ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΗΣ-γ IN VITRO ΙΩΑΝΝΗΣ Θ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΘΕΟΔΟΥΛΗ ΠΑΠΑΣΤΑΥΡΟΥ-ΜΑΥΡΟΥΔΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ 2220 ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΗΣ-γ IN VITRO ΙΩΑΝΝΗΣ Θ. ΝΤΟΤΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΘΕΟΔΟΥΛΗ ΠΑΠΑΣΤΑΥΡΟΥ-ΜΑΥΡΟΥΔΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ 2220 ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΗΣ-γ IN VITRO ΙΩΑΝΝΗΣ Θ. ΝΤΟΤΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

4 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΡΟΗΛΙΔΗΣ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ, ΑΝΑΠΛΗΡ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΝΑΚΟΥΔΗ ΤΣΑΚΑΛΙΔΟΥ ΦΛΩΡΕΝΤΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΝΤΕΛΙΑΔΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΡΟΗΛΙΔΗΣ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ, ΑΝΑΠΛΗΡ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΝΑΚΟΥΔΗ ΤΣΑΚΑΛΙΔΟΥ ΦΛΩΡΕΝΤΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΝΤΕΛΙΑΔΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΚΟΛΑΙΔΗΣ ΠΑΥΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΙΟΥ ΔΑΝΙΗΛ ΣΤΥΛΙΑΝΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΔΙΖΑ ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΕΥΔΟΞΙΑ, ΑΝΑΠΛΗΡ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΠΑΙΩΑΝΝΙΔΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ, ΑΝΑΠΛΗΡ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/32, αρθρ. 202 & 2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50 & 8)

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ

6

7 Στους γονείς μου Στη Χριστίνα μου

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 10 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 13 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 16 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ 21 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΜΥΚΗΤΩΝ 22 ASPERGILLUS 23 Λοιμώξεις από Aspergillus Σύνδρομα υπερευαισθησίας Σαπροφυτικά (μη διηθητικά) σύνδρομα ιηθητική νόσος 27 FUSARIUM 28 Λοιμώξεις από Fusarium Εντοπισμένη λοίμωξη ιηθητική λοίμωξη 31 ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ 32 Aμφοτερικίνη Β 33 Λιπιδικά είδη αμφοτερικίνης Β 36 Λιποσωματική αμφοτερικίνη Β 36 Λιπιδικό σύμπλεγμα αμφοτερικίνης Β 37 Λιπιδικό κολλοειδές διάλυμα αμφοτερικίνης Β 37 Ανοσομετατρεπτικές ιδιότητες αμφοτερικίνης Β 38 Εχινοκανδίνες 38 Κασποφουγκίνη 39 Λοιπά αντιμυκητιακά φάρμακα 39 ΑΜΥΝΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ-ΑΜΥΝΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ 41 Αμυντικοί μηχανισμοί 42 ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΜΥΝΑ ΑΝΟΣΙΑ 44 Κύτταρα συμμετέχοντα στην ανοσιακή απάντηση 46 ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ ΩΣ ΑΜΥΝΤΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΣΤΗΝ ΕΞΟΥ ΕΤΕΡΩΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ 51 ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΕΞΟΥ ΕΤΕΡΩΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ 54 ΑΝΟΣΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ASPERGILLUS & FUSARIUM 56 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ 62 Ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) 66

10 Ανταγωνιστής του υποδοχέα της ιντερλευκίνης 1 (IL-1ra) 66 Παράγοντας νέκρωσης των όγκων α (TNF-α) 67 ΧΗΜΕΙΟΚΙΝΕΣ 68 Χημειοελκτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων 1 (MCP-1) 69 Ανασταλτική πρωτεΐνη των μακροφάγων 1β (MIP-1β) 70 ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΕΣ Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) 70 Β. ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 75 Α. Παρασκευή των μονοκυττάρων 76 Β. Παρασκευή των ουδετεροφίλων 79 Γ. Αντιδραστήρια-επώαση των μονοκυττάρων/ουδετεροφίλων 79. Μικροοργανισμός στόχος 82 Ε. Προσδιορισμός του mrna κυτταροκινών και χημειοκινών 82 ΣΤ. Προσδιορισμός των κυτταροκινών και χημειοκινών 85 Ζ. Μέθοδος καταστροφής των υφών 86 Η. Μέθοδος παραγωγής ανιόντος υπεροξειδίου (O 2 ) 87 Θ. Μέθοδος παραγωγής υπεροξειδίου υδρογόνου (H 2 O 2 ) & H 2 O 2 εξαρτωμένων ενδοκυττάριων παραπροϊόντων εναλλακτικών μεταβολικών οδών 88 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 88 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 89 Κυτταροκίνες & χημειοκίνες που παράγονται από μονοκύτταρα: προσδιορισμός του mrna με τη μέθοδο RT-PCR 89 Κυτταροκίνες & χημειοκίνες που παράγονται από μονοκύτταρα: πρωτεϊνικός προσδιορισμός με την ανοσοενζυματική μέθοδο ELISA 92 Καταστροφή των υφών Aspergillus fumigatus από μονοκύτταρα 96 Παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου από μονοκύτταρα έναντι υφών Aspergillus fumigatus 98 Παραγωγή από μονοκύτταρα υπεροξειδίου υδρογόνου (H 2 O 2 ) & H 2 O 2 εξαρτωμένων ενδοκυττάριων παραπροϊόντων εναλλακτικών μεταβολικών οδών 100 Καταστροφή υφών Fusarium solani από μονοκύτταρα 102 Καταστροφή υφών Aspergillus fumigatus από ουδετερόφιλα 104 Καταστροφή υφών Fusarium solani από ουδετερόφιλα 106 Παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου από μονοκύτταρα έναντι υφών Fusarium solani 108 Παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου από ουδετερόφιλα έναντι υφών Aspergillus fumigatus 110 Παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου από ουδετερόφιλα έναντι υφών Fusarium solani 112 8

11 Επίδραση της επώασης των μονοκυττάρων με κασποφουγκίνη & ιντερφερόνη-γ στην καταστροφή υφών Aspergillus fumigatus από μονοκύτταρα 114 Επίδραση της επώασης των ουδετεροφίλων με κασποφουγκίνη& ιντερφερόνη-γ στην καταστροφή υφών Aspergillus fumigatus από ουδετερόφιλα 116 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 118 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 129 ABSTRACT 133 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 137 9

12 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ABCD Amphotericin B colloidal dispersion, λιπιδικό κολλοειδικό διάλυμα αμφοτερικίνηs B ABLC Amphotericin B lipid complex, λιπιδικό σύμπλεγμα αμφοτερικίνηs B CM Complete medium, πλήρες καλλιεργητικό υλικό DAMB Deoxycholate amphotericin B, δεοξυχολική αμφοτερικίνη B DHR-123 dihydrorhodamine-1,2,3, διυδροροδαμίνη-1,2,3 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay, ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία FCS Fetal calf serum, εμβρυϊκός ορός μόσχου FCM Fetal calf medium, θρεπτικό μέσον που περιέχει εμβρυϊκό ορό G-CSF granulocyte colony-stimulating factor, παράγοντας διέγερσης αποικιών των κοκκιοκυττάρων GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, παράγοντας διέγερσης αποικιών των κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων HBSS Hanks ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων χωρίς Ca 2+ και Mg 2+ HBSS + Hanks ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων με Ca 2+ και Mg 2+ H 2 O 2 Hydrogen peroxide, υπεροξείδιο του υδρογόνου IL Interleukin, ιντερλευκίνη IL 1β Interleukin-1β, ιντερλευκίνη-1β IL-1ra Receptor antagonist of interleukin-1, ανταγωνιστής του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-1 IFN-γ Interferon-gamma, ιντερφερόνη-γ LAMB Liposomal amphotericin B, λιποσωματική αμφοτερικίνη B MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1, χημειοελκτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων-1 MIP-1β Macrophage inhibitory protein-1β, ανασταλτική πρωτεΐνη των μακροφάγων-1β 10

13 NADPH Νicotinamide adenine dinucleotide phosphate, φωσφορικό νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο O 2 PCR PMA Superoxide anion, ανιόν υπεροξειδίου Polymerase chain reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Phorbol myristate acetate, άλας εστέρα φορβόλης-μυριστικού οξέος R-123 rhodamine-1,2,3, ροδαμίνη-1,2,3 RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute-1640, ειδικό καλλιεργητικό υλικό κυττάρων RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction, ανάστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Tc/s T-cytotoxic/suppressive, Τ-κυτταροτοξικά/κατασταλτικά λεμφοκύτταρα Th T-helper, Τ-βοηθητικά λεμφοκύτταρα TLR Toll-like receptors, Toll-like υποδοχείς TNF-α Tumor necrosis factor-α, παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α TNF-β Tumor necrosis factor-β, παράγοντας νέκρωσης των όγκων-β XTT Τetrazolium salt 2,3-bis {2-methoxy-4-nitro-5-[(sulfenylamino) carbonyl]-2h-tetrazolium-hydroxide}, χρωματομετρική μέθοδος ανίχνευσης της καταστροφής των υφών YNB yeast nitrogen base, αζωτούχος βάση ζύμης συμπληρωμένη με 2% γλυκόζη 11

14

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Από το εντυπωσιακό πλήθος των γενών και ειδών των μυκήτων τα οποία απαντώνται στη φύση, ευτυχώς πολύ λίγα είδη αναπτύσσονται στον άνθρωπο. Η συχνότητα όμως των διηθητικών, γενικευμένων ή συστηματικών μυκητιακών λοιμώξεων αυξάνεται σταδιακά τη τελευταία δεκαετία στους ασθενείς, κάθε ηλικίας. Οι λοιμώξεις αυτές είναι σοβαρές και συχνά απειλητικές για τη ζωή του ασθενούς. Η δυνατότητα μακρύτερης επιβίωσης ασθενών με παράγοντες κινδύνου που προδιαθέτουν στην ανάπτυξη συστηματικής μυκητίασης οδήγησε στην αύξηση των λοιμώξεων αυτών. Τέτοιους παράγοντες κινδύνου εμφανίζουν οι ασθενείς με μεταμόσχευση συμπαγών οργάνων ή αιμοποιητικών κυττάρων, ασθενείς με ανοσοανεπάρκεια (συγγενή ή επίκτητη), εγκαυματίες καθώς και τα πρόωρα νεογνά που λαμβάνουν ευρέως φάσματος αντιμικροβιακά και έχουν πολυάριθμους καθετήρες. Η Candida είναι ο μύκητας που απομονώνεται συχνότερα στις συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις με κυρίαρχο είδος την Candida albicans. Ο Aspergillus αποτελεί το δεύτερο σε συχνότητα αίτιο συστηματικών μυκητιακών λοιμώξεων με κυρίαρχο είδος τον Aspergillus fumigatus, που ευθύνεται για περισσότερο από το 70% των ασπεργιλλώσεων παγκόσμια. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση των κρουσμάτων, ενίοτε με ενδημικό χαρακτήρα, συστηματικών μυκητιάσεων από σπανιότερους μύκητες όπως το Fusarium, με συνηθέστερο είδος το Fusarium solani. Στην άμυνα του ανθρώπινου οργανισμού κατά των συστηματικών μυκητιακών λοιμώξεων συμμετέχουν, κυρίως σε ό,τι αφορά τη φυσική ανοσία, οι φυσικοί φραγμοί, τα φαγοκύτταρα του αίματος (μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα) και τα μακροφάγα των ιστών. Η σημαντικότερη λειτουργία των κυττάρων αυτών είναι η φαγοκυττάρωση, δηλαδή η σύλληψη, η ενδοκυττάρια πέψη και καταστροφή των ξένων μικροοργανισμών ή η σύλληψη και αποκομιδή αδρανών ουσιών. Σε ότι αφορά την επίκτητη ανοσία εμπλέκεται ιδιαίτερα το κυτταρικό σκέλος αυτής, βασικά τα λεμφοκύτταρα που διακρίνονται στα Β- και Τ-λεμφοκύτταρα, ενώ από τα Τ- λεμφοκύτταρα κυρίως, προέρχονται οι κυτταροκίνες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του οργανισμού. 13

16 Τα αντιμυκητιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των συστηματικών μυκητιακών λοιμώξεων διακρίνονται σε κατηγορίες σύμφωνα με τη χημική τους δομή και τον τρόπο δράσης τους. Η αμφοτερικίνη Β είναι το πλέον διαδεδομένο αντιμυκητιακό φάρμακο που δρα στην εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων. Διακρίνεται σε τέσσερα είδη: τη συμβατική δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, τη λιποσωματική αμφοτερικίνη Β, την αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικών συμπλεγμάτων και την αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικού κολλοειδούς. Στα νεότερα αντιμυκητιακά που δρουν στο κυτταρικό τοίχωμα ανήκουν οι εχινοκανδίνες με σημαντικότερο εκπρόσωπο την κασποφουγκίνη. Τα τελευταία χρόνια γίνεται προσπάθεια να μελετηθούν οι ανοσομετατρεπτικές ιδιότητες αντιμυκητιακών φαρμάκων πάνω σε φαγοκύτταρα. Οι συγκεκριμένες μελέτες όμως, είναι σχετικά περιορισμένες και αφορούν κατά κύριο λόγο τις ανοσομετατρεπτικές ιδιότητες μόνο της συμβατικής αμφοτερικίνης Β (Roilides και συν 1990, Wilson και συν 1991, Rogers και συν 2000, Rogers και συν 2002). Οι πρώτες αυτές παρατηρήσεις στάθηκαν εφαλτήριο για τη διενέργεια της παρούσης μελέτης. Ο σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να μελετηθεί η απάντηση των ανθρώπινων μονοκυττάρων και ουδετεροφίλων στη δράση αντιμυκητιακών φαρμάκων έναντι υφών A. fumigatus και F. solani. Επίσης, μελετήθηκε η απάντηση των ανθρώπινων μονοκυττάρων στη δράση συνδυασμού αντιμυκητιακών φαρμάκων με ιντερφερόνη-γ έναντι υφών A. fumigatus. Ειδικότερα, εκτιμήθηκε η επίδραση ειδών αμφοτερικίνης Β στην παραγωγή κυτταροκινών και χημειοκινών από μονοκύτταρα. Επίσης, προσδιορίστηκε η επίδραση ειδών αμφοτερικίνης Β στην καταστροφή των υφών A. fumigatus ή F. solani και ο αντιμικροβιακός οξειδωτικός μεταβολισμός έναντι υφών A. fumigatus ή F. solani από μονοκύτταρα ή ουδετερόφιλα. Επιπλέον, μελετήθηκε η παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και των H 2 O 2 εξαρτωμένων ενδοκυττάριων παραπροϊόντων εναλλακτικών μεταβολικών οδών από μονοκύτταρα έναντι υφών A. fumigatus. Τέλος, εκτιμήθηκε η επίδραση της κασποφουγκίνης με/ή χωρίς την προσθήκη ιντερφερόνης-γ στην καταστροφή των υφών A. fumigatus από μονοκύτταρα ή ουδετερόφιλα. Η όλη μελέτη χωρίσθηκε σε δύο μέρη Α. Στο γενικό μέρος επιχειρείται μια σύντομη αναφορά στη μυκητολογία του A. fumigatus και του F. solani, την επιδημιολογία, την παθογένεση και την ανοσολογία των λοιμώξεων από τους παραπάνω μύκητες καθώς και την αντιμετώπιση και την πρόγνωσή τους. Επίσης, γίνεται αναφορά στο ρόλο του 14

17 μονοκυττάρου και του ουδετεροφίλου στην αντιμυκητιακή άμυνα, στη δράση κατά των συστηματικών μυκητιακών λοιμώξεων των ειδών αμφοτερικίνης Β και της κασποφουγκίνης και στις φυσικοχημικές ιδιότητες και τις λειτουργίες της ιντερφερόνης-γ. Επιπλέον, αναφέρονται οι φυσικοχημικές ιδιότητες και λειτουργίες των κυτταροκινών και χημειοκινών που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη. Β. Στο ειδικό μέρος αναφέρονται τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν και ο τρόπος παρασκευής τους, οι εργαστηριακές μέθοδοι που εφαρμόστηκαν, η στατιστική ανάλυση που έγινε και τέλος τα αποτελέσματα της μελέτης, η συζήτηση και τα συμπεράσματα. Ακολουθεί η συζήτηση των αποτελεσμάτων με την αναφορά στοιχείων από τη διεθνή βιβλιογραφία και διατυπώνονται τα συμπεράσματα της μελέτης. Στο τελευταίο τμήμα της διατριβής παρατίθεται η περίληψη στην Ελληνική και Αγγλική γλώσσα και η βιβλιογραφία. 15

