זאלקונ ןודוקיטנא זאלקונה רתאו דיטואלקונ רושיק ירתא ןויפאו

Transcript

1 אנטיקודון נוקלאז- :PrrC טיהור, מבנה רביעוני ואפיון אתרי קישור נוקלאוטיד ואתר הנוקלאז חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מאת שני בלנגה-כנפי הוגש לסנאט אוניברסיטת תל-אביב חשוון תשס"ו

2 עבודה זו נעשתה בהדרכת פרופסור גבריאל קאופמן

3 באהבה לתומר

4 תודתי להורי שתמכו בי באהבה ובמסירות לאורך כל השנים ולכל משפחתי היקרה

5 תודתי והערכתי העמוקה לפרופ' גבריאל קאופמן שהייתה לי זכות גדולה להיות תלמידתו. בידיעותיו הרבות, מחשבתו המקורית, יצירתיותו ואישיותו המיוחדת הנחני, סייע ותמך בי לאורך כל שנות המחקר. תודה לד"ר עבד אלסלאם עאזם על מעורבותו האישית ותרומתו הרבה בטיהור החלבון. תודה למיכל עמיצור על העזרה, התמיכה הרבה ותחושת ביטחון שהעניקה לי. לחברי למעבדה בהווה ובעבר: תמר נתנאל, רוברטו מידלר, מירה פרלמן, לימור כהן-קצב, עופר מן, סלבה ריבקין, דניאל קליימן, לנה דוידוב, מור גולדנברג וקרין קובלסקי ברצוני להודות לכל אחד ואחת מכם על העזרה המקצועית ועל האווירה החמה והחברית שהייתה במעבדה. נהנתי לעבוד במחיצתכם.

6 רשימת קיצורים ACNase ASL BD DEPC DSS EDAC EF-Tu GA IPTG kda LysRS Anticodon nuclease Anticodon stem and loop 2,3-butanedione Diethylpyrocarbonate Disuccinimidyl suberate 1-ethyl-3-(3-dimethlamino-propyl) carbodiimide Translation elongation factor Tu Glutaraldehyde Isopropyl β-d-thiogalatoside Kilo Dalton Lysyl-tRNA Synthetase MALDI-TOF Matrix assisted laser desorption ionization- time of flight MS PEG PAGE PCR PG Prr Pnk Rli SDS TMAO Mass spectrometry Polyethylene-glycol Polyacrylamide gel electrophoresis Polymerase chain reaction Phenylglyoxal Pnk, Rli restriction Polynucleotide kinase RNA ligase Sodium dodecyl sulfate Trimethylamine N-oxide

7 תוכן עניינים תקציר מבוא ACNase מתפקד כאמצעי התאבדותי אנטי-ויראלי מנגנון הגבלת פאג' T4 ע"י ACNase מסלול ביקוע ותיקון ה- trna Lys אתר prr מקודד לתצמיד ACNase השלם Ic משתייך למערכת רסטריקציה מודיפיקציה מטיפוס EcoprrI מקור אתר prr באלמנט גנטי נייד שהתאזרח בכרומוזום.E coli פפטיד Stp תוצר פאג' T4 מפעיל את מערכת ACNase האינטראקציה בין PrrC ל- EcoprrI חלוקה מבנית-פונקציונלית של PrrC מנגנון הפעלת ACNase מנגנון הקטליזה המשוער והספציפיות לסובסטרט של PrrC חוסר יציבות PrrC ורעילותו לתא מטרת העבודה שיטות וחומרים חומרים רשימת בופרים רשימת גזעי חיידקים ופאג' םי רשימת פלסמידים רשימת הפריימרים לריאקציות PCR שיבוט הפלסמידים שנוצרו בעבודה זו הפקת תמציות תאים המכילות את PrrC בדיקת רמת ביטוי PrrC בתא מבחני פעילות ACNase שלבי טיהור PrrC שלבי טיהור PrrC נוספים שהתבצעו בשילובים חלקיים והביאו לטיהור חלקי ריאקציות לצילוב חלבון-חלבון אנליזת PrrC במיקרוסקופ אלקטרוני (EM) צילוב נוקלאוטידים ל- PrrC בדיקת פעילות NTPase ב- PrrC מודיפיקציות כימיות של PrrC אנליזת MALDI-TOF-MS זיהוי PrrC באמצעות נוגדנים שיטות כלליות תוצאות הגברת ביטוי PrrC בתא וייצובו במבחנה מוטנט PrrC-D222E בעל פעילת ACNase מוחלשת מצטבר בתא לרמה גבוהה ביטוי משולב של PrrC וחלבוני תיקון RNA

8 I פיצוי על הקודונים הנדירים ב- prrc משפר את ביטוי החלבון בתא השפעת TMAO על יציבות PrrC ועל ריאקצית ACNase ייצוב נוסף של PrrC ע"י הנוקלאוטיד dttp טיהור PrrC בצורתו הפעילה איחוי תווית His 6 לקצה הקרבוקסלי של PrrC שלבי טיהור PrrC שלבים נוספים שנבחנו לטיהור PrrC בירור המבנה הרביעוני של PrrC הצורה הפעילה של PrrC הינה טטרמרית הקשר בין המבנה האוליגומרי של PrrC לבין פעילותו המצב האוליגומרי של PrrC בתאים vivo) (in תמונה פרלימנרית של PrrC במיקרוסקופ אלקטרוני זיקת PrrC לנוקלאוטידים המעורבים בהפעלת האנזים הלטנטי PrrC קושר בצורה שונה את שלושת הקו-פקטורים הנוקלאוטידים מוטציות בחלק ה- NTPase של PrrC מעכבות את קישור הנוקלאוטידים פעילות NTPase ב- PrrC זיהוי רכיבי האתר הפעיל של ACNase באמצעות מודיפיקציות כימיות דיון הגורמים המשפיעים על יציבות PrrC השפעות נוגדות של TMAO על ייצוב PrrC ופעילות ACNase קישור נוקלאוטיד ל- PrrC מייצב את החלבון בקונפורמציה הפעילה המשך טיהור PrrC להומוגניות יצריך המשך ייצוב החלבון המבנה הרביעוני של PrrC הפרדה פונקציונלית של אתרי קישור נוקלאוטידים ב- PrrC שלושת הקו-פקטורים הנוקלאוטידים נקשרים לאותו אזור ב- PrrC ראיות ש- PrrC עשוי לקשור dttp בו-זמנית עם GTP אך לא עם ATP פעילות NTPase המשוערת של PrrC השוואת PrrC לאנזימי ATPase בעלי סוגי אתרי קישור נוקלאוטיד נפרדים אופן הבקרה של GTP,ATP ו- dttp בהפעלת ACNase הלטנטי תפקיד dttp בהפעלת ACNase הלטנטי האתר הקטליטי של PrrC מגדיר משפחת ריבונוקלאזות הגבלה חיידקיות ריכוז תת-מרווה של trna Lys מרגש את ACNase למתמירי Arg או Glu/Asp PrrC מייצג משפחת ריבונוקלאזות הגבלה בעלות ספציפיות מגוונת השלכות יישומיות רשימת ספרות רשימת פרסומים Summary

9 ה, תקציר PrrC הינו אנזים אנטיקודון נוקלאז (ACNase) חיידקי ייחודי ל-.tRNA Lys תפקידו ACNase התגלה הידוע הוא להגן על החיידק הנושא אותו מהתפשטות הדבקת פאג' T4. בגזע.E coli ייחודי המגביל מוטנטי T4 חסרי פולינוקלאוטיד קינאז (pnk) ו/או RNA ליגאז האתר prr אחראי להגבלה זו, מקודד לצורה הלטנטית של.ACNase הוא מושתת.(rli) על חלבון הליבה PrrC ועל מערכת רסטריקציה-מודיפיקציה של DNA המכונה.EcoprrI מערכת EcoprrI צמודה פיזית ל-,PrrC מייצבת אותו וממסכת את פעילות ה- ACNase EcoprrI מעוכבת ע"י פפטיד קטן שלו. כאשר פאג' T4 מדביק חיידק בעל אתר prr פעילות בשם Stp תוצר הפאג'. Stp מפעיל אגב כך את,PrrC ליבת ה-.ACNase הפעלת ACNase מביאה לביקוע מולקולות trna Lys של הפונדקאי. הביקוע מתרחש בלולאת האנטיקודון תוך יצירת קצוות 2-3 -פוספט ציקלי ו- 5 הידרוקסיל. פאג' T4 מזן הבר מתגבר על כך שכן הוא מתקן את הנזק באמצעות אנזימי תיקון :RNA פולינוקלאוטיד קינאז (Pnk) ו- RNA ליגאז.(Rli) אולם כאשר הפאג' חסר אחד מהם מידלדל מאגר trna Lys התאי. עקב כך נפסקת סינתזת חלבוני הפאג' המאוחרים וההדבקה נעצרת. עד כה התגלו אתרים דמויי prr ב- 16 זני חיידקים הפזורים בין קבוצות פילוגנטיות שונות. אתרים אלה מקודדים כנראה גם למערכות הגנה משולבות נוגדות פאג' םי, בדומה לאב-הטיפוס מ-.E. coli העניין ב- PrrC מ-.E coli ובהומולוגים שלו נובע משני טעמים. ראשית, הם מייצגים משפחת ריבונוקלאזות הגבלה אנטיויראליות הפועלות כקו הגנה שני אשר לא נחקרו דיין. שנית, נתקפים על ידם,ככל הנראה, מבני RNA חיוניים ומשומרים. לכן ייתכן שאפשר יהיה לפתח מהם אמצעים לתקיפת מטרות תאיות או נגיפיות בעלות חשיבות רפואית או ביוטכנולוגית. דוגמא לכך היא יכולתו של PrrC מ-.E coli לפגוע בסוג trna Lys אנושי הנחוץ לשכפול נגיף.HIV בשל זאת נשקלת האפשרות לפתח ממנו אמצעים נוגדי שכפול נגיף זה. 1

10 תוצאות קודמות של ניסויי מוטגנזה, מבדקי ACNase בתא ובמערכות אל-תאיות גולמיות וכן ניתוח נתוני רצף הגדירו שני דומיינים תפקודיים במסגרת הקריאה של :PrrC אחד משמש כ- NTPase ושני מכיל את אתר ה- ACNase בתוכו. דומיין ה- NTPase כולל את שני השלישים האמיניים של החלבון ומצויים בו מוטיבים אופייניים לתת-יחידת ה- ATPase של חלבוני.ABC transporter על פי השערה דומיין זה אחראי לוויסות האינטראקציה הממסכת של.EcoprrI בין היתר הוא עשוי לזרז הידרוליזת GTP הנחוצה להעברת ACNase מהמצב המושתק לפעיל. שני נוקלאוטידים נוספים משפיעים על ריאקצית ההפעלה: האפקטור החיובי,dTTP אשר נקשר ל- PrrC בזיקה גבוהה ב- 3 סדרי גודל לערך מ-,GTP וכן,ATP אשר מעכב את הפעלת.ACNase כיוון שהשערה זו התבססה על תוצאות שהתקבלו עם מקטעי אנזים גולמיים לא ניתן היה לשלול את האפשרות שהנוקלאוטידים הללו פועלים במערכת ה- ACNase בתיווך חלבונים נוספים או אחרים. בחלק הקרבוקסילי הנותר של,PrrC בו מקנן אתר,ACNase זוהו אתר משוער לקישור האנטיקודון שמוטציות בו שינו את הספציפיות לסובסטרט ה- trna וכן שיירים החשודים בקטליזת ריאקצית ביקוע ה- trna. הבנה ממצה של מבנה ומנגנון פעילות PrrC תלויה באפשרות להפיק ולטהר את החלבון להומוגניות. דבר זה לא התאפשר בשעתו בשל הקושי לצבור את PrrC בתא ברמה גבוהה ובשל אי יציבותו הרבה. המטרה הראשונה של עבודה זו הייתה להתגבר על מכשולים אלו ולטהר את הצורה הפעילה של PrrC להומוגניות. משהושגה מטרה זו ניתן היה לנצל את החלבון המטוהר כדי לבחון אחדות מההנחות שהוזכרו לעיל. הדרכים בהן הגברתי את ביטוי PrrC בתא וייצבתיו במבחנה כללו שימוש במוטנט מוחלש המצטבר בתא לרמה גבוהה מזו של גזע הבר, ביטויו בתא המייצר ביתר סוגי trna נדירים ושימוש בשתי מולקולות קטנות שייצבו אותו במבחנה: הצ'פרון הכימי TMAO והליגנד הנוקלאוטידי.dTTP אמצעים אלו אפשרו טיהור משמעותי של.PrrC אגב כך ניתן היה לקבוע שצורתו הפעילה היא טטרמרית, כנראה דימר של דימרים. 2

11 בהמשך שימש PrrC המטוהר לבחינת זיקתו המשוערת של החלבון לקו-פקטורים הנוקלאוטידיים המשפיעים על הפעלת האנזים הלטנטי. דגם קישור הנוקלאוטידים ל- PrrC התברר בעבודה זו מניסויי צילוב פוטוכימי וצילוב נגזרות נוקלאוטידיות מחומצנות ע"י פריודט. תוצאות ניסויים אלה מתיישבות עם הרעיון ש- GTP ו- dttp משתתפים שניהם בהפעלת ACNase הלטנטי ו- ATP משמש כאנטגוניסט להפעלה. מתוצאות אלו נרמז גם ש- GTP בלבד למצב בו הוא קושר בו-זמנית את ATP יכול לעבור בין מצב בו הוא קושר PrrC ו- dttp לאתרים תואמים בעלי אפיניות נמוכה או גבוהה. ייתכן שבקונטקסט הטבעי של האנזים השלם (תצמיד (EcoprrI-PrrC מחולל Stp מעבר מהמצב הראשון לשני ומפעיל בכך את.ACNase טיהור PrrC אפשר לחקור גם את תכונות האתר הקטליטי של.ACNase בעבודה זו מתוארים ניסויי מודיפיקציה כימית שנערכו כדי לבדוק את מעורבות השיירים Glu 324 ו - Arg 320 בקטליזת ביקוע,tRNA Lys דבר שנרמז ע"י ניסויי מוטגנזה וניסויי "הצלה כימית" קודמים. ממצאים ראשוניים המתוארים כאן מורים שהמגיבים הייחודיים ל- Arg ול- Glu מעכבים את פעילות,ACNase אולם רק בנוכחות ריכוזים תת-מרווים של trna Lys אך לא בהעדרו או בריכוז מרווה שלו. כיוון ש- PrrC הטטרמרי עשוי להכיל כמה אתרי ACNase ובהנחה שהמגיבים הנ"ל התמירו אמנם את שיירי Arg או Glu באתר הפעיל, ניתן להסיק שהאתר הקטליטי של ACNase קבור בתוך החלבון בהעדר.tRNA Lys אך בנוכחות כמות מוגבלת של סובסטרט זה מתחולל שינוי מבני בחלבון. שינוי זה חושף את האתרים הקטליטיים, שחלקם מוגן על ידי הסובסטרט בעוד שהפנויים נתקפים ע"י המגיבים הנ"ל. בנוכחות ריכוז מרווה של trna Lys מאוכלסים כל האתרים והם שוב נחסמים. השיירים החשודים כקטליטיים משומרים בכל ההומולוגים של PrrC ולכן סביר שהומולוגים אלה פועלים אף הם כריבונוקלאזות. לעומת זאת, השיירים המעורבים בהכרת trna Lys ע"י PrrC מ-.E coli שמורים רק ע"י כמה הומולוגים. מכאן אפשר להניח שיתר ההומולוגים תוקפים כנראה מבני RNA אחרים הנחוצים להתרבות הפאג' בתא המודבק. 3

12 לסיכום, בעבודה זו הושג לראשונה טיהור כמעט להומוגניות של,PrrC חלבון ליבת ה-.ACNase דבר זה אפשר בהמשך לגלות שהצורה הפעילה של PrrC היא טטרמרית ולבחון את יכולתו לקשור את הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים המשתתפים בהפעלת ACNase הלטנטי. תוצאות נוספות אוששו את ההנחה בדבר מעורבות שני שיירי PrrC בקטליזת ריאקצית ביקוע ה- RNA. הממצאים מספקים גם מערכת מתאימה לחקירה ממצה של יחסי המבנה-תפקוד של אב-טיפוס של משפחת ריבונוקלאזות הגבלה ויקדמו אולי יישומים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים שלה. 4

13 1. מבוא PrrC הינו אנזים אנטיקודון נוקלאז (ACNase) חיידקי ייחודי לטרנספר RNA של ליזין ) Lys PrrC.(tRNA מצוי בגזעי E. coli מסוימים במצב לטנטי ומופעל בעקבות הדבקת פאג' T4. כתוצאה מכך עשויה להיפגע סינתזת חלבוני הפאג', דבר שהיה מונע את התפשטותו באוכלוסיית תאי החיידק. אלא שהפאג' מתגבר על כך באמצעות מערכת תיקון.(Kaufmann, (2000 לה הוא מקודד RNA PrrC מעורר עניין מכמה היבטים. ראשית, הוא מייצג משפחת ריבונוקלאזות חיידקיות המשמשות מעין קו-הגנה שני מפני פאג'. שנית, חלק ממנו מהווה אתר NTPase רגולטורי בעל תכונות קישור נוקלאוטידים ייחודיות המתוארות לראשונה בעבודה זו, תכונות אותן הוא חולק כנראה רק עם ההומולוגים הישירים שלו הפזורים בעולם החיידקים. שלישית, תהליך הכרת הסובסטרט וביקועו כרוך כנראה בעקרונות חדשים של שילוב קישור החלבון ל- RNA עם הפעלת האתר הקטליטי. רביעית, PrrC וכנראה גם ההומולוגים שלו מזהים ותוקפים מטרות חיוניות לסינתזת חלבונים ולכן הם יכולים להוות מקור ליישומיים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים חדשים. במבוא אסקור את הידוע על התפקיד הביולוגי, יחסי המבנה-תפקוד של אנזים זה והקשרים נוספים שלו הרלבנטיים למטרות וממצאי עבודה זו. ACNase מתפקד כאמצעי התאבדותי אנטי-ויראלי 1.1 תאי חיידקים בודדים מקריבים עצמם לתועלת כלל האוכלוסייה. תופעה זו מתרחשת במגוון נסיבות, ביניהן הדבקת פאג' (1995.(Yarmolinsky, במקרים אלו התא המודבק מנטרל פונקציה תאית חיונית וכך מונע את ריבוי הפאג' והתפשטותו לתאים שכנים. שלוש מערכות התאבדות המופעלות בעקבות הדבקת הפאג' T4 תוארו ב-.E. coli הן כוללות את תעלת היונים Rex שהפעלתה גורמת להרס פוטנציאל הממברנה (1992 al.,,(parma et הפרוטאז Lit הבוקע את גורם התרגום (Yu and Snyder, 1994) Elongation factor Tu ו-, PrrC-ACNase הנדון בעבודה זו, המשבש תרגום חלבונים ע"י פגיעה ספציפית ב-.tRNA Lys 5

14 ש" הי מנגנון הגבלת פאג' T4 ע"י ACNase ACNase קיים בתא החיידק במצב לטנטי. כאשר מודבק החיידק בפאג' T4 הוא 2'-3' מופעל ובוקע את trna Lys בלולאת האנטיקודון בין הבסיסים ומותיר קצוות פוספט ציקלי ו- '5 הידרוקסיל. מאחר ושעתוק גנים חיידקיים נפסק מיד עם תחילת ההדבקה trna Lys משלו, מידלדל מאגר ה- trna Lys והפאג' אינו מקודד ל-,(Miller et al., (2003 התאי (1987 al.,.(amitsur et דבר זה עשוי לעכב את סינתזת חלבוני T4 המאוחרים ולעצור את ההדבקה (1978 al.,.(sirotkin et אולם שני אנזימי תיקון RNA המקודדים ע"י פאג' T4 - פולינוקלאוטיד קינאז (Pnk) ו- RNA ליגאז,(Rli) משחזרים את trna Lys השלם בריאקציות עוקבות ומאפשרים בכך את המשך ההדבקה. לכן פאג'ים החסרים להם אחד מאנזימי תיקון ה- RNA או את שניהם מוגבלים על חיידקים המבטאים את מערכת ACNase הלטנטית 1987) al.,.(amitsur et מסלול ביקוע ותיקון ה- trna Lys תיקון trna Lys לאחר ביקוע ACNase נעשה בשני שלבים. Pnk תחילה מפרק את הקשר הפוספודיאסטרי ליצירת ' 3 -פוספו-מונואסטר המוסר על ידו בהמשך לחשיפת '3- הידרוקסיל ובמקביל מזרחן את הקצה '5 הידרוקסיל. בשלב השני מאחה Rli את הקצוות שעובדו ע"י Pnk לקבלת מולקולת trna Lys שלמה ) 1987 al., (Amitsur et (תמונה 1.1). מכאן, שלושת האנזימים Pnk,ACNase ו- Rli יוצרים יחד מעין מסלול חבור סרק" בעל מאפיינים דומים לשחבור pre-trna יוקריוטי אך ללא חליצת אינטרון. שחבור ה- pre-trna נפתח כאשר אנדוריבונוקלאז בוקע את מולקולת ה- pre-trna פעמיים, משני עברי האינטרון הנמצא בלולאת האנטיקודון של דומיין ה- trna הבשל. בדומה ל- PrrC מותיר נוקלאז השחבור קצוות 2-3 -פוספט ציקלי ו- 5 דרוקסיל. עיבוד הקצוות והאיחוי נעשים בדומה למערכת החיידקית/פאג' תי, אולם אנזימי ה-' 3 -פוספטז-' 5 פולינוקלאוטיד קינאז ו- RNA ליגאז מאוחים כחלבון אחד. הפוספטז פותח את הפוספט הציקלי אך אינו מסיר את ה- '2 -פוספומונואסטר הנותר גם לאחר האיחוי ע"י הליגאז. 6

15 הסרתו של 2 -פוספט מסורה בידי פוספו-טרנספראז מתמחה, המעביר אותו לאחר האיחוי לנגזרת (Abelson et al., (1998 NADP (תמונה 1.1). קיים קשר אבולוציוני ברור בין אנזימי התיקון של הפאג' ומקבליהם השחבוריים בעוד שאין כל דמיון ברצף וסביר שגם לא במבנה בין הנוקלאזות הפותחות את התהליכים. תמונה -1.1 השוואת מסלול ביקוע-תיקון.A trna Lys ביקוע trna Lys ע"י ACNase בתאי E. coli המודבקים בפאג' B. T4. מסלול שחבור pre-trna יוקריוטי (1998 al.,.(abelson et סובסטרט ה- RNA, תוצרי ביניים ותוצרים בכל מסלול מתוארים סכמאטית. -P - מייצג קשר פוספודיאסטרי, <P ו- OH מייצגים קצוות '3-'2 פוספט ציקלי ו- 5'-OH, בהתאמה. OH ו- P מייצגים קצוות 3'-OH ו- phosphoryl '5, בהתאמה. P'2 מייצג קשר פוספודיאסטרי עם סרח עודף של phosphoryl '2. מקודד לתצמיד ACNase השלם 1.2 אתר prr התגלה בעקבות חיפוש תפקידים ביולוגים של אנזימי תיקון ה- RNA ACNase של E. coli נדירים פאג' T4 שתוארו לעיל. פאג'ים החסרים באחד מהם מוגבלים על זני 1982) al.,.(depew and Cozzarelli, 1974; Runnels et האלמנט הגנטי האחראי להגבלה כונה prr (על שום.(pnk rli restriction הוא מופה לדקה 29 בכרומוזום החיידק (1984 Snyder,.(Abdul-Jabbar and אתר prr כולל רצף של ארבעה מסגרות קריאה Levitz et al., ) המכונות,prrA-D אשר מקודדות לאנזים ACNase בצורתו הלטנטית נחשב כליבת.ACNase ביטויו כמות שהוא ב- coli.e או 1990). תוצר הגן prrc 7

16 במערכות הטרולוגיות דוגמת תאים אנושיים משרה פעילות ACNase גלויה (פעילות ליבה) PrrC המסקנה ש-.(Morad et al., 1993; Perlman, 2002; Shterman et al., 1995) מהווה בעצמו את ליבת ACNase נתמכת על ידי ראיות נוספות. למשל, מופו שיירים Jiang et al., 2002; ) ספציפיים ב- PrrC המעורבים בהכרת האנטיקודון של trna Lys al., 1999 (Jiang et al., 2001; Meidler et ובביקועו prep.).(amitsur et al., in כמו כן, כמתואר בעבודה זו, פעילות ליבת ACNase מתנקה עם הצורה הטטרמרית של PrrC.(Blanga et al., submitted) שלושת תוצרי הגנים הנוספים של אתר,PrrABD,prr מייצבים את PrrC וממסכים את פעילות הליבה, שכן בנוכחותם ACNase אינו פעיל בתא הלא מודבק. הגורמים הממסכים מהווים הן בעצמם והן בנוכחות PrrC מערכת רסטריקציה-מודיפיקציה של DNA מטיפוס Ic המכונה.(Linder et al., 1990) EcoprrI Ic משתייך למערכת רסטריקציה-מודיפיקציה מטיפוס EcoprrI מערכות רסטריקציה-מודיפיקציה מגינות על החיידק הנושא אותן מפני חדירת DNA זר. מערכות רסטריקציה-מודיפיקציה מטיפוס I המכונה host specificity ) Hsd,(determinant אליהן משתייך,EcoprrI מהוות תצמיד רב אנזימתי המזהה רצף מטרה ספציפי ב- DNA ופועל בהתאם לנוכחות או העדר מודיפיקציה בו. EcoprrI מכיל תת- יחידה לזיהוי רצף,(HsdS) DNA שני עותקי תת- יחידת המתילאז (HsdM) ושני עותקים של תת- יחידת הנוקלאז (HsdR) המשמש לטרנסלוקציה וביקוע ה-.DNA בהעדר כל מודיפיקציה האנזים מושך קטע DNA מאתר ההכרות ועד לאתר הביקוע העשוי להיות מרוחק כדי מאות עד אלפי בסיסים. מניחים כי מרחק זה מייצג את נקודת המפגש בין שתי מולקולות אנזים הפועלות בו זמנית על אתרי הכרות שכנים ו"נעות" זו לקראת זו,ATP לפעילויות האנזים דרושים.(Studier and Bandyopadhyay, 1988) S-Adenosylmethionine ויוני מגנזיום כקופקטורים. מערכות רסטריקציה-מודיפיקציה מטיפוס I נחלקות לארבע משפחות,,A-D כאשר EcoprrI משתייכת למשפחת C. מערכות 8

