הבדלים ביולוגיים וגנטיים בין אוכלוסיות תריפס הטבק לתכשיר ההדברה טרייסר

Transcript

1 הבדלים ביולוגיים וגנטיים בין אוכלוסיות תריפס הטבק tabaci(,)thrips רגישות ועמידות לתכשיר ההדברה טרייסר עבודת גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית של האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות" מאת רן רוזן אייר תשע"ד רחובות מאי 4102

2 הבדלים ביולוגיים וגנטיים בין אוכלוסיות תריפס הטבק tabaci( )Thrips רגישות ועמידות לתכשיר ההדברה טרייסר עבודת גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית של האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות" מאת רן רוזן אייר תשע"ד רחובות מאי

3 עבודה זו נעשתה בהדרכתם של: ד"ר דוד בן-יקיר פרופ' מוראד גאנם המחלקה לאנטומולוגיה, מנהל המחקר החקלאי, מרכז וולקני 3

4 1. תודות קודם כל ברצוני להודות לשני מנחי במחקר ובכתיבת עבודת התזה, פרופסור מוראד גאנם וד"ר דוד בן-יקיר. על ההכוונה, ההצעות וההערות המועילות שניתנו מתוך רצון כנה ללמד ועל כך ברצוני להודות להם. תודה למיכאל דוידוביץ, מיכאל חן וגלינה לבדב על הסיוע הרב בצד הטכני, על הסבלנות ועל הרצון לעזור. לעדי קליאוט, שלימדה אותי את טכניקות העבודה במעבדה והייתה נכונה לעזור בכל עניין. להדס שטייניץ, מרטין טרמל ועדי שדה על ההערות ועל העזרה שתמיד היו שם. תודתי הרבה נתונה לד"ר אלי הררי על רעיונות, עצות ותובנות ובעיקר על כך שדלתה תמיד הייתה פתוחה לשאלות ולהרהורים. ברצוני להודות לאגודת מגדלי התבלינים ולמדען הראשי במשרד החקלאות על תמיכתם במחקר. ועוד להודות למשרד החקלאות ופיתוח הכפר ולאוניברסיטה העברית על המלגות הנדיבות להן זכיתי. 2

5 2. תקציר תריפס הטבק tabaci( )Thrips הינו מזיק רב פונדקאי )Polyphagous( חשוב מסדרת התריפסאים Thripidae(.)Thysanoptera: התריפס נפוץ ברוב יבשות העולם ונוכחותו תועדה במעל 355 מיני צמחים פונדקאים, מתוכם רבים בעלי חשיבות כלכלית. תריפס זה מהווה מזיק חשוב במיוחד למינים מהסוג שום.)Allium( קצב רבייתם המהיר, בשילוב עם נטייתם של הזחלים להתקהל בחיק העלים, מקשים על הדברתם באמצעות חומרי הדברה כימיים המיושמים על העלווה ומקלים על התפתחות עמידות. המין עשוי לגרום להפחתת עד כ- 61% מהיבול בבצל הגינה cepa( )Allium ובעירית schoenoprasum( )Allium לנזקי הכספה קשים הפוגעים בשיווקה. תריפס הטבק הוא גם הנשא )vector( הידוע היחידי של הווירוס,Iris Yellow Spot Virus מחלה קשה הפוגעת בבצל וגורמת להפסדים כבדים ברחבי העולם. כאשר אוכלוסיות התריפס גדלות נאלצים המגדלים להגביר את תדירות השימוש בתכשירי הדברה כימיים, אך השימוש המוגבר מסייע להתפתחות עמידות לתכשירים ועד כה דווחה עמידות של התריפס לתכשירים ממספר קבוצות. בשנים האחרונות נעשה שימוש רב ויעיל בתכשיר ההדברה טרייסר, המבוסס על חומר הפעיל ספינוסד, להתמודדות עם תריפס הטבק. התכשיר הוא אחד התכשירים הבודדים המאושרים לשימוש כנגד המזיק ולאחרונה דווחה עמידות לתכשיר זה בחממות עירית בישראל. נעשה ניסיון לאפיין את מנגנוני העמידות לטרייסר ואת הדינאמיקה שלה באוכלוסיות התריפס. הבנה כזו חיונית לצורך פיתוח ממשק הדברה שעשוי לסייע בעיכוב או מניעת התפתחות עמידות לתכשיר ובכך לסייע בהתמודדות עם המזיק. נאספו אוכלוסיות תריפס רגישות =0.8ppm( )LC 50 =0.6ppm, LC 50 או עמידה =23258ppm) )LC 50 וכן נבררה )selection( אוכלוסייה לעמידות =117ppm( )LC 50 מהאוכלוסייה הרגישה. כדי לבחון את כשירות הפרטים העמידים בהשוואה לרגישים נבדקה פוריותם. נמצא שמספר הזחלים לנקבה היה גדול יותר באוכלוסייה העמידה )60.5±6.0( לעומת הרגישה )28.7±4.5(. מספר הזחלים לנקבה באוכלוסייה שנבררה היה 45.9±7.0. כדי לבחון האם עמידות מטבולית היא מנגנון העמידות העיקרי נעשה שימוש ב- synergists ששימשו כמעכבים של אנזימים משלוש קבוצות הידועות כמעורבות בעמידות ( P450 Cytochrome.)Glutathione-s-transferase,Esterase באמצעות שיטה זו נמצא שעמידות מטבולית אינה מנגנון העמידות העיקרי. בוצע ריצוף עמוק sequencing( )deep של מכלול ה- mrna המתבטא באמצעות De Novo.Transcriptome analysis הריצוף בוצע בדגימות מהאוכלוסייה הרגישה והעמידה כדי למצוא הבדלים בביטוי הגנים בין האוכלוסיות וכך לאתר גנים המעורבים בעמידות. סך הכל רוצפו ועברו Function annotation כ- 45,554 גנים. נמצאו אלפי גנים שהתבטאו באופן שונה בין האוכלוסיות ומתוכם נבחרו 9 גנים נבחרו כחשודים במעורבות בעמידות. גנים אלה מעורבים בבניית הקוטיקולה, במערכת העצבים, במטבוליזם של חומרים שונים וברבייה. רמת הביטוי של שני גנים, Cytochrome P450 ו- Vitellogenin )הידוע כמעורב ברבייה(, נבדקה גם ב.qRT-PCR רמת הביטוי של שני גנים אלו הייתה גבוהה יותר באוכלוסייה העמידה, הן על פי הריצוף והן על פי.qRT-PCR הבדלים ברמת הביטוי של ה- Cytochrome P450 מחזקים מאוד את הטענה כי הוא מעורב בעמידות אך נראה שהוא אינו מנגנון העמידות העיקרי. עוד הועלתה ההשערה שרמת הביטוי הגבוהה של ה- Vitellogenin קשורה להבדלים שנמצאו בפוריות האוכלוסייה העמידה בהשוואה לרגישה. מחקר זה סיפק לראשונה מידע גנטי רב לגבי תריפס הטבק אשר יכול לסייע בהמשך מחקר בתריפס זה ובמינים קרובים. 5

6 3. תוכן עניינים עמוד 0. תודות תקציר תוכן עניינים קיצורים מבוא תריפס הטבק 5.4. עמידות חרקים לתכשירי הדברה 5.3. טרייסר )ספינוסד( 5.2. עמידות לתכשירי הדברה בתריפס הטבק 6. שיטות וחומרים אוכלוסיות המעבדה 6.4. בדיקות רגישות לחומרי הדברה.6.3 ברירה )selection(.6.2 כשירות )fitness( 6.5. בחינת מנגנוני העמידות מטבולית באמצעות מעכבים )synergists( 6.6. שיטות עבודה עם רנ"א )RNA(.6.7 בחינת מנגנוני העמידות באמצעות De Novo Transcriptome Analysis 6.8. שיטות עבודה עם דנ"א )DNA( 7. תוצאות רגישות אוכלוסיות המעבדה.7.4 ברירה )selection(.7.3 כשירות )fitness( 7.2. בחינת מנגנוני עמידות מטבולית באמצעות מעכבים )synergists(.7.5 בחינת מנגנוני העמידות באמצעות De Novo Transcriptome Analysis 8. דיון ומסקנות רשימת ספרות נספחים תקציר באנגלית

7 4. רשימת קיצורים ת- - ח"מ- חלקי מיליון )ppm( - ח"פ- חומר פעיל )בתכשיר הדברה( - מ"צ- מעלות צלזיוס פ"מ- תריפס הפרחים המערבי occidentalis( )Frankliniella - O -ddh 2 מים מזוקקים פעמיים Insecticide resistance ( ממשק למניעת התפתחות עמידות לתכשיר הדברה -IRM - )management )Integrated pest management( הדברה משולבת -IPM - )Lethal concentration( ריכוז תכשיר הקוטל 51% מהפרטים באוכלוסייה -LC 50 - )Resistance ratio( יחס עמידות בין אוכלוסיות המחושב על פי ערכי LC 50 -RR 50 - RNA interference -RNAi - 7

8 5. מבוא 5.1. תריפס הטבק תריפס הטבק tabaci( )Thrips הינו מזיק רב פונדקאי )Polyphagous( מסדרת התריפסאים Thripinae ותת-משפחת ה Thripidae משפחת ה,Terebrantia תת הסדרה,Thysanoptera Mound ( ההערכות הן שמקור התריפס הוא במזרח הים התיכון.)Mound and Walker )1982.)Mound and Walker , אזור זה הוא גם המקור של הפונדקאי החשוב ביותר שלו - בצל הגינה cepa(.)mound )1997 )Allium תפוצתו הנוכחית של תריפס הטבק היא כלל עולמית והוא נפוץ בכל יבשות העולם למעט אנטרקטיקה )1997.)Lewis,1973,1997b Mound למרות משרע האקלים הרחב בו הוא נפוץ, מזג אויר חם ויבש מעודד את התפתחות התריפס ( Murai al. 2007,2000( Rueda et ומגביר את חומרת נזקיו )1973.)Lewis עד כה דווח שתריפס הטבק יכול להימצא על לפחות 355 מיני צמחים פונדקאים )1957,)Morison בתוכם צמחים רבים בעלי חשיבות כלכלית. תריפס הטבק הינו בעל גלגול חסר ומחזור חייו מורכב מביצה, שתי דרגות זחל, שתי דרגות גולם ובוגר )איור 0( )1997.)Moritz אוכלוסיות תריפס הטבק יכולות להתרבות בצורות רבייה שונות )2006 al..)moritz,1997 Nault et צורת הרבייה הנפוצה ביותר בעולם היא רביית בתולין.)Kendall and Capinera 1990, Lewis 1973( Thelytoky מהסוג )parthenogenesis( Thelytoky הוא צורת רבייה שבה מתפתחות נקבות מביצים לא מופרות )1973.)Lewis אולם במזרח הים התיכון ואיראן יחס הזוויגים שנצפה הוא 0:0, עובדה היכולה להעיד על רבייה מינית ביצה זחל דרגה 1.)Lewis 1973, Mound 1973( בבדיקה שנערכה במסגרת מחקר זה נמצא יחס זוויגים של 4 נקבות לזכר בוגר ומביצים לא מופרות התפתחו רק זכרים. ממצאים אלו מעידים על רבייה מינית באוכלוסיות שבהן נעשה שימוש במחקר )רוזן וחובריו, מידע שלא פורסם(. על הצמחים זמן ההתפתחות הממוצע מביצה לבוגר ב 43.2 מ"צ הוא 06 ימים ( Lall בקרקע.)and Singh 1968 הביצים מוטלות בתוך רקמת העלה ( and Shazli.)Gawaad 1971 לתריפס הטבק קצב טרום גולם גולם רבייה גבוה )0.1709= m r( וכל נקבה יכולה להטיל עד 065 ביצים בממוצע )ב 45 מ"צ( )2000.)Murai קצב איור 1: מחזור החיים של תריפס הטבק. המחזור מורכב הרבייה פוחת עם הזדקנות הנקבות משלב ביצה המוטלת בתוך רקמת העלה, שתי דרגות )1995.)Rijn קצב הרבייה הגבוה יחד זחל הניזונות על עלי הפונדקאי, שלב הבוגר ניזון גם הוא עם זמן ההתפתחות הקצר מוביל מהעלים. דרגות טרום גולם וגולם אינן ניזונות ונמצאות לעיתים קרובות להתפרצויות של לרוב בקרקע. עובד מאיור באתר- אוכלוסיות התריפס ( Montano Diaz-. al

9 5.1.1 תריפס הטבק כמזיק תריפס הטבק הוא מזיק בעל חשיבות כלכלית בגידולים חקלאיים באזורים ממוזגים, סובטרופיים ויבשים )2011.)Diaz- Montano התריפס ניזון ע"י פציעת הרקמה החיצונית של הצמח ומציצת מוהל התאים. תהליך זה גורם ליצירת כתמים כסופים המלבינים בהמשך התפתחות הצמח ( Kirk 1997(. מעבר לנזק האסטטי פגיעות אלו מפחיתות את שטח ההטמעה של הצמח ( Molenaar 1984( ויכולות לשבש אספקת חומרי הזנה )1997.)Parrella and Lewis בנוסף לנזק הישיר, התריפס גורם לנזק עקב העברת מחלות נגיפיות לצמחים. התריפס הוא הנשא )vector( הידוע היחידי של הווירוס Iris Yellow Spot Virus הפוגע בבצל הגינה ויכול לגרום לאובדן של עד 011% מהיבול 1999( al..)kritzman et al. 2001, Pozzer et בישראל תריפס הטבק גורם לנזקים משמעותיים בעיקר בבצל )בר אוריון וחובריה, 4101(, עירית )בן יקיר וחובריו, 4103( וכרוב )בן יקיר וחובריו, מידע שלא פורסם(. בבצל הגינה נזקי התריפס יכולים לגרום לאובדן של עד 61% מהיבולים )2008 al. )Waiganjo et ובעירית הנזק האסטטי מקשה מאוד את שיווקה.)Lebedev et al. 2013( פותחו שיטות שונות להתמודדות עם המזיק שכוללות הדברה ביולוגית, פיתוח זני צמחים עמידים, הדברה באמצעים מכאניים ופיזיקאליים, אולם הדרך הנפוצה והיעילה ביותר להתמודדות עם תריפס הטבק היא עדיין ההדברה כימית. תריפס הטבק פיתח עמידות לתכשירי הדברה רבים, בעיה אשר מקשה מאוד על התמודדות עם המזיק 2011( al..)lebedev et al. 2013, Diaz- Montano et 5.2 עמידות חרקים לתכשירי הדברה עמידות אוכלוסיית חרקים לתכשיר הדברה עלולה להתפתח בעקבות חשיפה מתמשכת או לא נכונה לתכשיר. בעקבות חשיפות לתכשיר ההדברה הפרטים הרגישים מתים והעמידים שורדים ולכן תדירותם באוכלוסייה עולה )2012.)IRAC התוצאה של תהליך זה היא ירידה משמעותית ביעילות התכשיר. עמידות לתכשירי הדברה נפוצה מאוד ודווחה ביותר מ- 551 מיני פרוקי רגליים. הערכות הן כי העמידות גורמת להפסדים כבדים בעולם והנזק השנתי בארה"ב מוערך במעל 2 מיליארד דולר )2008 al..)whalon et כדי למנוע או לעכב את התפתחות העמידות יש להשתמש בתכשירים באופן מושכל ומזערי )לדוגמה על פי סף פעולה( ולשם כך מפותחים ממשקי הדברה ( Insecticide.)resistance managements- IRM ממשקים אלו מבוססים על ידע אודות הביולוגיה, הפיזיולוגיה והגנטיקה של תכונת העמידות בחרקים )2012 al..)gao et מנגנוני עמידות ניתן לחלק את מנגנוני העמידות לארבע מנגנונים עיקריים: עמידות התנהגותית, הפחתת חדירת הרעלן )מתכשיר הדברה(, עמידות מטבולית ועמידות כתוצאה משינוי באתר המטרה.)IRAC( במקרים רבים מספר מנגנונים פועלים במקביל ( Pimprikar Ahmad et al. 2006, Jensen 2000 Gao ( או מנגנונים שונים פועלים באוכלוסיות נפרדות של אותו מין החרק )and Georghiou 1979.)et al עמידות התנהגותית resistance( :)Behavioral עמידות התנהגותית מוגדרת כהתנהגויות המצמצמות את מגעם של חרקים עם תכשירי ההדברה ומאפשרות להם לשרוד בסביבה שעשויה להיות קטלנית. מנגנון זה יכול לנבוע מזיהוי ורתיעה מהתכשיר או ע"י התפתחות בסביבה מוגנת בה הסיכון למגע עם התכשיר מצומצם ( al. Sparks et 1989(. לדוגמה, נטייתו של תריפס הטבק להימצא עמוק בחיק העלים מקטינה את הסיכוי שתכשירי הדברה המיושמים על הנוף ישפיעו עליו )2011 al..)diaz- Montano et 9

