Edita Sužiedėlienė. Molekulinė biologija. Vadovėlis

Transcript

1 Edita Sužiedėlienė Molekulinė biologija Vadovėlis Vilnius, 2014

2 UDK 577.2(075.8) Su-117 Vilniaus universiteto Studijų komiteto rekomenduota Recenzavo: prof. dr. Rimantas Daugelavičius prof. dr. Rolandas Meškys Leidinys finansuotas projekto Biotechnologijos ir biofarmacijos sektoriui reikalingų aukštos kvalifikacijos specialistų rengimo tobulinimas (BIOTEFA-A), Nr. VP1-2.2-ŠMM-09-V lėšomis. Viršelyje naujos DNR II tipo restrikcijos endonukleazės, sumodeliuotos pasitelkus kompiuterinį baltymų dizainą ir baltymų inžineriją, struktūros dalies, užtikrinančios konkrečios DNR sekos atpažinimą, vizualizacija (autorius dr. Č. Venclovas). Vaizdas sukurtas kaip iliustracija, apibendrinanti bendro VU Biotechnologijos instituto ir UAB Fermentas mokslininkų darbo rezultatus, paskelbtus JAV nacionalinės mokslų akademijos darbuose (Proc Natl Acad Sci USA, 2007; 104: ). Edita Sužiedėlienė, 2014 Vilniaus universitetas, 2014 ISBN

3 TURINYS PRATARMĖ... 8 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida Modelinės biologinės sistemos molekulinėje biologijoje...16 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Nukleorūgščių molekulinė struktūra DNR ir RNR pirminė struktūra DNR antrinė struktūra DNR spiralių B, A, Z šeimų ypatybės Neįprastos DNR antrinės struktūros DNR tretinė struktūra. Žiedinė DNR ir superspiralizacija Topoizomerazės RNR antrinė ir tretinė struktūra Pernašos RNR (trnr) antrinė ir tretinė struktūra Ribosominių RNR antrinė ir tretinė struktūra Kataliziškai aktyvios RNR (ribozimai) Ribojungikliai Genomai Baltymų molekulinė struktūra Aminorūgščių savybės Peptidinis ryšys ir jo savybės Aminorūgščių šoninės grupės Baltymų erdvinės struktūros susidarymui svarbūs nekovalentiniai ir kovalentiniai ryšiai Baltymų pirminė struktūra Baltymų antrinė struktūra α spiralė β struktūra Kiti baltymų antrinės struktūros elementai Baltymų struktūros motyvai (superantrinė struktūra) Baltymų tretinė struktūra Baltymų erdvinės struktūros susidarymas Baltymų tretinės struktūros domenai Baltymų ketvirtinė struktūra Daugiabaltyminiai kompleksai

4 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Nukleosoma chromatino struktūrinis ir reguliacinis vienetas Molekulinė nukleosomos organizacija Šerdinė nukleosominė dalelė Į nukleosomos sudėtį įeinančių histonų savybės Histonų aminorūgščių modifikacijos ir jų biologinė reikšmė Histonų kovalentinių modifikacijų kodo hipotezė nm ir 30 nm chromatino siūlai Chromatino aukštesnio lygio struktūros Chromatinas ir replikacija Chromatinas ir genų transkripcija bei jos valdymas Histonų acetilinimas ir genų transkripcijos valdymas Chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai ir transkripcijos valdymas DNR organizacija prokariotuose IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) DNR replikacijos mechanizmo išaiškinimas DNR polimerazės pagrindiniai DNR replikacijos fermentai DNR polimerazių bendrosios savybės DNR polimerazių katalizuojama reakcija DNR polimerazių struktūra DNR polimerazių įvairovė DNR replikacija prokariotuose Bakterijų (E. coli) DNR polimerazės E. coli replikacinės šakutės modelis Kiti E. coli replikacinės šakutės komponentai E. coli praimazė (DnaG) E. coli replikatyvinė helikazė (DnaB). Kitos DNR helikazės Topoizomerazės E. coli SSB baltymai Replikacijos iniciacija E. coli bakterijose DNR grandinės elongacija DNR ligazės Replikacijos terminacija bakterijose Bakterijų DNR replikacija ir ląstelių augimas bei dalijimasis Replikonai

5 4.4. DNR replikacija eukariotuose Eukariotų replikacinės šakutės komponentai ir jų funkcijos DNR α polimerazė-praimazė A replikacijos baltymas (RPA) PCNA slystantysis žiedas C replikacijos veiksnys (RFC) žiedo užkėlimo kompleksas DNR δ ir ε polimerazės Kitos eukariotų DNR polimerazės Okazaki fragmentų brendimas eukariotuose Replikatyvinės helikazės eukariotuose Replikacijos iniciacija eukariotuose Kiti DNR replikacijos būdai Besisukančio rato DNR replikacijos mechanizmas DNR replikacija θ mechanizmu DNR replikacija D kilpos mechanizmu Linijinių DNR replikacija Telomeros ir jų funkcijos Telomerų struktūra Telomerazės savybės ir funkcijos Telomerų ilgio reguliavimas, senimas ir vėžys V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) RNR transkripcijos bendrieji bruožai RNR polimerazių (RNAP) struktūra ir savybės Transkripcija prokariotuose Bakterijų RNR polimerazės Bakterijų RNR polimerazės šerdinė dalelė Bakterijų RNR polimerazių transkripcijos ciklas Bakterijų promotorių atpažinimas σ (sigma) veiksnys ir jo reikšmė bakterijų RNAP transkripcijai Bakterijų promotorių tipinės sekos Transkripcijos terminacija bakterijose Transkripcija eukariotuose Eukariotų RNR polimerazės RNR I polimerazės transkripcijos kompleksas RNR III polimerazės transkripcijos kompleksas RNR II polimerazė RNR II polimerazės transkripcijos preiniciacijos kompleksas RNR Pol II transkripcijos preiniciacijos komplekso (PIC) susimontavimas Mediatoriaus kompleksas ir jo vaidmuo RNR Pol II transkripcijoje

6 5.5. Transkripcijos valdymas prokariotuose Operonas Laktozės operonas Triptofano operonas Kiti bakterijų operonai Griežtasis atsakas Transkripcijos valdymas eukariotuose Transkripcijos aktyviklių savybės Transkripcijos aktyviklių atpažįstami atsako elementai Transkripcijos aktyviklių sąveikos su DNR motyvai Mažosios RNR ir genų raiškos valdymas VI. RNR brendimas Pre-tRNR brendimas Pre-tRNR brendimas prokariotuose trnr 3 ir 5 galų susidarymas Pre-tRNR brendimas eukariotuose Intronų pašalinimas iš eukariotų pre-trnr Kovalentinės trnr nukleotidų modifikacijos Eukariotų pre-trnr brendimo etapų eiliškumas Pre-rRNR brendimas Pre-rRNR brendimas prokariotuose Pre-rRNR brendimas eukariotuose Kovalentinės nukleotidų modifikacijos eukariotų pre-rrnr rrnr susimontavimas į ribosomas Intronų šalinimas iš eukariotų pre-rrnr I grupės intronų išsikirpimo mechanizmas II grupės intronų išsikirpimo mechanizmas Judrieji I ir II grupės intronai Pre-iRNR brendimas eukariotuose Eukariotų pre-irnr 5 galo modifikacijos. Kepurės struktūra Pre-iRNR 3 galo modifikavimas irnr splaisingas eukariotuose Pre-iRNR intronai splaisingo reakcijų substratas Splaisingui reikšmingos konservatyvios nukleotidų sekos intronuose ir egzonuose Splaisingo reakcijos Splaisosomos struktūra

7 Splaisosomos susimontavimas ties pre-irnr Splaisosomos katalizinis centras Splaisingo kompleksų lokalizacija branduolyje Alternatyvusis splaisingas irnr kokybės kontrolė RNR redagavimas Redagavimo tipai Nukleotido pakeitimas Nukleotidų sekų įterpimas arba pašalinimas VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Genetinis kodas ir jo savybės Pernašos RNR molekulės (trnr) baltymų biosintezės tarpininkai Aminorūgščių aktyvinimas. Aminoacil-tRNR sintetazės Supresorinės trnr Ribosomų struktūra ir funkcijos Ribosomos struktūros tyrimai Ribosominės RNR Ribosominiai baltymai Funkciniai centrai ribosomoje Baltymų biosintezė prokariotuose Transliacijos iniciacija Transliacijos elongacija Elongacijos ciklas Iškodavimas Peptidinio ryšio susidarymas Ribosomos peptidiltransferazinis aktyvumas Perstūmimas Transliacijos terminacija Baltymų biosintezė eukariotuose Transliacijos iniciacija IRES sritys ir jų ypatumai Poliribosomos Transliacijos tikslumo valdymo būdai REKOMENDUOJAMOS LITERATŪROS SĄRAŠAS DALYKINĖ RODYKLĖ

8 PRATARMĖ Molekulinės biologijos gana naujo ir sparčiai besivystančio mokslo vadovėlių lietuvių kalba iki šiol išleista nebuvo. Vadovėlyje Molekulinė biologija pateikiami molekulinės biologijos mokslo pagrindai lietuviakalbiams skaitytojams. Molekulinė biologija yra skirta tiems, kurie nori gilintis į gyvybę molekulių lygmenyje. Vadovėlis gimė iš paskaitų, beveik porą dešimtmečių dėstytų Vilniaus universiteto molekulinės biologijos ir kitų bakalauro studijų programų studentams, konspektų. Medžiagą teko nuolat atnaujinti, papildyti naujomis molekulinės biologijos mokslo žiniomis. Per tą laiką buvo išaiškinta žmogaus genomo nukleotidų seka, o genomų sekoskaita tapo įprastu reiškiniu. Buvo nustatyta ribosomos vienos didžiausių biologinių makromolekulių erdvinė struktūra, kurios viena atradėjų, 2006 m. Nobelio premijos chemijos srityje laureatė profesorė Ada Jonat (Ada Yonath) 2010 m. lankėsi Lietuvoje Gyvybės mokslų forume. Buvo sukurtas pirmasis sintetinis genomas, iš ląstelių išauginti audiniai ir organai. Nelengva užduotis buvo bent dalį šių mokslo pasiekimų perteikti knygoje, nes gyvybės mokslai ir jų žiniomis grindžiamos technologijos vystosi stulbinamai greitai. Knygoje pirmiausiai siekta supažindinti su pagrindinių ląstelės biomolekulių nukleorūgščių ir baltymų struktūra ir funkcijomis, taip pat su svarbiausiais molekuliniais vyksmais, kuriuose dalyvauja nukleorūgščių ir baltymų molekulės. Šie molekuliniai vyksmai lemia gyvybę. Biologinė informacija, užkoduota ir saugoma DNR molekulėje, perduodama palikuonims susintetinus šios molekulės kopijas replikacijos proceso metu. Tolesnis biologinės informacijos perdavimas apima transkripcijos procesą, per kurį susintetinamos genų kopijos RNR molekulės. Tada vyksta sudėtingas RNR molekulių brendimas, susidaro funkcionalios RNR, kurių įvairovė yra didžiulė, o funkcijos labai įvairios. Galiausiai, dalis tokių RNR molekulių tos, kurios koduoja baltymus, dalyvauja transliacijos procese. Transliacija yra paskutinis biologinės informacijos perdavimo etapas. Jos metu susintetinami tūkstančiai ląstelės baltymų, kuriems būdingos pačios įvairiausios funkcijos. 8

9 Knygą sudaro septyni skyriai, kuriuose aptariami pagrindiniai biologinės informacijos saugojimo, perdavimo ir raiškos vyksmai DNR biosintezė, RNR biosintezė, RNR brendimas ir baltymų biosintezė. Aptariant šiuos vyksmus stengtasi atidžiau pažvelgti į juose dalyvaujančių biologinių makromolekulių struktūrą ir funkcijas, atskleisti molekulinių mašinų sudėtingumą. Vadovėlio medžiaga gausiai papildyta iliustracijomis, atspindinčiomis svarbiausias molekulinės biologijos žinias ir pasiekimus. Orientuojantis į studentus kiekvieno skyriaus pabaigoje pateikiama analitinių klausimų ir uždavinių, kurie, tikimasi, padės įsisavinti vadovėlyje pateikiamą medžiagą. Knygos pabaigoje pateikiama dalykinė tekste vartojamų molekulinės biologijos terminų rodyklė ir rekomenduojamos literatūros sąrašas. Autorė nuoširdžiai dėkoja kolegoms, ypač profesoriui Jurgiui Kadziauskui už vertingas pastabas ir patarimus, studentams jų dėka klaidų ir netikslumų tekste liko mažiau ir atsirado gražių lietuviškų terminų. Taip pat redaktorei Giedrei už didelę ir nuoširdžią pagalbą redaguojant kalbą, Žygimantui už techninį teksto tvarkymą. Edita Sužiedėlienė 9

10

11 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida Dabar mes jau pripažįstame, kad molekulinė biologija nėra eilinis aspektas, kuriuo tiriamos biologinės sistemos. Ji yra reikalo esmė. Beveik visi gyvybės aspektai turi molekulinį pagrindą, ir jeigu nesuprasime molekulių, labai miglotai suvoksime gyvybę... Bet kokie tyrimų rezultatai aukštesniame biologinių sistemų lygmenyje tėra spėjimai, kol jie nepatvirtinti molekuliniame lygmenyje. 1 F. Crick, What Mad Pursuit (1988) 1.1 pav. D. Votsonas ir F. Krikas prie DNR dvigubos spiralės modelio 1953 m. ( collections/science_photo_library.html) Studijuojantiems ar norintiems pažinti molekulinę biologiją dabartinis šios mokslo srities vystymosi tarpsnis yra itin palankus: molekulinė biologija pastaraisiais dešimtmečiais vystosi taip sparčiai, kaip nė vienas kitas mokslas, ir skatina naujų atradimų lūkesčius. Tai yra labai jaunas mokslas, tačiau darantis įtaką beveik visoms šiuolaikinės biologijos sritims nuo tradicinių taksonomijos bei sistematikos iki genų funkcijas tiriančių sričių. Naują didelį postūmį molekulinės biologijos vystymuisi paskutiniajame dešimtmetyje suteikė naujomis technologijomis grindžiamų mokslo sričių genomikos, proteomikos, kitų omikų (transkriptomikos, metabolomikos, kt.) sukūrimas. Ankstyvasis molekulinės biologijos vystymosi tarpsnis. XX a. pradžia 1953 m. Molekulinė biologija išsivystė iš atskirų mokslų, pirmiausiai biochemijos ir genetikos, taip pat ląstelės biologijos, bakteriologijos. Pirmą kartą terminą molekulinė biologija pavartojo Rokfelerio fondo gamtos mokslų skyriaus direktorius Varenas Vyveris (Warren Weaver) m. ataskaitoje fondui prašydamas finansinės paramos jis rašė: Palaipsniui formuojasi nauja mokslo sritis molekulinė biologija, kuri pradeda mums atverti daugelį paslapčių apie gyvos ląstelės atskirus komponentus. 1 Vertimas autorės. Molekulinė biologija tiria genetinės informacijos saugojimo, dauginimo, perdavimo ir raiškos mechanizmus, biopolimerų baltymų ir nukleorūgščių struktūrą ir funkcijas. 11

12 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Tuo metu biochemikai atrado daug svarbių viduląstelinių cheminių reakcijų, ėmė aiškėti šių reakcijų ir baltymų bei fermentų svarba ląstelių savybėms. Deja, biochemikams ne itin rūpėjo genai, jų funkcijos jie tyrinėjo ląstelės metabolinius procesus. Buvo manoma, kad genai yra baltymai. To meto biochemijos vadovėliuose DNR (deoksiribonukleorūgščiai) buvo skiriamas mažas skyrelis. Tik 1930 m. buvo nustatyta, kad DNR yra didelė molekulė, kurios sudėtyje yra keturios skirtingos cheminės bazės. Tačiau DNR daug kam atrodė pernelyg nuobodi palyginti su baltymų molekulėmis, sudarytomis iš 20-ies skirtingų aminorūgščių! Ketvirtajame amžiaus dešimtmetyje genetikai siekė išaiškinti paveldimumo (genų) prigimtį. Jie nustatė ryšį tarp paveldimumo ir chromosomų. Amerikiečių mokslininkas Tomas H. Morganas (Thomas Hunt Morgan) ir jo bendradarbiai įrodė, kad genas yra chromosomos dalis. Tačiau genų cheminių bei kitų savybių genetikai ištirti negalėjo. Šia problema susidomėjo fizikai m. austrų fizikas Ervinas Šrėdingeris (Erwin Schrödinger) knygoje Kas yra gyvybė? (E. Schrödinger, What is life?, 1944; 1.2 pav.) išdėstė, kad gyvybės esmė yra biologinės informacijos saugojimas ir perdavimas, o chromosomos gali būti šios informacijos saugyklos. Ląstelėje, anot Šrėdingerio, didžiuliam biologinės informacijos kiekiui sutalpinti turi egzistuoti paveldimumo kodas. E. Šrėdingeris rašė: Genas galėtų būti nereguliarus, aperiodiškas kristalas, svarbus paveldimumo kodui. Taigi, E. Šrėdingeris pasiūlė paveldimumo kodo koncepciją. 1.2 pav. E. Šrėdingerio knyga Kas yra gyvybė? (1944) ( Ši nedidelė knyga padarė didžiulę įtaką to meto fizikams, biologams, kitų sričių mokslininkams ir atvėrė naują požiūrį į biologinius procesus. Vienas iš fizikų, tuo metu susidomėjęs biologija, buvo britas Frensis Krikas (Francis Crick). Į eksperimentinę biologiją taip pat pasuko amerikiečių mokslininkai vokiečių kilmės fizikas Maksas Delbriukas (Max Delbrück), italų kilmės gydytojas Salvadoras Lurija (Salvador Luria). Jie pradėjo eksperimentus su bakteriofagais, siekdami ištirti, kas užtikrina jų dauginimąsi bakterijose. Netrukus jų laboratorijos bendradarbiai Alfredas Heršis (Alfred Hershey) ir Marta Čeiz (Martha Chase) įrodė, kad su paveldimumu (genais) yra susiję ne baltymai, o DNR. Šie tyrimai įtikinamai patvirtino anksčiau atliktus ir mokslinės visuomenės gana skeptiškai sutiktus Osvaldo Eiverio (Oswald Avery), Ko- 12

13 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida lino Makliaudo (Colin MacLeod) ir Maklyno Makkarčio (Maclyn McCarty) eksperimentus su pneumokokais. Džeimsas Votsonas (James Watson), tuometinis S. Lurijos doktorantas, spėjo, kad ryšys tarp DNR ir genų slypi DNR molekulės cheminėje struktūroje. Tolesniems savo mokslinams tyrimams jis pasirinko būtent DNR struktūros tyrimus. Tuo metu (1939 m.) amerikiečių chemikas Linusas Polingas (Linus Pauling) išaiškino cheminio ryšio prigimtį. Tai leido suprasti biologinių makromolekulių stabilumo priežastis. Netrukus Polingas nustatė baltymų a spiralės struktūrą vieną pagrindinių baltymų struktūros elementų. Tuo metu makromolekulių tyrimams buvo pradėta naudoti rentgeno spindulių analizė, kuria austrų kilmės britų biologas Maksas Perucas (Max Perutz) patvirtino a spiralės struktūrą. Rentgenostruktūrinės analizės metodas buvo pradėtas naudoti ir DNR tyrimuose. Tai turėjo ypač didelės reikšmės išaiškinant DNR erdvinę struktūrą. Klasikinis molekulinės biologijos vystymosi tarpsnis ( m.) Bendradarbiaudamas su F. Kriku, D. Votsonas sukūrė ir 1953 m. paskelbė DNR erdvinės struktūros modelį bei pasiūlė galimą DNR biosintezės replikacijos būdą. Šis atradimas padarė esminę įtaką molekulinės biologijos mokslo vystymuisi ir laikomas faktine šio mokslo pradžia. Kurdami DNR struktūros modelį D. Votsonas ir F. Krikas panaudojo to meto žinias apie DNR struktūrinius komponentus, taip pat DNR rentgenostruktūrinės analizės duomenis, kuriuos gavo britų mokslininkai Morisas Vilkinsas (Maurice Wilkins) ir Rozalinda Franklin (Rosalind Franklin). D. Votsonui, F. Krikui ir M. Vilkinsui (R. Franklin tuo metu jau buvo mirusi) už DNR struktūros išaiškinimą 1962 m. skirta Nobelio premija. Išaiškinus DNR molekulės erdvinę struktūrą ir supratus, kad ji yra informacinė molekulė, toliau buvo siekiama ištirti, kaip genetinė medžiaga funkcionuoja. Rusų kilmės amerikiečių mokslininkas Džordžas Gamovas (George Gamow) 1954 m. pirmasis iškėlė idėją, kad baltymų aminorūgštis lemia DNR struktūriniai komponentai nukleotidų trejetai. Tačiau kaip vyksta genetinės informacijos perdavimas iš DNR į baltymus, nebuvo aišku. D. Votsonas iškėlė hipotezę, kad tarpininku šiame procese galėtų būti RNR molekulės. Šiai problemai spręsti net buvo įkurtas garsusis RNR kaklaraiščių klubas, vienijęs 20 garsiausių to meto mokslininkų, kurių kiekvienas turėjo po kaklaraiščio sagę su kurios nors aminorūgšties pavadinimo monograma. F. Krikas iškėlė mintį, kad aminorūgštis į baltymų biosintezės vietą galėtų nešti mažos RNR molekulės. Netrukus tokios molekulės pernašos RNR (trnr) buvo atrastos m. buvo atrastos ir informacinės RNR (irnr). Tai pagaliau sudarė prielaidas genetinio kodo išaiškinimui. Galiausiai 1966 m. Heinrichas Matajus (Heinrich Matthaei), Maršalas Nirenbergas (Marshall Nirenberg) ir Haras Gobaindas Korana (Har Gobind Khorana) nustatė, kuris DNR nukleotidų trejetas kurią aminorūgštį koduoja m. F. Krikas suformulavo pamatinę molekulinės biologijos dogmą (angl. the central dogma of molecular biology), anot kurios, biologinė informacija yra saugoma deoksiribonukleorūgščių (DNR) molekulėje (genuose). Biologinės informacijos pernaša vyksta DNR kopijuojant į ribonukleorūgščių (RNR) molekulę transkripcijos metu, o vėliau RNR naudojant kaip matricą baltymų molekulių Pamatinė molekulinės biologijos dogma teigia, kad genetinės informacijos pernaša iš DNR į baltymą yra galima, o atvirkščiai ne. DNR yra genetinės informacijos saugykla. 13

14 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA biosintezės metu. Pamatinė molekulinės biologijos dogma teigia, kad genetinės informacijos pernaša iš DNR į baltymą yra galima, o atvirkščiai ne. Pamatinę dogmą iliustruojančioje schemoje (1.3 pav.) galime matyti, kad biologinių molekulių hierarchijoje DNR užima aukščiausią vietą. DNR molekulėse yra saugoma genetinė informacija ir užkoduota būsimų baltymų aminorūgščių seka. Priešingai, baltymai nelemia DNR nukleotidų arba aminorūgščių sekos. Nors praėjo nemažai laiko nuo tada, kai buvo suformuluota pamatinė molekulinės biologijos dogma biologinės informacijos virsmo modelis, gausybė pastaraisiais metais sukauptų žinių apie biologines molekules ir jų funkcijas, F. Kriko nuomone, jos nepakeitė. Tačiau teko ją išplėsti remiantis fundamentaliais molekulinės biologijos atradimais. Buvo nustatyta, kad RNR molekulių sintezė gali vykti nuo RNR matricos, o DNR molekulės sintezė nuo RNR matricos (1.3 pav.). Pvz., retrovirusų DNR sintezė vyksta atvirkštinės transkripcijos būdu kaip matricą naudojant RNR. Eukariotų genuose buvo atrasti intronai sekos, kurios pašalinamos iš RNR jai bręstant. Be to, atradus RNR redagavimo fenomeną, paaiškėjo, kad genas gali ir nekoduoti baltymo aminorūgščių sekos: ji programuojama keičiant transkripto nukleotidų seką, t. y. RNR redagavimo metu. Redagavimas, anot F. Kriko, yra pats didžiausias nuokrypis nuo jo dogmos modelio. 1.3 pav. Schema, iliustruojanti pamatinę molekulinės biologijos dogmą Molekulinės biologijos tyrimai atskleidė naujų faktų, koreguojančių pamatinę dogmą. Atrasti prionai (angl. prion proteinaceous infectious particle) baltymai, sukeliantys neurodegeneracines ligas gyvūnų spongioforminę encefalopatiją ir žmogaus Kreucfeldo-Žakobo (angl. Creutzfeldt-Jacob s) sindromą. Siekiant išaiškinti ligos sukėlėją, ligą sukeliančiuose mėginiuose buvo suardyti DNR, RNR ir baltymai. Suleidus tokiu būdu paveikto nesveikų gyvūnų ląstelinio skysčio į sveikų laboratorinių gyvūnų smegenis, pastarieji vis tiek susirgdavo. Paaiškėjo, kad ligos sukėlėjas yra ne virusas, kaip manyta, o gyvūnų bei žmogaus neuronų paviršiuje esantis baltymas PrP. Sergančių žmonių ir gyvūnų ląstelėse baltymas yra netikslios erdvinės struktūros (konformacijos) PrP Sc. Netikslios struktūros baltymas yra ne neuronų paviršiuje, bet jų viduje, ten sudaro netirpius agregatus, todėl juos sunku sunaikinti 14

15 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida įprastais baltymų ardymo metodais, pvz., veikiant peptidazėmis. Pakliuvęs į sveiko gyvūno ar žmogaus organizmą toks baltymas sąlygoja, kad tokią pačią konformaciją įgytų šeimininko gamtinės konformacijos baltymas PrP C, kuris įprastomis sąlygomis nesukelia jokios patologijos. Taigi, baltymas baltymui perduoda informaciją apie savo konformaciją. Epigenetinių pokyčių paveldėjimo nustatymas eukariotų organizmuose atskleidė, kad informacija gali būti perduodama iš kartos į kartą ne tik DNR nukleotidų sekų (genų) pavidalu, bet ir DNR bei baltymų histonų modifikacijų pavidalu. Atradimai RNR biologijos srityje leido iškelti hipotezę, kad RNR galėjo būti molekulė, kuri gebėjo save kopijuoti ir davė pradžią gyvybės vystymuisi. Anot šios hipotezės, pirmykščiame pasaulyje būtent RNR buvo genetinės informacijos saugykla, ji gebėjo katalizuoti savo replikaciją ir dalyvavo kituose biologiniuose vyksmuose. Išaiškinus ribosomos struktūrą ir nustačius, kad peptidinis ryšys baltymų biosintezės metu susidaro ribosomos srityje, kurioje yra tik ribosominės RNR molekulės (žr. skyrių Baltymų biosintezė ), iškelta hipotezė, kad ribosoma gali būti didžiausia gamtinė RNR molekulė iškasena, pasižyminti katalizinėmis savybėmis. Vykstant evoliucijai, chemiškai stabilesnė DNR buvo atrinkta genetinės informacijos saugojimui, o įvairiomis cheminėmis savybėmis pasižyminčios baltymų aminorūgščių funkcinės grupės evoliucionavo į įvairiomis katalizinėmis savybėmis pasižyminčias baltymų molekules. Išaiškinus genetinį kodą, 7-ajame praėjusio amžiaus dešimtmetyje buvo sparčiai žengiama toliau siekta suprasti, kaip funkcionuoja genai m. prancūzų mokslininkai Fransua Žakobas (François Jacob) ir Žakas Mono (Jacques Monod) atrado, kad bakterijų (E. coli) genų, svarbių laktozės metabolizmui, veikla gali būti koordinuotai valdoma pasitelkiant baltymą represorių. Netrukus toks baltymas represorius buvo nustatytas ir apibūdintas. Išaiškinta, kad jis sąveikauja su DNR ir tokiu būdu valdo genų veiklą. Ilgainiui tapo aišku, kad genų veiklos valdymo būdas, dalyvaujant su DNR sąveikaujantiems baltymams aktyvikliams bei represoriams, būdingas visiems organizmams. 7-asis praėjusio amžiaus dešimtmetis buvo labai svarbus tolesnei molekulinės biologijos raidai: buvo sukurti rekombinantinės DNR kūrimo bei DNR nukleotidų sekos nustatymo (sekoskaitos) metodai. Jų pagrindu nepaprastai greitai vystėsi eksperimentinė molekulinė biologija. Šie metodai davė pradžią naujai pramonės šakai biotechnologijai m. amerikiečių mokslininkai Herbertas Bojeris (Herbert Boyer) ir Stenlis Kojenas (Stanley Cohen), panaudoję restrikcijos endonukleazę ir DNR ligazę, sukūrė pirmąją rekombinantinę DNR molekulę plazmidę, turinčią genus, kurie lemia atsparumą antibiotikams kanamicinui ir tetraciklinui. Tuo pat metu, nepriklausomai vienas nuo kito, amerikietis Volteris Žilbertas (Walter Gilbert) ir britas Frederikas Sengeris (Frederick Sanger) sukūrė DNR nukleotidų sekoskaitos cheminį ir fermentinį būdus. F. Sengerio fermentinis DNR nukleotidų sekoskaitos būdas ilgai naudotas organizmų genomų nukleotidų sekai nustatyti. Juo 2000 m. buvo nustatyta žmogaus genomo nukleotidų seka (žr. 1.1 lentelę). Šiuo metu DNR sekoskaitai naudojamos itin sparčios naujos kartos technologijos. Pogenominis molekulinės biologijos vystymosi tarpsnis (nuo 2000 m. iki dabar) 2000 m. beveik buvo baigtas ne tik žiniasklaidos plačiai išgarsintas Žmogaus genomo projektas (ŽGP) (angl. Human Genome Project), bet taip pat buvo nustatytos ir kitų eukariotinių bei prokariotinių organizmų genomų sekos. Taigi, dabartinį molekulinės biologijos vystymosi laikotarpį pagrįstai galima vadinti pogenomine era. Pogenominės eros pirmąjį dešimtmetį itin 15

16 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA sparčiai vystėsi DNR sekoskaitos technologijos: nors ŽGP prireikė beveik dešimties metų nustatyti pirmąjį genomą ir tai kainavo ~ 3 milijardus JAV dolerių per artimiausius kelerius metus tai bus galima padaryti per dieną vos už JAV dolerių. Vienas pirmųjų pogenominės eros netikėtumų daugelį ŽGP entuziastų nuvylęs faktas, kad žmogaus genome yra tik ~ genų, o visas haploidinis genomas sudarytas iš kiek daugiau nei 3,4 x 10 9 nukleotidų porų. Pasirodė, kad žmogaus genome yra mažiau nukleotidų nei, pvz., pelės, pušies (Pinus) ar pirmuonies amebos (Amoeba dubia) genomuose. Šie faktai ne vieną apstulbino ir nuvylė, kartu liudydami, kad ne genomo dydis lemia organizmų ir juose vykstančių biologinių vyksmų sudėtingumą. Palyginus žmogaus ir šimpanzės genų sekas, nustatyta net 99 % identiškų nukleotidų sekų, o didžiausi skirtumai aptikti kvapų ir klausos genuose, kuriais sunku paaiškinti akivaizdžius skirtumus tarp šių organizmų. Taigi, pogenominės eros tyrimų rezultatai leido daryti gal ir nuviliančią išvadą, kad ne genomo dydis ir struktūra lemia biologinius vyksmus. Tačiau šie tyrimai leido dar kartą įsitikinti genų raiškos valdymo svarba biologijoje. Dar daugiau pogenominėje eroje sukurtos labai našios biologinių molekulių ir vyksmų analizės technologijos (proteomika, transkriptomika, metabolomika ir t. t.), leidžiančios analizuoti visus ląstelės baltymus, viso genomo sudėtinių dalių ir genomo raiškos pokyčius. Naujai sukurtos pogenominės technologijos sudarė sąlygas lyginti įvairių patologijų audinių genų raišką. Tyrimų rezultatai leidžia manyti, kad patologijas (pvz., vėžinius susirgimus, Alzhaimerio ligą) lemia nedidelės genomo dalies ( genų) raiškos pokyčiai. Pogenominės eros tyrimų rezultatai dar nėra nuodugniai patikrinti, todėl dar anksti dabartinį biologijos mokslų, tarp jų ir molekulinės biologijos, vystymosi tarpsnį vadinti biomedicinos amžiumi. Tačiau šį laikotarpį galime drąsiai laikyti išskirtiniu biologijos mokslų raidos etapu dėl to, kad jame pamatinė molekulinės biologijos dogma atsiskleidė naujai. Šiuolaikinei molekulinei biologijai ne tiek svarbu nustatyti biologinių molekulių (DNR, RNR, baltymų) hierarchiją, kiek svarbu suprasti, kaip ir kokia genomo koduojama informacija veikia kiekvienoje organizmo ląstelėje Modelinės biologinės sistemos molekulinėje biologijoje Gyvieji organizmai yra labai sudėtingi. Kuo daugiau sužinoma apie vieną organizmą, tuo patrauklesnis jis tampa tolesniems tyrimams. Kiekvienas atradimas kelia naujų klausimų, o gautos žinios pasitelkiamos gilesniam supratimui, kaip funkcionuoja konkretus organizmas. Molekulinės biologijos tyrimams pasirenkami modeliniai organizmai, kurie daugelio pasaulio laboratorijų ir mokslininkų tyrinėjami įvairiais aspektais. Praėjusiame amžiuje labai svarbūs atradimai molekulinės biologijos srityje buvo padaryti tiriant bakterijas ir virusus (bakteriofagus). Tuo pat metu buvo sukurta daug molekulinės biologijos tyrimo metodų. Jų dėka sužinota apie ląstelių svarbiausių makromolekulių chemines ir fizines savybes. Kai kurie iš jų, pvz., nukleorūgščių ir baltymų sekoskaitos metodai, polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodas, buvo tokie reikšmingi molekulinės biologijos bei gretutinių mokslų ir biotechnologijų raidai, kad jų kūrėjai įvertinti Nobelio mokslo premijomis. Šiandien siekiama suprasti, kaip funkcionuoja vienaląsčiai ir daugialąsčiai eukariotiniai organizmai. Sparčiai vystantis technologijoms, eukariotinių organizmų molekulinių tyrimų galimybės labai išaugo. 16

17 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida Paprasčiausia gyvybės forma yra virusas. Jį sudaro DNR arba, kai kuriais atvejais, RNR molekulė, gaubiama baltymų apvalkalo. Virusas yra paprastas, nes yra parazitas, išnaudojantis ląstelės šeimininkės funkcijas. Virusų ląstelės šeimininkės gali būti bakterijos, archėjos, augalų ir gyvūnų ląstelės. Bakterijos tarp šių ląstelių yra paprasčiausios. Bakterijos yra laisvai gyvenantys vienaląsčiai organizmai (1.4 pav.). Jų yra daugybė rūšių. Bakterijos yra prokariotai jos turi chromosomą, neatskirtą branduolio, ir, palyginti su eukariotais, kurių chromosomos yra branduolyje, yra paprastesnės struktūros. Tačiau bakterijos turi daugelį savybių, dėl kurių patogu tirti jų biologinius procesus. Jas gana paprasta auginti, jos greitai dalijasi ir nėra reiklios. Pvz., maža, lazdelės formos žmonių ir gyvūnų žarnyno bakterija Escherichia coli (E. coli) 37 C temperatūroje pasidalija maždaug kas 20 min. Šis mikroorganizmas buvo vienas labiausiai molekulinės biologijos tiriamų objektų praėjusiame šimtmetyje. Apie E. coli vykstančius molekulinius procesus žinoma daugiausiai iš visų tyrinėtų organizmų. 1.4 pav. Escherichia coli bakterijos ( Bakterijos gali augti skystoje mitybinėje terpėje ir ant kietos terpės. Bakterijų populiacija, auganti skystoje terpėje, yra vadinama bakterijų kultūra. Jeigu mitybinė terpė yra sudėtingas biologinių medžiagų ekstraktas, ji vadinama turtinga mitybine terpe. Jeigu augimo terpę sudaro tik organinės medžiagos (pvz., gliukozė ar glicerolis), kurios bakterijų naudojamos kaip anglies šaltinis, augimo terpė vadinama minimalia. Be anglies šaltinio, minimalioje terpėje bakterijų augimui yra būtini Na +, K +, Mg2 +, Ca 2+, NH 4+, Cl -, HPO 4 2-, SO 4 2- jonai. Jeigu bakterijos auga minimalioje terpėje, reiškia, kad jos geba sintetinti visas reikalingas organines medžiagas, pvz., aminorūgštis, vitaminus, lipidus ir t. t. Tokios bakterijos yra prototrofai. Bakterijos, nesugebančios sintetinti visų reikalingų organinių medžiagų, yra auksotrofai. Bakterijos dažnai auginamos ant kietos terpės. Pirmoji jų augimui panaudota kieta terpė buvo bulvės riekelė. Vėliau ją pakeitė agaras į gelį panaši medžiaga, gaunama iš jūros dumblių. Agaras yra atsparus bakterijų fermentų poveikiui, todėl naudojamas terpėms kietinti. Bakterijų metabolizmas yra griežtai valdomas. Jos yra vieni efektyviausių iki šiol atrastų organizmų. Bakterijos retai sintetina medžiagas, kurių joms nereikia. Pvz., jos nustoja sintetinti aminorūgštį triptofaną, jeigu augimo terpėje yra triptofano. Išnaudojus terpėje esantį triptofaną, bakterijose tuoj pat įjungiama jo sintezei reikalingų komponentų gamyba. Tokie ląstelėje vykstantys procesai yra vadinami metaboliniu valdymu (angl. metabolic regulation). Dėl palyginti nesudėtingų auginimo sąlygų laboratorijoje bakterijos buvo vienas dažniausiai naudojamų objektų tiriant biologinių makromolekulių fizines bei chemines savybes ir pa- 17

18 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA sitarnavo gaunant daugelį molekulinės biologijos žinių. Pvz., informacija apie nukleorūgštis ir baltymus buvo gauta tiriant bakterijų ląstelių sudėtinius komponentus. Pirmosios žinios apie metabolinį valdymą taip pat buvo gautos tiriant bakterijas, tik vėliau augalų ir gyvūnų ląsteles. 1.5 pav. Vilniaus universiteto Biochemijos instituto mokslininkų atrastas Klebsiella bakterijas infekuojantis bakteriofagas RaK2 (PLOS One, 2013, DOI: ) Bakteriofagai. Išmokus kultivuoti bakterijas ir ištyrus jų metabolinius procesus, buvo pradėti tyrinėti bakterijų virusai bakteriofagai (1.5 pav.). Bakteriofagai yra žymiai paprastesnės struktūros negu bakterijos, juos gana lengva tyrinėti. Panaudojus bakteriofagus, buvo pirmą kartą sužinota, kad genetinė informacija yra saugoma ne baltymo, o DNR molekulėje. 1.6 pav. Archėja Methanococcus jannaschii ( Archebakterijos. Archebakterijos yra prokariotai, evoliuciškai artimiausi pirmosioms Žemėje atsiradusioms ląstelėms (1.6 pav.). Priklauso archėjų gyvybės domenui. Dažniausiai gyvena ekstremalioje aplinkoje. Archebakterijų genų raiška, dalijimosi mechanizmai yra labai saviti, tarpiniai tarp prokariotų ir eukariotų. 18

19 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida 1.7 pav. Mielės Saccaromyces cerevisiae ( Mielės. Mielės (1.7 pav.) yra eukariotinis organizmas (chromosomos yra branduolyje), tačiau kai kuriomis savybėmis jos panašios į bakterijas greitai dalijasi, nėra reiklios, jas patogu auginti laboratorijoje. Mielės yra naudojamos sintetinti rekombinantinę DNR (dirbtinės mielių chromosomos), turinčią įterptus kitų organizmų (pvz., žmogaus) genus. Genetiškai modifikavus Pitchia pastoris mieles, sukurtos vadinamosios humanizuotos mielės, kuriose vyksta susintetintų rekombinantinių žmogaus baltymų modifikacijos (glikozilinimas). Tokiu būdu dideliais kiekiais gaunami terapiniams tikslams reikalingi funkcionalūs žmogaus baltymai. Gyvūnų ląstelės. Daugelį gyvūnų ląstelių tipų, tarp jų ir kai kurių tipų žmogaus ląsteles, galima auginti laboratorijoje panašiais metodais kaip ir mielių bei bakterijų ląsteles. Pirminės ląstelių kultūros yra normalios nerūšiuotos gyvūnų ląstelės (pvz., odos ląstelės arba embrioninės ląstelės), išskirtos tiesiai iš audinio ir perkeltos į lėkštelę su mitybine terpe. Iš pradžių jos auga gerai, tačiau greitai žūva. Vėžinės ląstelės, priešingai, dalijasi neribotai, jas patogu auginti kultūroje, kur jos auga vienu sluoksniu monosluoksniu. Šiuo metu jau plėtojami tyrimai su ląstelėmis, kurios auga trimatėje erdvėje, t. y. panašiai kaip audinyje (1.8 pav.). 1.8 pav. Luiso (Lewis) plaučių karcinomos ląstelės, Nacionalinio vėžio instituto mokslininkų užaugintos trimatėje erdvėje (V. Stankevičiaus nuotr.) 19

20 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Ankstyvų stadijų žinduolių embrionų (pvz., pelės) ląstelės taip pat yra geras biologinių sistemų tyrimų modelis. Ankstyvojo embriono ląstelės, auginamos tam tikroje terpėje, diferencijuoja į įvairių tipų ląsteles. Tokios ląstelės dar vadinamos pirminėmis kamieninėmis ląstelėmis. Pvz., kai terpėje yra tam tikrų medžiagų, pirminės kamieninės ląstelės vystosi į nervų, raumenų, kepenų ir kt. ląsteles. Kamieninės ląstelės yra perspektyvus molekulinės ir ląstelės biologijos tyrimų objektas: naudojant kamienines ląsteles kuriami reikalingi audiniai bei organai. Augalų ląstelės. Pastarąjį dešimtmetį molekulinės biologijos, molekulinės genetikos, ląstelės biologijos tyrimų modeliniu organizmu tapo nedidelis kryžmažiedžių šeimos augalas baltažiedis vairenis (Arabidopsis thaliana) (1.9 pav.). Šis augalas yra patogus tyrimų objektas: jį galima auginti laboratorijoje, jo DNR yra nedidelė (135 x 10 6 nukleotidų porų, koduoja ~ genų), pasiskirsčiusi 5 chromosomose m. nustatyta Arabidopsis thaliana DNR nukleotidų seka. 1.9 pav. Baltažiedis vairenis (Arabidopsis thaliana) ( Arabidopsis_thaliana) 1.1 lentelė. Reikšmingiausi atradimai, padarę įtaką molekulinės biologijos mokslo gimimui ir tolesnei jo raidai Metai Autorius Atradimas 1865 G. Mendelis (G. Mendel) Atliko ir aprašė paveldimumo fenotipinius tyrimus 1869 F. Mišeris (F. Miescher) Atrado nukleiną (pūliuose ir žuvų spermoje) 1887 A. Veismanas (A. Weismann) Aprašė chromosomų dalijimąsi 1899 R. Altmanas (R. Altman) Išskyrė iš nukleino baltymus ir nukleorūgštis; sukūrė terminą nukleorūgštis Chemikai aprašė visas heterociklines bazes 1902 V. Sutonas (W. Sutton) Aprašė mejozę ir spermatogenezę vabzdžių organizmuose; sukurta chromosominė paveldimumo teorija 20

21 I. ĮVADAS. Pamatinė molekulinės biologijos dogma ir molekulinės biologijos mokslo raida Metai Autorius Atradimas 1911 T. H. Morganas (T. H. Morgan) Atrado chromosomų sukibimą ir krosingoverį drozofiloje 1913 A. Stiurtevantas (A. Sturtevant) Nustatė genų padėtis chromosomoje 1924 R. Fuelgenas (R. Fuelgen) Citochemiškai nudažė DNR 1928 F. Grifitas (F. Griffith) Naudodamas pneumokokus atrado DNR transformaciją 1930 P. Levenas (P. Levene) Atrado deoksiribozę 1941 D. Bidlis ir E. Tatumas (G. Beadle & E. Tatum) Suformulavo teiginį vienas genas vienas fermentas 1944 O. Eiveris, M. Makliaudas ir K. Makkartis (O. Avery, M. MacLeod & C. McCarty) Įrodė genetinį DNR vaidmenį, t. y. kad DNR yra genetinė medžiaga 1949 E. Čargrafas (E. Chargaff) Ištyrė DNR nukleotidų sudėtį ( Čargrafo taisyklės ) 1952 A. Heršis ir M. Čeiz (A. Hershey & M. Chase) Naudodami 32 P izotopą, ištyrė viruso DNR replikaciją 1953 D. Votsonas ir F. Krikas (J. Watson & F. Crick) Sukūrė DNR erdvinės struktūros modelį 1950 P. Mitčelas (P. Mitchell) Ištyrė chemiosmozę, t. y. kaip ląstelės gamina ATP, ir suformulavo chemiosmozinę hipotezę 1952 L. Polingas ir R. Koris (L. Pauling & R. Corey) Atrado baltymų α spiralę 1953 F. Sengeris (F. Senger) Pirmą kartą nustatė baltymo insulino aminorūgščių seką 1954 D. Gamovas (G. Gamow) Pasiūlė teiginį, kad DNR koduoja baltymus 1957 F. Krikas (F. Crick) Iškėlė sekos hipotezę ir suformulavo pamatinę molekulinės biologijos dogmą 1958 M. Mezelsonas ir F. Štalis (M. Meselson & F. Stahl) Eksperimentiškai įrodė pusiau konservatyvųjį DNR replikacijos būdą 1959 A. Kornbergas (A. Kornberg) Išgrynino RNR polimerazę ir nustatė jos veikimo principus 1960 D. Kendriu ir M. Perucas (J. Kendrew & M. Perutz) 1961 S. Breneris, F. Žakobas, M. Mezelsonas (S. Brenner, F. Jacob & M. Meselson) 1961 A. Lvovas, F. Žakobas, Ž. Mono (A. Lvov, F. Jacob, J. Mono) Pirmą kartą nustatė baltymo (hemoglobino ir mioglobino) erdvinę struktūrą Atrado informacinę RNR (irnr) Atrado fermentų biosintezės reguliacijos mechanizmą 1963 D. Vinogradas (J. Vinograd) Atrado DNR superspiralizaciją 1965 R. Holis, H. G. Korana, M. Nirenbergas ir Išaiškino genetinį kodą H. Matajus (R. Holley, H. G. Khorana, M. Nirenberg, H. Matthaei) 1968 S. Kojenas (S. Cohen) Atrado plazmides ir jų atsparumą antibiotikams 1970 H. Smitas (H. Smith) Atrado restrikcijos endonukleazę 1970 H. G. Korana (H. G. Khorana) Cheminiu būdu susintetino DNR 1970 D. Baltimorė ir H. Teminas (D. Baltimore & Atrado atvirkštinę transkriptazę ir atvirkštinę transkripciją H. Temin) 1972 H. Bojeris (H. Boyer), S. Kojenas (S. Cohen) Sukūrė pirmąją rekombinantinę DNR 1975 V. Žilbertas, A. Maksamas, F. Sengeris (W. Sukūrė DNR sekoskaitos cheminį ir fermentinį metodus Gilbert, A. Maxam, F. Sanger) 1975 C. Milšteinas, D. Koleris ir N. Džimis (C. Milstein, G. Kohler & N. Jeme) Susintetino monokloninius antikūnus 21

22 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Metai Autorius Atradimas 1977 R. Robertsas ir F. Šarpas (R. Roberts Atrado splaisingą (intronus ir egzonus) & P. Sharp) 1981 S. Altmanas ir T. Čechas (S. Altman & T. Cech) Atrado ribozimus 1983 K. Mulis (K. Mullis) Sukūrė polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą 1981 S. E. Liftas, M. G. Rozenfeldas ir R. M. Evansas Atrado alternatyvųjį splaisingą ląsteliniuose organizmuose (S. E. Left, M. G. Rosenfeld & R. M. Evans) 1990 Žmogaus genomo projektas (ŽGP) Prasidėjo projektas žmogaus DNR nukleotidų sekai nustatyti 1992 H. Noleris (H. Noller) Iškėlė hipotezę, kad peptidiltransferazė yra ribozimas 1994 Kompanija Calgene Sukūrė pirmąjį transgeninį augalą (pomidorą) 1996 J. Vilmutas (I. Wilmut) Pirmą kartą klonavo žinduolį (avį Doli) 1998 D. Tompsonas ir D. Gerhartas (J. Thompson & J. Gearhart) Sukultūrino daugiagales kamienines ląsteles 1999 K. Venteris ir kompanija Celera (C. Venter & Celera) 2000 JAV Žmogaus genomo projektas, K. Venteris (kompanija Celera) 2003 JAV Žmogaus genomo projektas, K. Venteris (kompanija Celera) 2005 JAV Nacionalinis žmogaus genomo tyrimų institutas 2006 JAV Nacionalinis žmogaus genomo tyrimų institutas Nustatė vaisinės muselės (Drosophilla melanogaster) DNR nukleotidų seką Nustatė žmogaus DNR nukleotidų seką (juodraštį) Nustatė visą žmogaus DNR nukleotidų seką Nustatė šimpanzės (Pan troglodytes) DNR seką Nustatė rezus makakos (Macaca mulatta) DNR sekos juodraštį 2007 K. Venterio institutas Nustatė diploidinio žmogaus genomo DNR seką 2008 K. Venterio institutas Sukūrė pirmajį sintetinį genomą (bakterijos Mycoplasma genitalium) 2010 Tarptautinis konsorciumas Nustatė pirmykščio žmogaus DNR nukleotidų seką 2012 F. Holigeris (P. Holliger) ir bendradarbiai Sukūrė sintetinę DNR (XNR), kurioje cukraus molekulės yra kitokios nei gamtinėje DNR (tokia DNR koduoja informaciją ir gali būti replikuojama) Panaudojus daugiagales kamienines ląsteles, išauginti miniorganai: kepenys, inkstai, kt. 22

23 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.1. Nukleorūgščių molekulinė struktūra Biologinėse sistemose nukleorūgštys užima išskirtinę vietą. Struktūriniai elementai, iš kurių sudarytos nukleorūgštys, nukleotidai yra palyginti paprasti, tačiau nukleorūgščių molekulės dalyvauja daugybėje sudėtingiausių ląstelės funkcijų. Gyvuose organizmuose yra dviejų tipų nukleorūgštys: deoksiribonukleorūgštys (DNR) ir ribonukleorūgštys (RNR). Deoksiribonukleorūgštyse esanti genetinė informacija yra saugoma, pasiekiama ir dauginama replikacijos proceso metu. Toliau, dalyvaujant ribonukleorūgštims, ribosomose ji yra aminorūgščių pavidalu perduodama sintetinamiems baltymams, kurių savybės bei funkcijos ląstelėje ir yra galutinė jos išraiška. Kai kurios ribonukleorūgštys taip pat pasižymi struktūrinėmis ir katalizinėmis funkcijomis DNR ir RNR pirminė struktūra DNR ir RNR molekulės yra nereguliarūs polimerai, sudaryti iš struktūrinių monomerų nukleotidų (2.1 pav., b), kovalentiškai sujungtų tarpusavyje 3, 5 -fosfodiesteriniu ryšiu (2.3 pav.). Taip sujungti nukleotidai sudaro polinukleotidus. Nedideli polinukleotidai, sudaryti iš kelių arba keliolikos monomerų, yra vadinami oligonukleotidais. Ilgi polinukleotidai dar vadinami polinukleotidinėmis grandinėmis. Polinukleotidinės grandinės yra nukleorūgščių pirminė struktūra. Norint suprasti nukleorūgščių funkcijas, būtina žinoti jas sudarančių monomerų nukleotidų savybes. Nukleotidus sudaro: z Monosacharidai (pentozės): Polinukleotidinė grandinė yra nukleorūgščių pirminė struktūra deoksi-d-ribozė (yra deoksiribonukleotiduose DNR sudėtyje) (2.1 pav., b); 99 D-ribozė (yra ribonukleotiduose RNR sudėtyje) (2.1 pav., b). 23

24 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Monosacharidų anglies atomai žymimi 1, 2, 3 ir t. t. 2 -deoksi-d-ribozė skiriasi nuo D-ribozės tuo, kad ties C2 atomu neturi hidroksi- (OH) grupės. Vietoje jos yra vandenilio (H) atomas. Iš sacharidų molekulių pavadinimų yra kilę ir DNR bei RNR pavadinimai deoksiribonukleorūgštis (DNR) ir ribonukleorūgštis (RNR). z Heterociklinės bazės: 99 Heterociklinės bazės DNR sudėtyje: purinai (turi purino žiedą): adeninas (A) ir guaninas (G) (2.1 pav., a); pirimidinai (turi pirimidino žiedą): citozinas (C) ir timinas (T). 99 Heterociklinės bazės RNR sudėtyje: purinai: adeninas (A) ir guaninas (G); pirimidinai: citozinas (C) ir uracilas (U). Purino ir pirimidino bazės yra plokščios struktūros, kurią lemia π elektronų debesėlių konjugacija. Purino žiedas purino molekulėje yra sudarytas iš dviejų kondensuotų pirimidino ir imidazolo žiedų. Adeninas, guaninas, citozinas, timinas ir uracilas yra dažniausiai nukleorūgštyse randamos heterociklinės bazės. Jos vadinamos pagrindinėmis heterociklinėmis bazėmis. Nukleorūgščių sudėtyje taip pat yra randamos įvairios mažiau paplitusios minorinės heterociklinės bazės. Jų yra prokariotų, archėjų, eukariotų DNR, irnr, itin gausu pernašos RNR (trnr) molekulėse (žr. skyrių Baltymų biosintezė ). Kodėl RNR sudėtyje yra timino heterociklinė bazė, o RNR uracilo? Dėl kelių priežasčių. Pirmoji yra susijusi su DNR apsauga. Timino heterociklinė bazė yra metiluracilas (2.1 pav.). Heterociklinių bazių metilinimas DNR atlieka apsauginę funkciją. Įvykus DNR sintezei, naujose DNR molekulėse metilinamos adenino ir citozino heterociklinės bazės, bet dttp (metiluracilas) susintetinamas iš dump dar iki DNR sintezės ir įtraukiamas į DNR molekulę replikacijos metu. Antra, timino heterociklinė bazė dėl savo cheminių savybių DNR molekulėje sudaro porą su adenino heterocikline baze, o uracilo heterociklinė bazė gali sudaryti poras su G ir C bazėmis bei su kita uracilo baze. Taigi, kai T yra DNR sudėtyje, replikacijos metu sumažėja tikimybė susidaryti ne Votsono-Kriko tipo poroms. Trečia, jeigu DNR sudėtyje būtų ne T, o U, ląstelės reparacijos mašinai būtų sunku atskirti tikruosius U nuo tų uracilo heterociklinių bazių, kurios atsiranda DNR dėl citozino deamininimo (C U). Heterociklinės bazės b-n-glikozidiniu ryšiu yra susijungusios su monosacharido žiedu, kuris yra furanozės formos, per C1 atomą. Purinai yra sujungti per jų N9 atomą, o pirimidinai per N1 atomą (2.1 pav., b). z Fosforo rūgšties liekana (viena arba kelios): Nukleozidai su fosforo rūgšties liekana sudaro nukleotidus. Fosforo rūgšties liekana (fosforilgrupė) yra prijungiama prie nukleozido monosacharido vienos iš hidroksigrupių esterinant nukleozidus fosforo rūgštimi. Kitaip tariant, nukleotidai yra nukleozidų fosforo rūgšties este- 24

25 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.1 pav. Nukleorūgščių struktūriniai komponentai. Heterociklinių bazių, įeinančių į DNR ir RNR nukleotidų sudėtį, struktūra (a); deoksiribonukleotidų (DNR) ir ribonukleotidų (RNR) struktūra (b) (D. L. Nelson, Cox M. M. Lehninger. Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) riai, arba fosforilinti nukleozidai. Esteriai yra alkoholių (monosacharidai yra polialkoholiai) ir rūgščių (fosforo rūgštis H 3 PO 4 ) reakcijos produktai. Laisvuose nukleotiduose fosforilgrupės gali būti prijungiamos prie monosacharidų 5, 3, 2 hidroksigrupių (2.1 pav., b). Dažniausiai esterinama OH grupė, esanti prie ribozės (deoksiribozės) C5 atomo. Fosforilgrupės padėtis nukleotido molekulėje nurodoma skaičiumi, o pavadinime naudojamas žodis fosfatas. Pvz., nukleozidas adenozinas, prie kurio deoksiribozės C5 atomo yra prijungta viena fosforilgrupė, vadinamas deoksiadenozino 5 monofosfatu (sutrumpintai damp). Nukleozidas adenozinas, prie kurio ribozės C3 atomo yra prijungta viena fosforilgrupė, vadinamas adenozino (adenozidas adenino heterociklinę bazę turinčio nukleozido pavadinimas) 3 monofosfatu (sutrumpintai 3 -AMP). 5 padėtyje esančios fosforilgrupės nežymimos (ATP), o esančios 3 padėtyje žymimos (3 -AMP). Nukleotidai dėl fosforo rūgšties liekanos dar yra vadinami ir rūgštimis. Pvz., AMP adenilo rūgštis (adenilatas), UMP uridilo rūgštis (uridilatas) ir t. t. (2.1 lentelė). Prie vienos fosforilgrupės nukleotiduose gali būti jungiama dar viena arba dvi fosforilgrupės. Fosforilgrupės jungiamos anhidridiniu ryšiu (2.2 pav.). Arčiausiai monosacharido esanti 25

26 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA fosforilgrupė yra a padėtyje. Toliau esančios grupės atitinkamai b ir g padėtyse. Anhidridiniai ryšiai turi daug potencinės energijos. Tokius ryšius turintys junginiai yra didžiaenergiai, t. y. suskaidžius anhidridinius ryšius, išsiskiria energija, kuri naudojama biologiniuose procesuose. 2.2 pav. Adenozino mono-, di-, trifosfato struktūros ( bcbp/molbiochem/ MBWeb/mb1/part2/ bioener.htm) 2.1 lentelė. Heterociklinių bazių, nukleozidų, nukleotidų pavadinimai ir trumpiniai Heterociklinė bazė Nuklezido žymėjimas Nukleotidas RNR (mono fosfatas) DNR (mono fosfatas) Nukleozidas Vienraidis simbolis Adeninas (deoksi-) adenozinas Ado (deoksi-) adenilo rūgštis, arba (deoksi-) adenozino monofosfatas AMP damp A Guaninas (deoksi-) guanozinas Guo (deoksi-) guanilo rūgštis, arba (deoksi-) guanozino monofosfatas GMP dgmp G Citozinas (deoksi-) citidinas Cyd (deoksi-) citidilo rūgštis, arba (deoksi-) citidino monofosfatas CMP dcmp C Timinas (deoksi-) timidinas Thd (deoksi-) timidilo rūgštis, arba (deoksi-) timidino monofosfatas TMP dtmp T Uracilas (deoksi-) uridinas Urd (deoksi-) uridilo rūgštis, arba (deoksi-) uridino monofosfatas UMP - U Nukleotidų struktūra yra polinė: jie turi 5 galą (fosforo rūgšties liekana arba hidroksigrupė grupė) ir 3 galą (hidroksigrupė arba fosforo rūgšties liekana). Per monosacharidų C5 ir C3 atomus nukleotidai fosfodiesteriniais ryšiais yra sujungiami į polinukleotidinę grandinę. Nukleotidai, sudarantys DNR ir RNR molekules, lemia jų chemines savybes. N-glikozidinis ryšys yra chemiškai stabilus todėl, kad į nukleorūgščių sudėtį įeinančios heterociklinės bazės pasižymi hidrofobinėmis savybėmis. DNR molekulė chemiškai yra daug stabilesnė nei RNR: šią DNR savybę didele dalimi nulemia tai, kad ties ribozės C2 atomu nėra OH grupės. O RNR molekulės, turinčios ribozės sudėtyje hidroksigrupę, yra itin jautrios šarminei hidrolizei. 26

27 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Tiek RNR, tiek DNR polinukleotidinėms grandinėms būdingos dvi bendros savybės: zpolinukleotidinė grandinė pasižymi kryptingumu. Fosfodiesteriniai ryšiai per fosforilgrupę sujungia vienos pentozės C5 atomą su kitos pentozės C3 atomu (5 3 fosfodiesterinis ryšys). Kiekvienos polinukleotidinės grandinės vienas galas turi laisvą 3 OH (hidroksi-) grupę, o kitas galas 5 fosforilgrupę (grupes). Nukleotidų sekas priimta rašyti 5 3, t. y. jų sintezės kryptimi (2.3 pav.). zpolinukleotidinė grandinė pasižymi individualumu, kurį lemia heterociklinių bazių, įeinančių į nukleotidų sudėtį, seka. Ši seka yra vadinama nukleotidų seka. Genetinė informacija yra saugoma šioje sekoje. Genas yra tam tikra nukleotidų seka. 2.3 pav. RNR ir DNR polinukleotidinės grandinės (D. L. Nelson, Cox M. M. Lehninger. Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) Nukleotidų seka polinukleotidinėje grandinėje (DNR arba RNR) gali būti užrašoma ir keliais paprastesniais būdais, nei pavaizduotieji 2.3 pav. Toliau pateiktoje schemoje (2.4 pav.) DNR ir RNR nukleotidų seka pažymėta jų raidiniais simboliais (A, G, C, T, U). Parodyti fosfodiesteriniai 27

28 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA ryšiai tarp 3 hidroksigrupės ir 5 fosforilgrupės. Viename polinukleotidinės grandinės gale yra 5 fosforilgrupė, o kitame 3 hidroksigrupė. RNR sudėtyje ties 2 anglies atomu esanti hidroksigrupė pažymėta. 2.4 pav. Vienas iš DNR ir RNR nukleotidų sekų žymėjimo būdų Dar glaustesnis nukleotidų sekos žymėjimas yra sekos užrašymas vienraidžiais simboliais pažymėjus fosforilgrupes (p): pgpcpapt. Anksčiau užrašytoje sekoje 3 gale yra laisva OH grupė (ji nežymima), o 5 gale fosforilgrupė (žymima). Pats paprasčiausias ir dažniausiai naudojamas DNR ir RNR nukleotidų sekų užrašymo būdas yra sekos užrašymas vienaraidžiais simboliais: GCAT. Tokiu būdu užrašomos ilgos organizmų genomų DNR nukleotidų sekos, kurios talpinamos nukleotidų sekų duomenų bazėse DNR antrinė struktūra DNR molekulę sudaro dvi polinukleotidinės grandinės, komplementarios tarpusavyje. Dvigrandinės DNR erdvinė struktūra yra antrinė šios molekulės struktūra. DNR antrinės struktūros modelį 1953 m. pasiūlė D. Votsonas ir F. Krikas. Tuo metu buvo siekiama suprasti DNR molekulės biologinę funkciją. Tam reikėjo žinoti molekulės erdvinę struktūrą. Votsonas ir Krikas rėmėsi to meto eksperimentiniais duomenimis apie DNR molekulės chemines bei struktūrines savybes. Praėjusio šimtmečio šeštojo dešimtmečio pradžioje buvo žinoma, kad: zdnr sudaro nukleotidai, o kiekvieną nukleotidą sudaro fosforo rūgšties liekana, deoksiribozė ir viena iš keturių heterociklinių bazių; z heterociklinės bazės nukleotiduose yra sujungtos su ribozėmis; zsusijungiant ribozėms-fosfatams su heterociklinėmis bazėmis gali susidaryti ilgos nukleotidų grandinės; 28

29 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA z keturių heterociklinių bazių kiekiai DNR skiriasi, tačiau adenino visada yra tiek pat kiek timino (A/T = 1), o guanino tiek pat kiek citozino (G/C = 1). Šis teiginys yra žinomas kaip Čargrafo taisyklės (2.2 lentelė); zdnr gali būti sudaryta iš dviejų grandinių tai paliudijo DNR molekulės tankio matavimai m. mokslininkų R. Franklin ir M. Vilkinso gauti DNR pluošto rentgeno spindulių difrakcijos analizės duomenys paliudijo, kad DNR turėtų būti reguliarios spiralinės struktūros. DNR spiralės kiekvienas sūkis sudaro ~ 34 Å, o spiralės diametras yra ~ 20 Å. Taigi, į struktūra yra antrinė šios mole- Dvigrandinės DNR erdvinė kiekvieną dvigubos DNR spiralės sūkį tilptų ~ 10 nukleotidkulės struktūra. porų. 2.2 lentelė. Pagrindinių heterociklinių bazių santykis įvairių organizmų DNR Organizmas Heterociklinės bazės, mol % % GC A G C T A/T G/C Bakteriofagas φx174 24,0 23,3 21,5 31,2 0,77** 1,08 44,8 Kukurūzas 26,8 22,8 17,0* 27,2 0,99 0,98 46,1 Aštuonkojis 33,2 17,6 17,6 31,6 1,05 1,00 35,2 Viščiukas 28,0 22,0 21,6 28,4 0,99 1,02 43,7 Žiurkė 28,6 21,4 20,5 28,4 1,01 1,00 42,9 Žmogus 29,3 20,7 20,0 30,0 0,98 1,04 40,7 * Augalų DNR yra nuokrypis nuo Čargrafo taisyklės, nes joje gausu metilintų citozino heterociklinių bazių. ** Bakteriofago DNR yra viengrandinė, todėl heterociklinių bazių santykis nepaklūsta Čargrafo taisyklėms. Išanalizavę R. Franklin gautus itin geros kokybės DNR pluošto rentgeno spindulių difrakcijos vaizdus ir apibendrinę tuo metu turėtas žinias apie DNR savybes, D. Votsonas ir F. Krikas pasiūlė teiginį: DNR molekulė yra sudaryta iš dviejų priešingų krypčių dešiniojo sukimo polinukleotidinių grandinių (DNR duplekso), kurios erdvėje sudaro dvigubą spiralę, susuktą apie tariamą ašį. Dvigubos DNR spiralės struktūra ir galimas DNR replikacijos mechanizmas paskelbti 1953 m. moksliniame žurnale Nature. Kaip susidaro DNR spiralė? Votsonas ir Krikas pasiūlė, kad DNR molekulę sudarančiose polinukleotidinėse grandinėse nukleotidų heterociklinės bazės yra nukreiptos į spiralės vidų, o fosforo rūgšties liekanos į spiralės išorę. Toks heterociklinių bazių ir fosforilgrupių išsidėstymas yra palankiausias paslėpti hidrofobiškas heterociklines bazes nuo vandens molekulių, o spiralinis polinukleotidinių grandinių išsidėstymas turėtų dar labiau apsunkinti vandens molekulių patekimą į molekulės vidų. Tai yra labai svarbi DNR struktūrinė savybė, apsauganti DNR 29

30 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA nuo galimos hidrolizės. Tam, kad DNR spiralė išlaikytų vienodą skersmenį, prieš purino heterociklinę bazę turi būti pirimidino heterociklinė bazė. Jeigu prieš purino heterociklines bazes būtų purino bazės, DNR spiralės skersmuo tose vietose būtų didesnis, o jeigu prieš pirimidino heterociklines bazes būtų pirimidino bazės mažesnis. Votsonas ir Krikas, dėliodami įvairias heterociklinių bazių modelių kombinacijas, taikliai numanė galimą bazių tarpusavio išsidėstymą DNR molekulėje. Jie pasiūlė, kad tarp adenino ir timino bei tarp guanino ir citozino heterociklinių bazių susidaro vandeniliniai ryšiai. Du vandeniliniai ryšiai susidaro tarp A ir T, trys vandeniliniai ryšiai tarp G ir C. Sąveika tarp būtent tokių heterociklinių bazių porų, anot Votsono ir Kriko, turėjo būti stipriausia. Vandeniliniai ryšiai tarp heterociklinių bazių susidaro dėl dalinių krūvių, susikaupiančių ties azoto (N), deguonies (O) ir vandenilio (H) atomais: teigiamas krūvis susikaupia ties azoto atomais, prie kurių prijungtas vandenilio atomas, o neigiamas krūvis susikaupia ties azoto atomais, prie kurių nėra prijungto vandenilio atomo, ir prie deguonies atomo. Vėliau eksperimentais ši numanyta sąveika tarp heterociklinių bazių buvo patvirtinta. Ji yra vadinama Votsono-Kriko sąveika 1 (2.5 pav., a). Dvigrandinėje DNR priešingos DNR polinukleotidinės grandinės turi būti antilygiagrečios, kad molekulė išlaikytų pastovią struktūrą, t. y. viena polinukleotidinė grandinė turi būti orientuota 3 5 kryptimi, o kita priešinga, t. y. 5 3, kryptimi: 5' 3' 3' 5' Votsonas ir Krikas taikliai numatė ne tik heterociklinių bazių sąveiką DNR molekulėje. Jie apibrėžė ir dviejų DNR grandinių komplementarumo principą, kuris yra genetinės informacijos perdavimo ir kartu gyvybės tęstinumo esmė: Dvigrandinėje DNR molekulėje A visuomet sąveikauja su T, t. y. A yra komplementarus T, o G visuomet sąveikauja su C, t. y. G yra komplementarus C. Atskyrus DNR grandines, naujos grandinės gali būti kopijuojamos pagal komplementarumo principą kaip matricas naudojant atskirtas grandines. Iš tiesų netrukus buvo patvirtinta, kad nepaprastai svarbūs ląstelės procesai, kuriuose sintetinamos nukleorūgštys, t. y. replikacija, transkripcija ir reparacija, yra pagrįsti bazių komplementarumo principu. 1 D. Votsonas ir F. Krikas 1953 m. pasiūlė tik du vandenilinius ryšius tarp G ir C. Vėliau (1956 m.) tris ryšius nustatė L. Polingas ir Robertas Koris (Robert Corey). 30

31 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.5 pav. Sąveika tarp heterociklinių bazių DNR molekulėje. Votsono-Kriko sąveika (a); Hugstyno sąveika (b) (C. Calladine, H. R. Drew, A. A. Travers. Understanding DNA, third edition, 2004) Dvigrandinėje DNR molekulėje guanino heterociklinių bazių yra tiek pat, kiek ir citozino, o adenino tiek pat, kiek timino. Šį faktą, dar iki DNR antrinės struktūros paskelbimo, nustatė Ervinas Čargrafas (Erwin Chargraff), tačiau jo gautų rezultatų prasmė tapo aiški tik sukūrus DNR struktūros modelį. Heterociklinės bazės gali sąveikauti DNR molekulėje ir kitu būdu: purinai sudaro vandenilinius ryšius ne tik su pirimidino žiedo atomais (kaip Votsono-Kriko sąveikoje), bet ir su imidazolo žiedo atomais (2.5 pav., b). Ši sąveika tarp heterociklinių bazių vadinama Hugstyno sąveika. Po to, kai Votsonas ir Krikas paskelbė DNR struktūros modelį, Karstas Hugstynas (Karst Hoogsteen) 10 metų bandė įrodyti Votsono-Kriko sąveiką eksperimentais su heterociklinėmis bazėmis. Jis siekė gauti jų kristalus ir įrodyti jų struktūrą. Tačiau gautame kristale jis nustatė kito tipo sąveiką, kuri ir buvo pavadinta jo vardu. Hugstyno sąveika tarp A ir T yra panašaus stabilumo kaip ir Votsono-Kriko sąveika tarp A ir T, o Hugstyno bazių pora tarp G ir C gali susidaryti esant protonuotam citozinui (C + ) (2.5 pav., b). Fiziologinėmis sąlygomis DNR molekulėje tarp heterociklinių bazių vyrauja Votsono-Kriko sąveika. Heterociklinių bazių atomai, dalyvaujantys Hugstyno sąveikoje, susidarant Votsono-Kriko poroms nedalyvauja. Taigi, purinai gali dalyvauti sudarant ir dvigubas sąveikas (ir Hugstyno, ir Votsono-Kriko) su dviem heterociklinėmis bazėmis. Tokių sąveikų pavyzdžius aptarsime vėliau. Laisvų nukleotidų konformacija yra panaši į jų erdvinę geometriją nukleorūgščių sudėtyje. 31

32 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Nukleotidų išsidėstymą erdvėje nusako kelios pagrindinės savybės: z ribozės žiedo (ribofuranozės) konformacija (2.6 pav., a); zheterociklinės bazės, kurią su riboze jungia b-n-glikozidinis ryšys, orientacija ribozės atžvilgiu (glikozidinio ryšio konformacija); z fosfodiesterinio ryšio konformacija; z C4 -C5 ryšio konformacija. Nukleozidų bei nukleotidų ribozės žiedas nėra plokščios struktūros: dažniausiai vienas ar du atomai yra ne plokštumoje. Reiškinys vadinamas ribozės raukšle (angl. pucker). Ribozės žiedo konformacijos dažniausiai yra arba voko, E (angl. envelope), arba tvist, T (angl. twist). Esant voko konformacijai, keturi ribozės ciklo atomai yra vienoje plokštumoje, o vienas pakrypęs į viršų arba į apačią C-5 atomo atžvilgiu (2.6 pav., a). Esant tvist konformacijai, trys ciklo atomai yra vienoje plokštumoje, o likę du greta esantys atomai nukrypę nuo žiedo plokštumos į priešingas puses (2.6 pav., a b). 2.6 pav. Ribozės (ribofuranozės) žiedo konformacijos. Voko (a); tvist (b) Kai ribozės žiedo atomas yra nukrypęs nuo monosacharido žiedo plokštumos į tą pačią pusę kaip ir C5 atomas, jo padėtis vadinama endo, o kai į priešingą pusę egzo. Nukleorūgščių sudėtyje dažniausios monosacharidų E tipo C2 ir C3 endo konformacijos. B spiralės formos DNR deoksiribozė yra C2 endo konformacijoje. Heterociklinės bazės, kovalentiškai sujungtos su monosacharidu per b-n-glikozidinį ryšį, gali suktis apie šį ryšį. Sukimasis nėra visiškai laisvas. Heterociklinės bazės DNR molekulėje, taip pat nukleotiduose bei nukleoziduose gali būti orientuotos energetiškai palankiausioje sin konformacijoje arba anti konformacijoje (2.7 pav., a). 32

33 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Šios konformacijos skiriasi torsinio kampo c (chi) (2.7 pav., b), kurį sudaro O4 -C1 -N9-C4 (purinuose) ir O4 -C1 -N1-C2 (pirimidinuose) atomai, dydžiu. Gamtoje B formos DNR molekulėse heterociklinės bazės dažniausiai yra anti konformacijoje (2.7 pav.). Ši konformacija yra palankesnė susidaryti komplementarioms poroms tarp purino ir pirimidino heterociklinių bazių. Tačiau, pvz., Z formos DNR molekulėje deoksiguanozinas yra sin konformacijoje (2.3 lentelė). 2.7 pav. β-n-glikozidinio ryšio konformacija nukleotiduose ir nukleoziduose. Heterociklinių bazių anti ir sin orientacija ribozės atžvilgiu nukleoziduose (a); sukimo kampai nukleotide ir jų pavadinimai (b) ( 33

34 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Iš pirmo žvilgsnio DNR ir RNR pirminės struktūros atrodo labai panašios. Tačiau tai, kad RNR molekulės sudėtyje esanti ribozė turi 2 OH grupę (ribozė dažniausiai C3 endo konformacijoje), lemia, kad RNR molekulės įgyja kitokią erdvinę struktūrą nei DNR molekulės. Tai yra vienas esminių RNR ir DNR struktūrinių skirtumų. Maždaug tuo pat metu, kai Votsonas ir Krikas sukūrė DNR erdvinės struktūros modelį, Franklin DNR rentgeno spindulių difrakcijos analize nustatė, kad gamtinės DNR pluošto (jį sudaro viena kryptimi orientuotos ilgos DNR molekulės), esant dideliam drėgniui (hidratuota DNR), difrakcijos vaizdas skiriasi nuo DNR, gautos mažesnio drėgnio sąlygomis (DNR dehidratacija, pvz., etanoliu), vaizdo. Pasiūlyta, kad DNR gali įgyti keletą skirtingų erdvinių struktūrų tipų. Vėliau paaiškėjo, kad DNR struktūra lokaliai gali kisti priklausomai nuo aplinkos ir pačios DNR savybių DNR spiralių B, A, Z šeimų ypatybės B formos DNR spiralė. DNR molekulės spiralės tipas, vyraujantis in vivo, yra vadinamoji B formos DNR spiralė. Votsonas ir Krikas erdviniui DNR modeliui konstruoti pasirinko būtent B formos DNR, teisingai numanydami, kad ši molekulės forma yra pagrindinė ląstelėje. Tačiau reikia pastebėti, kad DNR struktūra yra dinamiška, ir tam tikrose vietose ji gali pereiti iš vienos erdvinės konformacijos į kitą. B formos DNR molekulę sudaro dvi antilygiagrečios polinukleotidinės grandinės, kurios sudaro dešinio sukimo DNR spiralę. Spiralės viduje yra išsidėsčiusios heterociklinės bazės (2.8 pav. ir 2.9 pav., a). Priešingose polinukleotidinėse grandinėse esančios komplementarios heterociklinės bazės yra beveik statmenos tariamai spiralės ašiai. 2.8 pav. Dviguba DNR spiralė (R. F. Boyer. Concepts in Biochemistry, third edition, 2006) 34

35 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Vandeniliniai ryšiai, susidarantys tarp komplementarių bazių porų, stabilizuoja DNR dupleksą. Atstumas tarp kiekvienos bazių poros dvigubos DNR spiralės viduje yra 3,4 Å (0,34 nm) (2.9 pav., b). Tarp greta esančių komplementarių heterociklinių bazių porų aromatinių žiedų plokštumų susidaro vadinamoji stekingo sąveika (vadinamasis p stekingas; tokia sąveika susidaro tarp molekulių, turinčių aromatinį žiedą su p elektronais). Stekingo sąveika tarp heterociklinių bazių yra viena svarbiausių DNR erdvinės struktūros stabilumo dalių. Stekingui yra svarbi hidrofobinė sąveika ir heterociklinių bazių krūvis, tad skirtingų nukleotidų sekų DNR molekulėse stekingo sąveika skiriasi. Stekingo sąveika tarp heterociklinių bazių vaidina svarbiausią vaidmenį stabilizuojant B formos DNR erdvinę struktūrą. 2.9 pav. B formos DNR spiralės ir jos struktūrinių komponentų savybės. Vaizdas iš viršaus (a); vaizdas iš šono (b) Kiekviena heterociklinių bazių pora B formos DNR spiralėje yra pasisukusi kitos bazių poros atžvilgiu ~ 36 kampu (2.9 pav., a). Kiekviename tokios formos DNR spiralės sūkyje (360 ) telpa ~ 10 heterociklinių bazių porų (dažnesnis spiralės periodas 10,5 heterociklinių bazių). Vienas sūkis yra ~ 34 Å aukščio (3,4 Å x ~ 10 heterociklinių bazių) (2.9 pav., b). B formos DNR spiralės išorėje yra 2 deoksiribozės kartu su neigiamo krūvio fosforo rūgšties liekanomis. Fosforilgrupė, esanti nukleorūgščių sudėtyje, pasižymi stipriomis rūgštinėmis savybėmis (pk a ~ 1, todėl ir pavadinimas nukleorūgštis ). Taigi, DNR fiziologinėmis sąlygomis yra neigiamo krūvio. DNR paviršius yra hidrofiliškas. Greta esančios neigiamai įkrautos fosforilgrupės iš tiesų stumia viena kitą. Toks atostūmis turėtų destabilizuoti DNR molekulę. Kodėl jos struktūra lieka stabili? Neigiamą DNR krūvį in vitro neutralizuoja Na + ir K + jonai, o in vivo taip pat druskų jonai ir baltymai, sąveikaujantys su DNR. Dauguma tokių baltymų yra teigiamo krūvio. DNR spiralės paviršius yra ne lygus kaip cilindro, bet turi griovius. B formos DNR spiralės išorėje yra išskiriami du grioviai: didysis ir mažasis (angl. major groove, minor groove) (2.10 pav.). Pagal B formos DNR spiralės struktūrą platesnis griovys yra pavadintas didžiuoju, o siauresnis mažuoju (2.3 lentelė), nors grioviai DNR struktūroje skiriami pagal tai, kokios heterociklinių bazių porų pusės 35

36 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA juos sudaro. Z formos DNR didysis griovys beveik neįžiūrimas. Didžiojo griovio puse laikoma ta bazių poros pusė, kurioje yra purino C5 C8 atomai bei pirimidino C4 C6 atomai. Mažojo griovio puse laikoma ta bazių poros pusė, kurioje yra purino C2 bei N3 ir pirimidino C2 atomai (2.11 pav.). Grioviai yra labai svarbi DNR struktūrinė savybė: jie sukuria mikroaplinką prie DNR prisijungti įvairiems ligandams, taip pat vandens molekulėms. Ties didžiuoju DNR molekulės grioviu jungiasi dauguma su DNR sąveikaujančių baltymų. Ties mažuoju B formos DNR grioviu prisijungia vandens molekulės. Jos suformuoja nugarkaulį, kuris dar papildomai stabilizuoja DNR struktūrą pav. DNR B, A ir Z šeimų spiralių schematinis vaizdas. Viena rodykle pažymėtas DNR didysis griovys (DG), dviem rodyklėmis DNR mažasis griovys (MG) (Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology, v. 47, 1982). Viršuje parodytas spiralių sukimosi krypties nustatymas (J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013) 36

37 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA DNR erdvinės struktūros modelis buvo sukurtas remiantis tuo metu atlikta DNR pluošto rentgenostruktūrine analize. Ilgos DNR molekulės nėra geriausias objektas rentgenostruktūriniams tyrimams, nes DNR pluoštas nėra kristalai, todėl šių tyrimų analizė pateikia tik apytikrius duomenis apie molekulių erdvinę struktūrą. DNR B formos struktūra, aprašyta remiantis DNR pluošto analize, yra, galima sakyti, idealizuota m., gavę 12 nukleotidų porų dvigrandinės DNR fragmento kristalus, Ričardas Dikersonas (Richard Dickerson) ir Horasas Driu (Horace Drew) atliko jų rentgenostruktūrinę analizę, kuri suteikė tikslios informacijos apie B formos DNR struktūrą. Paaiškėjo, kad DNR B struktūroje tam tikrose vietose yra nuokrypių. Pvz., nustatyta, kad tos pačios bazių poros heterociklinės bazės ne visuomet yra vienoje plokštumoje, viena jų, pvz., gali būti pasisukusi kitos atžvilgiu (propelerio sūkis, angl. propeller twist) ir pan. Taip pat nustatyta, kad spiralė tam tikrose vietose išlinkusi (angl. bent). Išlinkimo kampas ir vieta sudėtingu būdu priklauso nuo DNR nukleotidų sekos pav. DNR heterociklinių bazių porų atomų išsidėstymas didžiajame ir mažajame grioviuose ( Ties mažuoju DNR grioviu neatrankiai jungiasi sintetiniai dažai DAPI, Hoechst, berenilas, kiti (2.12 pav., a). Dažų molekulės yra teigiamo krūvio, jos yra išlenktos, pusmėnulio formos struktūros. Šie dažai plačiai naudojami eksperimentinės molekulinės ir ląstelės biologijos tyrimuose vizualizuoti DNR in situ ląstelėse, audiniuose. Inkubuojant ląsteles dažais, jie prisijungia prie DNR, o apšvietus tam tikro ilgio banga fluorescuoja (2.12 pav., b). A formos DNR spiralė. DNR pereina iš B formos į A formą, kai aplinkoje santykinis drėgnis sumažėja iki 75 % (dehidratacija), o NaCl koncentracija tampa mažesnė nei 10 %. Palyginti su B formos DNR, A formos DNR yra kampuota ir išsipūtusi struktūra (2.13 pav.). Šios konformacijos DNR spiralė yra dešinio sukimo, viename spiralės sūkyje yra ~ 11 nukleotidų (2.3 lentelė). Būdinga šios DNR formos savybė ta, kad heterociklinių bazių plokštumos spiralės ašies atžvilgiu yra pakrypusios ir nutolusios nuo tariamos ašies (2.13 pav.). A formos DNR spiralėje ribozės yra C3 endo konformacijoje. A formos DNR turi gilų ir siaurą didįjį griovį, bet seklų ir platų mažąjį griovį (2.10 pav.). 37

38 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.12 pav. Sintetiniai dažai, prisijungiantys ties mažuoju DNR grioviu, naudojami eksperimentinėje biologijoje vizualizuoti DNR. Hoechst ir DAPI molekulių struktūros (a); ląstelės, inkubuotos DAPI dažu ir fluoroforu konjuguotais antikūnais prieš kitus baltymus. Branduoliuose mėlynai fluorescuoja DAPI (b) ( 2.3 lentelė. Struktūrinės B, A ir Z DNR spiralių ypatybės Savybės B A Z Spiralės sukimosi kryptis Dešinė Dešinė Kairė Heterociklinių bazių porų skaičius 1-ame 10,5 (9,7 10,6) 10,7 (~ 11) 12 spiralės sūkyje b-n-glikozidinio ryšio konformacija Anti Anti Anti ties pirimidinais Sin ties purinais Deoksiribozės žiedo konformacija C2 endo C3 endo C2 endo pirimidinams C3 endo purinams Spiralės skersmuo 20 Å 26 Å 18 Å Atstumas tarp greta esančių bazių porų 3,3 3,4 Å 2,6 Å 3,8 Å Didysis griovys Platus ir gilus Siauras ir gilus Seklus (beveik neįžiūrimas) Mažasis griovys Siauras ir gilus Platus ir seklus Siauras ir gilus Nukleorūgščių erdvinė A forma yra biologiškai svarbi šios formos gamtoje yra DNR-RNR heterodupleksai ir dvigrandinė RNR. RNR bei DNR-RNR heterodupleksai įgyja A formos struktūrą dėl ribozės 2 OH grupės RNR molekuleje. Ši hidroksigrupė erdviškai trukdytų susidaryti B formai, nes yra per arti fosforilgrupės ir gretimos heterociklinės bazės C8 atomo. Todėl dvigrandinė RNR negali įgyti B formos, net jeigu vandens molekulių kiekis yra pakankamas. DNR-RNR heterodupleksai ir dvigrandinė RNR gamtoje yra A formos. 38

39 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Kodėl in vivo DNR molekulė yra ne A, bet B formos? Atsakymas į šį klausimą gautas atlikus DNR rentgenostruktūrinę analizę. Priešingai nei A formos DNR, B formos DNR gali talpinti savo struktūroje jau minėtą vandens molekulių karkasą, kuris išsidėsto mažajame griovyje. Vandeniliniai ryšiai tarp vandens molekulių ir DNR struktūrinių elementų daro įtaką B formos molekulės stabilumui. Kai vandens molekulės iš DNR atimamos, kaip tai atsitinka gryninant DNR mažesnio drėgnio sąlygomis, DNR sudaro A formos spiralę pav. B ir A formų DNR spiralės. DNR molekulių struktūrinis vaizdas iš viršaus ir iš šono (kairėje); B ir A formos DNR rentgeno spindulių difrakcijos vaizdai (dešinėje) ( Molecular_models_of_DNA) Z formos DNR. Z formos DNR spiralę 1979 m. aptiko lietuvių kilmės mokslininkas Aleksandras Ričas (Alexander Rich), atlikęs nedidelio dvigrandinio oligonukleotido rentgenostruktūrinę analizę. Pati būdingiausia Z formos DNR savybė yra ta, kad DNR spiralė yra ne dešinio sukimo, o kairiojo (2.10 pav.). Tačiau ji nėra vien A ar B formų DNR veidrodinis atspindys. Z formos DNR spiralė yra ilgesnė palyginti su A ir B formomis viename jos sūkyje telpa 12 nukleotidų. Z formos DNR pasižymi plačiu ir sekliu didžiuoju grioviu (jis beveik neįžiūrimas) ir siauru bei labai giliu mažuoju grioviu (2.10 pav.) Ribozės konformacija Z formos DNR molekulėje yra C2 endo pirimidinų ir C3 endo purinų nukleotiduose, o glikozidinio ryšio konformacija yra anti pirimidinų ir sin purinų nukleotiduose (2.3 lentelė ir 2.14 pav.). Šios savybės lemia tai, kad šoninės DNR fosforo rūgšties liekanos išsidėsto zigzagu (iš čia kilęs pavadinimas Z forma). DNR Z formai tirpale susidaryti reikalinga didelė druskų koncentracija (3 4 M NaCl) ir periodiška pirimidinų ir purinų, dažniausiai dinukleotidų (pvz., (CG:CG)n, CA:TG)n), nukleotidų sekoje kaita. Citozino metilinimas C5 padėtyje, neigiama DNR superspiralizacija taip pat stabilizuoja Z formą. Šie veiksniai svarbūs Z formos DNR susidarymui ląstelėje, nes be jų Z formos DNR yra energetiškai nestabili ir trumpaamžė. 39

40 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.14 pav. Z formos DNR struktūrinių elementų ypatybės. C ir G nukleotidų, sudarančių Z DNR, ribozės ir N-glikozidinio ryšio konformacijos (a); C-G nukleotidų poros struktūra Z formos DNR molekulėje, nustatyta 0,5 Å skyros rentgenostruktūrine analize. Punktyru pažymėti vandeniliniai ryšiai, skaičiais atstumas tarp atomų angstremais (b) (Nucleic Acid Research, v. 39, p. 6245, 2011) Ilgai buvo manyta, kad kairiojo sukimo Z formos DNR spiralės susidaro tik in vitro. Šiuo metu gausu faktų, liudijančių, kad tokia DNR forma egzistuoja in vivo ir yra biologiškai svarbi. Tokią struktūrą bakterijose įgyja kai kurių genų promotorių sritys. Nors žmogaus genome G ir C skaičius mažesnis nei prokariotuose, bioinformatiniais metodais nustatyta, kad Z formos DNR potencialiai gali susidaryti kas bp. Nors Z DNR funkcijos dar nėra iki galo ištirtos, manoma, kad ji svarbi genų veiklos valdymui. Z formos biologinę reikšmę taip pat patvirtina rasti virusų ir ląstelių baltymai, atrankiai sąveikaujantys su Z DNR: RNR redagavimo fermentas ADAR1, interferonu indukuojamas žmogaus DLM baltymas, pox viruso baltymas E3L ir kt. Tokie baltymai turi domenų, kuriais atrankiai jungiasi prie Z DNR. Nustatyta Z formos DNR svarba ir eukariotų ląstelių genų aktyvumui: dalis imuninės sistemos geno CSF1 DNR, dalyvaujant chromatiną pertvarkančiam kompleksui (žr. skyrių Chromatino molekulinė struktūra ), įgyja Z formą, kad galėtų vykti geno transkripcija. Taigi, Z formos struktūrą DNR ląstelėje gali įgyti tam tikru metu. Žmogaus navikų ląstelėse Z DNR susidaro chromosomų trūkių vietose; manoma, kad ji sukelia dvigrandinius DNR trūkius ir dideles chromosomų iškritas, taigi, lemia genominį nestabilumą. Kaip ląstelėje tam tikrose DNR molekulės vietose susidaro Z formos struktūra? Perėjimas iš dešiniojo sukimo B formos į kairiojo sukimo Z formą turėtų smarkiai destabilizuoti DNR molekulės struktūrą. Atlikus 15 bp ilgio in vitro suformuoto DNR duplekso, kuriame B formos DNR spiralė perėjo į Z formos DNR spiralę, 2,6 Å skyros rentgenostruktūrinę analizę, paaiškėjo, kad perėjimo vietoje abi komplementariõs porõs heterociklinės bazės yra išsuktos (angl. flipped out) į spiralės išorę (2.15 pav.). Tokiu būdu, susidarant DNR Z formai, perėjimo vietoje yra suardoma tik vienos bazių poros struktūra, kitose vietose išlaikant spiralės pavidalo struktūrą. 40

41 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.15 pav. DNR B spiralės, pereinančios į Z spiralę, erdvinė struktūra. DNR B-Z-B spiralės schema (viršuje); DNR fragmento su išsuktomis T ir A heterociklinėmis bazėmis ties perėjimo iš Z į B formą riba erdvinė struktūra (apačioje) (Nature, v. 437, p. 1183, 2005) Neįprastos DNR antrinės struktūros Pastarųjų metų eksperimentiniai tyrimai atskleidė, kad DNR molekulės erdvinė struktūra yra gana dinamiška ir kinta. Be aprašytųjų A, B ir Z DNR spiralių tipų, yra ir kitų neįprastų DNR struktūrų, tarp jų yra ir biologiškai svarbių. Tokios struktūros dažniausiai susidaro tik tam tikras savitąsias nukleotidų sekas turinčiose DNR vietose, arba joms susidaryti reikia tokių sąlygų, kur nevyrautų įprasta B tipo DNR spiralė. Trigubą DNR spiralę (angl. triplex DNA) sudaro trys DNR grandinės arba DNR dupleksas ir RNR grandinė. Gana seniai buvo žinoma, kad RNR, kurios seka yra poli (U), poli (A), poli (U), gali sudaryti struktūrą iš trijų komplementarių grandinių. Vėliau buvo nustatyta, kad ir deoksinukleotidų tripletai, pvz., dt. da. dt arba dc + dg dc + (C + protonuota citozino forma), taip pat gali sudaryti DNR spiralę iš trijų grandinių. Tokioje triguboje spiralėje susidaro ne tik Votsono-Kriko, bet ir Hungstyno sąveika. Triguba DNR spiralė gali susidaryti ne tik iš trijų atskirų polinukleotidinių grandinių (tarpmolekulinis tripleksas), bet ir vien tik iš dvigrandinės DNR (vidumolekulinis tripleksas). Tokia triguba DNR spiralė dar vadinama H forma (2.16 pav., a). H spiralėje yra trys DNR grandinės, kurių vienoje yra vien tik pirimidinų heterociklinės bazės (homopirimidininė grandinė), o kitoje vien tik purinų heterociklinės bazės (homopurininė grandinė). Tokioje triguboje spiralėje susidaro ne tik Votsono-Kriko, bet ir Hungstyno sąveika (2.16 pav., a). Trečioji grandinė išsidėsto didžiajame DNR duplekso spiralės griovyje. Tripleksus gali sudaryti ir DNR dupleksas su RNR (heterotripleksas). Tripleksai dažnesni eukariotų nei prokariotų ląstelėse. Jų gausu svarbių genų, dalyvaujančių vystymosi ir signalų perdavimo procesuose, intronuose. Tripleksai yra imonugeniški prieš juos gauta antikūnų. Aptiktos atrankios helikazės, išskiriančios DNR tripleksą. Taip pat manoma, kad tripleksai, sukeldami dvigrandinius trūkius, gali daryti įtaką genominiam stabilumui. Kryžiaus formos DNR (angl. cruciform DNA) susidaro atvirkščiai pasikartojančių sekų (palindromų, sudarytų iš 6 nukleotidų) turinčioje DNR (2.16 pav., b). Toje pačioje grandinėje 41

42 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.16 pav. Neįprastos DNR struktūros. DNR dupleksas, galintis sudaryti trijų grandinių DNR spiralę (H DNR). Pur purinas; Pyr pirimidinas. Trigubosios DNR spiralės schematinis vaizdas ir sąveika tarp heterociklinių bazių porų (a); kryžiaus formos DNR susidarymas (b); paslinktosios DNR (S DNR) susidarymas ir DNR sekos, palankios tokiai struktūrai susidaryti (c) (Trends in Biochemical Sciences, v. 32, p. 271, 2007) 42

43 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA esančios komplementarios sritys sąveikauja tarpusavyje susidaro segtuko pavidalo atšakos (2.16 pav., b). Kryžiaus formos DNR susidarymas, palyginti su B formos susidarymu, yra energetiškai nepalankus. Išstumti tokias struktūras iš DNR spiralės reikia energijos, kuri yra neigiamai super spiralizuotoje DNR. Kryžiaus formos DNR lengviau susiformuoja daug A ir T nukleotidų porų turinčioje DNR. In vitro tokios struktūros stebėtos žiedinėje plazmidžių ir bakteriofagų DNR. Nustatyta, kad kryžiaus formos struktūros susidarymas, pvz., ties bakterijų promotoriais, daro įtaką genų transkripcijai. Paslinktoji DNR, S DNR (angl. slipped DNA). Paslinktosios DNR struktūra gali susidaryti, kai nukleotidų sekoje yra vadinamųjų tandeminių arba tiesioginių pasikartojimų (angl. tandem or direct repeats), pvz., 5 TCGGTCGGTCGG3 (2.16 pav., c). Susidaro neįprastos antrinės struktūros, turinčios iš DNR struktūros išstumtų kilpų. Kilpų susidarymas nustatytas viengrandinę DNR veikiant skaidančiomis nukleazėmis. Su paslinktosios DNR kilpų susidarymu siejama grupė paveldimų neurologinių ligų. Apie dvi dešimtys žmogaus neurodegeneracinių ligų siejama su nukleotidų pasikartojimu, pvz., (CTG)n įsiterpimu į DNR. Sekos gali būti įsiterpusios genų reguliacinėse, koduojančiose srityse, intronuose. Dėl to keičiasi arba geno raiška, arba jo koduojamo baltymo savybės. Beveik visiems atvejams yra būdingas dėsningumas slenkstinis įsiterpusių pasikartojimų (n) skaičius, kurį viršijus įsiterpimų labai greitai daugėja (didėja genominis nestabilumas), pasireiškia liga. Pvz., Hantingtono liga susergama, kai įsiterpusių CAG pasikartojimų skaičius IT15 gene viršija 36. Įdomu, kad esant ~ 32 pasikartojimams, liga nepasireiškia. Kitas pavyzdys yra Fridricho ataksija reta paveldima neurologinė liga. Sergant prastėja raumenų koordinacija (pasireiškia ataksija) ir plečiasi širdis. Liga nustatoma vaikystėje. Ligą lemia padidėjęs 5 (GAA) n (TTC) n- 3 kopijų skaičius Fridricho ataksijos geno (9 chromosoma) pirmame iš septynių intronų. Įprastai gene yra 8 30 kopijų, ataksijos atveju daugiau nei Kuo daugiau kopijų, tuo anksčiau susergama ir greičiau mirštama. Yra žinoma, kad dėl pasikartojimų Fridricho ataksijos geno (FRDA) DNR sudaro ne B formos struktūras, bet paslinktąją DNR arba trigubąją DNR, ir šios DNR formos dalyvauja geno raiškos slopinimo procesuose. Tai sumažina geno produkto baltymo frataksino (210 aminorūgščių) kiekį žmogaus mitochondrijose. Frataksinas yra geležį prijungiantis baltymas, teikiantis geležį geležies-sieros (Fe-S) kompleksui mitochondrijose. Sutrikus komplekso funkcijai, daugiau geležies susikaupia mitochondrijose nei citozolyje, dėl to kaupiasi oksidacinės pažaidos ir keičiasi fermentų aktyvumas. Kol kas nėra aišku, kodėl širdies raumenų ląstelių mitochondrijos ir sensoriniai neuronai tokie jautrūs sumažėjusiam baltymo frataksino kiekiui. DNR kvadrupleksas (angl. quadruplex DNA). Seniai buvo žinoma, kad milimolių ar didesnės koncentracijos guanozino bei jo darinių tirpalai yra klampūs, panašūs į gelius. Vėliau, gavus kristalus ir atlikus jų rentgenostruktūrinę analizę, paaiškėjo, kad guanino heterociklinės bazės tirpale sudaro savitas struktūras guanino (G) tetradas, arba guanino (G) kvartetus (angl. G-quartet). Guanino tetrada susidaro, kai vienoje plokštumoje išsidėsto keturios guanino heterociklinės bazės (2.17 pav., a). Tarp šių heterociklinių bazių susidaro vandeniliniai ryšiai ne Votsono-Kriko, bet Hugstyno sąveika. Kiekviena heterociklinė bazė tetradoje tuo pačiu metu yra dviejų vandenilio ryšių donoras ir akceptorius. Šiuos ryšius sudaro kiekvienos guanino heterociklinės bazės N1, N7, O6 ir N2 atomai (2.17 pav., a). Tokia sąveika vyksta išskirtinai tik tarp guanino heterociklinių bazių 43

44 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.17 pav. DNR G kvadrupleksų struktūra. Guanino tetrada (G kvartetas), susidaranti tarp keturių guanino heterociklinių bazių (centre vienvalenčio metalo jonas) (a); G kvadrupleksai, susidarantys G turinčiose polinukleotidinėse grandinėse: vienoje grandinėje, tarp dviejų grandinių ir tarp keturių grandinių (b); sumodeliuotos kvadrupleksų erdvinės struktūros (c) (Frontiers in Bioscience, v. 12, p. 4595, 2007) (jos turi aminogrupę, dalyvaujančią susidarant vandeniliniams ryšiams). Tetradų susidarymą stabilizuoja vienvalenčiai katijonai, pvz., Na + arba K +. Poli (G) homopolimerai taip pat įgyja savitą erdvinę struktūrą. Rentgeno struktūrinė analizė atskleidė, kad ją gali sudaryti keturios grandinės, kuriose tarpusavyje sąveikauja guanino heterociklinių bazių tetrados. Tokia greta esančių tetradų sąveika vadinama G kvadrupleksu, arba DNR tetrapleksu. G kvadrupleksas in vitro gali susidaryti iš vienos, dviejų arba keturių DNR grandinių, kuriose gausu G nukleotidų (2.17 pav., b). G kvadrupleksų susidarymui in vitro užtenka sąlygų, panašių į fiziologines (100 mm KCl, ph 7,5). Galimos įvairios erdvinės G kvadrupleksų struktūros (2.17 pav., c). G kvadrupleksai susilaukė didelio tyrėjų dėmesio, nes jų susidarymas buvo patvirtintas eksperimentais fiziologinėmis sąlygomis in vitro su žmogaus telomerų DNR, kuriai būdingos daug G turinčios pasikartojančios sekos (2.18 pav., a). Vidumolekulinių DNR kvadrupleksų susida- 44

45 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.18 pav. G kvadrupleksai telomerinėje DNR. Žmogaus chromosomų galų telomerinė DNR (a) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); schema, iliustruojanti, kaip viengrandinėje telomerinės DNR iškyšoje galėtų susidaryti G kvadrupleksai (b) (Bioessays, v. 29, p. 155, 2007); G kvadrupleksai, nustatyti su kvadrupleksams savitais raudonai fluorescuojančiais antikūnais žmogaus vėžinėse HeLa ląstelėse. DNR vizualizuota DAPI dažu (c) (Nature Chemistry, v. 5, p. 182, 2013) rymas tokioje DNR įmanomas, nes telomeros struktūros, esančios eukariotų chromosomų galuose, DNR turi viengrandinę nukleotidų 3 iškyšą (2.18 pav., b). Tada imta ieškoti įrodymų apie kvadrupleksų egzistavimą ląstelėse. Jų gauta daugiau nei pakankamai. Kvadrupleksų susidarymas chromosomų telomerų galuose ląstelėse patvirtintas eksperimentais su savitaisiais antikūnais prieš G kvadrupleksus (2.18 pav., c). Rasta ir kita molekulių grupė, galinti sudaryti kvadrupleksus, oligonukleotidų aptamerai, prisijungiantys prie ląstelinių taikinių ir slopinantys signalo perdavimą ar transkripciją. Dar viena DNR sekų, galinčių formuoti kvadrupleksus, grupė yra daug G turinčios sekos genų promotoriuose. Nuodugniai analizuota G kvadrupleksų svarba žmogaus c-myc onkogeno transkripcijai nuo vieno iš geno promotorių: suardžius G kvadrupleksą sudarančią struktūrą mutacijomis, geno transkripcija buvo aktyvinama. Atvirkščiai, esant cheminių junginių (pvz., dažų porfirinų), kurie stabilizavo struktūrą, transkripcija buvo slopinama. Bioinformatiniais metodais nustatyta, kad žmogaus genome gali būti ~ potencialių nukleotidų sekų, galinčių sudaryti kvadrupleksus; jų dažniausiai yra promotoriuose, intronuose, daug G turinčioje mikro- ir minisatelitinėje DNR. ~ 40 % žmogaus genų promotorių potencialiai galėtų turėti bent vieną tokią struktūrą. 45

