4 ml 1 gr 0,8 ml 200ml Μερκαπτοαιθανόλης/1ml ρυθμιστικού διαλύματος 4x Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (10x) Tris-base 30,2 gr Γλυκίνη 144,2 gr Απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 1 lt. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώνεται 1:10 (1x) με απεσταγμένο H 2 O πριν από τη χρήση του. Στο τελικό διάλυμα 1 lt (1x) προστίθεται και 10 ml (10% κ.β SDS). Πήκτωμα συμπυκνώσης (3,5%) d H 2 O Διάλυμα 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου SDS 10% κ.β Ammonium persulfate (AP) 20% TEMED 2,9 ml 1,25 ml 0,95 ml 50 μl 31,5 μl 7,5 μl 47

48 Πήκτωμα διαχωρισμού 10% 12% dh 2 O 6,5 ml 5,5 ml Διάλυμα 5 M Tris-HCl ph 8,8 3,75 ml 3,75 ml Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 5 ml 6 ml SDS 10% κ.β 150 μ 150 μl AP 20% 55 μl 55 μl TEMED 7,5 μl 7,5 μl Ανοσοαποτύπωμα (Western blot) Η μέθοδος αυτή επιτρέπει την εκλεκτική ανίχνευση μιας πρωτεΐνης-αντιγόνου, με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων που έχουν παρασκευαστεί γι αυτό. Η μέθοδος περιλαμβάνει την ηλεκτροφορητική ανάλυση ενός πρωτεϊνούχου διαλύματος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, την ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες και τέλος τη δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων στο αντιγόνο. Μετά από την κάλυψη των κενών θέσεων της μεμβράνης (blocking) πραγματοποιείται επώαση της μεμβράνης με ειδικό έναντι του υπό μελέτη αντιγόνου αντίσωμα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με αντίσωμα που αναγνωρίζει την Fc περιοχή του πρώτου αντισώματος. Το δεύτερο αντίσωμα είναι σημασμένο είτε ενζυμικά είτε ραδιενεργά, οπότε είναι δυνατή η ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος μετά από την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος. Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, όλα τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν σημασμένα ενζυμικά με την υπεροξειδάση (horse-raddish peroxidase, HRP). Πειραματική πορεία 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Εφαρμογή σταθερής ένταση ρεύματος 400 ma για 1,5 ώρα. Τα δείγματα μεταφέρονται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. Εικόνα 3-5 : Σχηματική της συσκευής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών. Αριστερά, σε μεγέθυνση απεικονίζεται η διάταξη που απαιτείται για τη σωστή ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών. Αυτή περιλαμβάνει σπόγγους, 48

49 χαρτιά Whatman, την PVDF μεμβράνη, το πήκτωμα και την πλαστική κασετίνα ή οποία τα συμπιέζει. Η φορά της κίνησης των πρωτεϊνών είναι από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. 3. H μεμβράνη υφίσταται κατάλληλη επεξεργασία ανάλογα με το είδος της πρωτεΐνης που αναλύεται, προκειμένου να πραγματοποιηθεί ή παρεμποδιστεί η μη ειδική δέσμευση των αντισωμάτων. 4. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS T 0,1% σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Εμβάπτιση της μεμβράνης και επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση. 6. Συλλογή του πρώτου αντισώματος. 7. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS T 0,1%σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα, σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση. 9. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS T 0,1% σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Εμφάνιση του ανοσοστυπώματος της πρωτεΐνης στη μεμβράνη με σύστημα χημειοφωταύγειας. Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών : Γλυκίνη Tris base Μεθανόλη Απεσταγμένο H 2 O 7,5 gr 1,5 gr 100 ml μέχρι τελικού όγκου 1 lt Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7,6 (10x): Tris base NaCl Απεσταγμένο H 2 O 24,2 gr 80 gr 800 ml Ρυθμίζεται το ph του διαλύματος σε τιμή ίση με 7,6 με τη χρήση πυκνού διαλύματος HCl (37%) και συμπληρώνεται ο όγκος του μέχρι 1lt με απεσταγμένο H 2 O. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και χρησιμοποιείται ως 1x μετά από αραίωση 1:9 με απεσταγμένο H 2 O. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride): Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS Tween 20 ph 7,6 (ΤΒS-T) Σύστημα Χημειοφωταύγειας: Χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την εταιρεία Chemicon (ChemiLucentTM #2600). 49

50 Αντίσωμα SM-α-Actin ( A5228) Calponin (C2687) Transgelin-SM22α (AP16212PU-N) β-tubulin (#05-661) Erk1/2 (#9102) Phospho Erk1/2 (#9101, rabbit) Anti-rabbit IgG (sc2004, goat) Anti-mouse IgG (sc2005, goat) Anti-goat IgG (sc2020, goatdonkey) Προέλευση Μονοκλωνικό αντίσωμα, Sigma Μονοκλωνικό αντίσωμα, Sigma Acris Μονοκλωνικό αντίσωμα, Μillipore Μονοκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Μονοκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Santa Cruz Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Santa Cruz Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Santa Cruz Πίνακας 3-1 : Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τα πειράματα με ανοσοαποτύπωμα. Αντίσωμα Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1ο αντίσωμα (overnight) 2ο αντίσωμα (1 ώρα, 100 o C) SM-α-Actin (mouse) 5% Άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1% 1:1500 σε TBS-T 0,1% Anti-mouse 1:5.000 σε TBS-T 0,1% Calponin (mouse) 5% Άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1% 1:1500 σε TBS-T 0,1% Anti-mouse 1:5.000 σε TBS-T 0,1% SM22α (goat) 5% Άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1% 1:1000 σε TBS-T 0,1% Anti-goat 1:5.000 σε TBS-T 0,1% β-tubulin (mouse) 5% Άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1% 1:1500 σε TBS-T 0,1% Anti-mouse 1:5.000 σε TBS-T 0,1% Πίνακας 3-2 : Συνθήκες οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν κατά τα ανοσοαποτυπώματα που πραγματοποιήθηκαν Αποδέσμευση αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) Η διαδικασία της ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western σε μεμβράνες PVDF παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των μεμβρανών για επώαση με διαφορετικά αντισώματα. Με τη διαδικασία της αποδέσμευσης των αντισωμάτων (stripping) πραγματοποιείται αποκόλληση από τη μεμβράνη των συμπλόκων πρώτου και δεύτερου αντισώματος, ενώ παραμένουν προσκολλημένες στη μεμβράνη οι ισχυρά δεσμευμένες (με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) σε αυτήν πρωτεΐνες από την ηλεκτρομεταφορά. 50

51 Πειραματική πορεία 1. Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ, ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με διάλυμα TBS-T 0,1%. 2. Επώαση της μεμβράνης με το διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C υπό ανάδευση. 3. Ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T 0,1%. 4. Πραγματοποιείται επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης αντισωμάτων: 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 25 ml SDS 4 gr β-μερκαπτοαιθανόλη 1600 μl Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20 ph 7,6 (TBS-T) Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων πρωτεϊνών με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προκειμένου να εξαχθούν ποσοτικά συμπεράσματα από τα ανοσοαποτυπώματα πρωτεϊνών, γίνεται ποσοτικοποίηση των ζωνών με τη χρήση συστήματος ανάλυσης εικόνας. Τα φίλμ σκανάρωνται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή και αναλύονται με τα προγράμματα Adobe Photoshop και Scion Image. Το λογισμικό είναι ρυθμισμένο κατάλληλα ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται, να καταγράφεται αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δύο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για τις ποσοτικές αναλύσεις Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εξήχθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων (μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα) έγινε με τη χρήση του unpaired t-test. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, μελετήθηκε η μεταβολή σε σχέση με συγκεκριμένη πειραματική ομάδα. 51

52 3.3 Καλλιέργειες βακτηρίων Παρασκευή δεκτικών βακτηρίων Παρασκευάστηκαν δεκτικά βακτήρια Ecoli χρησιμοποιώντας το στέλεχος DH5α με τη μέθοδο του χλωριούχου ρουβιδίου. Πειραματική πορεία 1. Από τρυβλίο επιστρωμένο με στερεό θρεπτικό με άγαρ χωρίς αντιβιοτικό όπου έχουν αναπτυχθεί over night αποικίες δεκτικών κυττάρων DH5α, μεταφέρεται μία αποικία σε αποστειρωμένο σωλήνα των 50 ml, στο οποίο έχουν προηγουμένως τοποθετηθεί 5 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB, και αφήνονται να αναπτυχθούν over night στον επωαστικό θάλαμό στους 37 ο C υπό ανάδευση. 2. Σε αποστειρωμένη κωνική φιάλη των 1000 ml μεταφέρονται 500 ml LB και τα 5 ml των βακτηρίων από την υγρή καλλιέργεια. Η κωνική φιάλη τοποθετείται στον επωαστικό θάλαμο στους 37 ο C υπό ανάδευση. Τα βακτήρια αφήνονται να αναπτυχθούν μέχρι η οπτική απορρόφηση στα 600nm να φτάσει περίπου την τιμή 0,5 (0-4-0,6). 3. Όταν η οπτική απορρόφηση στα 600nm φθάσει περίπου την τιμή 0,5 η κωνική φιάλη με την καλλιέργεια τοποθετείται απευθείας στον πάγο, όπου και παραμένει για 10 λεπτά (ώστε τα βακτήρια να σταματήσουν τον πολλαπλασιασμό). Η όλη η διαδικασία γίνεται στον πάγο. 4. Η καλλιέργεια που βρίσκεται στην κωνική μεταφέρεται σε δύο αποστειρωμένους σωλήνες των 500 ml. Οι σωλήνες φυγοκεντρούνται στους 4 ο C για 10 λεπτά στις 6000rpm. 5. Αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο ακολουθεί σταδιακή προσθήκη διαλύματος ΤΒ (το οποίο είναι κρύο και διατηρείται στους 4 ο C ) και ήπια ανάδευση του ιζήματος. Στη συνέχεια τα κύτταρα αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Οι σωλήνες φυγοκεντρούνται στους 4 ο C για 10 λεπτά στις 4500rpm. 6. Απομακρύνεται το υπερκείμενο. Ακολουθεί ήπια ανάδευση του ιζήματος σε 18,6 ml κρύου διαλύματος ΤΒ και προσθήκη 1,4 ml DMSO. Στη συνέχεια τα κύτταρα αφήνονται στον πάγο τουλάχιστον για 10 λεπτά. 7. Το εναιώρημα των βακτηριακών κυττάρων χωρίζεται σε aliquot των 200 μl. Στη συνέχεια τα βακτήρια παγώνονται σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται στους -80 ο C. Υλικά και διαλύματα TB Buffer 10mM HEPES 10mM CaCl2 250mM KCl Ρύθμιση του ph=6,7 με KOH 55mM MnCl2 Το διάλυμα φιλτράρεται, αποστειρώνεται και διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου. Θρεπτικό υλικό LB 52

53 3.3.2 Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Οι περισσότερες μέθοδοι για βακτηριακό μετασχηματισμό βασίζονται στις παρατηρήσεις των Mandel και Higa οι οποίοι έδειξαν ότι βακτήρια τα οποία είχαν προηγουμένως επεξεργαστεί με παγωμένα διαλύματα CaCl2 και στη συνέχεια θερμανθεί για μικρό χρονικό διάστημα, μπορούσαν να μετασχηματιστούν με DNA από λ βακτηριοφάγο. Από τότε έχουν αναπτυχθεί πολλές παραλλαγές αυτής της βασικής τεχνικής, με σκοπό τη βελτιστοποίηση της απόδοσης της μεθόδου. Για το μετασχηματισμό μας χρησιμοποιήθηκαν δεκτικά κύτταρα με τη χρήση χλωριούχου ρουβιδίου. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε σε κύτταρα DH5α και δίνει συχνότητα μετασχηματισμού ~108 αποικίες ανά μικρογραμμάριο πλασμιδιακού DNA. O μετασχηματισμός έγινε με την μέθοδο του θερμικού σοκ. Δεκτικά κύτταρα E.coli ξεπαγώνονται από τους -80 ο C στον πάγο. Πειραματική πορεία 1. Σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιούνται 100 μl δεκτικά κύτταρα. Τα κύτταρα ξεπαγώνονται στον πάγο. 2. Προσθήκη 2μg πλασμιδιακoύ DNA στον σωλήνα με τα κύτταρα. 3. Το σωληνάκι με τα κύτταρα τοποθετούνται για μισή ώρα στον πάγο και έπειτα σε υδατόλουτρο στους 42 ο C για 90 δευτερόλεπτα ακριβώς. 4. Τα κύτταρα μεταφέρονται αμέσως στον πάγο όπου ψύχονται για 2 λεπτά και αμέσως μετά παραμένουν στον πάγκο. 5. Στη συνέχεια προστίθενται 1000 μl θρεπτικού υλικού (soc medium) σε κάθε σωληνάριο και ακολουθεί επώαση των βακτηριακών κυττάρων υπό ανακίνηση στους 37 ο C για μία ώρα. 6. Φυγοκέντρηση των κυττάρων για 8 λεπτά στις 7000 rpm 7. Αφαίρεση το υπερκείμενου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 100 μl soc. Γίνονται δύο αραιώσεις 1 και 1: Σε τρυβλία Petri επιστρώνουμε 100 μl από το κάθε διάλυμα κυττάρων. 9. Αφού απορροφηθούν οι ποσότητες αυτές, τα τρυβλία τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο στους 37 ο C για όλη τη νύχτα. Η διαδικασία όλη πραγματοποιείται στην φλόγα και οι διασπορείς είναι αποστειρωμένοι. Υλικά και διαλύματα Δεκτικά κύτταρα E.coli DH10B Soc medium Τρυβλία Petri στρωμένα με θρεπτικό υλικό που περιέχουν το αντιβιοτικό αμπικιλίνη (100mg/ml). Θρεπτικό υλικό για κύτταρα, LB Σωληνάρια μικροφυγοκέντρου Υδατόλουτρο 37 ο C 53