10 הפחתת חדירה resistance( :)Reduced penetration בתכשיר הדברה הפועל במגע, קצב חדירת רעלן דרך הקוטיקולה תלוי בתכונות הפיסיקליות- כימיות שלה. האטת קצב חדירת הרעלן יכולה לצמצם את העומס על מערכת פירוק הרעלן ולעכב, לצמצם או למנוע את ההגעה של מנה קטלנית אל אתר המטרה. לדוגמה, בעש תנשמית האביב ( Helicoverpa )armigera נמצא שחדירת הרעלן Deltamethrin לתוך הזחל הייתה איטית לפחות פי 6 באוכלוסייה עמידה לעומת רגישה 2006( al..)ahmad et עמידות מטבולית resistance( :)Metabolic עמידות מטבולית היא מנגנון נפוץ מאוד בחרקים )1972.)Georghiou רעלנים רבים הם תרכובות הידרופוביות והאנזימים המעורבים בעמידות מטבולית ממירים אותם לתרכובות פחות פעילות ביולוגיות והידרופיליות הניתנות להפרשה מהירה בקלות יחסית. Cytochrome P450 monooxygenase ו Glutathione s transferase (GST),Esterases (CYP450) הן שלוש קבוצות אנזימטיות עיקריות המעורבות בעמידות בחרקים. אנזימים אלו מעורבים במטבוליזם של חומרים שמקורם פנימי או חיצוני הכולל גם פירוק רעלנים ממקורות צמחיים. לכן, אנזימים אלו נפוצים ומגוונים יותר בחרקים רב-פונדקאים המתמודדים עם מטבוליטים שניוניים רעילים רבים )2007 al..)li et כאשר מתפתחת עמידות היא עשויה לנבוע מביטוי יתר של גנים המקודדים לאנזים ו/או לעליה במספר העותקים של גנים אלו amplification(.)gene אפשרות נוספת היא שינוי ברצף המקודד לאנזים, המעניק לו יכולת פירוק מוגברת (,2011 Bass and Field.)Li et al ה- CYP450s היא קבוצת אנזימים המצויים כמעט בכל רקמות החרק. אנזימים אלו מעורבים בתהליכים כמו יצור ופירוק הורמונים או מטבוליזם של כימיקלים טבעיים וסינטטיים. ה- CYP450s קושרים מגוון מצעים )substrates( רחב ומזרזים את פירוקם בתהליך חמצון חיזור (,1999 Scott.)Scott et al ה GSTs היא קבוצת אנזימים הייחודית לאורגניזמים אירוביים. אנזימים אלו מפרקים חומרי הדברה באמצעות זירוז תהליכי הסרת חמצן וכלור )dehydrochlorination( או הסרת glutathione וע"י כך הופכים את הרעלנים להידרופילים.)conjugation( מעבר לכך, ה- GSTs מעורבים בהעברה תוך תאית, בסינתזה של הורמונים ובהגנה מנזקי חמצון )2005 al..)enayati et ה- Esterases היא קבוצה של אנזימים המבצעים הידרוליזה של קשרי אסטר. רעלנים רבים בתכשירי הדברה מכילים קשרי אסטר ולכן חיתוך הידרוליטי שלהם הינו מנגנון חשוב בפירוקם ובביטול פעילותם 1991(.)Li et al. 2007, Price שינויים באתר המטרה resistance( :)Target site עמידות הנגרמת עקב שינוי גנטי )מוטציה( בגן המקודד לחלבון המרכיב את אתר המטרה של הרעלן. השינוי מפחית או משנה את הזיקה בין הרעלן לאתר המטרה וכך מצמצם את פעילותו.)IRAC( לדוגמה, לקראת סוף מחקר זה התברר כי העמידות לספינוסד באוכלוסיות תריפס הפרחים המערבי occidentalis(,frankliniella תפ"מ( מספרד נבעה ממוטציה בקולטן הניקוטיני לאצטיל כולין nachr( )Nicotinic acetylcholine receptor- שהינו אתר המטרה של הרעלן. המוטציה שינתה את הזיקה בין הרעלן לאתר המטרה ובכך צמצמה את השפעתו על הקולטן ( al. Puinean et.) שיטות לאפיון העמידות ומנגנוניה הטכניקות לבדיקת עמידות בחרקים מותאמות למינים השונים אך בד"כ הן מבוססות על חשיפת החרקים לריכוזים עולים של תכשיר ההדברה בתנאי מעבדה מבוקרים. ממצאי החשיפה משמשים לבניית עקומת תמותה המתארת את שיעור התמותה כתלות בריכוזי התכשיר. מהעקומה ניתן לחשב 01

11 את הפרמטר- )Lethal concentration( LC 50 שהוא ריכוז התכשיר אשר יקטול 51% מהפרטים. פרמטר זה חשוב להשוואת העמידות בין אוכלוסיות. פרמטר חשוב נוסף הוא ה- Resistance ( RR,)ratio המחושב באמצעות חלוקת ערך ה- LC 50 של האוכלוסייה הנבדקת ב- LC 50 של אוכלוסיית ייחוס שהיא בד"כ רגישה לתכשיר (1990.(Scott קיימות שיטות רבות לבדיקת מנגנוני עמידות לתכשירי הדברה בחרקים. אחת השיטות המקובלות היא השימוש ב- synergists שהם מעכבי אנזימים המעורבים בפירוק מטבולי של רעלנים מתכשירי הדברה. שיטה זו מהירה ונוחה לזיהוי ראשוני של אנזימים הפועלים בעמידות מטבולית. השיטה מבוססת על ההנחה שאם אנזים מסוים מעורב בעמידות לרעלן, אז כאשר חרק עמיד נחשף למעכב יחד עם הרעלן, יכולתו לפירוק מטבולי של הרעלן תרד ולכן רגישותו לתכשיר תעלה )1990.)Scott בשנים האחרונות פיתוח טכנולוגיות )NSG( Next Generation Sequencing והוזלת השימוש בהן 2013( )National Human Genome Research Institute איפשרו את ישומן בחקר העמידות. לדוגמה, במסגרת השיטה De Novo Transcriptome analysis מרוצף מכלול הרנ"א השליח )mrna( המתבטא ומכומתת רמת הביטוי של כל רנ"א שליח. השיטה מבוצעת ללא צורך בידע גנטי מוקדם לגבי האורגניזם genome( )reference ולכן מאפשרת מחקר גם בחרקים שאין לגביהם מידע גנטי קודם )2010.)Surget- Groba and Montoya- Burgos באמצעות שיטה זו ניתן להשוות את ביטוי באוכלוסיות עמידות לעומת רגישות לתכשיר הדברה וכך לזהות גנים ומנגנונים המעורבים בעמידות 2011( al..)gregory et 5.3. טרייסר )ספינוסד( הטרייסר AgroSciences( )Dow הינו תכשיר הדברה המבוסס על החומר הפעיל ספינוסד המשתייך לקבוצת הספינוסינים. הספינוסינים הם macrocyclic lactones )איור 4( ממקורות טבעיים )החיידק )Spinosa Saccharopolysopra או סינטטיים למחצה. הספינוסד הוא תערובת ממקור טבעי של ספינוסין A )רכיב עיקרי( וספינוסין D )רכיב משני( )ראה סקירה של Salgado and Sparks 2005 המהווה בסיס למידע שלהלן(. הספינוסד אושר לשימוש לראשונה בארה"ב בשנת 0997, וזמן קצר אח"כ גם בישראל תחת השם המסחרי טרייסר. הספינוסד פותח בעיקר להדברת פרפראים איור 2: המבנה הכימי של הספינוסד, ותריפסאים אך הוא יכול לשמש גם להדברת מזיקים הרכיב הפעיל בתכשיר ההדברה טרייסר. אחרים )1995 al..)thompson et למרות טווח הספינוסד מורכב מספינוסין A ו- D. הפעולה הרחב, רעילותו לאויבים טבעיים ולאדם ההבדלים ביניהם מובאים בתחתית האיור. - Et אתיל, H- מימן, -Me מתיל. עובד נמוכה יחסית. הספינוסינים הם רעלני עצבים החודרים לחרק דרך מאיור ב- al Sparks et הפה ובמידה פחותה דרך הקוטיקולה. התכשיר גורם להפעלה לא רצונית של מערכת העצבים המרכזית, לרעידות והתכווצויות שרירים ולאחר מכן לשיתוק הנובע מתשישות. אתר המטרה של הספינוסינים הוא הקולטן הניקוטיני לאצטיל כולין.)nAChR( ה- nachr מהווה אתר מטרה גם לקבוצות חומרי הדברה נוספים, אך נראה שאתר הקישור של הספינוסינים אליו ייחודי 2010( al. nachr.)orr et al. 2009, Watson et הוא חלבון טרנס ממברנאלי המורכב מחמש תת יחידות המאורגנות סביב תעלת יונים )2004 al..)lester et על פי מחקרים שנעשו בזבוב התסיסה melanogaster(,)drosophila ובעש גב היהלום xylostella(,)plutella נראה שאתר 00

12 הקישור של הספינוסד ל- nachr נמצא בתת היחידה Baxter et al. 2010, Rinkevich et al. ( α6 al. 2010,2010(. Watson et בנוסף לאתר זה, נראה שהספינוסד משפיע גם על הקולטן ל-.)Watson 2001( אולם מנגנון הפעולה אינו ידוע )GABA( γ aminobutyric acid מנגנון הפעולה הייחודי של הספינוסד, יחד עם השפעתו המזערית על חרקים מועילים ועל הסביבה הופכות את הספינוסד לחומר בעל חשיבות גדולה בתוכניות IRM ובהדברה משולבת )IPM(.)Sparks et al. 2012( עמידות לספינוסד עמידות לספינוסד דווחה לראשונה ב באוכלוסיות שדה ומעבדה של העש Heliothis.)Young et al. )2001 virescens בהמשך, העמידות לתכשירים המכילים ספינוסד דווחה במינים רבים מהסדרות פשפאים, פרפראים, זבובאים, תריפסאים וחיפושיות ( al. Mota- Sanchez et al. 2012,2006(. Sparks et חשוב לציין כי חלק מהדיווחים מתייחסים לעמידויות שהושרו באופן מלאכותי בתנאי מעבדה ולא בשדה. יוצאת דופן היא העמידות שהתפתחה באוכלוסיות של עש גב היהלום מהוואי. העמידות אשר דווחה בעש זה התפתחה תוך שנתיים בלבד מהתחלת היישום, כנראה עקב שימוש אינטנסיבי ובלעדי בתכשירי ספינוסד. הפסקת השימוש )למשך שנתיים( בספינוסד הובילה להחזרת רגישות האוכלוסיות לתכשיר ולשילובו בממשק.IRM במחקרים שבחנו את העמידות לספינוסד בחרקים מסדרות שונות נמצאו מספר מנגנונים. 67% ממקרי העמידות נגרמו משינוי באתר המטרה, 45% מעמידות מטבולית והשאר משילוב של שניהם )נסקר ב Sparks.)et al בזבוב התסיסה, בעש גב היהלום ובתפ"מ העמידות נגרמה עקב שינוי באתר המטרה של הספינוסד, תת היחידה α6 של Perry et al. 2007, Puinean et al. 2013, Rinkevich et al. ( nachr 2010(. בתפ"מ המוטציה G275E גרמה להחלפת החומצה האמינית גליצין )Glycine( בחומצה גלוטמית acid( )Glutamic אשר הקנתה לחרק עמידות לספינוסד )2013 al..)puinean et לעומת זאת, בזבוב הבית העמידות אומנם נבעה משינוי ב- nachr אך לא בתת היחידה Scott ( α6.)2008 עמידות מטבולית לספינוסד נמצאה כמנגנון העיקרי בעש לפיגמה exigua( )Spodoptera שבה פורק הרעלן ע"י האנזים.)Wang et al. )2006 microsomal-o-demethylase בעש תנשמית האביב פורק הרעלן ע"י האנזים.)Wang et al. )2009 CYP450 בחיפושית שחרורית חומה acetylcholine ו- amylase,catalase נמצאה מעורבות של האנזימים )Tribolium castaneum(.)awan et al. 2012( בפירוק הרעלן esterase תורשת תכונת העמידות לספינוסד נבדקה בחרקים משתי סדרות: בעש גב היהלום נמצאה תורשה אוטוזמאלית רצסיבית )2002 al..)zhao et תורשה מסוג זה מעידה בד"כ על עמידות כתוצאה משינוי באתר המטרה )2005.)Salgado and Sparks בתפ"מ קיימות סתירות בנוגע לדרך התורשה של העמידות; במחקר אחד נמצא מנגנון תורשה דומה לעש והחוקרים שיערו שמעורב בעמידות גן יחיד )2007 al. )Bielza et באחר, תורשת העמידות נמצאה דומיננטית והחוקרים שיערו שהבעמידות נגרמה ממספר גנים )polygenic(.)zhang et al. 2008( עד כה מחקרים מעטים בלבד מצאו עמידות צולבת בין הספינוסד לרעלנים אחרים. עמידות צולבת דווחה בעיקר לספינותרם, רעלן ספינוסיני אחר המשמש להדברת חרקים )נסקר ב al. sparks et 2012(. עמידות צולבת לתכשירים לא ספינוסינים דווחה לפריטרואיד Deltamethrin בשחרורית החומה. אוכלוסיות של החיפושית שנבררו בצורה מלאכותית לעמידות לפריטרואיד הראו גם עמידות לספינוסד )2012 al..)awan et התאמה )correlation( בין עמידות ספינוסד לעמידות לתכשירים נוספים דווחה בתריפס הטבק לרעלן הקרבומטי )Lebedev et al. )2013 carbosulfan וכן ל- Abamectin בעש גב היהלום )2004 al..)sayyed et עמידות צולבת מעידה בד"כ על מעורבות של תהליכים מטבוליים ולא על שינוי באתר המטרה. 04