46 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Kvadrupleksai, susidarantys ląstelėje, pvz., telomerų galuose arba onkogenų promotoriuose, yra patrauklus taikinys priešvėžinei terapijai. Kuriamos molekulės ligandai, kurie stabilizuotų kvadrupleksus telomerose ir trukdytų juos ilginti, taip sukeldami vėžinių ląstelių senėjimą ir apoptozę. Klinikinių bandymų etape yra sukurti priešvėžiniai vaistai, kurių molekulinis veikimas paremtas G kvadrupleksų ties onkogenų promotoriais stabilizavimu DNR tretinė struktūra. Žiedinė DNR ir superspiralizacija Iš pradžių manyta, kad visos DNR molekulės yra linijinės ir turi du laisvus galus. Iš tiesų, kiekvienos eukariotų chromosomos DNR yra labai ilga linijinė molekulė. Tobulėjant DNR išskyrimo ir nustatymo metodams paaiškėjo, kad kai kurios DNR yra uždaro žiedo pavidalo. Tokios yra mitochondrijų, prokariotų, daugumos plazmidžių, kai kurių virusų DNR. Žiedinių DNR yra įvairiausių dydžių: nuo labai mažų, pvz., bakteriofago φx174, iki milžiniškų, pvz., bakterijos E. coli chromosoma. Ilgainiui paaiškėjo, kad ir ilgų linijinių chromosominių DNR galai ląstelėje negali laisvai suktis, nes yra fiksuoti prie savitų ląstelės struktūrų branduolio pamato baltymų (pastolių) arba prie membranos. Kaip žiedinės DNR ir fiksuotų galų linijinės DNR būsena veikia DNR molekulės erdvinį išsidėstymą? Gamtoje DNR molekulės yra ne tiesios, bet susilanksčiusios. Tai yra būtina sąlyga joms tilpti eukariotinės ląstelės branduolyje, taip pat bakterijų ląstelėse. Atliekant nedidelių viruso SV 40 ir poliomos viruso DNR molekulių elektroninę mikroskopiją bei sedimentacinę analizę, buvo aptiktos kelių formų virusų DNR: žiedinė ir susisukusio žiedo formos (2.19 pav., a b). Pastarasis fenomenas pavadintas DNR superspiralizacija. DNR superspiralizacija yra gyvybiškai svarbi ląstelėms. Dviguba DNR spiralė gali erdvėje sudaryti tretinę struktūrą superspiralizuotą DNR, kurioje dviguba spiralė dar sudaro papildomas spirales. Tokią būseną gali įgyti uždara žiedinė dvi pav. Žiedinės DNR superspiralizacija. Relaksuotos (a) ir superspiralizuotos (b) plazmidės pbr322 DNR nuotraukos, gautos atominės jėgos mikroskopijos metodu. Apačioje molekulių schemos (Nucleic Acids Research, v. 38, p. 2120, 2010) 46

47 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.20 pav. Vidinės (torsinės) įtempties sukeliama grandinės superspiralizacija ( uq.edu.au/~infinity/infinity7/supercoiling.html) grandinė DNR, taip pat linijinė DNR, jeigu jos galai tam tikru būdu fiksuoti. Tai yra būtina sąlyga superspiralizuotai DNR susidaryti. Jei galai laisvi, DNR molekulė yra relaksuota. Superspiralizacijai struktūroje atsirasti reikalinga vidinė įtemptis, dar vadinama torsine įtemptimi. Relaksuotoje struktūroje jos nėra, tokiai struktūrai superspiralizacija nebūdinga (2.19 pav., a). Superspiralizaciją galime stebėti taip: sukime vieną siūlo galą, laikydami kitą jo galą ir neleisdami jam išsisukti. Sukime tol, kol sukti taps vis sunkiau taip susuktame siūle atsiras įtemptis. Jeigu dabar, neleisdami laisvai išsisukti, susukto siūlo galus suartinsime, siūlas dar papildomai susisisuks apie save, t. y. įgis superspirales (2.20 pav.). Kaip atsiranda įtemptis DNR molekulėse? Pvz., viename linijinės DNR molekulės gale atskiros jos grandinės yra fiksuotos ir negali laisvai atsisukti, o kitame gale grandinės papildomai apsisuka tarpusavyje keletą kartų. Dabar sujunkime DNR galus, arba juos užfiksuokime taip, kad grandinės negalėtų laisvai atsisukti. DNR grandinės molekulėje dabar apsisukusios viena apie kitą daugiau kartų, nei buvo iki tol. Molekulėje atsiranda vidinė įtemptis. DNR, kurioje atsiranda įtemptis, panašiai kaip jau minėtas susuktas siūlas, negalėdama laisvai atsisukti, sukasi apie save pačią taip susidaro DNR superspiralės. Superspiralizuota DNR yra struktūra, kuri ilgio vienete turi daugiau nukleotidų nei įprasta standartinė DNR struktūra. Įprasta standartine DNR struktūra laikome dvigrandinės DNR tam tikros formos (A, B arba Z) spiralę, kurios viename sūkyje telpa tai formai būdingas skaičius bazių porų (pvz., B formos ~ 10,5). Tokia DNR yra relaksuota 2. DNR tirpale įgyja relaksuotą B struktūrą, nes jai palaikyti reikia mažiausiai energijos. Bet koks nuokrypis nuo relaksuotos struktūros, pvz., lankstymasis erdvėje, didina molekulės vidinę energiją. 2 Pažymėtina, kad relaksuotos formos DNR spiralės sūkiai (kuomet polinukleotidinės grandinės yra viena apie kitą apsivijusios) nėra DNR superspiralizacija. Superspiralizacija molekulėje (torsinė įtemptis DNR) atsiranda tik įvedus papildomus sūkius arba panaikinus sūkius. 47

48 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR superspiralizaciją galima aprašyti matematiškai naudojant tris dydžius: z sankibos laipsnį, Lk (angl. linking number); zsūkių skaičių, Tw (angl. twist); zsuperspirališkumo laipsnį, Wr (angl. whrite). Šie dydžiai tarpusavyje yra susiję tokiu būdu: Lk=Tw+Wr. Lk dydis yra suminė dviejų dydžių išraiška ir yra visos DNR molekulės topologinė savybė 3, aprašanti, kiek kartų DNR grandinės apsuka viena kitą (sukimba viena su kita) 360º (kitaip tariant, kiek kartų reikia visiškai atsukti grandines, kad jos išsiskirtų). Jeigu grandinės sukasi viena apie kitą į dešinę, tuomet sukibimas (Lk) laikomas teigiamu (žymima + ), jeigu sukasi į kairę neigiamu (žymima ): Lk=+1 Lk=-1 B ir A formos DNR molekulėse, kur viena grandinė apsisukusi apie kitą dešiniuoju sukimu, Lk yra teigiamas, o kairiojo sukimo DNR (pvz., Z formos) Lk yra neigiamas. Uždaroje žiedinėje DNR arba linijinėje DNR, kurios galai yra fiksuoti, Lk skaičius nekinta. Lk gali kisti tik tuo atveju, jeigu DNR grandinė yra nutraukiama ir sukibimai naikinami ( Lk) arba įvedami papildomi sukibimai (+Lk) (2.21 pav.). Jeigu po to DNR galai vėl sujungiami arba fiksuojami, Lk vėl tampa pastovus, gali kisti tik Tw ir Wr geometriniai parametrai. Tw dydis išreiškiamas taip: DNR sudarančių nukleotidų porų skaičius padalijamas iš tai DNR būdingo spiralės žingsnio (pvz., B formos DNR jis yra ~ 10,5, todėl, pvz., bp ilgio B formos DNR Tw=1050/10,5=100). DNR molekulėse, kur viena grandinė apsisukusi apie kitą dešiniuoju sukimu (pvz., B ir A formų spiralėse), Tw yra teigiamas, o kairiojo sukimo DNR (pvz., Z formos spiralėje) Tw neigiamas. Relaksuotoje DNR, kurioje nėra superspiralinių vijų: Lk=Lk 0. Lk yra visos DNR molekulės, o ne kurios nors jos dalies, topologinė savybė. 3 Topologija tai objekto savybė, kuri, vykstant jo deformacijai, nekinta, jeigu nepažeidžiamas objekto integralumas. 48

49 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Relaksuotoje DNR molekulėje sankibos laipsnis Lk 0 yra lygus DNR spiralės sūkių skaičiui Tw: Tokioje DNR torsinė įtemptis yra minimali. Lk 0 =Tw. Pvz., relaksuotoje B formos DNR, kurią sudaro nukleotidų porų, sankibos laipsnis Lk 0 =Tw=100 (1050/10,5=100). Relaksuotoje Z formos DNR, kurią sudaro nukleotidų porų, o spiralės žingsnis yra 12, sankibos laipsnis Lk 0 =Tw= 100 (1200/12= 100). Superspirališkumo laipsnis Wr nusako, kiek kartų DNR dupleksas dar papildomai sukasi erdvė je. Relaksuotų molekulių superspirališkumo laipsnis Wr = 0. Išnagrinėkime 2.21 pav. pateiktą pavyzdį. Turime relaksuotą 250 nukleotidų porų dvigrandinę DNR (B formos molekulė, kurios viename sūkyje yra ~ 10,5 nukleotidų porų). Tokios DNR 2.21 pav. DNR super spiralizacija (M. B. Berg, J. L. Tymozcko, L. Stryer. Biochemistry, seventh edition, 2012) 49

50 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA sankibos laipsnis: Lk=Lk 0 =25, Tw=25, superspirališkumo laipsnis Wr=0. Dabar viename gale atsukime DNR grandines, panaikindami du DNR sukibimus, paskui sujunkime molekulės galus. DNR atsiranda vidinė įtemptis. Uždara molekulė stengiasi įgauti relaksuotai DNR būdingą sūkių skaičių (Tw=25), tačiau sankibos laipsnis, panaikinus du sukibimus, jau yra Lk=23, jis turi išlikti pastovus. DNR molekulė superspiralizuosis DNR spiralė suksis apie save pačią, susidarys dvi neigiamos superspiralės (23=25+( 2), nes Lk=Tw+Wr). Tokia superspiralizuota DNR yra topologiškai lygiavertė DNR, kurioje nėra superspiralinių vijų (Wr=0), trūksta dviejų sūkių (Tw=23) ir kuri gali lengvai tokia virsti (2.21 pav.). Ši savybė išnaudojama biologiniuose procesuose (replikacijoje, transkripcijoje, raparacijoje), kai reikia išskirti DNR grandines nedidelėje srityje tai yra lengviau padaryti, kai DNR toje srityje yra superspiralizuota neigiamai. Dabar panagrinėkime kitą superspiralizacijos pavyzdį, pasitaikantį gamtoje. Žiedinė dvigrandinė viruso SV40 DNR yra sudaryta iš ~ bp. Galima tikėtis, kad ši molekulė ląstelėje yra relaksuota ir jos Lk=Lk 0 =~500. Tačiau viruso DNR, išskirta iš virionų, yra superspiralizuota neigiamai. Tokia superspiralizacija įmanoma, jeigu DNR spiralė yra ne visiškai susisukusi (angl. underwound). Iš tiesų, SV40 viruso DNR yra ne visiškai susisukusi joje trūksta ~ 25 sūkių. Siekiant išlaikyti nekintantį Lk, šį trūkumą kompensuoja neigiama viruso DNR superspiralizacija (475=500+( 25), nes Lk=Tw+Wr). Priešingu atveju, kai DNR yra persukta, t. y. turi daugiau sūkių nei relaksuota molekulė (angl. overwound), perteklių kompensuoja teigiama molekulės superspiralizacija. Etidžio bromido (EtBr) molekulė yra didelis, plokščias, keletą aromatinių žiedų turintis katijonas (2.22 pav., a). Dėl plokščios struktūros etidžio molekulės įsiterpia (interkaliuoja) į dvigrandinę DNR molekulę tarp gretimų heterociklinių bazių porų plokštumų (2.22 pav., b). Apšviestas ultravioletine šviesa etidžio bromidas fluorescuoja. Fluorescencija yra stipresnė dažui įsiterpus į DNR, todėl etidžio bromido dažas naudojamas DNR vaizdinimui. DNR mėginyje esant etidžio bromido, dažas įsiterpia į dvigrandinės DNR molekules. Išskirsčius DNR molekules pagal jų dydį agaroziniame gelyje ir apšvietus jį ultravioletine šviesa, DNR molekulės, kuriose įsiterpęs dažas, fluorescuoja stipriau (2.22 pav., c). Įsiterpusios į DNR, etidžio bromido molekulės padidina atstumą tarp greta esančių bazių porų, todėl Tw mažėja. Uždaroje žiedinėje molekulėje, pvz., plazmidės DNR, kurios Lk yra pastovus, tai kompensuojama superspiralizacijos (Wr) pokyčiu. Mažėjant Tw, Wr turi didėti. Į neigiamai superspiralizuotą dvigrandinę žiedinę DNR (dažniausiai ji tokia yra išgryninus iš ląstelių) įsiterpus EtBr molekulėms, Wr didėja, molekulė tampa labiau relaksuota. Jeigu EtBr sąveikauja su relaksuota žiedine DNR, ši superspiralizuojasi teigiamai. Relaksuotos žiedinės DNR yra mažiau judrios elektriniame lauke nei superspiralizuotos. Etidžio bromido ir kitų dažų gebėjimas interkaliuoti į dvigrandinę DNR plačiai naudojamas ir DNR superspiralizacijai tirti. Tam taip pat naudojami ir fermentai topoizomerazės. DNR superspiralizacija gali būti dvejopa: plektoneminė ir toroidinė. Plektoneminio tipo superspiralizacija yra DNR duplekso apsisukimas apie save patį. Plektoneminiu būdu superspiralizuojasi žiedinė DNR (pvz., bakterijų), taip pat DNR, kurioje susidaro torsinė įtemptis dėl biologinių procesų (replikacijos, transkripcijos) (2.23 pav., a). Dešiniojo sukimo krypties plektoneminė superspiralizacija yra neigiama, o kairiojo teigiama. Toroidinio tipo superspiralizacija yra DNR duplekso ašies sukimasis žiedais sudarant į cilindrą panašią struktūrą (2.23 pav., b). Tokiu būdu DNR yra superspiralizuota eukariotų chromatine: ji kairuoju sukimu apsisukusi nukleosomose aplink baltymus histonus 1,65 karto. Nu- 50

51 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA kleosomose DNR superspiralizuota neigiamai. Abiejų tipų superspiralizacija topologiškai yra lygiavertė. Vieno tipo DNR molekulės superspiralizacija gali pereiti į kito tipo (2.23 pav., c) Taigi, DNR supakavimas į nukleosomas chromatine sukuria neigiamą superspiralizaciją. Kiek DNR molekulė yra superspiralizuota (Lk), palyginti su relaksuota struktūra (Lk 0 ), galima išreikšti savituoju sankibos skirtumu, ΔLk: DLk=Lk Lk 0. Kuo labiau DLk skiriasi nuo nulio, tuo DNR yra labiau superspiralizuota. Jeigu Lk < Lk 0, tai DLk < 0, o DNR yra superspiralizuota neigiamai; jeigu Lk > Lk 0, tai DLk > 0, o DNR yra superspiralizuota teigamai. DLk ir Lk 0 priklauso nuo DNR molekulės ilgio, todėl DNR superspiralizacija apibūdinama ir superspiralizacijos tankiu, σ (sigma), kuris išreiškiamas: s=dlk/lk pav. Etidžio bromidas ir DNR vaizdinimas. Etidžio brimido struktūra (a); agarozės gelis su EtBr ir išskirstytomis DNR molekulėmis, apšviestas ultravioletiniais spinduliais (b) ( Ethidium_bromide) Žiedo pavidalo DNR, išskirtos iš bakterijų, superspiralizacijos tankio s dydis yra ~ 0,06. Neigiama superspiralizacija gamtoje yra būdinga daugumos organizmų DNR ne tik mažoms, žiedinėms DNR (mitochondrijų, virusų, bakterijų DNR), bet ir didelėms DNR molekulėms. Dėl neigiamos superspiralizacijos DNR supakuojama nukleosomose. Tokia DNR topologiškai lygiavertė DNR, kurioje trūksta sūkių tam tikroje srityje grandinės yra išskirtos. Tai lemia, kad 51

52 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.23 pav. Plektoneminė ir toroidinė DNR superspiralizacija. Plektoneminė superspiralizacija (a); toroidinė superspiralizacija (b); eukariotų DNR superspiralizacija prisijungus baltymams (histonams) (c) (J. D. Watson, T. A. berg, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013) per replikaciją ir transkripciją lokaliai išskirti grandines sunaudojama mažiau energijos nei, pvz., relaksuotoje DNR. Vieni iš organizmų, kuriuose DNR superspiralizuota teigiamai, yra kai kurios termofilinės archebakterijos, gyvenančios karštuosiuose šaltiniuose. Šiuo atveju laisvosios energijos saugykla yra teigiama DNR superspiralizacija. Energija naudojama apsaugoti DNR molekulę nuo denatūracijos aukštoje temperatūroje. Eukariotų chromosomų centromerose DNR taip pat superspiralizuota teigiamai ji susisukusi aplink baltymus histonus dešiniuoju sukimu (toroidinė superspiraliacija) Topoizomerazės Gamtinių DNR sankibos laipsnis (Lk) ląstelėse keičiamas pasitelkiant savitą grupę fermentų topoizomerazes. Topoizomerazės ląstelėje palaiko tam tikrą DNR topologinę būseną. Topoizomerazių yra bakterijų, archėjų ir eukariotų ląstelėse, virusuose. Šie fermentai pagal jų struktūrą ir veikimo mechanizmą skirstomi į I tipo ir II tipo. I ir II tipo topoizomerazės dar 52

53 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA skirstomos į penkias šeimas: IA, IB, IC, IIA ir IIB (2.4 lentelė). Mažiausiai penkios skirtingos DNR topoizomerazės aptiktos aukštesniųjų eukariotų, tarp jų ir žmogaus, ląstelėse. Topoizomerazės laikinai sukuria laisvus DNR galus, kuriuos atsukant arba susukant sumažinamas arba padidinamas Lk. Visos topoizomerazės skelia DNR grandinę, sudaro su ja laikiną kovalentinį ryšį, vėliau perskeltąją grandinę sujungia, pakeisdamos DNR molekulės Lk. Tokiu būdu superspiralizacija, kai ji trukdo judėti baltymams arba jų kompleksams, yra panaikinama. I tipo topoizomerazės keičia DNR molekulės Lk vienetu (DLk=1) arba n (DLk>1). II tipo topoizomerazės keičia DNR molekulės Lk dvejetu (DLk=2). Skiriasi I ir II tipo topoizomerazių struktūra ir veikimo mechanizmas. 2.4 lentelė. DNR topoizomerazių savybės Savybė I tipas II tipas Šeima IA IB IC IIA IIB Lk 1 n n 2 2 Fosfotirozininis ryšys 5 -tyr 3 -tyr 3 -tyr 5 -tyr 5 -tyr Panaikina superspirales ( ) (+)/( ) (+)/( ) (+)/( ) (+)/( ) Sukuria superspirales (+) Ne Ne ( ) Ne atvirkštinė girazė girazė Sukuria / išskiria Vngr. DNR Vngr. DNR - Dvigr. DNR Dvigr. DNR katenanus Metalo jonai Mg 2+ Ne Ne Mg 2+ Mg 2+ ATP Ne (taip) Ne Ne Taip Taip Ketvirtinė struktūra Mono/AB dimeras Monomeras Monomeras AB, A 2 B 2, A 2 B 2 C 2 A 2 B 2 Dydis (kda) ~ Iškyša Nenustatyta Nenustatyta Nenustatyta 4 nukleotidai 2 nukleotidai Mechanizmas Grandinės tempimas Išsukimas Išsukimas (?) Grandinės tempimas Grandinės tempimas I tipo topoizomerazės dažniausiai yra vieno polipeptido kelis funkcinius domenus turintys baltymai. Šie fermentai skelia vieną DNR grandinę. Fermentų aktyviajame centre esanti tirozino aminorūgšties liekana sudaro laikiną kovalentinį fosfotirozininį ryšį su skeltos DNR grandinės 5 galu (IA šeimos topoizomerazės) arba 3 galu (IB ir IC šeimos topoizomerazės). I tipo topoizomerazių veikimui, išskyrus kai kurių šeimų atstovus, ATP nereikia. IA šeimos topoizomerazės per skeltosios grandinės plyšį tempia sveikąją grandinę, tada sujungia perskeltosios DNR galus. Rezultatas Lk pakeičiamas vienetu (2.24 pav., a). Toks veikimo mechanizmas vadinamas vienerių vartų mechanizmu (angl. one gate). IA šeimai priklauso atvirkštinė girazė, randama visose hipertermofilinėse bakterijose ir archėjose. Fermentas unikalus tuo, kad sukuria DNR teigiamas superspirales (2.4 lentelė). Atvirkštinė girazė turi savo struktūroje topoizomerazėms nebūdingą helikazės domeną, o topoizomerazės veikimui reikia ATP. 53

54 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.24 pav. IA šeimos topoizomerazių vienerių vartų veikimo mechanizmą iliustruojanti schema. Fermentas prijungia dvigrandinę DNR (1); fermentas skelia vieną DNR grandinę, susidaro fosfotirozininis ryšys tarp topoizomerazės aktyviojo centro Tyr ir DNR 5 fosfato (2); fermento domenas atsilenkia (atviroji konformacija), per skeltąją grandinę traukiama sveikoji grandinė (3); skeltoji grandinė sujungiama (4 5) (D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) IB ir IC šeimų topoizomerazių veikimas kitoks: kai šio tipo topoizomerazės perskelia DNR ir sudaro kovalentinį ryšį su 3 galu, laisvasis 5 galas išsisukioja. Rezultatas Lk keičiamas n kartų. Išsisukimo (angl. swivel) valdymo mechanizmas nėra iki galo išaiškintas. IC šeimos topoizomerazės rastos tik Methanopyrus genties archėjose. II tipo topoizomerazės yra homodimerinės arba heterotetramerinės struktūros baltymai (2.25 pav.). Jų funkcijos yra gyvybiškai svarbios užtikrinant struktūrinę chromosomų būseną ląstelėje bei DNR struktūrinę būseną replikacijos, transkripcijos, reparacijos procesų metu. Visi gyvieji organizmai turi bent vieną II tipo topoizomerazę, žinduolių ląstelėse jų yra dvi (IIa ir IIb topoizomerazės). II tipo A šeimos topoizomerazių yra visuose ląsteliniuose organizmuose, jų taip pat rasta virusuose, organelėse. II tipo B šeimos topoizomerazių rasta archėjose, augaluose, kai kuriose bakterijose, pirmuonyse, dumbliuose. II tipo topoizomerazės naikina teigiamas ir neigiamas DNR superspirales, išskiria sukibusius DNR žiedus katenanus. Kai kurios šių topoizomerazių pasižymi neįprastomis savybėmis, pvz., bakterijų ir archėjų IIA topoizomerazės girazės sukuria neigiamas superspirales. II tipo tipoizomerazių veikimas kitoks nei I tipo. II tipo topoizomerazės skelia abi DNR grandines, palikdamos nukleotidų iškyšas kiekvienos skeltos grandinės 5 gale. Kiekvienas fermento protomeras su skeltų grandinių 5 galais sudaro po kovalentinį fosfotirozininį ryšį. II tipo topoizomerazių veikimui reikia ATP, jis naudojamas fermento konformaciniams virsmams. 54

55 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.25 pav. I ir II tipo topoizomerazių erdvinės struktūros. I tipo A šeimos topoizomerazės (E. coli III topoizomerazės) komplekso su DNR erdvinė struktūra (a); II tipo topoizomerazės (S. cerevisiae II topoizomerazės) erdvinė struktūra, kur Y kataliziškai aktyvi tirozino liekana, ADPNP ATP nukleotido analogas (b) (Quaterly Reviews of Biophysics, v. 41, 2008) II tipo A šeimos topoizomerazės skelia abi DNR grandines, per susidariusį laikiną plyšį tempia sveikąją DNR, tada skeltąją DNR sujungia. Veikimo mechanizmas vadinamas trejų vartų (angl. three gates) (2.26 pav.). Pirmiausiai per fermento, kuris yra atvirojoje konformacijoje, N vartus (ATPazės domenus) pakliūva vienas DNR fragmentas G segmentas (angl. gate). G DNR yra stipriai lenkiama, ji prijungiama DNR vartuose, kur vyksta jos skėlimas ir vėliau sujungimas. Prisijungus ATP prie N vartų (ATPazės domenų), vyksta domenų dimerizacija. N vartai užsiveria, įtraukdami kitą DNR fragmentą T segmentą (angl. transfer). G DNR skeliama, o per susidariusį plyšį traukiama sveikoji T DNR. Skeltoji G DNR sujungiama. T DNR išeina per C vartus, tada šie užsiveria. ATP molekulių hidrolizė prasideda, kai prasideda T DNR pernaša. Įvykus hidrolizei, disocijuoja ADP, ir fermentas grįžta į pradinę būseną. Veikiant topoizomerazėms susidaro dar kelios neįprastos tretinės DNR struktūros: mazgai ir katenanai (2.27 pav., a c). DNR mazgai aptikti in vitro veikiant DNR topoizomerazėmis. DNR mazgų aptinkama ir ląstelėse, tačiau retai: jų yra bakteriofagų, virusų, bakterijų, turinčių replikacijos baltymų mutacijų, DNR. Katenanai (lot. catena grandinė ) yra biologiškai svarbios DNR struktūros. Vykstant bakterijų, mitochondrijų, chloroplastų, virusų, plazmidžių žiedinių DNR replikacijai, dukterinės žiedinės DNR molekulės lieka sukibusios sudaro katenanus. Sukibimas (Lk) turi būti visiškai panaikintas, kad molekulės būtų atskirtos viena nuo kitos. Sukibimą panaikina II tipo DNR topoizomerazės (bakterijose IV topoizomerazė, eukariotuose II topoizomerazė). Šie fermentai gali ir sujungti DNR žiedus į katenanus. Jeigu žiedų DNR esti viengrandinių trūkių, žiedus atskirti ar sujungti gali I tipo topoizomerazės. 55

56 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.26 pav. II tipo topoizomerazių trejų vartų veikimo mechanizmą iliustruojanti schema. Apibrėžtas vienas fermento protomeras (Nucleic Acids Research, v. 37, p. 712, 2009) Tripanosomatidžių mitochondrijų DNR, kuri dar vadinama kinetoplasto DNR (kdnr), topologija yra labai neįprasta. DNR organizuota į didžiulį tarpusavyje sujungtų DNR žiedų (katenanų) tinklą. Pvz., organizmo Crithidia fasciculata kdnr sudaro ~ 25 dideli (37 kb) DNR žiedai ir mažų (2,5 kb) DNR žiedų. Visų žiedų DNR yra relaksuotos formos, kiekvienas jų sujungtas su maždaug trimis kitais žiedais. Žiedų tinklas primena iš daugybės žiedų nukaltą viduramžių riterių šarvą. Panašiai organizuotas ir Leishmania tarentolae genomas (2.14 pav., c). Dar nėra išaiškinta, kodėl tokia DNR struktūrinė organizacija atsirado tripanosomų mitochondrijų DNR, tačiau ji neabejotinai pasitarnauja šių organelių genomo talpinimui pav. DNR mazgai ir katenanai. DNR mazgų (a) ir katenanų (b) elektroninės mikroskopijos nuotraukos ir schemos; Leishmania tarentolae kinetoplasto DNR (kdnr) elektroninės mikroskopijos nuotrauka (c) ( 56

57 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA RNR antrinė ir tretinė struktūra Kitaip nei DNR spiralė, kuri yra linijinė struktūra, RNR molekulės nėra linijinės. Joms būdinga didelė dydžių ir struktūrų įvairovė (2.5 lentelė), kuri atspindi RNR funkcijų įvairovę. Vis labiau linkstama manyti, kad RNR funkcijos tiesiogiai priklauso nuo jų tretinės struktūros. 2.5 lentelė. Kai kurios RNR molekulės ir jų ilgiai RNR Ilgis nukleotidais Pernašos RNR (trnr) Ribosominės RNR 5S 5,8S (žiurkė) 16S (E. coli) 18S (žiurkė) 23S (E. coli) 28S (žiurkė) ~ Telomerazės RNR (Tetrahymena) 159 Ribonukleazės P M1 RNR I klasės ribozimo intronas (Tetrahymena) 413 Mažosios branduolio RNR RNR gidai ~ 60 Viroidų RNR RNR erdvinės struktūros, kurias in vivo ir in vitro įgyja RNR molekulės, nedaug kuo primena anksčiau aptartas DNR konformacijas. Jos labiau panašios į baltymų erdvines struktūras. F. Krikas yra pasakęs, kad šios molekulės atrodo kaip gamtos bandymas suteikti RNR baltymų funkcijas. RNR antrinės struktūros šiuo metu gana tiksliai aprašomos bioinformatiniais metodais, kurie remiasi lyginamąja RNR nukleotidų sekų analize, įvairių RNR konformacijų laisvosios energijos termodinaminiais duomenimis, RNR molekulių kristalų rentgeno analizės duomenimis. RNR molekulė neturi jai komplementarios grandinės, kurios heterociklinės bazės sudarytų poras su kitos RNR molekulės heterociklinėmis bazėmis, kaip yra dvigrandinėje DNR. Tačiau RNR molekulėms yra būdinga antrinė struktūra, kuri susidaro dėl vidumolekulinės sąveikos tarp tos pačios RNR molekulės heterociklinių bazių. Antrinė RNR struktūra yra RNR erdvinės struktūros organizacinis pagrindas. Antrines RNR struktūras priimta vaizduoti vienoje plokštumoje, tačiau antrinė RNR struktūra nėra tik dvimatė struktūra: ji turi tretinės struktūros elementų, pvz., A formos dvigrandinės RNR spiralių. A formos RNR spiralės yra tipiški RNR molekulių antrinės struktūros elementai, susidarantys sąveikaujant komplementarioms tos pačios RNR molekulės heterociklinėms bazėms. RNR spiralėje A sudaro komplementarią sąveiką su U, o G su C. Tarp šių heterociklinių bazių susidaro Votsono-Kriko sąveika. RNR spiralėse gausu (skaičiuojama daugiau nei 20) vadinamųjų nekanoninių (ne Votsono-Kriko) heterociklinių bazių porų. Iš jų labiausiai paplitusi G-U pora. 57

58 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.28 pav. RNR antrinė struktūra ir jos elementų tarpusavio sąveikos tretinėje struktūroje. RNR antrinės struktūros elementai (a) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second edition, 2007); antrinės struktūros elementų tarpusavio sąveika (b); RNR pseudomazgo susidarymo schema ir erdvinė struktūra (c) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 58

59 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.6 lentelė. RNR molekulių tipai ir jų funkcijos RNR Baltymus koduojančios irnr Baltymų nekoduojančios rrnr trnr mirnr snrnr sirnr rasirnr snornr Didelės ncrnr Funkcijos Matricos baltymų biosintezei ribosomose Struktūriniai ir funkciniai ribosomų komponentai Baltymų biosintezės tarpininkai Genų raiškos valdymas RNR splaisingo aparato komponentai Genų raiškos valdymas Genų raiškos valdymas rrnr brendimo aparato komponentai Genų raiškos valdymas RNR A formos spiralės mažasis griovys yra platus ir seklus, o didysis griovys labai siauras ir gilus, jį pakankamai sunku pasiekti su nukleorūgštimis sąveikaujantiems baltymams bei ligandams. Kita vertus, 2 OH grupės yra vandenilinių ryšių akceptoriai, todėl sąveikos galimybė yra. Dvigrandiniai fragmentai RNR molekulėje gali būti pertraukti nesuporuotų linijinių fragmentų įvairaus dydžio kilpų (angl. loop) ir pupsų (angl. bulge), kuriuos sudaro vienas ar keli nesuporuoti nukleotidai, išstumti iš suporuotos srities (2.28 pav., a). Dažnas RNR molekulių antrinės struktūros elementas yra plaukų segtukas (angl. hairpin), kurį sudaro dvigrandinės RNR fragmentas stiebas (angl. stem), turintis nesuporuotą kilpą. RNR stiebokilpos struktūros (angl. stem-loop) yra svarbūs pernašos RNR molekulių (trnr) erdvinės struktūros elementai. Dvigrandiniai RNR fragmentai bei kilpos sudaro ir šakotąsias struktūras (2.28 pav., a). Tretinėje RNR struktūroje antrinės struktūros elementai sąveikauja tarpusavyje. Taip, pvz., susidaro RNR pseudomazgai (angl. pseudoknots), besibučiuojantys plaukų segtukai (angl. kissing hairpins), plaukų segtuko pupso (angl. hairpin bulge) struktūros (2.28 pav., b). RNR pseudomazgas susidaro, kai RNR kilpoje esančios heterociklinės bazės sąveikauja su kito RNR molekulės fragmento heterociklinėmis bazėmis (2.28 pav., c). RNR pseudomazgai pirmą kartą buvo nustatyti griežčių mozaikos viruso RNR. Pseudomazgų esti įvairaus dydžio ir struktūrų, nes juos galinčių sudaryti RNR stiebų bei kilpų įvairovė taip pat yra didelė. Pseudomazgų funkcijos įvairios: jie sudaro katalizinę ribozimų šerdį, svarbūs telomerazės RNR struktūrai ir funkcijoms. Retrovirusų irnr susidarantys pseudomazgai lemia skaitymo rėmelio poslinkį transliacijos metu, toks poslinkis būtinas viruso dauginimuisi reikalingų baltymų sintezei. Ląstelėse RNR molekulių funkcijos yra labai įvairios (2.6 lentelė). Ląstelėse vyrauja trijų tipų RNR molekulės: z nedidelio ilgio pernašos RNR, trnr (angl. transfer RNR), kurios dalyvauja baltymų biosintezėje; z ribosominės RNR, rrnr, kurios ribosomose sudaro struktūrinį ir funkcinį pamatą peptidiniams ryšiams sintetinamose baltymų molekulėse susidaryti; z informacinės RNR, irnr, kuriose yra nuo DNR transkripcijos metu nurašyta informacija; irnr molekulės talpina informaciją apie baltymų aminorūgščių sekas. 59

60 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Be paminėtų RNR molekulių, ląstelėse gausu mažų RNR molekulių, kurios dalyvauja įvairiuose biologiniuose procesuose: irnr splaisingo bei redagavimo, trnr, rrnr, kitų RNR pirmtakų brendimo, baltymų išnašos, DNR replikacijos, genų raiškos valdymo (2.6 lentelė). Trumpai aptarsime pagrindinių RNR molekulių tipų antrinės ir tretinės struktūrų ypatybes Pernašos RNR (trnr) antrinė ir tretinė struktūra Pernašos RNR molekulių erdvinė struktūra lemia šių molekulių savitas funkcijas ląstelėje. trnr molekulių struktūra turi užtikrinti tikslų jų prisijungimą ribosomoje. Kita vertus, trnr molekulės turi pasižymėti ir pakankama struktūrų įvairove, užtikrinančia, kad trnr molekules atpažintų savitosios aminoacil-trnr sintetazės, jungiančios aminorūgštis prie trnr m. Robertas Holis (Robert Holley) nustatė mielių fenilanil-trnr (trnr Phe ) nukleotidų seką. Pernašos RNR yra palyginti mažos ir kompaktiškos molekulės (73 93 nukleotidai). Tačiau jos nėra linijinės. Antrinė trnr molekulių struktūra yra dobilo lapą primenanti struktūra, kuriai yra būdingos keturios dvigrandinės stiebo formos sritys, susidarančios tarp komplementarių heterociklinių bazių molekulėje (Votsono-Kriko poros), ir trys viengrandinės kilpos pavidalo sritys (2.29 pav., a). Antrinę trnr molekulių struktūrą iš dalies stabilizuoja Votsono-Kriko sąveika tarp heterociklinių bazių. Dvigrandinės trnr molekulės sritys yra A formos RNR spiralės. Visos žinomos citozolio trnr molekulės sudaro dobilo lapo formos antrinę struktūrą. zpernašos RNR molekulės funkcijoms labai svarbūs antrinės struktūros elementai yra antikodono stiebas ir antikodono kilpa. Stiebą sudaro 5 komplementarių nukleotidų poros. Antikodono kilpoje visos trnr molekulės turi 7 nukleotidus. Antrasis antikodono kilpos nukleotidas visuomet yra uridinas, U. Už jo kiekviena trnr molekulė turi savitą nukleotidų trejetą antikodoną, kuris komplementarus tam tikram nukleotidų trejetui kodonui irnr molekulėje. RNR molekulių kodono-antikodono sąveika susidaro ribosomoje. z5 gale visos trnr molekulės yra fosforilintos ir beveik visos turi 7 nukleotidų porų dvigrandinę struktūrą akceptorinį stiebą. trnr akceptoriniame stiebe yra netipiška bazių pora G-U. Akceptorinio stiebo 3 gale visos trnr turi viengrandinę keturių nukleotidų 5 RCCA3 OH iškyšą, prie kurios jungiama aminorūgštis (R purinas A arba G). z Kiti struktūriniai trnr elementai yra TψС stiebas su TψС kilpa. Stiebą sudaro penkios nukleotidų poros, o kilpoje yra labai konservatyvūs 7 nukleotidai, tarp jų modifikuotas nukleotidas pseudouridinas, y (psi), taip pat ir neįprastas RNR molekulei nukleotidas su T. z Visos trnr molekulės turi D stiebą ir D kilpą. D stiebą įprastai sudaro 4 nukleotidų poros, o D kilpą 7 11 nukleotidų. Kilpoje dažnai yra modifikuotas nukleotidas dihidrouridinas, D (iš čia kilęs ir kilpos pavadinimas). z Pernašos RNR struktūrai būdingas elementas yra kintamoji kilpa, V (angl. variable loop). Pagal kintamosios kilpos dydį trnr molekulės yra skirstomos į dvi grupes. 1-os grupės trnr turi nedidelę kintamąją kilpą, kurią sudaro 3 5 nukleotidai (tokią kilpą turi ~ 75 % trnr molekulių). 2-os grupės trnr molekulių kintamąją kilpą sudaro nukleotidas. 60

61 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Palyginus įvairių trnr antrines struktūras, paaiškėjo, kad tam tikrose padėtyse yra tie patys nekintamieji (angl. invariant) nukleotidai. Tam tikrose padėtyse nustatyti nukleotidai, turintys tik purino arba tik pirimidino heterociklines bazes iš dalies kintamieji (angl. semivariant). Tokių nukleotidų trnr molekulėje suskaičiuojama ~ 22. Kai kurių trnr molekulių antrinė struktūra skiriasi nuo daugumos trnr struktūros. Pvz., iniciatorinės trnr pasižymi struktūriniais skirtumais dėl savo ypatingų funkcijų. Šios trnr prisijungia ribosomoje ne A srityje, bet P srityje (žr. skyrių Baltymų biosintezė ). Prokariotų iniciatorinės trnr akceptorinio stiebo pirmoji nukleotidų pora yra ne Votsono-Kriko tai užtikrina iniciacijos veiksnio IF-2 prijungimą. Didžiule struktūrine įvairove pasižymi eukariotų organelių mitochondrijų trnr. Kai kuriose mitochondrijų trnr vietoje T arba D stiebo yra viengrandinės sritys. Šių molekulių erdvinė stuktūra dar nėra eksperimentiškai nustatyta. Tretinė trnr struktūra m. Maiklas Levitas (Michael Levitt), palyginęs keliolikos trnr molekulių nukleotidų sekas, pasiūlė teorinį erdvinės trnr struktūros modelį. Šis modelis nebuvo tikslus, tačiau tai buvo pirmasis bandymas susieti RNR molekulės struktūrą su jos biologine funkcija. trnr molekulės erdvinė struktūra buvo išaiškinta 1974 m. atlikus mielių trnr Phe molekulės kristalo rentgenostruktūrinę analizę. Tretinė trnr struktūra, kuri susidaro tirpale tarpusavyje sąveikaujant anksčiau minėtiems antrinės struktūros elementams, yra apverstos L raidės pavidalo (2.29 pav., b). Ši struktūra, taip pat kaip ir antrinė struktūra, yra būdinga visoms trnr molekulėms, nors jų nukleotidų sekos skiriasi pav. Pernašos RNR molekulių antrinė ir tretinė struktūros. trnr antrinė dobilo lapo formos struktūra. Pagrindiniai trnr molekulės struktūriniai elementai kilpos ir stiebai pažymėti; konservatyvūs nukleotidai, aptinkami visose trnr molekulėse, pažymėti apskritimais; ištisinės linijos jungia heterociklines bazes, kurioms yra būdinga tarpusavio sąveika susidarant tretinei trnr struktūrai (a); trnr tretinė struktūra (b) ( 61

62 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Tretinėje struktūroje trnr molekulės akceptorinis stiebas ir T kilpa sudaro vieną trnr erdvinės struktūros rankos formos elementą, o D kilpa ir antikodono kilpa panašiai sudaro kitą ranką. Abi rankos šioje trnr struktūroje yra ~ 60 Å ilgio, jos tarpusavyje sudaro ~ 90 kampą. Du labai svarbūs trnr molekulės funkciniai centrai antikodonas ir akceptorinis stiebas yra priešingose trnr erdvinės struktūros pusėse, juos skiria 7,5 8 nm. trnr molekulės erdvinė struktūra susidaro tirpale dėl vandenilinių ryšių tarp įvairiose trnr molekulės srityse esančių heterociklinių bazių (ne Votsono-Kriko). Tretinę trnr molekulių struktūrą stabilizuoja netipiškos sąveikos tarp heterociklinių bazių. Dauguma trnr konservatyvių ir pusiau konservatyvių nukleotidų heterociklinių bazių, esančių molekulės antrinės struktūros kilpose (D, V ir TyC) bei stiebuose, dalyvauja šiose netipiškose sąveikose. Pvz., sąveika tarp konservatyvių U8 ir A14 bei 9-oje ir 23-ioje padėtyse esančių purinų heterociklinių bazių lemia staigų posūkį nuo akceptorinio stiebo link D stiebo trnr molekulės erdvinėje struktūroje. Tai užtikrina tolesnį molekulės erdvinės struktūros formavimąsi (2.29 pav., a b). Pernašos RNR molekulių spiralių elementuose dažna netipiška bazių pora yra G-U (2.29 pav., a), kuri skiriasi nuo Votsono-Kriko bazių porų savo savybėmis. Dėl jų G-U bazių pora yra dažnas su RNR sąveikaujančių baltymų taikinys. Pvz., G-U pora, esanti trnr Ala molekulės akceptoriniame stiebe, yra vienas pagrindinių atpažinimo signalų fermentui aminoacil-trnr sintetazei jungti prie trnr aminorūgštį alaniną. Kitos netipiškos bazių poros, aptinkamos trnr molekulėse (taip pat ir kitose RNR molekulėse), yra Hugstyno sąveikos tarp A-U (2.30 pav.) heterociklinių bazių. Pernašos RNR bei kitose RNR molekulėse susidaro sąveikų tarp trijų heterociklinių bazių. Šios sąveikos yra labai svarbios tretinei molekulių struktūrai susidaryti ir palaikyti. trnr A23 heterociklinė bazė molekulės D stiebe sudaro Votsono-Kriko porą su U12 ir dar Hugstyno bazių porą su A9 (2.29 pav., a). Tokia sąveika stabilizuoja staigų išlinkimą tarp akceptorinio ir D stiebų. Kita panaši sąveika tarp C13, G22 ir G46 jungia D stiebą su V kilpa ir dalyvauja stekingo sąveikose molekulės tretinėje struktūroje pav. Netipiška G-U ir Hugstyno A-U sąveika tarp RNR heterociklinių bazių 62

63 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Stekingo sąveika tarp heterociklinių bazių trnr molekulės viduje yra labai svarbi molekulės tretinei struktūrai. Šioje sąveikoje dalyvauja iki 90 % trnr molekulės heterociklinių bazių. Molekulėje susidaro vadinamasis stiebų stekingas (angl. coaxial stacking). Stiebų stekinge dalyvauja keli dvigrandiniai spiralės pavidalo RNR fragmentai, išsidėstę vienas išilgai kito. Pvz., trnr akceptorinis stiebas, kurį sudaro 7 nukleotidų poros, dalyvauja stiebų stekinge su 5 nukleotidų porų T stiebu, o D stiebas su antikodono stiebu (2.29 pav., b). Dėl stekingo sąveikos į trnr molekulės vidų beveik nepatenka tirpalo molekulės, tačiau jos funkciniai centrai, pvz., antikodono kilpa ir akceptorinis stiebas, yra greitai pasiekiami su jais sąveikaujančių molekulių. Pernašos RNR molekulės transkripcijos metu susintetinamos kaip pre-trnr molekulės, kurios yra gerokai ilgesnės nei funkcionalios subrendusios trnr. Brendimo metu yra šalinamos ir įterpiamos nukleotidų sekos, modifikuojami nukleotidai (žr. skyrių RNR brendimas ) Ribosominių RNR antrinė ir tretinė struktūra Baltymų biosintezė visuose organizmuose vyksta ribosomose. Ribosomos yra labai sudėtingi nukleoproteinai nekovalentiniais ryšiais sąveikaujančių baltymų ir ribosominių RNR (rrnr) kompleksai. Du trečdalius ribosomų masės sudaro rrnr. Prokariotų ribosomų sudėtyje yra trijų tipų rrnr: 16S rrnr, 23S rrnr ir 5S rrnr. Eukariotų ribosomų sudėtyje 18S rrnr, 28S rrnr, 5,8S rrnr ir 5SrRNR. rrnr molekulės taip buvo pavadintos pagal jų sedimentavimo greičius (matuojamus svedbergais, S), nustatytus centrifuguojant druskų tankio gradiente ųjų pabaigoje palyginus kelių organizmų rrnr nukleotidų sekas, buvo pasiūlytos 5S, 16S ir 23S rrnr molekulių antrinės struktūros, kurios vėliau buvo patvirtintos daugelio laboratorijų tyrimais naudojant biocheminius bei kitus eksperimentinius metodus. Visų gyvybės domenų organizmų rrnr molekulių antrinės bei tretinės struktūros pasižymi dideliu konservatyvumu, nors pačių rrnr molekulių dydžiai ženkliai skiriasi. Pvz., bakterijų 16S rrnr bei jų analogų eukariotuose ilgis svyruoja nuo 620 iki daugiau nei nukleotidų, o bakterijų 23S rrnr bei jų eukariotų analogų nuo (tripanosomų mitochondrijose) iki daugiau nei nukleotidų (žmogaus ląstelėse). rrnr ilgių įvairovę lemia įsiterpusios nukleotidų sekos (angl. expansion elements), kurios dažniausiai išsidėsčiusios nekonservatyviuose rrnr molekulių struktūros elementuose ir gali siekti iki 900 nt. Ribosominių RNR antrinėje struktūroje gausu dvigrandinių fragmentų, turinčių nesuporuotų viengrandinių sričių, kilpų. Dėl tokių struktūros ypatumų rrnr molekulės įgyja labai sudėtingą tretinę struktūrą, kuriai dar papildomai daro įtaką sąveika su baltymais, vandens molekulėmis ir metalų jonais. Ribosominių RNR erdvinės struktūros šiuo metu pakankamai tiksliai aprašomos kompiuteriniais metodais, remiantis įvairių konformacijų laisvosios energijos termodinaminiais duomenimis, lyginamąja (filogenetine) rrnr sekų analize, kristalografinės analizės duomenimis. Pvz., lyginamoji nukleotidų sekų analizė remiasi principu, kad rrnr, kurių nukleotidų sekos yra panašios, pasižymi panašia antrine bei tretine struktūra. Konservatyvūs rrnr molekulių antrinės struktūros elementai sudaro universalią šerdį, būdingą tiek citozolio, tiek ir organelių (mitochondrijų, chloroplastų) rrnr. Ribosominių RNR erdvinei struktūrai būdingi beveik visi RNR erdvinės struktūros elementai. 63

64 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Pvz., E. coli 16S rrnr turi 45 dvigrandines sritis spirales. 16S rrnr antrinėje struktūroje yra keturi struktūriniai domenai: trys dideli (5 domenas, centrinis domenas, 3 didysis domenas) ir vienas mažesnis 3 mažasis domenas (2.31 pav., a). Manoma, kad kiekvienas domenas įgyja erdvinę struktūrą nepriklausomai. 16S rrnr molekulės labiausiai konservatyvios sritys yra išsidėsčiusios 24 spiralės kilpoje, 44 spiralės viršutinėje dalyje ir 18 spiralėje. Visos sritys yra labai svarbios 16S rrnr funkcijai: 24 spiralė dalyvauja ribosomos subvienetų sąveikoje, 44 spiralė yra ribosomos iškodavimo centro dalis (2.31 pav., a b), 18 spiralė dalyvauja susidarant funkciškai svarbiai pseudomazgo struktūrai pav. Bakterijos Thermus thermophilus 16S rrnr antrinė ir tretinė struktūros. 16S rrnr antrinė struktūra. Pagrindiniai molekulės domenai pažymėti. 44 spiralė yra išsidėsčiusi mažojo ir didžiojo ribosominių subvienetų sąlyčio paviršiuje (a); 16S rrnr tretinė struktūra, nustatyta rentgenostruktūrine analize. Parodyti ribosomos mažojo subvieneto struktūriniai elementai ir iškodavimo centras (b) (Nature, v. 407, p. 327, 2000) 23S rrnr molekulės antrinėje struktūroje labiausiai konservatyvūs yra apie 100 dvigrandinių spiralės pavidalo fragmentų, kurie organizuoti į šešis didelius I VI domenus (2.32 pav., a b). Molekulės V domene yra daugelis konservatyvių nukleotidų, kurie sudaro ribosomos peptidiltransferazės centrą (žr. skyrių Baltymų biosintezė ). VI domene (95 spiralė) yra konservatyvūs vadinamosios sarcino-ricino kilpos nukleotidai. Šioje srityje ribosomoje prisijungia transliacijos veiksniai EF-G ir EF-Tu. Mažiausios tarp rrnr yra 120 nt 5S rrnr molekulės, kurios yra labai konservatyvios visuose organizmuose. 5S rrnr antrinę struktūrą sudaro 5 dvigrandiniai spiraliniai fragmentai (2.32 pav., c). Tiksli tretinė rrnr molekulių struktūra buvo išaiškinta pastaraisiais metais, atlikus didelės skyros ribosomų bei ribosomos subvienetų rentgenostruktūrinę analizę. rrnr molekulių tretinės struktūros susidaro dėl heterociklinių bazių tarpusavio sąveikos ir stekingo sąveikos. Dalis 64

65 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.32 pav. Archėjos Haloarcula marismortui 23S rrnr ir 5S rrnr antrinė ir tretinė struktūros. 23S rrnr antrinė struktūra. I VI domenai pažymėti skirtingomis spalvomis (a); 5S rrnr antrinė struktūra (b); 23S rrnr kartu su 5S rrnr tretinė struktūra, nustatyta 2,4 Å skyros rentgenostruktūrine analize. 23S rrnr domenų spalvos atitinka pavaizduotąsias a dalyje (c) ( index.php/large_ribosomal_subunit_of_haloarculahttp:// Large_Ribosomal_Subunit_of_Haloarcula) 65

66 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA rrnr heterociklinių bazių sudaro Votsono-Kriko sąveikas ir formuoja A tipo RNR spirales. Kita dalis bazių sąveikų rrnr tretinėje struktūroje yra netipiškos: tai Hugstyno sąveikos, taip pat G-A, A-A, U-U sąveikos. Sąveikaujant netipiškoms bazių poroms, RNR molekulėse susidaro papildomos sąveikos, pvz., vandeniliniai ryšiai tarp ribozės-fosfatų karkasų, tarp ribozės-fosfatų ir heterociklinių bazių, sąveika tarp trijų bazių porų. Būdinga, kad tokiose sąveikose dalyvauja ne viena bazių pora, o kelios heterociklinių bazių poros, vadinamieji RNR motyvai. Šie motyvai, manoma, yra universalūs didelių RNR molekulių tretinės struktūros elementai pav. A minoriniai motyvai archėjos Haloarcula marismortui 23S rrnr molekulėje. Sąveika tarp IV domeno 68 spiralės (ji dalyvauja formuojant ribosomos aktyvųjį centrą) ir V domeno 75 spiralės. Keturios 68 spiralės adenino heterociklinės bazės sąveikauja su 75 spiralės mažuoju grioviu (a); sąveika tarp rrnr 52 ir 66 kilpų (b); sąveika tarp spiralių viengrandinės srities adeninų ir 89 bei 90 spiralių (c) (PNAS, v. 98, p. 4899, 2001) Gana paplitęs didelių RNR molekulių tretinės struktūros elementas yra vadinamasis A minorinis motyvas (2.33 pav., a c). Jis pirmą kartą nustatytas plaktuko galvos (angl. hammerhead) ribozime ir I grupės intronų P4 P6 domene (žr. skyrių RNR brendimas ). Šis erdvinės struktūros elementas susidaro sąveikaujant nesuporuotai ir išstumtai iš antrinės struktūros adenine heterociklinei bazei su Votsono-Kriko bazių pora RNR spiralėje iš jos mažojo griovio pusės. Jeigu yra ne vienas, o daugiau nesuporuotų adeninų, susidaro keletas tokio tipo sąveikų. Adeninas labai tiksliai įsiterpia į RNR mažąjį griovį. rrnr molekulių tretinei struktūrai susidaryti svarbios ir vandens molekulės bei metalų jonai. Didieji 16S rrnr domenai ribosomoje išsidėsto atskirai vienas nuo kito ir formuoja ribosomos 30S subvieneto dalis: galvą, kūną, platformą. Mažasis 3 domenas sudaro ilgą RNR spiralę (44 spiralė), kuri yra ribosomos 30S ir 50S subvienetų sąlyčio paviršiuje (2.31 pav., b). Kitaip nei tretinėje 16S rrnr struktūroje, 23S rrnr molekulėje šeši antrinės struktūros domenai sudaro labai kompaktišką vienalytę struktūrą. 5S rrnr išsidėsto 23S rrnr išorėje (2.32 pav., c). 66

67 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Kataliziškai aktyvios RNR (ribozimai) Ilgai manyta, kad tik baltymai gali pasižymėti katalizinėmis funkcijomis. Baltymų molekulės gali įgyti erdvinę struktūrą, gerai pritaikytą prijungti substratą ir turinčią aktyvųjį centrą cheminei reakcijai vykti. Tačiau pasirodė, kad ir tam tikros RNR molekulės gali įgyti sudėtingą erdvinę struktūrą, formuoti aktyvųjį centrą ir pasižymėti katalizinėmis savybėmis. Tokios RNR vadinamos ribozimais m. Tomas Čechas (Thomas Cech) su kolegomis tyrinėjo pirmuonies Tetrahymena thermophila rrnr pirmtako brendimą. Pirmtako genas koduoja didelį > 400 nt introną. Nuo geno in vitro buvo susintetinta pirmtako RNR, mokslininkai ketino išsiaiškinti, kokie Tetrahymena baltymai reikalingi pirmtako brendimui. Didelei jų nuostabai, netrukus paaiškėjo, kad intronas iš susintetinto rrnr pirmtako išsikirpo savaime, o likusios RNR molekulės dalys buvo sujungtos reakcijoje be jokių baltymų. Reakcijai vykti reikėjo tik paties pirmtako su intronu, Mg 2+ jonų ir koveiksnio guanozino. Tetrahymena rrnr pirmtako intronas susilankstė į erdvinę struktūrą, kurioje veiksmingai vyko introno išsikirpimo ir likusių dalių (egzonų) sujungimo reakcijos. Plačiau apie šį ribozimą skaitykite skyriuje RNR brendimas. Panašiu metu (1983 m.) Sidnis Altmanas (Sidney Altman) su kolegomis po ilgų tyrinėjimų metų nustatė, kad E. coli ribonukleazė P taip pat yra ribozimas. Bakterijų ribonukleazę P sudaro RNR (M1 RNR) molekulė ir baltymo (C5) molekulė, o kataliziniu aktyvumu pasižymi būtent RNR. Tolesni tyrimai atskleidė, kad ribonukleazė P yra gyvybiškai svarbi molekulė visų gyvybės domenų organizmuose. Su retomis išimtimis, ji dalyvauja bakterijų, archėjų, eukariotų trnr pirmtakų brendimo procese skelia pre-trnr molekulių 5 gale esančią lyderinę seką (žr. skyrių RNR brendimas ). Didžioji dauguma gamtinių ribozimų skelia fosfodiesterinius ryšius RNR molekulėse. Išimtis yra ribosoma, kur 23S rrnr katalizuoja kitokią cheminę reakciją peptidinio ryšio susidarymą. Ribozimai kataliziškai aktyvios RNR molekulės, kurių aktyvųjį centrą išimtinai sudaro RNR. Gamtinių ribozimų nėra daug (2.7 lentelė). Erdvinis RNR susilankstymas yra esminė ribozimų katalizinio aktyvumo sąlyga. Metalo jonai svarbūs RNR susilankstymui ir kai kurių ribozimų kataliziniam aktyvumui. Vis dėlto nors visų ribozimų kataliziškai aktyvus komponentas yra RNR, daugumos jų, išskyrus mažus ribozimus, aktyvumui in vivo pasireikšti reikia baltymų, tad ribozimų molekulės funkcionuoja kaip nukleoproteinai. Įdomus ribozimų pavyzdys yra maži save skeliantys ribozimai. Yra žinomi penki skirtingų struktūrų maži ribozimai: plaktuko galvos (angl. hammerhead), plaukų segtuko (angl. hairpin), VS (angl. Varkud satellite), HDV (angl. hepatitis delta virus) ir keli ribozimai, esantys bakterijų ir eukariotų irnr sudėtyje (2.7 lentelė). Plaktuko galvos ir plaukų segtuko ribozimų yra infekcinių agentų viroidų ir virusoidų RNR sudėtyje. Viroidai yra viengrandinės žiedinės RNR molekulės, funkcionuojančios be baltymų kapsidės. Viroidų RNR nekoduoja baltymų ir irnr. Viroidai infekuoja augalus ir sukelia jų ligas. Jie replikuojasi ląstelių branduolyje ir chloroplastuose, jų patogenezės mechanizmas nėra iki galo išaiškintas. Viroidų RNR dauginama besisukančio rato (angl. rolling circle) principu (2.34 pav., c). Kaip matricą naudojant viroido RNR (+ (plius) grandinė), besisukančio rato mechanizmu, pasitelkiant ląstelės šeimininkės baltymus, kopijuojama komplementari RNR grandinė ( (minus) grandinė). Susidaro linijinė RNR, kurioje yra viroido genomo kopijos. Kiekvienoje kopijoje susiformuoja nedidelis kataliziškai aktyvus plaktuko galvos ribozimas, kuris 67

68 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA skelia RNR. Susidaro linijinė molekulė (5 OH viename molekulės gale ir 2-3 ciklofosfatas kitame), kuri sujungiama (2.34 pav., c). Taip susidaro viengrandinės žiedinės viroido RNR kopija, kuri toliau taip pat gali būti kopijuojama besisukančio rato mechanizmu. Plaktuko galvos ribozimo molekulė susilanksto į savitą erdvinę struktūrą, kurioje yra trys RNR spiralės, o struktūra primena T raidę. Kataliziškai aktyvią ribozimo šerdį sudaro ~ 58 nukleotidai (2.34 pav., a b). Ribozimo aktyvumui itin svarbi sąveika tarp pupso I stiebe ir kilpos II stiebe ji stabilizuoja aktyvųjį centrą, kuriame tiksliai išdėstoma skėlimo vieta (С17 nukleotidas, 2.34 pav., a b) pav. Viroidų plaktuko galvos ribozimas ir jo vaidmuo viroido RNR replikacijoje. Plaktuko galvos ribozimo antrinė struktūra (a); plaktuko galvos ribozimo tretinė struktūra. Punktyrinės linijos žymi svarbias sąveikas tretinėje struktūroje. Raudonai nuspalvinti nukleotidai yra arti skėlimo vietos, geltonai nukleotidai, svarbūs katalizei (b) (Nature Reviews Genetics, v. 8, p. 778, 2007); viroido RNR replikacija besisukančio rato mechanizmu. Plaktuko galvos ribozimo struktūra, susidaranti viroido RNR. Ribozimas ir skėlimo vieta (pažymėta trikampiu) parodytos (c) Virusoidai (dar vadinami satelitine RNR) yra panašiai funkcionuojančios RNR, tačiau jos yra augalų virusų (pvz., tabako žiediškosios dėmėtligės viruso) sudėtyje, supakuotos viruso genome, ir jų replikacija priklauso nuo viruso replikacijos. Virusoidų RNR sudėtyje yra plaukų segtuko ribozimas, kurio erdvinės struktūros pagrindą sudaro keturi dvigrandiniai stiebai. Ribozimas funkcionuoja panašiai kaip ir viroidų plaktuko galvos ribozimas: skelia virusoido RNR kopijas, kai vyksta replikacija besisukančio rato mechanizmu. HDV ribozimas yra vienintelis žinomas ribozimas žmogaus ląsteles infekuojančioje satelitinėje RNR. HDV RNR yra žmogaus hepatito B viruso satelitinė RNR. Jai esant, pasireiškia itin sunki hepatito forma nt ilgio žiedinėje viengrandinėje RNR ribozimas sudaro 85 nt. Ribozimas susilanksto į savitą kataliziškai aktyvią dvigubo pseudomazgo struktūrą. 68

69 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.7 lentelė. Gamtiniai ribozimai ir jų savybės 4 Ribozimų klasė Save skeliantys Grupė Satelitinė RNR Nariai Plaktuko galvos Plaukų segtuko Pagrindinė funkcija Skeliantys ribozimai Replikacija besisukančio rato mechanizmu Genų raiškos valdymas Dydis (nukleotidais) Paplitimas 65 Viroidai, augalų virusų satelitinė RNR, eukariotai 75 Augalų virusų satelitinė RNR VS 155 Neurospora spp., mitochondrijų satelitinė RNR HDV 85 Žmogaus viruso satelitinė RNR irnr CoTC Transkripcijos 190 Beždžionės ir žmogus terminacija CPEB3 Splaisingo valdymas 70 Žinduoliai glms Genų raiškos valdymas 170 Gram teigiamos bakterijos Trans skeliantys RNazė P trnr brendimas Prokariotai ir eukariotai Splaisingo ribozimai I grupė II grupė Splaisosoma (U2 ir U6 snrnr) Ribosoma (23 S rrnr) Introno savaiminis išsikirpimas Introno savaiminis išsikirpimas Kiti Pre-iRNR, turinčių intronų, splaisingas Peptidiltransferazinė reakcija Organelės (augalai, pirmuonys, grybai), bakterijos, bakteriofagai, gyvūnų mitochondrijos Organelės (augalai, pirmuonys, grybai), bakterijos, archėjos 100; 180 Eukariotai Prokariotai, eukariotai VS ribozimas yra ~ 150 nt ilgio ribozimas, esantis RNR molekulėje, kuri kopijuojama nuo Neurospora crassa mitochondrijų plazmidės. Įdomus yra gram teigiamose bakterijose aptinkamo glms ribozimo veikimas. Fenomenas buvo aptiktas Bacillus genties bakterijose. Ribozimas yra glms geno irnr molekulės sudėtyje. glms genas koduoja fermentą glutamino fruktozės 6-fosfato amidotransferazę. Fermentas katalizuoja reakciją, kurios metu iš fruktozės 6-fosfato ir glutamino sintetinamas glukozamino 6-fosfatas (Glc6P), reikalingas peptidoglikano bakterijų sienelės komponento sintezei (2.35 pav., a). Ribozimas yra glms irnr netransliuojamoje 5 dalyje. Kai ligando Glc6P yra, jis prisijungia ribozimo aktyviajame centre, ribozimas įgyja kataliziškai aktyvią struktūrą (joje susidaro keli dvigubi pseudomazgai), vyksta glms irnr skėlimas (2.35 pav., b c). Išaktyvinus irnr, fruktozės 6-fosfato amidotransferazės biosintezė sustabdoma, kartu sustabdoma ir Glc6P sintezė. Kai Glc6P trūksta, glms irnr esantis ribozimas nėra aktyvus, irnr neskaidoma, vėl vyksta glms irnr sintezė, gaminamas Glc6P. Taigi, Bacillus glms ribozimas yra valdomas metabolito Glc6P. Ribozimas ypatingas dar ir tuo, kad jis kartu veikia ir kaip nuo ligando priklausomas ribojungiklis glms irnr esančio ribozimo struktūra pakinta ir gali daryti įtaką glms irnr raiškai tik prisijungus ligandui. 4 Pagal: Nature Reviews Genetics, v. 8, p. 777,

70 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.35 pav. Bacillus athracis glms ribozimo struktūra ir veikimas. glms irnr raiškos schema. Ribozimą koduojanti dalis glms irnr 5 dalyje pažymėta raudonai (a); glms ribozimo antrinė struktūra (b); glms ribozimo tretinė struktūra. Raudonuose apskritimuose parodytas ligandas GlcN6P ir glms irnr skėlimo vieta; punktyrinės linijos žymi svarbias sąveikas tretinėje struktūroje (c) (Nature Reviews Genetics, v. 8, p. 778, 2007) Ribojungikliai Didelė RNR molekulių struktūrų įvairovė lemia jų funkcijų įvairovę. Bakterijose kai kurių irnr molekulių, koduojančių baltymus, 5 netransliuojamose dalyse rasti RNR domenai, sąveikaujantys su mažomis molekulėmis ligandais ir galintys keisti irnr raišką. Tokios RNR vadinamos ribojungikliais. Daugelis žinomų ribojungiklių valdo genų raišką transkripcijos ateniuacijos mechanizmu arba slopina transliacijos iniciaciją. Tam tikrose bakterijose ribojungikliai valdo pakankamai didelę genų dalį. Ribojungikliai, reguliuojantys irnr splaisingą ir stabilumą, rasti grybuose ir augaluose. Vieną ribojungiklio glms, kuris veikia ir kaip ribozimas, pavyzdį ką tik aptarėme. Ribojungiklių veikimo mechanizmas paremtas alternatyvių ribojungiklio konformacijų susidarymu, prie jų konservatyvių sričių prisijungus metabolitui. Ribojungikliai tai RNR molekulės, kurių struktūra pasikeičia, prie jų prisijungus reguliacinėms molekulėms. 70

71 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Ribojungiklius sudaro dvi dalys aptameras (angl. aptamer), prie kurio atrankiai jungiasi reguliacinė molekulė (2.36 pav.), ir raiškos platforma (angl. expression platform) už aptamero esanti RNR dalis, kuria valdoma geno raiška (2.36 pav.). Aptameras (< 100 nt) gali įgyti alternatyvias erdvines struktūras priklausomai nuo to, ar prie jo yra prisijungęs ligandas ar ne, kartu kintant raiškos platformos struktūrai, kuria valdoma geno raiška. Genai, kurių raiška valdoma pasitelkiant ribojungiklius, dažnai koduoja to paties metabolito, kuris sąveikauja su ribojungikliu, biosintezės ar pernašos baltymus. Prisijungus metabolitui prie ribojungiklio, transkripcija stabdoma ir tokiu būdu slopinama geno produkto (-ų), sintetinančio (-ių) metabolitą, raiška. Slopinimas vyksta stabdant transkripciją arba slopinant susintetinto transkripto irnr transliacijos iniciaciją. Retais atvejais ribojungikliai įjungia transkripciją pav. Tiamino pirofosfatu valdomo ribojungiklio veikimo schema (Annual Review Microbiology, v. 59, p. 487, 2005) 2.36 pav. parodyta metabolitu tiamino pirofosfatu (TPP) valdomo bakterijų ribojungiklio struktūra ir veikimas. TPP valdomų ribojungiklių yra bakterijose, archėjose, kai kuriuose eukariotuose. Jei nėra prisijungusio ligando (TPP), bakterijų geno irnr, kurios 5 gale yra ribojungiklio struktūra, yra transliuojama, nes ribosomų prisijungimo vieta, RBS (angl. ribosome binding site), yra prieinama ribosomoms. TPP atrankiai jungiasi prie ribojungiklio aptamero. Prisijungimas keičia aptamero struktūrą, keičiasi ir raiškos platformos struktūra. Raiškos platformoje esanti ribosomų prisijungimo sritis susilanksto į antrinę struktūrą ir tampa neprieinama ribosomoms. Transliacija stabdoma. Iš viso žinoma apie 10 ribojungiklių klasių. Reguliacinės molekulės, kurios jungiasi prie ribojungiklių aptamerų, gali būti metabolitai aminorūgštys, heterociklinės bazės, kofermentai. Ribojungiklių aptamero dalis susilanksto į labai savitą erdvinę struktūrą, kurioje yra ligando prisijugimo kišenė (angl. pocket). Yra žinoma ribojungiklių, prie kurių jungiasi metalų jonai, taip pat ribojungiklių, valdomų temperatūra (RNR termometrai), ph, kitų mažų RNR, trnr (2.8 lentelė). 71

72 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.8 lentelė. Gamtiniai ribojungikliai ir jų savybės 5 Ribojungiklių klasė Grupė Narys Pagrindinė funkcija Gamtinis ligandas Dydis (nukleotidais) Paplitimas RNR termometrai Temparatūra valdomi - Įvairus Bakteriofagai, bakterijos, eukariotai srnr Mažos RNR > 85 Bakterijos T dėžutės trnr 190 Bakterijos Metabolitais valdomi Kofermentais TPP* TPP* 100 Bakterijos, archėjos, eukariotai (grybai ir augalai) ribojungikliai valdomi FMN* FMN* 120 Bakterijos Ado-Cbl* AdoCbl* 200 Bakterijos SAM*-I SAM* 105 Gram teigiamos bakterijos SAM*-II SAM* 60 a ir b proteobakterijos SAM*-III Genų SAM* 80 Gram neigiamos bakterijos Aminorūgštimis valdomi valdymas Lizino raiškos Lizinas 175 g proteobakterijos, Thermotogales, Firmicutes valdomi Glicino Glicinas 110 Bakterijos valdomi Heterociklinėmis Guanino valdomi Guaninas, hipoksantinas 70 Gram teigiamos bakterijos bazėmis Adenino Adeninas 70 Bakterijos valdomi valdomi Pre-Q* valdomi Pre-Q* 35 Bakterijos Mg valdomi ribojungikliai mgta Mg Gram neigiamos bakterijos *Ado-Cbl adenozino kobalaminas; FMN flavino mononukleotidas; pre-q pre-kuezinas; SAM S-adenozilmetioninas; TPP tiamino pirofosfatas. Daugelio Bradyrhizobium japonicum ir kitų Rhizobia genties bakterijų temperatūrinio streso genų raiška valdoma pasitelkiant konservatyvų RNR elementą ROSE (angl. repression of heat shock gene expression). ROSE yra temperatūrai jautrus ribojungkilis RNR termometras. Ribojungiklio struktūra jautri temperatūros pokyčiams 30 40ºС intervale. Esant žemesnei temperatūrai, irnr transliacijos iniciacija slopinama dėl susidariusios antrinės struktūros transkripte. Esant aukštesnei temperatūrai, antrinė struktūra suyra, ir irnr tampa prieinama transliacijai. Panašiu būdu yra valdoma E. coli temperatūrinio streso savitojo transkripcijos veiksnio, s 32 (RpoH), sintezė Genomai 1970 m. Karlas Vosė (Carl Woese) su kolegomis palygino įvairių eukariotų ir prokariotų 16S rrnr nukleotidų sekas. Šios molekulės yra vieni esminių ribosomos struktūrinių ir funkcinių komponentų, jų nukleotidų sekos evoliucionuoja lėtai. Todėl buvo padaryta prielaida, kad or- 5 Pagal: Nature Reviews Genetics, v. 8, p. 777,

73 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA ganizmai, kurių 16S rrnr nukleotidų sekos panašesnės, yra evoliuciškai artimesni. Remdamiesi 16S rrnr sekomis, mokslininkai sudarė organizmų filogenetinius medžius. Paaiškėjo, kad prokariotai sudarė dvi pagrindines šakas vienoje buvo įprastos bakterijos, o kitoje mikroorganizmai, gyvenantys ekstremaliomis sąlygomis. Ši grupė buvo pavadinta archėjomis. Archėjų 16S rrnr analizė atskleidė, kad jos labiau panėšėja į eukariotus nei į prokariotus. Ištobulėjus DNR sekoskaitos metodams, nustatytos tūkstančių organizmų genomų sekos. Aiškėja, kad genomų dydžiai ir jų koduojamų genų skaičius organizmuose labai skiriasi (2.37 pav., 2.9 lentelė) pav. Įvairių organizmų genomų dydžiai ir baltymus koduojančių genų skaičius (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) Genomus pagal jų dydį galima suskirstyti į dvi grupes: z mažus virusų, archėjų, bakterijų (< 10 Mb) ir vienaląsčių eukariotų (< 20 Mb) genomus; didžiają jų dalį sudaro baltymus ir RNR koduojantys genai; z didelius daugialąsčių eukariotų ir kai kurių vienaląsčių eukariotų (> 100 Mb) genomus; didžioji dalis genomo nukleotidų sekų yra genų nekoduojančios sekos. Tačiau šie dėsningumai turi nemažai nukrypimų. Pvz., milžiniško amebą infekuojančio mimiviruso genomo dydis yra 1,2 Mb ir prilygsta vidutinio bakterijos genomo dydžiui, o simbiontinė bakterija Carsonella rudii turi tik ~ 200 genų. Žmogaus genomas nėra pats didžiausias tarp eukariotų, didesnius genomus turi kai kurie augalai, pirmuonys. Taigi, nėra tiesioginės priklausomybės tarp genomo dydžio ir organizmo fenotipo sudėtingumo. Tai yra vadinamasis C kiekio paradoksas. C (angl. constant) kiekis yra organizmo haploidinio genomo DNR kiekis, dažniausiai išreiškiamas pikogramais. 73

74 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.9 lentelė. Kai kurių organizmų genomų dydis ir genų skaičius Organizmas Rūšis Genomo dydis (nukleotidų porų skaičius) Carsonella rudii Bakterija Escherichia coli Bakterija Pyrococcus horikoshii Archėja Saccharomyces cerevisiae Mielė Caenorhabditis elegans Kirmėlė Arabidopsis thaliana Vairenis Drosophila melanogaster Vaisinė muselė Genų skaičius Gallus gallus Viščiukas ~ Homo sapiens Žmogus ~ Mus musculus Pelė ~ Pan troglodytes Šimpanzė ~ Pinus resinosa Pušis ~ Amoeba dubia Ameba Nenustatyta Nustačius daugelio organizmų genomų nukleotidų sekas paaiškėjo, kad didžioji dalis eukariotų genomo sudaro įvairios pasikartojančios sekos, kilusios iš judriųjų elementų, pvz., transpozonų. Žmogaus genome tik ~ 40 % genomo koduoja genus ir į genus panašias sekas, iš jų ~ 2 % genų koduoja baltymus, likę ~ 38 % mažas nekoduojančias RNR, genų fragmentus, intronus, netransliuojamąsias sritis (angl. untranslated regions, UTRs), pseudogenus. Pseudogenai yra DNR sekos, panašios į tikrus genus, tačiau pakitusios taip, kad jų raiška nevyksta. Likusi žmogaus genomo dalis (~ 60 %) yra tarp genų esančios DNR sekos tarpgeninės sritys. Sekose yra unikalių, taip pat mažai pasikartojančių sekų ir vidutiniu dažniu bei dažnai pasikartojančių sekų. Kai kurių eukariotų genomai yra kompaktiškesni, pvz., viščiuko genome tik 10 % sekų yra pasikartojančios. 74

75 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.2. Baltymų molekulinė struktūra Mikroskopu žiūrėdami į ląstelę ar tirdami jos biocheminį aktyvumą, mes iš tikrųjų tiriame baltymus. Baltymai sudaro didesniąją dalį sausosios ląstelių masės. Baltymai (angl. protein, kilęs iš gr. proteios pirmas, ypatingos svarbos ) yra biologinės makromolekulės, pasižyminčios daugybe funkcijų. Tipinė žinduolių ląstelė turi ~ baltymų, atliekančių skirtingas funkcijas. Baltymai dalyvauja visuose biologiniuose procesuose. Savitieji baltymai fermentai labai greitina metabolines reakcijas; struktūriniai baltymai sukuria mechaninę ląstelių atramą jų viduje ir paviršiuje, ryšius tarp ląstelių; baltymai hormonai, augimo veiksniai ir genų veiklą valdantys baltymai atlieka valdymo funkcijas. Būdami membranų receptoriais ir nešikliais, baltymai lemia, į ką reaguos ląstelė, kokios medžiagos į ją paklius ir iš jos išeis. Antikūnai ir toksinai taip pat yra baltymai. Kaip vieno tipo makromolekulės gali atlikti tiek skirtingų funkcijų? Šią savybę lemia tai, kad baltymai gali būti įvairiausių struktūrų. Cheminiu požiūriu baltymai yra sudėtingiausios struktūros ir įvairiausių funkcijų žinomos molekulės. Jas baltymų molekulės įgijo per milijonus evoliucijos metų. Kiekvienas konkretus baltymas pasižymi savita struktūra, kuri lemia baltymo funkciją ląstelėje. Savitos struktūros baltymai labai atrankiai (specifiškai) sąveikauja su kitomis biologinėmis molekulėmis. Atranki sąveika su kitomis molekulėmis yra esminė baltymų savybė. Pvz., fermentas restrikcijos endonukleazė NotI atrankiai sąveikauja su savita aštuonių nukleotidų seka DNR molekulėje ir ją skelia, tačiau ignoruoja kitas aštuonių nukleotidų kombinacijas DNR sekoje! Baltymą sudaro vienas ar daugiau linijinių polimerų polipeptidų. Polipeptiduose aminorūgštys viena su kita yra sujungtos peptidiniais ryšiais. Aminorūgštys, esančios polipeptidų sudėtyje, vadinamos aminorūgščių liekanomis. Baltymai yra linijiniai polimerai, sudaryti iš monomerų aminorūgščių. Kiekvienas baltymas turi savitą aminorūgščių seką. Aminorūgščių kiekis, jų savybės ir seka lemia baltymo savybes Aminorūgščių savybės Gamtoje aptinkama ~ 700 skirtingų aminorūgščių, tačiau visų organizmų (virusų, bakterijų, augalų, gyvūnų) baltymai sintetinami iš 20-ies svarbiausių aminorūgščių (2.38 pav.). Jos dar vadinamos standartinėmis aminorūgštimis. Pastaraisias metais aptiktos dvi naujos aminorūgštys selenocisteinas ir L pirolizinas, kurios įjungiamos baltymų biosintezės metu į tam tikrų baltymų sudėtį (žr. skyrių Baltymų biosintezė ). Pavadinimas aminorūgštis puikiai nusako šių molekulių cheminę prigimtį: Aminorūgštys yra organinės karboksirūgštys, kuriose bent vienas anglies atomų grandinės atomas pakeistas aminogrupe. 75

76 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.38 pav. Standartinių aminorūgščių struktūra. Pateiktos jonizuotų aminorūgščių molekulių struktūros, triraidžiai ir vienraidžiai simboliai 76

77 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Kiekviena į baltymų sudėtį įeinanti aminorūgštis turi tipišką struktūrą: aminogrupę (-NH 2 ) ir karboksigrupę (-COOH), kovalentiniu ryšiu sujungtas su C atomu, dar vadinamu α anglies atomu (C a ) (graikiška raidė ties anglies atomu nurodo jo poziciją karboksigrupės anglies atomo atžvilgiu) (2.39 pav., a). Ties C a atomu yra dar prijungtas vandenilio (H) atomas ir savita kiekvienai aminorūgščiai šoninė grupė, R (2.39 pav., b). Šoninės grupės aminorūgštyse skiriasi savo dydžiu, krūviu, chemine sudėtimi (2.38 pav.). Ties α anglies atomu prijungtos grupės vadinamos α grupėmis, pvz., α karboksigrupė, α aminogrupė ir t. t pav. Aminorūgščių struktūra. Abėcėlinis (graikiško raidyno) anglies atomų žymėjimas organinėje karboksirūgštyje. Ties C a atomu yra prijungta aminogrupė (a); aminorūgšties struktūra (R šoninė grupė; aminorūgštis pavaizduota su jonizuotomis karboksi- ir aminogrupėmis) (b) Tarp 20-ies baltymus sudarančių standartinių aminorūgščių yra kelios, kurių struktūra skiriasi nuo tipiškos: aminorūgšties prolino šoninė grupė yra dar papildomu kovalentiniu ryšiu sujungta su α aminogrupės azoto atomu ir sudaro iminogrupę (2.38 pav.). Glicino aminorūgštis R padėtyje prie α anglies atomo turi prijungtą vandenilio atomą. Aminorūgštys žymimos trijų raidžių arba vienraidžiais simboliais pagal Tarptautinės teorinės ir taikomosios chemijos sąjungos (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC) rekomendacijas ( (2.38 pav.). Visose aminorūgštyse, išskyrus gliciną, α anglies atomas yra asimetriškas visos ties šiuo atomu prijungtos grupės yra skirtingos. Molekulės, turinčios asimetrijos centrą, arba chiralinį atomą, neturi simetrijos ašies ir vadinamos chiralinėmis molekulėmis. Visos baltymus sudarančios aminorūgštys, išskyrus gliciną, yra chiralinės molekulės. Aminorūgštys treoninas bei izoleucinas turi du chiralinius atomus. Chiralinių molekulių erdvinės formos vadinamos stereoizomerais. Steroizomerai gali būti dviejų tipų: enantiomerai ir diastereomerai. Enantiomerų cheminės formulės yra vienodos, tačiau prie chiralinio atomo prijungtos grupės skiriasi savo išsidėstymu erdvėje, panašiai kaip daiktas ir jo atspindys veidrodyje (2.40 pav., a). Tokios stereoizomerijos pavyzdžiai yra dešinė ir kairė rankos, varžtai su dešinio ir kairio sukimo sriegiais ir t. t. (2.40 pav., b). Diastereomerai šia savybe nepasižymi. Molekulės su vienu chiraliniu atomu turi du enantiomerus. Enantiomerų savybės yra vienodos, išskyrus tai, kad jų molekulės skirtinga kryptimi suka poliarizuotą šviesą jos yra optiškai aktyvios, todėl kartais yra vadinamos optiniais izomerais (2.40 pav., a). Visos aminorūgštys, išskyrus gliciną, turi 2 enantiomerus L-aminorūgštį (lot. laevo kairė ) ir D-aminorūgštį (lot. dextro dešinė ). Aminorūgštys, kurios ląstelėje jungiamos į baltymus biosintezės proceso metu, visuomet yra L aminorūgštys. D aminorūgštys gamtoje yra 77

78 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA gana retos. Toks stereoizomerų pasirinkimas nėra aiškus, svarstoma, ar jis yra evoliucijos rezultatas ar yra atsitiktininis. Pvz., meteorituose aptinkamos aminorūgštys yra racematai L- ir D-aminorūgščių mišiniai pav. Aminorūgščių chirališkumas. Vieną chiralinį atomą turinčios aminorūgšties stereoizomerai (enantiomerai) (a); stereoizomerų pavyzdžiai (b); optiškai aktyvių molekulių gebėjimas sukti poliarizuotos šviesos plokštumą (c) ( Mikroorganizmai tam tikrų mažų peptidų (ląstelės sienelės peptidų, antibiotikų gramicidino A, valinomicino, aktinomicino D) sintezei naudoja ir D-aminorūgštis. Pvz., jonų kanalą sudarančioje bakterijos Bacillus brevis 15 aminorūgščių gramicidino molekulėje L aminorūgštys kaitaliojasi su D-aminorūgštimis. Tai užtikrina, kad vidiniame kanalo paviršiuje išsidėstytų polinės aminorūgščių grupės. 78

79 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA D-aminorūgščių rasta peptiduose, esančiuose moliuskų, gyvačių, vorų nuoduose. Įdomu tai, kad nuodų stiprumas susijęs su D-aminorūgščių buvimu peptiduose. Pietų Afrikos medvarlės odoje sintetinamas D-alaniną turintis peptidas pasižymi tūkstantį kartų stipresniu poveikiu nei morfinas. Pakeitus D-aminorūgštį L-aminorūgštimi, junginio poveikis tampa žymiai silpnesnis. Savitieji fermentai (peptidų izomerazė) L-aminorūgštis jau susintetintuose peptiduose verčia D-aminorūgštimis. D-serinas aptiktas žmogaus smegenyse. Čia jis dalyvauja signalų perdavimo procese ir neurodegeneracijoje. Ši aminorūgštis rasta β amiloiduose, kurie susidaro smegenyse sergant Alzheimerio liga. Šiuolaikiniais metodais buvo susintetinti baltymai, sudaryti iš D-aminorūgščių. Šios molekulės buvo gamtinių molekulių veidrodiniai atspindžiai. Pvz., žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) peptidazė, susintetinta iš D-aminorūgščių, hidrolizavo baltymus, sudarytus taip pat iš D-aminorūgščių. Aminorūgštys yra silpnos rūgštys / bazės. Vandeniniuose tirpaluose, kur ph 7,5, aminorūgščių α karboksigrupė netenka protono (elgiasi kaip rūgštis) ir įgyja neigiamą krūvį (-COO - ), o α aminogrupė prijungia protoną (elgiasi kaip bazė) ir įgyja teigiamą krūvį (-NH 3+ ) (2.41 pav.). Tokia aminorūgšties molekulė yra cviterjonas. Stipriai rūgštinėje terpėje a karboksigrupė ir a aminogrupė yra protonizuotos, aminorūgštis virsta katijonu. Stipriai šarminėje terpėje abi grupės netenka protono, todėl aminorūgšties molekulė virsta anijonu (2.41 pav.). Aminorūgščių rūgštines ir bazines savybes aprašo šios lygtys: K a = [Η + ] - [A ] [ΗΑ] pk a = -log K 10 a + ph = -log [H ] 10 ph = pk a + log 10 - [A ] [ΗΑ] pav. Aminorūgščių jonizacija ( 79

80 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Kiekviena rūgštis [HA] turi jai būdingą disociacijos konstantą, K a, kuri aprašo protono [H + ] pernašą nuo rūgšties molekulės prie vandens molekulės. Tas pats tinka ir aminorūgštims. Patogumo dėlei naudojamos ne disociacijos konstantos, bet jos dešimtainio logaritmo, pk a, skaitinės reikšmės (2). Hendersono-Haselbalcho lygtis (4) sieja tirpalo ph ir disociacijos konstantos logaritmą, pk a. Tarkime, silpna rūgštis, kurios pk a = 4,0, ištirpinama buferyje, kurio ph yra 7,0. Atlikę skaičiavimus 4-oje lygtyje, pamatysime, kad tirpale bus kartų daugiau rūgšties molekulių, netekusių protono [A - ], nei molekulių, turinčių protoną [HA]. Kuo didesnis tirpalo ph, tuo daugiau disocijavusių rūgšties molekulių yra tirpale. Kai ph artimas 7,0, rūgštys, kurių pk a > 7,0, tirpale yra nedisocijavusios [HA]. O rūgštys, kurių pka < 7,0, yra disocijuotos formos [A - ]. Aminorūgščių karboksigrupės pk 1 yra ~ 2,4 ± 0,5, aminogrupės pk 2 yra ~ 9,6 ± 0,5. Kintant tirpalo ph, keičiasi ne tik aminorūgščių karboksi- ir aminogrupių jonizacija. Jonizuotis gali ir kai kurių aminorūgščių šoninės grupės, R. Aminorūgščių šoninių grupių, R, pk R reikšmės pateiktos 2.10 lentelėje lentelė. Aminorūgščių šoninių grupių pk R reikšmės Aminorūgštis Šoninės grupės pavadinimas pk R Argininas Guanidino- 12,5 Asparto aminorūgštis g karboksi- 3,9 Cisteinas Merkapto- 8,3 Glutamo aminorūgštis d karboksi- 4,2 Histidinas Imidazolo- 6,0 Lizinas Amino- 10,0 Serinas Hidroksi- 13,0 Treoninas Hidroksi- 13,0 Tirozinas Hidroksi- 10,1 Disocijuojančios aminorūgščių liekanų šoninės grupės lemia peptidų ir baltymų molekulės suminį krūvį (visų molekulėje esančių krūvių algebrinę sumą). Keičiantis tirpalo ph, keičiasi ir molekulės suminis krūvis. Tirpalo ph, kai jame esančios baltymo molekulės suminis krūvis yra lygus nuliui, vadinamas izoelektriniu tašku, pi. Nuliniu suminiu krūviu pasižyminti baltymo molekulė nejuda elektriniame lauke. Aminorūgščių karboksi- ir aminogrupės baltymuose dalyvauja sudarant peptidinius ryšius ir nedaro įtakos suminiam baltymų molekulės krūviui Peptidinis ryšys ir jo savybės Polipeptidinėje grandinėje aminorūgštys tarpusavyje sujungtos peptidiniu ryšiu, jungiančiu vienos aminorūgšties α karboksigrupę su kitos aminorūgšties α aminogrupe. Peptidinis ryšys cheminiu požiūriu yra amidinis ryšys (amidas susidaro reaguojant aminui ir aktyvintai karboksigrupei). Ląstelėje peptidinis ryšys susidaro ribosomoje reaguojant vienos aminorūgšties karboksigrupei su kitos aminorūgšties a aminogrupe. 80

81 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Aminorūgščių jungimasis yra kondensacijos reakcija. Susidarant ryšiui tarp aminorūgščių karboksi- ir aminogrupių, eliminuojama vandens molekulė (2.42 pav., a). Peptidinio ryšio susidarymas vandeninėje terpėje nėra termodinamiškai palankus. Pusiausvyra greičiau nusistovi šio ryšio hidrolizės pusėn. Tačiau savaiminis hidrolizės greitis yra labai nedidelis: peptidinio ryšio skilimo pusperiodis, kai ph 7,0, yra ~ 7 metai. Ląstelių fermentai peptidazės greičiau suskaido baltymų peptidinius ryšius, nei jie suskyla savaime. Gamtoje peptidiniam ryšiui susidaryti baltymų biosintezės metu naudojama energija hidrolizuojant didžiaenergius junginius: ATP, GTP (žr. skyrių Baltymų biosintezė ). Peptidinis ryšys yra kovalentinis ryšys, susidarantis tarp vienos aminorūgšties α karboksigrupės ir kitos aminorūgšties α aminogrupės. Susidarius peptidiniam ryšiui, aminorūgštys netenka anksčiau turėtų karboksi- ir aminogrupių, todėl polimero sudėtyje jos vadinamos ne aminorūgštimis, o aminorūgščių liekanomis. Daugelis gamtinių peptidų sudaryti iš aminorūgščių liekanų (M w > 5000 Da). Jie vadinami polipeptidais, arba baltymais. Ilgiausią žinomą gamtoje polipeptidinę grandinę turi raumenų baltymas titinas, sudarytas iš ~ aminorūgščių. Peptidai, sudaryti iš mažesnio skaičiaus (< 50) aminorūgščių liekanų, vadinami oligopeptidais, arba tiesiog peptidais. Vidutinė peptidus sudarančių aminorūgščių liekanų santykinė molekulinė masė yra ~ 110 Da. Baltymų molekulinei masei išreikšti yra naudojami atomo masės vienetai daltonai, Da (vieneto pavadinimas kilęs iš medžiagos atominės teorijos kūrėjo Džono Daltono (John Dalton) pavardės). Vienas daltonas prilygsta vienam atomo masės vienetui. Atomo masės vienetas beveik lygus vandenilio atomo masei (1,66 x g) pav. Peptidinio ryšio susidarymas. Dviejų aminorūgščių kondensacijos reakcija (a); pentapeptido Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu (serilgliciltirozilalanilleucino) struktūra (b) ( biochem.arizona.edu/classes/ bioc462/462a/notes/amino_ Acids/amino_acids.htm) 81

82 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.11 lentelė. Įvairių baltymų aminorūgščių kiekis, molekulinė masė, polipeptidinių grandinių skaičius Baltymas Molekulinė masė, Da Aminorūgščių skaičius Citochromas c (žmogus) Ribonukleazė A (jautis) Lizocimas (vištos kiaušinis) Mioglobinas (arklys) Chimotripsinas (jautis) Hemoglobinas (žmogus) Serumo albuminas (žmogus) Heksokinazė (mielės) RNR polimerazė (E. coli) Apolipoproteinas B (žmogus) Glutamino sintetazė (E. coli) Titinas (žmogus) Polipeptidinių grandinių skaičius Peptidinė grandinė viename gale turi aminorūgštį su laisva, t. y. nedalyvaujančia peptidiniame ryšyje, α aminogrupe. Šis polipeptidinės grandinės galas yra aminogalas, arba N galas. Kitas polipeptidinės grandinės galas turi aminorūgštį su laisva α karboksigrupe. Šis galas yra karboksigalas, arba C galas (2.42 pav., b). Rasta oligopeptidų, kurių N ir C galai yra sujungti. Tokie, pvz., yra θ (teta) defenzinai vieninteliai cikliniai oligopeptidai gyvūnų (beždžionių) organizmuose. Jie yra įgimto imuninio atsako dalis. Daugelio baltymų N galai yra modifikuojami jungiant N formil- ir N acetilgrupes. Kai kurie baltymai turi ir modifikuotą C galą. Polipeptidinės grandinės sintezė ląstelėse prasideda nuo N galo, o baigiasi C galu. Baltymų aminorūgščių seka rašoma pradedant N galu ir baigiant C galu, iš kairės į dešinę (2.42 pav., b). Peptido pavadinimas sudaromas iš aminorūgščių pavadinimų pridedant priesagą -il. Pradedama nuo N galo, baigiama paskutiniąja aminorūgštimi, esančia C gale. Jos pavadinimas nėra keičiamas (2.42 pav., b). Peptidinio ryšio savybės m. L. Polingas ir R. Koris, atlikę aminorūgščių rentgenostruktūrinę analizę, nustatė peptidinio ryšio struktūrines savybes. Peptidiniame ryšyje dalyvaujančiuose CONH atomuose, vadinamojoje peptidinėje (amidinėje) grupėje, nepadalintoji azoto atomo p elektronų pora konjuguoja su karbonilgrupės dvigubojo π ryšio >C=O elektronais. Susidaro π konjuguotoji sistema. Dėl konjugacijos peptidinėje grupėje vyksta cheminių ryšių ilgių pokyčiai. Dvigubasis ryšys karbonilgrupėje >C=O yra ilgesnis už įprastą (0,124 nm), o amidinis -C-N ryšys trumpesnis už įprastą (0,145 nm) (2.43 pav., a). Peptidinės grupės konjuguotosios sistemos C, O, N atomai yra vienoje plokštumoje, o elektronų tankis yra pasislinkęs elektroneigiamo deguonies atomo link. Dėl tokio elektronų pasiskirstymo peptidinis ryšys yra iš dalies dvigubasis. Elektronų tankio pasiskirstymą peptidinėje grupėje galima aprašyti rezonansinėmis struktūromis (2.43 pav., a c). Tiesa, labiau įprasta peptidinio ryšio formulę rašyti su viengubuoju -C-N ryšiu (2.43 pav., a). 82

83 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.43 pav. Peptidinio ryšio rezonansinės struktūros Sukimasis apie viengubuosius peptidinės grupės ryšius sąlygoja įvairų baltymų išsidėstymą erdvėje. Dėl konjuguotos sistemos susidarymo ir iš dalies dėl dvigubojo peptidinio ryšio sukimasis apie šį ryšį yra negalimas. Peptidinė grupė išsidėsto vienoje plokštumoje (2.44 pav., a). Taigi, polipeptidinė grandinė yra tarsi sudaryta iš daugelio peptidinių grupių plokštumų, tarpusavyje sujungtų per C a (C a1, C a2 ir t. t.) atomus C a -С- ir N-C a - ryšiais. Apie šiuos viengubuosius ryšius plokštumų sukimasis yra galimas. Šis sukimasis apibūdinamas dihedriniais (torsiniais) ψ (psi) (apie C a -С-) ir φ (fi) (apie N-C a -) kampais (2.44 pav., b d). Polipeptidinės grandinės išsidėstymą erdvėje ties kiekviena aminorūgšties liekana galima apibūdinti šiais kampais. Teoriškai šie kampai gali būti tarp 180 ir Sukimąsi iš dalies riboja šoninių grupių dydis ir gebėjimas išsidėstyti erdvėje. Nustatyta, kad dėl erdvinių susidūrimų tarp atomų ne visos padėtys yra galimos, t. y. du atomai negali būti toje pačioje vietoje tuo pačiu metu. Galimas ir negalimas konkrečios peptidinės grandinės erdvines padėtis, atsižvelgiant į atstumus tarp atomų, aprašo Ramačandrano diagrama (angl. Ramachandran plot / diagram). Šie erdviniai ribojimai galiausiai ir lemia polipeptidinės grandinės išsidėstymą erdvėje. Plokščios erdvinės struktūros peptidinė grupė dipeptide gali egzistuoti dviem konfigūracijomis: cis ir trans. Cis konfigūracijoje C a1 ir C a2 atomai yra toje pačioje C-N ryšio pusėje. Trans konfigūracijoje C a1 ir C a2 atomai yra išsidėstę priešingose C-N ryšio pusėse (2.44 pav., e). Daugumai peptidinių ryšių trans konfigūracija (dėl erdvinių susidūrimų) yra ~ kartų stabilesnė nei cis konfigūracija. Kristalografine analize baltymuose yra nustatoma apie 1 % cis konfigūracijos peptidinių ryšių. Peptidinis ryšys, kuriame dalyvauja prolinas (X-Pro), labiau linkęs įgyti cis konfigūraciją, nes iminogrupė neturi vandenilio atomo, kuris galėtų erdvėje susidurti su deguonies atomu (2.44 pav., e). Tai, kad peptidinis ryšys yra iš dalies dvigubasis, lemia kitą labai svarbią jo savybę: peptidinis ryšys yra polinis. Ties peptidinės grupės deguonies atomu yra sutelktas dalinis neigiamas krūvis, o ties azoto atomu dalinis teigiamas krūvis (2.43 pav., b c). Taigi, peptidinis ryšys yra krūvių dipolis. Ši peptidinio ryšio ypatybė lemia tai, kad ryšio atomai dalyvauja sudarant vandenilinius ryšius, kurie yra labai svarbūs aukštesniems baltymų struktūros lygmenims susidaryti. 83

84 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.44 pav. Peptidinio ryšio struktūra. Atstumai tarp atomų peptidiniame ryšyje ir peptidinės grupės erdvinė struktūra (a); peptidinės grandinės erdvinė struktūra (b) (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Principles, second edition, 1993); sukimasis apie y (С a -C) ir f (N-С a ) ryšius (taip pat parodytas ir b) (c d); peptidinio ryšio cis ir trans konfigūracijos (e) (J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemistry, seventh edition, 2012) Aminorūgščių šoninės grupės Savitas baltymų chemines ir fizikines savybes didžiąja dalimi lemia aminorūgščių šoninių grupių savybės. Pastaruoju metu naudojamos kelios aminorūgščių klasifikacijos pagal jų šoninių grupių struktūrą ir savybes, tačiau nė viena jų nėra visiškai išsami. Patogiausioje ir populia- 84

85 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA riausioje klasifikacijoje aminorūgštys skirstomos atsižvelgiant į jų polines savybes. Remiantis šia klasifikacija, aminorūgščių šoninės grupės skirstomos į dvi grupes: z nepolines (hidrofobines); z polines (hidrofilines): z krūvio neturinčias polines; z krūvį turinčias polines: z teigiamą krūvį turinčias polines; z neigiamą krūvį turinčias polines. Nepolinės (hidrofobinės) aminorūgštys. Šiai grupei priskiriamos glicino (Gly), prolino (Pro), leucino (Leu), alanino (Ala), fenilalanino (Phe), metionino (Met), valino (Val), triptofano (Trp) ir izoleucino (Ile) aminorūgštys (2.38 pav.). Aminorūgščių šoninės grupės yra hidrofobiškos, blogai tirpsta vandenyje. Jos nesudaro elektrostatine sąveika paremtų ryšių, nesąveikauja su vandens molekulėmis. Šoninės grupės skiriasi savo dydžiu, baltymų erdvinėje struktūroje jos išsidėsto vidinėje molekulės pusėje, sąveikaudamos tarpusavyje Van der Valso ryšais ir hidrofobine sąveika. Hidrofobinės aminorūgštys dar skirstomos į alifatines ir aromatines, priklausomai nuo šoninės grupės struktūros. z Hidrofobinių aromatinių aminorūgščių fenilalanino ir triptofano šoninės grupės struktūroje yra benzeno žiedas (2.38 pav.). zhidrofobinių alifatinių aminorūgščių prolino, glicino, leucino, alanino, valino ir izoleucino šoninės grupės sudarytos tik iš anglies ir vandenilio atomų. Kuo ilgesnė angliavandenilinė grandinė, tuo aminorūgštis hidrofobiškesnė. Metionino šoninės grupės sudėtyje yra sieros atomas, tačiau šoninė grupė išlieka hidrofobiška (2.38 pav.). Krūvio neturinčios polinės aminorūgštys. Šiai grupei priskiriamos serino (Ser), treonino (Thr), asparagino (Asn), cisteino (Cys), tirozino (Tyr), glutamino (Gln) aminorūgštys. Aminorūgščių šoninių grupių sudėtyje yra deguonies, sieros ir / ar azoto atomai. Tačiau šoninės grupės nepasižymi jonizacinėmis savybėmis, jos neturi krūvio. Teigiamą krūvį turinčios polinės aminorūgštys. Šiai grupei priklausančios amino rūgštys lizinas (Lys), argininas (Arg) ir histidinas (His) yra ne tik polinės, bet ir fiziologinėmis sąlygomis turi teigiamą krūvį, kurį suteikia jų šoninės grupės. Dėl krūvio šoninės grupės sudaro joninius ryšius su kitomis įkrautomis molekulėmis. Lizino ir arginino šoninių grupių pk a yra ~ 10, todėl fiziologinėmis sąlygomis jos turi teigiamą krūvį. Histidino šoninės grupės pk a = 6,5. Fiziologinėmis sąlygomis šios grupės jonizacija labai priklauso nuo artimiausios aplinkos. Ši savybė lemia histidino aminorūgšties liekanos svarbą fermentų katalizei, ji neretai yra fermentų aktyviajame centre, dalyvauja kaip H + donoras ar akceptorius. Neigiamą krūvį turinčios polinės aminorūgštys. Šiai grupei priklauso aspartatas (Asp) ir glutamatas (Glu), kurių šoninės grupės turi karboksigrupę. Ši grupė fiziologinėmis sąlygomis yra jonizuota, pasižymi neigiamu krūviu (dėmesio: nejonizuotos formos šios aminorūgštys 85

86 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA vadinamos glutamo aminorūgštimi ir asparto aminorūgštimi). O asparto ir glutamo aminorūgščių amidai asparaginas ir glutaminas fiziologinėmis sąlygomis krūviu nepasižymi. Šios aminorūgštys priskiriamos krūvio neturinčioms polinėms aminorūgštims Baltymų erdvinės struktūros susidarymui svarbūs nekovalentiniai ir kovalentiniai ryšiai Galimybė suktis atomams apie tam tikrus peptidinės grandinės ryšius suteikia grandinei lankstumo. Dėl šio lankstumo peptidinė grandinė turėtų erdvėje išsidėstyti kaip atsitiktinė grandinė (angl. random coil). Ji galėtų įgyti daugybę erdvinių struktūrų, kurių laisvoji energija yra panaši. Tačiau gamtoje kiekvienas baltymas įgyja vienintelę erdvinę struktūrą konformaciją, kurios laisvoji energija yra minimali. Konformaciją suprantame kaip molekulės atomų trimatį išsidėstymą erdvėje. Konkreti maksimaliai stabili baltymo konformacija susidaro dėl atskirų peptidinės grandinės atomų ir atomų grupių tarpusavio sąveikos bei jų sąveikos su tirpalo molekulėmis. Didžioji dauguma šių sąveikų yra silpni nekovalentinio tipo ryšiai: z Hidrofobinė sąveika tarp nepolinių (hidrofobinių) aminorūgščių liekanų. Hidrofobinė sąveika labiausiai veikia baltymo molekulės stabilumą. Nepolinės molekulės neturi nei jonų, nei ryšių, kuriems būdingas krūvių dipolis, todėl jos nėra hidratuotos; kitaip tariant, yra netirpios arba beveik netirpios vandenyje. Tokios molekulės vadinamos hidrofobinėmis. O polinės molekulės sąveikauja su polinėmis vandens molekulėmis. Jos yra hidrofilinės. Angliavandeniliai tai molekulės, sudarytos iš anglies ir vandenilio atomų. Jos yra hidrofobinės, t. y. beveik netirpios vandenyje. Angliavandeniliai sudaro biologinių membranų vidinį sluoksnį. Jėgos, skatinančios hidrofobines molekules arba nepolines molekulių dalis vandenyje agreguoti, kitaip tariant, kuo labiau sumažinti sąlytį su vandens molekulėmis, vadinamos hidrofobine sąveika, tiksliau hidrofobiniu efektu. Tai iš tikrųjų ne sąveika, o termodinaminis efektas. Jis atsiranda išstūmus vandens molekules iš hidrofobinių molekulių tarpo. Kodėl vyksta toks procesas? Patalpinus hidrofobines molekules į vandenį, jų paviršiuje susidaro tvarkingas vandens molekulių sluoksnis (2.45 pav.). Tačiau toks vandens molekulių išsidėstymas (klatratai) ant hidrofobinių molekulių paviršiaus yra tvarkingesnis (t. y. jam būdinga mažesnė sistemos entropija) nei vandens molekulių tarpusavyje sudaromas vandenilinių ryšių tinklas (kuriam būdinga didesnė sistemos entropija). Todėl hidrofobinės molekulės agreguoja tarpusavyje, išstumdamos dalį vandens molekulių į aplinką ir taip mažindamos pastarųjų galimybę sudaryti labiau tvarkingą, taigi, ir energetiškai imlesnę struktūrą. Baltymų molekulėse hidrofobinė sąveika atsiranda, kai tarpusavyje sąveikauja nepolinių aminorūgščių valino, leucino, izoleucino, alanino, metionino, fenilalanino, triptofano šoninės grupės. Vandeninėje terpėje tokių aminorūgščių liekanų šoninės grupės išsidėsto polipeptido viduje. 86

87 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.45 pav. Ryšiai baltymų molekulėje. Įvairios sąveikos polipeptidinėje grandinėje (viršuje); hidrofobinį efektą iliustruojanti schema (apačioje) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second edition, 2007) 87