18 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η διδακτορική αυτή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Ερευνητικό Εργαστήριο Λοιμώξεων της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του Α.Π.Θ. του Ιπποκρατείου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου προς όλους όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή του ΑΠΘ κ. Εμμανουήλ Ροηλίδη, ευχαριστώ θερμότατα για την επιλογή του θέματος, την παρότρυνση πριν και κατά τη διάρκεια της μελέτης, την καθοδήγηση για την διεκπεραίωση των πειραμάτων, αλλά κυρίως διότι με εμπιστεύτηκε να εργασθώ κοντά του, να αποκτήσω βασικές γνώσεις και να αγαπήσω την Παιδιατρική Λοιμωξιολογία. Την Καθηγήτρια και Διευθύντρια της Α Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Φλωρεντία Κανακούδη-Τσακαλίδου, ευχαριστώ θερμά για τις συμβουλές στην διεκπεραίωση των πειραμάτων της μελέτης και τις εύστοχες παρατηρήσεις στη συγγραφή αυτής της διατριβής. Τον Καθηγητή και πρώην Διευθυντή της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Χρήστο Παντελιάδη ευχαριστώ θερμά για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις του καθώς και την ουσιαστική συμβολή του στη συγγραφή της διατριβής. Τον Καθηγητή και πρώην Διευθυντή της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Ιωάννη Τσιούρη ευχαριστώ θερμά για την αμέριστη συμπαράσταση του για την ολοκλήρωση της μελέτης. Την Καθηγήτρια και νυν Διευθύντρια της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Παπασταύρου-Μαυρουδή Θεοδούλη ευχαριστώ θερμά για την στήριξή της στην ολοκλήρωση της μελέτης. Τη Δρα κ. Μαρία Σιμιτσοπούλου, μοριακή βιολόγο, ευχαριστώ ιδιαίτερα για την ουσιαστική βοήθεια της στα πειράματα προσδιορισμού του αγγελιοφόρου RNA καθώς και για τη γενικότερη συμβολή της στην ολοκλήρωση των υπολοίπων πειραμάτων της μελέτης. 16

19 Την κ. Μαρία Δαλακιουρίδου, βιολόγο, και την κ. Θωμαή Κωνσταντίνου, τεχνολόγο ιατρικών εργαστηρίων, ευχαριστώ πολύ για τη βοήθεια τους ως προς το τεχνικό μέρος της εκτέλεσης των πειραμάτων καθώς και για την άριστη συνεργασία σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Την Δρα κ. Άννα Ταπάρκου, βιολόγο, ευχαριστώ για τη συμβολή της στη διενέργεια των πειραμάτων παραγωγής H 2 O 2 και H 2 O 2 εξαρτωμένων ενδοκυττάριων παραπροϊόντων εναλλακτικών μεταβολικών οδών από μονοκύτταρα. Τον Καθηγητή και Διευθυντή του Immunocompromised Host Section, Pediatric Oncology Branch of National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA κ. Thomas J. Walsh, ευχαριστώ θερμά για την υψηλή εποπτεία και την ουσιαστική συμβολή του στην ολοκλήρωση της μελέτης. 17

20

21 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

22

23 ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Από την δεκαετία του 90 και μετά παρατηρείται αύξηση στις λοιμώξεις από ευκαιριακούς μύκητες. Ιδιαίτερα σε νοσηλευόμενους ασθενείς οι συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις έχουν αυξηθεί κατά ποσοστό που κυμαίνεται από 50% έως 400% ανάλογα με την εστία λοίμωξης. Ο μύκητας που απομονώνεται συχνότερα στις συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις είναι η Candida με κυρίαρχο είδος την Candida albicans (Pfaller 1994; Pfaller και συν 2001). Η καντινταιμία έχει αυξηθεί τόσο, ώστε πλέον η Candida αποτελεί το τέταρτο σε συχνότητα παθογόνο μικροοργανισμό που προκαλεί λοιμώξεις του κυκλοφορικού συστήματος στις ΗΠΑ, ενώ αντίστοιχη αύξηση παρουσιάζεται και στον Ευρωπαϊκό χώρο (Beck-Sague και συν 1993). Η συστηματική καντιντίαση είναι κυρίως νοσοκομειακή λοίμωξη και πλήττει το 1-8% των ασθενών που νοσηλεύονται στα νοσοκομεία ενώ εμφανίζει ιδιαίτερα μεγάλη θνητότητα που προσεγγίζει το 50% (Jarvis 1995). Στις μονάδες εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ) το ποσοστό συστηματικής καντιντίασης είναι ψηλότερο και φτάνει το 10%, αποτελώντας το 15% όλων των νοσοκομειακών λοιμώξεων. Αυτό οφείλεται κυρίως στο γεγονός ότι άτομα που νοσηλεύονται στις ΜΕΘ παρουσιάζουν πολλαπλούς παράγοντες κινδύνου. Αντίθετα, τα ποσοστά στις μονάδες εντατικής νοσηλείας νεογνών (ΜΕΝΝ) είναι αρκετά χαμηλά, συγκριτικά με αυτά των ενηλίκων και κυμαίνονται από 2-5% και σε κάποιες μελέτες είναι ακόμα χαμηλότερα (Roilides και συν 2004). Οι κυριότεροι παράγοντες κινδύνου που ευνοούν την εμφάνιση συστηματικών μυκητιακών λοιμώξεων είναι: α) η χρήση ενδοφλέβιων καθετήρων β) η μακροχρόνια χρήση αντιβιοτικών ευρέως φάσματος, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια, καθώς καταστρέφει τη φυσιολογική χλωρίδα και διαταράσσει τη μικροκυκλοφορία του εντέρου, συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στον ταχύτατο πολλαπλασιασμό των μυκήτων, γ) οι ανοσοανεπάρκειες, συγγενείς ή επίκτητες από παρατεταμένη χρήση κορτικοστεροειδών ή άλλων ανοσοκατασταλτικών δ) τα εκτεταμένα εγκαύματα, γιατί η βλάβη της συνεχείας του δέρματος που αποτελεί την αρχική γραμμή άμυνας του οργανισμού διαταράσσεται και ε) η διασωλήνωση μηχανικός αερισμός (Clark και Hajjeh 2002). Η συστηματική ασπεργίλλωση συναντάται ολοένα και πιο συχνά σε ασθενείς με ανοσοανεπάρκεια και αποτελεί σήμερα μείζον πρόβλημα νοσηρότητας και αυξημένης θνητότητας (Marr και συν 2002). Η κλινική σημασία του προβλήματος αυτού συνεχώς μεγαλώνει, καθώς αυξάνεται ο αριθμός των ασθενών με ανοσοανεπάρκεια, όπως είναι οι καρκινοπαθείς, οι ασθενείς με AIDS, οι δέκτες μοσχευμάτων και οι ασθενείς με συγγενείς ανοσοανεπάρκειες (Hage και συν 2002). 21

24 Η αντιμυκητιακή άμυνα του ξενιστή αποτελεί σημαντικό παράγοντα έναντι της προσβολής από παθογόνους μύκητες. Αυτό φαίνεται από τη μεγάλη επίπτωση των μυκητιάσεων σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και τη βελτίωση της έκβασης της μυκητίασης μετά την διόρθωση της ανοσοκαταστολής (Romani 2004). ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΜΥΚΗΤΩΝ Οι μύκητες είναι ευκαρυωτικοί οργανισμοί και τα κύτταρα τους έχουν τουλάχιστον έναν πυρήνα με πυρηνική μεμβράνη, ενδοπλασματικό δίκτυο, μιτοχόνδρια και εκκριτική συσκευή. Περιβάλλονται από κυτταρικό τοίχωμα που προσδιορίζει το σχήμα τους. Το τοίχωμα τους αποτελείται από πολυσακχαρίτες (που έχουν και αντιγονικές ιδιότητες), γλυκοπρωτεΐνες και λιπίδια. Οι περισσότεροι μύκητες είναι υποχρεωτικά ή προαιρετικά αερόβιοι οργανισμοί και παράγουν ένζυμα που αποικοδομούν μια μεγάλη ποικιλία οργανικών ουσιών (Jianping 2004). Οι μύκητες κατατάσσονται σε δύο βασικές κατηγορίες: α) ζυμομύκητες (yeasts) και β) νηματοειδείς μύκητες (molds) (Σχήμα 1) Στους ζυμομύκητες ο σημαντικότερος εκπρόσωπος είναι η Candida ενώ στους νηματοειδείς μύκητες ανήκουν οι Aspergillus, Fusarium, Scedosporium Cladophialophora, Microsporum, Phialophora, και το Trichophyton (Hajjeh και Warnock 2003). Οι ζυμομύκητες έχουν σφαιρικό ή ελλειψοειδές σχήμα και πολλαπλασιάζονται με σχηματισμό εκβλαστήσεων (budding). Oι νηματοειδείς μύκητες σχηματίζουν πολυκύτταρες νηματοειδείς αποικίες που αποτελούνται από διακλαδιζόμενους κυλινδρικούς σωληνίσκους (διαμέτρου 2-10 μm), που λέγονται υφές (hyphae). Τα κύτταρα που αποτελούν τις υφές χωρίζονται μεταξύ τους με διαφράγματα. Μερικά είδη μυκήτων είναι διμορφικά, που σημαίνει ότι μπορούν να αναπτύσσονται είτε ως ζυμομύκητες είτε ως νηματοειδείς μύκητες, ανάλογα με τις συνθήκες του περιβάλλοντος. Οι διμορφικοί μύκητες είναι οι Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei και Sporothrix schenckii (Kauffman και συν 2003). Παράλληλα, ορισμένες φορές οι ζυμομύκητες παράγουν εκβλαστήσεις οι οποίες δεν αποκόπτονται, και παίρνουν επίμηκες (κυλινδροειδές) σχήμα. Συχνά, σχηματίζεται μια αλυσίδα επιμηκυσμένων κυττάρων που συνδέονται μεταξύ τους και η οποία καλείται ψευδοϋφή ή ψευδομυκητήλιο. 22

25 Οι μύκητες μπορούν να σχηματίζουν σπόρια, που είναι ανθεκτικά σε δυσμενείς περιβαλλοντικές καταστάσεις και μπορούν να βλαστάνουν ξανά όταν οι συνθήκες το ευνοούν. Τα σπόρια παράγονται κατά δύο τρόπους: α) ασεξουαλικά, με μιτωτική αναπαραγωγή κυττάρων ζυμομυκήτων ή νηματοειδών μυκήτων (κονίδια ή μιτοσπόρια) και β) σεξουαλικά, όπου κύτταρα από συμβατά στελέχη υφίστανται μείωση, συντήκονται, και στη συνέχεια συνενώνουν το γενετικό τους υλικό Η μορφολογία των σπορίων που προκύπτουν από σεξουαλική αναπαραγωγή αποτελεί σήμερα και τη βάση για την ταξινόμηση των μυκήτων. Σχήμα 1. Σχηματική απεικόνιση ενός ζυμομύκητα, της Candida albicans με το βλαστοκονίδιο και το ψευδομυκητήλιο (ψευδοϋφή) της και ενός νηματοειδούς μύκητα, του Aspergillus fumigatus με την κονιδιοφόρο μορφή του. ASPERGILLUS Ο Aspergillus ανακαλύφθηκε το 1729 από τον λατίνο ιερέα Micheli και το όνομα που του δόθηκε προέρχεται από το λατινικό aspergo (=κατεονητήρας) λόγω του σχήματος του (Εικόνα 1) (Micheli 1729). Ανήκει στους υφομύκητες και αναγνωρίστηκαν περισσότερα από 200 είδη Aspergillus που χωρίζονται σε 18 ομάδες. Συχνότερα κατά σειρά εμφάνισης είναι: Aspergillus fumigatus (μακράν ο 23

26 συχνότερος), Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae και Aspergillus glaucus. Στο φυσικό περιβάλλον υπάρχουν σε αφθονία τα διάφορα είδη και παρουσιάζουν αύξηση στον αριθμό τους εποχιακά κατά το φθινόπωρο και λιγότερο το καλοκαίρι και το χειμώνα (Patterson 2003). Τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά στηρίζονται στην κονιδιοφόρο μορφή του κυττάρου τους. Με βάση τη μορφολογία της κεφαλής αναγνωρίζονται και ταυτοποιούνται τα είδη του Aspergillus. Οι υφές εμφανίζουν διακλαδώσεις από τις οποίες εκφύεται ένα κονιδιοφόρο κύτταρο που είναι παχύτερο από τα άλλα και καταλήγει στην κεφαλή. Από την κεφαλή φυτρώνουν σειρές από φιαλοειδή στηρίγματα πάνω από τα οποία υπάρχουν τα κονίδια, που είναι η τελική κατάληξη των στηριγμάτων. Ο αριθμός των στηριγμάτων, το μήκος, το χρώμα, η έκταση της κεφαλής η οποία καλύπτεται με αυτά και γενικά το μέγεθος της κεφαλής αποτελούν τις σημαντικότερες διαφορές μεταξύ των διαφόρων ειδών Aspergillus (Schmidt και Wolff 1997). Ο Aspergillus αναπτύσσεται σε πολλά θρεπτικά υλικά και σε διαφορετικές θερμοκρασίες, ευκολότερα όμως στο θρεπτικό υλικό Sabouraud και δυσκολότερα στο αίμα. Ειδικότερα, ο A. fumigatus μπορεί να αναπτυχθεί σε θερμοκρασίες >50 o C, ενώ τα υπόλοιπα είδη σε θερμοκρασίες γύρω στους 37 o C. Η ανάπτυξη των καλλιεργειών εμφανίζεται ήδη μετά τις πρώτες 48 ώρες. Η αντιγονική τους σύσταση παρουσιάζει ετερογένεια μεταξύ των ειδών αλλά η ύπαρξη της γαλακτομαννάνης, ενός πολυσακχαριδικού αντιγόνου του περιβλήματος, είναι ενδεικτική διηθητικής λοίμωξης από Aspegillus, όταν ανιχνεύεται στο αίμα (Sutton και συν 1998). Η μόλυνση γίνεται κυρίως με εισπνοή των σπορίων που βρίσκονται στο έδαφος, στα φυτά που αποσυντίθενται, στην οικιακή σκόνη, σε οικοδομικές κατασκευές, ακόμα και στον αέρα. Από εκεί αποικίζουν το ανώτερο και κατώτερο αναπνευστικό και σπανιότερα το δέρμα μετά από λύση της συνέχειας αυτού. Η εισπνοή σπορίων γίνεται καθημερινά από όλους τους ανθρώπους αλλά οι μηχανισμοί άμυνας προστατεύουν τον αποικισμό από το μύκητα. Έχει υπολογισθεί πως περίπου 200 σπόρια Aspergillus εισπνεόνται καθημερινά από τον άνθρωπο (Latge 1999). 24

27 Εικόνα 1. Aspergillus fumigatus, εικόνα από μικροσκόπιο Λοιμώξεις από Aspergillus Ο Aspergillus μπορεί να προκαλέσει στον ανθρώπινο οργανισμό, νόσους: 1. από υπερευαισθησία 2. ως σαπρόφυτο (μη διηθητική νόσος) 3. διηθητική νόσος (Denning 1998) 1) Σύνδρομα υπερευαισθησίας α) Άσθμα. Ο Aspergillus μπορεί να προκαλέσει μη ειδικά συμπτώματα αλλεργικού άσθματος μέσω σχηματισμού IgE αντισωμάτων (Denning και συν 2006). 25