13 5.3.2 השפעות העמידות לספינוסד על הכשירות בד"כ לעמידות לתכשיר הדברה יש מחיר כשירותי על הפרטים הנושאים אותה. המחיר יכול לנבוע מביטוי מוגבר של גנים המקודדים לאנזימים מפרקי רעלים, שינוי באתר המטרה של הרעלן הגורר פגיעה בתפקודו וכו' )נסקר ב-.)Kliot and Ghanim 2012 מחיר כשירותי עשוי להשפיע על הדינאמיקה של תכונת העמידות באוכלוסייה )1992 )Denholm and Rowland ולכן הוא גורם חשוב בפיתוח ממשק.)Kliot and Ghanim 2012( IRM עמידות לספינוסד גרמה לפגיעה בכשירות שהתבטאה בתופעות כגון: הארכת זמן ההתפתחות, הפחתה במספר הביצים, ולירידה במשקל הגלמים, בשיעורי ההגחה, ובהישרדות. תופעות אלו דווחו באוכלוסיות עמידות של עשים מהסוג Heliothis ובעש גב היהלום ( Wang Sayyed et al.,2008b al )et al.,2010 Wyss et בתפ"מ לא נמצא מחיר כשירותי לעמידות אלא להפך: מספר הביצים שהוטלו באוכלוסיות עמידות היה גבוה בהשוואה לרגישות )2008a.)Bielza et al. מצד שני, באוכלוסיות מעורבות של תריפסים עמידים ורגישים ירדה רמת העמידות לאחר כמה דורות. ממצא זה יכול להעיד בעקיפין על מחיר כשירותי לעמידות )2008c.)Bielza et al. 5.4 עמידות לתכשירי הדברה בתריפס הטבק מספר תכונות המאפיינות תריפסים תורמות להתפתחות מהירה של עמידות לתכשירי הדברה בחרקים אלה. נטייתם של התריפסים להתקבץ בחללים צרים בחיק העלים )2008 al. )Mo et מקטינה את המגע שלהם עם תכשירי ההדברה הפועלים במגע ומיושמים על נוף הצמח. גם החשיפה של ביצי וגלמי התריפס לתכשירי הדברה היא נמוכה מכיוון שהם אינם ניזונים ונמצאים בתוך רקמת הצמח או באדמה, בהתאמה )2011 al..)diaz- Montano et לכן, סביר שחלק מהתריפסים נחשפים לתכשירי הדברה בריכוזים תת-קטלניים (sub-lethal) שמעודדים התפתחות של עמידות. כמו כן, שינויים גנטיים הקשורים לעמידות מתפשטים ומתבססים מהר באוכלוסיית התריפס מפני שהוא בעל מחזור חיים קצר ופוריות גבוהה )1997.)Lewis עמידות תריפס הטבק לתכשירי הדברה דווחה לראשונה לתכשירים מקבוצת ה- Organochloride בשנות החמישים )1956.)Richardson and Wene בהמשך, דווחו עמידויות לזרחנים האורגנים ולפירתרואידים ( Morishita Herron et al 2008, MacIntyre et al. 2005b, Martin et al. 2003, al. 2003,2008(. Shelton et לאחרונה דווחה עמידות גם לקרבומטים וספינוסינים בישראל. בסקר שבוצע בחממות עירית באזורים שונים של ישראל נמצאו אוכלוסיות רבות אשר פיתחו עמידות לטרייסר ולרוב התכשירים המותרים לשימוש. העמידות לטרייסר הייתה ברמה גבוהה.)Lebedev et al. 2013( )RR 21,393( בעוד שמנגנוני העמידות של התפ"מ נלמדו בהרחבה )נסקר ב- al )Gao et מעט ידע קיים בנושא זה לגבי תריפס הטבק. מנגנון העמידות היחיד שידוע בתריפס הטבק הוא בעמידות לתכשירים מקבוצת הפירתרואידים אשר נובעת משינוי באתר המטרה )תעלת נתרן תלויות מתח(.)Toda and Morishita 2009( מטרת מחקר זה הייתה לאפיין חלק מהשינויים הגנטיים והביולוגיים הנובעים מהתפתחות העמידות לטרייסר באוכלוסיות תריפס הטבק. העבודה התמקדה בזיהוי המנגנונים המעורבים בעמידות באמצעות גנומיקה השוואתית ושימוש במעכבים ובלימוד השפעת העמידות על כשירות התריפסים. 03

14 6. שיטות 6.1 אוכלוסיות המעבדה איסוף אוכלוסיות המעבדה התריפסים נאספו בחממות עירית, או בסמוך אליהן, ע"י ניעור הצמחים מעל מגש לבן ואיסוף החרקים שנפלו באמצעות התקן ליניקת אויר )Aspirator( )נספח 0 א(. במקרים בהם צפיפות התריפסים הייתה נמוכה מאוד, הונחו באזור החממות צמחי עירית שגודלו בעציצים מושקים כצמחי מלכודת )ראה נספח 0 ב(. עציצי העירית הושארו באזור החממות למשך שבועיים ואז הועברו לחדר גידול מבוקר אקלים. כעבור שבוע התריפסים נאספו מהעירית, בדומה לאיסוף בחממות המתואר לעיל. נאספו שתי אוכלוסיות מנווה יער )ביוני 4100 ובאוגוסט 4104( ואחת מכמהין )אוקטובר 4117(. בנוסף נעשה שימוש באוכלוסייה שנבררה לעמידות לטרייסר )ראה סעיף 6.3( מתוך אוכלוסיית נווה יער גידול אוכלוסיות המעבדה התריפסים גודלו בחדר גידול )24±3 מ"צ, לחות יחסית 06 75±7%, שעות אור ביממה(, או בתא גידול Republic( )Friocell, MMM group, Brno, Czech 24±1( מ"צ, לחות יחסית 06,93±5% שעות אור ביממה(. התריפסים גודלו בצנצנות )ראה נספח 0 ג( עם שני תרמילי שעועית מצויה vulgaris( )Phaseolus שהכילו את כל דרגות ההתפתחות משני הזוויגים. צנצנות דומות שימשו להטלה מסונכרנת והן כללו רק בוגרים ) תריפסים(. בצנצנות ההטלה התרמילים הוחלפו כל 3 ימים והועברו לצנצנות חדשות לקבלת קבוצות גיל אחידות. תרמילי השעועית נרכשו בחנויות מזון, נשטפו במי ברז חמים ומעט סבון לפחות 6 פעמים. התרמילים יובשו ונשמרו במקרר )4 מ"צ( לא יותר מ- 2 ימים עד לשימוש. נקבות תריפס בנות 6 3- ימים שימשו לכל הניסיונות. 6.2 בדיקות הרגישות המבחן הביולוגי בדיקת הרגישות של התריפסים לתכשיר ההדברה בוצעה באמצעות תאי מונגר. התאים עברו התאמה לתריפסים )איור 3 ונספח 4( והורכבו על עלים )1998 al..)kontsedalov et נקבות תריפס נאספו באמצעות שאיבת אויר אל קונוס פלסטי )"טיפ"( בנפח 200µl והוכנסו אל התא דרך נקב להחדרת התריפסים. בבדיקות נעשה שימוש בתכשיר ההדברה "טרייסר אולטרה ת.ר" Agrosceinces(,Dow אינדיאנה, ארה"ב( המכיל 041 גרם ספינוסד לליטר. הריכוז המומלץ חושב באמצעות מידע שנלקח ממאגר מידע של השירותים להגנת הצומח ולביקורת של משרד החקלאות ופיתוח הכפר )משרד החקלאות ופיתוח הכפר( )ראה נספח 3(. צמחי כותנה ).L )Gossypium hirsutum מהזן אקלה )זרעים גדרה בע"מ, רבדים, ישראל( גודלו בתנאי חממה מבוקרת )25±3 מ"צ, 04 שעות אור ביממה( ומוגנת ממזיקים. העלים על צמחי הכותנה דוללו -3 6 שבועות לאחר הזריעה ועל כל גבעול הושארו שני עלים. כל גבעול הוכנס למבחנה בנפח 51 מ"ל שהכילה מים ונאטמה באמצעות Parafilm למניעת נזילה. העלים נטבלו במשך 41 שניות בתמיסות טרייסר בריכוזים שונים. בטיפול הביקורת העלים נטבלו במים מזוקקים לפרק זמן זהה. לאחר הטבילה העלים יובשו במנדף למשך שעה וחצי. לכל מבחן נבחרו ריכוזים שגרמו לתמותת תריפסים הנעה בין 1% ל- 011%. 02

15 על כל עלה הורכב תא מונגר ולתוכו הוכנסו בין 8 ל- 03 נקבות תריפס. כל תא היווה חזרה, ולכל טיפול היו בין 2 ל- 6 חזרות. 28 שעות לאחר הכנסתם נספרו התריפסים ונקבע שיעור התמותה בכל תא. לא נעשה שימוש בממצאים מניסיונות שבהם שיעור התמותה הממוצע בביקורת עלה על 41%. זכוכית אקרילית קצף פלסטי מוקשה נקב להחדרת התריפסים עלה כותנה נייר סופג זכוכית נושא איור 3: תא מונגר שהותאם לתריפסים ושימש לבדיקת רגישות התריפסים לטרייסר בריכוזים שונים. חלקי התא הודקו יחד לעלה באמצעות שני אטבים בניית עקומת תמותה שיפוע העקומה וערך ה- LC 50 חושבו באמצעות התוכנה,SPSS statistic גרסה ( 09 Inc.,SPSS שיקגו, ארה"ב(. מקדם הרגישות ( 50 )RR חושב ע"י חלוקת ערך ה- LC 50 של האוכלוסייה הנבדקת בערך ה- LC 50 של האוכלוסייה הרגישה ביותר. הצגה גרפית של התמותה נעשתה באמצעות Excel אחוז התמותה חושב באמצעות נוסחת.)Abbott )1925 Abbott 6.3 ברירה )selection( 051 תריפסים משני הזוויגים מאוכלוסיית נווה יער, 4100 הוכנסו לצנצנות גידול. לצנצנות הוכנסו גם תרמילי שעועית שטופלו בטרייסר בריכוז 0.1 ח"מ. הצנצנות נשמרו בתא גידול בטמפרטורה של 15±1 מ"צ למשך 3 ימים. הברירה התבצעה בטמפרטורה נמוכה מכיוון שיעילות התכשיר פוחתת בטמפרטורות נמוכות )בן יקיר וחובריו, מידע שלא פורסם(. כעבור 3 ימים, התריפסים ששרדו הועברו לצנצנות חדשות להמשך גידול רגיל )ראה סעיף 6.1.2(. הברירה בוצעה 5 פעמים בדורות 5, 3, 1, 6, ו- 01. הרגישות לטרייסר נבדקה )ראה סעיף 6.2( לפני תחילת הברירה ולאחריה. 6.4 כשירות נעשתה השוואה של הפריון של 3 אוכלוסיות המעבדה שהיו בעלות רגישות שונה לטרייסר )טיפולים(. לצנצנת זכוכית הוכנס תרמיל שעועית, נקבה ו- 4 זכרי תריפס )"צנצנת הטלה"(. נעשה שימוש ב- 8 "צנצנות הטלה" )חזרות( לכל טיפול. צנצנות ההטלה הוחזקו בתא הגידול. כעבור 3 ימים הוחלף התרמיל, הכולל את הביצים, בתרמיל חדש. התרמיל שעליו הוטלו הביצים הועבר לצנצנת נוספת )"צנצנת התפתחות"(. צנצנות ההתפתחות הוחזקו בחדר הגידול. בכל החלפת תרמיל שעועית נבדק מצב הנקבה. מספר ההחלפות המירבי היה 6 אך הן הופסקו כאשר הנקבה מתה. הצאצאים בדרגת זחל שני נספרו בכל "צנצנת ההתפתחות" במשך 9 ימים. ממצאים מ"צנצנות הטלה" בהן הנקבה מתה במהלך ששת הימים הראשונים של הניסוי הושמטו. בתום המחזור הראשון של הניסוי בוצע מחזור נוסף ובו נעשה שימוש ב- 01 "צנצנות הטלה" )חזרות(. נערכה בדיקה של התאמת הנתונים להנחות מבחני ANOVA )ראה נספח 2(. ניתוח סך הצאצאים לכל נקבה נעשה באמצעות מבחן Two Way ANOVA בו פקטור אחד היה המחזור והשני הטיפול. 05

16 כדי לדרג בין הטיפולים, נעשה שימוש במבחן Post Hoc מסוג.Tukey HSD השוואת הדינמיקה Repeated measure בזמן של מספר הצאצאים לנקבה באוכלוסיות התריפסים הושוותה באמצעות רשימת הטיפולים שבוצעו 1: טבלה.ANOVA כמו כן, חושב ערך קצב הרבייה ( X M( עבור כל אוכלוסייה )ראה נספח 5(. ניתוח הנתונים התבצע באמצעות תוכנת בניסוי בחינת מנגנוני עמידות מטבולית SPSS כמתואר לעיל. באמצעות מעכבים. ביקורת טיפול ללא טפטוף 6.5. בחינת מנגנוני עמידות מטבולית באמצעות מעכבים )Synergists( מבחן ביולוגי נקבות תריפס מאוכלוסיית כמהין הונחו מים מזוקקים במקרר למשך 05 דקות כדי להאט את פעילותן ולאפשר אצטון יישום נוח של הטיפולים )טבלה 0(. לאחר הקירור אצטון + PBO שהונחה על אל צלחת פטרי בכל פעם נקבות הועברו אצטון + DEM Inc.(,BioQuip רנצ'ו דומינגז, ארה"ב( משטח קירור אצטון + DEF ורופדה בנייר סופג. בכל טיפול 3µl של התמיסה הרלוונטית טופטפה על כל נקבה באמצעות פיפטור. טיפולים אצטון + טרייסר נעשה שימוש ב- 91% Piperonyl butoxide- PBO PBO + אצטון + טרייסר שהינו בולוגנה, איטליה(,Endura Fine Chemicals( אצטון + טרייסר+ DEM Diethyl,)Wilkinson, 1983( CYP450 מעכב של DEF + אצטון + טרייסר,Sigma- Aldrich Co. LLC.( 97% maleate- DEM סנט לואיס, ארה"ב( שהינו מעכב של )Yu, )2002 GST,Chem Service Inc.( ווסט צ'סטר, 97.5% s,s,s- tributyl phosphorotrithioate- DEF ו- ארה"ב( שהינו מעכב של.)Hur et al. 1992( Esterases המעכבים נמהלו באצטון ltd.(,bio- Lab ירושלים, ישראל( עד לריכוזים הבאים )מ"ג/ליטר(: - PBO 4111, DEM - DEF 0111, הטרייסר נמהל באצטון לריכוז 800 ח"מ. כל התמיסות עורבבו במשך רבע שעה. נעשו 5 חזרות לכל טיפול, בכל חזרה היו נקבות. לאחר הטפטוף הנקבות הועברו אל מבחנות פלסטיק של 50 מ"ל שהכילו פיסת נייר סופג )1x1 ס"מ( ותרמיל שעועית שנחתך לחצי. התרמיל נאטם בפרפין ltd.(,the British Drug Houses פול, התייבשותו. כל מבחנה נאטמה בפיסת בד )4x4 ס"מ( וגומייה. בריטניה( בצד החתוך כדי למנוע את 42 שעות לאחר הכנסת התריפסים נקבעו מספר התריפסים ושיעור התמותה בכל מבחנה. נערכה בדיקה של התאמת הנתונים להנחות מבחן Student s t test )ראה נספח 4(. ניתוח הנתונים נעשה באמצעות מבחן Student s t test להשוואה בין ממוצע התמותה בטיפול האצטון + טרייסר, לטיפול אצטון + טרייסר + מעכב. הניתוח נעשה באמצעות תוכנת.SPSS 6.6 שיטות עבודה עם רנ"א הפקת רנ"א תריפסים )בהתאם לניסוי( הוכנסו למבחנה ובה,MRC Inc.( TRI Reagent 300µl חולון, ישראל(. לאחר מכן, הוסף למבחנה Sigma- Aldrich ( )GenElute LPA( linear polyacrylamide LLC.,Co. סנט לואיס, ארה"ב( המשמש כנשא (carrier) לחומצות גרעין והתריפסים נכתשו. בהמשך הוסף למבחנה Chloroform 60µl והיא סורכזה בקירור,Eppendorf( המבורג, גרמניה( במשך 10 דקות, במהירות 12,000 סל"ד ובטמפרטורה של 2 מ"צ. לאחר מכן, הנוזל העליון הועבר למבחנה חדשה והוסף לו Isopropanol בנפח 1.75 מנפח הדגימה שעורבבה ושוקעה ב - 4 מ"צ למשך לילה. למחרת, הדוגמא סורכזה למשך 41 דקות ב- 13,400 סל"ד וב- 2 מ"צ. לאחר הסרכוז 06