54 3.3.3 Στερεή καλλιέργεια βακτηρίων E.coli, διαλογή μετασχηματισμένων βακτηρίων και ανακαλλιέργεια τους σε υγρό θρεπτικό υλικό Τα μετασχηματισμένα κύτταρα E.coli αφήνονται να αναπτυχθούν σε τρυβλία Petri τα οποία είναι επιστρωμένα με στερεό θρεπτικό υλικό (L-Broth). Στο θρεπτικό υλικό πριν την αποστείρωση άγαρ σε τελική συγκέντρωση 1%. Επίσης μετά την αποστείρωση και πριν την τοποθέτηση του θρεπτικού με το άγαρ υλικού στα τρυβλία Petri προστίθεται αμπικιλίνη (100mg/ml). Στη συνέχεια τα κύτταρα διασπείρονται με διασπορέα και αφήνονται για επώαση στους 37 ο C για όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα που έχουν μετασχηματιστεί και περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο είναι εκείνα τα οποία επιζούν (παρουσία αποικιών) καθώς στην αλληλουχία του πλασμιδίου περιέχεται και το γονίδιο το οποίο τα καθιστά ανθεκτικά να αναπτυχθούν σε υπόστρωμα που περιέχεται αμπικιλίνη. Μια αποικία από τα βακτήρια που έχουν μετασχηματιστεί με πλασμίδιο και έχουν αναπτυχθεί σε στερεή καλλιέργεια μεταφέρονται με εμβολιασμό σε 5 ml LB που περιείχε 5 λ αμπικιλίνης (100mg\ml). Ακολουθεί για όλη τη νύχτα ανάδευση στους 37 ο C. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό υλικό LB Bactotryptone 5g Bacto yeast 2,5g NaCl 5g Απεσταγμένο H 2 O σε τελικό όγκο 500ml Από τα δείγματα αυτά απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA (mini-preps: Nucleospin Plasmid, της εταιρίας Macherey-Nagel ). Στην περίπτωση μεσαίας κλίμακας απομόνωσης πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιήθηκε το Nucleobond Xtra Midi της εταιρίας Macherey-Nagel. Η μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA έχει απόδοση 1-3 μg/ml καλλιέργειας, ενώ η μεσαίας κλίμακας απομόνωση έχει απόδοση 2-4 μg/ml καλλιέργειας Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Mικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (mini prep) Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε με χρήση των αντιδραστηρίων της εταιρείας Macherey Nagel (Nucleospin Plasmid). Πειραματική πορεία 1. Οι υγρές καλλιέργειες αφήνονται για ανακίνηση μία ολόκληρη νύχτα (overnight) στους 37 ο C. 2. Αφού τις απομακρύνουμε από τον επωαστικό θάλαμο μεταφέρουμε για κάθε δείγμα μία ποσότητα (1ml) σε σωλήνα eppendorf και κάνουμε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στη μέγιστη ταχύτητα. Στη συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο, ενώ τα σωληνάκια eppendorf τοποθετούνται ανάποδα και αφήνονται να στεγνώσουν. 3. Σε κάθε δείγμα προστίθενται 250 μl από το διάλυμα Α1 και αιωρούμε τα κύτταρα πολύ 54

55 καλά με την πιπέτα. 4. Σε κάθε eppendorf προστίθενται 250 μl από το διάλυμα Α2, γίνεται ήπια ανακίνηση 6-8 φορών και τέλος τα δείγματα αφήνονται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (στους 25 ο C). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να σπάνε τα βακτηριακά κύτταρα και να απελευθερώνεται το πλασμιδιακό DNA. 5. Στη συνέχεια ακολουθούν προσθήκη 300 μl από το διάλυμα A3, ήπια ανακίνηση 6-8 φορών και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 17000xg. Το διάλυμα A3 προκαλεί κατακρήμνιση των πρωτεϊνών και του βακτηριακού DNA. 6. Ακολουθούν αφαίρεση του υπερκείμενου προσεκτικά με την πιπέτα, τοποθέτηση του φίλτρου στην κολώνα και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. 7. Αφού απομακρυνθεί από το σωλήνα συλλογής το διάλυμα που διαπέρασε το φίλτρο, προστίθενται σε κάθε φίλτρο 500 μl από το διάλυμα AW το οποίο έχει ήδη θερμανθεί στους 50 ο C. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. 8. Απομάκρυνση από το σωλήνα συλλογής το διαλύματος που διαπέρασε το φίλτρο. Στη συνέχεια προστίθενται σε κάθε φίλτρο 600 μl από το διάλυμα Α4 και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. Με το διάλυμα Α4 απομακρύνεται το αλάτι, οι μεταβολίτες και κάθε είδους άχρηστο συστατικό που μπορεί να υπάρχει στο δείγμα μας. Αφού απομακρυνθεί το υγρό που διαπερνά το φίλτρο επαναλαμβάνεται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 11000xg ώστε να στεγνώσει πολύ καλά η μεμβράνη. 9. Τοποθέτηση του κάθε φίλτρου σε σωλήνα eppendorf και προσθήκη 50 μl από το διάλυμα ΑΕ. Αφήνουμε τα δείγματα για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου (στους 25 ο C ). Τέλος πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. Tα καθαρά πλασμίδια αποθηκεύονται στο ψυγείο στους -20 ο C. Υλικά και διαλύματα κολώνες φυγοκέντρου σωλήνες συλλογής τα διαλύματα: o Α1 (Resuspension Buffer+RNAase A) o Α2 (Lysis Buffer) o Α3 (Neutralization Buffer) o ΑW (Wash Buffer) o A4 (Wash Buffer) o AE (Elution Buffer) Μεγάλης κλίμακας απομόνωση (midi prep) Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε με χρήση των αντιδραστηρίων της εταιρείας Macherey Nagel (NucleoBond Xtra Midi). Πειραματική πορεία ml καλλιέργειας βακτηρίων E. coli, σε θρεπτικό υλικό LB-αμπικιλίνη, επωάζονται για όλη τη νύχτα στους 37 ο C, με ανάδευση (250 rpm). 2. Η καλλιέργεια μεταφέρεται σε αποστειρωμένο πλαστικό σωλήνα των 50 ml και φυγοκεντρείται σε rpm, για 10 λεπτά στους 4 ο C. 3. Ακολουθεί απομάκρυνση του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος των βακτηρίων με 55

56 8 ml από το διάλυμα επαναιώρησης των κυττάρων (Buffer RES). 4. Στη συνέχεια προστίθενται στο σωλήνα 8 ml από το διάλυμα λύσης των κυττάρων (Buffer LYS). Ο σωλήνας αναδεύεται 5-6 φορές και επωάζεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Εξισσορόπηση τη στήλης με 12 ml από το διάλυμα ΕQU. Η στήλη αφήνεται να αδειάσει με τη βοήθεια της βαρύτητας ενώ βεβαιώνεται ότι το εσωτερικό φίλτρο έχει βραχεί καλά. 6. Ακολουθεί προσθήκη 8 ml στο σωλήνα από το διάλυμα ουδετεροποίησης ΝΕU και αφού αναδευτεί το δείγμα φόρες καλά περιχύνεται το περιεχόμενό του στη στήλη. 7. Αναμένεται μέχρι να περάσει όλο το περιεχόμενο της στήλης από το εσωτερικό φίλτρο και στη συνέχεια η στήλη ξεπλένεται με 5 ml από το διάλυμα ΕQU. 8. Στη συνέχεια αφαιρείται το φίλτρο της στήλης και ακολουθεί δεύτερο ξέπλυμα της στήλης με 8 ml από το διάλυμα έκπλυσης (WΑSH). 9. Η έκλουση του DNA από το εσωτερικό φίλτρο της στήλης γίνεται με την προσθήκη 5ml από το διάλυμα έκλουσης (ΕLU) και το περιεχόμενο συλλέγεται σε καθαρό αποστειρωμένο σωλήνα. 10. Έπειτα προστίθεται στο σωλήνα 3,5 ml ισοπροπανόλης για να κατακρημινιστεί το πλασμιδιακό DNA. Το περιεχόμενο αναδεύεται πολύ καλά και αφήνεται για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 11. Αφαιρείται προσεκτικά το υπερκείμενο του σωλήνα και το ίζημα επαναιωρείται με 2 ml αιθανόλης 70%. Το περιεχόμενο μεταφέρεται σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου και φυγοκεντρείται στις g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 12. Αφαιρείται προσεχτικά το μεγαλύτερο μέρος της αιθανόλης από το σωληνάριο και αφού στεγνώσει το ίζημα για 5-10 λεπτά, το DNA επαναιωρείται σε 200 μl αποστειρωμένου απιονισμένου νερού. Υλικά και διαλύματα Αποστειρωμένες στήλες και τα διαλύματα: o Buffer RES (Διάλυμα επαναιώρησης των κυττάρων). Περιέχει και RNase A o Buffer LYS (Διάλυμα λύσης των κυττάρων) o Buffer ΕQU (Διάλυμα εξισσορόπησης) o Buffer ΝΕU (Διάλυμα ουδετεροποίησης) o Buffer WΑSH (Διάλυμα έκπλυσης) o Buffer ΕLU (Διάλυμα έκλουσης) o Ισοπροπανόλη o Αιθανόλη 70% Ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός του πλασμιδιακού DNA Πραγματοποιείται με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων. Για κάθε πλασμίδιο που απομονώθηκε έγινε μέτρηση της απορρόφησης με τη βοήθεια φωτομέτρου στα 260nm και στα 280nm. Ο λόγος των οπτικών πυκνοτήτων O.D.260\O.D.280 πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 1,8 για να θεωρηθεί το DNA πολύ καθαρό. Η συγκέντρωση του DNA υπολογίζεται αν λάβει κανείς υπ όψιν του ότι 1 O.D.260 nm ισοδυναμεί με 50μg\ml DNA (για το RNA είναι 40μg\ml DNA). Υλικά και διαλύματα ddh 2 O 56

57 Αυτόματες πιπέτες και tips Κυβέτα χαλαζία Διάλυμα DNA (αραίωση 1/60). Φωτόμετρο 1. Μηδενισμός του φωτομέτρου με τη χρήση νερού ως τυφλού (το διάλυμα στο οποίο διαλύθηκαν τα δείγματά μας κατά το τελευταίο στάδιο της απομόνωσης απομόνωσης πλασμιδίου) 2. Φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού και ανάλυση των αποτελεσμάτων σε πήκτωμα αγαρόζης Προκειμένου να γίνει έλεγχος και να επιβεβαιωθούν οι αλληλουχίες των πλασμιδίων που απομονώθηκαν, πραγματοποιήθηκαν πέψεις με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού όπως προέκυψαν μετά από μελέτη του χάρτη περιορισμού του εκάστοτε πλασμιδιακού φορέα καθώς επίσης και σύμφωνα με δεδομένα που είχαμε στα χέρια μας από τις συνεργασίες που μας προμήθευσαν τα πλασμίδια. Τα ρυθμιστικά διαλύματα των ενζύμων που χρησιμοποιήθηκαν είναι αυτά που διατίθενται αντίστοιχα από την εταιρία κατασκευής των ενζύμων (New England Biolabs). Υλικά και διαλύματα Ένζυμο περιορισμού Διάλυμα αντίδρασης ενζύμου (enzyme buffer 10x) Υπόστρωμα DNA (η ποσότητα του υποστρώματος καθορίζει και τις χρησιμοποιούμενες μονάδες του ενζύμου, καθώς και τον τελικό όγκο στον οποίο θα πραγματοποιηθεί η αντίδραση) Οι ποσότητες των ενζύμων προστίθενται στο DNA μας και στο διάλυμα (enzyme buffer 10x) σε σωληνάκια μικροφυγοκέντρου που βρίσκονται στον πάγο. (Ενδεικτικές πέψεις, από το σύνολο που πραγματοποιήθηκαν): 1) Για το πλασμίδιο α1α-ar: Ένζυμα EcoRV και HindIII : DNA : 1 μg EcoRV : 0,5 μl HindIII : 0,5 μl 10x R2 buffer : 2 μl H 2 O : χμl /20μl αντίδραση Ένζυμο ApaI : DNA : 1μg ApaI : 1μl 10x R1 buffer : 2μl H 2 O : χμl /20μl αντίδραση 57

58 2) Για το πλασμίδιο α1β-ar : Ένζυμο ΒamHI : DNA : 1μg ΒamHI : 1μl 10x BamHI buffer : 2μl H 2 O : χμl /20μl αντίδραση 1. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 3 ώρες. 2. Προκειμένου να διαχωριστούν τα τμήματα του DNA που έχουν προκύψει από τις πέψεις με ένζυμα περιορισμού ακολουθείται η τεχνική της ηλεκτροφόρησης. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το αρχικό πλασμιδιακό DNA από το οποίο προέκυψαν οι αποικίες χωρίς βέβαια να έχει γίνει καμία επεξεργασία με ένζυμα περιορισμού. Τα δείγματά μας ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα 1% αγαρόζης. Υλικά και διαλύματα o o o Διάλυμα ηλεκτροφόρησης 0.5x TBE Για 500 ml διαλύματος 5x TBE: 54 g Tris base 27,5 g βορικό οξύ, 4,8 g EDTA Η 2 Ο ως 500 ml Xρωστική Loading Dye 6x : 0.25% μπλέ της βρωμοφαινόλης, 0.25% κυανούν του ξυλολίου, 15% φικόλλη, σε H 2 O. Σε 50 ml διαλύματος ηλεκτροφόρησης διαλύoυμε με θέρμανση στους C 1 gr αγαρόζης. Στη συνέχεια προσθέτουμε 1,5 μl βρωμιούχο αιθίδιο και αφήνουμε το διάλυμα να στερεοποιηθεί σε πλαστική συσκευή-εκμαγείο. Στα δείγματα του DNA προσθέτουμε 1/6 v/v της χρωστικής Loading Dye 6x και τέλος αυτά αναλύονται σε συσκευές ηλεκτροφόρησης, υπό σταθερή τάση 100V. Σαν μάρτυρα χρησιμοποιoύμε το ladder 1Kbp. Δείγματα: Μάρτυρας: 5 μl DNA 5 μl Η 2 Ο 2 μl Loading Dye 6x 9 μl Η 2 Ο 1 μl 100bp Ladder 2 μl Loading Dye 6x Αποθήκευση βακτηρίων για μακροπρόθεσμη χρήση Πειραματική πορεία Οι αποικίες που είχαν αναπτυχθεί σε στερεή καλλιέργεια και επιλέχθηκαν, αποθηκεύτηκαν (stocks). Σε αποστειρωμένα σωληνάρια μικροφυγοκέντρου προστίθενται 700 λ από την αρχική υγρή καλλιέργεια από την οποία γίνεται η μικρής κλίμακας απομόνωσης του πλασμιδιακού DNA και 300 λ γλυκερόλη (30%). Ακολουθεί καλή ανάμειξη και αποθήκευση στους -80 ο C. Η διαδικασία πραγματοποιείται υπό φλόγα. 58