28 β) Εξωγενής αλλεργική κυψελίτιδα («πνεύμονας των αγροτών»). Μετά από έκθεση στο μύκητα για 4-6 ώρες παρατηρείται έναρξη των συμπτωμάτων με πυρετό, βήχα και δύσπνοια που αργότερα γενικεύονται. Ο μηχανισμός της νόσου γίνεται μέσω σχηματισμού ανοσοσυμπλεγμάτων. Η ακτινογραφία θώρακα δείχνει διάχυτες διάμεσες διηθήσεις ενώ η χρόνια έκθεση οδηγεί σε μη αναστρέψιμη πνευμονική ίνωση (Stevens και συν 2000b). γ) Αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση. Παρατηρείται κυρίως σε παιδιά με κυστική ίνωση ή βρογχικό άσθμα. Πρόκειται για αλλεργία στα σπόρια του μύκητα και είναι αρκετά συχνή στους ασθματικούς ασθενείς. Ο μηχανισμός εμφάνισης αλλεργικής βρογχοπνευμονικής ασπεργίλλωσης στηρίζεται στο χρόνιο αποικισμό του αναπνευστικού βλεννογόνου από Aspergillus (χωρίς διήθηση) που προκαλεί μέσω σχηματισμού IgE αντισωμάτων υποτροπιάζοντα βρογχόσπασμο και κυλινδρικές ατελεκτασίες στους εγγύς αεραγωγούς. Συνήθως συνυπάρχουν ηωσινοφιλία στο αίμα, αυξημένη ολική IgE ανοσοσφαιρίνη, θετική δοκιμασία Rast καθώς και θετική δερματοαντίδραση στα αντιγόνα του Aspergillus. Η μη κατάλληλη αντιμετώπιση μπορεί να καταλήξει σε μόνιμη βλάβη των πνευμόνων, δηλαδή ίνωση. Η διάγνωση τίθεται με απεικονιστικές μεθόδους (κυρίως αξονική τομογραφία), εξετάσεις πτυέλων, βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (ΒAL), αίματος και δερματικές δοκιμασίες (Patterson και συν 2000). 2) Σαπροφυτικά (μη διηθητικά) σύνδρομα α) Ωτομυκητίαση. Εμφανίζεται ως χρόνια κατάσταση και αφορά τον έξω ακουστικό πόρο με συμπτώματα κυρίως κνησμό, πόνο και αίσθημα πληρότητας. Είναι συνηθέστερη στις τροπικές/υποτροπικές περιοχές (Kaur και συν 2000). β) Μη διηθητική παραρρινοκολπίτιδα. Αποτελεί χρόνια λοίμωξη των παραρρινίων κόλπων που δεν ανταποκρίνεται στα αντιβιοτικά και μπορεί να συνοδεύεται από σχηματισμό μάζας (ασπεργιλλώματος), ενώ είναι πιθανό να συνυπάρχει και αλλεργικός μηχανισμός. Σε άτομα με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα παρουσιάζεται συνήθως με ρινική συμφόρηση και χρόνια κεφαλαλγία (Ferguson 2000). Η συνήθης αντιμετώπιση είναι χειρουργική παροχέτευση ενώ η χορήγηση αντιμυκητιακών φαρμάκων συστηματικά καθώς και οι πλύσεις με αραιωμένα διαλύματα αντιμυκητιακών φαρμάκων έχουν δοκιμαστεί με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Σε ασθενείς που παρουσιάζουν ανοσοανεπάρκεια είτε συγγενή είτε επίκτητη, η βαρύτητα της νόσου είναι μεγαλύτερη και μπορεί να λάβει τη μορφή διηθητικής ασπεργίλλωσης. Η συμπτωματολογία είναι πιο γενικευμένη με πυρετό, έντονη 26

29 κεφαλαλγία με ρινίτιδα και ρινική συμφόρηση. Η διάγνωση τίθεται με τη διενέργεια αξονικής τομογραφίας και απομόνωση του μύκητα από καλλιέργεια ρινικών εκκρίσεων ή υλικού προερχόμενου από τους παραρρινίους κόλπους (Houser και Corey 2000). γ) Ασπεργίλλωμα των πνευμόνων. Η ανάπτυξη του μύκητα σε αυτή την κατάσταση γίνεται σε βρόγχους που δεν παροχετεύονται καλά ή σε προϋπάρχουσες κοιλότητες του πνευμονικού παρεγχύματος. Μπορεί να αποτελέσει επιπλοκή φυματίωσης, ιστοπλάσμωσης, σαρκοείδωσης ή σπανιότερα και διηθητικής ασπεργίλλωσης. Αυτό που συμβαίνει είναι αποικισμός και πολλαπλασιασμός του μύκητα μέσα στην κοιλότητα, χωρίς όμως διήθηση των αγγείων και επέκταση της λοίμωξης (Rafferty και συν 1983). Γενικά, οποιαδήποτε νόσος προκαλεί το σχηματισμό κοιλοτήτων μπορεί να δημιουργήσει στο άτομο την προδιάθεση για ανάπτυξη ασπεργιλλώματος, εφόσον υπάρχουν και κάποιοι άλλοι επιβαρυντικοί παράγοντες. Τα παιδιά με ασπεργίλλωμα πνευμόνων μπορεί να είναι αρχικά ασυμπτωματικά και να αναφέρουν προοδευτικά απώλεια βάρους, βήχα, αιμόπτυση και κακουχία. Η ακτινογραφία και η αξονική τομογραφία του θώρακα δείχνουν χαρακτηριστικά κοιλότητα του πνευμονικού παρεγχύματος στην οποία υπάρχει μια στρογγυλοποιημένη μάζα που περιβάλλεται από αέρα και θέτουν τη διάγνωση μαζί με ειδικές εξετάσεις του αίματος. Ειδικότερα, η ύπαρξη αντισωμάτων κατά του Aspergillus και η θετική PCR αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για τη διάγνωση. Η δοκιμασία γαλακτομαννάνης δεν έχει ακόμα τεκμηριωθεί ως ιδιαίτερα χρήσιμη στα παιδιά σε σχέση με τους ενήλικες και έτσι δεν μπορεί να αξιολογηθεί (Herbrecht και συν 2002, Millon και συν 2005). 3) Διηθητική νόσος Η διηθητική νόσος από Aspergillus προσβάλλει ανοσοκατεσταλμένα άτομα, κυρίως ουδετεροπενικούς ογκολογικούς και μεταμοσχευμένους ασθενείς. Αυξημένο κίνδυνο παρουσιάζουν επίσης ασθενείς με ασθενή αντιμυκητιακή άμυνα όπως εγκαυματίες, ασθενείς με AIDS και χρόνια κοκκιωματώδη νόσο. Γύρω από την αρχική εστία λοίμωξης επισυμβαίνει διήθηση των αγγείων από υφές του μύκητα, που ακολουθείται από θρόμβωση αυτών και νέκρωση των περιβαλλόντων ιστών. Στη συνέχεια είναι δυνατή η επέκταση της λοίμωξης είτε κατά συνέχεια ιστού είτε αιματογενώς σε απομακρυσμένα σημεία του οργανισμού. Η πρόγνωση είναι βαρύτατη και η θνητότητα, παρά τη θεραπεία, κυμαίνεται από % (Shao και συν 2006). Γίνονται προσπάθειες πρόληψης της νόσου, με χρήση φίλτρων αέρα στα δωμάτια ανοσοκατεσταλμένων ασθενών και με προληπτική χορήγηση 27

30 αντιμυκητιακών φαρμάκων (εισπνεόμενης αμφοτερικίνης Β ή ιτρακοναζόλης συστηματικά από του στόματος) (Denning 1998, Drew 2006). α) Διηθητική πνευμονική ασπεργίλλωση. Είναι η συχνότερη μορφή διηθητικής νόσου. Οι κλινικές εκδηλώσεις και η φυσική πορεία της νόσου ποικίλλουν ανάλογα με το υπόστρωμα του ασθενούς. Στους βαριά ανοσοκατεσταλμένους (π.χ. μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων, απλαστική αναιμία) η νόσος αρχικά δεν παρουσιάζει ειδικά συμπτώματα και εξελίσσεται πολύ γρήγορα, ενώ ο θάνατος επέρχεται σε 7-14 ημέρες. Σε λιγότερο ανοσοκατεσταλμένους, για παράδειγμα ασθενείς που λαμβάνουν κορτικοστεροειδή ή άλλα ανοσοκατασταλτικά, η νόσος και τα συμπτώματα εξελίσσονται αργά σε διάστημα 2-3 μηνών. Εκδηλώνεται με βήχα συνήθως ξηρό, πυρετό (όχι πάντα), θωρακικό άλγος, αιμόπτυση, δύσπνοια, πλευριτικό ήχο τριβής, πνευμοθώρακα και υποξαιμία. Η ακτινογραφία θώρακα στην ταχέως εξελισσόμενη νόσο μπορεί αρχικά να μην παρουσιάζει ιδιαίτερα παθολογικά ευρήματα, ενώ αργότερα εμφανίζει ποικίλα ακτινολογικά ευρήματα (Logan και συν 1994). Για το λόγο αυτό συνιστάται αξονική τομογραφία θώρακα υψηλής ευκρίνειας, που βοηθά ουσιαστικά στη διάγνωση (αρκετά ειδικά είναι το σημείο της άλω και το σημείο του μηνίσκου) (Denning 1998). Η χρόνια διηθητική ασπεργίλλωση είναι λιγότερο συχνή από την οξεία, ενώ εμφανίζεται κυρίως σε ασθενείς με AIDS ή χρόνια κοκκιωματώδη νόσο (Denning 2001). β) Διηθητική παραρρινοκολπίτιδα. Είναι σχετικά σπάνια στα παιδιά. Τα συμπτώματα μοιάζουν με της βακτηριακής παραρρινοκολπίτιδας. Μπορεί ταχέως να επεκταθεί στην υπερώα, τον οφθαλμικό κόγχο και τον εγκέφαλο (Iwen και συν 1997). γ) Άλλες εντοπίσεις είναι στο ΚΝΣ (πολύ βαριά πρόγνωση), στα οστά, στην καρδιά (ενδοκαρδίτιδα), στους οφθαλμούς (ενδοφθαλμίτιδα), στο δέρμα (ερυθηματώδεις πλάκες, νεκρωτικές εσχάρες, αιμορραγικές φυσσαλίδες), και στο έξω ους. FUSARIUM Τo Fusarium έλαβε το όνομα του από την ατρακτοειδή (fusiform) μορφή των κονιδίων του (Εικόνα 2) (Young και συν 1978). Ανήκει όπως και ο Aspergillus στους υφομύκητες ενώ υπάρχουν περισσότερα από 20 είδη Fusarium. Τα περισσότερο παθογόνα είδη για τον άνθρωπο είναι κατά σειρά συχνότητας: Fusarium solani (50% των περιπτώσεων), Fusarium oxysporum, Fusarium verticilloides, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, Fusarium dimerum, Fusarium chlamidosporum και Fusarium nygamai. Στο φυσικό περιβάλλον υπάρχουν ως παθογόνα των φυτών 28

31 ενώ βρίσκονται σε αποσυντιθεμένα βιολογικά υλικά και στο έδαφος (McCluskey 2003). Η ανάπτυξη του Fusarium μπορεί να γίνει σε πολλά θρεπτικά υλικά και σε διαφορετικές θερμοκρασίες αλλά αναπτύσσεται ευκολότερα στο θρεπτικό υλικό Sabouraud και δυσκολότερα στο αίμα. To F. solani ειδικότερα, αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες γύρω στους 25 o C. Η μόλυνση γίνεται κυρίως με εισπνοή των σπορίων που βρίσκονται κυρίως στο έδαφος, στα φυτά ή σε άλλα βιολογικά υλικά που αποσυντίθενται. Επίσης συχνή είναι και η λοίμωξη μέσω του δέρματος κατά τη διάρκεια ονυχομυκητιάσεων από Fusarium ή από τραύματα που υπάρχει λύση της συνεχείας του δέρματος. Σπανιότερα μόλυνση μπορεί να γίνει και από τη γαστρεντερική οδό (Dignani και Anaissie 2004). Εικόνα 2. Fusarium solani, εικόνα από μικροσκόπιο 29

32 Λοιμώξεις από Fusarium Το Fusarium μπορεί να προκαλέσει στον άνθρωπο τις παρακάτω λοιμώξεις: 1. εντοπισμένη λοίμωξη 2. διηθητική λοίμωξη (Fridkin και Jarvis 1996) 1) Εντοπισμένη λοίμωξη α) Επίμονος πυρετός αγνώστου αιτιολογίας. Η αρχική εκδήλωση της διηθητικής λοίμωξης από Fusarium είναι επίμονος πυρετός σε ασθενείς με βαριά ουδετεροπενία. Η εμφάνιση λοίμωξης των κόλπων του προσώπου και η προσβολή των πνευμόνων μπορεί συχνά να παρατηρηθεί και εμφανίζεται αργότερα από τον πυρετό (Groll και Walsh 2001). β) Παραρρινοκολπίτιδα. Η εμφάνιση λοίμωξης των κόλπων του προσώπου, συνηθέστερα παραρρινοκολπίτιδας, αποτελεί σοβαρό διαφοροδιαγνωστικό πρόβλημα γιατί συχνά παρατηρείται και στην λοίμωξη από Aspergillus. Η παραρρινοκολπίτιδα καθώς και άλλες εντοπισμένες λοιμώξεις από είδη Fusarium μπορεί να εξελιχθούν στη διηθητική μορφή της νόσου, κυρίως στην περίπτωση ασθενών με παρατεταμένη ανοσοκαταστολή. Λόγω της ανθεκτικότητας των στελεχών Fusarium στα αντιμυκητιακά φάρμακα, παρατηρούνται συχνά κρούσματα λοίμωξης από Fusarium σε ουδετεροπενικούς ασθενείς που λαμβάνουν εμπειρική ή προφυλακτική αγωγή με αμφοτερικίνη Β, φλουκοναζόλη ή ιτρακοναζόλη (Boutati και Anaissie 1997). γ) Δερματικές βλάβες. Εμφανίζουν συνήθως ποικιλομορφία και εκδηλώνονται με τη μορφή υποδόριων οζιδίων, πορφύρας ψηλαφητής ή μη, ερυθρών ή γκρίζων κηλίδων ή και βλατίδων, κηλίδων ή και βλατίδων με κεντρική νέκρωση, φυσαλίδων, αιμορραγικών πομφολύγων καθώς και δερματικών αποστημάτων. Οι εντοπίσεις τους μπορεί να είναι οπουδήποτε στο σώμα αλλά ιδιαίτερα προσβάλλονται τα άκρα. Ο αριθμός των δερματικών βλαβών ποικίλει και κυμαίνεται από 4 σε εντοπισμένες μορφές της νόσου ενώ μπορούν να ξεπεράσουν τις 30 σε ασθενείς με διηθητική νόσο (Bodey και συν 2002). δ) Εστιακές λοιμώξεις οργάνων. Είναι χαρακτηριστικό ότι οποιοδήποτε όργανο μπορεί να προσβληθεί από στελέχη Fusarium όπως για παράδειγμα το δέρμα, οι πνεύμονες, το ήπαρ, οι νεφροί, ο σπλήνας, ο εγκέφαλος, τα οστά, ο μυελός των οστών, η καρδιά, το πάγκρεας, οι οφθαλμοί, η μύτη, οι παραρρίνιοι κόλποι, η υπερώα καθώς και το λεπτό ή παχύ έντερο. Μερικές εκδηλώσεις διηθητικής λοίμωξης από Fusarium σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς είναι: οστεομυελίτιδα, σηπτική αρθρίτιδα, μυοσίτιδα, αποστήματα κάτω άκρων, ενδοκαρδίτιδα, μυοκαρδίτιδα, 30

33 εξωτερική ωτίτιδα, περιτονίτιδα, εγκεφαλικά αποστήματα, κυστίτιδα, μηνιγγοεγκεφαλίτιδα και χρόνια ηπατίτιδα (Walsh και Groll 1999b). 2) Διηθητική λοίμωξη Η διηθητική λοίμωξη από Fusarium αποτελεί τη σοβαρότερη εκδήλωση του φάσματος των λοιμώξεων που προκαλούνται από τα στελέχη Fusarium. Η πρώτη λοίμωξη που αναφέρθηκε στη βιβλιογραφία ήταν περίπου πριν από 30 χρόνια (Cho και συν 1973). Έκτοτε, η συχνότητα της διηθητικής λοίμωξης από Fusarium παρουσιάζει σημαντική αύξηση. Οι ουδετεροπενικοί ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες (κυρίως οξεία λευχαιμία), ασθενείς που υπεβλήθησαν σε αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών ή με εκτεταμένα εγκαύματα βρίσκονται σε αυξημένο κίνδυνο για εκδήλωση διηθητικής λοίμωξης από Fusarium. Ειδικότερα, οι ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες αποτελούν το 90% περίπου των δημοσιευμένων περιπτώσεων. Είναι χαρακτηριστικό ότι η λοίμωξη εκδηλώνεται κατά τη διάρκεια παρατεταμένης ουδετεροπενίας, περισσότερο από 2 μήνες, ενώ οι μισές τουλάχιστον περιπτώσεις οφείλονται στο F. solani ακολουθούμενες από το F. oxysporum και F. moniliforme που ανευρίσκονται σε αρκετά μικρότερη συχνότητα (Groll και Walsh 2001). Οι κλινικές εκδηλώσεις της διηθητικής λοίμωξης από Fusarium μοιάζουν με αντίστοιχες εκδηλώσεις της διηθητικής λοίμωξης από Aspergillus. Όμως υπάρχουν χαρακτηριστικές διαφορές, όπως η αυξημένη συχνότητα προσβολής του δέρματος και του υποδόριου ιστού καθώς και οι θετικές καλλιέργειες αίματος, ειδικά τις πρώτες μέρες του πυρετού που παρατηρούνται στους ασθενείς με διηθητική λοίμωξη από Fusarium (Σχήμα 2). Εντυπωσιακό είναι ότι οι καλλιέργειες αίματος είναι θετικές στο 50-70% των περιπτώσεων με διηθητική λοίμωξη από Fusarium σε αντίθεση με τη διηθητική λοίμωξη από Aspergillus, που το ποσοστό των θετικών καλλιεργειών αίματος είναι σχεδόν μηδενικό. Οι βλάβες του δέρματος που αποτελούν το χαρακτηριστικό των διηθητικών λοιμώξεων από Fusarium ανευρίσκονται σε ποσοστό από 60-90%, ενώ σε αντίθεση στους ασθενείς με διηθητική λοίμωξη από Aspergillus, ανευρίσκονται σε <10% (Martino και συν 1994, Bodey και συν 2002). Οι ουδετεροπενικοί ασθενείς παρουσιάζουν μεγαλύτερο κίνδυνο εμφάνισης δερματικών βλαβών συγκριτικά με ανοσοκατεσταλμένους, αλλά μη ουδετεροπενικούς ασθενείς. Οι βλάβες αυτές αποτελούν ιδιαίτερα καλό υλικό για βιοψία που θα μας οδηγήσει στη σωστή διάγνωση της διηθητικής λοίμωξης από Fusarium (Bodey και συν 2002). 31