17 המשקע נשטף באתנול )75%( ואז הורחף במים מזוקקים פעמיים. בתום ההפקה, ריכוז הרנ"א נמדד ב-,NanoDrop Technologies( Spectrophotometer ווילמינגטון, ארה"ב(. הדוגמא נשמרה ב- 80- מ"צ עד לשימוש ניקוי רנ"א ב- DNase הניקוי נעשה באמצעות הקיט,Ambion( Turbo DNA free קרלסבד, ארה"ב( והוא בוצע כדי לנקות דגימות רנ"א ששימשו ל.qReal Time PCR לדוגמת רנ"א הוסף Turbo DNase buffer בנפח 1.0 מנפח הדגימה ו-.Turbo DNase 1µl לאחר מכן הדגימות הושרו באינקובאטור בטמפ' של 37 מ"צ למשך 45 דקות. לאחר ההשריה הוסף לדגימה.DNase Inactivation Reagent ואז הדוגמה הונחה בטמפרטורת חדר ל- 4 דקות ולאחר מכן סורכזה במהירות סל"ד למשך 0.5 דקות Inc.(,Labnet International אדיסון, ארה"ב(. לאחר הסרכוז הנוזל הופרד מהמשקע והועבר למבחנה חדשה לשמירה ב- 81- מ"צ עד לשימוש. 6.6 בחינת מנגנוני העמידות באמצעות De Novo Transcriptome Analysis כדי לבחון הבדלים ברמת הביטוי של מכלול הגנים המתבטאים בתריפסים עמידים לעומת רגישים וכן כדי לקבל מידע גנטי כללי בוצע ריצוף רנ"א עמוק sequencing( )deep RNA בעזרת הטכנולוגיה של חברת אילומינה.)Illumina( דוגמאות הרנ"א לביצוע הריצוף נעשה שימוש ב- 2 דוגמאות רנ"א, 4 מאוכלוסיית נווה יער ) )sus,1 sus ו- 4 מאוכלוסייה כמהין )2.)Res,1 Res דוגמאות הרנ"א הופקו )ראה סעיף 6.6.0( מ- 051 נקבות ומ- 211 זחלים מדרגה 4 )בני 01-7 ימים( בנפרד ולאחר מכן אוחדו )ביחס 0:0 של כמות ה- RNA שנמדדה בספקטרופוטומטר(. הדגימות נשלחו בהקפאת קרח יבש לריצוף חברת )BGI( Beijing Genomics Institute )בייגינג, סין( הכנת הדגימות לריצוף והריצוף עצמו הכנת הדגימות והריצוף עצמו בוצעו ע"י חברת.)BGI( Beijing Genomic Institute תהליך ההכנה מובא בקצרה באיור 2. הריצוף עצמו בוצע באמצעות מכשיר מהדגם Illumina HiSeq 2000 Inc.(,Illumina סן דייגו, ארה"ב( ניתוח התוצאות המקטעים הקצרים שרוצפו נוקו מה- Adaptors שהוספו אליהם בהכנת הספריות ובריצוף. לאחר מכן נבררו החוצה מקטעים שרוצפו באיכות נמוכה. המקטעים שנותרו הועברו ל-.Assembly תהליך ה- Assembly מובא בקצרה באיור 5. מאחר ולא קיים כמעט רקע גנטי לתריפס הטבק ה- Assembly בוצע באמצעות Transcriptome De Novo Assembly המאפשר ריצוף ללא שימוש ב-.)Grabherr et al. 2011( Trinity בוצע באמצעות תוכנת Assembly ה-.Reference Genome בקצרה, התהליך בוצע ע"י איחוד מקטעים קצרים )Reads( למקטעים ארוכים יותר )Contigs( באמצעות חפיפה בין המקטעים הקצרים. לאחר מכן מקטעים קצרים נוספים מופו לאותו ה-.Contig המקטעים רוצפו משני הכיוונים end(,)paired שיטה אשר מעלה את יעילות ה-.Assembly בהמשך, ה- Contigs אוחדו למקטעים הארוכים ביותר הניתנים להרכבה.)Unigenes( לאחר איחוד המקטעים בוצע E( value 10> 5- ( blastx alignment בין ה- Unigenes למאגרי מידע של חלבונים COG( )nr, KEGG, Swiss port, כדי לקבוע את כיוון ה-.Unigenes במקרה שקביעת הכיוון לא התאפשרה ע"י blastx נעשה שימוש בתוכנת.)Iseli et al. 1999( ESTScan 07

18 בהמשך בוצע Functional ה- של Annotation לקביעת Unigenes התפקוד ורמת הביטוי של שהתקבלו. המקטעים Annotation במהלך ה- המקטעים הושוו לרצפים במאגרי מידע של חלבונים כיוון לבדיקת בדומה המקטעים. בנוסף לכך, ה- ב- נבחנו Unigenes אותם,blastn המשווה לרצפים במאגר מידע של E- עם )nucleotide( nt.value<10 5- כמו כן, בוצע ל- Unigenes מיון ה- )GO( Gene ontology התוכנות באמצעות Conesa et ( Blast2GO דוגמת סך הרנ"א העשרת )Enrich( רנ"א שליח באמצעות שרפי Oligo dt קיטוע הרנ"א ) בסיסים( הכנת דנ"א משלים באמצעות Random Hexamer Primers ברירה עפ"י גודל והגברה ב PCR ריצוף באמצעות Illumina איור 4: תרשים כללי של ההכנות שנעשו ע"י חברת BGI לדגימות הרנ"א עד לתחילת הריצוף. Ye ( WEGO ו )al )et al הניתוח הבא שבוצע הוא בחינת ההבדלים ברמות הביטוי של כל הגנים שעברו.Annotation מספר המקטעים (reads) שמופו Fragment Per kb Per Million Fragments באמצעות הנוסחה ל- נורמלו Unigene לכל )FPKM(.)Mortazavi et al. )2008 לאחר מכן בוצע מבחן סטטיסטי לבחינת מובהקות ההבדל ברמת הביטוי המבוסס על Audic et ( The significance of digital gene expression profiles.)al ולבסוף תקנון.)FDR( False Discovery Rate תקנון זה בוצע כדי לצמצם את הסיכוי לטעות מסוג )False positive( I כמקובל במבחנים רבי השוואות בחירת גנים להמשך בדיקה מתוך רשימת הגנים שהתבטאו באופן שונה בין שני אוכלוסיות המעבדה נבחרו מספר גנים להמשך בדיקה. הגנים שנבחרו עמדו בקריטריונים הבאים: 0. הבדל ברור ברמת הביטוי בין אוכלוסיות המעבדה: 2<Log 2 (FPKM resistance /FPKM susceptible ) ההפרש ברמת הביטוי בדגימות משתי אוכלוסיות המעבדה היה גדול מ 411 )200<resistance raw fragments* - susceptible raw fragment*( 4. הבדל מובהק ברמת הביטוי- FDR הגן התבטא ברמה כלשהיא בכל הדגימות fragment*( )0<raw.)FPKM( לפני הנרמול שלהם Unigene שמופו לאותו (Reads) הם המקטעים הקצרים raw fragments* 08

19 נבחרו רק גנים שעמדו בקריטריונים אלו בכל ארבעת ההשוואות שבוצעו בין האוכלוסיות, אך לא בהשוואות בתוך כל אוכלוסייה. 6.6 שיטות עבודה עם דנ"א הכנת דנ"א משלים )cdna( מכל דוגמת רנ"א נלקח 0.5ng רנ"א ולו הוסף 1µg/µl של תערובת Random Hexamer ו- Oligo dt )ביחס של 0:3 בהתאמה( ( Fisher Thermo Inc.,Scientific וולתאם, ארה"ב(. לאחר מכן הוסף לדוגמא מים מזוקקים פעמים עד לנפח.15µl בהמשך הדוגמא הועברה לאינקובציה למשך 5 דקות ב- 70 מ"צ. לאחר האינקובציה הוסף לדוגמא RT mix* 10µl והיא הועברה לאינקובציה נוספת למשך שעה ב- 42 מ"צ. המקטעים המרוצפים )Reads( הרכבת המקטעים ל Contigs מיפוי מקטעים נוספים ל Contigs הרכבת ה Unigenes ל Contigs איור 5: תרשים כללי המתאר את תהליך ה- assembly במסגרת.De Novo Transcriptome Analysis בתהליך זה מאוחדים המקטעים הקצרים שרוצפו למקטעים ארוכים יותר באמצעות החפיפה ביניהם וללא צורך ב-.reference genome *RT mix: (וולתאם, ארה"ב, Inc. 1.5µl dntp s mix (10mM) (Thermo Fisher Scientific (פיטסבורג, ארה"ב (Promega, 5µl M-MLV RT buffer (x5) 2.5µl ddh 2 O (פיטסבורג, ארה"ב (Promega, 1µl M-MLV RT enzyme הגברת מקטעי דנ"א משלים ב )PCR( Polymerase Chain Reaction כל הריאקציות בוצעו במכשיר,Biometra( T1 Thermocycler גוטינגן, גרמניה(. מרכיבי הריאקציה הם כדלהלן: (וולתאם, ארה"ב, Inc. Dream Taq 10µl (Thermo Fisher Scientific (מעבדות חי, רחובות, ישראל,) pmol) 0.3µl Primer F (20 (מעבדות חי, רחובות, ישראל,) pmol) 0.3µl Primer R (20 7.4µl ddh 2 O 2µl Template DNA טבלה 2: רשימת התחלים )primers( ששימשו להגברת מקטעים ב- PCR או.qReal Time- PCR טמפרטורת איחוי אורך רצף שם הגן )Annealing( המקטע )מ"צ( )בסיסים( Forward- CTGGGACTTGTTGTGGACCT CYP Reverse- GGACTTTTCGGTGTGCTTGT )CL844( Forward- TTTTTGATTGTGACCGACCA Vitellogenin 55 Reverse- CAAAAGTCCAGCACCCAGTT Forward- TTCCACTGCTGTTGTTGAGC Tubulin 55 Reverse- AGATGGCCTCATTGTCAACC (CL585_C5) 09

20 6.6.3 הפרדת מקטעי רנ"א או דנ"א משלים בג'ל אלקטרופורזה הפרדת המקטעים נעשתה בג'ל אגרוז (0%) המכיל אתידיום ברומיד,0.003µl/ml בבופר הרצה (20mM Tris, 10mM acetic acid, 0.5mM EDTA) TAEx0.5 ובמתח של.100V בתום ההרצה המקטעים צולמו תחת תאורה אולטרה סגולה. נעשה שימוש בסמן גודל )Ladder( Gene Ruler,Thermo Fisher Scientific Inc.( 100bp וולתאם, ארה"ב( ניקוי הדנ"א מג'ל וריצוף מקטעי דנ"א משלים שהוגבר ב- PCR הופקו מתוך ג'ל ונשלחו לריצוף כדי לאמת שהמקטע המוגבר הוא אכן המקטע המבוקש. ההפקה התבצעה באמצעות הקיט Zymoclean Gel DNA Recovery Research(,Zymo אירוין, ארה"ב(. חלקי ג'ל שהכילו את המקטעים נחתכו תחת תאורה אולטרה סגולה. המקטעים נשקלו והוכנסו למבחנות יחד עם Agarose Dissolving Buffer בנפח גדול פי 3 ממשקל הג'ל. לאחר מכן המבחנה הושרתה באמבט מים מחוממים )50 מ"צ( למשך 01 דקות. בהמשך הנוזל מהמבחנות הועבר לקולונה ומתחתיה מבחנה ואלו סורכזו ( International Labnet,Inc. אדיסון, ארה"ב( למשך דקה במהירות 01,111 סל"ד. לאחר מכן הנוזל מהמבחנה רוקן ו- 200µl של DNA Wash Buffer הוסף לקולונה. לאחר תהליך זה הקולונה, יחד עם המבחנה סורכזו שוב באותה המהירות והזמן. תהליך זה בוצע פעמיים. לבסוף הקולונה הועברה למבחנה חדשה ו- 6µl של מים מזוקקים פעמיים הוספו אליה והיא סורכזה שוב. ריכוז חומצות הגרעין נמדד ב-,Nano Drop Thermo Fisher Scientific Inc.( Spectrophotometer וולתאם, ארה"ב(. הדוגמא נשמרה ב- 4- מ"צ עד למשלוח לריצוף. הדוגמאות נשלחו לריצוף במעבדות חי Hy Laboratories Ltd. )רחובות, ישראל(. המידע נותח באמצעות תוכנת,Lynnon Corporation( DNAMAN פויינט קלייר, קנדה(. )qrt-pcr( Real Time PCR qrt-pcr בוצע במכשיר,Corbett Research( RG 3000 מורטלייק, אוסטרליה(. ניתוח התוצאות נעשה בתוכנה המסופקת יחד עם המכשיר. מרכיבי הריאקציה מובאים ב.*qRT-PCR בכל הניסויים בוצעו ארבע חזרות ביולוגיות בכל טיפול )דגימות דנ"א משלים שונות( ושלוש חזרות טכניות מכל אחת מהן )3 חזרות של אותה דגימת דנ"א משלים(. רמת הביטוי נורמלה באמצעות שימוש בגן המקודד ל 1-α.Tubulin Mix qrt-pcr* 7.5µl Absolute QPCR Blue SYBR Green ROX mix (Thermo Fisher Scientific Inc. (וולתאם, ארה"ב, (רחובות, ישראל, Ltd. 0.75µl Primer F (5 pmol) (Hy Laboratories (רחובות, ישראל, Ltd. 0.75µl Primer R (5 pmol) (Hy Laboratories 4µl ddh 2 O 4µl Template cdna 6. תוצאות 6.1 רגישות אוכלוסיות המעבדה: האוכלוסיות שנאספו בשדה היו בעלות רמות רגישות שונות לטרייסר. אוכלוסיות נווה יער 4100 ו היו בעלות רגישות גבוהה ואוכלוסיית כמהין הייתה בעלת רגישות נמוכה לתכשיר )איור 6(. רמת הרגישות של האוכלוסייה שנבררה מאוכלוסיית נווה יער 4100 מוצגת באיור 6 וטבלה 3 אך תוצג בהרחבה בסעיף

21 )%( תמותה על פי מודל,probit שיפועי העקומות )טבלה 3( של אוכלוסיות נווה יער היו גבוהים יחסית לשיפוע של אוכלוסיית כמהין. שיפועי העקומות של כל האוכלוסיות התאימו למודל probit, ( probit p(. גם על פי ערכי מקדם העמידות ( 50 )RR נראו הבדלים משמעותיים ברמת העמידות בין האוכלוסיות )טבלה 3(. אוכלוסיית כמהין הייתה עמידה לפחות פי 24,111 יותר מאוכלוסייה נווה יער מכיוון שמחקר זה עוסק בתכונת העמידות, משלב זה של העבודה שמות כל האוכלוסיות הוסבו למספר )המעוגל( של מקדם העמידות שלהם. טבלה 3: מדדי הרגישות ועקומת התמותה באוכלוסיות המעבדה. לבניית עקומת התמותה נעשה שימוש בלפחות 2 ריכוזי תכשיר ההדברה. בכל ריכוז לפחות 2 חזרות ובכל חזרה 8-03 נקבות תריפס. אתר וזמן איסוף האוכלוסייה נווה יער 4100 נווה יער 4100 לאחר ברירה נווה יער )חל"מ( ריכוז טרייסר RR כינוי האוכלוסייה 0 LC 50 )ערך מינימום- מקסימום ברמת בטחון של 55%( )ppm( 0.6 ( ) שיפוע העקומה )±שגיאת התקן( 1.6± ± ±0.2 < ( ) 0.8 (0-1.7) ( ) ,210.6 כמהין 4117 נווה יער 4100 נווה יער 4104 כמהין נווה יער 4100 לאחר ברירה *ערכי הטבלה עוגלו לצרכי נוחות איור 6: שיעור תמותת הנקבות באוכלוסיות המעבדה של תריפס הטבק כתוצאה מחשיפתן לתכשיר ההדברה טרייסר. הקווים המקווקווים מיועדים להמחשה בלבד. הקו המנוקד מציין את ריכוז הטרייסר המומלץ לשימוש חקלאי )375 חל"מ(. כל נקודה מייצגת את שיעור התמותה הממוצע. בכל ריכוז בוצעו לפחות 2 חזרות, בכל חזרה היו 8-03 נקבות תריפס. 6.2 ברירה: לחץ הברירה גרם לירידה משמעותית )0.001>p, )Student s t test, df=6 ברגישות האוכלוסייה שנבררה )403( בהשוואה לאוכלוסייה המקור )0( )איור 7(. אוכלוסייה 403 הייתה עמידה לפחות פי 40