88 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA zvandenilinis ryšys. Ryšį sudaro vandenilio (H) atomas, esantis tarp dviejų elektroneigiamų atomų (2.45 pav.). Vienas iš elektroneigiamų atomų (donoras) sudaro kovalentinį ryšį su vandenilio atomu (pvz., -NH, -OH) ir pritraukia vandenilio atomo elektroną į savo pusę, todėl pastarasis įgyja dalinį teigiamą krūvį (tampa beveik protonu) ir jį ima traukti kitas elektroneigiamas atomas (akceptorius, pvz., O, N). Tokiu būdu, vandenilio atomas yra ryšyje su dviem atomais, nors jo elektronas gali dalyvauti tik viename kovalentiniame ryšyje. Biologinėse molekulėse vandenilinius ryšius sudaro vandenilio atomai, kovalentiniu ryšiu sujungti su O (O-H) arba N (N-H) atomais, o akceptoriai dažniausiai yra N arba O atomai. Vandenilinio ryšio energija yra apie 3 7 kcal/mol. Ryšys stipriausias, kai visi trys ryšyje dalyvaujantys atomai yra vienoje linijoje. z Elektrostatinė (joninė) sąveika (druskų tilteliai) susidaro tarp dviejų priešingą krūvį turinčių atomų (jonų). Kovalentiniai ryšiai gali būti poliniai ir nepoliniai. Esant poliniam kovalentiniam ryšiui, vienas atomas yra daugiau elektroneigiamas nei kitas ir traukia į savo pusę bendrus ryšio elektronus. Ryšys tampa dipolinis. Nutrūkus kovalentiniam ryšiui, bendrieji ryšio elektronai dažniausiai lieka ties labiau elektroneigiamu atomu, kuris tampa neigiamą krūvį turinčiu jonu anijonu. Kitas ryšio atomas tampa teigiamą krūvį turinčiu jonu katijonu: COOH COO + H + Tarp anijono ir katijono susidaro elektrostatinė sąveika, pvz., tarp jonizuotų aminorūgščių liekanų šoninių grupių -COO - ir -NH 3 + (2.45 pav.). zvan der Valso sąveika yra silpna sąveika, atsirandanti dėl traukos tarp dviejų krūvių dipolių, susidarančių dėl elektronų pasiskirstymo polinėse ir nepolinėse molekulėse tam tikru momentu. Sąveiką pirmą kartą aprašė olandas Johanesas Diderikas van der Valsas (Johannes Diderik van der Waals). Ji atsiranda, kai dvi molekulės priartėja viena prie kitos tam tikru atstumu, ir tarp jų ima veikti labai silpnos traukos jėgos. Kiekvienos molekulės elektronų pasiskirstymas konkrečiu momentu sukuria laikiną elektroninį (krūvių) dipolį (sudarytą iš neigiamai įkrautų elektronų ir teigiamai įkrautų branduolių). Dviems molekulėms esant pakankamai arti viena kitos, tarp dviejų dipolių atsiranda silpna trauka. Tolstant molekulėms vienai nuo kitos, sąveika nyksta. Priešingai, joms per daug priartėjus, dėl neigiamo vidinių sluoksnių elektronų krūvio pasireiškia atostūmio jėgos. Taigi, Van der Valso sąveika optimaliai veikia molekulėms glaudžiai suartėjus savo elektronų debesimis (0,3 0,6 nm). Silpnų (1 2 kcal/mol) Van der Valso sąveikų tarp molekulių yra tūkstančiai. Jos susidaro visų tipų molekulėse. Biologinėse molekulėse Van der Valso sąveikos yra labai svarbios susidarant erdvinėms struktūroms ir biologinėms molekulėms sąveikaujant tarpusavyje. Nekovalentiai ryšiai yra ~ kartų silpnesni negu kovalentiniai ryšiai. Tačiau jeigu tam tikroje vietoje jų susidaro daug, peptidinės grandinės fragmentai gali tvirtai laikytis. 88

89 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Be šių nekovalentinio tipo sąveikų, kai kurių baltymų konformaciją stabilizuoja ir kovalentiniai ryšiai. Tokie yra disulfidiniai tilteliai, susidarantys peptidinėje grandinėje tarp dviejų cisteino aminorūgščių liekanų jų oksidacijos metu (2.45 pav.). Veikiant baltymus redukuojančiomis medžiagomis (2-merkaptoetanoliu, ditiotreitoliu), disulfidiniai tilteliai suyra, suardoma ir baltymo erdvinė struktūra. Visos anksčiau aprašytos sąveikos susidaro baltymų molekulėms įgyjant erdvinę struktūrą ir ją stabilizuoja. Skirtinguose baltymų struktūros lygiuose antrinėje, tretinėje ir ketvirtinėje struktūroje vyrauja skirtingo tipo sąveikos Baltymų pirminė struktūra Baltymų molekulės yra didelės ir sudėtingos, bet jų struktūra kiekvienoje konkrečioje aplinkoje yra apibrėžta ir nusakoma. Kiekviena baltymo molekulės aminorūgšties liekana išsidėsto savitai, jų visuma suteikia baltymui struktūrą ir funkcines savybes. Baltymų struktūrą galima apibūdinti keliais struktūros lygiais, kurie skiriasi cheminių ryšių prigimtimi ir kitomis ypatybėmis: pirmine, antrine, tretine ir ketvirtine struktūra. Baltymo pirminė struktūra yra aminorūgščių seka polipeptidinėje grandinėje. Baltymo pirminė struktūra yra linijinė polipeptidinė aminorūgščių grandinė. Kiekvienas baltymas turi savitą aminorūgščių seką. Baltymo aminorūgščių sekoje yra visa informacija apie jo antrinę, tretinę ir ketvirtinę struktūrą. Baltymus sudaro 20 skirtingų aminorūgščių, todėl sekos variantų gali būti 20 n, kur n yra aminorūgščių liekanų skaičius polipeptidinėje grandinėje. Daugelį baltymų sudaro daugiau nei 100 aminorūgščių, taigi, potencialių kombinacijų skaičius yra milžiniškas. Informacija apie kiekvieno baltymo savitąją aminorūgščių seką yra organizmo genome. Pirmą kartą baltymo (jaučio insulino) aminorūgščių seką nustatė Frederikas Sengeris (Frederick Sanger) ir jo bendradarbiai 1950 m. Jaučio insulinas nedidelis 51 aminorūgščių liekanos baltymas, kurį sudaro dvi polipeptidinės grandinės, sujungtos tarpusavyje keliais disulfidiniais tilteliais. Sengeris sukūrė baltymų aminorūgščių sekos nustatymo metodą, kuris 1958 m. buvo įvertintas Nobelio premija chemijos srityje. Ištobulėjus cheminės analizės technologijoms, šiais laikais baltymų tapatybė nustatoma masių spektrometrija, taip pat bioinformatiniais metodais analizuojant genomų nukleotidų sekas. Masių spektrometrija tapo viena populiariausių baltymų ir peptidų nustatymo strategijų, kuri remiasi jų molekulių masių nustatymu. Šiuo metu taikomi du masių spektrometrijos metodai. Pirmasis yra vieno baltymo peptidų masių pirštų atspaudų metodas, kuris pagrįstas jonizuotų peptidų praskriejimo laiko nustatymu (angl. Matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight, MALDI-TOF). Iš ląstelių išskiriami baltymai, jie išskirstomi vienos arba dviejų krypčių elektroforeze arba chromatografija. Konkretus baltymas, kurio tapatybę norima nustatyti, išgryninamas. Baltymas veikiamas peptidazėmis (tripsinu) ir suskaidomas į peptidus. Tripsinas atrankiai skelia polipeptidinę grandinę ties arginino ir lizino aminorūgščių C galu, jeigu už jų nėra prolino. Mišinio peptidų molekulinės masės 89

90 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA toliau nustatomos MALDI-TOF spektrometrija. Peptidai jonizuojami pasitelkiant lazerį ir nukreipiami į masių detektorių. Molekulių praskriejimo laikas detektoriuje yra atvirkščiai proporcingas jų masei ir tiesiogiai proporcingas krūviui. Detektorius registruoja jonizuotų peptidų masės ir krūvio santykį, m/z. Toliau, taikant kompiuterinius algoritmus, MALDI-TOF spektrai lyginami su peptidų, gautų in silico (kompiuterine simuliacija) peptidazėmis suskaidžius žinomų aminorūgščių sekų baltymus, masėmis. Nustatoma tiriamo baltymo tapatybė. Kitas metodas dviguba masių spektrometrija, MS / MS, remiasi visų ląstelės baltymų proteomos skaidymu peptidazėmis (2.46 pav., a b). Gautas peptidų mišinys išskirstomas skystinės chromatografijos arba dviejų krypčių elektroforezės metodais. Tada kiekvienas peptidas individualiai jonizuojamas elektroįpurškimo būdu. Peptidų m/z santykį detektuoja masių spektrometras. Tada peptidai dar skaidomi į mažesnius fragmentus pasitelkiant dujų atomus. Susidaro trumpesnių peptidų, besiskiriančių viena aminorūgštimi, mišinys. Nustatomas mišinio peptidų m/z santykis. Gaunamas vadinamasis tandeminis MS spektras. Pagal nustatytų mišinio peptidų masę, identifikuojama jų tapatybė ir aminorūgščių sekos, tada nustatoma viso baltymo aminorūgščių seka pav. Baltymų tapatybės nustatymas masių spektrometrija. Dvigubos masių spektometrijos (MS / MS) schema (a) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); dviejų pakopų praskriejimo laiko masių spektrometras Vilniaus universiteto Proteomikos centre (b) ( 90

91 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Baltymų antrinė struktūra Palyginus įvairių baltymų erdvines struktūras, pasirodė, kad, nors jos visiškai skirtingos, tam tikrose jų dalyse polipeptidinės grandinės išsidėsto sudarydamos dviejų tipų reguliarias struktūras. Šias dvi baltymų struktūras m., likus α spiralė ir β struktūra yra reguliarūs polipeptidinės grandinės išsidėstymai erdvėje konformacijos, susidarančios tam tikrose polipeptidinės grandinės vietose ir stabilizuojamos vandenilinių ryšių tarp -N-H ir >C=O grupių. dešimtmečiui iki pirmosios baltymo (mioglobino) erdvinės struktūros nustatymo, atrado L. Polingas ir R. Koris. Jie rėmėsi žiniomis apie baltymus sudarančių aminorūgščių cheminę struktūrą (L. Polingas čia buvo nepralenkiamas tarp to meto mokslininkų), taip pat aminorūgščių bei nedidelių peptidų rentgenostruktūrinės analizės duomenimis. Pirmoji pasiūlyta reguliari struktūra baltymų molekulėse buvo α spiralė. Ši struktūra buvo labai greitai patvirtinta baltyme keratine atlikus arklio plauko rentgenostruktūrinę analizę. Keratino baltymo gausu odoje, plaukuose, naguose, plunksnose. Struktūrą patvirtino Lorensas Bragas (Lawrence Bragg), anksčiau paskelbęs savo baltymų struktūros modelį, kuris, deja, buvo neteisingas. Kita reguliari struktūra baltymo molekulėse, pasiūlyta L. Polingo ir jo kolegų, buvo β struktūra. Ji netrukus buvo nustatyta fibroine, pagrindiniame šilko baltyme. Ji pavadinta antrąja graikų abėcėlės raide beta, nes buvo antroji nustatyta baltymų struktūra. Šoninės grupės vandeniliniuose ryšiuose, stabilizuojančiuose a spirales ir b struktūras, nedalyvauja. Taigi, a spirales ir b struktūras gali įgyti įvairių aminorūgščių sekų polipeptidinės grandinės. a spiralė ir b struktūra yra dažniausios baltymų antrinės struktūros. Detaliau aptarsime kiekvieną iš jų α spiralė Peptidinė grandinė α spiralėje susisuka apie tariamą ašį dešiniuoju sukimu (iš kairės į dešinę, 2.48 pav.). Spiralės vidinę dalį sudaro susisukusi pagrindinė polipeptidinė grandinė. Spiralės išorėje yra aminorūgščių liekanų šoninės grupės. a spiralė susidaro savaime, ji yra minimalios laisvosios energijos polipeptidinės grandinės konformacija. Šiuose vandeniliniuose ryšiuose dalyvauja visos peptidinės grupės, esančios a spiralėje (kiekviena peptidinė grupė dalyvauja sudarant po du vandenilinius ryšius). Spiralės vijos žingsnis sudaro 5,4 Å, jis talpina ~ 3,6 aminorūgšties liekanas (3,6 x 1,5 Å = 5,4 Å). Taigi, 36 aminorūgščių polipeptidas sudarytų 10-ties sūkių spiralę (2.12 lentelė). a spiralės struktūrą stabilizuoja vandeniliniai ryšiai, susidarantys tarp kiekvienos aminorūgšties liekanos (i) > C = O (karbonilgrupės) deguonies ir kas ketvirtos aminorūgšties liekanos (i+4) -N-H (iminogrupės) vandenilio. 91

92 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 2.12 lentelė. Kai kurių polipeptidinės grandinės antrinės struktūros elementų savybės Struktūra Aminorūgščių liekanų skaičius sūkyje Aukštis, kurį užima viena aminorūgštis spiralės sūkyje, Å Atomų skaičius vandenilinių ryšių stabilizuojamame žiede f ( ) y ( ) a spiralė 3,6 1, spiralė 3,0 2, p spiralė 4,4 1, Antilygiagreti b juosta 2,0 3,4 -* Lygiagreti b juosta 2,0 3,2 -* * Vandeniliniai ryšiai susidaro tarp polipeptidinių grandinių pav. Baltymų α spiralės struktūra. Schematinis α spiralės vaizdas. Linijomis parodyti vandeniliniai ryšiai, stabilizuojantys struktūrą (dešinėje); α spiralės fragmento, besisukančio apie tariamą ašį, atomų išsidėstymas (viduryje); vandeniliniai ryšiai, susidarantys tarp polipeptidinės grandinės atomų (kairėje); α spiralę sudarančios peptidinės grandinės fragmentas. Rodyklėmis pažymėtos karbonil- ir iminogrupės, tarp kurių susidaro vandeniliniai ryšiai (apačioje) (J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer. Biochemistry, seventh edition, 2012) 92

93 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Išilgai spiralės vandeniliniai ryšiai yra išsidėstę beveik lygiagrečiai tariamai spiralės ašiai, o juose dalyvaujantys atomai beveik vienoje linijoje. Tokiuose ryšiuose dalyvaujantys atomai yra krūvių dipoliai, a spiralė yra tokių dipolių visuma makrodipolis, turintis teigiamą krūvį N gale, ir neigiamą C gale. Dar viena svarbi a spiralės ypatybė yra ta, kad jos galai yra mažiau stabilūs nei vidinė struktūros dalis. Spiralės galuose keli vandeniliniai ryšiai nesusidaro. Juos gali sudaryti spiralės galuose esančių kai kurių aminorūgščių šoninės grupės. Pvz., spiralės N gale esančios serino arba asparagino aminorūgščių liekanos gali sudaryti vandenilinius ryšius su -N-H grupe. Aminorūgštys lizinas, histidinas ir glutaminas linkę sudaryti vandenilinius ryšius a spiralės C gale. Polipeptidinės grandinės gebėjimui sudaryti a spirales įtakos turi aminorūgščių liekanų cheminė prigimtis. Pvz., aminorūgštys alaninas (Ala), leucinas (Leu), metioninas (Met), histidinas (His) ir glutaminas (Gln) stabilizuoja a spiralę. Aminorūgštys triptofanas (Trp), fenilalaninas (Phe), lizinas (Lys), argininas (Arg), asparto (Asp) ir glutamo (Glu) aminorūgštys ją destabilizuoja. Polipeptidinėje grandinėje esančios prolino ir hidroksiprolino aminorūgščių liekanos sukuria staigius spiralės išlinkimus (~ 20 ), suardydamos trumpesnes a spirales. Taip atsitinka dėl prolino ir hidroksiprolino šoninių grupių ciklinio ryšio su -N-H grupe, kuri negali dalyvauti a spiralės vandeniliniuose ryšiuose. Baltymuose a spiralių ilgis gali siekti nuo kelių iki keliasdešimties aminorūgščių. Vidutinę a spiralę sudaro ~ 10 aminorūgščių liekanų. a spiralių kiekis baltymuose yra įvairus. Jų yra daug globuliniuose baltymuose hemoglobine, mioglobine, feritine; taip pat fibriliniuose baltymuose miozine, epidermine, fibrinogene, a keratine. Baltymo a keratino struktūroje a spiralės dominuoja. Tokios spiralės dar yra tarpusavyje kairiuoju sukimu (po 2) susivijusios į vieną superspiralę (angl. coiled coil). a keratino superspiralės yra plauko pamatinė struktūra: po dvi a keratino superspirales sąveikauja tarpusavyje galva-uodega būdu, sudarydamos protofilamentus. Keturi protofilamentai sudaro protofibriles tamprias skaidulas (2.48 pav., a b). Superspiralių, dažniausiai sudarytų iš 2 5 a spiralių, yra ir kituose struktūriniuose baltymuose, esančiuose gyvūnų ir mielių ląstelių citoskelete, Goldžio komplekse, chromatine, branduolio užpildo baltymuose. Jie randami virusų baltymuose, ląstelių transkripcijos veiksniuose, sąveikaujančiuose su DNR, pvz., baltyme GCN4. Superspirales stabilizuoja hidrofobinė sąveika dėl spiralių aminorūgščių izoleucino, valino, metionino, šoninių grupių, kurių tokiuose baltymuose yra gausu (2.48 pav., c). Daugumos superspirales sudarančių baltymų aminorūgščių seka pasižymi heptadiniu pasikartojimu. Ši seka gali būti užrašyta formule (a-b-c-d-e-f-g) n, kur a ir d aminorūgščių liekanos, turinčios hidrofobines šonines grupes. d padėtyje dažnai aptinkamas leucinas (Leu) arba izoleucinas (Ileu). e ir g pozicijose esančios aminorūgščių liekanų šoninės grupės turi krūvį, arba yra polinės. Septynios heptadinio pasikartojimo aminorūgštys išsidėsto maždaug dviejuose a spiralės sūkiuose. Heptadiniuose pasikartojimuose esančių a ir d aminorūgščių liekanų šoninės grupės išsirikiuoja išilgai vidinės spiralių pusės, tarp dviejų spiralių grupių atsiranda hidrofobinės sąveikos. Ši šoninių grupių rikiuotė šiek tiek sukasi, skatindama sąveikaujančias spirales susivyti į superspiralę (2.48 pav., c). Superspiralėje tarp atskirų a spiralių gali susidaryti ir kovalentiniai ryšiai disulfidiniai tilteliai. Tokia baltymo struktūra yra ypač stabili. Ja pasižymi jau minėtas a keratinas. a keratine 93

94 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA gausu cisteino (Cys) aminorūgščių liekanų, kurių šoninės grupės dalyvauja disulfidiniuose ryšiuose. Dėl disulfidinių ryšių gausos a keratiną sunku hidrolizuoti. Tačiau, pvz., kandžių lervų virškinimo sistemoje yra merkaptanų, suardančių vilnos a keratino disulfidinius ryšius. Nedideles a spirales turi membranose esantys baltymai, pvz., transporto baltymai, receptoriai. Šių baltymų dalys, perveriančios membranų lipidų sluoksnius, yra a spiralės, kurias sudaro nepolinių aminorūgščių liekanos. Kai kurių baltymų struktūroje a spiralių yra labai mažai arba visai nėra, pvz., chimotripsine, superoksido dismutazėje, citochrome c pav. Baltymų superspiralė. Superspiralės, sudarytos iš dviejų tarpusavyje susivijusių a spiralių, schematinis vaizdas (a); plauko, kurio pagrindą sudaro keratino a spiralės, struktūra (D. L. Nelson, M. C. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth editition, 2012) (b); heptadinis pasikartojimas baltymų superspiralėse (c): heptadinių pasikartojimų hidrofobinių aminorūgščių liekanos a ir d išsidėsto vidinėje a spiralių pusėje (kairėje); a spiralės sąveikauja tarpusavyje vidinėje pusėje esančiomis aminorūgščių liekanų hidrofobinėmis šoninėmis grupėmis, susivydamos į superspiralę (viduryje); transkripcijos veiksnio GCN4 baltymo superspiralės, sudarytos iš dviejų identiškų polipeptidų a spiralių, struktūra (dešinėje) 94

95 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Baltymuose esančios α spiralės dažniausiai yra dešinio sukimo. Erdvėje gali susidaryti ir kairiojo sukimo spiralė, tačiau tokia konformacija yra nestabili, todėl retai aptinkama gamtiniuose polipeptiduose. Randamos, nors ir retai, kitokių tipų a spiralės. Vadinamojoje 3 10 spiralėje vandenilinius ryšius tarp peptidinių grupių atomų sudaro kas ketvirta aminorūgšties liekana, o p spiralėje kas šešta spiralių yra gamtinių a spiralių galuose. p spiralės gamtiniuose polipeptiduose yra gana retos ir, manoma, yra evoliucinės adaptacijos rezultatas. Daugiausiai p spiralių rasta baltyme metano monooksigenazėje. Erdviniuose baltymų struktūros modeliuose a spiralės vaizduojamos kaip spiralės pavidalo kaspinai (2.48 pav., c) β struktūra Kita dažna baltymų reguliari antrinė struktūra yra β struktūra. Ji dar vadinama b lakštu, b klostytu lakštu, b klostyta struktūra. Tokioje struktūroje polipeptidinė grandinė yra ištįsusi, ji vadinama β juosta (angl. β strand). b juostos peptidinių grupių plokštumos per y ir f ryšius yra pasisukusios ir išsidėsto zigzagu, todėl struktūra atrodo išsilanksčiusi. Aminorūgščių šoninės grupės išsidėsto b grandinės viršuje arba apačioje (2.49 pav., a). Pavieniui b juostos nėra stabilios, todėl jos stengiasi sąveikauti su kitomis b juostomis, esančiomis kitose tos pačios polipeptidinės grandinės srityse (tai vadinama vidumolekuline sąveika), arba kitose polipeptidinėse grandinėse (tai vadinama tarpmolekuline sąveika). b juostų tarpusavio sąveiką stabilizuoja vandeniliniai ryšiai, susidarantys tarp b juostų >C=O ir -N-H grupių (2.49 pav., a b). Kitaip nei a spiralėje, vandeniliniai ryšiai tarp b juostų yra išsidėstę statmenai polipeptidinės grandinės ašiai ir skersai jungia vieną grandinę su kita arba du grandinės fragmentus. Tarpusavyje sąveikaujančios b juostos sudaro struktūrą β lakštą, arba β klostytą lakštą (angl. β-sheet, β platteled sheet). Polipeptidinės grandinės (β juostos) β struktūroje viena kitos atžvilgiu gali išsidėstyti dviem būdais: z lygiagrečioje β struktūroje polipeptidinių grandinių N galai yra nukreipti į vieną pusę (2.49 pav., b); z antilygiagrečioje β struktūroje polipeptidinių grandinių N galai nukreipti į priešingas puses (2.49 pav., c). Vandenilinių ryšių išsidėstymas yra stabilesnis antilygiagrečiojoje b struktūroje, nes >C=O ir -N-H grupių dipoliai yra vieno linijoje ir sąveikauja maksimaliai. Lygiagreti b struktūra yra ištįsusi ir dažniausiai baltymų viduje. Didesnę tikimybę sudaryti b struktūrą polipeptidinei grandinei suteikia valino (Val), izoleucino (Ile), treonino (Thr), fenilalanino (Phe), tirozino (Tyr), triptofano (Trp) aminorūgščių liekanos. Glutamino (Glu), glutamo rūgšties (Gln), lizino (Lys), asparagino (Asp), asparto (Asn), cisteino (Cys), prolino (Pro) aminorūgščių liekanos nėra palankios b struktūrai susidaryti. 95

96 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Kitaip nei a spiralę, baltymų b struktūrą dėl jos ištįsimo sunku ištempti. Pvz., šilkverpių siūlo ar voratinklio pagrindą sudaro antilygiagrečios baltymo fibroino b struktūros. Fibroino b struktūra yra maksimaliai ištįsusi. Ši ypatybė suteikia medžiagai ypatingo tvirtumo. Tačiau siūlai kartu yra ir labai lankstūs, nes tarpusavyje b struktūros sąveikauja silpnais nekovalentiniais Van der Valso ryšiais. Erdviniuose baltymų struktūros modeliuose b juostos vaizduojamos kaip plačios rodyklės. Rodyklių kryptis nurodo polipeptidinės grandinės kryptį (N galas C galas) (2.49 pav., b c) pav. Baltymo β struktūra. Polipeptidinės grandinės išsidėstymas b juostose, kurios sudaro b struktūrą (a); lygiagreti b struktūra (b); antilygiagreti b struktūra. Peptidinės grupės, dalyvaujančios sudarant vandenilinius ryšius, pažymėtos punktyru. Geltonos rodyklės žymi polipeptidinės grandinės kryptį (c) ( 96

97 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Kiti baltymų antrinės struktūros elementai Polipeptidinės grandinės antrinės struktūros reguliarūs elementai erdvėje keičia kryptį arba viena reguliari struktūra pereina į kitą. Posūkių arba perėjimų vietose, pvz., viena greta kitos išsidėstant b juostoms, Linkis ir kilpa yra nereguliarios polipeptidinės grandinės struktūra nėra reguliari, tačiau antrinės baltymų struktūros jai būdingi gana tipiški antrinės struktūros elementai, vadinamieji linkiai (angl. turns) ir kilpos (angl. elementai. loops). Posūkiai yra trumpi polipeptidinės grandinės fragmentai. Juose gali būti iki šešių aminorūgščių liekanų, dažniausiai gausu aminorūgščių glicino (Gly) ir prolino (Pro). Linkiuose tarp >C=O ir -N-H grupių taip pat susidaro vandeniliniai ryšiai, jie stabilizuoja struktūrą. Pagal tai, kiek aminorūgščių liekanų sudaro linkį, yra skiriami delta linkiai (2 aminorūgštys), gama linkiai (3 aminorūgštys), beta linkiai (4 aminorūgštys), alfa linkiai (5 aminorūgštys), pi linkiai (6 aminorūgštys). Beta linkiai baltymuose yra dažniausi. Jie jungia, pvz., b juostas antilygiagrečioje b struktūroje (2.50 pav., c). Dėl beta linkių polipeptidinė grandinė keičia kryptį 180 kampu. Beta linkiuose visuomet yra vandenilinis ryšys tarp pirmos aminorūgšties liekanos karbonilgrupės >C=O ir ketvirtos aminorūgšties liekanos iminogrupės -N-H (2.50 pav., a b). Beta linkių struktūros tarpusavyje šiek tiek skiriasi, skiriami šeši jų tipai. I ir II tipo beta linkiai yra labiausiai paplitę baltymuose (2.50 pav., a b). Linkiuose yra išsidėsčiusios iki trečdalio globulinių baltymų aminorūgščių. Šie struktūros elementai dažniausiai yra baltymo paviršiuje. Jie suteikia baltymams globulės pavidalą. Antikūnų atpažinimo, fosforilinimo, glikozilinimo, hidroksilinimo sritys yra linkiuose arba netoli jų. Kitas nereguliarios baltymų antrinės struktūros elementas yra kilpa. Elemento struktūra erdvėje primena kilpą, panašią į graikišką omega raidę, iš čia kilęs struktūros pavadinimas omega kilpa (2.50 pav., c). Omega kilpą sudaro 6 16 aminorūgščių liekanų. Kilpų aminorūgščių sudėtis 2.50 pav. Linkių ir kilpos struktūros. I tipo beta linkis (a); II tipo beta linkis (b); omega kilpa (c) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second edition, 2007) 97

98 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA įvairi. Pasitaiko ir ilgesnių omega kilpų. Kilpoje tarp aminorūgščių liekanų susidaro vandeniliniai ryšiai, jie yra nereguliarūs. Kilpos išsidėsto baltymų paviršiuje. Jose dažnai yra antigenų-antikūnų sąveikos sritys, metalų jonų sąryšos vietos. Kilpų yra fermentų aktyviuosiuose centruose Baltymų struktūros motyvai (superantrinė struktūra) 1973 m. S. Narasinga Rao (S. Narasinga Rao) ir Maiklas Rosmanas (Michael Rossmann) nustatė, kad baltymų erdvinėje struktūroje yra elementų, turinčių kelias a spirales, b juostas arba jų kombinacijas, kurias tarpusavyje jungia nereguliarios antrinės struktūros elementai staigūs posūkiai ir / ar kilpos. Šie elementai yra tarsi antrinės struktūros elementų Superantrinė baltymų struktūra (motyvai) tai tam tikras nuoseklus 2 3 antrinės struktūros baltymų struktūrose. Tokie struktūros elementai vadinami sankaupos, jų rasta pačias įvairiausias funkcijas atliekančių elementų išsidėstymas. baltymų struktūros motyvais, arba superantrine struktūra. Motyvus galima laikyti tarpine struktūra tarp antrinės ir tretinės baltymų struktūros lygių. Kai kurie baltymų struktūros motyvai pavieniui lemia konkrečią baltymo funkciją, tačiau kiti yra tik baltymų erdvinės struktūros dalis. Dažnai aptinkami šie baltymų struktūros motyvai: z Motyvai, kuriuose yra a spiralės struktūra (2.51 pav., a): z spiralė-kilpa-spiralė, H-L-H (angl. helix-loop-helix). Motyvą sudaro dvi a spiralės, kurias jungia kilpa. Dažnas ir kitas panašus motyvas: spiralė-linkis-spiralė, H-T-H (angl. helixturn-helix). Spiralės-linkio-spiralės motyvas lemia kai kurių baltymų funkcijas: atrankią baltymų sąveiką su DNR (pvz., katabolitų genus aktyvinančio baltymo, CAP, l bakteriofago slopiklio, lcro), Ca 2+ jonų surišimą pav. Baltymų struktūros motyvai ( 98

99 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 1973 m. nustatyta, kad karpio baltymo parvalbumino (M w = Da) struktūroje spiralėskilpos-spiralės motyvas kartojasi tris kartus. Du iš šių trijų motyvų dalyvauja surišant kalcio jonus. Tokio tipo kalcį surišantys motyvai yra paplitę baltymuose ir dar vadinami EF rankos (angl. EF hand) motyvais (2.51 pav., a). Motyvas nustatytas tarp parvalbumino E ir F spiralių, iš čia kilęs jo pavadinimas. EF rankos motyvo kilpą sudaro ~ 12 aminorūgščių liekanų, tarp jų gausu polinių ir hidrofobinių, esančių konservatyviose padėtyse. Ca 2+ jonai oktaedriniu būdu koordinuojami aminorūgščių liekanų šoninių karboksigrupių ir tirpiklio molekulių. EF motyvus turintys eukariotų baltymai, pvz., kalmodulinas, troponinas C, yra svarbūs signalų perdavimo kelių dalyviai. z Motyvai, kuriuose yra b struktūra (2.51 pav., c e): z β plaukų segtuko motyvas (angl. hairpin β-motif). Motyvą sudaro dvi antilygiagrečios b juostos, kurias jungia kilpa; zgraikų rakto motyvas (angl. greek key motif). Motyvą sudaro keturios greta esančios antilygiagrečios b juostos, jungiamos kilpų. Elementų išsidėstymas primena senovės Graikijos ornamentus, iš čia kilęs ir struktūros pavadinimas. z Motyvai, kuriuose yra b juostos ir a spiralės struktūros (2.51 pav., b): z beta-alfa-beta motyvas (angl. beta-alpha-beta motif). Motyvą sudaro b juosta, a spiralė ir dar viena b juosta, kurias tarpusavyje jungia kilpos. Palyginti su antilygrečiomis β juostomis, kurioms tarpusavyje sujungti pakanka nedidelės kilpos, lygiagrečias struktūras skersai jungia ilgos kilpos, neretai tarp jų yra a spiralė. Baltymų erdvinėje struktūroje aptinkamos antrinės struktūros motyvų grupės klostės (angl. fold), kurias galima laikyti dar sudėtingesnėmis superantrinėmis struktūromis. Pvz., du spiralės-kilpos-spiralės motyvai sudaro sudėtingesnę struktūrą keturių spiralių ryšulį (angl. four helix bundle) (2.52 pav., a). Šią struktūrą sudarančios spiralės yra amfipatinės hidrofobinės aminorūgščių liekanos išsidėsčiusios vienoje spiralės pusėje, o hidrofilinės kitoje. Keturių spiralių ryšulyje spiralės pakrypusios nuo tariamos ašies ~ pav. Struktūros motyvų grupės žmogaus baltymuose. Keturių spiralių ryšulys interleukino-2 struktūroje (a); globino klostė neuroglobine. Hemas parodytas centre (b); Rosmano klostė dehidrogenazėje. Parodyta ketvirtinė baltymo struktūra, sudaryta iš keturių baltymo monomerų. Kiekvienas monomeras prijungęs NADP (c) ( 99

100 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Kitas motyvas, sudarytas iš a spiralių struktūrų, yra globino klostė (angl. globin fold) (2.52 pav., b). Jį sudaro aštuonių spiralių ryšulys. Globino klostėje greta esančios spiralės viena kitos atžvilgiu išsidėsto antilygiagrečiai, jos pakrypusios nuo tariamos ašies ~ 50. Globino klostės struktūros motyvas būdingas hemoglobinui, mioglobinui, dumbliuose esančiam fikocianinui. Evoliuciniu požiūriu tai yra labai konservatyvi struktūra: ją išlaiko baltymai, kurių aminorūgščių sekų panašumas yra ne didesnis nei 16 %. Du beta-alfa-beta motyvai sudaro vadinamąją Rosmano klostę (angl. Rossmann fold) (2.52 pav., c). Motyvas būdingas baltymams, prijungiantiems nukleotidus, ypač nikotinamiddinukleotidą (NAD) Baltymų tretinė struktūra Tretinė baltymų struktūra apibūdina savitą erdvinį polipeptidinės grandinės antrinės struktūros elementų išsidėstymą susidarant kompaktiškai molekulės struktūrai. Visos to paties baltymo molekulės įgyja vienodą erdvinę struktūrą, kuri dar vadinama gamtine (angl. native) baltymo struktūra. Atsižvelgiant į baltymo molekulės tretinės struktūros pavidalą, baltymai skirstomi į globulinius ir fibrilinius. Globuliniai baltymai yra sferos, globulės formos, o fibriliniai ištįsusios (siūlo, lazdelės, pluošto) formos. Tiek globulinių, tiek fibrilinių baltymų tretinę struktūrą sudaro įvairūs antrinės struktūros elementai a spiralės, b juostos, nereguliarūs elementai. Fibrilinių baltymų struktūrai būdingas antrinės struktūros motyvų pasikartojimas. Fibriliniai baltymai dažniausiai yra struktūriniai baltymai (kolagenas, elastinas, miozinas, fibrinogenas). Globuliniai baltymai pasižymi didžiule struktūrų įvairove. Todėl ir jų funkcijos yra daug įvairesnės. Baltymų tretinė struktūra termodinaminiu požiūriu yra stabiliausia baltymo molekulės struktūra tirpale. Tretinę struktūrą stabilizuoja šios silpnos vidumolekulinės sąveikos tarp aminorūgščių šoninių grupių: 99 hidrofobinė sąveika; 99 vandeniliniai ryšiai; 99 elektrostatinė sąveika; 99 Van der Valso sąveika; 99 disulfidiniai tilteliai. Tretinė baltymo struktūra tai savitas polipeptidinės grandinės antrinės struktūros elementų išsidėstymas erdvėje į kompaktišką struktūrą. Susidarant baltymų tretinei struktūrai hidrofobinės aminorūgščių šoninės grupės paslepiamos struktūros viduje kuo labiau sumažinant kontaktą su vandens molekulėmis. Ilgai manyta, kad baltymo tretinę struktūrą lemia jo aminorūgščių seka, ir baltymas tirpale ją įgauna savaime, nedalyvaujant jokiems pašaliniams veiksniams. Šis teiginys žinomas kaip 100

101 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Anfinseno 1 dogma. Ši nuostata buvo grindžiama kai kurių baltymų gebėjimu, suardžius jų gamtinę erdvinę struktūrą, tirpale vėl savaime susilankstyti ir įgyti prarastą biologinį aktyvumą. Pvz., veikiant ribonukleazę A mažą 124 aminorūgščių liekanų baltymą redukuojančiomis medžiagomis (2-merkaptoetanoliu), kurios suardo disulfidinius tiltelius (redukuojamos merkaptogrupės), ir denatūruojančiomis medžiagomis (karbamidu, guanidino chloridu), suardoma baltymo erdvinė struktūra, jis praranda aktyvumą. Tačiau pašalinus denatūraciją sukėlusius veiksnius ir oksidavus merkaptogrupes deguonimi, tirpale Procesas, kurio metu suardoma baltymo erdvinė struktūra, vadinamas denatūracija. ribonukleazė A vėl įgyja erdvinę struktūrą ir biologinį aktyvumą. Toks grįžtamas procesas vadinamas renatūracija (2.53 pav.). Negrįžtamąją baltymų denatūraciją sukelia temperatūra, didelės koncentracijos rūgštys, šarmai, alkoholiai pav. Ribonukleazės A denatūravimo ir renatūravimo schema Baltymų erdvinės struktūros susidarymas Eksperimentai in vitro su ribonukleaze A ir kitais baltymais parodė, kad baltymai fiziologinėmis sąlygomis spontaniškai įgyja erdvinę struktūrą (angl. self assembling). Procesas mėgintuvėlyje trunka sekundes, o ląstelėje dar greičiau. Kaip jis vyksta? 1968 m. Sairusas Levintalis (Cyrus Levinthal) suformulavo teiginį, žinomą kaip Levintalio paradoksas. Jeigu erdvinę baltymo struktūrą lemia polipeptidinės grandinės aminorūgščių seka, kaip grandinė įgyja vienintelę termodinamiškai palankiausią erdvinę struktūrą per labai trumpą laiko tarpą? Levintalis šį klausimą pagrindė skaičiavimais. Tarkime, savaime susidaro 100 aminorūgščių liekanų polipeptido erdvinė struktūra. Manant, kad kiekviena aminorūgšties liekana gali egzistuoti vienoje iš trijų konformacijų ištįsusioje, kilpos bei spiralės, yra būdų susidaryti polipeptido erdvinei struktūrai, arba galimų erdvinės struktūros variantų. Ryšio sukimasis keičiant padėtį užtruktų ~ s. Tai reiškia, kad atsitiktinė stabiliausios polipeptidinės grandinės erdvinės struktūros paieška užtruktų s, arba metų. Tai daugiau nei visatos amžius. O jau minėta ribonukleazė A, renatūruota in vitro, įgyja erdvinę struktūrą greičiau nei per minutę. 1 Pavadinimas kilęs iš Kristiano B. Anfinseno (Christian B. Anfinsen) vardo. Baltymų erdvinė struktūra susidaro ne visų įmanomų struktūros variantų paieškos būdu. 101

102 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Taigi, gamtoje turi egzistuoti būdas baltymams įgyti minimalios energijos erdvinę struktūrą per palyginti trumpą laiką. Daugelį metų trukę eksperimentiniai tyrimai ir teoriniai skaičiavimai sprendė paradoksą, tačiau ir šiuo metu yra bent dvi baltymų erdvinės struktūros susidarymo (angl. folding) teorijos. Pirmoji teorija remiasi kinetiniais tyrimais, kurių rezultatai sudarė prielaidas manyti, kad baltymai nuosekliai įgyja erdvinę struktūrą per tam tikras savitas tarpines struktūros būsenas. Susidarius vienai tarpinei struktūrai, susidaro kita, išvengiant nestabilios konformacijos būsenų. Tokių tarpinių būsenų egzistavimą paliudijo eksperimentai in vitro. Naujesnė piltuvo (angl. funnel) teorija teigia, kad nėra vieno kelio, kuriuo baltymas įgyja minimalios laisvosios energijos erdvinę struktūrą, bet egzistuoja daug galimų kelių ją pasiekti. Molekulė pasirenka labai nedidelę dalį iš visų galimų erdvinių konformacijų, ir tarpinės erdvinės struktūros, mažėjant energijos, virsta galutine erdvine struktūra. Kitaip tariant, denatūruota molekulė energiniu piltuvu greitai pasiekia minimalios energijos erdvinę struktūrą, ir Levintalio paradoksas išsprendžiamas. Piltuvo teorija iliustruojama nelygaus paviršiaus (energinio paviršiaus) piltuvu, į kurio dugną (minimalios energijos erdvinę struktūrą) juda molekulė (2.54 pav.). Savaiminis baltymų susilankstymas (angl. self assembling) ląstelėse vyksta, tačiau tik kai kurių baltymų m. D. Elis (J. Ellis) iškėlė hipotezę, kad savaiminis susilankstymas nėra vyraujantis baltymų erdvinės struktūros susidarymo būdas gamtoje. Paaiškėjo, kad daugelio baltymų savitai tretinei struktūrai susidaryti reikia pagalbinių veiksnių molekulinių 2.54 pav. Energiniai paviršiai, iliustruojantys gamtinės baltymo erdvinės struktūros susidarymą. Levintalio paradokso golfo lauko energinis paviršius. N gamtinė baltymo konformacija; D denatūruota būsena. Polipeptidinė grandinė ieško mažiausios laisvosios energijos erdvinės struktūros atsitiktinai ir turi nedaug galimybių pakliūti į nedidelę duobutę, atitinkančią gamtinę struktūrą (a); energinis paviršius, kai baltymo erdvinė struktūra susidaro įvairiais keliais judant energiniu piltuvu. A baltymas iš karto pasiekia erdvinę struktūrą; gamtinė B baltymo struktūra susidaro per tarpines būsenas (b) (D.L. Nelson and M.V. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) 102

103 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA šaperonų. Taip yra ne todėl, kad baltymų aminorūgščių sekoje trūktų informacijos apie jų erdvinę struktūrą. Baltymų koncentracija ląstelėse yra labai didelė. Susidarant baltymo erdvinei struktūrai, galima daugybė nereikalingų sąveikų, kurios didina netikslios struktūros ir agregacijos susidarymo galimybę. Netiksliõs struktūros hidrofobinės aminorūgščių grupės dažnai yra baltymų molekulės išorėje, jos linkusios sąveikauti su kitų molekulių hidrofobinėmis grupėmis, ir tokie baltymai sudaro agregatus. Čia gelbsti molekuliniai šaperonai gausi baltymų, užtikrinančių tikslios kitų baltymų struktūros susidarymą ląstelėje, grupė Baltymų tretinės struktūros domenai Baltymų tretinėje struktūroje aptinkamos tam tikros antrinės struktūros elementų kombinacijos. Kai kurios iš jų yra gana dažnos globuliniuose baltymuose. Tokių antrinės struktūros kombinacijų baltymo erdvinėje struktūroje gali būti ne viena, o keletas. Šie baltymų tretinės struktūros vienetai yra vadinami domenais. Domeną vidutiniškai sudaro aminorūgščių liekanų. Vidutinio dydžio domenas yra ~ 25 Å skersmens globulė. Ilgesnes polipeptidines grandines turintys baltymai dažniausiai sudaryti iš dviejų ir daugiau domenų. Tarpusavyje domenai sujungti trumpa lanksčia polipeptidine Domenai yra pamatiniai polipeptidinės grandinės struktūriniai ir funkciniai vienetai, kuriems būdinga tretinė struktūra. grandine, kuriai nebūdinga reguliari antrinė struktūra. Domenų gebėjimas judėti erdvėje yra labai svarbus baltymų biologiniam aktyvumui, pvz., fermentų aktyvumo reguliacijai, jų gebėjimui jungtis su substratu. Katabolitų genus aktyvinančio baltymo, CAP (angl. catabolite acti pav. E. coli katabolitų genus aktyvinančio baltymo (CAP) antrinės struktūros elementai, tretinės struktūros domenai ir ketvirtinė struktūra. Rodyklėmis pažymėtos DNR ir ATP prisijungimo sritys, esančios skirtinguose baltymo domenuose (B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin et al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014) 103

104 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA vator protein), monomerui yra būdingi du domenai: vienas prisijungia ATP, o kitas jungiasi prie DNR (2.55 pav.). Kai kuriuos baltymų domenus galima atskirti skaidant juos jungiančios polipeptidinės grandinės fragmento peptidinius ryšius fermentais peptidazėmis. Tokie atskirti baltymo domenai išlaiko savo tretinę struktūrą, kuri yra jiems būdinga baltyme. Manoma, kad polipeptidai, kurių erdvinėje struktūroje yra ne vienas, o keletas domenų, atsirado evoliucijos keliu susiliejant genams, koduojantiems paprastesnės struktūros vieno domeno polipeptidus. Pvz., žinduolių baltymo fosfolipazės C molekulės domenai yra nustatyti kituose mažesniuose baltymuose. Toks evoliucijos metu vykstantis domenų dreifas kuria baltymus, pasižyminčius naujomis savybių kombinacijomis. Pagal tai, kokios antrinės struktūros elementų (motyvų) kombinacijos sudaro baltymo domeną, baltymų tretinės struktūros yra skirstomos į kelias grupes: 99 baltymai, sudaryti tik iš α spiralės struktūrų, kurias tarpusavyje jungia kilpos. Tokių baltymų hidrofobinių aminorūgščių liekanos yra giliai paslėptos viduje. Tokios struktūros yra mioglobinas, hemoglobinas, feritinas, bakteriorodopsinas, fosfolipazė C (2.56 pav.); 99 baltymai, sudaryti tik iš β juostų, dažniausiai išsidėsčiusių viena kitos atžvilgiu antilygiagrečiai (antilygiagretus b lakštas). Tokia struktūra pasižymi, pvz., baltymai imunoglobulinas, superoksido dismutazė; 99α-β struktūros baltymai. Baltymus sudaro b juostos, dažniausiai išsidėsčiusios į lygiagretų b lakštą, apsuptą a spiralių. Tokios struktūros yra baltymai alkoholio dehidrogenazė, subtilizinas, tioredoksinas, heksokinazė; 99 α + β struktūros baltymai. Baltymų struktūrą sudaro a spiralių ir b juostų motyvų kombinacija Baltymų ketvirtinė struktūra Kai kuriuos baltymus sudaro viena polipeptidinė grandinė. Tokie baltymai pasižymi tik tretine struktūra. Tačiau daugelį ląstelių baltymų sudaro ne viena, o dvi ar daugiau tarpusavyje sąveikaujančių polipeptidinių grandinių. Jos yra vadinamos subvienetais. Kiekvienas subvienetas įgyja savitą tretinę struktūrą nepriklausomai. Subvienetai sąveikauja tarpusavyje nekovalentinio tipo ryšiais, susidarančiais tarp atskirų polipeptidinių grandinių aminorūgščių šoninių grupių. Tai yra vandeniliniai ryšiai, joniniai ryšiai, Van der Valso ryšiai ir hidrofobinė sąveika. Visi minėti ryšiai stabilizuoja ketvirtinę baltymo struktūrą. Ketvirtinės struktūros susidarymas, išskyrus retas išimtis, yra būtinas baltymo funkcijoms pasireikšti. Tarpusavyje sąveikaujančų dviejų ar daugiau polipeptidinių grandinių (subvienetų), sudarančių funkcionalų baltymą, erdvinis išsidėstymas yra ketvirtinė baltymo struktūra. Daugiasubvienetės struktūros baltymai yra vadinami oligomerais. Subvienetai, sudarantys baltymą, gali būti identiški arba skirtingi. Iš identiškų subvienetų sudaryti baltymai, 104

105 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 2.56 pav. Baltymų domenų struktūra (D.L. Nelson and M.V. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) 105

106 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA priklausomai nuo juos sudarančių subvienetų skaičiaus, yra homodimerai (du subvienetai), homotrimerai (trys subvienetai), homotetramerai (keturi subvienetai) ir t. t. Pvz., E. coli DNR helikazę sudaro šeši identiški subvienetai, baltymas yra homoheksameras. Jeigu baltymą sudaro mažiausiai du skirtingi subvienetai, priklausomai nuo subvienetų skaičiaus, baltymai gali būti heterodimerai, heterotrimerai, heterotetramerai ir t. t. Daugiasubvienetės baltymų struktūros pavyzdys yra hemoglobinas O 2 surišantis eritrocitų baltymas. Žmogaus hemoglobino molekulę sudaro keturi subvienetai du a globino ir du b globino polipeptidai (2.57 pav., a c). Visų polipeptidų erdvinė struktūra yra globulės pavidalo, jie suformuoja globulės pavidalo hemoglobino molekulę. Kiekvienas polipeptidas turi prostetinę grupę hemą, kiekviena grupė prijungia vieną deguonies molekulę. Prostetinė grupė nėra baltymo polipeptidinės grandinės sudėtyje ji yra prijungiama prie baltymo jį susintetinus m. Maksas Perucas (Max Perutz) nustatė erdvinę hemoglobino struktūrą ir parodė, kad kiekvieno hemoglobiną sudarančio polipeptido erdvinė struktūra yra panaši į mioglobino struktūrą. Mioglobinas yra monomerinis raumenų baltymas, taip pat turintis hemą ir prijungiantis deguonies molekulę. Buvo spėta, kad abu į hemoglobino sudėtį įeinantys polipeptidai yra kilę iš mioglobino. Perucas taip pat nustatė, kad prisijungus deguonies molekulėms, b globino subvienetų erdvinis išsidėstymas pakinta: molekulės priartėja viena prie kitos. Taip pirmąkart buvo parodyta, kad sudėtingoms baltymų funkcijoms atlikti yra svarbūs net ir nedideli molekulės struktūros pokyčiai erdvėje. Baltymo subvienetams jungiantis į oligomerą, ~ % sumažėja tirpalui prieinamo baltymo paviršius. Oligomerai yra atsparesni proteazių, temperatūros, denatūracijos poveikiui. Atskiri baltymą sudarantys subvienetai patys dažniausiai yra nesimetriški, tačiau daugiasubvienečių baltymų ketvirtinės struktūros pasižymi įvairių rūšių simetrija, panašiai kaip kristaluose. Subvienetams jungiantis tokiu būdu yra siekiama sumažinti molekulės laisvąją energiją. Oligomerinė baltymų struktūra padidina molekulių stabilumą, suartina aktyviuosius centrus, užtikrina veikimo kooperatyvumą pav. Hemoglobino ir mioglobino erdvinės struktūros. Žmogaus oksihemoglobino molekulės ketvirtinė struktūra. Parodytos hemo prostetinės grupės ir baltymo b ir a subvienetai (a, b); banginio spermos oksimioglobino erdvinė struktūra (c) (D.L. Nelson and M.V. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) 106

107 II. NUKLEORŪGŠČIŲ IR BALTYMŲ MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Daugiabaltyminiai kompleksai Nors hemoglobino molekulę sudaro 4 subvienetai, jis laikomas palyginti paprastos struktūros baltymu. Neretai ląstelėje skirtingi baltymai, pasižymintys savita funkcija, asocijuoja sudarydami didelius daugiabaltyminius kompleksus. Daugiabaltyminiai kompleksai, dar vadinami molekulinėmis mašinomis (angl. molecular machines), dalyvauja svarbiausiuose ląstelės procesuose: replikacijos, transkripcijos, ribonukleorūgščių brendimo, baltymų biosintezės, pernašos, biomolekulių degradacijos. Daugelio šių kompleksų struktūra ir funkcijos bus nagrinėjami kituose skyriuose. Vienas pirmųjų nustatytų ir ištirtų daugiabaltyminių kompleksų buvo E. coli piruvato dehidrogenazės kompleksas. Kompleksą sudaro 3 skirtingų baltymų (fermentų piruvato dehidrogenazės, dihidrolipoiltransacetilazės ir dihidrolipoildehidrogenazės) molekulės (2.43 pav., a b). Kiekvieno baltymo molekulių komplekse yra ne viena, bet daug. Iš viso jį sudaro 60 polipeptidinių grandinių. Komplekso molekulinė masė yra ~ Da, jo skersmuo 50 nm. Komplekso fermentai katalizuoja dviejų metabolinių kelių glikolizės ir Krebso ciklo reakcijas. Daugiabaltyminė piruvato dehidrogenazės struktūra užtikrina, kad vienos fermentinės reakcijos produktas būtų iš karto nukreipiamas link kito komplekso fermento ir t. t. Komplekso viduje palaikoma didelė substratų koncentracija, koordinuotai vyksta fermentinių reakcijų reguliavimas. Kitas veiksmingai funkcionuojančio daugiabaltyminio komplekso pavyzdys ląstelių RNR ardymo molekulinė mašina egzosoma. Prokariotuose, archėjose, eukariotuose egzosomą sudaro iki devynių baltymų, 3-5 egzonukleazių bei kitų baltymų (2.58 pav., c d). Ląstelės daugiabaltyminiai kompleksai yra skirtingo stabilumo. Daugelio kompleksų baltymai jungiasi į kompleksą ir disocijuoja iš jo priklausomai nuo tam tikru momentu ląstelėje esančių sąlygų pav. Daugiabaltyminių kompleksų pavyzdžiai. E. coli piruvato dehidrogenazės komplekso struktūra, nustatyta krioelektroninės mikroskopijos metodu (a) (The EMBO Journal, v. 21, p. 5587, 2002); komplekso struktūros schema (b); žmogaus egzosomos komplekso struktūra, nustatyta rentgenostruktūrinės analizės metodu (c); egzosomos struktūros schema (d) (Journal of Cell Science, v. 122, p. 1488, 2009) 107

108 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA ANALITINIAI KLAUSIMAI IR UŽDAVINIAI 1. Kodėl dvigrandinė DNR įgyja dvigubos spiralės antrinę struktūrą? 2. Bakteriofago φx174 DNR heterociklinių bazių sudėtis yra tokia: 25 % A, 33 % T, 24 % G ir 18 % C. Ką šie duomenys sako apie bakteriofago DNR? 3. Kodėl daugelyje organizmų DNR yra superspiralizuota neigiamai? 4. Plazmidė pdj02 yra uždara dvigrandinė žiedinė DNR molekulė, sudaryta iš bazių porų. Koks yra šios molekulės Lk, kai ji yra relaksuota B formos DNR? Patogumo dėlei laikykime, kad B formos DNR viename sūkyje telpa 10 bazių porų, A formos DNR telpa 11 bazių porų, o Z formos DNR 12 bazių porų. 5. Ta pati plazmidės DNR yra perkeliama iš vandenilinio tirpalo į 70 % etanolio tirpalą. Koks DNR molekulės Lk bus šiuo atveju? Kuri molekulė bus kompaktiškesnė pirmuoju ar antruoju atveju? 6. Turime neigiamai superspiralizuotą dvigrandinę DNR. Ar keisis šitos molekulės Lk, Tw ir Wr, jeigu: a) padidinsime etanolio koncentraciją iki 70 %? b) pripilsime baltymo, kuris prisijungia prie DNR G ir C sekų ir sąlygoja Z formos susidarymą? 7. DNR sekos įgyja Z formą tam tikromis sąlygomis. Viena tokių sąlygų yra pasikartojančių deoksinukleotidų seka d(5 GC3 ). Įsivaizduokime, kad uždara žiedinė DNR yra sudaryta iš dešinio sukimo B formos relaksuotos DNR, kurią sudaro bazių porų ir 18 d(gc) dinukleotidų, kurie sudaro kairiojo sukimo Z formos DNR. Koks yra tokios molekulės Lk? 8. Viroidų RNR ir virusoidų (satelitinės) RNR sudėtyje yra save kerpančių ribozimų. Paaiškinkite, kam jie reikalingi? 9. Užrašykite RNR molekulės, kuri galėtų sudaryti 9 bp stiebą ir 7 nukleotidų kilpą, seką. 10. Kokios sekos dar reikia, kad RNR molekulė, aprašyta 9 klausime, įgytų pseudomazgo struktūrą? 108

109 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA DNR yra biologinė makromolekulė, sudaryta iš daugelio atomų ir pasižyminti savita molekuline struktūra. Tačiau DNR kartu yra ir biologinės informacijos (genų) saugykla. Kaip ji organizuota įvairių organizmų ląstelėse? Pirmiausia aptarsime eukariotų DNR organizaciją, nes ji yra sudėtingesnė nei prokariotų ir struktūriniu, ir funkciniu požiūriu (daugiau genų, sudėtingesnis jų veiklos valdymas). Beveik visa eukariotų DNR yra sutelkta branduolyje. Kartu su baltymais ji sudaro savitą dinamišką struktūrą chromatiną (gr. chromos spalvotas ; pavadinimas kilo dėl chromatino sąveikos su dažais). Chromatinas tam tikru ląstelės ciklo tarpsniu mitozės metu įgyja dar kompaktiškesnę formą, iš jo susidaro individualios struktūros chromosomos. Kiekvienos žmogaus somatinės ląstelės branduolyje yra 2 x 3,2 x 10 9 nukleotidų porų DNR, pasiskirsčiusi 46 chromosomose (diploidinis chromosomų skaičius). Chromosomas sudaro labai ilgos DNR molekulės. Iš viso susidarytų ~ 2 m ilgio 20 Å DNR siūlas. Nepamirškime, kad DNR ląstelėje yra hidratuota: vienai bazių porai tenka ~ 6 vandens molekulės. Taigi, branduolyje DNR užimamas tūris dar labiau padidėja. Nepaisant to, DNR telpa branduolyje, kurio skersmuo ~ 6 10 mm. Kad galėtume suvokti, kaip kompaktiškai ji supakuota, įsivaizduokime plonytį 40 km ilgio siūlą, sutalpintą į teniso kamuoliuką! Didžioji dalis DNR chromatine yra struktūriškai neprieinama ir funkciškai neaktyvi. Toks chromatinas yra vadinamas heterochromatinu. Pvz., chromosomų sritys, kurios yra neaktyvios (jose nevyksta genų raiška transkripcija), matomos per ląstelės ciklo interfazę (pvz., Baro kūneliai). Tik nedidelė dalis chromatino DNR sekų yra aktyvios, t. y. transkribuojamos. Toks chromatinas vadinamas euchromatinu. Visų eukariotų chromatino organizacija branduolyje yra stebėtinai panaši. DNR kartu su baltymais ir kitomis molekulėmis jame supakuota pagal tam tikrą hierarchinę sistemą. Eukariotų chromatinas yra sudėtingas nukleoproteinas, kurį sudaro: z DNR, z baltymai histonai, z nehistoniniai baltymai (~ baltymų branduolyje), z RNR (< 10 % DNR masės). Histonai yra maži, bazinėmis savybėmis pasižymintys baltymai. Jų struktūra gerai apibūdinta. O nehistoniniai baltymai yra labai įvarių struktūrų ir funkcijų molekulės. Dauguma nehistoninių baltymų, esančių chromatino sudėtyje, dar gana menkai ištyrinėti. 109

110 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.1. Nukleosoma chromatino struktūrinis ir reguliacinis vienetas 1974 m. Rodžeris Kornbergas (Rodger D. Kornberg) pasiūlė chromatino struktūros modelį. Jis suformulavo nukleosomų hipotezę, anot kurios, chromatino pamatą sudaro pasikartojantys elementai nukleosomos. Nukleosomose DNR Nukleosoma yra pagrindinis chromatino struktūrinis ir reguliacinis elementas. apsisuka apie baltymų histonų šerdį, o chromatine yra išsidėsčiusi į grandinėles chromatino siūlus (3.1 pav. ir 3.2 pav.). Remiantis šiuo modeliu buvo atliekami eukariotų chromatino tyrimai. Jau 1975 m. elektroninės mikroskopijos metodu buvo gauti pirmieji kokybiški nukleosomų vaizdai m., atlikus nukleosomos kristalo didelės skyros (2,8 Å) rentgenostruktūrinę analizę, nustatyta nukleosomos erdvinė struktūra. Buvo nustatytos visos pagrindinės nukleosomos molekulinės struktūros savybės. Šiuo metu nukleosomų kristalai analizuojami mažesne nei 2 Å skyra. Nukleosomos evoliuciškai yra labai konservatyvios struktūros ir aptinkamos visų eukariotų chromatine. Manoma, kad > 99,5 % genominės DNR galėtų būti nukleosominės struktūros. 3.1 pav. Chromatino struktūrinės organizacijos lygmenys ( File:DNA_to_Chromatin_Formation.jpg) 110

111 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Pagrindiniai nukleosomos organizacijos principai yra šie: z nukleosomos baltymų histonų šerdį histonų oktamerą sudaro po dvi keturių rūšių histonų molekules: H2A, H2B, H3 ir H4; z nukleosomos baltymų histonų masė yra apytikriai lygi DNR masei, histonų oktameras susijungia su maždaug 200 nukleotidų porų DNR; z histonų oktameras yra kompaktiška struktūra, apie kurią apsivynioja DNR; z su viena nukleosoma chromatine yra susijungusi maždaug viena jungties histono (pvz., H1) molekulė. Nukleosoma yra pirmasis chromatino organizacijos lygmuo. Chromatine nukleosomos išlieka ir mitozės, ir interfazės metu. Jų yra euchromatine ir heterochromatine. Nukleosoma yra pirmasis chromatino organizacijos lygmuo. Tam, kad pasiektų didžiausią DNR kondensaciją, kuri mitozės metu gali siekti kartų, DNR, organizuota į nukleosomas, kondensuojasi į dar keletą tarpinių struktūrų (3.1 lentelė, 3.1 pav.). In vitro geriau ištyrinėtos yra dvi tokios struktūros 10 nm chromatino siūlas (fibrilė) ir 30 nm chromatino siūlas (fibrilė) (3.2 pav.). 3.1 lentelė. Chromatino struktūros lygmenys Nr. Chromatino struktūra Kompaktizacijos laipsnis* 1. nuoga (be baltymų) DNR nm chromatino siūlas nm chromatino siūlas chromatino kilpa mitozinė chromosoma * Kompaktizacijos laipsnis nurodo, kiek mm DNR sutelpa į vieną atitinkamos chromatino struktūros ilgio mm. Aukštesnį DNR kompaktizacijos lygmenį atitinkančių chromatino struktūrų, pvz., chromatino kilpų bei mitozinių chromosomų, organizacija dar nėra gerai išaiškinta. Yra pasiūlytas ir kitas chromatino organizacijos modelis: z pirmąjį chromatino lygmenį sudaro nukleosomų grandinėlė (10 nm chromatino siūlas); z antrąjį chromatino lygmenį sudaro tarpusavyje sąveikaujančios nukleosomos (30 nm chromatino siūlas); ztrečiąjį chromatino lygmenį sudaro tarpusavyje sąveikaujančios antrojo lygmens struktūros kartu su chromatino architektūroje dalyvaujančiais baltymais. 111

112 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Molekulinė nukleosomos organizacija Nukleosomos išskiriamos tokiu būdu: suardomi ląstelių branduoliai, vėliau iš jų išskirtas chromatinas inkubuojamas į nedidelės joninės jėgos tirpalą. Chromatinas išbrinksta, kai kur išsivynioja į siūlo pavidalo struktūrą; joje elektroninės mikroskopijos būdu galima įžiūrėti pavienes nukleosomines daleles, kurias viena su kita jungia DNR. Praėjusio amžiaus 7-to dešimtmečio pradžioje buvo nustatyta, kad tokį iš dalies išpakuotą chromatiną paveikus fermentu mikrokokų nukleaze endonukleaze, skaidančia baltymais neapsaugotą DNR galima gauti pavienių dalelių. Dalelių sudėtyje aptikta baltymų ir ~ 200 nukleotidų porų DNR. Priešingai, veikiant mikrokokų nukleaze nuogą (be baltymų) DNR, buvo gauti skirtingų ilgių DNR fragmentai. Tai leido daryti prielaidą, kad chromosominė DNR yra apsaugota nuo nukleazių poveikio, išskyrus tam tikru periodiškumu pasikartojančias jos vietas. DNR, greičiausiai, apsaugojo baltymai. Tai leido R. Kornbergui suformuluoti jau minėtą chromatino struktūros nukleosomų hipotezę. Pavienės dalelės, gautos suskaidžius chromatiną nukleaze, yra pavienės nukleosomos. Jas sudaro penkių rūšių histonai H2A, H2B, H3, H4, vadinamasis jungties histonas (H1) ir DNR molekulė, kurios ilgis yra ~ 200 nukleotidų porų (3.3 pav.). Po dvi H2A, H2B, H3 ir H4 histonų molekules sudaro vadinamąją histonų šerdį, apie kurią apsivynioja DNR. Ilgiau inkubuojant nukleosomas mikrokokų nukleaze, įvairiu laipsniu suardomi ir apie histoninę šerdį apsivijusios DNR galai. Gaunamos nukleosominės dalelės, turinčios tik 165 nukleotidų porų DNR, chromatosomos (3.3 pav.). Ilgiau veikiant mikrokokų nukleaze, nuo jų atsiskiria H1 histonas. Nukleazė suskaido dar ~ 20 nukleotidų porų DNR, kurią, manoma, apsaugo jungties histono molekulė. Tokiu būdu gaunamos dalelės, kuriose apie histonų šerdį apsivyniojusi tik 146 nukleotidų porų DNR. Tokios dalelės yra vadinamos šerdinėmis nukleosominėmis dalelėmis (angl. nucleosome core particle). 2,8 Å skyros rentgenostruktūrine analize pirmą kartą nustatyta šerdinės nukleosominės dalelės erdvinė struktūra (3.4 pav.) m. atlikta 1,9 Ǻ skyros rentgenostruk- 3.2 pav. 10 nm ir 30 nm chromatino siūlai (fibrilės). Schema (a); chromatino siūlų nuotraukos, gautos elektroninės mikroskopijos metodu (b) ( umkc.edu/waterborg/ chromat/chroma09. html) 112

113 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 3.3 pav. Laipsniškas chromatino skaidymas mikrokokų nukleaze tūrinė analizė (analizės duomenis galima rasti peptidų duomenų bazėje (kodas 1AOI) interneto adresu Šia analize nustatytos visos baltymų ir DNR sąveikos šerdinėje nukleosominėje dalelėje bei ~ vandens molekulių buvimas Šerdinė nukleosominė dalelė Rentgenostruktūrine nukleosomų kristalų analize patvirtinta, kad nukleosomoje DNR apsiveja apie histonų šerdį 1,65 karto kairiuoju sukimu. Nukleosoma primena cilindrą, kurio aukštis yra ~ 6 nm, o skersmuo ~11 nm (3.4 pav.). Įeinančioji DNR (angl. entering DNA) ir išeinančioji DNR (angl. leaving DNA) nukleosomoje išsidėsčiuosios netoli viena kitos. 113

114 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.4 pav. Šerdinės nukleosominės dalelės struktūra, nustatyta 2,8 Å skyros rentgenostruktūrine analize. Vaizdas iš viršaus (a); vaizdas iš priekio (b). Rodyklėmis pažymėti DNR ir šerdiniai histonai (Nature, v. 389, p. 251, 2005) Kaip organizuotos histonų molekulės nukleosomoje? z Histonų tetrameras (H3-H4) 2, sudarytas iš dviejų H3-H4 heterodimerų, išsidėsto histonų šerdies centre; z du H2A-H2B heterodimerai išsidėsto ties DNR spiralės įėjimu ir išėjimu šerdinėje nukleosomoje. Histonų tarpusavio sąveiką daugiausiai lemia hidrofobinė sąveika. Nukleosomoje baltymams ir DNR būdinga tarpusavio elektrostatinė sąveika (sąveikauja histonų aminorūgštys ir DNR fosforo rūgšties liekanos), taip pat nepolinė sąveika (tarp aminorūgščių ir deoksiribozių). Kiekvienoje nukleosomoje susidaro 142 vandeniliniai ryšiai tarp histonų aminorūgščių ir DNR, iš jų maždaug pusė tarp aminorūgščių ir DNR fosforo rūgšties liekanų. Sąveika tarp histonų ir DNR heterociklinių bazių nenustatyta. Taigi, histonų ir DNR sąveikai nereikia savitųjų DNR sekų: histonų oktameras gali apsivyti apie bet kurią DNR. Vis dėlto DNR sąveika su histonų šerdies baltymais pasižymi tam tikrais struktūriniais ypatumais. DNR spiralei yra sunku beveik 2 kartus apsivynioti apie histonų oktamerą, nes reikia suspausti DNR mažąjį griovį. A ir T poras, esančias mažajame griovyje, yra 114

115 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA lengviau suspausti negu G ir C poras, todėl kiekvienas histonų oktameras stengiasi išsidėstyti taip, kad sąveikautų su A ir T poromis, esančiomis DNR spiralės mažuosiuose grioviuose. DNR fragmentas, turintis daugiau A ir T porų, lengviau apsivynioja apie histonus nei tas, kuriame daugiau G ir C porų (3.5 pav., a). Pastarųjų metų žmogaus ląstelių chromatino visuminiai tyrimai parodė, kad bent jau pirminėse kraujo ląstelėse tik nedidelės dalies nukleosomų padėtis yra susijusi su tam tikromis DNR sekomis (angl. nucleosome positioning). DNR spiralėje, apsivejančioje šerdinius histonus, vidutinis DNR sūkis yra mažesnis negu įprastos B formos DNR spiralėje ir talpina ~ 10,2 (o ne 10,5) nukleotidų porų. Toks pakitęs nukleosomos DNR spiralės periodas nėra toks pat visoje nukleosomos DNR, bet priklausomas nuo DNR lenkimo (angl. bending), susidarančio jai apsivejant apie histonų šerdį. Chromatino veiklos valdymui labai svarbi nukleosomos savybė yra ta, kad histonų, sudarančių nukleosomos šerdį, N galai yra išlindę į nukleosomos išorę (3.4 pav., a, b). H3 ir H2B histonų molekulių galai išlenda per plyšius, susidarančius tarp gretimų DNR vijų spiralių mažųjų griovių (tai įmanoma todėl, kad DNR kai kuriose vietose, kaip jau minėta, yra lenkiama), o H4 ir H2A histonų N galai išlenda per nukleosomos šonus. Išlindusiais į išorę šerdinių histonų N galais nukleosomos sąveikauja tarpusavyje. Histonų N galai lemia sudėtingiausių chromatino struktūrų (30 nm siūlo) susidarymą. Nors nukleosomines daleles stabilizuoja daugelis sąveikų tarp histonų ir DNR, nukleosomos yra dinamiškos struktūros. Veikiama baltymų (žr poskyrį Chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai ir transkripcijos valdymas ), histonų šerdis gali būti išstumta iš nukleosomos ir perkelta pakankamai toli DNR atžvilgiu Į nukleosomos sudėtį įeinančių histonų savybės Histonų molekulių kiekvienoje eukariotų ląstelėje yra nepaprastai daug: ~ 60 milijonų. Histonų genų kopijų eukariotų genomuose yra nuo pelės ląstelėse iki kelių šimtų jūrų ežio lastelėse. H3 ir H4 histonai sudaro du H3-H4 dimerus, kurie jungiasi į (H3-H4) 2 tetramerą. Centrinio histonų šerdies (H3- H4) 2 heterotetramero pagrindas dviejų H3 histonų molekulių keturių a spiralių ryšulys (angl. four helix bundle). Kitas keturių spiralių ryšulys, kurį sudaro H4 ir H2B histonų a spiralės, riša H2A-H2B dimerą su H3-H4 dimeru. H2A ir H2B histonai gali sudaryti įvairius kompleksus, tačiau dažniausiai sudaro H2A-H2B heterodimerus. Nukleosomos histonų šerdį sudaro keturių rūšių histonų molekulės, kiekvieno tipo po dvi, iš viso aštuonios. In vitro tetrameras ir du dimerai jungiasi į histonų šerdį tam tikra tvarka: pirmiausiai jungiasi (H3-H4) 2 tetrameras, vėliau prie jo prisijungia du H2A-H2B dimerai. Histonų oktamero, kuris susiformuoja sąveikaujant šerdiniams histonams tirpale, erdvinė struktūra yra panaši į oktamero struktūrą šerdinėje dalelėje. Tai reiškia, kad histonų oktamero struktūrą lemia sąveika tarp pačių histonų molekulių. 115

116 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.5 pav. Histonų klostė ir DNR sąveika su histonų šerdimi. Nukleosomos DNR sąveika su histonų šerdimi (a); H3 ir H4 histonų erdvinė struktūra. a spiralės ir kilpos pažymėtos atitinkamai a ir L (b); nukleosomos šerdies histonų molekulių struktūrinės schemos. Punktyru pažymėtos nestruktūrizuotos baltymų dalys (c) (Encyclopedia of Life Sciences, 2001) Histonai yra nedideli, kda baziniai baltymai, kurių sudėtyje yra daug teigiamai įkrautų aminorūgščių lizino ir arginino liekanų (3.2 lentelė). Atsižvelgiant į bazinių aminorūgščių kiekį histonuose, histonai skirstomi į turinčius daug lizino (pvz., H1) ir turinčius daug arginino (pvz., H3). Visų šerdį sudarančių histonų erdvinė struktūra yra panaši. Kiekvienas šerdinis histonas turi kompaktišką aminorūgščių domeną, vadinamąją histonų klostę (angl. histone fold) (3.5 pav., b, c). Histonų klostę sudaro trys a spiralės: centrinė didelė spiralė ir dvi mažesnės, kurias tarpusavyje jungia L1 ir L2 kilpos. Sąveika tarp šerdinių histonų centrinių spiralių stabilizuoja histonų heterodimerus. Likusios šerdinių histonų N galinių aminorūgščių yra nestruktūrizuotos. N galai yra mažiau konservatyvūs nei centrinės molekulių dalys. N galai išlenda į nukleosomos išorę per centrinį plyšį ir šonuose per DNR mažuosius griovius (3.4 pav., a, b). N galai labai svarbūs chromatinio struktūrai ir funkcijoms, tačiau jų vaidmuo skirtingas. 116

117 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA H2A histonas turi ir kintamo ilgio nestruktūrizuotą C galą (3.5 pav., b). Histonų galuose esančios aminorūgštys yra įvairiai modifikuojamos. Modifikacijos yra labai svarbios chromatino funkcijoms. 3.2 lentelė. Histonų savybės Histonų tipas Molekulinė masė daltonais Aminorūgščių skaičius Lizino ir arginino kiekis procentais H2A % lizino, 9 % arginino +15 H2B % lizino, 6 % arginino +19 H % lizino, 15 % arginino +20 H % lizino, 14 % arginino +16 H % lizino, 2 % arginino +58 Bendras molekulės krūvis Nukleosomos šerdies H3 ir H4 histonai yra vieni konservatyviausių eukariotų baltymų vienai aminorūgščiai šių histonų molekulėje pakisti reikėjo ~ 1 milijardo metų (palyginkime: hemoglobino baltymo molekulei taip pat pasikeisti reikėjo ~ 6 milijardų metų). H4 ypač konservatyvus. Žinduolių ir augalų organizmai skiriasi 2 aminorūgštimis. Tai, kad kiekviena aminorūgštis histonų molekulėse nepaprastai svarbi, patvirtino mielių histonų aminorūgščių mutacijos: tik pavienių aminorūgščių mutacijos buvo neletalios, tačiau ir jos lėmė svarbius genų raiškos pokyčius ir įvairias mielių anomalijas. Kodėl histonai yra tokie konservatyvūs baltymai? Viena priežasčių, nulėmusių šią savybę, galėtų būti ta, kad histonai ląstelėje sąveikauja su DNR, kurios molekulinė struktūra visuose organizmuose yra tokia pati. Kita galima priežastis: beveik visos šių nedidelių baltymų aminorūgštys dalyvauja ryšiuose arba su DNR, arba su kitais baltymais. Nors šerdiniai histonai yra labai konservatyvios molekulės, daugelyje eukariotų, be įprastų histonų, yra aptikti ir histonų baltymų variantai, kuriuos koduoja nealeliniai genai, o aminorūgščių sekos skiriasi nuo įprastų histonų. Histonų variantų įvairovė skiriasi tarp organizmų. Erdvinė nukleosomų, turinčių histonų variantus, struktūra, ypač nukleosomų paviršius, skiriasi nuo įprastos nukleosomos. Geriausiai yra ištirti H2A histonų (H2A.Z, H2A.X, MakroH2A ir H2A.Bbd ir kt.) bei H3 histonų (H3.3, CenH3 bei kt.) variantai. Nustatyta ir H2B histono variantų (3.3 lentelė). Specializuoti histonai egzistuoja kartu su įprastais (kanoniniais) histonais ir sudaro nukleosomas. Tiesa, jie sintetinami ne per S fazę jų įsijungimas į nukleosomas nepriklauso nuo DNR sintezės kaip įprastų histonų. H2A.Z histonas yra gyvybiškai svarbus daugeliui organizmų (Drosophilla, Tetrahymena, pelės), tačiau jo funkcija nėra iki galo išaiškinta. Histonas aptinkamas ir ties aktyviai transkribuojamais genais, ir ten, kur genų raiška slopinama. Esant DNR pažaidoms (dvigrandiniams trūkiams), H2A.X histono C gale fosforilinama serino aminorūgšties liekana. Histoną fosforilina ATM bei kitos kinazės, kurios telkiamos trūkių vietose. Šis histonas atsitiktiniu būdu pasiskirstęs chromatine, kur nukleosomose pakeičia H2A histoną. Histonų fosforilinimas išplinta nuo DNR pažaidos vietos nuo tūkstančių iki milijonų nukleotidų porų. Tada prie fosforilintų histonų telkiami reparacijos kompleksai. Taigi, H2A.X yra vienas ankstyvųjų DNR pažaidų jutiklių. 117

118 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Neaktyvios žinduolių X chromosomos taip pat turi vieną iš histonų variantų macroh2a, kuris yra bent tris kartus didesnis už H2A histoną. H2A.Bbd (angl. bar body deficient) histonas, priešingai, neaptinkamas neaktyviojoje X chromosomoje. H2A.Bbd aminorūgščių seka labai skiriasi nuo H2A histono. H2A.Bbd yra tose chromatino srityse, kuriuose vyksta transkripcija. Vienas histonų variantas CenH3 išskirtinai būdingas heterochromatinui, kuris yra chromosomų centromerų srityse. Žmogaus CenH3 histonas CENP-A. CENP-A yra būtinas histonas centromeroms susidaryti. Jo aminorūgščių seka tik ~ 46 % identiška H3. Susidarius centromerų nukleosomoms, prie jų prisijungia savitieji centromerų baltymai (CENP-B ir CENP-C), o toliau formuojasi kinetochorai struktūros, prie kurių tvirtinasi mitozinės verpstės mikrovamzdeliai. Žinduolių organizmuose nustatyti H3 variantai H3.1 ir H3.2, besiskiriantys tik viena aminorūgštimi. Jie atlieka H3 histonų vaidmenį nukleosomose. H3.3 histonas skiriasi nuo H3 trimis penkiomis aminorūgštimis. Pakeitus H3 histoną H3.3 histonu, aktyvinama genų raiška, kuri iki tol buvo slopinama dėl H3 histono lizino, esančio 9-oje padėtyje, metilinimo. Nėra daug žinoma, kaip specializuoti histonai pakliūva į savo vietą chromatine. Tai, kad įvairūs šerdinių histonų variantai aptinkami tam tikrose chromatino vietose, liudija apie evoliucinę chromatino adaptaciją. 3.3 lentelė. Žinduolių histonų variantai, lokalizacija ir funkcijos 1 Histonas Ląstelės ciklo fazė, kurios metu vyksta histono sintezė Lokalizacija Funkcija H2A S Visame genome Šerdinis histonas H2A.X ne S Visame genome ties DNR pažaidomis DNR reparacija, genomo integralumas H2A.Z ne S Visame genome a Genų raiškos aktyvinimas, slopinimas, chromosomų padalijimas H2A.Bbd Nenustatyta Nėra Xi (neaktyviojoje X chromosomoje) Genų raiškos aktyvinimas (?) Replikacija MacroH2A1.1 Nenustatyta Xi Xi chromosomos išaktyvinimas, genų raiškos slopinimas (?) MacroH2A1.2 Nenustatyta Xi Xi chromosomos išaktyvinimas, genų raiškos slopinimas (?) MacroH2.A2 Nenustatyta Xi Xi chromosomos išaktyvinimas, genų raiškos slopinimas (?) H2B S Visame genome Šerdinis histonas sph2b b Nenustatyta Telomerose Nenustatyta H2BFWT Nenustatyta Telomerose (?) Nenustatyta htsh2b b Nenustatyta Nenustatyta Nenustatyta H3.1 c S Nenustatyta Nenustatyta H3.2 c S Nenustatyta Nenustatyta H3.3 ne S Euchromatine Genų raiškos aktyvinimas H3.1t b S (?) Nenustatyta Nenustatyta CenH3 ne S Centromerose Chromosomų padalijimas H4 S Visame genome Šerdinis histonas a S. cerevisiae H2A.Z telkiasi ties euchromatino ir heterchromatino riba ir, manoma, tokiu būdu apsaugo nuo heterochromatino plitimo į euchromatino sritis; b sintetinamas sėklidėse; c H3.1 ir H3.2 žinduolių organizmuose skiriasi tik viena aminorūgštimi, jie yra kanoniniai histonai, todėl dažnai vadinami tiesiog H3. 1 Pagal: E. Bernstein and S. B. Hake. Biochem Cell Biol, 2006; A. Loyola and G. Almouzni. Trends Biochem Sci,

119 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Kitaip nei daugelio baltymų, kurie sintetinami per ląstelės ciklo interfazę, pagrindinių histonų sintezė vyksta per S fazę, kai vyksta ir DNR replikacija. S fazės metu histonų irnr kiekis išauga apie 5 kartus (tai lemia bent du veiksniai: padidėjusi transkripcija ir padidėjęs irnr stabilumas). Baigiantis S fazei, kai baigiasi ir DNR replikacija (arba esant DNR sintezės slopiklių), pagrindinių histonų irnr stabilumas staigiai krinta, irnr suskaidomos per kelias minutes. Histonų variantai dažniausiai sintetinami ne per S fazę (3.3 lentelė). Histonų molekulės yra labai stabilios ir gali tokios išlikti visą ląstelės amžių. Ryšys tarp histonų ir DNR sintezės yra labai glaudus. Jis užtikrinamas grįžtamosios kontrolės (angl. feedback) principu: ląstelėje nustatomas laisvų histonų kiekis ir iš to sprendžiama, kiek reikės sintetinti naujų histonų, kad jų užtektų susidaryti nukleosomoms iš naujai replikuotos DNR Histonų aminorūgščių modifikacijos ir jų biologinė reikšmė H2A, H2B, H3, H4 histonų, jungties histonų, histonų variantų molekulės po transliacijos yra modifikuojamos prie aminorūgščių kovalentiniais ryšiais prijungiant įvairių cheminių struktūrų grupes ar baltymus (angl. post-translational modifications, PTMs). Histonuose modifikuojamos savitos aminorūgštys savitose padėtyse. Modifikuojama > 160 aminorūgščių liekanų (modifikacijos nustatytos su savitaisiais antikūnais ir masių spektrometrija). Daugiausiai modifikuotų histonų yra molekulių N galuose, kurie išlenda į nukleosomų paviršių. Tačiau rasta modifikacijų ir nukleosomos viduje. Parodyta, kad šerdies histonai gali būti modifikuojami ir nesimetriškai viena to paties histono molekulė modifikuojama, kita ne. Taigi, modifikacijų kombinacijų skaičius gali būti didžiulis. Histonų aminorūgščių modifikavimas valdomas dinamiškas procesas, vykstantis per įvairius ląstelės gyvenimo tarpsnius: chromatino susidarymą, tam tikrų chromatino sričių genų transkripciją, mitozę, vystymąsi. Nustatyta daugiau nei dešimt skirtingų histonų aminorūgščių modifikacijų: zacetilinimas; zmetilinimas; zfosforilinimas; z ADP-ribozilinimas; zdeimininimas; z baltymo ubikvitino prijungimas; z baltymo SUMO prijungimas; zkrotonilinimas; z tirozino hidroksilinimas; z prolino izomerizacija; zbiotinilinimas. Histonų modifikacijos yra labai svarbios chromatino struktūros sudarymui ir genų veiklos valdymui. 119

120 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Įvairiausiai histonuose modifikuojamos lizino aminorūgščių liekanos (3.4 lentelė). Histonai sintetinami citozolyje, vėliau iš jų branduolyje sudaromos nukleosomos. Kai kurios modifikacijos vyksta citozolyje tuoj po baltymų biosintezės, tačiau dauguma branduolyje, histonams jau esant nukleosomų sudėtyje. Branduolyje sutelkta dauguma histonų aminorūgščių modifikacijas vykdančių bei jas pašalinančių fermentų. 3.4 lentelė. Kai kurios histonų aminorūgščių kovalentinės modifikacijos Histonų tipas Lys Lys Arg Ser Thr Acetilinimas Metilinimas Fosforilinimas Ubikvitino prijungimas Lys Lys Glu Asp SUMO prijungimas ADP-ribozilinimas Deimininimas Arg Prolino izomerizacija Pro-cis Pro-trans Modifikuojamos aminorūgštys H2A N N N H2B N N H N + N + + H N + N + N H1 N N + N N + N N Funkcija Transkripcija, reparacija, replikacija, kondensacija Transkripcija, reparacija Transkripcija, reparacija, kondensacija Transkripcija, reparacija Transkripcija Transkripcija Transkripcija Transkripcija N nenustatyta. Histonų acetilinimas. Pagrindinis acetilinimo taikinys histonuose yra ε aminogrupės lizino aminorūgštyse, esančiose histonų molekulių N galuose (3.6 pav., a). Acetilgrupės prijungimu panaikinamas neigiamas lizino šoninės aminogrupės krūvis. Acetilinimas nustatytas visuose šerdiniuose histonuose, tačiau nenustatytas H1 histone. Dar 1964 m. Vincentas Alfris (Vincent G. Alfrey) ir kt. ištyrė, kad in vitro acetilinti histonai slopina nuo DNR matricos vykstančią RNR sintezę mažesniu laipsniu negu neacetilinti. Vėliau atlikti tyrimai patvirtino, kad chromatino vietose, kuriose vyksta genų transkripcija, yra daug acetilintų histonų. Pvz., aktyviai transkribuojamame chromatine buvo acetilinamos tos aminorūgštys, kurios nebuvo acetilinamos nuolat neaktyviame (konstitutyviajame) heterochromatine histonuose (hipoacetilintame chromatine). Pakeitus mielių H4 histono acetilinamas lizino aminorūgščių liekanas arginino aminorūgščių liekanomis, vyko mielių tam tikrų genų transkripcijos slopinimas. Ėmė aiškėti akivaizdi sąsaja tarp histonų acetilinimo ir genų transkripcijos valdymo. Tik 1996 m. pirmą kartą buvo aptiktas eukariotinių organizmų fermentas, acetilinantis histonų molekules, histonų acetiltransferazė, HAT (angl. histone acetylransferase). Vėliau rasta daug baltymų, pasižyminčių histonų acetiltransferaziniu aktyvumu. Nustatyti ir modifikaciją panaikinantys fermentai histonų deacetilazės, HDAC (angl. histone deacetylase). Remiantis ankstesniais tyrimais, visiems šiems baltymams buvo priskiriamos transkripcijos aktyviklių ar represorių funkcijos. 120

121 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA HAT veikia ne pavieniui, o būdama didelių ląstelės baltyminių kompleksų sudėtyje (pvz., RNR Pol II transkripcijos komplekse). Pirmiausia nustatyta, kad histonų acetiltransferaziniu aktyvumu pasižymi mielių genų transkripcijos aktyviklis GCN5 baltymas. Parodyta, kad jis įjungiamas į 1,8 MDa kompleksą (SAGA), kurio komponentai sąveikauja su DNR ir dalyvauja transkripcijoje. Histonų acetiltransferaziniu aktyvumu taip pat pasižymi pagrindinio eukariotų RNR II polimerazės transkripcijos veiksnio TFIID subvienetas TAF II 250, žmogaus genų transkripcijos aktyviklis p300/cbp, mielių genų transkripcijos aktyviklis Nut1 baltymas. Pastarasis yra mediatoriaus komplekso, dalyvaujančio eukariotų genų transkripcijoje, sudėtyje (žr. skyrių RNR biosintezė ). Neretai transkripcijos kompleksuose yra ne viena, bet kelios skirtingo atrankumo histonų acetiltransferazės. Šiuo metu yra žinoma apie 20 eukariotų baltymų, pasižyminčių histonų acetiltransferaziniu aktyvumu. Jie yra skirstomi į kelias histonų acetiltransferazių šeimas (GNAT, MYST, p300/cbp, GCN5/PCAF, kt.). Chromatino imunoprecipitacijos ir chromatino sekoskaitos (angl. chip seq) ekperimentai, kuriuose buvo naudojami acetilintoms histonų formoms savitieji antikūnai, parodė, kad HAT fermentai dažniausiai modifikuoja histonus ties genų promotorių sritimis. Histonų acetilinimo pasekmės yra tokios: z nukleosomoje susilpninami ryšiai tarp DNR bei histonų, ir tokiu būdu palengvinamas tolesnis transkripcijos aktyviklių jungimasis (3.6 pav., b); z sukuriamos savitos atpažinimo vietos baltymams, dalyvaujantiems transkripcijoje (3.14 pav., b). 3.6 pav. Lizino acetilinimas histonuose ir jo poveikis chromatinui. Lizino e aminogrupės acetilinimas. Acetilgrupė apibrėžta raudonai (a); acetilinimo poveikis suminiam šerdies histonų teigiamam krūviui ir transkripcijai. HAT histonų acetiltransferazė, TF transkripcijos veiksnys, pol II holo RNR II polimerazės holofermentas (b) 121

122 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Histonų acetilinimas gali vykti ne tik ties pavienių genų promotorių sritimis, bet ir didelėse chromatino srityse. H3 ir H4 histonų molekulių N galai yra acetilinami konservatyviose padėtyse (3.7 pav.). H3 lizinas 14 ir H4 lizinai 8 ir 16 acetilinami branduolyje A grupės HAT fermentų. Šis histonų acetilinimas susijęs su genų transkripcijos aktyvinimu. Priešingai, H4 histono lizinai 5 ir 12 acetilinami citozolyje, kai sintetinamos naujos histonų molekulės, dar iki joms susiformuojant į nukleosomas. Šias modifikacijas vykdo B grupės histonų acetiltransferazės. Citozolyje modifikuoti histonai surenkami į nukleosomas, o acetilgrupės histonuose greitai pašalinamos histonų deacetilazių. Šis acetilinimo citozolyje pavyzdys liudija, kad acetilinimas susijęs ne tik su transkripcija branduolyje, bet ir su naujų nukleosomų susidarymu replikacijos metu. Nustačius funkcinį ryšį tarp histonų acetilinimo ir genų transkripcijos, buvo parodyta, kad histonų deacetilinimas sukelia genų transkripcijos slopinimą, o daugelis baltymų, anksčiau laikytų tik transkripcijos represoriais, pasižymi deacetilaziniu aktyvumu. Beveik visuose organizmuose transkripciškai neaktyvus chromatinas yra hipoacetilintas. Ryšys tarp chromatino funkcinio aktyvumo ir histonų acetilinimo / deacetilinimo akivaizdus mielėse: sir genų produktai, baltymai Sir2, Sir3, Sir4, dalyvauja susidarant chromatino tyliosioms sritims bei telomerinėms sritims. Sir3 ir Sir4 baltymai prisijungia prie deacetilintų histonų in vitro. Sir2 baltymas yra nuo NAD + priklausoma histonų deacetilazė. Tačiau ne viskas taip paprasta: nustatytas ir priešingas histonų acetilinimo poveikis transkripcijai. Mielėse bei drozofiloje H4 histono lizino aminorūgšties liekanos (12 padėtyje) acetilinimas sukelia genų transkripcijos slopinimą. 3.7 pav. Kai kurios šerdinių histonų aminorūgščių modifikacijos. Modifikacijų trumpiniai: ph fosforilinimas, ac acetilinimas, me metilinimas, ub1 baltymas ubikvitinas (Nature Structual Molecular Biology. v. 14, p. 1008, 2007) 122

123 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Neacetilinti histonai būdingi heterochromatinui. Šia savybe pasižymi tiek konstitutyvusis heterochromatinas (centromerose ir telomerose), tiek fakultatyvusis heterochromatinas (neaktyvus vienose ląstelėse, tačiau aktyvus kitose). HAT koduojančių genų iškritos ir mutacijos lemia įvairius embriogenezės sutrikimus (nustatytus eksperimentais su pelėmis), taip pat yra susijusios su žmogaus tam tikrais piktybiniais navikais (pvz., mutacijų sukeltas sutrikęs histonų acetilinimas yra susijęs su daugeliu leukemijos rūšių). Pagrindiniai neatsakyti klausimai apie histonų acetilinimą ir jame dalyvaujančius fermentus yra tokie: kaip atrankiai atpažįstama viena ar kita aminorūgštis histonuose, kurią reikia acetilinti? Kodėl vienas aminorūgštis acetilina vienos grupės HAT, o kitas kitos? Ar lizinų krūvio panaikinimas juos acetilinant lygiai taip pat susilpnina histonų ir DNR bei nukleosomų tarpusavio ryšius ląstelėje, kaip tai nustatyta in vitro? Histonų fosforilinimas. Histonuose fosforilinamos serino ir treonino aminorūgščių liekanos (3.7 pav.). Fosforilinimo reakcijas vykdo fermentai kinazės. Manoma, kad histonų, ypač H1 ir H3, fosforilinimas yra susijęs su chromosomų kondensacija mitozės metu. Pvz., H1 histonas fosforilinamas sukultūrintose ląstelėse prasidėjus mitozei ir greitai defosforilinamas po anafazės. Šis histonas yra Cdc2 kinazės, kuri dalyvauja ląstelės dalijimosi valdyme, substratas. Taigi, histonų fosforilinimas-defosforilinimas yra cikliškas. Histonus defosforilina fosfatazių 1 bei 2 šeimų fosfatazės (PP1, PP2). Neblogai ištyrinėtas yra H3 histono serino aminorūgšties liekanos 10-oje pozicijoje fosforilinimas. Panaudojus savitus antikūnus prieš šioje pozicijoje fosforilintą seriną, buvo nustatyta, kad modifikacija stipriai koreliuoja su chromosomų kondensacija mejozės ir mitozės metu. Sąsają tarp H3 histono fosforilinimo ir chromatino supakavimo patvirtina eksperimentai su pirmuonimi Tetrahymena. Tetrahymena mutante, kurio H3 10-oje pozicijoje esanti serino liekana negalėjo būti fosforilinama, nenormaliai vyko chromosomų kondensacija bei padalijimas. Išveiklinus (angl. knockout) Jil-1 kinazės, kuri fosforilina Ser 10 H3 histone, geną, pasekmės D. melanogaster buvo letalios: prieš žūvant musių lervoms, jų politeninės chromosomos buvo ypač kondensuotos. Taigi, H3 fosforilinimas sąlygoja normalios kondensacijos chromatino susidarymą. Eksperimentiniai duomenys liudija, kad ši histonų modifikacija yra susijusi ir su genų transkripcijos aktyvinimu. Pvz., H3 histono fosforilinimas koreliuoja su c-jun, c-fos, c-myc onkogenų transkripcijos aktyvinimu. Tiriant fosforilintų histonų pasiskirstymą mielėse chromatino imunoprecipitacijos metodu, rasta, kad fosforilinti histonai pasiskirstę ne tolygiai, bet ties tam tikrais genais. Jau minėta, kad H2A.X histono fosforilinimas yra svarbus DNR dvigrandinių trūkių reparacijai. Histonų metilinimas. Histonuose metilinami lizinai ir argininai, dažniausiai histonų H3 bei H4 molekulių N galuose (3.7 pav.). Metilinimas nesumažina bendro lizino teigiamo krūvio, kaip acetilinimo atveju. In vivo lizinų aminorūgščių liekanos gali būti mono-, di- arba trimetilintos (3.8 pav.), o argininų mono- arba dimetilintos (3.9 pav.). Tokia metilinimo derinių įvairovė užtikrina įvairias su chromatino veikla susijusias funkcijas. Histonus metilina savita fermentų grupė histonų metiltransferazės, HMT (angl. histone methyltransferase). Histonų metiltransferazės yra vieni atrankiausių žinomų fermentų. Lizinus metilina lizinų metiltransfereazės, o argininus argininų metiltransferazės. Mono-, di-, trimeti- 123

124 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.8 pav. Lizino ε aminogrupės mono-, di-, trimetilinimo reakcijos. SAM S-adenozilmetioninas, SAH S-adenozilhomocisteinas (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8, p. 307, 2007) linimo funkcijas atlieka skirtingi fermentai. Visų iki šiol atrastų histonų metiltransferazių substratas S-adenozilmetioninas. Pirmosios histonų metiltransferazės atrastos palyginti neseniai (2000 m.). Šiuo metu jau žinomos bent kelios arginino metiltransferazės ir daugelis lizino metiltransferazių. Skirtingų histonų metilinimas yra susijęs su skirtingomis chromatino funkcijomis. Pirmiausiai nustatyta, kad H3 Lys9 metilinimas yra susijęs su genų veiklos slopinimu ir yra kondensuotų chromatino sričių, tarp jų ir heterochromatino, savybė. Pvz., E ciklino promotoriaus aktyvumas slopinamas ląstelės ciklo G1 fazėje dėl lizino, esančio 9-oje padėtyje, metilinimo. Pereinant iš G1 į S fazę ši modifikacija turi būti panaikinta, kad vyktų E ciklino geno raiška. Mielėse Lys4 pozicijoje metilinti H3 histonai yra tyliosiose chromatino srityse. Tačiau kai kuriuose eukariotuose (mielėse) Lys4 metilinimas H3 histone yra susijęs su genų transkripcijos aktyvinimu. Manoma, kad ne tiek metilinimo padėtis histonų molekulėse, kiek metilinimo laipsnis turi didesnės įtakos funkcinėms modifikacijų pasekmėms. 3.9 pav. Arginino mono-, dimetilinimas. SAM S-adenozilmetioninas, SAH S-adenozilhomocisteinas (Genes and Development, v. 15, p. 243, 2001) 124

125 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Iki šiol manyta, kad histonų metilinimas, kitaip nei acetilinimas ir fosforilinimas, yra ilgalaikė ir negrįžtama histonų molekulių modifikacija. Tačiau 2010 m. pirmą kartą rastas fermentas, demetilinantis H4 Lys20. In vitro galima atrankiai demetilinti mono- bei dimetilintą lizino liekaną reakciją katalizuoja žmogaus fermentas poliamino oksidazė (LSD1). Deimininimas. Deimininimo reakcijos metu argininas verčiamas citrulinu. H3 ir H4 histonų arginino liekanos verčiamos citrulinu dalyvaujant fermentui peptidilarginino deiminazei 14 (PAD14). PAD14 gali deimininti ir monometilintą argininą (3.10 pav.). Ubikvitino ir SUMO baltymų prijungimas. Šių baltymų prijungimas yra didžiausios histonų aminorūgščių liekanų modifikacijos. Ubikvitino (lot. ubīque bet kur, visur ) yra gausu eukariotų ląstelėse; tai nedidelis 76 aminorūgščių baltymas, kuris gali būti kovalentiniu ryšiu jungiamas prie įvairių substratų kelių fermentinių reakcijų (fermentinės kaskados) keliu. Kai prijungiamos kelios šio baltymo molekulės (t. y. vyksta poliubikvitilinimas), dažniausiai tokia modifikacija signalizuoja apie baltymo suardymą. Tačiau ubikvitino prijungimas taip pat gali būti signalas plazminės membranos baltymų endocitozei arba baltymo konformacijos pasikeitimui. Histonų molekulėse ubikvitino baltymas jungiamas dažniausiai jų C gale prie lizino aminorūgščių liekanos izopeptidiniu ryšiu (3.11 pav., b, c). Fermentas, kuris jungia ubikvitiną prie H2B histono Lys123 Rad6, pirmą kartą rastas mielėse. Žinduolių ląstelėse ~ 10 % H2A ir ~ 1,5 % H2B histonų turi prijungtą po vieną ubikvitino baltymo molekulę, t. y. histonai yra monoubikvitilinti. Nustatyti modifikaciją panaikinantys fermentai deubikvitilazės. H2A ir H2B histonų monoubikvitilinimo pasekmės chromatino funkcijoms yra skirtingos. H2A ubikvitilinimas labiau susijęs su genų raiškos slopinimu, o H2B ir su aktyvinimu, ir su slopinimu. Fermentai, ubikvitilinantys ir deubikvitilinantys histonus, yra dideliuose baltymų kompleksuose. Prie histonų lizino jungiamas ir kitas, į ubikvitiną panašus 101 aminorūgšties baltymas SUMO (angl. small ubiquitin-related modifier). Tarp SUMO ir ubikvitino baltymų 18 % aminorūgščių yra vienodos, baltymų erdvinės struktūros taip pat panašios (3.11 pav., a). SUMO prie baltymų yra jungiamas taip pat fermentinės kaskados keliu. SUMO prijungimas prie H4 histono aminorūgščių liekanų in vivo ir in vitro transkripciją slopino sukėlė nuo proteosomos priklausomą transkripcijos veiksnių suardymą. Parodyta, kad SUMO geno išveiklinimas (geno iškrita) mielėse panaikino heterochromatino slopinimą sukėlė Lys4 metilinimą ir aktyvino transkripciją pav. Arginino deimininimas (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8, p. 307, 2007) 125

126 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.11 pav. Ubikvitino ir SUMO baltymai bei jų jungimas prie histonų. Ubikvitino ir SUMO baltymų erdvinės struktūros (a) (Cell Molecular Life Sciences, v. 69, p. 3269, 2012); nukleosomos, kurioje ubikvitilinti du H2B histonai, erdvinė struktūra (b); izopeptidinis ryšys tarp histono lizino e aminogrupės ir ubikvitino (c) Histonų ADP ribozilinimas. Ši modifikacija konservatyvi stuburiniuose, tačiau neaptikta mielėse. Ji gali būti mono- arba poli- formos. Gali būti modifikuojami visi šerdiniai histonai ir jungties histonas. Modifikacijas vykdo MART baltymai monoadp riboziltransferazės ir PARP baltymai poli (ADP) polimerazės. Pirmieji fermentai prijungia monoadp ribozės liekaną, o antrieji šakotas poli (ADP) ribozės grandines prie glutamato (Glu) ir aspartato (Asp) histonų aminorūgščių liekanų γ karboksigrupių (3.12 pav., b). Modifikacija yra grįžtama: šakotas poli (ADP) grandines ląstelėje hidrolizuoja poli (ADP) ribozės glikohidrolazė (PARG) arba ribozilbaltymo liazė. Nustatyta, kad poli (ADP) ribozilintas chromatinas yra mažiau kondensuotas. Tai pasitarnauja transkripcijai (3.12 pav., a), nukleosomų dinamikai, DNR reparacijai, replikacijai. 126

127 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 3.12 pav. Histonų ADP ribozilinimas. Histonų ADP ribozilinimo pasekmės transkripcijai (a); poli (ADP) ribozės jungimas dalyvaujant poli (ADP) polimerazei PARP-1. Žaliomis rodyklėmis pažymėtos hidrolizės dalyvaujant glikohidrolazei (PARG) vietos (b) (Journal of Cell Science, v. 117, p. 6815, 2004) Prolino izomerizacija. Prolino aminorūgšties liekanos pasižymi cis arba trans konformacija. Šie konformaciniai pokyčiai gana stipriai veikia polipeptidę grandinę. Mielėse rastas fermentas FPR4, kuris vykdo prolino izomerizaciją H3 histone. Prolino izomerizacija gali būti reikalinga atpažinti ir metilinti H3 lizino aminorūgšties liekaną 36-oje padėtyje. Lizinų krotonilinimas m. didelio našumo chromatino analizės metodais rastos dar 67 naujos histonų modifikacijos, dalis jų krotonilinti lizinai (Kcr). Ši konservatyvi modifikacija aptikta genų promotorių ir stipriklių srityse. Vykstant spermatogenezei, po mejozės, Kcr žymi laikinas transkripciškai aktyvių genų sritis lytinėse chromosomose. Histonų biotinilinimas yra kovalentinis vitamino biotino prijungimas prie histonų lizino aminorūgščių liekanų. Ši histonų modifikacija atrasta pastaraisiais metais. Reakciją nepriklausomai vykdo bent du fermentai biotinidazė ir holokarboksilazės sintetazė. Spėjama, kad biotinilinami visų tipų histonai, nors kol kas nustatytos tikslios modifikuotų lizino aminorūgščių liekanų padėtys tik H3, H4, H2A histonuose. Biotinilinimas siejamas su ląstelių proliferacija, genų slopinimu, atsaku į DNR pažaidas bei apoptoze. Nustatyta, kad esant dvigrandinės DNR trūkių, kuriuos sukelia priešvėžinis vaistas etopozidas, H4 histonuose mažėja Lys12 biotinilinimo laipsnis. Biotinilinimas gali būti atsakas į DNR pažaidas. 127

128 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Histonų kovalentinių modifikacijų kodo hipotezė Nukleosominės dalelės, kuriose histonai yra modifikuoti, erdvinė struktūra nedaug skiriasi nuo nukleosominės dalelės, sumontuotos in vitro iš DNR bei rekombinantinių histonų baltymų (susintetintų E. coli bakterijoje ir neturinčių modifikacijų) erdvinės struktūros. Tai liudija, kad histonų aminorūgščių modifikacijos svarbios ne tiek nukleosomos struktūrai susidaryti ir / ar palaikyti, kiek kitiems biologiniams vyksmams m. Brajanas Štralis (Brian D. Strahl) ir Devidas Alis (David C. Allis), remdamiesi žiniomis apie histonų molekulių modifikacijų įvairovę ir jų savitumą, suformulavo modifikacijų kodo hipotezę. Hipoteze teigiama, kad chromatine egzistuoja histonų modifikacijų kodas, kurį skaito baltymai ir kitos molekulės, sąveikaujančios su chromatinu, ir tokiu būdu valdo chromatino veiklą. Šios hipotezės esmė yra ta, kad histonų modifikacijos ir / ar jų deriniai yra molekuliniai žymenys, kuriuos atpažįsta kiti ląstelės komponentai ir kurie lemia konkrečius biologinius vyksmus, pvz., transkripcijos aktyvinimą arba slopinimą, mitozę, naujų histonų susijungimą su replikuota DNR ir t. t. Histonų kodo hipotezė teigia, kad egzistuoja histonų modifikacijų kodas molekuliniai žymenys, kuriuos atpažįsta baltymai ir kitos molekulės, sąveikaujančios su chromatinu, ir lemia vyksmus, kurie valdo chromatino veiklą. Histonų kodo signalai gali būti: z trumpalaikiai, reikalingi aktyvinti arba slopinti individualių genų transkripciją; zstabilūs chromatino žymenys, sąlygojantys chromatino būseną, kuri paveldima epigenetiniu (ne DNR mutacijų) keliu pav. Histonų modifikacijų kodo pavyzdys. Dešinėje pateikta H3 ir H4 histonų kai kurių modifikacijų galima biologinė reikšmė 128