17 המשתייכות לאותה משפחה חולקות הומולוגיה גבוהה וניתן ליצור ביניהן צירופי תת-יחידות כימריים פעילים. פרטים מאותה משפחה נבדלים ביניהם בעיקר באתר הכרות רצף ה- DNA שבתת-יחידת HsdS (מאמר סקירה.(Murray, 2000 E. coli מקור אתר prr באלמנט גנטי נייד שהתאזרח בכרומוזום EcoR124I במערכות הומולוגיות ל- EcoprrI מטיפוס Ic דוגמת יש במקום הגן מרווח בין גני בין prrb / hsds ל- prrd / hsdr באורך של כ- 120 בסיסים. prrc כנראה ש- prrc חדר לתוך מרווח כזה (1990 al.,.(linder et אתרים משולבים כאלה נמצאו עד כה בלמעלה מתריסר גנומי חיידקים שונים בעוד ש- prrc חופשי לא התגלה עדיין. ייתכן אפוא שאירוע החדרת prrc התרחש במנגנון רקומבינציה באתר ייחודי באחת ממערכות Hsd בחיידק כל שהוא. לאחר מכן הועבר prrc לאתרי hsd נוספים ברקומבינציה הומולוגית. תרחיש חלופי הוא קיום אלמנט נושא prrc אשר מחדירו לעת מוצא במנגנון רקומבינציה באתר ייחודי לאתרי.hsd יש לציין שמערכות Hsd הומולוגיות ל- EcoprrI ידועות ב-.E coli רק כתוצרי פלסמידי R והן סמוכות לרצפים דמויי סיגנל אריזה של פאג' (pac packaging signals) P1 ולמערכת phd/doc הממכרת את התא לפלסמיד הנושא אותה 1997) al.,.(lehnherr et al., 1993; Tyndall et דמיון זה רומז שמקורה של מערכת prr של.E coli בפלסמיד R או בפרופאג'. מאידך, מערכות Hsd מתת- המשפחה.prrC מצויות גם בכרומוזומים של גזעי חיידקים שגם להם אתרים עם או בלי Ic לכן מנגנון העברת prrc מחיידק לחיידק במינים אלה יכול להיות שונה. כמו כן, יש לציין שמערכות התאבדות נוספות הפועלות כנגד הדבקת פאג' T4 מקודדות אף הן ע"י אלמנטים גנטיים ניידים שעברו אינטגרציה לכרומוזום החיידק (1995.(Snyder, 9

18 1.2.3 הפפטיד Stp תוצר פאג' T4 מפעיל את מערכת ACNase שתי מערכות ההגבלה אלו של ה- DNA (EcoprrI) ו- trna (PrrC) מוצמדות לא רק ברמת הגן אלא מצויות גם באינטראקציה פיזית ברמת החלבון, כפי שהסתבר משיקוע אימוני משותף (1992 al.,.(amitsur et משמעות אפשרית של ההצמדה הגנטית והתפקודית של שתי מערכות ההגבלה אלו נרמזת מתכונות,Stp פפטיד תוצר פאג' T4. פפטיד זה מעכב את פעילות הגבלת ה- DNA של,EcoprrI ומפעיל אגב כך את PrrC -ליבת.ACNase סבורים ששינויים מבניים הנגרמים ב- EcoprrI בעקבות קישור Stp משפיעים על PrrC מבלי שייפרד מהאנזים השלם (תצמיד.(EcopprI-PrrC עיכוב מערכת הגבלת ה- DNA אינו תלוי בנוכחות.PrrC לכן סביר שמטרתו הראשונית של Stp היא נטרול מערכת.(Penner et al., 1995) EcoprrI בהמשך אכנה את תצמיד EcoprrI-PrrC אנזים ACNase השלם (בין שמדובר בצורתו הלטנטית או המופעלת) ואת PrrC החופשי המבוטא בהעדר חלבוני EcoprrI כליבת.ACNase ניתן לתאר תרחיש אבולוציוני בו רכש החיידק בשלב הראשון את מערכת הגבלה כנגד ה- DNA של הפאג', והוא מצידו השיב ברכישת פפטיד המנטרל מערכת זו. החיידק (ACNase) הוסיף "מוקש" בדמות אנזים כנגד trna Lys המהווה קו הגנה שני אשר מופעל עם נטרול מערכת ההגבלה כנגד ה-.DNA לבסוף הפאג' רכש שני אנזימים המתקנים את הנזק ל- trna Lys ומאפשרים לו להמשיך בהדבקה ללא הפרעה (תמונה 1.2). אולם יש לציין כי תרחיש זה מותיר שאלות לא פתורות. למשל, שיירי הציטוזין ב- DNA של פאג' T4 מותמרים ע"י קבוצת 5 -הידרוקסימתיל וע"י אחד או שני שיירי גליקוזיל. התמרות אלו מחסנות אותו מלכתחילה מפני, EcoprrI ואמנם נמצא ש- Stp אינו חיוני להדבקת חיידקים המקודדים למערכת.prr יתר על כן, כמו שהוזכר קודם, Stp אינו מגן על פאג' םי T4 EcoprrI המוטנטים ב- Pnk ו/או Rli בעלי DNA לא מותמר מפני פעילות (1984 Snyder,.(Abdul-Jabbar and ולמרות זאת Stp השתמר בקרב אותם פאג' םי.(Penner et al., 1995) מוטנטים T4 10

19 תופעה זו של מסלול ביקוע- תיקון RNA הנובע ממאבק בין פאג' ותא הפונדקאי נפוצה כנראה בעולם החיידקים. עד כה התגלו אתרים משולבים המכילים את prrc משובץ בין הגנים של hsd ב- 16 זני חיידקים הפזורים בין קבוצות פילוגנטיות שונות. הופעתם הספוראדית (בזן זה אך לא באחר מאותו סוג) מחזקת את הסברה שהם מהווים מערכות הגנה משולבות נוגדות פאג' םי, בדומה לאב-הטיפוס מ- coli (Amitsur et al., (2003.E Vibrio (תמונה 1.3). סברה זו מתיישבת עם צרוף המקרים של הופעת מערכת prr ב (Miller et al., 2003) vulnificus ואנזימי תיקון RNA בנגיף ויבריו רחב-טווח. (Chen et al., 2003a) תמונה 1.2- PrrC ליבת ACNase משמשת כקו הגנה שני מפני הדבקת פאג' PrrC T4. (אליפסה ירוקה) מוחזק בתא החיידק במצב לא פעיל ע"י אינטראקציה עם אנזימי רסטריקציה מודיפיקציה ל- DNA EcoprrI (אליפסות אדומות). בזמן ההדבקה, פאג' T4 מבטא את פפטיד Stp המנטרל את.EcoprrI האינטראקציה בין Stp ל- EcoprrI משפיעה על PrrC ומפעילה את פעילות ACNase שלו. פעילות זו מביאה לביקוע מולקולות trna Lys החיוניות להתרבות הפאג'. Pnk ו- Rli המקודדים ע"י הפאג' מאחים את מולקולות trna ומשיבים להן את פעילותן (2000.(Kaufmann, 11

20 1.2.4 האינטראקציה בין PrrC ל- EcoprrI כאמור, באנזים ACNase השלם מצוי PrrC באינטראקציה עם,EcoprrI ופעילות ליבת ACNase שב- PrrC עוברת מיסוך הפיך ע"י.EcoprrI סביר להניח שבזמן הדבקת,ACNase הפאג', הפפטיד EcoprrI גורם לשינויים מבניים ב- Stp המפרים את מיסוך זאת, מבלי ש PrrC ו- EcoprrI ייפרדו זה מזה. השערה זו נתמכת מניסויים בהם היה ניתן לבצע שיקוע אימוני משותף ל- PrrC ול- EcoprrI גם לאחר הפעלת ACNase הלטנטי ע"י.Stp לעומת זאת בניסויי קומפלמנטציה לא נמצאה זיקה פונקציונלית בין PrrC ל- EcoR124I ההומולוגי ל-.(Amitsur et al., (1992 EcoprrI תצפית זו מעידה על אתר ספציפי ב- EcoprrI העשוי להגיב עם.PrrC הבדלי רצף בין הקצוות האמיניים של תת- היחידות HsdR של EcoprrI ו- EcoR124I לעומת שימור מוחלט של החלק הנותר, של HsdM ושל האלמנטים הקבועים של HsdS (שאינם מעורבים בזיהוי רצף (DNA רומזים על האזור האמיני של HsdR מ- EcoprrI כממשק אפשרי של.(Penner, (1996 PrrC יש לציין שאנזים EcoprrI בעל סימטריה כפולה מדומה.(pseudosymmetry) הוא מורכב משני דימרים של HsdM ו- HsdR, ותת-היחידה, HsdS הבודדת, בעלת שני חלקים דומים אך לא זהים (2000.(Murray, הממצאים המדווחים על ידי בעבודה זו מעידים ש- PrrC מצוי כטטרמר בעל סימטריה כפולה, מבנה שיכול להתאים לאינטראקציה שלו עם PrrC הדימרי בפרט. זיקה של HsdR בעל הסימטריה הכפולה המדומה בכלל ועם EcoprrI לאזורים הלא-שמורים של תת-היחידה HsdS נראית פחות סבירה שכן אלה נוגעים ברצף ה- Stp הלטנטי יופעל על ידי ACNase לקשור כדי ש- EcoprrI אותו חייב DNA.(Amitsur et al., 2003) 12

21 1.3 חלוקה מבנית-פונקציונאלית של PrrC מסגרת התרגום של prrc מקודדת לפוליפפטיד בן 396 חומצות אמינו, ולתוצר התרגום הראשוני מסה מונואיזוטופית חזויה של 45,530 Da (אך סביר שבתא מוסר שייר Met 1 שכן לאחריו מופיעה חומצה אמינית קטנה, al., 1996.(Schmitt et במסגרת הקריאה מוגדרים שני דומיינים תפקודיים: דומיין NTPase ודומיין.ACNase דומיין ה- של PrrC NTPase מצוי בשני השלישים של החלבון בצד האמיני. דומיין זה מאופיין במוטיבים המצויים בתת-יחידת ה- ATPase של חלבוני.(Chen et al., 2003b) ABC transporter הם כוללים את מוטיבי Walker A&B ו- ABC signature (תמונה 1.3). יש לציין שדומיינים אלה אינם מוגבלים לטרנספורטרים חוצי ממברנה ומופיעים גם בחלבונים מסיסים ובכלל זה חלבונים הפועלים על חומצות גרעין דוגמת Rad50 יוקריוטי (2000 al.,.(hopfner et נוכחות מוטיבים אלו בדומיין NTPase של PrrC ותלות הפעלת האנזים הלטנטי בהוספת נוקלאוטידים (יפורט בהמשך) הובילה להשערה שדומיין זה אחראי לוויסות האינטראקציה הממסכת של,EcoprrI כלומר העברת ACNase מהמצב המושתק לפעיל, זאת ע"י קישור ופירוק נוקלאוטידים מסוימים. השערה זו נתמכה גם ע"י גילוי שתי מוטציות בדומיין זה N194K-D197N) (N42K & שהפרו באופן כלשהו את האינטראקציה שבין PrrC ל- ACNase ופגעה ביצירת ו/או הפעלת האנזים הלטנטי מבלי לפגוע בפעילות ליבת EcoprrI של PrrC החופשי 2003) al.,.(amitsur et החלק הקרבוקסילי הנותר של PrrC מהווה את דומיין ACNase המזהה את (D287Y, S288P) ומזרז את ביקועו. באזור זה התמפו שתי מוטציות סמוכות trna Lys שכל אחת מהן גרמה לפנוטיפ חיתוך ייחודי שונה מזה של זן הבר ומשל מוטנטים אחרים ששמרו את דגם זן הבר. הבדלים אלה התבטאו בסדר העדפה שונה של סובסטרטים משניים של PrrC (הנתקפים על ידו כאשר הוא מבוטא ביתר) ובהסטת אתר הביקוע באחדים מסובסטרטים אלה. מעניין לציין שלמרבית הסובסטרטים המשניים רצפי אנטיקודון דומים לאלה של הסובסטרט הטבעי (לדוגמה,(tRNA Glu, trna Gln עובדה שחזקה את הסברה שהאנטיקודון מהווה אלמנט הכרות מרכזי בסובסטרט (1999 al.,.(meidler et 13

22 Walker A (P loop) MGKTLSEIAQ QLSTPQKVKK TVHKEVEATR AVPKVQLIYA FNGTGKTRLS PrrC signature RDFKQLLESK VHDGEGEDEA EQSALSRKKI LYYNAFTEDL FYWDNDLQED AEPKLKVQPN SYTNWLLTLL KDLGQDSNIV RYFQRYANDK LTPHFNPDFT ABC signature EITFSMERGN DERSAHIKLS KGEESNFIWS VFYTLLDQVV TILNVADPDA Walker B RETHAFDQLK YVFIDDPVSS LDDNHLIELA VNLAGLIKSS ESDLKFIITT NTPase ACNase trna Lys recognition HSPIFYNVLF NELNGKVCYM LESFEDGTFA LTEKYGDSNK SFSYHLHLKQ ACNase catalysis TIEQAIADNN VERYHFTLLR NLYEKTASFL GYPKWSELLP DDKQLYLSRI INFTSHSTLS NEAVAEPTPA EKATVKLLLD HLKNNCGFWQ QEQKNG The conservation scale: Variable Average Conserved תמונה 1.3- מידת השימור של שיירי חומצות אמינו ואתרים תפקודיים ב- PrrC.PrrC מ-.E coli ו- 16 הומולוגים שאותרו ממאגר הגנומי החיידקי ב- Blast (Altschul et al., (1997 הושוו ויושרו ע"י ClustalW Conseq סקלת השימור של.(Berezin et al., 2004) Conseq ועובדו ע"י (Thompson et al., 1994) מתוארת למעלה. המוטיבים ל- NTPase דומים לאלו בתת-יחידת ה- ATPase של חלבוני ABC transporter 2003b) "PrrC signature",(chen et al., מיוחד למשפחת.PrrC אתר הכרות סובסטרט trna Lys שמור רק בחלק מההומולגים 1999) al., (Jiang et al., 2002; Jiang et al., 2001; Meidler et והמשולש הקטליטי המשוער שמור בכולם perp).(amitsur et al, in 14

23 .trna Lys בהמשך נמצאה זיקה בין Asp 287 למודיפיקציה בבסיס ה- wobble של מסקנה זו נבעה מניסויים שהראו כי ניתן לפצות על העדר מודיפיקציה זו או החלפתה במודיפיקציה הטרולוגית של סוג trna Lys אנושי ע"י החלפת Asp 287 בחומצות אמינו שונות כדוגמת His,Asn,Gln או Jiang et al., 2002 ; Jiang et al., 2001 ) Gly PrrC יתר על כן, נמצא לאחרונה שפפטיד סינתטי קצר חופף לרצף.(Perlman, 2002 המכיל את Asp 287 מעכב פעילות ACNase וניתן לצלוב אותו לאזור האנטיקודון של trna-lysyl synthetase PrrC קליימן-תקשורת אישית). (דניאל trna Lys שונה מ- trna Lys מכיר את האנטיקודון של LysRS.tRNA באופן הכרת הסובסטרט (LysRS) באמצעות שיירים פזורים בין מספר אלמנטים שניוניים המשתרעים על פני למעלה ממאה שיירים ברצף החלבון (1996 al.,.(cusack et מאידך, PrrC דומה למספר חלבוני תרגום דוגמת גורמי השחרור & 2 RF1 וגורם ההארכה EF-G המזהים את מטרותיהם באמצעות צבר קצר ורציף של שיירי חומצות אמינו (2000 al.,.(ito et צבר חומצות אמינו של PrrC המעורב בהכרת trna Lys משותף רק למקצת מהומולוגי PrrC השונים (תמונה 1.3). בניגוד לכך בחלק הקרבוקסילי של PrrC המוגדר כדומיין ה- ACNase אותרו שיירים חשודים כקטליטיים שדרגת שימורם מוחלטת. מסקנות אלה מסתמכות על ניסויי מוטגנזה, "הצלה כימית" rescue) (Chemical ומודיפיקציה כימית. ניסויים אלה רמזו על Glu 324, Arg 320 ו- His 356 כמרכיבי המשולש הקטליטי של אתר ה- ACNase (תמונה 1.3). הסבר מבנה ומנגנון הפעולה של אתר ריבונוקלאז כזה יתואר בקצרה בהמשך. שמשפחת חלבוני שימור האתר הקטליטי ואי שימור אתר הכרות הסובסטרט רומזים PrrC כוללת ריבונוקלאזות הגבלה חיידקיות נוגדות פאג'ים בעלות ספציפיות מגוונת. ייתכן מאוד אפוא כי יימצאו ביניהם כאלה התוקפים מטרות אחרות חשובות לסינתזת חלבוני הפאג'ים התוקפים או מבני RNA אחרים הדרושים להתפתחותם prep).(amitsur et al, in בנוסף, יש לציין שבדומיין NTPase מצוי רצף של 14 חומצות אמינו המשותף להומולוגים הישירים של- PrrC אך לא מצוי באף משפחת חלבונים ידועה 15

24 ס, אחרת. אזור זה כונה signature" "PrrC ויש להניח שיש לו תפקיד ייחודי במנגנון ההפעלה ו/או הפעולה של ACNase אותו יש לברר (תמונה 1.3). 1.4 מנגנון הפעלת ACNase בניסויים ביוכימיים התבררו תנאים הדרושים להפעלת ACNase הלטנטי במבחנה ותוצאות מוטגנזה מאשרות את נחיצות חלקם גם בתא. כך מראים ממצאים אלו כי: (1) הפעלת האנזים הלטנטי ע"י Stp נעשית בנוכחות סובסטרט ה- DNA הייחודי של EcoprrI הקשור אליו, (2) ההפעלה תלויה בהידרוליזה של GTP המתווכת כנראה ע"י דומיין NTPase של,PrrC (3) באופן מפתיע נמצא שניתן להחליף את Stp כאקטיבטור ע"י dttp ונוקלאוטידים דומים לו וביניהם נגזרת שאינה ברת-הידרוליזה. ההפעלה בנוכחות.GTP והידרוליזת EcoprrI תלויה אף היא בנוכחות סובסטרט dttp בנוסף נמצא ש-,(EcoprrI החופשי ) המבוטא בתא ללא PrrC של ACNase מייצב את פעילות ליבת dttp אולם לכך נדרש ריכוז dttp קטן פי 100~ מזה הדרוש להפעלת האנזים הלטנטי. לכן, בעוד ש- Stp מפעיל את האנזים הלטנטי ע"י פעולתו על EcoprrI ביר ש- dttp עושה זאת ע"י קישור לדומיין NTPase של.PrrC (4) נמצא גם ש- ATP מעכב את הפעלת האנזים הלטנטי. יש לציין שפעילות ACNase עצמה אינה דורשת הידרוליזה של נוקלאוטיד שכן אנלוגים שאינם יכולים לעבור הידרוליזה לא מעכבים פעילות זו של PrrC החופשי.(Amitsur et al., 2003; Morad et al., 1993) ממצאים אלו הובילו להשערה ש- dttp ו- GTP משתפים פעולה בהפעלת האנזים הלטנטי ע"י אינטרקציה בו-זמנית עם.PrrC לעומת זאת ATP עשוי לעכב את ההפעלה (או לשמר את מצבו הלטנטי של האנזים השלם) ע"י תחרות עם אחד או שני הנוקלאוטידים האחרים על קישור ל-.(Amitsur et al., (2003 PrrC עם זאת יש לציין שהשערות אלה התבססו על תוצאות שהתקבלו עם מקטעי אנזים גולמיים. לכן לא ניתן היה לשלול מעורבות חלבון קושר נוקלאוטידים נוסף או אחר בהפעלת האנזים הלטנטי. מן הראוי, אפוא, היה להמשיך ולבחון את ההצעה שהקו-פקטורים הנוקלאוטידיים מפעילים את האנזים הלטנטי 16

25 בתיווך PrrC באמצעות תכשיר חלבון מטוהרים הן של אנזים הליבה (PrrC) והן של האנזים השלם (תצמיד.(EcoprrI-PrrC המשמעות הביולוגית האפשרית של הפעלת ACNase ע"י dttp במקום Stp מסקרנת אף היא. במודל אחד שהוצע, משמש,dTTP או מטבוליט אחר אותו dttp מייצג, כאקטיבטור חליפי של ACNase הפועל במצבי עקה שונים מהדבקת פאג' T4. במודל חילופי dttp הוא גורם הכרחי בהפעלת ACNase הלטנטי ומשתף פעולה עם.Stp במקרה זה פעולת Stp על EcoprrI משנה את מבנה האנזים השלם ומנגישה את dttp ל- PrrC. עובדות התומכות במודל זה כוללות סינרגיזם בין Stp ל- dttp בהפעלת האנזים הלטנטי (2003 al., (Amitsur et ועליה ברמת dttp התאי בשלב מוקדם של הדבקת פאג' T4.(Greenberg et al., 1994) 1.5 מנגנון הקטליזה המשוער והספציפיות לסובסטרט של PrrC כאמור PrrC מותיר קצוות '3-'2 פוספט ציקלי ו- '5 הידרוקסיל. ריאקצית טרנס- אסטרפיקציה זו דומה לשלב הראשון בריאקצית המזורזות ע"י ריבונוקלאזות "קלאסיות" (כמו למשל,(RNase T1 אנזימים אלו, בשונה מ- PrrC, ממשיכים גם בריאקציה הידרוליזה של הפוספו-דיאסטר הציקלי 1998) Raines,.(Steyaert, 1997 ; הקצוות הנוצרים ע"י PrrC דומים גם לאלו הנוצרים ע"י אנטיקודון נוקלאז לא הומולוגי בעל ספציפיות שונה הכלול במולקולות Colicin E5 מסוימות 2002) Ogawa,,(Masaki and ע"י אנדוריבונוקלאז של (Hopper and Phizicky, 2003) trna splicing וגם ע"י ריבוזימים בוקעי- עצמם 2002) Cech,.(Doudna and בריבונוקלאזות "קלאסיות" כדוגמת,RNase T1 שיירי האתר הפעיל כוללים Glu, His ו- Arg. השניים הראשונים פועלים בהתאמה כחומצה ובסיס כללי והאחרון תורם מטען חיובי לייצוב מצב המעבר הפנטמרי (1997.(Steyaert, להלכה יכול כל אחד מהשיירים במשולש קטליטי זה לתרום להעלאת קצב הריאקציה עד פי 10~ 4 מזה של הריאקציה הספונטאנית. אולם בפועל לא ממוצה פוטנציאל זה במלואו והערכים המתאימים לריבונוקלאזות הקלאסיות קרובים יותר לזירוז של פי

26 (2003 al.,.(breaker et כזכור, בדומיין ה- ACNase של PrrC אותרו שלושה שיירים שמורים Glu 324, Arg 320 ו- His 356 המהווים על פי השערה משולש הקטליטי דומה לזה של.RNase T1 ספציפיות PrrC לסובסטרט ה- RNA נחקרה ע"י השוואת אנלוגי trna Lys שונים במבדקי.ACNase אנלוגים אלה כללו מוטנטי trna Lys חסרי התמרה בבסיס ה- wobble או חסרי התמרות בכלל ומוטנטים שלהם בעלי רצפי אנטיקודון שונים, סוגי trna Lys אנושיים וכן, סובסטרטים מינימאליים בעלי גבעול ולולאת אנטיקודון בלבד המכונים ASL (U 8 UU) trna Lys מהשוואות אלו הוסק שהאנטיקודון של.(Anticodon stem and loop) Meidler et al., 1999; Shterman et al., 1995) מהווה אלמנט הכרות עיקרי של PrrC al., 2001 (Jiang et al.,2002; Jiang et. בנוסף נמצא שפרטי המבנה השניוני של לולאת האנטיקודון המושפעים מהתמרות הבסיסים וזיווגי בסיסים באזור זה חשובים אף הם לאינטראקציה בין PrrC לסובסטרט. על פי השערה זו, מבנה הסובסטרט המועדף על האנזים הוא כאשר האנטיקודון לובש קונפורמצית A-RNA קשיחה וזיווגי הבסיסים בחלקה העליון של הלולאה או בבסיס גבעול האנטיקודון מתרופפים חלקית. שלשת הבסיסים המותמרים t 6 A37,mnm 5 s 2 U34 ו- ψ39 משפיעים כל אחד בדרך משלו על פעילות ACNase כאשר לשניים הראשונים השפעה חיובית עליה ולשלישי השפעת מרסנת. בנוסף, כפי שהוזכר כבר, נמצאה אינטראקציה ישירה בין השרשרת הצדדית של בסיס ה- Jiang et al., 2002; Jiang et al., ) PrrC של ושייר Asp 287 (mnm5s2u34) wobble 2001). מעניין לציין, שפפטיד המחקה את אזור הכרת הסובסטרט ב- PrrC (שיירים -284.(IC ביעלות יחסית PrrC ולעכב את ביקועו ע"י trna Lys 50 ~10-5 M) 294) יכול להקשר ל- נגזרת של פפטיד זה עשויה לשמש בעתיד כחומר מוצא לפיתוח תרכובות בעלות זיקה גבוהה יותר לא רק לסובסטרט המקורי אלא גם למולקולות trna Lys3 אנושי המשמשות את HIV לייזום השעתוק ההופכי של הגנום הויראלי (דניאל קליימן-תקשורת אישית). 18