22 )%( תמותה אוכלוסייה 403 היה נמוך בסדר גודל 411 בהשוואה לאוכלוסייה 0. שיפוע עקומת התמותה של בהשוואה לאוכלוסייה 0 )טבלה 3( A אחרי הברירה לפני הברירה B איור 6: השפעת הברירה על שיעור תמותת נקבות אחרי 5 חשיפות לטרייסר בריכוז 1.0 ח"מ. בוצע מבחן df=6, n=5 ( Student s t test.)p< כשירות: לא נמצא הבדל מובהק במספר הזחלים בין שני מחזורי הניסוי )0.8=p.)ANOVA, df=1, נמצא הבדל מובהק במספר הזחלים בין האוכלוסיות השונות )טיפולים( )0.006=p )ANOVA, df=2, )איור 8(. מספר הזחלים באוכלוסייה 24,111 היה גבוה במובהק מהמספר באוכלוסייה ( 4 HSD, Tukey Tukey HSD, ( מספר הזחלים באוכלוסייה 403 לא נבדל מאף אחת מהאוכלוסיות 0.002=p(. 0.05<p(. מספר הזחלים הממוצע לנקבה באוכלוסיות 403 4, ו- 24,111 היה )שגיאת התקן±ממוצע( 45.9± ±4.5, ו 60.5±6.0 בהתאמה. מספר הזחלים הממוצע בכל האוכלוסיות היה 45.9±4.0. נמצאה השפעה של גיל הנקבה על מספר הזחלים ( df=2.67, Repeated measure ANOVA, 0.003=p(. מספר הזחלים לנקבה ירד עם הזדקנותן של הנקבות )איור 9(. לא נמצאה אינטראקציה בין גיל הנקבה לבין האוכלוסייה )0.05<p.)Repeated measure ANOVA, df=5.35, בממוצע שרדו בין 38% ל- 53% מהנקבות עד סוף הניסוי )08 יום( אך לא נמצאו הבדלים בהשרדות בין האוכלוסיות. מרבית הנקבות מתו בין יום 9 ליום

23 מספר הזחלים לנקבה )דרגה 2( )%( זחלים AB B A אוכלוסיית המעבדה איור 6: מספר הזחלים מדרגה 4 שהוטלו ע"י נקבות מארבעת אוכלוסיות המעבדה. הקו השחור מייצג את החציון. הקופסה מתארת את הרבעון השני והשלישי והקווים את הרבעונים הראשון והרביעי. בוצע מבחן )df=2, n 13, p=0.006( ANOVA ומבחן.Tukey HSD זמן מתחילת הניסוי )ימים( איור 5:.)5 השיעור זחלים של הממוצע שהתפתחו מביצים שהוטלו בכל פרק זמן )ראה חישוב בנספח 43

24 )%( תמותה 6.4 בחינת מנגנוני עמידות מטבולית באמצעות מעכבים :)Synergists( בכל טיפולי הביקורת תמותת התריפסים לא עלתה על 5.5%. טפטוף אצטון בלבד על הנקבות לא גרם לעליה באחוזי התמותה בהשוואה לנקבות שלא טופלו כלל ( df=8 Student s t test, DEM או DEF או PBO + לא הייתה עלייה באחוזי התמותה גם בטפטוף של אצטון 0.425=p(. )0.05<p.)Studen s t test, df=8, טיפול בטרייסר + כל אחד מהמעכבים לא גרם לעליה מובהקת בתמותה p>0.05( )Student s t test,,df=7, בהשוואה לטיפול בטרייסר )איור.)01 טרייסר + DEM טרייסר + DEF טיפול איור 10: שיעור תמותת נקבות )ממוצע± שגיאת התקן( בעקבות חשיפה לטרייסר בלבד או לטרייסר יחד עם מעכבים שונים.)PBO,DEF,DEM( בכל טיפול בוצעו 5 חזרות, בכל חזרה היו 8-03 נקבות תריפס. 6.5 בחינת מנגנוני עמידות באמצעות De Novo Transcriptome Analysis תוצאות כלליות: תוצאות כלליות וסטטיסטיות של ריצוף ה- Transcriptome מובאות בטבלה 2. בממוצע )בארבעת מתוך המקטעים הקצרים שרוצפו Contigs 77,749 הדגימות שרוצפו( הורכבו )Assembled( 359 בסיסים ושל ה- היה )Reads( ו-.Unigenes 27,105 האורך הממוצע של ה- contigs 587 Unigenes בסיסים )איור.)00.)Illumina )באמצעות Transcriptome פירוט כללי וסטטיסטי של תוצאות ריצוף ה- 4: טבלה הריצוף בוצע בשתי דגימות )1,2 )Sus מהאוכלוסייה הרגישה )0( ושתיים )1,2 )Res מהאוכלוסייה העמידה )24,111(. כל דגימה הופקה מ- 051 נקבות תריפס ו- 211 זחלים מדרגה 4. אחוז הבסיסים C ו G אחוז הבסיסים ג Q 20 ב מספר בסיסים א מספר מקטעים דוגמה 55.89% 97.18% 2,408,525,460 26,761,394 Sus % 97.13% 2,356,845,480 26,187,172 Sus % 97.08% 2,444,597,280 27,162,192 Res % 97.06% 2,354,747,940 26,163,866 Res 2 א- מספר המקטעים reads( )clean לאחר ניקוי מקטעים באיכות נמוכה. ב- מספר הבסיסים שנספרו ב.clean reads ג- אחוז הבסיסים שרוצפו והסיכוי לטעות בריצופם הוא טרייסר + PBO טרייסר 42

25 מספר ה contigs מספר ה unigenes מתוך ה- Unigenes שהורכבו, 45,554 עברו Functional Annotation לאחד ממאגרי המידע GO(.)NR, NT, Swissport, KEGG, COG, פרמטרים שונים של רמות ההומולוגיה שנמצאו ב- Contigs Functional Unigenes Annotation מובאים באיור.04 אורך המקטע )מספר בסיסים( אורך המקטע )מספר בסיסים( איור 11: אורך המקטעים unigenes( )contigs, שרוצפו והורכבו ב- Transcriptome De Novo.Assembly אורך המקטעים מעיד על איכות הריצוף וה-.assembly באיור מוצגים אורכי המקטעים של דגימה אחת )כמדגם מייצג( מתוך הארבע שרוצפו. )א( התפלגות רמת ההומולוגיה ברצף )ב( התפלגות ה- E value )ג( התפלגות הגנים על פי מין החרק Tribolium castaneum Pediculus humanus corporis Nasonia vitripennis Megachile rotundata Acyrthosiphon pisum Harpegnathos saltator Bombus impatiens Others ם 45

26 מספר ה Unigenes איור 12: התפלגות ה- Unigenes על פי מדדים שונים של ה- :Function annotation )א( רמת ההומולוגיה של כל unigene שהורכב ל unigene ממאגר המידע, )ב( ערך E value )ג( התפלגות הגנים ממיני חרקים שונים שעברו Function annotation למקטעים שרוצפו והורכבו במחקר. החלוקה לתפקוד כללי של מכלול ה- Unigenes שרוצפו ועברו Functional annotation על פי סיווג של מאגר המידע )Clusters of Orthologous groups( COG מוצגת באיור 03. ניתן לראות שמירב ה- Unigenes היו בעלי תפקוד לא ידוע או שהייתה קיימת לגביהם תחזית כללית בלבד לגבי התפקוד. באיור 02 ניתן לראות חלוקה לתפקוד על פי.)GO( Gene Ontology סיווג ה Unigenes סיווג COG A: RNA processing and modification B: Chromatin structure and dynamics C: Energy production and conversion D: Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning E: Amino acid transport and metabolism F: Nucleotide transport and metabolism G: Carbohydrate transport and metabolism H: Coenzyme transport and metabolism I: Lipid transport and metabolism J: Translation, ribosomal structure and biogenesis K: Transcription L: Replication, recombination and repair M: Cell wall/membrane/envelope biogenesis N: Cell motility O: Posttranslational modification, protein turnover, chaperones P: Inorganic ion transport and metabolism Q: Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism R: General function prediction only S: Function unknown T: Signal transduction mechanisms U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport V: Defense mechanisms W: Extracellular structures Y: Nuclear structure Z: Cytoskeleton איור 13: התפלגות מספר ה- unigenes שרוצפו ועברו Function Annotation המאגר, COG הקטגוריות השונות מובאות מימין לגרף. על פי סיווג של 46

27 איור 14: התפלגות אחוז ה- UNIGENES על ידי שימוש ב-.)GO( Gene Ontology על פי חלוקת ה-,GO הגנים מחולקים לשלוש קטגוריות עיקריות )תפקיד ביולוגי, מיקום בתא, ותפקיד מולקולארי( ובתוכם חלוקה לקטגוריות משנה. אחוז הגנים מסך הגנים ומספרם מצוינים בצירי ה- Y גנים החשודים כמעורבים בעמידות הרמה והכיוון של ביטוי מכלול המקטעים )Unigenes( שרוצפו והורכבו מובאת באיור 05. מספר רב של גנים התבטאו ברמות שונות בין שתי הדגימות sus2( )sus1, מהאוכלוסייה הרגישה )0( לשתי הדגימות res2( )res1, מהאוכלוסייה העמידה )24,111(. בכל השוואה 651 גנים בממוצע הראו עליה בביטוי באוכלוסייה העמידה regulated( )Up ו גנים הראו ירידה בביטוי ( Down.)regulated ערכי רמת הביטוי הנורמלת )FPKM( נעו בין 1 ל ההבדל המקסימלי ברמת הביטוי ]( sus )Log 2 [FPKM res /FPKM היה והמינימלי.1 מתוך הגנים אשר התבטאו באופן שונה נבחרו 8 גנים החשודים במעורבות בעמידות )טבלאות 6 ו- 7(. גנים אלו נבחרו על סמך הקריטריונים המובאים בפרק שיטות )סעיף 6.7.2(. בנוסף לגנים אלו, נבחר גן נוסף להמשך בדיקה. המקטע המקודד לגן זה הוא ה- CL1604 Contig אשר עבר Anotation לגן המקודד לחלבון.Vitellogenin-5 גן זה עמד בקריטריונים להמשך בדיקה והתבטא בממוצע )בארבעת ההשוואות( פי 07 יותר באוכלוסייה העמידה לעומת הרגישה ( 5- )FDR 1.37x10 )איור 09 א(. חשוב לציין שמספר רב של Unigenes עמדו בקירטריונים אך נפסלו כמועמדים להמשך בדיקה מכיוון שהתפקוד שלהם לא זוהה )לא עברו Function Anotation בהצלחה( או שלא היה לגביהם כל מידע בנוגע למעורבות אפשרית בעמידות. 47

28 א איור 15: רמת הביטוי של מכלול הגנים אשר רוצפו באוכלוסייה 0 )דגימות: )Sus1, Sus 2 ובאוכלוסייה 42,000 )דגימות:.)Res1, Res2 כל נקודה על הגרף מייצגת את רמת הביטוי של גן בודד בכל אחת מהדגימות. ערכי רמת הביטוי מיוצגים ע"י הלוגריתם של רמת הביטוי המנורמלת.)FPKM( הנקודות האדומות מייצגות עלייה מובהקת בביטוי בדגימה המיוצגת בציר Y ואילו הנקודות הירוקות מייצגות עלייה מובהקת בביטוי בדגימה המיוצגת בציר FDR 1.110( X ו-.)Log 2 [FPKM res /FPKM sus [ 4X טבלה 5: פירוט רמת הביטוי של הגנים החשודים במעורבות בעמידות לטרייסר, כפי שהתקבלה בריצוף ה-.Transcriptome ג רמת מובהקות הבדל בביטוי גן משוער א שם סידורי ב )Log 2 [res /sus [( FDR 2.35x Cytochrome P450 Unigene22894 FDR 2.40x Cytochrome P450 CL844 FDR 2.26x Cytochrome P450 Unigene20207 FDR 2.29x voltage gated chloride CL490 channel FDR 5.97x voltage gated chloride Unigene9317 channel FDR 1.38x cuticle protein CL353 FDR 5.58x cuticle protein CL2493 FDR 2.66x cysteine protease CL2817 השם הסידורי כפי שניתן על ידי החברה המרצפת.)BGI( ב ממוצע ההבדלים בארבעת ההשוואות שבוצעו. ג רמת המובהקות המקסימאלית שהתקבלה בארבעת ההשוואות שבוצעו. ההשוואה בוצעה באמצעות מבחן המבוסס על.FDR התוצאות עברו תקנון.The significance of digital gene expression profiles 48

29 טבלה 6: פירוט Function Annotation ו- Gene Ontology עבור הגנים אשר חשודים במעורבות בעמידות לטרייסר. Gene Ontology (GO) E ג value Accession number מאגר ב מידע גן משוער שם א סידורי GO: , cell part 2x XP_ Nr cytochrome P450 4g15-like (Bombus terrestris) Unigene GO: ,me tal ion binding/ GO: , oxidoreductase activity/ GO: , 1x AEK Nr cytochrome P450 (Bemisia tabaci) CL844 membrane GO: , cell part GO: , Molecular Function GO: , hydrolase activity 5x x10-6 9x10-6 7x x x10-67 JC8026 XP_ XP_ XP_ P83992 AAL Nr Nr Nr Nr Swiss -prot Nr cytochrome P450 enzyme, CYP4C39 enzyme (Carcinus maenas) voltage gated chloride channel domain-containing protein (Toxoplasma gondii) voltage gated chloride channel domain-containing protein (Toxoplasma gondii) cuticle protein (Nasonia vitripennis) cuticle protein 16.5 Isoform A (Locusta migratoria) cysteine protease CP19 precursor (Frankliniella occidentalis) Unigene CL490 Unigene 9317 CL353 CL2493 CL2817 א א השם הסידורי כפי שניתן על ידי החברה המרצפת.)BGI( ב מאגר המידע שבתוכו נמצא הרצף שאליו הגן הרלוונטי עבר אנוטציה. ג ערך ה- E, value רמת המובהקות של התאמת הגן שרוצף לגן ממאגר המידע הגברה ב PCR מתוך הגנים בטבלאות 6 ו- 7 הוגבר הגן המקודד ל- )CL844( Cytochrome P450 וכן הגן המקודד.)CL1604( יתר הגנים Vitellogenin-5 ל- ב התבטאו בעיקר בזחלים או היה קושי בהגברה ספציפית שלהם. תמונת הג'ל מהרצת המקטעים של CYP450 ו Vitellogenin מובאת באיור 06. איור 16: תמונת ג'ל אלקטרופורזה של מקטעי דנ"א שהוגברו ב- PCR מתוך דנ"א משלים: )א( הגן CL844,CYP450 )באורך 075 בסיסים( )ב( הגן,Vitellogenin-5 ( CL1604 באורך 64 בסיסים(. )0( סמן גודל, )4( בקרה- ללא דנ"א משלים, )3( דנ"א משלים שמקורו באוכלוסייה 0, )2( דנ"א משלים שמקורו באוכלוסייה 24,

