ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΕΥΚΑΙΡΙΑΚΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΘΕΟΔΟΥΛΗ ΠΑΠΑΣΤΑΥΡΟΥ-ΜΑΥΡΟΥΔΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ 2690 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΕΥΚΑΙΡΙΑΚΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ Θεοδούλη Στεργιοπούλου ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΡΟΗΛΙΔΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής ΑΠΘ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΙΔΟΥ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΑΠΘ ΙΩΑΝΝΗΣ ΤΣΙΟΥΡΗΣ Καθηγητής ΑΠΘ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΡΟΗΛΙΔΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής ΑΠΘ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΙΔΟΥ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΑΠΘ ΙΩΑΝΝΗΣ ΤΣΙΟΥΡΗΣ Καθηγητής ΑΠΘ ΙΩΣΗΦ ΜΕΛΕΤΙΑΔΗΣ Λέκτορας Πανεπιστημίου Αθηνών ΤΙΜΟΛΕΩΝ- ΑΧΙΛΛΕΑΣ ΒΥΖΑΝΤΙΑΔΗΣ Λέκτορας ΑΠΘ ΜΑΛΑΜΑΤΕΝΙΑ ΑΡΒΑΝΙΤΙΔΟΥ- ΒΑΓΙΩΝΑ Καθηγήτρια ΑΠΘ ΘΕΟΔΟΥΛΗ ΠΑΠΑΣΤΑΥΡΟΥ- ΜΑΥΡΟΥΔΗ Καθηγήτρια ΑΠΘ 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 3

4 Στους γονείς μου 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... 8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΚΥΡΙΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ...18 Αντιμυκητιακά φάρμακα...20 Μη αντιμυκητιακά φάρμακα με αντιμυκητιακή δράση...22 Φθοριοκινολόνες...24 In vitro επίδραση των κινολονών στη δράση των αντιμυκητιακών φαρμάκων...30 In vivo επίδραση των κινολονών στη δράση των αντιμυκητιακών φαρμάκων...34 Κυκλοσπορίνη...37 Ο ρόλος των ουδετεροφίλων κατά των διεισδυτικών μυκητιακών λοιμώξεων...41 Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΕΝΑΝΤΙΟΝ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ...44 ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ...45 ΚΛΑΣΣΙΚΑ ΚΑΙ ΝΕΑ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ...48 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...54 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...57 Στελέχη...57 Πειράματα προσδιορισμού ελάχιστης ανασταλτικής δράσης με φαρμακευτικούς συνδυασμούς ) Πειράματα συνδυασμών σιπροφλοξασίνης, μοξιφλοξασίνης και λεβοφλοξασίνης με αντιμυκητιακά φάρμακα

6 2) Πειράματα συνδυασμού κυκλοσπορίνης με σιπροφλοξασίνη και αμφοτερικίνη Β εναντίον της C. albicans και του Α. fumigatus...62 Πειράματα συνδυασμού ουδετεροφίλων με αμφοτερικίνη Β και σιπροφλοξασίνη εναντίον του A. fumigatus...63 Α) Απομόνωση ουδετεροφίλων...63 B) Προσδιορισμός της αλληλεπίδρασης ουδετεροφίλων με σιπροφλοξασίνη και αμφοτερικίνη Β εναντίον του A. fumigatus...64 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ...66 Α) Δείκτης κλασματικής ανασταλτικής συγκέντρωσης...67 Β) Ισομπολογραφικό μαθηματικό μοντέλο...68 I) Γραμμική ανάλυση...68 II) Ανάλυση της αλληλεπίδρασης των φαρμάκων...69 Γ) Εφαρμογή του μαθηματικού μοντέλου Bliss...71 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...73 Πειράματα συνδυασμού σιπροφλοξασίνης, μοξιφλοξασίνης και λεβοφλοξασίνης με αντιμυκητιακά φάρμακα...73 Προσδιορισμός των ΜIC των αντιμυκητιακών φαρμάκων...73 Φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις των συνδυασμών μεταξύ φθοριοκινολονών και αντιμυκητιακών φαρμάκων εναντίον της C. albicans...73 Σύγκριση της φαρμακοδυναμικής αποτελεσματικότητας μεταξύ των συνδυασμών εναντίον της C. albicans...76 Φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις των συνδυασμών μεταξύ φθοριοκινολονών και αντιμυκητιακών φαρμάκων εναντίον του Α. fumigatus...77 Σύγκριση της φαρμακοδυναμικής αποτελεσματικότητας μεταξύ των συνδυασμών εναντίον του A. fumigatus...79 Πειράματα συνδυασμού κυκλοσπορίνης με σιπροφλοξασίνη και αμφοτερικίνη Β εναντίον της C. albicans και του Α. fumigatus...80 Πειράματα συνδυασμού ουδετεροφίλων με αμφοτερικίνη Β και σιπροφλοξασίνη εναντίον του A. fumigatus

7 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...85 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΒ ΒΡ ΚΛ ΚΦ ΦΛ ABCD Αμφοτερικίνη Βορικοναζόλη Κυκλοσπορίνη Κασποφουγκίνη Φλουκοναζόλη Amphotericin B colloidal dispersion, κολλοειδικό διάλυμα αμφοτερικίνης Β ABLC Amphotericin B lipid complex, λιπιδιακό σύμπλεγμα αμφοτερικίνης Β ATTC CIP, ΣΠ CLSI American Type Culture Collection Σιπροφλοξασίνη Clinical and Laboratory Standard Institute, Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων DAMB FIC Deoxycholate amphotericin B, δεοξυχολική αμφοτερικίνη B Fractional Inhibitory Concentration, Κλασματικός Δείκτης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης IFN-γ IL LAMB LEV, ΛΒ MCP-1 Interferon-γ, Ιντερφερόνη-γ Interleukin, Ιντερλευκίνη Liposomal amphotericin B, λιποσωματική αμφοτερικίνη B Λεβοφλοξασίνη Monocyte chemoattractant protein-1, χημειοτακτική πρωτεϊνη των μονοκυττάρων-1 8

9 MIC Μinimal Ιnhibitory Concentration, Eλάχιστη Aνασταλτική Συγκέντρωση MOX, ΜΞ MRP NCCLS Μοξιφλοξασίνη Multidrug resistance proteins National Committee for Clinical Laboratory Standards, Κρατική Επιτροπή Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων OD PMNs οπτική πυκνότητα Ουδετερόφιλα RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute, ειδικό καλλιεργητικό υλικό κυττάρων SAAMF TLR TNF-α XTT Synthetic Amino Acid Medium- Fungal Toll-like receptors, Toll-like υποδοχείς Tumor necrosis factor-α, Παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α Τetrazolium salt 2, 3-bis {2-methoxy-4-nitro-5-[(sulfenylamino) carbonyl]-2h-tetrazolium-hydroxide}, χρωματομετρική μέθοδος ανίχνευσης της καταστροφής των υφών YNB Yeast nitrogen base, αζωτούχος βάση ζύμης 9

10 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η συχνότητα των διεισδυτικών μυκητιάσεων έχει αυξηθεί σημαντικά τις δύο τελευταίες δεκαετίες σε ασθενείς κάθε ηλικίας. Αυτό οφείλεται κυρίως στην αύξηση του αριθμού ανοσοκατασταλμένων ασθενών, λόγω χημειοθεραπείας για την αντιμετώπιση κακοηθειών και λόγω της χρήσης άλλων ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων (π.χ. κορτικοστεροειδών, κυκλοσπορίνης) για την αποφυγή απόρριψης μοσχευμάτων. Οι πιο συχνές διεισδυτικές μυκητιάσεις που αντιμετωπίζουν οι ανοσοκατασταλμένοι ασθενείς οφείλονται στα είδη Candida και στα είδη Aspergillus. Η Candida albicans αποτελεί το 49-53% των καντινταιμιών σύμφωνα με δύο μελέτες στην Ευρώπη. Οι διεισδυτικές ασπεργιλλώσεις από τον Aspergillus fumigatus αποτελούν το 80-90% όλων των διεισδυτικών μυκητιάσεων από είδη Ασπεργίλλου. Παρά το γεγονός ότι η χρήση μονοθεραπευτικών σχημάτων συνέβαλε σημαντικά στην καταπολέμηση των μυκητιακών λοιμώξεων στα παιδιά, η θεραπεία τους εξακολουθεί να προβληματίζει την ιατρική κοινότητα. Ο περιορισμός ανεπιθύμητων ενεργειών ορισμένων αντιμυκητιακών φαρμάκων και η ανάγκη για αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των μυκητιάσεων, οδηγεί στην αναζήτηση συνδυασμών όχι μόνο των αντιμυκητιακών φαρμάκων μεταξύ τους, αλλά και με άλλες κατηγορίες φαρμάκων. Μία από αυτές τις κατηγορίες φαρμάκων, που προσελκύει το ενδιαφέρον των ερευνητών, είναι οι φθοριοκινολόνες. Αν και οι κινολόνες είναι αντιβακτηριακά φάρμακα, υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν ότι ο 10