34 Ομοιότητες Πύλη εισόδου μυκήτων μέσω της εισπνοής-πνεύμονες Διαφορές* 1. Αίμα Διηθήσεις λεμφαδένων και/ή πνευμονικού παρεγχύματος 50-70% θετικές καλλιέργειες αίματος Παθολογοανατομικά Διηθήσεις αγγείων + οξεία διήθηση των βρόγχων από υφές Πρόγνωση Υψηλή νοσηρότητα/θνητότητα Υποτροπή μετά από ανοσοκαταστολή Ποικίλη επανεμφάνιση μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών 2. Δέρμα α. Μεταστατικές δερματικές βλάβες στο 60-70% (υποδόριοι λεμφαδένες γαγγραινώδες έκθυμα εντοπισμένες βλάβες) β. Συχνές πύλες εισόδου (ονυχομυκητίαση, τραύματα) 3.Μεγαλύτερη αντοχή στα αντιμυκητιακά φάρμακα * Οι διαφορές σχετίζονται με συστηματική λοίμωξη από Fusarium Σχήμα 2. Σύγκριση των κλινικοπαθολογικών ευρημάτων διηθητικής λοίμωξης από στελέχη Aspergillus και Fusarium ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Τα αντιμυκητιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των μυκητιάσεων, συστηματικών και μη, διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες σύμφωνα με τη χημική τους δομή (Aoun 2000, Ντότης και Ροηλίδης 2003): 1) Πολυένια, όπως αμφοτερικίνη Β και νυστατίνη. Εκτός από τη συμβατική δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β (DAMB, Fungizone), υπάρχουν σήμερα και τρία λιπιδικά φαρμακευτικά είδη αμφοτερικίνης Β, η λιποσωματική αμφοτερικίνη Β (LAMB, Ambisome), η αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικών συμπλεγμάτων (ABLC, Abelcet) και η αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικού κολλοειδούς (ABCD, Amphocil). 2) Εχινοκανδίνες που περιλαμβάνουν την κασποφουγκίνη, μικαφουγκίνη και ανιδουλαφουγκίνη. 3) Νουκλεοσιδικά ανάλογα, όπως φλουκυτοσίνη. 4) Αζόλια, όπως τα παλαιότερα ημιδαζόλια μικοναζόλη, κετοκοναζόλη και κλοτριμαζόλη, τα τριαζόλια α γενιάς φλουκοναζόλη και ιτρακοναζόλη και τα τριαζόλια β γενιάς βορικοναζόλη, ποσακοναζόλη και ραβουκοναζόλη. In vitro δράση. Τα αντιμυκητιακά φάρμακα δρουν σε συγκεκριμένους στόχους στη δομή και το μεταβολισμό του μύκητα. Γενικά, η αμφοτερικίνη Β δρα στην 32

35 εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης, η φλουκυτοσίνη στον αναδιπλασιασμό του DNA του μύκητα, τα αζόλια στην παραγωγή εργοστερόλης και οι εχινοκανδίνες στη σύνθεση της γλυκάνης, απαραίτητου συστατικού του κυτταρικού τοιχώματος. Στο Σχήμα 3 φαίνεται η δράση των διαφόρων κατηγοριών αντιμυκητιακών φαρμάκων πάνω στο κύτταρο του μύκητα (Neely και Ghannoum 2000). Στο Σχήμα 4 φαίνεται η δράση της αμφοτερικίνης Β και της κασποφουγκίνης πάνω στο κύτταρο. Στον πίνακα 1 γίνεται σύγκριση του μηχανισμού δράσης των πολυενίων, αζολών και εχινοκανδινών. Το αντιμυκητιακό φάσμα των διαφόρων φαρμάκων ποικίλλει. Η αμφοτερικίνη Β έχει ευρύ φάσμα που περιλαμβάνει σχεδόν όλες τις κατηγορίες των μυκήτων, αλλά και τα νεότερα αζόλια και οι εχινοκανδίνες έχουν αρκετά ευρύ αντιμυκητιακό φάσμα. Αμφοτερικίνη Β Δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β. Η αμφοτερικίνη Β ανήκει στα πολυένια και ανακαλύφθηκε το 1955 από τον Gold και τους συνεργάτες του ως παράγωγο του Streptococcus nodosus. Η δεοξυχολική ή συμβατική αμφοτερικίνη Β είναι ένα σύμπλοκο αμφοτερικίνης Β που αποτελείται από μία υδρόφιλη πολυ-υδροξυλική αλυσίδα κατά μήκος της μίας πλευράς του μορίου και μια λιπόφιλη πολυενική υδροκαρβονική αλυσίδα στην άλλη πλευρά. Επιλέχθηκε από άλλα είδη αμφοτερικίνης Β γιατί αποτελούσε το λιγότερο τοξικό είδος κατά την ενδοφλέβια χορήγηση του και ήταν ελάχιστα υδατοδιαλυτό (Stevens και Bennett 2000a). Πολυένια Φλουκυτοσίνη Εχινοκανδίνες Αζόλια Σύνθεση DNA μύκητα Εργοστερόλη Σύνθεση β-(1,3)-d- γλυκάνης Σχήμα 3. Σχηματική απεικόνιση της δράσης των διαφόρων κατηγοριών των αντιμυκητιακών φαρμάκων πάνω στο κύτταρο (τροποποιημένο από Neely και Ghannoum 2000) 33

36 Κασποφουγκίνη Κυτταρικό τοίχωμα β-(1,6)-d-γλυκάνη Κυτταρική μεμβράνη β-(1,3)-d-γλυκάνη Σύνθεση β-(1,3)-d-γλυκάνης Εργοστερόλη Αμφοτερικίνη Β Σχήμα 4. Λεπτομερέστερη σχηματική απεικόνιση της δράσης της κασποφουγκίνης στο κυτταρικό τοίχωμα και της αμφοτερικίνης Β στην κυτταρική μεμβράνη Πίνακας 1. Σύγκριση του μηχανισμού δράσης των διαφόρων κατηγοριών αντιμυκητιακών φαρμάκων Αντιμυκητιακά φάρμακα Πολυένια Αζόλια Εχινοκανδίνες Σημείο δράσης στο κύτταρο του μύκητα Κυτταρική μεμβράνη Κυτταρική μεμβράνη Κυτταρικό τοίχωμα Μηχανισμός Ενώνονται με την εργοστερόλη στην κυτταρική μεμβράνη με αποτέλεσμα: Αύξηση της διαπερατότητας της μεμβράνης Διαρροή κυτταροπλασματικών συστατικών Θανάτωση μυκητιακού κυττάρου Αναστέλλουν την C14-α-δεμεθυλάση, με αποτέλεσμα την καταστροφή της κυτταροπλασματικής μεμβράνης εξαιτίας: Εξάντλησης της εργοστερόλης Συσσώρευσης τοξικών στεροειδών Αναστέλλουν τη σύνθεση της β-(1,3)-d-γλυκάνης στο κυτταρικό τοίχωμα με αποτέλεσμα: Διακοπή της δομής του κυτταρικού τοιχώματος Οσμωτική αστάθεια και τελική λύση του κυττάρου του μύκητα Ο μηχανισμός δράσης της αμφοτερικίνης Β στηρίζεται στην ικανότητα της να συνδέεται με τις στερόλες, με βασικότερη προτίμηση την εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων. Το αποτέλεσμα είναι να επηρεάζει την οσμωτικότητα της κυτταρικής μεμβράνης μέσω της διάνοιξης πόρων σε αυτήν που 34

37 τελικά οδηγεί σε διαρροή του ενδοκυτταρίου καλίου, μαγνησίου, σακχάρων και άλλων μεταβολιτών και τελικά επέρχεται ο θάνατος του μύκητα. Αυτός ο μηχανισμός δράσης αφορά τόσο τη δεοξυχολική όσο και τα λιπιδικά είδη αμφοτερικίνης Β (Brajtburg και Bolard 1996). Η μεγαλύτερη «συγγένεια» της αμφοτερικίνης Β προς την εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων συγκριτικά με τη χοληστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των ανθρωπίνων κυττάρων εξηγεί την ισχυρότερη δράση της κατά των μυκήτων. Μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, η DAMB συνδέεται σε μεγάλο ποσοστό με τις πρωτεΐνες του ορού και κατανέμεται κυρίως στους νεφρούς, το ήπαρ, το σπλήνα, το μυελό των οστών και τους πνεύμονες. Η απέκκριση του φαρμάκου είναι ταχύτερη στα βρέφη και στα παιδιά (Starke και συν 1987). Οι περισσότεροι ασθενείς που λαμβάνουν το φάρμακο παρουσιάζουν κάποιου βαθμού δυσανεξία. Οι κυριότερες ανεπιθύμητες ενέργειες της DAMB είναι η νεφροτοξικότητα, ενώ οι άμεσες αντιδράσεις κατά τη χορήγηση του φαρμάκου είναι πυρετός, ρίγος, κεφαλαλγία, ανορεξία, κακουχία, μυαλγίες, αρθραλγίες, φλεβίτιδα, θρομβοφλεβίτιδα, κοιλιακά άλγη, ναυτία, έμετοι και διάρροια. Άλλες ανεπιθύμητες αντιδράσεις είναι αζωθαιμία, υπόταση, υποκαλιαιμία, ουραιμία, νεφρική σωληναριακή οξέωση ή άλλες εκδηλώσεις που σχετίζονται κυρίως με τη νεφροτοξικότητά της (Goodwin και συν 1995). Η DAMB συνεχίζει να είναι φάρμακο εκλογής στην αρχική θεραπεία απειλητικών για τη ζωή μυκητιακών λοιμώξεων. Η συνιστώμενη δόση είναι 0,5 1,5 mg/kg/h ενδοφλέβια σε 2 έως 4 ώρες για βαριές συστηματικές μυκητιάσεις. Η εμπειρική θεραπεία σε επίμονο πυρετό ανθεκτικό στην αντιμικροβιακή θεραπεία σε ουδετεροπενικούς ασθενείς είναι 0,5 0,8 mg/kg/h (Robinson και Nahata 1999). Οι ενδείξεις χορήγησης αμφοτερικίνης Β είναι οι συστηματικές λοιμώξεις από Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Mucor και οι ενδημικές μυκητιάσεις όπως ιστοπλάσμωση, βλαστομύκωση και κοκκιδιοειδομύκωση. Οι ασθενείς που μπορούν να λάβουν DAMB είναι άρρωστοι που έχουν καλή νεφρική λειτουργία. Τα νεογνά λόγω της ανωριμότητας του νεφρικού συστήματός τους και της συνακόλουθης μη νεφροτοξικής δράσης της DAMB σε αυτά, δεν παρουσιάζουν τις ανεπιθύμητες ενέργειες που εμφανίζουν οι μεγαλύτεροι ασθενείς και μπορούν να λάβουν συμβατική αμφοτερικίνη Β. Η χορήγησή της γίνεται μετά από αραίωση σε διάλυμα 5% γλυκόζης εντός 2 4 ωρών. Όταν η έγχυση γίνεται σε χρονικό διάστημα μικρότερο από 45 λεπτά, η συχνότερη ανεπιθύμητη ενέργεια που εμφανίζεται είναι ο πυρετός. Η προληπτική χορήγηση παρακεταμόλης και η φόρτιση με φυσιολογικό ορό 10 ml/kg πριν την 35

38 χορήγηση της DAMB μπορεί να περιορίσει τις άμεσες αντιδράσεις (Goodwin και συν 1995). Λιπιδικά είδη αμφοτερικίνης Β Τα λιπιδικά είδη αμφοτερικίνης Β έχουν ελαττωμένη νεφροτοξικότητα σε σχέση με την DAMB. Ειδικότερα κατά φθίνουσα σειρά η νεφροτοξικότητα των ειδών αμφοτερικίνης Β είναι DAMB >>> ABCD >> ABLC >/= LAMB. Ένδειξη χρήσης των λιπιδικών ειδών αποτελούν οι γενικευμένες μυκητιακές λοιμώξεις που επιμένουν μετά από χορήγηση DAMB ή όταν υπάρχει ελαττωμένη νεφρική λειτουργία που εμποδίζει τη θεραπεία με DAMB ή όταν συγχορηγούνται ιδιαιτέρως νεφροτοξικά φάρμακα (Hann και Prentice 2001, Kleinberg 2006). Φαινόμενα άμεσων ανεπιθύμητων αντιδράσεων μπορούν να εμφανιστούν και με τα τρία είδη αλλά σε μικρότερο βαθμό συγκριτικά με τη DAMB, με εξαίρεση μόνο την ABCD. Χρειάζονται τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες για τη σύγκριση της DAMB με κάθε μια από τα λιπιδικά είδη αμφοτερικίνης Β. Το κόστος των λιπιδικών ειδών είναι πολύ μεγαλύτερο από αυτό της DAMB, αυτό όμως αντιρροπείται από την έλλειψη των οικονομικών συνεπειών της αντιμετώπισης της νεφροτοξικότητας (Dupont, 2002; Lemke και συν 2005). Λιποσωματική αμφοτερικίνη Β. Η LAMB είναι ένα μονόστιβο λιπόσωμα με διάμετρο nm το οποίο περιέχει ένα μόριο αμφοτερικίνης Β ανά 9 μόρια λιπιδίων. Αποτελείται από μίγμα υδρογονωμένης λεκιθινο-χοληστερολοδιστεαροϋλφωσφατιδογλυκερόλης προερχόμενης από σόγια, σε αναλογία 10:5:4. Σε αντίθεση με τα υπόλοιπα λιπιδικά είδη τα επίπεδα της LAMB στον ορό δεν είναι χαμηλότερα από αυτά που προκύπτουν από ίση δόση DAMB (Walsh και συν 1999a). Η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια της LAMB αναφέρονται σε διάφορες μελέτες. Το συμπέρασμα των περισσότερων μελετών είναι πως η αποτελεσματικότητα της LAMB δεν διαφέρει από αυτήν της DAMB. Η βασικότερη διαφορά έγκειται στην αισθητά μικρότερη νεφροτοξικότητα και στο μικρότερο βαθμό υποκαλιαιμίας που προκαλεί η LAMB συγκριτικά με τη DAMB (Cagnoni 2002). Η δοσολογία της LAMB ως εμπειρική θεραπεία ουδετεροπενικών ασθενών προτείνεται να είναι 3 mg/kg/η. Η προτεινόμενη δόση σε περιπτώσεις κρυπτοκόκκωσης, καντιντίασης και ασπεργίλλωσης κυμαίνεται μεταξύ 3 5 mg/kg/η και χορηγείται σε ασθενείς που δεν ανταποκρίθηκαν ή δε μπορούν να λάβουν θεραπεία με DAMB. Η LAMB χορηγείται επιπλέον σε περιπτώσεις παρασιτικών λοιμώξεων από Leishmania και είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική μειώνοντας κατά πολύ το χρόνο θεραπείας και τον κίνδυνο υποτροπών (Ντότης και συν 2002, Dotis και συν 2003). 36