30 רמת ביטוי יחסית )CYP450/Tubulin( רמת ביטוי מנורמלת )FPKM( אימות ב qrt-pcr בדומה לתוצאות הריצוף )איור 07 א(, רמת הביטוי של הגן המקודד ל- )CL844( CYP450 הייתה גבוהה באוכלוסייה 24,111 בהשוואה לאוכלוסייה 0 )פי )7.84 p=0.006( )Student s t test, df=6 )איור 07 ב(. הבדלים ברמת הביטוי של גן זה נמצאו גם באוכלוסיות הנוספות ( df=3 ANOVA, Tukey 08(. רמת הביטוי באוכלוסייה 0.5 הייתה גבוהה בהשוואה לאוכלוסייה ( 0 )איור 0.003=p( 0.005=p.)HSD, רמת הביטוי של אוכלוסייה 403 הייתה גבוהה יותר מאוכלוסייה 0 אך לא באופן מובהק p>0.05(.)tukey HSD, רמות הביטוי של הגן המקודד ל- Vitellogenin-5 )CL1604( נבדלו בין האוכלוסיות השונות )0.009=p )ANOVA, df=3 )איור 09 ב(. רמת הביטוי של אוכלוסייה 403 הייתה גבוהה יותר בהשוואה לאוכלוסייה p=0.009( 0.5 )Tukey HSD, ואוכלוסייה p=0.026( 0.)Tukey HSD, אוכלוסייה 24,111 לא נבדלה מאף אוכלוסייה )0.05<p.)Tukey HSD, A B א ב A B אוכלוסיית המעבדה אוכלוסיית המעבדה איור 16: רמת הביטוי )ממוצע+שגיאת התקן( של הגן )CL844( Cytochrome P450 באוכלוסייה 0 ו- 24,111. רמת הביטוי נמדדה באמצעות ריצוף Transcriptome )א( או qrt-pcr )ב(. בריצוף ה- Transcriptome בוצע מבחן המבוסס על The significance of digital gene expression profiles ותקנון.)n=2, FDR 2.39x10-28 ( FDR ב- qrt-pcr רמת הביטוי נורמלה באמצעות הגן ל-.Tubulin בוצע מבחן.)df=6, n=4,p=0.0059( Student s t test 31

31 )Vitell'/Tubulin( FPKM)( רמת הביטוי היחסית רמת ביטוי יחסית רמת הביטוי המנורמלת )CYP450/Tubulin( 1.60 B B AB A אוכלוסיית המעבדה איור 16: רמת הביטוי היחסית של הגן )CL844S( Cytochrome P450 באוכלוסיות השונות. רמת הביטוי נמדדה באמצעות qpcr ונורמלה באמצעות הגן.Tubulin בוצע מבחן df=3, ( ANOVA.Tukey HSD ומבחן )n=4, p= A A B AB B א ב A אוכלוסיית המעבדה אוכלוסיית המעבדה איור 15: רמת הביטוי )ממוצע+שגיאת התקן( של הגן )CL1604( Vitellogenin באוכלוסייה 0 ו- 24,111. רמת הביטוי נמדדה באמצעות ריצוף Transcriptome )א( או qrt-pcr )ב(. בריצוף ה- The significance of digital gene expression בוצע מבחן המבוסס על Transcriptome profiles ותקנון,2=n(. FDR 1.37x10 5- ( FDR ב qrt-pcr רמת הביטוי נורמלה באמצעות הגן ל-.Tubulin בוצע מבחן )df=3, n=4, p=0.009( One way ANOVA ומבחן.Tukey HSD 30

32 6. דיון רגישות אוכלוסיות המעבדה בגידולי עירית בישראל, הטרייסר הוא תכשיר ההדברה היעיל ביותר המורשה להדברת תריפס הטבק )לבדב וחובריה 4101(. גם בגידולים אחרים ברחבי העולם נחשבים התכשירים המכילים,spinosad ליעילים ביותר להדברת תריפס הטבק )2008 al.,2003.)shelton et בעבודה זו נבחנו שינויים ביולוגיים וגנטיים הכרוכים בהתפתחות עמידות התריפס לטרייסר. הפערים ברמת העמידות בין אוכלוסיית המעבדה העמידה לאוכלוסיות הרגישות היו גדולים מאוד. ערכי מקדם העמידות )RR( וה- LC 50 של האוכלוסייה העמידה היו גבוהים, ומעטים הדיווחים בספרות על עמידות תריפסים ברמה כזו )2007b.)Bielza et al. ביסוס אוכלוסיות בעלות הבדלים משמעותיים ברמת העמידות סייעו לזהות מנגנונים המעורבים בה. אוכלוסיית המעבדה שעברה ברירה לעמידות הייתה עמידה ברמה נמוכה. הבדלים בין אוכלוסיות עמידות ורגישות, בעלות רקע גנטי שונה, יכולים לנבוע משונות גנטית אקראית ללא קשר לתכונת העמידות. האוכלוסייה שנבררה לעמידות הייתה בעלת רקע גנטי זהה לאוכלוסייה הרגישה ולכן אפשרה לבדוק האם ההבדלים שנמצאו נבעו מהתפתחות העמידות. שיפועי עקומות התמותה של אוכלוסיות המעבדה ירדו ככל שהאוכלוסייה הייתה עמידה יותר. מבחינה מתמטית, שיפוע עקומת תמותה הוא פרמטר המציין את תגובת האוכלוסייה לעליה בריכוז התכשיר. מבחינה ביולוגית )Scott )1990 Scott הציע ששיפועי עקומות תמותה יכולות לספק מידע בנוגע למספר הגנים המעורבים בעמידות. באוכלוסיות עם פרטים בעלי רמות עמידות שונה, כאשר גן יחיד מעורב בעמידות צפוי ששיפוע העקומה לא ישתנה אלא רק ערכי ה- LC 50 כתלות בשיעור הפרטים העמידים באוכלוסייה. לעומת זאת, כאשר מספר גנים מעורבים בעמידות, התכונה תתפלג כמותית ולכן צפויים שיפועים שונים על פי התפלגות התכונה. כשירות הכשירות מורכבת ממספר רב של תכונות כגון פוריות, שיעור ההגחה מהביצים, התמודדות עם טריפה. בעבודה זו נבחן מרכיב כשירות אחד והוא מספר הצאצאים לנקבה. מספר הצאצאים נקבע בשלב הזחל מדרגה 4 ולכן ערך זה כולל את פוריות הנקבה, שיעור הגיחה מהביצים והישרדות הזחל עד דרגה 4. בניסוי שבחן את הרבייה וההתפתחות של תריפס הטבק באמצעות גידולם על מזון עשיר מספר הצאצאים הבוגרים לנקבה היה ) )Murai במחקר זה נעשה ניסיון לדמות תנאי שדה ולכן מספר הצאצאים היה נמוך יותר )45.9±4.0(. ככל שהעמידות עלתה הייתה עלייה במספר הצאצאים. עליה זו בקו עמיד מפתיעה מכיוון שבמקרים רבים, ללא לחץ הדברה העמידות גוררת ירידה בכשירות ( and Bielza et al.,2008a Kliot.)Ghanim 2012 אולם קיימים דיווחים ליתרון כשירותי או לחוסר פגיעה בו באוכלוסיות עמידות של זבוב הבית 1967( )Keiding וכנימת עלה האפרסק persicae(.)wiliams et al. 1998( )Myzus בתפ"מ דווחה מגמה דומה- הפוריות )מספר ביצים לנקבה( באוכלוסייה עמידה לספינוסד הייתה גבוהה )042.1±9.6( בהשוואה לאוכלוסייה הרגישה )85.7±04.2( 2008a(.)Bielza et al. מתוך הנחה כי אוכלוסיות עמידות הן הטרוגניות ברמת העמידות שלהן )2012 al. )Gao et ובמידה וקיים מחיר כשירותי לעמידות, אז ללא חשיפה לתכשיר, תדירות הפרטים העמידים צפויה לרדת. בדיקות רגישות לטרייסר שנערכו לאוכלוסייה העמידה במהלך המחקר הראו שהעמידות הייתה יציבה ללא חשיפה נוספת לתכשיר )מידע שלא פורסם(. ממצאים אלה מחזקים את ההשערה כי לאוכלוסייה העמידה במחקר זה אין מחיר כשירותי לעמידות. ראוי לציין שהבדלים בכשירות יכולים לנבוע גם משונות אקראית בין אוכלוסיות, ללא קשר לעמידות )1982 al..)mckenzie et לכן, יש 34

33 צורך בניסויים נוספים שישוו את הכשירות בין אוכלוסיות רגישות ועמידות נוספות ורצוי שאוכלוסיות אלו יהיו בעלות רקע גנטי דומה. מרכיב הכשירות שנבדק במחקר זה הוא רק רכיב אחד מתוכה, יתכן ורכיבים אחרים משפיעים על הכשירות בצורה שלילית. בתפ"מ Bielza וחובריו 2008a,c( )Bielza et al. מצאו כי למרות שפוריות הנקבות מהאוכלוסייה העמידה הייתה גבוה יותר, ערבוב האוכלוסייה העמידה יחד עם הרגישה הוביל, לאורך זמן, לירידה בעמידות האוכלוסייה המעורבת. מכאן ניתן להקיש כי היה מחיר כשירותי שגרם לירידה בשכיחות הפרטים העמידים. הכשירות כוללת אוסף תכונות וכימותן באופן פרטני לא תמיד יכול להסביר את המחיר הכשירותי ואת הדינאמיקה של התכונה באוכלוסייה. בעתיד ראוי לבחון את האוכלוסיות שבחנו במחקר זה במתכונת דומה לניסוי הנ"ל של Bielza וחובריו. מחקר כזה יוכל לבחון הבדלים בכשירות תוך שקלול השפעתם של כל מרכיביה. ידועים מנגנונים רבים המעורבים במחיר כשירותי לעמידות )2012 )Kliot and Ghanim אולם קיים מידע מועט לגבי אלה המעורבים ביתרון כשירותי. Baker וחובריו )1998 al. )Baker et הציעו שמחיר כשירותי נגרם עקב אפקט pleiotropic בו שינוי בגן יחיד משפיע על מספר תכונות )למשל עמידות וכשירות(. ולכן החוקרים הציעו כי אפקט pleiotropic שלילי יגרום ליתרון כשירותי. השערה נוספת היא שבתהליך הברירה לעמידות, ישנה ברירה לפרטים גדולים שלהם צפוי שתהיה גם כשירות גבוהה יותר. Bileza וחובריו )2008a )Beilza et al הציעו את מעורבות תהליך ה-.co- adaptation בתהליך זה אללים המשפיעים על תכונה אחת נקשרים או משפיעים על אללים המשפיעים על תכונה אחרת. מכיוון שקיימת הטרוגניות טבעית בכשירות )כתוצאה מאללים שונים(, אללים הקשורים לעמידות יכולים להיקשר לאללים לתכונות המשפיעות על כשירות ולכן לחץ ברירה בתכונה אחת יכול להשפיע גם על ביטוי התכונה השנייה )1986.)Keiding לדוגמה, תאחיזה בין אלל הגורם לביטוי יתר של גן המקודד ל- CYP450 )המעורב בעמידות( לבין גן המעורב בפוריות הנקבות. בריצוף ה- Transcriptome וה- qrt-pcr שבוצע במחקר זה נמצא כי רמת הביטוי של הגן Vitellogenin 5 הייתה גבוהה יותר באוכלוסיות העמידות. ה- Vitellogenins הינם קבוצת חלבוני ביצה המכונים Yolk proteins ולהם, בין היתר, תפקיד חשוב ברבייה בפרוקי רגליים ובאורגניזמים אחרים. תפקידם ברבייה הינו בתהליך ה- Vitellogensis בו נאגרים מרכיבים הכרחיים בתאי הנבט הנקביים )oocyte( תוך כדי הבשלתם. ל- Vitellogenin קשר הדוק לרבייה ( Khalaila Roth and 2012( ולכן, יתכן שהגן המקודד לחלבון זה מעורב בעליה בפוריות באוכלוסיות עמידות לטרייסר. זו השערה ראשונית ומחקר רב עוד דרוש לפני שיהיה אפשר להסיק מסקנות חותכות בנושא. בעתיד יש לתכנן ניסויים שבודקים את רמת הביטוי של הגן באוכלוסיות נוספות במקביל לבדיקת המרכיב הכשירותי בהם. אפשרות נוספת היא להפחית את ביטוי הגן באמצעות )RNA interference( RNAi ובדיקת השפעת ההפחתה על המרכיב הכשירותי. למחקר העוסק במחיר הכשירותי הכרוך בעמידות חשיבות גדולה מכיוון שהוא מרכיב חשוב בפיתוח תכניות.IRM תכניות אלו מתבססות על שימוש מחזורי בתכשירים בעלי מנגנון פעולה שונה. שימוש מחזורי מצמצם את העמידות כי כאשר החרקים לא נחשפים לתכשירי הדברה ויש מחיר כשירותי תדירות הפרטים העמידים צפויה לרדת )1991.)Tabashnik אולם כאשר אין מחיר כשירותי, תדירות הפרטים העמידים לא צפויה לרדת )2008c.)Bielza et al. בחינת מנגנוני עמידות בחינת מנגנוני עמידות באמצעות מעכבים )synergist( שימוש במעכבים במחקר זה לא הוביל לירידה בעמידות ולכן אין אישוש להנחה כי עמידות מטבולית היא מנגנון העמידות העיקרי לטרייסר בתריפס הטבק. בתפ"מ התקבלה תוצאה דומה ( al. Bileza et.)puinean et al. )2013 ובהמשך נמצא שהעמידות נובעת משינוי באתר המטרה 2007b( 33