11 συνδυασμός τους με αντιμυκητιακά φάρμακα ενισχύει την αντιμυκητιακή δράση των τελευταίων. Αυτό ίσως να οφείλεται στο γεγονός ότι δρουν ως αναστολείς της DNA γυράσης, τοποϊσομεράσης τύπου ΙΙ των μυκήτων. Πιθανή συνεργική δράση των αντιμυκητιακών φαρμάκων με τις φθοριοκινολόνες στην αναστολή της ανάπτυξης της C. albicans και του A. fumigatus είναι σημαντική καθώς συχνά οι ανοσοκατασταλμένοι ασθενείς είναι σε φαρμακευτική αγωγή και με τις δύο αυτές κατηγορίες φαρμάκων. Καθώς η ανοσοκαταστολή επιτυγχάνεται με ανοσοκατασταλτικά φάρμακα, όπως η κυκλοσπορίνη, είναι ενδιαφέρον να μελετηθεί η αλληλεπίδραση των αντιμυκητιακών φαρμάκων και των φθοριοκινολονών με τα φάρμακα αυτά. Μία μερίδα ανοσοκατασταλμένων ασθενών είναι ουδετεροπενικοί μετά από κυτταροτοξική αγωγή ή λόγω συγγενών διαταραχών. Οι ασθενείς αυτοi στερούνται την παρουσία ουδετεροφίλων. Τα ουδετερόφιλα είναι σημαντικοί παράγοντες του ανοσοποιητικού συστήματας που συντελούν σημαντικά στη φαγοκυττάρωση των υφών των μυκήτων. Το κατά πόσο η παρουσία των ουδετεροφίλων μπορεί να ενισχύσει την αλληλεπίδραση των συνδυασμών αντιμυκητιακών φαρμάκων με τις φθοριοκινολόνες αποτελεί ένα από τα υπό μελέτη θέματα της παρούσας διδακτορικής εργασίας. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής εργασίας είναι: 1) η φαρμακοδυναμική μελέτη μεταξύ των πλέον χρησιμοποιούμενων στην κλινική πράξη αντιμυκητιακών φαρμάκων και φθοριοκινολονών εναντίον της C. albicans και του A. fumigatus 11

12 2) η φαρμακοδυναμική μελέτη των συνδυασμών αυτών παρουσία κυκλοσπορίνης εναντίον των ίδιων οργανισμών 3) η μελέτη του τριπλού συνδυασμού ουδετεροφίλων με σιπροφλοξασίνη και αμφοτερικίνη Β εναντίον του A. fumigatus. Η διδακτορική μελέτη χωρίζεται σε δύο μέρη: Α) Γενικό μέρος. Στο γενικό μέρος αρχικά επιχειρείται μία αναφορά στη βασική μορφολογία των μυκήτων και σε δύο κύριους παράγοντες που συμβάλλουν στην αντιμετώπιση των διεισδυτικών μυκητιάσεων: i. των φαρμάκων με αντιμυκητιακή δράση. Περιγράφονται οι κύριες κατηγορίες των αντιμυκητιακών φαρμάκων, αλλά και τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται κυρίως για την αντιμετώπιση άλλων παθολογικών καταστάσεων που όμως μπορούν να αναστείλουν μερικώς και την ανάπτυξη ορισμένων μυκήτων ii. της δράσης των ουδετεροφίλων, βασικών συστατικών της φυσικής ανοσίας Ακολουθεί σχολιασμός της σημασίας της μελέτης των φαρμακευτικών συνδυασμών, αλλά και της σημασίας των μαθηματικών μοντέλων που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση τους. Β) Ειδικό μέρος. Στο ειδικό μέρος αναφέρονται τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν και ο τρόπος απόκτησης ή παρασκευής τους, οι εργαστηριακές μέθοδοι που εφαρμόστηκαν, η στατιστική ανάλυση που έγινε και τέλος τα αποτελέσματα της μελέτης. Ακολουθεί η συζήτηση των 12

13 αποτελεσμάτων με την αναφορά στοιχείων από τη διεθνή βιβλιογραφία και διατυπώνονται τα συμπεράσματα της μελέτης. Στο τελευταίο τμήμα της διατριβής παρατίθεται η περίληψη στην Ελληνική και Αγγλική γλώσσα και η βιβλιογραφία. 13

14 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου προς όλους όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής: Ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή του ΑΠΘ κ. Εμμανουήλ Ροηλίδη και τον Διευθυντή του Immunocompromised Host Section, Pediatric Oncology Branch of National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA κ. Thomas J. Walsh, οι οποίοι υπήρξαν μέντορές μου στον τομέα της έρευνας. Στον κ. Εμμανουήλ Ροηλίδη, οφείλω την αγάπη και την ενασχόληση με την έρευνα και τον ευχαριστώ θερμά για τη συνεχή ερευνητική καθοδήγηση. Στον κ. Thomas J. Walsh οφείλω την εξέλιξή μου στον ερευνητικό τομέα, καθώς είχα την ευκαιρία να δουλέψω σε ένα από τα πιο γνωστά διεθνώς εργαστήρια στον τομέα των λοιμώξεων. Τον Λέκτορα Μυκητολογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών Ιωσήφ Μελετιάδη, ο οποίος μου μετέδωσε την εργαστηριακή εμπειρία του και με στήριξε σε όλη τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής. Τον Καθηγητή και πρώην Διευθυντή της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Ιωάννη Τσιούρη για την ανάθεση του θέματος και τη συμπαράστασή του στην ολοκλήρωση της μελέτης. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παρασκευή Παπαϊωαννίδου του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ για τη θερμή υποστήριξή της και την ουσιαστική συμβολή της στη διόρθωση των κειμένων. 14

15 Την Καθηγήτρια και νυν Διευθύντρια της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Παπασταύρου-Μαυρουδή Θεοδούλη για την υποστήριξη και τις συμβουλές της κατά την εκπόνηση της διατριβής. Tον Λέκτορα Μικροβιολογίας του ΑΠΘ κ. Τιμολέοντα-Αχιλλέα Βυζαντιάδη και την Καθηγήτρια του Εργαστηρίου Υγιεινής του ΑΠΘ κ. Μαλαματένια Αρβανιτίδου-Βαγιωνά για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους και τη συμμετοχή τους στην επταμελή επιτροπή. 15

16 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 16

17 17

18 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΚΥΡΙΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ Οι μύκητες είναι ευκαρυωτικοί οργανισμοί και τα κύτταρα τους έχουν τουλάχιστον έναν πυρήνα. Περιβάλλονται εκτός από την κυτταρική τους μεμβράνη και από κυτταρικό τοίχωμα. Η κυτταρική μεμβράνη τους περιέχει στερόλες και όχι πεπτιδογλυκάνες. Το κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται από πολυσακχαρίτες, γλυκοπρωτεΐνες και λιπίδια. Στο κυτταρόπλασμα εντοπίζονται μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο και σωματίδια Golgi (1-4) (Σχήμα 1). Κυτταρικό τοίχωμα Μιτοχόνδρια Κενοτόπιο Πυρήνας Κυτταρική μεμβράνη Κυτταρόπλασμα Σχήμα 1. Αναπαράσταση κυττάρου ζυμομύκητα με τα οργανύλλια στο εσωτερικό του. Οι μύκητες κατατάσσονται σε δύο βασικές κατηγορίες: α) ζυμομύκητες (yeasts) με κύριο εκπρόσωπο την Candida και β) νηματοειδείς μύκητες (moulds) με κύριο εκπρόσωπο τους Aspergillus, Zygomycetes, Fusarium, 18

19 Scedosporium και Τrichophyton. Οι ζυμομύκητες έχουν σφαιρικό ή ελλειψοειδές σχήμα και πολλαπλασιάζονται με σχηματισμό εκβλαστήσεων (budding) (Σχήμα 2). Κενοτόπιο Αναπτυσσόμενο άκρο Πυρήνες Κυτταρικό τοίχωμα Κυτταρική μεμβράνη Golgi σύστημα Μιτοχόνδριο Αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο Πυρήνας Σχήμα 2. Υφή νηματοειδούς μύκητα και απεικόνιση των οργανυλλίων του αναπτυσσόμενου άκρου. Oι νηματοειδείς μύκητες σχηματίζουν πολυκυττάριες νηματοειδείς αποικίες που αποτελούνται από διακλαδιζόμενους κυλινδρικούς σωληνίσκους (διαμέτρου 2-10 μm), που λέγονται υφές (hyphae). Τα κύτταρα που αποτελούν τις υφές μπορεί να χωρίζονται ή όχι μεταξύ τους με διαφράγματα, π.χ Aspergillus και Zygomycetes, αντίστοιχα. Οι συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις αποτελούν μία από τις σημαντικότερες αιτίες για την αύξηση της θνητότητας στους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς κάθε ηλικίας (5, 6). Η αντιμετώπισή τους 19

20 αποτελεί μεγάλο πρόβλημα στα παιδιά που λαμβάνουν χημειοθεραπεία για την καταπολέμηση όγκων, που βρίσκονται στο στάδιο ανοσοκαταστολής μετά από μεταμόσχευση πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων και που αντιμετωπίζουν κακοήθειες του αίματος ή άλλες μορφές πρωτοπαθών ή επίκτητων ανοσολογικών ανεπαρκειών (7, 8). Η αύξηση του αριθμού των ασθενών με διεισδυτικές μυκητιάσεις (9, 10) και η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα αντιμυκητιακά φάρμακα (11, 12) οδήγησε στην ανάγκη για μελέτη των παραγόντων που συντελούν στην αντιμετώπισή τους: i) των νέων αντιμυκητιακών φαρμάκων ή φαρμάκων που συντελούν στην αντιμυκητιακή αγωγή και τη μελέτη συνδυασμών τους και ii) των παραγόντων του ανοσοποιητικού συστήματος που στρέφονται κατά της ανάπτυξης των μυκήτων. Αντιμυκητιακά φάρμακα Οι σημαντικότερες κατηγορίες αντιμυκητιακών φαρμάκων που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των διεισδυτικών μυκητιάσεων (13) είναι οι ακόλουθες: 1. Πολυένια, όπως αμφοτερικίνη, νυστατίνη. Εκτός από τη συμβατική δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β (DAMB, Fungizone ), υπάρχουν σήμερα και τρία λιπιδιακά φαρμακευτικά είδη αμφοτερικίνης Β, η λιποσωματική αμφοτερικίνη Β (LAMB, Ambisome ), η αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδιακών συμπλεγμάτων (ABLC, Abelcet ) και η αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδιακού κολλοειδούς (ABCD, Amphocil ). 20