59 3.4 Διαμόλυνση κυττάρων Πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα διαμόλυνσης Τα περισσότερα από τα πλασμίδια αναφοράς της λουσιφεράσης τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη έχουν αποκτηθεί και βρίσκονται στο εργαστήριό μας στα πλαίσια μίας συνεργασίας μας με το εργαστήριο του Dr. Joseph Miano, καθηγητή στο Aab Cardiovascular Research Institute, University του Rochester Medical School (NY, USA). Τα πλασμίδια Luc φέρουν τμήματα υποκινητών κατάλληλα των υπό μελέτη γονιδίων, συνδεδεμένα με το Luc γονίδιο αναφοράς. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν τα εξής πλασμίδια που φέρουν τμήματα υποκινητές ειδικών γονιδίων των λείων μυϊκών κυττάρων: Το πλασμίδιο SM-α-Αctin/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο τμήματος του υποκινητή του γονιδίου του αγρίου τύπου της α Ακτίνης των ΛΜΚ (-2560 / +2784). Το πλασμίδιο SM-MHC/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο τμήματος του υποκινητή του γονιδίου του αγρίου τύπου της βαριάς αλυσίδας της Μυοσίνης των ΛΜΚ (-2266 / +74). Το πλασμίδιο SM-Calponin/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο τμήματος του υποκινητή του γονιδίου του αγρίου τύπου της Καλπονίνης των ΛΜΚ (-549 /+ 2784). Το πλασμίδιο SM-Calponin-3xCArG/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο τμήματος του υποκινητή του γονιδίου της Καλπονίνης των ΛΜΚ με μεταλλαγμένα και τα τρία στοιχεία CΑrG που περιέχει. Το πλασμίδιο SM22α/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο τμήματος του υποκινητή του γονιδίου του αγρίου τύπου της SM22α των ΛΜΚ (-450 / +88). Το πλασμίδιο SM22α-CArG/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο τμήματος του υποκινητή του γονιδίου της SM22α των ΛΜΚ με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑrG που περιέχει. Στις παραπάνω κατασκευές, πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων στα τμήματα αυτά οδηγεί στην έκφραση της λουσιφεράσης (και άρα σε ενζυματική ενεργότητα). Αυτά τα πλασμίδια έχουν εκτεταμένα χρησιμοποιηθεί τα τελευταία χρόνια σε μελέτες ελέγχου του φαινοτύπου των λείων μυϊκών κυττάρων Ο λόγος είναι ότι έχει αποδειχθεί ότι περιέχουν όλα τα απαραίτητα στοιχεία τα οποία επιτρέπουν την ειδική έκφραση των ενδογενών γονιδίων in vitro και in vivo (Owens GM 2004). Επίσης στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν και τα εξής πλασμίδια: Το πλασμίδιο pcdna3 ως πλασμίδιο μάρτυρας. 59

60 Εικόνα 3-6 : Χάρτης περιορισμού του pcdna3. Το πλασμίδιο του αδρενεργικού υποδοχέα α1-α ανθρώπου (α1a-ars). Το πλασμίδιο του αδρενεργικού υποδοχέα α1-β χάμστερ (α1b-ars). Τα παραπάνω πλασμίδια αποκτήθηκαν από το εργαστήριο της Prof. Susanna Cottechia, καθηγήτρια στο Departement de pharmacologie et de toxicologie, Universite de Lausanne. Το πλασμίδιο SRE (Serum Response Element)/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο αυξητικών παραγόντων όπως τους PDGFs και α1-αδρενεργικούς αγωνιστές. Το πλασμίδιο CRE (camp Response Element)/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο του camp σε απόκριση σε β- αδρενεργικούς αγωνιστές. Το πλασμίδιο CAGA-MLP/Luc, το οποίο κωδικοποιεί το γονίδιο της Firefly luciferase υπό τον έλεγχο του αυξητικού παράγοντα TGFβ Αδενοϊοί που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα διαμόλυνσης Σε μια ομάδα πειραμάτων διαμόλυνσης χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένα εργαλεία τα οποία έχουν τη δυνατότητα να υπερεκφράζουν οποιαδήποτε ουσία και ονομάζονται αδενοιοί. Στη παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά είδη αδενοϊών. Με στόχο την υπερέκφραση της Μυοκαρδίνης χορηγήθηκαν στα κύτταρα διαφορετικές από τον αδενοιό ΑdvMcrd και αντίστοιχες συγκεντρώσεις από τον αδενοιό ΑdvLacZ για μάρτυρα Ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα διαμόλυνσης Στη παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι αυξητικοί παράγοντες ΤGF-β1 και PDGF-BB σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και διάφορες ουσίες όπως η Φαινυλεφρίνη, η Πραζοσίνη, η Ισοπροτερενόλη, η Φορσκολίνη, η Υοχιμβίνη. 60

61 3.4.4 Παροδική διαμόλυνση σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί, με τα πλασμίδια αναφοράς Παροδική διαμόλυνση με το jetpei σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί Για την παροδική διαμόλυνση των κυττάρων με τα διάφορα πλασμίδια αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το κατιονικό πολυμερές πολυαιθυλενιμίνη ειδικό τόσο για κυτταρικές σειρές όσο και για πρωτογενή κύτταρα, jetpei (Polyplus Transfection, Qbiogene, France). Η πειραματική πορεία που ακολουθεί αναφέρεται για εφαρμογή σε καλλιέργειες των παραπάνω τύπων κυττάρων σε πλακίδια των 96 μικροκυψελίδων όπου έχει προηγηθεί η επίστρωση των κυττάρων την προηγούμενη ημέρα με τη μέθοδο της ανακαλλιέργιας κυττάρων που έχει αναφερθεί παραπάνω. Για την παροδική διαμόλυνση κυττάρων στο πλακίδιο των 96 μικροκυψελίδων απαιτείται τα κύτταρα να καλύπτουν το 40-50% της επιφάνειας του πλακιδίου (40-50% confluent). Πειραματική πορεία 1. Αρχικά γίνεται προετοιμασία του συμπλόκου πολυμερούς-dna ως εξής: Σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου προστίθενται 0,2 μg του εκάστοτε πλασμιδίου σε 10 μl NaCl 150 mm (DNA διάλυμα). Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο μεταφέρονται και 0,4 μl του πολυμερούς (διάλυμα jetpei) σε 10 μl NaCl 150 mμ. Οι ποσότητες αναφέρονται για κάθε μικροκυψελίδα του 96-πλακιδίου. Το διάλυμα jetpei μεταβιβάζεται στο αντίστοιχο διάλυμα του DNA (20 μl τελικός όγκος για κάθε μικροκυψελίδα). Προσοχή: όχι με την αντίθετη σειρά. Έπειτα ακολουθεί ανάδευση, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 2. Αφού περάσουν τα 30 λεπτά αναμιγνύεται το τελικό διάλυμα διαμόλυνσης με 80 μl θρεπτικού μέσου (DMEM+1%FBS). 3. Στη συνέχεια γίνεται αναρρόφηση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας των κυττάρων που είναι επιστρωμένα σε πλακίδιο των 96 μικροκυψελίδων και προστίθενεται τα 100 μl με τη βοήθεια πιπέτας. 4. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων για 16 ώρες στους 37 ο C. 5. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου με θρεπτικό μέσο χωρίς όρο που περιέχει 0,1% BSA των κυττάρων, προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών και επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για επιθυμητό χρονικό διάστημα. Ακολουθεί η διαδικάσία τεχνικής ανίχνευσης ενεργότητας της λουσιφεράσης όπως περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω. Yλικά και Διαλύματα o o o o o o Μικροπλακίδιο που έχει 96 μικροκυψελίδες Θρεπτικό μέσο DMEM BSA Ορό (FBS) NaCl 150 mm JetPEI solution 61

62 Παροδική διαμόλυνση με το jetprime σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί Για τη παροδική διαμόλυνση των κυττάρων με τα διάφορα πλασμίδια αναφοράς εκτός απο το jetpei χρησιμοποιήθηκε και το jetprime της εταιρίας Polyplus Transfection. Με το jetprime χρειάζονται πολύ μικρότερες ποσότητες πλασμιδιακού DNA για τη διαμόλυνση των κυττάρων. Η πειραματική πορεία που ακολουθεί αναφέρεται για εφαρμογή σε καλλιέργειες των παραπάνω τύπων κυττάρων σε πλακίδια των 96 μικροκυψελίδων όπου έχει προηγηθεί η επίστρωση των κυττάρων την προηγούμενη ημέρα με τη μέθοδο της ανακαλλιέργιας κυττάρων που έχει αναφερθεί παραπάνω. Για την παροδική διαμόλυνση κυττάρων στο πλακίδιο των 96 μικροκυψελίδων απαιτείται τα κύτταρα να καλύπτουν το 40-50% της επιφάνειας του πλακιδίου (40-50% confluent). Πειραματική πορεία 1. Αρχικά γίνεται προετοιμασία των διαλυμάτων για 20 μικροκυψελίδες ως εξής: Σε σωληνάκι μικροφυγοκέντρου προστίθενται 1 μg του εκάστοτε πλασμιδίου σε 100 μl jetprime buffer (DNA διάλυμα) και ακολουθεί ανάμειξη με vortex. Στη συνέχεια στο σωληνάκι προστίθενται 2 μl από το αντιδραστήριο jetprime reagent. Έπειτα ακολουθεί ανάδευση με vortex, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. 2. Αφού περάσουν τα 10 λεπτά αναμιγνύεται το τελικό διάλυμα διαμόλυνσης με 1800 μl πλήρους θρεπτικού μέσου. 3. Στη συνέχεια γίνεται αναρρόφηση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας των κυττάρων που είναι επιστρωμένα σε πλακίδιο των 96 μικροκυψελίδων και προστίθενεται τα 100 μl με τη βοήθεια πολυπιπέτας. 4. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων για 24 ώρες στους 37 ο C. 5. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου με θρεπτικό μέσο χωρίς όρο που περιέχει 0,1% BSA των κυττάρων, προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών και επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για επιθυμητό χρονικό διάστημα. Ακολουθεί η διαδικάσία τεχνικής ανίχνευσης ενεργότητας της λουσιφεράσης όπως περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω. Yλικά και Διαλύματα o Μικροπλακίδιο που έχει 96 μικροκυψελίδες o Θρεπτικό μέσο DMEM o 0,1 % BSA o Ορό (FBS) o jetprime Buffer o jetprime Reagent Σταθερή διαμόλυνση κυττάρων και επιλογή των λειτουργικών κλώνων Η μόνιμη διαμόλυνση κυττάρων γίνεται σε κυτταρικές σειρές προκειμένου να εκφράζεται συνέχεια το επιθυμητό γονίδιο. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκαν τα πλασμίδια του αδρενεργικού υποδοχέα α1 και το pcdna3 ως γονίδιο μάρτυρας. Στην κυτταρική σειρά A7r5 η μόνιμη διαμόλυνση με τα επιθυμητά πλασμίδια έγινε σε πλακίδιο 12 μικροκυψελίδων με το jetpei της εταιρίας Polyplus Transfection. Στην κυτταρική σειρά ΝΙΗ3Τ3 η μόνιμη διαμόλυνση με τα επιθυμητά πλασμίδια έγινε σε πλακίδιο 6 μικροκυψελίδων με το jetprime της ίδιας εταιρίας. Και στις δύο περιπτώσεις η επίστρωση των κυττάρων έγινε μία μέρα πριν από τη διαμόλυνση. Ο αριθμός των κυττάρων ήταν 62

63 τέτοιος ώστε την ημέρα της διαμόλυνσης η κάλυψη της μικροκυψελίδας από τα κύτταρα να είναι 40-50% (confluency 40-50%). Πειραματική πορεία για την κυτταρική σειρά A7r5 1. Αρχικά γίνεται προετοιμασία του συμπλόκου πολυμερούς-dna ως εξής: σε σωληνάκι μικροφυγοκέντρου προστίθενται 2 μg του εκάστοτε πλασμιδίου σε 50 μl NaCl 150 mm (DNA διάλυμα). Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο μεταφέρονται και 4 μl του πολυμερούς (διάλυμα jetpei) σε 50 μl NaCl 150 mμ. Οι ποσότητες αναφέρονται για κάθε μικροκυψελίδα του 12- πλακιδίου. Το διάλυμα jetpei μεταβιβάζεται στο αντίστοιχο διάλυμα του DNA (100 μl τελικός όγκος για κάθε μικροκυψελίδα). Προσοχή: όχι με την αντίθετη σειρά. Έπειτα ακολουθεί ανάδευση, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 2. Αφού περάσουν τα 30 λεπτά το τελικό διάλυμα διαμόλυνσης προστίθεται στα κύτταρα που έχουν επιστρωθεί στο πλακίδιο. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό μέσο για 24 ώρες στους 37 ο C. 3. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό Νεομυκίνη (G418) σε τελική συγκέντρωση 200 μg/ml. Τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν ανανεώνοντας τα κάθε 4 ημέρες με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό Νεομυκίνη (G418) σε τελική συγκέντρωση 200 μg/ ml. Πειραματική πορεία για την κυτταρική σειρά ΝΙΗ3Τ3 1. Σε σωληνάκι μικροφυγοκέντρου προστίθενται 2 μg του εκάστοτε πλασμιδίου σε 200 μl jetprime buffer (DNA διάλυμα) και ακολουθεί ανάμειξη με vortex. Στη συνέχεια στο σωληνάκι προστίθενται 4 μl από το αντιδραστήριο jetprime reagent. Έπειτα ακολουθεί ανάδευση με vortex, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. 2. Αφού περάσουν τα 10 λεπτά το τελικό διάλυμα διαμόλυνσης προστίθεται στα κύτταρα που έχουν επιστρωθεί στο πλακίδιο. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό μέσο για 24 ώρες στους 37 ο C. 3. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό Νεομυκίνη (G418) σε τελική συγκέντρωση 900 μg/ml. Τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν ανανεώνοντας τα κάθε 4 ημέρες με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό Νεομυκίνη (G418) σε τελική συγκέντρωση 900 μg/ml. 4. Αφού αναπτυχθούν τα κύτταρα και στις δυο περιπτώσεις μεταφέρονται σε τριβλύα Petri και αφήνονται να πολλαπλασιαστούν για να δημιουργηθούν μοναδικές αποκίες. 5. Στη συνέχεια η κάθε αποικία μεταφέρεται σε πλακίδιο 12 μικροκυψελίδων και αφήνεται να αναπτυχθεί σε πλήρες θρεπτικό μέσο με Νεομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 900 μg/ml. Yλικά και Διαλύματα o o o o o o o Μικροπλακίδιο που έχει 12 και 6 μικροκυψελίδες Πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM NaCl 150 mm JetPEI solution jetprime Buffer jetprime Reagent Νεομυκίνη (G418) της εταιρείας Invivogen 63