27 1.6 חוסר יציבות PrrC ורעילותו לתא בהעדר EcoprrI מתערערת יציבות PrrC ופעילותו רגישה מאוד לטמפרטורה. ניסויים קינטיים הראו שזמן מחצית החיים של פעילות ליבת ACNase במבחנה ב- C 25 o הוא כדקה אחת (1993 al.,.(morad et המשמעות הביולוגית של חוסר יציבות PrrC החופשי יכולה להיות מוסברת כאמצעי הגנה של התא מפני רעילות אפשרית של PrrC המבוטא בעודף ביחס ל- EcoprrI או משתחרר ממנו בשל נזק שנגרם ב-.EcoprrI מאחר שבניסויי פעימה דחיקה של PrrC נשמר הפוליפפטיד לאורך זמן ללא הופעת תוצרי דגרדציה ומאחר שיציבות PrrC במבחנה לא מושפעת ממעכבי פרוטאזות (2000,(Blanga, סביר להניח כי הגורם לחוסר יציבותו הקיצוני של PrrC הוא דנטורציה תרמית. ביטוי PrrC לבדו (ללא (EcoprrI ברמה בינונית מאט, אך לא עוצר את גידול החיידק. בתנאים אלו מפוצה אובדן של מולקולות trna Lys ע"י שעתוק והתמרה מחודשים. לעומת זאת, ביטוי PrrC ברמה גבוהה מונע את גידול החיידקים שכן אז הייצור המחודש אינו מדביק את קצב הפירוק. למרות זאת, כאשר בוטאה צורת גזע הבר של PrrC או צורות פעילות אחרות ביתר לא הצטברו כמויות ניכרות ממנו, גם כאשר הביטוי היה מפלסמיד רב עותקים תחת שליטה של אותות בקרת שעתוק ותרגום חזקים. הגבלת הביטוי נובעת כנראה מעצם פעילותו של PrrC שכן פגיעתו ב- trnas מעכבת תרגום חלבונים, כולל שלו עצמו. בהסכמה לכך, מוטנטים בלתי פעילים או בעלי פעילות מוחלשת מצטברים לרמה גבוהה יחסית בתא (1999 al.,.(meidler et שני קשיים אלו, עיכוב תרגום וחוסר יציבות, מנעו טיהור PrrC הפעיל. בשל כך נחקר החלבון עד כה בעיקר ע"י מוטגנזה ואפיון ביוכימי in vivo ובמערכות אל-תאיות גולמיות. 19

28 מטרת העבודה מטרת העבודה הייתה לאפיין את יחסי מבנה-תפקוד של PrrC ליבת ה-.ACNase כיוון שדבר זה היה מותנה באפשרות להפיק ולטהר את PrrC בצורתו הפעילה התעורר צורך לפתח תחילה אמצעים לצבור אותו בתא ברמה גבוהה ולהתגבר על אי יציבותו, ורק בהמשך לנסות לטהרו בצורתו הפעילה ולהגדיר את מבנהו הרביעוני. השגת טיהור PrrC הפעיל אפשר לבחון את ההשערות בדבר תפקידי שלשת הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים ואתר ה- NTPase של PrrC בהפעלת ACNase הלטנטי ולזהות שיירים המעורבים בקטליזת.ACNase 20

29 2. חומרים ושיטות 2.1 חומרים אנזימי רסטריקציה, Taq polymerase ו- T4 RNA ligase נרכשו מחברת NEB ו- T4 polynucleotide kinase מחברת.USB במקרים שלא צוין אחרת סופקו הבופרים לריאקציה ולמיהול האנזימים ע"י היצרן. נוקלאוטידים מסומנים רדיואקטיבית סופקו מחברת.Amersham תמיסות מכוילות של ריבונוקלאוטידים ודאוקסי-ריבונולקאוטידים מטוהרים ב- HPLC נרכשו מחברת,Pharmacia Biotech אולם dttp שנצרך בכמות גדולה במהלך הטיהור הוזמן גם יבש מחברת סיגמה. מחברת סיגמה נרכשו גם החומרים הבאים:,(TMAO) Trimethylamine N-oxide אוליגונוקלאוטידים, גלוטאראלדהיד, (BD) 2,3-butanedione,(PG) phenylglyoxal,(depc) diethylpyrocarbonate DSS ו-.(EDAC) 1-ethyl-3-(3-dimethlamino-propyl) carbodiimide היה מתוצרת.Pierce סמני גודל ב- SDS-PAGE היו Broad-Range ו- SeeBlue Plus 2 מ- NEB או,Invitrogen בהתאמה. תערובת החלבונים לכיול עמודת פילטרצית ג'ל נרכשה מחברת Ferritin,Blue Dextran 2000 (2,000 kda) והיא הכילה,Pharmacia Biotech Albumin Bovine,Aldolase (158 kda),catalase (232 kda),(440 kda) שרף ה- TALON-IMAC נקנה מחברת.Clontech.Ovalbumin (45 kda) ו- (66 kda) טבליות של Protease Inhibitor Cocktail ללא EDTA נרכשו מ-.Roche סרטי צילום ומסכי הגברה היו מתוצרת.Kodak 21

30 2.2 רשימת בופרים שם הבופר שימוש הרכב הערות 10mM Tris-HCl; ph-7.5, 15mM בופר I לשטיפת MgCl 2, 1M KCl, 0.1mM Na- חיידקים EDTA, 10% glycerol בופר II לשטיפת דומה לבופר I, אך מכיל חיידקים 50mM KCl ולא כולל EDTA 10mM Na-HEPES; ph-7.5, 1mM MgCl 2, 30mM NaCl, 10% glycerol, Protease Inhibitor Cocktail Tablet, EDTA-free 10mM Na-HEPES; ph-7.5, בופר III בופר IV להפקת תמציות תאי חיידקים לטיהור PrrC בשלבים המוקדמים של העבודה השתמשתי בבופר III המכיל בופר Tris במקום MgCl 2 ו- HEPES בריכוז 15mM בחלק מהמקרים dttp היה בריכוז 1mM MgCl 2, 30mM NaCl, 10 µm 10% glycerol, 2M TMAO, 2µM dttp למבדק דומה לבופר IV למעט שריכוז בופר V 0.5M היה TMAO ACNase 1mg/ml BSA בופר VI למיהול PrrC בופר IV בתוספת TBEx0.25 שימש להרצת DNA ו- הוכן כמתואר TBE RNA להרצת (Sambrook and Russell, 2001) RNA לאנליזת הוכנו כמתואר TBS,PBS (Sambrook and Russell, 2001) Western blot ו- TBS-T Tween בתוספת TBS הוא TBS-T.0.5% M Phosphate; ph 7, 20% בופר להרצת Glycerol, 4% SDS, 0.4M DTT, העמסה חלבונים ב % Bromophenol Blue לחלבונים 2X SDS-PAGE (Cannon-Carlson and Tang, 1997) 22

31 2.3 רשימת גזעי חיידקים ופאג' םי גזע תכונות מקור (Russel and Model, 1984) (Studier, 1991) Novagen (Depew and Cozzarelli, 1974) (Grant et al., 1990) T7 RNA פונדקאי לביטוי מושרה ממערכת Hfrc.polymerase/promoter BF -, dcm, ompt, hsds (r - B m - B ), gal λ: plyss (Cam R ) פונדקאי לביטוי מושרה ממערכת פרומוטור T7. הגן T7 RNA Polymerase מצוי בכרומוזום החיידק תחת פרומוטור. lac ביטוי נמוך וקבוע של ליזוזים מפאג' T7 מעכב רמה שיורית של T7 RNA פולימראז אך לא כאשר פעילות אנזים זה מושרית ע"י.IPTG נגזרת של BL21: (DE3) plyss המבטאת ביתר חמשה סוגי trna נדירים מהפלסמיד. prare K-12xCT196, prr + lac-pro,enda1, gyra,thi1,hsdr17, supe44 lacf [proab,laciq,lacz, M15,Tn10] K38 E. coli BL21:(DE3) plyss Rosetta CTr5X DH10B Stratagene enda1,hsdr17,supe44,thi1,reca1,gyra96,rel A1,lac,F',proAB,lacI q,zm15,tn10 XL1-blue פאג' T4 (Snyder et al., 1976) (cd,pset,alc) מוטנט בעל חסר ב-.Pnk מוגבל ע"י אתר prr pset 1 23

32 2.4 רשימת פלסמידים תאור פלסמיד לביטוי PrrC תחת בקרת פרומוטור T7-lac ובקרת תרגום של T7ф10 prrc11 עם מוטציה נקודתית prrc בגן D222E פלסמיד ביטוי T7 RNA pol מושרה בחום נגזרת prrc11 הנושאת את הגן prrc במורד ל- pnk נגזרת prrc11 הנושאת את הגנים pnk ו- rli במורד ל- prrc prrc11 עם מוטציה נקודתית D222E בגן prrc הנושאת את הגנים pnk ו- rli במורד ל- prrc נגזרת prrc11 בה חובר קצה- prrc11-d222e Linker-His (6) p11-dlh-k46n p11-dlh-k168n p11-dlh-k46n- K168N נגזרת prrc11-d222e-linker- His 6 עם שתי מוטציות נקודתיות ב- prrc ו- K168N K46N מקור (Meidler et al., 1999) (Meidler et al., 1999) (Tabor and Richardson, 1985) עבודה זו עבודה זו עבודה זו עבודה זו עבודה זו עבודה זו עבודה זו עבודה זו His (6) פלסמיד prrc11 prrc11- D222E pgp1-2 p11-pnk p11-pnk-rli p11-d222e- pnk-rli prrc11 - Linker- C' של prrc לתווית His 6 דרך גשר פפטידי גמיש ואתר לפקטור.Xa נגזרת D222E של - prrc11.linker-his (6) tag נגזרת prrc11-d222e-linker- K46N עם מוטציה נקודתית His 6 ב- prrc. נגזרת prrc11-d222e-linker- N168K עם מוטציה נקודתית His 6 ב- prrc 24

33 2.5 רשימת פריימרים לריאקציות PCR מ ס' יעד שם גדיל רצף 5'GATGATCCCGTTAGCTCCCTTGAGGATACCCAT TGATTGAACTG 5'CAGTTCAATCAAATGGTTATCCTCAAGGGAGCT AACGGGATCATC 5'CGGCGAATTCATGAAAAAGATTATTTTGAC Sense Anti-sense Sense D222E-S D222E-AS PNK30S החדרת D222E ל- prrc11 חילוץ גן pnk 1 2 5'CGCCGGCTCTTAAAAATCTCCCGAAGC Anti-sense PNK28A מ- puc19t4 PNK 5'GGGAGCTCAGGAAACAGCTATGCAAGAACTTTT TAAC 5'GGCGTCGACTTAGTATCCTTCTGGG 5'CTAGCCGAGGTGGCGGATCAGGAGGCGGAGGTT CTGGAGGAGGTGGGAGTATCGAGGGTAGGC Sense Anti-sense Sense RLI38S RLI25A SLIN15 חילוץ גן rli מ- pet23-74rl הוספת לינקר ל- prrc 'TTAAGCCTACCCTCGATACTCCCCACCTCCTCC AGAACCTCCGCCTCCTGATCCGCCACCTCGG 5'GGATGGTACCTTTGCC Anti-sense Sense ALIN15 5 הוספת His 6 ל s 5'CAAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGCCTAC CCTCGATACTCCC Anti-sense prrc11- Linker Histag46- A 5'CTTTCAATGGCACGGGTAATACGCGTCTTTCC Sense K46NS 6 החדרת K46N 5'GGAAAGACGCGTATTACCCGTGCCATTGAAAG Anti-sense K46NA prrc11- D222E- ל- Linker-His 6 5'CGTTCCGCCCACATCAATTTATCCAAAGGTGAA G 5'CTTCACCTTTGGATAAATTGATGTGGGCGGAAC G Sense Anti-sense K168NS K168NA החדרת K46N ל- prrc11- D222E- 7 Linker-His 6 25

34 2.6 שיבוט הפלסמידים שנוצרו בעבודה זו שיבוט גנים לתיקון RNA ב- prrc11 פלסמידים מבטאי Pnk ביתר התקבלו מ- New ) Dr. Elisabeth Raleigh או- Rli (England Biolabs ומקטעי הגנים pnk ו- rli חולצו מהם בראקציות PCR (פריימרים מס' 2 ו- 3 ). גן pnk הוחדר לפלסמיד prrc11 באזור בין ה- ORF של prrc לטרמינטור של T7, בין אתרי.SacI-EcorI לפלסמיד שנוצר,,p11-pnk הוחדר גן rli במורד ל- pnk בין SalI-.p11-pnk-rli ליצירת,SacI יצירת נגזרות (6) PrrC-His נגזרת His 6 של PrrC-D222E נבנתה תחילה בפלסמיד prrc11 ואח"כ הוכנסה המוטציה הנקודתית בשיטת (Ansaldi et al., 1996) Quick change עם זוג פריימרים מס'.1 האיחוי נעשה ע"י הכנסת אתר AgeI ע"י החלפת Asn 394 עם Thr בקצה- 'C של,PrrC שינוי שלא פגע בפעילות.(Shalem, (2003 ACNase באתר זה שובץ לינקר סינתטי עשיר ב- Gly ו- Ser ומכיל אתר פרוטאזה (GGGSGGGGSGGGGSIEGRGS) Factor Xa בריאקצית PCR עם זוג פריימרים מס' 4. רצף His (6) -tag הוחדר בהמשך במורד ללינקר באמצעות PCR עם זוג פריימרים מס' 5 המקודדים ל-.His 6 יצירת מוטציות מכוונות באתר NTPase ב- PrrC נגזרות PrrC הפגועות באתר NTPase היו K168N,K46N ומוטנט כפול.K46N-K168N המוטציות הנקודתיות האלו הוחדרו לפלסמיד prrc11-d222e-linker-his 6 בשיטת (Ansaldi et al., 1996) Quick change עם זוגות פריימרים מס' 6 ו

35 2.7 הפקת תמציות תאים המכילות את PrrC חיידקי E. coli K38: pgp1-2 נושאי פלסמידי ביטוי PrrC גודלו ב- 30 o C במדיום LB המכיל 800µg/ml אמפיצילין ו- 50µg/ml קנמיצין עד ל- 0.6= 600.O.D לאחר מכן התרבית עברה אינדוקציה ע"י העלאת הטמפרטורה ל- 42 o C למשך 20 דקות כדי לבטא את T7 RNA פולימראז. לאחר מכן הוסף IPTG לריכוז 1mM לדה-רפרסית ביטוי PrrC תחת פרומוטר,T7-lac וההדגרה נמשכה ב- 30 o C למשך 40 דקות נוספות כדי להפיק את PrrC הרגיש לחום. חיידקי E. coli BL21-Rosetta נושאי פלסמידי ביטוי PrrC גודלו ב- 37 o C במדיום LB המכיל 100µg/ml אמפיצלין ו- 34µg/ml כלורמפניקול עד ל- 0.6= 600.O.D במקרה זה בוצעו אינדוקצית T7 RNA פולימראז ודה-רפרסית ביטוי PrrC בו-זמנית ע"י הוספת IPTG לריכוז 1mM והדגרה לשעתיים ב- 30. o C בשתי ההפקות החיידקים נקצרו בקור, נשטפו פעמיים בבופר I ופעם אחת בבופר. II פלט החיידקים השטוף נשקל והורחף בבופר III (ביחס 1:1.5). תמצית תאים הוכנה ב- (18,000 psi) French Press והוסף לה TMAO לריכוז.2M התמצית סורכזה 30 דקות בקור ב - g 30,000 x לקבלת הנוזל העליון (30-S) והוא נשמר ב- -70ºC להמשך שלבי טיהור.PrrC לחילופין בוצע סרכוז נוסף באולטרצנטריפוגה למשך שעה ב- 150,000 x g לקבלת מקטע 150-S..E coli CTr5X לפני ואחרי הדבקה בפאג' T4 שימשו לצילוב חלבון-חלבון 30ºC ב- LB גודלו במצע (Depew and Cozzarelli, 1974) התאים.DSS תמציות תאי in vivo עם עד 0.5= 600.O.D התרבית הופרדה לשני כלים נפרדים, כאשר כלי אחד הודבק בפאג' T4 pse T1 כפי שתואר (1992 al.,.(amitsur et ההדגרה ב- 30ºC נמשכה לעוד 15 דקות, ולאחריה הכלים הועברו לסל קרח כדי להפסיק את ההדבקה. החיידקים נקצרו בקור והפלט שהתקבל נשטף פעמיים בבופר.III 27

36 2.8 בדיקת רמת ביטוי PrrC בתא דגימות חיידקים מבטאי 1ml) PrrC תרבית) נקצרו והורתחו בבופר העמסת חלבונים. לאחר Western זוהה ב- PrrC סוניקציה לשבירת ה- DNA הופרדו החלבונים ב-.SDS-PAGE.(Meidler et al., 1999) באמצעות נוגדן פוליקלונלי מנוקה blotting 2.9 מבחני פעילות ACNase מבחן פעילות in vivo ACNase חיידקי Rosetta-pRRC11 גודלו וביטוי PrrC הושרה בהם כמתואר לעיל. 1.5 ml תרבית נקצרה בקור והפלט שהתקבל נשטף פעמיים עם בופר המכיל 10mM Tris-HCl; ph 8 ו- RNA נמוך מולקולרי מוצה עם פנול ב-.0ºC תערובת הסימון (5µl) הכילה.0.1M NaCl 1.35µM [γ- 32 P]-ATP,1µg RNA בפעילות ספציפית,(100Ci/mmol) 1.2 יחידות 38mM Tris-HCl; ph7.5,t4 polynucleotide kinase ו-.7.7mM MgCl 2 הריאקציה נמשכה 10 דקות ב.25ºC בתנאים אלה מסתמנים בעיקר קצוות 5'-OH שנוצרו ע"י. 0.01% Xylene cyanoll ו- 10M Urea 15µl הריאקציה הופסקה ע"י הוספת.ACNase הדגימות הופרדו באלקטרופורזת ג'ל 15% פוליאקרילאמיד עם 7M Urea בבופר TBEx0.25 והורצו במתח 36 V/cm באותו בופר. לאחר ההרצה נחשף הג'ל לסרט צילום עם מסך הגברה. in vitro מבחן פעילות ACNase הבדיקה מבוססת על ביקוע trna Lys מסומן בחוליית החיתוך (33p34). הביקוע מותיר מקטע 1-33 מסומן. הכנת הסובסטרט בוצעה כמתואר ב-( 1989 al.,.(amitsur et ריאקציה אופיינית בוצעה בנפח של.10µl תערובת הריאקציה הסטנדרטית, הוכנה ב- C 0. o היא הכילה: ng ממקטעי PrrC המצוינים, 1 fmol [ 32 P]-tRNA Lys בפעילות ספציפית Ci/mmol) 2,000~) ו- 5µl בופר V. הריאקציה נפתחה ע"י הוספת הסובסטרט הרדיואקטיבי. לאחר הדגרה 2-30 דקות ב- 10 o C הופסקה הריאקציה ע"י הוספת 15µl 28

37 10M Urea ו % Xylene cyanol הדגימות הוטענו על ג'ל פוליאקרילאמיד 15% בתוספת 7M Urea ובופר TBE x 0.25 והורצו במתח 36 V/cm באותו בופר. לאחר ההרצה נחשף הג'ל לסרט צילום עם מסך הגברה שלבי טיהור PrrC פרוטוקול הטיהור של PrrC כלל שלושה שלבים: סירכוז בצנטריפוגה מהירה, כרומטוגרפית זיקה של תווית ה- His 6 לשרף קושר קובלט (TALON) ופילטרצית ג'ל בסופרדקס 200. מקטע 30-S שהתקבל מחיידקי.E coli BL21-Rosetta נושאי פלסמידי ביטוי PrrC- D222E-L-His 6 (ראה סעיף 2.6) הכיל ~30mg/ml חלבון כללי. עמודת TALON בנפח של 5mM אימידזול. דגימה של 2ml ממקטע IV בופר 4.5ml נשטפה ב- 0.5ml קר בתוספת 30-S הובאה לריכוז 2µM dttp ו- 5mM אימידזול והוטענה על עמודה זו. ההפרדה נעשתה בקור, תחילה נשטפה העמודה עם 4.5 ml באותו בופר IV בתוספת 5mM אימידזול, ולאחר מכן בבופר IV שהכיל 0.25M אימידזול. חלבון PrrC שהתמצה בנפח 0.25ml הוטען על עמודת Superdex 200 מתוצרת Pharmacia בת 30ml לאחר שנשטפה בבופר.IV ההפרדה נעשתה בקור באותו בופר בקצב ml/min רוב PrrC התמצה כחלבון אוליגומרי פעיל במקטע PrrC ml זוהה בשלבי טיהור אלו ב- Silver.ACNase ובבדיקת פעילות Western אנליזת,stain 2.11 שלבי טיהור PrrC נוספים שהתבצעו בשילובים חלקיים והביאו לטיהור חלקי פילטרצית ג'ל Superdex 200 תמצית תאים 150-S שהתקבלה מחיידקי.E coli BL21-Rosetta נושאי פלסמידי ביטוי על עמודה Superdex ml סעיף 2.6) הוטענה בנפח (ראה PrrC-D222E פרפרטיבית בנפח 120. ml ההפרדה נעשתה בקור במהירות 1 ml/min עם בופר.IV בנפח אילוציה של 58-60ml התמצה PrrC האוליגומרי הפעיל. אך רוב חלבון PrrC התמצה בנפחים גדולים יותר והם הכילו בעיקר צורות ביניים של אוליגומר. 29

38 מחליף אניונים MonoQ עמודת מחליף אניונים Mono-Q מסוג 15Q מתוצרת Pharmacia בגודל 2ml נשטפה בבופר.IV תמצית 150-S המכילה את PrrC-D222E בנפח 2-4ml הוטענה על העמודה ומיצוי החלבונים נעשה בגרדיאנט M. NaCl קצב הזרימה היה PrrC.1ml/min M הפעיל התמצה בריכוזי NaCl של Hydroxylapatite גרגירי Hydroxylapatite מחברת Calbiochem הותפחו במים במבחנה 12ml 0.1gr ועברו אקויליברציה עם בופר.IV לאחר מכן הוספה למבחנה 1ml ממקטע PrrC פעיל לאחר הפרדה ב- Mono-Q והמבחנה טולטלה במשך שעה ב- C 4. o החלבון מוצה בשטיפות בנות 0.5ml של בופר אשלגן פוספט,pH 7.5 בטווח ריכוזים של mm בתוספת של.KPi של בופר 20-40mM הפעיל התמצה בין הריכוזים PrrC.2µM dttp ו- 2M TMAO שיקוע PrrC ב- PEG דגימות בנפח 30µl מתמצית 150-S הודגרו ב- C 0 o למשך שעה עם (3350) PEG בטווח ריכוזים של % הנפח הכולל של כל דגימה היה.200µl לאחר מכן הדגימות סורכזו ב- 30,000xg ב- 4 o C למשך 30 דקות. הנוזל העליון נבדק לפעילות ACNase כמות שהוא ואילו הפלט הורחף ב- 20µl בופר IV ואז נבדק לפעילות.ACNase 30

39 2.12 ריאקציות לצילוב חלבון-חלבון צילוב in vitro באמצעות גלוטאראלדהיד (GA) ריאקצית צילוב חלבון-חלבון בעזרת גלוטאראלדהיד נעשתה לדגימות PrrC מטוהרות חלקית אחרי TALON או אחרי פילטרצית ג'ל. במקרה הראשון נערכה הריאקציה ב- 0 o C לפרקי זמן שבין דקה עד 4 שעות. תערובת הריאקציה µl) 30) הכילה: 27µl ממקטע TALON (סעיף 2.9) שהכיל 2.5µg PrrC ו- 0.01% גלוטאראלדהיד. הריאקציה הופסקה ע"י הוספת 3 בופר µl 1M. Tris-HCl; ph 7.5 הדגימות הורתחו בבופר העמסה לחלבונים והופרדו בגרדיאנט 5-13% של. SDS-PAGE תוצרי צילוב PrrC אופיינו לאחר מכן ע"י צביעת הג'ל עם תמיסת צבע.(GeBA) SeeBand Forte במקרה השני, הריאקציה נעשתה באופן דומה, למעט שתערובת הריאקציה (10µl) הכילה: 5µl מקטע מטוהר חלקית בפילטרצית ג'ל ~1µg) של,(PrrC הדגימות הופרדו ב- SDS-PAGE 10% ותוצרי צילוב PrrC אופיינו.Western- blotting כאשר הדגימה הייתה מהולה היא רוכזה פי 20 לאחר הצילוב ע"י שיקוע אצטוני והורחפה בבופר ההעמסה לחלבונים. (DSS) Disuccinimidyl suberate צילוב in vivo באמצעות 5-10 ml מתרביות חיידקיים מבטאי אללים שונים של PrrC הושרו לביטוי החלבון כמתואר למעלה. לאחר קצירת התאים נשטף הפלט שלוש פעמים ב- 0.5 ml בבופר III ב-.4 o C 2mM DSS ריאקצית הצילוב בוצעה ב- 0 o C ע"י הרחפת הפלט ב- 40µl בופר III המכיל במשך שעה. לאחר מכן שוקעו החיידקים וטופלו בסוניקציה. החלבונים הומסו ע"י הרתחה בבופר העמסה לחלבונים והופרדו ב- 10% SDS-PAGE ועברו אנליזת.Western blot צילוב PrrC הכלול בתצמיד האנזים הלטנטי לפני או אחרי הפעלתו ע"י הדבקה בפאג' T4 נעשה בצורה דומה למעט השימוש בתרבית חיידקי.E coli CTr5X לפני או אחרי ההדבקה. 31