21 2. Αζόλια, όπως τα παλαιότερα ιμιδαζόλες μικοναζόλη, κετοκοναζόλη και κλοτριμαζόλη, τα τριαζόλια α γενιάς φλουκοναζόλη και ιτρακοναζόλη και τα τριαζόλια β γενιάς βορικοναζόλη, ποσακοναζόλη και ραβουκοναζόλη. 3. Εχινοκανδίνες, που περιλαμβάνουν την κασποφουγκίνη, μικαφουγκίνη και ανιδουλαφουγκίνη. Τα παραπάνω αντιμυκητιακά φάρμακα δρουν σε συγκεκριμένους στόχους στη δομή και το μεταβολισμό του μύκητα (Σχήμα 3). Η αμφοτερικίνη δρα στην εργοστερόλη, δημιουργεί πόρους στην κυτταρική μεμβράνη των μυκήτων, με αποτέλεσμα την έξοδο στοιχείων από το κύτταρο και τον κυτταρικό θάνατο. Τα αζόλια αναστέλλουν την C14-α-απομεθυλάση, προκαλώντας έτσι αναστολή του σχηματισμού της εργοστερόλης και καταστροφή της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων. Τέλος, οι εχινοκανδίνες αναστέλλουν τη σύνθεση της β-(1,3)-d-γλυκάνη, οδηγώντας στη διακοπή της δομής του κυτταρικού τοιχώματος, σε οσμωτική αστάθεια και τελική λύση του κυττάρου του μύκητα. Η επιλογή των αντιμυκητιακών φαρμάκων γίνεται με βάση το αντιμυκητιακό τους φάσμα, αν χρησιμοποιούνται σαν προφυλακτική ή θεραπευτική αγωγή, την κλινική εικόνα του ασθενούς και την αποφυγή συγκεκριμένων παρενεργειών που μπορεί να προκαλέσουν ορισμένες κατηγορίες αντιμυκητιακών φαρμάκων. 21

22 Κύτταρο μύκητα Κυτταρική μεμβράνη και κυτταρικό τοίχωμα Μανοπρωτεΐνες β- (1,6) - γλυκάνη β- (1,3) - γλυκάνη Χιτίνη Φωσφολιπιδική στοιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης Εργοστερόλη β - (1,3) γλυκανική συνθάση Σύνθεση εργοστερόλης Πολυένια Εχινοκανδίνες DNA/RNA Σύνθεση Αζόλια Σχήμα 3. Σχηματική απεικόνιση της δράσης των πολυενίων και των αζoλίων στην κυτταρική μεμβράνη και των εχινοκανδινών στο κυτταρικό τοίχωμα. Μη αντιμυκητιακά φάρμακα με αντιμυκητιακή δράση Στη βιβλιογραφία ο όρος «μη αντιμυκητιακά φάρμακα με αντιμυκητιακή δράση» χρησιμοποιείται ως παράδοξο για να περιγράψει μία ομάδα φαρμάκων που χρησιμοποιούνται κυρίως για την αντιμετώπιση άλλων παθολογικών καταστάσεων, αλλά παρατηρήθηκε ότι μπορούν να αναστείλουν μερικώς και την ανάπτυξη ορισμένων μυκήτων (14). Τέτοιου είδους φάρμακα που έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία μέχρι στιγμής είναι αντιψυχωσικά φάρμακα, β- αποκλειστές και αντιαρρυθμικά φάρμακα, αναστολείς της αντλίας των 22

23 πρωτονίων, αντινεοπλασματικά φάρμακα, ανοσοκατασταλτικά φάρμακα, αντιβακτηριακά φάρμακα και αντιπαρασιτικά φάρμακα (Πίνακας 1). Κάποια από τα φάρμακα αυτά δρουν τροποποιώντας μηχανισμούς των ανθρώπινων ευκαρυωτικών κυττάρων. Καθώς τα κύτταρα των μυκήτων είναι ευκαρυωτικά, μπορεί να διαθέτουν κοινούς μηχανισμούς με τα ανθρώπινα κύτταρα (14). Αυτό σημαίνει ότι ίσως τα παραπάνω φάρμακα να μπορούν να παρέμβουν με ίδιο τρόπο και στα κύτταρα των μυκήτων αναστέλλοντας έτσι τη μυκητιακή ανάπτυξη. Τέτοιοι κοινοί μηχανισμοί, στους οποίους ίσως τα φάρμακα με την έμμεση αντιμυκητιακή δράση μπορεί να παρεμβαίνουν, είναι: i) η λειτουργία των αντλιών του ασβεστίου που μπορεί να αναστείλουν οι β- blockers, τα αντιαρρυθμικά φάρμακα, οι αναστολείς της αντλίας των πρωτονίων, τα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα και τα αντιπαρασιτικά φάρμακα ii) ο διπλασιασμός και η δημιουργία του DNA, όπου μπορεί να παρεμβαίνουν τα αντινεοπλασματικά φάρμακα. Κατά ανάλογο τρόπο, σε περιπτώσεις που τα προκαρυωτικά κύτταρα έχουν παρόμοιες κυτταρικές ουσίες με τα κύτταρα των μυκήτων, φάρμακα που αναστέλλουν την ανάπτυξη των προκαρυωτικών οργανισμών αναστέλλουν και τη μυκητιακή ανάπτυξη π.χ φθοριοκινολόνες. Το γεγονός ότι μη αντιμυκητιακά φάρμακα μπορούν να επιδείξουν αντιμυκητιακή δράση, καθιστά ενδιαφέρουσα τη μελέτη της δράσης τους μόνων τους ή σε συνδυασμό με άλλα αντιμυκητιακά φάρμακα εναντίον μυκήτων που προκαλούν θανατηφόρες διεισδυτικές μυκητιάσεις. Στην παρούσα διδακτορική εργασία, από τα μη αντιμυκητιακά φάρμακα με αντιμυκητιακή δράση μελετώνται οι φθοριοκινολόνες και η κυκλοσπορίνη. 23

24 Πίνακας 1. Μη αντιμυκητιακά φάρμακα με αντιμυκητιακή δράση ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΦΑΡΜΑΚΑ Ανοσοκατασταλτικά κυκλοσπορίνη, τακρόλιμους, σιρόλιμους Αντιβακτηριακά Αναστολείς της φθοριοκινολόνες, μακρολίδια, ριφαμπικίνη, κοτριμοξαζόλη λανσοπραζόλη, ομεπραζόλη αντλίας πρωτονίων Αντινεοπλασματικά Αντιψυχωσικά β-αποκλειστές και αντιαρρυθμικά μεθοτρεξάτη, κυκλοφωσφαμίδη, μπλεομυκίνη, σισπλατίνη χλωροπρομαζίνη, τριφθοριοπεραζίνη, φλουναζίνη προπρανόλη, σιναριζίνη, βεραπαμίλη, νιφεδιπίνη, νιμοδιπίνη, λιδοκαΐνη φάρμακα Αντιπαρασιτικά Άλλα φάρμακα πενταμιδίνη, κινακρίνη, χλωροκίνη ιμπουπροφένη, στατίνες, οξείδιο του αζώτου Φθοριοκινολόνες Οι φθοριοκινολόνες είναι μία από τις σημαντικότερες κατηγορίες αντιμικροβιακών φαρμάκων που χρησιμοποιούνται παγκοσμίως. Ανακαλύφθηκαν το 1962, αλλά άρχισαν να χρησιμοποιούνται ευρέως τη δεκαετία του

25 Η αντιβακτηριακή χρήση των κινολονών οφείλεται στην αναστολή της DNA γυράσης, τύπου II τοποϊσομεράσης, και στην αναστολή της τοποϊσομεράσης τύπου ΙV (15-17). Οι τοποϊσομεράσες είναι ένζυμα που εμποδίζουν την υπερσυσπείρωση του DNA, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στο διπλασιασμό και στη μετάφραση του DNA (Σχήμα 4). Καθένα από τα ένζυμα αυτά αποτελείται από ένα τετραμερές που απαρτίζεται από δύο μονάδες: η DNA γυράση αποτελείται από τις υποομάδες gyra και gyrb και η τοποϊσομεράση IV αποτελείται από τις υποομάδες ParC και ParE. Διαφορετική προσκόλληση των φθοριοκινολονών στις δύο αυτές τοποϊσομεράσες επηρεάζει και την αντιβακτηριακή αποτελεσματικότητα τους. Από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες φθοριοκινολόνες είναι η σιπροφλοξασίνη, η μοξιφλοξασίνη και η λεβοφλοξασίνη (15, 17) (Σχήμα 5). Η σιπροφλοξασίνη είναι φθοριοκινολόνη που ανήκει στη δεύτερη γενιά φθοριοκινολονών. Άρχισε να χρησιμοποιείται ευρέως στις αρχές τις δεκαετίας του 80. Η λεβοφλοξασίνη και η μοξιφλοξασίνη ανήκουν στην τρίτη γενιά φθοριοκινολονών και κυκλοφόρησαν το 1997 και το 2000, αντίστοιχα. Η σιπροφλοξασίνη έχει καλύτερη αντιμικροβιακή δράση εναντίον των Gram αρνητικών βακτηρίων σε σχέση με τις νεώτερες φθοριοκινολόνες, ενώ η λεβοφλοξασίνη και η μοξιφλοξασίνη έχουν καλύτερη αποτελεσματικότητα εναντίον των Gram θετικών μικροβίων (15, 17). 25