129 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Dalies konkrečių modifikacijų biologinė reikšmė yra išaiškinta: pvz., dvigubai acetilintas H4 histonas 9-oje padėtyje N gale atpažįstamas baltymo, kurio reikia genų raiškai vykti; metilinta lizino liekana H3 histone lemia chromatino susipakavimą, kuris slopina genų raišką, ir t. t. (3.13 pav.). Histonų kodo hipotezę paremia šie faktai: Pirma, tam tikri baltymai atrankiai jungiasi prie modifikuotų histonų. Pvz., grupė baltymų, kurie turi ~ 100 aminorūgščių savitą konservatyvų domeną bromodomeną, domenu atrankiai jungiasi su acetilintomis histonų aminorūgštimis. Bromodomeno struktūrai būdingas keturių a spiralių ryšulys (3.14 pav., a). Bromodomenų turi transkripcijos aktyvikliai, kurių sudėtyje yra HAT (jau minėti p300, GCN5, PCAF ir kiti baltymai). Kai kurie baltymai turi vadinamąjį dvigubą bromodomeną juo jungiasi prie dviejų acetilintų lizinų. Pirmą kartą ši savybė nustatyta eukariotų transkripcijos veiksnio TFIID baltyme TAF1. Kita grupė baltymų, sąveikaujančių su chromatinu, turi savitą ~ 60 aminorūgščių domeną chromodomeną, kuriuo sąveikauja su metilintu lizinu (3.14 pav., b). Pvz., chromodomenų turi histonų metiltransferazės, kiti chromatino slopinime, pertvarkoje dalyvaujantys baltymai. Su metilintais lizinais ir argininais atrankiai są pav. Baltymų domenai, kuriais jie sąveikauja su modifikuotomis histonų aminorūgštimis. Bromodomeno ir acetilinto lizino komplekso erdvinė struktūra (a) (PDB: 1e6i); chromodomeno ir metilinto lizino komplekso erdvinė struktūra (b) (PDB: 1KNA); baltymų, turinčių bromodomeną (TAFII, PCAF, GCN5) arba chromodomeną (HP1), sąveikos su chromatinu schema ir poveikis transkripcijai (c) 129

130 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.15 pav. Histonų modifikacijų tarpusavio ryšių pavyzdžiai. H3 histono Ser10 fosforilinimas skatina to paties histono Lys14 acetilinimą, kurį vykdo acetiltransferazinį aktyvumą turintis transkripcijos veiksnys GCN5 (a); H2B histono Lys120 monoubikvitilinimas skatina Lys4 trimetilinimą H3 histone, kurį atlieka baltymų kompleksas Set1-COMPASS. Metilinimas slopinamas, jeigu yra įvykęs netoli esančio arginino metilinimas (b) (Cell, v. 142, p. 683, 2010) veikaujančių baltymų domenų rasta ir daugiau PHD, Tudor, kt. Žinomi saviti domenai, kuriais baltymai jungiasi prie fosforilintų, ubikvitilintų aminorūgščių histonuose. Baltyminiuose kompleksuose, sąveikaujančiuose su chromatinu, gali būti ne vienas, o daugiau baltymų, turinčių įvairių savitų domenų, kuriais sąveikauja su histonų modifikacijų kombinacijomis moduliais. Antra, išaiškinti sudėtingi tarpusavio ryšiai (angl. histone crosstalk) tarp histonų modifikacijų: viena modifikacija gali priklausyti nuo kitos modifikacijos tame pačiame histone (cis padėtyje) ar / ir nuo modifikacijos kitame histone (trans padėtyje) (3.15 pav., a b) nm ir 30 nm chromatino siūlai Atskiros nukleosomų dalelės gaunamos išpakuotą chromatiną veikiant mikrokokų nukleaze. Tačiau pavienės nukleosomos ląstelėje paprastai neegzistuoja. Inkubuojant chromatiną nedidelės joninės jėgos tirpale, elektroninės mikroskopijos būdu matomos siūlų pavidalo ~ 10 nm skersmens struktūros, kuriose nukleosomas jungia DNR (3.2 pav., b). Tokioje struktūroje nukleosomos išsidėsčiusios reguliariai. Struktūrai susidaryti nereikia jungties histono molekulių, tačiau jų reikia kompaktiškesnei struktūrai 30 nm siūlui susidaryti. Taigi, 10 nm siūlas susidaro tik dėl pačių nukleosomų savybių. Nėra aišku, ar tokia struktūra egzistuoja in vivo ar tėra chromatino dekondensacijos in vitro pasekmė. 10 nm chromatino siūle esančios DNR kondensacijos laipsnis yra ~ 6 7, t. y. kiekvienas tokios struktūros ilgio mikrometras talpina 6 7 mikrometrus DNR. DNR, nukleosominėje grandinėje skirianti vieną nukleosominę dalelę nuo kitos, yra vadinama jungties DNR, arba DNR jungtuku. Jungtuko, skiriančio nukleosomines daleles, ilgis įvairių organizmų chromatine ir net to paties organizmo įvairių tipų ląstelėse skiriasi, tačiau tai neturi didelės reikšmės nukleosomoms ir chromatinui susidaryti. Pvz., mielių chromatine jungtuką 130

131 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 3.16 pav. 30 nm chromatino siūlo solenoido ir zigzago modeliai. Kairėje 30 nm chromatino struktūros in vitro elektroninės mikroskopijos nuotrauka (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) sudaro ~ 20 nukleotidų porų DNR, o jūros ežio ~ 100 nukleotidų porų DNR. Žinduolių neuronuose nukleosomos yra labai glaudžiai supakuotos, be jungtukų, o greta esančiose glijos ląstelėse jas skiria 34 nukleotidų porų DNR. DNR, apsivijusi apie histonų oktamerą (šerdinėje nukleosominėje dalelėje), ir DNR jungtukas nukleosomų kartotėje iš viso sudaro apie nukleotidų porų. Jungties histonus galima pašalinti iš chromatino veikiant jį 0,3 0,45 M NaCl tirpalu, H2A ir H2B histonus veikiant chromatiną ~ 0,8 M NaCl tirpalu, o histonų (H3-H4) 2 tetramerą veikiant chromatiną 1,2 M NaCl tirpalu. Nedidelės joninės jėgos tirpale chromatinas išsivynioja į 10 nm siūlą, kuriame elektroniniu mikroskopu aiškiai galima pamatyti atskiras nukleosomas. Padidinus tirpalo joninę jėgą, galima stebėti dar vieną chromatinui in vitro būdingą struktūrą 30 nm siūlą (3.2 pav., b). 30 nm chromatino siūle DNR kondensacijos laipsnis siekia ~ 40. Yra pasiūlyti solenoido ir zigzago, taip pat kiti 30 nm chromatino siūlo modeliai (3.16 pav.). Solenoido modelyje nukleosomos grandinėlė sukasi apie tariamą ašį, o nukleosomos išsidėsto nuosekliai viena greta kitos. Šis modelis dar vadinamas vieno starto modeliu. Zigzago modelyje nukleosomos išsidėsto zigzagu: vienõs nukleosomų grandinėlės nukleosomos sąveikauja su kaimyninėmis kitos grandinėlės nukleosomomis ir tokiu būdu 30 nm siūlą formuoja dvi nukleosomų grandinėlės. Kitaip šis modelis dar vadinamas dviejų startų modeliu m. 11 Å skyros krioelektroninės mikroskopijos metodu atlikta in vitro suformuotos struktūros, kurią sudarė 12 nukleosomų (kartu su jungties histonu H1) grandinėlė, analizė. Iš gautų mikroskopijos duomenų (3.17 pav., a) padaryta išvada, kad struktūra yra zigzago formos, atitinkanti dviejų startų modelį (3.17 pav., b). Remiantis šia išvada, pasiūlyta 30 nm chromatino siūlo struktūra, kurioje dvi nukleosomų grandinėlės sukasi viena apie kitą kairiuoju sukimu (3.17 pav., c). 30 nm chromatino siūle tarp nukleosomų, manoma, yra vidutiniškai po vieną H1 histono molekulę (3.16 pav.). Apie H1 histono išsidėstymą chromatine iš pradžių spręsta iš biocheminių eksperimentų su mikrokokų nukleaze. Suskaldžius chromatiną, gautos chromatosomos, kuriose yra histonų šerdis, 165 nukleotidų porų DNR ir histono H1 molekulė. Toliau veikiant mikrokokų nukleaze pašalintas jungties histonas H1 ir suskaidytos dar 20 nukleotidų porų DNR. 131

132 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.17 pav. Chromatino 30 nm siūlo struktūra. In vitro suformuotos 12 nukleosomų grandinėlės (su jungties histonu H1) elektroninės mikroskopijos nuotraukos (a); mikroskopijos duomenimis paremtas 12 nukleosomų erdvinės struktūros modelis (nukleosomos sunumeruotos) (b); dviejų startų chromatino 30 nm siūlo modelis (c) (Science, v. 344 p. 376, 2014) Pašalinus H1 histoną, DNR suskaidyta į 146 np fragmentus. Gautos šerdinės nukleosominės dalelės, turinčios 146 np DNR. Taigi, jungties histonas H1 apsaugojo ~ 20 nukleotidų porų DNR, kuri jungia vieną nukleosomą su kita. Jungties histonas H1 yra Da molekulė, daug mažiau konservatyvus baltymas nei nukleosominės šerdies histonai. 80 % nukleosomų turi H1 histoną. H1 histono dydis smarkiai varijuoja tarp organizmų rūšių ir tos pačios rūšies organizmuose. Yra tam tikriems audiniams savitų H1 histonų. Pvz., žmogaus ir pelės ląstelėse yra 11 H1 histono variantų (potipių): H1 a-e, H1, H1t. H1 histonų potipių aminorūgščių sekos skiriasi %. H1 histono erdvinėje struktūroje yra konservatyvi centrinė globulė ir mažiau konservatyvūs nestruktūrizuoti N bei C galai (3.18 pav., a). Kai kurių organizmų H1 histono molekulė turi dvi globules, o, pvz., pirmuonies Tetrahymena H1 globulės neturi. Atlikus paukščių eritrocitų H5 histono (H5 yra H1 šeimos baltymas) globulės erdvinės struktūros analizę, nustatyta, kad ji panaši į su DNR sąveikaujančių baltymų, kurie turi vadinamąjį whth (angl. winged helix-turn-helix) motyvą (3.18 pav., b), struktūrą. Nestruktūrizuoti H1 histono galai galėtų neutralizuoti neigiamą jungties DNR krūvį ir taip skatinti chromatino kompaktizavimą. Fotoblukimo eksperimentų duomenys parodė, kad gyvų ląstelių chromatine H1 histonas pasiskirstęs tolygiai. Pasiskirstymas dinamiškas: H1 greitai prisijungia prie chromatino vietų ir greitai nuo jų atsijungia. Nustatyta, kad H1 pasiskirstymas pakinta, kai sukeliami dvigrandinės DNR trūkiai. Yra pasiūlytas H1 histono išsidėstymo 30 nm chromatino siūlo solenoido ir zigzago struktūrose modelis. Jungties histonas prisijungia nukleosomoje ties DNR įėjimo ir išėjimo vietomis, tačiau jo padėtis nėra simetriška nukleosomos ašies atžvilgiu (3.18 pav., c). Modelinės 12 nukleosomų grandinėlės krioelektroninės mikrosko- 132

133 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 3.18 pav. Jungties histono struktūra ir vieta nukleosomoje. Jungties H1 histono struktūros ir prisijungimo nukleosomoje schema (a); paukščių eritrocitų jungties histono H5 globulės erdvinė struktūra (b); H1 histono padėtis nukleosomoje remiantis 12 nukleosomų dalelės 11 Å krioelektroninės mikroskopijos duomenimis. Simetrijos ašis parodyta raudonu punktyru (c) (Science, v. 344 p. 376, 2014) pijos tyrimai parodė, kad greta esančių nukleosomų H1 histonai sąveikauja tarpusavyje ir tokiu būdu galėtų suartinti chromosomas. Duomenys apie H1 histono reikšmę chromatino struktūrai ir funkcijoms gana prieštaringi. Nėra aišku, kiek H1 svarbus aukštesnių chromatino struktūrų susidarymui. Ilgai vyravo požiūris, kad H1 histonas yra neatskiriamas chromatino komponentas, skatinantis chromatino kondensaciją ir tokiu būdu slopinantis genų transkripciją. Tačiau eksperimentais su Xenopus laevis parodyta, kad mitozinių chromosomų (tokios chromosomos savo fizinėmis savybėmis nedaug skiriasi nuo mitozinių chromosomų ląstelėje) susidarymui in vitro H1 histonas nėra svarbus. Pvz., pirmuonies Tetrahymena ir grybo Aspergillus nidulans mutantai neturi H1 koduojančio geno. Nors Tetrahymena mutantų branduoliai yra dvigubai didesni nei laukinio tipo ląstelių, organizmo gyvybingumui ir chromosomų bei branduolio struktūrai tai neturi reikšmingos įtakos. Kita vertus, pelių embrionai, turintys mažesnį H1 kiekį ląstelėse, žūva. Tai liudija apie H1 svarbą normaliam šių žinduolių vystymuisi Chromatino aukštesnio lygio struktūros Tolesnė chromatino kompaktizacija branduolyje nėra gerai išaiškinta. Daugiausiai žinių apie struktūrinę chromatino organizaciją buvo gauta tiriant mitozines chromosomas. Šiuolaikiniai tyrimų metodai (pvz., in situ hibridizacija, fluorescentinė gyvų ląstelių mikroskopija) jau leidžia tirti ir interfazinio chromatino struktūrinę organizaciją. 133

134 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.18 pav. Chromatino struktūra per interfazę ir mitozę. Struktūros modelis (kairėje); mitozinės chromosomos vaizdai, gauti įvariais vizualizavimo metodais (dešinėje) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second edition, 2007) Mitozinių chromosomų organizacija. Remiantis mitozinių chromosomų ir specializuotų chromosomų (pvz., politeninių chromosomų, lempų šepečių chromosomų) tyrimais, pasiūlytas toks tolesnio chromatino susipakavimo branduolyje modelis: 30 nm chromatino siūlas sudaro chromatino kilpas, kuriose DNR superspiralizuota, o jos kondensacijos laipsnis siekia ~ (3.19 pav.). Kiekviena mitozinė chromosoma tai atskira dvigrandinė DNR molekulė kartu su baltymais. Vidutinis chromosomos DNR dydis ~ 100 Mb. Užbaigtos kondensacijos mitozinę chromosomą sudaro dvi dukterinės chromatidės, kurias jungia centromera. Kai kuriais atvejais chromosomų kilpas patogu stebėti. Afrikos naguotosios varlės Xenopus laevis ovocitų chromosomos pasižymi tuo, kad turi didžiules kilpas, kurios puikiai matomos mikrosokopu. Tokios chromosomos vadinamos lempų šepečiais (angl. lampbrush). Šios chromosomos susidaro dėl labai užsitęsusios mejozės, kuri gali trukti mėnesius. Kiekviena konkreti lempų šepečių chromosomos kilpa atitinka konkrečią DNR seką ir lieka tokio kilpos pavidalo visą laiką, kol ovocitas auga. Įdomu, kad injekavus į ovocitą kito organizmo (pvz., žuvies) DNR, kuriai nebūdinga sudaryti lempų šepečių struktūrų, ovocite svetima DNR suformuoja tokias struktūras. Parodyta, kad lempų šepečių DNR kilpose intensyviai vyksta daugelio genų raiška. Deja, didžioji dalis lempų šepečių DNR yra ne kilpose, bet, smarkiai kondensuota, talpinama chromomerose struktūrinėse chromatino ašyse, nuo kurių kilpos išsišakoja. 134

135 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Mitozinėse chromosomose chromatino kilpos prisitvirtinusios prie pagrindo branduolio baltymų, dar vadinamų pastoliais (angl. scaffold) (3.16 pav.). Branduolio pastolių baltymai yra ne histonų tipo ir sudaro ~ 1/3 mitozinių chromosomų masės. Šie baltymai dar menkai ištirti. Pašalinus nukleazėmis didžiają dalį DNR ir histonų, pastoliai išlaiko savo struktūrą ir pri pav. SMC baltymų ir kompleksų struktūra. SMC baltymo dimero struktūros schema. Parodytos struktūros dalys ir aminorūgščių motyvai, sudarantys ATPazės aktyvųjį centrą (a) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7, p. 311, 2006); vidumolekulinio ir tarpmolekulinio SMC baltymų dimero susidarymo schemos (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biolology, v. 7, p. 311, 2006); kohezinų ir kondensinų kompleksų schemos (c) (Nature Reviews Genetics, v. 11, p. 391, 2010) 135

136 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 3.21 pav. Mitozinės chromosomos ir jų sritys per interfazę. Vaizdai gauti fluorescentinės hibridizacijos metodu, naudojant individualioms chromosomoms savitas fluorescentines žymes. Diploidinis mitozinių viščiuko chromosomų rinkinys (a); chromatinas per interfazę (b) (Nature Reviews Genetics, v. 2, p. 292, 2001) mena dvi chromatides (3.19 pav.). Sritys, kuriomis chromatino DNR prisitvirtina prie pastolių baltymų, pasižymi savitumu, nes turi charakteringų restrikcijos endonukleazių skeliamų sričių. Vienoje kilpoje yra apie nukleotidų porų DNR. Iš mitozinių chromosomų preparato pašalinus didžiąją dalį baltymų (histonų), kilpas galima stebėti elektroninės mikroskopijos būdu (3.19 pav.). Tõkios didžiõsios dalies baltymų netekusios chromosomos turi centrinį rezginį, nuo kurio į visas puses išsišakoja didžiulis DNR kilpų tinklas. Panaši chromatino struktūra stebima ir panašiu būdu veikiant ląstelių branduolius interfazės metu, tik ji dar sudėtingesnė, nes joje lieka daug ribonukleoproteinų. Chromatino kilpos gerai matomos metafazės metu, kai susidaro dukterinės chromatidės, kurias jungia centromera (3.19 pav.). Susiklosčiusi į kilpas DNR, pvz., žmogaus DNR, sudaro tik ~ 100 mikronų, bet kad tilptų branduolyje, ji turi dar labiau kompaktizuotis. Tokią kompaktizaciją pasiekia metafazinės chromosomos, kurių kondensacijos laipsnis yra Tokį kompaktiškumo laipsnį įgijusias chromosomas yra patogiausia paskirstyti tarp dukterinių ląstelių. Vienas baltymų, kurių kiekis mitozinių chromosomų pastoliuose yra didžiausias, tai DNR II topoizomerazė (Topo IIa). Imunofluorescentine analize nustatyta, kad II topoizomerazės gausu ties centromeromis ir išilgai dvigubų mitozinių chromosomų ašių ties DNR kilpų pamatu. Mielėse, turinčiose II topoizomerazės išveiklintą geną, nevyksta galutinė mitozinių chromosomų kompaktizacija. Gali būti, kad II topoizomerazė reguliuoja DNR superspiralizacijos procesą. Kita branduolio pastolių baltymų grupė, svarbi mitozinio chromatino kompaktizacijai, yra SMC (angl. structural maintainence of chromosomes) šeimos baltymai. Pirmieji SMC baltymai atrasti mielėse, kur jie reikalingi minichromosomoms palaikyti. SMC baltymai rasti visuose eukariotų genomuose, kurių nukleotidų seka yra nustatyta. Įdomu, kad jų turi ir beveik visi prokariotai. Pastarųjų metų tyrimai liudija, kad SMC baltymai yra viena svarbiausių baltymų grupių, valdančių chromatino struktūrinę ir funkcinę organizaciją organizmuose nuo bakterijų iki žmogaus. Mielių chromatino imunoprecipitacijos tyrimai parodė kondensinų telkimąsi centromerinėse, pericentromerinėse srityse, telomerose ir pasikartojančiose genomo srityse. 136

137 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA SMC baltymai yra dideli, aminorūgščių polipeptidai. Baltymų N ir C galuose yra išsidėstę ATPazėms būdingi vadinamieji aminorūgščių Volkerio motyvai, kurie prijungia ir hidrolizuoja ATP. Iškelta hipotezė, kad ATP jungimas ir hidrolizė sąlygoja chromatino struktūrinius pokyčius. Hipotezę paremia eksperimentai in vitro, kuriuose SMC baltymai sukėlė žiedinės DNR superspiralizaciją nuo ATP priklausomu būdu. Tarp SMC baltymų ATPazės motyvų yra ilgi, superspirales sudarantys domenai, perskirti lankstaus domeno, sąvaros (angl. hinge) (3.20 pav., a). In vitro tyrimais nustatyta, kad du SMC baltymai sudaro dimerus vieno monomero N galui sąveikaujant su kito monomero C galu arba dviems monomerams stipriai sąveikaujant per lankstųjį domeną (pastarasis atvejis dažnesnis) (3.19 pav., b). Baltymų dimeras įgyja įvairių erdvinių struktūrų. Dažniausia nustatyta struktūra primena V raidę. SMC baltymai sudaro didelės molekulinės masės baltymų kompleksų, svarbių eukariotų chromatino struktūrai per mitozę, mejozę ir kitus su DNR susijusius vyksmus užtikrinti, šerdį (3.19 pav., c). Homologiškų kompleksų turi netgi bakterijos. Eukariotuose žinomi šie kompleksai: z du kohezinų kompleksai (mitozės kohezinų kompleksas ir mejozės kohezinų kompleksas); ztrys kondensinų kompleksai (I kondensinas, II kondensinas ir genų dozės kompensavimo kompleksas I DC kondensinas); z DNR reparacijos kompleksas. Kompleksų sudėtyje yra du SMC šeimos baltymai ir 2 3 ne SMC baltymai (3.20 pav., c). Kohezinai laiko replikuotas DNR (seserines chromatides), t. y. užtikrina koheziją nuo S fazės pradžios iki mitozės, kol nesuardomas jų komponentas baltymas a kleizinas. Kondensinai per mitozę užtikrina savalaikę chromosomų kompaktizaciją ir naikina chromosomų sukibimą, susidariusį, manoma, dėl kompaktizacijos. Taip pat tiriamas kohezinų bei kondensinų vaidmuo ir per interfazę. Chromatino organizacija per interfazę. Anksčiau buvo manyta, kad chromatinas per interfazę yra difuziškai pasiskirstęs branduolyje. Pastarųjų metų chromatino tyrimai in vivo atskleidė, kad atskirų chromatino fragmentų dydis interfazės metu branduolyje keičiasi nežymiai. Tai liudija, kad jis yra supakuotas į pakankamai stabilias struktūras. Interfazinio chromatino sritys, kurios atitinka daugiau genų turinčias chromosomas, yra mažiau kondensuotos; jos išsidėsčiusios branduolio centre. Smarkiai patobulėjus chromatino analizės metodams, daugėja informacijos, kad interfazės metu chromosomos išlaiko savo struktūrą ir užima fiksuotas branduolio sritis (3.21 pav., a, b). Kai kuriais atvejais savitas interfazinio chromatino struktūras galima nesunkiai stebėti. Pvz., Drosophila, taip pat uodo trūklio lervų seilių liaukų ląstelės užauga labai didelės, kai jų DNR dauginamas daugybę kartų nevykstant ląstelių dalijimuisi. Tokiose ląstelėse DNR molekulių kopijos organizuotos politeninėse chromosomose, kuriose chromatidės išsidėsto viena šalia kitos. 137

138 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Chromatinas per interfazę tvirtinasi prie branduolio skeleto branduolio užpildo baltymų ir sąveikauja su tankiąja plokštele lamina, kuri iškloja branduolio apvalkalėlį iš vidaus. Branduolio užpildo baltymų skaičiuojama iki kelių šimtų. Laminą sudaro branduolio užpildo baltymai laminai, kai kurie branduolio vidinės membranos baltymai, periferiniai baltymai. DNR prisitvirtina prie branduolio užpildo baltymų per savitas branduolio užpildo prisijungimo sekas MAR-SAR (angl. matrix attachment region / scaffold atachment region) sekas. Sekose yra gausu A ir T nukleotidų (70 %), tačiau didesniu konservatyvumu jos nepasižymi. Būdinga MAR DNR sekų savybė ta, kad jose yra sričių, veikiančių kaip transkripcijos cis reguliacinės sekos, taip pat II topoizomerazės atpažinimo sričių. MAR-SAR sričių padėtis susijusi su chromatino veikla. Neaišku, ar MAR-SAR nukleotidų sekos yra tos pačios sekos, kuriomis DNR prisitvirtina prie pastolių baltymų mitozinėse chromosomose. Yra žinoma, kad dalis baltymų, dalyvaujančių palaikant mitozinių chromosomų ir interfazinio chromatino struktūras, skiriasi, tačiau kai kurie jų yra tie patys, pvz., II topoizomerazė. Tai liudija, kad DNR topologijos valdymas yra svarbus interfazinio ir mitozinio chromatino struktūrai Chromatinas ir replikacija Naujai susintetintos DNR molekulės greitai supakuojamos į chromatiną. Naujajame chromatine turi būti atgaminta visa epigenetinė informacija, kuri turi būti perduota ląstelėms (DNR metilinimo pobūdis, posttransliacinės histonų modifikacijos, histonų variantai ir jų pasiskirstymas). Turi egzistuoti mechanizmas, užtikrinantis greitą nukleosomų susidarymą ant replikuotos DNR. Vykstant DNR replikacijai, nukleosomos laikinai suardomos, kad replikacijos šakutės galėtų judėti pirmyn. Šerdies histonai disocijuoja į (H3-H4) 2 ir H2A-H2B kompleksus. Nukleosomos labai greitai vėl susidaro ant dukterinių DNR grandinių. Elektronine mikroskopija nustatyta, kad nenukleosominės struktūros DNR yra tik ties replikacijos šakute, o jau už ~ 600 nukleotidų poros DNR yra nukleosominės struktūros (3.22 pav.). Kaip vyksta naujų nukleosomų susidarymas ant dukterinių DNR grandinių? Galimi du keliai: z prie DNR pirmiausiai prisijungia (H3-H4) 2 histonų tetrameras, vėliau prisijungia du H2A- H2B histonų heterodimerai ir užbaigia histonų šerdies, apie kurią apsiveja 146 nukleotidų porų DNR, formavimąsi; z apie jau susiformavusį šerdinių histonų oktamerą apsivynioja DNR ir susidaro nukleosomos. Naujų nukleosomų susidarymas ties replikuota DNR vyksta pirmuoju keliu. Antruoju keliu nukleosoma formuojasi vykstant chromatino pertvarkai. Nukleosomos ties naujai replikuota DNR susidaro iš senų ir naujai susintetintų histonų molekulių. Didžiosios dalies naujų histonų sintezė citozolyje koreliuoja su DNR replikacija. Reiškinys vadinamas nuo DNR replikacijos priklausoma histonų sinteze. 138

139 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Naujų histonų įjungimą į nukleosomas valdo baltymai histonų šaperonai, kurie prijungia histonus citozolyje ir branduolyje juos nukreipia link DNR. Čia histonų šaperonai atpalaiduoja pavienius histonus arba jų kompleksus, ir pastarieji kartu su DNR sudaro nukleosomas. Naujų histonų pristatymas į naujai replikuotos DNR vietą yra kritiškai svarbus: jeigu S. cerevisiae S fazėje nevyksta histonų sintezė, mielės yra negyvybingos, net jeigu histonų sintezė indukuojama po DNR sintezės ląstelės ciklo G2 fazėje. Histonų šaperonai neleidžia netaisyklingai susisukti (angl. missfolding) naujai susintetintiems histonams. Prisijungę prie histonų molekulių, šaperonai neutralizuoja teigiamą jų krūvį, tokiu būdu apsaugodami histonus nuo tarpusavio agregacijos, kitų tarpinių sąveikų. Histonų šaperonai taip pat veikia ir kaip histonų saugyklos pav. Nukleosomų susidarymo ties naujai replikuota DNR schema. Apačioje dešinėje replikuojamos DNR vaizdas, gautas elektronine mikroskopija. Aiškiai matyti nukleosomos už replikacinės šakutės ir prieš ją (Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2013) 139

140 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Tyrimų, kuriais siekta išaiškinti, kokią įtaką žmogaus ląstelių baltymai daro DNR replikacijai ir replikuotos DNR susipakavimui, metu buvo pastebėta, kad nukleosomos susidaro tik ant replikuojamos arba ką tik replikuotos DNR (3.22 pav.). Naujai susintetintus H3-H4 dimerus ties naujai replikuojama DNR pristato ASF1 šaperonas. ASF1 čia pristato ir tėvinius H3-H4 dimerus, išmontuotus iš senųjų nukleosomų H3-H4 tetramerų (3.22 pav.). Čia H3-H4 dimerus prijungia kitas šaperonas CAF1 (angl. chromatin assembly factor), kuris pasižymi funkcija prijungti dimerą ties replikuojama DNR. CAF1 (trys jo subvienetai) nustatytas žmogaus organizme, homologiškus kompleksus turi Sacharomyces ir Drosophila organizmai. CAF1 prisijungia prie histonų H3-H4 dimero ir nukreipia jį replikuotos DNR link (3.22 pav.). CAF1 prijungia H3-H4 histonų dimerą, kuriame histonai turi citozolio modifikaciją metilintą Lys 5 ir acetilintą Lys 12. Pirmiausiai ties naujai replikuota DNR sumontuojamas (H3-H4) 2 tetrameras, o vėliau, dalyvaujant kitiems baltymams, H2A-H2B histonų heterodimerai. Per S fazę CAF1 telkiamas ties euchromatinu, o vėliau nukreipiamas į replikuojamas heterochromatino sritis. Čia CAF1 sąveikauja su PCNA baltymu. PCNA baltymo gausu ties replikuojama ir reparuojama DNR (žr. skyrių DNR biosintezė ). Nustatyta, kad PCNA baltymas yra molekulinis žymuo, kurį CAF1 atpažįsta replikuojamoje arba ką tik replikuotoje DNR. PCNA baltymas pritraukia CAF1 prie DNR, čia jis atpalaiduoja H3-H4. H2A-H2B dimerams prijungti ties naujai replikuota DNR reikalingas kitas specializuotas šaperonas Nap1 baltymas, kuris, kaip ir CAF1 bei ASF1 histonų šaperonai, eukariotuose yra konservatyvus. Nap1 lokalizacija ląstelėje keičiasi priklausomai nuo ląstelės ciklo fazės. Taigi, Nap1 baltymas, greičiausiai, taip pat pasitelkiamas H2A-H2B histonų įnašai iš citozolio į branduolį. Prisijungus visiems šerdiniams histonams, vyksta chromatino brendimas: susidaro reguliarios nukleosomos, kurias skiria vienodo dydžio DNR jungtukai. DNR tampa nepasiekiama I DNazei, deacetilinamas H4 histonas, prie nukleosomų prisijungia H1 histonas. Tačiau vien tik histonų šaperonų nepakanka, kad susidarytų reguliarios chromatinui būdingos nukleosomos. Nustatyta, kad reguliarių nukleosomų susidarymui in vivo reikia papildomų veiksnių, pvz., chromatiną pertvarkančių kompleksų, kurių veikimui reikia ATP Chromatinas ir genų transkripcija bei jos valdymas Chromatine DNR yra nebeprieinama baltymams ir baltyminiams kompleksams, dalyvaujantiems genų transkripcijoje. Eukariotinėse ląstelėse egzistuoja keletas būdų įveikti chromatino struktūrinius barjerus: z histonų modifikacijos (pvz., acetilinimas, ubikvitilinimas); z chromatino struktūrą pertvarkantys baltyminiai kompleksai, kurių veikimui reikia ATP; z šerdinių histonų variantai (aptarti anksčiau), kurie tam tikrose chromatino vietose pakeičia įprastus histonus ir tokiu būdu veikia chromatino struktūrą. 140

141 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Histonų acetilinimas ir genų transkripcijos valdymas Daugiau nei prieš 30 metų buvo pasiūlyta hipotezė, kad histonų lizino aminorūgščių liekanų acetilinimas gali turėti tiesioginės įtakos genų transkripcijai eukariotinėse ląstelėse. Kaip jau aptarėme, šių aminorūgščių liekanų acetilinimas sumažina teigiamą krūvį histonų molekulių galuose ir tokiu būdu susilpnina jų sąveiką su DNR. Nukleosomų konformacija ir stabilumas keičiasi, DNR tampa labiau prieinama transkripcijoje dalyvaujantiems baltymams. Acetiltransferaziniu ir deacetilaziniu aktyvumu pasižymi genų transkripcijos aktyvikliai, represoriai bei RNR Pol II baltyminio komplekso komponentai Chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai ir transkripcijos valdymas Nors histonų molekulių galų acetilinimas gali susilpninti tarpnukleosominius ryšius, mažai tikėtina, kad šis procesas galėtų visiškai suardyti nukleosomas taip, kad histonai būtų pašalinti nuo DNR, o pastaroji taptų prieinama transkripcijai. Kaip minėta, acetilinami daugiausia histonų molekulių galai, o jie nesudaro pagrindinių tarpmolekulinių ryšių formuojantis šerdinei nukleosominei dalelei. Dažnu atveju transkribuojamų genų promotorių bei stipriklių (angl. enhancer) sritys yra nenukleosominės struktūros: tai liudija šių sričių DNR jautrumas deoksiribonukleazių poveikiui. Taip pat eksperimentiškai nustatyta, kad nukleosomos trukdo prisijungti prie DNR RNR polimerazei bei kitiems transkripcijos baltymams. Kokiu būdu nukleosomos suardomos, kai reikia transkribuoti genus? Ryšiai nukleosomoje tarp baltymų, taip pat tarp baltymų ir DNR, yra suardomi vykstant chromatino pertvarkai (angl. chromatine remodeling). Histonai disocijuoja nuo DNR, DNR tampa prieinama kitiems baltymams. Šiems procesams vykti reikia energijos. Kokiais būdais gali būti pertvarkomas chromatinas? In vitro tyrimais buvo nustatyti šie galimi chromatino pertvarkymo būdai: zhistonų oktameras gali slysti išilgai DNR; taip pasikeičia tam tikrų sekų padėtis nukleosomos atžvilgiu (3.23 pav.); zgali kisti atstumas tarp histonų oktamerų; taip pat pasikeičia tam tikrų sekų padėtis nukleosomos atžvilgiu; z histonų oktameras gali būti išstumtas iš nukleosomos; taip susidaro nenukleosominės struktūros tarpas chromatine. Chromatino pertvarką ląstelėje vykdo chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai (angl. chromatin remodeling protein complexes) nuo ATP priklausomos DNR translokazės, prisijungiančios prie tam tikros vietos histonų oktamere ir keičiančios DNR padėtį jo atžvilgiu 141

142 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA (3.23 pav.). Vykstant šiems pokyčiams, turi būti suardomi ir vėl sudaromi molekuliniai ryšiai tarp histonų molekulių ir DNR. Chromatiną pertvarkantys kompleksai reikalingi šiems vyksmams: z visiškai supakuoti genomą; z sukurti specializuotas chromatino sritis (pvz., su histonų variantais); z užtikrinti valdomą priėjimą prie genominės DNR. Chromatiną pertvarkančių baltymų kompleksų eukariotuose yra rasta gana daug ir randama vis daugiau. Kompleksų sudėtyje yra subvienetas, pasižymintis ATPaziniu aktyvumu, kuris yra komplekso motoras. Pagal ATPazių panašumą skiriamos keturios kompleksų šeimos. ATPazių subvienetai panašūs tik savo ATPazių domenais, kiti domenai skirtingi. Skirtinguose kompleksuose yra skirtinga ir kitų baltyminių subvienetų sudėtis (3.24 pav.). Kiti kompleksų baltymai valdo ATPazės aktyvumą, sąveikauja su chromatino baltymais ar transkripcijos veiksniais. Gausiausios yra SWI-SNF ir ISWI baltymų šeimos. Chromatiną pertvarkantys kompleksai, panaudodami ATP hidrolizės metu gautą energiją, keičia nukleosomų struktūrą, t. y. nukleosomos histonų padėtį DNR atžvilgiu. Chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai chromatino link yra nukreipiami dvejopai: z juos pritraukia genų transkripcijoje dalyvaujantys baltymai aktyvikliai arba represoriai; zbaltyminių kompleksų sudėtyje esantys subvienetai atpažįsta ir savo domenais atrankiai sąveikauja su modifikuotais histonais (histonų epitopais ). Pvz., komplekso SWI-SNF sudėtyje esantis Snf2 subvienetas savo bromodomenu jungiasi prie acetilintų histonų chromatine tiek in vitro, tiek in vivo. Chromatino struktūrą keičiantys kompleksai, greičiausiai, veikia ne visą chromatiną, o pavienių genų promotorius. Pvz., nustatyta, kad SWI-SNF kompleksai mielėse daro įtaką ~ 6 % genų veiklai pav. Chromatiną pertvarkančių baltymų kompleksų veikimas (J. E. Krebs, E. S. Goldstein, S. T. Kilpatrick. Lewin s Genes XI, 2014) 142

143 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA 3.24 pav. Nuo ATP priklausomi chromatiną pertvarkantys kompleksai eukariotuose. Chromatiną pertvarkančių baltymų kompleksų šeimų ATPazės subvienetų struktūrų schemos. Parodyti baltymų domenai ir sekos, įsiterpusios į ATPazės domeną (a); SWI-SNF ir ISWI šeimos kompleksų struktūros schema. Apačioje parodyti kompleksų sudėtyje esantys baltymai (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7, p. 437, 2006) Kompleksų veikimas chromatino atžvilgiu skiriasi. SWI-SNF šeimos kompleksai destabilizuoja nukleosomas, suardydami DNR ir histonų ryšius: tą liudija chromatino jautrumo deoksiribonukleazėms pokyčiai. Nustatyta, kad vienas iš SWI-SNF šeimai priskiriamų kompleksų, RSC, in vitro gali visiškai suardyti nukleosomą ir perkelti jos histonų šerdį ant kitos DNR molekulės. ISWI baltyminiai kompleksai tokių žymių chromatino persitvarkymų nesukelia. Apibendrinant galima pasakyti, kad genų promotorių bei kitos transkripcijos valdymo sritys, vykstant genų transkripcijos iniciacijai, yra nenukleosominės struktūros; reguliacinių baltymų bei RNR polimerazės komplekso sąveika su DNR yra palengvinama chromatino struktūrą keičiant jį pertvarkantiems baltymų kompleksams. Transkripcijos metu, veikiant chromatiną pertvarkantiems kompleksams, nukleosomos veikia kaip dinamiškos struktūros, kuriose histonų oktameras gali būti išstumiamas iš nukleosomos ir vėl grąžinamas atgal. Ar DNR supakuota į nukleosomas, kai RNR polimerazė, transkribuodama geną, juda į priekį? Chromatino, kuriame transkribuojami genai, elektroninės mikroskopijos nuotraukose matyti, 143

144 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA kad RNR polimerazė gali transkribuoti DNR šiai esant nukleosominės struktūros: nukleosomos matyti prieš RNR polimerazę ir už jos. Atliktais tyrimais remiantis siūloma, kad silpnai transkribuojamų genų atveju RNR polimerazė įveikia nukleosomos barjerą nesuardydama histonų oktamero (3.25 pav., a). RNR polimerazė, judėdama išilgai DNR, suardo molekulinius ryšius tarp DNR bei histonų pirmiausiai tose vietose, kur jie yra silpniausi ties DNR įėjimo į nukleosomą vieta. Dalies šerdyje esančių histonų ryšiai su DNR susilpnėja. Laikinai susidaro uždara kilpa, kurios viename krašte yra RNR polimerazė, o kitame histonų oktameras. Judėdama toliau RNR polimerazė išskiria DNR grandines kilpą sudarančiame DNR fragmente atsiranda teigiama superspiralizacija, ir tolesnis judėjimas tampa vis sudėtingesnis. Pasiekusi DNR vidurį RNR polimerazė ima judėti greitai. Šiuo momentu histonų oktameras, greičiausiai, yra išstumiamas ir apsivynioja DNR už RNR polimerazės, t. y. keičia savo padėtį DNR atžvilgiu, nuo jos nedisocijuodamas. Fotosąsiuvų eksperimentai liudija, kad judant RNR polimerazei, histonų oktameras nedisocijuoja į atskirus histonus. Aktyviai transkribuojamų genų srityse histonų oktameras yra suardomas. Šiame procese dalyvauja chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai ir histonų šaperonai (3.25 pav., b). HeLa ląstelėse buvo nustatytas transkripcijos elongacijai reikalingas kompleksas FACT (angl. facilitates chromatin transcription). In vitro, kai nėra FACT komplekso, RNR Pol II po transkripcijos iniciacijos etapo užstringa ties DNR, suformuota į nukleosomas, ir transkripcijos elongacija yra stabdoma. Pridėjus FACT baltyminio komplekso, transkripcijos elongacija vyksta. FACT kompleksas destabilizuoja nukleosomos struktūrą, pašalindamas H2A-H2B dimerą, o vėliau gali prijungti histonus prie DNR, t. y. veikia kaip histonų šaperonas. Drozofilos politeninėse chromosomose FACT kompleksų yra ten, kur vyksta aktyvi genų transkripcija ir joje dalyvauja RNR Pol II, bet ne RNR Pol III kompleksas pav. Transkripcijos nukleosomose procesą iliustruojantys modeliai. Silpnai transkribuojami genai (a); aktyviai transkribuojami genai (b) (Biochimica et biophysica acta, v. 1890, p. 332, 2013) 144

145 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA Apibendrinant chromatino molekulinę struktūrą ir jo vaidmenį genų veiklos valdyme, galima suformuluoti šiuos principus: znukleosoma pagrindinis chromatino struktūrinis ir reguliacinis elementas yra sudaryta iš histonų oktamero, į kurį įeina po dvi keturių tipų histonų molekules: H2A, H2B, H3, H4, ir DNR, kuri yra apsivijusi apie histonų oktamerą. z Kiekvienas histonas yra organizuotas į du domenus: centrinės histonų globulės, kurios yra išsidėsčiusios nukleosomos viduje, sudaro nukleosomos šerdį, apie kurią apsiveja DNR spiralė, o nestruktūrizuoti histonų molekulių N galai išlenda į nukleosomos išorę ir dalyvauja chromatino struktūrinėje organizacijoje bei chromatino veiklos reguliacijoje. znukleosomų grandinė, sąveikaujant šerdinių histonų molekulių N galams su gretimomis nukleosomomis, sudaro aukštesnius chromatino struktūros lygmenis (I III lygmens struktūras). Šiame procese dalyvauja jungties histonai, kiti baltymai. Ši sąveika gali keistis, kovalentiškai modifikuojant histonų N galus. zchromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai keičia nukleosomų struktūrą genų promotorių, stipriklių ir kitose transkripcijos valdymo srityse, palengvindami transkripcijoje dalyvaujančių baltymų bei daugiabaltyminių kompleksų sąveiką su DNR. zgenų transkripcijos aktyvinimas bei slopinimas gali būti sąlygojami histonų acetiltransferazių bei histonų deacetilazių, kurios kovalentiškai modifikuoja histonų molekulių galus nukleosomose. Nuolatinio transkripcijos slopinimo heterochromatine pamatas taip pat yra nukleosomos, kuriose histonų molekulių galai sąveikauja su savitaisiais baltymais slopikliais (angl. silencing proteins); šios nukleosomos sudaro chromatino struktūras, kurios gali būti perduodamos iš kartos į kartą DNR organizacija prokariotuose Ilgą laiką bakterijų DNR struktūrinė organizacija ląstelėje nebuvo aiški. Ištobulėjus vaizdinimo technikai bei kitiems metodams, nustatyta, kad bakterijų viduląstelinės struktūros yra organizuotos ir pertvarkomos tam tikru būdu, atsižvelgiant į ląstelės augimo, dalijimosi poreikius. Bakterijų DNR daugiausiai yra žiedinės dvigrandinės DNR molekulės. Kai kurios iš jų yra pakankamai didelės: kad sutilptų ląstelėje, jos turi sudaryti pakankamai kodensuotą struktūrą. Pvz., E. coli žiedinė 4,6 x 10 6 nukleotidų porų DNR chromosoma yra iš viso ~ 1,5 mm ilgio, ir turi tilpti ~ 1 2 mm ilgio ir 0,5 1 mm pločio ląstelėje. Bakterijų DNR kartu su DNR sąveikaujančiais baltymais ląstelėje sudaro savitą struktūrą nukleoidą (3.26 pav., a). Nukleoidas yra funkcinis eukariotų branduolio ekvivalentas. Bakterijų nukleoidas yra pakankamai kondensuota struktūra, užimanti tam tikrą ląstelės erdvės sritį, kurioje yra mažai ribosomų. Nukleoide DNR yra superspiralizuota neigiamai, prie jos prisijungę savitieji nukleoido baltymai. Bakterijose nustatyta ~ skirtingų nukleoido baltymų. Jie dažniausiai gausiai sintetinami. Geriausiai apibūdinti yra H-NS, HU, IHF, Lrp, CbpA, CbpB baltymai. Dalis šių baltymų (pvz., H-NS, HU, CbpA, CbpB) nepasižymi savitumu DNR sekoms, kiti atrankiai jungiasi prie DNR (pvz., IHF, Lrp). Nukleoido HNS, HU, IHF baltymai pasižymi savybe superspiralizuoti ir lenkti 145

146 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR. Bakterijose aptikti baltymai, panašūs į eukariotų SMC baltymus ir gebantys kompaktizuoti DNR; toks, pvz., yra MukB baltymas. Prisijungę prie DNR, baltymai daro įtaką DNR struktūrai ir funkcijoms replikacijai, rekombinacijai, reparacijai ir transkripcijai. Be nukleoido baltymų, prie bakterijų DNR būna prisijungę dar ~ 100 transkripcijos veiksnių aktyviklių bei represorių, sąveikaujančių su savitosiomis DNR sekomis genų promotoriuose. Bakterijų DNR ląstelėje nesudaro struktūrinių elementų, panašių į eukariotų nukleosomas, tačiau jų genomas yra organizuotas į tam tikras struktūras, kurios gerai matomos elektronine mikroskopija. Pvz., lizavus E.coli ląsteles, aplink jas į visas puses pasklinda įvairaus dydžio DNR kilpos (3.26 pav., b, c). Bakterijų DNR kilpose DNR yra superspiralizuota plektoneminiu būdu. Manoma, kad būtent DNR kilpos sudaro struktūrinius nukleoido domenus bakterijos ląstelėje. Topologiškai domenai nėra susiję, jų dydis ir superspiralizacija skiriasi. Atskirų domenų kraštuose yra savitųjų DNR sekų. Domenai yra tam tikru būdu fiksuoti. Bakterijos DNR turėtų būti susiklosčiusi į ~ tokių domenų, o kiekvieną kilpą turėtų sudaryti ~ nukleotidų porų. Tokia struktūrinė nukleoido organizacija būdinga daugeliui tirtų bakterijų. Archėjų DNR organizacija skiriasi nuo bakterijų m. tyrinėjant archėją Methanothermus fervidus, buvo atrasta, kad joje yra du skirtingi histonai HmfA ir HmfB. Šie baltymai yra eukariotų histonų ortologai, todėl tapo įdomu ar žiedinė archėjų DNR taip pat yra organizuota į nukleosomas? Daugelio archėjų histonai turi tik histonų klostę, nestruktūrizuotų N ir C galų nėra. Įvairiose archėjose gali būti 2 6 histonus koduojantys genai, kai kurios jų iš viso neturi (pvz., Thermoplasma). Archėjų histonai labiausiai panėšėja į eukarotų H3 ir H4 histonus. Nustatyta, kad prie archėjų DNR prisijungia histonų tetrameras arba du dimerai, jie apvynioja ~ 60 nukleotidų porų DNR. Methanopyrus kandleri rūšies ir Halobacterium genties archėjose rastas dvigubas histonas HMk, turintis dvi histonų klostes. Manoma, kad šį histoną koduojantis genas evoliucijos metu išsiskaidė į atskirus genus, skirtus koduoti eukariotų histonus pav. DNR organizacija bakterijose. E. coli bakterijos elektroninės mikroskopijos nuotrauka. Ląstelės viduje gerai matyti kompaktiška struktūra nukleoidas (a); lizuotos E. coli ląstelės elektroninės mikroskopijos nuotrauka. DNR kilpos pasklidusios aplink bakterijos apvalkalėlį (b); bakterijos DNR kilpų schema (c) ( 146

147 III. CHROMATINO MOLEKULINĖ STRUKTŪRA ANALITINIAI KLAUSIMAI IR UŽDAVINIAI 1. Eksperimentiniais chromatino tyrimo metodais nustatyta, kad ~ 95 % žmogaus kamieninių ląstelių chromatino yra nukleosominės struktūros. Pasitelkę turimas žinias apie žmogaus nukleosomas, chromosomas ir DNR, atsakykite: a) Kiek nukleosomų galėtų būti kiekvienos tokios ląstelės branduolyje? b) Kiek histonų molekulių iš viso reikėtų de novo susintetinti ląstelei S fazės metu, kad būtų pasiektas Jūsų apskaičiuotas nukleosomų skaičius kiekvienoje iš dukterinių ląstelių? 2. Kas yra nesimetrinis histonų modifikavimas? 3. Kokiais ryšiais nukleosomoje sąveikauja DNR ir baltymai histonai? 4. Trumpai veikiant eukariotų chromatiną mikrokokų nukleaze, gaunamos dalelės, kuriose yra 200 bp DNR. Pakartojus eksperimentą, bet ilgiau inkubavus fermentu, gaunamos dalelės, kuriose yra 146 bp DNR. Kodėl pakinta bazių porų skaičius? 5. Iki 10 % chromatino masės gali sudaryti RNR. Kokios tai RNR ir kokios jų funkcijos? 147

148 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Kiekvienai gyvai ląstelei, nepriklausomai nuo to, ar jos DNR organizuota daugelyje chromosomų, ar tik vienoje, svarbu išsaugoti ir perduoti palikuonims savo genetinę medžiagą DNR. Tai užtikrina ląstelės vystymąsi, egzistavimą sudėtingoje aplinkoje, savalaikį dalijimąsi ir žūtį. Šis tikslas yra pasiekiamas DNR replikacijos procesu, kai prieš pasidalijant ląstelei įvyksta genetinės medžiagos dvigubėjimas m. D. Votsonas ir F. Krikas pasiūlė ne tik DNR struktūros modelį, bet ir galimą DNR molekulės kopijavimo būdą. Jis buvo paremtas komplementarumo tarp heterociklinių bazių principu. Pagal Votsono ir Kriko pasiūlytą DNR replikacijos modelį, naujos DNR molekulės sintetinamos pagal matricas. Matricos yra laikinai atskirtos motininės DNR duplekso grandinės. DNR grandinės yra komplementarios, todėl vienoje grandinėje yra visa informacija apie kitą grandinę. Netrukus šis modelis buvo patvirtintas eksperimentais DNR replikacijos mechanizmo išaiškinimas 1958 m. Metju Mezelsonas (Matthew Meselson) ir Frankas Štalis (Frank Stahl) eksperimentais įrodė, kad ląstelėse DNR replikacija vyksta pusiau konservatyviuoju būdu, t. y. po replikacijos susidaro dvi DNR molekulės, identiškos senajai DNR molekulei, kuriose viena nukleotidinė grandinė yra sena (motininė), o kita naujai susintetinta (dukterinė). M. Mezelsono ir F. Štalio eksperimentu buvo atmesti kiti tuo metu svarstyti galimi alternatyvūs DNR replikacijos būdai: konservatyvusis bei dispersinis. Pagal konservatyvųjį DNR replikacijos būdą, po replikacijos lieka motininė DNR molekulė, kurioje abi DNR grandinės yra senos, ir susintetinta dukterinė DNR molekulė, kurioje abi grandinės yra naujos. Pagal dispersinį DNR replikacijos modelį, po replikacijos susidariusių DNR molekulių abi grandinės yra senõs ir naujõs DNR fragmentų mišinys (4.1 pav.). DNR replikacija vyksta pusiau konservatyviuoju būdu. Po replikacijos yra susidariusios dvi DNR molekulės, identiškos senajai DNR molekulei, kuriose viena nukleotidinė grandinė yra sena (motininė), o kita naujai susintetinta (dukterinė). Mezelsonas ir Štalis, atlikdami eksperimentą, rėmėsi prielaida, kad molekules, kurių tankis skiriasi nežymiai, galima atskirti vieną nuo kitos centrifuguojant druskų tankio gradiente. Koncentracijos tankio gradientas sukuriamas naudojant koncentruotą sunkiojo metalo druskos, pvz., CsCl, tirpalą. Nukleorūgščių molekulės, esančios tokio tirpalo paviršiuje, centrifuguojant (veikiant išcentrine jėga) migruoja žemyn iki tos vietos, kur jų tankis sutampa su tirpalo tankiu. 148

149 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Mezelsonas ir Štalis augino E. coli bakterijas augimo terpėje, kur vienintelis azoto (N) šaltinis buvo amonio chloridas (N 15 H 4 Cl). Amonio chloridas vietoje stabiliojo N 14 azoto atomo ( lengvojo ) turėjo radioaktyvų N 15 azoto atomą ( sunkųjį ). Buvo siekiama, kad į augančių bakterijų DNR heterociklinių bazių sudėtį būtų įjungtas sunkusis N 15 izotopas. Keletą kartų pasidalijus bakterijoms, augimo terpė buvo centrifuguota. Iš dalies bakterijų buvo išskirta DNR (1 mėginys), likusios bakterijos buvo resuspenduotos šviežioje augimo terpėje su N 14 H 4 C, kuris jau turėjo stabilųjį N 14 azoto atomą. Bakterijos šioje terpėje buvo augintos tiek, kad pasidalytų vieną kartą (2 mėginys) ir du kartus (3 mėginys). Iš 2 ir 3 mėginių taip pat buvo išskirta DNR. Dar vienas DNR mėginys (4) buvo išskirtas iš E. coli, augintų tik N 14 azotą turinčioje terpėje. 4.1 pav. Pusiau konservatyviosios DNR replikacijos įrodymas M. Mezelsono ir F. Štalio eksperimentu. Hipotetiniai DNR replikacijos būdai (a); DNR sintezė E. coli bakterijose, augančiose terpėje su radioaktyviuoju izotopu (b); DNR centrifugavimas CsCl tankio gradiente (c) ( houghton/2107%20 14/lecture24.html) 149

150 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Tada DNR 1 4 mėginiai buvo centrifuguoti CsCl tankio gradiente ir nustatyta, kad stabilųjį N 14 azoto atomą turinčios DNR tankis skiriasi nuo DNR, turinčios radioaktyvų N 15 azoto atomą, tankio ~ 1 %. Todėl DNR išsidėsto tankio gradiente skirtingose zonose. N 15 izotopą turinčioje terpėje augusių E. coli DNR (1 mėginys) yra vienodo tankio (~ 1,724 g/ml) ir išsidėsto vienoje gradiento zonoje. Taip pat vienoje zonoje išsidėsto ir N 14 azoto atomą turinčioje terpėje ilgai augusių bakterijų DNR (4 mėginys). Ši DNR yra lengvesnė, jos tankis siekia 1,710 g/ml. Bakterijų, perkeltų į terpę su stabiliuoju N 14 azoto atomu ir pasidalijusių vieną kartą (2 mėginys), visos DNR molekulės taip pat buvo vienodo tankio, tačiau tankio reikšmė buvo tarpinė tarp sunkiosios (N 14 ) ir lengvosios (N 15 ) DNR tankių ~ 1,717 g/ml. Tokia DNR, kurioje pusė molekulėje esančių heterociklinių bazių turėjo sunkųjį N 15 azoto atomą, o pusė lengvąjį N 14, vieną kartą pasidalijus bakterijoms, perkeltoms į N 14 turinčią terpę, galėjo būti susintetinta tuo atveju, jei naujai pasidalijusiose ląstelėse viena DNR polinukleotidinė grandinė buvo sena, t. y. sunki, o kita naujai susintetinta, t. y. lengva. Du kartus pasidalijusių E. coli bakterijų (3 mėginys) DNR pasiskirstė tokiu būdu: dalies DNR tankis buvo tarpinis tarp sunkiosios ir lengvosios DNR, kitos DNR dalies tankis atitiko lengvosios DNR tankį. Tai paliudijo, kad DNR sintezė vyksta kaip matricą naudojant atskiras motinines grandines, o į dukterines ląsteles pakliūva DNR, turinti vieną senąją motininę ir vieną naują dukterinę grandinę. Taip buvo patvirtinta, kad DNR replikacija vyksta pusiau konservatyviuoju būdu, o ne, pvz., dispersiniu ar konservatyviuoju, nes pastaraisiais atvejais DNR pasiskirstymas būtų kitoks. 4.2 pav. Bakterijų DNR replikacija. Besireplikuojančios E. coli žiedinės DNR autoradiografijos vaizdas (kairėje); schema, paaiškinanti autoradiografijos rezultatus. X ir Y replikacinės šakutės, A C kilpos, susidarančios replikuojamoje DNR; dvigubomis linijomis pažymėta senoji DNR grandinė; punktyrine linija naujoji DNR grandinė (apačioje); E. coli žiedinės DNR replikacijos schema (dešinėje) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 150

151 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Netrukus pavyko vizualizuoti replikuotą DNR. Džonas Kairnsas (John Cairns) 1963 m., panaudojęs autoradiografijos metodą, patvirtino, kad žiedinė E. coli DNR replikuojama pusiau konservatyviuoju būdu. Autoradiografijos metodas pagrįstas tuo, kad mėginyje esanti radioaktyvi medžiaga apšviečia rentgeno juostą. Kairnsas panaudojo E. coli augimo terpę, kurioje buvo DNR biosintezės pirmtako timidino, turinčio radioaktyvų vandenilio izotopą tritį (H 3 ). Buvo nustatyta, kad E. coli DNR replikuojama per ~ 40 minučių. Bakterijos buvo augintos terpėje su izotopu dvi generacijas. Kairnsas intaktinę bakterijų DNR patalpino ant mikroskopinio stiklelio, padengė fotografine emulsija ir po dviejų mėnesių ją išryškino. Eksperimento rezultatai patvirtino, kad bakterijos žiedinė DNR replikuojama pusiau konservatyviuoju būdu. Buvo padarytas dar vienas svarbus atradimas: bakterijos DNR replikacija vyksta dviem kryptimis tą paliudijo stebėtos nuo replikacijos iniciacijos taško į priešingas puses judančios dvi replikacinės šakutės (angl. replication forks) (4.2 pav.). Vėliau, ištyrus daugelio organizmų bei virusų DNR replikaciją, buvo išaiškinta, kad pusiau konservatyvioji DNR replikacija gali būti: zvienkryptė prasidedanti replikacijos pradžios vietoje ir nuo jos vykstanti viena kryptimi (suformuojant vieną replikacinę šakutę) (4.3 pav.); zdvikryptė prasidedanti replikacijos pradžios vietoje ir nuo jos vykstanti dviem priešingomis kryptimis (suformuojant dvi replikacines šakutes) (4.3 pav.). Prokariotų ir eukariotų chromosomų DNR replikacija, vykstanti nuo replikacijos iniciacijos sričių, yra dvikryptė ir pusiau konservatyvi. Replisoma yra laikinas baltymų kompleksas, veikiantis ties DNR replikacinėmis šakutėmis. Prokariotuose ir eukariotuose chromosomų DNR replikacija yra pusiau konservatyvi ir dvikryptė. Remiantis palyginti paprastu DNR struktūros modeliu, buvo linkstama manyti, kad ir DNR replikacija yra paprasta. Tačiau keletą dešimtmečių vykdyti replikacijos tyrimai parodė, kad šis procesas nepaprastai sudėtingas. Pagrindiniuose DNR replikacijos etapuose iniciacijos, elongacijos ir terminacijos veikia daug ląstelės baltymų ir baltyminių kompleksų. Jų veikimas tiksliai koordinuotas. 4.3 pav. Dvikryptės ir vienkryptės replikacijos schema 151

152 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Replikacijos iniciacijos metu DNR replikacijos iniciacijos sritį atpažįsta baltymų kompleksas. Komplekso baltymai užtikrina, kad prieš prasidedant DNR replikacijai abi DNR duplekso grandinės būtų laikinai atskiriamos ir stabilizuojamos tokios būsenos. Tada replikacinėje šakutėje prasideda naujų komplementariųjų DNR grandinių sintezė. Kitas DNR replikacijos etapas elongacija (kitaip ilginimas) vyksta dalyvaujant baltymų kompleksui replisomai. Replisoma yra laikinas baltymų kompleksas, veikiantis ties DNR replikacinėmis šakutėmis. Replikacines šakutes sudaro replisomos ir replikuojama DNR. Replisoma užtikrina pagrindinius bet kurio genomo replikacijos tikslus tiksliai ir veiksmingai nukopijuoti DNR. DNR sintetinantys fermentai DNR polimerazės šių tikslų visiškai realizuoti negali, todėl pasitelkiami pagalbiniai baltymai. Replisomos sudėtiniai komponentai yra konservatyvūs visuose organizmuose nuo paprasčiausių iki žmogaus. Replisomai judant išilgai DNR, abi DNR grandinės išskiriamos, vyksta komplementariųjų DNR grandinių sintezė. Tačiau DNR biosintezės metu replisoma susiduria su esmine problema, kurią derėtų čia pat aptarti. Dvigrandinės DNR duplekso grandinės yra antilygiagrečios, t. y. viena grandinė išsidėsčiusi 3 5 kryptimi, o kita priešinga, 5 3, kryptimi. Iš pradžių manyta, kad replikacijos metu atskyrus DNR grandines, viena komplementari grandinė sintezuojama 5 3 kryptimi, o kita 3 5 kryptimi. Tačiau paaiškėjo, kad DNR sintezė gamtoje vyksta tik 5 3 kryptimi. Kaip replikacijos metu kopijuojamos ilgosios DNR? Atsakymas buvo gautas 1960 m. pabaigoje japonų mokslininkų Reidži ir Cuneko Okazaki (Reiji & Tsuneko Okazaki). Eksperimento metu į greitai besidalijančių E. coli bakterijų kultūrą buvo įpilta timidino, turinčio radioaktyvų H izotopą tritį (H 3 ). Įpylus timidino, bakterijos buvo auginamos tik keletą sekundžių tol, kol radioaktyvusis timidinas buvo įjungtas į ką tik susintetintą DNR. Išskyrus tokią DNR iš ląstelių, ji centrifuguota cezio chlorido gradiente. Nustačius, kur susitelkęs radioaktyvusis timidinas, paaiškėjo, kad labai trumpai (keletą sekundžių) inkubuojant ląsteles su radioaktyviuoju timidinu, jis susitelkė nukleotidų ilgio DNR fragmentuose. Ilgiau inkubuojant ląsteles su radioaktyviuoju timidinu, radioaktyvioji žymė jau telkėsi ilgose DNR molekulėse (4.4 pav.). Eksperimento rezultatai paliudijo, kad viena iš DNR grandinių sintetinama fragmentais (nutrūkstamai), kurie vėliau sujungiami į ištisą DNR grandinę. Šie fragmentai pavadinti Okazaki fragmentais. Okazaki fragmentai sintetinami tik 5 3 kryptimi ir vėliau sujungiami į ištisą DNR grandinę. DNR grandinė, kuri sintetinama tokiu būdu, vadinama vėluojančiąja DNR grandine (angl. lagging DNA strand) (4.4 pav.). Kita DNR grandinė yra sintetinama 5 3 kryptimi nenutrūkstamai. Ji vadinama pirmaujančiąja DNR grandine (angl. leading strand) (4.4 pav.). Okazaki fragmentai DNR replikacijos metu sintetinami daugumos organizmų DNR biosintezės metu. Kaip matyti iš schemos, pateiktos 4.4 pav., vėluojančiosios DNR grandinės sintezės kryptis yra priešinga pirmaujančiosios grandinės sintezės krypčiai, taip pat ir replikacinės šakutės judėjimo krypčiai. Vėluojančiosios grandinės sintezė šiek tiek atsilieka, nes pirmiausiai turi būti susintetintas pirmaujančiosios grandinės fragmentas, kad viena iš matricų taptų prieinama Okazaki fragmento sintezei. Pasibaigus DNR replikacijai, replisomą sudarantys komponentai disocijuoja. DNR replikacijos procesas baigiasi terminacija (dar vadinama baigtimi). Šiame replikacijos etape dalyvauja 152

153 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) savitieji terminacijos baltymai. Įvykus terminacijai, sudvigubėjusios chromosomos atskiriamos viena nuo kitos ir paskirstomos tarp dukterinių ląstelių. DNR biosintezė ląstelėse vyksta ne tik replikacijos metu, bet ir reparacijos metu, kai, pašalinus pažeistą DNR grandinės nukleotidą ar fragmentą, yra sintetinama nauja DNR grandinė. Reparacijoje dalyvaujančios DNR polimerazės yra paprastesnės struktūros baltymai nei ilgas DNR molekules replikuojančios DNR polimerazės. Jos veikia dažniausiai konkrečiose reparuojamos DNR vietose. 4.4 pav. Pirmaujančiosios ir vėluojančiosios DNR grandinės sintezė. R. ir C. Okazaki eksperimento rezultatai (kairėje); DNR pirmaujančiųjų ir vėluojančiųjų grandinių sintezės schema (dešinėje ) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 153

154 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.2. DNR polimerazės pagrindiniai DNR replikacijos fermentai Fermentai, sintetinantys naujas DNR molekules pagal matricą, vadinami DNR polimerazėmis (nuo matricos priklausomomis DNR polimerazėmis). Prokariotų ir eukariotų ląstelėse yra įvairių DNR polimerazių. Tik tam tikros DNR polimerazės dalyvauja DNR replikacijoje. Tokios DNR polimerazės dar vadinamos replikazėmis. Replikazės sudėtingi baltymai, sudaryti iš daugelio subvienetų. Kitos DNR polimerazės atlieka tam tikras specializuotas funkcijas replikacijos metu arba dalyvauja reparacijoje ir rekombinacijoje DNR polimerazių bendrosios savybės DNR polimerazės pasižymi didele dydžių, fermentinių savybių įvairove, dalyvauja skirtinguose biologiniuose vyksmuose. Tačiau eukariotų, prokariotų, taip pat bakteriofagų bei virusų DNR polimerazėms, sintetinančioms DNR, yra būdingos kelios bendros savybės. Viena iš bendrų savybių yra ta, kad visos nuo matricos 1 priklausomos DNR polimerazės (DNR nukleotidiltransferazės) katalizuoja tokią pačią cheminę DNR sintezės reakciją, kurios metu jungia monomerus deoksinukleozido 5 trifosfatus (dntp) prie sintetinamos DNR grandinės ribozės laisvos 3 OH grupės (t. y. perneša nukleotidilgrupę). Tarp dntp α padėtyje esančio fosfato ir 3 OH grupės susidaro fosfoesterinis ryšys. Reakcijos metu atsipalaiduoja pirofosfatas. DNR polimerazių katalizuojamos reakcijos schema pateikta 4.5 pav. Reakciją galima užrašyti ir tokia lygtimi: matrica-pradmuo-(dnmp)n + dntp matrica-pradmuo-(dnmp) n+1 + PP i (kur n nukleotidų skaičius sintetintoje grandinėje; i neorganinis pirofosfatas, fosforo rūgšties anijonas). Šios reakcijos laisvoji energija yra palyginti nedidelė. Papildoma laisvoji energija gaunama fermentui pirofosfatazei greitai hidrolizuojant pirofosfatą į dvi fosfato grupes: matrica-pradmuo-(dnmp)n + dntp matrica-pradmuo-(dnmp) n+1 + 2P i. Į grandinę įjungto nukleotido laisva ribozės 3 OH grupė tampa akceptoriumi kitam deoksinukleozido trifosfatui. Koks nukleotidas toliau bus jungiamas į sintetinamą grandinę, priklauso nuo jo komplementarumo matricoje esančiam nukleotidui m. Tomas Steicas (Tom Steitz) pasiūlė universalų DNR ir RNR polimerazių katalizuojamos reakcijos cheminį modelį. Šiame modelyje svarbus vaidmuo skiriamas metalo jonams, dalyvaujantiems reakcijoje (4.6 pav.). Metalo jonai (dažniausiai Mg 2+ arba Zn 2+ ) yra DNR polimerazių kofaktoriai (angl. cofactors). Anot Steico, metalo jonai koordinuojami DNR (taip pat RNR) polimerazių aktyviajame centre dviejų (kartais trijų) konservatyvių fermento asparto (Asp) aminorūgščių karboksigrupių deguonies atomų. Šios aminorūgščių liekanos yra visiškai konservatyvios DNR ir RNR polimerazėse. Nustačius visų DNR polimerazių šeimų atstovų molekulių ir jų substratų kompleksų erdvines struktūras, paaiškėjo, kad DNR polimerazių aktyviuosiuose centruose panašiai išsidėstę metalo jonai, panaši jų sąveika su reakcijoje dalyvaujančiomis grupėmis, nepaisant didelių skirtumų tarp baltymų aminorūgščių sekų. Vienas metalo 1 Matrica naudoja DNR arba kai kuriais atvejais RNR molekulę. 154

155 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.5 pav. DNR polimerazių katalizuojamos reakcijos schema (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 155

156 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.5 pav. DNR polimerazės katalizuojamos reakcijos mechanizmas, pasiūlytas T. Steico (D. L. Nelson, M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) jonas (A) yra išsidėstęs tiksliai ties pradmens galinio nukleotido ribozės 3 OH grupe ir laisvo dntp α fosfato grupe. Teigiamas metalo jonas poliarizuoja 3 OH grupę (t. y. pritraukia deguonies elektronus), jos vandenilio jonas disocijuoja. Toliau vyksta S N 2 tipo nukleofilinio pakeitimo reakcija: 3 OH grupės deguonis atakuoja deoksiribonukleozido 5 trifosfato (dntp) α padėtyje esantį fosfatą. Abu metalo jonai (A ir B) stabilizuoja tarpinę pentakovalentinę α fosfato būseną. Šioje būsenoje α fosforo atomas yra koordinuotas su penkiais deguonies atomais. Kitas metalo jonas (B) stabilizuoja neigiamą krūvį ties nueinančiosios grupės deguonimi ir suriša β bei γ fosfatus. Katalizės mechanizmas ir aktyviojo centro geometrija yra konservatyvūs net ir evoliuciškai labai nutolusiose DNR polimerazėse, pvz., T7 bakteriofago ir mitochondrijų DNR β polimerazėje. Tai liudija apie šio mechanizmo veiksmingumą. Kita eukariotų, prokariotų, taip pat bakteriofagų bei virusų DNR polimerazėms, sintetinančioms DNR, bendra savybė yra ta, kad DNR polimerazės negali vykdyti DNR sintezės de novo, 4.7 pav. DNR matricos, netinkamos DNR sintezei 156

157 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) t. y. sintetinti kaip matricą naudodamos tik ištisinį DNR dupleksą (4.7 pav., a, b) arba tik viengrandinę DNR (4.7 pav., c). Sintezės reakcijai vykti reikalinga matrica ir jai komplementarus pradmuo. Iš tikrųjų visa ilga matrica nėra būtina DNR polimerazei svarbi matricos-pradmens jungties vieta (angl. primer/template junction) (4.4 pav. ir 5.5 pav.). Pradmuo suteikia laisvą ribozės 3 OH grupę, kuri panaudojama cheminėje reakcijoje. Pradmeniu gali būti matricai komplementari RNR, DNR, taip pat prie baltymo prijungtas nukleotidas, komplementarus matricos nukleotidui DNR polimerazių katalizuojama reakcija DNR polimerazių katalizuojamai reakcijai vykti reikia: z 1 substrato visų keturių deoksiribonukleozido 5 trifosfatų: datp, dgtp, dctp, dttp; z 2 substrato matricos-pradmens; z metalo (Mg 2+ ) jonų. Sintezės reakcijos vyksmui ir dideliam jos greičiui bei tikslumui užtikrinti DNR polimerazės turi pasižymėti šiomis savybėmis: z atpažinti ir prisijungti prie matricos-pradmens; zatpažinti ir prijungti visus keturis deoksinukleozido 5 trifosfatus (dntp) bei užtikrinti, kad į grandinę jungiamas nukleotidas būtų komplementarus matricoje esančiam nukleotidui; zkatalizuoti nukleotidilgrupės pernašą ir sudaryti kovalentinį fosfoesterinį ryšį tarp ilginamos DNR grandinės laisvos 3 OH grupės ir nukleotidilgrupės; z pakeisti vienu nukleotidu pailginto DNR polimero padėtį aktyviojo centro atžvilgiu tam, kad būtų prijungtas kitas nukleotidas. Kokios turi būti DNR matricos, kad DNR polimerazė galėtų sintetinti joms komplementarią grandinę? Matrica turi turėti jai komplementarų pradmenį pvz., viengrandinę DNR ar RNR, kurios 3 galinė sritis komplementari matricai. Pradmens nukleotidas turi turėti laisvą 3 OH grupę. Tokį pradmenį ilgina DNR polimerazė. 4.8 pav. pateikti keli matricų pavyzdžiai: viengrandinės linijinės DNR arba RNR ir pradmens kompleksas (a); viengrandinės žiedinės DNR arba RNR ir pradmens kompleksas (b); segtuko struktūra, susidaranti DNR ar RNR tarp komplementarių viengrandinių sričių užsilenkiant 3 galui (c) ir vienos grandinės trūkis dvigrandinėje DNR (d). Pastaruoju atveju, įvykus vienos grandinės trūkiui dvigrandinėje DNR, atsiranda laisva 3 OH grupė, DNR polimerazė ją ilgina. Kai kurios DNR polimerazės pasižymi savybe išstumti priekyje esančią DNR ar RNR grandinę (angl. strand displacement) iš duplekso. Išstumta grandinė suardoma iki DNR polimerazės katalizuojama DNR sintezės reakcija vyksta tik 5 3 kryptimi. 157

158 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA nukleotidų ar oligonukleotidų DNR polimerazių, kurios pasižymi 5 3 egzonukleaziniu aktyvumu (pvz., E. coli DNR I polimerazės), arba nukleazių. Laisvą 3 OH grupę DNR sintezei gali suteikti ir prie DNR matricos prisijungęs baltymas, turintis kovalentiškai prijungtą nukleotidą, kuris sudaro komplementarią porą su vienu iš matricos nukleotidų (4.8 pav., e). Toks DNR replikacijos mechanizmas būdingas kai kuriems bakteriofagams ir virusams. Cheminiu požiūriu nukleotidinė grandinė gali būti ilginama ir 3 5 kryptimi. Šiai reakcijai taip pat būtų tinkami 5 deoksinukleozidų trifosfatai (5 dntp). Reakcijai vykti reikėtų aktyvinti 5 dntp 3 OH grupę, ji reaguotų su 5 trifosfatu sintetinamos grandinės gale (4.9 pav.), susidarytų fosfodiesterinis ryšys. Taigi, sintezė 3 5 kryptimi yra įmanoma. Kodėl gamtoje aptinkamos DNR polimerazės nepasižymi tokiu aktyvumu? Tai, kad DNR polimerazės gali ilginti grandinę tik viena kryptimi, yra susiję su kita labai svarbia replikacijos proceso ypatybe replikacijos tikslumu (angl. fidelity). Replikacijos tikslumas apibrėžiamas pagal matricai komplementarių nukleotidų įjungimą į naujai sintetinamą DNR polinukleotidinę grandinę. Aptarsime šią DNR polimerazių savybę išsamiau. DNR polimerazės yra ypač atrankūs (specifiški) fermentai, bent keliais būdais užtikrinantys replikacijos tikslumą (4.1 lentelė). Tiksliomis DNR polimerazėmis laikomi fermentai, kurių klaidų dažnis yra ~ 1 klaida 1 mln. įjungtų nukleotidų (10 6 ). Pirmasis DNR polimerazių tikslumo lygmuo. DNR polimerazė pirmiausiai prijungia DNR matricą-pradmenį. Vandens molekulės išstumiamos iš fermento aktyviojo centro. Patekęs į aktyvųjį centrą, dntp sudaro porą su matricos nukleotidu. Nekomplementarus nukleotidas greičiau disocijuoja iš DNR polimerazės (disociacijos konstanta K d = 4 8 mm), nes nekomplementariõs porõs geometrija neatitinka fermento aktyviojo centro ji nesudaro pakankamai ryšių su fermentu, palyginti su nukleotidu, komplementariu matricos nukleotidui (kurio disociacijos konstanta K d = 20 µm). DNR polimerazės komplementarių nukleotidų jungimo aktyviajame centre tikslumas siekia pav. Įvairūs matricos-pradmens kompleksai, tinkami DNR polimerazės katalizuojamai sintezei 158

159 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) DNR polimerazės taip pat pasižymi savybe veiksmingai skirti dntp nuo rntp, nepaisant to, kad pastarųjų viduląstelinė koncentracija yra bent 10 kartų didesnė. Tam, kad atskirtų dntp nuo rntp, DNR polimerazės pasitelkia įvairius būdus: pvz., T7 bakteriofago DNR polimerazėje tik dntp ribozės C-2 ato mas įlenda į siaurą fermento kišenę, į kurią netelpa rntp C-2 OH grupė. Kitose DNR polimerazėse rntp prisijungti aktyviajame centre pasitelkiamas trukdymo būdas: aminorūgščių funkcinės grupės, pvz., DNR Pol I Glu liekana, trukdo prisijungti rntp. Antrasis DNR polimerazių tikslumo lygmuo. DNR polimerazė pasižymi savybe atrinkti komplementarias heterociklines bazių poras nuo nekomplementarių. Fermentas sąveikauja su į aktyvųjį centrą pakliuvusiu dntp. Tik tuo atveju, jeigu aktyviajame centre yra matricai komplementarus nukleotidas, DNR polimerazės konformacija keičiasi iš atvirosios (angl. open) į uždarąją (angl. closed). Čia svarbus vaidmuo tenka fermento struktūriniam pirštų domenui (4.11 pav., a). Kelios domeno aminorūgštys sudaro ryšius su aktyviajame centre esančiu dntp. Susidarius komplementariai sąveikai tarp dntp ir matricos nukleotido, pirštų domeno α spi- 4.9 pav. Schema, iliustruojanti DNR polimerazės įjungtų nekomplementarių nukleotidų taisymo kelius, jeigu DNR sintezė vyktų 3 5 ir 5 3 kryptimis (Pagal B. Alberts, D. Bray, Johnson et al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014) 159

160 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA ralė (O spiralė) pasisuka ~ 40º kampu (4.10 pav.). Ji labai priartėja prie dntp ir sudaro su juo ryšius. Atvirojoje fermento konformacijoje ši spiralė yra nutolusi nuo dntp. Toks DNR polimerazės struktūrinis virsmas patvirtintas matricos-dntp-dnr polimerazės komplekso rentgenostruktūrine analize. Priartėjus O spiralei prie dntp, susidaro ryšiai tarp dntp ir kai kurių O spiralės aminorūgščių. Tarp tirozino ir dntp heterociklinės bazės ima veikti stekingo sąveika, o dvi krūvį turinčios aminorūgščių liekanos sąveikauja su trifosfatu. Uždarojoje DNR polimerazės konformacijoje dntp priartėja prie metalo jonų aktyviajame centre šie pokyčiai labai greitina cheminę reakciją. Ką tik aptarta DNR polimerazių savybė skirti komplementarią bazių sąveiką nuo nekomplementarios yra vadinama indukuoto atitikimo (angl. induced fit) valdymo mechanizmu. Esant komplementariajai sąveikai tarp laisvo dntp ir matricos nukleotido, susidaro trinaris kompleksas matrica-dntp-dnr polimerazė. Tik tuomet vyksta katalizinė reakcija. Kovalentiniu ryšiu prijungus nukleotidą, DNR polimerazė grįžta į pirminę atvirąją konformaciją. Dėl anksčiau aprašyto indukuoto atitikimo mechanizmo nukleotidų jungimo tikslumas pasiekia Vis dėlto anksčiau aptartų DNR sintezės tikslumą užtikrinančių mechanizmų nepakanka pasiekti labai didelio tikslumo, būtino ląstelei sintetinant ilgas genomines DNR. Todėl yra įjungiami nekomplementarūs nukleotidai. Dažniausiai tai įvyksta dėl atsitiktinio dntp heterociklinių bazių virsmo į tautomerines (imino arba enolinę) formas. Nekomplementarūs nukleotidai, 4.10 pav. DNR polimerazės indukuoto atitikimo mechanizmas (J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013) 160

161 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) kurių heterociklinės bazės yra tam tikros tautomerinės formos, gali būti tiksliai išdėstomi katalizinei reakcijai fermento aktyviajame centre ir įjungiami į sintetinamą grandinę (įjungimo dažnis yra ~ 1 įjungimas iš 10 5 ). Reakcija vyksta lėtai, DNR polimerazei nebūdingas konformacijos virsmas iš atvirosios į uždarąją. Trečiasis DNR polimerazių tikslumo lygmuo. Nekomplementarus nukleotidas turi būti pašalintas, o vietoje jo įjungtas komplementarus. Šią klaidų taisymo (angl. proofreading) katalizinę funkciją turi tam tikros DNR polimerazės. Ji vadinama 3 5 egzonukleaziniu aktyvumu. Aktyvumas grandinės atžvilgiu veikia priešinga kryptimi, nei vyksta DNR sintezė. Tokiu būdu nuo sintetinamos grandinės 3 galo pašalinamas įjungtas nekomplementarus nukleotidas (4.9 pav.). Dėl 3 5 egzonukleazinio aktyvumo DNR polimerazių tikslumas išauga dar ~ 100 kartų ir gali siekti 10 7 (4.11 pav.). DNR polimerazių 3 5 egzonukleazės aktyvusis centras paprastai būna nutolęs nuo polimerazės aktyviojo centro ~ Ǻ. Jis gali būti tame pačiame polipeptide, kaip ir polimerazės aktyvusis centras (pvz., DNR Pol I), arba kitame baltyminiame subvienete (pvz., DNR Pol III). Svarbi 3 5 egzonukleazės aktyviojo centro savybė viengrandinės DNR jungimo sritis. Replikatyvinės DNR polimerazės pasižymi klaidas taisančiu 3 5 egzonukleaziniu aktyvumu. Egzonukleazės aktyviajame centre, panašiai kaip ir polimerazės aktyviajame centre, rūgštinėmis savybėmis pasižyminčios aminorūgščių liekanos prijungia du metalo jonus, kurie veikia panašiai kaip metalo jonai, esantys polimerazės aktyviajame centre. Vienas metalo jonas deprotonizuoja vandens molekulę. Toliau vyksta susidariusio hidroksido jono nukleofilinė ataka į fosfatą. Abu metalo jonai koordinuoja fosfodiesterinio ryšio deguonies atomus, stabilizuodami tarpinę būseną ir palengvindami produkto nukleotido oksianijono pasišalinimą pav. Kai kurių eukariotinių ir prokariotinių DNR polimerazių sintezės tikslumas (Nature Reviews Genetics, v. 9, p. 594, 2008) 161

162 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR sintezės metu įjungtas nekomplementarus nukleotidas sulėtina DNR polimerazės greitį, fermentas lieka atvirojoje konformacijoje. Pvz., įjungus nekomplementarų nukleotidą, T7 bakteriofago DNR polimerazės greitis sumažėja nuo 300 nt/s iki 0,01 nt/s. Šios pauzės metu DNR atpalaiduojama iš DNR polimerazės aktyviojo centro ir nukreipiama į egzonukleazės aktyvųjį centrą (4.11 pav., d). Nustatyta, kad nekomplementari bazių pora DNR polimerazės aktyviajame centre stimuliuoja egzonukleazės aktyvumą. Tai patvirtina in vitro eksperimentai su substratų analogais, kurie tiko aktyviajame centre, bet nesudarė vandenilinių ryšių su matricos heterociklinėmis bazėmis. Klaidų taisymas vyksta nepaleidžiant matricos iš DNR polimerazės fermento. Tarkime, kad nukleotidinės grandinės sintezė vyksta ne 5 3, bet 3 5 kryptimi. Įvykus klaidai ir įjungus nekomplementarų nukleotidą, jis turi būti pašalintas. 5 gale įjungtą nukleotidą gali pašalinti 5 3 egzonukleazė. Po hidrolizės grandinės 5 gale lieka fosfoesteris (4.9 pav.). Ši grupė, papildomai neaktyvinta, negali sudaryti fosfodiesterinio ryšio su nauju dntp. Be aktyvinimo grandinės sintezė nutrūksta. Taigi, 3 5 kryptimi vykstančios DNR sintezės klaidų taisymas yra energetiškai nenaudingas. Galiausiai, egzistuoja dar vienas etapas, kurio metu taisomos DNR polimerazės replikacijos metu paliktos klaidos, nekomplementarių nukleotidų reparacija (angl. missmatch repair). Dėl šio proceso DNR replikacijos metu padaromų klaidų skaičius sumažėja dar ~ kartų (4.11 pav.) DNR polimerazių struktūra Visos replikatyvinės DNR polimerazės, išskyrus eukariotų DNR α polimerazę-praimazę, turi polimerazės aktyvųjį centrą ir 3 5 egzonukleazės aktyvųjį centrą, esantį arba tame pačiame subvienete, arba kitame baltyme m. pirmą kartą buvo nustatyta DNR polimerazės E. coli DNR I polimerazės erdvinė struktūra. Šiuo metu yra nustatytos daugiau nei 30 DNR polimerazių erdvinės struktūros. Bendra visų žinomų polimerazių ne tik dalyvaujančių DNR replikacijoje, bet ir reparacijoje, taip pat atvirkštinės transkriptazės ir net RNR polimerazės struktūrinė ypatybė yra ta, kad šie baltymai savo struktūroje turi plyšį (angl. cleft), kuriame išsidėsto B formos DNR (4.12 pav., a, c). Erdvinė DNR polimerazių struktūra primena pusiau atgniaužtą dešinį delną, todėl jos domenai yra vadinami plaštakos dalimis. Fermento apatinėje dalyje esančiame delne (angl. palm) yra DNR polimerazės aktyvusis centras, kuriame išsidėsčiusios konservatyvios asparto aminorūgštys, prijungiančios metalo jonus, taip pat aminorūgštys, sąveikaujančios su pradmens 3 galu ir laisvo dntp α fosfatu. Delno domene yra konservatyvūs aminorūgščių A ir C motyvai, būdingi visoms nukleorūgščių polimerazėms, taip pat B motyvas, būdingas tik DNR polimerazėms. Delno domeno aminorūgštys sudaro vandenilinius ryšius su DNR mažuoju grioviu. Jeigu yra įjungiamas nekomplementarus nukleotidas, ryšių susidaro mažiau, reakcijos greitis sumažėja, o matrica yra nukreipiama į DNR polimerazės egzonukleazės aktyvųjį centrą. 162

163 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Kiti du polimerazių domenai tai pirštai (angl. fingers) ir nykštys (angl. thumb) (4.12 pav., a c). Šie domenai yra mažiau konservatyvūs polimerazėse nei delno domenas, tačiau daugelyje fermentų lemia panašias svarbias funkcijas. Pirštų domenas svarbus katalizei. Jo O spiralė sąveikauja su aktyviajame centre esančiu laisvu dntp (4.7 pav., a). Pirštai sąveikauja su DNR matrica. Tuoj už aktyviojo centro matricos grandinė smarkiai išlinksta. Dėl išlinkimo tik vienas matricos nukleotidas yra išdėstomas aktyviajame centre (4.12 pav., a). Nykščio domenas sąveikauja su DNR dupleksu. Tokiu būdu užtikrinama fermento sąveika su substratu DNR pav. DNR polimerazių struktūra. E. coli DNR I polimerazės Klenovo fragmento su DNR polimerazės ir 5 3 egzonukleazės aktyviaisiais centrais schema (a, b) (J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013); T. aquaticus DNR I polimerazės kartu su matricos-pradmens DNR erdvinė struktūra (c) 163

164 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR polimerazių įvairovė Įvairių organizmų DNR polimerazės pagal aminorūgščių sekų homologiją yra skirstomos į 7 šeimas, šeimos dar skirstomos į pošeimius. Pagal DNR polimerazes koduojančių genų pola, polb ir polc nukleotidų sekų panašumą E. coli DNR Pol I, DNR Pol II ir DNR Pol III priskiriamos A, B ir C šeimoms (4.2 lentelė). DNR III polimerazė yra vienetelis C šeimos atstovas bakterijose. C šeimos polimerazių rasta ir virusuose. Eukariotų DNR Pol β ir į ją panašios DNR polimerazės neturi homologų E. coli ir sudaro atskirą X šeimą. Palyginti neseniai atrastos E. coli DNR Pol IV ir DNR Pol V, kurių katalizinius subvienetus koduoja genai umuc ir dinb, sudaro dar vieną, pastaruoju metu sparčiai gausėjančią Y šeimą. Dar vieną D šeimą sudaro archėjų (Archaea) pogrupio Euryarchaeota atstovuose atrastas fermentas DNR PolDI. D šeimos atstovų iki šiol nerasta jokioje kitoje organizmų grupėje. Dar žinoma RT polimerazių šeima, kurią sudaro nuo RNR priklausomos DNR polimerazės bei telomerazių atvirkštinės transkriptazės. 4.2 lentelė. DNR polimerazės archėjose, bakterijose, eukariotuose ir virusuose Gyvybės domenas / virusai Archėjos - PolBI PolBII* (PolBIII)** DNR polimerazių šeima A B C D X Y RT - PolDI*** + Dpo4 Dbh Bakterijos Pol I Pol II Pol III - + Pol IV / DinB Pol V / UmuC Eukariotai Pol θ (teta) Pol γ (gama) Pol α (alfa) Pol δ (delta) Pol ε (epsilon) Pol V**** Pol ζ (zeta) - - Pol β (beta) Pol λ (lambda) Pol μ (miu) Pol σ (sigma) Pol η (eta) Pol κ (kapa) Pol ι (jota) REV1 - - Telomerazės atvirkštinė transkriptazė Virusai (+) - ŽIV viruso DNR polimerazė DNR polimerazės yra pateikiamos lentelėje su jų pavadinimais; jeigu pavadinimo neturi, žymima +. * Tik Crenarchaeota. ** Polimerazės, kurios tik atsitiktinai aptiktos kurios nors karalystės atstovuose, pažymėtos skliaustuose. *** Tik Euryarchaeota. **** Tik mielėse. DNR polimerazėms būdinga ir dydžių įvairovė: mažiausia DNR polimerazė, priklausanti X šeimai, yra ~ 20 kda fermentas; žmogaus DNR ζ (zeta) polimerazės katalizinio subvieneto molekulinė masė yra 344 kda, o E. coli DNR Pol III holofermento net ~ 800 kda. Tačiau, nepaisant labai skirtingų dydžių ir savybių, DNR polimerazių katalizuojamos sintezės reakcijos mechanizmas yra universalus. 164

165 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.3. DNR replikacija prokariotuose Bakterijų (E. coli) DNR polimerazės DNR I polimerazė m. Arturas Kornbergas (Arthur Kornberg) ir jo kolegos atrado pirmąją DNR polimerazę Escherichia coli DNR I polimerazę, DNR Pol I (E. coli DNR polimerazės numeruojamos pagal jų atradimo eiliškumą). E. coli DNR I polimerazė yra 109 kda baltymas, jį sudaro viena 928 aminorūgščių polipeptidinė grandinė. Trys polimerazės kataliziniai aktyvumai (4.2 lentelė ir 4.13 pav.) yra išsidėstę skirtinguose domenuose. Panašia domenine organizacija pasižymi daugelio bakterijų DNR Pol I. Atliekant E. coli DNR I polimerazės dalinę proteolizę fermentais tripsinu ir subtilizinu buvo nustatyta, kad baltymas skaidomas į du fragmentus: mažesnįjį 323 aminorūgščių ir didesnįjį 605 aminorūgščių fragmentą. Mažasis DNR Pol I fragmentas pasižymi 5 3 egzonukleaziniu aktyvumu. Didysis fragmentas pasižymi 5 3 DNR polimeraziniu ir 3 5 egzonukleaziniu aktyvumu. Proteolizės būdu gautas didysis fragmentas yra dar vadinamas Klenovo fragmentu ir dažnai naudojamas DNR sintezės reakcijose in vitro. Klenovo fragmentas pasižymi ir nedideliu atvirkštinės polimerazės aktyvumu. Klenovo fragmente kataliziniai DNR polimerazės ir egzonukleazės centrai yra nutolę vienas nuo kito ~ 30 Å. Abu centrai išsidėstę DNR polimerazės delne (4.12 pav., a c). Esant tokiai centrų konfigūracijai, sintetinamos DNR grandinės 3 galas turėtų pasisukti iš vieno aktyviojo centro į kitą tuo atveju, jeigu reikėtų pašalinti įjungtą nekomplementarų nukleotidą. Įvykus sintezės klaidai, DNR duplekso 3 gale vandeniliniai ryšiai tarp heterociklinių bazių suyra (angl. melting). Toks dupleksas netinkamas substratas DNR polimerazei. Jos sintezės greitis mažėja. Pasisukusi viengrandinė DNR (turinti 4 5 nukleotidus 3 gale) yra giminingesnė egzonukleazei, DNR Pol I egzonukleazė aktyvinama. Vyksta nekomplementariojo nukleotido pašalinimas nedisocijuojant DNR iš fermento. Proteolizės būdu gautas mažasis DNR I polimerazės fragmentas pasižymi 5 3 egzonukleaziniu aktyvumu. Dėl šio katalizinio aktyvumo DNR I polimerazė gali pašalinti nedidelius viengrandinius oligonukleotidus (iki 10) arba mononukleotidus nuo DNR 5 galo (4.8 pav., d). Gali būti pašalinami tiek deoksinukleotidai (dvigrandinėje DNR), tiek ribonukleotidai (DNR- RNR hibride). E. coli DNR I polimerazė in vitro gali pradėti DNR sintezę nuo DNR grandinėje esančio viengrandinio trūkio (4.8 pav., d). Trūkio vietoje DNR I polimerazė ilgina laisvąjį 3 galą. Priekyje esanti komplementari grandinė yra išstumiama (angl. strand displacement) ir suardoma DNR I polimerazės 5 3 egzonukleazinio aktyvumo. Nė viena kita DNR polimerazė nepasižymi savybe išstumti priekyje esančių grandinių. Šis procesas yra dar vadinamas įkarpos transliacija (angl. nick translation). DNR I polimerazės molekulių E. coli ląstelėje yra žymiai daugiau negu DNR II polimerazės ir DNR III polimerazės (4.13 pav.). Dėl didelio DNR I polimerazės kiekio E. coli sun- DNR I polimerazė užpildo DNR grandinėje atsiradusius plyšius replikacijos metu arba po DNR reparacijos. 165

166 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.13 pav. E. coli DNR polimerazių savybės. TLS DNR sintezė ties pažaidomis (FEMS Microbiology Reviews, v. 36, p , 2012) ku aptikti kitas DNR polimerazes. Tačiau nepaisant to, kad DNR Pol I bakterinėje ląstelėje yra daug, ne ji sintetina ilgas E. coli DNR. DNR II polimerazė. Nors DNR II polimerazė (M w = ~ 90 kda) buvo atrasta seniai (1970 m.), ilgą laiką jos funkcija ląstelėje buvo nežinoma. Pastaruoju metu aiškėja, kad fermentas yra svarbus ląstelės SOS atsako į ultravioletinės spinduliuotės (UV) sukeltas DNR pažaidas dalyvis. E. coli ląstelėje DNR Pol II koduoja dina genas, kurio transkripcija aktyvinama keletą kartų atsiradus UV sukeltoms DNR pažaidoms (4.13 pav.). Be DNR polimerazinio aktyvumo, DNR Pol II taip pat pasižymi ir 3 5 egzonukleaziniu aktyvumu. Taigi, DNR Pol II yra tiksli polimerazė (klaidų dažnis: ~ 1 klaida/1 mln. nukleotidų). DNR Pol II priskiriama polimerazių B šeimai. B šeimai dar priklauso archėjų ir eukariotų DNR polimerazės. Genetiniais ir biocheminiais tyrimais nustatyta, kad DNR Pol II dalyvauja šiuose procesuose: zdnr, turinčios UV sukeltų spindulių pažaidų, reparacijoje (SOS mutagenezėje); tarpgrandininių sąryšų reparacijoje; DNR, kurioje nukleotidai yra netekę heterociklinių bazių, reparacijoje; z atnaujinant DNR replikaciją (angl. replication restart). Šis procesas vyksta tada, kai dėl UV spindulių, oksidacinio streso sukeltų DNR pažaidų DNR III polimerazė užstringa ties 166

167 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) DNR matrica ir nebegali tęsti sintezės. Replikacijos atnaujinimas žymiai vėluoja ląstelėse, kurios yra DNR Pol II mutantai. Nemutantinėse ląstelėse ji įvyksta po 10 min, o mutantinėse po 50 min. DNR Pol II veikimo mechanizmas šiame procese dar nėra iki galo išaiškintas. Manoma, kad ji pradeda sintezę už pažaidos dalyvaujant atnaujintos replikacijos praimosomai. Vėliau DNR Pol II pakeičia DNR Pol V ir DNR Pol III (4.14 pav.); z episomų (plazmidžių) replikacijoje in vivo; z procesyviosios DNR sintezės metu in vitro sąveikaudama su β žiedu ir γ-τ žiedo užkėlimo kompleksu. DNR IV polimerazė ir V polimerazė. E. coli DNR IV polimerazė (kurią koduoja dinb genas) ir V polimerazė (kurią koduoja umuc ir umud genai) buvo atrastos tik pastaraisias metais. Šių polimerazių sintezė aktyvinama ląstelės SOS atsako į DNR pažaidas metu, kaip ir DNR Pol II (4.13 pav.). Abi šios DNR polimerazės neturi 3 5 egzonukleazinio aktyvumo, jos priklauso DNR polimerazių Y šeimai. IV ir V polimerazės dalyvauja UV spindulių sukeltų DNR pažaidų reparacijos procesuose, jų gebėjimas sintetinti DNR ties pažaidomis matricinėje grandinėje vadinamas DNR pažaidų perėjimu, TLS (angl. translession synthesis). Sintetindamos DNR ties 4.14 pav. E. coli DNR II polimerazės veikimas dėl UV spindulių sukeltų DNR pažaidų nustojus veikti DNR III polimerazei 167

168 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA pažaidomis polimerazės palieka klaidų, t. y. įterpia nekomplementarių nukleotidų. Tokia DNR sintezė vadinama klaidas paliekančiąja (angl. error prone). DNR polimerazės, kurios dalyvauja šiuose procesuose, yra vadinamos klaidas paliekančiosiomis, arba DNR EP polimerazėmis. Replikatyvinės DNR polimerazės, priėjusios DNR matricinėje grandinėje pažaidą, sustoja, nes jų aktyvusis centras jautriai reaguoja į pasikeitusią DNR geometriją. Kas tuomet vyksta? Nustatyta, kad tiek prokariotinėse, tiek eukariotinėse ląstelėse gausu DNR polimerazių, kurios pasižymi daug mažesniu tikslumu nei replikatyvinės polimerazės. Esant DNR pažaidų, jos pakeičia ties pažaida užstrigusią replikatyvinę DNR polimerazę, kuri nebegali tęsti sintezės. DNR EP polimerazėms yra būdingos kelios bendros savybės: zdnr EP polimerazės veiksmingai sintetina DNR ties pažaida vienos arba kartu su pagalbiniais baltymais; z DNR EP polimerazės palieka klaidų (klaidų dažnis: ); zdnr EP polimerazės yra linkusios tarp matricos ir sintetinamos DNR sudaryti ne Votsono- Kriko tipo nukleotidų poras. DNR Pol V yra heterotrimerinis baltymas UmuD 2 C (4.13 pav.). DNR Pol V DNR pažaidos link nukreipia kitas SOS atsako komponentas RecA baltymas. Polimerazės veikimui užtikrinti dar reikia prie viengrandinės DNR prisijungiančių bakterijos SSB baltymų, taip pat DNR Pol III holofermento komponentų β žiedo ir ŽUK komplekso. Ties pažaida DNR Pol V dažniausiai įterpia A nukleotidą (4.15 pav.). Ištaisius pažaidą, DNR III polimerazė gali toliau tęsti sintezę. DNR V polimerazė gali veikti ir kitaip: esant tam tikroms pažaidų rūšims, ji įjungia komplementarų 4.15 pav. Bakterijų DNR V polimerazės veikimo schema (PNAS, v. 98, p. 8350, 2001) 168

169 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) nukleotidą, t. y. sintetina be klaidų (angl. error free). DNR Pol V gali sintetinti DNR ir pagal nepažeistą DNR matricą, tačiau, kaip minėjome, sintezės klaidų dažnis yra gana didelis. DNR Pol IV pasižymi tuo, kad dažnai įterpia klaidų į sintetinamą DNR grandinę. Taigi, šios polimerazės veikimas yra mutageninis. Padidinus DNR Pol IV sintezę, ląstelėje esančioje plazmidėje mutacijų padaugėja ~ kartų. DNR Pol IV yra labai neprocesyvi (distributyvi) polimerazė: prijungusi vieną nukleotidą ji disocijuoja nuo matricos. Taigi, atsiradus DNR pažaidoms, organizmas verčiau renkasi ties jomis replikuoti DNR polimerazes, kurios įterpia daug nekomplementarių nukleotidų, negu stabdyti replikaciją. Sintezės būdas, taip pat ir DNR polimerazė, pakeičianti replikatyvinę DNR Pol III, greičiausiai, pasirenkami priklausomai nuo pažaidų tipo, DNR nukleotidų sekų. Pvz., cis-sin pirimidino dimerai replikuojami nepaliekant klaidų, o heterociklinių bazių netekę nukleotidai su klaidomis. E. coli DNR III polimerazė. DNR polimerazė, dalyvaujanti E. coli chromosomos replikacijoje, arba replikazė, yra DNR III polimerazė. Ji buvo aptikta E. coli pola mutante, kuris neturėjo DNR Pol I aktyvumo. Ši DNR polimerazė ypatinga tuo, kad ląstelėje funkcionuoja kaip iš 10 skirtingų tipų subvienetų sudarytas baltymų kompleksas holofermentas. Kelių į holofermento sudėtį įeinančių subvienetų tipų esti po keletą kopijų. Visą DNR III polimerazės holofermentą sudaro 17 polipeptidų. Holofermentas, esantis replisomos sudėtyje, yra labai stabilus, tačiau gryninamas iš ląstelių disocijuoja į atskirus subvienetus arba holofermento dalis (4.16 pav., a). Toliau 4.3 lentelėje yra pateikiama DNR III polimerazės holofermento sudėtis ir trumpai apibūdintos jį sudarančių subvienetų funkcijos. 4.3 lentelė. E. coli DNR III polimerazės holofermento komponentai ir jų funkcijos Komponentas (subvienetų kiekis holofermente) Genas Molekulinė masė* (kda) Funkcija α (2) dnae 129,9 5 3 polimerazinis aktyvumas ε (2) dnaq 27,5 3 5 egzonukleazinis aktyvumas θ (2) hole 8,6 Stimuliuoja ε egzonukleazę; stimuliuoja šerdinės dalelės susimontavimą γ-τ kompleksas Nuo ATP priklausomas β žiedo užkėlimo kompleksas γ-τ (1 / 2)** dnax 47,5 / 71,1 γ ATPazė, τ organizuoja DNR Pol III holofermentą (jungia dvi šerdines DNR Pol III, DnaB) δ (1) hola 38,7 Jungia β žiedą δ (1) holb 36,9 Stimuliuoja γ ATP 1 srityje χ (1) holc 16,6 Jungiasi prie SSB ψ (1) hold 15,2 Jungia χ prie žiedo užkėlimo komplekso γ-τ komplekso β (2 dimerai) dnan 40,6 Žiedas užtikrina DNR polimerazės procesyvumą*** * Viso E. coli DNR Pol III holofermento molekulinė masė sudaro ~ 791,5 kda. ** Priklausomai nuo to, ar kompleksas yra laisvas tirpale ar holofermento sudėtyje, γ-τ subvienetų stechiometrinė sudėtis skiriasi. Lentelėje pateikta holofermento sudėtyje esančio γ-τ sudėtis. *** Procesyvumas polimerazių savybė jungti nukleotidus nedisocijuojant nuo matricos. 169