64 Εικόνα 3-7 : Σχηματική απεικόνιση μόνιμης διαμόλυνσης σε κύτταρα που έχουν ήδη επιστρωθεί μία ημέρα πριν τη διαμόλυνση Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης Ο έλεγχος της έκφρασης από τα κύτταρα των υπό μελέτη πλασμιδίων, γίνεται με το κιτ της Βiotium Firefly Luciferase Assay Kit ακολουθώντας τις αναλυτικές οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας που συνοδεύουν το κιτ. Πρόκειται για μια γρήγορη τεχνική που χρησιμοποιείται για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και λειτουργίας, και επίσης σε φαρμακολογικό έλεγχο, τόσο σε ευκαρυωτικά όσο και σε προκαρυωτικά κύτταρα. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη λουσιφεράση (firefly luciferase από την πυγολαμπίδα Photinus) δεν εκφράζεται από τα ευκαρυωτικά κύτταρα ή από ιστούς, αλλά η έκφρασή της είναι ανάλογη του πλασμιδιακού DNA που ενσωματώνεται και εκφράζεται στο κύτταρο και για το λόγο αυτό πρόκειται για έναν αρκετά ευαίσθητο γονιδιακό δείκτη. Συνοπτικά, η αλληλουχία του υποκινητή (ή ρυθμιστική αλληλουχία) του γονιδίου που μελετάται, συνδέεται στο γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης. Το πλασμίδιο εισάγεται στα ευκαρυωτικά κύτταρα (transfection) και ακολουθεί έκφραση της πρωτεΐνης λουσιφεράσης. Το ένζυμο της λουσιφεράσης αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους 62 kda, είναι ενεργό ως μονομερές και δεν χρειάζονται μετα-μεταφραστικές διαδικασίες για να ενεργοποιηθεί ενζυματικά και έτσι μπορεί να δράσει απευθείας μετά το τέλος της διαδικασίας της μετάφρασης. Το ένζυμο καταλύει την ΑΤΡ-εξαρτώμενη οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση της λουσιφερίνης (D-luciferin). Για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης αντίδρασης είναι απαραίτητη η παρουσία ιόντων μαγνησίου (Mg2+). Αποτέλεσμα αυτής της αντίδρασης είναι η παραγωγή οξειδωμένης λουσιφερίνης και η εκπομπή φωτός σε μήκος κύματος 560nm το οποίο 64

65 ανιχνεύεται με τη χρήση κατάλληλου λουμινόμετρου. Το kit της Biotium χρησιμοποιεί αυτό το γονίδιο αναφοράς για την ανίχνευση του ποσοστού έκφρασης των πλασμιδίων από τα κύτταρα. Η εκπομπή φωτός της αντίδρασης διαρκεί μέχρι 20 δευτερόλεπτα και ανιχνεύεται σε ειδικό λουμινόμετρο (Luminoskan της Biolabs). Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι η λουσιφεράση έχει μικρό χρόνο ημιζωής στα ευκαρυωτικά κύτταρα συγκριτικά με άλλες πρωτεΐνες αναφοράς όπως η CAT (chloramphenicol acetyltransferase), και για αυτό το λόγο επιλέγεται η μέθοδος παροδικής διαμόλυνσης των κυττάρων με τα συγκεκριμένα πλασμίδια. Τα κύτταρα που έχουν ενσωματώσει επιτυχώς το συγκεκριμένο πλασμίδιο Luc και το έχουν εκφράσει ως μέρος του γονιδιώματος τους, θεωρείται ότι έχουν ενσωματώσει και εκφράσει εξίσου επιτυχώς και το υπό μελέτη πλασμίδιο. Συνεπώς αυτό το γονίδιο αναφοράς αποτελεί τον εσωτερικό μάρτυρα της τεχνικής, βάση του οποίου εξομαλύνονται οι τυχόν διακυμάνσεις στις τιμές των δειγμάτων που μπορεί να οφείλονται σε αντίστοιχες διακυμάνσεις είτε λόγω βιωσιμότητας των κυττάρων είτε λόγω διαφοράς στην αποτελεσματικότητα της διαμολύνσεως. Η μέθοδος ανίχνευσης της λουσιφεράσης είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και σχετικά εύκολη στους πειραματικούς χειρισμούς. Το εύρος ανίχνευσής της με αυτή τη μεθοδολογία είναι 10fg-10ng λουσιφεράσης. Η μέθοδος μειονεκτεί μόνο στο γεγονός ότι η παραγωγή φωτός είναι παροδική και σχετικά γρήγορη (peak sec) κάνοντας τους πειραματικούς χειρισμούς δύσκολους. Εφόσον στα δείγματα υπάρχει λουσιφεράση που έχει εκφραστεί από τα κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί, αυτή θα αντιδράσει με το υπόστρωμά της και θα παραχθεί φως στα 560nm. Η έκφραση του γονιδίου είναι ανάλογη της ενεργότητα της λουσιφεράσης, κατά επέκταση ανάλογη της εκπομπής φωτός στα 560 nm και οι μονάδες μέτρησης της ενεργότητας είναι οι σχετικές μονάδες φωτός (RLU: Relative Light Units). Πειραματική πορεία 1. Απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων. Προσθήκη διαλύματος λύσης (40 μl/μικροκυψελίδα) και επώαση του πιάτου για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση. Τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν στο στάδιο αυτό στους -20 ο C για περαιτέρω χρήση. 2. Σε καθαρό πλακίδιο που περιέχει 96 μικροκυψελίδες και είναι ειδικό για χρήση στο λουμινόμετρο μεταφέρονται 20 μl από το εκχύλισμα κυττάρων και το πιάτο τοποθετείται στην ειδική θέση στο λουμινόμετρο. 3. Προετοιμάζεται το διάλυμα λουσιφεράσης και τοποθετείται στην αντίστοιχη θέση του λουμινόμετρου έτοιμο για να εγχυθεί αυτόματα με τη χρήση του injector. (Το αντιδραστήριο λουσιφεράσης έχει προεπωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου) 4. Στη συνέχεια γίνονται οι απαραίτητες ρυθμίσεις στο μηχάνημα (όπως για παράδειγμα η περιοχή του πλακιδίου στην οποία επιθυμούμε να γίνει έγχυση του διαλύματος λύσης, η ποσότητα του διαλύματος λουσιφεράσης που θα εγχυθεί σε κάθε μικροκυψελίδα καθώς επίσης και το πρόγραμμα με τις αναλυτικότερες ρυθμίσεις). Χρησιμοποιήθηκαν 40 μl διαλύματος αντιδραστηρίου λουσιφεράσης για κάθε μικροκυψελίδα. 5. Ακολουθεί απευθείας μέτρηση του πιάτου και αυτόματη εκτύπωση των αποτελεσμάτων για περαιτέρω επεξεργασία. Yλικά και διαλύματα Από το σύστημα αντιδράσεων Firefly Luciferase Assay Kit, παρέχεται το διάλυμα λύσης των κυττάρων και το διάλυμα αντιδραστηρίων της λουσιφεράσης. Διάλυμα λύσης των κυττάρων (Firefly Luciferase Lysis Buffer) : Σε έναν όγκο 5x Firefly Luciferase Lysis Buffer προστίθενται 4 όγκοι απιονισμένου νερού και το διάλυμα 65

66 αναμειγνύεται αρκετά καλά. Το 1x διάλυμα λύσης διατηρείται στους -20 ο C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί για λύση των κυττάρων. Διάλυμα αντιδραστηρίων της λουσιφεράσης (Firefly Luciferase Assay Solution) : Τα 10 mg D-λουσιφερίνης διαλύονται σε 5 ml απιονισμένο νερό (συγκέντρωση: 2 mg/ml), αναδεύονται καλά και το υπόστρωμα φυλάσσεται σε μικρότερες ποσότητες στους -80 ο C για περαιτέρω χρήση. Από το διάλυμα αυτό αναμειγνύονται 500 μl μαζί με 5 ml από το διάλυμα Firefly Luciferase Assay Buffer και έτσι έχουμε το τελικό διάλυμα λουσιφεράσης σε συγκέντρωση 0,2 mg/ml. To διάλυμα αυτό πρέπει να προετοιμάζεται κάθε φορά όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί και να προφυλάσσεται από την παρουσία φωτός Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εξήχθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του student t-test. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. 66

67 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 67

68 4.1 Μοριακός έλεγχος του ΛΜΦ σε ΛΜΚ A7r Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών α1-αδρενεργικών υποδοχέων σε ΛΜΚ A7r5 Οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς (α1-αυς) είναι υπέυθυνοι για τη δράση των συμπαθητικών νευρικών απολήξεων στα αγγειακά τοιχώματα. Παίζουν καθοριστικό ρόλο σε διάφορες ασθένειες των αγγείων, στην παθοφυσιολογία του αγγειακού τοιχώματος και στην υπερτροφία και τον πολλαπλασιασμό των ΛΜΚ. Παρόλα αυτά οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους δρουν, επηρεάζουν και καθορίζουν το φαινότυπο των ΛΜΚ παραμένουν ακόμη άγνωστοι. Γι αυτό το λόγο χρησιμοποιήσαμε διαφοροποιημένα λεία μυϊκά κύτταρα A7r5 προκειμένου να διερευνήσουμε πώς οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ. Αρχικά λοιπόν θελήσαμε να ελέγξουμε αν τα ΛΜΚ A7r5 εκφράζουν ενδογενώς τους α1- αδρενεργικούς υποδοχείς (α1-αυs). Επειδή στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς επάγουν τον παράγοντα SRF (Mao J., 1998) χρησιμοποιήσαμε ως πλασμίδιο αναφοράς το SRE-Luc που η ενεργότητα της λουσιφεράσης καθορίζεται από την πρόσδεση του SRF στα στοιχεία SRE. Κύτταρα A7r5 παροδικά συν-διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς SRE-Luc και είτε με το πλασμίδιο-μάρτυρα pcdna3 είτε με το πλασμίδιο που εκφράζει τον α1α-αδρενεργικό υποδοχέα (α1α-αυ) ανθρώπου, είτε με το πλασμίδιο που εκφράζει τον α1β-αδρενεργικό υποδοχέα (α1β-αυ) από ινδικό χοιρίδιο σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους και αφέθηκαν για επώαση σε θρεππικό μέσο που περείχε όρο (1% FBS) για 24 ώρες. Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά εκτέθηκαν για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (DMEM 0,1% BSA) στις εξής ουσίες : στον παράγοντα PDGF-BB (BB) σε συγκέντρωση 20 ng/ml, στον εκλεκτικό αγωνιστή των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, Φαινυλεφρίνη (PE), σε συγκέντρωση 1 μμ, στον εκλεκτικό αναταγωνιστή των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, Πραζοσίνη (PRAZ), σε συγκέντρωση επίσης 1 μμ, σε συνδυασμό τους και σε ορό (FBS 10%) που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Έπειτα μετρήθηκε η ενεργότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-1). A) pcdna3 + SRE-Luc 68

69 B) α1a-αυ + SRE-Luc Γ) α1b-αυ + SRE-Luc Εικόνα 4-1 : Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς SRE-Luc, (Α) σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο-μάρτυρα pcdna3, (Β) σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο α1α-αυ και (Γ) σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο α1β-αυ σε κύτταρα A7r5 τα οποία επωάστηκαν με PDGF-BB (BB) σε συγκέντρωση 20 ng/ml, Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ, Πραζοσίνη (PRAZ) σε συγκέντρωση 1 μμ, συνδυασμό Φαινυλεφρίνης με Πραζοσίνη και ορό (FCS 10%). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), n=4. Τα 69