26 Fluoroquinolones inhibit Α Σχήμα 4. Α) Οι φθοριοκινολόνες αναστέλλουν τη λειτουργία i) της DNA γυράσης, τοποϊσομεράσης τύπου II και ii) της τοποϊσομεράσης τύπου ΙV. Καθένα από τα ένζυμα αυτά αποτελείται από ένα τετραμερές που απαρτίζεται από δύο μονάδες: η DNA γυράση αποτελείται από τις υποομάδες gyra και gyrb και η τοποϊσομεράση IV αποτελείται από τις υποομάδες ParC και ParE. Β) Οι φθοριοκινολόνες δρουν εναντίον των Gram (-) και Gram (+) βακτηρίων αναστέλλοντας τη σύνθεση του DNA μέσω της δράσης τους στην DNA γυράση τύπου II και στην τοποϊσομεράση τύπου ΙV. Β 26

27 Σιπροφλοξασίνη Λεβοφλοξασίνη Μοξιφλοξασίνη Σχήμα 5. Σχηματική παράσταση της χημικής δομής της σιπροφλοξασίνης, λεβοφλοξασίνης και μοξιφλοξασίνης. Το γεγονός ότι στους μύκητες εντοπίστηκε τοποϊσομεράση παρόμοια με την DNA γυράση των βακτηρίων (18) οδήγησε στην υπόθεση ότι πιθανόν οι φθοριοκινολόνες να έχουν δράση και κατά των μυκήτων (19, 20). Έτσι άρχισαν οι πρώτες μελέτες για πιθανή αντιμυκητιακή δράση των φθοριοκινολονών μόνες τους ή σε συνδυασμό με άλλα αντιμυκητιακά φάρμακα. Ενδιαφέρουσες είναι και οι μελέτες σχετικά με την επίδραση των κινολονών στους διάφορους υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης. Ίσως μέρος της ερμηνείας για τη συνεργική δράση, που παρατηρείται μεταξύ κινολονών και αντιμυκητιακών φαρμάκων, να είναι ο συνδυασμός της δράσης τους σε υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης. Σε μία μελέτη με τη βοήθεια της χρωστικής ροδαμίνης παρατηρήθηκε ότι παρουσία των κινολονών 27

28 οξυφλοξασίνη ή γκρεπαφλοξασίνη αυξάνεται η συγκέντρωση της φλουκοναζόλης μέσα στα κύτταρα ανθεκτικού στελέχους C. albicans (21). Η ροδαμίνη είναι καλός δείκτης έκφρασης της εμφάνισης αντλιών στην κυτταρική μεμβράνη, οι οποίες αντλούν τα αζόλια έξω από τα κύτταρα, καθώς και η ίδια αντλείται από αυτές. Όταν επωάστηκαν τα κύτταρα του ανθεκτικού στελέχους της C. albicans παρουσία της φλουκοναζόλης, δεν υπήρξε καμία διαφορά στην ενδοκυττάρια ροδαμίνη. Αντίθετα, η ενδοκυττάρια ροδαμίνη αυξήθηκε κατά 86% παρουσία οξυφλοξασίνης ή γκρεπαφλοξασίνης. Σε ευαίσθητο στέλεχος στη φλουκοναζόλη, το οποίο δεν εκφράζει αντλίες εκροής (efflux pumps) του φαρμάκου, δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά της ενδοκυττάριας φλουκοναζόλης παρουσία κάποιας από τις δύο κινολόνες. Ενδιαφέρον παρουσιάζει και ο ρόλος συγκεκριμένων υποδοχέων της κυτταρικής μεμβράνης, που ονομάζονται πρωτεΐνες σχετιζόμενες με την αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (multidrug resistance proteins, MRP), σε σχέση με τη σιπροφλοξασίνη (22). Η παρουσία άλλων φαρμάκων, όπως της προβενεσίδης και της κυκλοσπορίνης Α, που αποκλείουν αυτούς τους υποδοχείς, αυξάνουν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση της σιπροφλοξασίνης. Οι υποδοχείς αυτοί έχουν απομονωθεί και στην C. albicans (23). Οι φθοριοκινολόνες μπορούν να επηρεάζουν και μηχανισμούς του ανοσοποιητικού συστήματος (24). Μπορούν να επηρεάσουν την παραγωγή του ΤNF-α αλλά και άλλων κυτταροκινών, όπως των ιντερλευκινών. Χαρακτηριστική είναι η προστατευτική δράση που ασκεί η μοξιφλοξασίνη σε ανοσοκατασταλμένα ποντίκια που μολύνθηκαν στους πνεύμονες με C. 28

29 albicans. Στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκε ότι για 14 ημέρες είχαν μικρότερες συγκεντρώσεις κυτταροκινών TNF-α, IL-8 και ιντερφερόνης-γ (IFΝ-γ) σε σύγκριση με τις ομάδες των μολυσμένων με C. albicans ποντικιών που δεν λάμβαναν μοξιφλοξασίνη. Σε άλλη in vitro μελέτη παρατηρήθηκε ότι η μοξιφλοξασίνη είχε αντιφλεγμονώδη δράση σε ανθρώπινα μονοκύτταρα, που απομονώθηκαν από αίμα υγιών δοτών, και σε μονοκύτταρα κυτταρικής σειράς όταν επωάστηκαν μαζί με κονίδια του A. fumigatus (25). Τα επίπεδα συγκεντρώσεων των κυτταροκινών IL-8, ΙL-1β και TNF-α ήταν πιο υψηλά όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τον A. fumigatus χωρίς μοξιφλοξασίνη. Η επίδραση των φθοριοκινολονών στο ανοσοποιητικό σύστημα και ο επηρεασμός της λειτουργίας της φυσικής ανοσίας καθιστά αναγκαία τη διεξαγωγή περαιτέρω ερευνών. 29

30 In vitro επίδραση των κινολονών στη δράση των αντιμυκητιακών φαρμάκων Μέχρι σήμερα, καμία από τις χρησιμοποιούμενες στην κλινική πράξη κινολόνες δεν βρέθηκε να έχει προσδιορίσιμη ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (minimal inhibitory concentration, MIC) εναντίον της ανάπτυξης των μυκήτων, σε πειράματα ελέγχου ευαισθησίας στελεχών μυκήτων. Ο συνδυασμός τους, όμως, με άλλα αντιμυκητιακά φάρμακα φαίνεται να έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς παρατηρείται αύξηση της δραστικότητας ορισμένων αντιμυκητιακών σε συγκεκριμένους συνδυασμούς (20, 26-30). Αρκετές ερευνητικές ομάδες ασχολήθηκαν με την in vitro μελέτη του συνδυασμού αντιμυκητιακών με κινολόνες εναντίον των μυκήτων. Η αμφοτερικίνη Β και τρία αζόλια (μικοναζόλη, κετοκοναζόλη και ιτρακοναζόλη) συνδυάστηκαν ξεχωριστά με μία από τις τέσσερεις κινολόνες (ναλιδιξικό οξύ - που είναι η πρώτη κινολόνη που χρησιμοποιήθηκε κλινικά, νορφλοξασίνη, σιπροφλοξασίνη και ενοξασίνη) εναντίον της C. albicans (26). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων, που έγιναν χρησιμοποιώντας ως θρεπτικό υλικό στερεό άγαρ, στο οποίο διαλύθηκαν οι διάφορες συγκεντρώσεις των φαρμάκων σε συνδυασμούς, έδειξαν ότι καμία από τις κινολόνες σε χαμηλή συγκέντρωση δεν αυξάνει την αντιμυκητιακή δραστικότητα της αμφοτερικίνης Β. Σε υψηλές σχετικά συγκεντρώσεις του ναλιδιξικού οξέος και της ενοξασίνης παρατηρείται συνέργεια με αμφοτερικίνη Β, σε αντίθεση με υψηλές συγκεντρώσεις της νορφλοξασίνης ( μg/ml) και της σιπροφλοξασίνης (100 μg/ml) που παρατηρείται ανταγωνισμός. Οι συνδυασμοί όλων των αζολίων με χαμηλές συγκεντρώσεις όλων των 30