170 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR III polimerazės katalizuojamai reakcijai in vitro užtenka trijų baltymų: α, ε ir θ. Kompleksas, kurio sudėtyje yra po vieną α, ε ir θ polipetidą (M w = 166 kda), dar vadinamas šerdine (angl. core) DNR III polimeraze. Šerdinė DNR polimerazė pasižymi šiais aktyvumais: z α polipeptidas pasižymi 5 3 DNR polimeraziniu aktyvumu; z ε polipeptidas pasižymi 3 5 egzonukleaziniu aktyvumu; z θ polipeptidas stimuliuoja ε egzonukleazę. Šerdinės polimerazės sintezės greitis ir procesyvumas yra nedideli: sintezės greitis siekia ~ 20 nt/s, o procesyvumas 1 10 nukleotidų. Dar mažesni yra α subvieneto sintezės greitis (8 nt/s) ir procesyvumas. Ilgų genominės DNR molekulių replikacijai ląstelėje užtikrinti DNR polimerazė susijungia su papildomais baltymais ir sudaro DNR III polimerazės holofermentą. Tokia polimerazė yra itin greita (iki nt/s) ir procesyvi (> 50 kb). Holofermento sudėtyje esantys baltymai atlieka įvairias funkcijas, kurios būtinos užtikrinti veiksmingą genomo DNR replikaciją. E. coli DNR III polimerazės holofermentas organizuotas į tris funkcinius vienetus (4.4 lentelė). Tokia replikatyvinių DNR polimerazių replikazių funkcinė organizacija yra konservatyvi visuose organizmuose nuo bakterijų iki žmogaus: z šerdinių (α, ε, θ) DNR III polimerazių holofermente iš viso yra dvi po vieną pirmaujančiosios ir vėluojančiosios DNR grandinių sintezei (4.16 pav., a); z γ-τ žiedo užkėlimo (angl. clamp loader) kompleksas; z du β žiedai (angl. sliding clamp), kurių kiekvienas sudarytas iš dviejų β baltymo monomerų pav. E. coli DNR III polimerazės holofermento struktūra. Holofermento struktūros schema (a); holofermento baltymų savybės ir juos koduojantys genai (b) ( replication.html) 170

171 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.17 pav. E. coli DNR polimerazės holofermento γ ir τ subvienetų stuktūrinė organizacija Žiedo užkėlimo kompleksą (ŽUK) sudaro 7 baltymai, jų stechiometrinė sudėtis 3γ-τ, δ, δ, χ (chi) ir ψ (psi). γ ir τ subvienetai pasižymi ATPaziniu aktyvumu, yra koduojami to paties E. coli dnax geno (4.15 pav. b). τ baltymas turi 24 kda ilgesnį C galą negu γ polipeptidas (4.17 pav.). Pastarasis yra sintetinamas įvykus skaitymo rėmelio poslinkiui dnax ribosomoje irnr transliacijos metu. γ ir τ subvienetų I III domenai yra identiški, τ subvienetas turi papildomus IV ir V domenus, kurių reikia DnaB helikazės ir šerdinių DNR Pol III jungimui (4.17 pav.). Žiedo užkėlimo komplekse DnaX baltymų yra iš viso 3, tačiau jų stechiometrinė sudėtis gali būti įvairi: γ 3, γ 2 τ 1, γ 1 τ 2, τ 3, priklausomai nuo to, ar šis kompleksas yra laisvas ar jis yra DNR Pol III holofermento sudėtyje. τ baltymai C galinėmis sritimis jungiasi su šerdinėmis polimerazėmis (α, ε, θ). Mažiausiai dvi šerdinės polimerazės turi būti įjungtos į holofermentą, kad būtų užtikrinta vėluojančiosios ir pirmaujančiosios DNR grandinių sintezė. Tam reikalingi mažiausiai du τ subvienetai. Dviejų τ subvienetų ir dviejų šerdinių polimerazių subkompleksas dar vadinamas DNR Pol. Be anksčiau minėtos funkcijos, τ subvienetai dar sujungia holofermentą su DnaB helikaze (4.16 pav., a). Kai heksamerinė DnaB helikazė τ baltymų sujungiama su DNR Pol III holofermentu, DNR grandinių išskyrimo greitis labai padidėja ir tampa panašus į DNR Pol III holofermento, sintetinančio DNR, greitį. Taigi, τ subvienetai yra replisomos, kurias sudaro DNR Pol III holofermentas, DnaB helikazė, DnaG praimazė, SSB baltymai bei organizacinis centras (4.16 pav., a). Šerdinių polimerazių ir γ-τ žiedo užkėlimo komplekso komponentai sudaro DNR Pol III* kompleksą vadinamąją DNR Pol III žvaigždę (angl. DNA Pol III star). DNR Pol III* jungiasi su β žiedais. Iš anksčiau pateikto komponentų aprašymo matyti, kad DNR III polimerazės holofermentas yra asimetrinės struktūros, nes turi tik vieną γ-τ kompleksą. Holofermentas yra asimetriškas ir funkcine prasme, nes γ-τ kompleksas funkcionuoja ties ta replisomos vieta, kur yra sintetinama vėluojančioji DNR grandinė. Daugelio eubakterijų genomuose yra DNR Pol III holofermento komponentus koduojančių genų, tarp kurių labiausiai konservatyvūs genai, koduojantys α, β, τ, δ, δ subvienetus, o kitus subvienetus koduojantys genai smarkiai pakitę arba jų iš viso nėra. Pamatinė struktūrinė DNR Pol III organizacija ir pagrindinės biocheminės funkcijos yra tos pačios. Tiesa, kai kurios gram teigiamos bakterijos, pvz., B. subtilis, S. aureus, S. pyogenes, turi dvi skirtingas DNR polimerazes, dalyvaujančias genomo replikacijoje. Kaip susimontuoja didžiulis DNR III polimerazės holofermentas, dydžiu (kuris yra ~ Da) beveik prilygstantis mažajam E. coli ribosomos subvienetui, ir kokios jo komponentų funkcijos replikacijos procese? Šerdinės DNR Pol III (α, ε, θ) sintezės greitis ir procesyvumas yra maži. Tapti veiksmingomis replikazėmis joms būtini slystantieji žiedai (angl. sliding clamp) polimerazių procesyvumo veiksniai. Slystantieji žiedai yra DNR polimerazių procesyvumo veiksniai. 171

172 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Prieš prisijungiant šerdinėms DNR III polimerazėms prie DNR grandinių ir prieš prasidedant DNR sintezei, prie DNR pirmiausiai jungiami žiedai. Prie jų prisijungia ar yra prijungiamos DNR polimerazės, taip pat daugelis pagalbinių replikacijoje, reparacijoje bei kituose procesuose dalyvaujančių baltymų. Slystantiesiems žiedams sąveikaujant su daugeliu baltymų, valdomas ir pačių DNR polimerazių darbas. Slystantieji žiedai yra paplitę daugelyje organizmų nuo bakteriofagų iki žmogaus ir atlieka tą pačią funkciją replikacijoje. Šių DNR polimerazių procesyvumo veiksnių aminorūgščių sekos skiriasi, tačiau jų erdvinė struktūra yra itin panaši: baltymų monomerai sudaro žiedą (homodimerą arba homotrimerą), turintį ~ 35 Å ertmę, kurioje yra DNR dupleksas (4.18 pav., a). Žiedo vidiniame paviršiuje yra α spiralių, jis neigiamo krūvio. Žiedo viduje taip pat išsitenka pora sluoksnių vandens molekulių. Išsidėsčiusios tarp vidinio baltymo paviršiaus ir DNR jos gali palengvinti DNR slydimą. Žiedą sudarantys monomerai tarpusavyje sąveikauja vandeniliniais, 4.18 pav. Slystantieji žiedai ir jų su DNR kompleksas. E. coli β žiedo komplekso su DNR erdvinė struktūra. I III baltymo domenai (a); įvairių organizmų slystančiųjų žiedų struktūros (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7, p. 751, 2006) 172

173 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) hidrofobiniais, joniniais (druskų tiltelių) ryšiais. Vieno monomero N galas sąveikauja su kito monomero C galu ( galvos-uodegos principu). Sąveika yra labai glaudi. Žiedo pusės skiriasi: vienoje jo pusėje yra protomerų C galai. Iš šios pusės su žiedu sąveikauja žiedo užkėlimo kompleksas, DNR polimerazės, kiti baltymai. Į žiedo vidų patalpinamas DNR dupleksas. Atrankia sąveika su DNR žiedas nepasižymi. Atsiradus dvigrandiniam DNR trūkiui, žiedas nuo DNR nukrinta, nes sumažėja baltymo ir DNR sąveikų skaičius. Slystantieji žiedai bakterijose paprastai sudaryti iš dviejų monomerų, o bakteriofaguose, archėjose ir eukariotuose iš trijų (4.18 pav., b). Kiekvieną E. coli DNR III polimerazės slystantįjį žiedą sudaro du vienodi β subvienetai. (4.18 pav., a). β subvienetų dimeras yra labai stabilus. Jo gyvavimo ant DNR pusamžis sudaro ~ 100 min 37ºC. β dimero jungimui prie DNR reikia ATP ir γ-τ komplekso žiedo užkėlimo komplekso, ŽUK (4.3 lentelė). Žiedų užkėlimo kompleksai paplitę bakterijose, virusuose, archėjose ir eukariotuose. Pvz., T4 bakteriofago ir eukariotų žiedo užkėlimo kompleksai sudaryti iš penkių subvienetų, o archėjų iš dviejų subvienetų, didžiojo ir mažojo, kurių stechiometrinė sudėtis yra 1:4. Bakterijose ant sintetinamos pirmaujančiosios DNR grandinės β žiedas užkeliamas vieną kartą, o ant vėluojančiosios DNR grandinės kas 1 2 s, pradedant sintetinti kiekvieną naują Okazaki fragmentą ties praimazės susintetintu RNR pradmeniu. Žiedui užkelti ŽUK naudoja ATP jungimą ir hidrolizę. Mažiausiai vienos ATP molekulės reikia užkelti vieną žiedą ant T4 bakteriofago DNR polimerazės, 2 3 ATP molekulių užkelti vieną žiedą ant E. coli DNR Pol III. E. coli β žiedui užkelti užtenka į γ-τ komplekso sudėtį įeinančių subvienetų, kurių stechiometrinė sudėtis yra 3γ 2, δ, δ (vadinamasis minimalus žiedo užkėlimo kompleksas). Į γ-τ komplekso sudėtį įeinantys γ, δ, δ subvienetai yra AAA + (angl. ATPases associated with a variety of cellular activities) ATPazių šeimos atstovai. Šeimai priklauso labai daug įvairias funkcijas atliekančių ląstelės baltymų, kurie skirstomi į 7 klases. AAA + baltymų funkcijos priklauso nuo ATP prijungimo ir hidrolizės. γ-τ komplekso baltymai priklauso I klasei, jie sudaro atviro žiedo pavidalo struktūrą. Kitų klasių AAA + šeimos atstovai, išskyrus II klasės, sudaro uždaro žiedo struktūras. Kiekvieną ŽUK subvienetą sudaro trys domenai (4.19 pav., a). ŽUK žiede tarp δ ir δ subvienetų yra ~ 20 Å plyšys (4.19 pav., b). Per šį plyšį talpinama DNR. ŽUK subvienetų C galiniai domenai (III domenai) žiedo užkėlimo komplekso struktūros viršuje sudaro uždarą apykaklę. Apykaklėje plyšio nėra, todėl ties apykakle viengrandinė DNR išlinksta (4.20 pav.). Rentgenostruktūriniai tyrimai patvirtino, kad ŽUK struktūra iš tiesų nėra visiškai žiedinė: N galiniai AAA + domenai (I ir II) išsidėsto sudarydami struktūrą, panašią į dešiniojo sukimo spiralę. E. coli ŽUK šis struktūrinis ypatumas nėra toks ryškus kaip, pvz., eukariotų ŽUK. ŽUK ATPazinį motorą sudaro trys γ subvienetai. Būtent jų sudėtyje yra konservatyvūs AAA + šeimos baltymams būdingi aminorūgščių motyvai (Volkerio A ir B motyvai, SRC motyvas su arginino pirštu), kur prijungiamos ir hidrolizuojamos ATP molekulės (4.19 pav., b). ATP prijungimas ir hidrolizė valdo ŽUK aktyvumą. δ subvienetas komplekse sąveikauja su δ, neleisdamas jam anksčiau laiko jungti β žiedo. δ subvienetas tiesiogiai sąveikauja su β žiedu. Sąveika su 2 Ląstelės replisomoje funkcionuoja γτ 2 δδ χψ kompleksas. 173

174 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA β žiedu tampa įmanoma, kai ŽUK prijungia ATP. ATP prijungimas sukelia konformacinių pokyčių ŽUK. δ ir δ subvienetai, kitaip nei γ, ATPaziniu aktyvumu nepasižymi. Jei nėra ATP, γ-τ kompleksas silpnai sąveikauja su β žiedu. O vienas δ subvienetas pasižymi stipria sąveika su β žiedu, ir šiai sąveikai ATP nereikia. Tai liudija, kad ŽUK komponentas, tiesiogiai sąveikaujantis su β žiedu, yra paslėptas. ATP molekulių prijungimas prie komplekso subvienetų keičia ŽUK erdvinę struktūrą. Tada vienas jo subvienetų (δ) gali prijungti β žiedą (4.20 pav.). Bakterijų ŽUK turi tris ATP prijungimo sritis, o eukariotų net keturias. Parodyta, kad žiedo jungimo metu mažiausiai viena ATP molekulė turi prisijungti prie γ-τ komplekse esančių vieno iš subvienetų, kad komplekse prasidėtų konformaciniai pokyčiai, išlaisvinantys δ subvienetą. δ subvienetas prisijungia prie β žiedo. Kompleksas pirmiausiai prijungia žiedą, o tada jį praveria ties žiedo monomerų sąveikos riba (4.20 pav.). Neseniai patvirtinta, kad žiedo pravėrimo metu ŽUK dalyvauja tiesiogiai. Koks galėtų būti žiedo pravėrimo mechanizmas? Tiriant komplekso erdvinę struktūrą, nustatyta, kad δ subvieneto sritis, esanti subvieneto N galiniame domene, kaip pleištas įsiterpia į hidrofobinę kišenę, kuri yra β žiedo vieno iš subvienetų C gale. Žiedas praveriamas. Pro susidariusį plyšį įterpiamas ~ 20 Å DNR dupleksas (DNR matrica-pradmuo) pav. E. coli žiedo užkėlimo komplekso stuktūra. Komplekso baltymų erdvinės struktūros. I III domenai parodyti (a); ATPazės aktyvusis centras, formuojamas dviejų greta esančių subvienetų (kairėje); žiedo užkėlimo komplekso struktūros schema (dešinėje) (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7, p. 751, 2000) 174

175 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Žiedo užkėlimo kompleksas su prijungtu prie jo ir pravertu žiedu užkelia žiedą ant DNR. Žiedas turi būti užkeltas ant DNR taip, kad ta jo pusė, prie kurios vėliau jungsis DNR polimerazė, būtų tiksliai išdėstyta DNR atžvilgiu (4.20 pav.). DNR polimerazė jungiasi ties tuo pačiu žiedo paviršiumi (žiedo C galine dalimi), kaip ir ŽUK. DNR prijungimui ATP hidrolizės nereikia: šiame etape ATP gali būti pakeistas nehidrolizuojamu analogu ATPγS. ŽUK vienodai veiksmingai prijungia tiek DNR matricos-pradmens kompleksą, turintį viengrandinės matricos 5 galo iškyšą, (4.20 pav.), tiek dvigrandinę DNR, nepriklausomai nuo to, yra β žiedas ar ne. Tačiau tik pirmuoju atveju prijungtas substratas matricapradmuo ~ 100 kartų aktyvina γ-τ komplekso ATPazes. Tada vyksta ATP hidrolizė. Pasibaigus ATP hidrolizei, γ-τ komplekse vyksta struktūros pokyčiai. ŽUK disocijuoja, paleisdamas žiedą. β žiedas užsiveria aplink DNR matricos-pradmens dupleksą. Su ta pačia β žiedo puse sąveikauja šerdinė DNR Pol III, būtent tuo metu ji jungiasi prie žiedo. Reikia pastebėti, kad γ-τ kompleksas gali ir užkelti žiedą ant DNR, ir jį nukelti. Spėjama, kad pastarąją funkciją gali atlikti pats δ subvienetas. Tie β kompleksai, prie kurių yra prisijungusi DNR III polimerazė, apsaugoti nuo disociacijos, o tie, kurie yra laisvi, gali būti nukeliami nuo DNR ir naudojami kitose vietose, kur reikia prijungti DNR polimerazę. Neseniai tyrimais patvirtinta, kad ties bakterijų vėluojančiąja grandine yra daug nenukeltų žiedų. Dvi šerdinės DNR III polimerazės pasižymi skirtingomis disociacijos nuo DNR savybėmis. Toji šerdinė DNR polimerazė, kuri sintetina pirmaujančiąją grandinę, lieka nuolat susijungusi su β žiedu, o ta, kuri sintetina vėluojančiąją grandinę, kartas nuo karto perjungiama nuo baigto sintetinti Okazaki fragmento prie žiedo ties naujo fragmento pradmeniu. Todėl γ-τ kompleksas replisomoje yra susijungęs su ta šerdine DNR polimeraze, kuri sintetina vėluojančiąją grandinę. Žiedų ląstelėje yra kartų daugiau nei DNR III polimerazės holofermentų kompleksų. γ-τ komplekso disociacija nuo žiedo ir DNR duplekso yra būtina, kad prie jos galėtų prisijungti likę DNR polimerazės subvienetai ir prasidėti DNR replikacija pav. Baltymų žiedo jungimas prie DNR matricos-pradmens komplekso dalyvaujant žiedo užkėlimo kompleksui (ŽUK) (BMC Biology, v. 10, 2012) 175

176 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Neseniai buvo nustatyta, kad šerdinės polimerazės disociacijai, kai ji baigia Okazaki fragmento vėluojančiojoje grandinėje sintezę, reikia τ subvieneto. Kai DNR polimerazė pasiekia prieš tai sintetinto Okazaki fragmento pradmens 5 galą ir įjungia paskutinį prieš ankstesnįjį pradmenį, lieka atviras plyšys. Iš DNR polimerazės holofermento yra išsukamas τ subvienetas. Jis sukelia DNR polimerazės šerdinės dalelės disociaciją nuo β žiedo. Šiam procesui reikalingas τ subvieneto C galinis domenas, kuris yra komplekso išorėje ir sąveikauja su DNR polimeraze. Įdomu, kad išsukimas priklauso nuo to, ar Okazaki fragmento sintezė baigta ar ne jis vyksta tik polimerazei įjungus paskutinį nukleotidą. Manoma, kad tokiu būdu apsisaugoma nuo pernelyg didelio procesyvumo. Kaip nustatoma Okazaki fragmento sintezės pabaiga ir kada DNR polimerazės šerdinę dalelę reikia perjungti ties kitu žiedu? τ subvieneto C galinis domenas pasižymi savybe atrankiai sąveikauti su DNR. Šios savybės, pvz., neturi to paties geno koduojamas, tik trumpesnį C galą turintis γ baltymas. Siūloma hipotezė, kad baltymo C galinis domenas holofermente yra išsidėstęs arti šerdinės dalelės α subvieneto, kuris sąveikauja su DNR ir gali identifikuoti, kada Okazaki fragmento sintezė baigta. Disocijavusi nuo β žiedo DNR polimerazės šerdinė dalelė greitai prijungiama prie kito β žiedo, ŽUK prijungto ties naujai susintetintu pradmeniu. Kaip susimontuoja E. coli DNR Pol III holofermentas? Turi susidaryti dimerinė holofermento struktūra, turinti vieną ŽUK. Čia svarbiausias vaidmuo tenka dviems DNR Pol III τ subvienetams. τ subvienetų dimeras DNR III polimerazės holofermente laiko γ-τ kompleksą ir dvi šerdines DNR polimerazes, sintetinančias pirmaujančiąją ir vėluojančiąją DNR grandines E. coli replikacinės šakutės modelis Asimetrinės E. coli DNR III polimerazės holofermento struktūros nustatymas davė pagrindą ir replikacinės šakutės struktūrinio modelio sukūrimui. Modelis vadinamas trombono modeliu. Jame viena šerdinė DNR III polimerazė sintetina pirmaujančiąją grandinę, o kita vėluojančiąją grandinę. Visas DNR III polimerazės holofermentas juda išilgai DNR (arba DNR juda per jį) ta kryptimi, kuria sintetinama pirmaujančioji DNR grandinė. Motininė grandinė, kuri yra matrica vėluojančiosios grandinės sintezei, praskiriama tiek, kad galėtų prasidėti RNR pradmens sintezė (4.21 pav., a). Ji sudaro kilpą užsilenkiant grandinei replikacinės šakutės judėjimo kryptimi. Kuo toliau į priekį juda DNR III polimerazės holofermentas, tuo didesnė kilpa susidaro vėluojančiosios grandinės sintezei. Kai praimazė susintetina pirmąjį RNR pradmenį Okazaki fragmentui, prie matricos-pradmens ŽUK prijungia žiedą. Tada prie jo prisijungia šerdinė DNR Pol III. Siūloma hipotezė, kad susidarant DNR kilpai, abi šerdinės DNR III polimerazės dalelės juda viena kryptimi kartu su visu holofermentu (4.21 pav.). Šerdinė DNR Pol III dalelė, sintetinanti vėluojančiąją grandinę, nedisocijuoja iš DNR Pol III holofermento, tačiau persijungia nuo vieno susintetinto Okazaki fragmento prie naujo pradmens, susintetinto kitam Okazaki fragmentui. Abi DNR III polimerazės šerdines daleles holofermente, kaip jau minėta, laiko τ subvienetai. Replikacinė šakutė E. coli juda nt/s greičiu. Vėluojančiojoje grandinėje yra sintetinami nukleotidų ilgio Okazaki fragmentai. Kiekvienas naujas Okazaki fragmentas pradedamas sintetinti kas 1 2 s. Tai vyksta ciklais (4.21 pav., a d), kurių metu: z praimazė, sąveikaudama su DNR helikaze, sintetina RNR pradmenį; 176

177 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) zžuk kompleksas pašalina praimazę, jai susintetinus pradmenį; kiekvienam naujam pradmeniui sintetinti praimazė pritraukiama iš aplinkinės terpės; z prie matricos-pradmens ŽUK kompleksas prijungia β žiedą; zšerdinė DNR III polimerazė, disocijavusi nuo baigto sintetinti Okazaki fragmento, prijungiama prie žiedo pav. Bakterijų DNR III polimerazės holofermento vykdomos DNR replikacijos trombono modelis. Pirmaujančiosios ir vėluojančiosios grandinių sintezė vyksta koordinuotai. Rodyklė žymi replikacinės šakutės judėjimo kryptį. Okazaki fragmento sintezės pabaiga vėluojančiojoje grandinėje (a); naujo pradmens sintezė (b); žiedo jungimas ties nauju matricos-pradmens kompleksu (c); DNR Pol III šerdinės dalelės jungimas prie žiedo, naujo Okazaki fragmento sintezė (d) (J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013) 177

178 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Kiti E. coli replikacinės šakutės komponentai Be DNR III polimerazės holofermento, E. coli replikacinėje šakutėje svarbų vaidmenį replikacijos metu atlieka ir kiti replisomos komponentai: praimazė, helikazė ir SSB baltymai. Aptarsime kiekvieno jų funkcijas. 4.4 lentelėje pateikti prokariotų ir eukariotų baltymai, esantys replikacinės šakutės sudėtyje ir dalyvaujantys DNR replikacijoje. 4.4 lentelė. Baltymai ir jų funkcijos prokariotų ir eukariotų replikacinėse šakutėse Funkcija E. coli / λ fagas T4 fagas SV40 virusas / žmogus Mielės Helikazė DnaB gp41 T antigenas (SV 40 specifinis) MCM baltymai / MCM baltymai Praimazė DnaG gp61 Praimazės subvienetai DNR Pol α praimazėje Polimerazė DNR Pol III holofermento α subvienetas 3 5 egzonukleazė DNR Pol III holofermento ε subvienetas Praimazės subvienetai DNR Pol α praimazėje gp43 DNR Pol δ DNR Pol δ ir DNR Pol ε Dalis gp43 polimerazės subvieneto Dalis DNR Pol δ subvieneto Slystantysis žiedas β subvienetas gp45 PCNA PCNA Žiedo užkėlimo γ-τ kompleksas gp44/62 RFC RFC kompleksas Prie viengrandinės DNR prisijungiantis baltymas SSB gp32 RPA RPA Dalis DNR Pol δ ir ε subvienetų E. coli praimazė (DnaG) DNR polimerazės negali sintetinti nukleotidinės grandinės de novo. Jos tik ilgina pradmenį. Kaip tada pradedama DNR grandinės sintezė? Dar 1971 m. A. Kornbergas ir jo kolegos iškėlė hipotezę, kad DNR replikacijai reikia RNR sintezės. Vienus pirmųjų eksperimentų, kuriais buvo nustatyta, kad DNR sintezės metu sintetinami RNR pradmenys, atliko R. ir C. Okazaki. E. coli buvo auginamos su radioaktyvų fosforo izotopą turinčiu α-[ 32 P]dNTP ir neradioaktyviais rntp. Iš bakterijų išskirta DNR buvo veikiama silpnu šarmu, kad įvyktų RNR hidrolizė (DNR yra atsparesnė tokiai hidrolizei). R. ir C. Okazaki spėjo, kad jeigu DNR sintezė prasideda nuo RNR pradmens 3 galo, tai kiekviename Okazaki fragmente turėtų būti po vieną DNR-RNR jungtį radioaktyvaus dntp su rntp. Po šarminės hidrolizės radioaktyvus fosfatas turėtų likti prisijungęs prie rntp 2 arba 3 hidroksigrupės. Tokie radioaktyvūs ribonukleozido monofosfatai ir buvo nustatyti (4.22 pav.). Vėliau buvo atrasti fermentai, kurie per replikaciją sintetino nedidelius RNR fragmentus pradmenis, komplementarius DNR matricai. Tokius pradmenis ilgino RNR polimerazės. Šie baltymai, pavadinti praimazėmis, buvo aptikti įvairiausiuose organizmuose nuo virusų iki daugialąsčių eukariotų. Praimazės yra specialios klasės RNR polimerazės, kurios vieną kartą sintetina RNR pradmenį pirmaujančiojoje grandinėje ir daugelį kartų vėluojančiojoje grandinėje. 178

179 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Organizmuose praimazės gali būti pavienių baltymų arba keliais fermentiniais aktyvumais pasižyminčių baltyminių kompleksų subvienetų pavidalu. Replikacijos metu praimazės sąveikauja su kitais replisomos komponentais. Praimazės, kitaip nei DNR polimerazės, gali pradėti RNR pradmens de novo sintezę ties daugeliu DNR matricinės grandinės vietų, vadinamų starto sritimis. Praimazės sintetina RNR pradmenį de novo. E. coli RNR pradmenis chromosomos DNR replikacijos metu replisomoje sintetina jau minėta praimazė DnaG. Ji yra ir atnaujintos replikacijos (angl. replication restart) replisomos sudėtyje. Be praimazės, atnaujintos replikacijos komplekse dalyvauja pagalbiniai baltymai (PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB, DnaC), kartu jie sudaro praimosomą. Atnaujintos replikacijos mechanizmas įjungiamas, kai replisoma prieina DNR pažaidas. Reparacijos metu pažaidos ištaisomos ir DNR sintezė tęsiama. Praimazėms būdingas cinko pirštų (angl. zink fingers) motyvas ZBD domene, kuris sąveikauja su DNR. ZBD domenas (15 kda) yra baltymo N gale (4.23 pav., a). 36 kda centriniame domene yra RNR polimerazinis aktyvumas, o 15 kda domenas C gale reikalingas sąveikai su DnaB helikaze. Įdomu, kad T7 bakteriofago praimazės C galinis domenas yra kovalentiniu ryšiu sujungtas su helikazės subvieneto N galiniu domenu. Taigi, T7 heksamerinė helikazė turi net 6 praimazes (6:6)! Daugelio praimazių sintezės substratai yra tiek dntp, tiek rntp, tačiau pirmenybė teikiama ribonukleotidams, nes jų kiekiai ląstelėje yra didesni (nėra žinoma, ar mišrūs pradmenys sin pav. Schema, iliustruojanti R. ir C. Okazaki eksperimentą, kuriuo nustatyta, kad DNR sintezė E. coli pradedama RNR pradmeniu 179

180 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA tetinami in vivo). Praimazių procesyvumas yra labai mažas, in vivo jos gali sintetinti ne ilgesnius nei 11±1 nukleotidų RNR. E. coli praimazės funkciniam aktyvumui pasireikšti reikalinga jos sąveika su DnaB helikaze (4.23 pav., b, c) ir SSB baltymais. DNR replikacijai prasidėti DNR grandinės turi būti atskirtos. DNR grandines atskiria DNR DnaB helikazė. Atskyrus ~ 65 bp DNR, praimazė gali prisijungti prie atskirtų grandinių ir pradėti pradmens sintezę. Praimazės sąveika su DNR helikaze padidina praimazės aktyvumą > kartų. DNR helikazė, savo ruožtu, aktyvina praimazę, valdo, kur ir kiek pradmenų ji sintetina. Pradmenų sintezės vietoms būdingas nedidelis (dažniausiai 2 3 nukleotidų) matricinės grandinės sekų savitumas. Pvz., E. coli pradmenų sintezės vietos yra 5 -CTG-3, o RNR pradmens seka pppag(n) 8 10 (kur N bet kuris nukleotidas). E. coli praimazės sąveika su kitais replisomos komponentais SSB baltymais yra labai stipri: fotosąsiuvų būdu SSB baltymus galima kovalentiniais ryšiais prisiūti prie modifikuoto ATP, esančio praimazės aktyviajame centre. Nustatyta, kad praimazė, susintetinusi ~ 11±1 nukleotidų pradmenį, nedisocijuoja nuo DNR-RNR duplekso, o lieka tvirtai prisijungusi. Tokios sąveikos priežastys nėra aiškios: gali būti, kad taip RNR pradmuo apsaugomas nuo ribonukleazių; arba gali būti, kad ši sąveika užtikrina, kad pradmuo nebūtų ilginamas kitų DNR polimerazių, o tik DNR III polimerazės. Manoma, kad praimazę nuo RNR pradmens pašalina γ-τ kompleksas. Vienas iš šio komplekso subvienetų, χ, taip pat sąveikauja su SSB baltymais. Prisijungus prie SSB χ subvienetui, susilpninama SSB sąveika su praimaze, ir ši disocijuoja. Kai γ kompleksas pašalina praimazę nuo pradmens, jis 4.23 pav. E. coli praimazės (DnaG) erdvinė struktūra ir sąveika su helikaze DnaB. DnaG domenai (a); su helikaze sąveikaujančio domeno ir helikazės DnaB erdvinė struktūra (b); DnaG ir DnaB domeninė organizacija. Rodyklės žymi sąveikas (c) (Nucleic Acids Research, v. 34, p. 4082, 2006) 180

181 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) prijungia β žiedą, prie kurio jau gali prisijungti DNR III polimerazes šerdinė dalelė. Tuomet gali prasidėti DNR replikacija. Eukariotinėse ląstelėse RNR pradmenis DNR replikacijos metu sintetina DNR polimerazė-α praimazė (4.4 lentelė), kuri, kitaip nei kitos žinomos prokariotų ir eukariotų DNR polimerazės, pasižymi ir praimazės aktyvumu E. coli replikatyvinė helikazė (DnaB). Kitos DNR helikazės DNR helikazės yra molekuliniai motorai, hidrolizuojantys NTP judėti išilgai nukleorūgščių. Helikazės dalyvauja visuose svarbiausiuose nukleorūgščių metabolizmo procesuose: replikacijoje, reparacijoje, transkripcijoje. Visoms helikazėms yra būdingos tokios biocheminės savybės: z nukleorūgščių jungimas; z NTP / dntp jungimas; z nuo NTP / dntp priklausomas nukleorūgščių duplekso išskyrimas 3 5 arba 5 3 kryptimi. Ląstelėje yra daug helikazių bei baltymų, veikiančių panašiai kaip helikazės: 14 helikazių aptikta E. coli, 15 mielėse, > 24 žmoguje. Pagal baltymų aminorūgščių sekų panašumą ir helikazių domenų konservatyvumą, helikazės skirstomos į helikazių superšeimas. Tam tikros superšeimos helikazės pasižymi heksamerine žiedo pavidalo struktūra. Žiedo viduje išsidėsto viena nukleorūgšties grandinė, o išorėje kita. Tokios helikazės geba procesyviai judėti išilgai nukleorūgščių, išskirdamos dupleksą (DNR, dvigrandinę RNR arba DNR-RNR heterodupleksą). Heksamerine struktūra pasižymi ir replikatyvinės helikazės (4.24 pav., a), kurios per replikaciją prijungiamos prie DNR replikacijos iniciacijos srities (ori). Atskyrusios DNR duplekso grandines, helikazės sukuria replikacines šakutes (4.24 pav., b). Visos replikacijos metu helikazės lokalizuojasi replikacinių šakučių priekyje ir vykdo DNR grandinių išskyrimą. Replikatyvinės helikazės rastos organizmuose nuo virusų iki žmogaus. Heksamerines helikazes dažniausiai sudaro vienodi subvienetai, bet, pvz., žmogaus ląstelių replikatyvinės helikazės MCM 2 7 yra heteroheksamerinės struktūros. Helikazės veikia ne pavieniui, bet kartu su kitais baltymais. Joms būdingas didelis procesyvumas ir sąveika su savosiomis (angl. cognate) DNR polimerazėmis. Pvz., jei nėra DNR polimerazės, E. coli DnaB helikazė išskiria tik ~ 35 nukleotidų porų DNR per sekundę. DNR III polimerazės holofermento τ subvieneto užtikrinama helikazės sąveika su DNR polimeraze E. coli replikacinėje šakutėje, padidina grandinių išskyrimo greitį ~ 10 kartų. Helikazės prijungiamos aplink vieną iš DNR grandinių ir juda arba 3 5 arba 5 3 kryptimi, atskirdamos kitą DNR grandinę. Manoma, kad E. coli replikacijos iniciacijos metu ties replikacijos iniciacijos sritimi (oric) prisijungia dvi helikazės ir juda į priešingas puses, išskirdamos DNR dupleksus (4.24 pav., b). Kaip veikia replikatyvinė helikazė? Siūloma hipotezė, kad priklausomai nuo ATP prijungimo ir hidrolizės, keičiasi helikazės subvienetų erdvinė struktūra. Dėl erdvinės struktūros kitimo, fermentas juda sukdamasis išilgai DNR. Manoma, kad vienu metu du ATPazės subvienetai galėtų 181

182 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA būti prijungę ATP, kiti du ADP (po ATP hidrolizės), dar kiti du tušti (4.24 pav., b). In vitro vienai heterociklinių bazių porai DNR išskirti reikia 1 2 molekulių ATP. Manoma, kad NTP hidrolizė ir DNR judėjimas helikazėje yra valdomi. Sąveika tarp helikazės, praimazės ir DNR polimerazės užtikrina replikacinės šakutės veiklą. Sąveika tarp helikazės ir DNR polimerazės, savo ruožtu, padidina šerdinės DNR polimerazės, sintetinančios pirmaujančiąją DNR grandinę, procesyvumą pav. Replikatyvinių helikazių struktūra ir veikimas. T7 bakteriofago helikazės, kurią sudaro šeši vienodi subvienetai, erdvinė struktūra. Subvienetuose prisijungęs ATP, ADP arba aktyvusis centras yra tuščias (a); schema, iliustruojanti, kaip dvi E. coli DnaB helikazės išsidėsčiusios replikacijos iniciacijos ori srityje (b) (Cell, v. 101, p. 589, 2000); ATP jungimas ir hidrolizė sukelia helikazės judėjimą išilgai nukleorūgščių (c) (B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin et al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014) 182

183 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Helikazės sulaukė daugelio tyrėjų dėmesio, kai buvo nustatyta, kad dvi paveldimos ligos Vernerio sindromas (angl. Werner syndrome) ir Blumo sindromas (angl. Bloom syndrome) yra susijusios su helikazių defektais. Žmonės, sergantys šiomis ligomis, yra labiau linkę sirgti piktybiniais navikais. Vernerio sindromu sergantys ligoniai labai greitai sensta, pražyla 20-ties metų, apanka nuo kataraktos ir miršta nesulaukę 50-ties metų. Vernerio sindromu ir Blumo sindromu sergančių žmonių genome nustatytos mutacijos genuose, kurie koduoja baltymus, pasižyminčius homologija E. coli recq geno produktui. Šie genai 8-oje chromosomoje koduoja helikazę, kuri dalyvauja homologinėje DNR rekombinacijoje ir gali būti reikalinga tose vietose, kur po UV spindulių sukeltų DNR pažaidų reparacijos vyksta replikacija. Žinomos ir kitų helikazių mutacijos, susijusios su vėžinėmis ligomis ir senėjimu Topoizomerazės E. coli chromosoma ląstelėje yra replikuojama nuo replikacijos iniciacijos oric srities į abi puses. Replikacijos greitis yra ~ nukleotidų per minutę. Jeigu nebūtų mechanizmo, panaikinančio vidinę įtemptį, susidarančią DNR spiralėje dėl intensyvaus grandinių išskyrimo, priekyje DNR superspiralizuotųsi (vyktų teigiamoji superspiralizacija), o replikacinių šakučių judėjimas anksčiau ar vėliau labai sulėtėtų. DNR topologijos problemas, kurios iškyla replikacijos metu, sprendžia topoizomerazės. Apie jų molekulines savybes plačiau kalbėta II skyriuje Nukleorūgščių ir baltymų molekulinė struktūra. Topoizomerazių svarbą DNR biologijoje iliustruoja tai, kad jos yra antimikrobinių ir priešvėžinių vaistų taikiniai. Maždaug pusės vėžio chemoterapijai naudojamų vaistų (pvz., doksorubicino, etopozido, kt.) taikinys yra eukariotų II topoizomerazė. I topoizomerazė yra priešvėžinio vaisto kamptotechino taikinys, o bakterijų II tipo topoizomerazės yra chinolonų klasės antibiotikų taikiniai. Antibiotikai ir priešvėžiniai vaistai veikia slopindami kurį nors topoizomerazių katalizinio ciklo etapą arba sukelia DNR pažaidas DNR-topoizomerazės komplekse E. coli SSB baltymai E. coli replikacinėje šakutėje helikazėms atskyrus dvi DNR grandines, prie jų prisijungia SSB baltymai (angl. single strand binding protein), kurie pasižymi dideliu giminingumu viengrandinei DNR. Prisijungę prie atskirtų DNR grandinių, SSB baltymai neleidžia joms vėl sudaryti duplekso bei kitokių antrinių struktūrų (4.25 pav., a). SSB baltymai taip pat apsaugo viengrandinę DNR nuo nukleazių poveikio. SSB baltymai DNR atrankumu sekoms nepasižymi. SSB baltymai yra gyvybiškai svarbūs nukleorūgščių metabolizmo komponentai visuose organizmuose. Jie dalyvauja DNR reparacijoje, rekombinacijoje, replikacijoje. SSB baltymai rasti organizmuose nuo virusų iki žmogaus. SSB baltymams būdinga sąveika ne tik su DNR, bet ir su daugeliu kitų ląstelės baltymų. DNR replikacijos metu E. coli SSB baltymams yra priskiriamos kelios svarbios funkcijos: zssb baltymai dalyvauja užtikrinant pirmaujančiosios ir vėluojančiosios grandinių sintezės koordinaciją; 183

184 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA zssb baltymai nukreipia praimazę link tos DNR vietos, kur bus sintetinamas pradmuo; neleidžia praimazei per anksti sintetinti pradmens vėluojančiojoje grandinėje; z DNR III polimerazės holofermento ŽUK komplekso χ subvienetas konkuruoja su praimaze dėl sąryšos su SSB baltymais, ir tokiu būdu ją pašalina nuo RNR pradmens, kai reikia prijungti β žiedą; z SSB baltymai stimuliuoja DNR Pol III polimerazinį aktyvumą ir 3 5 egzonukleazinį aktyvumą; z SSB baltymai stimuliuoja DNR helikazę pav. E. coli SSB baltymai ir jų sąveika su viengrandine DNR. SSB jungimasis prie viengrandinės DNR replikacijos metu (a) (B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin et al. Essential Cell Biology, 2013); E. coli SSB baltymo tetramero ir viengrandinės DNR komplekso struktūra (b); SSB baltymo OB domeno erdvinė struktūra (c); schema, iliustruojanti galimą viengrandinės DNR prisijungimą prie SSB tetrametro (d) (Molecular Biology, v. 22, p. 369, 2007) 184

185 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) E. coli SSB baltymai yra 19 kda monomerai, sudarantys homotetramerą. Tetrameras turi 4 DNR jungimo sritis (4.25 pav., b). SSB prijungia viengrandinę DNR OB domenais (angl. oligosacharide/oligonucleotide binding) (4.25 pav., c). OB domenus sudaro aminorūgščių. SSB baltymai jungiasi prie DNR įvairiais būdais. Kai druskų koncentracija nedidelė (< 10 mm NaCl), sąveika su DNR pasižymi kooperatyvumu, t. y. savybe, kai vienos ar kelių baltymo molekulių prisijungimas prie DNR skatina kitų molekulių jungimąsi. Jeigu vienoje vietoje prasideda SSB molekulių jungimasis prie DNR, visa likusi nuoga DNR grandinė greitai yra padengiama SSB baltymais. Kai druskų koncentracija didelė (> 0,2 M NaCl), SSB baltymų jungimasis kooperatyvumu nepasižymi. Kiekvienas SSB baltymų tetrameras prisijungia prie ~ 35 nt viengrandinės DNR. Tetrameras gali prijungti ir ~ 65 nt (4.25 pav., d). Manoma, kad skirtingais būdais prie viengrandinės DNR SSB baltymai jungiasi priklausomai nuo to, kuriame procese DNR rekombinacijos, reparacijos ar replikacijos jie dalyvauja. Nustatyta, kad SSB-DNR kompleksų struktūra yra dinamiška Replikacijos iniciacija E. coli bakterijose Replikacinės šakutės susidaro ne atsitiktinėje DNR grandinės vietoje, o tam tikrose chromosomos srityse replikacijos iniciacijos ori srityse. Replikacijos ori (angl. origin) sritys prokariotuose veikia kaip cis elementai replikatoriai, kurie yra būtini ir pakankami replikacijos iniciacijai vykti. Replikacijos inciacijai taip pat reikia trans veiksnių baltymų iniciatorių, kurie atrankiai jungiasi prie ori srities ir lemia kitų replikacijos iniciacijos dalyvių susimontavimą. Bakterijų ori sritis atlieka šias funkcijas: z ties ori sritimi vyksta DNR replikacijos iniciacija; z ori sritis valdo replikacijos iniciacijos dažnį; z ori sritis užtikrina chromosomų padalijimą (segregaciją) į dukterines ląsteles. Bakterijų ori sričių organizacija skiriasi, tačiau jų sekas DnaA iniciacijos baltymas atpažįsta panašiu principu kaip ir E. coli. E. coli žiedinėje chromosomoje (4,6 x 10 6 bp) esanti 486 bp DNR sritis užtikrina visas anksčiau išvardytas ori srities funkcijas. Minimalus E. coli ori srityje esantis 245 bp DNR fragmentas oric užtikrina bakterijos DNR replikacijos iniciaciją ir valdo replikacijos iniciacijos dažnį. E. coli oric sričiai būdingos šios struktūrinės savybės: zpenki devynių nukleotidų pasikartojimai R1 R5. Tipiška pasikartojimų seka yra 5 TTA- TCCACA3. R1 R5 nukleotidų sekos šiek tiek skiriasi. Pasikartojimai vadinami DnaA dėžutėmis (angl. DnaA box) (4.26 pav., a). Dėžutės dažniausiai prijungia ATP-DnaA ir ADP- DnaA kompleksus; z kitos sekos, kurios yra panašios į DnaA dėžutes ir išsidėsčiusios tarp jų. I sritys prijungia ATP-DnaA kompleksus; ztrys daug A ir T nukleotidų turinčios sritys. Tipišką seką sudaro 13 nukleotidų: 5 GATC- TNTTNTTTT3. Visos trys sekos vadinamos DUE elementu (angl. DNA unwinding element). DUE yra išskiriamos DNR grandinės. DUE yra sekų, prie kurių jungiasi tik ATP ir DnaA kompleksai. Sritys vadinamos ATP-DnaA dėžutėmis (4.26 pav., a). 185

186 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA E. coli replikacijos iniciacijos vyksmų seka apibendrinta 4.26 pav., b. Pirmiausiai bakterijos iniciacijos baltymas DnaA komplekse su ATP arba ADP prisijungia prie DnaA dėžučių R1 R5. DnaA baltymai priklauso AAA + ATPazių šeimai. DnaA struktūroje yra keturi funkciniai domenai; III domenas atsakingas už silpną ATPazinį aktyvumą (4.27 pav., a, b). Prie ori srities R dėžučių DNR DnaA baltymas jungiasi IV domenu. DnaA gali prisijungti prie viengrandinės ir dvigrandinės DNR. DnaA pasižymi savybe oligomerizuotis; DnaA bakterijų replikacijos iniciacijos baltymas. šią savybę užtikrina III baltymo domenas. Oligomerizaciją taip pat skatina bakterijos nukleotido architektūrinis IHF baltymas. Siūloma hipotezė, kad DnaA molekulės sudaro tvarkingos struktūros filamentą, kur apie keliasdešimties DnaA baltymų oligomerą apvejama DNR (4.27 pav., c). Baltymų oligomero ir DNR kompleksas ties ori sritimi matomas elektroniniu mikroskopu. Gebėjimu oligomerizuotis pasižymi ir virusų, archėjų, eukariotų iniciacijos baltymai. Toliau vyksta kitas replikacijos iniciacijos ties oric sritimi įvykis. oric DUE srityje DnaA baltymai atskiria DNR grandines (4.27 pav., c). Šiam procesui vykti reikalingi ATP-DnaA kompleksai, kurie jungiasi prie ATP-DnaA dėžučių DUE srityje. DNR grandinių išsiskyrimo mechanizmas nėra gerai išaiškintas. DnaA gali prijungti ir viengrandinę, ir dvigrandinę DNR. Kai DNR grandinės išskiriamos, ATP-DnaA kompleksai išaktyvinami hidrolizavus ATP iki ADP. Viengrandines DNR padengia SSB baltymai pav. Replikacijos iniciacija E. coli oric srityje. oric struktūros schema. R1, R2, R4 didelio gimingumo DnaA dėžutės, R3, R5 mažesnio giminingumo DnaA dėžutės. I sričių, IHF ir Fis baltymų prisijungimo sritys parodytos. Žvaigždutėmis parodytos GATC sekų padėtys (a); replikacijos iniciacija ties oric dalyvaujant DnaA iniciacijos baltymui, DnaB helikazei ir helikazės DnaC jungikliui (b) 186

187 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Kitas iniciacijos etapas yra replikatyvinių helikazių prijungimo etapas (4.26 pav., b). E. coli replikatyvinę helikazę, veikdamas kartu su DnaA baltymais, prijungia helikazės jungiklis DnaC baltymas. Jungimo mechanizmas nėra iki galo išaiškintas. Šeši DnaC baltymai sudaro kompleksą su ATP ir prijungia DnaB helikazės heksamerą. DnaC baltymas yra AAA + baltymų šeimos narys. DnaB, DnaC ir ATP komplekse helikazės aktyvumas slopinamas. Kompleksas atpažįsta oric srities su DnaA baltymais struktūrą (4.27 pav., c). DnaC sąveikauja su DnaA baltymais. Prijungus DnaB, DnaC baltymai disocijuoja. DnaG praimazė prisijungia ties viengrandine DNR tik tada, kai helikazės pradeda DNR grandinių atskyrimą (atskiria ~ 65 bp). Praimazei susintetinus pradmenį ir disocijavus nuo jo, ŽUK pradeda jungti žiedą. Veiksmingam DNR grandinių atskyrimui (~ bp/s) reikia DNR III polimerazės τ subvieneto. Helikazė iniciacijos oric srityje iš pradžių juda lėtai, o vėliau, prisijungus DNR polimerazei, ima judėti žymiai greičiau ( bp/s). Lėtas helikazės judėjimas oric srityje didina tikimybę, kad oric srityje prisijungs praimazė. Užtikrinti veiksmingą DNR grandinių išskyrimą E. coli replikacinėje šakutėje reikalingi dar keli baltymai: dėl II tipo topoizomerazės DNR girazės veikimo panaikinama torsinė įtemptis replikacinės šakutės priekyje; architektūrinis bakterijos nukleoido baltymas HU, nors ir nėra būtinas, in vitro stimuliuoja replikacijos iniciacijos reakciją pav. DnaA baltymo struktūra ir veikimo mechanizmas. Dna baltymo domeninė organizacija (a); DnaA baltymo erdvinė struktūra (b); hipotetinis DnaA sąveikos su oric sritimi ir sąveikos su helikaze DnaB modelis (Annual Review of Biochemistry, v. 82, p. 25, 2013) 187

188 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Replikacijos iniciacijos valdymas bakterijose užtikrinamas įvairiais būdais. Valdymo taikiniai yra DnaA baltymas ir oric sritis. Tarpsnis, per kurį nevyksta nauja replikacijos iniciacija, vadinamas eklipse (angl. eclipse). Sritis oric turi 11 kopijų GATC sekų. Sekos išsidėsčiusios DUE ir DnaA dėžutėse (4.26 pav., a). Jose adenino heterociklinės bazės N6 azoto atomas yra metilintas. Adeniną DNR sudėtyje metilina Dam metilazė. Prieš replikaciją šiose srityse adenino heterociklinės bazės abiejose DNR grandinėse yra metilintos. Tuoj pat po replikacijos senoji motininė grandinė būna metilinta, o nauja nemetilinta; taigi, DNR yra hemimetilinta. Kol oric srityje DNR yra hemimetilinta, replikacijos iniciacija nevyksta. Įdomu tai, kad oric srityje adenino bazės lieka nemetilintos pakankamai ilgą laiką (hemimetilintos būsenos pusperiodis sudaro 8 10 min), nors kitur chromosomoje analogiškos GATC sekos po replikacijos metilinamos daug greičiau (hemimetilintos būsenos pusperiodis sudaro 1 2 s). Panašiai, t. y. vėluojant, metilinamos E. coli GATC sekos, esančios ir dnaa geno promotoriuje. Kol ši seka promotoriaus DNR yra hemimetilinta, dnaa geno transkripcija ties šiuo promotoriumi slopinama. Tai savo ruožtu lemia DnaA baltymo kiekio sumažėjimą ląstelėje. Kaip užtikrinamas vėlesnis tam tikrų DNR sričių metilinimas? Nustatyta, kad E. coli chromosomoje esant seqa geno mutacijai, oric ir dnaa promotoriaus sričių metilinimas nevėluoja. Priešingai iniciacija vyksta itin dažnai. SeqA baltymų dimeras jungiasi prie GATC sekų; jo sąveika su hemimetilinta DNR yra stipresnė negu su visiškai metilinta DNR. SeqA pasižymi didesniu giminingumu hemimetilintai DNR nei Dam metilazė. Manoma, kad SeqA oligomeras paslepia hemimetilintą replikacijos iniciacijos srities DNR ir neleidžia Dam metilazei per anksti metilinti šių sričių. Bakterijos membrana taip pat dalyvauja valdant oric ir dnaa sričių metilinimą. Tik hemimetilintos GATC sritys gali prisijungti prie bakterijos membranos in vitro; visiškai metilintos negali. Replikacijos iniciacija gali būti valdoma keičiant DnaA baltymo aktyvumą ir kiekį ląstelėje. Tik ATP ir DnaA kompleksas, prisijungęs ties oric sekomis, sukelia DUE srities išskyrimą; ADP ir DnaA kompleksas oric atžvilgiu yra neaktyvus. Esant DnaA mutacijų, kurios daro įtaką ATP jungimui ir hidrolizei, DnaA baltymas ląstelėse tampa nuolat aktyvus (angl. constitutively active). Tokiose ląstelėse padidėja iniciacijos ties oric sritimi dažnis. Taigi, ATP ir DnaA komplekso išaktyvinimas in vivo yra būtinas replikacijos iniciacijos valdymui. Susimontavus replisomoms, slystantysis β žiedas sudaro laikiną RIDA (angl. regulatory inactivation of DnaA) kompleksą su ATP ir DnaA bei Hda baltymu (angl. homologous to DnaA). RIDA stimuliuoja ATP hidrolizę. ADP disocijuoti iš komplekso skatina rūgštiniai fosfolipidai (kardiolipinas), kurių yra bakterijos membranoje. Ląstelėje yra valdomas ir laisvų DnaA baltymų kiekis. E. coli chromosomoje yra ~ 300 sričių, turinčių tipiškų sekų DnaA dėžučių, prie kurių gali jungtis DnaA baltymas. DnaA nevienodai giminingas šioms sritims. Vyksta konkurencija dėl DnaA tarp oric ir už jos ribų esančių dėžučių. Įdomu, kad didžiausiu giminingumu DnaA pasižymi net ne oric esančios dėžutės, bet netoli esanti data sritis. Čia prisijungia žymiai daugiau DnaA baltymų (~ 380 molekulių) negu prie oric. Manoma, kad vykstant data srities replikacijai (greitai po replikacijos iniciacijos) čia prisijungia DnaA baltymai. Tokiu būdu didžioji dalis DnaA baltymų prijungiama prie data srities dar replikacijos pradžioje ir jų nepakanka reiniciacijai ties oric sritimi. Pašalinus data sritį, ties oric reiniciacija padažnėja. Priešingu atveju, esant daugiau nei vienai data kopijai, iniciacija slopinama. 188

189 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) DNR grandinės elongacija Vykstant replikacijai, pirmaujančioji DNR grandinė sintetinama ištisai, o vėluojančioji Okazaki fragmentais. Okazaki fragmentų sujungimui reikia papildomų baltymų. Iškiriami trys Okazaki fragmentų brendimo etapai: z RNR pradmens pašalinimas; z plyšio tarp Okazaki fragmentų užpildymas deoksiribonukleotidais; z Okazaki fragmentų sujungimas DNR ligazės E. coli 1 2 etapus vykdo DNR I polimerazė, kuri, kaip jau aptarėme, pasižymi 5 3 egzonukleaziniu aktyvumu. Dėl šio aktyvumo pašalinamas priekyje eantis RNR pradmuo, o vietoje jo sintetinama DNR. Bakterijose, turinčiose išveiklintą DNR I polimerazės geną (pola), Okazaki fragmentų brendimas vyksta komplikuotai, bet bakterijos yra gyvybingos. H ribonukleazė taip pat gali pašalinti didžiąją dalį RNR pradmens, tačiau ji palieka ribonukleotidą ties DNRpradmens riba. Tiesą sakant, šiuo metu nelabai sutariama, kuris šių fermentų dalyvauja Okazaki fragmentų brendime in vivo. Pašalinus RNR pradmenis Okazaki fragmentuose, lieka plyšys, kuriame vietoje pašalinto RNR pradmens yra naujai sintetinto DNR fragmento 3 OH grupė ir DNR Pol III sintetintos DNR 5 fosfatinė grupė (4.28 pav.). Plyšius sujungia fermentai DNR ligazės. Okazaki fragmentų brendime prokariotuose ir eukariotuose DNR ligazės atlieka tokias funkcijas: z katalizuoja fosfoesterinio ryšio susidarymą tarp oligo- arba polinukleotido fosfato 5 gale ir kito oligo- arba polinukleotido 3 OH grupės (4.28 pav.); z sujungia viengrandinės DNR plyšius dvigrandinėje DNR, taip pat DNR-RNR hibride; z E. coli ir T4 bakteriofago DNR ligazės sujungia ir du DNR dupleksus, ir dvi RNR molekules. Šios reakcijos yra dažnai naudojamos in vitro eksperimentuose. E. coli ląstelėje yra ~ 300 DNR ligazės molekulių. DNR ligazės katalizuojamą reakciją galima suskirstyti į tris etapus: z DNR ligazės lizino ε aminogrupė prijungia AMP iš savo kofaktoriaus NAD + molekulės (4.28 pav.). Atsipalaiduoja nikotinamido mononukleotidas (NMN) ir susidaro tarpinis DNR ligazės ir AMP kompleksas adenililligazės kompleksas (E. coli DNR ligazė prijungia AMP iš NAD +, o eukariotų ir bakteriofagų DNR ligazės AMP prijungia iš ATP); z adenililgrupė nuo fermento yra pernešama ant DNR 5 fosfato (jis yra aktyvinamas) ties DNR plyšio vieta; z aktyvintą fosfatą atakuoja plyšio vietoje esanti 3 OH grupė, susidaro fosfoesterinis ryšys, tada disocijuoja fermentas ir AMP. 189

190 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.28 pav. DNR ligazės katalizuojamos reakcijos schema Replikacijos terminacija bakterijose E. coli DNR replikacija prasideda vienoje chromosomos srityje oric ir tęsiasi abiem kryptimis nuo šios srities. Dvi replisomos juda priešingomis kryptimis, kol susitinka terminacijos srityje, esančioje beveik priešingoje chromosomos pusėje (4.29 pav., b). Šioje srityje DNR replikacija stabdoma. Stabdymo procese dalyvauja du pagrindiniai ląstelės komponentai: z 10 terminacijos sričių (Ter A J) bakterijos chromosomoje. Ter A J turi ~ 23 nukleotidų gana konservatyvią seką (4.29 pav., a, c). Sritys gana plačiai pasklidusios E. coli genome. Pvz., B. subtilis bakterijose terminacijos sritys išsidėsčiusios daug kompaktiškiau, o jų konservatyvioji seka skiriasi nuo E. coli; z Tus baltymas (36 kda), kuris atrankiai jungiasi prie konservatyviųjų sekų Ter srityse. Prie DNR jungiasi baltymo monomeras (4.29 pav., b). Baltymo sąveika su Ter sritimis labai stipri. Kokiu būdu Tus baltymas, prisijungęs prie DNR iš vienos pusės, stabdo replisomos judėjimą? Sutariama, kad yra stabdoma replisomos priekyje esanti replikatyvinė helikazė, tačiau kaip? Siūlomi du veikimo modeliai. Pagal pirmąjį modelį, Ter srities išskyrimas nėra būtinas stabdyti replikatyvinę helikazę iš nepralaidžiosios pusės. Tus-Ter komplekso struktūra iš šios pusės tiesiog fiziškai stabdo helikazę (2.30 pav.). 190

191 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Antrasis modelis remiasi Ter srities ir Tus baltymo komplekso su replikacine šakute (imituota situacija, kurią sukuria helikazė, priartėjusi prie Ter srities) erdvinės struktūros tyrimais. Tokiame komplekse konservatyvios G ir C nukleotidų poros 6-oje padėtyje C heterociklinė bazė išsukta ir sąveikauja su Tus baltymu jo vadinamojoje citozino kišenėje (2.30 pav.). Toks kompleksas su išsukta DNR heterocikline baze galėtų veikti kaip užraktas, stabdantis replikatyvinės helikazės judėjimą iš vienos Tus-Ter komplekso pusės. Iš kitos komplekso pusės panaši struktūra nesusidaro ir helikazės judėjimas nestabdomas Bakterijų DNR replikacija ir ląstelių augimas bei dalijimasis Bakterijose replikacijos iniciacijos dažnis valdomas atsižvelgiant į ląstelės augimo greitį. DNR replikacijos ciklo pabaigoje vyksta ląstelės dalijimasis: dvi dukterinės chromosomos segreguoja į pasidalijusias ląsteles (4.31 pav., b) pav. Replikacijos terminacija (baigtis) E. coli. Ter A J sritys E. coli chromosomoje (a); Tus ir DNR Ter srities komplekso erdvinė struktūra (b) (PDB, kodas 1ECR); Ter A J sričių konservatyviosios sekos. Vienodi nukleotidai pažymėti brūkšneliais (c) (Cell, v. 125, p. 1309, 2006) 191

192 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Bakterinės ląstelės augimo greitis išreiškiamas dalijimosi laiku. Kuo trumpesnis dalijimosi laikas, tuo greičiau ląstelės auga. Bakterijos gali pasidalyti ir per 20 minučių, jeigu augimo sąlygos yra palankios, ir gali užtrukti iki keliadešimties valandų (pvz., žmogaus skrandyje). Jeigu substratai DNR sintezei nėra riboti, E. coli replikacijos greitis ląstelėje daugiau ar mažiau pastovus. Genomo replikacija trunka ~ 40 min (kai replikacijos greitis yra nukleotidų/min). Replikacijos iniciacijos dažnis valdomas pasitelkiant vieną ori sritį. Po chromosomos replikacijos 4.30 pav. Hipotetiniai E. coli DnaB helikazės stabdymo modeliai dalyvaujant Tus-Ter DNR kompleksui. Rodyklė žymi replisomos judėjimo kryptį (PNAS, v. 105, p , 2008) 4.31 pav. Bakterijų replikacija ir dalijimasis. Replikacijos ir dalijimosi ciklo trukmė (a); replikacijos iniciacijos, nepasibaigus ankstesniam replikacijos ciklui, schema (b) (J. E. Krebs, E. S. Goldstein, S. T. Kilpatrick. Lewin s Genes XI, 2014) 192

193 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) pabaigos turi praeiti dar 20 minučių, kol ląstelė pasidalija (reikia laiko, kad susidarytų dalijimosi aparatas) (4.25 pav., a). Jeigu ląstelės dalijimosi laikas trumpesnis nei 60 min (40 min replikacija + 20 min dalijimosi aparato susiformavimas), tai reiškia, kad naujas replikacijos ciklas ląstelėje turi prasidėti dar nepasibaigus ankstesniajam replikacijos ciklui. Tokiu atveju į pasidalijusias ląsteles pakliūva chromosomos, kuriose jau yra susiformavusios naujos replikacinės šakutės (4.25 pav., b) Replikonai Bakteriofagai ir virusai reprodukcinio ciklo metu sintetina daug DNR kopijų, o ląstelėse, kurios dalijasi į dvi dukterines ląsteles, DNR sintezė ir genetinės medžiagos paskirstymas turi būti tiksliai valdomi, nepriklausomai nuo to, ar ląstelė turi tik vieną chromosomą (bakterijose) ar DNR organizuota į daug chromosomų (eukariotuose). Pagrindiniai šio valdymo principai yra tokie: z genominė DNR turi būti kopijuojama vieną kartą per ląstelės ciklą; z DNR replikacija turi būti koordinuojama atsižvelgiant į ląstelių dalijimąsi; z ląstelių dalijimasis turi būti koordinuojamas atsižvelgiant į ląstelių augimą; z DNR kopijos turi būti tiksliai paskirstomos palikuonims. DNR replikaciją valdo replikonai (angl. replicon). Replikonas yra DNR vienetas, kuris turi replikaciją užtikrinančius valdymo elementus ir gali save replikuoti. Replikono modelį 1963 m. pasiūlė Fransua Žakobas (Francois Jakob), Sidnis Breneris (Sydney Brenner) ir Žakas Kjuzinas (Jacques Cuzin). Pagal šį modelį, replikacijos iniciaciją valdo du komponentai: replikatorius ir iniciatorius. Replikatorių sudaro DNR cis sekos, kurių pakanka replikacijos iniciacijai užtikrinti. Ori sekos, kuriose prasideda replikacija, taip pat yra replikatoriaus dalis. Replikonas yra DNR (arba RNR) molekulė, kuri turi replikaciją užtikrinančius valdymo elementus ir gali save replikuoti. Kitas komponentas iniciatorius yra trans veikiantis iniciacijos baltymas. Baltymas atpažįsta DNR savitas sekas replikatoriuje ir aktyvina replikacijos iniciaciją. Iniciacijos baltymų turi virusai, prokariotai ir eukariotai. Jie nėra homologiški, tačiau jų funkcijos panašios. Kiekvienas replikonas pradedamas ir baigiamas replikuoti tik vieną kartą per ląstelės ciklą. Bakterijos replikacijos iniciacija vyksta, kaip jau aptarėme, vienintelėje bakterijos chromosomos vietoje, tuomet dvi replikacinės šakutės juda priešingomis kryptimis, kol prieina terminacijos sritį. Tada bakterinės ląstelės pasidalija susidarius sąsmaukai (angl. septum). Bakterijų chromosomos turi vieną replikoną. Tai dažniausiai žiedinės DNR, bet pasitaiko ir linijinių bakterijų chromosomų (pvz., Borrelia ir Streptomyces gentyse). Bakterijos dažnai turi plazmidžių autonomiškų įvairaus dydžio žiedinių ar linijinių DNR. Plazmidės taip pat turi atskirus replikonus. Plazmidžių replikacijos valdymas gali priklausyti nuo bakterijos chromosomos replikacijos. Tuomet sintetinama viena plazmidės kopija, kaip ir bakterijos chromosomos. Tokios plazmidės yra mažakopijinės (angl. low copy). 193

194 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Tam tikrų plazmidžių ląstelėje gali būti sintetinamas įvairus kopijų skaičius. Tokios plazmidės yra vadinamos daugiakopijinėmis (angl. multicopy). Virusų ir bakteriofagų DNR taip pat turi vieną replikoną, kuriame per infekcinį ciklą daug kartų vyksta replikacija. Eukariotų ląstelėse chromosomų linijinių DNR replikacija vyksta per ląstelės ciklo S fazę. Yra daug genomo sričių, replikonų, kur prasideda replikacija (4.32 pav., a; 4.5 lentelė). Replikacija vyksta telkiniuose replikacijos fabrikuose (angl. replication factories) (4.32 pav., b). Evoliucijoje tai, kad eukariotai didelių genomų replikacijai panaudojo daugiau replikonų, galėjo užtikrinti jų genomų didėjimą neilginant DNR sintezės (S fazės) trukmės. Pvz., nors daugelio archėjų DNR, kaip ir bakterijų, turi po vieną replikoną, kai kurios archėjos turi po keletą replikonų (pvz., Sulfolobus acidocaldarius 3). ~ 330 replikonų yra mielių genome ir daugiau nei daugialąsčių organizmų genomuose. Valdyti visų replikonų replikaciją per ląstelės ciklo S fazę yra sudėtingas uždavinys. Replikacijos iniciacija visuose replikonuose vyksta skirtingu metu, tačiau visas genomas yra baigiamas replikuoti per S fazę. 4.5 lentelė. DNR replikacija prokariotuose ir eukariotuose Organizmai Replikonų skaičius Replikonų ilgis (kb) Replikacinės šakutės judėjimo greitis (bp/min) E. coli S. cerevisiae D. melanogaster X. laevis M. musculus Vidutinis eukariotinis organizmas ~ ~ pav. Eukariotų replikonai. Eukarotų replikacijos nuo ori sričių schema (a); žaliai fluorescuoja replikacijos fabrikai ląstelės branduolyje, vaizdinti bromodeoksiuridinu (BrdU), kuris įjungiamas į DNR replikacijos metu. Kita DNR vaizdinta DAPI (b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 194

195 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Eukariotų replikacijos iniciacija (angl. origin fire) ori srityse vyksta tikslia tvarka: pirmiausiai replikuojamos vienos genomo sritys, vėliau kitos, ir t. t. Įžvelgta tam tikrų dėsningumų tarp replikonų aktyvinimo ir chromatino struktūros. Pvz., heterochromatinas replikuojamas per S fazę labai vėlai, o aktyviai transkribuojamų genų sritys euchromatine anksti. Tiriant žinduolių patelių X chromosomas pastebėta, kad nors chromosomos vienodos, transkripciškai neaktyvi chromosoma yra kondensuota heterochromatine ir replikuojama S fazės pabaigoje, o kita chromosoma yra mažiau kondensuota ir replikuojama per visą S fazę. Eukariotų ląstelėse taip pat yra žiedinių nechromosominių DNR (mitochondrijų, chloroplastų DNR, kitų DNR). Jos taip pat turi replikonų DNR replikacija eukariotuose Eukariotinėje ląstelėje genetinės medžiagos dvigubėjimas vyksta per kiekvieno ląstelės ciklo S fazę vienintelį kartą. Replikacija koordinuojama su kitais ląstelės ciklo etapais mitoze ir citokineze, taip pat su replikacija kitose ją supančiose ląstelėse. Palyginti su prokariotais, eukariotų DNR replikacijos greitis yra nedidelis (~ 75 nt/s). Nedidelį greitį nulemia tai, kad eukariotų DNR yra supakuota į chromatiną. Pirmieji svarbūs eksperimentiniai duomenys apie eukariotų replikaciją buvo gauti naudojant modelinę replikacijos sistemą in vitro. Sistemą sudarė plazmidės DNR, turinti žinduolių (beždžionių) papovaviruso SV40 (Simian virus 40) replikacijos pradžios sritį (SV40 ori) ir žinduolių ląstelių ekstrakto, kuriame buvo visi plazmidės DNR replikacijai reikalingi komponentai. SV40 viruso žiedinės DNR replikacijai pasitelkiamas ląstelės šeimininkės replikacijos aparatas ir vienintelis viruso DNR koduojamas baltymas T antigenas, Tag (angl. T antigen) (4.33 pav., a). T antigenas atlieka replikacijos iniciacijos veiksnio (iniciatoriaus) ir DNR helikazės funkcijas pav. SV40 viruso ir ląstelės šeimininkės replisomos (PLOS Pathogens, v. 8, 2012) 195

196 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA SV40 viruso T antigenas yra dvigubas heksameras, kuris, esant ATP, prisijungia ties viruso DNR replikacijos pradžios ori sritimi. T antigeno prisijungimas sukelia struktūrinių pokyčių ori srityje. Toliau prie T antigeno jungiasi viengrandinei DNR savitas ląstelės baltymas RPA. SV40 viruso T antigenas pasižymi 3 5 helikaziniu aktyvumu ir išskiria viruso ori srities DNR grandines. T antigeno helikazinį aktyvumą stimuliuoja prie DNR prisijungęs RPA baltymas. Prie RPA baltymo prisijungia ląstelės DNR α polimerazė-praimazė, kuri sintetina pradmenį. RFC baltymas prijungia DNR polimerazės procesyvumo PCNA veiksnį. Prasideda viruso DNR replikacija. Šie procesai ir juose dalyvaujantys ląstelės komponentai toliau aptariami išsamiau Eukariotų replikacinės šakutės komponentai ir jų funkcijos SV40 viruso DNR replikacijos tyrimais, taip pat mielių genetiniais tyrimais nustatyta daugelis eukariotų replikacijoje dalyvaujančių baltymų (4.6 lentelė). 4.6 lentelė. Eukariotų DNR replikacinės šakutės komponentai ir jų funkcijos Baltymas α polimerazė-praimazė RPA RFC PCNA δ / ε polimerazė FEN1 Dna2 DNR I ligazė I topoizomerazė IIα topoizomerazė arba IIβ topoizomerazė T antigenas MCM baltymų kompleksas Funkcijos Pradeda pirmaujančiosios ir vėluojančiosios grandinių sintezę; sintetina DNR-RNR pradmenį (~ 7 14 ribonukleotidų 5 gale ir ~ 20 deoksiribonukleotidų 3 gale) Prisijungia prie viengrandinės DNR (E. coli SSB baltymo analogas); stimuliuoja DNR α, δ polimerazes; skatina DNR helikazės prisijungimą Nuo DNR priklausoma ATPazė (E. coli, γ-τ žiedo užkėlimo komplekso analogas); prisijungia prie matricos-pradmens komplekso; stimuliuoja DNR polimerazę; prijungia PCNA; reikalinga polimerazių perjungimui: suardo kontaktus tarp RPA ir DNR Pol α-praimazės DNR polimerazių procesyvumo veiksnys; stimuliuoja DNR polimerazes ir RFC ATPazę (slystantysis žiedas) DNR polimerazė; 3 5 egzonukleazė; sintetina pirmaujančiąją ir vėluojančiąją grandines 5 3 endonukleazė; pašalina išstumtą DNR-RNR pradmenį (1 2 nt) Nukleazė / helikazė; pašalina išstumtą DNR-RNR pradmenį Sujungia Okazaki fragmentus Panaikina torsinę įtemptį replikacinės šakutės priekyje Išskiria DNR žiedus (katenanus) Replikatyvinė DNR helikazė (3 5 ); dalyvauja susimontuojant praimosomai; dalyvauja atpažįstant SV40 ori sritį Replikatyvinė DNR helikazė DNR α polimerazė-praimazė Eukariotų ir archėjų praimazės yra heterodimerinės struktūros baltymai, sudaryti iš didžiojo subvieneto (PriL) ir mažojo subvieneto (PriS). Eukariotų praimazė yra komplekse su DNR α po- 196

197 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.34 pav. Eukariotų DNR α polimerazės-praimazės struktūra ir veikimas. Komplekso struktūra, išaiškinta remiantis krioelektroninės mikroskopijos duomenimis (a); komplekso struktūrinė schema. Subvienetai pažymėti (b); komplekso judėjimo modelis (c) (Nucleic Acids Research, v. 39, p. 8187, 2011) limeraze ir B subvienetu. Krioelektronine mikroskopija nustatyta, kad baltymų kompleksas nesimetrinis, primena svarmenį (4.34 pav., a, b). Komplekso praimazė sintetina RNR pradmenį (~ 7 14 nt), tada DNR α polimerazė sintetina nedidelį ~ 20 nukleotidų DNR fragmentą iniciatorinę DNR. Praimazei būdingas labai mažas procesyvumas ir mažas tikslumas. DNR-RNR pradmenys sintetinami vieną kartą pirmaujančiojoje grandinėje ir daug kartų vėluojančiojoje grandinėje. Pradmenų sintezė vėluojančiojoje grandinėje labai dažna, jie sintetinami maždaug kas 50 nukleotidų. Tyrimais nustatyta, kad DNR polimerazės α praimazės dalys, kuriose yra aktyvieji centrai, yra judrios (4.34 pav., c). Manoma, kad tai padidina pradmens perjungimo iš praimazės į DNR α polimerazės aktyvųjį centrą veiksmingumą. Įvykus DNR polimerazių perjungimui, mišrus DNR-RNR pradmuo toliau ilginamas replikatyvinių DNR polimerazių DNR Pol ε ir Pol δ, sintetinančių pirmaujančiąją ir vėluojančiąją DNR grandines (4.33 pav., b). DNR polimerazes perjungia eukariotų žiedo užkėlimo kompleksas RFC. Nuo A ciklino priklausomos kinazės (CDK) fosforilina abu DNR Pol α-praimazės subvienetus ląstelės ciklo S fazės metu. Vėliau polimerazė yra defosforilinama, o G1 fazės metu vėl fosforilinama. DNR α polimerazė yra svarbus replikacijos proceso dalyvis, todėl yra daugelio DNR replikacijos ir ląstelės ciklo kontrolės taškų (angl. cell cycle checkpoints) reguliatorių taikinys A replikacijos baltymas (RPA) A replikacijos baltymas (RPA, angl. replication protein A) yra prie viengrandinės DNR prisijungiantis heterotrimerinės struktūros baltymas (4.35 pav., a, b). Replikacijos procese jis veikia analogiškai bakterijų SSB baltymams. RPA baltymai stabilizuoja viengrandinę DNR neleisdami susidaryti antrinėms struktūroms, kurios stabdytų replikacinių šakučių judėjimą, taip 197

198 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.35 pav. Eukariotų (S. cerevisiae) PCNA slystančiojo žiedo ir RFC žiedo užkėlimo komplekso struktūra. PCNA homotrimero erdvinė struktūra. I III baltymo domenai (a); PCNA ir RFC komplekso erdvinė struktūra. RFC1 RFC5 komplekso subvienetai (b); PCNA-RFC-DNR komplekso erdvinė struktūra (c); PCNA-RFC-DNR komplekso struktūros schema (d) (Trends in Microbiology, v. 15, p. 156, 2007) pat apsaugo nuo nukleazių poveikio. Didžiausias RPA subvienetas, RPA70, prisijungia prie viengrandinės DNR, tačiau funkcionaliam baltymui reikia visų trijų subvienetų. RPA taip pat reikalingas DNR grandinių išskyrimui SV40 DNR ori srityje, kurį atlieka viruso baltymas T antigenas. RPA baltymas eukariotuose sąveikauja su DNR α polimeraze-praimaze ir stimuliuoja DNR polimerazinį aktyvumą; taip pat sąveikauja su kitais baltymais. RPA yra fosforilinamas prasidedant S fazei ir atsiradus DNR pažaidoms PCNA slystantysis žiedas PCNA baltymas (angl. proliferating cell nuclear antigen) yra vienas svarbiausių eukariotų DNR metabolizmo baltymų. Baltymo gausu piktybinių navikų ląstelėse, todėl jis naudojamas kaip vienas ląstelinių žymenų nustatant vėžines ląsteles. PCNA aminorūgščių seka labai konservatyvi visuose organizmuose nuo vienaląsčių eukariotų iki žmogaus. Baltymo homologai 198

199 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) atrasti eukariotų virusuose bei archėjose. PCNA dalyvauja ne tik DNR replikacijos, bet ir rekombinacijos, reparacijos, kituose ląstelės procesuose. PCNA yra homotrimeras, sudarytas iš trijų vienodų (žmogaus ląstelėse 36 kda) monomerų, susijungusių į žiedą su ertme viduryje (4.35 pav., a). Eukariotų DNR replikacijos metu PCNA funkcionuoja kaip DNR polimerazių procesyvumo veiksnys. PCNA žiedą ant DNR duplekso užkelia RFC baltymų kompleksas (4.35 pav., b d). Toliau prie PCNA ir matricos-pradmens komplekso prisijungia DNR δ polimerazė. Nustatyta, kad PCNA panašiai stimuliuoja ir DNR ε polimerazę, tačiau tik tam tikromis aplinkybėmis. Panašiai kaip ir bakterijose, dėl jungimosi srities su PCNA konkuruoja RFC žiedo užkėlimo kompleksas ir DNR polimerazės. Daugelis ląstelės baltymų, dalyvaujančių DNR reparacijos ir ląstelės ciklo valdymo procesuose, sąveikauja su PCNA. Manoma, kad archėjų replikacijos aparatas yra panašus į eukariotų. Archėjos turi PCNA žiedą, žiedo užkėlimo kompleksą, B šeimos DNR polimerazę C replikacijos veiksnys (RFC) žiedo užkėlimo kompleksas RFC yra nuo DNR priklausoma ATPazė, kuri užkelia trimerinį PCNA baltymo žiedą ant matricos-pradmens duplekso ir taip užtikrina replikatyvinių DNR polimerazių (δ ir ε) procesyvumą. RFC (angl. replication factor C) baltymas yra vienas svarbiausių veiksnių prijungiant eukariotų DNR polimerazes ties matrica-pradmeniu. RFC buvo nustatytas tiriant SV40 viruso DNR replikacijos mechanizmą (4.33 pav., a, b). Žmogaus RFC baltymas sudarytas iš penkių subvienetų RFC1 5 (4.35 pav., b). RFC komplekso struktūra panaši į E. coli γ-τ komplekso struktūrą. RFC subvienetai homologiški E. coli γ ir δ baltymams. RFC užkelia PCNA žiedą ant matricos-pradmens komplekso (4.35 pav., c, d); jungia žiedą ir DNR viengrandinių trūkių vietose; gali nukelti žiedą nuo DNR, kaip ir jo analogai prokariotuose. Eukariuotuose yra įvairios sudėties RFC kompleksų, kuriuose tam tikri RFC subvienetai pakeisti kitais į juos panašiais subvienetais. Manoma, kad tokie alternatyvios struktūros ŽUK atlieka tam tikras specializuotas funkcijas, pvz., ląstelės ciklo DNR pažaidų kontrolės taške, sąveikaujant seserinėms chromatidėms ir t. t DNR δ ir ε polimerazės Eukariotuose replikacijos metu pagrindiniai DNR grandines sintetinantys fermentai yra DNR δ polimerazė ir ε polimerazė (4.33 pav., b). Abi polimerazės gyvybiškai svarbios ląstelėms. Nors DNR δ polimerazė buvo atrasta dar 1976 m., praėjo nemažai laiko, kol buvo nustatyta, kad būtent ji dalyvauja DNR replikacijoje. DNR δ polimerazė (Pol δ) sintetina vėluojančiąją grandinę, o DNR ε polimerazė (Pol ε) pirmaujančiąją (4.33 pav., b). Eukariotų replikatyvinės DNR polimerazės yra DNR δ polimerazė ir ε polimerazė. 199

200 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR δ polimerazės sudėtis eukariotuose yra gana heterogeniška: žmogaus Pol δ sudaryta iš keturių subvienetų, S. pombe mielių DNR polimerazė iš penkių, S. serevisiae mielių iš trijų. Didžiausiame δ polimerazės subvienete (A subvienete) yra DNR polimerazinis ir 3 5 egzonukleazinis aktyvumai. Subvieneto N galas sąveikauja su PCNA baltymu. Su PCNA sąveikauja ir kiti DNR Pol δ subvienetai. Kartu su PCNA žiedu ir RFC žiedo užkėlimo kompleksu DNR Pol δ sudaro DNR polimerazės holofermentą. DNR δ ir ε polimerazės dalyvauja ir reparacijoje Kitos eukariotų DNR polimerazės Eukariotuose atrasta ~ 15 DNR polimerazių (4.7 lentelė), tačiau ne visų jų funkcijos nustatytos. DNR β polimerazė (Pol β). Pol β yra nedidelis, dažniausiai vieno polipeptido fermentas, patogus tirti. Tai pirmoji DNR polimerazė, kuri buvo ištirta rentgenostruktūrinės analizės metodu ir išsamiai aprašyta. Pol β sudaro du domenai, kurių kiekvienas pasižymi biocheminiu aktyvumu. N galinis domenas (8 kda) pasižymi deoksiribozės fosfato liazės (drp liazės) aktyvumu. Šis aktyvumas sąlygoja deoksiribozės fosfato pašalinimą nuo DNR β eliminacijos mechanizmu, kai prie ribozės nėra prijungtos heterociklinės bazės (vadinamieji bazių netekę nukleotidai). Tas pats N galinis domenas taip pat labai atrankiai prisijungia ties 5 nukleotidų viengrandinės DNR plyšiais dvigrandinėje DNR, jeigu plyšio gale yra 5 fosfatinė grupė. C galinis domenas (31 kda) pasižymi DNR polimeraziniu aktyvumu. Pol β vykdoma sintezė ties matricos-pradmens kompleksu yra distributyvi, fermentas prijungia vieną nukleotidą ir disocijuoja. Pol β neturi klaidas taisančio aktyvumo, tačiau ties viengrandinės DNR plyšiais sintetina procesyviai ir tiksliai. Todėl Pol β savybės tinkamos užpildyti viengrandinės DNR plyšius bazių išpjovimo reparacijos, BER (angl. base excision repair), proceso metu. Taip pat yra eksperimentinių įrodymų, kad ši polimerazė dalyvauja nukleotidų išpjovimo reparacijoje, NER (angl. nucleotide excision repair), ir rekombinacijoje mejozės metu. DNR γ polimerazė (Pol γ). Pol γ dalyvauja mitochondrijų DNR replikacijoje. Žinduolių Pol γ sudaro du subvienetai didysis ( kda) ir mažasis (35 55 kda), koduojami branduolio genų. Didysis subvienetas pasižymi polimeraziniu, 3 5 egzonukleaziniu, 5 deoksiribozės fosfato liaziniu aktyvumais. Pol γ procesyvumui reikia RPA baltymo. Pol γ yra tiksli polimerazė, kurios klaidų dažnis, nustatytas in vitro, yra Eksperimentai su transgeninėmis pelėmis liudija, kad 3 5 egzonukleazinis aktyvumas lemia šios polimerazės tikslumą ir in vivo: egzonukleazės mutacija sąlygoja taškines mitochondrijų mutacijas ir sukelia gyvūnų kardiomiopatiją. Pol γ yra vienintelė mitochondrijose esanti DNR polimerazė, todėl jidalyvauja ir mitochondrijų genomo pažaidų bazių išpjovimo reparacijoje. TLS polimerazės. Be DNR α, β, δ, ε, γ polimerazių, kurias galima laikyti klasikinėmis polimerazėmis, eukariotų ląstelėse yra daug kitų DNR polimerazių. Jų aktyvumui pasireikšti reikia tam tikrų sąlygų, todėl ilgą laiką jos nebuvo aptiktos ląstelėse tradiciniais biocheminiais metodais. Replikatyvinės DNR polimerazės sustoja, jeigu prieina pažaidą DNR matricoje. Jos yra jautrios dėl pažaidos pasikeitusiai DNR geometrijai ir disocijuoja, pa- TLS DNR polimerazės pasižymi gebėjimu sintetinti DNR ties pažaidomis matricinėje DNR grandinėje. 200

201 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) likdamos laisvą ilginamos grandinės 3 OH galą. Kaip ir bakterijose, eukariotuose yra TLS DNR polimerazių, kurios ties DNR pažaidomis pakeičia replikatyvines DNR polimerazes. Polimerazių sintezė taip pat indukuojama DNR pažaidų, t. y. SOS atsako metu. TLS fenomenas eukariotuose itin paplitęs. Eukariotų TLS DNR polimerazės (kurių pirmosios atrastos 1999 m.) pasižymi skirtingu atrankumu substratui ir kitomis savybėmis. Pasitelkiant įvairias polimerazes, DNR replikacija vyksta net ir esant įvairių tipų pažaidų matricinėje grandinėje. Šiuo metu žinomos ir apibūdintos šios Y šeimos TLS DNR polimerazės (4.7 lentelė): z DNR η (eta) polimerazė (Pol η); z DNR κ (kapa) polimerazė (Pol κ); z DNR ι (jota) polimerazė (Pol ι); z DNR Rev1 polimerazė (Pol Rev1). DNR h polimerazė unikali tarp eukariotinių DNR polimerazių, nes sintetina DNR ties savitomis matricos pažaidomis cis-sin timino (T-T) dimerais. Sintezė veiksminga ir tiksli (žmoguje ir mielėse įterpia A-A), lyg matricos DNR būtų visiškai nepažeista, t. y. Pol h veikia kaip tiksli polimerazė (angl. error free). Pol h gali veiksmingai sintetinti ir ties kitos rūšies pažaidomis 7,8 dihidro-8-oksiguaninu. Pol h yra homologiška E. coli UmuC (Dna Pol IV) ir DinB (DNR Pol V) baltymams. DNR h polimerazė svarbi apsisaugant nuo UV spindulių sukeliamo odos vėžio. Žmonės, kurie serga odos liga pigmentine kseroderma (būdingi ligos požymiai yra pigmentuota, sausa oda), tiksliau, viena iš šios ligos atmainų vadinamąja XP-V forma, priklauso itin didelės rizikos susirgti odos vėžiu grupei. XP-V forma sergančių ligonių chromosomoje yra mutavusi Pol h. Sergančiųjų ląstelės yra labai jautrios UV spinduliams, jos negali replikuoti pažeistos DNR. Pigmentinės kserodermos molekulinis mechanizmas siejamas su UV spindulių sukeltų T-T fotodimerų susidarymu, ties kuriais replikatyvinės DNR polimerazės negali vykdyti sintezės. Jei nėra DNR h polimerazės, kuri gali tiksliai vykdyti sintezę ties tokios rūšies pažaidomis, replikacija sutrinka. DNR h polimerazės savybė netiksliai sintetinti DNR panaudojama somatinės hipermutacijos procese genuose, koduojančiuose antikūnus. Manoma, kad būtent DNR h polimerazė vykdo tokių genų DNR replikaciją. Šiuose genuose mutacijų dažnis 10 6 didesnis nei vidutinis kitų genų mutacijos dažnis. Tokiu būdu generuojami didelio savitumo antikūnai. Tačiau nėra aišku, kaip DNR h polimerazė nukreipiama į antikūnus koduojančių genų sritis. DNR i polimerazė ties timino dimerais įterpia ne A, bet G nukleotidus. DNR κ polimerazė vykdo sintezę pereidama heterociklinių bazių netekusias vietas (angl. abasic sites), taip pat DNR aduktus. Dėl polimerazės veikimo susidaro rėmelio poslinkio mutacijos. DNR x (zeta) polimerazė, kitaip nei DNR Pol h, sintetina DNR ties T-T dimerais, darydama daug klaidų. Atlikus Y šeimos DNR polimerazių struktūrinius tyrimus, paaiškėjo svarbūs polimerazių struktūriniai ypatumai, lemiantys ypatingas jų biologines funkcijas. Y šeimos DNR polimerazių katalizinį subvienetą sudaro delno, pirštų ir nykščio domenai, būdingi ir kitų šeimų DNR polimerazėms. Tačiau delno ir pirštų domenai yra neįprastai maži, palyginti su replikatyvinėmis DNR polimerazėmis, o aktyvusis centras toleruoja smarkius nukrypimus nuo Votsono-Kriko 201

202 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.7 lentelė. Eukariotinių DNR polimerazių sudėtis, fermentiniai aktyvumai ir funkcijos Polimerazė Šeima Subvienetai a (M x 10 3 ) Fermentinis aktyvumas Funkcijos α (alfa) B 165 (167) DNR polimerazė Replikacija: iniciacija, Okazaki fragmentų 67 (79 / 86) 58 (58) 48 (48) Praimazė sintezė; Reparacija: viengrandinių trūkių reparacija; Telomerų ilgio reguliacija; Ląstelės ciklo reguliacija β (beta) X 39 (68) DNR Pol, 5 deoksiribozės fosfato liazė* Reparacija: bazių išpjovimo reparacija; viengrandinių trūkių reparacija; Mejozė Mitochondrijų DNR replikacija γ (gama) A 125 (143) 35 DNR Pol, 3 5 egzonukleazė δ (delta) B 125 (125) DNR Pol, Replikacija: vėluojančioji grandinė, replikacija 3 5 egzonukleazė esant DNR pažaidoms; 66 (55) Reparacija: nesuporuotų nukleotidų pašalinimas, 50 (40) bazių išpjovimo reparacija, dvigrandinių trūkių reparacija; (22) Ląstelės ciklo reguliacija ε (epsilon) B 261 (256) DNR Pol, Replikacija: pirmaujanti grandinė; 59 (79) 3 5 egzonukleazė Reparacija: dvigrandinių trūkių reparacija, bazių išpjovimo reparacija, nukleotidų išpjovimo (34) reparacija; (29) Ląstelės ciklo reguliacija x (zeta) B 353 (173) DNR Pol Klaidas paliekančioji (angl. error prone) DNR polimerazė; (29) Somatinė hipermutacija** η (eta) Y 78 (70) DNR Pol (Rad30) Klaidų nepaliekančioji (angl. error free) DNR polimerazė; Somatinė hipermutacija; Seserinių chromatidžių sukibimas θ (teta) A 198 (?) DNR Pol, helikazė (?) Tarpgrandininių sąsiuvų taisymas ι (jota) Y 80 (?) DNR Pol (Rad30B), 5 deoksiribozės Klaidas paliekančioji DNR polimerazė fosfato liazė λ (liambda) X 66 DNR Pol, 5 deoksiribozės Mejozinė reparacija (?) fosfato liazė κ (kapa) Y 99 DNR Pol Klaidų nepaliekančioji ir klaidas paliekančioji (angl. error free ir error prone) DNR polimerazė μ (miu) X 55 DNR Pol, galinė transferazė Somatinė hipermutacija σ (sigma) X 42 / 55 DNR Pol Seserinių chromatidžių sukibimas Rev1 Y - DNR Pol a Pateikiami duomenys apie žinduolių ir skliausteliuose mielių DNR polimerazes. * Deoksiribozės fosfato liazės aktyvumas pašalina deoksiribozės fosfatą iš DNR β eliminacijos mechanizmu; jeigu prie ribozės nėra prijungtos heterociklinės bazės, DNR yra skeliama ties 5 padėtimi. Ši reakcija yra tarpinė bazių išpjovimo reparacijos (BER) procese. ** Somatinė hipermutacija vyksta savituose imunoglobulino genų segmentuose limfinių audinių ląstelėse. 202

203 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) bazių porų geometrijos. Y šeimos polimerazės turi papildomą C galinį domeną, kuriame yra struktūrinis elementas mažasis pirštelis. Jis iš dalies kompensuoja fermento ir DNR matricos sąveikų stygių. TLS savybėmis pasižymi ir DNR x polimerazė, kuri yra priskiriama B šeimai (4.7 lentelė). Neseniai atrastos, bet dar neapibūdintos DNR q (teta), λ (liambda), μ (miu) polimerazės. Manoma, kad jos taip pat pasižymi TLS savybėmis. TLS DNR polimerazės pritraukiamos prie DNR pažaidų matricinėje grandinėje dalyvaujant PCNA žiedui. Esant pažaidų ir sustojus replikatyvinėms DNR polimerazėms, PCNA ubikvitilinamas. Prie ubikvitilinto PCNA veiksmingiau jungiasi TLS DNR h, κ, ι, Rev1 polimerazės. Prisijungusios jos gali pakeisti replikatyvines DNR polimerazes. Savitieji ties DNR pažaidomis replikuojančių DNR polimerazių veikimo mechanizmai, nors nėra iki galo išaiškinti, siejami su DNR replikacijos ir reparacijos procesų koordinavimu ląstelėje. Galima manyti, kad DNR replikacijai ties savitomis pažaidomis yra pasitelkiamos savitos DNR polimerazės, kurios sintetinamos ląstelėje kaip atsakas į DNR pažaidas ir kurios tam procesui yra tinkamiausios Okazaki fragmentų brendimas eukariotuose Eukariotuose vėluojančiosios grandinės sintezė vyksta sintetinant trumpus nukleotidų Okazaki fragmentus, kurie prasideda mišriais pradmenimis. Prieš sujungiant Okazaki fragmentus į ištisą DNR grandinę, nukleazės pašalina pradmenis. Pradmens 5 galą pirmiausiai išstumia Pol δ (kartu su PCNA žiedu), sintetinanti prieš tai esantį Okazaki fragmentą (4.36 pav.). DNR polimerazė, manoma, įsiterpia tarp pradmens ir matricos, tuomet yra išstumiama ilgesnė ar trumpesnė viengrandinė uodega (angl. flap). Išstumtąją DNR atpažįsta ir skelia nukleazės. Mielių ir kitų eukariotų tyrimais nustatyta, kad Okazaki fragmentų brendime dalyvauja bent dvi nukleazės FEN1 (angl. flap endonuclease 1) ir Dna2. FEN1 gali pašalinti pradmens RNR dalį, kai RNR pradmuo yra išstumtas iš DNR-RNR duplekso. FEN1 užsineria ant išstumtos uodegos. Kai FEN1 pašalina pradmenį, DNR polimerazės (pvz., Pol δ) ima sintetinti DNR, kad užpildytų plyšį. DNR ligazės sujungia DNR (4.36 pav.). FEN1 atpažįsta ir skelia tik trumpą (1 2 nt) iš duplekso išstumtą uodegą. Ilgesni išstumti fragmentai slopina FEN1 aktyvumą (tokie greičiausiai susidaro in vivo). Ilgesnius fragmentus skelia Dna2. Dna2 yra daugiafunkcinis fermentas, pasižymintis nuo DNR priklausomu ATPaziniu, 3 5 helikaziniu ir viengrandinei DNR savitu endonukleaziniu aktyvumais. Dna2 sąveikauja su keletu baltymų, dalyvaujančių DNR replikacijoje, pvz., RPA baltymais. Pasiūlytas RNR pradmens pašalinimo, dalyvaujant Dna2 ir FEN1, mechanizmas (4.36 pav.). Okazaki fragmento RNR pradmenį išstumia Pol δ. Jeigu išstumiamas didesnis fragmentas, nei yra tinkamas substratas FEN1 endonukleazei, RPA baltymai greitai padengia išstumtąją uodegą. Prisijungia Dna2 nukleazė ir slopina tolesnį uodegos susidarymą. Dna2, greičiausiai, nuskelia visą RNR-DNR pradmenį, netiksliai susintetintą DNR α polimerazės-praimazės. Nuskėlus pradmenį, RPA ir Dna2 disocijuoja. Plyšį sujungia DNR ligazė. 203

204 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.36 pav. Okazaki fragmentų brendimas eukaruotuose dalyvaujant FEN1 ir Dna2 baltymams (Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, v. 40, p. 115, 2005) Replikatyvinės helikazės eukariotuose Eukariotų organizmuose replikatyvinių helikazių funkcijos priskiriamos MCM (angl. minichromosome maintainance) baltymams. Baltymai nustatyti genetine analize mielėse, kurioms buvo būdingas plazmidžių, turinčių klonuotas centromeros ir replikacijos pradžios ori sritis, netekimas. Iš viso nustatyti šeši skirtingi MCM baltymai (MCM2 7), kurie atrasti ne tik mielėse, bet ir visuose iki šiol tirtuose eukariotuose. MCM baltymus koduojančių genų turi ir archėjos. Tai liudija apie labai seną MCM baltymų kilmę. Kiekvienas MCM2 7 baltymus koduojantis genas yra gyvybiškai svarbus. MCM2 7 baltymai sudaro atskirą AAA+ šeimos baltymų pogrupį. Kiekvienas MCM baltymas C gale turi ATPazės domeną (4.37 pav., a). In vitro MCM2 7 sudaro įvairius kompleksus, dažniausiai heksamerą iš šešių skirtingų baltymų. Funkcionalus MCM2 7 yra žiedo pavidalo, tačiau jei nėra ATP, žiedas gali turėti plyšį (4.37 pav., b). Prisijungus ATP ir aktyvinantiems baltymams, MCM2 7 plyšys užsidaro. Manoma, kad replikacijos metu ties ori sritimi funkcionuoja du MCM2 7 heksamerai (4.37 pav., b d). MCM juda išilgai tos DNR grandinės, kuri naudojama kaip matrica pirmaujančiosios grandinės sintezėje, t. y. 3 5 kryptimi. 204

205 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.37 pav. MCM2 7 baltymų erdvinė struktūra. Sulfolobus sulfolactarius MCM2 7 komplekso erdvinė struktūra. AAA+ ir N galinis domenai pažymėti (a); Drosophila melanogaster MCM2 7 komplekso erdvinė struktūra (b); MCM2 7 komplekso, prijungto ori srityje, schema (c); dviejų MCM2 7 heksamerų erdvinė struktūra (d) (Annual Reviews of Biochemistry, v. 82, p. 25, 2013) Replikacijos iniciacija eukariotuose Eukariotų genomų replikacija S fazės metu vyksta pakankamai greitai. Pvz., kai kurių organizmų ankstyvuose embrionuose replikacija įvyksta per keletą minučių. Greitą replikaciją užtikrina ori sričių gausa ir iniciacijų ties ori sritimis dažnio valdymas. Pvz., žmogaus genome yra ~ sričių, kur gali prasidėti replikacija. Tam, kad replikacijos iniciacija vyktų prie ori sričių, turi prisijungti iniciacijos baltymai. Eukariotų organizmuose replikacijos iniciacijos baltymų funkciją atlieka ORC baltymų kompleksas (angl. origin recognition complex). Kompleksą (~ 400 kda) sudaro šeši baltymai, kuriuos koduoja cdc (angl. cell division cycle) genai. Komplekso baltymai konservatyvūs visuose organizmuose nuo mielių iki žmogaus (4.38 pav., a c). Skirtingų eukariotų ori sritys skirtingos (4.39 pav., a). S. cerevisiae mielių ori sritis sudaro ARS elementai (angl. autonomously replicating sequences), nutolę vienas nuo kito ~ 40 kb atstumu. Sritys yra palyginti nedidelės ~ bp. Mielių genome yra > 400 tokių sričių. ARS elementui būdinga konservatyvi 11 nukleotidų, daug A ir T turinti seka A elementas (5 ATT- TATPUTTTA 3, kur Pu purinas). Mutacijos šioje konservatyvioje srityje daro įtaką ori srities funkcijoms. S. pombe mielių ori sritys ilgesnės bp. Jose nėra konservatyvių sekų, bet yra du ar daugiau daug A ir T nukleotidų turinčių elementų (4.39 pav., a). Daugialąsčių eukariotų replikacijos pradžios sritys ištirtos menkai. DNR sekos, kurios nustatytos kaip galinčios atlikti replikacijos pradžios sričių funkciją (pvz., galinčios būti įterptos į plazmides), neturi konservatyvių elementų (4.39 pav., a). Pačios ori sritys yra kelių tūkstančių bp ilgio. Bendras tokių sričių bruožas tas, kad jos turi daug A ir T turinčių sekų. Manoma, kad ne ori nukleotidų sekos, bet chromatino struktūra ir transkripcijos cis bei trans veiksniai yra svarbūs jų kaip ori sričių funkcijai. 205

206 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.38 pav. ORC baltymų struktūra. ORC ir Cdc6 baltymų domeninė organizacija. WHD sparnuotos spiralės domenas (angl. winged helix domain), BAH bromo kaimynystės (angl. bromo-adjanced homology) domenas (a); Drosophila melanogaster ORC komplekso struktūra, paremta elektroninės mikroskopijos duomenimis. Punktyru parodyta, kur telkiasi AAA+ domenai (b); mielių ORC su Cdc6 baltymų komplekso struktūra, paremta elektroninės mikroskopijos duomenimis. Orc6 pakeistas archėjų Orc1 (c) (Annual Reviews of Biochemistry, v. 82, p. 25, 2013) 4.39 pav. ori sritys eukariotuose (a) ir pre-rc komplekso susimontavimas (b) 206

207 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Mielėse ORC kompleksas yra prisijungęs prie DNR per visą ląstelės ciklą. Žinduoliuose komplekso stabilumas priklauso nuo ląstelės ciklo fazės: kompleksas iš dalies išsimontuoja per mitozę ir vėl susimontuoja per ankstyvąją G1 fazę. Išsimontavimas ir susimontavimas susijęs su ORC baltymų fosforilinimu. Taigi, ORC kompleksas nustato, kur vyks replikacijos iniciacija. Tačiau replikacijos iniciacijai vykti turi būti patenkintos tam tikros sąlygos gautas replikacijos leidimas (angl. replication licencing). Ties eukariotų replikacijos pradžios ori sritimis turi susidaryti pre-rc kompleksas (angl. pre-replication complex). Tai yra būtina sąlyga replikacijos iniciacijai vykti. Pagrindiniai pre-rc komplekso baltymai yra ORC, Cdc6, Cdt1 ir MCM2-7 (4.39 pav., b). Replikacijos leidimas tai vyksmai, užtikrinantys prereplikacijos komplekso (pre-rc) susimontavimą ties replikacijos pradžios ori sritimi. Prereplikacijos komplekso susimontavimo procesą valdo nuo ciklinų priklausomos kinazės. Pre-RC kompleksas pradeda montuotis dar vėlyvojoje M fazėje / ankstyvoje G fazėje (tuoj po M fazės), kai S fazės nuo ciklinų priklausomų kinazių aktyvumas yra mažas (4.40 pav.) pav. Eukariotų pre-rc kompleksas ir jo aktyvinimas. Ribos tašką žymi rodyklė (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 207

208 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Prie ORC prisijungia Cdc6 baltymas. Tada į pre-rc kompleksą ORC-Cdc6 kompleksas įjungia Cdt1 ir MCM2 7 baltymus. Įjungimas yra aktyvus procesas, jam reikia ATP hidrolizės. ORC-Cdc6 N galiniai AAA+ domenai sąveikauja su С galiniais MCM2 7 AAA+ domenais. ORC-Cdc6 komplekse vyksta erdviniai pokyčiai, jis įgyja dešinio sukimo spiralės pavidalą, panašiai kaip RFC žiedo užkėlimo kompleksas (4.35 pav.). Pre-RC komplekse yra net 14 baltymų. Eukariotų pre-rc kompleksą sudaro ORC, MCM 2 7, Cdc6 ir Ctd1 baltymai. Pre-RC komplekso susidarymas vyksta tiksliai nustatytu ląstelės ciklo tarpsniu per G1 fazę iki ribos taško (angl. restriction point). Perėjus ribos tašką, S fazės kinazių kiekis ląstelėje vėl išauga (pirmiausiai Cdk-E ciklino, vėliau Cdk-A ciklino). Kol nepasibaigia mitozė, nauji pre-rc kompleksai susidaryti nebegali, nes dėl S fazės kinazių veikimo išaktyvinami komplekso komponentai Cdc6 ir Cdt1 baltymai. Išaktyvinimo būdai gali būti įvairūs. Pvz., S. cerevisiae Cdc6 sintetinamas tik G1 fazėje, o Cdt1 ir MCM sintetinami visą laiką, bet branduolyje būna tik per G2 fazę. Daugialąsčiuose organizmuose pre-rc komplekso susidarymą valdo ir baltymas gemininas, sintetinamas per S ir G2 fazes. Jis ir suriša Cdt1. Pre-RC komplekse MCM2 7 baltymai yra neaktyvūs. Jie aktyvinami pereinant nuo G1 į S fazę. MCM kompleksų, prisijungusių prie ori sričių, aktyvinimas vyksta individualiai ir yra valdomas. MCM baltymams aktyvinti reikalingi Cdc45 baltymas bei GINS baltymų kompleksas. Šie baltymai tiesiogiai sąveikauja su MCM baltymais. Aktyvinimą valdo CDK (S-CDK) kinazė ir DDK (Cdc-Dfb4) kinazė. Kinazės fosforilina pre-rc komplekso komponentus, taip pat ir kitus replikacijoje dalyvaujančius baltymus, tuomet aktyvinama MCM helikazė. Aktyvintas MCM2 7 kompleksas išskiria DNR grandines. Toliau ties ori sritimi prisijungia DNR α polimerazė-praimazė, kiti replisomos komponentai Kiti DNR replikacijos būdai Pagal klasikinį eukariotų ir prokariotų DNR replikacijos modelį, replikacijos metu dvi replikacinės šakutės juda priešingomis kryptimis nuo ori srities, sintetinama vėluojančioji ir pirmaujančioji grandinė. Gamtoje yra įvairių šio mechanizmo modifikacijų. Aptarsime kai kurias iš jų Besisukančio rato DNR replikacijos mechanizmas Besisukančio rato (angl. rolling circle) mechanizmu replikuojami nedideli genomai, pvz., viengrandinės DNR genomą turinčių bakteriofagų, taip pat bakterijų kai kurių plazmidžių (pvz., F plazmidės) DNR. Nors replikacijos principas yra tas pats, tam tikri replikacijos etapai gana smarkiai skiriasi. Skirtumai atsirado dėl skirtingų biologinių tikslų: bakteriofagams reikia sintetinti kuo daugiau DNR kopijų, o plazmidėms tik tam tikrą tiksliai apibrėžtą kopijų skaičių bakterinėje ląstelėje. Replikuojant DNR besisukančio rato mechanizmu vėluojančioji ir pirmaujančioji DNR grandinės replikuojamos atskirai. Dvigrandinėje DNR savitasis iniciacijos baltymas, IP (angl. ini- 208