70 σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Τα κύτταρα A7r5 που συν-διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο-μάρτυρα δηλ, pcdna3 επιπλέον του SRE-Luc (εικόνα Α) αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν στον παράγοντα PDGF-BB ενώ δεν αποκρίθηκαν στον αγωνιστή των α1-αυ, Φαινυλεφρίνη. Όταν όμως εκφράσαμε τους υποτύπους των α1-αυ, α1α και α1β (εικόνες Β και Γ, αντίστοιχα), παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα αποκρίθηκαν στη Φαινυλεφρίνη όπως φαίνεται από επαγωγή του SRE. Κάνοντας περαιτέρω φαρμακολογικό έλεγχο με τη χρήση του ανταγωνιστή των α1-αυ Πραζοσίνη, παρατηρήσαμε ότι αυτή η απόκριση των κυττάρων στην Φαινυλεφρίνη καταστέλλεται. Συμπεραίνουμε ότι τα κύτταρα A7r5 που χρησιμοποιούμε δεν εκφράζουν ενδογενώς τους υποτύπους των α1-αυ, α1α και α1β. Για το λόγο αυτό στα επόμενα πειράματά μας είναι απαραίτητο να τους εισάγουμε στα κύτταρα. Επειδή οι α1-αυs επάγουν τη μεταγραφή του SRF και γνωρίζοντας ότι τα γονίδια-δείκτες που καθορίζουν τον ΛΜΦ εξαρτώνται από αυτό το μεταγραφικό παράγοντα, μελετήσαμε μέσω ενεργοποίησης των υποτύπων α1α και α1β των α1-αυ από τη Φαινυλεφρίνη τη μεταγραφή αυτών των γονιδίων-δεικτών. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε συνδιαμόλυνση των κυττάρων A7r5 με το πλασμίδιο αναφοράς SRE-Luc και με το πλασμίδιο του αδρενεργικού υποδοχέα α1α σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους και τα κύτταρα αφέθηκαν για επώαση σε θρεππικό μέσο που περείχε όρο (1% FBS) για 24 ώρες. Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA) με τις εξής ουσίες : τον παράγοντα PDGF-BB (BB) σε συγκέντρωση 20 ng/ml και τον αγωνιστή των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, Φαινυλεφρίνη (PE), σε διάφορες συγκεντρώσεις 0,1-10 μμ. Έπειτα μετρήθηκε η ενεργότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-2). α1α-αυ + SRE-Luc Εικόνα 4-2 : Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς SRE-Luc σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο α1α-αυ σε κύτταρα A7r5 τα οποία επωάστηκαν με PDGF-BB (BB) σε συγκέντρωση 20 ng/ml και 70

71 Φαινυλεφρίνη (PE) σε διάφορες συγκεντρώσεις 0,1-10 μμ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), n=4. Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t- test. Από το παραπάνω διάγραμμα παρατηρούμε δοσοεξαρτώμενη επίδραση της φαινυλεφρίνης στα κύτταρα Α7r5 που εκφράζουν τον αδρενεργικό υποδοχέα α1α μέσω αύξησης της ενργότητας του SRE-Luc Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα Α7r5 Στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε στα κύτταρα A7r5 πώς οι α1α-αυs επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Τα γονίδια SM-α-Αctin, SM-Calponin, SM-MHC, SM22α όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω καθορίζουν το συσταλτό-φυσιολογικό φαινότυπο των ΛΜΚ. Για τα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε πλασμίδια τα οποία περιείχαν τμήματα των υποκινητών των παραπάνω γονιδίων [SM-α-Αctin-Luc (-2560/+2784), SM-Calponin-Luc (- 549/+2784), SM-MHC-Luc (-2266/+74), SM22α-Luc (-450/+88)] συνδεδεμένα με το Luc γονίδιο αναφοράς. Αυτά τα πλασμίδια έχουν εκτεταμένα χρησιμοποιηθεί τα τελευταία χρόνια σε μελέτες ελέγχου του φαινοτύπου των λείων μυϊκών κυττάρων. Ο λόγος είναι ότι έχει αποδειχθεί ότι περιέχουν όλα τα απαραίτητα στοιχεία τα οποία επιτρέπουν in vivo την ιστοειδική έκφραση (σε λείους μυϊκούς ιστούς) των γονιδίων (Owens et al., 2004). Για να μελετήσουμε λοιπόν πώς οι α1α-αυs επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ πραγματοποιήσαμε συν-διαμόλυνση των κυττάρων A7r5 είτε με το πλασμίδιομάρτυρα (pcdna3) είτε με το πλασμίδιο των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων (α1α-αυ) και με τους minimal υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ (SM-α-Αctin-Luc, SM- Calponin-Luc, SM-MHC-Luc, SM22α-Luc). Τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν αρχικά σε θρεπτικό μέσο με ορό (1% FBS) για 24 ώρες και μετά επωάστηκαν με Φαινυλεφρίνη (PE) συγκέντρωσης 1 μμ για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-3). 71

72 Α) Συν-διαμόλυνση των κυττάρων A7r5 με το πλασμίδιο-μάρτυρα (pcdna3) 72

73 Β) Συν-διαμόλυνση των κυττάρων A7r5 με το πλασμίδιο των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων (α1α-αυ) Εικόνα 4-3 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin, SM- MHC σε κύτταρα Α7r5 που Α) έχουν συν-διαμολυνθεί με το πλασμίδιο-μάρτυρα (pcdna3) και Β) έχουν συνδιαμολυνθεί με το πλασμίδιο α1α-αυ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 4 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=16. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από τα παραπάνω διαγράμματα συμπεραίνουμε ότι η ενεργοποίηση των α1α-αυ από τη Φαινυλεφρίνη επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM- Calponin, SM-α-Αctin και SM-MHC σε κύτταρα που έχουν συν-διαμολυνθεί με το πλασμίδιο του α1α-αδρενεργικού υποδοχέα, α1α-αυ, (εικόνα 4-5, Β) σε σχέση με τα κύτταρα που έχουν συνδιαμολυνθεί με το πλασμίδιο-μάρτυρα, pcdna3, (εικόνα 4-5, Α). Αυτή η επαγωγή παρατηρήθηκε έμμεσα σε επίπεδο μεταγραφής. 73

74 4.1.3 Μελέτη ΛΜΚ A7r5 που εκφράζουν σταθερά τους α1α-αδρενεργικούς υποδοχείς Αυτό που θελήσαμε να ερευνήσουμε στη συνέχεια ήταν να ανιχνεύσουμε αν αυτή η επαγωγή ισχύει και άμεσα σε επίπεδο πρωτεϊνης. Για την πραγματοποίηση των επόμενων πειραμάτων χρειάστηκε να ακολουθήσουμε μια χρονοβόρα διαδικασία προκειμένου τα ΛΜΚ A7r5 να εκφράζουν σταθερά τα επιθυμητά γονίδια: είτε του α1α-αδρενεργικού υποδοχέα (α1α-αυ) ανθρώπου είτε του γονιδίου-μάρτυρα (pcdna3). Τα πλασμίδια αυτά παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό της Νεομυκίνης. Γι αυτό το λόγο πραγματοποιήσαμε προκαταρκτικά πειράματα καμπύλης θανάτου σε κύτταρα Α7r5 με σκοπό να ελέγξουμε τη συγκέντρωση Νεομυκίνης που μπορούμε να χρησιμοποιούμε για την ανάπτυξη των κυττάρων που έχουν συμπεριλάβει τα επιθυμητά πλασμίδια. Η συγκέντρωση που επιλέξαμε ήταν 200 μg/ml λόγω του ότι σε αυτή τη συγκέντρωση παρουσιάστηε ο μεγαλύτερος κυτταρικός θάνατος. Για να δημιουργήσουμε κύτταρα τα οποία σταθερά εξέφραζαν τα επιθυμητά πλασμίδια αρχικά πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων A7r5 με τα παραπάνω πλασμίδια σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Ακολουθεί αλλαγή του θρεπτικού μέσου 24 ώρες μετά από τη διαμόλυνση των κυττάρων με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό της Νεομυκίνης σε συγκέντρωση 200 μg/ml. Στη συνέχεια επιλέγθηκαν μερικά μονήρη κύτταρα προκειμένου από το καθένα από αυτά να δημιουργηθούν μοναδικές αποκίες-κλώνοι. Οι κλώνοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρες θρεππικό μέσο που περείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 200 μg/ml αλλάζοντας κάθε 4 ημέρες το θρεπτικό τους μέσο. Στη συνέχεια ελέγξαμε τους κλώνους αυτούς για να δούμε αν όντως εκφράζονται σταθερά τα επιθυμητά γονίδια. Για να ελέγξουμε λοιπόν αν οι κλώνοι που δημιουργήσαμε υπερεκφράζουν σταθερά τα επιθυμητά γονίδια, τα κύτταρα, 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους, διαμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο SRE-Luc σε πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 200 μg/ml και αφέθηκαν για επώαση σε θρεππικό μέσο που που περείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 200 μg/ml και όρο (1% FBS) για 24 ώρες. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων με τις ουσίες PDGF-BB (ΒΒ) συγκέντρωσης 20 ng/ml και Φαινυλεφρίνης (PE) συγκέντρωσης 1 μm για 6 ώρες σε θρεπτικό υλικό μέσο που περείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 200 μg/ml αλλά δεν περιείχε ορό (0,1% BSA). Τέλος μετρήθηκε η ενεργότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνες 4-4 και 4-5). 74

75 Εικόνα 4-4 : Σχετική δραστηριότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc σε κλώνους ΛΜΚ A7r5 με το γονίδιο-μάρτυρα (pcdna3) που επωάστηκαν με PDGF-BB σε συγκέντρωση 20 ng/ml και Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μm για 6 ώρες σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), n=4. Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Για τη συνέχεια των πειραμάτων μας επιλέξαμε τον κλώνο Νο 2 αφού τα κύτταρα αυτού του κλώνου αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν στον παράγοντα PDGF-BB ενώ δεν αποκρίθηκαν στον αγωνιστή των α1-αυ Φαινυλεφρίνη. 75

76 Εικόνα 4-5 : Σχετική δραστηριότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc σε κλώνους ΛΜΚ A7r5 με το γονίδιο του αδρενεργικού υποδοχέα α1α (α1α-αυ) που επωάστηκαν με PDGF-BB σε συγκέντρωση 20 ng/ml και Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μm για 6 ώρες σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσηςσε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (CTL), n=4. Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Για τη συνέχεια των πειραμάτων μας επιλέξαμε τον κλώνο Νο 2 αφού τα κύτταρα αυτού του κλώνου αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν και στον παράγοντα PDGF-BΒ και στον αγωνιστή των α1α-αυ Φαινυλεφρίνη. Για τα επόμενα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε αυτούς τους 2 λειτουργικούς κλώνους. 76

77 4.1.4 Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην έκφραση των ΛΜΚειδικών πρωτεϊνών σε κύτταρα A7r5 Η επαγωγή των υποκινητών μας επιτρέπει με έναν έμμεσο τρόπο να αξιολογήσουμε τη δράση των α1α-αυs στο ΛΜΦ. Για να ελέγξουμε τι συμβαίνει άμεσα σε επίπεδο πρωτεΐνης όσον αφορά στην επαγωγή της έκφρασης της SM-α-Ακτίνης και της SM-Καλπονίνης από την ενεργοποίηση των α1α- ΑΥs, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα A7r5 τα οποία εκφράζουν σταθερά το γονίδιο του α1ααδρενεργικού υποδοχέα (α1α-αυ) και κύτταρα A7r5 που εκφράζουν σταθερά το γονίδιο-μάρτυρα (pcdna3). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ σε θρεπτικό μέσο με Νεομυκίνη συγκέντρωσης 200 μg/ml που δεν περιείχε ορό (0% FBS), 48 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Στη συνέχεια το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων αυτών (10μg) αναλύθηκε σε SDS-PAGE όπου ταυτοποιήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών της SM-α-Ακτίνης και της SM-Καλπονίνης (εικόνα 4-6), για τα οποία είχαμε τα κατάλληλα αντισώματα. Εκτός από αυτά τα αντισώματα χρησιμοποιήσαμε αντίσωμα και για την SM-MHC αλλά δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Εικόνα 4-6 : Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την SM-α-Ακτίνη και την SM-Καλπονίνη σε κύτταρα A7r5 που εκφράζουν σταθερά τον α1α-αδρενεργικό υποδοχέα (α1α-αυ) και το γονίδιο-μάρτυρα (pcdna3). Τα κύτταρα αυτά έχουν εκτεθεί για 24 ώρες σε Φαινυλεφρίνη (PE) συγκέντρωσης 1 μm σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία (control). Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 2 φορές. Από την ανάλυση κατά Western βλέπουμε η Φαινυλεφρίνη επάγει την έκφραση της SM-α-Ακτίνης και της SM-Καλπονίνης. Αυτό που συμπεραίνουμε λοιπόν είναι ότι ενεργοποίηση των α1ααδρενεργικών υποδοχέων επάγει την έκφραση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. 77

78 4.1.5 Ρόλος των στοιχείων CΑrG στην ενεργοποίηση των γονιδίων του ΛΜΦ από τους α1α-αδρενεργικούς υποδοχείς Ο παράγοντας SRF (Serum Response Factor) θεωρείται σημαντικότατος στις περισσότερες των περιπτώσεων για τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών των ΛΜΚ. Στην περίπτωση του συσταλτούφυσιολογικού ΛΜΦ ο παράγοντας SRF συμπλοκοποιείται με την Μυοκαρδίνη και στη συνέχεια το σύμπλοκο αυτό προσδένεται σε στοιχεία του DNA που ονομάζονται στοιχεία CΑrG τα οποία βρίσκονται στους υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που χαρακτηρίζουν το συσταλτό φαινότυπο των ΑΛΜΚ και επάγεται η μεταγραφή τους (Mack, 2011, Owens et al., 2004, Chen et al., 2002). Βέβαια υπάρχει περίπτωση η μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ να γίνεται μέσω του αυξητικού παράγοντα TGF-β. Ο παράγοντας αυτός επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων των ΛΜΚ, μέσω της ενεργοποίησης των σηματοδοτικών μορίων Smad2 και Smad3 τα οποία συμπλοκοποιούνται με τη Μυοκαρδίνη (Qiu et al., 2005, Mack, 2011). Γι αυτό το λόγο στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε αν τα στοιχεία CΑrG, πάνω στα οποία προσδένεται ο SRF, είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Οι υποκινητές των γονιδίων αγρίου τύπου περιέχουν και τα 3 στοιχεία CΑrG ενώ στους μεταλλαγμένους υποκινητές απουσιάζουν και τα 3 στοιχεία CΑrG. SM22α Υποκινητές γονιδίων CΑrG mutants SM22α-Luc SM-Calponin 3x CΑrG mutants SM-Calponin- Luc SM-α-Αctin SM-MHC Αριθμός στοιχείων CΑrG 3 στοιχείων CΑrG Μεταλλάξεις σε κάποιο από τα 3 στοιχεία CΑrG 3 στοιχεία CΑrG Μεταλλάξεις και στα 3 στοιχεία 3 στοιχεία CΑrG 3 στοιχεία CΑrG Για να το ελέγξουμε αυτό, κύτταρα A7r5 συν-διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο των α1α-αυs και με τους υποκινητές των γονιδίων SM22α και SM-Calponin με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑrG (CΑrG mutants SM22α-Luc, 3x CΑrG mutants SM-Calponin-Luc ή αλλιώς 3x CΑrG mutants SM-CΝΝ- Luc). Τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν αρχικά σε θρεπτικό μέσο με ορό (1% FBS) για 24 ώρες και μετά επωάστηκαν με Φαινυλεφρίνη (PE) συγκέντρωσης 1 μμ για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-7). 78