40 2.13 אנליזת PrrC במיקרוסקופ אלקטרוני (EM) דגימת PrrC מטוהרת בבופר IV בנפח 0.5 ml עברה צילוב מלא עם 0.1 % גלוטאראלדהיד למשך 4 שעות ב- C 0. o הריאקציה הופסקה ע"י הוספת 50µl בופר 1M. Tris-HCl; ph 7.5 לאחר מכן הוחלף בופר הדגימה באמצעות מבחנות פילטר (Amicon) Microcon לבופר IV נטול גליצרול ו- TMAO והדגימה רוכזה פי שניים. ריכוז PrrC הסופי היה mg/ml האנליזה במיקרוסקופ האלקטרוני נעשה ע"י ד"ר שרון וולף ממכון ויצמן בשיטת Negative.(Danziger et al., כפי שתואר ב-( 2003 staining 2.14 צילוב נוקלאוטידים ל- PrrC צילוב פוטוכימי של dttp ל- PrrC כל ריאקציות הצילוב נעשו על מקטע PrrC שטוהר על עמודת.TALON הצילוב עם dttp TALON נעשה בהקרנה ב-.UV 254 דגימת מקטע נמהלה 1:10 בבופר IV נטול.dTTP תערובת הריאקציה ) (10µl הכילה: (50ng) 1 µl מקטע TALON המהול, [α- 32 P]-dTTP בפעילות ספציפית 300Ci/mmol בטווח ריכוזים µM ו- 5µl מבופר המיהול. ההקרנה נעשתה מלמעלה לדגימות שהושמו על צלוחית אליזה קטנה (60 באריות) שהונחה על קרח. מנורת ה- UV (UVGL-25, SAN Gabriel) הוצבה במרחק 10cm מהדגימות וההקרנה נמשכה 5 דקות. בסיומה הורתחו הדגימות בבופר העמסה לחלבונים והופרדו ב-.SDS-PAGE לאחר ההרצה הועבר החלבון לממברנה ניטרוצלולוז. PrrC זוהה עליה ב- Western blotting והנגזרת המותמרת ע"י הנוקלאוטיד זוהתה באוטורדיוגרפיה. צילוב נגזרות מחומצנות של GTP,ATP ו- UTP ל- PrrC GTP,ATP או- UTP הוצלבו ל PrrC לאחר חמצונם בפריודט בדומה למתואר ע"י al, 1992.Low et תערובת ריאקצית הצילוב הסטנדרטית ) (10µl הכילה 1µl מקטע, 0.5mM ובריכוז ~1Ci/mmol בפעילות ספציפית [α- 32 P]-rNTP,( PrrC 1 µg) TALON 15mM NaCl,10mM Tris-HCl; ph7.5,1mm MgCl 2 ו-.4mM NaIO 4 התערובת 32

41 מ) הודגרה ב- C 10 o למשך 30 דקות. בסיס שיף שנוצר חוזר בשני שלבים בטמפ' החדר: הדגרה למשך 10 דקות עם 10mM NaBH 3 CN ולאחר מכן הדגרה נוספת ל- 10 דקות עם 10mM תערובת הריאקציה הורתחה בבופר להעמסת חלבונים והדגימה הופרדה ב-- SDS.NaBH 4 Western blotting לממברנת ניטרוצלולוז וזוהה ב- PrrC לאחר ההרצה הועבר.PAGE והנגזרת המותמרת ע"י הנוקלאטיד זוהתה באוטורדיוגרפיה בדיקת פעילות NTPase ב- PrrC בדיקת פעילות GTPase ו- ATPase נעשתה בתערובת ריאקציה (20µl) שהכילה 10mM Tris-,1mM MgCl 2,1mM בריכוז 0.1Ci/mmol בפעילות ספציפית [γ- 32 P]- NTP 15mM NaCl ו- 1µg מקטע סופרדקס מטוהר (סעיף 2.9). הריאקציה,HCl; ph7.5 נפתחה בהוספת האנזים. התערובת הודגרה ב- C 10 o ובפרקי זמן המצוינים נלקחו ממנה דגימות של.1µl הן עורבבו עם 0.01% Xylene cyanoll 1µl מומס במים והוטענו מיד על שכבה דקה של (POLYGRAM Cell300) PEI מתוצרת.Machery-Nagel הפרדה כרומטוגרפית של תוצרי הפירוק הנוקלאוטידים נעשתה עם 0.5M אמוניום ביקרבונט והם זוהו באוטורדיוגרפיה. בדיקת פעילות dttpase נעשתה בתערובת ריאקציה דומה שהכילה 1µg PrrC ממקטע TALON ו- 0.5µM או [α- 32 P]-dTTP 10µM בפעילות ספציפית 100Ci/mmol וכן 10mM KPi; ph 7.5 שנועד לעכב פעילות שיורית של פוספטאז בסיסי במקטע ה- TALON מודיפקציות כימיות של PrrC מודיפיקציה ע"י -DEPC DEPC נמהל באתנול קר לפני השימוש ונשמר על הקרח. דגימה בת 100µl ממקטע TALON עברה דיאליזה ממצה להרחקת האימידזול באמצעות Dialysis (GeBA) kit ב- C 4 o למשך לילה נגד 250ml בופר.IV הבופר הוחלף פעמיים במהלך הדיאליזה. פעילות ACNase נשמרה במלואה בתנאים אלה (תוצאות לא מוצגות). תערובת 2.5mM המודיפיקציה (5µl) הכילה: 150ng) 3 µl מקטע TALON לאחר הדיאליזה, 33

42 DEPC ב-.50mM HEPES; ph7.5 ההדגרה הייתה ב- C 10 o למשך 2-10 דקות, והופסקה ע"י הוספת 10mM אימידזול. מבחנת ביקורת עברה טיפול דומה אך הוסף לה אתנול נטול.DPEC לאחר מכן נבדקה פעילות ACNase כמתואר לעיל. שיירי לזיהוי PrrC שהותמרו ע"י DEPC בתנאים אלה בוצעה ריאקציה דומה בקנה מידה גדול. החלבון שוקע אח"כ ע"י אצטון בנוכחות 1mg חלבון.BSA הפלט הורחף ב- 10µl מים, הורתח בבופר העמסה לחלבונים והופרד על.SDS-PAGE הג'ל נצבע בקומסי ופס PrrC נשלח לאנליזת.MALDI-TOF-MS באנליזה זו הושוו פפטידים שהתקבלו מחיתוך בטריפסין מ-.DEPC שהותמר ע"י PrrC מקורי ומ- PrrC באנליזה זו ניתן היה לגלות שיירי His או Lys שהותמרו ע"י DEPC בעליית מסת הפפטידים המכילים אותם ב- 72 Da (משקל מולקולת בנוסף לכך, התמרת Lys מונעת ביקוע ע"י טריפסין ויוצרת פפטידים חדשים.(DEPC גדולים יותר. מודיפיקציה ע"י BD,PG ו- EDAC המגיבים הומסו בתמיסה אתנולית בריכוז 0.5M ונמהלו לפני השימוש במים ל- 0.2M. המודיפיקציות לפני ובעת ריאקצית ACNase בוצעו בדומה למתואר עבור DEPC בהבדלים הבאים. ראשית, לא היה צורך לסלק את האימידאזול ממקטע ה TALON של.PrrC שנית, ריכוז המגיב המתמיר הסופי היה.50mM Borate buffer; הכילה ph 7.5 BD שלישית, תערובת הריאקציה של.10mM PG רביעית, המגיבים נוטרלו בתום הריאקציה כדלקמן. 0.1M Arg הוספו כדי לנטרל את או BD ו M Tris-Acetate; ph שמש לנטרול.EDAC 2.17 אנליזת MALDI-TOF-MS זיהוי PrrC וזיהוי פפטידים מעיכול טריפטי של PrrC המותמר ב- DEPC נעשה על דגימות שבודדו ב SDS-PAGE באנליזת MALDI-TOF-MS במכשיר AppliedBiosystems Voyager DE-STR במכון מימן לחקר הפרוטאום באוניברסיטת ת"א. 34

43 2.18 זיהוי PrrC באמצעות נוגדנים נוגדנים פוליקלונליים כנגד PrrC מטוהרים ע"י ספיחה למקטע PrrC הוכנו כמתואר ב- (1999 al.,.(meidler et הם שימשו לזיהוי PrrC ב- Western blotting מהולים בדרך כלל 1:1000 ב- PBS בתוספת.1% BSA 2.19 שיטות כלליות הפרדת חלבונים ב- SDS-PAGE בוצע כמתואר ב- (2001 Russell,.(Sambrook and ג'ל הרצה היה בצפיפות 10% פוליאקרילאמיד או גל גרדיאנט. 5-13% ההפרדה הייתה במכשיר Bio-Rad) Mini (Protean משך שעה ב- 25, V/cm או במכשיר (Bio-Rad) Protean II להפרדה ארוכה במתח 20 V/cm למשך 4 שעות. לאחר ההרצה, הג'לים עברו לפי הצורך אנליזת Western blotting או נצבעו בצביעה כללית של חלבונים (כמתואר למטה). Western blotting העברה חשמלית של חלבונים מג'ל לניטרוצלולוז התבצעה במתקן Fastblot B44 של חברת Biometra בזרם של 1. ma/cm 2 גיליון הניטרוצלולוז נחסם ע"י הדגרה בחלב עמיד דל שומן לשעתיים. התספיג נשטף שלוש פעמים בבופר TBS-T והודגר במשך כ- 16 שעות ב- 4 o C בסרום נוגדן ראשוני המהול ב-.PBS + 1% BSA התספיג נשטף שוב והודגר במשך שעתיים עם נוגדן שניוני (עז כנגד ארנבת מצומד לפראוקסידאז) מתוצרת חברת ECL ריאקצית.TBS-T מהול 1:7500 בחלב. לאחר ההדגרה נשטף התספיג ב- Jackson בוצעה על-פי הוראות היצרן. 35

44 צביעת חלבונים כללית צביעה בתמיסת צבע (GeBA) SeeBand Forte נעשתה על-פי הוראות היצרן. ריאקצית צביעה Stain" "Silver נעשתה כדלקמן: לאחר הרצה ב- SDS-PAGE הג'ל עבר פיקסציה למשך שעה עם 12% Acetic Acid,50% Et-OH ו-.50µl 37% Formaldehyde לאחר מכן, הג'ל נשטף עם 50% Et-OH פעמיים למשך 20 דקות, ועבר חיזור למשך דקה עם 100gr אחרי שטיפה במים הג'ל הודגר 20 דקות עם AgNO 3.10mg Na 2 S 2 O 3 x5h 2 O ו-.37.5µl 37% Formaldehyde תהליך הפיתוח נעשה עם 1ml, 3gr Na 2 CO 3 של תמיסת החיזור ו-.25µl 37% Formaldehyde אחרי שזוהו החלבונים בג'ל הריאקציה הופסקה עם 50% Met-OH ו-.12% Acetic Acid PCR ריאקציות PCR בוצעו בדומה ל- (2001 Russell,.(Sambrook and מכשיר ה- PCR היה Mastercycler personal מחברת.Eppendorf תערובת ריאקציה אופיינית (50µl) הכילה 30ng תבנית 100 מכל pmol,dna פריימר, 0.2mM מכל אחד מה-, dntps 2 יחידות אנזים Taq polymerase מסוג Vent ובופר שסופק ע"י היצרן. ההרצה הייתה בד"כ 30 מחזורים, טמפ' ההיברידיזציה השתנתה לפי אורך והרכב הפריימרים. המחזור הראשון נמשך 5 דקות ב- C, 95 o המחזורים הבאים היו של: 30 שניות ב- C 30, 95 o שניות בטמפ' ההיברידיזציה המתאימה ודקה ב- C 72. o המחזור האחרון היה של 7 דקות ב- 72. o C מוטגנזה בשיטת Quick change ריאקצית PCR נעשתה כמתואר ב- (1996 al.,.(ansaldi et תערובת הריאקציה הכילה: 35ng תבנית DNA ו- pmol 15 מכל פריימר, ריכוז dntps היה 0.2mM ויחידה מאנזים Taq DNA polymerase שהיה מסוג PfuTurbo מחברת.Stratagene ההרצה הייתה בת 18 מחזורים כאשר המחזור הראשון היה 30 שניות ב- C, 95 o המחזורים הבאים היו: 30 שניות ב- C 95, o דקה ב- C 55 o ו- 12 דקות ב- C 68. o בסיום הריאקציה הוסף לתערובת ה- 36

45 1µl מאנזים (10U/µl) DpnI והיא הודגרה למשך שעתיים ב- 37 o C כדי לעכל את PCR תבנית ה- DNA המקורית. לאחר מכן, הוחדר התוצר המוטנטי בטרנספורמציה ע"י Heat shock לחיידקי XL1-blue במדיום + NZY לאחר קביעת רצף ה DNA הוחדר הפלסמיד לחיידקי Rosetta לביטוי prrc המוטנטי. הפרדת DNA על ג'ל אגרוז ההפרדה בוצע כמתואר ב- (2001 Russell,.(Sambrook and מיצוי ה- DNA בוצע באמצעות ערכה מתאימה system" "Wizard SV Gel and PCR Clean של חברת. Promega טרנספורמציה לתאי.E coli ברוב המקרים בוצעה ע"י אלקטרופורציה במכשיר EC100 elctroporator מתוצרת חברת E-C Apparatus Cororaton כפי שמתואר ב-( 1990 Jesse,.(Smith and תוצרי מוטגנזת Quick change הוחדרו לחיידקי E. coli XL1-blue ע"י Heat shock כמתואר ב-.(Sambrook and Russell, 2001) קביעת רצף DNA כל הרצפים של האללים המוטנטים של prrc נקבעו באופן אוטומטי במכשיר PRISM ABI 3100 Genetic Analyzer ע"י Sequencing Unit בפקולטה למדעי החיים, אוניברסיטת ת"א. הכנת מצעי גידול לחיידקים LB הוכן כמתואר ב- 2001) Russell,.(Sambrook and 1 ליטר + NZY (ph 7.5) הוכן מ- 12.5mM MgSO 4,12.5mM Mgcl 2,5gr NaCl,5gr yeast extract,10gr NZ amine ו-.20% glucose 37

46 3. תוצאות 3.1 הגברת ביטוי PrrC בתא וייצובו במבחנה חקירה מפורטת של יחסי מבנה-תפקוד של PrrC מותנית באפשרות להפיקו ולטהרו בצורתו הפעילה. טיהור PrrC התעכב במשך שנים בשל שתי תכונות של החלבון הקשורות לתפקידו: האחת, ביטוי נמוך בתא הנובע מעצם פעילות,PrrC והשנייה, חוסר יציבותו. בסעיפים הבאים אתאר פיתוחם של מספר אמצעים שנועדו לעקוף בעיות אלה מוטנט PrrC-D222E בעל פעילת ACNase מוחלשת גזע הבר של prrc מצטבר ברמה נמוכה בתאי.E coli גם כאשר הוא משובט בפלסמיד רב עותקים ומבוטא תחת בקרת אותות שעתוק ותרגום חזקים. הגבלת הביטוי נובעת מעצם פעילות ACNase של PrrC שכן פגיעתו ב- trnas מעכבת תרגום חלבונים וביניהם את חלבון PrrC עצמו. בהתאמה לכך, מוטנטים הפגועים בפעילות ACNase מעכבים פחות את תרגום החלבונים ולכן מצטברים בתא ברמה גבוהה יותר מאשר גזע הבר (1999 al.,.(meidler et ריכוז גבוה של PrrC מוטנטי בעל פעילות מוחלשת עשוי להקל על בידוד החלבון ולאפשר את אפיון פעילות ה- ACNase. מניסויי מוטגנזה אקראית בגן in vivo נמוכה ACNase שהראה פעילות PrrC-D222E התגלה מוטנט prrc והצטבר בתא לרמה גבוהה בהשוואה לגזע הבר (תמונה 3.1A). בניגוד למוטנטים אחרים בעלי פעילות חלקית שרובם איבדו את פעילותם in vitro הייתה לתמצית תאים שהכילה את דווקא פעילות גבוהה יותר במבחנה מאשר לזן הבר (תמונה 3.1B). הבדל PrrC- D222E זה יכול היה לנבוע מיציבות מוגברת של פעילות המוטנט in vitro בהשוואה לגזע הבר. אולם כאשר משווים את ריכוז החלבון המוטנטי בתמצית התאים הגולמית לזה של גזע הבר על ידי מיהולו בתמצית איזוגנית חסרת PrrC מוצאים שפעילויות שניהם דועכות בקצב דומה in vitro של PrrC-D222E נובעת (תמונה 3.1C). מכאן אפשר להסיק שהגברת היציבות 38

47 מהריכוז הגבוה של החלבון המוטנטי שמצטבר בתא ולאו דווקא בגלל עלייה ביציבות המהותית של החלבון. תמונה 3.1- פעילות ACNase ורמת חלבון של PrrC ה- wt והמוטנט A..D222E השריית ביטוי נגזרות ACNase בתמצית התאים ורמת פעילות PrrC רמת חלבון.IPTG המצוינות בתא נעשתה ע"י הוספת PrrC (ביקוע (trna Lys נקבעו כפונקציה של זמן האינדוקציה, כמפורט בשיטות. B. פעילות ACNase במבחנה של נגזרות PrrC המצוינות במקטעי 150-S, נעשה כמתואר בשיטות. C. מקטעי 150-S של מוטנט D222E נלקחו כפי שהם (ערוצים 1-5) או נמהלו פי 20 במקטע איזוגני שלא הכיל PrrC (ערוצים 6-10) כדי להשוות את ריכוז החלבון המוטנטי עם זה של ה- wt (ערוצים 11-15). הדגימות עברו הדגרה מוקדמת ב- 37 o C בנוכחות 2M TMAO ולאחר מכן נבדקה פעילות ACNase שנותרה ב- 10 o C למשך 10 דקות (עבור ה- wt והמוטנט הלא מהול) או 60 דקות (עבור המוטנט D222E המהול) בתנאים הסטנדרטים. ערכי ה- t 1/2 של הפעילויות שנמדדו היו כ- 11 דקות למוטנט הלא מהול, 5 דקות למוטנט המהול ו- 4 דקות ל- -trna Lys.wt סובסטרט trna Lys fr.1-33, trna Lys ו- fr trna Lys תוצרי הביקוע של ACNase,פרגמנט 1-33 ו של trna Lys בהתאמה. 39

48 3.1.2 ביטוי משולב של PrrC וחלבוני תיקון RNA במהלך ההדבקה בפאג' T4 מתקנים האנזימים פולינוקלאוטיד קינאז (Pnk) ו- RNA ליגאז (Rli) מולקולות trna Lys שנפגעו ע"י ACNase וכך מבטלים את הנזק שעשוי היה להיגרם לתרגום חלבוני הפאג' המאוחרים ולמנוע את התפשטותו לתאים אחרים באוכלוסייה.E coli כיוון שניתן לבטא ביתר את שני האנזימים בחיידקי.(Amitsur et al., (1987 (1985 Murray, (Midgley and, ניסיתי לבטאם בחברת PrrC כדי לבחון אם תיקון שנבקע ע"י ACNase הגדיל את רמת חלבון PrrC בתא. trna Lys לשם כך שיבטתי במורד לגן prrc ותחת בקרה משותפת של אותו פרומוטור ו-.rli (T7-lac) את הגנים המקודדים לשני אנזימי התיקון pnk שיבוט מקביל נעשה בפלסמיד של הנגזרת המוטנטית.PrrC-D222E שני הפלסמידים הוחדרו לחיידק PrrC שמצטברת בתא (תמונה 3.2). רמת חלבון PrrC ונבדקה רמת חלבון K38:pGP1-2 מזן הבר עלתה פי עשר כאשר בוטא בחברת חלבוני תיקון ה- RNA 3.2,ערוץ 1 (תמונה מול 2). לעומת זאת, רמת החלבון המוטנטי PrrC-D222E לא זו בלבד שלא עלתה עקב ביטוי משולב עם, Pnk+Rli אלא פחתה דווקא (תמונה 3.2, ערוץ 3 מול 4). שני גורמים עשויים להסביר ממצא זה. ראשית, בשל פעילותו החלשה יחסית של PrrC-D222E הוא אינו גורם למחסור משמעותי של התחדשות של מולקולות חדשות. trna Lys בתא, שכן קצב האובדן אינו עולה על קצב שנית, הביטוי הנוסף של אנזימי תיקון RNA גוזל כנראה משאבים ש"נועדו" לביטוי.PrrC מאידך, רמתו של PrrC-D222E המבוטא ביתר (רמתו מוערכת כ- 1% ממסת חלבוני התא) הייתה רחוקה עדיין מזו של חלבונים רקומביננטיים רבים המבוטאים ביתר במערכות ביטוי דומות (שמצטברים לכדי 10-20%). לכן אפשר היה להניח שקיימים גורמים נוספים שבעטיים לא ניתן לבטא את PrrC-D222E המוטנטי ברמה דומה. לדוגמא, כמו שמפורט בסעיף הבא, מסגרת הקריאה של prrc עשירה יחסית בקודונים נדירים שסוגי ה- trna התואמים להם אף הם נדירים. אמצעים נוספים להגברת ביטוי PrrC נעשו בהמשך בעיקר עם החלבון המוטנטי. אציין גם שהאפשרות לטהר את PrrC מזן הבר המבוטא בחברת חלבוני תיקון RNA לא נבדקה במסגרת עבודה זו. 40

49 ב( תמונה מס' 3.2- ביטוי חלבון PrrC עם חלבוני תיקון.RNA תאי K38 עם הנגזרות השונות של פלסמיד prrc11 גודלו ועברו אינדוקציה לביטוי prrc והגנים לתיקון ה- trna. לאחר שבירת החיידקים הוטען הליזט על ג'ל חלבונים לאנליזת.Western blot פיצוי על הקודונים הנדירים ב- prrc משפר את ביטוי החלבון בתא בדומה לתוצרי גנים אחרים של.E coli המבוטאים ברמה נמוכה, גם מסגרת הקריאה של prrc עשירה יחסית בקודונים נדירים (כמו- AGA,CUA,CGG,CCC ו- AUA ) שסוגי ה- trna התואמים להם אף הם נדירים (טבלה 3.1). ניתן להגביר משמעותית ביטוי (Novagen) Rosetta חלבונים אלו בשימוש גזעי.E coli מסחריים כדוגמת חיידקי המבטאים ביתר סוגי trna מהפלסמיד.pRARE נדירים יתרון זה ויתרונות נוספים של חיידקי ה- Rossetta הם: (א) ביטוי T7 RNA פולימראז מכרומוזום החיידק תחת פרומוטור,PrrC אותו ניתן להפעיל "במלוא הקיטור" גם בטמפרטורה נמוכה, נוחה יותר ליציבות lac ( נוכחות הגן לליזוזים של פאג' T7 שביטויו ברמה נמוכה מעכב מחד פעילות שרידית של T7 RNA פולימראז ללא אינדוקציה, ומאידך, השפעתו זניחה כאשר הפולימראז מתבטא ביתר. כך נמנעת רעילות לא רצויה של גן דוגמת prrc בהעדר האינדוקציה. 41

50 Codon TTA TTG CTT CTC CAT CTG CGT CGC CGA CGG AGA AGG ATT ATC ATA GGT GGC GGA GGG CCT CCC CCA CCG Amino-acid Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile Ile Gly Gly Gly Gly Pro Pro Pro Pro % prrc % EC-II טבלה 3.1- שימוש קודונים ב- prrc לעומת קבוצת גנים שמבוטאים בשפע ב-.E coli המכונים II" "Class. prrc מתבטאים ברמה גבוהה ב- (המסומנים) EC-II ניתן לראות שהקודונים הנדירים ב-.(EC-II) בתמונה 3.3A אפשר לראות שביטוי החלבון PrrC-D222E בתאי Rosetta ניתן לזיהוי בזמן מוקדם יותר והוא מצטבר לרמה גבוהה יותר מאשר בתאי BL-21 חסרי.pRARE מכאן, אפשר להסיק שביטוי PrrC שופר בשל הפיצוי על הקודונים הנדירים. במקביל הושוותה הפעילות האנזימתית של תמציות מחיידקי Rosetta וממערכת ה K38:pGP1-2 בה השתמשתי קודם. נראה שפעילות ביקוע trna Lys בתמצית הראשונה גבוהה בהרבה (שכן היא הגיעה לרוויה תוך 10 דקות) (תמונה 3.3B ערוץ 1 מול 4) וגם יציבה יותר (כפי שנקבע לפי עמידות בהדגרה מוקדמת) (תמונה 3.3B ערוץ 3 מול 6) מאשר בשנייה. היציבות המוגברת בתמצית Rosetta יכולה להיות מוסברת הן בשל הריכוז הגבוה של PrrC והן בשל השראת ביטוי T7 RNA פולימראז ב 30 o C ולא ב- 42. o C 42

51 תמונה 3.3 השוואת רמת ביטוי חלבון ופעילות in-vitro של PrrC בחיידקי BL1-2,Rosetta ו- K38. trnas המבטא ביתר prare המכילים את פלסמיד Rosetta בחיידקי PrrC-D222E רמת ביטוי חלבון A. נדירים או בחיידקי BL-21 חסרי פלסמיד זה כפונקציה של זמן אינדוקציה. הדגימות כוילו, והוטענו על ג'ל חלבונים לאנליזת Western blot כמתואר בשיטות..B השוואת פעילות in vitro PrrC-D222E בחיידקי Rosetta וב- K38 כפי שמתואר בשיטות. הפרה-אינקובציה נעשתה בטמפ' -trna Lys 10. o C סובסטרט. trna Lys פרגמנט 1-33 של,ACNase תוצר הביקוע של -trna Lys fr.1-33, trna Lys השפעת TMAO על יציבות PrrC ועל ריאקצית ACNase כפי שצוין קודם, טיהור PrrC נמנע גם בשל אי יציבות תרמית של החלבון (1993 al.,.(morad et לכן, בדקתי אם פעילות ACNase של PrrC תיוצב בנוכחות הצ'פרון הכימי TMAO. (TMAO) trimethylamine N-oxide היינו אוסמוליט טבעי המסייע גם בקיפול חלבונים שנפרשׂו.(unfolded) יכולתו לשחזר את המצב הנטיבי הודגמה באמצעות אנזימים שאבדו את המבנה והפעילות בשל מודיפיקציה כימית או מוטציה (1998 Bolen,.(Baskakov and כדי לבחון את השפעת TMAO על יציבות,PrrC הודגרו דגימות של תמצית תאים גולמית שהכילה את PrrC-D222E בין 15 ל- 40 o C בנוכחות (0-2M). לאחר מכן נקבעה המהירות ההתחלתית של ביקוע ריכוזים עולים של TMAO trna Lys בדגימות אלו ב- 10 o C בנוכחות 1M TMAO (תמונה.(3.4A,B התוצאות מראות 43