209 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) DNR replikacija besisukančio rato mechanizmu vyksta išstumiant senąją DNR grandinę, prieš tai iniciacijos baltymui perskėlus vieną iš dviejų motininės DNR grandinių ir pradmeniu sintezei panaudojus skeltosios DNR 3 OH galą. tiation protein) skelia vieną DNR grandinę. Trūkio vietoje laisva motininės grandinės 3 OH grupė tampa pradmeniu pirmaujančiosios grandinės sintezei. Replisomai judant į priekį, motininės DNR grandinės 5 galas išstumiamas. Nauja DNR grandinė lieka kovalentiniu ryšiu sujungta su senąja motinine grandine. Visiškai susintetinus pirmaujančiąją grandinę, motininė grandinė nuskeliama. Likusi senoji DNR sujungiama, o vėliau paverčiama dvigrandine DNR, susintetinus RNR pradmenį (prnr), kuris naudojamas komplementarios grandinės sintezei. Aptarsime dviejų genomų, kurių DNR replikuojama besisukančio rato principu, replikacijos mechanizmus. Bakteriofago φx174 DNR nedidelė viengrandinė žiedinė DNR vadinama plius (+) grandine. Šiai grandinei sintetinama komplementari minus ( ) DNR grandinė. Taip susintetinama dvigrandinė fago DNR. Tokia DNR forma, RF (angl. replicative form), naudojama fago genomo replikacijai. RF DNR yra superspiralizuota. Replikacija vyksta besisukančio rato mechanizmu. Sintetinama daug viengrandinės fago DNR kopijų, kurios supakuojamos į naujas fagų daleles. Replikacijos iniciacijai reikia fago genomo koduojamo A iniciacijos baltymo (4.41 pav., bendroje schemoje IP iniciacijos baltymas). Visi gamtiniai replikonai, DNR sintezei naudojantys besisukančio rato mechanizmą, koduoja savitus iniciacijos baltymus. Baltymai priskiriami grandinių transferazių baltymų superšeimai. Baltymai, prieš tai išskyrę srities DNR, prisijungia prie ori srities pirmaujančiojoje grandinėje. Iniciacijos baltymai atrankiai skelia viengrandinę DNR netoli prisijungimo srities. Baltymo aktyviajame centre esanti tirozino aminorūgšties liekana vaidina svarbiausią vaidmenį susidarant trūkiui (4.41 pav.). Daugeliu atvejų (tačiau ne visais) iniciacijos baltymas lieka kovalentiniu ryšiu prisijungęs prie skeltosios DNR 5 galo. Susidarius trūkiui, ties matricos-pradmens vieta susimontuoja replisoma. Replisomą sudaro šeimininko SSB baltymai, DNR Pol III holofermentas, helikazė (Rep), bakteriofago iniciacijos baltymas. Pirmaujančiosios grandinės sintezė vyksta išstumiant senąją DNR grandinę. Kovalentiškai prisijungęs iniciacijos baltymas lieka replikacinėje šakutėje. Šakutei nutolus nuo ori srities, pirmaujančiojoje grandinėje susintetinama nauja ori sritis. Joje yra nukleotidų seka, kurią vėl gali skelti iniciacijos baltymas. Tačiau skėlus naująją DNR grandinę, tolesnė replikacija sustotų. Kadangi dvigrandinė DNR, kurią sudaro senoji minus grandinė ir naujoji plius grandinė, nėra superspiralizuota, o iniciacijos baltymas skelia savitąją sritį tik superspiralizuotoje DNR, tokiu būdu naujai susintetinta ori sritis apsaugoma nuo pakartotinio skėlimo. Pirmaujančiosios DNR grandinės sintezės terminacija įvyksta tuomet, kai replisoma, sintetindama naują grandinę, pasiekia ori sritį dvigrandinėje DNR. Čia pirmaujančioji DNR grandinė susintetinama šiek tiek toliau už srities, kurioje viengrandinę DNR gali skelti iniciacijos baltymas. Šiuo momentu replisoma stabteli, iš jos disocijuoja DNR helikazė. Pirmaujančiosios DNR grandinės 5 galas įsiterpia tarp dviejų senųjų DNR grandinių. Senosios plius grandinės skėlimo sritis tampa prieinama iniciacijos baltymui, grandinė skeliama. Skėlimo procese dalyvauja kita IP baltymo tirozino aminorūgšties liekana. Toliau vyksta transesterinimo reakcija: skeltos senosios plius grandinės 3 OH galas sujungiamas 209

210 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA su tos pačios grandinės 5 galu, ir senoji plius grandinė ciklizuojama (4.41 pav.). Kai sujungiama ir paleidžiama motininė DNR grandinė, ta pati bakteriofago iniciacijos baltymo molekulė, prisijungusi prie susintetintos pirmaujančiosios grandinės, pradeda naują DNR sintezės ciklą. Tai leidžia sintetinti pirmaujančiąją plius grandinę nenutrūkstamai, perjungiant senąją ir naująją DNR grandines nuo vienos iniciacijos baltymo Tyr aminorūgšties liekanos prie kitos. Kaip jau minėta, vėluojančioji DNR grandinė yra sintetinama nepriklausomai nuo pirmaujančiosios DNR grandinės sintezės. Vėluojančiosios grandinės DNR sintezei naudojama kita replikacijos pradžios ori sritis. Fago replikacijos iniciacijos baltymas šiame procese nedalyvauja. RNR pradmenį sintetina šeimininko RNR polimerazė, replikacijoje dalyvauja SSB, DNR Pol III holofermentas, kiti baltymai. Daugiausiai žinių apie plazmidžių replikaciją besisukančio rato mechanizmu gauta tiriant stafilokokų ir streptokokų plazmides. Mechanizmas panašus į ką tik aptartąjį. Replikacija prasideda, kai Rep iniciacijos baltymas, koduojamas plazmidės, prisijungia prie dvigrandinės plazmidės DNR savitos dso srities (angl. double stranded origin) (4.42 pav.). Srityje yra seka, kurią atrankiai atpažįsta ir skelia iniciacijos baltymas. Tam tikrose plazmidėse baltymo prisijungimo ir skėlimo sritys yra viena šalia kitos, kitose gali būti nutolusios iki 85 bp. Dėl Rep baltymo ir dso srities sąveikos DNR stipriai išlenkiama. dso srityje susidaro dviejų kilpų pavidalo struktūra (4.42 pav.). Tokios struktūros viengrandinėje DNR esančią skėlimo sritį pasiekia iniciacijos Rep baltymas. Rep baltymas skelia vieną DNR grandinę dso srityje. Kaip ir fagų replikacijos inicia pav. φx174 bakteriofago replikacijos besisukančio rato mechanizmu schema. Y1, Y2 iniciacijos baltymo tirozino aminorūgštys, dalyvaujančios reakcijoje, IP iniciacijos baltymas, H DNR helikazė, Pol šeimininko DNR Pol III 210

211 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) cijos baltymų, taip ir besisukančio rato mechanizmu besireplikuojančių plazmidžių iniciacijos baltymų sudėtyje yra dvi skėlimui svarbios tirozino aminorūgšių liekanos. Galimas ir kitoks variantas: pvz., pt181 plazmidės RepC baltymas veikia kaip dimeras (RepC- RepC), sudarytas iš baltymo monomerų, turinčių po vieną tirozino aminorūgšties liekaną (4.42 pav.). RepC baltymui skėlus viengrandinę plazmidės DNR, prie DNR prisijungia bakterijos helikazė. Bakteriofagų ir plazmidžių DNR replikacijoje dalyvauja įvairios ląstelės helikazės (pvz., Rep helikazė, UvrD helikazė ir kt.). Replikacijai dar reikalingi SSB baltymai ir DNR III polimerazės holofermentas. Pirmaujančiosios grandinės sintezė vyksta taip pat, kaip ir bakteriofagų išstumiant motininę grandinę ir ją vėliau skeliant (4.42 pav., b). Naujai susintetinta ir išstumtoji DNR grandinės ciklizuojamos, o RepC-RepC baltymų dimeras disocijuoja (4.42 pav.). Prie kiekvienos iš RepC baltymų dimero Tyr aminorūgšties liekanos lieka prijungtas nedidelis oligonukleotidas. Esminis skirtumas tarp plazmidžių ir fagų DNR replikacijos pabaigos yra tas, kad plazmidės RepC baltymų dimeras po vieno replikacijos ciklo lieka neaktyvus. Tai reiškia, kad plazmidės DNR replikacija gali prasidėti tik tada, kai susiformuoja naujas aktyvus RepC baltymų dimeras. Vėluojančioji DNR grandinė, kaip ir φx174 bakteriofago DNR, replikacijos metu sintetinama panaudojant RNR pradmenį, šeimininko DNR III polimerazės holofermentą bei kitus baltymus. Vėluojančiosios grandinės sintezės iniciacijai yra naudojama kita plazmidės DNR sritis sso. sso sritys plazmidėje turi promotorius, kuriuos atpažįsta ląstelės RNR polimerazė. RNR polimerazė sintetina trumpą pradmenį (dažniausiai nukleotidų, bet būna ir ilgesnių), kurį ilgina DNR Pol I, o vėliau ją pakeičia procesyvesnė DNR Pol III. Galiausiai DNR molekules į žiedus sujungia DNR ligazė, o superspiralizuoja DNR girazė pav. Plazmidžių replikacija besisukančio rato mechanizmu (Molecular Microbiology, v. 37, p. 447, 2000) 211

212 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.43 pav. Xenopus laevis rdnr replikacijos mechanizmas (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) Įdomus replikacijos atvejis nustatytas Afrikos naguotosios varlės Xenopus laevis ovocituose. Čia, kaip ir kitų eukariotų ląstelėse, yra nechromosominių DNR žiedinių dvigrandinės DNR molekulių, kuriose yra pasikartojančių sekų. Tokių nechromosominių DNR Xenopus yra itin gausu. Nechromosominių DNR žieduose koduojamos rrnr. Tokia DNR vadinama rdnr. Žiedų replikacija labai intensyvi ovogenezės metu, kada reikia užtikrinti veiksmingą ribosomų sintezę. Replikacija prasideda skeliant vieną grandinę (4.43 pav.) ir vyksta besisukančio rato mechanizmu. Pirmaujančioji grandinė sintetinama nenutrūkstamai. Ji naudojama kaip matrica vėluojančiosios grandinės sintezėje sintetinant Okazaki fragmentus. Tokioje dvigrandinėjė DNR yra daug rdnr kopijų. DNR į atskiras kopijas suskaldo nukleazė, o sujungia DNR ligazė DNR replikacija θ mechanizmu θ (teta) mechanizmu dažniausiai replikuojamos plazmidžių DNR. Vykstant θ replikacijos procesui, motininės DNR grandinės yra išskiriamos, vėliau sintetinamas RNR pradmuo (prnr). DNR pirmaujančiosios grandinės sintezė pradedama, kai DNR polimerazė ilgina prnr pradmenį. Pirmaujančioji DNR grandinė sintetinama nenutrūkstamai, o vėluojančioji DNR grandinė fragmentais. θ replikacija gali prasidėti vienoje arba keliose ori srityse. Replikacinės šakutės gali judėti viena arba abiem kryptimis. Elektroninės mikroskopijos būdu gautose nuotraukose šio tipo mechanizmu besireplikuojančios DNR molekulės yra panašios į graikišką teta ( θ ) raidę (4.44 pav.). 212

213 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.44 pav. Plazmidžių replikacija θ (teta) mechanizmu Beveik visų plazmidžių DNR, kurios yra replikuojamos θ mechanizmu, replikacijos iniciacijai reikia plazmidžių koduojamų Rep iniciacijos baltymų. Plazmidžių ori srityse yra šių baltymų prisijungimo vietos. ori sritys pasižymi dar keletu būdingų savybių: z turi iteronų pasikartojančių nukleotidų sekų; zturi A ir T nukleotidų gausių sričių, kuriose išskiriamos DNR grandinės ir prisijungia šeimininko replikacijos baltymai; z turi šeimininko DnaA baltymo prisijungimo vietų. Iteronai yra ~ 20 bp DNR pasikartojimai (4.45 pav.). Jų nukleotidų sekos pasižymi gana dideliu konservatyvumu. Pasikartojimai yra saviti kiekvienai plazmidei, prie jų atrankiai prisijungia tik tos plazmidės DNR koduojamas Rep iniciacijos baltymas. Rep baltymą koduojantis genas yra išsidėstęs netoliese. DnaA baltymo prisijungimo srityse yra Dam metilazės metilinimo vietų (nors metilinimas nėra svarbus šių plazmidžių DNR replikacijai). Taigi, θ mechanizmu besireplikuojančių plazmidžių DNR ori sritys primena bakterijų, pvz., E. coli, DNR replikacijos ori sritis. Replikuojant DNR θ mechanizmu, replikacijos iniciacijos metu susimontuoja replisoma, kurią sudaro šeimininko DNR Pol III holofermentas, DnaB helikazė ir praimazė. Daugelio plazmidžių DNR replikacijos iniciacijai reikia plazmidės koduojamo Rep baltymo ir šeimininko DnaA baltymo. DnaA baltymas reikalingas replikacijos iniciacijai, bet ATP nėra būtinas. Rep baltymų prisijungimas prie iteronų sričių užtikrina replikacijos ori srities grandinių išskyrimą. Rep baltymai nepasižymi ATPaziniu aktyvumu. Jų prisijungimo sąlygotų DNR ori srities pokyčių, greičiausiai, pakanka, grandinėms išskirti. Tai, kad Rep baltymas dalyvauja išskiriant DNR grandines, neleidžia plazmidžių DNR replikacijai visiškai priklausyti tik nuo šeimininko baltymų. Rep-DNR kompleksas kartu su šeimininko DnaA baltymu lemia DnaB-DnaC komplekso prisijungimą prie plazmidės DNR ori srities ir abiejų grandinių išsiskyrimą daug A ir T nukleotidų turinčioje srityje. Šiame procese taip pat gali dalyvauti šeimininko HU, IHF, FIS baltymai pav. Plazmidžių, besireplikuojančių θ mechanizmu, ori sričių struktūra 213

214 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA DNR replikacija D kilpos mechanizmu D kilpos mechanizmu vyksta mitochondrijų žiedinės dvigrandinės DNR replikacija. Kaip matrica sintezėje iš pradžių naudojama viena iš dviejų DNR grandinių L grandinė (angl. light). Ties H grandinės ori sritimi, O H, susintetinamas pradmuo (4.46 pav., a). Pradmenį susintetina mitochondrijų RNR polimerazė. Pradmenį dar sutrumpina tam tikros endonukleazės (pvz., MRP ribonukleazė), kurių substratas yra DNR-RNR heterodupleksas. Sutrumpintą pradmenį ilgina DNR γ polimerazė, sintetindama pirmaujančiąją grandinę, o L grandinė yra išstumiama. Susidaro struktūra, primenanti D raidę. Struktūra vadinama D kilpa. Judančioje D kilpoje DNR grandinės yra išskiriamos ~ nukleotidų srityje. Sintetinama maždaug du trečdaliai naujosios L grandinės. Tuomet išstumtoje senojoje DNR L grandinėje replikacijai tampa prieinama kita DNR ori sritis O L. Prasideda naujos H (angl. heavy) grandinės, komplementarios L grandinei, sintezė (4.46 pav., b, c) pav. Žinduolių mitochondrijų DNR (mtdnr) replikacija D kilpos mechanizmu. Replikacijos schema (a, b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); mitochondrijų DNR replikacijoje dalyvaujantys baltymai (c) ( 214

215 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Vykstant tam tikrų organizmų mitochondrijų DNR replikacijai, susidaro ne viena, o kelios D kilpos. Tai liudija, kad šios DNR turi ne vieną, o kelias replikacijos pradžios ori sritis. Panašus mechanizmas pasitelkiamas ir chloroplastų DNR replikacijai Linijinių DNR replikacija Iki šiol aptarėme linijinių DNR replikaciją, neužsimindami apie tai, kaip replikuojami chromosomų galai. Ląstelė, replikuodama linijines DNR molekules, susiduria su problema, kaip tiksliai nukopijuoti abiejų DNR grandinių galus. Pašalinus RNR pradmenį pirmaujančiojoje grandinėje ir paskutinį pradmenį vėluojančiojoje grandinėje, lieka jų 5 galai. Gamtoje egzistuoja įvairūs linijinių DNR galų replikacijos problemos sprendimo būdai. Aptarsime kai kuriuos iš jų. T4 ir T7 bakteriofagai, kurių DNR yra dvigrandinė, turi pasikartojančių komplementarių sekų. Kai DNR replikuojama ir pašalinami galuose esantys pradmenys, dukterinės grandinės lieka trumpesnės. Fagų DNR molekulės sąveikauja komplementariomis sekomis ir susijungia. Tokiu būdu į vieną ilgą molekulę konkatemerą sujungiama daug linijinių fago DNR (~ 20). Vėliau sujungtos fago DNR molekulės tiksliai suskaldomos į vienodo ilgio DNR molekules būsimų naujų fagų genomus. 4.8 lentelė. Adenoviruso DNR replikacijoje dalyvaujantys viruso ir ląstelės baltymai Viruso / ląstelės baltymas Viruso baltymai DNR galinio baltymo pirmtakas, ptp Prie DNR kovalentiškai prijungtas galinis TP baltymas DNR polimerazė (Ad Pol) Prie DNR (viengrandinės) prisijungiantis DBP baltymas Molekulinė masė (kda) Funkcijos replikacijos iniciacijos metu 80 Prisijungęs prie polimerazės veikia kaip pradmuo 55 Apsaugo 5 galus; padidina matricos aktyvumą; aktyvina ptp Ad Pol prisijungimą; pakeičia replikacijos ori srities struktūrą; 140 Prisijungia ties šerdine sritimi (kartu su ptp baltymu); prijungia dcmp prie ptp Funkcijos replikacijos elongacijos metu - - Sintetina naują DNR grandinę, išstumdama senąją grandinę 59 Sumažina dcmp Km; aktyvina NFI prisijungimą Apsaugo viengrandinę DNR; išskiria DNR dupleksą replikacinėje šakutėje; padidina DNR replikacijos procesyvumą ir sintezės greitį Peptidazė - - Po replikacijos skaldo ptp baltymą iki 55 kda TP baltymo Ląstelės baltymai Branduolio I veiksnys, NFI Branduolio III veiksnys, NFIII 55 Prisijungia ties pagalbine sritimi; prisijungia prie ptp Ad Pol; nukreipia ptp Ad Pol ori srities link; stabilizuoja preiniciacijos kompleksą 90 Prisijungia prie pagalbinės srities; lenkia DNR; silpnai prisijungia prie ptp Ad Pol

216 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Bakteriofagas φ29 ir adenovirusas sintetina linijines DNR dar kitokiu savitu būdu. Pradmens vaidmenį DNR sintezėje atlieka DNR gale kovalentiniu ryšiu prijungtas baltymas. Adenoviruso genomą sudaro kb dvigrandinė DNR, kurios kiekviename gale prie grandinės 5 galo kovalentiniu ryšiu prijungtas adenoviruso TP baltymas (4.47 pav.). Kiekviena adenoviruso DNR grandinė replikuojama atskirai, išstumiant vieną motininę DNR grandinę, iki tol buvusią duplekse su kita DNR grandine. Replikacija gali vykti nepriklausomai kiekviename viruso dvigrandinės DNR gale. Kai replikacinė šakutė pasiekia kitą DNR galą, išstumtoji DNR grandinė atsipalaiduoja kaip viengrandinė DNR. Adenoviruso linijinės DNR replikacijoje dalyvauja 4 viruso koduojami baltymai ir 3 ląstelės šeimininkės baltymai (4.8 lentelė). Adenoviruso DNR turi 51 bp atvirkščius nukleotidų pasikartojimus abiejuose DNR galuose. Pasikartojimuose yra cis reguliacinės sritys, dalyvaujančios nustatant replikacijos iniciacijos pradžios ori sritis. ori srityse išskiriami keli funkciniai domenai. A domeną sudaro 18 bp. A domenas yra minimali replikacijos ori sritis. Jis reikalingas replikacijai, bet užtikrina tik savo paties minimalią replikaciją. Sritis tarp 9 18 bp yra konservatyvi daugelio adenovirusų serotipų genomuose. Šioje srityje prisijungia ptp baltymas kartu su adenoviruso DNR polimeraze. B domeną sudaro bp, o C domeną bp. B ir C domenai nėra būtini adenoviruso DNR replikacijai, bet jie labai pagerina replikacijos iniciacijos veiksmingumą. Ties B ir C domenais jungiasi ląstelės baltymai branduolio I veiksnys (NFI) ties B, o branduolio III veiksnys (NFIII) ties C do pav. Adenoviruso DNR replikacijos schema. Adenoviruso replikacijos schema (a); adenoviruso replikacijos iniciacijos schema (b) 216

217 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) menu. Kiekviename subrendusio viruso DNR 5 gale kovalentiniu ryšiu prijungtas TP baltymas taip pat veikia kaip cis reguliacinis elementas adenoviruso DNR replikacijoje. Replikaciją galima suskirstyti į keletą etapų (4.47 pav., b). Pirmiausia viruso DNR padengiama DBP baltymais. Tada DBP baltymas kooperatyviai sąveikauja su branduolio veiksniu, NFI, kuris prisijungia prie adenoviruso savitos sekos DNR ori srityje. Tada prie ori prisijungia NFIII branduolio veiksnys. Sąveika tarp NFI baltymo ir adenoviruso DNR polimerazės (Ad Pol), taip pat tarp ptp ir NFIII į preiniciacijos kompleksą įjungia ptp-ad Pol heterodimerą (4.47 pav., b). Susidaro preiniciacijos kompleksas. Tada prie ptp baltymo kovalentiniu ryšiu prijungiamas dcmp nukleotidas. Tarp nukleotido α fosfato grupės ir ptp baltymo serino aminorūgšties liekanos β hidroksigrupės susidaro kovalentinis ryšys. Ryšio susidarymą katalizuoja Ad Pol. dcmp 3 OH grupė veikia kaip pradmuo komplementarios grandinės sintezėje. dcmp komplementarus ketvirtajam matricos nukleotidui. DNR sintezę pradeda Ad Pol. Sintetinamas nukleotidų trejetas 5 CAT3. Tai yra tarpinis replikacijos kompleksas. Dauguma ptp-ad Pol kompleksų tokioje stadijoje disocijuoja. Laisvos Ad Pol molekulės toliau ilgina grandinę, tada ptp-cat kompleksas grįžta atgal ir sudaro komplementarią sąveiką su pirmaisiais trimis adenoviruso matricos nukleotidais (GTA). Grįžimas, manoma, reikalingas užtikrinti iniciacijos tikslumą. Kita motininė DNR grandinė išstumiama, judant DNR polimerazei į priekį (4.47 pav., a). Ad Pol pereina iš replikacijos iniciacijos į elongacijos etapą. Grįžimas replikacijos iniciacijos metu yra būdingas ir φ29 bakteriofago replikacijai, taip pat vyksta replikuojant kitas DNR, kai pradmens funkciją atlieka baltymo molekulė Telomeros ir jų funkcijos Kai vyksta eukariotų chromosomų linijinės DNR replikacija, RNR pradmuo pirmaujančiojoje grandinėje, taip pat paskutiniojo Okazaki fragmento RNR pradmuo vėluojančiojoje grandinėje yra pašalinami. Jų vietoje DNR polimerazės negali de novo susintetinti DNR, nes sintezę vykdo tik 5 3 kryptimi. Tokiu būdu dukterinės DNR grandinės lieka sutrumpėjusios (4.48 pav.). Kitame replikacijos cikle, kur kaip matricos naudojamos sutrumpėjusios DNR grandinės, DNR sintetinama taip pat trumpesnė. Kiekvieno naujo replikacijos ciklo metu chromosomų 5 galai trumpėja, ir į dukterines ląsteles pakliūva vis trumpesnės chromosomos. Pvz., žmogaus ląstelių chromosomų 5 galai po kiekvieno replikacijos ciklo sutrumpėja ~ nukleotidų. Toks genetinės medžiagos praradimas įjungia nuo p53 baltymo priklausomą DNR pažaidų taisymo kelią. Ląstelės visam laikui pasitraukia iš ciklo (reiškinys vadinamas replikaciniu senimu) arba žūva apoptozės keliu. Kartais netgi pakanka vieno chromosomos galo sutrumpėjimo, kad būtų sustabdyta ląstelių proliferacija. Taigi, chromosomų galų trumpėjimas yra vienas naviką slopinančių mechanizmų. Gamtoje egzistuoja molekulinių būdų, kurie apsaugo tam tikrų ląstelių chromosomas nuo trumpėjimo. Dauguma eukaruotų tam pasitelkia telomeras ir telomerazę. 217

218 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 4.48 pav. Linijinės DNR 5 galų trumpėjimas dėl replikacijos Telomerų struktūra 1930 m. Hermanas Miuleris (Hermann Muller) ir Barbara MakKlintok (Barbara McClintock) tyrimais nustatė, kad eukariotų chromosomose yra telomerų. Šios struktūros ląstelėms yra gyvybiškai būtinos. Telomeros yra universalios baltymų-dnr struktūros eukariotų chromosomų galuose. Telomeros atlieka keletą svarbių biologinių funkcijų: zužtikrina, kad dalyvaujant fermentui telomerazei chromosomos po kiekvieno DNR replikacijos ciklo netrumpėtų (tačiau tik tam tikrose ląstelėse); zužtikrina chromosomų stabilumą apsaugo linijinių chromosomų galus nuo rekombinacijos, sujungimo, nukleazių poveikio; z užtikrina visišką chromosomų replikaciją bei padalijimą į dukterines ląsteles; z dalyvauja chromatino organizacijoje branduolyje; z dalyvauja valdant genų veiklą. Telomerų sudėtyje esantys molekuliniai komponentai sąveikauja tarpusavyje ir sudaro įvairius kompleksus (4.49 pav.): z DNR-baltymų kompleksą, išsidėsčiusį ties visa telomerine DNR; z subtelomerinį heterochromatiną, kurio sudėtyje yra ir nukleosomos; z baltymų kompleksą, išsidėsčiusį ties telomerinio pasikartojimo dvigrandinės DNR galu; 218

219 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) z DNR-baltymų kompleksus, išsidėsčiusius ties telomerinio pasikartojimo viengrandinės DNR galu; z telomerines DNR kilpas; z telomerazės nukleoproteino komponentus. Daugelio eukariotų chromosomų galuose DNR yra trumpos kartotinės (~ 5 8 bp) G gausios sekos. Šis pasikartojimas vadinamas telomeriniu pasikartojimu. Sekos gali pasikartoti nuo mažiau kaip šimto iki kelių tūkstančių kartų. Nukleotidų seka ir jos ilgis varijuoja tarp organizmų, ląstelių tipų ir net tos pačios ląstelės chromosomų. Pvz., Tetrachymena pirmuonyje seka yra (TTGGGG)n, kito žiuželinių klasės atstovo, Oxytricha nova, DNR (TTTTGGGG)n, žmogaus ir pelės DNR (TTAGGG)n. Kai kuriuose eukariotuose, pvz., mielėse, telomerinis pasikartojimas yra nere pav. Eukariotų chromosomų DNR galų struktūra. Chromosomų galo struktūra (a); DNR-baltymų kompleksai kai kurių eukariotų chromosomų galuose (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8, p. 825, 2007) 219

220 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA guliarus (TG) 1-6 TG 2-3 (4.8 lentelė). Telomeros sudaro iki 2 20 kb žmoguje, iki 150 kb kai kuriose pelių rūšyse, ~ 300 bp mielėse ir tik keliasdešimt bp Oxytricha pirmuonyje. Pačiuose telomerų DNR galuose yra viengrandinės DNR 3 galo iškyša, kurioje gausu G nukleotidų (2.18 pav.). Telomerų viengrandinės DNR iškyša gali būti įvairaus ilgio ir yra svarbi telomerų funkcijai. 4.8 lentelė. Telomeriniai pasikartojimai įvairiuose organizmuose ir jų struktūra Organizmas 5 3 pasikartojanti seka Pasikartojančias sekas turinčios telomeros ilgis Daug G turinčios iškyšos 3 gale ilgis Pirmuonys Tetrahymena T 2 G bp b? Oxytricha T 2 G 4 20 bp (makrobranduolys) 16 b Nėra Euplotes T 2 G kb (mikrobranduolys) Nenustatyta Yra Trypanosoma T 2 AG 3 28 bp kb Grybai 14 b ~ b Saccharomyces cerevisiae (TG) 1-6 TG 2-3 ~ 300 bp b? Shizosaccharomyces pombe T 1-2 ACA 0-1 C 0-1 G 1-6 ~ 300 bp Nenustatyta? t kilpa? Yra Augalai Arabidopsis T 3 AG 3 2 4,5 kb ~ b? Stuburiniai Homo sapiens T 2 AG kb ~ b Yra Mus musculus T 2 AG 3 iki 100 kb ~ b? Daugelis kitų T 3 AG kb ~ b? Telomerų DNR nebūtinai yra sudaryta iš vienodų daug G ir T turinčių pasikartojimų: kai kuriuose eukariotuose, pvz., S. pombe mielėse ir Paramecium pirmuonyje, yra ne vienas, o keletas skirtingų telomerinių pasikartojimų. Subtelomerinėms chromosominės DNR sekoms, kurios yra netoli telomerinių pasikartojimų, taip pat būdingi sekų pasikartojimai, tačiau jie labai įvairūs tarp rūšių. Prie telomerinės DNR yra prisijungę telomeroms savitieji baltymai (4.49 pav., b), kuriuos pagal sąveikos su DNR pobūdį būtų galima suskirstyti į dvi grupes: dvigrandinei telomerų DNR savituosius baltymus ir viengrandinei telomerų DNR savituosius baltymus. Baltymai taip pat skirstomi į evoliuciškai konservatyvias grupes. Baltymai, kurie tiesiogiai sąveikauja su telomerų galų DNR, dar sąveikauja su kitais baltymais, sudarydami didelius nukleoproteininius kompleksus chromosomų galuose telomerų kepures (angl. telomere cap). Prie žinduolių telomerų DNR yra prisijungęs šelterino (angl. shelterin) baltymų kompleksas. Komplekse yra šeši baltymai: TRF1 (angl. telomeric repeat binding factor 1), TRF2, POT1 (angl. protection of telomeres 1), TIN2 (angl. TRF1-interacting protein 2), TPP1 ir RAP1 (4.50 pav., a). TRF1 ir TRF2 jungiasi prie telomerinio pasikartojimo dvigrandinės DNR. POT1 jungiasi prie telomerinio pasikartojimo viengrandinės DNR 3 galo iškyšos. TRF1 ir TRF2 pritraukia į kompleksą kitus baltymus: TIN2, TPP1 ir POT1. 220

221 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.50 pav. Telomerų DNR ir baltymų komplekso struktūra. Žinduolių šelterino kompleksas ir telomerinės DNR kilpos (a) (Nature Reviews Cancer, v. 8, p. 451, 2008); t kilpa žmogaus HeLa ląstelių telomerinėje DNR. Vaizdas gautas elektronine mikroskopija (b) (Cell, v. 97, p. 510, 1999) Įvairių organizmų telomerų tyrimais nustatyta, kad telomerinės DNR 3 galo viengrandinė iškyša gali įsiterpti į telomerinės DNR dvigrandinę sritį ir sudaryti dupleksą su viena iš grandinių, nes dėl telomerinių pasikartojimų sąveika yra komplementari. Antroji duplekso grandinė išstumiama (4.50 pav., a, b). Taigi, telomerinė DNR primena lasą ir jos struktūroje yra dvi kilpos t kilpa (angl. t-loop) ir D kilpa (angl. displacement loop). t kilpos vaidmuo yra svarbus apsaugant chromosomų galus nuo jų atpažinimo kaip DNR dvigrandinių trūkių. Ląstelės molekulinė mašina, kuri atpažįsta tokius DNR trūkius, turi prieiti prie pat DNR galo. Telomerų galo paslėpimas kilpoje gali ją apsaugoti nuo atpažinimo ir DNR pažaidų taisymo (chromosomų galų jungimo) mechanizmo aktyvinimo. Telomerų kilpos gali būti nuo 0,3 kb dydžio tripanosomų organizmuose iki 30 kb dydžio pelių organizmuose. Daug informacijos apie chromosomų galų struktūrą buvo gauta tiriant Tetrahymena ir Oxytricha pirmuonis. Kitaip nei kitų eukariotų, pirmuonių mikrobranduoliuose genomas yra fragmentuotas. Jį sudaro daug mažų minichromosomų, kurių yra nuo 40 iki Oxytricha turi net 10 7 geno dydžio chromosomų. Oxytricha nova (dar vadinama Sterkiella nova) organizmo heterodimerinis TEBP baltymas (angl. telomere and binding protein) pirmasis baltymas, kurio sąveika su telomerinės DNR 3 galo viengrandine iškyša buvo nustatyta. Viengrandinė telomerinės DNR iškyša yra paslėpta TEBP baltymo, sudaryto iš α ir β monomerų, viduje. In vitro eksperimentais įrodyta, kad TEBP apsaugo telomerinę DNR nuo egzonukleazių poveikio. Taigi, Oxytricha nova TEBP baltymas, prisijungęs prie viengrandinės DNR telomerų galuose, atlieka jų apsauginę funkciją. TEBP gali sudaryti heterodimerus ir homodimerus. Tiek vieno, tiek kito tipo kompleksas gali jungtis ties Oxytricha 16 nukleotidų viengrandine iškyša. Heterodimeras apsaugo telomeros galą nuo telomerazės, o homodimeras neapsaugo. 221

222 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Žinduoliuose šelterino kompleksas funkcionuoja kartu su daugybe kitų baltymų, kurie daro įtaką chromosomų galų integralumui bei dinamikai. Tarp jų nemažai DNR reparacijoje ir rekombinancijoje dalyvaujančių ląstelės komponentų. Nustatyta, kad jie svarbūs telomerų replikacijai, apsaugai ir stabilumui. Trumpėjant telomerinei DNR arba sutrikus baltymų komplekso funkcionavimui, telomeros praranda apsauginę funkciją tampa nefunkcionaliomis telomeromis (angl. dysfunctional telomeres). Tai sukelia genominį nestabilumą (pvz., aneuploidiją) Telomerazės savybės ir funkcijos Telomeros atlieka ne tik apsauginę chromosomų galų funkciją, bet ir užtikrina, kad telomerinės DNR galai vykstant replikacijai netrumpėtų. Apsaugant DNR galus nuo trumpėjimo tiesiogiai dalyvauja fermentas telomerazė. Telomerazė yra ribonukleoproteinas, sudarytas iš baltyminio subvieneto telomerazės atvirkštinės transkriptazės, TERT (angl. telomerase reverse transcriptase) ir RNR molekulės, TER RNR (angl. telomerase RNA) (4.50 pav. ir 4.51 pav.). Šie komponentai sudaro šerdinę telomerazę. Tokia telomerazė yra aktyvi in vitro, bet in vivo jos aktyvumui reikalingi kiti į ribonukleoproteininio komplekso struktūrą įeinantys baltymai. Telomerazė yra ribonukleoproteinas, kurį sudaro RNR ir baltyminis subvienetas (subvienetai) pav. Telomerazės struktūra. Žmogaus telomerazės holofermento komponentai (a) (World Journal of Stem Cells, v. 3, 2011, p. 89); telomerazės RNR antrinė struktūra. Domenai pažymėti (b) (Annual Review of Biochemistry, v. 75, p. 493, 2006) 222

223 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.52 pav. Telomerazės veikimo mechanizmas (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz. Cell Biology, second edition, 2007) 223

224 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA TERT yra specializuota DNR polimerazė, sintetinanti DNR pagal RNR matricą. TERT baltymas pirmą kartą buvo aptiktas Euplotes aediculatus pirmuonyje. TERT evoliuciškai artimiausia ne-ltr tipo retrotranspozonų ir retronų atvirkštinėms transkriptazėms. Nuo kitų atvirkštinių transkriptazių TERT skiriasi tuo, kad turi prijungtą TER RNR, kurią naudoja kaip matricą sintezei; taip pat tuo, kad sintetina pasikartojimus. Be polimerazinio aktyvumo, būdingo atvirkštinėms transkriptazėms, TERT pasižymi ir endonukleaziniu aktyvumu, dėl kurio yra nuskeliama DNR, esanti duplekse su telomerazės RNR. Manoma, jog šis aktyvumas gali atlikti klaidų taisymo funkciją. TER RNR turi seką, kuri yra komplementari ~ 1,5 telomerinio pasikartojimo. RNR ilgis įvairus pvz., Tetrahymena 146 nt, o Candida albicans net nt. TER RNR nukleotidų sekos gerokai skiriasi tarp organizmų, tačiau antrinės struktūros turi konservatyvių domenų. Aukštesniuosiuose eukariotuose, palyginti su žemesniaisiais, telomerazės RNR ilgesnės, be to, jose yra funkcionalių sekų, pvz., H/ACA dėžutė (angl. H/ACA box), būdinga mažoms branduolėlio RNR (snornr), kurios dalyvauja bręstant ribosominėms RNR (4.51 pav., b). Ši dėžutė, taip pat kiti RNR molekulės domenai yra svarbūs telomerazės aktyvumui, brendimui ir viduląstelinei lokalizacijai. Be baltyminio subvieneto ir RNR, in vivo telomerazė yra susijungusi su keletu baltymų ir sudaro telomerazės holofermentą (4.51 pav., a). Šie baltymai skirtinguose organizmuose yra skirtingi. Jie, greičiausiai, veikia tarsi telomerazės holofermento komponentai, darydami įtaką jos procesyvumui, sąveikai su telomerų DNR arba viso telomerazės komplekso susidarymui. Telomerazė prisijungia ties telomerinės DNR 3 iškyša ir savo RNR sritimi, komplementaria telomeriniam pasikartojimui, sudaro su ja dupleksą (4.52 pav.). Kaip pradmenį Telomerazė yra atvirkštinė transkriptazė, turinti matricą telomerazės RNR. naudodama iškyšą, telomerazė ilgina telomerinės DNR 3 galą. Kai susintetinamas telomerinės DNR pasikartojimas, telomerazė disocijuoja ir vėl prijungia savo RNR molekulę ties naujai susintetintos DNR galu taip, kad telomeriniam pasikartojimui komplementari telomerazės RNR sritis galėtų būti vėl kopijuojama fermento. Kokiu būdu yra ilginamas telomerinės DNR 5 galas? Manoma, kad telomerazei pakankamai pailginus telomerinės DNR 3 viengrandinę iškyšą, RNR polimerazės susintetina pradmenį, kurį jau gali ilginti DNR polimerazės. Likusį plyšį sujungia DNR ligazės. Telomerazės vykdomas DNR galų ilginimas yra valdomas, kad nebūtų prijungta per daug nukleotidų sekų. Įdomu, kad telomerazės veikimas yra slopinamas, kai tik fermentas susintetina sutrumpėjusią telomerinę DNR iki pradinio ilgio. Manoma, kad telomerazei nustatyti, kokio ilgio DNR sintetinti, padeda RAP1 baltymas, kuris prisijungia prie susintetintos DNR ties daug G turinčiais pasikartojimais kas ~ nukleotidų porų Telomerų ilgio reguliavimas, senimas ir vėžys Esminis skirtumas tarp kultūroje augančių normalių ląstelių ir vėžinių ląstelių yra tas, kad normalios ląstelės pasidalija tam tikrą apibrėžtą kartų skaičių (tai vadinama ląsteliniu senimu), 224

225 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) 4.53 pav. Žmogaus fibroblastų telomerų trumpėjimas ląstelėms senstant. Ląstelių, pasidalijusių 16 kartų, chromosomų vaizdas, gautas FISH (angl. fluorescence in situ hybridisation) analizės metodu (a); ląstelių, pasidalijusių > 60 kartų, chromosomos. Kaip zondas analizei naudota telomerinio pasikartojimo DNR (b) o vėžinės ląstelės dalijasi neapibrėžtą kartų skaičių (yra nemirtingos, angl. immortal). Iškelta hipotezė, kad ląstelė turi molekulinį laikrodį, kuris skaičiuoja, kada laikas nustoti dalytis, pasenti ir mirti. Replikacinio senimo (angl. replicative senescence) hipotezėje teigiama, kad molekulinio laikrodžio funkciją atlieka telomeros ir jų ilgio užtikrinimo mechanizmas ląstelėse. Mechanizmo esmė tokia: sulig kiekvienu nauju replikacijos ciklu telomerų DNR sutrumpėja ~ bp. Kai telomeros tampa kritiškai trumpos, ląstelės nustoja dalytis ir pereina į pirmąją mirtingumo fazę, dar vadinamą M1 faze (angl. mortality stage 1), arba Haifliko riba (angl. Hayflick limit) (4.53 pav., 4.54 pav.). Šį fenomeną 1961 m. aptiko Leonardas Haiflikas (Leonard Hayflick), tyrinėdamas žmogaus embrioninio audinio ląsteles. Jis nustatė, kad iki M1 fazės žmogaus embrioninio audinio ląstelės pasidalija ~ kartų. Perėjimo į M1 fazę signalu gali būti sutrumpėjusių telomerų kaip chromosomų trūkių atpažinimas ir jų taisymo mechanizmo aktyvinimas (pvz., dalyvaujant baltymams p53, p16, p21). Dėl sutrumpėjusių telomerų aktyvinus DNR pažaidų taisymo mechanizmą, ląstelės žūva apoptozės keliu arba nustoja dalytis pereina į jau minėtą ląstelinio senimo fazę (M1 fazę). Ląstelinio senimo fazėje ląstelė, įprastu atveju, negrįžtamai pasitraukia iš ląstelės ciklo. Ciklas stab pav. Replikacinio senimo hipotezė 225

226 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA domas veikiant DNR pažaidų kontrolės taškų mechanizmams. Senos ląstelės būna metaboliškai aktyvios. Tokių ląstelių savitas molekulinis žymuo lizosomų hidrolazė β galaktozidazė, SA-βGal (angl. senescence-associated β-galactosidase). Manoma, kad SA-bGal senose ląstelėse yra daug dėl sutrikusių lizosomų funkcijų. Taigi, ląstelės pasitraukimas iš dalijimosi ciklo funkcionuoja kaip apsauga nuo mechanizmų, kurie lemia vėžinių ląstelių atsiradimą. Kitaip tariant, tai yra naviką slopinantis mechanizmas. Senimą gali sukelti ne tik nefunkcionalios telomeros, bet ir tam tikros DNR pažaidos (pvz., sukeltos oksidacinio streso), tam tikrų onkogenų aktyvinimas. Ląstelių dalijimąsi M1 fazėje vėl gali suaktyvinti virusiniai bei ląsteliniai onkogenai, kitų genų mutacijos. Ląstelės vėl pradeda dalytis, nepaisant to, kad jų telomeros trumpos, kol pasiekia kitą fazę M2, arba krizės fazę (angl. crisis phase). Krizės fazėje ląstelėms būdingas genominis nestabilumas. Didžioji dalis ląstelių šioje fazėje nustoja dalytis ir žūva. Tačiau tam tikros ląstelės išgyvena ir dalijasi toliau. Tokioms ląstelėms būdinga aktyvi telomerazė arba kiti mechanizmai, užtikrinantys telomerų ilgį, nors ląstelių fenotipą (vėžinį) nulemia ne jie. Telomerų ilgio užtikrinimo mechanizmai tampa svarbūs tolesniam pakitusių ląstelių dalijimuisi ir išgyvenimui, t. y. ląstelių piktybėjimui. Taigi, telomerazės aktyvinimas krizės fazės metu gali lemti ląstelių supiktybėjimą. Replikacinio senimo hipotezę patvirtina pakankamai eksperimentinių duomenų. Nustatyta, kad sergant genetinėmis ligomis, kurios lemia ankstyvą senimą (pvz., Vernerio sindromu, Hatčinsono ir Džilfordo pirmalaikio senėjimo sindromu, Žmogaus organizme telomerazės yra aktyvios lytinėse ląstelėse ir neaktyvios daugelyje somatinių ląstelių. 21 chromosomos trisomija), telomeros trumpėja greičiau. Žmogaus fibroblastų linijos ląstelėse ekspresavus tiek aktyvios telomerazės, kad ji galėjo ilginti telomerų galus, fibroblastų, palyginti su kontrolinių ląstelių, gyvenimo laikas pailgėjo apie 200 generacijų. Panašūs rezultatai gauti tiriant ir daugelį kitų eukariotinių ląstelių kultūrų. Pelių, turinčių išveiklintą TERT koduojantį geną, palikuonys pasižymėjo sutrikusia kaulų čiulpų ir odos regeneracine funkcija. Jų pusamžis (angl. halflife) ir viso gyvenimo trukmė buvo trumpesni, mutacijos efektas ryškėjo vėlesnėse kartose. Vis dėlto ne visoms somatinėms ląstelėms būdinga neaktyvi telomerazė: pvz., naudojant jautrų telomerų kartotinių sekų aptikimo metodą, aktyvios telomerazės buvo atrasta kai kuriose hemapoetinės sistemos ląstelėse, epidermio ląstelių baziniame sluoksnyje, plaukų folikulų ląstelėse, kai kuriose žarnyno ląstelėse, kaulų čiulpų ląstelėse. Mutacijos, dėl kurių sutrinka žmogaus telomerazės sintezė, sukelia tam tikras su ląstelių proliferacija susijusias ligas. Kelių sistemų sutrikimais pasižyminti kongenitinė diskeratozė (Dyskeratosis congenita) ypatinga tuo, kad sergant šia liga neatsinaujina įprastai dideliu regeneraciniu potencialu pasižymintys audiniai oda, žarnyno epitelis, kaulų čiulpai. Kongenitinę diskeratozę sąlygoja mutacijos telomerazės RNR arba su šia RNR susijungusiame baltyme diskerine. Šia liga sergančių pacientų telomeros yra trumpesnės nei sveikų žmonių. Telomerazės yra aktyvios daugelyje (> 90 %) vėžinių ląstelių. Vėžinių ląstelių telomeros dažniausiai yra trumpos, nuo kritinio sutrumpėjimo jas apsaugo telomerazė. Piktybinio naviko ląstelės, užuot dėl DNR pažaidų aktyvinusios žūties mechanizmą, dalijasi toliau. 226

227 IV. DNR BIOSINTEZĖ (REPLIKACIJA) Pastaruoju metu intensyviai kuriami ir kliniškai tiriami telomerazės slopikliai: telomerazės RNR sekai priešprasmės (angl. antisense) RNR; dominuojantys neigiami TERT subvieneto mutantai; molekulės, kurios neleidžia susidaryti telomerų galuose savitosioms struktūroms kvadrupleksams; taip pat nedidelės molekulės, slopinančios telomerazės aktyvumą. Telomerų ilgį lemia ne tik aktyvi telomerazė, bet ir daugelis genetinių bei epigenetinių veiksnių. Pvz., seno žmogaus ląstelių telomeros gali būti ilgesnės negu jauno žmogaus to paties tipo ląstelių telomeros. Taip pat manoma, kad telomerų ilgis nėra vienintelis signalas, kokio amžiaus yra ląstelė ir kiek dar jai liko gyventi. Tolesni tyrimai atskleidė, kad telomerazių aktyvumas nuolat kinta ir yra sudėtingai valdomas ląstelės ciklo metu ne tik normaliose ląstelėse, bet ir nuolat besidalijančiose ląstelėse (tai vadinama telomerų homeostaze). Telomeros gali laikinai būti susijungusios su baltymų kepurėmis (angl. capped telomeres), ir tada jos yra neprieinamos telomerazei, arba būti be baltymų kepurių (angl. uncapped telomeres), ir tada jos yra prieinamos telomerazei. Gamtoje egzistuoja ir kitokie chromosomų ilgio užtikrinimo mechanizmai, kuriuose telomerazė nedalyvauja. Pvz., Diptera genties vabzdžiai, tarp jų ir vaisinė muselė Drosophila, neturi funkcionalios telomerazės. Drosophila chromosomos neturi ir eukariotų telomeroms įprastų kartotinių sekų. Jų chromosomų galuose yra dažniausiai dviejų tipų retrotranspozonai HeT- A ir TART. Veikiant retrotranspozonams, įterpiamos pasikartojančios sekos ir taip užtikrinamas stabilus chromosomų galų ilgis. Žmogaus ląstelės taip pat pasižymi gebėjimu užtikrinti stabilius chromosomų galus nenaudodamos telomerazės. Toks telomerų ilgio užtikrinimo mechanizmas yra vadinamas alternatyvuoju telomerų ilginimu, ALT (angl. alternative lengthening of telomeres). Įdomu, kad telomeros šiuo atveju taip pat yra ilginamos prijungiant telomerinius pasikartojimus, tačiau ilginimo mechanizmas kitoks. 227

228 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Analitiniai klausimai ir uždaviniai 1. Kuo rėmėsi Mezelsonas ir Štalis įrodydami, kad DNR biosintezė vyksta pusiau konservatyviuoju būdu? 2. Nubraižykite pausiau konservatyviuoju ir konservatyviuoju būdais vykstančios replikacijos schemas. 3. Kokia dažniausia priežastis, dėl kurios replikatyvinės DNR polimerazės į sintetinamą grandinę įjungia nekomplementarius nukleotidus? 4. Kokios yra DNR polimerazių aktyviojo centro delno domeno aspartatų funkcijos per katalizę? 5. Į greitai augančių ir besidalijančių bakterijų kultūrą pripilama radioaktyvų izotopą (H 3 ) turinčio timidino (DNR biosintezės pirmtako). Po kelių sekundžių augimas sustabdomas (perkeliant kultūrą į 4 C temperatūrą). Išskiriama bakterijų DNR, o H 3 izotopą turinčių DNR tankis tiriamas centrifuguojant cezio chlorido tirpalo koncentracijos gradiente. Iš ko bus sudaryta ši DNR? Pažymėkite teisingą atsakymą: 1. Daugiausiai iš ilgų DNR ir nedidelės dalies trumpų DNR molekulių. 2. Daugiausiai iš trumpų DNR ir nedidelės dalies ilgų DNR molekulių. 3. Vien tik iš radioaktyvų izotopą turinčių deoksinukleotidų. 4. Iš ilgų DNR molekulių. 6. Kodėl DNR III polimerazė yra tinkamesnė replikuoti E. coli chromosomą nei DNR I polimerazė? 7. Kuo panašūs ir kuo skiriasi replikacijos procesai bakterijose ir eukariotinėse ląstelėse? 8. Kokia yra TLS DNR polimerazių biologinė reikšmė? 9. Jūs atradote naują archėją Studentis lasiensis, kurios genomas yra ~ 1 Mb dydžio. Iškėlėte hipotezę, kad genome gali būti daugiau nei viena replikacijos pradžios sritis. Kaip tai eksperimentiškai patikrinsite? 10. Trumpai apibūdinkite, kaip apsisaugoma nuo priešlaikinės replikacijos iniciacijos bakterijų ir eukariotų organizmuose? 228

229 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Biologinė informacija, užkoduota DNR nukleotidų sekoje, pirmiausiai įrašoma į RNR molekulę, kuri sintetinama per transkripcijos procesą (lot. transcriptio perrašymas ). Kaip ir DNR, taip ir RNR molekulė yra linijinis polimeras, sudarytas iš monomerų ribonukleotidų (rgmp, ramp, rcmp, rump), sujungtų tarpusavyje fosfodiesteriniais ryšiais. Chemine sudėtimi RNR molekulė nežymiai skiriasi nuo DNR (žr. Įvadą ), o genetinės informacijos saugojimo principas nukleotidų seka RNR molekulėje yra toks pats, kaip ir DNR molekulėje. Tačiau, nors sudarytos iš panašių struktūrinių komponentų, RNR molekulės erdvinė struktūra labai skiriasi nuo dvigrandinės DNR spiralės struktūros. Sintetinamos RNR yra linijinės, vėliau jos įgyja įvairias erdvines struktūras, kurios lemia RNR molekulių funkcijas. Per transkripciją susintetinama RNR grandinė yra identiška vienai iš dviejų DNR duplekso grandinių koduojančiajai DNR grandinei. RNR molekulės nukleotidų seka skiriasi nuo koduojančiosios DNR grandinės nukleotidų sekos tuo, kad joje vietoje timidilo rūgšties (TMP) yra uridilo rūgštis (UMP). Transkripcija tai procesas, kurio metu pagal matricą DNR grandinę sintetinama jai komplementari RNR molekulė. Per transkripciją kaip matrica sintezei naudojama grandinė, komplementari koduojančiajai DNR grandinei, vadinama matricine DNR grandine RNR transkripcijos bendrieji bruožai RNR transkripcijos procesas pagrindiniais bruožais panašus į DNR sintezę. Transkripcija prasideda, kai fermentas, sintetinantis RNR, RNR polimerazė, prisijungia prie savitosios reguliacinės DNR srities, vadinamos promotoriumi (angl. promoter) (5.1 pav.). Promotorius dažniausiai išsidėstęs prieš struktūrinį geną. Struktūriniai genai koduoja baltymus ir RNR. Per transkripcijos iniciaciją DNR duplekso grandinės išskiriamos, o viena iš grandinių (matricinė) naudojama kaip matrica RNR sintezei. Kaip ir per DNR sintezę, RNR molekulės sintetinamos pagal komplementarumo nukleotidams DNR matricoje principą. Ribonukleozidtrifosfatas (rntp), komplementarus nukleotidui DNR matricoje, kovalentiniu ryšiu jungiamas prie sintetinamos RNR grandinės 3 OH galo. Reakcijos metu atsipalaiduoja pirofosfatas, PPi (5.1 pav.). Reakcija negrįžtama, nes atsipalaidavęs pirofosfatas yra hidrolizuojamas pirofosfatazės iki neorganinio fosfato (Pi). Taigi, reakcijos metu įvyksta nukleotidilgrupės pernaša. Tik viena iš dviejų DNR grandinių yra transkribuojama. 229

230 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA RNR transkripcija tam tikrais bruožais skiriasi nuo DNR replikacijos: zkitaip nei naujai sintetinamos dukterinės DNR grandinės, sintetinama RNR molekulė nesudaro ištisinio duplekso su matricos DNR. Nedidelis dupleksas tarp RNR ir DNR grandinių susidaro tik sintezės vietoje (transkripcijos burbule), o likusi susintetinta RNR molekulė išstumiama iš fermento; zsusintetintos RNR molekulės nėra tokios ilgos kaip genominės DNR molekulės, sintetinamos per replikaciją. Promotorius tai DNR nukleotidų seka, aktyvinanti transkripciją. RNR polimerazė prijungiama prie promotoriaus ir pradeda RNR sintezę. Promotoriaus sritis DNR molekulėje yra netoli pirmojo transkribuojamo DNR nukleotido (5.2 pav.). Nuo transkripcijos pradžios srities RNR polimerazė juda per DNR matricą, sintetindama RNR, kol pasiekia terminacijos sritį. 5.1 pav. RNR sintezės schema (G. Karp. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments, fifth edition, 2008) 230

231 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Transkribuojama sritis nuo promotoriaus (nuo +1) iki terminatoriaus vadinama transkripcijos vienetu. Transkripcijos vienetą gali sudaryti vienas transkribuojamas struktūrinis genas (tokie dažniausiai yra eukariotų genų Transkripcija vyksta 5 3 kryptimi. transkriptai), taip pat gali sudaryti daugiau transkribuojamų struktūrinių genų (prokariotų genų transkriptai). Nukleotidų sekos, išsidėsčiusios prieš pirmąjį transkribuojamą nukleotidą, vadinamos priešsrovinėmis (angl. upstream), o sritys, esančios už pirmojo transkribuojamo nukleotido, pasrovinėmis (angl. downstream) sritimis (5.2 pav.). DNR sekos dažniausiai žymimos užrašant tik koduojančiąją DNR seką. Nukleotidas, ties kuriuo prasideda transkripcija, žymimas +1. Nuo šio nukleotido skaičiuojami transkribuojamo geno nukleotidai. Jie žymimi pliuso (+) ženklu. Nukleotidai, esantys prieš pirmąjį transkribuojamą nukleotidą, žymimi minuso ( ) ženklu ir numeruojami didėjančia tvarka į kairę nuo +1 nukleotido (5.2 pav.). Nulinės ( 0 ) pozicijos nėra. Didžiąją dalį ląstelėse susintetintų RNR molekulių (transkriptų) sudaro genų, koduojančių baltymus, transkriptai informacinės RNR molekulės, irnr (angl. messenger RNA, mrna). irnr molekulės naudojamos kaip matricos baltymų biosintezei ribosomose. Mažesnę transkriptų dalį sudaro įvairios kitos RNR molekulės (trnr, rrnr, snrnr, snornr, mirnr, sirnr ir kt.), kurios nekoduoja baltymų, bet atlieka daugelį kitų funkcijų ląstelėje. RNR molekulės, sintetinamos transkripcijos metu ir iš karto po transkripcijos, vadinamos pirminiais transkriptais (pre-rnr). Ląstelėse greitai vyksta jų brendimas. Brendimo metu pirminiai transkriptai modifikuojami. Taip susidaro subrendusios irnr, rrnr, trnr ir kitos RNR. Veikiant reguliaciniams baltymams, nustatoma, ar vyks tam tikro geno transkripcija ar ne. Dažniausiai toks ir yra Transkripcija tai pirmoji genetinės informacijos raiškos (genų raiškos) pakopa ir svarbiausias genų raiškos valdymo taikinys. transkripcijos valdymo principas. Taigi, transkripcija dažniausiai valdoma iniciacijos etape. Tačiau transkripcijos procesą sudaro keli etapai, todėl yra galimybė valdyti transkripciją ir juose. 5.2 pav. Transkripcijos vienetas 231

232 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5.2. RNR polimerazių (RNAP) struktūra ir savybės Visi ląsteliniai organizmai transkripcijai pasitelkia specializuotus baltymus nuo DNR priklausomas RNR polimerazes, RNAP (angl. RNA polymerases). Bakterijų, archėjų, eukariotų RNR polimerazės yra konservatyvios struktūros baltymai, atliekantys panašias funkcijas. Jos priklauso daugiasubvienetinių RNAP šeimai (angl. multisubunit RNAP family). Manoma, kad RNR polimerazės kilo iš vieno bendro protėvio m. Rodžeriui Kornbergui (Roger Kornberg) skirta medicinos Nobelio premija už eukariotų RNR II polimerazės ir transkripcijos tyrimus m. pirmą kartą nustatyta archėjos (S. sulfolactarius) RNR polimerazės erdvinė struktūra. Bakterijose ir archėjose visų genų transkripcijai pasitelkiama viena RNR polimerazė. Eukariotų ląstelėse yra 4 7 RNR polimerazės, kurios dalyvauja skirtingų grupių genų transkripcijoje. RNAP sudarantys subvienetai skirstomi į kelias funkcines grupes: 1) subvienetai, reikalingi fermento susimontavimui; 2) subvienetai, kurie sudaro aktyvųjį centrą ir prijungia bei išdėsto DNR bei RNR molekules; 3) pagalbiniai subvienetai. Bazinėms RNAP funkcijoms užtikrinti užtenka pirmųjų dviejų grupių. Pagalbiniai subvienetai suteikia paviršius papildomoms sąveikoms su transkripcijos veiksniais. Archėjų ir eukarotų RNAP turi subvienetų, homologiškų bakterijų subvienetams. Tai yra polimerazių šerdiniai subvienetai, kurie sudaro fermento pagrindą ir aktyvųjį centrą (5.3 pav. ir 5.1 lentelė). Bakterijų, archėjų ir eukariotų RNR polimerazės yra dideli fermentai, kurių molekulinė masė gali siekti ~ Da. Pvz., eukariotų DNR I, II, III polimerazes sudaro net subvienetų. Bakteriofagams užtenka žymiai mažesnių fermentų. Kai kurių jų dydis atitinka, pvz., penktadalį eukariotinių RNR polimerazių dydžio. Nuo DNR priklausomos RNR polimerazės užtikrina šias funkcijas: z rntp jungimą; z fosfodiesterinio ryšio susidarymą; z pirofosfato atpalaidavimą; z fermento perstūmimą matricos atžvilgiu; z sintezės tikslumą; z kitas funkcijas. 5.3 pav. Bakterijų, archėjų ir eukariotų RNR polimerazių struktūrinė organizacija. Schemose tomis pačiomis spalvomis pažymėti konservatyvūs (šerdiniai) subvienetai 232

233 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.1 lentelė. Bakterijų, archėjų ir eukariotų RNAP baltyminiai subvienetai 1 Bakterijų RNR Pol Archėjų RNR Pol Eukariotų RNR Pol II Eukariotų RNR Pol III Eukariotų RNR Pol I Augalų RNR Pol IV Augalų RNR Pol V β subvienetas Rpo1 (RpoA) RPB1 C160 A190 NRPD1 NRPE1 β subvienetas Rpo2 (RpoB) RPB2 C128 A135 NRPD/E2 NRPD/E2 α subvienetas Rpo3 (RpoD) RPB3 AC40 AC40 NRB3 RPB3 α subvienetas Rpo11 (RpoL) RPB11 AC19 AC19 NRB11 RPB11 ω subvienetas Rpo6 (RpoK) RPB6 RPB6 RPB6 NRB6 NRB6 Rpo5 (RpoH) RPB5 RPB5 RPB5 NRB5 NRPE5 Rpo8 (RpoG) RPB8 RPB8 RPB8 NRB8 NRB8 Rpo10 (RpoN) RPB10 RPB10 RPB10 NRB10 NRB10 Rpo12 (RpoP) RPB12 RPB12 RPB12 NRB12 NRB12 Rpo4 (RpoF) RPB4 C17 A14 NRPD/E4 NRPD/E4 Rpo7 (RpoE) RPB7 C25 A43 NRPD7 NRPE7 Rpo13 (kai kurios) RPB9 C11 A12 NRPD9b RPB Transkripcija prokariotuose Bakterijų RNR polimerazės Bakterijose viena RNR polimerazė sintetina visas RNR: irnr (informacines RNR), trnr (pernašos RNR), rrnr (ribosomines RNR) bei kitas RNR molekules. Bakterijoje yra apie RNR polimerazės molekulių. Vienu metu transkripcijoje dalyvauja ~ fermento molekulių. Daugiasubvienetinių RNAP šeimoje bakterijų RNR polimerazės yra mažiausi (~ Da) fermentai. Bakterijų RNR polimerazės šerdinę dalelę (~ 400 kda) sudaro penki polipeptidai: β subvienetas, β subvienetas, du vienodi α subvienetai, α I ir α II, bei ω subvienetas (5.3 pav.). Stechiometrinę šerdinės dalelės RNAP sudėtį galima užrašyti taip: α 2 ββ ω. Bakterijų polimerazėje išskiriami du struktūriniai ir funkciniai vienetai šerdinė dalelė ir holofermentas Bakterijų RNR polimerazės šerdinė dalelė Bakterijų RNAP šerdinės dalelės erdvinė struktūra primena krabo žnyples (angl. crab claw) (5.5 pav., a). Tokia katalizinių subvienetų struktūra pasižymi ir archėjų bei eukariotų RNAP, tačiau pastarosios dar turi papildomų struktūrinių elementų. Du žnyplių čiuptuvai (angl. pincer) sudaro plyšį (angl. cleft), kurio viduje yra kanalas (5.5 pav., b). Kanalo skersmuo Å. Į jį patenka ir jame talpinama DNR. Pagrindinis kana- 1 Pagal: F. Werner, D. Grohmann. Nat Rev Microbiol,

234 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA las pereina į RNR išėjimo kanalą. Plyšio vidus yra išklotas teigiamai įkrautomis aminorūgščių liekanomis. RNR polimerazės išorėje gausu neigiamai įkrautų aminorūgščių liekanų. Plyšio gale yra RNR polimerazės aktyvusis centras. Aktyvųjį centrą supančios baltymų sritys yra konservatyvios įvairių organizmų RNR polimerazėse. Mg 2+ jonus riša trys asparto (Asp) aminorūgščių liekanos, kurios yra visiškai konservatyviame tarp RNR polimerazių aminorūgščių motyve NADFDGD. Šis motyvas yra didžiausiame β subvienete. Motyvo asparto aminorūgščių mutacijos yra letalios: mutacijų turintis fermentas sudaro kompleksą su DNR, tačiau nepasižymi kataliziniu aktyvumu (negali sintetinti RNR). Vienas Mg 2+ jonų yra nuolat prisijungęs prie aktyviojo centro, o kitas, greičiausiai, yra atnešamas su substratais. Didžiausias molekulės β subvienetas sudaro vieną čiuptuvą ir formuoja dalį plyšio (5.5 pav., b). Didieji RNAP β ir β subvienetai sudaro ~ 60 % šerdinės dalelės molekulinės masės ir visi kartu suformuoja katalizinį fermento centrą. RNR polimerazė nėra statiška struktūra. Nors β ir β subvienetų pagrindinės dalys sudaro gana nejudrią RNR polimerazės šerdį, fermento struktūroje yra judrių elementų. β subvieneto dalyje, esančioje priešais čiuptuvus, yra elementas, keičiantis savo padėtį, vožtuvas (5.5 pav., b) (angl. β subunit flap). Manoma, kad jis uždaro kanalą, kuriuo juda iš fermento išeinanti sintetinama RNR. Kai susintetintoje RNR susidaro terminacijos segtukai, kanalas atsidaro, transkriptas disocijuoja iš RNAP, įvyksta transkripcijos terminacija. β subvieneto, kuris formuoja vieną RNAP čiuptuvą, struktūroje yra gnybtas (angl. clamp). Kitas judrus RNAP elementas yra nedidelis β subvieneto aminorūgščių motyvas, vadinamas vairu (angl. rudder). Šio elemento funkcija, manoma, yra fiksuoti RNAP kanale matricinę DNR grandinę ir neleisti jai susijungti su išstumtąja koduojančiąja grandine (5.5 pav., b). β subvieneto vidinėje pusėje yra rifampicino kišenė. Čia prisijungia antibiotikas rifampicinas (ir kiti rifamicinai) ir slopina transkripcijos iniciaciją. Rifampicinas užtveria RNR kelią DNR-RNR hibride, kai RNR tampa 2 3 nt ilgio. 5.4 pav. Bakterijų RNR polimerazės sudėtis ir subvienetų funkcijos 234

235 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) RNAP molekulėje yra dar vienas kanalas antrinis kanalas (angl. secondary chanel), kurio forma primena piltuvą. Šiuo kanalu laisvi rntp patenka į RNR polimerazės aktyvųjį centrą. Kanalo skersmuo ~ Å. Panašus kanalas rastas ir archėjų bei eukariotų RNR polimerazėse. Antrinio kanalo pamate (β subvienete) yra du judrūs RNAP elementai BH spiralė (angl. bridge helix) ir TL kilpa (angl. trigger loop) (5.5 pav., b). Šie struktūriniai elementai labai svarbūs komplementarių nukleotidų atrankai aktyviajame centre, katalizei ir perstūmimui (angl. translocation). 5.5 pav. Bakterijų RNR polimerazės struktūra. Thermus aquaticus RNR polimerazės šerdinės dalelės (A) (kairėje) ir Thermus aquaticus RNR polimerazės holofermento (dešinėje) erdvinės struktūros, nustatytos didelės skyros rentgenostruktūrine analize. 1 2 čiuptuvai; 3 plyšys; rutuliukas žymi Mg 2+ joną (a); bakterijų RNR polimerazės holofermento struktūrinė schema. Elementai pažymėti atskirai. Žvaigždutė žymi katalizinį centrą (b) (Trends in Microbiology, v. 16, p. 126, 2008) 235

236 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Du vienodi bakterinės RNR α polimerazės subvienetai I ir II yra išsidėstę už plyšio (5.5 pav., a, b). α subvienetų dimeras lemia dviejų didžiųjų RNAP β ir β subvienetų išsidėstymą. α Ι subvienetas sąveikauja su β subvienetu, o α ΙΙ subvienetas sąveikauja su β subvienetu. α subvienetą sudaro du domenai: N galinis domenas (αντd), kuris yra atsakingas už sąveiką su individualiais β subvienetais, ir C galinis domenas (αctd), kuris yra atsakingas už α subvieneto sąveiką su promotorių DNR, taip pat už sąveiką su aktyvikliais bei represoriais, prisijungusiais prie promotorių. T4 bakteriofagui patekus į šeimininko (E. coli) ląstelę, kartu pakliūvantis fago fermentas ADP riboziltransferazė ribozilina vieno iš dviejų RNAP α subvienetų arginino aminorūgšties liekaną. Taip sumažinamas RNAP atrankumas genų promotoriams. Tai liudija, kad α subvienetas reikalingas atrankiam promotoriaus atpažinimui. Netoli RNAP čiuptuvo, kurį formuoja β subvienetas, yra išsidėstęs ω subvienetas. Nustatyta, kad Taq RNAP molekulėje ω subvienetas apsiveja apie β subvieneto C galą ir taip, manoma, padeda pritvirtinti β subvienetą prie likusios fermento dalies. Šio mažiausio RNR polimerazės subvieneto funkcija nėra iki galo išaiškinta. Manoma, kad jis galėtų pasižymėti šaperonų savybėmis. Bakterijų σ (sigma) veiksnys tai promotorių atrankumo veiksnys. Bakterijų RNR Pol šerdinė dalelė + σ veiksnys = RNR Pol holofermentas. Bakterijų RNAP sudėtyje esančiame β subvienete nustatytas Zn 2+ surišimo centras trys konservatyvios cisteino aminorūgščių liekanos vadinamasis cinko piršto (angl. zink finger) motyvas (5.5 pav., b). Manoma, kad Zn 2+ reikalingas susidaryti fermento erdvinei struktūrai ir tam tikroms RNAP funkcijoms. Taip pat RNAP paviršiuje nustatyta ~ 250 H 2 O molekulių. RNR polimerazės šerdinė dalelė, nors ir pasižymi kataliziniu aktyvumu, negali pradėti RNR sintezės ties genais. Tam reikia papildomo, atrankumą promotoriams lemiančio baltymo σ (sigma) veiksnio. Kartu su σ veiksniu šerdinė RNAP dalelė sudaro holofermentą. RNR polimerazių katalizuojama reakcija panaši į DNR polimerazių katalizuojamą reakciją. Skirtumas yra tas, kad RNR polimerazių reakcijoje dalyvauja ne dntp, bet rntp (5.1 pav.). Pirmieji į RNR jungiami nukleotidai paprastai yra purinai. Pirmasis RNR molekulės 5 gale esantis ribonukleotidas yra ribonukleozidtrifosfatas (ppp5 NpNpN3 ). Substratai rntp jungiami substratų surišimo srityje (i+1). Sintetinamos RNR 3 galas išsidėsto i srityje (5.7 pav., b). 5.6 pav. Transkripcijos burbulas 236

237 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) RNR sintezė vyksta transkripcijos burbule (angl. transcription bubble). Jame DNR grandinės yra laikinai išskirtos (5.6 pav.). Transkripcijos burbulas turi dvi viengrandinės DNR atkarpas ir jas ribojančias dvi dvigrandinės DNR atkarpas. Viengrandinių ir dvigrandinių DNR fragmentų susijungimo taškas yra vadinamas šakutės susikirtimo tašku (angl. fork junction). Vykstant RNR sintezei, transkripcijos burbulas juda kartu su polimeraze, o sintetinamos RNR grandinė ilgėja. RNR polimerazė išskiria DNR duplekso grandines priekyje, o už transkripcijos burbulo vėl susidaro DNR dupleksas. Tai yra daug energijos reikalaujantis procesas. Energija gaunama jungiant rntp substratus RNR sintezės metu. Transkripcijos burbulo dydis yra ~ 12±1 nukleotidų (5.6 pav.). DNR dupleksas, patenkantis į RNAP, ir iš jos išeinantis DNR dupleksas, sudaro ~ 90 kampą. RNAP viduje yra ~ 9 DNR-RNR hibrido nukleotidų poros ir ~ 9 DNR grandinės nukleotidai. RNAP sintetina RNR iš 5 galo į 3 galą. Reakcijos greitis yra ~ nt/s 37ºC temperatūroje. Klaidų dažnis 1 klaida/ nt. Bakterijose transkripcijos greitis maždaug sutampa su transliacijos greičiu (15 ar/s). Sintezės pradžioje pirmasis ir antrasis nukleotidai, ypač pirmasis, turi būti tiksliai išdėstyti fermento aktyviajame centre. RNAP sąveikauja su nukleotidais daugeliu tarpmolekulinių ryšių (5.7 pav., a, b). RNAP elementai TL kilpa ir BH spiralė svarbūs pirmojo nukleotido išdėstymui aktyviajame centre (5.6 pav., b). Kai aktyviajame centre prisijungia komplementarus nukleoti- DNR-RNR hibridas yra trumpas, sintezės metu jis susidaro vis iš naujo, o RNR transkriptas atsipalaiduoja kaip laisva molekulė. RNR polimerazės sintetina RNR molekulę de novo. Kitaip nei DNR polimerazėms, šiems fermentams pradmens nereikia; reikia tik DNR matricos. 5.7 pav. Bakterijų RNR polimerazės aktyviojo centro struktūra. Pagrindiniai Thermus thermophilus RNAP aktyviojo centro struktūriniai elementai. D743, D741, D739 β subvieneto konservatyvios asparto aminorūgščių liekanos. Raudona spalva pažymėtas laisvas rntp, žalia įjungtas rntp, violetiniai rutuliukai Mg 2+ jonai. Kitos β subvieneto aminorūgščių liekanos pažymėtos ruda spalva, β subvieneto pilka (a); tarpmolekuliniai ryšiai RNAP aktyviajame centre (b) (Trends in Microbiology, v. 16, p. 126, 2008) 237

238 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA das, TL kilpa netiesiogiai stimuliuoja katalizę, susidaro fosfodiesterinis ryšys. Tuomet TL kilpa pakeičia konformaciją taip, kad kitas nukleotidas nepakliūtų į aktyvųjį centrą, ir polimerazė pasislenka sintetinamo DNR-RNR duplekso atžvilgiu per vieną padėtį (įvyksta translokacija). Kai į RNR įjungiamas nekomplementarus nukleotidas, įvyksta transkripcijos pauzė. Prieš tai aprašytas procesas yra viena iš transkripcijos pauzių rūšių. RNR polimerazė grįžta atgal (angl. backtracking). RNR polimerazei judant atgal, susintetinto transkripto 3 galas išstumiamas iš aktyviojo centro per fermento antrinį kanalą (piltuvą), kuriuo patenka nukleotidai. Transkripto 3 galui užėmus kanalą, NTP nebepatenka į aktyvųjį centrą, todėl fermentas sustoja. Atsipalaidavusį transkripto galą pasiekia skėlimo veiksniai, kurie būna prisijungę netoli kanalo (pvz., GreA ir GreB baltymai bakterijose, TFIIS veiksnys eukariotuose). Jie skatina silpną nukleazinį RNR polimerazės aktyvumą, ir išstumtasis galas nuskeliamas. Nuskėlus išstumtąjį RNR galą, substratai vėl patenka į aktyvųjį centrą, trankripcija tęsiama toliau Bakterijų RNR polimerazių transkripcijos ciklas Transkripcijos procesas skirstomas į keletą etapų: z surandamas promotorius (promotoriaus atpažinimas); z prasideda RNR sintezė (iniciacija); z RNR polimerazė sintetina RNR molekulę (elongacija); z pasiekusi terminacijos signalą, transkripcija sustoja (terminacija). DNR promotoriaus atpažinimas (angl. promoter engagement). Bakterijų RNR polimerazės holofermentas, kurio sudėtyje yra σ veiksnys, atlieka promotoriaus atpažinimo funkciją (5.8 pav.). σ veiksnys atrankiai jungiasi prie tipinių promotoriaus sekų. Dėl šios sąveikos ties promotoriaus 10 sritimi išskiriamos DNR grandinės. Susidaro transkripcijos burbulas. Promotorių atpažįsta RNR polimerazės holofermentas šerdinė RNAP dalelė su vienu iš σ veiksnių. Vyksta grįžtamasis RNAP prisijungimas prie dvigrandinės DNR promotoriuje. Susidaro uždarasis RNAP ir promotoriaus DNR kompleksas, RP c (5.8 pav.). Fermentas uždengia promotoriaus sritį ~ nuo 50 iki +6 nukleotido. Šioje srityje DNR apsaugota nuo I deoksiribonukleazės (I DNazės) ir hidroksilo radikalų poveikio. RP c komplekse DNR grandinės yra susijungusios į dupleksą, transkripcijos burbulas dar nėra susidaręs. σ veiksnio struktūrinis elementas σ 3.2 kilpa išsidėsto RNAP pagrindiniame kanale, kur yra fermento aktyvusis centras (5.5 pav., b). Šiame transkripcijos etape DNR nėra išdėstyta fermento kanale, ji yra fermento išorėje (5.8 pav.). Toliau σ veiksnys išskiria DNR grandines promotoriaus 10 srityje (~ 11 +2). Susidaro atvirasis RNAP ir promotoriaus DNR kompleksas, RP o (5.8 pav.). E. coli σ 70 veiksnyje nustatytos bent trys konservatyvios aromatinių aminorūgščių liekanos, svarbios promotoriaus DNR išskyrimui. Jos, greičiausiai, prisijungia prie koduojančiosios grandinės 10 srityje. Pirmiausiai išskiriama promotoriaus A ir T nukleotidų pora 11 padėtyje. Išskyrimui nereikia ATP hidrolizės. Manoma, kad šiluminių virsmų ir trankripcijos komplekso vidinės energijos pakanka šiam procesui. 238

239 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Tuo pat metu ir RNAP vyksta erdvinės transformacijos. ~ 20 bp DNR, esanti prieš +1, išdėstoma RNAP fermento kanale, kur yra aktyvusis centras (5.8 pav.). Išskirtos DNR grandinės (transkripcijos burbulas) apima sritį ir yra pagrindiniame fermento kanale. +1 matricos nukleotidas tiksliai išdėstomas aktyviajame centre. Komplementarūs rntp išdėstomi pagal matricos +1 ir +2 nukleotidus. Iniciacija. Prasideda sintezė. Transkripcijos kompleksas virsta transkripcijos iniciacijos kompleksu, RP init (5.9 pav.). Per iniciaciją RNR polimerazė jungia į RNR pirmuosius nukleotidus. Ji lieka prisijungusi prie promotoriaus, kol nesusintetinami pirmieji ~ 9 nukleotidai. DNR pėdsakų analizės (angl. footprint analysis) metodu nustatyta, kad sintetindama transkriptą, RNR polimerazė beveik nejuda DNR atžvilgiu. Perėjimą iš iniciacijos fazės į sintezės fazę stabdo nutrūkstamoji iniciacija (angl. abortive innitiation). Nutrūkstamosios iniciacijos metu RNAP, nedisocijuodama nuo matricos, sintetina trumpus (~ 7 10 nt) transkriptus, atpalaiduoja juos, bet nenukrinta nuo matricos, po to pradeda RNR sintezę iš naujo. Iniciacijos etapas pasibaigia, kai fermentas susintetina ilgesnį nei 10 nt transkriptą. Tai sukelia σ veiksnio disociaciją iš holofermento. Disocijavus σ veiksniui, įvyksta RNR polimerazės atsilaisvinimas nuo promotoriaus (angl. promoter escape). Disocijavus σ veiksniui, RNAP struktūroje įvyksta pokyčių, įgalinančių ją palyginti lengvai judėti per DNR. Kartu fermentas sudaro su DNR labai tvirtą kompleksą, kuris gali vykdyti pro- 5.8 pav. Bakterijų RNR polimerazės transkipcijos ciklas: promotoriaus atpažinimas ir uždarojo bei atvirojo komplekso susidarymas. Skaičiais pažymėtos promotoriaus DNR padėtys transkripcijos pradžios nukleotido atžvilgiu (Trends in Microbiology, v. 16, p. 126, 2008) 239

240 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA cesyvią sintezę. Kol σ veiksnys tvirtai prisijungęs prie promotoriaus, matricos DNR negali laisvai judėti, ji suspaudžiama (angl. scrunching) pagrindiniame kanale ir už jo (5.9 pav.). RNR judėti trukdo ir kanale esanti σ veiksnio 3.2 kilpa. Tik susintetinus trumpą (~ > 10 nt ilgio) transkriptą, transkripcijos iniciacijos komplekse dėl susikaupusios vidinės energijos suyra ryšiai tarp σ ir DNR. σ disocijuoja, o RNR polimerazė atsiskiria nuo promotoriaus. Pastarųjų metų tyrimais nustatyta, kad σ veiksnys elongacijos metu gali ir nedisocijuoti nuo šerdinės dalelės. Tokiu atveju pakinta tik σ veiksnio sričių, kurios trukdo polimerazei sintetinti RNR, 3.2 srities ir 4 srities, sąveika. Elongacija. Visuose anksčiau minėtuose etapuose RNAP nebūna statiška struktūra, judrieji jos elementai keičia savo padėtis. Dėl vykstančių erdvinių pokyčių RNAP gali palyginti lengvai judėti ir sintetinti RNR. Transkripcijos elongacijos kompleksas, RP elong, arba TEC (angl. transcription elongation complex), palieka promotorių ir pradeda vykdyti procesyvią RNR sintezę (5.9 pav.). Fermento čiuptuvai uždaro kanalą, kuriame yra DNR ir sintetinti pradėta RNR molekulė. RNAP-DNR-RNR kompleksai yra labai stabilūs daugelis TEC kompleksų nedisocijuoja net esant 1 M KCl 65 C. Tokius trinarius RNAP-DNR-RNR kompleksus galima išskirti iš ląstelių. Per transkripcijos elongaciją tiek transkripcijos burbulo dydis, tiek DNR-RNR duplekso ilgis išlieka daugiau ar mažiau tokie pat. Vykstant RNR sintezei, DNR duplekso nukleotidų poros prieš polimerazę ir už jos išskiriamos ir vėl susijungia sinchroniškai. RNR sintezė vyksta, kol pasiekiama terminacijos sritis. Jeigu fermentas disocijuoja nuo DNR anksčiau, nei pasiekiama terminacijos sritis, transkripcija nutrūksta. Per elongaciją transkripcijos elongacijos kompleksas, veikiant cis ir trans veiksniams, yra lėtinamas (angl. pause) arba sustabdomas (angl. arrest). Dėl pauzių signalų transkripcijos elongacijos kompleksas virsta iš greitai sintetinančio komplekso alternatyvios konformacijos kompleksu, kuriame RNR sintezės greitis gali būti slopinamas eilėmis. Sustabdytas transkripcijos elongacijos kompleksas grįžta atgal ir gali tęsti sintezę toliau. Pauzės gali veikti kaip saviti reguliaciniai signalai, kurie reikalingi RNAP sąveikai su reguliacinėmis molekulėmis. Tokių transkripcijos pauzių pavyzdžiu gali būti pauzės, susidarančios dėl plaukų segtukų RNR struktūrų E. coli ir S. typhimurium aminorūgščių biosintezės genų transkriptų lyderinėse sekose. Ties plaukų segtuku, transliuodamos lyderinę seką ir suardydamos segtuką, užstrigusią RNR polimerazę išlaisvina ribosomos. Individualios RNR polimerazių molekulės pasižymi skirtingomis savybėmis įveikti transkripcijos pauzes. Kai transkripcijos elongacijos kompleksas palieka promotorių, prie jo gali prisijungti kitas RNAP holofermentas. Procesų, vykstančių per iniciaciją, greitis lemia, kaip greitai bus toliau ilginama sintetinti pradėta RNR ir kaip greitai RNAP paliks užimtą promotorių (angl. promoter clearance), kad prie jo galėtų prisijungti kita RNAP holofermento molekulė. Procesų greitį nulemia transkripcijos komplekso komponentų tarpusavio sąveika, o kai kuriais atvejais įtakos turi ir papildomi veiksniai. Pvz., RNR skėlimo veiksniai GreA ir GreB baltymai in vitro stimuliuoja RNAP atsilaisvinimą nuo kai kurių promotorių, vykdydami nutrūkstamosios iniciacijos procesą. RNR polimerazės nebegali vėl ilginti atsipalaidavusių transkriptų. 240

241 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.9 pav. Bakterijų RNR polimerazės transkipcijos ciklas: iniciacija ir elongacija. Skaičiais pažymėtos promotoriaus DNR nukleotidų padėtys (Trends in Microbiology, v. 16, p. 126, 2008) Terminacija. Terminacija įvyksta, kai RNAP prieina savituosius terminacijos signalus, disocijuoja iš transkripcijos komplekso ir RNR sintezė nutrūksta. Terminacijos signalai daro įtaką transkripcijos komplekso stabilumui. Dėl jų veikimo kompleksas disocijuoja per kelias sekundes. Kai kuriuose terminatoriuose gali būti papildomų reguliacinių signalų, įgalinančių RNAP tęsti transkripciją (t. y. vykdyti antiterminaciją). Transkripcijos terminaciją taip pat gali įvairiais būdais valdyti (aktyvinti arba slopinti) baltyminiai veiksniai Bakterijų promotorių atpažinimas Šerdinė RNAP dalelė pasižymi nedideliu giminingumu (angl. affinity) DNR molekulei. Prisijungus šerdinei RNAP, DNR molekulėje neįvyksta jokių pokyčių. Tokios prisijungimo sritys vadinamos silpnomis RNAP prisijungimo sritimis. Prisijungęs prie šerdinės RNAP, σ veiksnys esmingai pakeičia jos giminingumą DNR molekulei. σ veiksnys sąveikauja su šerdine RNAP dalele, sudarydamas ryšius su jos β ir β subvienetais 5.10 pav. Bakterijų σ 70 šeimos transkripcijos veiksnių struktūra (J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013) 241

242 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA (5.5 pav.). σ veiksnys, prisijungęs prie šerdinės RNAP, labai padidina RNAP giminingumą promotorių DNR. Tiesa, RNAP asociacijos su įvairiais promotoriais konstantos gali svyruoti nuo 10 6 iki Sąveikoje su promotoriumi taip pat dalyvauja ir RNR polimerazės α subvienetai. Sritys, su kuriomis vyksta sąveika, buvo nustatytos bakterijų genų promotorių mutacinės analizės būdu, o sąveika su promotoriaus DNR patvirtinta rentgenostruktūrine analize. Bakterijų genų promotorių elementai koduojančiojoje σ veiksnio sudėtyje esantys konservatyvūs motyvai sąveikauja su savitosiomis sritimis promotoriaus DNR; ši sąveika nulemia RNAP išsidėstymą transkripcijos pradžios nukleotido atžvilgiu. DNR grandinėje, lemiantys RNR polimerazės holofermento, kurio sudėtyje yra pagrindinis σ (E. coli σ 70 ) veiksnys, prisijungimą ties promotoriaus DNR ir transkripcijos proceso iniciaciją, yra šie (5.10 pav.): z heksamerinis nukleotidas, esantis prieš transkripcijos pradžios nukleotidą 10 srityje ( 10 sritis); z heksamerinis nukleotidas, esantis prieš transkripcijos pradžios nukleotidą 35 srityje ( 35 sritis); z sritis tarp 10 ir 35 sričių (jungtukas); za ir T nukleotidų gausi DNR sritis, esanti nt prieš transkripcijos pradžios nukleotidą (UP elementas); z +1 transkripcijos pradžios nukleotidas σ (sigma) veiksnys ir jo reikšmė bakterijų RNAP transkripcijai RNAP holofermente σ veiksnys užtikrina bakterijų RNR polimerazės prisijungimą prie promotorių DNR. σ veiksnių įvairovė bakterijose didelė. Pvz., Mycoplasma genitalia turi 1, Escherichia coli 7, o Streptomyces celicolor net 60 veiksnių. Kiekviena bakterinė ląstelė turi pagrindinį σ veiksnį, kuris dalyvauja genų, reikalingų normaliam jos augimui, transkripcijoje, ir keletą ar daugiau alternatyvių σ veiksnių. Pastarieji pasitelkiami genų, kurių raiška aktyvinima įvairių aplinkos veiksnių, transkripcijai. Tokių veiksnių sintezė ir kiekis ląstelėje, sąveika su RNR polimeraze yra valdomi. Daugelis bakterijų σ veiksnių (išskyrus σ 54 ) priklauso vadinamajai σ 70 šeimai ir struktūrine organizacija yra panašūs į E. coli σ 70 veiksnį. Šeimai priklausantys baltymai turi keturias lanksčiomis baltymų grandinėmis sujungtas struktūrines sritis σ 1.1, σ 2, σ 3 ir σ 4, kuriose yra konservatyvių aminorūgščių liekanų, svarbių sąveikai su promotorių elementais (5.10 pav.). 2, 3 ir 4 sritys dar skirstomos į atskiras funkciškai svarbias posrites. 1.1 sritis atlieka autoslopinimo funkciją ir neleidžia σ veiksniui, esančiam ne RNAP holofermento sudėtyje, atrankiai prisijungti prie genų promotorių. 1.1 sritis būdinga tik pagrindiniams transkripcijos veiksniams, alternatyvūs σ veiksnio σ 2 sritis sąveikauja su promotoriaus 10 sritimi, o σ 4 sritis su 35 sritimi. 242

243 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.11 pav. Bakterijų RNAP holofermento sąveika su promotoriumi. αctd α subvieneto C galinis domenas; αntd α subvieneto N galinis domenas (J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013) veiksniai jos neturi. Autoslopinimas panaikinamas, σ veiksniui prisijungus prie RNAP šerdinės dalelės. Holofermente 1.1 sritis keičia savo padėtį ir išdėstoma fermento kanale (5.5 pav., b). Manoma, kad toks domeno išdėstymas įmanomas dėl neigiamo 1.1 srities krūvio (elektrostatinės sąveikos su RNAP baltymais). Neigiamai įkrauta baltymo sritis imituoja neigiamai įkrautą DNR, kuri vėliau ir išdėstoma šiame kanale. Kai susidaro atvirasis RNAP-DNR kompleksas (t. y. vyksta iniciacija), ši σ sritis išstumiama iš fermento. Panašia sąveika aiškinamas ir 1.1 srities vykdomas autoslopinimas laisvame σ veiksnyje: σ 1.1 imituoja DNR ir sąveikauja su tomis σ sritimis, kurioms būdinga sąveika su neigiamai įkrauta DNR molekule (σ 2 ir σ 4 sritimis). Rentgenostruktūrine analize nustatyta, kad sąveikos vietoje DNR yra lenkiama apie σ 4 srities spiralės-posūkio-spiralės motyvą. Tai pakeičia DNR trajektoriją, ir labiau nutolusios promotoriaus sritys (pvz., UP elementas) priartėja prie RNAP, kad pastaroji galėtų sąveikauti su šiais elementais (5.8 pav.). Tokiu būdu skatinama transkripcijos iniciacija. σ posritė atpažįsta 10 sritį promotoriaus DNR (greičiausiai, dvigrandinės formos). σ posritės dalyvavimas yra svarbiausias išskiriant promotoriaus DNR grandines transkripcijos iniciacijos metu. RNR polimerazė turi rasti tam tikrus promotorius visame bakterijos genome, pvz., ~ 60 bp promotorių visame > 4 x 10 6 bp E. coli genome. Manoma, kad holofermentas skenuoja DNR viena kryptimi arba šokinėja keisdamas sekas trimatėje erdvėje. Kai σ veiksnys atsiskiria nuo holofermento, jis gali prisijungti prie kitos RNAP molekulės. Didžioji dalis šerdinių RNAP dalelių sąveikauja su mažai giminingomis DNR sritimis, laisvų dalelių ląstelėje nėra daug. σ veiksnio molekulių užtenka maždaug trečdaliui RNAP šerdinių dalelių. Maždaug pusė šerdinių RNAP dalelių vienu metu transkribuoja genus ir yra elongacijos fazėje Bakterijų promotorių tipinės sekos Kaip seka, kurią turi atpažinti transkripcijoje dalyvaujantys savitieji baltymai, promotorius skiriasi nuo sekų, kurios yra tik transkribuojamos arba tik transliuojamos. Šioje DNR sekoje yra informacija apie promotoriaus funkcijas: seka yra signalas. Taigi, promotorių sekos veikia kaip cis signalai. 243

244 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Palyginus daugybę prieš bakterijų struktūrinius genus esančių DNR sričių, nustatyta, kad daugelis jų prieš +1 transkripcijos nukleotidą yra konservatyvios. Tai yra trumpos sekos, svarbios σ subvieneto sąveikai su promotoriaus DNR. Jos vadinamosios tipinėmis (angl. consensus) sekomis. Genų promotoriams būdingos trumpos tipinės nukleotidų sekos, esančios tam tikrose padėtyse. Genų promotoriuose, kuriuos atpažįsta E. coli RNAP holofermentas, savo sudėtyje turintis σ 70, yra šios konservatyvios sritys: z transkripto pradžios +1 nukleotidas (dažniausiai (> 90 % atvejų) tai yra purino nukleotidas); z 10 srities nukleotidų tipinė seka TATAAT; z 35 srities nukleotidų tipinė seka TTGACA; z nukleotidų ilgio atstumas tarp 10 ir 35 srities (> 90 % atvejų optimalus atstumas sudaro 17 nukleotidų). Nepaisant gana didelio konservatyvumo, genų promotorių sekos yra skirtingos. Taip yra todėl, kad tipinės sekos lemia promotorių stiprumą (angl. promoter strenght), t. y. transkripcijos iniciacijų skaičių per laiko vienetą. Evoliucijos procese tipinės sekos susidarė taip, kad atitiktų vieno ar kito geno transkripcijos poreikius. Genų, koduojančių RNR ir baltymus, kurių ląstelei reikia didžiulių kiekių (pvz., rrnr ir ribosominių baltymų), promotoriai daug stipresni nei tų, kurių produktų reikia nedaug. Genų, turinčių silpnus promotorius, transkripcijai aktyvinti pasitelkiami kiti valdymo būdai, pvz., įtraukiami baltymai transkripcijos aktyvikliai. Jei ląstelės adaptacijai prie pasikeitusių aplinkos sąlygų reikia genų produktų, pagrindinį E. coli σ veiksnį (σ 70 ) RNAP holofermente gali pakeisti kiti σ veiksniai. E. coli, be σ 70 veiksnio, nustatyti dar šeši σ veiksniai, kurie pasitelkiami bakterijos genų transkripcijai tam tikromis aplinkybėmis (5.2 lentelė). Kiekvienas iš veiksnių atpažįsta skirtingas promotorių klases. 5.2 lentelė. E. coli ląstelės σ veiksniai ir jų atpažįstamų promotorių tipinės sekos σ veiksnys σ 70 Sąlygos, kada naudojamas transkripcijai Įprastomis augimo sąlygomis, kai transkribuojami namų ūkio genai (angl. housekeeping) 10 srities tipinė seka 35 srities tipinė seka Jungtukas tarp 10 ir 35 sričių TATAAT TTGACA bp σ 32 (σ H ) Temperatūrinis šokas CCCGATNT CCCTTGAA bp σ 38 (σ S ) Stacionari augimo fazė TATAAT TTGACA bp σ 24 (σ E ) Temperatūrinis šokas YCTGA GAA 16 bp σ 54 (σ N ) Azoto apykaita TTGCA CTGGNA 6 bp σ 28 (σ F ) Žiuželių sintezė GCCGATAA CTAAA 15 bp σ 18 (σ FccI ) Geležies citrato transportas Nenustatyta Nenustatyta Nenustatytas Pagrindinio σ 70 veiksnio E. coli ląstelėje yra daugiausiai ~ molekulių, kitų žymiai mažiau. Pvz., σ E ir σ F veiksnių yra tik po keletą molekulių ląstelėje. 244

245 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Transkripcijos terminacija bakterijose Kai RNAP, sintetindama RNR, pasiekia savituosius terminacijos signalus, ji sustoja, transkripcijos kompleksas disocijuoja. Tam, kad įvyktų transkripcijos terminacija, vandeniliniai ryšiai, kuriais prie transkripcijos komplekso yra prijungtas DNR-RNR hibridas, turi būti suardyti, o transkripcijos burbulo vietoje turi vėl susidaryti DNR dupleksas. Bakterijų, taip pat ir bakteriofagų nukleotidų sekos, reikalingos terminacijos reakcijai įvykti, vadinamos transkripcijos terminatoriais, arba transkripcijos terminacijos signalais. Skirtingi terminatoriai skirtingu veiksmingumu stabdo transkripciją, kai kurių jų veikimas priklauso nuo papildomų baltyminių veiksnių. Bakterijų genų transkripcijos terminatoriai skirstomi į dvi grupes: znuo veiksnių nepriklausomi transkripcijos terminatoriai transkripcijos terminatoriai, kurių veikimui nereikia jokių papildomų baltyminių veiksnių. Jie dar vadinami vidiniais terminatoriais (angl. intrinsic terminators); z nuo Rho baltymo priklausomi transkripcijos terminatoriai (angl. Rho dependent terminators). 1 grupei priklausantys transkripcijos terminacijos signalai yra koduojami DNR ir pasižymi šiomis struktūrinėmis savybėmis: z transkripcijos terminacijos signalai sudaryti iš invertuotų G ir C gausių nukleotidų sekų ir už jų esančios T gausios nukleotidų sekos; z susintetinus terminatoriaus RNR, G ir C gausus invertuotas pasikartojimas sudaro antrinę RNR plaukų segtuko struktūrą netoli RNR 3 galo (5.12 pav., a); zuž plaukų segtuko RNR molekulėje susintetinamas U nukleotidų ruožas pačiame transkripto 3 gale. U nukleotidų ruože tam tikruose terminatoriuose gali būti įsiterpusių kitų nukleotidų (5.12 pav., a). RNR molekulėje plaukų segtuko struktūros stiebo dalis netoli pamato yra gausi G ir C nukleotidų porų. Tipiškas atstumas tarp segtuko stiebo ir U ruožo yra 7 9 nukleotidai. Taškinės mutacijos, panaikinančios transkripcijos terminaciją bakterijose, genome nustatomos būtent segtuko stiebo srityje. Bioinformatine analize nustatyta, kad E. coli ~ 80 % terminatorių RNR yra vidiniai terminatoriai. Tačiau kai kuriose kitose bakterijose ir archėjose nėra tokio tipo terminatorių. Kaip vidinis terminatorius stabdo transkripciją? Manoma, kad terminacija prasideda sintezės vietoje suirus nestabiliam DNR-RNR hibridui (da-ru). RNR polimerazė sustabdoma. Tokia pauzė yra gana įprasta ir elongacijos metu, tačiau tada RNR polimerazė grįžta atgal. Sustojus polimerazei terminacijos atveju, susintetintame RNR fermento RNR išėjimo kanale susidaro plaukų segtuko struktūra. Manoma, kad jos susidarymas skatina beveik visiškai suirti DNR-RNR hibridą, esantį RNR polimerazėje. Tai atidaro RNR išėjimo kanalą. RNR disocijuoja, transkripcija sustabdoma. Egzistuoja ir kitokių transkripcijos stabdymo mechanizmų. 245

246 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Per transkripcijos elongaciją TEC kompleksas taip pat gali būti sustabdomas į terminatorius panašių struktūrų, susidarančių RNR molekulėje. Tokiose struktūrose atstumas tarp segtuko ir U ruožo yra didesnis nei įprastuose terminatoriuose t. y nukleotidų. Ties tokia struktūra RNAP sustoja, grįžta atgal, o atsipalaidavęs U gausus transkripto 3 galas nuskeliamas. RNR polimerazė toliau tęsia transkripciją. Prokariotai pasitelkia ir kitą nuo Rho baltymo priklausomą transkripcijos terminacijos būdą. Rho yra gyvybiškai svarbus baltymas daugelyje bakterijų. Manoma, kad ~ 20 % E. coli trankriptų terminacija vyksta dalyvaujant Rho. Rho baltymas yra homoheksamerinės struktūros (6 x 46,8 kda). Tai yra nuo ATP priklausoma translokazė, kuri pasitelkia ATP hidrolizę judėjimui išilgai RNR. Kaip translokazė, ji galėtų arba ištraukti RNR iš transkripcijos komplekso, nustumti RNR polimerazę, arba jos helikazinis aktyvumas galėtų išskirti DNR-RNR hibridą. Rho veikimo būdas dar yra tiriamas pav. Transkripcijos terminacijos būdai prokariotuose. Vidinis terminatorius. Dešinėje vidinio terminatoriaus antrinė struktūra, plaukų segtuko struktūra pažymėta apskritimu (a); transkripcijos terminacija dalyvaujant Rho veiksniui. Dešinėje hipotetinis RNR judėjimo Rho helikaze modelis. Mėlyna spalva pažymėtos RNR jungimo sritys, raudona spalva ATPazės domenai (b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 246

247 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Tam, kad Rho galėtų funkcionuoti, jis turi prisijungti prie ne mažiau kaip ~ nukleotidų ilgio viengrandinės antrinių struktūrų neturinčios RNR molekulės rut (angl. Rho utilization) srities. rut srities sekose yra gausu pirimidinų (C) nukleotidų, tačiau dar nėra išaiškinta tokių sekos savybių svarba Rho veikimui. Rho veikia ties netransliuojamomis, t. y. ribosomų neuždengtomis arba baltymų neuždengtomis RNR, sritimis. Rho prisijungus prie rut srities, RNR pakliūva į baltymo vidų, ją prijungia RNR surišantys Rho baltymo subvienetų domenai. Aktyvinama Rho helikazė (5.11 pav., b). Dėl ATP hidrolizės, RNR juda (5 3 kryptimi) išilgai baltymo ir taip Rho priartėja prie stabtelėjusios RNR polimerazės. Veikdamas kaip translokazė ar helikazė, Rho baltymas sukelia transkripcijos terminaciją tais atvejais, kai dėl tam tikrų priežasčių ribosomos negali tuoj pat transliuoti susintetinto transkripto ir jis lieka neuždengtas ribosomų. Įprastais atvejais prokariotuose transkripcija ir transliacija vyksta sinchroniškai, ties susintetintu transkriptu tuoj pat prisijungia ribosomos, ir Rho baltymui tarp RNR polimerazės ir ribosomos nebelieka laisvos RNR, ties kuria jis galėtų prisijungti. Sintetinant transkripto galą veikia kitoks mechanizmas. Kai ribosoma prieina transliacijos STOP kodoną, ji stabteli. Tuo metu RNR polimerazė dar sintetina RNR. Susidaro RNR fragmentas, neuždengtas ribosomų, ties kuriuo ir prisijungia Rho. Rho neaktyvus ir nesukelia transkripcijos terminacijos tų genų, kurie nekoduoja baltymų, pvz., trnr genų, nors ties jų transkriptais nesijungia ribosomos. trnr genų transkriptai greitai įgyja erdvinę struktūrą, kuri nepasižymi viengrandinėmis sritimis, pakankamomis prisijungti Rho ir jį aktyvinti. Rho baltymo kristalo rentgenostruktūrinė analizė suteikė informacijos, kaip Rho baltymas galėtų prisijungti ties RNR. ~ 60 nukleotidų RNR sritis uždengiama ir apsaugoma nuo nukleazių poveikio. Tokio ilgio RNR fragmento užtenka sąveikai su Rho baltymu in vitro. Šeši identiški Rho subvienetai sudaro žiedą, tačiau jame yra plyšys, per kurį į vidų gali patekti RNR. Įdomu, kad Rho heksamere atskirų subvienetų sritys, kurių reikia sąveikai su RNR, yra išsidėsčiusios taip, kad RNR vinguriuoja per šias sritis Rho heksamere (5.11 pav., b). Pirmosios 125 N galinės Rho aminorūgštys sudaro atskirą domeną, kuris jungiasi prie C nukleotidų turinčios RNR ir DNR sričių. Likusiame 290 aminorūgščių fragmente yra ATP prijungimo sritis. Įdomu, kad Rho gali prijungti tiek C gausią RNR, tiek DNR, tačiau helikazinis aktyvumas pasireiškia tik prijungus RNR. Manoma, kad prijungus RNR, pakinta ATP surišančių domenų konformacija, ir tai aktyvina ATP hidrolizę Transkripcija eukariotuose Kitaip nei bakterijose, eukariotų ląstelėse RNR sintetina kelios RNR polimerazės. Didžiąją dalį RNR sintetina trys RNR polimerazės: z rrnr sintetina RNR I polimerazė; z irnr sintetina RNR II polimerazė; z trnr, 5S rrnr ir kai kurias mažas RNR sintetina RNR III polimerazė. 247