79 Εικόνα 4-7 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων αγρίου τύπου SM22α και SM-Calponin και των υποκινητών με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑrG (CΑrG mutants SM22α, 3x CΑrG mutants SM-CΝΝ) σε κύτταρα Α7r5. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από τα παραπάνω διαγράμματα φαίνεται ότι ο υποκινητής της SM22α ενεργοποιείται από τους α1α-αυς όταν περιέχει και τα 3 στοιχεία CΑrG ενώ αντίθετα, δεν ενεργοποιείται όταν υπάρχουν μεταλλάξεις στα στοιχεία αυτά. Επίσης ο υποκινητής της SM-Calponin ενεργοποιείται από τους α1α-αυς είτε όταν ο υποκινητής περιέχει και τα 3 στοιχεία CΑrG είτε όταν υπάρχουν μεταλλάξεις στα στοιχεία αυτά. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι στα κύτταρα A7r5 η ενεργοποίηση του υποκινητή της SM22α από τους α1α-αυς εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG ενώ η ενεργοποίηση του υποκινητή της SM-Calponin δεν εξαρτάται από τα στοιχεία αυτά. 79

80 4.1.6 Επίδραση των α1β-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα Α7r5 Όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία κάθε υπότυπος των α1-αδρενεργικών υποδοχέων συμβάλλει στην αγγειακή συστολή. Η λειτουργία όμως καθένα από τους υπότυπους των α1-αυ εξαρτάται από την κατανομή τους στα αιμοφόρα αγγεία, τις διαφορετικές G-πρωτεΐνες που προσδένονται στους υποδοχείς αυτούς μετά την ενεργοποίησή τους από την επινεφρίνη και τη νορεπινεφρίνη και τους διαφορετικούς σηματοδοτικούς μηχανισμούς που υπάγονται στα σηματοδοτικά μονοπάτια τους (Hein et al., 2006). Στη συνέχεια λοιπόν θελήσαμε να ελέγξουμε στα κύτταρα A7r5, αν και πώς οι α1β-αδρενεργικοί υποδοχείς επίσης επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε παροδική συν-διαμόλυνση των κυττάρων A7r5 με το πλασμίδιο των α1β-αδρενεργικών υποδοχέων (α1β-αυ) και με τους minimal υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ (SM-α-Αctin-Luc, SM-Calponin-Luc, SM-MHC-Luc, SM22α-Luc). Τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν αρχικά σε θρεπτικό μέσο με ορό (1% FBS) για 24 ώρες και μετά επωάστηκαν με Φαινυλεφρίνη (PE) συγκέντρωσης 1 μμ για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-8). 80

81 Εικόνα 4-8 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων SM-α-Αctin, SM-Calponin, SM-MHC, SM22α σε κύτταρα Α7r5. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από το παραπάνω διάγραμμα συμπεραίνουμε ότι η ενεργοποίηση των α1β-αυ από τη Φαινυλεφρίνη επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α και SM- Calponin ενώ φαίνεται να μην επηρεάζει την μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων της SM-α-Αctin και της SM-MHC. Αρά, οι υπότυποι των α1-αυs, α1α και α1β, επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη μεταγραφή των υποκινητών των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το φαινότυπο των ΛΜΚ. 81

82 4.1.7 Ρόλος των στοιχείων CΑrG στην ενεργοποίηση των γονιδίων του ΛΜΦ από τους α1β-αδρενεργικούς υποδοχείς Στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε αν τα στοιχεία CΑrG, πάνω στα οποία προσδένεται ο SRF, είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Για να το ελέγξουμε αυτό, κύτταρα A7r5 συν-διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο των α1β-αδρενεργικών υποδοχέων (α1β-αυ) και με τους υποκινητές των γονιδίων SM22α και SM-Calponin με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑrG (CΑrG mutants SM22α-Luc, 3x CΑrG mutants SM-Calponin-Luc ή αλλιώς 3x CΑrG mutants SM-CΝΝ-Luc). Τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν αρχικά σε θρεπτικό μέσο με ορό (1% FBS) για 24 ώρες και μετά επωάστηκαν με Φαινυλεφρίνη (PE) συγκέντρωσης 1 μμ για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-9). Εικόνα 4-9 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων αγρίου τύπου SM22α και SM-Calponin και των υποκινητών με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑrG (CΑrG mutants SM22α, 3x CΑrG mutants SM-CΝΝ) σε κύτταρα Α7r5. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας 82

83 λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 4 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=16. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από τα παραπάνω διαγράμματα φαίνεται ότι τόσο ο υποκινητής της SM22α όσο και ο υποκινητής της SM-Calponin ενεργοποιούνται από τους α1β-αυς όταν οι υποκινητές τους περιέχουν τα στοιχεία CΑrG ενώ αντίθετα, δεν ενεργοποιούνται όταν υπάρχουν μεταλλάξεις στα στοιχεία αυτά. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι στα κύτταρα A7r5 η ενεργοποίηση των υποκινητών της SM22α και της SM-Calponin από τους α1β-αυς εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG. Άρα και η εξάρτηση από τα στοιχεία CΑrG είναι διαφορετική μεταξύ των δύο υποτύπων των α1-αυ. 83

84 4.1.8 Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών β-αδρενεργικών υποδοχέων σε ΛΜΚ A7r5 Επειδή και οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς (β-αυs), που ενδογενώς επίσης απαντούν στις ενδογενείς κατεχολαμίνες (αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη) είναι λειτουργικά πολύ σημαντικοί στο αγγειακό τοίχωμα, θελήσαμε να ερευνήσουμε αν και πώς οι υποδοχείς αυτοί επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το φαινότυπο των ΛΜΚ. Για να διερευνήσουμε την ύπαρξη των β-αδρενεργικών υποδοχέων στα κύτταρα A7r5 χρησιμοποιήσαμε το πλασμίδιο CRE-Luc στο οποίο η ενεργότητα της λουσιφεράσης εξαρτάται από αύξηση στα επίπεδα του camp λόγω αύξησης της αδενυλικής κυκλάσης, καθότι είναι διαπιστωμένο ότι οι β-αυs δρούν μέσω της αδενυλικής κυκλάσης. Κύτταρα A7r5 διαμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο CRE (camp Response Element)-Luc σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργειά τους. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA) με τις εξής ουσίες : Ισοπροτερενόλη (ISO), ο οποίος αποτελεί άμεσο αγωνιστή των β-αυs, σε συγκέντρωση 10 μμ, Φορσκολίνη (FORSK) ως θετικό κοντρόλ σε συγκέντρωση 1 μμ και DMSO, λόγω του ότι σε αυτό έχει διαλυθεί η Φορσκολίνη, σε συγκέντρωση 1 μμ. Πριν από αυτό όμως ορισμένα τρυβλία επωάστηκαν για 20 λεπτά με τον εκλεκτικό ανταγωνιστή των α2-αδρενεργικών υποδοχέων, Υοχιμβίνη σε συγκέντρωση 10 μμ, προκειμένου να μπλοκάρει τους υποδοχείς αυτούς και να μην επηρεάσουν τη δράση των β-αυs που μελετάμε. Έπειτα μετρήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-10). CRE-Luc Εικόνα 4-10 : Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς CRE-Luc σε κύτταρα A7r5 τα οποία επωάστηκαν με Ισοπροτερενόλη (ISO) σε συγκέντρωση 10 μμ, Φορσκολίνη (FORSK) σε συγκέντρωση 1 μμ και DMSO σε συγκέντρωση 1 μμ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το 84

85 παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Η Φορσκολίνη αυξάνει τα επίπεδα της αδενυλικής κυκλάσης το οποίο στη συνέχεια αυξάνει το camp. Γνωρίζουμε ότι το πλασμίδιο CRE-Luc αποκρίνεται στο camp. Συνεπώς χρησιμοποιώντας την Φορσκολίνη μπορούμε να πιστοποιήσουμε την σωστή λειτουργία του πλασμιδίου αυτού. Παρατηρούμε λοιπόν από το παραπάνω διάγραμμα ότι η Φορσκολίνη μέσω αύξησης του camp αυξάνει τη μεταγραφική ενεργότητα του CRE. Επίσης παρατηρούμε ότι τα κύτταρα A7r5 αποκρίνονται στον άμεσο αγωνιστή των β-αυ, την Ισοπροτερενόλη, μέσω αύξησης της ενεργότητας του CRE πράγμα που αποδεικνύει ότι τα κύτταρα αυτά έχουν ενδογενώς λειτουργικούς β-αυς Επίδραση των β-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ στα κύτταρα A7r5 Αφού πλέον γνωρίζουμε ότι τα κύτταρα A7r5 εκφράζουν ενδογενώς τους β-αυς, θελήσαμε να ελέγξουμε πώς οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Γι αυτό το λόγο, όπως προηγουμένως με τους α1α-αυs, πραγματοποιήσαμε παροδική διαμόλυνση των κυττάρων A7r5 με τους minimal υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ (SM22α-Luc, SM-Calponin-Luc, SM-α-Αctin-Luc, SM- MHC-Luc) σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργειά τους. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA) με τις εξής ουσίες : Ισοπροτερενόλη (ISO) συγκέντρωσης 10 μμ, Φορσκολίνη (FORSK) συγκέντρωσης 1 μμ και DMSO συγκέντρωσης 1 μμ. Πριν από αυτό όμως τα κύτταρα επωάστηκαν για 20 λεπτά με τον εκλεκτικό ανταγωνιστή των α2-αδρενεργικών υποδοχέων, Υοχιμβίνη συγκέντρωσης 10 μμ, προκειμένου να μπλοκάρει τους υποδοχείς αυτούς και να μην επηρεάσουν τη δράση των β-αυ που μελετάμε. Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-11). 85

86 Εικόνα 4-11 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin, SM- MHC σε κύτταρα Α7r5. Τα κύτταρα A7r5 επωάστηκαν με Ισοπροτερενόλη (ISO) σε συγκέντρωση 10 μμ, Φορσκολίνη (FORSK) σε συγκέντρωση 1 μμ και DMSO σε συγκέντρωση 1 μμ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 4 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=16. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από το παραπάνω διάγραμμα παρατηρούμε ότι η Ισοπροτερενόλη μειώνει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM-Calponin και SM-MHC ενώ δεν επηρεάζει την ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α και SM-α-Αctin. Επίσης η Φορσκολίνη μειώνει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM-Calponin, SM-α-Αctin, SM-MHC ενώ δε φαίνεται να επηρεάζει την ενεργότητα των υποκινητή της SM22α. Συμπερασματικά λοιπόν, συγκρίνοντας τους α και τους β αδρενεργικούς υποδοχείς παρατηρήσαμε ότι επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη μεταγραφή των υποκινητών των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ. 86

87 Επίδραση των β-αδρενεργικών υποδοχέων στην έκφραση των ΛΜΚ-ειδικών πρωτεϊνών σε κύτταρα A7r5 Για να ελέγξουμε τι συμβαίνει σε επίπεδο πρωτεΐνης όσον αφορά στην επαγωγή της έκφρασης της SM-α-Ακτίνης, της SM-Καλπονίνης και της SM22α από την ενεργοποίηση των β-αυ χρησιμοποιήσαμε τα κύτταρα A7r5 τα οποία επωάσαμε για 24 ώρες με Ισοπροτερενόλη (ISO) συγκέντρωσης 10 μμ και Φορσκολίνη (FORSK) συγκέντρωσης 1 μμ είτε σε θρεπτικό μέσο που δεν περείχε ορό (0% FBS) είτε σε θρεπτικό μέσο που περιείχε ορό (10% FBS), 48 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Στη συνέχεια το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων αυτών (10μg) αναλύθηκε σε SDS-PAGE όπου ταυτοποιήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών της SM-α-Ακτίνης, της SM- Καλπονίνης και της SM22α (εικόνα 4-12). Το πείραμα αυτό πραγματοποιήθηκε 3 φορές. Εικόνα 4-12 : Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western σε κύτταρα A7r5 για την SM-α-Ακτίνη, την SM-Καλπονίνη και την SM22α για 24 ώρες μετά την επίδραση Ισοπροτερενόλης (ISO) σε συγκέντρωση 10 μμ και Φορσκολίνης (FORSK) σε συγκέντρωση 1 μμ σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία (control). Παρόλο που πραγματοποιήσαμε το πείραμα 3 φορές και κάνοντας στατιστική ανάλυση (semiquantitative) δεν μπορέσαμε να καταλήξουμε σε κάποιο συμπέρασμα διότι υπήρχε μεγάλη ανομοιογένεια μεταξύ των πειραμάτων. Αυτό πιθανώς να οφείλεται στο ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες έχουν μεγάλο χρόνο ημιζωής. Επομένως, για να μπορέσουμε να δούμε μείωση σε επίπεδο πρωτεΐνης μετά από έκθεση των κυττάρων στις διάφορες ουσίες, πιθανόν θα πρέπει πρώτα να έχουν αποδομηθεί οι πρωτεΐνες που παράγουν ενδογενώς τα κύτταρα. Πιθανόν θα πρέπει, επαναλαμβάνοντας τα πειράματα, να εκθέσουμε τα κύτταρα σε αυτές τις ουσίες για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα προκειμένου να έχουμε την δυνατότητα να δούμε πιο ξεκάθαρα αποτελέσματα. 87