52 ש- TMAO מעלה את ה- Tm של החלבון, הנמדד ע"פ דעיכת פעילות,ACNase עד כדי 10~ o C בריכוז 2M של TMAO (תמונה 3.4C). אבל בניגוד להשפעת TMAO על חלבונים אחרים שתוארו ע"י TMAO, Bolen & Baskakov לא השיב פעילות ACNase לאחר שאבדה (ניתן לראות זאת בערוצים 1-6 בתמונה 3.4A. הדגימות המתוארות נבדקו לפעילות ACNase בנוכחות 1M TMAO לאחר שעברו קודם לכן אינאקטיבציה תרמית בהעדר.(TMAO PrrCin-vitro נבחנה ACNase ופעילות 2M TMAO הודגרו בטמפ' המצוינות למשך 30 דקות בלי ועם D222E תמונה מס' TMAO-3.4 מעלה את היציבות התרמית של A..PrrC דגימות של מקטע 150-S של למשך 20 דקות ב- C 10 o בנוכחות B. 1M. TMAO עיכוב פעילות ACNase כפונקציה הטמפ' בזמן הפרה- אינקובציה בריכוזי TMAO המצוינים C. ערך ה- Tm של האינאקטיבציה כנגד ריכוז ה- TMAO. בנוסף על השפעת הייצוב שיש ל- TMAO על פעילות TMAO,PrrC משפיע גם על ריאקצית ACNase עצמה. בטמפ' PrrC 10 o C יציב ללא קשר לנוכחות TMAO (תמונה ). 3.5A בתנאים אלו הייתה להוספת TMAO עד 0.5M השפעה קטנה על קצב ביקוע trna Lys של.E coli ע"י.PrrC אבל מעל ריכוז זה הפך TMAO לגורם מעכב של הריאקציה (תמונה 3.5B). בניגוד לכך דווח הגברת פעילות ACNase בריכוז TMAO מעל 0.5M כאשר הוסף לתערובת הריאקציה סובסטרט אנלוגי פחות מובנה, כמו למשל אוליגונוקלאוטיד שמורכב מגבעול ולולאת האנטיקודון (ASL) הנגזר מ- trna Lys של.E coli או trna Lys חסר מודיפיקציות al.,2002) Jiang et al., 2001; Jiang et וכן תוצאות שאינן מוראות). הסבר אפשרי להתנהגויות השונות של סובסטרטים אלה יינתן בפרק הדיון. 44

53 תמונה 3.5- TMAO מעכב את פעילות ACNase של A.פעילות. PrrC ACNase של PrrC-D222E נבחנה בשימוש סובסטרט.E coli trna Lys אחרי שהודגר האנזים בטמפ' המצוינות ללא B..TMAO מהירות התחלתית של ביקוע E. coli trna Lys ב- 10 o C ע"י PrrC-D222E כנגד ריכוז.TMAO ייצוב נוסף של PrrC ע"י הנוקלאוטיד dttp במהלך ניסויים בהם נבחן קשר אפשרי בין אתר NTPase ב- PrrC לבין תפקודי ACNase נמצא במפתיע שהנוקלאוטיד dttp מייצב את פעילות ACNase במידה ניכרת כבר בריכוזים נמוכים כאשר האפקט המרבי מושג כבר ב-.(Amitsur et al., (2003 ~2µM מאחר שבתמצית הגולמית של PrrC מצוי dttp אנדוגני ניכרת השפעת ייצובו על PrrC רק במקטע שנוקה חלקית בפילטרצית ג'ל (סופרדקס- 200 ) בה מסולק הנוקלאוטיד. בתמונה 3.6 מושוות פעילות ACNase במקטעי סופרדקס של PrrC-D222E שהופרדו ללא dttpאו בנוכחות 10µM ממנו. התוצאות מורות כי פעילות ACNase של מקטע סופרדקס שהופרד בנוכחות dttp הייתה גבוהה באופן משמעותי מאשר בהעדרו. מכאן, ניתן להשתמש גם בנוקלאוטיד זה לייצב את PrrC במהלך טיהורו. 45

54 תמונה 3.6- פעילות ACNase לאחר הפרדת PrrC בפילטרצית ג'ל (סופרדקס 200) בנוכחות ובהעדר.dTTP שני מקטעי סופרדקס שהופרדו בהעדר (ערוץ 1) ובנוכחות 10µM dttp (ערוץ 2) נבדקו לפעילות 2µM dttp בנוכחות ACNase לאחר שהושווה ריכוז PrrC בשני המקטעים. fr trna Lys תוצר הביקוע של ACNase,פרגמנט 1-33 של, trna Lys סובסטרט -trna Lys. trna Lys 46

55 3.2 טיהור PrrC בצורתו הפעילה כאמור, טיהור PrrC בצורתו הפעילה הצריך מחד הגברת ביטויו בתא ומאידך ייצוב פעילותו במבחנה. לפיכך ניסיונות טיהור PrrC המתוארים כאן נעשו בתנאי הביטוי המשופרים. אלה כללו (1) שימוש בנגזרת PrrC-D222E בעלת הפעילות החלקית המצטברת בתא ברמה גבוהה, (2) ביטויה בזן Rosetta המפצה על ריבוי הקודונים הנדירים ב- prrc ו- (3) ייצוב נוסף במבחנה על ידי הכללת TMAO ו- dttp לאחר שנמצא שהשפעתם על ייצוב PrrC הייתה אדטיבית (תוצאות לא מוצגות). מולקולות אלה הוכללו בכל מקטעי האנזים והבופרים ששימשו לטיהור החלבון, TMAO בריכוז 1-2M ו- dttp בריכוז.2-10µM בגלל ההשפעה המעכבת של TMAO על ריאקצית,ACNase היה צורך למהול את האנזים כדי להפחית את ריכוז TMAO בתערובת הריאקציה. בנוסף לכך, כדי להחיש את הטיהור אוחתה לחלבון תווית מתאימה למטרת בידודו בכרומטוגרפית זיקה איחוי תווית His 6 לקצה הקרבוקסלי של PrrC עבודות קודמות במעבדה הראו שחיבור שותפי איחוי שונים לקצה האמיני של PrrC His 6 מפחית או מבטל כליל את פעילות.ACNase מסיבה זו בחרתי לאחות תווית לקצה הקרבוקסילי של.PrrC-D222E האיחוי בוצע בתיווך פפטיד מגשר גמיש בן 20 חומצות Factor Xa המיועד אמינו. פפטיד זה, העתיר בשיירי,Gly-Ser הכיל גם רצף המוכר ע"י לאפשר הסרה פרוטאוליטית של התווית בעת הצורך. לתוצר האיחוי המכונה PrrC-D222E-L-His 6 הייתה פעילות גבוהה במקצת מזו של החלבון החופשי כמודגם במבדק in vivo (תמונה 3.7). הפעילות המוגברת של חלבון האיחוי נובעת כנראה מייצוב המוקנה ע"י איחוי הגשר הפפטידי לקצה ה- C שכן ניתן להקנותו גם ע"י איחוי הגשר הפפטידי לבדו (2003.(Shalem, לשם פשטות אכנה מכאן ואילך את הנגזרת.PrrC* כ- PrrC-D222E-L-His 6 47

56 תמונה 3.7- השוואת רמת ביטוי חלבון ופעילויות in vivo ACNase ו- in vitro של PrrC-D222E ללא ועם תווית.A,B.His 6 הפלסמידים prrc11-d222e (ערוץ (2, (6) prrc11-d222e-l-his (ערוץ (3 והפלסמיד prrc11 שלא מכיל prrc (ערוץ 1) בוטאו בחיידקי.Rosetta לאחר האינדוקציה נדגמו דגימות מכוילות של חיידקים לאנליזת Western ולבדיקת פעילות in vivo ACNase כמתואר בשיטות. C. בדיקת פעילות in vitro ACNase במקטע 30-S לנגזרת (6) PrrC-D222E-L-His (ערוץ 4) כמתואר בשיטות, ביקורת המבדק כללה תערובת ריאקציה עם מקטע 30-S שלא מכיל PrrC (ערוץ 5) שלבי טיהור PrrC שלבי הטיהור של PrrC* מליזט התאים כללו סירכוז בצנטריפוגה מהירה (TALON) לשרף קושר קובלט His 6 כרומטוגרפית זיקה של תווית ה-,(30,000xg) ~90% ופילטרצית ג'ל בסופרדקס 200. הפרוטוקול הניב PrrC* מטוהר כדי הומוגניות והעשיר את פעילות ACNase פי 40~ בהשוואה למקטע 30-S (טבלה 3.2 ותמונה 3.8). אציין גם, שפס החלבון המטוהר בתמונה 3.8, ערוץ 3 זוהה כמכיל את PrrC* בלבד באנליזת MALDI-TOF-MS (מפורט בשיטות וחומרים). Step Protein ACNase Specific Yield Purification (mg) (units) activity (U/mg) S , TALON 0.3 9,500 31, Superdex , טבלה 3.2- טיהור.PrrC שלבי הטיהור בוצעו על נגזרת (6) PrrC-D222E-L-His כמתואר בשיטות. קביעת ריכוז חלבון כללי במקטעים נעשה ע"י ריאגנט.Bradford יחידת פעילות ACNase מוגדרת ככמות האנזים הדרושה לביקוע 1 fmol סובסטרט E. coli trna Lys בדקה ב-.10 o C 48

57 תמונה 3.8- שלבי טיהור.PrrC הטיהור נעשה על נגזרת (6) PrrC-D222E-L-His ושלבי הטיהור היו צנטריפוגה מהירה (30-S), כרמוטוגרפית זיקה (IMAC) TALON ופילטרצית ג'ל סופרדקס.(GF) 200 דגימות משלבי טיהור אלו הופרדו על SDS-PAGE והחלבונים זוהו ב- Silver stain (שיטות). במאמר מוסגר אציין שלכרומטוגרפית זיקה העדפתי שרף קושר יוני קובלט על שרף קושר ניקל שכן האחרון לא גרם לניקוי יעיל והשתחררו ממנו יוני מתכת שגרמו לשבירה לא ספציפית של סובסטרט ה- RNA במבדק האנזימתי (תוצאות לא מוצגות) שלבים נוספים שנבחנו לטיהור PrrC בחיפוש אחר פרוטוקול טיהור מתאים ל- PrrC בדקתי מספר אמצעים מקובלים לטיהור חלבונים. למרות שחלקם (המצוינים למטה) נראו יעילים מבחינת דרגת הטיהור ושימור פעילות, שילובם בפרוטוקול הניקוי שתואר לעיל היה בעייתי בשל אובדן פעילות שנגרם ככל כנראה בשל ירידת ריכוז החלבון הכללי במהלך הטיהור הנוסף. הוספת אמצעים אלה לפרוטוקול הקיים תצריך כנראה מציאת דרכים נוספות לייצוב את החלבון ו/או הגברת הפקתו מעבר למה שהושג עד כה. אמצעי ניקוי נוספים אלה מתוארים להלן. א. כרומטוגרפית חילוף אניונים (Q (Mono ערך ה- pi של PrrC הוא כ- 5.5 וכצפוי הוא נקשר למחליפי אניונים. מקטע PrrC שהתקבל לאחר אולטרה-צנטרפוגציה (150-S) הופרד על עמודת (15Q). Mono-Q צורתו הפעילה של NaCl התמצתה מהעמודה בריכוז PrrC של mM ועימה כ- 50% מהחלבון כאשר שאר החלבון הלא פעיל מוצה קודם מהעמודה בריכוז מלח נמוך יותר (תמונה 3.9). בהפרדה זו PrrC שמר על מרבית פעילותו, ודרגת הניקוי שהושגה הייתה 30%~ (תוצאות לא מוצגות). יתרון חשוב של שלב זה שהוא 49

58 מאפשר ריכוז החלבון בנפח קטן דבר שעשוי לסייע לשמירת פעילותו. הצורה הלא פעילה של החלבון שהתמצתה בריכוז מלח נמוך יותר מקבילה כנראה להרכבים חלקיים לא פעילים של החלבון האוליגומרי שלא הופרדו לגמרי בפילטרצית ג'ל (פירוט בפרק 3.3). תמונה 3.9- ניקוי תמצית 150-S של PrrC על.Mono-Q דגימות ממקטעי הקולונה ומתמצית 150-S (load) נבדקו לפעילות ACNase ולביטוי חלבון PrrC באנליזת Western blot (שיטות). האילוציה מהקולונה נעשתה בגרדיאנט מלח, במקטעים (מקום יציאת PrrC הפעיל) נמדד ריכוז mm של.Nacl ב.כרומטוגרפית Hydroxyl-apatite מקטע PrrC פעיל לאחר ניקוי ב- Mono-Q כפי שתואר לעיל הוטען על עמודה Hydroxyl-apatite והחלבון מוצה במפל ריכוזים עולה של 3.10 ניתן בופר אשלגן-פוספט ph7.5 בריכוזים שנעו בין 20 ל mm בתמונה לראות שחלבון PrrC נקשר לשרף והתמצה בתחום mm של הבופר במקביל לפעילת ACNase שנראית גבוהה לכאורה אף מהקטע המקורי שהוטען. סיבה אפשרית לעלייה לכאורה בפעילות האנזים היא סילוק גורם מעכב כלשהו שהיה במקטע שהוטען, כמו למשל שאריות של סובסטרט אנדוגני. 50

59 תמונה המשך טיהור PrrC ממקטע Mono-Q על.Hydroxyl-apatite המקטע שהוטען (מקטע PrrC פעיל לאחר שלב (Mono-Q והמקטעים שמוצו מהקולונה בריכוזי הפוספט המצוינים נבדקו לפעילות ACNase כמתואר בשיטות, תוך השוואת ריכוזי הפוספט בתערובת הריאקציה. בחלק התחתון של התמונה מוצגת אנליזת Western blot לנוכחות.Flow through F.T.PrrC ג. שיקוע סלקטיבי עם -PEG בניסויים מקדימים נמצא שהוספת PEG לתערובת ריאקצית ACNase אינה פוגעת בפעילות האנזים (תוצאות לא מוצגות). כיוון ששיקוע דיפרנציאלי באמצעות PEG הוא שלב טיהור מקובל בחנתי אם ניתן ליישמו לשם טיהור.PrrC מרבית.(Ingham, (1990 PEG לעומת זאת, רובו של החלבונים נוטים לשקוע בין 2 ל- 25% של PrrC וכל פעילות ה- ACNase שלו נותרו מסיסים ב- 25% PEG (תמונה 3.11 ערוץ 1 מול 2). יתר על כן, אפילו ב- 40% PEG נותרו אחוזים משמעותיים מהפעילות ומהחלבון מסיסים (תמונה 3.11 ערוץ 3 מול ). 4 על סמך תוצאה זו וכן מדגם כלל החלבונים במקטעים שהתקבלו בשני ריכוזים של PEG (תוצאות לא מוצגות) ניתן לצפות שיהיה אפשר להשיג טיהור משמעותי של PrrC פעיל ע"י שיקוע דיפרנציאלי בין 25 ל- 40% של.PEG 51

60 תמונה שיקוע PrrC ע"י PEG 3350.PEG הוסף בריכוזים המצוינים לתמצית 150-S המכילה את 0 o C הדגימות הודגרו למשך 30 דקות ב-.PrrC-D222E וסורכזו בקור. המשקע שהופרד מהנוזל העליון הורחף בשני שליש מהנפח המקורי. דגימות משני מקטעים אלו נבדקו לנוכחות פעילות ACNase ועברו אנליזת Western (שיטות). supernatant -S (נוזל עליון), pellet -P (משקע). ד. הסרת תווית His 6 מ-* PrrC - צעד זה אמור היה להקל על סילוק חלבונים לא ספציפיים הנקשרים ל- TALON ומתמצים עם.PrrC- His 6 בפפטיד המגשר בין PrrC לתוויות ה- His 6 נמצא אתר המוכר ע"י הפרוטאז פקטור.Xa אולם הדגרת PrrC-D222E-L-His 6 עימו לשם הסרת התווית גרמה להסרה חלקית בלבד אשר לוותה בפירוק חלקי של PrrC עצמו (תוצאות לא מוצגות). בשל כך יצרתי נגזרת נוספת של PrrC-D222E-L-His 6 ובה אתר לפרוטאז.(Stols et al., (2002 TEV על פי הניסיון שנצבר עם חלבונים רקומביננטיים אחרים, פרוטאז זה מסיר את התווית ביעילות מבלי לפגוע בשותף האיחוי, אך יש לציין כי מרבית המקרים האלה נמצאה התווית במעלה לרצף המוכר ע"י הפרוטאז. הדגרת חלבון האיחוי החדש עם פרוטאז TEV לא גרם להסרת התווית. מאידך, לא הייתה גם פגיעה ב- PrrC (תוצאות לא מוצגות). סיבה אפשרית להעדר חיתוך באתר ה- TEV שהאתר לא היה נגיש לפרוטאז. בעוד שבחלבוני האיחוי עליהם TEV פעל התווית הייתה במורד לאתר הפרוטאז, בנגזרת PrrC-D222E-L-His 6 האתר נמצא במעלה לתווית ה-.His 6 לכן ייתכן שניתן יהיה לפתור בעיה זו ע"י הכנסת רצף מגשר שיחצוץ בין אתר TEV לבין תווית His 6 בנגזרת.PrrC 52

61 3.3 בירור המבנה הרביעוני של PrrC פעילות ACNase הופיעה במקטעי פילטרצית ג'ל המתאימים לחלבון גלובולרי במשקל kDa מכאן הוסק שהצורה הפעילה של PrrC היא אוליגומרית ומכילה בין ארבע לשש תת יחידות (תמונה 3.12). כאשר הפרדתי מקטע גולמי של (150-S) PrrC ישירות על פילטרצית ג'ל התמצתה צורתו הפעילה בשיא המתאים לחלבון אוליגומרי. אך צורה זו היוותה במקרה זה רק 9% מחלבון PrrC שהוטען על העמודה. עיקר החלבון התחלק בין שיאים חסרי פעילות שהתמצו מאוחר יותר והיוו כנראה הרכבים חלקיים של האוליגומר הנטיבי או מונומרים (תמונה 3.14A). יש לציין שגם PrrC מגזע הבר הראה פרופיל אילוציה בפילטרצית ג'ל הדומה לזה של נגזרת PrrC-D222E שאותה כאמור טיהרתי. אך בניגוד לנגזרת המוטנטית, נותרה רק פעילות שרידית של PrrC מזן הבר לאחר ההפרדה וגם זו רק פעם אחת מבין מספר פעמים שנוסו (תוצאות לא מוצגות). תמונה הצורה הפעילה של PrrC היא אוליגומרית. פרופיל אילוציה של חלבון PrrC ופעילות ACNase מעמודת פילטרצית ג'ל. מקטע TALON הופרד על עמודת סופרדקס 200 בגודל 30ml ונוכחות חלבון PrrC ופעילות ACNase נבדקו במקטעים שמוצו כמו שמתואר בשיטות. -KDa מרקרים חלבוניים נטיבים. 53

62 3.3.1 הצורה הפעילה של PrrC הינה טטרמרית גודלה של הצורה הפעילה נאמד גם ע"י צילוב חלבון-חלבון באמצעות גלוטראלדהיד GA כאשר מוסף 3.13A כמו שנראה בתמונה.SDS-PAGE והפרדת התוצרים ב- (GA) הופיעו מלבד PrrC המונומרי שלושה פסים נוספים שנדדו לאט יותר. הפסים האלו מתאימים Azem et al., 1998; Hajdu et al., 1976; להיות צורות דימר, טרימר וטטרמר של ) PrrC al., 1975 (Hucho et. תבנית הסריקה של הפסים כפי שמוצגת בתמונה 3.13B מראה שעוצמת פס הטרימר הייתה נמוכה מזו של הדימר או הטטרמר. תבנית כזו מתאימה לחלבונים שמתארגנים כדימר של דימרים. בין חלבונים אלו מצויה תת-יחידת ATPase של חלבוני ABC transporter ההומולוגית לאתר ה- NTPase שב- PrrC (ראה מבוא).(Denis et al., 2004) תמונה צילוב הדרגתי של PrrC* עם גלוטאראלדהיד.(GA) A. דגימות ממקטע TALON צולבו ב- 0 o C עם 0.01% GA בזמנים המצוינים. לאחר ההדגרה הופרדו הדגימות על ג'ל SDS-PAGE גרדיאנט -5 13% והג'ל נצבע בתמיסת Seeband Forte כמתואר בשיטות. ערוץ 1 מכיל דגימה ללא,PrrC. GA 4&2,3 PrrC מציינים את PrrC המונומרי והצורות דימר, טרימר וטטרמר שלו בהתאמה. B. פרופיל תוצרי הצילוב של GA נלקח מתמונה : A ערוץ 1 (קו מנוקד), 2 (קו תכלת), 6 (קו ורוד). 54

63 מעניין לציין שבדגם הצילוב של PrrC עם GA שהתקבל בהדגרה הקצרה (תמונה 3.13A ערוץ 2) היו שתי צורות דימר. בהדגרות ממושכות יותר נעלמה אחת מהן כאשר במקומה מופיעה הצורה הטטרמרית. לעומת זאת כמות הצורה הדימרית השנייה לא השתנתה (תמונה 3.13A ערוץ 3). ייתכן אפוא שרק חלק ממולקולות PrrC היו מקופלות בתכשיר זה בצורה המתאימה ליצור את הצורה הטטרמרית והן הוצגו ע"י תוצר הביניים הדימרי קצר-החיים הקשר בין המבנה האוליגומרי של PrrC לבין פעילותו כאמור, ניתן היה להפריד בין הצורות האוליגומריות השונות של PrrC ע"י טיהורו על עמודת פילטרצית ג'ל (תמונה 3.14A). במקרה זה רק המקטע הפעיל מניב בצילוב מלא עם GA את הצורה הטטרמרית (תמונה 3.14B ערוצים 1,2). לעומת זאת, מקטע PrrC לא פעיל, שמתמצה מאוחר יותר מהקולונה נתן בצילוב זהה רק צורות נמוכות של האוליגומר שמתאימות להיות דימריות (תמונה 3.14B ערוצים 3,4). צילוב שנעשה באופן דומה בתמצית הגולמית המקורית הראה שהפרופורציה של הטטרמר גדולה בערך פי 5 מכמות החלבון הטטרמרי המתקבל לאחר ההפרדה על הקולונה. ירידה זו הייתה מלווה באיבוד פעילות ACNase במהלך ההפרדה על הקולונה (תוצאות לא מוצגות). מכאן אפשר להסיק שאובדן הפעילות כרוך היה בדיסוציאצית של PrrC הטטרמרי. אבל חימום עדין של מקטע סופרדקס פעיל שגרם לאיבוד פעילות ACNase ולאחריו צילוב מלא עם GA לא היה מלווה כמעט בדיסוציאצית הטטרמר (תמונה 3.14B ערוצים ). 5,6 מכאן, המבנה הטטרמרי נחוץ אבל לא מספיק לפעילות.ACNase יתכן אפוא שאובדן הפעילות נגרם משינויים מבניים בלתי הפיכים שאינם פוגעים בשלמות הטטרמר. 55

64 תמונה הפרדת PrrC על עמודת פילטרצית ג'ל וצילוב מקטעי PrrC פעיל, לא פעיל ומקטע פעיל שעבר אינאקטיבציה A. מקטע 150-S של PrrC-D222E טוהר חלקית על פילרצית ג'ל סופרדקס 200 בנפח 120. ml המקטעים עברו אנליזת Western blot (קו כחול), בדיקת פעילות ACNase (קו אדום) ובדיקת כמות חלבון כללית ב- OD 280 (קו אפור מנוקד). B. מקטעים שהתמצו ב-,active) 60ml ערוצים 1,2) ו- 72ml,inactive) ערוצים 3,4) או מקטע פעיל שעבר אינאקטיבציה בחום למשך 30 דקות ב- 40 o C (ערוצים 5,6) הופרדו כמו שהם על SDS-PAGE או עברו לפני כן צילוב מלא עם 0.01%. GA לאחר ההפרדה נעשתה אנליזת Western-blot (שיטות) המצב האוליגומרי של PrrC בתאים vivo) (in היציבות היחסית של הצורה האוליגומרית הגבוהה של PrrC רומזת שריכוזה הנמוך בתמצית התאים נובעת מאוליגומריזציה לא יעילה.in vivo כדי לבחון אפשרות זאת חשפתי תאים המבטאים את PrrC למגיב DSS המשמש לצילוב חלבון-חלבון גם בתוך התא. תבנית הסולם שהתקבלה עם DSS דמתה לזו שנצפתה in vitro עם,GA כלומר קבלת הצורה האוליגומרית הטטרמרית,אוליגומרים חלקיים ומונומר בלתי מצולב, כאשר אחוז הצורה הטטרמרית הייתה בקירוב 10% מכלל החלבון (תוצאות לא מוצגות). בנוסף, בחנתי את מצבו האוליגומרי של PrrC הכלול בתצמיד.EcoprrI-PrrC הצילוב נעשה עם DSS באנזים ACNase הלטנטי בתאים לא מודבקים ובתאים מודבקים בפאג' T4 בהם הופעל האנזים ACNase הלטנטי. כפי שניתן לראות בתמונה 3.15 תוצרי הצילוב העיקרים היו צורות 56

65 דימריות וצורה אוליגומרית גבוהה בין שהתאים הודבקו ואם לאו (תמונה 3.15 ערוצים 3-6). הצורה האוליגומרית הגבוהה מתאימה בגודלה לתוצר הטטרמרי של PrrC החופשי ממקטע סופרדקס פעיל (תמונה 3.15 ערוץ 2). העדר של תוצרי צילוב נוספים שהיינו מצפים בין חלבוני EcoprrI ל- PrrC רומז שהזיקה בין PrrC ל- EcoprrI חלשה מזיקת הפרוטומרים של.PrrC תמונה פרופיל צילוב של in vivo PrrC באנזים ACNase הלטנטי והמודבק בפאג' T4. חיידקי.E coli CTr5X גודלו והודבקו בפאג' T4 pse T1 (כמתואר בשיטות). לפלטי החיידקים לפני ואחרי ההדבקה הוסף 2mM DSS למשך שעה ב- C 0. o לאחר הריאקציה הורחפו פלטי החיידקים עם בופר הטענה לחלבונים, הופרדו על 10% SDS-PAGE ועברו אנליזת western לזיהוי PrrC (שיטות). ערוצים 1,2 מתארים את PrrC במקטע סופרדקס פעיל לפני ואחרי צילוב עם GA בהתאמה, בדומה לתמונה 3.14 B ערוצים. 1,2 57