248 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Archėjose, panašiai kaip ir bakterijose, RNR sintetina viena RNR polimerazė. Ji panaši į eukariotų RNR II polimerazę m. nustatyta archėjų RNR polimerazės struktūra. Žydinčiuose augaluose nustatytos dar dvi branduolio RNR polimerazės RNR IV ir V polimerazės. RNR IV polimerazė sintetina mažas RNR endogenines sirnr, kurios yra svarbios genų raiškos slopinimui. RNR V polimerazė dalyvauja nuo transkripcijos priklausomo DNR metilinimo procese. Eukariotuose taip pat yra mitochodrijų ir chloroplastų RNR polimerazių. Visos eukariotinės RNR polimerazės yra dideli daugiasubvienetės struktūros baltymai, kurių molekulinė masė siekia 500 kda. Paprastai tokios polimerazės turi subvienetų. RNR I ir II polimerazių transkribuojamų genų promotoriai išsidėstę prieš transkripcijos pradžios nukleotidą, tačiau tam tikrų RNR III polimerazės transkribuojamų genų promotoriai yra genų viduje, t. y. už transkripcijos pradžios nukleotido. Kiekvienas promotorius, panašiai kaip ir prokariotų genų promotoriai, turi įvairių nukleotidų sričių, kurias atpažįsta savitieji transkripcijos veiksniai. Taigi, eukariotų organizmuose genų promotorius atpažįsta transkripcijos veiksniai, o ne RNR polimerazės. Prisijungę ties promotoriais, transkripcijos veiksniai sukuria struktūrą, prie kurios po to jungiama RNR polimerazė. Prijungti RNR I ir III polimerazes reikia palyginti nedaug transkripcijos veiksnių jie atpažįsta nedaug skirtingų promotorių. Tačiau šių polimerazių sintetinami transkriptų kiekiai yra dideli. Pvz., rrnr molekulių yra ~ kopijų ląstelėje (~ 50 % visos RNR). Genų, kuriuos transkribuoja RNR II polimerazė, transkriptai yra daug įvairesni. Daugelyje eukariotinių ląstelių sintetinama ~ skirtingų irnr. Transkripcijos veiksnių, kurie užtikrina promotorių atpažinimą, taip pat yra labai daug > Eukariotų RNR polimerazės Erdvinės bakterijų ir eukariotų RNR polimerazių struktūros bei jų katalizuojamos reakcijos yra panašios, bet transkripcijos procesuose yra skirtumų. Bakterijų RNR polimerazė (su vienu iš s veiksnių) gali inicijuoti transkripciją in vitro nedalyvaujant pagalbiniams baltymams. Eukariotų RNR polimerazėms inicijuoti transkripciją reikia savitųjų transkripcijos veiksnių, kurie prisijungia prie promotoriaus. Tam, kad eukariotuose prasidėtų transkripcija, reikia išpakuoti chromatiną. Čia svarbų vaidmenį atlieka chromatiną pertvarkantys kompleksai ir histonų acetilinimas. Trys pagrindinės eukariotų RNR polimerazės lokalizuotos skirtingose eukariotų ląstelės branduolio vietose. RNR I polimerazė sutelkta savitoje branduolio struktūroje branduolėlyje (angl. nucleolus), kur sintetina rrnr pirmtaką ilgą, ~ 47S pre-rrnr. Toliau vyksta pre-rrnr brendimas, susidaro funkcionalios rrnr molekulės 28S rrnr, 5,8S rrnr ir 18S rrnr. RNR I polimerazės sintetinamos RNR kiekis yra didžiausias. RNR II polimerazė yra sutelkta nukleoplazmoje. Ji sintetina vadinamąją heterogeninę branduolio RNR (hnrnr), t. y. irnr molekulių pirmtakus. RNR I ir II polimerazės susintetina didžiąją dalį ląstelės RNR. RNR III polimerazė taip pat yra nukleoplazmoje. Ji sintetina trnr, 5S rrnr bei kitas mažas RNR. 248

249 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Pagrindinės eukariotų RNR polimerazės pasižymi skirtingu jautrumu α amanitinui. α amanitinas yra oktapeptidas, sintetinamas žalsvojoje musmirėje Amanita phalloides (5.13 pav., a). RNR I polimerazė yra nejautri α amanitinui. RNR III polimerazė skirtinguose organizmuose pasižymi skirtingu jautrumu šiam junginiui: gyvūnų ląstelių RNR Pol III yra labai jautri, o mielių ir vabzdžių nejautri. RNR II polimerazė yra labai greitai slopinama α amanitinu. α amanitino poveikis ląstelėms, apsinuodijus A. phalloides, pasireiškia ne iš karto, bet po dienos ar dviejų, kai ima trūkti naujų irnr, reikalingų baltymų biosintezei. α amanitinas slopina RNR Pol II transkripcijos elongacijos procesą prisijungdamas netoli fermento aktyviojo centro ir blokuodamas DNR-RNR perstūmimo procesą (5.13 pav., b) pav. α amanitinas ir jo veikimo būdas. α amanitino struktūra (a); mielių RNR II polimerazės ir α amanitino, prisijungusio netoli aktyviojo centro, komplekaso struktūra, nustatyta 2,8 Å skyros rentgenostruktūrine analize. Raudona spalva pažymėtas α amanitinas. Raudonas rutuliukas Mg 2+ jonas, mėlyni rutuliukai Zn 2+ jonai (b) (PNAS, v. 99, p. 1218, 2002) Detaliau aptarsime eukariotų RNR polimerazes ir jų transkribuojamų genų promotorius RNR I polimerazės transkripcijos kompleksas RNR I polimerazė sintetina geno, kuris koduoja rrnr pirmtaką, transkriptą pre-rrnr. Transkripcijos veiksniai, dalyvaujantys RNR Pol I transkripcijoje, atpažįsta vieno tipo promotorių. Ląstelėms reikia didžiulio kiekio ribosomų, todėl rrnr pirmtako genome yra šimtai geno kopijų. Tam tikrais atvejais rrnr genų kopijų skaičius genome gali padidėti tūkstančius kartų, pvz., amfibijų, žuvų ovogenezės metu, kai ląstelės dalijasi labai greitai ir reikia didelio kiekio rrnr. Šių organizmų rrnr pirmtaką koduojantys genai labai tinkamas objektas tirti rrnr transkripciją ir brendimą. RNR I polimerazė sintetina rrnr pirmtako RNR pre-rrnr. Ribosominės RNR pirmtaką koduojantys genai susitelkę tam tikrose kelių chromosomų vietose rrnr pirmtako genų sankaupose. Šios sankaupos yra vadinamos branduolėlio organizavimo sritimis, NOR (angl. nucleolar organizer regions). Jų skaičius organizmuose skiriasi. 249

250 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Žmogaus ląstelėse yra penkios tokios sritys. Kiekviena sritis yra skirtingoje chromosomoje (haploidiniame genome). NOR sritys per interfazę sudaro ypatingą branduolio struktūrą branduolėlį, kur vyksta rrnr pirmtako genų transkripcija ir pre-rrnr transkriptų brendimas. Branduolėlis turi aiškią struktūrą, matomą optiniu mikroskopu. Pre-rRNR sintezės vietoje iš karto montuojasi būsimų ribosomų subvienetai, telkiami rrnr brendimo veiksniai. Tai suteikia branduolėliui savitą pavidalą. Skirtingų eukariotinių organizmų rrnr genų promotorių nukleotidų sekos skirtingos, tačiau reguliacinės sritys konservatyvios visuose organizmuose nuo mielių iki žmogaus. Reguliacinės sritys konservatyvios netgi afrikietiškoje tripanosomoje, kur vieninteliu žinomu atveju RNR Pol I sintetina ne tik pre-rrnr, bet ir dar du baltymus koduojančių genų transkriptus. Pre-rRNR pirmtako transkripcijos vienete rrnr išsidėsčiusios tokia tvarka: 18S, 5,8S ir 28S (5.14 pav., a b). Pirmtakus koduojantys genai, kaip minėta, sudaro dideles sankaupas. Genus skiria tarpgeniniai tarpai, IGS (angl. intergenic spacer). Jie netranskribuojami (5.14 pav). Tarpgeniniuose tarpuose yra rrnr pirmtako genų promotoriai. Žmogaus ląstelėse tarpgeniniai tarpai gali siekti iki 30 kb. Promotorių sudaro dvi pagrindinės reguliacinės sritys: šerdinis promotorius ir UCE sritis. Šerdinį (angl. core) promotorių sudaro ~ 50 nukleotidų sritis ( ), persiklojanti su transkripcijos pradžios sritimi (5.15 pav.). Jis yra būtinas bei pakankamas daugelyje organizmų inicijuoti rrnr transkripciją. Šerdiniame promotoriuje yra transkripcijos pradžios nukleotidas. Šerdinis promotorius turi tik vieną konservatyvų elementą ribosominį iniciatorių, rinr. rinr sritis pasižymi A ir T nukleotidų gausa pav. Ribosominių RNR pirmtako (pre-rnr) transkripcija branduolėlyje. rrnr pirmtako geno sankaupa (a); rrnr pirmtako geno ir tarpgeninės srities (IGS) struktūra. Juoda rodyklė žymi 47S pre-rrnr transkripciją, raudona rodyklė transkripciją nuo tarpgeninės srities. Pilki stačiakampiai stiprikliai tarpgeninėje srityje. Raudoni stačiakampiai transkripcijos terminacijos sritys. ETS išorinis transkribuojamasis tarpas (angl. external transcribed spacer) (b); transkripcijos veiksniai ir RNR I polimerazė ties rrnr geno pirmtako promotoriumi (c) (Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 50, p. 135, 2010) 250

251 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Transkripcijos iniciacija ties rrnr genų promotoriais žymiai veiksmingesnė, kai prieš šerdinį promotorių yra UCE (angl. upstream control element) elementas (5.15 pav.). Kartais jis vadinamas ir UPE (angl. upstream promoter element). UCE išsidėstęs nukleotidų srityje prieš transkripcijos pradžios nukleotidą. Jis labai veiksmingai stimuliuoja transkripciją, tačiau daugeliu atveju nėra būtinas. RNR I polimerazės vykdomai transkripcijai reikia dviejų transkripcijos veiksnių SL1 (angl. selectivity factor 1) ir UBF (angl. upstream binding factor) bei daugelio pagalbinių baltymų (angl. auxiliary proteins) (5.14 pav., b). Bazinei transkripcijai vykti užtenka SL1 veiksnio, o veiksmingai transkripcijai reikia abiejų. UBF dimeras prisijungia prie daug G ir C turinčios UCE sekos. UBF lenkia DNR, ir ši sudaro ~ 140 bp kilpą (5.15 pav.). UBF skatina prie promotoriaus prisijungti SL1. UBF ir SL1 jungimuisi prie promotoriaus būdingas kooperatyvumas. SL1 sudaro keli polipeptidai. Skirtinguose organizmuose jis vadinamas skirtingai: SL1 žmogaus ląstelėse, TIF-IB pelės ląstelėse, ir t. t. Visuose iki šiol tyrinėtuose organizmuose, išskyrus 5.15 pav. RNR I polimerazės transkripcijos preiniciacijos komplekso susidarymas ties žmogaus rrnr pirmtako geno promotoriumi (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz. Cell Biology, second edition, 2008) 251

252 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA mieles S. cerevisiae, šerdinį veiksnį sudaro TBP baltymas ir trys arba keturi papildomi baltymai savitieji su TBP baltymu susijungę TAF I veiksniai (angl. TBP associated factors) (5.15 pav.). SL1 funkcija tiksliai prijungti RNR Pol I prie rrnr pirmtako geno šerdinio promotoriaus (taip susidaro transkripcijos preiniciacijos kompleksas, PIC) ir nustatyti transkripcijos pradžios vietą. Įdomu, kad vykstant pre-rrnr transkripcijai, pakartotinė transkripcijos iniciacija (reiniciacija) yra labai veiksminga. Su šerdiniu promotoriumi sąveikaujantis veiksnys lieka prisijungęs prie promotoriaus ir gali į transkripcijos kompleksą įjungti naują RNR Pol I molekulę. Pvz., ameboje kita RNR Pol I gali prisijungti prie promotoriaus, prieš tai prisijungusiai molekulei susintetinus vos 17 nukleotidų. RNR Pol I rrnr transkripciją stabdo terminatorių sekos, išsidėsčiusios pirmame nukleotidų už rrnr pirmtako geno (5.14 pav., c). Eukariotų 5S rrnr genai genome išsidėstę atskirai nuo kitas rrnr koduojančių genų. Jų transkripcija taip pat vyksta atskirai, ją vykdo RNR Pol III. Šio atskyrimo priežastis nėra išaiškinta. Tačiau kai kuriuose žemesniuosiuose eukariotuose, pvz., mielėse S. cerevisiae, 5S rrnr genai yra išsidėstę šalia kitas rrnr koduojančių genų RNR III polimerazės transkripcijos kompleksas Labiausiai išsiskirianti RNR Pol III transkribuojamų genų promotorių savybė yra ta, kad konservatyvieji promotorių elementai yra išsidėstę už transkripcijos pradžios nukleotido, t. y. genų viduje. Šie promotoriai vadinami vidinės kontrolės sritimis, ICR (angl. internal control regions). Promotoriai sudaryti iš transkripcijos veiksnių prisijungimo sričių, kurias skiria mažiau transkripcijai svarbūs jungtukai. RNR Pol III transkribuojamų genų promotorius galima suskirstyti į tris tipus. I ir II tipo promotoriai būtent ir pasižymi anksčiau minėtais elementais. III tipo promotoriai tokių elementų neturi. I tipo promotorių pavyzdžiu galėtų būti Xenopus laevis 5S rrnr geno promotorius. Būtent X. laevis rrnr genų transkripcijos tyrimais nustatyta, kad šių genų promotorių Kai kurių RNR III polimerazės transkribuojamų genų promotorių reguliacinės sritys yra išsidėsčiusios genų viduje. reguliacinės sritys yra išsidėsčiusios rrnr genų viduje: 5S rrnr geno transkripcija vyko pašalinus visą prieš šį geną esančią DNR sritį. I tipo promotorius sudaro trys elementai, kurių pakanka geno transkripcijai vykti (5.16 pav.): z A elementas, esantis tarp +50 ir +64 nukleotido; zvidurinysis elementas, IE (angl. intermediate element), esantis tarp +67 ir +72 nukleotido; z C elementas, esantis tarp +80 ir +97 nukleotido. I tipo promotoriai yra palyginti nejautrūs skiriamųjų jungtukų tarp promotoriaus elementų pokyčiams. Už 5S rrnr promotoriaus srities patalpinus bet kurią DNR, jos transkripcija vyksta. 252

253 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) II tipo promotorius dažniausiai turi trnr genai. Šio tipo promotoriuose yra du konservatyvūs A ir B elementai (5.16 pav.). A elementas panašus į I tipo promotorių A elementą, tik jis yra daug arčiau transkripcijos pradžios nukleotido. B elemento padėtis labai įvairi, dažniausiai priklausoma nuo intronų, esančių trnr genų viduje. Optimalus atstumas tarp A ir B elementų yra ~ bp. Tačiau žinomas ir 365 bp skirtukas. Prie A ir B elementų II tipo promotoriuose vienu metu prisijungia TFIIIC transkripcijos veiksnys, ir skirtukas išstumiamas lauk. Nedidelė grupė RNR Pol III transkribuojamų genų promotorių neturi jokių tipiškų elementų, esančių genų viduje. Jie priklauso III tipo promotorių grupei. Geriausiai apibūdintas tokio tipo promotorius yra žmogaus U6 geno promotorius. Genas koduoja splaisosomos RNR. Promotoriaus sẽkos, reikalingos veiksmingai transkripcijai vykti, yra: TATA sritis (angl. TATA consesus sequence), esanti nt prieš transkripcijos pradžios nukleotidą; artimasis sekos elementas, PSE (angl. proximal sequence element), esantis tarp 66 ir 47 nukleotido, ir tolimasis sekos elementas, DSE (angl. distal sequence element), esantis tarp 244 ir 214 nukleotido (5.16 pav.). Reikia pastebėti, kad kai kurie RNR Pol III transkribuojamų genų promotoriai nėra panašūs nė į vieną iš minėtų trijų promotorių tipų. Prie RNR Pol III transkribuojamų 5S rrnr ir trnr genų I ir II tipo promotorių A, B bei C elementų prisijungia daugiasubvienetis TFIIIC transkripcijos veiksnys (5.17 pav.). Prie I tipo (pvz., 5S rrnr geno) promotorių prijungti TFIIIC veiksnį reikia pagalbinio veiksnio TFIIIA. TFIIIA prisijungia prie promotoriaus A elemento ir tarpininkauja prijungiant TFIIIC veiksnį prie C elemento. TFIIIC pats silpnai sąveikauja su I tipo promotoriaus C elementu. II tipo promotoriams TFIIIA veiksnio nereikia. TFIIIC yra vienas didžiausių žinomų transkripcijos veiksnių. Mielių TFIIIC sudaro 6 subvienetai. Nė vienas subvienetas pavieniui negali prisijungti prie DNR. Subvienetai formuoja dvi baltymų globules, kiekvienos skersmuo ~ 10 nm. Fotosąsiuvų eksperimentai parodė, kad kone visi TFIIIC veiksnį sudarantys komponentai prisijungia išilgai viso trnr Tyr geno. II tipo promotoriuose TFIIIC prisijungia prie A ir B elementų vienu metu. Jeigu jungtukas, skiriantis elementus, yra per didelis (jame neretai yra intronas), DNR yra tiesiog išstumiama lauk. Pagrindinė TFIIIC veiksnio funkcija prijungti transkripcijos veiksnį TFIIIB (5.17 pav.). TFIIIB yra tikrasis transkripcijos iniciacijos veiksnys ir įeina į transkripcijos iniciacijos kompleksų (PIC) sudėtį atpažįstant visų tipų RNR III polimerazės promotorius. TFIIIB užima sritį, esančią ~ 40 bp 5.16 pav. RNR III polimerazės transkribuojamų genų promotoriai. Tn terminacijos sritis. Rodyklė žymi transkripcijos pradžią 253

254 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5.17 pav. Žmogaus ląstelių RNR III polimerazės preiniciacijos kompleksai, susimontavę ties I III tipo promotoriais. Rodyklės žymi transkripcijos pradžios vietą ir kryptį (PLOS One, 2014) prieš transkripcijos pradžios nukleotidą. TFIIIB sudaro trys polipeptidai, kurių didžiausias TBP baltymas. TFIIIB sudėtyje esantis TBP gali prisijungti prie TATA sričių, tačiau daugelis I ir II tipo promotorių šių sričių neturi. Prijungus TFIIIB prie DNR, TFIIIA ir TFIIIC tolesnei transkripcijos iniciacijai nebereikalingi. TFIIIB veiksnys prie promotoriaus prijungia RNR III polimerazę ir tiksliai ją išdėsto ties transkripcijos pradžios vieta. Su RNR Pol III tiesiogiai sąveikauja TFIIIB veiksnio BRF subvienetas (angl. TFIIB related factor) RNR II polimerazė RNR II polimerazė yra pagrindinis eukariotų genų veiklą valdantis fermentas, kuris (su retomis išimtimis) sintetina visas irnr molekules. Eukariotinėse ląstelėse RNR II polimerazė yra didžiulis baltymas, kurio molekulinė masė siekia ~ 500 kda m. 4,1 Å skyros rentgenostruktūrine analize nustatyta S. cerevisiae RNR II polimerazės struktūra, kurią sudaro 12 subvienetų (Rpb1 12, numeruojami nuo mažiausio iki didžiausio). Žmogaus RNR II polimerazė panaši į mielių RNR II polimerazę. Atitinkamus RNR polimerazių subvienetus koduojantys žmogaus ir mielių genai pasižymi didele homologija. Daugelis žmogaus RNR Pol II subvienetų gali pakeisti atitinkamus mielių RNR Pol II subvienetus. RNR Pol II yra transkripcijos proceso šerdis. Tačiau pats vienas šis fermentas, nors ir pasižymi polimeraziniu aktyvumu, negali inicijuoti transkripcijos nuo genų promotorių. Tam būtini papildomi baltymai, kurie, kartu su RNR Pol II, sudaro transkripcijos iniciacijos bei elongacijos kompleksus, gali atpažinti promotorius ir reaguoti į transkripcijos signalus. 254

255 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Transkripcijos preiniciacijos kompleksas, susimontuojantis ties eukariotų genų promotoriais, yra itin didelė struktūra (5.3 lentelė). Ją sudaro: z RNR II polimerazė; z pagrindiniai transkripcijos veiksniai, GTF (angl. general transcription factors): TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH; z mediatoriaus kompleksas, sudarytas iš daugelio baltymų. 5.3 lentelė. RNR Pol II transkripcijos iniciacijos komplekso komponentai Komponentai Subvienetų skaičius Molekulinė masė (kda) RNR II polimerazė Pagrindiniai transkripcijos veiksniai Mediatorius Iš viso RNR II polimerazės struktūros bruožai. Eukariotų RNR II polimerazės šerdinės dalies struktūra panaši į bakterijų polimerazės, nepaisant to, kad jų sudėtyje esančių baltymų aminorūgščių sekų panašumas nedidelis. Be to, eukariotų baltymas dar turi papildomų subvienetų, kurie suteikia jam savitų struktūrinių ir funkcinių ypatybių (5.18 pav.). Labiausiai išsiskiriantis eukariotų RNR Pol II bruožas Rpb4 ir Rpb7 subvienetų formuojama kamino struktūra (angl. stalk). Ši RNR Pol II dalis yra išorėje; ji, beje, būdinga ir archėjų RNR polimerazei. Kaminui priskiriamos svarbios funkcijos per transkripciją vykstančio atvirojo komplekso susidarymo metu, užtikrinančios procesyvumą ir pagrindinio transkripcijos veiksnio TFIIE veikimą pav. Bakterijų bei archėjų RNR polimerazių ir eukariotų RNR II polimerazės erdvinės struktūros. Mėlynai pažymėti subvienetai, konservatyvūs visose polimerazėse, violetine spalva baltymai, esantys eukariotų ir archėjų, bet ne bakterijų RNR polimerazėse (Nature Reviews Microbiology, v. 9, p. 85, 2011) 255

256 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Du didžiausi RNR Pol II subvienetai Rpb1 ir Rpb2 sudaro fermento šerdį (5.19 pav., a b). Įdomu, kad eukariotuose ir bakterijose abu subvienetus koduoja vienas genas, o archėjose du genai, organizuoti į operoną. Mažesnieji RNR Pol II subvienetai yra daugiausiai didžiųjų subvienetų išorėje. Fermento erdvinė struktūra primena jau anksčiau aprašytą bakterijų RNR polimerazės erdvinę struktūrą: Rpb5, Rpb9 subvienetai ir dalis Rpb1 subvieneto sudaro čiuptuvus, o plyšyje tarp jų išdėstoma DNR. Plyšyje esančio kanalo pamate surišami du Mg 2+ jonai. Kanalo skersmuo yra ~ 25 Å. Jis gali talpinti ~ 20 bp, iš kurių ~ 9 bp sudaro DNR-RNR hibridas. RNR Pol II aktyviojo centro struktūros modelis pasiūlytas remiantis dviejų metalo jonų išsidės pav. Eukariotų RNR II polimerazės struktūra. S. cerevisiae RNR Pol II erdvinė struktūra, nustatyta 3,5 Å skyros rentgenostruktūrine analize (nėra Rpb4 ir Rpb7 subvienetų). Subvienetai pažymėti skirtingomis spalvomis (a); RNR Pol II struktūros schema (b) (Science, v. 292, p. 411, 2001); RNR Pol II, esančios elongacijos etape, schema (pjūvis iš šono). Rodyklė apačioje žymi transkripcijos kryptį (c) (PNAS, v. 99, p. 1218, 2002) 256

257 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) tymu RNR II polimerazėje. Pagal šį modelį, laisvas rntp kartu su vienu Mg 2+ jonu prisijungia tarp paskutinės DNR-RNR hibrido bazių poros ir RNR II polimerazės struktūrinio elemento BH spiralės (angl. bridge helix) (5.19 pav., a b, ir 5.20 pav.). BH spiralė yra svarbus RNR II polimerazės funkcinis elementas. R. Kornbergas kartu su kolegomis nustatė, kad BH spiralė būna tiesi arba išlenkta. Jie iškėlė hipotezę, kad spiralės konformacija kinta perstūmimo (angl. translocation) metu: kai spiralė tiesi, į aktyvųjį centrą gali pakliūti NTP. Prijungus NTP, užpildomas plyšys tarp RNR 3 galo ir BH spiralės (5.20 pav., a). Tikslus substratų išdėstymas aktyviajame centre skatina fosfodiesterinio ryšio susidarymą ir pirofosfato atsipalaidavimą. Vykstant perstūmimui, BH spiralė išlinksta, paskui grįžta į pradinę būseną. RNR II polimerazės elongaciją slopinantis α amanitinas prisijungia netoli BH spiralės, trukdo jai išlinkti ir taip stabdo perstūmimą. Aktyviojo centro kanalą užstoja fermento struktūroje esanti siena (angl. wall) (5.19 pav., c). Dėl jos DNR, esanti fermento kanale, yra ne tiesi, bet išlinksta ~ 90 kampu. Fermento struktūroje po aktyviuoju centru taip pat yra pora (angl. pore) (5.19 pav., c). Pora platėja išorės link. Per ją rntp patenka į RNR polimerazės aktyvųjį centrą. Tam tikrais atvejais į ją patenka ir yra ten nuskeliamas RNR transkripto 3 galas. Transkripto 5 galas išeina per kitą išėjimo (angl. exit) kanalą, kur jis atskiriamas nuo DNR grandinės keleto struktūrinių RNR II polimerazės elementų baltymų kilpų (5.19 pav., c). Svarbus RNR II polimerazės struktūrinis elementas yra gnybtas (angl. clamp) (5.19 pav., c). Jį 5.20 pav. RNR II polimerazės aktyviojo centro funkciniai elementai. BH spiralė (a) (Archaea, 2011); BH spiralės konformacijos kitimas elongacijos metu. Oranžine spalva pažymėti purino, mėlyna pirimidino nukleotidai aktyviajame centre (b d) (PNAS, v. 104, p , 2007; Science, v. 292, p. 411, 2001) 257

258 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA sudaro Rpb1, Rpb 6 ir Rpb2 subvienetų dalys. Gnybtas apgaubia DNR dupleksą, kai šis patenka į fermentą. Dar vienas svarbus aktyviojo centro elementas yra TL kilpa (angl. trigger loop). Ji yra judri ir fiksuoja komplementarią laisvo rntp ir matricos nukleotido porą (5.20 pav., d). TL kilpos aminorūgštys sąveikauja su visomis rntp struktūrinėmis dalimis heterocikline baze, fosfatais ir riboze. TL aminorūgščių mutacijos daro įtaką transkripcijos substratų atrankos procesui. Dėl tam tikrų mutacijų RNR Pol II beveik nebeskiria rntp nuo dntp, nors įprastai klaidų dažnis yra 1 iš tūkstančio RNR II polimerazės transkripcijos preiniciacijos kompleksas Tipišką geno, kurio transkripciją vykdo RNR Pol II, promotorių sudaro daug reguliacinių cis elementų. Vienaląsčių eukariotų genų promotorių reguliaciniai elementai išsidėstę arti transkripcijos pradžios nukleotido (5 gale) (5.21 pav., a). Daugialąsčiuose eukariotuose jų įvairovė žymiai didesnė ir padėtis geno atžvilgiu įvairesnė (5.21 pav., b). Eukariotų genų transkriptų dydis plačiai svyruoja nuo kelių šimtų iki milijonų nukleotidų (pvz., žmogaus distrofino geno transkriptas yra 2,5 milijono nukleotidų ilgio). Tiriant daugelio eukariotų genų, kurių transkripciją vykdo RNR Pol II, promotorių sekas, netoli +1 nukleotido buvo nustatytos tik gana nedidelės konservatyvios sritys. Mutagenezės būdu buvo patvirtinta, kad jos yra svarbios transkripcijos iniciacijai. Šios sritys sudaro RNR Pol II transkribuojamų genų šerdinį promotorių (5.21 pav., a b) pav. Vienaląsčių (a) ir daugialąsčių (b) eukariotų genų, kuriuos transkribuoja RNR II polimerazė, promotoriai. UAS priešsrovinė aktyvinamoji seka (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 258

259 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) RNR Pol II transkribuojamų genų promotoriams būdingos ir kitos reguliacinės sritys, esančios toliau nuo šerdinio promotoriaus. Jos skirstomos į šias grupes: zartimieji promotoriaus elementai (angl. proximal promoter elements), išsidėstę bp prieš transkripcijos pradžios nukleotidą (5.21 pav., b); z tolimieji reguliaciniai elementai (angl. long range regulatory elements), išsidėstę ir daugiau bp nuo tranksripcijos pradžios nukleotido (5.21 pav., b). RNR II polimerazės šerdinį promotorių sudaro ~ 60 bp DNR sritis, kurioje yra transkripcijos pradžios nukleotidas (5.22 pav.). Su šia sritimi sąveikauja pagrindiniai transkripcijos veiksniai ir RNR II polimerazė. Daugelio RNR Pol II transkribuojamų genų šerdiniai promotoriai turi konservatyvią sritį TATA dėžutę, kuri yra nutolusi nuo +1 nukleotido ~ 25 nukleotidus. TATA dėžutę sudaro nukleotidai ATATAAA. Jos konservatyvi seka labai panaši į bakterijų promotorių 10 sritį. TATA dėžutę turi stiprūs promotoriai. TATA buvo pirmasis nustatytas RNR Pol II transkribuojamų genų promotoriaus elementas. Dėžutė yra gana dažnas žinduolių genų šerdinio promotoriaus elementas. Tačiau, pvz., žmogaus genome šio elemento neturi didesnė pusė genų promotorių (vadinamieji TATA neturintys promotoriai). Greta TATA dažnai yra dar viena šerdiniui promotoriui būdinga sritis BRE (angl. TFIIB recognition element) (5.22 pav.). Prie BRE atrankiai jungiasi pagrindinis transkripcijos veiksnys TFIIB. TATA dėžutė užtikrina tikslų transkripcijos pradžios nukleotido nustatymą per transkripcijos iniciaciją. Prie jos atrankiai jungiasi transkripcijos veiksnio TFIID sudėtyje esantis TBP baltymas (angl. TATA binding protein). Kiti TFIID subvienetai sąveikauja su kitais šerdinio promotoriaus elementais. Kiti žinomi eukariotų genų šerdinio promotoriaus elementai yra: z iniciatorius, Inr (angl. initiator) (5.22 pav.); z pasrovinis promotoriaus elementas, DPE (angl. downstream promoter element); z 10-ies narių motyvas, MTE (angl. motif ten element). Iniciatoriaus Inr viduje yra transkripcijos pradžios nukleotidas (5.22 pav.). Inciatoriaus tipinė seka yra PyPyANT/APyPy (Py pirimidino nukleotidas, A transkripcijos pradžios nukleotidas, N bet kuris nukleotidas). Prie iniciatoriaus jungiasi pagrindinio transkripcijos veiksnio TFIID subvienetai TAF1 ir TAF2 (senąja nomenklatūra TAFII250 ir TAFII150). Iniciatorius Inr gali 5.22 pav. Eukariotų genų šerdinio promotoriaus elementai (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 259

260 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA funkcionuoti vienas, be TATA dėžutės. Būdami kartu, šie promotoriaus elementai veikia sinergetiškai. Jei šerdinis promotorius turi arba TATA, arba Inr ( aštrus promotorius, angl. sharp promoter), transkripcija prasideda tiksliai ties +1 nukleotidu. Jeigu šių elementų nėra ( platus promotorius, angl. wide promoter) transkripcija prasideda įvairiose vietose. Kitas eukariotuotų genų šerdinio promotoriaus elementas yra už +1 nukleotido esantis DPE (5.22 pav.). DPE elementas yra šerdinio promotoriaus srityje. Taigi, jis yra genų viduje. Kitaip nei Inr, DPE negali visiškai pakeisti TATA, todėl DPE turintys promotoriai įprastai turi dar TATA arba Inr. Eukariotų RNR II polimerazės bazinis transkripcijos aparatas, prisijungęs prie šerdinio promotoriaus, užtikrina bazinę transkripciją. Tokių prieš tai išvardytų elementų rinkiniai dažniausiai ir sudaro šerdinį promotorių, prie kurio jungiasi RNR Pol II transkripcijos kompleksas. Šerdinio promotoriaus elementai užtikrina, kad ties promotoriumi susiformuotų bazinis transkripcijos aparatas ir vyktų bazinė transkripcija. Bazinė transkripcija nėra veiksminga. Veiksmingai transkripcijai vykti reikia kitų baltymų reguliacinių transkripcijos veiksnių, dažniausiai transkripcijos aktyviklių (angl. activators). Transkripcijos aktyvikliai skatina prie promotoriaus kooperatyviai jungtis transkripcijos aparato komponentus. Transkripcijos veiksniai jungiasi prie savitųjų nukleotidų sekų, esančių prieš šerdinius promotorius, prie artimųjų promotorių elementų. Trumpi sekų elementai, prie kurių jungiasi šie baltymai, gali būti panašūs į kitas prieš genus esančias sekas, tačiau jie taip pat gali funkcionuoti ir kaip labai saviti reguliaciniai elementai, kai reikia transkribuoti geną tam tikroje vietoje ir tam tikru laiku. Pvz., didelė dalis mielių genų promotorių turi vadinamąją priešsrovinę aktyvinamąją seką, UAS (angl. upstream activating sequence). Sekoje yra 2 3 savitosios sritys, prie kurių jungiasi transkripcijos veiksniai (5.21 pav., a). Daugialąsčiuose eukariotuose artimųjų promotorių elementų įvairovė daug didesnė. Pavyzdys galėtų būti GC dėžutė GGGCGG seka, esanti ~ 90 bp prieš transkripcijos pradžios nukleotidą. Ją turi 60 % žmogaus genų, daugiausiai namų ūkio genų (angl. housekeeping genes). Prie GC dėžutės jungiasi SP1 baltymas ir pritraukia prie promotoriaus TFIID veiksnį per vieną jo baltymų. Kitas dažnas elementas yra nukleotidų seka GGCCAATCT. Sritis vadinama CAAT dėžute. CAAT taip pat prijungia savituosius transkripcijos veiksnius. Dar vienas promotorių elementas, išsidėstęs ~ np atstumu prieš transkripcijos pradžios nukleotidą, yra oktameras, prie kurio nukleotidų ATTTGCAT sekos taip pat jungiasi savitasis transkripcijos veiksnys. Reikia pastebėti, kad didžioji dauguma eukariotų RNR Pol II transkribuojamų genų promotorių turi keletą elementų, kurie daro įtaką transkripcijos iniciacijos veiksmingumui (iniciacijos dažniui), tačiau nė vienas jų nėra esminis visiems promotoriams. Promotorių elementai greičiau primena mozaiką, o reguliacinių elementų organizacija gali būti labai įvairi. Jie organizuoti vadinamuoju sumaišyk ir pataikyk (angl. mix and match) principu. Daugialąsčių eukariotų baltymus koduojančių genų būdinga savybė yra ta, kad prie jų transkripcijos valdymo prisideda tolimieji reguliaciniai elementai (angl. long range control elements), kurie gali būti nutolę nuo šerdinio promotoriaus tūkstančius bp ir valdyti konkretaus geno transkripciją organizmo vystymosi ir diferenciacijos metu. 260

261 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Yra žinomi kelių tipų tolimieji reguliaciniai elementai: z stiprikliai (angl. enhancers); z slopikliai (angl. silencers); z izoliatoriai (angl. insulators); z srities kontrolės elementai, LCR (angl. locus control regions); z užpildo prisijungimo sritys, MAR (angl. matrix attachment regions). Stiprikliai ir slopikliai. Daugialąsčių eukariotų baltymą koduojančio geno transkripcija įprastai valdoma bent kelių stipriklių. Stiprikliai nutolę ~ bp nuo geno (gali būti nutolę ir šimtus tūkstančių bp). Neįprasta jų savybė yra ta, kad kitaip nei šerdinio promotoriaus elementai, jie gali būti išsidėstę tiek prieš geną, tiek už jo, tiek gali būti geno viduje (5.23 pav., a) pav. Daugialąsčių organizmų transkripcijos tolimieji reguliaciniai elementai. Stipriklių padėtys geno atžvilgiu (a); srities kontrolės elementai (LCR), aktyvinantys už jų esančių žmogaus individualių β globinų genų raišką įvairiais vystymosi periodais. Apačioje galimas LCR veikimo modelis (b); izoliatorių veikimas eritrocituose. Raudonos rodyklės transkripcijos slopinimas, žalia rodyklė transkripcija (c) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 261

262 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Stiprikliai gali būti įterpiami priešinga orientacija neprarasdami funkcijos. Vidutinis stipriklis yra ~ 500 bp ilgio modulinės struktūros: turi ~ 10 nukleotidų sekų, prie kurių atrankiai jungiasi įvairūs transkripcijos veiksniai bei kiti baltymai (pvz., histonus modifikuojantys baltymai, chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai ir kt.). Savo organizacija stiprikliai yra gana panašūs į artimuosius promotorių elementus. Eksperimentais įrodyta, kad stipriklis gali aktyvinti bet kokį promotorių, jeigu tas promotorius bus patalpintas arti jo. Pasiūlyti keli stipriklių veikimo modeliai, pagal kuriuos stiprikliai veikia keisdami DNR topologiją, palengvindami transkripcijos veiksnių priėjimą prie šerdinio promotoriaus. Panašūs, tačiau transkripciją ne stiprinantys, o slopinantys reguliaciniai elementai vadinami slopikliais. Slopikliai yra DNR sekos, kurios neigiamai veikia geno transkripciją. Prie slopiklių jungiasi baltymai represoriai. Izoliatoriai. Eukariotų chromatiną sudaro genų gausa pasižymintis euchromatinas ir kondensuotas heterochromatinas, kur genų nėra daug ir kur jų raiška slopinama. Heterochromatinas plinta į gretimas chromatino sritis, todėl iškyla būtinybė nuo struktūrinio slopinimo apsaugoti gretimose euchromatino srityse esančių aktyvių genų transkripciją m. drozofiloje buvo nustatyti tolimieji reguliaciniai elementai, kurie pasižymėjo būtent tokia apsaugine funkcija. Izoliatoriai yra bp sekos, kurioms būdingos šios savybės (5.23 pav., c): z patalpintas tarp stipriklio ir promotoriaus, izoliatorius slopina stipriklio poveikį promotoriui; zpatalpintas tarp heterochromatino ir aktyvaus geno, izoliatorius stabdo heterochromatino plitimą į aktyvių genų sritį. Tam tikri izoliatoriai pasižymi abiem savybėmis, kiti tik viena jų. Izoliatoriai turi keletą DNR sričių, prie kurių atrankiai jungiasi savitieji baltymai. Izoliatorių veikimas nėra iki galo išaiškintas. Siūlomi keli veikimo modeliai. Vienas modelis sieja izoliatorius ir transkripcijos komponentus. Pagal šį modelį, prie izoliatoriaus prisijungęs transkripcijos aktyviklis nebegali sąveikauti su savo taikiniu promotoriuje. Apsaugos nuo heterochromatino plitimo atveju siūloma, kad prie izoliatorių pritraukiami genų raišką aktyvinantys baltymai bei histonus modifikuojantys baltymai, kurie neleidžia tose srityse susidaryti heterochromatinui. Kitas modelis sieja izoliatorius ir chromatino struktūrinę organizaciją. Pagal jį, izoliatoriai fiziškai atskiria chromatino sritis ir taip neleidžia sąveikauti, pvz., stiprikliui ir geno promotoriui. Srities kontrolės elementai (LCR). Srities kontrolės elementai, LCR, priklauso valdymo elementų (tokių kaip stiprikliai, slopikliai, izoliatoriai, užpildo prisijungimo sritys), vykdančių chromatino srities ar genų sankaupų transkripcijos valdymą, grupei. Prie šios elementų grupės jungiasi transkripcijos aktyvikliai, koaktyvikliai, chromatiną pertvarkantys baltymų kompleksai. LCR dažniausiai esti prieš valdomą genų grupę, bet, pvz., randami ir intronuose m. nustatyti ir gerai ištirti žmogaus LCR. Jie yra prieš β globinų genų sankaupą (5.23 pav., b). Sankaupos individualių b globinų genų transkripcija vyksta įvairiais vystymosi periodais ir valdoma pasitelkiant LCR bei įvairius transkripcijos veiksnius. LCR yra labai jautrūs I DNazės poveikiui, tai liudija apie jų dalyvavimą transkripcijoje. Chromatino imunoprecipita- 262

263 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) cijos eksperimentais nustatyta, kad bazinis transkripcijos aparatas (RNR Pol II ir pagrindiniai transkripcijos veiksniai) pirmiausiai pritraukiami prie LCR pasitelkiant transkripcijos veiksnius, o po to RNR Pol II nukreipiama promotoriaus link (5.23 pav., b). Užpildo prisijungimo sritys (MAR). Šiandien neabejojama, kad chromatino erdvinė struktūra yra genų raiškos valdymo eukariotuose pagrindas. Chromatino aukštesniųjų struktūrų elementai, pvz., chromatino kilpos, tvirtinasi prie branduolio savitųjų baltymų. Kilpas tvirtinančių baltymų sudėtis interfazėje ir metafazėje skiriasi. Interfazėje, kai vyksta intensyvi genų transkripcija, chromatino kilpos tvirtinasi prie baltymų per vadinamąsias užpildo prisijungimo sritis, MAR. MAR būdinga A ir T nukleotidų gausa, jos yra netoli stipriklių. Manoma, kad MAR gali pritraukti chromatino sritis prie kitų sričių, kur vyksta aktyvi genų transkripcija ir yra gausu transkripcijos komponentų RNR Pol II transkripcijos preiniciacijos komplekso (PIC) susimontavimas Pagrindiniai tanskripcijos veiksniai ir RNR Pol II ties geno promotoriumi jungiasi tam tikra tvarka bei sudaro transkripcijos preiniciacijos kompleksą, PIC. Per transkripcijos iniciaciją pagrindiniai transkripcijos veiksniai jungiasi tam tikra tvarka ir ties promotoriumi sudaro transkripcijos preiniciacijos kompleksą, PIC (angl. preinitiation complex), į kurį įjungiama RNR II polimerazė. PIC (kurio molekulinė masė ~ 2 MDa) svarbus nustatant transkripcijos pradžios nukleotidą, išskiriant DNR grandines ir atlaisvinant RNR Pol II nuo promotoriaus. Tyrimais in vitro nustatytos PIC komplekso montavimosi ypatybės. Formuojantis transkripcijos preiniciacijos kompleksui pirmasis prie promotorių, kurie turi TATA elementą, prisijungia pagrindinis transkripcijos veiksnys TFIID. TFIID sudėtyje esančius baltymus galima skirstyti į dvi pagrindines grupes: z prie TATA prisijungiantis baltymas TBP (~ 30 kda); z TAF veiksniai (angl. TBP associated proteins). Į TFIID sudėtį įeina TAF veiksnių, kurių molekulinė masė kda. TAF veiksnių rinkinys TFIID sudėtyje gali būti įvairus. Skirtingus TAF veiksnių rinkinius turintys TFIID atpažįsta skirtingus promotorius. TBP baltymas, būdamas TFIID veiksnio sudėtyje, atrankiai prisijungia prie genų promotorių TATA srities (5.25 pav., a). Tokiu būdu, prisijungus TBP baltymui, nustatoma transkripcijos pradžios nukleotido padėtis. Kiti TFIID veiksnio subvienetai sąveikauja su kitomis promotoriaus sritimis. TBP baltymas yra visų RNR polimerazių (RNR Pol I, RNR Pol II, RNR Pol III) transkripcijos veiksnių sudėtyje. Nors jis RNR Pol I ir RNR Pol III transkribuojamų genų promotoriuose nebūtinai jungiasi prie sekų, panašių į TATA, tačiau yra pagrindinis prie šių promotorių prisijungiančių transkripcijos veiksnių komponentas. TBP yra konservatyvus eukariotų baltymas. Jo konservatyvumas didžiausias baltymo C gale (~ 180 aminorūgščių). TBP jungiasi prie promotorių TATA srities DNR iš mažojo griovio pusės. 263

264 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA TBP apgaubia vieną DNR pusę tarsi balnas ir išlenkia DNR ~ (5.25 pav., b). Lenkimas vyksta didžiojo DNR griovio link, tad yra praplatinamas mažasis griovys. Toks DNR išlenkimas turi funkcinę prasmę: ties išlenkta DNR gali geriau prisijungti transkripcijos veiksniai ir RNR polimerazė, dalyvaujantys transkripcijos iniciacijoje. Manoma, kad TBP baltymas geriausiai sąveikauja su daug A ir T turinčios DNR srities šoninėmis grupėmis, o ne su jos savitomis heterociklinėmis bazėmis. Tai paaškintų, kodėl įvairios A ir T gausios sritys prijungia TBP ir gali veikti kaip TATA dėžutės. Prisijungus TFIID transkripcijos veiksniui, toliau jungiasi kiti transkripcijos veiksniai, vienas paskui kitą. DNR ir baltymų sąveikos pėdsakų (angl. footprint) metodu atlikti tyrimai liudija, kad prisijungiant vis didesniam veiksnių skaičiui, vis didesnė promotoriaus sritis yra uždengiama. Prie TFIID-TATA komplekso prisijungia TFIIA veiksnys (5.24 pav., a). Jis atlieka bent dvi funkcijas: stabilizuoja TBP-DNR sąveiką ir neleidžia prisijungti slopikliams, kurie stabdo tolesnį PIC komplekso susidarymą. TFIIA skatina į PIC kompleksą įsijungti transkripcijos veiksnį TFIIB. TFIIB veiksnys yra vieno polipeptido baltymas. TFIIB C galinis domenas sąveikauja su TBP, DNR ir RNR Pol II. TFIIB N galinis domenas (NTD) sąveikauja su RNR Pol II. TFIIB prisijungia prieš TATA dėžutę, šalia TBP baltymo prie savitosios BRE srities ir už TATA srities (5.25 pav., a), pailgindamas TFIID sąveikos su promotoriaus DNR paviršių. Prisijungus TFIIB, DNR išlinkimas, atsiradęs prisijungus TFIID (TBP) transkripcijos veiksniui, dar labiau padidėja. TFIIB jungiamojo domeno dalis B pirštas (angl. B finger) įsiterpia į RNR Pol II sritį, kurią sintezės metu užima DNR-RNR dupleksas (5.25 pav., a). Manoma, kad B pirštas gali atlikti panašią funkciją kaip ir σ veiksnio 3.2 sritis. Prie TFIIB-TFIID (TBP) komplekso ties promotoriumi prisijungia RNR Pol II, kurią į kompleksą įjungia TFIIF veiksnys (5.24 pav.). TFIIF veiksnį sudaro du dideli (TFIIFα-RAP74) ir du maži (TFIIβ- RAP74) subvienetai. Didieji subvienetai turi daugelį funkciškai svarbių domenų, kurių vaidmuo iniciacijoje, elongacijoje ir tam tikrų baltymų kinazių aktyvumo valdyme yra skirtingas. TFIIF veiksnio funkcija, susidarant transkripcijos preiniciacijos kompleksui, yra tiksliai prijungti prie 5.24 pav. RNR II polimerazės transkripcijos preiniciacijos komplekso susidarymas. Promotoriaus schema. BRE, TATA, Inr elementai pažymėti. Rodyklė žymi transkripciją (a); pagrindinių transkripcijos veiksnių jungimosi tvarka (b); transkripcijos preiniciacijos komplekso tarpiniai kompleksai (c) (Nature, v. 495, p. 481, 2013) 264

265 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) promotoriaus RNR Pol II ir neleisti jai sąveikauti su ne promotoriaus DNR. Manoma, kad TFIIF- RNR Pol komplekso prisijungimas prie promotoriaus yra būtinas, kad vėliau prisijungtų TFIIH ir TFIIE veiksniai. Pastarieji įsijungia į PIC kompleksą paskutiniai. TFIIE veiksnys reikalingas prijungti TFIIH veiksnį ir vėliau TFIIH veiksnio aktyvumams pasireikšti. Mielių TFIIH veiksnį sudaro 10 subvienetų (5.4 lentelė). Jo molekulinė masė prilygsta RNR Pol II molekulinei masei. TFIIH yra pats sudėtingiausias pagrindinis transkripcijos veiksnys ir kol kas vienintelis, kuriame nustatyti fermentiniai aktyvumai 2 priešingomis kryptimis veikiančios nuo ATP priklausomos DNR helikazės (XPB ir XPD) ir nuo ciklinų priklausoma baltymų kinazė (ciklinas H cdk7) (5.26 pav., 5.4 lentelė). TFIIH galima sąlygiškai suskirstyti į dar mažesnius subkompleksus: z šerdinį TFIIH kompleksą (6 subvienetai); z ciklino-kinazės kompleksą, CAK (3 subvienetai); z jungiamąjį baltymą (1 subvienetas). 5.4 lentelė. Mielių pagrindiniai transkripcijos, vykdomos RNR Pol II, veiksniai Veiksnys Molekulinė masė (kda) Gyvybiškai svarbus Charakteristika ir funkcijos TBP * 27 Taip Prisijungia prie TATA srities, pradeda iniciacijos komplekso montavimąsi ties promotoriumi, įjungia į transkripcijos kompleksą TFIIB TFIIB 38 Taip Stabilizuoja TATA-TBP sąveiką, įjungia į transkripcijos kompleksą RNR Pol II- TFIIF, lemia transkripcijos pradžios nukleotido nustatymą TFIIF 2 x 74 2 x 30 Taip Taip Pagreitina RNR Pol II prijungimą prie promotoriaus, stimuliuoja transkripciją elongacijos etape, sąveikauja su TFIIB; homologiškas σ veiksniui, neleidžia RNR Pol II sąveikauti su ne promotoriaus DNR Yra TFIID, TFIIF ir SWI-SNF kompleksų sudėtyje TFIIH 95 Taip Nuo DNR priklausoma ATPazė, nuo DNR priklausoma helikazė (3 5 ); dalyvauja DNR grandinių išskyrimo, transkripcijos burbulo susidarymo, elongacijos, DNR reparacijos procesuose 85 Taip Nuo DNR priklausoma ATPazė, nuo DNR priklausoma DNR helikazė (5 3 ), dalyvauja DNR reparacijoje 73 Taip Dalyvauja DNR reparacijoje 59 Taip Dalyvauja DNR reparacijoje 50 Taip Dalyvauja DNR reparacijoje 47,45 Taip - 37 Taip - 32 Taip - 33 Taip Baltymų kinazė, fosforilinanti RNR Pol II didžiojo subvieneto CTD domeną TFII E 66 x 2 43 x 2 Taip Taip Įjungia į transkripcijos TFIIH kompleksą, stimuliuoja TFIIH aktyvumą, dalyvauja susidarant transkripcijos burbului ir atsilaisvinant RNR Pol II nuo promotoriaus Dalyvauja susidarant transkripcijos burbului ir atsilaisvinant RNR Pol II nuo promotoriaus * Lentelėje yra tik TFIID sudėtyje esantis TBP baltymas. TFIID, nors ir dalyvauja transkripcijos iniciacijoje ties daugeliu eukariotų promotorių, nėra unikalus: ties kai kuriais promotoriais pasitelkiamas kitas kompleksas, kuris turi savo sudėtyje baltymą, panašų į TBP. 265

266 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA TFIIH veiksnys reikalingas RNR Pol II transkripcijos iniciacijos (DNR grandinių atskyrimo, transkripcijos burbulo susidarymo), atsilaisvinimo nuo promotoriaus (angl. promoter escape) ir elongacijos etapams. Nuo DNR priklausoma XPB helikazė sąveikauja PIC komplekse su DNR sritimis, esančiomis prieš transkripcijos pradžios nukleotidą ir už jo. DNR apsukama apie PIC kompleksą. Manoma, kad nuo ATP priklausoma XPB helikazė galėtų išskirti DNR grandines promotoriaus srityje, nors tai patvirtinančių eksperimentinių įrodymų trūksta. Susidarius transkripcijos burbului, uždarasis transkripcijos iniciacijos kompleksas virsta atviruoju transkripcijos iniciacijos kompleksu, kuris gali vykdyti transkripcijos iniciaciją. TFIIH transkripcijos veiksnio helikazės aktyvumas pasireiškia ir DNR NER reparacijoje (angl. nucleotide excision repair). Kai RNR Pol II transkripcijos metu prieina DNR pažaidas, tam tikri TFIIH veiksnio subvienetai tampa komplekso, kuris dalyvauja šių pažaidų reparacijoje, sudėtine dalimi. TFIIH veiksnio sudėtyje esanti nuo ciklino priklausoma kinazė (ciklinas H-Cdk7) fosforilina RNR Pol II didžiojo subvieneto CTD domeno (angl. carboxy terminal domain) serino aminorūgštis. Modifikacija yra grįžtama. CTD domenas tai eukariotų RNR Pol II didžiojo subvieneto 5.25 pav. TBP baltymas ir jo sąveika su šerdinio promotoriaus TATA sritimi. TBP sąveika su TFIIB, DNR ir RNR Pol II (a) (Cell, v. 149, p. 1432, 2012); TBP baltymo struktūrinė organizacija (b); TBP-TATA DNR komplekso erdvinė struktūra (c) ( MoBio/Free/Ch4E.htm) 266

267 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.26 pav. TFIIH veiksnio struktūra. Subkompleksų baltymai nuspalvinti skirtingomis spalvomis (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 13, p. 343, 2012) 5.27 pav. RNR II polimerazės CTD domenas. CTD domeno hipotetinė (spiralės pavidalo) erdvinė struktūra (Nature, v. 430, p. 223, 2004) (a); CTD domeno aminorūgščių motyvo pasikartojimai eukariotuose (b) 267

268 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA C gale esantys septynių aminorūgščių Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (YSPTSPS) pasikartojimai (5.27 pav., b). CTD domenas polimerazės struktūroje yra išsidėstęs atskirai nuo pagrindinės baltymo dalies (5.27 pav., a). Domeno aminorūgščių seka yra konservatyvi daugelyje eukariotų, tačiau CTD pasikartojimų skaičius skiriasi. Pvz., mielėse jis pasikartoja kartus, C. elegants 34 kartus, D. melanogaster 45 kartus, o žmogaus RNR Pol II 52 kartus. Akivaizdu, kad kuo didesnis genomas, tuo CTD pasikartojimų RNR Pol II subvienete daugiau. Mielių CTD domeno iškrita yra letali. Žmogaus B ląstelėse RNR Pol II Rpb1 subvieneto, neturinčio CTD domeno, raiška lemia žymius transkripcijos defektus. CTD neturi archėjų RNR polimerazė, pirmuonių RNR Pol II, taip pat eukariotų RNR Pol I ir RNR Pol III. Be TFIIH veiksnio kinazės, CTD aminorūgščių liekanas fosforilina dar bent kelios ląstelės kinazės, kurių aktyvumas valdomas ciklinų. Fosforilinimas sustiprina CTD domeno rūgštines savybes. Dėl CTD fosforilinimo vyksta transkripcijos komplekso erdviniai pokyčiai ir skatinamas pirmųjų nukleotidų įjungimas į RNR. Fosforilintą CTD domeną defosforilina CTD fosfatazė. CTD yra fosforilinamas ir defosforilinamas skirtingais transkripcijos etapais. Be to, fosforilinimas priklauso ir nuo genų, kurių transkripciją vykdo RNR Pol II, promotorių pav. RNR II polimerazės CTD domeno fosforilinimas transkripcijos ciklo metu 268

269 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) CTD vaidmuo svarbus pereinant RNR Pol II iš iniciacijos etapo į elongacijos etapą bei paliekant promotorių. Ląstelėje yra dvi RNR Pol II formos. Pirmoji forma RNR Pol II, kurios CTD domenas yra palyginti mažai fosforilintas; tokia RNR Pol II įjungiama į transkripcijos preiniciacijos PIC kompleksą. Tai yra hipofosforilinta RNR Pol II forma RNAP IIA (5.28 pav.). Pereinant iš transkripcijos iniciacijos į elongacijos etapą (arba tuo pačiu metu, arba tuojau po to), CTD fosforilinamas. Taip susidaro hiperfosforilinta RNR Pol II forma RNAP IIO (5.28 pav.). Hiperfosforilintoje CTD uodegoje žinduolių RNR Pol II yra > 50 fosfato grupių (~ po 1 grupę heptadiniam CTD domeno pasikartojimui). Serino 5 aminorūgšties liekana heptadinio pasikartojimo padėtyje fosforilinama, RNR Pol II esant ties promotoriais iniciacijos metu, o serino 2 aminorūgšties liekana fosforilinama, RNR polimerazei transkribuojant geną elongacijos metu (5.28 pav.). RNR Pol II CTD domenas yra svarbus RNR pirminių transkriptų (pre-irnr) brendimui. Prie domeno atrankiai jungiasi brendime dalyvaujantys baltymai ir fermentai. RNR Pol II iniciacijos kompleksui, kaip ir prokariotų transkripcijos iniciacijos kompleksui, yra būdinga nutrūkstamoji sintezė nedidelių transkriptų sintezė, kol susintetinami ilgesni nei nukleotidų transkriptai. RNR Pol II transkripcijos kompleksas atsilaisvina nuo promotoriaus ir pereina į transkripcijos elongacijos etapą. Iš transkripcijos komplekso šiame etape atsipalaiduoja daugelis transkripcijos veiksnių. TFIID lieka ties promotoriumi ir gali dalyvauti pakartotinėje transkripcijos iniciacijoje. RNR Pol II transkripcijos kompleksas elongacijos etape pasižymi dideliu procesyvumu. Jis, pvz., gali susintetinti 2 milijonų nukleotidų ilgio distrofino geno irnr pirmtaką nedisocijuodamas nuo matricos. RNR Pol II transkripcijos elongacijos kompleksas, kaip ir bakterinės RNR polimerazės TEC kompleksas, gali būti stabdomas įvairių signalų. Elongacijos komplekse veikia papildomi baltyminiai veiksniai (pvz., ELL baltymas, elonginas ir kt.), kurie arba aktyvina stabtelėjusią polimerazę, arba apsaugo ją nuo transkripcijos pauzių. Jeigu RNR Pol II yra sustabdoma, ji grįžta atgal, prieš tai susintetintas transkripto 3 galas nuskeliamas panašiai kaip ir bakterijose. Šią RNR Pol II funkciją stimuliuoja elongacijos komplekse esantis dar vienas transkripcijos veiksnys TFIIS. Manoma, kad šis veiksnys įterpia savo β segtuko struktūrą į aktyvųjį centrą ir tokiu būdu išdėsto vieną iš metalo jonų bei nukleofilą RNR hidrolizės reakcijai. Veiksnys TFIIS stimuliuoja ir elongaciją, apsaugodamas RNAP II nuo transkripcijos pauzių Mediatoriaus kompleksas ir jo vaidmuo RNR Pol II transkripcijoje Transkripcijos šerdis, kurią sudaro RNR Pol II ir pagrindiniai transkripcijos veiksniai, yra labai konservatyvi eukariotuose. Tačiau in vitro tyrimai parodė, kad be šių transkripcijos proceso dalyvių, transkripcijoje dalyvauja ir kiti komponentai, kurie veikia kaip tarpininkai tarp RNR Pol II bei transkripcijos veiksnių ir savitų genams transkripcijos reguliatorių. R. Kornbergas su kolegomis mielėse nustatė didelį baltyminį kompleksą, kuris didino nuo transkripcijos aktyviklio priklausomą transkripciją in vitro. Be transkripcijos aktyviklio komplekso veikimas nepasireiškė, vyko tik bazinė geno transkripcija. Netrukus buvo nustatyta funkcinė sąsaja tarp komplekso 269

270 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA baltymus koduojančių genų ir RNR Pol II: genų supresorinės mutacijos panaikino efektus, sukeliamus sutrumpėjusio RNR Pol II CTD domeno. Šių genų koduojami baltymai kartu su papildomais baltymais sudaro ~ baltymų kompleksą (M w = Da), kuris buvo pavadintas mediatoriumi (angl. mediator). Kompleksas nustatytas eukariotuose nuo mielių iki žmogaus. Aukštesnieji eukariotai turi keletą panašių kompleksų. Mediatoriaus struktūra yra konservatyvi. Išskiriamos trys pagrindinės komplekso struktūrinės dalys: galva (angl. head, h), vidurys (angl. middle, m), uodega (angl. tail, t) ir kinazės (CDK8) kompleksas (5.29 pav., a). Pastarojo asociacija su kompleksu silpnesnė nei likusių dalių. Mediatoriaus komplekso baltymai sukuria paviršių, su kuriuo sąveikauja transkripcijos aktyvikliai, RNR Pol II, pagrindiniai transkripcijos veiksniai, koaktyvikliai, modifikuoti histonai chromatine (5.29 pav., b.). Mediatoriaus kompleksas yra vienas esminių transkripcijos valdymo Mediatorius sujungia transkripcijos aktyviklius ties tolimaisiais reguliaciniais elementais su RNR II polimerazės transkripcijos komplekso komponentais ir tokiu būdu skatina susimontuoti transkripcijos preiniciacijos kompleksą ties genų promotoriais. komponentų. Jis netgi įtraukiamas į pagrindinių transkripcijos veiksnių grupę. Aiškėja, kad mediatorius veikia ne tik transkripcijos iniciacijos, bet ir elongacijos, terminacijos metu, vykstant pre-irnr brendimui ir chromatino pertvarkai. Eukariotų RNR Pol II transkripcijos kompleksą sudaro > 60 baltymų (5.30 pav.). Kodėl jis toks sudėtingas? Manoma, kad kompleksas užtikrina daugybę reguliacinių funkcijų ir yra reikalingas genų transkripcijai būtent chromatine pav. Mediatoriaus struktūra vienaląsčių ir daugialąsčių eukariotų ląstelėse. Mediatoriaus komplekso sudėtis (a) (Molecular Cell Biology, sixth edition, 2007); mediatoriaus ir RNR Pol II komplekso struktūra (b) (Nature Structural Molecular Biology, v. 11, p. 394, 2004) 270

271 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.30 pav. RNR II polimerazės transkripcijos preiniciacijos komplekso schema (Current Biology, v. 19, R153, 2009) 5.5. Transkripcijos valdymas prokariotuose Prokariotuose genų raiška gali būti valdoma transkripcijos, transkriptų brendimo ir transliacijos etapuose. Genų raiškos valdymas transkripcijos metu dažniausiai vyksta iniciacijos etape, elongacijos etape jis retas. Valdymas pasireiškia ir terminacijos metu, kai RNR polimerazė arba reaguoja į savitus terminacijos signalus, arba toliau tęsia transkripciją. Pamatinius genų valdymo principus bakterijose 1961 m. suformulavo Fransua Žakobas (Francois Jacob) ir Žakas Mono (Jacques Monod), atlikę E. coli lac operono ir λ bakteriofago tyrimus. Tolesni tyrimai parodė, kad šie principai galioja ir eukariotuose. Žakobas ir Mono pasiūlė, kad genų veikla yra valdoma atrankiai sąveikaujant trans veiksniams (angl. trans-acting factors) (dažniausiai baltymams) su cis veiksniais (angl. cis-acting factors) (dažniausiai DNR sritimis). Genas yra DNR seka, koduojanti tam tikrą produktą baltymą arba RNR. Geno produktas palieka sintezės vietą ir funkcionuoja kitur jis yra trans veikiantis. Cis veikančios sekos yra tos DNR sekos, kurios nepaverčiamos kokiu nors produktu ir funkcionuoja kaip sekos, darančios įtaką su jomis susijusiai DNR. Genų veikla valdoma atrankiai sąveikaujant trans veiksniams (dažniausiai baltymams) su cis veiksniais (dažniausiai DNR). Reguliatoriaus genas koduoja baltymą reguliatorių (arba RNR), kuris valdo kitų genų transkripciją prisijungdamas prie tam tikros DNR srities (sričių). 271

272 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Apibūdinant genų veiklos valdymo mechanizmus yra vartojami terminai struktūrinis genas (angl. structural gene) ir reguliatoriaus genas (angl. regulator gene). Struktūrinis genas koduoja produktą baltymą arba RNR. Struktūrinių genų produktų funkcijos ląstelėje yra pačios įvairiausios. Reguliatoriaus genas koduoja produktą baltymą ar RNR, kuris dalyvauja valdant kitų genų transkripciją. Transkripcijos reguliavimo pobūdis gali būti dvejopas. Teigiamasis reguliavimas pasireiškia, kai prisijungus baltymui reguliatoriui prie DNR, vyksta geno transkripcija. Neigiamojo reguliavimo atveju, prisijungus baltymui reguliatoriui, iki tol vykusi geno transkripcija yra stabdoma. Baltymų reguliatorių prisijungimo vietos dažniausiai (bet ne visuomet) yra išsidėsčiusios prieš struktūrinį geną netoli promotoriaus. Bakterijų transkripcijos valdymui būdingas ir teigiamasis, ir neigiamasis valdymo pobūdis. Neigiamojo genų transkripcijos valdymo atveju baltymas reguliatorius represorius (angl. repressor) prisijungia prie savitosios DNR srities netoli promotoriaus ir neleidžia prie jo prisijungti RNR polimerazei (5.31 pav.). Seka, prie kurios jungiasi baltymas represorius, yra cis seka. Ji yra greta promotoriaus, kartais persikloja su jo nukleotidų seka. Ši seka vadinama operatoriumi (5.31 pav). Esant teigiamajam genų transkripcijos valdymui, baltymas aktyviklis prisijungia netoli geno promotoriaus ir įgalina RNR polimerazę pradėti transkripciją. Baltymai transkripcijos represoriai ir aktyvikliai yra trans Genų transkripcijos valdymo pobūdis gali būti teigiamasis arba neigiamasis. Operatorius tai prokariotų DNR seka, prie kurios jungiasi baltymas represorius. veiksniai, atpažįstantys cis sekas, esančias dažniausiai prieš genus. Cis sekos yra labai trumpos, dažniausiai mažesnės nei 10 bp. Šios sekos yra svarbiausios atrankiam baltymų represorių ir aktyviklių prisijungimui, tačiau iš tikrųjų prisijungę baltymai reguliatoriai uždengia didesnį DNR fragmentą pav. Bakterijų operono organizacija (G. Karp. Cell Biology, sixth edition, 2010) 272

273 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Operonas Esminis skirtumas tarp genų organizacijos prokariotuose ir eukariotuose yra tas, kad, kitaip nei daugumos eukariotų genų, kurių transkripcija vyksta atskirai, prokariotų struktūriniai genai dažnai sudaro genų sankaupas, kurių transkripcija valdoma koordinuotai ir vyksta nuo vieno promotoriaus. Tokios prokariotų genų sankaupos vadinamos operonais. Operono molekulinį valdymo modelį 1966 m. pasiūlė F. Žakobas ir Ž. Mono. Operoną sudarantys genai transkribuojami kartu susintetinant policistroninį transkriptą. Cistronas reiškia vieną geną. Operonas dažnai turi 2 6 genus, tačiau yra operonų, turinčių 20 ir daugiau genų. Operonas yra reguliacinis vienetas, kurį sudaro struktūriniai genai ir elementai, valdantys jų transkripciją (promotorius, operatorius, terminatorius, baltymai represoriai ir / ar aktyvikliai) (5.31 pav.). Operonas yra reguliacinis vienetas, kurį sudaro struktūriniai genai ir jų transkripciją valdantys elementai Laktozės operonas Bakterijų struktūriniams genams, koduojantiems funkciškai susijusius baltymus, yra būdinga operono organizacija ir transkripcijos valdymas. Tokie, pvz., yra genai, koduojantys metabolizmo fermentus. Bakterijų lac operonas ir jo transkripcijos valdymas yra tipiškas prokariotų genų transkripcijos valdymo pavyzdys. Išnagrinėsime jį detaliau. Laktozės operoną laczya sudaro trijų struktūrinių genų sankaupa. Genų produktai įneša į ląstelę ir skaldo (metabolizuoja) β galaktozidus, pvz., laktozę (5.32 pav., a). Operono struktūrinių genų funkcijos yra šios: zlacz genas koduoja fermentą β galaktozidazę. Aktyvus fermentas yra ~ 500 kda tetrameras. Fermentas skaldo β galaktozidus į monosacharidus. Pvz., laktozė suskaldoma iki galaktozės ir gliukozės, kurios ląstelėje toliau metabolizuojamos (5.32 pav., a); z lacy genas koduoja laktozės permeazę. Baltymas (30 kda) yra ląstelės membranoje esančios transporto sistemos, kuri įneša β galaktozidus į ląstelę, komponentas; z laca genas koduoja tiogalaktozido transacetilazę. Fermentas katalizuoja acetilgrupės pernašą nuo acetil-coa (A acetilkofermento) ant β galaktozidų. Manoma, kad jo katalizuojama modifikacija sumažina tiogalaktozidų toksiškumą. Laktozės operoną genų transkripciją valdo baltymas reguliatorius, kurį koduoja laci genas, išsidėstęs kitoje chromosomos vietoje. Pasitaiko, kad laci genas bakterijose yra išsidėstęs netoli lac operono genų, tačiau visais atvejais jo transkripcija vyksta atskirai nuo lac operono genų. laci genas turi savo promotorių ir terminatorių. laci geno transkripcija nėra valdoma ir priklauso nuo RNR polimerazės savybės jungtis ties geno promotoriumi ir inicijuoti transkripciją. lac operono transkripcijos valdymo pobūdis yra neigiamasis. Transkripcija vyksta, kol jos nesustabdo baltymas reguliatorius. Baltymo reguliatoriaus mutacijos lemia nuolatinę operono transkripciją. laci geno produktas dar vadinamas lac represoriumi (angl. lac repressor). Repre- 273

274 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5.32 pav. Bakterijų lac operono transkripcijos valdymas. Laktozės skaidymas į galaktozę ir gliukozę (a); lac operono indukcijos schema (b) (G. Karp. Cell Biology, sixth edition, 2010) 274

275 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) sorius yra homotetrameras, kurį sudaro 38 kda monomerai. Laukinio tipo E. coli ląstelėse yra ~ 10 represoriaus molekulių (tetramerų). Kaip veikia laci represorius? LacI baltymas prisijungia ties savitomis operatoriaus sekomis lac operone (5.32 pav., b). lac operono struktūroje yra ne viena, bet trys operatoriaus sekos (O1, O2 ir O3), prie kurių gali jungtis baltymas represorius. Kiekvienas tetramerinio baltymo sudėtyje esantis dimeras gali prisijungti prie vienos operatoriaus sekos. Taigi, tetrameras vienu metu gali prisijungti prie dviejų operatoriaus DNR sekų. O1 operatoriaus seka yra išsidėsčiusi ties pirmuoju struktūriniu operono lacz genu. O2 ir O3 operatoriaus sekos yra išsidėsčiusios už O1 operatoriaus sekos (+410 bp už transkripcijos pradžios nukleotido) ir prieš O1 operatoriaus seką ( 81 bp prieš transkripcijos pradžios nukleotidą). Baltymo represoriaus giminingumas O1 operatoriaus sekai yra didžiausias. Operatoriaus DNR seka yra palindrominė seka, kurią atpažįsta ir prie kurios jungiasi baltymas represorius (5.33 pav., a). Ties kiekvienu palindrominės sekos invertuotu pasikartojimu prisijungia represoriaus monomeras. Su DNR sąveikauja baltymo monomero spiralės-posūkiospiralės motyvas: dvi jo α spiralės sąveikauja su savitosiomis DNR heterociklinėmis bazėmis didžiajame DNR griovyje. Šis motyvas yra baltymo monomero N gale galvos domene (angl. headpiece). Galvos domenui priklauso ir maža α spiralė sąvara (angl. hinge) (5.33 pav., b). Sąvara įgyja struktūrą tik prisijungusi prie operatoriaus DNR mažojo griovio. Centrinė baltymo struktūros dalis yra šerdis (angl. core), o C gale yra α spiralė, turinti du heptadinius leucino aminorūgščių liekanų pasikartojimus. Ši sritis lemia baltymo represoriaus oligomerizaciją. Ties viena operatoriaus seka jungiasi vienas baltymo dimeras. Baltymo represoriaus tetrameras vienu metu gali prisijungti ties dviem iš trijų (O1, O2, O3) operatoriaus DNR sekų. Prisijungus represoriaus tetramerui prie dviejų operatoriaus sekų, jas skirianti DNR sudaro kilpą. Baltymo represoriaus jungimasis ties daugiau nei viena operatoriaus seka didina transkripcijos slopinimą. Pašalinus O2 arba O3 operatoriaus seką, slopinimas sumažėja 2 4 kartus, o pašalinusjas abi net 100 kartų. Nėra nustatyta, kodėl represoriaus jungimasis ties dviem operatoriaus sekomis didina transkripcijos slopinimą. Prisijungęs prie operatoriaus, baltymas represorius neleidžia prie promotoriaus prisijungti RNR polimerazei ir pradėti lac operono struktūrinių genų transkripcijos. Kaip tuomet ji vyksta? Lac operono transkripcija yra indukuojama. Genų, koduojančių metabolizmo fermentus, transkripcijos indukcija vyksta, kai aplinkoje yra savito substrato. Nesant substrato, transkripcija stabdoma. Toks genų transkripcijos valdymas yra labai paplitęs bakterijose ir vienaląsčiuose eukariotuose (mielėse). Taip mikroorganizmai geriau prisitaiko prie aplinkos pokyčių. Nesant augimo terpėje β galaktozidų (laktozės), bakterijose nesintetinama ir juos skelianti β galaktozidazė. Ląstelėje yra tik kelios fermento molekulės. Esant terpėje β galaktozidų, fermento sintezė išauga iki kelių tūkstančių molekulių. Pakeitus augimo terpę į terpę, kurioje nėra β galaktozidų, pvz., laktozės, β galaktozidazė toliau nebesintetinama. Kokiu būdu induktorius laktozė pakliūva į ląstelę, jeigu lac operono transkripcija yra slopinama ir nesintetinamas laktozės įnašai reikalingas fermentas β galaktozido permeazė? Ląstelėje visuomet yra kelios baltymo molekulės, kurių užtenka, kad tam tikras kiekis induktoriaus molekulių pakliūtų į ląstelę. RNR polimerazė, atsitiktinai disocijavus baltymui represoriui, prisijungia ir sintetina irnr (vyksta bazinė operono transkripcija). To užtenka, kad būtų sisusintetinta tam tikras kiekis baltymo. Be to, induktorius gali pakliūti į ląstelę ir kitais pernašos keliais. 275

276 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Laktozė, tiksliau jos izomeras alolaktozė, yra lac operono induktorius. Induktorius sąveikauja su laisvu baltymu represoriumi ir su represoriumi, prisijungusiu ties operatoriaus DNR. Dėl sąveikos su induktoriumi represorius tampa neaktyvus sumažėja jo giminingumas DNR. Baltymai represoriai praranda gebėjimą jungtis su operatoriaus DNR sekomis (laisvas represorius nebesijungia su DNR, o prisijungęs disocijuoja). Tuomet prie lac operono promotoriaus 5.33 pav. Bakterijų lac operono transkripcijos represoriaus struktūra ir veikimas. lac operono operatoriaus DNR struktūra (a); LacI represoriaus monomero bei tetramero komplekso su DNR erdvinės struktūros (b) ( 276

277 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) DNR, iki tol užimtos represoriaus, prisijungia RNR polimerazė: vyksta operono genų transkripcija (5.32 pav., b). Laktozės operono represorius turi dvi savitas sritis: viena sritimi jis jungiasi prie operatoriaus DNR, kita prijungia induktoriaus laktozės molekulę. Prisijungus laktozei, keičiasi represoriaus molekulės konformacija, kartu ir sąveikos su DNR sritis. Represorius nebegali prisijungti prie operatoriaus DNR. Toks baltymo aktyvumo valdymo būdas, kai viena jo sritis keičia kitos srities aktyvumą, vadinamas alosteriniu valdymu (angl. allosteric control). Veikiant induktoriui, lac operono genai transkribuojami kartu, o ribosomose vyksta visų operono koduojamų polipeptidų sintezė. Kai fermentų koncentracija didelė, induktorius (laktozė), kuris kartu yra ir β galaktozidazės substratas, yra suskaidomas. Laktozės koncentracija sumažėja. Sumažėjus viduląstelinei induktoriaus koncentracijai, jis disocijuoja nuo baltymo represoriaus, o šis tampa aktyvus ir jungiasi prie lac operatoriaus. lac operono transkripcija slopinama (5.32 pav.). Ne visos molekulės, indukuojančios fermentų sintezę, yra jų ir metabolizuojamos kaip, pvz., laktozė. Induktoriai, kurie, patekę į ląstelę, ilgai lieka nesuskaldyti ir indukuoja genų transkripciją, vadinami nemokamais induktoriais (angl. gratuitous inducers). Tam tikru cheminiu būdu susintetinti induktoriai yra panašūs į gamtinius induktorius ir plačiai naudojami biotechnologijoje reikalingų genų transkripcijai indukuoti. Toks yra, pvz., tiogalaktozidas izopropiltiogalaktozidas IPTG. IPTG nėra β galaktozidazės substratas, tačiau labai veiksmingai indukuoja lac operono, arba genų, patalpintų už lac promotoriaus, transkripciją. IPTG prisijungia plyšyje tarp LacI baltymo represoriaus monomerų šerdinių domenų ir juos išskiria. Esant IPTG, tik vieno monomero DNR prijungiantis domenas sąveikauja su DNR didžiuoju grioviu, todėl represoriaus sąveika su operatoriaus DNR silpnėja. Bakterijų lac operono transkripcija yra ne tik neigiamojo valdymo taikinys. Transkripcijai būdinga ir teigiamoji reguliacija. Teigiamoji reguliacija bakterijose buvo atrasta tiriant vadinamąjį gliukozės efektą. Bakterijoms augant terpėje, kurioje greta kitų anglies šaltinių, pvz., laktozės, yra gliukozės, pirmiausiai yra metabolizuojama gliukozė. Gliukozė tiesiogiai skaidoma glikolizės cikle, ją metabolizuoti bakterijoms paprasčiau negu kitus sacharidus, kurių metabolizmui reikia susintetinti papildomų fermentų. Kol augimo terpėje yra gliukozės, laktozės metabolizme dalyvaujančių fermentų (lac operono transkripcija) sintezė slopinama. Kai gliukozė sunaudojama, indukuojama genų, koduojančių kitų terpėje esančių sacharidų metabolizmo fermentus, transkripcija. Reiškinys, kai operono genų transkripciją valdo ne jų koduojamų fermentų substratas, bet kitas katabolitas, vadinamas kataboliniu slopinimu. Transkripcijos valdymas katabolinio slopininimo būdu būdingas daugeliui bakterijų operonų (lac, gal, ara, kt.), koduojančių cukrų metabolizmo fermentus. Kai katabolinio slopinimo molekulinis mechanizmas buvo ištirtas, paaiškėjo, kad iš tikrųjų jis yra ne slopinimo, bet transkripcijos aktyvinimo mechanizmas. lac operono transkripcijos aktyvinimas vyksta, kai gliukozės koncentracija augimo terpėje yra maža. Transkripcijos aktyviklis yra CRP baltymas (angl. cyclic AMP receptor protein), prijungiantis nedidelę molekulę ciklinį adenozino monofosfatą, camp (5.34 pav., a). CRP baltymas (anksčiau vadintas CAP) yra 210 aminorūgščių polipeptidų homodimeras. camp atradimas bakterijų ląstelėse 1965 m. buvo ne- 277

278 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA tikėtas: iki tol manyta, kad jis dalyvauja tik eukariotų metabolizme. camp koncentracija bakterijose priklauso nuo gliukozės koncentracijos: kuo gliukozės koncentracija augimo terpėje yra didesnė, tuo camp koncetracija ląstelėje yra mažesnė, ir atvirkščiai. camp sintetina fermentas adenilato ciklazė, ciklizuodamas 3-5 fosfoediesterinį ryšį (5.34 pav., a). Adenilato ciklazę aktyvina fosforilintas IIA baltymas. Kai gliukozės koncentracija ląstelėje yra didelė, IIA baltymas defosforilinamas, adenilato ciklazė neaktyvinama, o camp sintezė sumažėja. Transkripcijos aktyviklis CRP baltymas atrankiai prisijungia prie DNR greta lac promotoriaus tik būdamas komplekse su camp (5.34 pav., b c). Taigi, CRP baltymas yra aktyvus tik prisijungus prie jo mažai molekulei induktoriui. Prie DNR prisijungia CRP baltymo dimeras. Konservatyvios sritys, prie kurių jungiasi CRP-cAMP kompleksas, nėra didelės. Svarbiausias sekos elementas yra pentameras 5 TGTGA3. Mutacijos šiose srityje slopina CRP veikimą pav. CRP baltymo erdvinė struktūra ir sąveika su DNR. camp struktūra ir sintezė (a); camp-crp- DNR komplekso erdvinė struktūra (b) (M. K. Campbell and S. O. Farrell, Biochemistry, seventh edition, 2012); camp-crp sąveika su promotoriaus DNR ir RNR polimeraze. αctd RNR Pol α subvieneto C galinis domenas, αntd N galinis domenas (c) (R. F. Weaver. Molecular Biology, fifth edition, 2012) 278

279 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) CRP dimeras jungiasi prie dviejų (invertuotų) pentamerų, tačiau daugelyje prisijungimo vietų antrojo pentamero nėra, ir antrasis CRP baltymo monomeras prisijungia prie kitokios DNR sekos. CRP prisijungimo sekos genų transkripcijos pradžios nukleotido atžvilgiu išsidėsčiusios įvairiai: lac operone jos greta promotoriaus ( 61), gal operone promotoriuje ( 41), ara operone gerokai nutolusios nuo promotoriaus ( 92). Prisijungęs prie promotoriaus DNR, transkripcijos aktyvikis keičia DNR struktūrą lenkia ją ~ 90 kampu (5.34 pav., b). Manoma, kad DNR lenkimas arba palengvina CRP sąveiką su RNR polimeraze ties promotoriumi ir įgalina ją pradėti transkripciją, arba tiesiogiai daro įtaką tranksripcijai. Nesant transkripcijos aktyviklio, RNR polimerazės sąveika su promotoriumi silpna, transkripcijos iniciacija nevyksta. Panašiu principu veikia ir kiti transkripcijos aktyvikliai, kurie prisijungia prie promotorių bei gretimų sričių DNR: jie įgalina RNR polimerazę transkribuoti geną. Taigi, lac operono indukcijai reikia laktozės (išaktyvinti LacI represorių) ir sumažėjusios gliukozės koncentracijos (aktyvinti camp sintezę ir kartu aktyvinti CRP). CRP baltymas yra ne tik lac operono, bet daugelio bakterijos genų transkripcijos aktyviklis Triptofano operonas Bakterijų laktozės operono genai koduoja fermentus, katabolizuojančius β galaktozidus. lac operono transkripcija indukuojama, kai yra induktorių substratų. Kitokiu būdu yra valdoma tam tikrų aminorūgščių biosintezės fermentus koduojančių genų transkripcija. Kol aminorūgščių ląstelėje pakanka, jų biosintezės genų transkripcija slopinama. Kai aminorūgščių ima stigti, transkripcijos slopinimas nevyksta. Tokio transkripcijos valdymo pavyzdys yra bakterijų triptofano (trp) operonas. Triptofano operoną sudaro penki struktūriniai genai ir promotoriaus-operatoriaus sritis (5.35 pav. ir 5.36 pav., a). Struktūriniai genai koduoja fermentus, sintetinančius triptofaną iš chorizminės rūgšties. Operono transkripciją slopina baltymas Trp represorius (58 kda), kurį koduoja trpr genas, išsidėstęs kitoje chromosomos srityje. Triptofano operono represoriaus dimeras prisijungia prie savitos operatoriaus srities trp operone, tik sudaręs kompleksą su ligandu triptofanu, ir stabdo transkripciją. Triptofanas yra trp operono korepresorius (angl. corepressor). Laisvas Trp represorius yra neaktyvus (aporepresorius). Kai triptofano koncentracija ląstelėje sumažėja, triptofanas disocijuoja iš komplekso, o baltymas represorius nuo operatoriaus DNR srities. RNR polimerazė jungiasi prie promotoriaus, vyksta triptofano biosintezės genų transkripcija. Trp represorius valdo ne tik trp operono, bet ir dar kelių operonui nepriklausančių genų (aroh ir savo paties geno trpr0) transkripciją, prisijungdamas prie juose esančių operatorių sričių. Toks valdymo būdas yra autogeninis valdymas. Triptofano operono transkripcija valdoma dar ir kitu būdu ateniuacijos (5.36 pav., b). Ateniuacijos būdu valdomi dar mažiausiai šeši E. coli operonai. Transkripcijai valdyti pasitelkiamas ateniuatorius RNR struktūra (segtukas), kuri gali susidaryti transkripcijos vieneto pradžioje. Jeigu RNR segtukas susidaro, RNR polimerazė nebegali tęsti struktūrinių genų transkripcijos, įvyksta transkripcijos terminacija; jeigu ne RNR polimerazė tęsia transkripciją. 279

280 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5.35 pav. trp operono transkripcijos valdymas (G. Karp, Cell Biology, sixth edition, 2010) 280

281 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.36 pav. Bakterijų trp operono transkripcijos valdymas ateniuacijos būdu. trp operono struktūrinė organizacija (a); lyderinės sekos ir lyderinio peptido struktūra (b); ateniuacijos schema (c) (R. F. Weaver. Molecular Βiology, fifth edition, 2012) 281

282 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Išnagrinėsime bakterijų trp operono transkripcijos valdymą ateniuacijos būdu. Apie trp operono valdymą ateniuacijos būdu buvo sužinota, kai pašalinus DNR seką tarp operatoriaus ir pirmojo operono struktūrinio geno trpe, genų transkripcija padidėjo. Šis efektas nepriklausė nuo operono slopinimo: pašalinus seką, transkripcija padidėjo tiek vykstant, tiek nevykstant slopinimui. Tai paliudijo, kad pašalintoji seka darė įtaką jau prasidėjusiai operono transkripcijai. Triptofano operono ateniuatorius vidinis terminatorius yra tarp promotoriaus ir trpe struktūrinio geno (5.36 pav., a). Susidaręs susintetintoje RNR, jis stabdo tolesnę transkripciją. Ties vidiniu terminatoriumi nutrūksta trp operono genų transkripcija tiek in vivo, tiek in vitro. Susidaro ~ 140 nukleotidų ilgio transkriptas. Ar įvyks terminacija ties ateniuatoriumi ar ne, priklauso nuo triptofano koncentracijos ląstelėje. Kai yra daug triptofano, operono transkripcija stabdoma. Dauguma (~ 90 %) RNR polimerazių, po transkripcijos iniciacijos palikusios promotorių, ties ateniuatoriumi yra stabdomos. Kai triptofano yra mažai, sintetinamas visas policistroninis trp operono transkriptas (5.36 pav., a). Be to, jei trūksta triptofano, transkripcijos slopinimas ties operatoriumi nevyksta, taigi, transkripcijos iniciacijos dažnis ties promotoriumi taip pat išauga. Iš viso trp transkripcijos veiksmingumas išauga iki 700 kartų. Kokiu būdu ateniuacija priklauso nuo triptofano koncentracijos? Signalai ateniuacijai vykti yra trp operono lyderinėje sekoje (angl. leader sequence). Lyderinė seka yra išsidėsčiusi vadinamojoje trpl srityje (5.36 pav., a). Seka koduoja 14 aminorūgščių polipeptidą, kuriame yra dvi viena šalia kitos esančios triptofano aminorūgštys. Lyderinė seka turi ribosomų prisijungimo sritį ir transliacijos terminacijos (STOP) kodoną (5.36 pav., b). Lyderinė seka, po to, kai susintetinama jos irnr, gali sudaryti dvejopą antrinę struktūrą (5.36 pav., c). Kokia antrinė irnr struktūra susidarys, priklauso nuo ribosomų gebėjimo transliuoti irnr. Pirmoji lyderinės sekos RNR struktūra susidaro tarp 1 ir 2 bei 3 ir 4 sričių. Tarpusavyje komplementarios 3 ir 4 sritys sudaro segtuko struktūrą, už kurio yra 8 uridino nukleotidai. Ši struktūra veikia kaip įprastas transkripcijos terminatorius: ji yra esminis ateniuacijos elementas. Antroji lyderinės sekos struktūra susidaro, kai susintetintos RNR 1 sritis negali sudaryti komplementarios sąveikos su 2 sritimi. Taip nutinka tuo atveju, kai dėl triptofano stygiaus ribosomos sustoja ties Trp kodonais (kol į ribosomas nepaklius triptofanil-trnr Trp ) ir uždengia 1 sritį. RNR polimerazė sintetina visą ~ nukleotidų trp operono irnr (5.36 pav., c). Kai triptofano koncentracija maža, ribosomos jungiasi prie pradėtos sintetinti trpl irnr. Pasiekusios Trp kodonus, ribosomos ties jais sustoja, nes ląstelėje nepakanka triptofaną turinčių trnr (triptofanil-trnr Trp ). Tuo pat metu RNR polimerazė tęsia trp genų irnr sintezę. Transkripte, ties kuriuo nėra prisijungusių ribosomų (~ 90 nukleotidų fragmentas), susidaro antrinė RNR struktūra segtukas (tarp komplementarių irnr 2 ir 3 sričių) (5.36 pav., c). Segtukas netrukdo RNR polimerazei pabaigti transkripto sintezės. Kai triptofano yra pakankamai, ribosomos greitai jungiasi prie lyderinės sekos, vyksta transliacija. 1 ir 3 sritys tampa laisvos ir sąveikauja atitinkamai su 2 sritimi ir 4 sritimi. Lyderinėje sekoje susidaro struktūra, veikianti kaip RNR polimerazės terminatorius. RNR polimerazė sustoja. Tuo metu ribosomos, pasiekusios lyderinio peptido STOP kodoną, disocijuoja. Sustabdyta vidinio terminatoriaus, iš transkripcijos komplekso disocijuoja ir RNR polimerazė. Susintetinama 133 nukleotidų irnr. 282

283 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Kiti bakterijų operonai Praėjusio amžiaus antrojoje pusėje atlikti bakterijų lac, trp, SOS sistemų, λ bakteriofago reguliacinių sistemų tyrimai patvirtino F. Žakobo ir Ž. Mono teiginį, kad genų raiška dažniausiai yra valdoma genų transkripcijos metu, ir valdymo principas yra atranki baltymų reguliatorių ir DNR sąveika. Nustatyta didelė transkripcijos valdymo būdų įvairovė: valdymas pasitelkiant keletą operatorių bei promotorių, daugelio operonų valdymas vienu represoriumi, baltymų reguliatorių sąveika su DNR ją lenkiant, ankstyvoji transkripcijos terminacija ir t. t. Pvz., bakterijos galaktozės operono (gal), kurio koduojami genai skaldo galaktozę (galaktozė yra lac operono koduojamos β galaktozidazės reakcijos produktas), transkripcijai valdyti pasitelkia du promotorius. gal operonas yra neigiamai reguliuojamas baltymo represoriaus 5.37 pav. Bakterijų ara operono transkripcijos valdymas. ara operono transkripcija, esant ir nesant arabinozės (a); AraC represorių koduojnčio geno tanskripcijos valdymas (b) (R. F. Weaver. Molecular Βiology, fifth edition, 2012) 283

284 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA panašiu būdu kaip ir lac operonas. gal operone prieš struktūrinius genus yra išsidėstę du promotoriai, S1 ir S2, kurių tipiškos sekos persikloja. Transkripcijos pradžios nukleotidų padėtys skiriasi 5 nukleotidais. Transkripcija nuo S1 promotoriaus yra valdoma katabolinio slopinimo būdu. Kai augimo terpėje yra gliukozės, transkripcija nevyksta. Tuo metu kitas S2 promotorius yra aktyvus. Bakterijų ara operono transkripcijos valdymas yra dar kitoks. Trys operono struktūriniai genai arab, araa ir arad koduoja fermentus, metabolizuojančius arabinozę į ksilulozės 5 fosfatą. arac genas koduoja reguliacinį baltymą, kuris jungiasi su arabinoze. Arabinozė yra ara operono induktorius. Prisijungęs arabinozę, reguliatorius tampa aktyvus, jungiasi ties savitąja arai sritimi (5.37 pav., a). Tačiau to nepakanka transkripcijai indukuoti. Gretimoje srityje turi būti prisijungęs camp-crp kompleksas. Tuomet vyksta ara genų transkripcija. Kai arabinozės augimo terpėje yra mažai, AraC baltymas veikia kaip represorius ir prisijungia prie dviejų operatoriaus sričių arao 1 arao 2, taip pat prie srities arai (5.37 pav., a). AraC molekulės, prisijungusios prie arao 2 ir arai sričių DNR, sąveikauja tarpusavyje: susidaro DNR kilpa, ara operono genų transkripcija stabdoma. arao 2 sritis yra arac geno promotoriuje: prisijungus AraC baltymui ties šia sritimi, stabdoma arac geno transkripcija (5.37 pav., b). Taigi, arac geno transkripciją valdo pats geno produktas AraC baltymas. Toks transkripcijos valdymo būdas yra vadinamas transkripcijos autoreguliavimu. Taigi, AraC transkripcijos reguliatorius veikia ir kaip transkripcijos aktyviklis, ir kaip represorius. Tokiu valdymo būdu reguliuojama ir kai kurių kitų prokariotų genų transkripcija (pvz., λ bakteriofago transkripcijos ci represorius veikia panašiai) Griežtasis atsakas Kai trūksta medžiagų apsirūpinti ląstelei aminorūgštimis, ląstelėje slopinami tam tikri gyvybiškai svarbūs procesai. Toks valdymo būdas vadinamas griežtuoju atsaku (angl. stringent response). Griežtojo atsako metu ląstelės metabolizmas yra minimalus, o kai maisto medžiagų aplinkoje padaugėja, metaboliniai procesai suaktyvėja. Griežtojo atako metu rrnr ir trnr sintezė sumažėja kartų, o visų RNR sintezė 5 10 %. Išauga baltymų ardymas, tai, savo ruožtu, sumažina nukleotidų, angliavandenių, lipidų sintezę. Griežtąjį atsaką sukelia arba kurios nors aminorūgšties trūkumas, arba mutacija aminorūgštis prie trnr jungiančiose aminoacil-trnr sintetazėse. Griežtojo atsako metu yra sintetinami du netipiški nukleotidai, vadinami alarmonais. Alarmonas ppgpp turi prijungtus difosfatus nukleozido 3 ir 5 galuose. Alarmonas pppgpp turi prijungtą trifosfatą guanozino 3 gale ir difosfatą 5 gale. Alarmonai yra mažos molekulės efektoriai, kurie prisijungia prie baltymų ir keičia jų aktyvumą. Alarmonas ppgpp valdo keletą procesų, tarp jų transkripcijos slopinimą. Pvz., ppgpp slopina transkripcijos iniciaciją ties rrnr genų promotoriais, taip pat slopina transkripcijos elongaciją ties daugeliu genų, sukeldamas RNR polimerazių pauzes. 284

285 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 5.6. Transkripcijos valdymas eukariotuose Fenotipinius skirtumus, kuriais pasižymi eukariotų ląstelės, lemia skirtinga genų, kurių transkripciją vykdo RNR Pol II, raiška. Ji valdoma keliais pagrindiniais būdais reguliuojant: z chromatino struktūrą; z transkripcijos iniciaciją ir elongaciją; z transkriptų brendimą; z transkriptų įnašą į citozolį; z transkriptų transliaciją; z transkriptų skaidymą ir apykaitą. Genų raiška pirmiausiai priklauso nuo chromatino struktūros geno promotoriaus vietoje ir DNR srityje aplink jį. Aktyviai transkribuojami genai yra euchromatino srityse, jų DNR jautri DNazių poveikiui. Dažniausiai genų raiška valdoma darant įtaką transkripcijos iniciacijai. Transkripcijos iniciacijos metu daugelis baltymų, prisijungusių ties genų promotorių ir stipriklių sritimis, sąveikauja tarpusavyje ir su RNR II polimeraze. Veiksnius, dalyvaujančius transkripcijoje ir jos valdyme, galima skirstyti į kelias grupes: z pagrindiniai transkripcijos veiksniai: jie kartu su RNR II polimeraze sudaro bazinį transkripcijos aparatą ir prisijungia ties geno promotoriumi; z transkripcijos aktyvikliai (angl. activators); z transkripcijos represoriai (angl. repressors). Aktyvikliai ir represoriai eukariotuose atpažįsta savitas trumpas sekas promotoriuose ir stiprikliuose. Išskiriamos trys transkripcijos aktyviklių klasės: ztikrieji aktyvikliai (angl. true activators), tiesiogiai arba netiesiogiai (pvz., per koaktyviklius, angl. coactivators) sąveikaujantys su pagrindiniais transkripcijos veiksniais ir RNR Pol II ties genų promotoriais; zantirepresoriai (angl. antirepressors), kurie, prisijungę prie stipriklių sekų, pritraukia chromatiną pertvarkančius baltymus, o pastarieji išpakuoja chromatiną, t. y. apsaugo jį nuo slopinamos būsenos; z architektūriniai chromatino baltymai (angl. architectural proteins), galintys lenkti DNR ir taip suartinti transkripcijai aktyvinti reikalingus baltymus. Eukariotų transkripcijos represoriai veikia įvairiais būdais. Jie gali prisijungti prie transkripcijos veiksnių, uždengdami jų įnašos į branduolį sekas, kad pastarieji nepakliūtų į branduolį. Panašiu būdu gali būti valdoma ir paties represoriaus įnaša iš citozolio į branduolį. Represorius gali prisijungti prie transkripcijos aktyviklio, prisijungusio prie DNR (pvz., stipriklio), ir uždengti jo funkcinius domenus. Represorius ir aktyviklis taip pat gali konkuruoti dėl prisijungimo vietos stipriklio DNR sekoje. Skirtingų eukariotų genų transkripcijos iniciacija valdoma pasitelkiant įvairius anksčiau minėtų veiksnių derinius. 285

286 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Transkripcijos aktyviklių savybės Baltymai transkripcijos aktyvikliai skatina bazinio transkripcijos aparato susidarymą ties genų promotoriais ir tokiu būdu greitina transkripcijos iniciaciją. Eukariotų transkripcijos aktyvikliai yra modulinės struktūros baltymai, turintys kelis domenus. Svarbiausi domenai yra: prie DNR prisijungiantis domenas (angl., DNA binding domain), trans aktyvinamasis domenas (angl. trans-acitvating domain) ir domenas, atsakingas už dimerizaciją (angl. dimerization domain) (5.38 pav.). Kai kurie transkripcijos aktyvikliai dar turi domenų, kuriais sąveikauja su kitomis molekulėmis ligandais (pvz., hormonais). Aktyvikliai taip pat turi išnašos iš branduolio (angl. nuclear export sequence) ir įnašos į branduolį (angl. nuclear localization sequence) sekas. Paaiškėjo, kad kiekvienas aktyviklio domenas, patalpintas šalia kito tipo domeno, veikia nepriklausomai. Su DNR sąveikaujantys domenai užtikrina atrankų prisijungimą prie DNR netoli genų promotorių. Aktyvinamaisiais domenais transkripcijos aktyvikliai sąveikauja su baziniu transkripcijos aparatu. Dėl šių sąveikų skatinamas veiksmingesnis bazinių transkripcijos komponentų jungimasis prie geno promotoriaus. Pvz., TFIID veiksnys yra dažnas transkripcijos aktyvikių taikinys, nes jį sudaro daugelis baltymų TAF ų. Tai paaiškina, kodėl TBP baltymas, esantis TFIID sudėtyje, užtikrina tik bazinę transkripciją nuo genų promotorių, o veiksmingai transkripcijai vykti reikia viso TFIID veiksnio. Įvairūs jo sudėtyje esantys baltymai suteikia savo paviršius įvairiems baltymams aktyvikliams prisijungti pav. Eukariotų transkripcijos aktyviklių domenai. Domenų įvairovė (a); eukariotų transkripcijos aktyviklių domeninė organizacija (b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 286

287 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Tam tikri transkripcijos aktyvikiai turi tik domeną, užtikrinantį jų atrankų prisijungimą prie genų promotorių bei stipriklių, tačiau neturi aktyvinančio domeno. Todėl tokie transkripcijos aktyvikliai prijungia baltymus koaktyviklius (angl. coativators), turinčius tokius domenus. Transkripcijos aktyvikiai gali turėti savituosius koaktyviklius Transkripcijos aktyviklių atpažįstami atsako elementai Eukariotų genai, kurių transkripcijos valdymo pobūdis yra panašus (pvz., visų jų transkripcija aktyvinama atsakant į kokį nors aplinkos veiksnį, hormoną ir t. t.), turi promotorių ar stipriklių reguliacines sekas, kurias atpažįsta tas pats transkripcijos aktyviklis. Tokie sekų elementai yra vadinami atsako elementais (angl. response elements). Prisijungus prie atsako elemento savitam transkripcijos aktyvikliui, yra aktyvinama transkripcija. Genų atsako elementų pavyzdžiai 5.39 pav. Zinko piršto motyvo struktūra ir sąveika su DNR. Zinko piršto motyvo schema (a) (T. Brown. Introduction to Genetics: a Μolecular Approach, first edition, 2012); žmogaus transkripcijos aktyviklio Zif268, turinčio tris zinko piršto motyvus, ir DNR komplekso struktūra. Raudonos rodyklės žymi β struktūrą, žali rutuliukai Zn 2+ jonai (b) ( TFIIIA transkripcijos veiksnio ir DNR komplekso struktūra (c) (PNAS, v. 95, p. 2938, 1998) 287

288 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA yra temperatūrinio šoko atsako elementas, HSE (angl. heat shock response element), gliukokortikoidų atsako elementas, GRE (angl. glucocorticoid response element), serumo atsako elementas, SRE (angl. serum response element). Atsako elementai pasižymi trumpomis tipiškomis sekomis, prie kurių jungiasi transkripcijos aktyvikliai. Skirtinguose genuose tie patys atsako elementai yra panašūs, bet jų nukleotidų sekos nebūtinai yra identiškos. Promotoriuose atsako elementai yra išsidėstę prieš transkripcijos pradžios nukleotidą < 200 np. Vieno atsako elemento kopijos paprastai užtenka transkripcijos atsakui pasireikšti, tačiau jų gali būti ir daugiau. Atsako elementų yra ne tik promotoriuose, bet ir stiprikliuose. Tipiškas atvejis, kai grupės genų transkripcija valdoma to paties transkripcijos reguliatoriaus, yra genomo atsakas į temperatūrinį šoką. Koordinuotas genų transkripcijos atsakas į šį aplinkos veiksnį yra būdingas ir eukariotams, ir prokariotams. Bakterijose sintetinamas vienas iš RNR polimerazės σ veiksnių σ 32 veiksnys. Jis RNR polimerazės holofermento sudėtyje jungiasi ties savitosiomis promotorių sritimis ( 10 ir 35) temperatūrinio šoko atsako genuose. Esant temperatūriniam šokui, vyksta šių genų transkripcija. Eukarotuose temperatūrinio šoko genai promotoriuose turi HSE atsako elementus. Tokių genų yra ~ 20. Elementai išsidėstę genų promotoriuose įvairiose padėtyse. Prie HSE atsako elementų atrankiai jungiasi transkripcijos aktyviklis HSTF. HSE atsako elementai ir prie jų prisijungiantis transkripcijos veiksnys yra konservatyvūs eukariotuose: temperatūriniu šoku galima aktyvinti D. melanogaster temperatūrinio šoko genus, įterptus į jūrų ežio, žinduolių ląsteles. Kitas atsako elemento pavyzdys yra GRE elementas (5 AGAACANNNTGTTCT 3, kur N bet kuris nukleotidas). GRE seka yra palindromas. Joje yra dvi konservatyvios sritys ir vidurinė nekonservatyvi sritis. Prie dviejų GRE elemento sričių jungiasi dvi transkripcijos aktyviklio gliukokortikoido receptoriaus baltymo molekulės (5.39 pav.). Gliukokortikoidai (pvz., kortizolis) yra steroidiniai hormonai, gaminami antinksčių žievėje. Hormonų gamyba išauga streso, badavimo metu, esant dideliems fiziniams krūviams. Hormono veikimas pasireiškia tuo, kad jis skatina kepenų ląsteles gaminti gliukozę iš aminorūgščių ir kitų mažų molekulių. Tam reikia sintetinti metabolizmo fermentus, prieš tai aktyvinus juos koduojančių genų transkripciją. Gliukokortikoidai lengvai patenka į ląstelės branduolį, ten sąveikauja su savituoju receptoriumi. Gliukokortikoido receptorius kartu yra ir transkripcijos aktyviklis. Susijungęs su savo ligandu hormonu, baltymas jungiasi prie GRE atsako elemento, esančio grupės genų stiprikliuose ir smarkiai aktyvina genų transkripciją. Sumažėjus hormono kiekiui, transkripcija silpnėja Transkripcijos aktyviklių sąveikos su DNR motyvai Nustačius daugelio transkripcijos aktyviklių erdvines struktūras, paaiškėjo ir jų domenų, sąveikaujančių su DNR, struktūros. Juose esantys motyvai pagal jų erdvines struktūras skirstomi į keletą grupių: z cinko piršto motyvai; z steroidiniai receptoriai; 288