88 4.2 Μοριακός έλεγχος του ΛΜΦ σε NIH3T Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών α1-αδρενεργικών υποδοχέων σε κύτταρα ινοβλαστών NIH3T3 Τα αρχικά μας συμπεράσματα σε κύτταρα A7r5 είναι ότι όντως οι α1-αυs επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ. Από τη βιβλιογραφία γνωρίζουμε ότι οι ινοβλάστες μπορούν να διαφοροποιηθούν σε μυοϊνοβλάστες και έπειτα σε λεία μυϊκά κύτταρα ως απόκριση σε βιοχημικά και μηχανικά ερεθίσματα (Faber et al., 2001). Γι αυτό το λόγο θέλαμε να δούμε τι συμβαίνει σε κύτταρα που δεν εκφράζουν σε βασικό επίπεδο τα ειδικά για τα ΛΜΚ γονίδια. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τα παρακάτω πειράματα είναι τα κύτταρα ινοβλαστών ΝΙΗ3Τ3. Αρχικά θελήσαμε να ελέγξουμε αν οι ινοβλάστες ΝΙΗ3Τ3 εκφράζουν ενδογενώς στους α1- αδρενεργικούς υποδοχείς. Επειδή στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς επάγουν τον παράγοντα SRF (Mao J., 1998) χρησιμοποιήσαμε ως πλασμίδιο αναφοράς το SRE-Luc που η ενεργότητα της λουσιφεράσης καθορίζεται από την πρόσδεση του SRF στα στοιχεία SRE. Κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παροδικά συν-διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς SRE-Luc και είτε με το πλασμίδιο-μάρτυρα pcdna3 είτε με το πλασμίδιο που εκφράζει τον α1α-αδρενεργικό υποδοχέα (α1α-αυ) ανθρώπου, είτε με το πλασμίδιο που εκφράζει τον α1β- αδρενεργικό υποδοχέα (α1β-αυ) χάμστερ σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά εκτέθηκαν για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA) στις εξής ουσίες : στον παράγοντα PDGF-BB (BB) σε συγκέντρωση 20 ng/ml, στον αγωνιστή των α- αδρενεργικών υποδοχέων, Φαινυλεφρίνη (PE), σε συγκέντρωση 1 μμ, στον εκλεκτικό αναταγωνιστή των α-αδρενεργικών υποδοχέων, Πραζοσίνη (PRAZ), σε συγκέντρωση επίσης 1 μμ, σε συνδιασμό τους και σε ορό (FBS10%). Έπειτα μετρήθηκε η ενεργότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-13). A) pcdna3 + SRE-Luc 88

89 B) α1a-αυ + SRE-Luc Γ) α1b-αυ + SRE-Luc Εικόνα 4-13 : Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς SRE-Luc, (Α) σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο-μάρτυρα pcdna3, (Β) σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο α1α-αυ και (Γ) σε συν-διαμόλυνση με το πλασμίδιο α1β-αυ σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 τα οποία επωάστηκαν με PDGF-BB (BB) σε συγκέντρωση 20 ng/ml, Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ, Πραζοσίνη (PRAZ) σε συγκέντρωση 1 μμ, συνδιασμό Φαινυλεφρίνης με Πραζοσίνη και ορό (FCS 10%). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), n=4. Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. 89

90 Τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που συν-διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο-μάρτυρα (δηλ, pcdna3 επιπλέον του SRE-Luc, εικόνα Α) αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν στον παράγοντα PDGF-BB ενώ δεν αποκρίθηκαν στον αγωνιστή των α1- ΑΥs Φαινυλεφρίνη. Όταν όμως εκφράσαμε τους υποτύπους των α1-αυs, α1α και α1β (εικόνες Β και Γ, αντίστοιχα), παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα αποκρίθηκαν στη Φαινυλεφρίνη. Κάνοντας περαιτέρω φαρμακολογικό έλεγχο με τη χρήση του ανταγωνιστή των α1-αυs Πραζοσίνη, παρατηρήσαμε ότι αυτή η απόκριση των κυττάρων στην Φαινυλεφρίνη καταστέλλεται. Συμπεραίνουμε ότι τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που χρησιμοποιούμε δεν εκφράζουν ενδογενώς τους υποτύπους των α1-αυ, α1α και α1β. Για το λόγο αυτό στα επόμενα πειράματά μας είναι απαραίτητο να τους εισάγουμε στα κύτταρα. Μπορούμε λοιπόν να εισάγουμε τους υπό διερεύνηση υποδοχείς μέσω πλασμιδίων για να μελετήσουμε την επίδραση των υποτύπων α1α και α1β των α1-αυ στη μεταγραφή των γονιδίων που εξαρτώνται από τον μεταγραφικό παράγοντα SRF, όπως τα γονίδια-δείκτες που καθορίζουν τον ΛΜΦ Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 στην παροδική διαμόλυνση Στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 πώς οι α1α-αυs επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε συν-διαμόλυνση των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 με το πλασμίδιο των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων (α1α- ΑΥ) και με τους minimal υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ (SM-α-Αctin- Luc, SM-Calponin-Luc, SM-MHC-Luc, SM22α-Luc) 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο για 24 ώρες και μετά επωάστηκαν με τις ουσίες της Φαινυλεφρίνης (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ και του παράγοντα TGFβ1 σε συγκέντρωση 10 ng/mlγια 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-14). 90

91 Εικόνα 4-14 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin, SM- MHC σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που έχουν συν-διαμολυνθεί παροδικά με το πλασμίδιο του α1α-αδρενεργικού υποδοχέα (α1α-αυ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από τα παραπάνω διαγράμματα συμπεραίνουμε ότι τα κύτταρα αποκρίνονται στον παράγοντα TGF-β1, κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο αφού τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 έχουν υποδοχείς μέσω των οποίων δρα ο παράγοντας TGF-β1. Όσον αφορά στη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin και SM-MHC παρατηρείται επαγωγή τους από τη Φαινυλεφρίνη. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι α1α-αυs επάγουν τη μεταγραφή των υποκινητών των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ και σε κύτταρα ινοβλαστών. 91

92 4.2.3 Επίδραση των α1β-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ειδικών υποκινητών των γονιδίων του ΛΜΦ σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 στην παροδική διαμόλυνση Στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 πώς οι α1β-αδρενεργικοί υποδοχείς επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε συν-διαμόλυνση των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 με το πλασμίδιο των α1βαδρενεργικών υποδοχέων (α1β-αυ) και με τους minimal υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ (SM-α-Αctin-Luc, SM-Calponin-Luc, SM-MHC-Luc, SM22α-Luc) 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά επωάστηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο για 24 ώρες και μετά επωάστηκαν με τις ουσίες της Φαινυλεφρίνης (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ και του παράγοντα TGF-β1 σε συγκέντρωση 10 ng/ml για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-15). Εικόνα 4-15 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin, SM- MHC σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που έχουν συν-διαμολυνθεί παροδικά με το πλασμίδιο του α1β-αδρενεργικού υποδοχέα (α1β-αυ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας 92

93 λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από το παραπάνω διάγραμμα συμπεραίνουμε ότι η ενεργοποίηση των α1β-αυ από τη Φαινυλεφρίνη επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM- Calponin και SM-MHC ενώ φαίνεται να μην επηρεάζει την ενεργότητα του υποκινητή της SM-α- Αctin. Συνεπώς, οι υπότυποι των α1-αυ, α1α και α1β, επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη μεταγραφή των υποκινητών των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ και στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ Έλεγχος λειτουργικών κλώνων σε κύτταρα ινοβλαστών NIH3T3 Για την πραγματοποίηση των επόμενων πειραμάτων χρειάστηκε να ακολουθήσουμε μια χρονοβόρα διαδικασία προκειμένου τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 να εκφράζουν σταθερά τα επιθυμητά γονίδια του α1α-αδρενεργικού υποδοχέα (α1α-αυ) ανθρώπου και του γονιδίου-μάρτυρα (pcdna3). Αρχικά πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 με τα παραπάνω πλασμίδια σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Ακολουθήθηκε αλλαγή του θρεπτικού μέσου 24 ώρες μετά από τη διαμόλυνση των κυττάρων με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό της Νεομυκίνης σε συγκέντρωση 900 μg/ml (σε προκαταρκτικά πειράματα καμπύλης θανάτου σε κυττάρα NIH3T3 είδαμε ότι η κατάλληλη συγκέντρωση Νεομυκίνης που μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε είναι τα 900 μg/ml). Από τη στιγμή αυτή αναπτύσσονται μόνο τα κύτταρα που περιέχουν σταθερά τα επιθυμητά πλασμίδια αφού τα πλσμίδια των γονιδίων αυτών έχουν ανθεκτικότητα στη Νεομυκίνη. Στη συνέχεια επιλέγθηκαν μερικά μονήρη κύτταρα προκειμένου από το καθένα από αυτά να δημιουργηθούν μοναδικές αποκίες-κλώνοι. Οι κλώνοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρες θρεππικό μέσο που περείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml αλλάζοντας κάθε 4 ημέρες το θρεπτικό τους μέσο. Στη συνέχεια ελέγξαμε τους κλώνους αυτούς για να δούμε αν όντως εκφράζονται σταθερά τα επιθυμητά γονίδια. Για να ελέγξουμε λοιπόν αν οι κλώνοι που δημιουργήσαμε υπερεκφράζουν σταθερά τα επιθυμητά γονίδια, τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο SRE-Luc σε πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων με τις ουσίες PDGF-BB (ΒΒ) συγκέντρωσης 20 ng/ml και Φαινυλεφρίνης (PE) συγκέντρωσης 1 μm για 24 ώρες σε θρεπτικό υλικό μέσο που περείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml αλλά δεν περιείχε ορό (0,1% BSA). Τέλος μετρήθηκε η ενεργότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνες 4-16, 4-17). 93

94 Εικόνα 4-16 : Σχετική δραστηριότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc σε κλώνους κυττάρων NIH3T3 με το γονίδιο-μάρτυρα (pcdna3) που επωάστηκαν με PDGF-BB σε συγκέντρωση 20 ng/ml και Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μm για 24 ώρες σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας), n=4. Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Για τη συνέχεια των πειραμάτων μας επιλέξαμε τον κλώνο Νο 1 αφού τα κύτταρα αυτού του κλώνου αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν στον παράγοντα PDGF-BB ενώ δεν αποκρίθηκαν στον αγωνιστή των α1-αυs Φαινυλεφρίνη. 94

95 Εικόνα 4-17 : Σχετική δραστηριότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc σε κλώνους κυττάρων NIH3T3 με το γονίδιο του αδρενεργικού υποδοχέα α1α (α1α-αυ) που επωάστηκαν με PDGF-BB σε συγκέντρωση 20 ng/ml και Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μm για 24 ώρες σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσηςσε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (CTL), n=4. Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Για τη συνέχεια των πειραμάτων μας επιλέξαμε τον κλώνο Νο 1 αφού τα κύτταρα αυτών των κλώνων αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν και στον παράγοντα PDGF-BΒ και στον αγωνιστή των α1α-αυ Φαινυλεφρίνη. 95

96 4.2.5 Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην ενεργότητα των ΛΜΚειδικών υποκινητών σε κύτταρα NIH3T3 Στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε στα κύτταρα NIH3T3 που εκφράζουν ήδη σταθερά το γονίδιο των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων (α1α-αυ) πώς οι υποδοχείς αυτοί επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε παροδική διαμόλυνση αυτών των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 με τους minimal υποκινητές των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ (SM22α-Luc, SM-Calponin-Luc, SM-α-Αctin-Luc, SM-MHC-Luc) σε πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση των ουσιών TGF-β1 σε συγκέντρωση 10 ng/ml και Φαινυλεφρίνης (PE) σε συγκέντρωση 1 μm για 24 ώρες σε θρεπτικό υλικό μέσο που περιείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml αλλά δεν περιείχε ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-18). 96

97 A) Κλώνος pcdna3 97

98 Β) α1α-αυ Κλώνος 1 Εικόνα 4-18 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin, SM- MHC σε κύτταρα NIH3T3 που εκφράζουν σταθερά Α) το πλασμίδιο-μάρτυρα pcdna3 και Β) το γονίδιο των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων (α1α-αυ), κλώνος 2. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 5 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=20. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από τα παραπάνω διαγράμματα παρατηρούμε ότι και στους 2 κλώνους τα κύτταρα αποκρίνονται στον παράγοντα TGF-β1, κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο αφού τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 έχουν υποδοχείς μέσω των οποίων δρα ο παράγοντας TGF-β1. Όσον αφορά στη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin και SM-MHC δεν παρατηρείται επαγωγή τους από τη Φαινυλεφρίνη, όπως αναμένεται, στον κλώνο-μάρτυρα pcdna3 (εικόνα 4-18Α). Αντίθετα στον 1 ο κλώνο όπου υπερεκφράζεται το γονίδιο των α1α-αυ (Κλώνος 1, εικόνα 4-18Β) παρατηρήσαμε ότι η Φαινυλεφρίνη επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin, SM-α-Αctin και SM-MHC. Αυτή η επαγωγή παρατηρήθηκε έμμεσα σε επίπεδο μεταγραφής. 98

99 4.2.6 Επίδραση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων στην έκφραση των ΛΜΚειδικών πρωτεϊνών σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 Για να ελέγξουμε τι συμβαίνει σε επίπεδο πρωτεΐνης όσον αφορά στην επαγωγή της έκφρασης της SM-α-Ακτίνης, της SM-Καλπονίνης και της SM22α από την ενεργοποίηση των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα NIH3T3 τα οποία εκφράζουν σταθερά το γονίδιο του α1α- ΑΥs και κύτταρα NIH3T3 που εκφράζουν σταθερά το γονίδιο-μάρτυρα (pcdna3). Τα κύτταρα αφού αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε πλήρες θρεπτικό μέσο με Νεομυκίνη συγκέντρωσης 900 μg/ml, επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο με Νεομυκίνη συγκέντρωσης 900 μg/ml που δεν περείχε ορό (0,1% BSΑ). Έπειτα επωάστηκαν για 24 ώρες με τον παράγοντα TGF-β1 σε συγκέντρωση 10ng/ml και με τη Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ σε θρεπτικό μέσο με Νεομυκίνη συγκέντρωσης 900 μg/ml που δεν περείχε ορό (0,1% BSΑ). Στη συνέχεια το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων αυτών (40μg) αναλύθηκε σε SDS-PAGE όπου ταυτοποιήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών της SM-α-Ακτίνης, της SM-Καλπονίνης και της SM22α (εικόνα 4-19). Το πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές. Εικόνα 4-19 : Σταθερή έκφραση του α1α-αδρενεργικού υποδοχέα (α1α-αυ) και του γονιδίου-μάρτυρα (pcdna3) σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την SM-α-Ακτίνη, τη SM-Καλπονίνη και τη SM22α 24 ώρες μετά την επίδραση με τον παράγοντα TGF-β1 σε συγκέντρωση 10ng/ml και τη Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μm σε σχέση με κύτταρα που δεν επωάστηκαν με καμία ουσία (control). Παρόλο που πραγματοποιήσαμε το πείραμα 3 φορές και κάνοντας στατιστική ανάλυση (semiquantitative) δεν μπορέσαμε να καταλήξουμε σε κάποιο συμπέρασμα διότι υπήρχε μεγάλη ανομοιογένεια μεταξύ των πειραμάτων. 99