34 שימוש במעכבים כדי לבחון מעורבות של עמידות מטבולית היא שיטה מקובלת מאוד אולם יש לה שתי מגבלות. הראשונה, היא שמעכב שנועד לעכב קבוצת אנזימים מסוימת לא בהכרח מעכב את כל האנזימים מקבוצה זו. השנייה היא שחלק מהמעכבים יכולים לעכב גם אנזימים מקבוצות אחרות ולכן השפעתם על החרק בלתי צפויה. מסיבות אלו השיטה יעילה רק ככלי ראשוני לקביעת מנגנון עמידות ואי אפשר לקבוע אותו רק באמצעותה )1990.)Scott בחינת מנגנוני עמידות באמצעות De Novo Transcriptome analysis תוצאות כלליות מספר פרמטרים המעידים על איכות הריצוף וה-,assembly כמו אחוז ה- Q 20 )אחוז הבסיסים שרוצפו ונקבעו ברמת ביטחון 99%( או התפלגות אורך המקטעים שהורכבו, העידו כי הם בוצעו באיכות טובה ובדומה למחקרים דומים 2011( al..)gregory et al. 2011, Shen et במסגרת ה-,Function annotation מעל 45,111 מהרצפים שהתקבלו עברו annotation ונמצאו הומולוגים לרצפים ממאגרי המידע )מרביתם ברמת הומולוגיה גבוהה מ- 40% וב- 30- value<e E(. החרק בעל רמת ההומולוגיה הגבוהה ביותר לתריפס הטבק היה החיפושית שחרורית חומה. תוצאות דומות התקבלו גם ב- De Novo Transcriptome Analysis שבוצע בתפ"מ 2013( al..)zhang et מעניין שבתפ"מ נמצא גם דמיון רב לרצפים ממיני זבובאים כמו זבוב התסיסה והיתוש אדס מצרי aegypti( )Aedes ואילו בתריפס הטבק לא נמצא דמיון כזה. אולם, הידע הגנטי בחרקים מוגבל ולכן דמיון גדול לא בהכרח מצביע על קרבה אלא על כמות המידע הגנטי וכמות הרצפים הקיימים בבנק הגנים לגבי אותו מין החרק. במסגרת ה- Function annotation הרצפים סווגו לפי תפקוד של מאגר המידע,COG המתבסס על רצפי חלבונים מאורגניזמים בעלי גנום מרוצף במלואו או מפרויקט ה- GO אשר נועד ליצור חלוקת תפקוד ומתן שמות אחידים לגנים ותוצריהם. חלוקה תפקודית של מכלול הגנים המתבטאים יכול לשמש "כחותמת הביטוי" האופיינית למין )2013 al..)chen et באופן כללי החלוקה לתפקודים דמתה לממצאים מחרקים אחרים 2011( al..)zhang et al. 2013, Shen et מתוך מכלול הגנים שעניינו אותנו כחשודים במעורבות בעמידות היו גנים אשר מוינו כמעורבים ב- secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism )בחלוקה על פי ה )COG או metabolic process )בחלוקה על פי.)GO התפקוד של מספר רב של גנים שעברו annotation לא ידוע או ידוע באופן חלקי בלבד. המידע שהתקבל בריצוף יכול לשמש ככלי רב ערך להמשך מחקר מולקולרי בתריפס הטבק, הן בנוגע לעמידות לטרייסר והן בנוגע לנושאים נוספים כמו יכולת העברת ווירוסים או עמידות לתכשירים אחרים. מידע כזה יכול לשמש, לדוגמה, בתכנון תחלים או בהשתקת גנים באמצעות.RNAi המידע שהתקבל חשוב במיוחד מכיוון שתריפס הטבק הינו מזיק בעל חשיבות כלכלית רבה אך כמעט ולא קיים מידע גנטי לגביו Information(,National Center for Biotechnology.) מנגנוני עמידות בדומה לניסויים דומים מהספרות, נמצאו מאות גנים שהתבטאו באופן שונה בין האוכלוסיות 2012( al..)gregory et al. 2011, Niu et אולם, סביר שחלק מההבדלים בביטוי נבעו מהטרוגניות טבעית ללא קשר לעמידות. כדי לאתר הגנים שאכן מעורבים בעמידות נבחרו רק גנים שהתבטאו באופן השונה והמובהק ביותר בין האוכלוסיות ולשם כך הוגדרו קריטריונים ברורים תוך כדי ניתוח התוצאות )ראה סעיף 6.7.2(. במיוחד נעשה ניסיון לאתר גנים שקיים לגביהם מידע מהספרות הקושר אותם לעמידות. גנים כמו CYP450, GST, Esterase המעורבים בעמידות מטבולית. גנים המעורבים בבניית הקוטיקולה ויכולים להיות מעורבים בהפחתת חדירת התכשיר לחרק. גנים הקשורים למערכת העצבים היכולים להיות מעורבים בעמידות הנובעת משינוי באתר המטרה. על 32

35 סמך קריטריונים אלו נבחרו 9 גנים המעורבים בבניית הקוטיקולה, במערכת העצבים ובמטבוליזם של חומרים שונים. שני גנים נוספים, הקשורים להתפתחות הביצה ולפירוק חלבונים ( Vitellogenin,,cysteine protease בהתאמה(, נבחרו מכיוון שההבדלים ברמת הביטוי שלהם הייתה חריגה, אף על פי שלא היה קיים לגביהם קשר ישיר או ברור לעמידות. ממצאים דומים מהספרות מחזקים ממצאים אלו: ביתוש Anopheles funestus עמידות לפירתרואידים התבטאה בעליה בביטוי בגנים המעורבים בבניית הקוטיקולה, במטבוליזם של חומרים שונים, במערכת העצבים ובתחומים נוספים 2011( al..)gregory et גם באקרית הארגמנית citri( )Niu et al. 2012( )Panonychus ובכנימת עש הטבק tabaci( )Yang et al. 2013( )Bemisia התקבלה מגמה דומה. מעבר לגנים אלו, נמצאו מספר רב של גנים שהתבטאו באופן שונה בין האוכלוסיות אולם קיים לגביהם מידע חלקי בלבד ולא נמצא לגביהם קשר משוער לעמידות. בעתיד יש להשוות רצפים אלו למאגרי המידע מתוך הנחה כי עליה בהיקף הידע הגנטי בחרקים יסייע לשפוך אור על מעורבות אפשרית שלהם בעמידות. סביר שחלק מגנים אלו טומנים בתוכם ידע לגבי תהליכים המעורבים בעמידות שעדיין לא התגלו. לדוגמה, לאחרונה פורסם מחקר שבמסגרתו רוצף ה- Transcriptome של התפ"מ )2013 al..)zhang et הצלבת המידע בין הניסויים תוכל לסייע למשל בביצוע Function annotation לגנים שלא עברו annotation במחקר זה וכך יתברר תפקודם ומעורבותם האפשרית בעמידות. הבדלים ברמת הביטוי של חלק מהגנים החשודים כמעורבים בעמידות אומתו גם ב-.qRT-PCR במיוחד בלט גן )CL844( בעל הומולוגיה גבוה ל- Cytochrome P450 מכנימת עש הטבק. ה- Scott ( היא על משפחת אנזימים בעלת חשיבות גדולה בעמידות חרקים לתכשירי הדברה CYP ( אולם, תפקודו הספציפי של הגן ההומולוגי מכנימת עש הטבק לא נבדק. בציקדה Laodelphax striatella ביטוי יתר של גן דומה AGN52797( )accession number: נמצא אחראי לעמידות החרק לתכשיר ההדברה.)Zhang et al. )2012 Buprofezin על פי תוצאות הריצוף וע"י אימותן ב qrt- PCR רמת הביטוי של הגן בתריפס הטבק הייתה גבוה בלפחות פי 7 באוכלוסייה העמידה לעומת הרגישה. כמו כן הברירה לעמידות גרמה לעלייה ברמת הביטוי של הגן. עובדה זו מחזקת את הטענה כי עליה ברמת הביטוי של הגן מעורבת בעמידות ולא נובעת מהטרוגניות גנטית. יוצאת דופן במגמה זו היא האוכלוסייה הרגישה הנוספת )אוכלוסייה 4(. רמת הביטוי הגבוהה של הגן באוכלוסייה זו מחלישה את הטענה כי ביטוי גבוה של הגן הוא הגורם העיקרי לעמידות. הממצאים ממחקר זה ומהספרות מעלים השערות סותרות בנוגע למעורבות אפשרית של CYP450 בעמידות לספינוסד: מצד אחד בשנים האחרונות התפרסמו מחקרים שמצאו כי שינוי באתר המטרה הוא המנגנון העיקרי לעמידות בחרקים כמו בעש גב היהלום ובתפ"מ (,2013 al. Puinean et al )Rinkevich et גם תוצאות השימוש במעכבים )synergist( במחקר זה הראו כי עמידות מטבולית אינה מנגנון העמידות העיקרי. רמת הביטוי הגבוה של הגן CYP450 באחת האוכלוסיות הרגישות )4( חיזקה גם היא את הטענה כי עמידות מטבולית המתווכת ע"י CYP450 אינה כנראה מנגנון העמידות העיקרי. מצד שני ההבדלים הברורים ברמת הביטוי בין האוכלוסייה הרגישה )0( והעמידה יחד עם ההבדל באוכלוסייה שעברה ברירה מחזקים מאוד את הממצא כי הגן CYP450 מעורב בצורה כלשהי בעמידות, ולכן יתכן שעמידות מטבולית תורמת לעמידות התריפס לטרייסר. מכיוון שבמיני חרקים שונים, או אפילו בין אוכלוסיות של אותו המין, יכולים להתקיים מנגנוני עמידות שונים לאותו התכשיר )2012 al. )Gao et ומכיוון שבמקרים רבים מספר מנגנוני עמידות מתקיימים במקביל 1979( )Ahmad et al. 2006, Jensen 2000 Pimprikar and Georghiou התוצאות שהתקבלו לא בהכרח סותרות. על סמך הממצאים מהספרות וממחקר זה קשה להגיע למסקנה חד- משמעית לגבי מעורבותו של ה- CYP450 בעמידות לספינוסד. אולם, סביר מאוד שה- CYP450 מעורב בעמידות בדרך שאינה ברורה אך נראה שהוא אינו מנגנון העמידות העיקרי. ניסויי המשך אשר ישתיקו את ביטוי הגן או יבדקו את רמת הביטוי שלו תוך כדי חשיפה לטרייסר יכולים לשפוך אור על מעורבותו. ניסוי נוסף שיוכל לסייע בכך הוא בדיקה באמצעות chromatography- Gas 35

36 )GC- MS( mass spectrometry האם הספינוסד מפורק בגוף החרק. עוד כדאי לבדוק האם המוטציה שתוארה בתפ"מ קיימת וקשורה לעמידות גם בתריפס הטבק. לסיכום, במסגרת מחקר זה בוססו אוכלוסיות תריפס עמידות ורגישות לטרייסר ואופיינו מרכיבים ביולוגים וגנטיים של העמידות. נמצאה השפעה חזקה של העמידות על כשירות הפרטים הנושאים אותה והועלו השערות לגבי מנגנונים אפשריים המעורבים בתהליך. באמצעות De Novo Transcriptome Analysis נמצאו הבדלים בביטוי הגנטי בין האוכלוסיות ונבחרו מספר גנים החשודים כמעורבים בעמידות. האנליזה הגנטית סיפקה גם מידע גנטי כללי ואין ספק שמידע זה יוכל לסייע במחקר עתידי בנוגע לתריפס הטבק או מינים קרובים. הועלו מספר הצעות להמשך מחקר ביניהם השתקת הגנים החשודים כמעורבים בעמידות, בדיקת הממצאים באוכלוסיות שדה נוספות ובדיקת המוטציה אשר קשורה לעמידות בחרקים אחרים גם בתריפס הטבק. 5. רשימת ספרות בן יקיר ד., מ. חן, א. מרגלית, ש. גרף, נ. עומרי, א. בוכשטב תריפס הטבק בשדות בצל: פנולוגיה, נזקים ופיתוח ממשק להדברתו. שדה וירק : בר אוריון מ., ד. חיימוביץ, ד. סילברמן, ש. ביטון, ד. שטיינברג, ד. בן יקיר פיתוח שיטת ניטור ומודל להערכת הנזקים עבור תריפס הטבק בעירית. שדה וירק : לבדב ג., ג. גפני, פ. אבו מוח, ס. דוברינין, ד. שדה, ד. סילברמן, ד. בן-יקיר, מ. גאנם עמידות תריפס הבצל לתכשירי הדברה בעירית. שדה וירק : משרד החקלאות ופיתוח הכפר. השירותים להגנת הצומח- מאגר חומרי הדברה. 0 לינואר.4103 Abbott, W A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of economic entomology 18: Ahmad, M., I. Denholm, and R. H. Bromilow Delayed cuticular penetration and enhanced metabolism of deltamethrin in pyrethroid-resistant strains of Helicoverpa armigera from China and Pakistan. Pest management science 62: Audic, S., and J. M. Claverie The significance of digital gene expression profiles. Genome research 7: Awan, D. A., M. A. Saleem, M. S. Nadeem, and A. Shakoori Toxicological and biochemical studies on spinosad and synergism with piperonyl butoxide in susceptible and resistant strains of Tribolium castaneum. Pakistan journal of zoology 44: Baker, J., P. J. MENDOZA, R. Beeman, and J. Throne Fitness of a malathion-resistant strain of the parasitoid Anisopteromalus calandrae (Hymenoptera: Pteromalidae). Journal of economic entomology 91: Bass, C., and L. M. Field Gene amplification and insecticide resistance. Pest management science 67: Baxter, S. W., M. Chen, A. Dawson, J.-Z. Zhao, H. Vogel, A. M. Shelton, D. G. Heckel, and C. D. Jiggins Mis-spliced transcripts of nicotinic acetylcholine receptor α6 are associated with field evolved spinosad resistance in Plutella xylostella (L.). PLoS genetics 6: e Bielza, P., V. Quinto, E. Fernandez, C. Gravalos, and J. Contreras. 2007a. Genetics of spinosad resistance in Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Journal of economic entomology 100: Bielza, P., V. Quinto, J. Contreras, M. Torne, A. Martin, and P. J. Espinosa. 2007b. Resistance to spinosad in the western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), in greenhouses of south eastern Spain. Pest management science 63:

37 Bielza, P., V. Quinto, C. Grávalos, J. Abellán, and E. Fernández. 2008a. Lack of fitness costs of insecticide resistance in the western flower thrips (Thysanoptera: Thripidae). Journal of economic entomology 101: Bielza, P., V. Quinto, C. Grávalos, E. Fernández, J. Abellán, and J. Contreras. 2008b. Stability of spinosad resistance in Frankliniella occidentalis (Pergande) under laboratory conditions. Bulletin of entomological research 98: Chen, E. H., D. D. Wei, G. M. Shen, G. R. Yuan, P. P. Bai, and J. J. Wang De novo characterization of the Dialeurodes citri transcriptome: mining genes involved in stress resistance and simple sequence repeats (SSRs) discovery. Insect molecular biology 23: Chen, X., L. Yuan, Y. Du, Y. Zhang, and J. Wang Cross-resistance and biochemical mechanisms of abamectin resistance in the western flower thrips, Frankliniella occidentalis. Pesticide biochemistry and physiology 101: Conesa, A., S. Götz, J. M. García-Gómez, J. Terol, M. Talón, and M. Robles Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics 21: Denholm, I., and M. Rowland Tactics for managing pesticide resistance in arthropods: theory and practice. Annual review of entomology 37: Diaz-Montano, J., M. Fuchs, B. A. Nault, J. Fail, and A. M. Shelton Onion thrips (Thysanoptera: Thripidae): A global pest of increasing concern in onion. Journal of economic entomology 104: Enayati, A. A., H. Ranson, and J. Hemingway Insect glutathione transferases and insecticide resistance. Insect molecular biology 14: 3-8. Gao, Y., Z. Lei, and S. R. Reitz Western flower thrips resistance to insecticides: detection, mechanisms and management strategies. Pest management science 68: Georghiou, G. P The evolution of resistance to pesticides. Annual review of ecology and systematics 3: Grabherr, M. G., B. J. Haas, M. Yassour, J. Z. Levin, D. A. Thompson, I. Amit, X. Adiconis, L. Fan, R. Raychowdhury, and Q. Zeng Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature biotechnology 29: Gregory, R., A. C. Darby, H. Irving, M. B. Coulibaly, M. Hughes, L. L. Koekemoer, M. Coetzee, H. Ranson, J. Hemingway, and N. Hall A De novo expression profiling of Anopheles funestus, malaria vector in Africa, using 454 pyrosequencing. PloS one 6: e Herron, G. A., T. M. James, J. Rophail, and J. Mo Australian populations of onion thrips, Thrips tabaci Lindeman (Thysanoptera: Thripidae), are resistant to some insecticides used for their control. Australian journal of entomology 47: Hur, J. H., S. Y. Wu, and J. E. Casida Oxidative chemistry and toxicology of S, S, S-tributyl phosphorotrithioate (DEF defoliant). Agricultural and food chemistry 40: Iseli, C., C. V. Jongeneel, and P. Bucher ESTScan: a program for detecting, evaluating, and reconstructing potential coding regions in EST sequences In, ISMB, Insecticide Resistance Action Committee (IRAC) Mode of action. Online.org/documents/moa- classification/?ext=pdf. Accessed 6 december Insecticide Resistance Action Committee (IRAC). Resistance mechanisms. Online.org/about/resistance/mechanisms/. Accessed 6 december Jensen, S. E Insecticide resistance in the western flower thrips, Frankliniella occidentalis. Integrated pest management reviews 5: Keiding, J Persistence of resistant populations after relaxation of selection pressure. World review of pest control 6: Keiding, J Prediction or resistance risk assessment, pp , In Pesticide resistance strategies and tactics for management. National academies press, Washington, DC. Kendall, D., and J. Capinera Geographic and temporal variation in the sex ratio of onion thrips. Southwestern entomologist 15:

38 Kirk, W. D. J Feeding, In T. Lewis (ed.), Thrips as crop pests. CAB International, New York. Kliot, A., and M. Ghanim Fitness costs associated with insecticide resistance. Pest management science 68: Kontsedalov, S., P. Weintraub, A. Horowitz, and I. Ishaaya Effects of insecticides on immature and adult western flower thrips (Thysanoptera: Thripidae) in Israel. Journal of economic entomology 91: Kritzman, A., M. Lampel, B. Raccah, and A. Gera Distribution and transmission of Iris yellow spot virus. Plant disease 85: Lall, B., and L. SINCH Biology and Control of the onion thrips in India. Journal of economic entomology 61: Lebedev, G., F. Abo Moch, G. Gafni, D. Ben Yakir, and M. Ghanim High level of resistance to spinosad, emamectin benzoate and carbosulfan in populations of Thrips tabaci collected in Israel. Pest management science 69: Lester, H. A., M. I. Dibas, D. S. Dahan, J. F. Leite, and D. A. Dougherty Cys-loop receptors: new twists and turns. Trends in neurosciences 27: Lewis, T Thrips, their biology, ecology and economic importance. Academic, London. Lewis, T Pest thrips in prespective, In T. Lewis (ed.), Thrips as crop pests. CAB International, Ney York. Li, X., M. A. Schuler, and M. R. Berenbaum Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual reviews of entomology 52: MacIntyre Allen, J. K., C. D. Scott-Dupree, J. H. Tolman, and C. Ron Harris Resistance of Thrips tabaci to pyrethroid and organophosphorus insecticides in Ontario, Canada. Pest managements science 61: Martin, N., P. Workman, and R. Butler Insecticide resistance in onion thrips (Thrips tabaci) (Thysanoptera: Thripidae). New zealand journal of crop and horticultural science 31: MckKenzie, J. A., M. J. Whitten, and A. M. A The effect of genetic background on the fitness of diazinon resistance genotypes of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina. Heredity 49: 1-9. Mo, J., S. Munro, A. Boulton, and M. Stevens Within-plant distribution of onion thrips (Thysanoptera: Thripidae) in onions. Journal of economic entomology 101: Molenaar, N. D Genetics, thrips (Thrips tabaci L.) resistance and epicuticular wax characteristics of nonglossy and glossy onions (Allium cepa L.). Dissertation Abstracts International, B (Sciences and engineering) 45. Morishita, M Pyrethroid-resistant onion thrips, Thrips tabaci Lindeman (Thysanoptera: Thripidae), infesting persimmon fruit. Applied entomology and zoology 43: Morison, G. D Review of British glasshouse Thysanoptera. Transactions of the royal entomological society of london 109: Moritz, G Thrips as crop pests, In T. Lewis (ed.). Thrips as crop pests. CAB International, New York. Mortazavi, A., B. A. Williams, K. McCue, L. Schaeffer, and B. Wold Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature methods 5: Mota-Sanchez, D., R. M. Hollingworth, E. J. Grafius, and D. D. Moyer Resistance and crossresistance to neonicotinoid insecticides and spinosad in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae). Pest management science 62: Mound, L. A Viruses and invertebrates, In A. J. Gibbs (ed.), Viruses and invertebrates. Marcel dkker, New York. Mound, L. A Biological diversity, In T. Lewis (ed.), Thrips as crop pests. CAB International, New York. 38

39 Mound, L. A., and A. K. Walker Terebrantia (Insecta: Thysanoptera) In Mound, L. A., and A. K. Walker, Founa of New Zealand. Wellington, New Zealand. Murai, T Effect of temperature on development and reproduction of the onion thrips, Thrips tabaci Lindeman (Thysanoptera: Thripidae), on pollen and honey solution. Applied entomology and zoology 35: National Center for Biotechnology Information. Accessed 15 December National Human Genome Research Institute DNA Sequencing Costs. gov/sequencingcosts/. Accessed 15 December Nault, B. A., A. M. Shelton, J. L. Gangloff-Kaufmann, M. E. Clark, J. L. Werren, J. C. Cabrera-la Rosa, and G. G. Kennedy Reproductive modes in onion thrips (Thysanoptera: Thripidae) populations from New York onion fields. Environmental entomology 35: Niu, J. Z., W. Dou, T. B. Ding, G. M. Shen, K. Zhang, G. Smagghe, and J. J. Wang Transcriptome analysis of the citrus red mite, Panonychus citri, and its gene expression by exposure to insecticide/acaricide. Insect molecular biology 21: Orr, N., A. J. Shaffner, K. Richey, and G. D. Crouse Novel mode of action of spinosad: Receptor binding studies demonstrating lack of interaction with known insecticidal target sites. Pesticide biochemistry and physiology 95: 1-5. Parrella, M. P., and T. Lewis Integrated pest management (IPM) in field crops, In T. Lewis (ed.), Thrips as crop pests. CAB International, New York. Perry, T., J. A. McKenzie, and P. Batterham A Dα6 knockout strain of Drosophila melanogaster confers a high level of resistance to spinosad. Insect biochemistry and molecular biology 37: Pimprikar, G. D., and G. P. Georghiou Mechanisms of resistance to diflubenzuron in the house fly, Musca domestica (L.). Pesticide biochemistry and physiology 12: Pozzer, L., I. Bezerra, R. Kormelink, M. Prins, D. Peters, R. d. O. Resende, and A. De Ávila Characterization of a tospovirus isolate of Iris yellow spot virus associated with a disease in onion fields in Brazil. Plant disease 83: Price, N Insect resistance to insecticides: mechanisms and diagnosis. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology 100: Puinean, A. M., S. J. Lansdell, T. Collins, P. Bielza, and N. S. Millar A nicotinic acetylcholine receptor transmembrane point mutation (G275E) associated with resistance to spinosad in Frankliniella occidentalis. Neurochemistry 124: Richardson, B., and G. Wene Control of onion thrips and its tolerance to certain chlorinated hydrocarbons. Journal of economic entomology 49: Rinkevich, F. D., M. Chen, A. M. Shelton, and J. G. Scott Transcripts of the nicotinic acetylcholine receptor subunit gene Pxylα6 with premature stop codons are associated with spinosad resistance in diamondback moth, Plutella xylostella. Invertebrate neuroscience 10: Roth, Z., and I. Khalaila Identification and characterization of the vitellogenin receptor in Macrobrachium rosenbergii and its expression during vitellogenesis. Molecular reproduction and development 79: Rueda, A., F. R. Badenes-Perez, and A. M. Shelton Developing economic thresholds for onion thrips in Honduras. Crop protection 26: Salgado, V., and T. Sparks The spinosyns: chemistry, biochemistry, mode of action, and resistance, pp In Gilbert, L., Iatrou, K., Gill. S. S. (eds.), Comprehensive molecular insect science, vol. 6, New York. Sayyed, A. H., D. Omar, and D. J. Wright Genetics of spinosad resistance in a multi resistant field selected population of Plutella xylostella. Pest management science 60:

40 Sayyed, A. H., M. Ahmad, and N. Crickmore Fitness costs limit the development of resistance to indoxacarb and deltamethrin in Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of economic entomology 101: Scott, J. G Investigating mechanisms of insecticide resistance: methods, strategies, and pitfalls, In R. T. Roush and B. E. Tabashnik (eds.), Pesticide resistance in arthropods. Springer, New York. Scott, J. G Cytochromes P450 and insecticide resistance. Insect biochemistry and molecular biology 29: Scott, J. G Unraveling the mystery of spinosad resistance in insects. Pesticide science 33: Scott, J. G., N. Liu, and Z. Wen Insect cytochromes P450: diversity, insecticide resistance and tolerance to plant toxins. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, toxicology and endocrinology 121: Shazli, A., and A. A. Gawaad Studies on Thrips tabaci Lind.: A new stage in its life cycle. Cellular and molecular life sciences 27: Shelton, A., B. Nault, J. Plate, and J. Zhao Advances in control of onion thrips (Thysanoptera: Thripidae) in cabbage. Journal of economic entomology 96: Shelton, A., J. Plate, M. Chen Regional and temporal variation in susceptibility to λ- cyhalothrin in onion thrips, Thrips tabaci (Thysanoptera: Thripidae), in onion fields in New York. Journal of economic entomology 101: Shen, G.-M., W. Dou, J.-Z. Niu, H.-B. Jiang, W.-J. Yang, F.-X. Jia, F. Hu, L. Cong, and J.-J. Wang Transcriptome analysis of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis). PloS one 6: e Sparks, T. C., J. E. Dripps, G. B. Watson, and D. Paroonagian Resistance and cross-resistance to the spinosyns a review and analysis. Pesticide biochemistry and physiology 102: Sparks, T. C., J. A. Lockwood, R. L. Byford, J. B. Graves, and B. R. Leonard The role of behavior in insecticide resistance. Pesticide science 26: Surget-Groba, Y., and J. I. Montoya-Burgos Optimization of De novo transcriptome assembly from next-generation sequencing data. Genome research 20: Tabashnik, B. E Modeling and evaluation of resistance management tactics, pp , In R. T. Roush and B. E. Tabashnik (eds.), Pesticide resistance in arthropods. Springer, New York. Thompson, G., J. Busacca, O. Jantz, H. Kirst, L. Larson, and T. Sparks. Year Spinosyns: an overview of new natural insect management systems. In Proceedings of the 2001 Beltwide Cotton Production Conference, National Cotton Council.. Toda, S., and M. Morishita Identification of three point mutations on the sodium channel gene in pyrethroid-resistant Thrips tabaci (Thysanoptera: Thripidae). Journal of economic entomology 102: Waiganjo, M., J. Mueke, and L. Gitonga Susceptible onion growth stages for selective and economic protection from onion thrips infestation. Acta horticulturae Wang, D., X. Qiu, X. Ren, F. Niu, and K. Wang Resistance selection and biochemical characterization of spinosad resistance in Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae). Pesticide biochemistry and physiology 95: Wang, D., X. Qiu, H. Wang, K. Qiao, and K. Wang Reduced fitness associated with spinosad resistance in Helicoverpa armigera. Phytoparasitica 38: Wang, W., J. Mo, J. a. Cheng, P. Zhuang, and Z. Tang Selection and characterization of spinosad resistance in Spodoptera exigua (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae). Pesticide biochemistry and physiology 84: Watson, G. B Actions of insecticidal spinosyns on γ-aminobutyric acid responses from smalldiameter cockroach neurons. Pesticide biochemistry and physiology 71: Watson, G. B., S. W. Chouinard, K. R. Cook, C. Geng, J. M. Gifford, G. D. Gustafson, J. M. Hasler, I. M. Larrinua, T. J. Letherer, and J. C. Mitchell A spinosyn-sensitive Drosophila melanogaster nicotinic acetylcholine receptor identified through chemically induced target 21

41 site resistance, resistance gene identification, and heterologous expression. Insect biochemistry and molecular biology 40: Whalon, M., D. Mota-Sanchez, and R. Hollingworth Analysis of global pesticide resistance in arthropods, pp In M. Whalon, D. Mota-Sanchez and R. Hollingworth (eds.), Global pesticide resistance in arthropods. CABI, Wallingford. Wilkinson, C Role of mixed-function oxidases in insecticide resistance, , Pest resistance to pesticides. Springer. Williams, I. S., H. L. A, A. MDewar, and A. F. G. Dixon Selection for a moderately insecticide resistant clone of Myzus persicae (Hemiptera: Aphididae) on sugarbeet in the absence of pesticides. Bulletin of entomological research 88: Wyss, C. F., H. P. Young, J. Shukla, and R. M. Roe Biology and genetics of a laboratory strain of the tobacco budworm, Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae), highly resistant to spinosad. Crop protection 22: Yang, N., W. Xie, C. Jones, C. Bass, X. Jiao, X. Yang, B. Liu, R. Li, and Y. Zhang Transcriptome profiling of the whitefly Bemisia tabaci reveals stage specific gene expression signatures for thiamethoxam resistance. Insect molecular biology 22: Ye, J., L. Fang, H. Zheng, Y. Zhang, J. Chen, Z. Zhang, J. Wang, S. Li, R. Li, and L. Bolund WEGO: a web tool for plotting GO annotations. Nucleic acids research 34: W293-W297. Young, H., W. Bailey, R. Roe, T. Iwasa, T. Sparks, G. Thompson, and G. Watson Mechanism of resistance and cross-resistance in a laboratory, spinosad-selected strain of the tobacco budworm and resistance in laboratory-selected cotton bollworms. In Proceedings of the 2001 Beltwide Cotton Production Conference, National Cotton Council. Yu, S Substrate specificity of glutathione- S -transferases from the fall armyworm. Pesticide biochemistry and physiology 74: Zhang, S., S. Wang, H. Li, and L. Li Vitellogenin, a multivalent sensor and an antimicrobial effector. The international journal of biochemistry and cell biology 43: Zhang, S. Y., S. Kono, T. Murai, and T. Miyata Mechanisms of resistance to spinosad in the western flower thrip, Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae). Insect science 15: Zhang, Y., H. Guo, Q. Yang, S. Li, L. Wang, G. Zhang, and J. Fang Overexpression of a P450 gene (CYP6CW1) in buprofezin-resistant Laodelphax striatellus (Fallén). Pesticide biochemistry and physiology 104: Zhang, Z., P. Zhang, W. Li, J. Zhang, F. Huang, J. Yang, Y. Bei, and Y. Lu De novo transcriptome sequencing in Frankliniella occidentalis to identify genes involved in plant virus transmission and insecticide resistance. Genomics 101: Zhao, J., Y. Li, H. Collins, L. Gusukuma-Minuto, R. F. L. Mau, G. Thompson, and A. Shelton Monitoring and characterization of diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) resistance to spinosad. Journal of conomic entomology 95:

42 10. נספחים נספח 1- )א( התקן ליניקת אויר )Aspirator( אשר שימש להעברת התריפסים באמצעות שאיבה. ההתקן בנוי מצינור סיליקון ולתוכו הורכב צינור זכוכית ופיסת צמר גפן. )ב( צמחי מלכודות לאיסוף תריפסים. העציצים הונחו במתקן כשמעליהם בקבוקי מים עם טפטפת לצורך השקיה. העציצים הונחו למשך שבועיים בקרבת חממות עירית. )ג( צנצנות הגידול בהם גודלו התריפסים. א ג ב נספח 2- תאי מונגר שהותאמו לבדיקת רגישות לחומרי הדברה בתריפסים )1998 al..)kontsedalov et על פי מידע שנלקח ממשרד החקלאות ופיתוח הכפר המומלץ לחקלאי הטרייסר נספח 3- חישוב ריכוז במ"ל לדונם.) הנתונים באתר האינטרנט הם ומקובל לרסס בנפח תרסיס של 45 ליטרים לדונם. מינון תכשיר ההדברה המומלץ לטרייסר הינו 71 מ"ל לדונם. משקלו של 0 מ"ל תכשיר ההדברה טרייסר הוא גרם. מכאן שמשקלו של 71 מ"ל הינו על כן משקלו המומלץ של התכשיר עבור 0 ליטר הינו גרם. מכיוון שאחוז החומר הפעיל בתכשיר הוא )041 04% גרם חומר פעיל לליטר(, כמות החומר הפעיל המומלצת מ"ג חומר פעיל ליטר.)376ppm( תכשיר ההדברה נמהל במים מזוקקים לריכוזים 376 הינה הנדרשים. כל התמיסות עורבבו ביסודיות כדי להבטיח פיזור הומוגני של התכשיר בתמיסה. 24