39 Η αραίωση της όσο αφορά τη χορήγηση κυμαίνεται ανάμεσα στα 1 2 mg/ml και γίνεται εντός δύο ωρών. Ο ρυθμός χορήγησης μπορεί να συντομευτεί στα 60 λεπτά σε ασθενείς που ανέχονται καλά τη θεραπεία αλλά οι σύντομες εγχύσεις εμπεριέχουν τον κίνδυνο εμφάνισης δύσπνοιας με θωρακικό άλγος ή εμφάνισης υποξίας. Αν και δεν έχει διαπιστωθεί σημαντική τοξικότητα από τη χορήγηση μέχρι 15 mg/kg/η LAMB, η μέγιστη χορηγούμενη δόση σε ιδιαίτερα ανθεκτικές μυκητιακές λοιμώξεις συνιστάται να μη ξεπερνά τα 10 mg/kg/η αφού μεγαλύτερες δόσεις δεν προκαλούν καλύτερα επίπεδα στον ορό και κατά επέκταση καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα (Ellis 2000). Λιπιδικό σύμπλεγμα αμφοτερικίνης Β. Η ABLC είναι ένα σύμπλεγμα σχεδόν ισομοριακών συγκεντρώσεων αμφοτερικίνης Β και λιπιδίων, που μοιάζει με κορδέλα και έχει μέγεθος 1,6 11 μm. Μακροσκοπικά αποτελείται από ένα θολερό εναιώρημα σωματιδίων. Η αποτελεσματικότητα της ABLC διαπιστώθηκε σε διάφορες μελέτες που έδειξαν τοξικότητα παρόμοια με αυτήν της DAMB αλλά σε μικρότερη συχνότητα (Walsh και συν 1998). Τα επίπεδα που φτάνει η ABLC στον ορό είναι περίπου το 1/5 από τα αντίστοιχα επίπεδα της DAMB στην ίδια δόση και για το λόγο αυτό η χορηγούμενη δόση της ABLC είναι πενταπλάσια από αυτήν της DAMB, δηλαδή 5 mg/kg/η χορηγούμενα με αραίωση 1 mg/ml εντός δύο ωρών. Λιπιδικό κολλοειδές διάλυμα αμφοτερικίνης Β. Η ABCD που περιέχει χοληστερινικούς εστέρες θειικού οξέος σε ισόποσες δόσεις με την DAMB, αποτελείται από δισκόμορφα κολλοειδικά σωματίδια διαμέτρου 122±48 nm. Σε μια τυχαιοποιημένη διπλή τυφλή μελέτη συγκρίθηκε η DAMB σε δόση 0,8 mg/kg/η με την ABCD σε δόση 4 mg/kg/η σε ουδετεροπενικούς ασθενείς των οποίων ο πυρετός παρέμεινε μετά από 72 ώρες παρά τη χρήση αντιμικροβιακής αγωγής (White και συν 1998). Διαπιστώθηκε πως η αποτελεσματικότητα των δύο φαρμάκων καθώς και το ποσοστό διακοπής της θεραπείας λόγω νεφροτοξικότητας ήταν ίδια. Οι άμεσες αντιδράσεις, κυρίως η αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος, ήταν στατιστικά σημαντικότερες με την ABCD. Η νεφροτοξικότητα της ABCD είναι μικρή, ακόμα και σε υψηλές δόσεις της τάξης των 7,5 8 mg/kg/η. Η προτεινόμενη δόση της ABCD για ενήλικες και για παιδιά κυμαίνεται μεταξύ 3 4 mg/kg/η χορηγούμενη ενδοφλεβίως σε αραίωση 0,6 mg/ml με ρυθμό 1 mg/kg/ώρα. Ο ρυθμός έγχυσης μπορεί να επιταχυνθεί και να ολοκληρωθεί εντός 2 ωρών εφόσον ο ασθενής ανέχεται καλώς το χορηγούμενο φάρμακο (Ellis 2000). 37

40 Ανοσομετατρεπτικές ιδιότητες της αμφοτερικίνης Β Οι ανοσομετατρεπτικές ιδιότητες της DAMB έχουν μελετηθεί ως ένα βαθμό και έχει βρεθεί, ότι έχει ευοδωτική επίδραση στη δράση των ουδετερόφιλων, μονοκυττάρων και λεμφοκυττάρων (Roilides και συν 1990, Roilides και συν 2002). Επίσης έχει βρεθεί ότι προάγει την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών από ανθρώπινα μονοκύτταρα και μακροφάγα. Το φαινόμενο αυτό σχετίζεται με την εμφάνιση άμεσων ανεπιθύμητων αντιδράσεων κατά τη χορήγηση του φαρμάκου που περιλαμβάνουν πυρετό, ρίγος, κεφαλαλγία, ανορεξία, κακουχία, μυαλγίες, αρθραλγίες, φλεβίτιδα, θρομβοφλεβίτιδα, κοιλιακά άλγη, ναυτία, εμέτους και διάρροια. Έχει βρεθεί ότι η DAMΒ προκαλεί απελευθέρωση ιντερλευκίνης-1β (IL- 1β), παράγοντα νέκρωσης των όγκων-α (TNF-α) και προσταγλανδίνης E2 (PGE2) από ανθρώπινα μονοκύτταρα in vitro (Rogers και συν 1998). Επίσης η αμφοτερικίνη Β αυξάνει την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν την παραγωγή των χημειοκινών: ιντερλευκίνης-8 (IL-8), χημειοελκτικής πρωτεΐνης των μονοκυττάρων-1 (MCP-1), ανασταλτικής πρωτεΐνης των μακροφάγων-1β (MIP-1β) και των παραγόντων όπως το ενδοκυτταρικό προσκολλητικό μόριο-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM 1) και το CD44 από τα ανθρώπινα μονοκύτταρα (Rogers και συν 2000). Υπάρχουν τέλος μελέτες που έδειξαν ότι η DAMB επιδρά στα μονοκύτταρα αυξάνοντας την παραγωγή προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-1β και TNF-α) σε μικρό βαθμό αλλά παράλληλα αναστέλλει σε μεγαλύτερο βαθμό την παραγωγή της αντι-φλεγμονώδους κυτταροκίνης, ανταγωνιστή του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-1 (IL-1ra). Αποτέλεσμα είναι να υπάρχει αύξηση συνολικά στην δράση των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών όπως αυτή εκφράζεται από το λόγο IL-1ra/IL-1β (Vonk και συν 1998). Επιπλέον η DAMB βρέθηκε ότι επηρεάζει ευοδωτικά τη χημειοταξία, τη φαγοκυττάρωση, την προσκολλητικότητα και την αντιμυκητιακή δραστηριότητα των ανθρωπίνων μονοκυττάρων και ουδετεροφίλων (Wilson και συν 1991). Εχινοκανδίνες Οι εχινοκανδίνες είναι ημισυνθετικά κυκλικά λιποπεπτίδια που αναστέλλουν τη β-(1,3)-d-γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος (Σχήμα 4), ενώ ο μεταβολισμός τους γίνεται στο ήπαρ (Vazquez και Sobel 2006). Για το λόγο αυτό πρέπει να χορηγούνται με προσοχή φάρμακα που μεταβολίζονται με τα ίδια ένζυμα όπως η σιζαπρίδη. Το πρώτο φάρμακο της κατηγορίας που εγκρίθηκε για χορήγηση σε ενήλικες είναι η κασποφουγκίνη (Cancidas), ενώ στην ίδια κατηγορία ανήκουν και τα νεότερα μέλη μικαφουγκίνη και ανιδουλαφουγκίνη. Το θεραπευτικό τους φάσμα περιλαμβάνει στελέχη Candida, Aspergillus και Pneumocystis jiroveci (Denning 2002). 38

41 Κασποφουγκίνη. H κασποφουγκίνη είναι ένα ημισυνθετικό υδατοδιαλυτό λιποπεπτίδιο, που αποτελεί προϊόν ζύμωσης του μύκητα Glarea lozoyensis. Ανήκει στην οικογένεια των εχινοκανδινών και είναι παράγωγο της πνευμονοκανδίνης Bo. Η αντιμυκητιακή δράση στης κασπογουγκίνης εναντίον των ειδών Candida και Aspergillus έχει αποδειχθεί τόσο in vitro όσο και in vivo. Σε κλινικές μελέτες που έχουν διεξαχθεί με την κασποφουγκίνη δεν έχουν σημειωθεί ιδιαίτερες ανεπιθύμητες ενέργειες (Villanueva και συν 2001). Η κασποφουγκίνη έχει ένδειξη χορήγησης σε ανθεκτικές στην θεραπεία συστηματικές ασπεργιλλώσεις που δεν αντιμετωπίστηκαν επαρκώς ή ήταν αδύνατο να αντιμετωπιστούν από τα συνήθη αντιμυκητιακά (δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, λιπιδικά είδη αμφοτερικίνης Β, ιτρακοναζόλη), στην οισοφαγίτιδα από Candida καθώς και στις συστηματικές λοιμώξεις από Candida. Συγκριτική μελέτη έδειξε ότι είναι εξ ίσου αποτελεσματική με την αμφοτερικίνη Β για την θεραπεία της συστηματικής καντιντίασης και ιδιαίτερα της μυκηθαιμίας από Candida ενώ παράλληλα ήταν καλύτερα ανεκτή (Deresinski και Stevens 2003, Mora-Duarte και συν 2002). Σε άλλη συγκριτική μελέτη για την θεραπεία συστηματικής καντιντίασης σε ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες και κακοήθειες συμπαγών οργάνων επιβεβαιώθηκε ακριβώς το ίδιο αποτέλεσμα με τις προηγούμενες μελέτες και φάνηκε μικρή ανωτερότητα της κασποφουγκίνης (DiNubile και συν 2005). In vitro έχει βρεθεί συνεργική δράση της κασποφουγκίνης με την αμφοτερικίνη Β, λόγω και του διαφορετικού τρόπου δράσης, εναντίον ειδών Aspergillus και Fusarium (Arikan και συν 2002). Επίσης, ενδείκνυται στην αντιμετώπιση εμπύρετης ουδετεροπενίας μη ανταποκρινόμενης σε αντιμικροβιακή θεραπεία (Walsh και συν 2004). Λοιπά αντιμυκητιακά φάρμακα Φλουκυτοσίνη (5-FC). Η 5-FC αποτελεί φθοριούχο ανάλογο της κυτοσίνης και μπορεί να αναστείλει τη δράση της DNA-συνθετάσης του μύκητα. Η 5-FC έχει καλή αποτελεσματικότητα σε ασθενείς με λοιμώξεις από Candida και Cryptococcus, δεν αποτελεί όμως το φάρμακο εκλογής καθώς η DAMB είναι πιο αποτελεσματική και εμφανίζεται δυσκολότερα αντοχή σε αυτήν από ότι στην 5-FC. Ο συνδυασμός 5-FC και DAMB φαίνεται να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικός στις περιπτώσεις ασθενών με κρυπτοκοκκική μηνιγγίτιδα και σε εν τω βάθει καντιντιάσεις (Dismukes και συν 1987). Αντιμυκητιακά αζόλια. Τα αζόλια αναστέλλουν τη μετατροπή λανοστερόλης σε εργοστερόλη, βασικό συστατικό της κυτταρικής μεμβράνης του μύκητα, δρώντας στο ένζυμο 14α-δεμεθυλάση της λανοστερόλης. Ο μεταβολισμός τους γίνεται στο ήπαρ 39

42 με τα ισόμορφα ένζυμα CYP2C9 και CYP3A4 του κυτοχρώματος P-450. Η μικοναζόλη και η κετοκοναζόλη ανήκουν στα παλαιότερα ημιδαζόλια. Τα πρώτα τριαζόλια ήταν η φλουκοναζόλη και η ιτρακοναζόλη (τριαζόλια α γενιάς) ενώ στα νεότερα τριαζόλια (τριαζόλια β γενιάς) ανήκουν η βορικοναζόλη, η ποσακοναζόλη και η ραβουκοναζόλη. Τα τριαζόλια έχουν ιδιότητες που τα κάνουν προτιμότερα από τα ημιδαζόλια. Ειδικότερα, έχουν μικρότερη ανασταλτική ορμονική επίδραση, λιγότερες αλληλεπιδράσεις κατά τη συγχορήγησή τους με άλλα φάρμακα, μπορούν να χορηγηθούν παρεντερικά, έχουν ευρύτερο θεραπευτικό φάσμα, καλύτερη κατανομή στα υγρά του οργανισμού, λιγότερες ανεπιθύμητες εκδηλώσεις από το γαστρεντερικό και μικρότερη ηπατοτοξικότητα (Hoffman και συν 2000). Κετοκοναζόλη: Χορηγείται σπάνια σήμερα κυρίως σε δερματολογικά σκευάσματα και στην αντιμετώπιση της χρόνιας βλεννογονικής καντιντίασης και των ενδημικών συστηματικών μυκητιάσεων (Borgers και συν 2005). Φλουκοναζόλη: Δρα έναντι των περισσοτέρων ειδών Candida και άλλων ζυμομυκήτων. Αποτελεί ένα πολύ καλό αντιμυκητιακό φάρμακο για την αντιμετώπιση της στοματοφαρυγγικής και οισοφαγικής καντιντίασης ενώ η δράση της σε μηνιγγίτιδα από Cryptococcus είναι ιδιαίτερα ικανοποιητική. Η φλουκοναζόλη δεν έχει δράση απέναντι στη Candida krusei και έχει ποικίλη δράση απέναντι σε στελέχη του είδους Candida glabrata (van t Wout και συν 1988). Ιτρακοναζόλη: Έχει παρόμοιο αντιμυκητιακό φάσμα με τη φλουκοναζόλη και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των ενδημικών μυκητιάσεων ενώ έχει και δραστικότητα έναντι ειδών Aspergillus και μελανομυκήτων (Potter 2005). Βορικοναζόλη: Χρησιμοποιείται για λοιμώξεις που οφείλονται στον Aspergillus, άλλους νηματοειδείς μύκητες και ανθεκτικά στελέχη Candida. Σε in vitro πειράματα έχει αποδειχθεί πως η δράση της είναι ίδια ή ανώτερη από αυτή της φλουκοναζόλης, της ιτρακοναζόλης ή της αμφοτερικίνης Β. Οι ενδείξεις χορήγησης της βορικοναζόλης είναι οι συστηματικές λοιμώξεις από Aspergillus συμπεριλαμβανομένων των λοιμώξεων του ΚΝΣ, των πνευμονικών λοιμώξεων και της ενδοκαρδίτιδας (Spanakis και συν 2006). Επίσης ενδείξεις αποτελούν η πνευμονική λοίμωξη από Cryptococcus και η συστηματική λοίμωξη από είδη Candida, που περιλαμβάνουν την C. glabrata και την C. krusei (Ghannoum και Kuhn 2002). Η βορικοναζόλη έχει εγκριθεί πλέον ως φάρμακο πρώτης εκλογής για την αντιμετώπιση πνευμονικής λοίμωξης από Aspergillus. 40

43 ΑΜΥΝΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΑΜΥΝΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Ο ανθρώπινος οργανισμός για την αντιμετώπιση των διαφόρων λοιμογόνων παραγόντων διαθέτει ένα σύνολο ανοσολογικών μηχανισμών. Η ανοσία του διακρίνεται σε φυσική και επίκτητη (Σχήμα 5). Η πρώτη γραμμή άμυνας εναντίον των παθογόνων εισβολέων συμπεριλαμβανομένων και των μυκήτων, αποτελείται από τους φραγμούς του δέρματος και των βλεννογόνων που περιλαμβάνονται στους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας (Müller 2005). Επίσης κάποιοι γενετικοί παράγοντες επηρεάζουν με άλλοτε άλλον τρόπο τη φυσική ανοσία. Φυσική ανοσία Μύκητας Επιφάνεια βλεννογόνου Ανώριμο δενδριτικό κύτταρο Ωρίμανση Λειτουργίες φυσικής ανοσίας: Φαγοκυττάρωση Αποκοκκίωση ουδετεροφίλων Ουδετερόφιλο Φλεγμονώδης απάντηση Μονοκύτταρο Αντιγονική παρουσίαση Ώριμο δενδριτικό κύτταρο Β λεμφοκύτταρο Β λεμφοκύτταρο Παραγωγή αντισωμάτων Τ λεμφοκύτταρο Τ λεμφοκύτταρο Ενεργοποίηση λεμφοκυττάρων και παραγωγή κυτταροκινών Ειδική ανοσία Σχήμα 5. Σχηματική απεικόνιση της συνεργασίας της φυσικής ανοσίας και της ειδικής ανοσίας κατά μιας μυκητιακής λοίμωξης. Οι περισσότεροι μύκητες αναγνωρίζονται και εξοντώνονται μέσα σε λίγες ώρες από την φυσική ανοσία που κυρίως εκφράζεται από τα φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα). Οι μηχανισμοί της φαγοκυττάρωσης ξεκινούν άμεσα και ακολουθούνται από μια πρώιμη φλεγμονώδη απάντηση, που έχει σκοπό να κρατήσει τη λοίμωξη υπό έλεγχο. Παράλληλα, ξεκινά μια αλυσιδωτή ενεργοποίηση της ειδικής ανοσίας, εφόσον ο μύκητας ξεπεράσει την πρώτη γραμμή άμυνας. Παράγονται αντιγονο-ειδικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Τh1 και Th2), ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (Τreg) και Β λεμφοκύτταρα που έχουν συγκεκριμένο στόχο τον παθογόνο μύκητα και επάγουν τα κύτταρα μνήμης, ώστε να προληφθεί υποτροπή της λοίμωξης από το ίδιο παθογόνο (τροποποιημένο από Romani 2004). 41