31 κινολονών, αλλά και με υψηλές συγκεντρώσεις της ενοξασίνης και του ναλιδιξικού οξέος, ήταν συνεργικοί. Αντίθετα, ανταγωνισμός παρατηρήθηκε στους συνδυασμούς των αζολίων με σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις της σιπροφλοξασίνης και της νορφλοξασίνης. Μείωση της δράσης της αμφοτερικίνης Β και της κετοκοναζόλης παρουσία νορφλοξασίνης (25 μg/ml) κατά της C. albicans αναφέρθηκε και σε άλλη δημοσίευση (31). Οι κινολόνες σιπροφλοξασίνη, ενοξασίνη και νορφλοξασίνη σε συνδυασμό με τη φλουκυτοσίνη, ένα αντιμυκητιακό φάρμακο που αναστέλλει την ομαλή παραγωγή νουκλεϊνικών οξέων των μυκητιακών κυττάρων, δεν είχαν κανένα επιπλέον αποτέλεσμα στην αναστολή της ανάπτυξης της C. αlbicans. Συνδυασμός in vitro της φλεροξασίνης με ιτρακοναζόλη ή φλουκοναζόλη, σε Casitone άγαρ, δεν αύξησε ούτε και μείωσε τη δραστικότητα των δύο αυτών αντιμυκητιακών φαρμάκων κατά της ανάπτυξης της C. albicans. Επιπρόσθετα, δεν παρατηρήθηκε ούτε συνέργεια ούτε ανταγωνισμός σε συνδυασμό με την αμφοτερικίνη Β. Ανταγωνισμός δεν παρατηρήθηκε ούτε σε υψηλές συγκεντρώσεις της φλεροξασίνης ( μg/ml), ενώ είχε διαπιστωθεί για αντίστοιχες συγκεντρώσεις της σιπροφλοξασίνης και νορφλοξασίνης. Η φλεροξασίνη με κετοκοναζόλη παρουσίασε συνεργική δράση κατά της ανάπτυξης της C. albicans (27). Εναντίον του ίδιου μύκητα, η οφλοξασίνη με τη φλουκοναζόλη δεν επέδειξαν ούτε συνέργεια ούτε ανταγωνισμό. Η τεχνική που εφαρμόστηκε σε αυτήν την μελέτη βασίστηκε στο πρωτόκολλο του Ινστιτούτου Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων των ΗΠΑ (Clinical and Laboratoty Standards 31

32 Institute, CLSI), προηγούμενως γνωστό ως Εθνικό Συμβούλιο για Κλινικά Εργαστηριακά Πρότυπα (National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS), για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας των μυκήτων στα αντιμυκητιακά φάρμακα (21). Ο Nakajima και λοιποί συγγραφείς συνδύασαν την DU-6859a, μία κινολόνη που ήταν υπό έρευνα και δεν είχε εισαχθεί στην κλινική πράξη, με την αμφοτερικίνη Β εναντίον της Candida albicans, της Candida tropicalis, της Candida krusei, της Candida glabrata, του Cryptococcus neoformans και του Aspergillus fumigatus (28). Η DU-6859a συνδυάστηκε και με τη φλουκοναζόλη εναντίον της C. albicans και C. tropicalis. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε τεχνική με διαλύσεις των φαρμάκων σε τρία διαφορετικά υγρά θρεπτικά υλικά σε πλάκες των 96 πηγαδιών. Τα υγρά θρεπτικά υλικά ήταν: yeast nitrogen base (YNB), συνθετικό μέσο για μύκητες εμπλουτισμένο με αμινοξέα (SAAMF) και RPMI 1640 με L-glutamine και 0,165 M MOPS. Έκπληξη προκάλεσε το γεγονός ότι τα αποτελέσματα εξαρτήθηκαν από το χρησιμοποιούμενο θρεπτικό μέσο. Ο συνδυασμός της DU-6859a με την αμφοτερικίνη Β εναντίον του Α. fumigatus σε YNB ήταν συνεργικός σε χαμηλές συγκεντρώσεις της DU-6859a και ανταγωνιστικός σε υψηλές συγκεντρώσεις της DU-6859a (πάνω από 25 μg/ml). O ίδιος συνδυασμός σε RPMI 1640 με L-glutamine και 0,165 M MOPS δεν είχε καμία δράση, ενώ πάλι σε υψηλές δόσεις της κινολόνης παρατηρήθηκε ανταγωνισμός. Συνεργικός ήταν και ο συνδυασμός της DU-6859a με αμφοτερικίνη Β σε ΥΝΒ εναντίον των C. albicans, C. tropicalis και Cr. neoformans. Ο συνδυασμός της DU- 32

33 6859a με φλουκοναζόλη σε ΥΝΒ και σε RPMI 1640 με L-glutamine και 0,165 M MOPS ήταν «αδιάφορος» εναντίον του A. fumigatus και Cr. neoformans, ενώ σε SAAMF ήταν συνεργικός εναντίον της C. albicans. Ένας ακόμα από τους συνδυασμούς κινολονών με αντιμυκητιακά, που μελετήθηκαν in vitro, είναι της τροβαφλοξασίνης με αμφοτερικίνη Β και της τροβαφλοξασίνης με φλουκοναζόλη εναντίον στελεχών της C. albicans, της C. tropicalis, του Cr. neoformans, του Α. fumigatus και του R. oryzae (20). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της έρευνας, που βασίστηκε στο πρωτόκολλο CLSI, η τροβαφλοξασίνη ούτε ενισχύει ούτε μειώνει τη δράση της αμφοτερικίνης Β και της φλουκοναζόλης για κανένα από τα είδη των μυκήτων που ελέγχθηκαν. Σε άλλη in vitro πειραματική εργασία, η αμφοτερικίνη Β συνδυάστηκε με φλουκυτοσίνη και σιπροφλοξασίνη και η ιτρακοναζόλη με σιπροφλοξασίνη, λεβοφλοξασίνη και λομεφλοξασίνη εναντίον της Exophiala spinifera, η οποία αποτελεί έναν από τους πιο επιθετικούς μύκητες για δημιουργία εκτεταμένων λοιμώξεων και ανήκει στην κατηγορία των Μελανομυκήτων (30). Η τεχνική και αυτής της μελέτης στηρίχτηκε στο πρωτόκολλο CLSI. Συνέργεια παρατηρήθηκε στους συνδυασμούς της ιτρακοναζόλης με σιπροφλοξασίνη, ιτρακοναζόλης με λεβοφλοξασίνη, αμφοτερικίνης Β με σιπροφλοξασίνη και αμφοτερικίνης Β με φλουκυτοσίνη. 33

34 In vivo επίδραση των κινολονών στη δράση των αντιμυκητιακών φαρμάκων Η μελέτη αντιμυκητιακών με κινολόνες επεκτάθηκε και in vivo σε πειραματόζωα. Σε ποντίκια με καντιντίαση από στέλεχος της C. albicans, η χρήση της φλεροξασίνης μαζί με αντιμυκητιακά φάρμακα δε συνετέλεσε στην επιμήκυνση του χρόνου επιβίωσης σε σύγκριση με τη χρήση των αντιμυκητιακών ως μοναδικών θεραπευτικών μέσων (27). Σε πειραματικό μοντέλο με ποντίκια που μολύνθηκαν με C. albicans ενδοφλέβια, η σύγχρονη χορήγηση της DU-6859a (25 mg/kg/day) με μη θεραπευτικές δόσεις αμφοτερικίνης Β (0,1 mg/kg/day) είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του χρόνου και του ποσοστού επιβίωσης σε σύγκριση με την ίδια δόση αμφοτερικίνης B όταν χορηγήθηκε ως μοναδικό φάρμακο. Το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και με τη συγχορήγηση της DU-6859a με μη θεραπευτικές δόσεις φλουκοναζόλης (28). Η αποτελεσματικότητα του συνδυασμού DU-6859a και αμφοτερικίνης Β επιβεβαιώθηκε με τη μέτρηση των αποικιών της C. albicans μετά από καλλιέργεια των νεφρών, σπλήνα και ήπατος. Η μη θεραπευτική δόση αμφοτερικίνης Β επιβράδυνε την ανάπτυξη του αριθμού των αποικιών της C. albicans, σε σχέση με τα ποντίκια που δεν έλαβαν θεραπεία, μέχρι και την 10 η μέρα μετά τη μόλυνση των πειραματόζωων. Αμφοτερικίνη Β με DU-6859a επιβράδυναν ακόμα περισσότερο την ανάπτυξη μεγάλου αριθμού αποικιών μέχρι και την 18 η ημέρα. Σε ποντίκια μολυσμένα με Α. fumigatus, ο συνδυασμός DU-6859a, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, με μη θεραπευτική δόση αμφοτερικίνης Β (0,25 mg/kg/day) ήταν πιο αποτελεσματικός από ότι η αμφοτερικίνη Β μόνη της 34