66 3.3.4 תמונה פרלימינרית של PrrC במיקרוסקופ אלקטרוני 3.8 ערוץ 3) הוצלבה עם,GA רוכזה דגימה מהמקטע סופרדקס של PrrC (תמונה ונצפתה במיקרוסקופ אלקטרוני ב- Negative staining (שיטות וחומרים). תצפיות ראשונות (תמונה 3.16) רומזות על מבנה אליפטי באורך 15 nm וברוחב 10, nm ממדים המתיישבים עם הצורה טטרמרית. אין ספק שתידרש הפרדה ברמה גבוהה יותר כדי לאושש הנחה זו. תמונה PrrC תחת מיקרוסקופ אלקטרוני. דגימה של מקטע סופרדקס עברה צילוב מלא עם GA ורוכזה. אנליזת Negative staining במיקרוסקופ האלקטרוני בוצעה כמתואר בשיטות. 58

67 3.4 זיקת PrrC לנוקלאוטידים המעורבים בהפעלת האנזים הלטנטי ממצאי עבודה קודמת רומזים שאתר ה- NTPase של PrrC מעביר את אות ההפעלה המושרה ע"י הפפטיד Stp מ- EcoprrI לאתר ה.ACNase נמצא שהפעלת אנזים dttp כאשר ריכוז ה-,GTP והידרוליזה של dttp הלטנטי דורשת נוכחות של ACNase הדרוש להפעלה נמצא נמוך בסדר גודל לערך מ- 50µM) GTP לעומת,300µM בהתאמה). בנוסף, כפי שהוזכר קודם, dttp מייצב את PrrC החופשי ועושה זאת בריכוזים נמוכים ביותר בתחום.µM כמו כן, נמצא ש- ATP מעכב את הפעלת האנזים הלטנטי והוא עושה זאת באפיניות נמוכה בדומה ל-.GTP תופעות אלו הובילו להשערה ש- PrrC מכיל שני סוגי אתרי קישור נוקלאוטיד בעלי אפיניות נמוכה וגבוהה. סוג אחד קושר dttp בזיקה גבוהה ומאפשר בכך פרוק GTP ע"י הסוג השני, כאשר ATP מתחרה עימם על קישור לאחד או לשני סוגי האתרים (2003 al.,.(amitsur et הנחות אלה היו מבוססות על תוצאות ניסויים בהם נחקרה השפעת הנוקלאוטידים על האנזים הלטנטי השלם (תצמיד (EcoprrI-PrrC וחלבון הליבה PrrC) חופשי) בתמציות גולמיות. ולכן לא היה ניתן לשלול מעורבות של חלבון אחר או נוסף בקשירת נוקלאוטידים אלו בהפעלת האנזים הלטנטי. מסיבה זו החלטתי להמשיך ולבחון השערות אלה ישירות תוך בחינת קישור שלושת הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים הללו ל- PrrC המטוהר. חשוב לציין שהשפעת הנוקלאוטידים הללו באה לידי ביטוי בהפעלת האנזים הלטנטי השלם ולא בביטוי PrrC חופשי. לכן בהמשך, לאחר השגת הטיהור של תצמיד,EcoprrI-PrrC יהיה צורך לבדוק שוב את תכונות הקישור שלהם ל- PrrC בקונטקסט של התצמיד השלם. PrrC קושר בצורה שונה את שלושת הקו-פקטורים הנוקלאוטידים PrrC של ACNase מייצב פעילות dttp כפי שתואר בפרק התוצאות החופשי בטווח ריכוזים של.µM דבר זה אפשר לבחון את האינטראקציה שלו עם PrrC המטוהר ע"י צילוב פוטוכימי. PrrC* המטוהר הודגר עם -α] 32 [P -dttp והתצמיד קובע ע"י קרינת UV באורך גל.254nm כתוצאה מכך הופיע תוצר מסומן שנדד ב- SDS-PAGE 59

68 במקום מתאים ל- PrrC מונומרי (תמונה.(3.17A,B במפתיע התקבלה עקומת פעמון של ~0.5 µm dttp תלות הריאקציה בריכוז dttp כאשר הצילוב האופטימאלי הושג ב- (תמונה 3.17B). דגם תגובה זה שונה מהדגם הסיגמואידי שנצפה עבור ייצוב פעילות ACNase של PrrC ע"י.dTTP במקרה זה הושגה מחצית הייצוב המרבי ב- 0.5µM וייצוב מרבי ב- 2µM.(Amitsur et al., (2003 הסבר אפשרי להבדל זה יפורט בדיון. שני הקו-פקטורים האחרים ATP ו- GTP עיכבו את צילוב dttp ל-* PrrC אבל במידה שונה. ATP הפחית ב- 80% את צילוב dttp כאשר הוסף בעודף של פי 100 וב- 96% בעודף של פי 1,000. בניגוד לכך, להוספת עודף של פי 100 של GTP לא הייתה כל השפעה ועודף של פי 1000 הוריד את עוצמת הקישור של dttp רק בחצי (תמונה 3.17D). תמונה דומה נראתה בעבר כאשר הושוו השפעות ATPγS ו- GTP על יכולת dttp להגן על PrrC מפני אינאקטיבציה של פעילות.(Amitsur et al., (2003 ACNase תוצאות אלו רומזות על כך ש- ATP יכול להפר את הקשר בין PrrC ו- dttp בעוד ש- GTP כנראה רק מווסת אותו. במלים אחרות הן תומכות בקישור של dttp ו- GTP בו זמנית ולאתרים נפרדים ב-.PrrC תמונה צילוב פוטוכימי של PrrC עם A. -dttp מקטע TALON של PrrC* הודגר עם הריכוזים המצוינים של -α] 32 P]-dTTP בפעילות ספציפית (300Ci/mmol) והוקרן ב- UV (254nm) למשך 5 דקות כפי שמתואר בשיטות. הדגימות הופרדו ב- SDS-PAGE 10%, הועברו לממברנת ניטרוצלולוז שנחשפה לאוטורדיוגרפיה ועברה אנליזת B..Western תלות יצירת התצמיד PrrC-dTTP בהקרנת C..UV קישור היחסי של dttp ל- PrrC כנגד ריכוזו. D. השפעת יעילות הצילוב של dttp עם PrrC בנוכחות ריכוזים שונים של ATP ו- GTP. 60

69 מאחר ש- GTP ו- ATP נקשרים ל- PrrC באפיניות נמוכה ויעילות ריאקצית הצילוב הפוטוכימי נמוכה אף היא, העדפתי לחקור בעקיפין את קישורם ל- PrrC ע"י קיבוע קוולנטי של הקישור לאחר חימצון הנוקלאוטיד הקשור לחלבון בפריודט (1992 al., (Low et (פירוט בשיטות). על מנת להשוות בניסויים אלו את דגם הקישור של הנוקלאוטידים הפורינים ל- dttp (אותו לא ניתן כמובן לצלוב באופן זה), השתמשתי במקומו ב-.UTP החלפה זו נראית מוצדקת מאחר שגם UTP מייצב את פעילות ACNase ומפעיל את האנזים הלטנטי. ההבדל בינו לבין dttp שהוא עושה זאת בריכוזים גבוהים יותר (בערך פי ) (2003 al., Amitsur et ותוצאות לא מוצגות). בניסויים אלה הודגר PrrC* המטוהר עם כל GTP,ATP) ו- UTP ) כאשר הם מסומנים ב-[ P -α] 32 ולתערובת אחד משלשת ה- rntps הוסף גם פריודט, כתוצאה מכך נוצרו בסיסי-שיף,כנראה בין הנוקלאוטידים לקבוצות אמיניות של ליזין בחלבון, והם יוצבו בחיזור. התצמידים המיוצבים הופרדו ואובחנו כמתואר בשיטות (תמונה 3.18A). התצמידים בין PrrC ל- GTP או ATP נוצרו בקינטיקה סיגמואידית דומה עם ערך EC 50 של ~0.4mM (תמונה.(3.18A,B דגם זה מזכיר את דגם תלות הפעלת ACNase לטנטי ב- (Amitsur et al., (2003 GTP. בניגוד לכך דגם יצירת התצמיד בין PrrC ל- UTP היה פעמוני כאשר הקישור האופטימלי הוא בין UTP mM (תמונה dttp תבנית זו דמתה לתבנית שנצפתה בצילוב הפוטוכימי של.(3.18A,B ל - PrrrC אם כי אפיניות הקישור של UTP הייתה נמוכה יותר. כדי לבחון אם GTP,ATP ו- UTP מתקשרים לאותו סוג אתרים ב-,PrrC ביצעתי ניסויי תחרות בהם הודגר PrrC* עם צרופים זוגיים של הנוקלאוטידים כאשר אחד מבני הזוג מסומן רדיואקטיבית וריכוזו קבוע ובו זוגו השני אינו מסומן וריכוזו משתנה. בנוסף בדקתי אם dttp מסוגל לעכב את האינטראקציה של PrrC עם rntps המחומצנים השונים. 61

70 תמונה צילוב נגזרות מחומצנות של GTP,ATP ו- UTP ל- PrrC. A. דגימות ממקטע TALON של PrrC* הוגבו עם כל אחד מה- rntps המסומנים ב-[ -α] 32 P בטווח ריכוזים mM התוצרים שהתקבלו הופרדו ב- SDS-PAGE 10% הועברו לממברנה ניטרוצלולוז ולאחר מכן נחשפו לאוטורדיוגרפיה ועברו אנליזת -α] 32 P ה- rntps -[. C ריכוזם. כנגד ל- PrrC rntps קישור היחסי של B. כמתואר בשיטות. Western המחומצנים צולבו ל- PrrC בנוכחות ריכוזים שונים של מתחרים לא מסומנים המצוינים rntps) ו- dttp )..D-F קישור יחסי של rntps המסומנים כנגד ריכוזים שונים של הנוקלאוטידים מתחרים לא מסומנים. 62

71 כפי שמתואר בתמונות,3.18C-F שלושת ה- rntps התחרו זה בזה על קישור GTP ביעילות רבה יותר מאשר PrrC מ- UTP דוחק את ATP אולם נמצא ש-.PrrC (תמונה 3.18F). כמו כן, dttp עיכב את קישור UTP המחומצן ל- PrrC ביעילות הגבוהה ביותר כצפוי מהדמיון בין בסיסיהם. בנוסף לכך dttp דחק את ATP מ- PrrC ביעילות רבה יותר מאשר את GTP (תמונה.(3.18D-F גם תוצאות ניסויים אלה רומזים ש- UTP,GTP מאחר ש-. GTP המחקה כנראה את dttp נקשר לסוג אתרים שונה מזה של UTP ו- dttp מתחרים כולם על קישור של ATP המחומצן, אפשר להסיק ש- ATP נקשר לשני סוגי האתרים או שקישורו לאחד מהם מפריע לקישור נוקלאוטידים לסוג השני מוטציות בחלק ה- NTPase של PrrC מעכבות את קישור הנוקלאוטידים השייר השמור Lys 46 שייך למוטיב ה- (P-loop) Walker A ב- PrrC (תמונה.(1.3 הוא חשוב לפעילות ACNase של PrrC החופשי מאחר שהחלפתו מבטלת פעילות זו ומכיוון שקישור נוקלאוטיד מייצב את החלבון (2003 al.,.(amitsur et לכן, ציפיתי ששייר זה יוכל לייצר בסיס-שיף בין PrrC לבין קבוצת האלדהיד של ה- rntps המחומצנים. בהתאם להנחה זו הייתה המוטציה בשייר זה צריכה לפגוע בריאקציה צילוב זו. ציפיתי גם שמוטציה זו תשפיע על קישור הנוקלאוטיד באופן כולל יותר ולכן גם תעכב את הצילוב הפוטוכימי של בסיס הנוקלאוטיד dttp ל-,PrrC זאת בהנחה ש- dttp נקשר לשיירים הכלולים באותו מוטיב. לעומת זאת ציפיתי שלשייר השמור Lys 168 המצוי מספר שיירים במעלה למוטיב ABC signature (תמונה 1.3) תהיה השפעה קטנה יותר אם בכלל על קישור הנוקלאוטיד. בחנתי ציפיות אלו ע"י החלפת כ"א משיירי Lys אלו או החלפת שניהם ב-.Asn חילופים אלה בוצעו על רקע.PrrC-D222E-L-His 6 החלבונים המוטנטים היו מסיסים וניתן היה לטהרם בדומה לחלבון המקורי. הם דמו לו גם בתבנית הצילוב עם GA אבל חסרו פעילות ACNase (תוצאות לא מוצגות). המוטציה K46N הפחיתה כדי חצי את קישור UTP ו- ATP ל- PrrC (תמונה K168N המוטציה 3.19B). (תמונה GTP אבל לכאורה לא השפיעה על קישור,(3.19A,C 63

72 לא הפחיתה את קישור ATP ו- GTP ל- PrrC והשפיעה מעט על קישור. UTP למרות זאת ניתן היה להבחין בהשפעת כל אחת מהמוטציות הבודדות ע"י שיתוף הפעולה ביניהן במוטנט הכפול.K46N-K168N כך עיכבה המוטציה הכפולה את קישור UTP ו- GTP יותר מאשר המוטציה K46N לבדה (תמונה.(3.19A-C תוצאות אלו מתיישבות עם חשיבות Lys 46 לקישור הנוקלאוטידים ל- PrrC. אבל הן מראות גם ששיירי Lys נוספים,כנראה בדומיין ה-,NTPase עשויים להגיב עם קבוצות האלדהיד של ה- rntps המחומצנים הקשורים ל-.PrrC העיכוב המשולב של K46N ו- K168N רומז על כך שגם ל- Lys 168 יש השפעה על קישור ה-.rNTPs מעניין לציין גם שהצילוב הפוטוכימי של dttp עוכב במידה ניכרת בהרבה ע"י כל אחת משלוש המוטציות (תמונה 3.19D). מאחר שהעיכוב במקרה זה היה חריף יותר אפשר להניח שיכולת בסיס הנוקלאוטיד המעורר ע"י הקרינה לתקוף את החלבון רגישה בהרבה לשינויים המוטציוניים ב-,PrrC מאשר יצירת בסיס השיף עם כל אחד משיירי האלדהיד של נגזרות ה rntp המחומצנות. מניסויים אלו ניתן להסיק שכל הנוקלאוטידים שנבדקו נקשרים לאותו דומיין בחלבון PrrC ולאותם מוטיבים באותו דומיין. מאחר שהצורה הטטרמרית של PrrC מכילה ארבעה אתרי קישור לנוקלאוטיד אפשר גם להניח שאתרים אלה יכולים לעבור דיפרנציאציה לסוגי אתרי משנה הנבדלים ע"י שינויים קלים כתוצאה מאופן קיפול החלבון פעילות NTPase ב- PrrC GTP הפעלת אנזים ACNase הלטנטי דורשת ככל הנראה הידרוליזת PrrC ב- נקשר לאתר ה- NTPase GTP מאחר שנמצא ש-. (Amitsur et al., (2003 בדגם הדומה לתלות הפעלת האנזים הלטנטי בריכוז,GTP מתעוררת השאלה האם PrrC בנוסף להיותו ליבת ו- dttp בנוסף, מאחר ונמצא ש- ATP.GTPase הוא גם ACNase נקשרים גם כן למוטיב ה- NTPase שב- PrrC ראוי לבדוק אם גם הם עוברים 64

73 תמונה השפעת מוטציות בחלק ה- NTPase של PrrC על קישור נוקלאוטידים. השוואת קישור נגזרות מחומצנות של rntps וצילוב פוטוכימי של dttp ל-* PrrC ולמוטנטים המצוינים בניסויים דומים לאלו שתוארו בתמונה 3.18 ו בהתאמה. הידרוליזה על ידיו, בין שהדבר נחוץ לתפקוד האנזים או משקף עיוות של פעילותו בשל הפרדת אנזים הליבה משותפיו הפיזיולוגיים. בבדיקת פעילות NTPase של PrrC* המטוהר נתקלתי ברקע גבוה של תוצרי הפרוק מעבר לזה שנבע מפירוק ספונטאני של הנוקלאוטידים. רקע זה נבע כנראה מפעילות NTPase ו/או פוספוטאז שלא הופרדו מ- PrrC במהלך הטיהור. לכן כדי לזהות פעילות הידרוליזה מעל הרקע השוויתי במקביל את תוצרי פרוק הנוקלאוטידים של PrrC* המטוהר המקורי עם PrrC* מוטנטי בו חל חילוף בשייר משומר של מוטיב ה- Walker A של ה-.(K46N-K168N) באותו דומיין ABC-signature ושייר נוסף במעלה למוטיב ה NTPase 65

74 מוטציות אלו, בעיקר K46N אמורות לבטל את יכולת ההידרוליזה (1990 al.,.(saraste et החלבון המוטנטי כאמור היה מסיס, הניב דגם צילוב ע"י גלוטראלדהיד זהה לזה של זן המקורי וניתן היה לטהרו באופן דומה. במבדקי ה- NTPase אלו הדגרתי מקטעי סופרדקס של PrrC (תמונה 3.8 ערוץ (3 ו- PrrC המוטנטי K46N-K168N) ( עם - P] [γ- 32 או γ] 32 [P -ATP בריכוז 1mM בפרקי הזמן המצוינים. הפרדתי את התוצרים על GTP כרומוטוגרפית.TLC מהתוצאות ניתן להסיק על פעילות הידרוליזה ספציפית של שני הנוקלאוטידים ע"י PrrC* המקורי מעל הרקע של PrrC* המוטנטי (תמונה 3.20A ערוצים 2,3 מול 5,6 ו- 8,9 מול- 11,12 ). פעילות dttpase נבדקה עם -α] 32 P]-dTTP בריכוז 0.5µM ו- 10µM במקטעי TALON של PrrC* המקורי. מקטעי TALON של המוטנט PrrC*-K46N-K168N ומוטנט חסר PrrC- שאינו מכיל בכלל את מוטיב ה- NTPase (תמונה 1.3) שמשו כבקורות. במקרה זה אפשר היה להבחין בפעילות הידרוליזה של dttp ע"י PrrC* מזן הבר מעל הרקע המוטנטי רק בריכוז הנמוך של 0.5µM (תמונה 3.20B ערוצים 19,20 מול 23,24 ו- ). 15,16 לעומת זאת בריכוז 10µM dttp לא הובחנה פעילות dttpase ב- wt מעל הרקע של המוטנטים (תמונה ) C 66

75 תמונה פעילות NTPase ב- PrrC. A. מקטעי סופרדקס של PrrC* המקורי (wt) ומוטנטי בשיירים במוטיב (K46N-K168N) NTPase הודגרו עם [γ- 32 P] -GTP ועם [γ 32 P]- ATP בריכוז 1mM ב- 10 o C בזמנים המצוינים. לאחר מכן הדגימות הופרדו ב- PEI כפי שמתואר בשיטות. B. מקטעי TALON של PrrC* המקורי,(wt) מוטנט PrrC החסר בחלק ה- NTPase (2-242 ) ומוטנט בשיירי (K46N-K168N) NTPase הודגרו עם -α] 32 [P dttp בריכוז 0.5µM בניסוי דומה כמו ב- A. 67

76 3.5 בחינת זהות רכיבי האתר הפעיל של ACNase באמצעות מודיפיקציות כימיות השוואת רצפי ההומולוגים השונים של PrrC (תמונה 1.3) הצביעה על מספר שיירים פונקציונליים פוטנציאליים השמורים לחלוטין בחלקו הקרבוקסילי שצפוי היה להכיל את אתר ה-.ACNase ניסויי מוטגנזה החשידו שלושה מהם Glu 324, Arg ו- - His 356 במעורבות ישירה בקטליזת ריאקצית ה ACNase ותוצאות ניסויי "הצלה כימית" rescue) (Chemical.(Amitsur et al, in prep) התיישבו עם ההנחות ביחס ל- Arg 320 ו- גישה בלתי Glu 324 תלויה המאפשרת להתרשם מתרומת שייר חומצה אמינית לקטליזה אנזימתית היא שימוש במודיפיקציה כימית ייחודית אשר פוגעת בפעילות האנזים (1999.(Fersht, השתמשתי בגישה זו כדי להמשיך לבחון את המעורבות האפשרית של Glu 324, Arg 320 ו- His בקטליזת ACNase תוך שימוש בתכשיר PrrC שטוהר כמתואר בפרק לשם כך (DEPC) אשר diethylpyrocarbonate בדקתי את השפעתם של המגיבים הבאים: (1) (PG) phenylglyoxal מתמיר שיירי His ו- Lys,(Miles, 1977) (2) מתמירי :Arg ו- (Berghauser, 1975; Rohrbach and Bodley, 1977) (BD) 2,3-butanedione (EDAC) 1-ethyl-3-(3-dimethlamino-propyl) carbodiimide שמתמיר Glu ו- (1977 al.,.(pho et השפעת מגיבים אלה על פעילות ACNase נבדקה בשתי ו- (3) Asp דרכים: הדגרתם עם PrrC לפני הריאקציה או הוספתם בזמן הריאקציה, כלומר בהעדר או בנוכחות הסובסטרט, בהתאמה. בדרך הראשונה הודגרה דגימה מנוקה של PrrC* עם המגיב הנתון ב- 10 o C בין 10 ל- 30 דקות. בסיום ההדגרה הוספה כמות עודפת של ריאגנט מתאים כדי לסתור את המגיב, ארגינין במקרה של PG או,BD אימידאזול במקרה של DEPC ואצטט במקרה של.EDAC לאחר מכן הוסף הסובסטרט trna Lys המסומן ונבדקה פעילות ACNase השיורית (שיטות וחומרים). נמצא שבתנאים אלו DEPC מעכב את פעילות ACNase לחלוטין (תמונה 3.21A ערוץ 5 מול- 6). לעומת זאת, שאר המגיבים לא גרמו להפחתה נראית בפעילות האנזים (תמונה 3.21A ערוץ 1 מול 3 2, ו- 4 ). כדי לזהות שיירי PrrC שהותמרו ע"י DEPC בוצעה אנליזת.MALDI-TOF-MS באנליזה זו הושוו פפטידים שהתקבלו בעקבות פרוק 68

77 טריפטי של PrrC מקורי ומ- PrrC שהותמר ב- DEPC (בשני המקרים מדובר בנגזרת באנליזה זו נמצא שרק שיירי הליזין הלא משומרים,Lys 60 ). PrrC-D222E-L-His 6 Lys 140 ו- Lys 299 הותמרו. מסקנה זו התקבלה מאחר וטריפסין לא בקע את החלבון באתרים אלה ומסת הפפטידים שהתקבלו , ו הייתה גבוהה מהטבעית ב-,72Da כצפוי מהתמרה ע"י DEPC (תוצאות לא מוצגות). מאחר ושיירי ליזין אלה אינם שמורים סביר להניח שהם אינם שייכים לאתר הקטליטי. לכן, ביטול פעילות ACNase ע"י trna Lys נגרם כנראה משינוי לא ספציפי במבנה החלבון או מפגיעה בקישור ה- DEPC לאנזים (בשל קרבה אפשרית של Lys 299 לאתר הקישור) אבל לא בגלל פגיעה בשייר קטליטי. בסוג הניסויים השני הוספו PG,EDAC ו- BD לתערובת ריאקצית ACNase (תמונה 3.21C ערוץ 11 מול- 12, 13 ו- 14 ). במקרים אלה נצפה עיכוב משמעותי במהלך הריאקציה. עיכוב זה לא נבע משינוי שחל בריאקטיביות הסובסטרט מאחר שהדגרה מוקדמת שלו עם כל אחד מהמגיבים לא גרמה לעיכוב ביקועו (תמונה 3.21B ערוצים 7-10). כלומר, שלושת המגיבים PG,EDAC ו- BD שלא עיכבו את PrrC כאשר בוצעה הדגרה מוקדמת איתו, עיכבו אותו בצורה משמעותית בנוכחות הסובסטרט. השפעת הסובסטרט על עיכוב ACNase ע"י המגיבים נחקרה בהמשך בשיתוף עם מיכל עמיצור במעבדתנו. בניסויים אלה נמצא שהוספת המגיבים PG,EDAC ו- BD לתערובת ריאקציה המכילה ריכוז סובסטרט לא מרווה M) (Jiang et al., 2002) (5x10-10 עיכבה את ריאקצית.ACNase אבל כאשר הועלה ריכוז הסובסטרט חלה הפחתה בעיכוב עד שחדלה לגמרי בריכוז מרווה ) 8-5x10) (מיכל עמיצור-תקשורת אישית). דגם העיכוב של EDAC היה מורכב עוד יותר. עיכוב מרבי נצפה ב- 5-10mM של מגיב זה, אך עם העלאת הריכוז מעבר לכך נחלש תחילה העיכוב ואח"כ התחלף בהגברה של פעילות האנזים מעבר לזו שנצפתה עם אנזים לא מותמר (מיכל עמיצור-תקשורת אישית). לסיכום, מתמירים כימיים ייחודיים לארגנין או לשיירים קרבוקסיליים לא השפיעו על פעילות ACNase בהעדר סובסטרט או בנוכחות ריכוז מרווה שלו אך פגעו משמעותית בפעילות האנזים בנוכחות ריכוזים תת-מרווים של הסובסטרט. 69

78 A. דגימות TALON הודגרו הדגרה השפעת מודיפקציות כימיות על פעילות.ACNase תמונה 10mM למעט DEPC שריכוזו מוקדמת למשך 15 דקות ב- C 10 o עם המגיבים המצוינים. הם הוספו בריכוז אחרי נטרול המגיבים (שיטות) הוסף הסובסטרט ונבדקה פעילות B..ACNase הסובסטרט היה.2.5mM לאחר נטרולם הוסף PrrC ופעילות A. trna Lys הודגר הדגרה מוקדמת עם המגיבים המצוינים בדומה ל- C. המגיבים המצוינים נכללו בריאקצית ACNase סטנדרטית בריכוז.10mM הראקציה ACNase נבדקה. מסמל ".w" נמשכה 15 דקות ב- C 10. o ערוצי הביקורת,1,5,7 11 הכילו אתנול במקום תמיסת המגיב..with 70