100 4.2.7 Ρόλος των στοιχείων CΑrG στην ενεργοποίηση των γονιδίων του ΛΜΦ από τους α1α-αδρενεργικούς υποδοχείς στα κύτταρα NIH3T3 Στη συνέχεια θελήσαμε να ελέγξουμε αν τα στοιχεία CΑrG, πάνω στα οποία προσδένεται ο SRF, είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν τον ΛΜΦ από τους α1α-αυs. Για να το ελέγξουμε αυτό, κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν ήδη σταθερά το γονίδιο των α1α-αυs διαμολύνθηκαν με τους υποκινητές των γονιδίων SM22α και SM-Calponin με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑrG (CΑrG mutants SM22α-Luc, 3x CΑrG mutants SM-Calponin-Luc ή αλλιώς 3x CΑrG mutants SM-CΝΝ-Luc, αντίστοιχα) σε πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση των ουσιών TGF-β1 σε συγκέντρωση 10 ng/ml και Φαινυλεφρίνης (PE) σε συγκέντρωση 1 μm για 24 ώρες σε θρεπτικό υλικό μέσο που περιείχε Νεομυκίνη σε συγκέντρωση 900 μg/ml αλλά δεν περιείχε ορό (0,1% BSA). Έπειτα πιστοποιήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα των ειδικών minimal υποκινητών με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-20). 100

101 Εικόνα 4-20 : Mέτρηση ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίων αγρίου τύπου SM22α και SM-Calponin και των υποκινητών με μεταλλαγμένα τα στοιχεία CΑΥG (CΑΥG mutants SM22α, 3x CΑΥG mutants SM- CΝΝ) σε κύτταρα NIH3T3 που εκφράζουν σταθερά το γονίδιο των α1α-αδρενεργικών υποδοχέων (α1α-αυ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από τα παραπάνω διαγράμματα φαίνεται ότι τόσο ο υποκινητής της SM22α όσο και ο υποκινητής της SM-Calponin ενεργοποιούνται από τους α1α-αυs είτε όταν οι υποκινητές περιέχουν όλα τα στοιχεία CΑrG είτε όταν υπάρχουν μεταλλάξεις στα στοιχεία αυτά. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν ήδη σταθερά το γονίδιο των α1α-αυs η ενεργοποίηση των υποκινητών της SM22α και της SM-Calponin από τους υποδοχείς αυτούς δεν εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG. Άρα, όσον αφορά στους α1α-αυs, η εξάρτηση της μεταγραφής των υποκινητών των γονιδίων SM22α και της SM-Calponin από τα στοιχεία CΑrG είναι διαφορετική μεταξύ των δύο διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών που μελετάμε. 101

102 4.3 Μελέτη λειτουργικών υποδοχέων σε κύτταρα DU Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών υποδοχέων για τον ΤGF-β1 σε κύτταρα DU145 Η κυτταρική σειρά DU145 προέρχεται από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη. Αυτό που θελήσαμε να ελέγξουμε ήταν αν αυτά τα κύτταρα εκφράζουν τους υποδοχείς TGF-β-R και τους α1- ΑΥs προκειμένου να αποτελέσουν μοντέλα έρευνας των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στον καθορισμό του ΛΜΦ. Γνωρίζοντας τον λειτουργικό ρόλο του αυξητικού παράγοντα ΤGF-β1 σε in vivo και in vitro συστήματα και γνωρίζοντας την ύπαρξη λειτουργικών υποδοχέων για τον παράγοντα αυτό στα κύτταρα A7r5 και NIH3T3 θελήσαμε να ελέγξουμε την επίδραση και στα κύτταρα DU145. Ο TGF-β επάγει την πλειονότητα των δράσεών του στα κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης των σηματοδοτικών μορίων Smad 2,3 τα οποία έχουν τη δυνατότητα να δημιουργούν σύμπλοκα με την Μυοκαρδίνη. Για αυτόν το λόγο χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο αναφοράς CAGA-MLP/Luc το οποίο φέρει το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης καθοδικά του υποκινητή MLP o οποίος συνδέεται με αλληλουχίες CAGA υπεύθυνες για την μεταγραφική ενεργότητα του παράγοντα Smad, ο οποίος είναι ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας σε απάντηση της έκθεσης σε ΤGF-β1. Κύτταρα DU145 διαμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο CAGA-MLP/Luc σε πλήρες θρεπτικό μέσο για 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργειά τους. Ακολούθησε επώαση τους για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο που δεν περιείχε ορό (0,1% ΒSA) και έπειτα έγινε προσθήκη του μεταγραφικού παράγοντα ΤGF-β1 σε συγκέντρωση 10 ng/ml για 6 ώρες. Έπειτα μετρήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα του πλασμιδίου με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-21). Εικόνα 4-21 : Σχετική δραστηριότητα του πλασμιδίου αναφοράς CAGA-MLP/Luc σε κύτταρα DU145 τα οποία επωάστηκαν με ΤGF-β1 σε συγκέντρωση 10 ng/ml για 6 ώρες σε σχέση με κύτταρα τα οποία δεν επωάστηκαν με τον παράγοντα (CTL). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της 102

103 % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 2 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=8. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Από το παραπάνω διάγραμμα παρατηρούμε ότι τα κύτταρα DU145 αποκρίνονται στον παράγοντα ΤGF-β1 μέσω αύξησης της μεταγραφικής ενεργότητας του πλασμιδίου αναφοράς CAGA-MLP/Luc. Συνεπώς βγάλαμε το συμπέρασμα ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα έχουν τους κατάλληλους υποδοχείς με τους οποίους αποκρίνονται στον αυξητικό παράγοντα ΤGF-β Έλεγχος ύπαρξης λειτουργικών α1-αδρενεργικών υποδοχέων σε κύτταρα DU145 Τέλος γνωρίζοντας ότι στα κύτταρα A7r5 και NIH3T3 δεν εκφράζονται ενδογενώς οι α1- αδρενεργικοί υποδοχείς θελήσαμε να ελέγξουμε αν οι υποδοχείς αυτοί εκφράζονται ενδογενώς στα κύτταρα DU145. Επειδή στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς επάγουν τον παράγοντα SRF (Mao J., 1998) χρησιμοποιήσαμε ως πλασμίδιο αναφοράς το SRE- Luc που η ενεργότητα της λουσιφεράσης καθορίζεται από την πρόσδεση του SRF στα στοιχεία SRE. Κύτταρα DU145 παροδικά διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς SRE-Luc σε πλήρες θρεπτικό μέσο 24 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους. Ακολούθησε επώαση τους για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο που δεν περιείχε ορό (0,1% ΒSA) και στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά εκτέθηκαν για 6 ώρες σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (DMEM 0,1% BSA) στις εξής ουσίες : στον αγωνιστή των α1- αδρενεργικών υποδοχέων, Φαινυλεφρίνη (PE), σε συγκέντρωση 1 μμ και στον ορό (FBS 10%). Έπειτα μετρήθηκε η ενεργότητα του πλασμιδίου αναφοράς SRE-Luc με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (εικόνα 4-22). Εικόνα 4-22 : Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς SRE-Luc σε κύτταρα DU145 τα οποία επωάστηκαν με Φαινυλεφρίνη (PE) σε συγκέντρωση 1 μμ και με ορό (FCS 10%) για 6 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % ενεργότητας λουσιφεράσης σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (μάρτυρας). Τα σημεία *, ** και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας 103

104 P<0,05, 0,01 και 0,001 αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα. Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές και το κάθε δείγμα ήταν εις τετραπλούν, n=12. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student s t-test. Τα κύτταρα DU145 που διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς SRE-Luc αποκρίθηκαν όπως αναμενόταν στον ορό ενώ δεν αποκρίθηκαν στον αγωνιστή των α1-αδρενεργικών υποδοχέων Φαινυλεφρίνη. Από τα παραπάνω βγάλαμε το συμπέρασμα ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα δεν έχουν τους κατάλληλους υποδοχείς με τους οποίους αποκρίνονται στην Φαινυλεφρίνη. Από τα παραπάνω πειράματα φαίνεται ότι τα κύτταρα DU145 δεν εκφράζουν ενδογενώς τους υποδοχείς των α1-αδρενεργικών υποδοχέων και δυστυχώς δεν μπορούμε να εξετάσουμε σε αυτά τα κύτταρα τη δράση τους στο ΛΜΦ. Αντιθέτως φαίνεται πως εκφράζουν τους υποδοχείς TGF-β-R. 104

105 4.4 Έλεγχος του φαινομένου ΕΜΤ σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Εκτός από τον ρόλο που παίζουν οι Μυοκαρδίνες στα ΛΜΚ, οι Μυοκαρδίνες εκφράζονται de novo σε επιθηλιακά κύτταρα και μπορούν να ελέγξουν σημαντικές διαδικασίες όπως είναι η ανάπτυξη, η οργάνωση του κυτταροσκελετού, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και η κυτταροκίνηση. Αυτές οι διαδικασίες αναφέρονται ως επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (EMT-Epithelial to Mesenchymal Transition). Η επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση εμφανίζεται σε υγιείς καταστάσεις όπως στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, στη μορφολογία ιστών και στην αγγειογένεση, εμφανίζεται όμως και σε παθολογικές καταστάσεις όπως στην ίνωση, στο κλείσιμο πληγών, στη μετάσταση και στην παθολογική αγγειογένεση. Κατά την επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση παρατηρείται μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών E-Καντερίνης και VE-Καντερίνης και ταυτόχρονη αύξηση των πρωτεϊνών SM-α-Aκτίνης Βιμεντίνης/Δεσμίνης και N-Καντερίνης. Αυτό που μας είναι άγνωστο είναι αν η έκφραση της Μυοκαρδίνης σε ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει το φαινόμενο EMT. Προκειμένου να ελέγξουμε αυτό το φαινόμενο χρησιμοποιήσαμε εδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) στα οποία υπερεκφράσαμε τη Μυοκαρδίνη χρησιμοποιώντας τον αδενοϊό (ΑdMyocd). Για το σκοπό αυτό πραγματοπoιήσαμε διαμόλυνση των κυττάρων, 48 ώρες μετά την ανακαλλιέργιά τους, με 50 moi (multiplicity of infection) από αδενοϊό (ΑdMyocd) και αντίστοιχα με 50 moi από αδενοϊό που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας (ΑdLacZ) σε θρεπτικό μέσο που δεν περιείχε ορό (Μ199 0,1% ΒSA) για 24 ώρες. Έπειτα ελήθφησαν φωτογραφίες από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Εικόνα 4-23). Εικόνα 4-23 : Αντιπροσωπευτική εικόνα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC τα οποία διαμολύνθηκαν με τον αδενοϊό ΑdMyocd (50 moi) και τον αδενοϊό-μάρτυρα ΑdLacZ (50 moi) σε σύγκριση με κύτταρα που δεν 105

106 διαμολύνθηκαν (control). Το πείραμα αυτό πραγματοποιήθηκε 3 φορές, n=3. Από την παραπάνω εικόνα παρατηρούμε ότι όταν υπερεκφράζουμε την Μυοκαρδίνη αλλάζει η μορφολογία των κυττάρων HUVEC. Ενώ τα κύτταρα στα οποία είτε δεν έχουμε επιδράσει με αδενοϊό (κύτταρα control) είτε έχουμε διαμολύνει με τον αδενοϊό-μάρτυρα (ΑdLacZ) διατηρείται η φυσιολογική στρογγυλοποιημένη μορφή, τα κύτταρα στα οποία έχουμε επιδράσει με αδενοϊό ΑdMyocd είναι πιο επιμήκη με ατρακτοειδή μορφή. Προκειμένου να ελέγξουμε αν αυτή η μορφολογική αλλαγή των κυττάρων επηρεάζει άμεσα την έκφραση των πρωτεϊνών της Ακτίνης και της Καλπονίνης χρησιμοποιήθηκαν τα ολικά εκχυλίσματα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC του παραπάνω πειράματος. Το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων αυτών αναλύθηκε σε SDS-PAGE όπου ταυτοποιήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών της SM-α-Ακτίνης και Καλπονίνης (Εικόνα 4-24). Εικόνα 4-24 : Υπερέκφραση της Μυοκαρδίνης σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την SM-α-Ακτίνη και την Καλπονίνη 24 ώρες μετά την επίδραση με τον αδενοϊό ΑdMyocd (Myocd, 50 moi) και τον αδενοϊό-μάρτυρα ΑdLacZ (LacZ, 50 moi) σε σύγκριση με κύτταρα που δεν διαμολύνθηκαν (control). Το παραπάνω πείραμα πραγματοποιήθηκε 3 φορές, n=3. Από την ανάλυση κατά Western βλέπουμε ότι υπερεκφράζοντας στα κύτταρα HUVEC την Μυοκαρδίνη επάγεται η έκφραση των πρωτεϊνών της SM-α-Ακτίνης και Καλπονίνης. Από αυτό συμπεραίνουμε ότι η Μυοκαρδίνη επάγει αλλαγές που χαρακτηρίζουν το φαινόμενο EMT. Δεν παρατηρήσαμε αλλαγές στην έκφραση των πρωτεϊνών E-Καντερίνης, VE-Καντερίνης Βιμεντίνης/Δεσμίνης και N- Καντερίνης (τα αποτελέσματα δεν συμπεριλαμβάνονται). 106