35 στην ίδια συγκέντρωση. Η δραστικότητα του συνδυασμού αυτού αύξανε κατά αναλογία με τη συγκέντρωση της DU-6859a. Σε ποντίκια που μολύνονταν ενδοφλέβια με C. albicans, το ποσοστό επιβίωσης ήταν σχεδόν το ίδιο μεταξύ της ομάδας των ποντικιών που έλαβαν φλουκοναζόλη (80 mg/kg/day) και αυτών που έλαβαν φλουκοναζόλη (40 mg/kg/day) μαζί με σιπροφλοξασίνη (4 mg/kg/day) (20). Στο ίδιο πειραματικό μοντέλο ο συνδυασμός της αμφοτερικίνης Β με τη σιπροφλοξασίνη δεν είχε τόσο εντυπωσιακό αποτέλεσμα. Ωστόσο ο συνδυασμός της αμφοτερικίνης Β σε μη θεραπευτικές δόσεις (0,2 mg/kg/day) με σιπροφλοξασίνη (4 mg/kg/day) είχε μεγαλύτερη προστατευτική δράση από ότι το καθένα από τα φάρμακα μόνο του. Πρέπει όμως να σημειωθεί ότι ο προηγούμενος συνδυασμός δεν μπόρεσε να αυξήσει το ποσοστό επιβίωσης τόσο όσο η χορήγηση μόνο της θεραπευτικής δόσης της αμφοτερικίνης Β (1 mg/kg/day). Εντυπωσιακό είναι το γεγονός, ότι η χορήγηση της σιπροφλοξασίνης ως μοναδικού φαρμάκου είχε ως αποτέλεσμα την επιβίωση κάποιου αριθμού ποντικιών, σε σχέση με αυτά που δεν λάμβαναν κανένα φάρμακο και που δεν επιβίωσε κανένα στο ίδιο χρονικό διάστημα. Στην ίδια μελέτη, ο συνδυασμός της τροβαφλοξασίνης (40 mg/kg/day) με χαμηλή δόση φλουκοναζόλης (40 mg/kg/day) σε μία ομάδα ποντικιών παράτεινε την επιβίωση σε σχέση με αυτά που λάμβαναν μόνο την ίδια δόση φλουκοναζόλης. Το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και με το συνδυασμό τροβαφλοξασίνης (80 mg/kg/day) με αμφοτερικίνη Β (0,2 mg/kg/day). Καλλιέργειες των νεφρών την 12 η ημέρα μετά τη μόλυνση των 35

36 πειραματοζώων επιβεβαίωσαν την αποτελεσματικότητα αυτών των συνδυασμών στις δόσεις που εξετάστηκαν. Ο αριθμός των αποικιών της C. albicans στις καλλιέργειες ήταν μικρότερος στους νεφρούς των ποντικών που λάμβαναν είτε φλουκοναζόλη με τροβαφλοξασίνη είτε αμφοτερικίνη Β με τροβαφλοξασίνη, σε σύγκριση με αυτά που ήταν σε μονοθεραπεία. Με αφορμή αυτά τα αποτελέσματα μελετήθηκε στην ίδια εργασία και ο συνδυασμός τροβαφλοξασίνης (40 mg/kg/day) με φλουκοναζόλη (80 mg/kg/day) ή αμφοτερικίνη Β (0,2 mg/kg/day) σε ποντίκια που μολύνθηκαν με ανθεκτικό στη φλουκοναζόλη στέλεχος C. albicans. Τα αποτελέσματα του πειράματος ήταν εντυπωσιακά. Ενώ δεν επιβίωσε κανένα από τα ποντίκια που έλαβαν μόνο φλουκοναζόλη μέχρι την 30 η ημέρα, υπήρξε 50% επιβίωση στην ομάδα των ποντικιών που έλαβαν τροβαφλοξασίνη με φλουκοναζόλη. Αύξηση επιβίωσης από 20% σε 80% παρατηρήθηκε με την προσθήκη τροβαφλοξασίνης στην αμφοτερικίνη Β. Επιπρόσθετα, την 30 η ημέρα καλλιεργήθηκαν οι νεφροί, ο σπλήνας και το ήπαρ όλων των ποντικιών που επιβίωσαν. Σε όλες τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία, ακόμα και στην απλή θεραπεία με τροβαφλοξασίνη, παρατηρήθηκε αντιμυκητιακή δράση, καθώς ο αριθμός των αποικιών ήταν μικρότερος σε σχέση με τον αριθμό που λήφθηκε από καλλιέργειες των πειραματόζωων που δεν έλαβαν θεραπεία. Σε ποντίκια με λοίμωξη των πνευμόνων από Rhizopus oryzae, η θεραπεία με τροβαφλοξασίνη (80 mg/kg δύο φορές ημερησίως) ή φλουκοναζόλη (80 mg/kg δύο φορές ημερησίως) δεν είχε σημαντική διαφορά στο χρόνο επιβίωσης σε σχέση με τα ποντίκια που δεν λάμβαναν καμία αγωγή 36

37 (29). Αντίθετα, ο συνδυασμός της τροβαφλοξασίνης με τη φλουκοναζόλη αύξησε στατιστικά σημαντικά το ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με την απλή θεραπεία. Το σχήμα θεραπείας φλουκοναζόλη με τροβαφλοξασίνη και με αμφοτερικίνη Β (1 mg/kg/day) και το σχήμα τροβαφλοξασίνης και αμφοτερικίνης Β δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική διαφορά στην αύξηση του ποσοστού επιβίωσης σε σχέση με τη χορήγηση αμφοτερικίνης Β μόνο. Στην ίδια πειραματική έρευνα, ο συνδυασμός σιπροφλοξασίνης (80 mg/kg δύο φορές ημερησίως) με φλουκοναζόλη ήταν πιο αποτελεσματικός θεραπευτικά σε σύγκριση με τη φλουκοναζόλη μόνη της. Οι συνδυασμοί τροβαφλοξασίνης με φλουκοναζόλη ή σιπροφλοξασίνης με φλουκοναζόλη είχαν την ίδια αποτελεσματικότητα. H συνδυασμένη χορήγηση οφλοξασίνης (20 mg/kg/day) με φλουκοναζόλη (20 mg/kg/day) σε ποντίκια μολυσμένα με C. albicans δε συνέβαλε στην επιμήκυνση του χρόνου επιβίωσης. Ωστόσο, οι αποικίες της C. albicans που μετρήθηκαν μετά από καλλιέργεια του σπλήνα ήταν στατιστικά λιγότερες στην περίπτωση της θεραπείας με το συνδυασμό παρά με τη μονοθεραπεία. Μείωση του αριθμού των αποικιών εξαιτίας του συνδυασμού παρατηρήθηκε και στους νεφρούς, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (21). Κυκλοσπορίνη Η κυκλοσπορίνη ανακαλύφθηκε τη δεκαετία του 70 (32). Απομονώθηκε από το μύκητα Tolypocladium inflatum (Σχήμα 6) και αρχικά μελετήθηκε για την αντιμυκητιακή της δράση. Αργότερα ανακαλύφθηκε η ανοσοκατασταλτική της δράση και αποτελεί πλέον ένα από τα πιο βασικά ανοσοκατασταλτικά φάρμακα (33, 34). 37

38 Σχήμα 6. Φωτογραφία με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο του μύκητα Tolypocladium inflatum από τον οποίο απομονώθηκε η κυκλοσπορίνη. H κυκλοσπορίνη αναστέλλει την καλσινευρίνη, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στον ομαλό κυτταρικό κύκλο και στη διχοτόμηση των ευκαρυωτικών κυττάρων (35, 36). Επίσης συμμετέχει καθοριστικά και στη ρύθμιση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του ασβεστίου (37, 38). H ανάγκη για εύρεση καινούργιων αντιμυκητιακών φαρμάκων ή θεραπευτικών συνδυασμών, λόγω της ανάπτυξης αντοχής των μυκήτων σε ήδη υπάρχοντα αντιμυκητιακά φάρμακα και λόγω της αύξησης του αριθμού των ευαίσθητων σε διεισδυτικές μυκητιάσεις ασθενών (39), οδήγησε σε νεώτερες έρευνες για το πόσο μπορεί να συμβάλλει η κυκλοσπορίνη στην αντιμυκητιακή θεραπεία. Μία σειρά μελετών περιγράφουν τη δράση της κυκλοσπορίνης κατά της ανάπτυξης διαφόρων μυκήτων. Σε in vitro μελέτες παρατηρήθηκε ότι η κυκλοσπορίνη και η φλουκοναζόλη έχουν συνεργική δράση κατά της C. albicans. O Marchetti και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν διαφορετικές in vitro τεχνικές, όπως την τεχνική των μικροδιαλύσεων βασισμένη στο 38

39 πρωτόκολλο CLSI, την τεχνική διαχύσεως φαρμάκων από δίσκους και την τεχνική δημιουργίας καμπυλών αναστολής της ανάπτυξης σε σχέση με το χρόνο. Με όλες τις παραπάνω μεθόδους παρατηρήθηκαν συνεργικές αλληλεπιδράσεις της κυκλοσπορίνης με τη φλουκοναζόλη εναντίον της C. albicans (40). Ο ίδιος συγγραφέας παρατήρησε το ίδιο φαινόμενο και in vivo με το συνδυασμό κυκλοσπορίνης με φλουκοναζόλη να υπερέχει της φλουκοναζόλης ή αμφοτερικίνης Β κατά της ανάπτυξης αποικιών της C. albicans σε νεφρούς ποντικιών (40). Εντυπωσιακή είναι η in vitro και in vivo συνέργεια του συνδυασμού κυκλοσπορίνης με φλουκοναζόλη σε σχέση με τη δράση της φλουκοναζόλης από μόνη της εναντίον βιοϋμενίων της C. albicans (41). Καθώς τα βιοϋμένια της C. albicans είναι 1000 φορές περισσότερο ανθεκτικά στη δράση της φλουκοναζόλης, η ανεύρεση συνεργικών συνδυασμών αναδεικνύεται ακόμα πιο σημαντική. Ο Li και οι συνεργάτες του δοκίμασαν συνδυασμούς της κυκλοσπορίνης με αζόλια (φλουκοναζόλη, ιτρακοναζόλη και βορικοναζόλη) εναντίον αποδεδειγμένα ανθεκτικών στα αζόλια στελεχών της C. albicans. Αξιοσημείωτο είναι ότι οι αλληλεπιδράσεις αυτών των συνδυασμών ήταν ισχυρά συνεργικές, δίνοντας ελπίδες ότι είναι πιθανόν οι συνδυασμοί αυτοί να αποτελέσουν μία από τις λύσεις που μπορούν να δοθούν για τη συνεχή αύξηση ανθεκτικών στελεχών της C. albicans στα αζόλια (42). Ο συνδυασμός της κυκλοσπορίνης με μία από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες εχινοκανδίνες, την κασποφουγκίνη, εξαλείφει την παράδοξη ανάπτυξη της C. albicans σε υψηλές δόσεις 8 με 32 μg/ml κασποφουγκίνης (43). Δεν είναι σαφές κατά πόσο η in vitro παράδοξη 39