79 4. דיון חקירת יחסי מבנה-תפקוד של,PrrC ליבת ACNase התעכבה במשך שנים בשל הקושי לבטא חלבון רעיל זה ביתר ובשל אי-יציבותו. בעבודה זו תוארו אמצעים שונים לפתרון בעיות אלה. אמצעים אלה הגבירו במידה ניכרת את רמת ביטוי PrrC בתא החיידק ואת יציבותו במבחנה. הם אפשרו בהמשך לטהר את PrrC כמעט להומוגניות, ובעקבות כך לגלות שבצורתו הפעילה PrrC הוא טטרמר וכנראה מורכב מדימר של דימרים. טיהור PrrC אפשר מצדו לבחון את זיקתו המשוערת של החלבון לקו-פקטורים הנוקלאוטידיים הנחוצים להפעלת ACNase הלטנטי וסייע בזיהוי שיירי חומצות אמינו שעשויות להיכלל באתר הפעיל של האנזים. טיהור PrrC יתרום לחקירת היבטים תפקודיים ומבניים נוספים של האנזים. פרק זה מתייחס לנושאים אלו בסדר זה. 4.1 הגורמים המשפיעים על יציבות PrrC אחת המגבלות העיקריות לטיהור PrrC הייתה אי-היציבות הקיצונית של פעילותו. במבחנה פעילות ה- ACNase רגישה ביותר. כך נמצא שבתמצית אל-תאית מאבד PrrC מחצית מפעילותו בפחות מדקה ב- 30. o C מאחר ואובדן הפעילות לא כרוך בפרוטאוליזה נצפית, הוצע שהוא נובע מדנטורציה תרמית (1993 al.,.(morad et בעבודה זו נמצאו דרכים שונות להגביר את יציבות PrrC ובכללן: העלאת ריכוזו בתא ע"י שימוש במוטנט בעל פעילות מוחלשת, ביטוי החלבון בתא המבטא ביתר סוגי trna נדירים וטיהורו בנוכחות שתי מולקולות קטנות מייצבות: הצ'פרון הכימי TMAO והליגנד הנוקלאוטידי.dTTP אמצעים אלו אפשרו לטהר את PrrC במצבו הפעיל ואגב כך לברר את מבנהו הרביעוני השפעות נוגדות של TMAO על ייצוב PrrC ופעילות ACNase TMAO הוא אוסמוליט אורגני הנמצא בתאי elasmobranches (דגי סחוס) המכילים אוריאה בריכוז גבוה. סבורים ש- TMAO מגן על החלבונים התאיים מפני השפעתה המזיקה של האוריאה ושומר על פעילותם הביולוגית. בהסכמה לכך, נמצא שבמבחנה 71

80 TMAO מתפקד כצ'פרון כימי שכן הוא מקפל חלבונים שנפרשו (unfolded) בשל מודיפיקציה כימית או מוטציה ומשיב להם את פעילותם הביולוגית. כדוגמאות אפשר לציין נגזרת של ריבונוקלאז T1 אשר נפרשה באופן בלתי הפיך ע"י חיזור, שלאחריו הותמרו הציסטאינים המחוזרים בשיירי קרבוקסיאמיד.(RCAM-T1) הדוגמא השנייה היא נגזרת מוטנטית של נוקלאז מסטפילוקוקוס (T62P) בה נקטעה כנראה רציפות אחד מהליקסי α ע"י ההתמרה. נוכחות TMAO השיבה לכ"א מהחלבונים הפגומים את המבנה הנטיבי וגם את פעילותם האנזימתית לרמה הקרובה לזו של חלבון שלא עבר מודיפיקציה או לזן הבר, בהתאמה Phd היא של TMAO דוגמא אחרת לחלבון שיוצב ע"י.(Baskakov and Bolen, (1998 Phd שאינו יציב באופן טבעי. (Prevent host death) פועל כאנטי-טוקסין במערכת התמכרות שגורמת לתא החיידק לשמור על פלסמיד פאג' Phd P1. נפרש בקלות ונחשף לדגרדציה פרוטואוליטית. אך בנוכחות TMAO נשאר Phd מקופל בצורתו הנטיבית ומוגן מפירוק 1999) Sauer,.(Gazit and בעבודה זו מצאתי ש- TMAO ייצב את פעילות PrrC ע"י העלאת נקודת היתוכו".(3.4 בכדי ~10 o C (המתבטאת באובדן מחצית הפעילות) (תמונה עובדה זו תומכת בהנחה שחוסר יציבות PrrC נובע מנטיית החלבון להיפרש בטמפרטורה נמוכה יחסית. המודל הכללי שהוצע למנגנון ייצוב חלבונים ע"י TMAO מבוסס על אפקט סולבופובי (solvophobic) הפועל על השלד הפפטידי החשוף כאשר החלבון פרוש. בהתאם לרעיון זה, TMAO "מצפה" את השלד הפפטידי בעטיפה הידרופובית וגורם בכך לצורה המקופלת של החלבון להיות מועדפת אנרגטית יחסית לפרושה (1998 Bolen,.(Baskakov and ניתן להסביר באופן דומה את ייצוב PrrC ע"י.TMAO מאידך, בניגוד לחלבונים אחרים שעברו דנטורציה, TMAO לא השיב ל- PrrC פעילות ACNase אם אבדה (תמונה 3.4). ניתן להניח, אם כן, שפרישת PrrC כוללת שלב הפיך המגיב ל- TMAO ושלב בלתי הפיך שאינו מגיב לו. השלב הבלתי הפיך יכול להתרחש ברמת הטטרמר מאחר שאובדן פעילות ACNase בעקבות חימום קל של PrrC לא היה כרוך בדיסוציאצית הצורה הטטרמרית (תמונה 3.14). בהקשר לכך אציין שתבניות צילוב חלבון-חלבון שהתקבלו עבור PrrC 72

81 בתצמיד אנזים ACNase השלם in vivo הראו שהוא מצוי בצורה הטטרמרית גם במצב הלטנטי טרם ההדבקה בפאג' T4 וגם בצורה המופעלת לאחריה (תמונה 3.15). מכאן שהפעלת האנזים הלטנטי אינה כרוכה בהיווצרות הטטרמר ממונומרים או הרכבים חלקיים לא פעילים, אלא בשינויים מבניים ברמת הטטרמר. במפתיע נמצא שריכוז TMAO גבוה שייצב את המבנה הפעיל של PrrC גם עיכב במידה ניכרת את ריאקצית,ACNase בייחוד כאשר trna Lys הטבעי היה הסובסטרט (תמונה 3.5). השפעה מעכבת ריאקציה של TMAO תוארה גם במקרה של נוקלאז מסטפילוקוקוס וההסבר שניתן לכך היה ש- TMAO מייצב גם את סובסטרט ה- DNA במבנה דו-גדילי שהוא פחות ריאקטיבי מחד- גדיל (1998 Bolen,.(Baskakov and בנוסף נמצא ש- TMAO מייצב גם את מבנה ה- RNA ההליקלי ב-.(Gluick and Yadav, (2003 trna מכאן, השפעת TMAO על ריאקצית ACNase יכולה לנבוע גם משינוי מבני שהוא מחולל בסובסטרט.tRNA Lys תופעה כזו עשויה לספק תימוכין למודל הסובסטרט האופטימאלי שהוצע עבור.ACNase על פי מודל זה PrrC מעדיף לפעול על סובסטרט בו שלשת האנטיקודון מוקשחת במבנה A-RNA וזיווגי בסיסים באזור גבעול-לולאת האנטיקודון מעורערים במידת מה 2001) al.,.(jiang et al., 2002; Jiang et בהקשר זה אציין שריכוזי TMAO גבוהים יחסית משפרים דווקא את הריאקטיביות של אנלוגי trna Lys בעלי מבנה פחות יציב דוגמת trna Lys חסר מודיפיקציות או דומיין ה- Anticodon stem ) ASL המבודד 2001) al.,.(jiang et al., 2002; Jiang et ייתכן אפוא ש- TMAO (and loop מקשיח את מבנה A-RNA של האנטיקודון בסובסטרטים הפחות יציבים אלו ובכך מעלה את הריאקטיביות שלהם, ומאידך מקשיח את זיווגי הבסיסים בסובסטרט הטבעי ובכך פועל דווקא בכיוון ההפוך. הנחות אלה אינן סותרות אפשרות נוספת שהשינוי המבני ש- TMAO מחולל ב- PrrC עשוי להקפיא את החלבון בקונפורמציה פחות פעילה. רעיונות אלו צריכים להיבדק ע"י בחינת השפעת TMAO על מבנה החלבון והסובסטרטים השונים שלו באנליזות מבניות ישירות. 73

82 4.1.2 קישור נוקלאוטיד ל- PrrC מייצב את החלבון בקונפורמציה פעילה מספר ממצאים הובילו להשערה שקישור נוקלאוטיד למוטיב NTPase ב- PrrC מייצב את החלבון בצורתו הפעילה. ראשית, פעילות ACNase של PrrC החופשי מיוצבת ע"י ריכוזים נמוכים ביותר של dttp ובמידה פחותה ע"י ריכוז גבוה יותר של ATPγS (2003 al.,.(amitsur et שנית, ניצולת גבוהה של פעילות ACNase התקבלה כאשר PrrC טוהר בנוכחות dttp מאשר בהעדרו (תמונה 3.6). שלישית, המוטציה K46N בשייר השמור במוטיב Walker A של ה- NTPase האמורה לפגוע בקישור נוקלאוטיד לחלבון עיכבה את צילוב הנוקלאוטידים המחומצנים ל- PrrC (תמונה 3.19), ובטלה גם את פעילות.(Amitsur et al., 2003) EcoprrI-PrrC החופשי והן של תצמיד PrrC הן של ACNase ABC מוטיבי ה- NTPase של PrrC דומים לאלה של תת-יחידת ATPase של.E coli מ-,MalK דוגמת הטרנספורטר למלטוז, transporters הפועל כהומו-דימר. לממשקי הדימר נקשרות שתי מולקולות,ATP כאשר כ"א מהן ממוקמת בין מוטיב Walker A של תת-יחידה אחת ומוטיב ABC signature של תת-היחידה השנייה. כל ממשק חלבון-נוקלאוטיד כולל 22 אינטראקציות ייחודיות מזוהות אשר באמצעותן הנוקלאוטיד מייצב כנראה את המבנה הדימרי (2003b.(Chen et al., בשל הדמיון בין MalK לדומיין ה- NTPase של PrrC סביר להניח שגם דימריזצית PrrC כרוכה ביצירת ממשקים קושרי נוקלאוטיד משותפים לשתי תת היחידות. Asp 222 הינו שייר שמור במוטיב Walker B של דומיין NTPase של PrrC (תמונה 1.3). לכן החלפתו ב-,Glu בנגזרת המוטנטית בה השתמשתי לטיהור החלבון, עשויה הייתה לשנות את תפקוד ה- NTPase וכתוצאה מכך להשפיע באופן כלשהו גם על פעילות של הדומיין הקרבוקסילי השכן. ואכן, המוטציה PrrC-D222E הקטינה את ה- ACNase הפעילות האינטרינזית של.ACNase כמוסבר בהמשך, ירידה זו לא נבעה מאובדן יציבות החלבון. שלהם. מוטנטי PrrC בעלי פעילות ACNase מוחלשת מעכבים פחות את הסינתזה בשל כך הצטבר מוטנט זה בתא ברמה גבוהה יותר מאשר ה- wt (תמונה 3.1A). 74

83 אולם בניגוד למוטנטים מוחלשים רבים אחרים שהצטברו אף הם לרמה גבוהה, ל-.in vitro הייתה בתמצית התאים פעילות גבוהה PrrC-D222E יתר על כן, פעילות זו הייתה גבוהה אף יותר משל תמצית תאים של זן הבר, היפוכו של המצב.in vivo תופעה זו יוחסה להגברת היציבות של החלבון המוטנטי PrrC-D222E בתמצית התאים. הגברת יציבות זו נבעה מצדה מריכוז החלבון הגבוה יותר של המוטנט ולא משינוי מהותי ביציבותו בשל המוטציה. מסקנה זו נבעה מהממצא שפעילות המוטנט דעכה בדומה לזו של wt כאשר הושוו ריכוזי החלבונים של שתי הצורות בתמצית התאים (תמונה.(3.1B,C ייתכן שהחלשת הפעילות האנזימתית האינטרינזית בשל המוטציה D222E רומזת שלאתר ה- NTPase ממסך את פעילות ה- תפקיד כל שהוא בוויסות פעילות אתר ה-.ACNase כזכור, EcoprrI.Stp ומיסוך זה מופר בשל שינויים שמחולל הפפטיד ACNase שינויים אלה תלויים בין היתר בהידרוליזת GTP וקישור dttp המתווכים כנראה ע"י דומיין מאידך, פעילות ACNase עצמה אינה תלויה בהידרוליזת ה- NTPase של.PrrC נוקלאוטיד למרות שהיא מיוצבת ע"י קישורו (2003 al.,.(amitsur et לכן יש לשקול גם את האפשרות שהמוטציה D222E שינתה באופן כלשהו את אופן קישור הנוקלאוטיד ל- PrrC F1-ATPase בשל הסטת הקבוצה הקרבוקסילית. אפשרות זו נתמכת ע"י מודל הגביש של מיטוכונדריאלי. במודל זה יוצר יון +2 Mg קשרי קואורדינציה מחד עם חמצן פוספט של הנוקלאוטיד ומאידך עם קבוצת הקרבוקסיל של Asp השמור במוטיב,Walker B ישירות או בתיווך מולקולת מים (1999 al.,.(hu et מכאן, החלפת Asp ב- Glu במוטיב Walker B ב- PrrC עשויה להסיט במידת מה את הקשר הקואורדינטיבי ובכך להשפיע על אופן קישור הנוקלאוטיד ועל יכולתו לעבור הידרוליזה. בהקשר זה יש לציין שהנגזרת PrrC-D222E-L- His 6 שטוהרה קשרה את כל האפקטורים הנוקלאוטידיים המעורבים בהפעלת האנזים הלטנטי או במניעת ההפעלה (תמונות 3.17 ו ) אך ניסויים נוספים נחוצים כדי להשוות פעילויות אלה לפעילות זן הבר כדי להתרשם כמותית מהשפעת המוטציה. דבר זה לא נעשה לפי שעה בשל אי יציבות זן הבר. כמו כן יהיה צורך לקבוע אם מוטציה זו משפיעה על תפקיד אתר ה- NTPase של PrrC ועל מיסוך והפעלת האנזים הלטנטי התלויים בפעילות 75

84 D222E סביר שלמוטציה האיזוסטרית D222N תהייה השפעה חריפה מזו של.NTPase על קישור והידרוליזת הנוקלאוטיד שכן היא תבטל את קשר הקואורדינציה עם יון המגנזיום הנחוץ לקישור הנולקאוטיד, ומכאן גם את הפעלת האנזים הלטנטי ופעילות הליבה התלויות בקישור זה. כאמור, כדי להשוות את PrrC-D222E לחלבון מזן הבר נחוצים אמצעים נוספים לייצוב PrrC שיאפשרו גם טיהור משמעותי של חלבון זה. לחלופין, אפשר יהיה לבחון לצורך זה מוטנט אחר של PrrC בעל דומיין NTPase תקין אך חסר פעילות ACNase שניתן להפיקו ברמה גבוהה. יתר על כן, שניים מהמוטנטים שנפגעו באתר הקטליטי שמרו על המבנה הפונקציונאלי שכן ניתן היה להפעילם במבחנה בשיטת ה"הצלה כימית", כלומר ע"י Amitsur et al., ) מתן מולקולה קטנה המפצה על חוסר שרשרת צדדית קטליטית בחלבון NTPase רומזות על האפשרות שדומיין ה- D222E לסיכום, תכונות המוטנט.(in prep. מווסת באופן כל שהוא את רמת פעילות דומיין ה-.ACNase אך רעיון זה מצריך ברור נוסף ע"י השוואה מלאה של תפקודי המוטנט וזן הבר בפעילויות השונות של החלבון בתא ובמבחנה וכן ע"י מוטגנזה נוספת של שייר זה ושיירים נוספים במוטיב אליו הוא משתייך המשך טיהור PrrC להומוגניות יצריך המשך ייצוב החלבון His 6 שיפור תנאי הביטוי והייצוב של PrrC וחיבור תווית לקצה הקרבוקסילי שלו אפשרו את טיהור PrrC בצורתו הפעילה לדרגת ניקוי של כ- 90% (טבלה 3.2 ותמונה 3.8). כדי לפענח את המבנה המרחבי של PrrC יהיה צורך להמשיך לטהרו ע"י פיתוח אמצעי ייצוב וניקוי נוספים. בפרק התוצאות מתוארות שיטות ניקוי נוספות שנמצאו יעילות עבור PrrC בנפרד או בצרופים חלקיים. למרות זאת לא הצלחתי לשלבן בפרוטוקול הניקוי הנוכחי בשל אובדן הפעילות בשלבים המתקדמים. דבר זה נבע כנראה מהריכוז הנמוך של BSA החלבון שכן מיהול PrrC המטוהר פי 2 ומעלה פגע בפעילותו. בהסכמה לכך, הוספת ששמש כחלבון נשא (carrier) בריכוז 1mg/ml מנעה אובדן פעילות בשל מיהול החלבון (תוצאות לא מוצגות), אם כי, בדומה ל- TMAO לא ניתן היה להשיב פעילות שכבר אבדה. בנוסף, ריכוז מקטעי PrrC המונומרי והדימרי בנוכחות TMAO או אפילו בנוכחות צ'פרון 76

85 ACNase לא גרמו אף הם להשבת פעילות (Levy-Rimler et al., (2001 GroEL/ES (תוצאות לא מוצגות). מאחר שאובדן פעילות PrrC כתוצאה מאינאקטיבציה תרמית גרם לפירוק שולי של האוליגמר (תמונה 3.14B), סביר להניח שאובדן פעילות PrrC הראשוני כתוצאה ממיהול לא נבע מפירוק האוליגומר. הגברת יציבות PrrC במבחנה יכולה להיעשות עתה, אם כן, בשילוב TMAO כמונע פרישה ו- dttp כליגנד נוקלאוטידי טבעי הנחוץ לייצוב הדימר וממילא גם את הטטרמר. סביר שכדי להמשיך לטהר את PrrC יהיה צורך למצוא עוד דרכים לייצבו. למשל, מציאת גורם שווה ערך לחלבון הנשא BSA שיאפשר ביצוע שלבי ניקוי הכרוכים במיהול זמני של.PrrC ייתכן גם שייצוב נוסף של PrrC יושג ע"י אנלוג של סובסטרט ה- trna Lys שאינו מתפרק. באשר להעלאת ריכוז החלבון, קיימת האפשרות לנסות ולטהר נגזרות PrrC מוטנטיות פגועות באתר הפעיל אותן ניתן לצבור ברמה גבוהה (בגלל חוסר רעילותן). חלבונים מוטנטיים אלה שומרים על המבנה התפקודי הרלבנטי שכן ניתן להפעילם במבחנה בנוכחות מולקולה קטנה המפצה על אובדן השרשרת הצדדית הפונקציונאלית (מיכל עמיצור- תקשורת אישית). בנוסף, כדאי יהיה לנסות ולטהר מוטנטים פגועים באתר קישור האנטיקודון. חלבונים אלה אינם אמורים אפילו לקשור את הסובסטרט בתא ולכן עשויים להיות עוד פחות רעילים ויחד עם זאת עשויים להיות רלבנטיים לחקירה מבנית. רעיון נוסף שכדאי לבחון הוא איתור השיירים האחראים לאוליגומריזציה ב- PrrC ושינויים במוטציות העשויות לייצב את המבנה האוליגומרי. ייתכנות רעיון זה הודגמה עבור הרפרסור.LacR חלבון זה פועל כטטרמר ועובר דנטורציה תרמית בלתי הפיכה ע"י פרוק האוליגומר. החלפת שייר אחד בממשק הדימריזציה של LacR הגדיל את ה- Tm ב- C 40 o ללא אובדן הפעילות (2000 al.,.(gerk et אפשרויות נוספות אותן ניתן לבחון הן ראשית, סלקציה גנטית למוטנטי PrrC טוקסיים יותר ולכן אולי עמידים יותר, זאת על רקע המוטציה המחלישה.D222E שנית, זיהוי עתידי של הממשק בין PrrC ל- EcoprrI יוביל אולי לפיתוח אמצעי ייצוב נוספים דוגמת מרכיב מינימאלי של EcoprrI המקנה עמידות ל-.PrrC בדומה לכך, ייתכן והדרך המעשית תהיה לבודד ולקבוע את מבנה החלבון בתצמיד המקורי של 77

86 שלישית, במקום לנסות להמשיך ולייצב את PrrC מ- coli.e, יהיה כדאי.EcoprrI-PrrC לנסות לזהות הומולוג יציב יותר ולהפיק ולטהר אותו. הומולוג PrrC מעין זה עשוי להימצא בקרב זני החיידק התרמופילי Rhodothermus marinus שבקטריופאג' שלהם (RM378) מקודד לאנזימי תיקון RNA דמויי.(Blondal et al., 2005) T4 4.2 המבנה הרביעוני של PrrC ממצאי עבודה זו מצביעים על כך ש- PrrC החופשי פועל כ- ACNase כאשר הוא מאורגן כהומו-טטרמר, הבנוי כדימר של דימרים. מסקנה זו נובעת מהתצפיות הבאות: ראשית, פעילות ACNase התמצתה מעמודת פילטרצית ג'ל כחלבון גלובולרי נטיבי בן kda (תמונה 3.12). שנית, תבנית צילוב חלבון-חלבון ע"י GA המתבטאת בסדר הופעת תוצרי הצילוב, מספרם ומידת נדידתם באלקטרופורזה (תמונה,3.13A) B דמתה לזו של חלבונים בעלי מבנה טטרמרי ידוע. יתר על כן, חלבונים בעלי דגם צילוב כזה, וביניהם גם חלבון ABC transporter המכיל מוטיב NTPase הומולוגי לזה של,PrrC מתארגנים ע"י דימריזציה של דימרים 1975) al.,.(denis et al., 2004; Hajdu et al., 1976; Hucho et שלישית, מאחר שתבנית צילוב PrrC דומה נצפתה גם in vivo באנזים ACNase השלם, כלומר בתצמיד עם,EcoprrI לפני ואחרי הדבקה בפאג' T4 (תמונה 3.15), אפשר להניח שהוא מצוי כטטרמר באנזים השלם בשני המצבים אלו. התארגנות PrrC כדימר של דימרים מתיישבת עם יכולתו לקשור קואופרטיבית את הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים, וכן עם יכולתו המשוערת לקשור בו-זמנית שני נוקלאוטידים שונים כ"א בדרגת זיקה שונה. הסימטריה הכפולה של PrrC תואמת גם את הסימטריה הכפולה של EcoprrI המצומד לו (ראה מבוא). בנוסף, הסימטריה הכפולה של PrrC יכולה גם לרמוז על המצאות שני אתרי קישור לסובסטרט.tRNA Lys אפשרות זו נרמזת גם ע"י יכולתם של המתמירים הכימיים לעכב פעילות ACNase בריכוזים תת-מרווים של trna Lys אך לא בריכוז מרווה או בהעדר סובסטרט זה (הסבר מפורט יותר בסעיף 4.4.1). אציין גם ש- LysRS בנוי גם הוא כדימר היכול לקשור בו-זמנית שתי מולקולות trna Lys 78

87 (1995 al.,.(commans et אמנם לא ידוע אם ל- PrrC זיקה ישירה ל- LysRS, אך מאחר שמולקולות LysRS המצויות בתא מצומדות רוב הזמן ל- trna Lys ייתכן ש- PrrC "שולף" אותן מתצמיד כזה. ממצא הרומז על אפשרות כזו הוא שכאשר מבטאים את PrrC בקו תאי אדם המלווה בביטוי חלבוני Gag Pol של HIV נצפה עיכוב בפעילות ביקוע מולקולות.tRNA Lys הסבר אפשרי לכך הוא ש- PrrC ו- Gag Pol מתחרים על אותו מאגר של מולקולות trna Lys המצומדות ל-.(Kleiman and Cen, 2004; Perlman, 2002) LysRS מאידך, לא ניתן לשלול את האפשרות ש- PrrC מבקע את trna Lys דווקא כאשר הוא מצומד ל-.(EF-Tu) Elongation Factor Tu שכן, בניגוד ל- LysRS המגיב עם האנטיקודון של הסובסטרט, קישור trna Lys ע"י EF-Tu מותיר את לולאת האנטיקודון חשופה (1995 al.,,(nissen et וזמינה לביקוע ע"י PrrC הזקוק רק לדומיין ה- ASL כדי לזהות את הסובסטרט. יתר על כן, EF-Tu מקנה לאנטיקודון קונפורמציה קשיחה, המתאימה למבנה.(Jiang et al., 2002; Jiang et al., 2001) הסובסטרט המועדף ע"י PrrC בניסויים מקדמיים שנועדו לפענח את המבנה הכללי של PrrC באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הבחנתי במבנים אליפטיים באורך 15 nm וברוחב 10, nm ממדים המתיישבים עם הצורה הטטרמרית של החלבון (תמונה 3.16). אנליזה מפורטת יותר ע"י הדמיה ממוחשבת של תמונות קריו-מיקרוסקופ אלקטרוניות תצריך טיהור כמויות חלבון גדולות יותר מאלה שהפקתי עד כה. כמו כן, גודלו של PrrC הוא גבולי לאנליזה זו ולכן כדאי אולי לנסות ולבדוק באנליזה המתקדמת דווקא את התצמיד הלטנטי EcoprrI-PrrC מטוהר או משוחזר ממרכיביו. קיבוע PrrC המטוהר לשרף TALON עשוי להקל על שחזור התצמיד הלטנטי ע"י pull-down של EcoprrI מתמצית תאים המבטאים אותו ביתר. כאשר PrrC הופק מתאים המבטאים אותו ברמה נמוכה יחסית נמצאו לאחר פילטרצית גל רק 10% ממנו במקטע הפעיל הטטרמרי (תמונה 3.14A). צורה זו הייתה עמידה גם בתנאי טמפרטורה בהם אבדה הפעילות האנזימתית (תמונה 3.14B). ייתכן אפוא שרק חלק ממולקולות PrrC המתורגמות בתא בהעדר EcoprrI מתארגנות לאנזים הטטרמרי הפעיל, בייחוד כאשר ריכוזן נמוך יחסית. לחלופין, הדיסוציאיציה ארעה בזמן 79