44 Αμυντικοί μηχανισμοί Βήχας. Αποτελεί αντανακλαστικό της ενεργοποίησης των C ινιδίων και των υποδοχέων ταχείας προσαρμογής (rapidly adapting receptors, RAPs) του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος. Επίσης μπορεί να προκληθεί μετά από διέγερση παρασυμπαθητικών υποδοχέων ή αυτοβούλως. Ο βήχας αποτελεί ένα πολύ σημαντικό μηχανισμό για τον καθαρισμό του εγγύς τμήματος των αεραγωγών του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος από ξένα υλικά (Irwin και συν 1998). Κατά τη διάρκεια του βήχα, ενώ η γλωττίδα είναι κλειστή αυξάνει η ενδοθωρακική πίεση από τη σύσπαση των θωρακικών μυών. Με το απότομα άνοιγμα της γλωττίδας εξέρχεται βιαίως ο αέρας παρασύροντας οτιδήποτε βρίσκεται στην πορεία του (Widdicombe 1998). Ιδιαίτερης σημασίας είναι η πίεση του αέρα που αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια του βήχα και η οποία πρέπει να είναι αρκετά υψηλή, ώστε να μπορούν να εξέλθουν μεγαλύτερα μόρια, όπως για παράδειγμα οι μύκητες, από τον αναπνευστικό βλεννογόνο. Δέρμα και βλεννογόνοι. Αποτελούν φυσικό φραγμό που εμποδίζει την είσοδο παθογόνων μικροοργανισμών στο εσωτερικό του σώματος και στην κυκλοφορία του αίματος. Το δέρμα δε διαπερνάται παρά από ελάχιστους μικροοργανισμούς λόγω της κερατίνης στοιβάδας του. Επιπλέον, ο ιδρώτας και οι εκκρίσεις των σμηγματογόνων αδένων έχουν αντιμικροβιακές ιδιότητες λόγω του χαμηλού ph και των λιπαρών οξέων που επίσης βρίσκονται στις εκκρίσεις αυτές. Η φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα του δέρματος και των βλεννογόνων παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρόλο στην άμυνα (Braff και Gallo 2006) Το δέρμα παρουσιάζει διαφορετική ανθεκτικότητα στις διάφορες ηλικίες, μικρή στην παιδική ηλικία και αυξανόμενη με τη πάροδο των χρόνων, λόγω της αύξησης των ακόρεστων λιπαρών οξέων στις εκκρίσεις των σμηγματογόνων αδένων του δέρματος. Η μικρή ανθεκτικότητα του δέρματος στην παιδική ηλικία εξηγεί με αυτό τον τρόπο την αυξημένη συχνότητα των δερματικών μυκητιάσεων σε αυτή την ηλικιακή ομάδα (Γερμενής 2000). Ο αποικισμός του δέρματος και των βλεννογόνων ξεκινά λίγες ώρες μετά από τη γέννηση, με πλήθος βακτηρίων καθώς και ορισμένων μυκήτων. Οι μικροοργανισμοί που αποτελούν τη φυσιολογική χλωρίδα δρουν ανταγωνιστικά στην εγκατάσταση και στον πολλαπλασιασμό των παθογόνων μικροβίων. Κυρίως, οι περισταλτικές κινήσεις του βλεννοκροσσωτού επιθηλίου των αναπνευστικών οδών αλλά και το όξινο ph του γαστρικού υγρού και του κόλπου είναι παράγοντες που συντελούν επίσης στην προστασία του οργανισμού από λοιμώξεις. 42

45 Ειδικότερα για το βλεννοκροσσωτό επιθήλιο, ξένα μόρια προς τον οργανισμό μπορούν να απομακρυνθούν από τους αεραγωγούς του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος με τις περισταλτικές κινήσεις του. Οι αεραγωγοί είναι σχεδόν πλήρως καλυμμένοι με ψευδοπολύστιβο βλεννοκροσσωτό επιθήλιο που επικαλύπτεται από βλέννα. Τα μικρόβια, οι μύκητες και τα ξένα σώματα που επικάθονται στο βλεννογόνο των αεραγωγών απομακρύνονται μηχανικά, δηλαδή προσλαμβάνονται από τη βλέννα και με τη ρυθμική κίνηση του βλεννοκροσσωτού επιθηλίου αποβάλλονται (Houtmeyers και συν 1999). Συνεργικά μπορεί να δράσει και ο βήχας. Τα διάφορα είδη Aspergillus και Fusarium δεν ανευρίσκονται στη φυσιολογική χλωρίδα του ανθρώπινου οργανισμού. Τα είδη Aspergillus μπορούν όμως να αποικίσουν το ανώτερο αναπνευστικό σύστημα ορισμένων ατόμων με ελαττωμένη τοπική άμυνα όπως είναι οι ασθενείς με κυστική ίνωση, οι καπνιστές και άλλοι. Βιοχημικά συστατικά των ιστών. Στους ιστούς και στις εκκρίσεις του ανθρώπινου οργανισμού υπάρχει ποικιλία βασικών πρωτεϊνών οι οποίες δρουν πάνω στο μικροβιακό τοίχωμα και καταστρέφουν τα μικρόβια. Τέτοια πρωτεΐνη είναι η προπερδίνη που με την παρουσία συμπληρώματος δρα έναντι θετικών κατά Gram (Gram + ) και αρνητικών κατά Gram (Gram ) βακτηρίων. Στην ίδια κατηγορία ανήκει και η λυσοζύμη που προσβάλει κυρίως τα Gram + βακτήρια καθώς και τους μύκητες. Επίσης, στους ιστούς και στις εκκρίσεις του ανθρώπινου οργανισμού ανευρίσκονται και πολλοί αναστολείς διαφόρων ενζύμων, οι οποίοι δρουν έναντι βακτηρίων και μυκήτων. Για παράδειγμα αναφέρεται ο αναστολέας της υαλουρονιδάσης και ο αναστολέας της τρυψίνης. Φλεγμονή και πυρετός. Η είσοδος των μικροοργανισμών από το δέρμα και τους βλεννογόνους έχει ως συνέπεια την ανάπτυξη φλεγμονής που αρχίζει με διαστολή των απολήξεων των αγγείων. Τα φαγοκύτταρα συρρέουν στο σημείο της φλεγμονής αρχίζοντας τη διαδικασία καταστροφής των μικροβίων με τη φαγοκυττάρωση. Η φλεγμονή συνοδεύεται συνήθως από πυρετό. Ο πυρετός αποτελεί αμυντικό μηχανισμό του οργανισμού, γιατί με την άνοδο της θερμοκρασίας αυξάνεται ο μεταβολισμός του οργανισμού και με αυτό τον τρόπο ενισχύονται οι αμυντικές του δυνάμεις. Η εμφάνιση πυρετού στη φλεγμονή σχετίζεται με την απελευθέρωση προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών με κυριότερο εκπρόσωπο τον παράγοντα TNF-α. Κατά τη διάρκεια της φλεγμονής απελευθερώνονται ένα πλήθος ακόμα κυτταροκινών αλλά και χημειοκινών που σκοπό έχουν να την ελέγξουν αλλά και να αντιμετωπίσουν την περαιτέρω επέκτασή της. 43

46 Γενετικοί παράγοντες. Ένα πλήθος παραγόντων όπως η φυλή, το είδος, η κληρονομικότητα, η ηλικία, το φύλο, οι ατομικές διαφορές, η διατροφή και οι ορμόνες μπορούν να επηρεάσουν την φυσική ανοσία. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΜΥΝΑ ΑΝΟΣΙΑ Όπως προαναφέρθηκε, η ανοσία του ανθρώπινου οργανισμού διακρίνεται σε φυσική και επίκτητη. Το χαρακτηριστικό της φυσικής ανοσίας είναι πως δεν κατευθύνεται ειδικά και απαντά άμεσα στα ξένα ερεθίσματα. Στη φυσική ανοσία υπάγονται η φαγοκυττάρωση, το συμπλήρωμα και διάφορες αμυντικές ουσίες, όπως η ιντερφερόνη. Στο μεγαλύτερο ποσοστό τους οι περισσότερες ανοσιακές απαντήσεις έναντι λοιμογόνων παραγόντων απαρτίζονται από ένα σύνολο ενδογενών και επίκτητων μηχανισμών (Hohl και συν 2006). Στην αρχική φάση της λοίμωξης κυριαρχούν οι ενδογενείς μηχανισμοί ενώ αργότερα ενεργοποιούνται οι μηχανισμοί επίκτητης ανοσίας. Με τον τρόπο αυτό η ανοσιακή απάντηση φτάνει γρηγορότερα στην κορύφωσή της και είναι περισσότερο αποτελεσματική. Φυσική ανοσία Φαγοκυττάρωση: Αποτελεί τον κυριότερο κυτταρικό μεσολαβητή της φυσικής ανοσίας και θα περιγραφεί αναλυτικότερα παρακάτω. Συμπλήρωμα: Υπάρχουν περίπου 30 προστατευτικές πρωτεΐνες στο αίμα και στους ιστούς που αποτρέπουν την εξάπλωση των παθογόνων μικροοργανισμών και στο σύνολό τους συγκροτούν ένα σύστημα που αναφέρεται ως συμπλήρωμα. Όταν ενεργοποιηθούν οι πρωτεΐνες αυτές από την παρουσία ενός βακτηρίου ή μύκητα, ξεκινά μια σειρά αλυσιδωτών αντιδράσεων κατά την οποία κάποιες από αυτές συσσωρεύονται στο βακτηριακό ή μυκητιακό τοίχωμα και δημιουργούν πόρους. Το αποτέλεσμα είναι να καταστρέφεται το κύτταρο του μικροοργανισμού με πλασμόλυση. Ακόμα όμως και αν ο παθογόνος μικροοργανισμός δεν καταστραφεί, η προσκόλληση των συμπληρωματικών πρωτεϊνών στο τοίχωμα του θα προσελκύσει τα φαγοκύτταρα για να το καταστρέψουν με φαγοκυττάρωση. Ιντερφερόνες: Είναι πολυπεπτίδια που παράγονται από ευκαρυωτικά κύτταρα ως απάντηση σε διάφορα ερεθίσματα. Τα ερεθίσματά για την παραγωγή τους μπορεί να προέρχονται από λοίμωξη με ιούς, ενδοτοξίνες βακτηρίων ή διάφορα μιτογόνα. Κατατάσσονται στις κυτταροκίνες και εκκρίνονται από διαφόρους τύπους κυττάρων ανάλογα με τον τύπο τους. Γνωστές ιντερφερόνες είναι η α (IFN-α) που παράγεται κυρίως από τα λευκά αιμοσφαίρια, η β (IFN-β) που παράγεται κυρίως από τους ινοβλάστες και η γ (IFN-γ) που παράγεται κυρίως από τα Τ κύτταρα. Αποτελούν σημαντικό ανασταλτικό παράγοντα του πολλαπλασιασμού των ιών, αλλά έχουν και 44

47 πολλές άλλες δράσεις όπως αντιμιτωτική, ανοσοτροποποιητική, διαφοροποιητική, αναστέλλουν τη νεοαγγειογένεση, αναστέλλουν τα ογκογονίδια, προκαλούν αύξηση του αριθμού και της δράσης των κυττάρων-φονέων και αυξάνουν τη φαγοκυτταρική ικανότητα των μακροφάγων. Παρακάτω θα αναφερθούν περισσότερα για την ΙFN-γ (Kunzi και Pitha 2003). Κύτταρα φυσικοί φονείς (natural killers, NK): Συνιστούν περίπου το 10-15% των λεμφοκυττάρων του αίματος. Έχουν την ικανότητα να λύουν κύτταραστόχους χωρίς προηγούμενη ευαισθητοποίηση και χωρίς περιορισμό από τα αντιγόνα του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας. Στη δράση τους περιλαμβάνεται η καταστροφή νεοπλασματικών κυττάρων, μολυσμένων κυττάρων από ιούς ή βακτήρια καθώς και αντιγόνα επενδυμένα με IgG ανοσοσφαιρίνες. Τα NK κύτταρα δεν φέρουν ειδικούς δείκτες στην επιφάνειά τους, ενώ παράγουν ΙFN-γ, IL-1 καθώς και GM SCF, διαδραματίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στην αιμοποίηση και στην ανοσιακή απάντηση (Orange και Ballas 2006). Πρωτεΐνες οξείας φάσης: Αποτελούν μια ετερογενή ομάδα πρωτεϊνών, των οποίων η συγκέντρωση αυξάνει στο πολλαπλάσιο στην οξεία φάση της λοίμωξης. Η ομαδοποίησή τους γίνεται ανάλογα με το βαθμό και την ταχύτητα αύξησής τους. Στην ομάδα Ι ανήκουν η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), και το αμυλοειδές, που αυξάνονται φορές σε 4-10 ώρες. Στην ομάδα ΙΙ ανήκουν η α 1 -αντιθρυψίνη, η α 1 -αντιχυμοθρυψίνη, η απτοσφαιρίνη και η α 1 -όξινη γλυκοπρωτεΐνη, που αυξάνονται κατά 2-4 φορές σε 24 ώρες. Στην ομάδα ΙΙΙ ανήκουν η σερουλοπλασμίνη και το κλάσμα 3 του συμπληρώματος που αυξάνονται κατά 0,5 φορές στις 24 ώρες. Οι πρωτεΐνες οξείας φάσης συντελούν στην αποκατάσταση της ιστικής βλάβης, ενεργοποιούν το συμπλήρωμα και περιορίζουν τη φλεγμονή Επίκτητη ανοσία Η επίκτητη ανοσία χωρίζεται σε δύο τύπους: α) την κυτταρική και β) τη χυμική Η κυτταρική ανοσία διεγείρεται μέσω των Τ-λεμφοκυττάρων που διακρίνονται σε δυο κύριους υποπληθυσμούς, τα Τ-βοηθητικά (T-helper, Th) και τα Τ- κυτταροτοξικά/κατασταλτικά (T-cytotoxic/suppressive, Tc/s), λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά αναγνωρίζουν αντιγόνα στην επιφάνεια των κυττάρων και όχι διαλυτά αντιγόνα. Η χυμική ανοσία διενεργείται μέσω των Β-λεμφοκυττάρων που παράγουν αντισώματα, τα οποία είναι ειδικά για συγκεκριμένα αντιγόνα. 45

48 Κύτταρα συμμετέχοντα στην ανοσιακή απάντηση Τα κύτταρα που συμμετέχουν στην ανοσιακή απάντηση είναι τα λευκά αιμοσφαίρια και τα οποία διακρίνονται σε δύο κύριες ομάδες: α) τα φαγοκύτταρα και β) τα λεμφοκύτταρα (Σχήμα 6). Αιμοποιητικό προγονικό κύτταρο Λεμφικό προγονικό κύτταρο Β-κύτταρο Τ-κύτταρο ΝΚ-κύτταρο Διδύναμο προγονικό κύτταρο Μονοκύτταρο Μακροφάγο * P <0 P <0? Ηωσινόφιλο Βασεόφιλο Δενδριτικό κύτταρο Ουδετερόφιλο Μεγακαρυοκύτταρο Αιμοπετάλια Ερυθροκύτταρο Σχήμα 6. Στάδια διαφοροποίησης των λεμφοκυττάρων και των κυττάρων της ερυθράς και λευκής σειράς. α) Τα φαγοκύτταρα στα οποία περιλαμβάνονται τα ουδετερόφιλα και τα κύτταρα του μονοπυρηνικού φαγοκυτταρικού συστήματος, με σημαντικότερα τα μονοκύτταρα του αίματος και τα μακροφάγα των ιστών. Η δράση τους είναι ως αμυντικοί μηχανισμοί πρώτης γραμμής, ενώ η σύνδεσή τους με το αντιγόνο είναι μη ειδική αλλά μπορεί να γίνει και με την παρουσία αντισώματος. Αντιγονοπαρουσιαστική χαρακτηρίζεται η ικανότητα των μακροφάγων να προσλαμβάνουν το αντιγόνο και να το «παρουσιάζουν» στα λεμφοκύτταρα σε μορφή τέτοια που να είναι εύκολα αναγνωρίσιμη από αυτά. 46