40 ανάπτυξη της C. albicans σε αυτές τις συγκεντρώσεις, που μπορούν να ανιχνευτούν στο πλάσμα του αίματος, μπορεί να επηρεάσει την αντιμυκητιακή της δράση in vivo (44). To γεγονός ότι η προσθήκη της κυκλοσπορίνης αναστέλλει την εμφάνιση αυτού του φαινομένου, ίσως να διασφαλίζει την in vivo επιτυχημένη αντιμυκητιακή δράση της κασποφουγκίνης. Ο συνδυασμός κυκλοσπορίνης με κασποφουγκίνη ήταν συνεργικός και εναντίον του Α. fumigatus, όπως παρατηρήθηκε με τη χρήση in vitro δοκιμασιών αλλά και μικροσκοπικών τεχνικών (45). Τέλος, πρέπει να αναφερθεί ότι η κυκλοσπορίνη έχει αντιμυκητιακή in vitro δράση και κατά μυκήτων, όπως εναντίον της ανάπτυξης του Fusarium oxysporum, Fusarium solani (46), του Cryptococcus neoformans (47) και του Paracoccidioides brasiliensis (48). Αξιοσημείωτο είναι ότι η κυκλοσπορίνη μπορεί να επιδράσει και σε αντλίες της κυτταρικής μεμβράνης που συμβάλλουν στην έξοδο φαρμάκων από τα κύτταρα (49, 50). Ο αποκλεισμός τέτοιων αντλιών της κυτταρικής μεμβράνης ευκαρυωτικών κυττάρων από την κυκλοσπορίνη επηρεάζει την ενδοκυττάρια συγκέντρωση αντικαρκινικών (51) ή αντιμικροβιακών (22) φαρμάκων. Πιθανόν η κυκλοσπορίνη να μπορεί να αυξήσει και τη συγκέντρωση των αντιμυκητιακών φαρμάκων στα κύτταρα των μυκήτων με το να αποκλείει παρόμοιου τύπου αντλίες. Κατά πόσο η κυκλοσπορίνη μπορεί να αυξήσει τη δράση των ήδη χρησιμοποιούμενων αντιμυκητιακών φαρμάκων πρέπει να αποτελέσει αντικείμενο περαιτέρω ερευνών. Η ταυτόχρονη μάλιστα χορήγηση κυκλοσπορίνης και αντιμυκητιακών φαρμάκων σε ανοσοκατασταλμένους 40

41 ασθενείς κάνει ακόμα περισσότερο χρήσιμη τη γνώση της πιθανής βοήθειας που μπορεί να προσφέρει στην καταπολέμηση διειυσδυτικών μυκητιάσεων. Ο ρόλος των ουδετεροφίλων κατά των διεισδυτικών μυκητιακών λοιμώξεων Η φυσική ανοσία αποτελεί ενάν από τους πιο σημαντικούς μηχανισμούς του ανοσοποιητικού συστήματος εναντίον της ανάπτυξης των μυκήτων (52). Η φυσική ανοσία ασκεί την αντιμυκητιακή της δράση μέσω κυττάρων που έχουν φαγοκυτταρικές ικανότητες, κυτταροκινών, χημειοκίνων, toll-like υποδοχέων και αντιμικροβιακών πεπτιδίων. Μία κατηγορία κυττάρων με φαγοκυτταρικές ικανότητες που παίζουν βασικό ρόλο στην καταπολέμηση των μυκητιάσεων είναι τα ουδετερόφιλα (53, 54). Τα ουδετερόφιλα αποτελούν τη δεύτερη γραμμή άμυνας, μετά τα μακροφάγα, κατά της ανάπτυξης των μυκήτων στον ανθρώπινο οργανισμό. Τα κονίδια των υφομυκήτων, που είναι αερομεταφερόμενα, μπορούν να εγκατασταταθούν στις πνευμονικές κυψελίδες. Αρχικά, τα μακροφάγα στρέφονται κατά των κονιδίων με το μηχανισμό της φαγοκυττάρωσης. Τα ουδετερόφιλα στη συνέχεια στρέφονται ενάντια στις υφές που προέρχονται από τα κονίδια που ξέφυγαν από τη δράση των μακροφάγων (Σχήμα 7). Είναι χαρακτηριστικό ότι ασθενείς με ουδετεροπενία αποτελούν από τις πιο ευαίσθητες ομάδες ατόμων που προσβάλλονται από διειυσδυτικές μυκητιάσεις (55). Η δράση των ουδετεροφίλων κατά των μυκήτων μπορεί να επηρεαστεί από την επίδραση φαρμάκων ή ουσιών. Παλαιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι 41

42 η δεοξυχολική και οι λιποσωματικές μορφές της αμφοτερικίνης Β σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις αυξάνουν τη δράση των ουδετεροφίλων κατά των υφών του A. fumigatus (54). Ουδετερόφιλα που επωάστηκαν μαζί με το πεπτίδιο 2 αύξησαν τη δράση τους εναντίον της C. albicans και του Α. fumigatus (56). Η μελέτη, επομένως, του συνδυασμού ουδετεροφίλων με αντιμικροβιακά φάρμακα αποτελεί σημαντικό κομμάτι της έρευνας στην αναζήτηση παραγόντων για την κατανόηση των μηχανισμών που ενισχύουν την αντιμυκητιακή θεραπεία. 42

43 Υφές Α. fumigatus ουδετερόφιλο Α Υφές Α. fumigatus Σχήμα 7. Δείγματα βιοψίας πνεύμονα με διεισδυτική ασπεργίλλωση σε μη ουδετεροπενικό (Α) και ουδετεροπενικό (Β) ασθενή Α) Απεικονίζονται οι υφές Ασπεργίλλου και τα ουδετερόφιλα του πνεύμονα που τις προσεγγίζουν και προσπαθούν να τις φαγοκυτταρώσουν Β) Λόγω ουδετεροπενίας δεν υπάρχουν ουδετερόφιλα να προσεγγίσουν τις υφές του Ασπεργίλλου. Β 43

44 Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΕΝΑΝΤΙΟΝ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ Τις τρεις τελευταίες δεκαετίες, η αύξηση του αριθμού των ανοσοκατασταλμένων παιδιών (9), όπως παιδιών που λαμβάνουν αντικαρκινική αγωγή, υποβάλλονται σε μεταμοσχεύσεις ή επιθετικές χειρουργικές επεμβάσεις ή πάσχουν από AIDS, έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση του αριθμού των παιδιατρικών ασθενών που είναι ευάλωτοι στις μυκητιακές λοιμώξεις. Η αύξηση του αριθμού των μυκητιακών λοιμώξεων και η ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών (12, 57) οδήγησε στην ανάγκη εύρεσης νέων αντιμυκητιακών φαρμάκων (58, 59). Στην προσπάθεια για αποτελεσματική θεραπεία, οι ερευνητές μελέτησαν in vitro (60-62) και in vivo (63) συνδυασμούς των αντιμυκητιακών μεταξύ τους, αλλά και με ουσίες που ανήκουν σε άλλες φαρμακευτικές κατηγορίες (30, 64, 65). Οι φαρμακευτικοί συνδυασμοί εναντίον της ανάπτυξης των μυκήτων είχαν είτε συνεργικά (61, 63), είτε ανταγωνιστικά (63), είτε χωρίς επίδραση αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών ήταν ιδιαίτερα σημαντικά καθώς πολλοί από τους ασθενείς, που έχουν αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη διεισδυτικών μυκητιάσεων, είναι δυνατόν να λαμβάνουν τους ίδιους φαρμακευτικούς συνδυασμούς. Έτσι μπορούμε να έχουμε ενδείξεις κατά πόσο οι φαρμακευτικοί συνδυασμοί, που λαμβάνουν οι ασθενείς, ενισχύουν ή όχι την αντιμετώπιση κατά των μυκητιάσεων. Ορισμένα από τα αντιμυκητιακά φάρμακα, όπως η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, όταν χορηγούνται σε θεραπευτικές συγκεντρώσεις έχουν 44