88 ההפקה בשל מיהול החלבון. יתר על כן, כאשר PrrC חופשי בוטא מפלסמיד נמוך עותקים ומהפרומוטור ומתיבת ה- (Shine Delgarno) SD המקוריים לא ניתן היה להבחין כלל בפעילות ACNase בתא. לעומת זאת, כאשר אותה כמות PrrC בוטאה בנוכחות EcoprrI שבוטא בטרנס התקבל ACNase לטנטי אותו ניתן היה להפעיל ע"י הדבקה בפאג' T4 או באמצעות הפפטיד Stp במבחנה 1993) al.,.(amitsur et al., 2003; Morad et שתי תצפיות אלו מרמזות על אי היכולת של PrrC להתארגן לצורתו הפעילה (הטטרמרית) בצורה יעילה in vivo ללא.EcoprrI ייתכן אפוא שהתארגנות רביעונית לא יעילה של PrrC PrrC מבוטא בהעדר EcoprrI מגנה על התא מפני ביקוע לא רצוי של trna Lys כאשר בעודף ביחס לשותפו הטבעי. בנוסף, ייתכן ש- EcoprrI ממלא תפקיד של צ'פרון ספציפי המשפר את יעילות הרכבת הצורה האוליגומרית של.PrrC את המסקנה ש- PrrC פועל כטטרמר יש צורך לבסס על ידי קביעה מדויקת של משקלו הנטיבי. דרגת הניקוי של PrrC המטוהר וכמותו לא אפשרו עדיין להשתמש בשיטות מקובלות, כמו אולטרצנטריפוגציה אנליטית, ספקטרוסקופית מסות או פיזור אור, בהן ניתן לקבוע בדיוק רב נתון זה וכך לקבוע בוודאות גמורה את מספר הפרוטומרים של.PrrC ניתן יהיה לעשות זאת לאחר פיתוח אמצעים נוספים לייצוב הטטרמר בתא ובמבחנה כמפורט קודם בסעיף לחלופין, ניתן גם לנקוט בדרכים עקיפות כדי לחקור את המבנה הרביעוני של.PrrC למשל, ממצאים מקדמיים מורים שגם דומיינים נפרדים של PrrC עוברים אוליגומריזציה מלאה (תוצאות לא מוצגות, ילנה דיודוב- תקשורת אישית). לכן כדאי יהיה לטהרם ולבחון את ממשקי הצילוב ואת גודל הצורות האוליגומריות שלהם בנפרד. הדמיון בין דומיין NTPase של PrrC לתת-יחידה ATPase של חלבוני ABC transporter יאפשר גם לבצע הדמיות מבנה חישוביות ולבחון אתרי הדימריזציה והטטרמריזציה חזויים במוטגנזה ובמבדקים תפקודיים. 80

89 4.3 הפרדה פונקציונלית של אתרי קישור נוקלאוטידים ב- PrrC דגם קישור הנוקלאוטידים של PrrC המטוהר (תוצאות פרק 3.4) מבסס ומרחיב השערות שהוצעו בעבר על סמך דרישות ריאקצית הפעלת ACNase הלטנטי במערכת אל- תאית גולמית (2003 al.,.(amitsur et על פי הצעות אלה בתצמיד EcoprrI-PrrC פעילות נשמרת במצב לטנטי כאשר קשור ל- PrrC PrrC הנוקלאוטיד ATP באפיניות ACNase של נמוכה. כאשר מופיע הפפטיד,Stp בעקבות ההדבקה, חלה דיפרנציאציה של אתרי הקישור. GTP נדחק מהחלבון כאשר ATP ו- dttp מסייעים בהפעלת ה ACNase הלטנטי ע"י התקשרות לסוגי אתרים תואמים בעלי אפיניות נמוכה וגבוהה, בהתאמה. בפרק זה אדון בעובדות עליהן מבוסס מודל זה שלושת הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים נקשרים לאותו אזור ב- PrrC כאמור, PrrC מכיל בדומיין האמיני מוטיבי NTPase הומולוגיים לתת-יחידת ATPase של Chen et al., 2003b ) ABC transporter ותמונה.(1.3 מאידך, שליש החלבון הנותר מכיל את אתר ה- ACNase המתאים בגודלו ל- Transesterifying RNases (1998 Raines,.(Li and Abelson, ;2000 לכן ניתן להניח שלא קיימים ב- PrrC אתרי קישור נוקלאוטיד נוספים על האתר דמוי- ABC שבדומיין האמיני. בנוסף מאחר שמוטציות באחד ממוטיבי ה- NTPase של PrrC עיכבו את הקישור של שלושת הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים אליו גם יחד (תמונה 3.19), אפשר גם להניח ששלושת הנוקלאוטידים נקשרים לאותו סוג אתר קישור נוקלאוטיד בחלבון המושתת על מוטיבי רצף זהים. יש לציין שעדין צריך לבסס טענה זו ע"י בדיקת השפעות מוטציות במוטיבי NTPase נוספים ב- PrrC וכן למפות את נקודות הקישור של שלושת הנוקלאוטידים השונים בחלבון. למרות שאתרי קישור הנוקלאוטיד ב- PrrC זהים ברצף, אפיניות הקישור של GTP ו- dttp לאותו אתר שונה בסדרי גודל ונוקלאוטידים אלה אינם דוחקים כנראה זה את זה מהחלבון (תמונה 3.18). לכן אפשר להוסיף ולהציע ש- PrrC יכול להתארגן מרחבית כך שארבעת אתרי קישור הנוקלאוטיד מתמיינים לשני תת-סוגים שכ"א מתאפיין באפיניות קישור שונה וסוג 81

90 שונה של נוקלאוטיד מוכר, תת-סוג אחד קושר dttp באפיניות גבוהה והשני קושר GTP באפיניות נמוכה (תמונה 4.1). רעיון כזה הועלה כבר מניסויים קודמים שנערכו עם תכשירי ACNase גולמיים. בניסויים אלו התבררה מעורבות שני נוקלאוטידים ייחודיים בהפעלת האנזים הלטנטי GTP) ו- dttp ) ושל נוקלאוטיד נוסף במניעתה.(ATP) כמו כן נמצאה השפעה שונה של נוקלאוטידים אלה על ייצוב או ערעור פעילות ליבת ACNase של- PrrC החופשי. אך מאחר שניסויים אלה בוצעו עם תכשירים אנזימתיים גולמיים לא היה ניתן לשלול מעורבות אפשרית של חלבון אחר או נוסף בפעילויות אלה של הקו-פקטורים הנוקלאוטידיים ) al., Amitsur et תכונות קישור הנוקלאוטידים של PrrC המבודד שתוארו בעבודה זו מחזקות את.(2003 ההנחות בדבר תפקידו של PrrC בפעילויות קישור ופרוק הנוקלאוטידים הדרושות לשמירה על פעילות ACNase במצב הלטנטי ולהפעלתה. ראיות ש- PrrC עשוי לקשור ATP אך לא עם GTP בו-זמנית עם dttp מבין הממצאים שהוצגו בעבודה זו שתמכו ברעיון ש- PrrC עשוי להיות קשור ל- dttp ו- GTP בו-זמנית עם אך לא עם,ATP אזכיר ראשית את העובדה ש-* PrrC יכול היה לעבור צילוב פוטוכימי עם dttp באפיניות קישור גבוהה, בטווח ריכוזים של µm (תמונה.(3.17A-C הקישור הקוולנטי מתיישב עם ההנחה ש- dttp הגן על פעילות ACNase של PrrC החופשי מפני אינאקטיבציה וסייע בהפעלת האנזים הלטנטי ע"י אינטראקציה ישירה עם.(Amitsur et al., 2003) PrrC שנית, ATP עיכב את הצילוב הפוטוכימי של dttp ל- PrrC* בתנאים בהם ל- GTP לא הייתה כל השפעה (תמונה.(3.18D-E במהלך ניסויי הצילוב הפוטוכימי של dttp ל- PrrC* נמצא במפתיע שדגם הצילוב כתלות בריכוז הנוקלאוטיד הראה עקומת פעמון עם ערך אופטימלי של.~0.5µM דגם פעמוני זה היה שונה מהדגם הסיגמואידי שנצפה עבור ייצוב פעילות ACNase ע"י נוקלאוטיד זה. כך למשל, מחצית הייצוב הושגה בנוכחות 0.5µM dttp וייצוב מרבי ב-.(Amitsur et al., ( µm קישור הנגזרת המחומצנת של UTP התרחש בדגם פעמוני 82

91 דומה למעט אפיניות קישור חלשה יותר ל-* PrrC (תמונה,(3.18A,B ובשונה מהדגם הסיגמואידי שנצפה בנוכחות ATP או.GTP הסיבה להבדלים בין דגמי תלות הריכוז של GTP ו- ATP לזו של UTP בריאקצית הצילוב ופעילות ההגנה והשוני בין התנהגויות dttp (תמונה ( 3.18A B, אינם ברורים. דרך אפשרית ליישב סתירות אלה היא להציע שהקישור הקואופרטיבי של הנוקלאוטידים הפירימידיניים לחלבון כרוך בשינויים מבניים המרחיקים את הנוקלאוטיד הקשור משייר החלבון האמור לקשור אותו קוולנטית. אך ללא קשר להסבר הנכון, סביר שהשוני בין דגמי קישור dttp או UTP לאלה של ATP ו- GTP מעידים על אופי קישור שונה לחלבון. אציין גם ש- UTP ו- dttp דמו זה לזה גם באופן המועדף בו נדחקו מ- PrrC* ע"י ATP לעומת GTP (תמונות 3.17D ו- 3.18F). מאידך, זיקת UTP ל- PrrC* הייתה חלשה בהרבה משל.dTTP כמו כן, התנהגויות dttp ו- UTP במבחני התחרות עם GTP נבדלו. בעוד ש- UTP דחק את GTP בדומה ל- ATP, dttp דחק את GTP ביעילות רבה מאשר את ATP (תמונה ). 3.18D-F סביר לכן שלקישור UTP עם PrrC* מאפיינים של קישור,dTTP בגלל הדמיון בין הבסיסים, וגם מאפיינים של קישור של ATP או GTP בשל שייר הסוכר המשותף. כאמור, דגמי הצילוב הסיגמואידיים של הנגזרות המחומצנות של ATP ו- GTP ל- PrrC* היו דומים הן בצורה והן בטווח הריכוזים האפקטיבי בסביבות ה- mm (תמונה.(3.18D,E דומה (תמונה בצורה כמו כן, שניהם דחקו זה את זה מ- PrrC.(3.18A,B לכאורה, אפשר היה להסיק מכך ש- ATP ו- GTP נקשרים לאותו תת-סוג אתרים ב- PrrC* בעלי האפיניות הנמוכה. מאידך, ATP מנע את צילוב dttp ל- PrrC* בתנאים בהם ל- PrrC* מ- ATP דחק את dttp ); ובמהופך, 3.17D לא הייתה כל השפעה (תמונה GTP ביעילות רבה מאשר את GTP (תמונה ). 3.18D,E כלל תוצאות קישור הנוקלאוטידים ל- המטוהר תומכות בהשערה ש- PrrC PrrC* לובש שני מצבים שונים של קישור נוקלאוטיד. במצב אחד, המתאים אולי למצב הלטנטי של PrrC הטטרמרי קושר ATP באפיניות נמוכה לכל ארבעת האתרים, ובמצב,ACNase השני, כאשר ACNase מופעל, מתמיינים אתרים אלה לשני תת-סוגים: אחד בעל אפיניות 83

92 גבוהה הקושר dttp והשני בעל אפיניות נמוכה הקושר.GTP אולם ייתכן שהחלוקה בין שני ATP תת-סוגי אתרי הקישור הנבדלים בדרגת הזיקה היא קשיחה. לפי מודל זה נקשר כמו GTP רק לתת-סוג האתרים בעל האפיניות הנמוכה כאשר תת הסוג השני נותר ריק. כמו כן, PrrC ל- dttp מונע אז את קישור ATP בעקיפין ע"י שינוי מבנה אלוסטרי ולאו דווקא בתחרות ישירה על אותו אתר קישור. פועל יוצא מכך הוא שקישור dttp לאתרים התואמים בעלי הזיקה הגבוהה מתיישב עם קישור GTP ולא ATP לאתרים בעלי הזיקה החלשה (תמונה 4.1). בסעיף יידונו שתי אפשרויות אלו שוב בהקשר פיזיולוגי פעילות NTPase המשוערת של PrrC הפעלת ACNase הלטנטי המותנית בעיכוב EcoprrI ע"י Stp דורשת גם נוכחות,GTP בעוד ש GTPγS מעכב אותה. מתצפיות אלה הוסק שהפעלת האנזים הלטנטי דורשת הידרוליזת,GTP כנראה כדי לגרום לשינויים מבניים מתאימים בתצמיד EcoprrI- PrrC או ב- PrrC המצומד בעצמו (2003 al.,.(amitsur et כיוון שב- PrrC מקנן אתר.PrrC מתווכת על ידי אתר זה של GTPase סביר היה להניח שפעילות,NTPase בהתאמה לכך, מוטציות בשיירים שמורים של מוטיב Walker A ביטלו את הפעלת האנזים הלטנטי, אך גם פגעו בפעילות הליבה החופשית המיוצבת ע"י קישור נוקלאוטיד. לעומת זאת, המוטציה N42K במוטיב זה בטלה רק את הפעלת האנזים הלטנטי והותירה את פעילות הליבה. מוטציה זו משנה שייר המצוי במרווח בן ארבעת השיירים הפחות שמור במוטיב Walker A.PrrC אך שמור בין כל ההומולוגים של (A/GX 4 GKT/S) ייתכן אפוא שהמוטציה N42K לא פגעה בקישור הנוקלאוטיד הנחוץ לייצוב אנזים הליבה אך מנעה את ההידרוליזה הנחוצה על פי השערה להפעלת האנזים הלטנטי (2003 al.,.(amitsur et בעבודה זו הודגם קישור קוולנטי של נגזרת מחומצנת של GTP ל-* PrrC בקינטיקה סיגמואידית המזכירה את דגם תלות הפעלת ACNase הלטנטי בריכוז GTP (תמונה.(Amitsur et al., (2003 (3.18A,B הקבלה זו מחזקת את האפשרות ש- PrrC מתווך את הפעלת ACNase הלטנטי ע"י הידרוליזת.GTP אולם קישור GTP ל- PrrC* עדיין לא 84

93 PrrC* המטוהרת מוכיח שלחלבון פעילות.GTPase בבדיקת פעילות GTPase בנגזרת חלקית ) 6 ( PrrC-D222E-Linker-His ניתן היה להבחין בפעילות GTPase מעל רקע של המוטנט שלה הפגוע פגיעה כפולה בדומיין ה- (K46N-K168N ) NTPase (תמונה 3.20). יש לציין בהקשר זה שעדין לא ברור כיצד משפיעה המוטציה האיזו-פונקציונלית D222E על יכולות קישור והידרוליזת נוקלאוטיד של.PrrC שכן מוטציה זו מתמפה לשייר משומר של מוטיב Walker B ב- PrrC. אם נניח שמוטציה זו הסיטה רק במעט את הקבוצה הקרבוקסילית הפונקציונלית ולא בטלה פעילויות אלה כי אז אפשר להתייחס לפעילות ה-.PrrC שנצפתה מעל לרקע כאל פעילות אותנטית של GTPase אפשר לייחס פעילות הידרוליזה זו כגורם המניע בעת הפעלת האנזים הלטנטי את השינויים המבניים שמביאים להסרת המיסוך של EcoprrI על.PrrC אולם בשל הרמה הנמוכה של פעילות זו יחסית לרקע ואי הוודאות בדבר השפעת המוטציה D222E ראוי להמשיך ולעקוב אחר פעילות זו בטיהור נוסף של PrrC וכן ע"י שימוש בנגזרת אחרת של PrrC החפה ממוטציות במוטיבי ה-.NTPase בהנחה שפעילות GTPase המתקבלת היא בכל זאת משמעותית, מתעוררת השאלה למה היא כל-כך נמוכה. חישוב גס של ערך ה- turnover העלה ש- PrrC* ביקע בתנאי הניסוי מולקולת GTP אחת ב- 10 דקות. מהירות זו נמוכה על פי אומדן בשני סדרי גודל מזו הנחוצה להפעלה מחזורית של ACNase הלטנטי in vivo כך שמולקולת אנזים אחת תוכל לבקוע כמאה מולקולות trna Lys בפרק זמן דומה במהלך ההדבקה (1987 al.,.(amitsur et אולם מספר גורמים יכולים להעלות אומדן זה. ראשית, ייתכן ששייר Asp 222 מעורב בהידרוליזת הנוקלאוטיד והחלפתו ב- Glu הקטינה את פעילות ה- 3.13B המטוהר עשויות להיות פעילות (תמונה PrrC* שנית, רק חלק ממולקולות.NTPase ערוץ 6). שלישית, פעילות GTPase דרושה להפעלת האנזים הלטנטי ולא לפעילות הליבה ולכן ייתכן מאוד שהיא מושפעת מנוכחות.EcoprrI לכן, אין להוציא מכלל חשבון מעורבות.GTP או אפילו של חלבון נוסף של החיידק, במיחזור,EcoprrI 85

94 בניסויים שתוארו נצפתה גם הידרוליזה של ATP ושל- dttp ע"י תכשיר PrrC* המטוהר (תמונה 3.20). פעילויות אלה לא היו צפויות שכן לאנלוגים של dttp ושל ATP שאינם ברי הידרוליזה הייתה השפעה דומה (אם כי לא תמיד זהה) לזו של האגוניסטים על הפעלת האנזים הלטנטי,(dTTP) על מניעת ההפעלה (ATP) ועל ייצוב PrrC (שניהם), (2003 al.,.(amitsur et ייתכן שפעילות ההידרוליזה של dttp ו- ATP שנצפתה עם PrrC* המטוהר במבחנה נובעת מפירוק לא ספציפי של נוקלאוטידים אלה ע"י אתר שפעילותו הטבעית היא פעילות.GTPase מאידך, יש לציין ש dtdp מייצב את PrrC בדומה ל- dttp וכן ש-,dTMP-PCP אנלוג dttp שאינו עובר הידרוליזה, יעיל פחות מהאגוניסט בהפעלת האנזים הלטנטי (2003 al.,.(amitsur et לכן ייתכן שאין סתירה בין פעילות dttpase של PrrC* המטוהר ובין יכולת הנוקלאוטיד להגן על פעילות PrrC במבחנה. כלומר לא ניתן לשלול את האפשרות שגם נוקלאוטיד זה עובר הידרוליזה בעת הפעלת האנזים הלטנטי. מעניין לציין שפעילות dttpase של PrrC* נצפתה בריכוז 0.5µM של הנוקלאוטיד בעוד שבריכוז 10µM לא ניתן היה להבחין בה מעל הרקע. ממצא זה מתיישב מצד אחד עם הזיקה החזקה של PrrC* לנוקלאוטיד זה. מצד שני, סביר שאי היכולת לצפות בפעילות זו מעל לרקע בריכוז הגבוה יותר משקפת התגברות יחסית של פעילויות שמקורן בחלבונים לא ספציפיים בעלי זיקה חלשה יותר לנוקלאוטיד. מאידך, יתכן שהממצא הזה קשור גם לאופן הקישור של dttp ל- PrrC. כזכור, בבדיקת תלות הצילוב של dttp ל-* PrrC בריכוז הנוקלאוטיד התקבלה עקומת פעמון כאשר הצילוב האופטימאלי נעשה ב- 0.5µM dttp ובריכוז גבוה יותר הייתה ירידה חדה בצילוב (תמונה.(3.17A,B ההסבר שניתן לדגם צילוב כזה היה שיתכן שבמהלך הקישור הקואופרטיבי של dttp ל-* PrrC משתנה מבנה החלבון עם קישור המולקולה השנייה באופן המרחיק את הבסיס משייר החומצה האמינית הפעילה בצילוב. על סמך אותו טיעון אפשר להסביר אולי גם את פעילות הידרוליזת של dttp האופטימאלית בריכוז תת- מרווה של הנוקלאוטיד. 86

95 4.3.4 השוואת PrrC לאנזימי ATPase בעלי סוגי אתרי קישור נוקלאוטיד נפרדים ההפרדה הפונקציונלית בין אתרי קישור נוקלאוטיד ב- PrrC מזכירה אנזימי ATPase הקסמריים המאופיינים בשתי קבוצות של אתרי קישור.ATP לאנזימים אלה קבוצה אחת של אתרי קישור לא קטליטית בעלת אפיניות גבוהה וקבוצה שנייה ובעלת אפיניות נמוכה. האתרים הקטליטיים עוברים בין שלושה מצבים לסירוגין: קטליטית באחד נקשר,ATP בשני, תוצרי פירוק ATP והשלישי נשאר פנוי. המעברים בין מצבים אלו יוצרים תנועה סיבובית המאפשרת שאיבת פרוטונים (1997 (Boyer, או משיכת סליל DNA PrrC אולם, בעוד שלאנזימים אלו סימטריה משולשת,. (Patel and Pica, (2000 הטטרמרי עשוי להיות דימר של דימרים בעל סימטריה כפולה. סימטריה זו מרמזת אולי על מנגנון דמוי בוכנה (פעימה ודחיקה) המאפשר מעבר האנזים הלוך-ושוב בין שני מצבים: מצב לטנטי ומצב פעיל. PrrC נבדל גם מאנזימי GTPase ההקסמריים ובעצם מכל משפחות ה- NTPase הידועות, בכך שתת-סוגי אתרי קישור הנוקלאוטיד שלו נבדלים לא רק בחוזק הזיקה לנוקלאוטיד ובפוטנציאל הקטליטי אלא גם בסוג הנוקלאוטיד המוכר אופן הבקרה של GTP,ATP ו- dttp על הפעלת ACNase הלטנטי על סמך תכונות קישור הנוקלאוטידים של PrrC שתוארו בעבודה זו מוצעים כאן שני מנגנונים חליפיים המסבירים את תפקידיהם המשוערים בהשתקת ובהפעלת ACNase (תמונה 4.1). במנגנון אחד, ATP קשור לארבע אתרים זהים בעלי זיקה נמוכה ב- PrrC הטטרמרי ושומר בכך את האנזים במצבו הלטנטי. בזמן הדבקת פאג' T4 מחולל Stp שינויים מבניים ב- EcoprrI שמשפיעים מצדם על אתרי קישור הנוקלאוטיד של ATP.PrrC נדחק מאתרים אלו והם מתמיינים עתה לשתי קבוצות. קבוצה אחת קושרת dttp באפיניות גבוהה והשנייה קושרת GTP באפיניות חלשה. הידרוליזת GTP שמתרחשת לאחר מכן מפעילה את ACNase (תמונה 4.1A). במנגנון השני קיימת ב- PrrC הפרדה תמידית בין שתי קבוצות אתרי קישור בעלות אפיניות גבוהה ונמוכה. במצב הלטנטי ATP מאכלס רק את הקבוצה בעלת האפיניות הנמוכה. פעולת Stp על EcoprrI מנגישה את 87

96 PrrC לקישור dttp לאתרי האפיניות הגבוהה ומפנה את ATP מאתרי האפיניות הנמוכה לטובת קישור GTP (תמונה 4.1B). האינטראקציה בין EcoprrI ל- PrrC נשמרת כנראה גם לאחר ההפעלה שכן, כפי שהוסבר כבר בעבר (2003 al., PrrC,(Amitsur et חופשי אינו יציב דיו כדי לשרוד בטווח הזמן הנחוץ לרוקן את התא המודבק מ- trna Lys (בהעדר אנזימי התיקון של הפאג') (1987 al.,.(amitsur et תמונה 4.1 מודל לתפקיד הקו-פקטורים הנוקלאוטידים ב- ACNase הלטנטי והמופעל. PrrC הטטרמרי מצוין כארבע אליפסות ירוקות. כאשר ההפרדה לשני סוגי אתרי קישור נוקלאוטיד מצוירת לצורך הנחות כאליפסות בצבע ירוק זית (אפיניות גבוהה) ואליפסות בירוק רגיל (אפיניות נמוכה), למרות שלמעשה אתר לקישור נוקלאוטיד ב- ATPase של ABC transporter נוצר באינטראקציה ראש לזנב בין שתי תת-יחידות 2003b).(Chen et al., אנזימי (HsdSM 2 R 2 ) EcoprrI מצוירים כאליפסות אדומות. סובסטרט ה- dsdna של EcoprrI מצויר כפס כתום ו- Stp כמשולש כחול. A. באנזים ACNase הלטנטי אתרי קישור הנוקלאוטיד ב- PrrC דומים ומאוכלסים ב-.ATP בזמן הדבקת פאג' Stp T4, מעכב את פעילות הגבלת DNA של,EcoprrI דבר המעורר שינויים מבניים באנזים השלם. בעקבות כך אתרי קישור נוקלאוטיד ב- PrrC מתמיינים לשני סוגים, אחד בעל אפיניות גבוהה, לא קטליטי הקושר את dttp והשני קטליטי עם אפיניות נמוכה הקושר את.GTP הידרוליזת GTP הופך את ACNase מהמצב הלטנטי למצב מופעל בו חל ביקוע B..tRNA Lys כמו ב- A חוץ מאשר ההפרדה בין שני סוגי האתרים מראש קיימת ב- PrrC. ATP מאכלס במצב הלטנטי רק את האתר עם האפיניות הנמוכה, אותו אתר שבמצב המופעל GTP נקשר אליו. בעקבות האינטראקציה בין Stp ל- EcoprrI PrrC, יעבור לקשור את dttp לאתר עם אפיניות גבוהה ואת GTP לאתר עם אפיניות נמוכה. 88