49 Ουδετερόφιλα. Προέρχονται από το ίδιο άωρο κύτταρο του μυελού των οστών, όπως και το μονοκύτταρο, το προγονικό μυελομονοκύτταρο (colony forming unitgranulocyte monocyte, CFU-GM), με ενδιάμεσα στάδια ωρίμανσης τη μυελοβλάστη και το μυελοκύτταρο. Τα μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών για να μπορέσει να διατηρήσει σε σταθερό αριθμό τα κύτταρα του αίματος, μέσω της διαρκούς ανανέωσής τους, χρησιμοποιεί αυξητικούς παράγοντες καθώς και παράγοντες διαφοροποίησης. Η διάρκεια ζωής των ουδετεροφίλων στην κυκλοφορία είναι περίπου 6-12 ώρες και παράγονται καθημερινά περίπου 2x10 4 ουδετερόφιλα/μl ώστε να υπάρχει σταθερά στο αίμα ένας αριθμός τουλάχιστον 5x10 3 ουδετερόφιλα/μl. Δηλαδή, καθημερινά ο συνολικός αριθμός ουδετεροφίλων είναι 2x10 4 x5x ουδετερόφιλα/μl την ημέρα. Τα ουδετερόφιλα αποτελούν το 55-65% των κυττάρων του περιφερικού αίματος του ενήλικα. Οι αυξητικοί παράγοντες G-CSF και GM-CSF όχι μόνο προάγουν την κυτταρική διαίρεση, αλλά επηρεάζουν και τη σύνθεση αρκετών κυτταροπλασματικών παραγόντων καθώς και την έκφραση παραγόντων μεταγραφής οι οποίοι είναι απαραίτητοι για τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Παράγοντες μεταγραφής όπως ο PU.1, Sp-1, C/EBP-α και Oct-1 επιδρούν στη διαφοροποίηση των κυττάρων του μυελού (Shimokawa και Ra 2003). Τα ουδετερόφιλα βρίσκονται στο αίμα που κυκλοφορεί και μπορούν να ανιχνεύσουν χαμηλά επίπεδα χημειοκινών καθώς και άλλων χημειοτακτικών παραγόντων που μπορεί να εκλυθούν από ένα σημείο φλεγμονής. Οι παράγοντες αυτοί εκκινούν μια σειρά πολύπλοκων αλλαγών στα μόρια επιφανείας των ουδετεροφίλων αλλά και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Προκαλείται αρχικά χαμηλή έλξη και χαλαρή συγκόλληση των ουδετεροφίλων λόγω της σύνδεσης με την L- σελεκτίνη με αποτέλεσμα την έναρξη της «λευκοκυτταρικής περιστροφής» κατά μήκος της ενδοθηλιακής επιφάνειας. Με τον τρόπο αυτό τα ουδετερόφιλα έρχονται σε μεγαλύτερη έκθεση με τους ενεργοποιητικούς παράγοντες, όπως ο TNF-α και η IL-1. Στη συνέχεια συμβαίνει επαγωγή αλλαγών στους υποδοχείς συγκόλλησης της β2- ιντεργκρίνης με συνέπεια την αλλαγή του σχήματος των ουδετεροφίλων και την ισχυρή συγκόλληση τόσο μεταξύ τους όσο και με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Κατόπιν τα μόρια συγκόλλησης αιμοπεταλίων ενδοθηλιακών κυττάρων (Platelet-endothelial cell adhesion molecules, PECAM) που βρίσκονται στα σημεία συνένωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων αντιδρούν με την παραμορφωμένη επιφάνεια των ουδετεροφίλων (Wu και συν 2005). Αποτέλεσμα είναι τα ουδετερόφιλα να διαπερνούν το φραγμό που σχηματίζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και να 47

50 μεταναστεύουν στο σημείο της λοίμωξης (Σχήμα 7). Η δράση των ουδετεροφίλων όπως και των μονοκυττάρων είναι η έντονη φαγοκυττάρωση μικροοργανισμών. Σχήμα 7 (Πλαίσια Α-Δ). Σχηματική απεικόνιση της απάντησης των ουδετεροφίλων στη λοίμωξη (Πλαίσιο Α) Τα ουδετερόφιλα βρίσκονται στο αίμα κυκλοφορώντας χωρίς να προσκολλώνται στο αγγειακό τοίχωμα και ανιχνεύοντας χαμηλά επίπεδα χημειοκινών καθώς και άλλων χημειοτακτικών παραγόντων που εκλύονται από σημεία φλεγμονής. (Πλαίσιο Β) Οι παράγοντες αυτοί εκκινούν μια σειρά πολύπλοκων αλλαγών στα μόρια επιφανείας των ουδετεροφίλων αλλά και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αρχικά παρατηρείται χαμηλή έλξη και χαλαρή συγκόλληση των ουδετεροφίλων λόγω της σύνδεσης με την L- σελεκτίνη με αποτέλεσμα την έναρξη της «λευκοκυτταρικής περιστροφής» κατά μήκος της ενδοθηλιακής επιφάνειας. Με τον τρόπο αυτό τα ουδετερόφιλα έρχονται σε μεγαλύτερη έκθεση με τους ενεργοποιητικούς παράγοντες, όπως ο TNF-α και η IL-1. (Πλαίσιο Γ) Ακολουθεί η επαγωγή αλλαγών στους υποδοχείς συγκόλλησης της β2- ιντεργκρίνης με συνέπεια την αλλαγή του σχήματος των ουδετεροφίλων και την ισχυρή συγκόλληση τόσο μεταξύ τους όσο και με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. (Πλαίσιο Δ) Τελικά τα μόρια συγκόλλησης αιμοπεταλίων ενδοθηλιακών κυττάρων (Plateletendothelial cell adhesion molecules, PECAM) που βρίσκονται στα σημεία συνένωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων αντιδρούν με την παραμορφωμένη επιφάνεια των ουδετεροφίλων. Αποτέλεσμα είναι τα ουδετερόφιλα να διαπερνούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα και να μεταναστεύουν στο σημείο της λοίμωξης. 48

51 Μονοκύτταρα. Προέρχονται, όπως και τα ουδετερόφιλα, από το προγονικό μυελομονοκύτταρο CFU-GM, με ενδιάμεσα στάδια ωρίμανσης τη μονοβλάστη και το προμονοκύτταρο. Τα μονοκύτταρα έχουν μέγεθος μm και αποτελούν το 3-5% των κυττάρων του περιφερικού αίματος του ενήλικα ενώ μπορούν να φτάσουν μέχρι το 20%, ενώ έχουν χρόνο ημίσειας ζωής στο αίμα περίπου 8,5 ώρες. Κατόπιν εγκαταλείπουν την κυκλοφορία με αμοιβαδοειδή κίνηση, μεταναστεύουν μέσω των μεσοκυττάριων διαστημάτων του τοιχώματος των αγγείων σε διάφορους ιστούς και όργανα του σώματος και διαφοροποιούνται σε μακροφάγα των ιστών. Τέτοια κύτταρα είναι τα κυψελιδικά μακροφάγα των πνευμόνων, τα κύτταρα Kupffer του ήπατος, τα ενδοσπειραματικά μεσαγγειακά κύτταρα του νεφρού καθώς και τα μακροφάγα των ορογόνων υμένων, των κολποειδών του σπληνός και της μικρογλοίας του εγκεφάλου. Τα μονοκύτταρα καθώς και τα μακροφάγα που προέρχονται από αυτά έχουν στην επιφάνειά τους υποδοχείς φρουκτόζης και μαννόζης [macrophage fructose receptor (MFR) και macrophage mannose receptor (MMR)] και μέσω αυτών ενώνονται με αντίστοιχους συνδέτες (ligands) των μικροοργανισμών. Διαθέτουν και μόρια CD14, που αποτελούν υποδοχείς πρωτεΐνης που συνδέουν λιποπολυσακχαρίτες και βρίσκονται στο τοίχωμα Gram μικροοργανισμών. Επίσης διαθέτουν 3 διαφορετικά είδη υποδοχέων Fc για την ανοσοσφαιρίνη IgG: 1. το μόριο FcγRI (CD64), υψηλής συγγένειας για την IgG 2. το μόριο FcγRIΙ (CD32) 3. το μόριο FcγRIΙΙ (CD16) (Swanson και Hoppe 2004) Τα κύτταρα αυτά διαθέτουν επίσης υποδοχείς συμπληρώματος, υποδοχείς χαμηλής συγγένειας για το τμήμα Fc της IgE καθώς και αντιγόνα του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας MHC I και II. Η προσκόλληση και η πέψη των ξένων σωματίων ευνοείται όταν αυτά καλύπτονται από συμπλήρωμα και ειδικές ανοσοσφαιρίνες IgG, οπότε και ενώνονται με τα μονοκύτταρα μέσω ειδικών υποδοχέων για την ανοσοσφαιρίνη IgG (Fcγ υποδοχείς) και το συμπλήρωμα (C3b ή C3bi υποδοχέας). Διάφορες κυτταροκίνες, που παράγονται από τα Τ-λεμφοκύτταρα καθώς και από άλλα είδη κυττάρων, μπορούν να επιδρούν στη λειτουργία των μονοκυττάρων/μακροφάγων συνδεόμενες με ανάλογους υποδοχε ίς στην επιφάνειά τους. Τα ίδια τα μονοκύτταρα επίσης παράγουν κυτταροκίνες καθώς και στοιχεία του συμπληρώματος. Η δράση των μονοκυττάρων και των μακροφάγων είναι η έντονη φαγοκυττάρωση μικροοργανισμών, που περιγράφεται παρακάτω. 49

52 Στην άμυνα του ανθρώπινoυ oργανισμoύ κατά των μυκητιακών λoιμώξεων συμμετέχoυν κυρίως: α) η φυσική ανoσία, πoυ περιλαμβάνει τoυς φυσικoύς φραγμoύς τoυ oργανισμoύ (δέρμα, βλεννoγόνoυς), τη φυσιoλoγική μικρoβιακή χλωρίδα, καθώς και τα φαγoκύτταρα (oυδετερόφιλα πoλυμoρφoπύρηνα και μoνoπύρηνα-μακρoφάγα), β) η επίκτητη ανoσία, και ιδιαίτερα τo κυτταρικό σκέλoς αυτής (Τ-λεμφoκύτταρα, κα ι μάλιστα τα CD4 + κύτταρα τύπoυ Th1). Κατά συνέπεια, ευάλωτα στις μυκητιακές λoιμώξεις και ιδιαίτερα στις ευκαιριακές (καντιντίαση, ασπεργίλλωση, κ.λ.π.) είναι: α) άτoμα με πoσoτική ή λειτoυργική ανεπάρκεια των oυδετερoφίλων, όπως ασθενείς πoυ λαμβάνoυν κυτταροτοξική χημειoθεραπεία λόγω αιματoλoγικών ή άλλων νεoπλασιών ή μεταμόσχευσης μυελoύ των oστών, ασθενείς πoυ πάσχoυν από χρόνια κoκκιωματώδη νόσo και άτoμα πoυ λαμβάνoυν κoρτικoστερoειδή, β) ασθενείς πoυ πάσχoυν από AIDS, καθώς και από συγγενείς ανoσoανεπάρκειες πoυ αφoρo ύν και στην κυτταρική ανoσία, γ) πρόωρα νεoγνά, άτoμα με ανoσoλoγικό έλλειμμα στα oπoία η συνέχεια τoυ δέρματoς διασπάται από ενδoφλέβιoυς καθετήρες (κεντρικoύς, περιφερικoύς) ή από χειρoυργικές επεμβάσεις, άτoμα με εγκαύματα ή σακχαρώδη διαβήτη, καθώς και ασθενείς με παρατεταμένη λήψη αντιβιoτικών πoυ συνoδεύεται από διαταραχή της φυσιoλoγικής μικρoβιακής χλωρίδας. β) Τα λεμφοκύτταρα είναι ο εντολοδόχος του ανοσιακού συστήματος και διαφέρει από τα υπόλοιπα κύτταρα του ανοσιακού συστήματος γιατί αντιδρά ειδικά με το αντιγόνο. Τα λεμφοκύτταρα διακρίνονται στα Β- και Τ-λεμφοκύτταρα. Τα Β-λεμφοκύτταρα αποτελούν το 20% των περιφερικών λεμφοκυττάρων και εξαρτώνται από το λεμφικό ιστό του εντέρου. Τα Β-λεμφοκύτταρα διακρίνονται ανάλογα με το βαθμό διαφοροποίησής τους σε: α) μητρικό πολυδύναμο κύτταρο, β) προ-προ-β-λεμφοκύτταρο, γ) προ-β-λεμφοκύτταρο, δ) άωρο Β-λεμφοκύτταρο, ε) μικρό Β-λεμφοκύτταρο, στ) ώριμο Β-λεμφοκύτταρο και ε) πλασματοκύτταρο. Το τελευταίο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή ανοσοσφαιρινών. Τα Β-λεμφοκύτταρα έχουν και αντιγονοπαρουσιαστικές ιδιότητες αφού μετά τη δέσμευση του αντιγόνου στην επιφάνειά τους, το παρουσιάζουν στο Τ-λεμφοκύτταρο, το οποίο συμβάλλει με τη σειρά του στη διαφοροποίηση προς πλασματοκύτταρο. Τα Τ-λεμφοκύτταρα φέρουν επιφανειακούς δείκτες οι οποίοι χαρακτηρίζουν ένα στάδιο διαφοροποίησης, τα λεγόμενα αντιγόνα διαφοροποίησης (clusters of differentiation, CD), που είναι λειτουργικά μόρια της επιφανείας των Τ- λεμφοκυττάρων. Αποτελούν το 75% των περιφερικών λεμφοκυττάρων και διακρίνονται σε δύο υποπληθυσμούς, όπως έχει προαναφερθεί, τα Th (CD4 + ) που αποτελούν το 65% των περιφερικών Τ-λεμφοκυττάρων και τα Tc/s (CD8 + ) που 50

53 αποτελούν το 35% των περιφερικών Τ-λεμφοκυττάρων. Ο λόγος CD4 + /CD8 + είναι περίπου 2:1. Τα παρθένα CD4 + Τ-λεμφοκύτταρα όταν ενεργοποιηθούν πρέπει πρώτα να διαφοροποιηθούν σε δύο υποπληθυσμούς, τους Th-1 και Th-2 με βάση τις κυτταροκίνες που παράγουν, και αποτελούν το μοντέλο Th-1/Th-2. Βέβαια οι δύο αυτές κατηγορίες κυτταροκινών δεν είναι στεγανές και το μοντέλο Th-1/Th-2 είναι υπερβολικά απλουστευμένο. Αυτό αποδεικνύεται με το γεγονός ότι πολλές Th-1 και Th-2 κυτταροκίνες έχουν ιδιότητες που δε μπορούν να καταταχθούν σε μια από τις δύο κατηγορίες. ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ ΩΣ ΑΜΥΝΤΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΣΤΗΝ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ Τα φαγοκύτταρα αποτελούν τ ην πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμ ού έναντι επιτιθέμενων μικροοργανισμών εξουδετερώνοντάς τους με εντυπωσιακή αποτελεσματικότητα. Τέτοια κύτταρα είναι τα ουδετερόφιλα και τα μονοκύτταρα που υπάρχουν στο αίμα, καθώς και τα μακροφάγα που υπάρχουν στου ς ιστούς. Η φαγοκυττάρωση ή ενδοκυττάρωση είναι η λειτουργία της σύλληψης, ενδοκυττάριας πέψης και καταστροφής των ξένων μικροοργανισμών ή η σύλληψη και αποκομιδή αδρανών σωματιδίων (Γερμενή ς 2000). Η φαγοκυττάρωση μπορεί να γίνει είτε: α) με απ ευθείας πινοκυττάρωση, β) μέσω υποδοχέων (κλαθρίνη, ακτίνη) ή γ) μέσω οφωνινοποίησης. Σημαντικός είναι ο ρόλος του συμπληρώματος στη διαδικασία της φαγοκκυτάρωσης. Ο οργανισμός, αντιδρώντας στην προσβολή από τα παθογόνα βακτήρια, παράγει αντισώματα τα οποία ενώνονται στην επιφάνεια των βακτηρίων. Τα αντισώματα τα οποία καλύπτουν τα βακτήρια, τους μύκητες ή άλλα σωματίδια διεγείρουν την πρόσληψή τους από τα μακροφάγα κύτταρα. Στην επιφάνεια των μακροφάγων κυττάρων και των ουδετερόφιλων λευκοκυττάρων, υπάρχουν υποδοχείς που αναγνωρίζουν εκλεκτικά τα ανοσοσυμπλέγματα (δηλ. τα αντισώματα που έχουν συνδεθεί με τα αντιγόνα) και συνδέονται μαζί τους. Ο πλέον γνωστός υποδοχέας, είναι ο Fc υποδοχέας που αναγνωρίζει και συνδέεται εκλεκτικά με την περιοχή Fc των ανοσοσφαιρινών. Η σύνδεση των ανοσοσυμπλεγμάτων στους Fc υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας επάγει τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης. Ο υποδοχέας FcγR ενεργοποιεί, μετά τη σύνδεσή του με την IgG, ένα μονοπάτι μεταγωγής μηνυμάτων που τελικά οδηγεί στην αναδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού ακτίνης ο οποίος βρίσκεται κοντά στην πλασματική μεμβράνη (Booth 2006). Μια άλλη ομάδα πρωτεϊνών του ορού, το συμπλήρωμα (κυριότερη πρωτεΐνη της ομάδας αυτής είναι η C3b), καλύπτει τα ξένα σωματίδια μη ειδικά και επάγει τη 51