45 σοβαρές παρενέργειες (66). Οι μελέτες των φαρμακευτικών συνδυασμών επιτρέπουν την ανίχνευση τυχόν συνεργικών φαινομένων σε μικρότερες συγκεντρώσεις από τις θεραπευτικές (67). Σε περιπτώσεις που η αποτελεσματικότητα του φαρμακευτικού συνδυασμού είναι ίδια ή μεγαλύτερη σε μη θεραπευτικές συγκεντρώσεις σε σχέση με την αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών συγκεντρώσεων ενός αντιμυκητιακού φαρμάκου με σοβαρές παρενέργειες, υπάρχει ένδειξη για περαιτέρω μελέτη αυτού του συνδυασμού. Η χρήση ενός τέτοιου αντιμυκητιακού φαρμάκου σε μικρότερες συγκεντρώσεις στους ασθενείς με διεισδυτικές μυκητιάσεις μπορεί να μειώσει τις επιδράσεις των ανεπιθύμητων παρενεργειών. Γίνεται επομένως φανερό, πόσο η μελέτη και η αξιολόγηση των φαρμακευτικών συνδυασμών μπορεί να βοηθήσει την εξέλιξη της αντιμυκητιακής θεραπείας. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Το γεγονός ότι σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρείται ασυμφωνία μεταξύ των in vitro και in vivo αποτελεσμάτων για τους ίδιους συνδυασμούς φαρμάκων, δημιουργεί ερωτηματικά και πρέπει να αποτελέσει αφετηρία για περαιτέρω έρευνα (20, 27, 28). Πιθανές εξηγήσεις μπορεί να είναι ο τεχνικός σχεδιασμός των in vitro πειραμάτων, όπως το είδος και η υφή (στερεά ή υγρή) των θρεπτικών υλικών, αλλά και του τρόπου ανάλυσης των αποτελεσμάτων. Η χρησιμοποίηση της κλασσικής μεθόδου με τον 45

46 προσδιορισμό του δείκτη της κλασματικής ανασταλτικής συγκέντρωσης (FIC) αποτελεί ενδεικτικό, αλλά αδρό τρόπο εργαστηριακής ανάλυσης. Η χρήση σήμερα πιο πολύπλοκων αλλά και πιο ευαίσθητων μαθηματικών μοντέλων μπορεί να ανιχνεύσει την in vitro συνέργεια και έτσι να μην υπάρχει απόκλιση από τα in vivo αποτελέσματα (63). Μια ακόμα παράμετρος, που εξηγεί όχι μόνο τις ασυμφωνίες μεταξύ in vitro και in vivo αποτελεσμάτων, αλλά και ενισχύει την ερμηνεία για την in vivo συνέργεια σε όλες σχεδόν τις πειραματικές μελέτες, είναι η πιθανή σύγχρονη επίδραση των κινολονών με τα αντιμυκητιακά στο ανοσοποιητικό σύστημα. Και οι δύο κατηγορίες φαρμάκων, κινολόνες και αντιμυκητιακά, επηρεάζουν τη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, προκαλώντας μεταβολές στις συγκεντρώσεις των κυτταροκινών και ιντερλευκινών (24, 68). Αναφορικά, η αμφοτερικίνη Β σχετίζεται με αύξηση του παράγοντα νέκρωσης των όγκων-άλφα (TNF-α), της ιντερλευκίνης (ΙL)-1, της ΙL-6, της IL-8 και της χημειοτακτικής πρωτεΐνης 1 των μονοκυττάρων (MCP-1) (69, 70), η φλουκοναζόλη με αύξηση της παραγωγής του ΝΟ από τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα (71), η βορικοναζόλη με αύξηση της παραγωγής του TNF-α από μονοκύτταρα όταν συνεπωάζονται με A. fumigatus (72) και η κασποφουγκίνη και η μικαφουγκίνη αυξάνουν τη φαγοκυτταρική ικανότητα των μονοκυττάρων και ουδετεροφίλων εναντίον των κονιδίων του A. fumigatus (73). Πολλές από τις ανοσολογικές αυτές επιδράσεις φαίνεται ότι αυξάνουν ακόμα περισσότερο τη δράση των λευκοκυττάρων κατά των μυκήτων, και 46

47 έτσι τα φάρμακα εκτός από τη φαρμακοδυναμική προσφορά στη θεραπεία, βοηθούν και μέσω ανοσολογικών μηχανισμών. 47

48 ΚΛΑΣΣΙΚΑ ΚΑΙ ΝΕΑ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ Η ανάλυση της αλληλεπίδρασης των φαρμάκων κατά μικροοργανισμών, δηλαδή η δράση των συνδυασμών των φαρμάκων σε σύγκριση με το πόσο δραστικό θα ήταν ένα φάρμακο από μόνο του, αποτέλεσε και ακόμα αποτελεί αντικείμενο μελέτης για τους ερευνητές. Οι πρώτες ερευνητικές εργασίες που μελετούσαν τις φαρμακευτικές αλληλεπιδράσεις διέφεραν μεθοδολογικά, γεγονός που καθιστούσε ακόμα πιο δύσκολη τη δημιουργία ενός ενιαίου τρόπου αξιολόγησης των φαρμακευτικών αλληλεπιδράσεων. Με την καθίερωση της τεχνικής των μικροδιαλύσεων ως τρόπου καθορισμού των MIC των μικροοργανισμών με βάση το πρωτόκολλο CLSI (74, 75), η πλειονότητα των ερευνητών άρχισε να χρησιμοποιεί την ίδια τεχνική με τις κατάλληλες τροποποιήσεις για τις φαρμακοδυναμικές μελέτες συνδυασμού φαρμακευτικών ουσιών. Το γεγονός αυτό συνέβαλε στην καθιέρωση ενός κλασσικού τρόπου αξιολόγησης των φαρμακευτικών αλληλεπιδράσεων κατά των μικροοργανισμών, με τον προσδιορισμό του κλασματικού δείκτη της ανασταλτικής συγκεντρώσεως (fractional inhibitory concentration, FIC) (76), ο οποίος είναι το άθροισμα των FICs κάθε φαρμάκου χωριστά: 48

49 ΣFIC = FIC Α + FIC B +...+FIC W = MIC A comb /MIC A alone +MIC B comb /MIC B alone + + +MIC W comb /MIC W alone όπου MIC comb είναι η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου alone στο φαρμακευτικό συνδυασμό και MIC A είναι η η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου όταν δρα μόνο του. Το ΣFIC μπορεί να υπολογισθεί για κάθε MIC διαφορετικών ποσοστών ανάπτυξης του μικροοργανισμού, π.χ για το 0% ή 25% της αναπτυξής του. Γενικά με βάση τη βιβλιογραφία ορίστηκε, όταν το ΣFIC είναι 0,5 παρατηρούμε φαινόμενο συνέργειας, ενώ όταν το ΣFIC είναι 4 παρατηρούμε φαινόμενο ανταγωνισμού. Σε κάθε άλλη περίπτωση (0,5<ΣFIC 4) θεωρούμε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των φαρμάκων είναι «αδιάφορη» (76, 77). Αν και η μέθοδος αυτή βοήθησε αρκετά στην αποτίμηση της in vitro συνδυασμένης χημειοθεραπείας, αποτελεί έναν αδρό τρόπο εκτίμησης των φαρμακοδυναμικών αλληλεπιδράσεων. Eπιπλέον, δεν έχει ορισθεί με σαφήνεια το φαινόμενο της συνέργειας ή του ανταγωνισμού, στην περίπτωση που στο συνδυασμό συμμετέχει ουσία στην οποία δεν προσδιορίζεται MIC, ή συμμετέχουν πάνω από δύο φαρμακευτικές ουσίες (76). Προκειμένου οι ερευνητές να ανιχνεύσουν και φαρμακευτικές αλληλεπιδράσεις που δεν μπορούσαν να προσδιοριστούν με τη χρήση των FIC και να αξιολογήσουν πιο πολύπλοκους συνδυασμούς, ανέπτυξαν καινούργια μαθηματικά μοντέλα (60, 49

50 76). Δύο από αυτά είναι το μαθηματικό μοντέλο Bliss και το μοντέλο της ισομπολογραφικής ανάλυσης. Το ισομπολογραφικό μαθηματικό μοντέλο είχε εφαρμοστεί αρχικά για την αξιολόγηση των φαρμακοδυναμικών αλληλεπιδράσεων μη αντιμικροβιακών φαρμάκων, όπως αντινεοπλασματικά (78), αντιεπιληπτικά (79), αναλγητικά (80), αντιφλεγμονώδη φάρμακα (81) και τα φάρμακα για το καρδιαγγειακό σύστημα (82). Πρόσφατα το ισομπολογραφικό μοντέλο εφαρμόστηκε και για τη μελέτη των φαρμακευτικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πολυενίων και αζολίων κατά της ανάπτυξης του Α. fumigatus (83). To μοντέλο Bliss έχει εφαρμοστεί σε μελέτες συνδυασμού αντιμυκητιακών φαρμάκων, όπως αζολίων με τερμπιναφίνη εναντίον της ανάπτυξης του Scedosporium prolificans (84) και αμφοτερικίνης Β με ιτρακοναζόλη εναντίον του Α. fumigatus (83). Σε συγκριτική μελέτη των νεώτερων μαθηματικών μοντέλων, που αξιολογεί τις φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις των φαρμακευτικών συνδυασμών, το μοντέλο Bliss εντόπισε με ευαισθησία τις συνεργικές και ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις συνδυασμών αντιμυκητιακών φαρμάκων κατά ζυμομυκήτων ή υφομυκήτων (60). Η χρήση του μοντέλου Bliss συνέβαλε στη συσχέτιση των in vitro και in vivo ανταγωνιστικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ λιποσωματικής αμφοτερικίνης και ραβουκοναζόλης εναντίον του A. fumigatus (63). H συσχέτιση in vitro και in vivo δεδομένων αποτελεί αντικείμενο προβληματισμού και έρευνας της επιστημονικής κοινότητας (76). Το μοντέλο Bliss ίσως μπορέσει να βοηθήσει σε αυτόν τον προβληματισμό. 50