54 διεργασία πρόσληψής τους συνδεόμενη σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας των μακροφάγων (υποδοχείς συμπληρώματος) (Tarameli και συν 1996). Οι ανοσοσφαιρίνες και η πρωτεΐνη C3b του συμπληρώματος ονομάζονται οψωνίνες, και αποτελούν τους κυριότερους παράγοντες που επάγουν τη φαγοκυττάρωση. Η σύνδεση του σωματιδίου στην επιφάνεια του φαγοκυττάρου δημιουργεί ένα διαμεμβρανικό σήμα που οδηγεί βαθμιαία στην εγκόλπωση και την εσωτερίκευση του σωματιδίου. Η εσωτερίκευση του σωματιδίου γίνεται συνήθως με το μηχανισμό "φερμουάρ" και σταματά όταν δεν υπάρχουν ελεύθερες θέσεις αναγνώρισης ή υποδοχείς σε όλη την επιφάνεια του κυττάρου. Η χημειοταξία προηγείται της διαδικασίας της φαγοκυττάρωσης και επιτελείται με τους χημειοτακτικούς παράγοντες. Τέτοιοι παράγοντες είναι οι κυτταροκίνες, όπως η IL-1, η IFN-γ, ο TNF-α καθώς και άλλες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην κατευθυνόμενη μετακίνηση των μακροφάγων στο χώρο της φλεγμονής. Η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης ελέγχεται από τους Toll-like υποδοχείς (TLR) σε διάφορα στάδια. Πρωτεΐνες που βρίσκονται στο κυτταρικό τοίχωμα μικροοργανισμών, όπως λιποπολυσακχαρίτες (LPS) ή άλλες χημικές ουσίες, αναγνωρίζονται και δεσμεύονται στους TLR, ενεργοποιώντας έτσι μία σειρά από κλιμακωτές βιοχημικές αντιδράσεις για την προώθηση του μηνύματος και την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB, ο οποίος επάγει την έκφραση και έκκριση κυτταροκινών όπως του παράγοντα TNF-α και της IL-1 (West και συν 2004). Τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα είναι εξαιρετικά εκκριτικά κύτταρα που εκκρίνουν ποικιλία ουσιών, όπως κυτταροκίνες, παράγοντες συμπληρώματος και άλλα. Η ένωση φαγοσώματος και λυσοσώματος, όπως θα δούμε παρακάτω, με σκοπό τη δημιουργία του φαγολυσοσώματος επιταχύνεται μέσω σημάτων που ελέγχονται από TLR και την MyD88-εξαρτώμενη οδό. Όσον αφορά τα κονίδια του A. fumigatus, παρατηρήθηκε ότι η ενδοκυτταρική θανάτωση και η έκκριση κυτταροκινών είναι MyD88-ανεξάρτητη (Marr και συν 2003). Ο ρόλος των TLR και της MyD88-οδού θα συζητηθεί εκτενέστερα παρακάτω. Ο μηχανισμός της φαγοκυττάρωσης που ακολουθεί τη χημειοταξία διακρίνεται στα εξής στάδια: Προσκόλληση: η στενή επαφή του φαγοκυττάρου με το στόχο εξασφαλίζεται από ειδικούς υποδοχείς, όπως για παράδειγμα από τους CD64, CD32 και CD16, που αναγνωρίζουν το Fc κλάσμα των ανοσοσφαιρινών και τα C3b και C3bi κλάσματα του συμπληρώματος. Τα κλάσματα των ανοσοσφαιρινών και του συμπληρώματος προσκολλώνται στην επιφάνεια του βακτηρίου-στόχου (οψωνινοποίηση) και συμβάλλουν στην πρόσληψή του από το φαγοκύτταρο. 52

55 Ενδοκυττάρωση: η κυτταρική μεμβράνη επεκτείνεται δημιουργώντας ψευδοπόδια γύρω από το ξένο σωματίδιο, διαδικασία που απαιτεί τη συμμετοχή του κυτταρικού σκελετού (Σχήμα 8). Στη συνέχεια, η μεμβράνη κλείνει γύρω από το σωματίδιο και αποσπάται από την κυτταροπλασματική μεμβράνη, δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο ένα φαγοκυτταρικό κυστίδιο, το φαγόσωμα. Το φαγόσωμα μόλις σχηματιστεί έχει, παροδικά, ουδέτερο ph. Το φαγόσωμα μετασχηματίζεται σε λειτουργικό φαγολυσόσωμα με την απόκτηση λυσοσωμικών ενζύμων και με πτώση του ph κάτω από 5. Tα νεοσχηματιζόμενο φαγόσωμα έχει την ίδια σύσταση σε μεμβρανικές πρωτεΐνες μ ε την πλασματική μεμβράνη από την οποία προέρχεται. Όμως, μέσα σε διάστημα λίγων λεπτών, η μεμβρανική σύσταση του φαγοσώματος τροποποιείται ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασής των με οργανίδια του ενδοκυτταρικού μονοπατιού και της μεμβρανικής ανακύκλωσης. Η τύχη του φαγοκυτταρικού κυστιδίου εξαρτάται από τον τύπο του υποδοχέα που έλαβε μέρος κατά την πρόσληψη του σωματιδίου. Συνέπεια αυτών είναι ότι ένας μικροοργανισμός που φαγοκυτταρώνεται, κατά πρώτον βρίσκεται σε ένα εχθρικό περιβάλλον, λόγω του ph και των ενζύμων υδρόλυσης, αλλά ακόμα και αν επιβιώσει στερείται θρεπτικών συστατικών, καθώς είναι περιορισμένος στο φαγολυσόσωμα (Blander και Medzhitov 2004). Πέψη και καταστροφή: μέσα στο φαγοκύτταρο πραγματοποιείται η πέψη και καταστροφή των φαγοκυτταρικών κυστιδίων που περιέχουν τα ξένα σώματα, με δύο τρόπους. Είτε με τη δράση των υδρολυτικών ενζύμων των λυσοσωμάτων, είτε με τη δράση των ελεύθερων ριζών O 2 και Ν, κατά την οξειδωτική έκρηξη. Η τοξική δράση των ελεύθερων ριζών ενισχύεται από ένα ένζυμο των λυσοσωμάτων, την μυελοϋπεροξειδάση, ενώ άλλα υδρολυτικά ένζυμα τους συμβάλλουν στη θανάτωση των μικροοργανισμών. Ειδικότερα, η λυσοζύμ η, οι κατιονικές πρωτεΐνες και η πρωτεΐνη BPI καταστρέφουν το κυτταρικό τοίχωμα των μικροβίων. Επιπλέον, η λακτοφερίνη αποστερεί από τα μικροβιακά κύτταρα το σίδηρο, που είναι απαραίτητος για την ανάπτυξή τους. 53

56 Σχήμα 8. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας ενδοκυτταρώσεως ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΗ ΜΥΚΗΤΩΝ Πέρα από τη φαγοκυττάρωση, υπάρχουν και άλλοι μηχανισμοί οι οποίοι βοηθούν στο να περιοριστεί η ανάπτυξή των μικροβίων και ειδικότερα των μυκήτων. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω ενός συνδυασμού οξειδωτικών, και μη-οξειδωτικών μηχανισμών. Οι μη-οξειδωτικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την αποκοκκίωση και την εξωκυττάρια ή ενδοκυττάρια, μετά από τη φαγοκυττάρωση, απελευθέρωση κατιονικών πεπτιδίων, αντιμικροβιακών πεπτιδίων, όπως αμυντικών πρωτεϊνών (defensins), πρωτεολυτικών ενζύμων, λυσοζύμης, λακτοφερίνης και άλλων χημικών ουσιών. Οι οξειδωτικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν ένζυμα όπως την NADPH (φωσφορικό-νικοτιναμιδο-αδενίνο δινουκλεοτίδιο) οξειδάση, την μυελοϋπεροξειδάση (myeloperoxidase), την δισμουτάση του υπεροξειδίου (superoxide dismutase) και την συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (Iles και Forman 2002). Αυτά τα ένζυμα ενεργοποιούνται μέσω των οξειδωτικών οδών, κατά τη δραστηριότητα των οποίων παρατηρείται ιδιαίτερα αυξημένη κατανάλωση οξυγόνου, αλυσιδωτή αντίδραση η οποία είναι γνωστή ως αναπνευστική ή οξειδωτική έκρηξη (Babior 1999). Κατά τη διάρκεια της αναπνευστικής έκρηξης το ένζυμο NADPH μετατρέπει το Ο 2 σε ανιόν υπεροξειδίου (Ο 2 ) και κατόπιν από το Ο 2 σχηματίζονται το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), το στοιχειακό οξυγόνο ( * Ο 2 ) και οι ρίζες υδροξυλίου (ΟΗ ). Το Η 2 Ο 2 στη συνέχεια αντιδρά με τη ρίζα Cl και παράγει υποχλωριώδες οξύ (HOCl). Από εκεί και πέρα ξεκινά ο σχηματισμός και άλλων δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Intermediates, ROIs). Κατά τη διάρκεια της αναπνευστικής έκρηξης σχηματίζεται μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), που 54

57 είναι επίσης τοξικό προϊόν (Babior 1999, Rhee 1999a, Rhee και συν 1999b). Συνοπτικά, οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα φαίνονται στο Σχήμα 9. Η φύση των ROIs εξαρτάται από το είδος του φαγοκυττάρου από το οποίο παράγονται, καθώς και από τον παθογόνο μικροοργανισμό που ενεργοποιεί την παραγωγή τους (Romani 2004). Οι δραστικές αυτές μορφές του οξυγόνου προκαλούν επιζήμιες τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες των μυκήτων, υδρόλυση των νουκλεϊκών τους οξέων, καθώς και λιπιδικές υπεροξειδώσεις (Mansour και Levitz 2002). Η παραγωγή αυτών των ουσιών επάγεται από μικροβιακά προϊόντα, όπως οι λιποπολυσακχαρίτες και επαυξάνεται μέσω σημάτων από οψωνίνες και κυτταροκίνες. Σχήμα 9: Οι κυριότερες οξειδωτικές οδοί των ουδετεροφίλων. Διακρίνεται στην εικόνα, η αυξημένη ανάγκη σε οξυγόνο, χαρακτηριστικό της οξειδωτικής έκρηξης. Η δράση των NADPH-οξειδασών (ένζυμα που υπάρχουν στα κοκκία των ουδετεροφίλων) στο οξυγόνο αποτελεί την εκκίνηση αυτής της οξειδωτικής οδού, η οποία καταλήγει στο σχηματισμό χλωραμινών (R-NCl). Οι χλωραμίνες είναι λιγότερο δραστικοί, αλλά πιο σταθεροί οξειδωτικοί παράγοντες. Ένα πολύ σημαντικό ενδιάμεσο παράγωγο αυτής της οδού είναι το υποχλωριώδες οξύ (HOCl), το οποίο οξειδώνει άμεσα μόρια του στόχου. Τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα εκφράζουν μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ)- συνθετάση, η δράση της οποίας και ξεκινά την οδό του NO. Το ΝΟ, όπως φαίνεται, μετατρέπεται σε ιδιαίτερα τοξικούς παράγοντες. Ως απάντηση, οι μύκητες έχουν αναπτύξει στρατηγικές αναστολής της αναπνευστικής έκρηξης των φαγοκυττάρων. Αυτό το επιτυγχάνουν μέσω της έκφρασης ουσιών, όπως είναι η καταλάση, οι γλοιοτοξίνες και οι αφλατοξίνες, η δράση των οποίων αναλύεται παρακάτω. 55

58 ΑΝΟΣΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ASPERGILLUS & FUSARIUM Η πλέον συνηθισμένη πύλη εισόδου των κονιδίων του Aspergillus και του Fusarium είναι η πνευμονική οδός. Με την είσοδο των κονιδίων στο αναπνευστικό βρογχικό δένδρο, μετά από τη διέλευση από το κροσσωτό επιθήλιο της αναπνευστικής οδού, ο σημαντικότερος αμυντικός παράγοντας της ανοσίας του οργανισμού είναι τα λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα που εδράζονται στο πνευμονικό επιθήλιο (Tronchin και συν 1995, Hostetter 1996). Η ενεργοποίηση των φαγοκυττάρων, που είναι καθοριστική για την επιτυχή αντιμετώπιση του παθογόνου παράγοντα, επιτυγχάνεται με τα μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα, τα οποία έρχονται σε επαφή με το κονίδιο αμέσως μετά την απόθεσή του. Τα μακροφάγα έχουν την ικανότητα να συλλέγουν δειγματοληπτικά με βάση τη φύση των εισβαλλόντων μικροοργανισμών ορισμένους από αυτούς, με τη βοήθεια ειδικών πρωτεϊνών της μεμβράνης τους που προαναφέθηκαν και είναι γνωστοί ως TLR. Οι TLR θεωρούνται ότι είναι οι κύριοι υποδοχείς της αντιμικροβιακής άμυνας. Σήμερα, η οικογένεια των TLR αποτελείται από έντεκα μέλη. Ο κάθε TLR αναγνωρίζει μια ποικιλία από μοριακές δομές που προέρχονται από μικροοργανισμούς (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Τέτοια μοτίβα απαντώνται στα συστατικά που αποτελούν το κυτταρικό τοίχωμα των μικροοργανισμών, σε λειτουργικές πρωτεΐνες που εκφράζονται κατά την έναρξη και διάρκεια της λοίμωξης, σε νουκλεϊκά οξέα, ή και σε χημικές ουσίες πού εκκρίνονται από αυτούς (Beutler και συν 2003). Οι TLR ενεργοποιούνται μόλις κάποια μικροβιακή ουσία δεσμευτεί στην εξωκυττάρια περιοχή. Το σήμα προωθείται από τις κυτταροπλασματικές περιοχές των TLR σε πρωτεΐνες-προσαρμογείς. Οι πρωτεΐνες αυτές, ενεργοποιούν μία σειρά από κλιμακωτές αντιδράσεις στο κύτταρο που καταλήγουν στην παραγωγή κυτταροκινών, ή και στην ενεργοποίηση περαιτέρω αντιδράσεων, όπως είναι η φαγοκυττάρωση (Takeda και συν 2001). Μία από αυτές τις πρωτεΐνες-προσαρμογείς είναι η MyD88 (Myeloid Differentiation factor 88), η οποία μεσολαβεί στην προώθηση μίας αλληλουχίας σημάτων που καταλήγει στην μεταφορά του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB (nuclear factor-κβ) από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, επιτρέποντας την παραγωγή κυτταροκινών (Mambula και συν 2002). Όλοι οι TLR μόλις ενεργοποιηθούν, κινητοποιούν συγκεκριμένες αντιδράσεις στον οργανισμό, όπως είναι η φλεγμονή. Ο κάθε TLR ενεργοποιεί ταυτόχρονα και πιο ειδικές αντιδράσεις, οι οποίες είναι είτε MyD88-εξαρτώμενες είτε MyD88-ανεξάρτητες, οι οποίες είναι υπό έρευνα. 56

59 Όσον αφορά τον A. fumigatus, έχει βρεθεί ότι τα μονοκύτταρα «αντιλαμβάνονται» τις υφές του μέσω των TLR4 και των CD14. Πιθανολογείται ότι διαφορετικοί TLRs ενεργοποιούνται από διαφορετικές μορφές του ίδιου μύκητα, κάτι που ίσως να οφείλεται στο ότι μπορεί κατά τη μορφολογική αλλαγή του μύκητα από κονίδιο σε υφές, κάποια συστατικά του κυτταρικού τοιχώματός του να ανακατατάσσονται και να γίνονται πιο «εμφανή» (Marr και συν 2003). Τα μακροφάγα απαντούν στα κονίδια του A. fumigatus μέσω του TLR4 με παραγωγή προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως TNF-α, IL-1α και IL-1β, κάτι που δεν συμβαίνει και με τις υφές. Το ίδιο ισχύει και στην περίπτωση του TLR2, μόνο που το αποτέλεσμα αυτό δεν χάνεται κατά τη μορφολογική αλλαγή του μύκητα από κονίδιο σε υφή. Επίσης, μετά από ενεργοποίηση του TLR2 παράγεται και IL-10, όμως μόνο σε απάντηση στις υφές και όχι στα κονίδια του A. fumigatus (Netea και συν 2003). Αυτή η διαφορά υποδηλώνει και υποδεικνύει ότι η μετάβαση από κονίδιο σε υφή στον A. fumigatus, ίσως να αποτελεί έναν μηχανισμό αποφυγής της ανοσιακής απάντησης του ξενιστή (Σχήμα 10). Σχήμα 10: Σχηματική απεικόνιση της ενεργοποίησης της MyD88-εξαρτώμενης οδού. Η αναγνώριση των μοριακών μοτίφ που συσχετίζονται με την παθογονικότητα (pathogenassociated molecular patterns, PAMPs) του κάθε μύκητα από τους TLR υποδοχείς, οδηγεί στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης-προσαρμογέα MyD88. Αυτή, με τη σειρά της ενεργοποιεί την αντιμυκητιακή δράση των φαγοκυττάρων. Συγκεκριμένα, προάγει την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών, προάγει την παραγωγή IL-12 από δενδριτικά κύτταρα και καταλήγει στην οξειδωτική έκρηξη και στην αποκοκκίωση (Mambula και συν 2002). 57