289 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) z spiralės-posūkio-spiralės motyvai; z spiralės-kilpos-spiralės motyvai; z leucino užtrauktuko motyvai. Motyvų struktūrų įvairovė liudija, kad eukariotų baltymai pasitelkia įvairių būdų sąveikauti su DNR. Transkripcijos aktyvikliai (dažnai jų erdvinė struktūra yra α spiralės) tokiais motyvais atrankiai sąveikauja su didžiuoju DNR grioviu 3 6 bp srityse. Susidarant nekovalentiniams ryšiams (Van der Valso, joniniams, vandeniliniams ryšiams) tarp baltymo aminorūgščių šoninių grupių ir DNR heterociklinių bazių didžiajame griovyje, atpažįstama savitoji DNR seka. Sąveika tarp aminorūgščių šoninių grupių ir deoksiribozių bei fosfatinių grupių taip pat stabilizuoja DNR-baltymo kompleksą. Cinko piršto motyvai (angl. zink finger). Cinko piršto struktūrinis motyvas pirmą kartą buvo nustatytas pagrindiniame TFIIIA transkripcijos veiksnyje, kuris reikalingas RNR Pol III 5S rrnr genų transkripcijai. Motyvo pavadinimas susijęs su jo struktūros ypatumais. Cinko pirštą sudaro baltymo ~ 23 aminorūgščių grupė, kurioje dvi cisteino ir dvi histidino aminorūgščių liekanos kartu koordinuoja po vieną cinko joną (Zn 2+ ) (5.39 pav., a). Cinko piršto motyve cisteino aminorūgščių liekanos yra β struktūroje, o histidino priešingoje pusėje esančioje α spiralėje (5.39 pav., a b). Aminorūgštys, neprijungiančios cinko, sudaro kilpą. Cinko piršto motyvas savo α spirale (C galinėje motyvo dalyje) jungiasi ties didžiuoju DNR grioviu. Cinko piršto motyvų dažniausiai yra ne vienas, o keli. Pvz., jau minėtame TFIIIA veiksnyje yra net 9 motyvai: jie užima kone visą baltymo erdvinę struktūrą (5.39 pav., b c). Steroidiniai receptoriai. Steroidiniai receptoriai sudaro savitą transkripcijos aktyviklių grupę, nes juos sieja funkcinis panašumas: kiekvienas receptorius yra aktyvinamas prisijungus tam tikram steroidui (ligandui). Steroidiniai receptoriai priklauso dar didesnei ligandais aktyvinamų aktyviklių grupei. Antinksčių žievės ląstelės gamina daugiau nei 30 skirtingų steroidų. Dvi didžiausias grupes sudaro jau minėtieji gliukokortikoidai ir mineralokortikoidai. Steroidinių receptorių (ir kai kurių kitų baltymų) motyvų, sąveikaujančių su DNR, erdvinė struktūra yra panaši į jau minėtą cinko piršto motyvą. Tačiau šis motyvas turi tik cisteino aminorūgščių liekanas, kurios suriša cinko (Zn 2+ ) joną. Kitaip nei Cys ir His aminorūgščių liekanas turintis motyvas, vien tik Cys liekanas 5.40 pav. Žmogaus progesterono receptoriaus dimero ir DNR komplekso erdvinė struktūra (PDB: 2C7A). Pilki rutuliukai Zn 2+ jonai 289

290 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA turinčių cinko piršto motyvų pasikartojimų baltymuose nėra daug: pvz., gliukokortikoidų ir estrogenų receptoriai jų turi po du. Du cinko pirštai sudaro dviejų α spiralių struktūras, kurios kartu sudaro didelę globulę. Aromatinės α spiralių aminorūgščių grupės kartu su jas jungiančia β struktūra sudaro hidrofobinį centrą. Du gliukokortikoidų receptoriai sudaro dimerą, kiekvienas monomeras sąveikauja su atsako elemento palindrominės sekos konservatyvia sritimi (5.40 pav.). Kiekviename monomere esantys du cinko pirštai pasižymi dvejopa funkcija. Vieno cinko piršto aminorūgštys sąveikauja su palindrominės sekos konservatyvia sritimi, o kito reguliuoja atstumą tarp kiekvieno monomero atpažįstamų DNR sričių atsako elemente. Kai kurie steroidiniai receptoriai veikia kaip homodimerai, kiti kaip heterodimerai. Homodimerinės struktūros steroidiniai receptoriai sąveikauja su palindrominėmis sekomis atsako elementuose. Heterodimerinės struktūros receptoriai atpažįsta tiesioginius sekų pasikartojimus, t. y. orientuotus ta pačia kryptimi. Kaip steroidiniai receptoriai kartu su ligandu, prisijungę ties atsako elementu, reguliuoja transkripciją? Jie tiesiogiai sąveikauja ne su baziniu transkripcijos aparatu, bet su baltymais koaktyvikliais, kurie, savo ruožtu, sąveikauja su transkripcijos komplekso komponentais. Spiralės-posūkio-spiralės (angl. helix-turn-helix, HTH) motyvai. Šie transkripcijos reguliatorių motyvai pirmiausiai buvo nustatyti bakteriofagų transkripcijos represorių erdvinėje struktūroje, vėliau aptikti ir transkripcijos aktyvikliuose. Viena motyve esanti α spiralė išsidėsto atsako elemento didžiajame DNR griovyje, kita pasisukusi kampu išilgai DNR (5.41 pav., a). Vienas šio tipo motyvų variantų yra homeodomenas. Homeodomenas pirmą kartą buvo nustatytas D. melanogaster genuose (homeotiniame lokuse), reguliuojančiuose ankstyvąjį vystymąsi. Homeodomenų turi ir žinduolių transkripcijos veiksniai. Motyvą sudaro ~ 60 amino pav. Transkripcijos veiksnių spiralės-posūkio-spiralės motyvo struktūra. Motyvo schema (a) ( Drosophila melanogaster homeodomeno motyvo ir DNR komplekso erdvinė struktūra (b) (PDB: 1AHD) 290

291 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) rūgščių liekanų. Jos formuoja tris α spirales. Didžiausiu aminorūgščių konservatyvumu pasižymi 3-ioji α spiralė (17 aminorūgščių liekanų). Ši α spiralė sąveikauja su didžiuoju DNR grioviu ji sudaro didžiąją dalį ryšių tarp baltymo ir DNR (5.41 pav., b). Įdomu, kad α spiralė išdėstoma DNR griovyje susidarant ryšiams tarp baltymo ir šoninių fosfatinių grupių. Kitos dvi α spiralės yra DNR išorėje. N galinė motyvo dalis, esanti prieš 1-ąją α spiralę, yra nukreipiama į mažąjį DNR griovį. Savitąją saveiką su DNR heterociklinėmis bazėmis lemia tik nedidelė dalis homeodomeno aminorūgščių, esančių motyvo N bei C galuose. Spiralės-kilpos-spiralės motyvai (angl. helix-loop-helix, HLH). Su DNR sąveikaujančių baltymų HLH motyvo struktūrą sudaro dvi α spiralės, kurias jungia kilpa (5.42 pav., a). Baltymams, turintiems HLH motyvą, būdinga ir kita savybė: jie sudaro dimerus (5.42 pav., a b). HLH motyve yra ~ aminorūgščių liekanų. Dvi motyvo α spiralės yra amfipatinės, t. y. vienoje α spiralių pusėje yra hidrofobinių aminorūgčių liekanos, kitoje hidrofilinių. Kilpos, skiriančios dvi α spi pav. Baltymų spiralės-kilpos-spiralės ir leucino užtrauktuko motyvai. Spiralės-kilpos-spiralės motyvo struktūrinė schema (a); motyvą turinčio Myc-Max baltymo dimero ir DNR komplekso erdvinė struktūra (b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); leucino užtrauktuko motyvo ir DNR komplekso erdvinė struktūra (c) ( 291

292 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA rales, dydis būna įvairus. HLH motyvą turintys baltymai gali būti homodimerai arba heterodimerai priklausomai nuo to, kokiomis hidrofobinėmis α spiralių aminorūgštimis jie sąveikauja. Daugeliui HLH motyvą turinčių baltymų yra būdinga bazinėmis savybėmis pasižyminti 15 aminorūgščių sritis, esanti prieš HLH motyvą. Joje yra ~ 6 konservatyvios aminorūgštys. Būtent ši sritis nulemia baltymo sąveikos su DNR atrankumą. Tokių baltymų spiralės-kilpos-spiralės motyvas dar vadinamas bhlh motyvu. bhlh motyvą turintys baltymai visuomet sąveikauja su DNR kaip dimerai. Galimybė sudaryti heterodimerus ypač padidina DNR taikinių įvairovę. Ląstelėje, sintetinančioje penkis skirtingus polipeptidus su HLH motyvais, gali susidaryti 32 skirtingi transkripcijos veiksnių dimerai, sąveikaujantys su skirtingomis DNR sekomis. Ne visų kombinacijų dimerai vienodai stipriai sąveikauja su DNR sekomis. Nėra nustatyta, kaip įvairių kombinacijų dimerai atpažįsta mažai besiskiriančias nukleotidų sekas. HLH motyvus turintys transkripcijos veiksniai yra vieni iš pagrindinių genų, lemiančių tam tikrų audinių (pvz., raumenų) diferenciaciją, transkripcijos reguliatorių. Šie veiksniai svarbūs kontroliuojant ląstelių proliferaciją ir yra susiję su tam tikrais vėžio tipais. Leucino užtrauktuko motyvas (angl. leucine zipper motiv). Motyvą turintys transkripcijos veiksniai taip pat pasižymi savybe dimerizuotis. Motyvą sudaro aminorūgščių liekanų, kurios formuoja amfipatinę α spiralę. Jo pavadinimas susijęs su tuo, kad spiralėje kas 7 aminorūgšties liekana yra leucinas. α spiralės sūkyje telpa 3,5 aminorūgšties liekanos, todėl leucino užtrauktuko motyve leucino aminorūgščių liekanos išsidėsto vienoje (hidrofobinėje) α spiralės pusėje (5.42 pav., c). Du leucino užtrauktuko motyvus turintys polipeptidai sąveikauja tarpusavyje sudarydami superspiralės struktūros dimerą. Superspiralėje vieno monomero α spiralės leucino aminorūgščių liekanų šoninės grupės įsiterpia tarp kito monomero α spiralės leucino šoninių grupių. Kaip leucino užtrauktuko motyvas sąveikauja su DNR? Kiekvieno baltymo monomero struktūroje šalia α spiralės yra bazinių aminorūgščių liekanų sritis, kuri sąveikauja su DNR. Sekos, su kuriomis sąveikauja motyvą turintys baltymai, yra palindromai, jų neskiria joks tarpas. Baltymų dimero, sąveikaujančio su DNR, struktūra primena apverstą Y raidę: stiebą sudaro dviejų α spiralių superspiralė, o kiekvieno monomero bazinių aminorūgščių fragmentai dvi rankas (angl. arm) (5.42 pav., c). Ši struktūra vadinama bzip. AP1 transkripcijos aktyviklis yra leucino užtrauktuko motyvą turinčio transkripcijos veiksnio pavyzdys. AP1 yra heterodimeras, sudarytas iš dviejų polipeptidų, koduojamų genų c-fos ir c-jun. Abu genai yra svarbūs ląstelių proliferacijai, jų mutacijos sukelia vėžinę transformaciją Mažosios RNR ir genų raiškos valdymas Genų raiška prokariotuose ir eukariotuose valdoma pasitelkiant ne tik baltymus, bet ir RNR. Kai kuriuos tokio valdymo pavyzdžius bakterijose (ribojungiklius, ateniuaciją) aptarėme ankstesniuose skyriuose. Prokariotuose transkripcijos ir transliacijos procesai vyksta citozolyje, o eukariotuose jie atskirti erdvėje (transkripcija vyksta branduolyje, transliacija citozolyje). Eukariotų irnr molekulės daug stabilesnės nei eukariotų, todėl yra galimybė išplėsti tą genų raiškos valdymą, kurio taikiniai yra būtent irnr. Tam pasitelkiamos trumpos (20 30 nukleotidų) RNR molekulės mažosios RNR (angl. small RNA), kurios, sudariusios kompleksą su savitaisiais 292

293 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) baltymais (Argonautų šeimos baltymais, Ago), slopina trankripciją, RNR molekulių brendimą arba transliaciją. Mažųjų RNR fenomenas buvo atrastas tyrinėjant kirmėlės Cenorhabditis elegans vystymosi mutantus. Mutacijos buvo nustatytos ne baltymus koduojančiuose genuose, bet mažųjų RNR genuose. Tokią RNR kodavo reguliacinis lin-4 genas, kurio taikinys lin14 genas. C. elegans lin- 14 genas reguliuoja jos vystymąsi pirmose vystymosi stadijose. lin-4 genas koduoja 22 nukleotidų lin-4 RNR. 10 šios RNR nukleotidų yra komplementarūs lin-14 irnr 3 sričiai. lin-14 geno raiška slopinama, prie lin-14 irnr komplementarių sričių prisijungus kelioms lin-4 molekulėms (5.43 pav.). Susidarius tokiam kompleksui, slopinama lin-14 irnr transliacija. Vėliau paaiškėjo, kad irnr gali būti ir suardoma. Po kelerių metų C. elegans atrasta dar viena mažoji reguliacinė RNR let-7. Taip išaiškėjo, kad mažosios RNR yra universalus eukariotų genų raiškos valdymo būdas. Mažųjų RNR veikimo fenomeną 1999 m. paaiškino Endriu Fairas (Andrew Fire) ir Kreigas Melu (Craig Mello). Jie injekavo į kirmėles dvigrandinę RNR. Ši slopino geno taikinio raišką tais atvejais, kai turėjo irnr molekulei komplementarių sričių. Fenomeną tyrėjai pavadino RNR interferencija (angl. RNA interference, RNAi). Už šį atradimą jiems 2006 m. paskirta Nobelio medicinos premija. Mažųjų RNR sukeliamas efektas augaluose, konkrečiai, petunijose, buvo pastebėtas dar anksčiau, tačiau jo nesugebėta paaiškinti m. Ričardas Jorgensenas (Richard Jorgensen) su kolegomis įterpė į petunijas genus (transgenus), norėdami padidinti chalkono sintazės geno raišką. Panaudodami fermentą antocianino pigmentų gamybai, jie siekė gauti ryškesnes gėles. Netikėtai išaugo baltos su ryškiu piešiniu arba visiškai baltos gėlės. Tai paliudijo, kad už pigmento sintezę atsakingo geno raiška ne padidėjo, bet, atvirkščiai, buvo slopinama. Reiškinys pavadintas kosupresija, nes pasireiškė tiek endogeninių, tiek įterptų genų raiškos slopinimas. irnr sintezė sumažėjo apie 50 kartų. Šie eksperimentai sukėlė susidomėjimą, ir efektas imtas tyrinėti kituose eukariotiniuose organizmuose. Praėjus daugiau nei dvidešimčiai metų po mažųjų RNR atradimo, šiandien žinome, kad jų ląstelėse yra tūkstančiai. Mažosios RNR yra svarbūs eukariotų genų raiškos valdymo komponentai. Išskiriamos trys mažųjų RNR klasės: z mirnr (angl. micro RNA, mirna); z sirnr (angl. small interfering RNA, sirna); z pirnr (angl. PIWI-interacting RNA, pirna). Didžiausia mirnr molekulių klasė. Jų rasta visų gyvybės domenų organizmuose bei virusuose. mirnr koduojantys genai sudaro ~ 1 % aukštesniųjų eukariotų genomo. Nustatytų eukariotų mirnr skaičius jau perkopė Žmogaus ląstelėse yra > įvairių mirnr, o numanomų jų taikinių > Kai kurios mirnr konservatyvios tarp rūšių. Genome mirnr koduojantys genai gali būti išsidėstę telkiniais ir transkribuojami kartu. mirnr gali būti koduojamos baltymus koduojančių genų egzonuose ir intronuose (žinduoliuose ~ 70 % mirnr koduojamos tokių genų intronuose); taip pat ilgose nekoduojančiose RNR; kai kurios, manoma, gali būti transkribuojamos nuo savų promotorių. Didžiosios dalies mirnr transkripcijoje 293

294 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA dalyvauja RNR Pol II, kai kurias mirnr (esančias Alu pasikartojimuose) transkribuoja RNR Pol III. Augaluose kai kurias mirnr transkribuoja RNR Pol IV. Pirminiai mirnr transkriptai yra įvairaus ilgio, vidutinis jų ilgis ~ nt. RNR Pol II transkribuojamų mirnr galas modifikuojamas kaip ir pre-irnr molekulių. Funkcionalios yra subrendusios mirnr. 5.5 lentelė. Eukariotų mažųjų RNR savybės ir funkcijos 2 Savybės mirnr sirnr pirnr Ilgis ~ 22 nt ~ 21 nt ~ nt Brendime dalyvaujantys fermentai Susiję Ago baltymų pošeimai Veikimo mechanizmas Funkcijos Drosha ir Dicer Dicer Zucchini ir kiti nežinomi fermentai AGO AGO PIWI Transliacijos slopinimas; irnr ardymas Baltymus koduojančių genų raiškos valdymas irnr skaldymas Baltymus koduojančių genų raiškos ir transpozonų valdymas; priešvirusinė apsauga Transpozonų transkripcinis arba posttranskripcinis slopinimas Transpozonų slopinimas lytinėse ląstelėse (nelytinių ląstelių pirnr funkcijos menkai ištirtos) Išskiriami keli mirnr molekulių brandinimo etapai. Pirmojo etapo įvykiai vyksta branduolyje (5.44 pav.). Nesubrendusios pri-mirnr sudaro stiebo-kilpos struktūrą. Stiebo ilgis apie bp. Struktūrą atpažįsta ir skelia branduolio nukleazė Drosha. Drosha yra dvigrandinei RNR atranki endonukleazė, priklausanti RNazės III tipo baltymų šeimai. Baltymas yra dimerinės arba pseudodimerinės struktūros, turintis du RNazės III domenus (RIIID). Drosha veikia Mikroprocesoriaus komplekse (angl. Microprocessor complex) kartu su baltymu kofaktoriumi (žmogaus ląstelėse tai yra DGCR8 baltymas). Kofaktorius sąveikauja su pri-mirnr ir su Drosha. Mikroprocesoriaus komplekso baltymai yra konservatyvūs gyvūnų organizmuose, o augalų ląstelėse brendime dalyvauja tik į Drosha panašūs baltymai. Drosha skelia dvigrandinę pri-mirnr dviejose vietose ~ 11 bp atstumu nuo viengrandinių fragmentų (5.44 pav.). Atskeliama segtuko pavidalo ~ 70 nt ilgio pre-mirnr. Po skėlimo pre-mirnr 3 gale lieka 2 nukleotidų iškyša, o 5 gale fosfato grupė. Iškyšą atpažįsta baltymas eksportinas 5. Jeigu mirnr yra koduojamos intronuose, jų brendimas vyksta kartu su transkripcija. Po skėlimo pre-mirnr išnešamos į citozolį. Išnašai reikia eksportino 5 ir GTP surišančio Ran baltymo. Pernešus pre-mirnr į citozolį, GTP hidrolizuojamas. Citozolyje pre-mirnr ties kilpa skelia Dicer endonukleazė, susidaro ~ 22 np dvigrandinė mirnr. Dicer endonukleazė turi tandeminį endonukleazės aktyvųjį centrą, panašų į Drosha. Dicer pasižymi ir helikazės domenu C gale bei PAZ domenu, kuris prisijungia prie pre-mirnr galo (5.45 pav., a). Iškelta hipotezė, kad PAZ ir endonukleazės domenai veikia kaip molekulinė liniuotė skeliant pre-mirnr. 2 Pagal: M. Ha and V. N. Kim. Nat Rev Mol Cell Biol,

295 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) Nustatyta ir netipiškų mirnr brendimo būdų, kuriuose nedalyvauja Mikroprocesoriaus kompleksas ar Dicer endonukleazė. mirnr pirmtakai mirtronai gali būti iškerpami laso pavidalo introno struktūroje vykstant pre-irnr splaisingui branduolyje. Laso struktūra atidaroma, RNR susilanksto į stiebo-kilpos struktūrą, panašią į mirnr. mirnr brendimo metu vyksta ir kitos modifikacijos: pvz., augalų mirnr 3 galą metilina metiltransferazė HEN1. Po Dicer skėlimo dvigrandinė subrendusi mirnr prijungiama prie vieno iš Ago šeimos baltymų susidaro RISC kompleksas (angl. RNA-induced silencing complex, RISC). RISC komplekso susimontavimas apima du įvykius dvigrandinės mirnr jungimą, vėliau jos grandinių atskyrimą. AGO baltymai skirstomi į tris poklasius: AGO, PIWI ir kirmėlėms savitus Ago baltymus (angl. worm-specific AGO proteins, WAGO s). AGO baltymų turi bakterijos, archėjos, eukariotai. AGO baltymai yra tridomeninės struktūros: PAZ domenas atsakingas už sąveiką su mirnr vienos 5.44 pav. mirnr brendimas (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 15, p. 509; 2014; Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 10, p. 126, 2009) 295

296 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5.45 pav. AGO baltymų struktūra. AGO2 baltymo domeninė organizacija (a); AGO2 baltymo ir mirnr grandinės vedančiosios RNR komplekso erdvinė struktūra (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 15, p. 509, 2014) 5.46 pav. mirnr taikinių atpažinimas augalų (a) ir gyvūnų (b) ląstelėse. ORF atvirasis skaitymo rėmelis (Nature Reviews Genetics, v. 12, p. 99, 2011) 296

297 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) RNR grandinės vedančiosios RNR (angl. RNA guide) grandinės 3 galu, MID domenas atsakingas už sąveiką su jos 5 galu, o PIWI domenas yra panašus į RNazę H ir gali skelti taikinį irnr (5.45 pav., a b). Tačiau skėlimo aktyvumu pasižymi ne visi AGO baltymai: pvz., iš keturių žmogaus AGO baltymų tokį aktyvumą turi tik AGO2. Prisijungus AGO baltymams, vyksta RISC komplekso brendimas. Brendimo metu viena mirnr grandinė vadinamoji keleivinė grandinė (angl. passenger strand) atskiriama ir greitai suardoma, o kita grandinė jau minėta vedančioji grandinė paliekama. Kai kuriuose RISC kompleksuose keleivinė grandinė skeliama. Grandinių atranka vyksta pagal nedidelio RNR duplekso galų stabilumą. Grandinė, kurios 5 galas yra mažiau stabilus, paprastai pasirenkama kaip vedančioji grandinė. Kitas kriterijus pasirenkant grandines yra pirmasis grandinės nukleotidas grandinė su U pirmoje pozicijoje pasirenkama kaip vedančioji grandinė. Pasirenkant mirnr grandinę turi reikšmės Dicer baltymas ir su juo sąveikaujantys baltymai. Subrendę RISC kompleksai prijungia taikinius irnr. Prijungimas vyksta dėl komplementarios sąveikos tarp mirnr ir irnr molekulių. Svarbiausia mirnr dalis yra 5 8 nt seka molekulės 5.47 pav. Egzo- ir endo-sirnr biogenezės būdai (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 10, p. 126, 2009) 297

298 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5 gale, kuria ji prisijungia prie taikinio irnr molekulės 3 galo. Pvz., augaluose mirnr yra visiškai komplementari taikiniui, kuris dažniausiai skeliamas per irnr-mirnr duplekso vidurį ir suardomas (5.46 pav., a). Augalų mirnr 3 galas yra modifikuojamas prijungiant prie 2 O metilgrupę, kuri apsaugo mirnr molekulę nuo suardymo. Gyvūnų mirnr seka tik iš dalies komplementari irnr taikiniui (5.46 pav., b). Prijungiant taikinį tokių mirnr 5 gale esanti grūdo seka (angl. seed sequence) nukleotidai 2 7 padėtyse yra pagrindinė. Šiuo atveju RISC kompleksas veikia dvejopai: skatina irnr 3 galo deadenilinimą ir irnr suardymą arba slopina transliaciją iniciacijos ar elongacijos etapuose (5.44 pav.). Transliacijos iniciacijos etape RISC kompleksas gali prisijungti prie kepurės (angl. cap) struktūros irnr 5 gale ir trukdyti jungtis iniciacijos eif4e veiksniui arba didžiajam ribosomos subvienetui, taip pat trukdyti kepurės ir poli (A) galo sąveikai ciklizuojantis irnr. Informacinės RNR RISC kompleksuose taip pat gali būti telkiama citozolyje P kūneliuose (angl. P bodies) ir taip išvengti transliacijos (5.44 pav.). P kūneliai yra RNR ir baltymų sankaupos citozolyje, kuriuose pradedama ardyti irnr. Čia gausu 3 poli (A) galą ir 5 kepurę šalinančių fermentų. Kitos mažųjų RNR klasės sirnr molekulės (~ 21 nt) dažniausiai nėra koduojamos genome. Jos susidaro iš egzogeninės dvigrandinės RNR (virusų RNR, taip pat įterptos į ląstelę dvigran pav. pirnr biogenezė (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 12, p. 246, 2011) 298

299 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) dinės RNR) arba endogeninės dvigrandinės RNR vadinamosios endo-sirnr. Endogeninės kilmės sirnr susidaro iš genome koduojamų transpozonų transkriptų, priešprasmių (angl. antisense) ir prasminių (angl. sense) tos pačios genomo srities RNR porų, ilgų, stiebo-kilpos struktūros transkriptų (5.47 pav.). Endo-siRNR rasta vabzdžiuose, augaluose, kirmėlėse, žinduoliuose. Kitaip nei mirnr, egzogeninės ir endogeninės kilmės sirnr brendime citozolyje dalyvauja tik Dicer endonukleazė. Prie sirnr prisijungia vienas iš Ago baltymų. sirnr ir Ago2 kompleksas skelia irnr; nustatyti kompleksai, kurie slopina irnr transliaciją. Egzogeninės sirnr plačiai naudojamos eksperimentinėje ląstelės biologijoje eukariotų genų raiškai slopinti. Taikiniui komplementarios sirnr gali būti tiesiogiai įterpiamos į ląsteles ilgų RNR pirmtakų pavidalu arba koduojamos rekombinantiniuose raiškos vektoriuose, kurie įterpiami, pvz., transfekcijos būdu. Indukavus prasminės ir priešprasmės grandinių, klonuotų vektoriuje, transkripciją, ląstelėje susidaro dvigrandinė RNR, kurią citozolyje skelia Dicer. Susidaro funkcionali sirnr, komplementari taikiniui irnr. sirnr molekulės slopina geno taikinio raišką įvairiais laipsniais (angl. knockdown). Įprastai raiška nėra visiškai slopinama, kaip, pvz., išveiklinus (angl. knockout) geną mutacijomis. Trečio mažųjų RNR klasės pirnr molekulės (24 30 nt) brandinamos iš viengrandinių RNR, koduojamų tarpgeninėse srityse, kuriuose yra pasikartojančių elementų, aktyvių transpozonų genų ir vadinamųjų pirnr telkinių (angl. pirna clusters) (5.48 pav.). Įvairių pirnr molekulių ląstelėje yra tūkstančiai. pirnr susijungia su PIWI baltymais, kurie yra Ago šeimos pošeimio baltymai, būdingi lytinėms ląstelėms. Pagrindinė pirnr funkcija yra transpozoninių elementų (transpozonų, retrotranspozonų), kurie gali įsiterpti įvairiose genomo vietose ir tokiu būdu trikdyti jo integralumą, slopinimas (angl. silencing) lytinėse ląstelėse. Ši pirnr savybė konservatyvi gyvūnų organizmuose, ir tai liudija jos svarbą. Žinduoliuose ir vabzdžiuose pirnr yra komplementarios transpozono prasminei ir priešprasmei RNR grandinėms. Drosha ar Dicer nukleazės pirnr brendime nedalyvauja. Brendimas apima du etapus: pirminį ir antrinį brendimą. Pvz., vykstant pirminiam brendimui žinduoliuose ir vabzdžiuose, ilgas transpozono transkriptas, kuriame yra pirnr molekulė, skeliamas savitosios nukleazės. Antrinis brendimas vyksta vadinamuoju ping pong ciklo mechanizmu (angl. ping-pong cycle). Prasminė pirminė pirnr molekulė nukreipia PIWI baltymus prie komplementarių priešprasmių RNR, nurašytų nuo tos pačios genomo srities. PIWI baltymai skelia taikinį, susidaro RNR su nauju 5 galu. Ji prisijungia prie kito PIWI baltymo. Skeliamas tokios priešprasmės pirnr molekulės 3 galas. Tokia subrendusi priešprasmė pirnr gali nukreipti PIWI baltymus prie prasminių transkriptų ir t. t. (5.48 pav.). Taigi, tokiu mechanizmu ne tik skaldoma transpozonų RNR ir slopinama transpozicija, bet ir gausinamas pirnr molekulių kiekis. Eukariotuose nustatyta ir kitokių pirnr brendimo būdų. 299

300 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA ANALITINIAI KLAUSIMAI IR UŽDAVINIAI 1. Kokios bendrosios savybės būdingos visoms RNR polimerazėms? 2. Kurie bakterijų RNR polimerazės struktūros elementai yra svarbūs transkripcijos tikslumui ir perstūmimui? 3. A geno seka: 5 ATTGCCATTATGAAAGCG 3. Kuris iš toliau pateiktų transkriptų yra A geno transkriptas? a) 5 UAACGGUAAUACUUUCGC 3 ; b) 3 UAACGGUAAUACUUUCGC 5 ; c) 5 AUUGCCAUUAUGUUUGCG 3 ; d) 3 AUUGCCAUUAUGUUUGCG Jūs tiriate E. coli geno transkripcijos terminaciją. Geno 3 gale yra tokia seka (pateiktos abi grandinės): 5 CGAAGCGCCGATTGCCGGCGCTTTTTTTTT 3 3 GCTTCGCGGCTAACGGCCGCGAAAAAAAAA 5 Jūs sukonstravote geno mutantus, kuriuose geno seka pakeista tokiu būdu (parodyta koduojanti grandinė): A mutantas: 5 CGAAACTAAGATTGCAGCAGTTTTTTTTT 3 B mutantas: 5 CGAAGCGCCGTAGCACGGCGCTTTTTTTTT 3 C mutantas: 5 CGAAGCGCCGATTGCCGGCGCTTACGGCCC 3 Jūs tyrėte, kaip kiekviename mutante vyksta transkripcijos terminacija. Gavote tokius transkripcijos terminacijos rezultatus: Mutantas Su Rho baltymu Be Rho baltymo Laukinio tipo E. coli 100 % 100 % A mutantas 40 % 40 % B mutantas 95 % 95 % C mutantas 20 % 40 % Padarykite išvadą apie transkripcijos terminaciją, remdamiesi rezultatais. 5. Koks yra labiausiai tikėtinas įvykių scenarijus, kai sintetinančioje bakterijų RNR polimerazėje susidaro RNR-DNR hibridas, kuris viename gale yra iširęs? 300

301 V. RNR BIOSINTEZĖ (TRANSKRIPCIJA) 6. Toliau paveiksle yra pateikti bakterijų promotoriai, kuriuos atpažįsta RNR polimerazės holofermentas su pagrindiniu σ veiksniu (σ 70 ) (N bet kuris nukleotidas). Kuris iš promotorių yra stipriausias? 7. Jūs iškėlėte hipotezę, kad nukleotidų seka, esanti prieš geną, veikia kaip stipriklis, o ne kaip promotorius. Kaip tai eksperimentiškai patikrinsite? 8. Koks yra α amanitino, slopinančio eukariotų RNR II polimerazę, veikimo molekulinis mechanizmas? 9. Išvardykite, kokia tvarka in vitro susimontuoja RNR II polimerazės preiniciacijos kompleksas? 10. Koks TATA sekos vaidmuo RNR II polimerazės vykdomoje transkripcijoje? 301

302 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA VI. RNR brendimas RNR kiekiai, sintetinami ląstelėje, yra itin dideli: pvz., greitai augančių mielių ląstelės susintetina ~ ribosominių RNR pirmtako molekulių per minutę. Daugelis RNR molekulių modifikuojamos dar transkripcijos metu arba tuoj pat po transkripcijos. Dėl modifikacijų RNR molekulės įgyja savitą gamtinę erdvinę struktūrą ir gali atlikti biologines funkcijas. Didžioji dauguma RNR molekulių funkcionuoja kompleksuose su baltymais ribonukleoproteininėse dalelėse. Procesas, per kurį pirminiai transkriptai (pre-rnr) virsta funkcionaliomis RNR, vadinamas brendimu (angl. processing). Nesubrendusios RNR molekulės vadinamos pirminiais transkriptais, arba RNR pirmtakais, pre-rnr. RNR molekulės brendimo metu patiria tokias modifikacijas: z RNR sekų pašalinimą iš pirminių transkriptų; z RNR sekų, kurios nėra koduojamos genuose, pri jun gi mą; z tam tikrų nukleotidų kovalentines modifikacijas. Brendimas tai modifikacijos, dėl kurių pirminiai RNR transkriptai (pre-rnr) virsta funkcionaliomis RNR molekulėmis. RNR brendimas yra sudėtinė genų raiškos dalis. RNR brendimo funkcijos yra šios: z RNR molekulių brendimas yra genų raiškos valdymo taikinys; ztam tikri brendimo vyksmai padidina RNR molekulės stabilumą jos tampa labiau apsaugotos nuo ląstelės ribonukleazių; z per brendimą susidaro funkcionalios RNR molekulės, kurias gali atpažinti ir su kuriomis gali sąveikauti kiti ląstelės komponentai; z tam tikri brendimo vyksmai eukariotų branduolyje yra tiesiogiai susiję su RNR molekulių išnaša į citozolį Pre-tRNR brendimas Pagrindinis trnr molekulių biologinis vaidmuo būti baltymų biosintezės tarpininkėmis (angl. adaptors). Šiai funkcijai atlikti trnr molekulės turi būti subrendusios. trnr molekulės turi būti struktūriškai panašios, kad su jomis galėtų sąveikauti transliacijos elongacijos veiksniai, ribosomos komponentai, tačiau kartu ir skirtingos, kad jas atpažintų skirtingos aminoacil-trnr sintetazės (jungiančios aminorūgštį prie trnr 3 galo). Pre-tRNR brendimo vyksmai apima: z 5 galo skėlimą dalyvaujant P ribonukleazei; z 3 galo skėlimą ir ardymą dalyvaujant endonukleazėms ir egzonukleazėms; z 5 CCA3 sekos trnr 3 gale jungimą eukariotuose, daugumoje bakterijų, kai kuriose archėjose; z intronų pašalinimą didžiojoje daugumoje eukariotų, kai kuriose archėjose; z kovalentines nukleotidų modifikacijas. 302

303 VI. RNR brendimas 6.2. Pre-tRNR brendimas prokariotuose Prokariotuose, pvz., E. coli, daugumos pre-trnr molekulių sudėtyje yra daugiau negu vienas trnr pirmtakas (policistroniniai transkriptai) (6.1 pav.). Maždaug pusėje tokių transkriptų yra rrnr ir irnr molekulių. Pre-tRNR molekulės atskeliamos nuo didelio pirminio transkripto ir sutrumpinamos iki subrendusių trnr molekulių ilgio. Šiame procese dalyvauja endoribonukleazės ir egzoribonukleazės. 6.1 lentelėje yra išvardytos žinomos nukleazės, kurios dalyvauja E. coli pre-trnr brendime. 6.1 lentelė. E. coli pre-trnr brendime dalyvaujančios ribonukleazės Ribonukleazė Aktyvumas Funkcija RNazė PC Endonukleazė Skelia monomerinius trnr pirmtakus iš pirminio transkripto RNazė E Endonukleazė Skelia monomerinius trnr pirmtakus iš pirminio transkripto RNazė P Endonukleazė Skelia pre-trnr lyderinę seką 5 gale RNazė II 3 5 egzonukleazė Ardo 3 galą RNazė D 3 5 egzonukleazė Ardo 3 galą RNazė T 3 5 egzonukleazė Ardo 3 galą RNazė Z Endonukleazė Skelia pre-trnr priekabos seką 3 gale RNazė PH 3 5 egzonukleazė Ardo 3 galą Polinukleotidfosforilazė (PNPazė) 3 5 egzonukleazė Ardo 3 galą RNazė III Endonukleazė Skelia monomerinius trnr pirmtakus iš pirminio transkripto, atskiria pre-rrnr, jeigu ji yra šalia pre-trnr trnr 3 ir 5 galų susidarymas Bakterijose, archėjose, eukariotuose, taip pat ir mitochondrijose bei chloroplastuose trnr pirmtakų subrendę 5 galai susidaro dėl P ribonukleazės (RNazės P) veikimo. RNazė P yra pretrnr atranki endoribonukleazė. RNazė P atpažįsta pre-trnr transkripto dalis, kurios pasižymi savita erdvine struktūra (6.2 pav.). Ši endoribonukleazė skelia lyderinę seką (angl. leader sequence) pre-trnr molekulės 5 gale (6.1 pav. ir 6.2 pav.). Susidaro trnr pirmtakai su funkcionaliu 5 galu. 5 galą RNazė P skelia dar tuo metu, kai trnr pirminis transkriptas sintetinamas, nes trnr molekulių su nesubrendusiais 5 galais neįmanoma išskirti iš bakterijų. RNazė P buvo viena pirmųjų išsamiai tiriamų ribonukleazių. Bakterijų RNazę P sudaro ~ 120 aminorūgščių baltymas (E. coli C5, 119 aminorūgščių) ir nukleotidų ilgio RNR molekulė (E. coli M1 RNR, 377 nt). RNazė P yra ribonukleoproteinas, kurio RNR komponentas pasižymi kataliziniu aktyvumu. RNazė P yra visų organizmų ląstelėse, kuriose vyksta trnr sintezė: bakterijose, archėjose, eukariotų branduolyje, eukariotų mitochondrijose ir chloroplastuose. 303

304 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6.1 pav. Pre-tRNR brendimas prokariotuose Archėjų (~ 4 baltymai) ir eukariotų (~ 10 baltymų) RNazės P baltyminis sąstatas sudėtingesnis, RNR molekulės ilgis įvairus, ji nepasižymi dideliu panašumu į bakterijų RNazės P RNR, tačiau turi konservatyvių struktūros elementų. Bakterijų (taip pat ir kai kurių archėjų) RNazės P RNR molekulė yra kataliziškai aktyvi su tam tikrais substratais in vitro net ir tada, kai molekulės sudėtyje nėra baltymo. Įrodyti šį faktą Sidniui Altmanui (Sidney Altman) ir jo kolegoms prireikė daugiau nei 10 metų. In vivo RNazės P RNR molekulė atrankiai skelia trnr, tačiau aktyvumui pasireikšti būtina baltyminė molekulės dalis. Baltymas (baltymai) RNazės P molekulėje padeda RNazės P RNR molekulė pasižymi kataliziniu aktyvumu RNazė P yra ribozimas. 304

305 VI. RNR brendimas 6.2 pav. Bakterijų pre-trnr 5 galo brendimas dalyvaujant RNazei P (Nature Reviews Microbiology, v. 4, p. 724, 2006) RNR įgyti aktyvią konformaciją ir skatina tikslų substrato pre-trnr jungimą bei išdėstymą (6.3 pav.). RNazės P ir substrato komplekso susidarymui ir molekulės kataliziniam aktyvumui būtini bent du metalo jonai (Mg 2+ ) aktyviajame centre. Ląstelių gyvybingumui RNazė P yra būtina. RNazės P RNR molekulė sąveikauja S domenu (angl. specificity domain) su substratu pretrnr (6.3 pav.). Susidaro stekingo sąveika tarp heterociklinių bazių pre-trnr TψC ir D kilpose ir A minorinis motyvas ties akceptoriniu stiebu bei kanoninės nukleotidų poros pre-trnr 3 gale. Pastaruoju atveju, jeigu pre-trnr yra koduojama 5 CCA3 seka, kurios priekyje yra purino nukleotidas (5 RCCA3, 6.2 pav.), RNazės P RNR molekulės konservatyvūs GGU nukleotidai sudaro komplementarias poras su pre-trnr RCC nukleotidais. Kitas svarbus pre-trnr elementas sąveikai su RNaze P yra lyderinė seka. Jos pirmasis nukleotidas (dažnai U arba C), esantis prieš skėlimo vietą, sąveikauja su konservatyviu A nukleotidu RNazės P RNR molekulėje. 6.3 pav. Thermotoga maritima RNazės P ir pre-trnr komplekso erdvinė struktūra. RNazės P RNR molekulės S ir C domenai, baltymas, pre-trnr pažymėti. Rodyklė žymi lyderinės sekos 5 gale skėlimo vietą (PDB: 3Q1R) 305

306 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6.4 pav. Pre-tRNR 3 galo brendimas prokariotuose. Egzonukleolitinis 3 galo brendimas E. coli ir B. subtilis. Pagrindinės egzoribonukleazės paryškintos, N nukleotidas diskriminatorius (a); endonukleolitinis brendimas dalyvaujant RNazei Z (b) (Nature Reviews Microbiology, v. 4, p. 724, 2006) RNazė P dalyvauja pre-trnr pirmtakų brendime visų gyvybės domenų organizmuose. Tačiau pastaraisiais metais atskleista naujų įdomių faktų. Augalų organelės ir žmogaus mitochondrijos turi RNazę P, kurioje nėra RNR komponento yra tik baltymas. Eksperimentais parodyta, kad baltymo sąveika su substratu yra panaši kaip ir RNazės P RNR komponento ir yra esminė jos funkcionavimui. Bakterijų trnr pirmtakų 3 galas susidaro dviem būdais. Jeigu 5 CCA3 seka, kuri yra būtina trnr molekulei prijungti aminorūgštį, yra koduojama trnr gene, pre-trnr priekabos seka suardoma dalyvaujant endoribonukleazėms ir egzoribonukleazėms (6.1 pav., 6.4 pav., a). Jeigu 5 CCA3 seka nekoduojama, pre-trnr priekabos seką skelia Z endoribonukleazė, RNazė Z. Skėlimas vyksta už nukleotido diskriminatoriaus (angl. discriminator), kuris yra paskutinis nukleotidas pre-trnr 3 gale prieš jungiant CCA seką (6.4 pav., b). Visos subrendusios prokariotų ir eukariotų trnr molekulės turi 3 gale 5 CCA3 seką. Jeigu seka nekoduojama gene, ji turi būti jungiama po transkripcijos, kai visi 3 galo brendimo procesai yra įvykę (6.5 pav.). 5 CCA3 seką jungia fermentas trnr nukleotidiltransferazė. trnr nukleotidiltransferazei matricos nereikia. E. coli trnr nukleotidiltransferazė taip pat katalizuoja 6.5 pav. 5 CCA3 sekos jungimas bakterijų ir eukariotų trnr. D nukleotidas diskriminatorius (Cell and Molecular Life Sciences, v. 64, p. 2404, 2007) 306

307 VI. RNR brendimas galinio A nukleotido jungimą, jeigu jį skelia RNazė T arba kitos egzonukleazės. CCA seka 3 gale panašiu būdu jungiama prie visų prokariotų trnr. Pagal aminorūgščių sekų panašumą išskiriamos dvi CCA seką jungiančių fermentų klasės: archėjų fermentai (I klasė) ir eubakterijų / eukariotų fermentai (II klasė) Pre-tRNR brendimas eukariotuose Eukariotuose pre-trnr molekules sintetina RNR III polimerazė. Augalų ir gyvūnų ląstelėse yra ~ 50 skirtingų trnr, kurių kiekvieną koduoja atskiras genas. Kiekvieno geno genome yra kelios kopijos. Pvz., mielių genome yra ~ 275 trnr genai, vaisinės muselės ~ 850, o žmogaus ~ trnr genai sudaro nedideles sankaupas, kuriose esti po kelis skirtingas trnr koduojančius genus. Tą pačią trnr koduojantis genas pasitaiko įvairiose sankaupose. Eukariotų pre-trnr brendime dalyvauja daug fermentų. Pvz., mielių Saccharomyces cerevisiae pre-trnr brendime dalyvauja 38 genų produktai. Kai kurie brendimo įvykiai yra bendri visoms pre-trnr molekulėms, kiti unikalūs. Pre-tRNR 5 gale turi ilgą lyderinę seką, o 3 gale priekabos seką (angl. trailer sequence). Abi sekos brendimo metu skeliamos arba palaipsniui ardomos dalyvaujant ribonukleazėms, kol molekulės sutrumpinamos iki funkcionalioms trnr būdingo ilgio. Pre-tRNR lyderinę seką skelia RNazė P. trnr 3 galo brendimas prasideda, kai pre-trnr transkripcija, kurią vykdo RNR III polimerazė, stabdoma susintetinus įvairaus ilgio U seką 3 gale. Branduolyje prie pre-trnr molekulių 3 galo ( 3U) iš karto, kai pre-trnr susintetinama, prisijungia La baltymas. La yra daugiafunkcinis baltymas, jo kiekiai branduolyje labai dideli (~ 20 mln. kopijų). Baltymas apsaugo pre-trnr 3 galą nuo suardymo egzonukleazėmis ir skatina endonukleolitinį skėlimą. Jo taip pat reikia RNazės P skėlimui. Priekabos seką už nukleotido diskriminatoriaus skelia RNazė Z (6.4 pav.). Už jo trnr nukleotidiltransferazė prijungia 5 CCA3 seką Intronų pašalinimas iš eukariotų pre-trnr 1977 m. Filipas Šarpas (Phillip Sharp) su bendradarbiais tirdami adenoviruso transkripciją nustatė, kad viruso transkriptai nėra visiškai komplementarūs jo DNR. Tais pačiais metais Alikas Džefris (Alec Jeffreys) ir Ričardas Flavelas (Richard Flavell) aptiko seką globino gene, kurios nebuvo geno transkripte. Taip buvo suprasta, kad eukariotų genuose yra įsiterpusių sekų, kurios vėliau pašalinamos iš pirminių transkriptų. Nukleotidų sekos, randamos DNR, pirminiame transkripte, bet neaptinkamos subrendusioje RNR, vadinamos intronais. Apibrėžiant geną kaip DNR, kuri yra transkribuojama, intronus taip pat galima laikyti geno dalimi, nors jie ir pašalinami iš RNR brendimo metu. Nukleotidų sekos, aptinkamos ir DNR, ir subrendusioje RNR, vadinamos egzonais. Egzoninė-introninė genų organizacija yra itin būdinga eukariotams, tiek žemesniesiems, tiek aukštesniesiems. Prokariotų genuose intronų pasitaiko retai. Intronų yra genuose, kurie koduoja trnr, rrnr ir irnr. 307

308 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Nustačius, kad genuose koduojančiose srityse yra intronų, buvo aiškinamasi, kokiu būdu vyksta jų pašalinimas. RNR splaisingas (angl. splicing) yra irnr, trnr ir tam tikrų rrnr brendimo proceso dalis. Šių RNR splaisingo mechanizmai yra skirtingi. Pirminiame transkripte intronas skiria 2 egzonus (6.6 pav.). Vienas egzonas yra priekyje, arba introno 5 galo Intronai iš transkriptų pašalinami, o egzonai sujungiami vykstant RNR splaisingui. pusėje, o kitas už introno, arba jo 3 galo pusėje. Sritis, kur egzonas ribojasi su introno 5 galu, vadinama 5 splaisingo sritimi. Sritis, kur kitas egzonas ribojasi su introno 3 galu, vadinama 3 splaisingo sritimi. Pagal intronų iškirpimo mechanizmą ir struktūrą, jie skirstomi į penkias grupes: z I grupės savaime išsikerpantys intronai; z II grupės savaime išsikerpantys intronai; z pre-trnr intronai, kurie iškerpami savituoju būdu dalyvaujant fermentams; z archėjų pre-trnr intronai, kurie iškerpami savituoju būdu dalyvaujant fermentams; z pre-irnr intronai, iškerpami dalyvaujant splaisosomai. Mielių genome apie penktadalis trnr genų turi po vieną introną. Augalų, žmogaus genome intronų turinčių trnr genų esti daug mažiau. Intronų ilgis pre-trnr svyruoja nuo 14 iki nt (pasitaiko ir 60 nt ilgio intronų). Intronai pre-trnr molekulėse išsidėstę už vieno nukleotido po antikodono (6.7 pav., a). Intronų nukleotidų sekos pre-trnr nėra panašios. Nėra konservatyvių sekų nei intronų viduryje, nei jų galuose, ar srityse, ribojančiose intronus su greta esančiais egzonais. Pre-tRNR intronų iškirpimas ir likusių dalių sujungimas vyksta dalyvaujant fermentams. 6.6 pav. Intronų pašalinimo iš pre-rnr ir egzonų sujungimo schema. Lenkta rodyklė žymi transkripcijos pradžią ir kryptį 308

309 VI. RNR brendimas 6.7 pav. Mielių pre-trnr Phe introno struktūra ir iškirpimas. Pre-tRNR Phe ir subrendusios trnr antrinė struktūra. Parodytos tik tos trnr dalys, kur vyksta introno iškirpimas (a) (J. E. Krebs, E. S. Goldstein, S. T. Kilpatrick. Lewin s Genes X, 2011); pre-trnr Phe tretinė struktūra. Raudonai intronas, žaliai antikodono nukleotidai (b) Tai būdinga pre-trnr intronams visuose eukariotuose. Tačiau bendras visų organizmų trnr intronų bruožas yra tas, kad jie turi seką, komplementarią trnr antikodonui (6.7 pav., a). Dėl šios savybės pre-trnr molekulės, turinčios intronų, įgyja savitą erdvinę struktūrą. Ją atpažįsta endoribonukleazė, skelianti introną. Intronų iškirpimas iš mielių pre-trnr vyksta 2 etapais, juose dalyvauja daugiafunkcinis baltymų kompleksas. Šiam procesui reikia ATP. Pirmajame etape pre-trnr skeliama ties introno ir jį supančių sekų sritimis 5 ir 3 splaisingo srityse. Šiam etapui ATP nereikia. Reakciją vykdo savita endonukleazė. Ji atpažįsta introną pre-trnr molekulėje. Pvz., mielių endonukleazė yra multimerinis fermentas: du fermento subvienetai (Sen 34 ir Sen 42) skelia introną (6.7 pav., b). Dar vienas subvienetas, Sen 54, veikia kaip matuoklis, nustatantis atstumą tarp introno galų. Įdomu tai, kad mielėse trnr introno iškirpimas ir likusių dalių jungimas vyksta ne branduolyje, bet citozolyje (6.11 pav.). Endonukleazė yra sutelkta mitochondrijų paviršiuje, kiti fermentai citozolyje. Endonukleazei nuskėlus introną, pirmojo egzono 3 gale lieka 2, 3 ciklofosfatas, o introno 5 gale 5 OH grupė (6.8 pav.). Antrojo egzono 5 gale lieka hidroksigrupė, o introno 3 gale 2, 3 ciklofosfatas. Vėliau daugiafunkcinio komplekso sudėtyje esanti ciklofosfodiesterazė hidrolizuoja 2, 3 ciklofosfatą pirmajame egzone. Susidaro 2 fosfato esteris. Komplekso sudėtyje esanti kinazė perneša fosforilgrupę nuo GTP prie antro egzono 5 OH grupės. Iškirpus introną, dvi trnr molekulės dalys neatsiskiria dėl savitos erdvinės pre-trnr molekulės struktūros. Kitam brendimo etapui reikia ATP. RNR ligazė katalizuoja fosfodiesterinio ryšio susidarymą tarp dviejų trnr molekulės dalių. Pirmiausiai fermentas katalizuoja AMP pernašą nuo ATP prie antrojo egzono 5 fosfato. Perneštą grupę atakuoja 3 O atomas pirmajame egzone. Susidaro 3, 5 fosfodiesterinis ryšys. 2 fosfato esteris, susidaręs introno iškirpimo metu ties 1 egzono galu, pašalinamas 2 fosfatazės (6.8 pav.). Savitas intronų iškirpimo iš pre-trnr mechanizmas nustatytas kai kuriose archėjose. ~ 70 % archėjų trnr genų turi intronų (16 44 nt). Čia intronai iškerpami dalyvaujant savitai endonu- 309

310 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6.8 pav. Introno iškirpimo ir likusių dalių jungimo pre-trnr, dalyvaujant fermentams, mechanizmas. Introno skėlimo vietos pažymėtos rodyklėmis, fosfato grupė apskritimu ir trikampiu 6.9 pav. Pre-tRNR cis ir trans splaisingo būdai archėjose (PNAS, v. 102, p , 2005) 310

311 VI. RNR brendimas 6.10 pav. Kai kurie modifikuoti nukleotidai trnr molekulių sudėtyje 311

312 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA kleazei, kuri yra homodimerinės arba homotetramerinės struktūros. Kiekvienas endonukleazės subvienetas turi aktyvųjį centrą, kuriame vyksta introno skėlimas. Endonukleazė archėjų pretrnr atpažįsta savitas pupso-spiralės-pupso (angl. bulge-helix-bulge, BHB) struktūras introne kiekvienoje skėlimo vietoje. Skėlimas vyksta pupsų sekose (6.9 pav.). Likusias molekulės dalis sujungia RNR ligazė. Archėjose nustatytas dar vienas įdomus pre-trnr brendimo atvejis trnr trans splaisingas (angl. trans-splicing). Parazitinėje archėjoje Nanoarchaeum equitans kelių trnr molekulių 6.11 pav. Pre-tRNR brendimas ir pernaša iš branduolio į citozolį. Taip pat parodytas mielių pre-trnr splaisingas citozolyje (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8, p. 761, 2007) 312

313 VI. RNR brendimas dalys genome koduojamos atskirai. Susintetinus jų transkriptus, molekulės susijungia savo komplementariomis sritimis. Tokia pre-trnr turi pupso-spiralės-pupso struktūras, kurias atpažįsta ir skelia endonukleazė, o likusias molekulės dalis sujungia RNR ligazė (6.9 pav.). Anksčiau aptartas intronų iškirpimo iš pre-trnr ir egzonų sujungimo mechanizmas dalyvaujant fermentams labai skiriasi nuo intronų iškirpimo ir egzonų sujungimo mechanizmų kitose pre-rnr. Pastarieji aptariami tolesniuose poskyriuose Kovalentinės trnr nukleotidų modifikacijos Prokariotuose ir eukariotuose subrendusios trnr molekulės turi kovalentiškai modifikuotų nukleotidų (6.10 pav.). Kiekviena trnr molekulė turi ~ 8 tokias modifikacijas. Nustatyta ~ 100 skirtingų modifikacijų. Modifikacijos yra įvairaus sudėtingumo: nuo metilgrupės iki, pvz., 2-metiltio-N6-treonilkarbamoilgrupės, prijungtos prie adenozino. Modifikacijų trnr molekulėje, manoma, reikia jos stabilumui užtikrinti ir transliacijai. Pvz., kovalentinės modifikacijos molekulės šerdinėje dalyje (D, TψC, antikodoninė kilpos) stabilizuoja L pavidalo trnr erdvinę struktūrą. Kitos modifikacijos daro įtaką iškodavimo proceso tikslumui ribosomoje. Hipermodifikuotam uridinui, mnm 5 s 2 U (6.9 pav.), esančiam trnr Lys ir trnr Glu molekulėse, būdinga nevienareikšmė sąveika (angl. wobble, žr. VII skyriuje Baltymų biosintezė ). Dėl 2-tiogrupės U34 nukleozido ribozė įgyja 3 endo konformaciją, dėl kurios nukleozidas sąveikauja tik su purinais. Taigi, mnm 5 s 2 U modifikacija leidžia trnr Lys ir trnr Glu iškodavimo metu atskirti purinus nuo pirimidinų ir nesąveikauti su irnr NNY kodonais (Y pirimidinas). Kovalentines modifikacijas trnr atlieka įvairūs fermentai. trnr molekulėse yra daugiausiai ir įvairiausių modifikuotų nukleotidų iš visų RNR molekulių, nors jos palyginti nedidelės Eukariotų pre-trnr brendimo etapų eiliškumas Pre-tRNR brendimo etapai įvairiuose organizmuose vyksta skirtingu eiliškumu: mielėse visos modifikacijos įvyksta iki intronų pašalinimo, o Xenopus laevis ovocituose prieš kitus brendimo etapus vyksta splaisingas. Eukariotų pre-trnr pirmiausia sukuriami 3 ir 5 galai, tuomet pašalinami intronai (mielėse jie šalinami citozolyje), modifikuojami nukleotidai, susintetinamas 5 CCA3 galas, ir galiausiai subrendusios molekulės pernešamos iš branduolio į citozolį. Nustatyta, kad 5 ir 3 galų susidarymas ir 5 CCA3 sekos jungimas yra būtinos modifikacijos veiksmingai trnr molekulių pernašai į citozolį, o intronų pašalinimas nebūtinas. Taip pat nustatyta, kad kai kurios trnr molekulės gali būti aminoacilinamos jau branduolyje ir tai palengvina jų pernašą per branduolio membraną. Subrendusios trnr atpažįstamos ir išnešamos iš branduolio į citozolį dalyvaujant savitajam trnr išnašos receptoriui eksportinui t, kuris yra karioferinų baltymų superšeimos narys (6.11 pav.). Toks trnr atpažinimas yra dalis kontrolės mechanizmo, kuris užtikrina, kad nevisiškai subrendusios trnr nepakliūtų į citozolį. Receptoriaus atpažinimui yra svarbi trnr molekulės antikodono ir pseudouridininės kilpos (TψC) struktūra. Pvz., eksportinas t in vitro

314 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA kartų geriau sąveikauja su trnr, turinčia subrendusius 3 ir 5 galus, palyginti su nesubrendusia. GTPazė Ran padidina eksportino t giminingumą subrendusioms trnr, taip pat kitoms RNR molekulėms kroviniams (angl. cargo), kurių eksporto receptorius jis yra. Citozolyje trnr eksportino t ir Ran-GTP kompleksas suyra įvykus GTP hidrolizei. trnr paleidžiama į citozolį Pre-rRNR brendimas Ribosominių RNR molekulės visuose organizmuose yra sintetinamos ilgų pre-rrnr transkriptų pavidalu, tada vyksta jų brendimas. Pre-rRNR brendimas apima šiuos įvykius: zpirminių transkriptų skaldymą į mažesnius dalyvaujant endonukleazėms ir egzonukleazėms; zkovalentines nukleotidų modifikacijas (ribozių metilinimą 2 padėtyje, tam tikrų heterociklinių bazių metilinimą, uridino heterociklinės bazės modifikaciją į pseudouridiną); z intronų pašalinimą Pre-rRNR brendimas prokariotuose Prokariotų ribosomų sudėtyje yra trijų rūšių rrnr molekulės: 16S, 23S ir 5S rrnr. Bakterijos chromosomoje šias rrnr koduojantys genai yra dalis didelio operono, kurio transkripcija vyksta nuo vieno promotoriaus. rrnr genų išsidėstymo tvarka operone yra tokia: 16S, 23S, 5S. Prokariotų genomai įprastai turi keletą tokių rrnr genų operonų (pvz., E. coli turi 7). rrnr operonai savo sudėtyje dar turi trnr genų, kurių skaičius kiekviename operone gali skirtis. trnr genai būna dažniausiai įsiterpę tarp 16S ir 23S rrnr koduojančių genų (6.12 pav.). Bakterijų pre-rrnr yra ilga 30S RNR molekulė, kurią sudaro ~ nukleotidų. Šio transkripto brendimas prasideda dar nepasibaigus jo sintezei. Pirminiame transkripte būsimos 16S ir 23S rrnr molekulės sudaro antrines segtuko pavidalo struktūras, kurias atrankiai atpažįsta III endoribonukleazė (RNazė III) ir iš abiejų segtuko stiebo pusių skelia pirminį transkriptą į individualias 16S ir 23S rrnr molekules (6.12 pav.). Tačiau po skėlimo 16S ir 23S rrnr dar nėra galutinai subrendusios. Molekulių 3 ir 5 galai dar kartą skeliami endonukleazių. 16S rrnr 3 galą dar sykį skelia RNazė E ir RNazė G, abi sekoms atrankios endoribonukleazės. 5S rrnr iš ilgo pirminio transkripto skelia endoribonukleazė RNazė E. Po šio skėlimo 5S rrnr molekulės galuose lieka po tris nukleotidus, kuriuos nuo 3 galo pašalina egzoribonukleazė RNazė T, o nuo 5 galo nenustatyta nukleazė (6.12 pav.). Kovalentiškai modifikuojamų nukleotidų prokariotų rrnr yra žymiai mažiau nei eukariotų. Pvz., E. coli rrnr molekulėse yra tik keturios 2 padėtyje metilintos ribozės ir 10 pseudouridinų Pre-rRNR brendimas eukariotuose Eukariotų ribosomose yra 18S, 28S, 5S rrnr molekulės, homologiškos bakterijų 16S, 23S ir 5S rrnr molekulėms. Be šių rrnr, eukariotai turi dar 5,8S rrnr. 18S, 5,8S, 28S rrnr pirm- 314

315 VI. RNR brendimas takas (mielėse ~ nt, o žmoguje ~ nt) sintetinamas RNR I polimerazės, o 5S rrnr atskirai RNR III polimerazės. 18S, 5,8S, 28S rrnr pirmtako 5 ir 3 galuose yra vadinamosios išorinės transkribuojamosios sekos, ITS (angl. external transcribed spacer), o viduje vidinės transkribuojamosios sekos, VTS (angl. internal transcribed spacer). Jos pašalinamos brendimo metu (6.13 pav.). Pirmasis pre-rrnr brendimo įvykis transkripto skėlimas už 28S rrnr, kurį vykdo fermentas, panašus į bakterijų RNazę III. Tada greitai vyksta nukleotidų modifikacijos: ribozių metilinimas ir uridino izomerizacija į pseudouridiną (bus aptariami kitame poskyryje). Po to, kai pirminis transkriptas visiškai susintetinamas, pradedamos šalinti sekos. Pirmiausiai pre-rrnr skelia endoribonukleazės. Įdomu, kad tam tikras nukleazes prie taikinių nukreipia mažos branduolėlio RNR snornr (angl. small nucleolar RNA), sąveikaujančios su nukleotidų sekomis pre-rrnr. Pvz., U3 snornr sąveika su ITS seka 5 gale ir su 18S RNR yra svarbi 5 ITS sekos skėlimui. rrnr prieš 5,8S skelia RNazė MRP (6.13 pav.). Šios RNazės sudėtis panaši į RNa pav. Pre-rRNR brendimas bakterijose (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 2, p. 514, 2001) 315

316 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6.13 pav. Pre-RNR brendimas eukariotuose. ITS išorinės transkribuojamosios sekos, VTS vidinės transkribuojamosios sekos (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 2, p. 514, 2001) zės P sudėtį aštuoni iš devynių baltymų subvienetų yra tokie patys. Manoma, kad RNazė MRP kilo iš bakterijų RNazės P. Toliau individualių transkriptų galus palaipsniui ardo egzonukleazės, kurių atrankumas ir veikimo eiliškumas nėra gerai išaiškinti. Pre-rRNR brendime dalyvaujančios egzonukleazės branduolyje sudaro ~ 11 fermentų kompleksą egzosomą. Kitokios nukleazių sudėties egzosoma egzistuoja ir citozolyje. Eukariotų 5S rrnr posttranskripcinis brendimo mechanizmas paprasčiausias iš visų rrnr. Kartais iš viso jokio molekulės brendimo nėra; kitu atveju endonukleazė skelia 5S rrnr molekulės 3 galą. Molekulės 5 galas lieka su trifosfatu, kuris buvo pirmajame įjungtame į sintetinamą RNR grandinę nukleotide. 5S rrnr molekulėje nevyksta nei 3 galo adenilinimas, nei splaisingas Kovalentinės nukleotidų modifikacijos eukariotų pre-rrnr Dažniausios rrnr kovalentinės modifikacijos eukariotuose ribozių metilinimas 2 O padėtyje ir uridino izomerizacija į pseudouridiną (6.14 pav.). Pre-rRNR nukleotidai yra modifikuojami pirminio transkripto sintezės metu. Iškelta hipotezė, kad ribozių metilinimas stabilizuoja rrnr molekulę, padidindamas molekulės hidrofobinį paviršių. Uridino izomerizacija į pseudouridiną sukuria galimybę susidaryti papildomam vandeniliniam ryšiui ties molekulės 316

317 VI. RNR brendimas Mažosios branduolėlio RNR (snornr) dalyvauja eukariotų pre-rrnr brendime. N1 atomu, o tai gali turėti reikšmės rrnr molekulės erdvinei struktūrai. Modifikuoti nukleotidai rrnr molekulėje yra konservatyviose padėtyse. Eukariotų rrnr kovalentinių nukleotidų modifikacijų mechanizmai skiriasi nuo bakterijų. Aukštesniuosiuose eukariotuose rrnr molekulės turi ~ O padėtyje metilintų ribozių ir ~ 95 pseudouridinus. Mielių rrnr šių modifikacijų yra dvigubai mažiau. Modifikacijas atlieka įvairūs fermentai. Modifikacijų taikiniai rrnr molekulėse nustatomi pasitelkiant mažąsias branduolėlio RNR snornr. Mažųjų branduolėlio RNR snornr molekulių dydis nt. Žinoma ~ 150 skirtingų snornr molekulių stuburiniuose, grybuose, augaluose, pirmuonyse. ~ 70 snornr galėtų būti mielėse (iš viso ~ kopijų), daugiau nei 100 stuburiniuose (~ kopijų). snornr sintetinamos nukleoplazmoje, bet telkiamos branduolėlyje rrnr sintezės vietoje. Čia jos funkcionuoja kompleksuose su baltymais snornp dalelėse (angl. small nucleolar ribonucleoprotein, sno RNP). Mechanizmas, kuriuo nustatomos modifikacijų vietos rrnr molekulėje, dalyvaujant snornr, gana neįprastas. Modifikacijos vieta rrnr molekulėje nustatoma komplementarumo principu: snornr molekulėse yra sritys, komplementarios tam tikroms pre-rrnr sritims. Netoli šių sričių rrnr molekulėje yra nukleotidas-modifikacijos taikinys. Nustačius daugelio snornr nukleotidų sekas, snornr molekulės buvo suskirstytos į dvi pagrindines grupes. Pirmoji grupė tai snornr, turinčios konservatyvų elementą C/D dėžutę (angl. C/D box). snornr molekulės gali turėti ir antrą tokią dėžutę C /D, 6.15 pav., a). Jos dalyvauja nustatant taikinius 2 O ribozės metilinimui rrnr molekulėse. C dėžutės konservatyvi seka yra RUGAUGA/U (R bet kuris purinas). D dėžutės konservatyvi seka yra CUGA. snornr prisijungia prie jai komplementarių rrnr sričių, kurios sudaro ~ bp dupleksą, tuomet metilazė metilina rrnr molekulėje penktąjį nukleotidą už D arba D dėžutės (6.15 pav., a). Visa snornr nėra būtina tiksliam ir veiksmingam rrnr metilinimui pav. Uridino izomerizacijos į pseudouridiną ir ribozės 2 O metilinimo schema 317

318 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Pvz., jeigu snornr yra išlikusi tik viena C/D dėžutę turinti sritis, užtenka, kad taikinys rrnr būtų atpažintas ir metilintas. Mielių Saccharomyces cerrevisiae genome yra 51 snornr koduojanti seka (mielių rrnr yra metilinamos 55 ribozės). Antrąją grupę sudaro snornr, turinčios konservatyvų elementą H/ACA dėžutę (6.15 pav., b). Pasitelkiant šias snornr rrnr molekulėje yra nustatomi uridino nukleotidai. Tokie nukleotidai modifikuojami (izomerizuojami) į pseudouridiną (U Ψ). Šių snornr struktūrai yra būdinga tai, kad H dėžutė (nukleotidų seka ANANNA, kur N bet kuris nukleotidas) yra išsidėsčiusi linkyje tarp dviejų segtukų (segtuko-linkio-segtuko-uodegos motyve, 6.15 pav., b), o ACA sritis nutolusi per tris ribonukleotidus nuo snornr molekulės 3 galo. snornr sudaro su rrnr komplementarias sritis dviejose vietose. Susidaro dupleksas tarp komplementarių snornr ir rrnr molekulės sričių. Šiame duplekse U rrnr nukleotidai yra nesuporuoti ir išsidėsto vadinamosiose pseudouridinų kišenėse (angl. pseudouridine pocket) ir ten modifikuojami. snornr susijungia su baltymu diskerinu, kuris pasižymi pseudouridino sintazės aktyvumu ir kitais baltymais pav. snornr molekulių struktūra ir rrnr taikinių modifikavimas. rrnr ribozės 2 O metilinimas (a); uridino modifikacija į pseudouridiną (b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 318

319 VI. RNR brendimas Brendime dalyvaujančios snornp dalelės telkiamos nukleoplazmoje Kajalo kūneliuose 1 (angl. Cajal bodies). Čia vyksta rrnr modifikacijos. Stuburinių H/ACA snornr turi seką, nukreipiančią snornp į Kajalo kūnelius. Nustatyta, kad antrinė snornr molekulių struktūra yra svarbi: pašalinus molekulės dalį (pvz., vieną antrojo tipo snornr segtuką), jos stabilumas sumažėja, ji nebegali atlikti savo funkcijos. Mažosios branduolėlio RNR pačios neatlieka rrnr modifikacijų. Jos keičia pre-rrnr erdvinę struktūrą, kad molekulę atpažintų modifikacijas vykdantys fermentai. Kai kurios snornr, kaip jau minėta, nustato taikinius endoribonukleazėms, skaldančioms pre-rrnr. Archėjoms taip pat būdingas rrnr ribozių metilinimas ir uridino izomerizacija į pseudouridiną. Taikinius trijose archėjų rrnr molekulėse (23S rrnr, 16S rrnr ir 5S rrnr) nustato į eukariotų snornr panašios molekulės kartu su archėjų baltymais. Genetinė snornr molekulių organizacija ir biogenezė yra labai neįprastos. snornr gali būti koduojamos genuose (kartais kelios snornr nurašomos vienu policistroniniu transkriptu), taip pat gali būti skeliamos iš intronų, esančių kituose genuose (genuose šeimininkuose) m. buvo nustatyta, kad U22 snornr, dalyvaujanti 18S rrnr brendime, yra geno šeimininko introne. Buvo nustatyta, kad ženkli introno sekų dalis yra komplementari rrnr. Likę sujungti egzonai baltymo nekoduoja: tokia RNR greitai suardoma citozolyje. Taip pat paaiškėjo, kad geno šeimininko intronuose koduojamos dar bent 8 skirtingos snornr rrnr susimontavimas į ribosomas Beveik visuose organizmuose rrnr montavimasis į ribosomines daleles yra konservatyvus procesas. rrnr molekulės subrandinamos iš ilgų pirminių transkriptų vykstant kovalentinėms modifikacijoms, 3 ir 5 galų brendimui. Subrendusios molekulės kartu su ribosominiais baltymais sumontuojamos į ribosomas. Montavimasis prasideda jau rrnr sintezės branduolėlyje metu: čia įnešama ir telkiama nukleoplazmoje susintetinta 5S rrnr. Brendimo metu rrnr patiria gausybę struktūrinių persitvarkymų. Pvz., eukariotuose nustatyta keliolika RNR helikazių, kurios, manoma, dalyvauja tokioje pertvarkoje. Prokariotuose šie procesai vyksta citozolyje, o eukariotuose ribosominiai baltymai pernešami iš citozolio į branduolį; tuomet iš branduolio ribosominiai subvienetai vėl išnešami į citozolį, kur susimontuoja į funkcionalias ribosomas Intronų šalinimas iš eukariotų pre-rrnr Intronų eukariotų pre-rrnr yra kai kurių vienaląsčių organizmų branduolio pre-rrnr, mitochondrijų bei chloroplastų pre-rrnr. Šie intronai iškerpami kitokiu mechanizmu negu intronai, esantys pre-trnr sudėtyje. Pre-rRNR esantys intronai in vitro išsikerpa savaime, nedalyvaujant fermentams. Toks intronų išsikirpimo būdas dar vadinamas autosplaisingu (angl. self-splicing). Išsikirpimas ir likusių RNR dalių sujungimas vyksta dviejų trans esterinimo reakcijų keliu (6.16 pav.). Vykstant šioms reakcijoms, fosfodiesterinių ryšių skaičius lieka nepakitęs. 1 Kūnelius atrado Santjagas Ramonas Kajalas (Santiago Ramón y Cajal). Intronų savaiminis išsikirpimas vyksta trans esterinimo reakcijų keliu. 319

320 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6.16 pav. Intronų savaiminio išsikirpimo trans esterinimo reakcijos. R nukleotidas RNR grandinėje Savaiminis intronų išsikirpimas iš RNR pirmtakų yra būdingas ne tik rrnr intronams, bet ir kai kuriems pre-irnr intronams. Savaiminis intronų išsikirpimas gali vykti dviejų tipų mechanizmais. I tipo mechanizmu išsikerpa I grupės intronai. Tokiam išsikirpimui reikia guanozino kofaktoriaus (angl. guanosine cofactor). Žinoma ~ I grupės intronų, ~ 90 % iš jų rasta grybuose, augaluose, rausvuosiuose ir žaliuosiuose Intronų savaiminio išsikirpimo reakcijas katalizuoja pačios pre- RNR molekulės. dumbliuose. I grupės intronų yra vienaląsčių eukariotų branduolio rrnr, žemesniųjų eukariotų mitochondrijų bei chloroplastų irnr, aukštesniųjų augalų mitochondrijų irnr, taip pat kai kuriose bakterijose, bakteriofaguose ir virusuose. Gyvūnuose I tipo intronai nustatyti tik pavieniuose organizmuose. Branduolio genomuose I grupės intronai yra daugiausia rrnr genuose, o organelių genomuose jų yra irnr, rrnr ir trnr genuose. I grupės intronų nerasta archėjose. I grupės intronų nukleotidų sekos nėra homologiškos, tačiau jiems būdinga panaši savita antrinė struktūra, turinti keletą konservatyvių elementų. Mutagenezės metodu nustatyta, kad 6.17 pav. I grupės savaime išsikerpančių intronų antrinė ir tretinė struktūros. Kairėje introno antrinė struktūra. Žalia spalva introną ribojantys egzonai, pilka katalizinė šerdis. Dvigrandiniai RNR struktūros elementai pažymėti (P); dešinėje introno katalizinės šerdies erdvinė struktūra. Geltonai pažymėta G jungimo vieta (D. L. Nelson, M. L. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012) 320

321 VI. RNR brendimas I grupės intronų šerdį sudaro P3, P4, P6 ir P7 sritys (6.17 pav.). Savaime išsikerpantys intronai įgyja erdvinę struktūrą, kuri lemia molekulės katalizinį aktyvumą. Pirmasis savaime išsikerpantis intronas buvo nustatytas pirmuonies Tetrahymena thermophila pre-rrnr. II tipo mechanizmu išsikerpa II grupės intronai. Reakcijoms vykti reikalinga adenilato liekana, kuri yra pačioje pre-rnr molekulėje. II grupės intronai daug mažiau paplitę nei I grupės intronai. Jų yra tik kai kurių pirmuonių, augalų, grybų, dumblių mitochondrijų bei chloroplastų irnr. Keli II grupės intronai rasti trnr ir rrnr sudėtyje. II grupės intronams taip pat būdinga konservatyvi antrinė ir tretinė struktūra (6.18 pav.) I grupės intronų išsikirpimo mechanizmas Tetrahymena thermophila pre-rrnr pirmtako genas turi didelį 413 bp introną. Pirmtako transkripto brendimą in vitro 1980 m. tyrusį Tomą Čechą (Tom Cech) ir jo bendradarbius ištiko didžiulė nuostaba, kai jie pastebėjo, kad pre-rrnr intronas iškerpamas, o likusios rrnr molekulės dalys sujungiamos reakcijos mišinyje, kuriame nėra jokių baltymų! Mokslininkai nustatė, kad reakcijas vykdo pati pre-rrnr molekulė. Buvo išsiaiškinta, kad reakcijai vykti reikia pre-rrnr, metalo jonų ir kofaktoriaus guanozino. I grupės intronai išsikerpa vykstant dviems trans esterinimo reakcijoms: z pirmoje reakcijoje guanozino kofaktoriaus 3 hidroksigrupės deguonis atakuoja fosfato grupę rrnr molekulės 5 splaisingo srityje (6.19 pav.); z antroje reakcijoje pirmojo egzono 3 hidroksigrupė atakuoja G nukleotido fosfato grupę rrnr molekulės 3 splaisingo srityje paskutinėje introno pozicijoje (6.19 pav.). Savaiminio išsikirpimo reakcijoje guanino kofaktoriuje kita heterociklinė bazė negali pakeisti, tačiau trifosfatas nebūtinas: reakcija vyksta su GTP, GDP, GMP arba guanozinu. Guanino nukleotidas arba nukleozidas turi turėti laisvą ribozės 3 OH grupę. Metalo jonai (Mg 2+ ) yra būtini katalizinei reakcijai vykti. Jie padeda aktyvinti 3 OH grupės deguonį pirmai trans esterinimo reakcijai. 5 splaisingo sritis pre-rrnr priartinama prie nukleofilo susidarant dupleksui 6.18 pav. II grupės savaime išsikerpančių intronų antrinė struktūra. Lactococcus lactis II grupės introno antrinė struktūra. Introno I VI domenai pavaizduoti skirtingomis spalvomis, introno VI domenas, koduojantis atvirkštinę transkriptazę, pažymėtas punktyrine linija, I ir II egzonai storesne linija, šakojimosi taško A nukleotidas parodytas (Mobile DNA, v. 5, 2014) 321

322 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA tarp pirmojo egzono galo ir jai komplementarios introno nukleotidų sekos, IGS (angl. internal guide sequence, 6.17 pav.). Guanozino kofaktorius prisijungia guanozino prisijungimo srityje introne guanozino prisijungimo kišenėje (angl. guanosine binding pocket) (6.19 pav.). Ji yra katalizinėje introno šerdyje, netoli Mg 2+ jungimo vietos. Guanozino 3 hidroksigrupės deguonies atomas atakuoja fosfatą 5 splaisingo srityje. Susidaro kovalentinis ryšys tarp guanozino ir introno 5 galo. Skeliamas I egzonas. Jis lieka duplekse su introno IGS sritimi. Guanozino kofaktorius disocijuoja iš guanozino kišenės. Tada prie I egzono 3 OH grupės priartėja 3 splaisingo sritis, esanti tarp introno 3 galo ir II egzono 5 galo. Paskutinis introno nukleotidas 3 splaisingo srityje yra G (6.19 pav.). Jis išdėstomas guanozino kišenėje antrai trans esterinimo reakcijai. Antroje reakcijoje I egzono 3 hidroksigrupės deguonies atomas atakuoja fosfatą 3 splaisingo srityje tarp introno ir II egzono. Trans esterinimo reakcijų metu intronas iškerpamas, o I ir II egzonai sujungiami. Šių reakcijų metu vienas fosfato esteris virsta kitu, tarpiniai produktai nesusidaro pav. I grupės introno išsikirpimo schema. Dešinėje trans esterinimo reakcijų schema; kairėje guanozino, prisijungusio introno guanozino kišenėje, schema. Punktyru pažymėti po reakcijų sujungti egzonai (Nature, v. 418, p. 222, 2002) 322

323 VI. RNR brendimas Trans esterinimo reakcijoms nereikia papildomos energijos didžiaenergių ATP arba GTP junginių pavidalu. Tai yra grįžtama reakcija, tačiau jos metu pusiausvyra tarp pre-rrnr ir reakcijos produkto rrnr, kurioje intronas jau pašalintas, nenusistovi dėl didelės guanozino kofaktoriaus koncentracijos. Dėl jos trans esterinimo reakcija stumiama į produkto susidarymo pusę. Be to, pasikeičia antrinė rrnr struktūra, ir tai taip pat turi įtakos reakcijos eigai. Ribozimų katalizuojamos reakcijos labai panašios į baltymų katalizuojamas chemines reakcijas. Pvz., Tetrahymena pre-rrnr ribozimo katalizuojama savaiminė introno išsikirpimo reakcija yra keliomis eilėmis greitesnė negu cheminė trans esterinimo reakcija. Kaip ir fermentai, ribozimas (pre-rrnr) atrankus savo substratui. Tačiau introno savaiminio išsikirpimo reakcija nėra iki galo fermentinė reakcija, nes katalizatorius (šiuo atveju pati rrnr) reakcijos metu pakinta. Fermentai po reakcijų lieka nepakitę ir vėl gali dalyvauti naujose reakcijose. Reikia pastebėti, kad trans esterinimo reakcijų metu iškirptas intronas gali dalyvauti dar keliose cheminėse reakcijose, pvz., tam tikroms aplinkybėmis I intronai gali katalizuoti endonukleolitinio skėlimo, RNR jungimo reakcijas II grupės intronų išsikirpimo mechanizmas II grupės intronų, kaip ir I grupės intronų, išsikirpimas prasideda trans esterinimo reakcija, tačiau kofaktorius reakcijoje nedalyvauja. Nukleofilas yra adenilato liekanos 2 OH grupė pačiame introne (6.20 pav.). 2 OH grupė yra išsidėsčiusi segtuko struktūroje introno viduje 6.20 pav. II grupės introno išsikirpimo schema. Punktyru pažymėti po reakcijų sujungti egzonai (Nature, v. 418, p. 222, 2002) 323

324 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA (6.18 pav.). Ši vieta vadinama šakojimosi tašku (angl. branch point). RNR molekulė, turinti II grupės introną, sudaro savitą erdvinę struktūrą, dėl kurios trans esterinimo reakcijose dalyvaujančios grupės ir nukleotidai išdėstomi tiksliai. 2 hidroksigrupės deguonies atomas atakuoja fosfatą tarp I egzono ir introno 5 splaisingo srityje (6.20 pav.). Skeliamas I egzonas, susidaro tarpinė šakota laso (angl. lariat) struktūra, kurioje yra 2, 5 fosfodiesterinis ryšys. Tada I egzono 3 OH grupės deguonies atomas atakuoja fosfatą tarp introno ir II egzono 3 splaisingo srityje. Vykstant antrai trans esterinimo reakcijai, iškerpamas intronas, o I ir II egzonai sujungiami (6.20 pav.). Reakcijų metu antrinė introno molekulės struktūra išlieka stabili. II grupės intronų savaiminio išsikirpimo mechanizmas labai panašus į intronų iškirpimą iš branduolio pre-irnr, kurį vykdo splaisosoma (angl. spliceosome). II grupės intronai savaime veiksmingai išsikerpa in vitro. Reakcijai vykti reikia didelės (nefiziologinės) druskų koncentracijos. Veiksmingam savaiminiam išsikirpimui in vivo būtini baltymai jie sulanksto (angl. folding) introną į kataliziškai aktyvią molekulę Judrieji I ir II grupės intronai Kai kurie I ir II grupės savaime išsikerpantys intronai pasižymi įdomiomis savybėmis. Jie yra judrūs (angl. mobile) ir gali įsiterpti kitame geno alelyje, jeigu ten nėra introno (angl. homing). Tad intronai gali plisti iš organelių į branduolio DNR ir atvirkščiai, taip pat tarp organizmų. I grupės intronų judėjimui reikalinga sekai atranki endonukleazė (angl. homing endonuclease). Nukleazę gali koduoti ir pats intronas, tačiau I grupės intronuose ji pasitaiko retai. Didžioji dauguma II grupės intronų koduoja atviruosius skaitymo rėmelius, homologiškus atvirkštinėms transkriptazėms. Iškirptas intronas įsiterpia į homologišką DNR vietą, o introno koduojama atvirkštinė transkriptazė sintetina DNR, kaip matricą naudodama introno RNR. Introno išsikirpimui ir įsiterpimui reikia ne tik atvirkštinės transkriptazės, bet ir kitų baltymų, pvz., maturazės (angl. maturase). Maturazės dažnai koduojamos intronų, jos reikalingos introno struktūrai stabilizuoti. Manoma, kad II grupės judrieji intronai yra tam tikrų tipų retrotranspozonų pirmtakai Pre-iRNR brendimas eukariotuose Eukariotų irnr molekulės pasižymi šiomis bendromis savybėmis: z koduoja baltymus; z funkcionuoja citozolyje; z prisijungia ribosomose baltymų biosintezės metu; z dauguma pre-irnr turi fragmentų, kurie nekoduoja baltymų ir yra pašalinami brendimo metu; z eukariotų irnr 3 ir 5 galai yra savitai modifikuojami. 324

325 VI. RNR brendimas Eukariotų pre-irnr 5 galo modifikacijos. Kepurės struktūra Eukariotinių irnr sintezė dažniausiai prasideda nuo A (kartais G) nukleotido. Pirmas RNR II Pol įjungtas nukleotidas turi trifosfato grupę 5 gale. Tačiau šios grupės subrendusioje irnr nėra. Vietoje jos irnr molekulės turi neįprastą struktūrą. Molekulės 5 gale yra du nukleozidai, sujungti 5-5 trifosfatiniu ryšiu. Ši struktūra susidaro, kai prie irnr molekulės 5 galo trifosfato yra prijungiamas guanozinas. Paskutiniai trys nukleotidai irnr molekulės 5 gale gali būti dar ir metilinti įvairiose padėtyse. Tokia struktūra vadinama kepure (angl. cap). Kepures 5 gale turi visos eukariotų RNR Pol II susintetintos irnr molekulės. Kepurė irnr molekulių 5 gale, kaip ir poli (A) sintezė 3 gale, sintetinama tik RNR Pol II transkriptuose. Kepurė pradedama sintetinti, kai RNR II Pol susintetina ~ irnr nukleotidų (6.21 pav.). Kepurės struktūra užtikrina šias irnr funkcijas: z kepurė padeda nustatyti 5 splaisingo sritį pirmojo introno skėlimui ir užtikrina tikslų splaisingą; z kepurė reikalinga irnr pernašai iš branduolio į citozolį; zkepurė dalyvauja transliacijos iniciacijoje prisijungdama prie eif-4e transliacijos veiksnio ir taip užtikrina, kad baltymo sintezė prasidėtų ties pirmuoju AUG kodonu irnr molekulėje; z kepurė stabilizuoja irnr apsaugodama ją nuo 5 egzonukleazių poveikio. Kepurės sintezę vykdo trys fermentai: z trifosfatazė pašalina fosfatą, hidrolizuodama trifosfatą 5 gale iki difosfato; z guanililtransferazė jungia GMP; z 7-metiltransferazė metilina galinio nukleotido (GMP) guanino heterociklinę bazę. Šie fermentai yra RNR Pol II komplekse kartu su kitais pre-irnr pirmtakų brendime dalyvaujančiais baltymais. Pirmiausia yra nuskeliamas pre-irnr 5 galinio nukleotido (pppnp) monofosfatas ir prie likusio difosfato (ppnp) per 5-5 ryšį jungiamas GMP (Gppp GpppNp) (6.21 pav.). Ši modifikacija vyksta tik tuo atveju, jeigu pre-irnr 5 gale yra di- arba trifosfatas. Tada paskutinė heterociklinė bazė G modifikuojama metilinant ją 7 padėtyje. Taip modifikuotas nukleotidas ir sudaro kepurę. Tokias kepures, dar vadinamas cap 0, turi visos eukariotų irnr. Kiekvienas iš kepurę sintetinančių fermentų gyvybiškai svarbus mielėms. Daugialąsčiai organizmai turi vieną bifunkcinį polipeptidą, pasižymintį fosfataziniu ir guanililtransferaziniu aktyvumais, o mielės turi du polipeptidus, kurie sudaro heterodimerą. Daugelio eukariotų (išskyrus vienaląsčius) irnr kepurėje dar gali būti modifikuojami kiti nukleotidai 5 gale. Antrajame nukleotide (pirmajame irnr 5 galo nukleotide) metilinama ri- 325

326 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA bozė 2 O padėtyje (6.21 pav.). Reakciją vykdo 2 O metiltransferazė. Tokia struktūra vadinama cap 1. Kai kurios aukštesniųjų eukariotų irnr turi dar vieną metilgrupę. Ji prijungiama prie heterociklinės bazės, jeigu pastaroji yra adeninas ir jeigu nukleotide prieš tai jau yra metilinta ribozė. Metilinamas N atomas 6 padėtyje. Kai kurių organizmų irnr kepurėje dar metilinama ribozė 2 O padėtyje trečiajame nukleotide molekulės 5 gale. Tokia struktūra yra vadinama cap 2. Aukštesniųjų eukariotų irnr dar yra metilinamos adenino (N6) heterociklinės bazės visoje RNR molekulėje (maždaug viena metilinta heterociklinė bazė tūkstančiui nukleotidų) pav. Kepurės sintezė RNR Pol II transkriptų 5 gale. Kepurės struktūra (a); kepurės sintezės etapai (b) (Nature Reviews Microbiology, v. 10, p. 51, 2012) 326

327 VI. RNR brendimas Kepurės būtinos veiksmingai eukariotų virusų irnr transliacijai. Daugeliu atveju kepurės sintezė vyksta taip pat kaip ir šeimininko irnr. Tačiau kai kuriuose virusuose rasta alternatyvių irnr kepurės sintezės kelių. Pvz., pūslelinio stomatito virusas VSV (angl. vesicular stomatitis virus, VSV) panaudoja savo baltymo nuo RNR priklausomos polimerazės vieną iš aktyvumų (oligoribonukleotidiltransferazės aktyvumą) 5 fosforilintos irnr jungimui prie GDP susidarant tarpiniam kovalentiniam ryšiui tarp baltymo ir RNR. Kepurės metilinimo eiga taip pat skiriasi nuo ląstelės šeiminkės irnr. Fermentai, kurie sintetina irnr kepurę, labai anksti prisijungia prie transkripto 5 galo pačioje transkripcijos elongacijos pradžioje (6.22 pav.). irnr molekulės galų modifikacijoms labai svarbus RNR II Pol didžiojo subvieneto CTD domenas. CTD yra vieta, kur jungiasi brendime dalyvaujantys ląstelės komponentai. Nustatyta, kad RNR Pol II CTD koduojančio fragmento iškrita slopina kepurės sintezę, splaisingą, poli (A) jungimą 3 gale. Brendime dalyvaujančių veiksnių jungimasis prie CTD valdomas fosforilinant CTD aminorūgštis. Nustatyta, kad žinduolių ir mielių guanililtransferazės jungiasi tik prie fosforilinto CTD domeno. Mielių metiltransferazė taip pat prisijungia prie CTD nuo fosforilinimo priklausomu būdu (6.22 pav.). Tuojau po to, kai susintetinama pre-irnr kepurė, prie jos prisijungia CBC baltymų kompleksas (angl. cap binding complex). Jis aktyvina tolesnį splaisingą ir irnr molekulės 3 galo susidarymą. Keli CBC komplekso subvienetai lieka prisijungę prie irnr visą transkripcijos bei brendimo laiką ir disocijuoja nuo jos tik citozolyje, kur prie irnr kepurės prisijungia transliacijos veiksnys eif-4e pav. RNR II Pol CTD domenas ir irnr kepurės sintezė mielėse. Mielių kepurę sintetinantys fermentai pažymėti. Lenkta rodyklė žymi transkripcijos pradžią ir kryptį (Current Opinion in Structural Biology, v. 15, p. 99, 2005) 327

328 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Pre-iRNR 3 galo modifikavimas Baltymus koduojančių genų transkripcijos, kurioje dalyvauja RNR Pol II, terminacija yra susijusi su pre-irnr 3 galo brendimu. Pirmiausiai, RNR II Pol, baigdama sintetinti pre-irnr, susintetina reguliacines sekas poliadenilinimo seką, PAS (angl. polyadenylation sequence), ir G ir U gausią seką. Prie šių irnr cis elementų jungiasi trans veiksniai baltymai, kurių, kartu su kitais brendime dalyvaujančiais baltymais, 3 galo brendimo komplekse gali būti iki 80. pre-irnr yra skeliama tarp PAS ir G ir U sekų (6.23 pav.). Prie nuskeltos pre-irnr 3 galo prijungiama poli (A) seka, o kita nuskeltos pre-irnr dalis suardoma. Poli (A) seką 3 gale turi beveik visos subrendusios eukariotų irnr, kurias sintetina RNR Pol II. Tokių sekų nėra daugialąsčių eukariotų histonų irnr ir dumblių irnr. irnr molekulių 3 galo modifikacijos užtikrina šias funkcijas: z padidina irnr molekulės stabilumą; z užtikrina veiksmingą irnr transliaciją; z yra reikalinga irnr pernašai iš branduolio į citozolį. Poli (A) seką 3 gale turi visos, su retomis išimtimis, subrendusios eukariotų irnr, kurias sintetina RNR Pol II. Pre-iRNR molekulėje PAS seka tai heksanukleotidas 5 AAUAAA3, nutolęs nukleotidų atstumu nuo skėlimo-poliadenilinimo vietos. AAUAAA seka yra viena iš konservatyviausių žinomų reguliacinių sekų. Nevisiškai atitinkančių seką poliadenilinimo elementų yra ~ 10 %. Dauguma jų turi vieną pakitusį nukleotidą (dažniausiai vietoje A yra U) pav. Pre-iRNR 3 galo brendimas eukariotuose. Parodyti skėlimo-poliadenilinimo komplekso baltymai (šerdiniai veiksniai), pagalbiniai veiksniai, irnr reguliacinės sekos (Nature Reviews Genetics, v. 11, p. 75, 2010) 328

329 VI. RNR brendimas Prie histonų irnr poli (A) seka 3 gale nėra prijungiama. pre-irnr 3 galą skelia endonukleazė. Tam, kad įvyktų skėlimas, pre-irnr molekulėje prieš skėlimo vietą turi susidaryti RNR segtukas. Prie segtuko prisijungia savitas baltymas SLBP. Prie kito irnr elemento, esančio nukleotidų už skėlimo srities, prisijungia U7 snrnr molekulė ji nustato skėlimo vietą. SLBP baltymas lieka prisijungęs prie histonų irnr ir jos pernašos į citozolį metu. Pre-iRNR 3 galo brendimas prasideda, kai prie PAS sekos prisijungia skėlimo ir poliadenilinimo atrankumo veiksnys CPSF (angl. cleavage and polyadenylation specificity factor), o prie G ir U gausios sekos CstF veiksnys (angl. cleavage stimulatory factor) (6.23 pav.). CPSF komplekso sudėtyje yra endoribonukleazė ji skelia pre-irnr. Skėlimo vieta yra apie nt už PAS sekos ir apie 30 nt prieš G ir U seką. Prie nuskeltos pre-irnr 3 galo poli (A) polimerazė, PAP (angl. polya polymerase), jungia A nukleotidus. Žinduoliuose į komplekso sudėtį įeina tvirtinamasis baltymas simplekinas (angl. symplekin) (6.24 pav.). Poli (A) polimerazė yra nukleotidiltransferazių superšeimos narė, nuo matricos nepriklausanti polimerazė. AMP nukleotidų jungimui poli (A) polimerazė naudoja tą patį katalizinį mechanizmą kaip ir DNR bei RNR polimerazės. Poli (A) polimerazė jungiasi prie RNR-CPSF-CstF komplekso, sąveikaudama su CPSF didžiuoju subvienetu. Prie irnr 3 galo prijungiami pirmieji ~ 10 A nukleotidų. Tada prie susintetinto fragmento prisijungia PABPN1 (angl. polya binding protein 1, N branduolys) baltymai ir sudaro kompleksą su irnr pirmaisiais A nukleotidais, CPSF ir poli (A) polimeraze. Tokiame komplekse PAP polimerazės procesyvumas išauga ji nedisocijuodama prijungia dar ~ 200 nukleotidų. Manoma, kad PABPN1 baltymas lieka prisijungęs prie irnr 3 galo tol, kol molekulė pernešama į citozolį. Citozolyje prie poli (A) sekos jungiasi citozolio PABP analogas PABPC baltymas. Jis apsaugo irnr nuo suardymo ir yra svarbus transliacijos iniciacijai prijungia transliacijos iniciacijos veiksnį eif4g. Todėl citozolyje subrendusios irnr 3 ir 5 galai suartėja, sudarydami kilpą. Manoma, kad irnr molekulės poli (A) ilgis 3 gale lemia irnr gyvavimo pusamžį. Kuo ilgesnis šis galas, tuo ilgiau jis deadenilinamas ląstelės egzonukleazių. Kaip ir pre-irnr kepurė 6.24 pav. Eukariotų pre-irnr 3 galo brendime dalyvaujantys baltymai. SV pre-irnr skėlimo vieta, CTD RNR Pol II C galinis domenas (Nature Structural and Molecular Biology, v. 19, p. 577, 2012) 329

330 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 5 gale, taip ir 3 galo poliadenilinimas priklauso nuo RNR Pol II CTD domeno. Eksperimentais sutrumpinus šį domeną, ląstelėse pre-irnr transkriptai neskeliami 3 gale transkripcija stabdoma kitose vietose. Nustatyta, kad irnr 3 galo skėlimo ir poliadenilinimo komplekso komponentai prisijungia prie RNR Pol II CTD domeno. Citozolyje tam tikru ląstelės diferenciacijos momentu poli (A) vėl sintetina citozolio fermentai. Nustatyta, kad toks procesas vyksta per ovocitų brendimą ir ankstyvuoju pelių bei varlių vystymosi periodu. Panašu, kad citozolio poliadenilinimo aparatas aktyvinamas tam tikru brendimo ir diferenciacijos momentu irnr splaisingas eukariotuose Kol nebuvo žinoma eukariotų genų struktūra, manyta, kad jie organizuoti taip pat, kaip ir prokariotų, t. y. visa geno DNR seka koduoja baltymą arba RNR. Tačiau paaiškėjo, kad daugelis eukariotų genų, koduojančių baltymus, turi įterptų sekų, kurios per transkripciją ar po transkripcijos yra pašalinamos iš pre-irnr. Išskiriamos dviejų tipų sekos: z egzonai, t. y. sekos, kurios po kirpimo sujungiamos; z intronai, t. y. sekos, kurios, po iškirpimo iš pre-irnr, lieka fiziškai atskirtos. Daugeliui eukariotų genų, koduojančių baltymus, būdinga egzoninė-introninė organizacija pav. Intronų egzistavimo įrodymas R kilpų metodu. Adenoviruso heksono geno struktūrinė organizacija (a); heksono geno DNR dalies, hibridizuotos su subrendusia heksono irnr, elektroninės mikroskopijos nuotrauka ir ją paaiškinanti schema. A C žymi intronų DNR (b) (PNAS, v. 74, p. 3173, 1977) 330

331 VI. RNR brendimas Tokių sekų turintiems transkriptams būdingas savitas brendimas branduolyje vykstantis splaisingas (angl. nuclear splicing). Splaisingo metu intronai pašalinami iš pre-irnr, o egzonai sujungiami. Šios reakcijos vyksta branduolyje transkripcijos metu arba tuoj pat po transkripcijos. Pre-iRNR virsta subrendusia irnr, ji pernešama į citozolį, ten naudojama kaip matrica baltymų biosintezei. Sekų pašalinimas iš pre-irnr ir likusių dalių sujungimas vyksta splaisingo proceso metu. Pirmiausiai buvo pastebėta, kad branduolio RNR molekulės heterogeninė branduolio RNR, hnrnr (angl. heterogeneous nuclear RNA), yra ilgesnės nei irnr, esančios citozolyje. Pirmasis intronų egzistavimo įrodymas gautas sulyginus adenoviruso sintetinamą heksono geno irnr ir geną koduojančią DNR. irnr ir DNR buvo hibridizuojamos tarpusavyje, o hibridai išryškinti elektroninės mikroskopijos metodu. Pasirodė, kad didelė dalis adenoviruso DNR nesihibridizavo su irnr: tokios DNR sritys hibride buvo išstumtos kaip didelės kilpos (6.25 pav.). Šis intronų ir egzonų nustatymo būdas yra vadinamas R kilpų technika. irnr ir DNR hibridai vėliau nustatyti tyrinėjant ir kitų eukariotinių organizmų irnr ir DNR. Taigi, buvo įrodyta, kad DNR egzistuoja sritys, kurių nėra subrendusiose irnr. Splaisingo atradimas 1977 m. buvo vienas svarbiausių atradimų eukariotų molekulinėje biologijoje Pre-iRNR intronai splaisingo reakcijų substratas Nėra nė vieno iki šiol žinomo eukariotų genomo, kuriame nebūtų rasta intronų ir splaisosomos ar jos komponentų. Vidutinis eukariotų genas turi ~ 8 egzonus, jo pre-irnr yra apie 4 10 kartų ilgesnė už subrendusią irnr. Egzonai yra palyginti trumpi ( nt), o intronų ilgis gali siekti ir nt. Aukštesniuosiuose eukariotuose intronų skaičius vienoje pre-irnr svyruoja nuo 0 iki > 50, o genomuose tik nedidelė dalis genų (~ 6 %) neturi intronų (6.26 pav.) pav. Intronų skaičius eukariotų genuose (Nature Reviews Genetics, v. 7, p. 211, 2006) 331

332 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Žemesniuosiuose eukariotuose, priešingai, tik nedidelė dalis genų turi intronų pvz., mielių Saccharomyces cerevisiae tik 235 genuose iš (< 4 %) yra intronų; genuose jų nedaug, intronai dažniausiai yra trumpi ir išsidėstę arčiau geno 5 galo. Iki šiol diskutuojama dėl intronų kilmės eukariotuose. Buvo iškeltos dvi hipotezės. Pirmoji yra vadinamoji anksti atsiradusių intronų hipotezė (angl. introns early). Ji teigia, kad eukariotų genai intronus įgijo iš prokariotų, paskui kai kurie organizmai juos prarado, todėl genomuose jų dydis ir skaičius įvairus. Prokariotai taip pat prarado intronus ir splaisomą, nes dėl evoliucinio spaudimo turėjo didinti DNR replikacijos greitį ir intronų bei splaisosomos atsisakyti. Kita vadinamoji vėlai atsiradusių intronų (angl. introns late) hipotezė teigia, kad archėjos ir bakterijos niekada neturėjo intronų ir splaisosomos ir kad šie atsirado iš karto eukariotuose kaip genomo patobulinimas, kuris funkcionuoja iki šiol kuriant naujus genus. Genomų sekoskaitos tyrimai atskleidė, kad iš tiesų intronų įgijimas ir praradimas vyksta iki šiol, pvz., intronų transpozicijos, intronų įterpimo, genų duplikacijos būdais. Šiandien vystoma intronų kilmės teorija, jungianti abi anksčiau minėtas teorijas. Ji teigia, kad dauguma intronų eukaruotų genomuose atsirado labai ankstyvuose evoliucijos etapuose. Genai, turintys intronų, pasižymi šiomis savybėmis: z egzonų eiliškumas yra toks pats ir gene, ir subrendusioje irnr. Pvz., jeigu egzonų tvarka gene yra a, b, c, d, f, po splaisingo ji lieka tokia pati; z intronų turintis genas išlaiko tą pačią struktūrą visų audinių ląstelėse, taip pat ir lytinėse ląstelėse, nesvarbu, vyksta jo raiška ar ne; zbranduolio genuose intronai įprastai koduoja terminacijos kodonus visuose skaitymo rėmeliuose. Jeigu intronai iš pre-irnr nepašalinami, jie anksčiau laiko stabdo baltymų sintezę Splaisingui reikšmingos konservatyvios nukleotidų sekos intronuose ir egzonuose Intronai branduolyje pašalinami iš irnr molekulių dalyvaujant molekulinei mašinai splaisosomai (angl. spliceosome), kurios komponentai (splaisingo trans veiksniai) atpažįsta trumpas konservatyvias sritis egzonų ir intronų sandūros srityse bei intronų ir egzonų viduje (splaisingo cis veiksnius). Splaisingo cis ir trans veiksniai užtikrina splaisingo tikslumą ir veiksmingumą. Splaisingo cis veiksniai skirstomi į dvi grupes konservatyviąsias sekas egzonų ir intronų sandūros srityse bei reguliacines sekas egzonuose ir intronuose. Konservatyviosios sekos egzonų ir intronų sandūros srityse yra šios: z5 splaisingo sritis AG/GURAGU (R purinas, pasvirasis brūkšnelis skiria egzoną ir introną) (6.27 pav., a); z 3 splaisingo sritis introne YAG (Y pirimidinas) (6.27 pav., a). Eukariotų pre-irnr splaisingas vyksta dalyvaujant cis veiksniams nukleotidų sekoms pre-irnr, ir trans veiksniams splaisosomai ir splaisingo veiksniams. 332

333 VI. RNR brendimas Konservatyviosiose srityse intronų 5 ir 3 galuose esantys dinukleotidai GU ir AG bei šakojimosi sekos A nukleotidas yra labai konservatyvūs. Sritys buvo nustatytos mutagenezės metodu gavus mutacijas, kurios sukėlė įvairaus laipsnio splaisingo slopinimą. Sritys yra panašios stuburiniuose, augaluose ir mielėse. Pastarosiose jos dar konservatyvesnės. Toks nukleotidų sekų panašumas liudija, kad introninę-egzoninę organizaciją turintys genai ir splaisingas egzistavo labai seniai. z Šakojimosi taško seka, BPS (angl. branch point sequence). Ji yra netoli (18 40 nt) nuo 3 splaisingo srities introne. Jos seka yra YNCURAY (N bet kuris nukleotidas) (6.27 pav., a b). Ties A nukleotidu, įvykus pirmai trans esterinimo reakcijai, susidaro introno kilpa. Kilpos susidarymo mechanizmas yra toks pats kaip ir II grupės savaime išsikerpančių intronų kilpos susidarymas pirmos trans esterinimo reakcijos metu. z Polipirimidinų ruožas (Y) n (6.27 pav., a). Jį sudaro pirimidino nukleotidų. Sritis būdinga aukštesniųjų eukariotų intronams. Ji yra tarp šakojimosi taško sekos ir 3 splaisingo srities. Mielėse šakojimosi taško seka (UACUAAC) yra labai konservatyvi, o polipirimidinų ruožo kartais iš viso nėra. Tai galima paaiškinti tuo, kad palyginti nedaug mielių pre-irnr turi intronus. Anksčiau išvardyti konservatyviųjų sekų elementai yra svarbūs katalizinėms reakcijoms splaisosomoje vykti. Žinduolių genuose aptikta nedidelė grupė intronų, kurių galuose esantys konservatyvūs elementai skiriasi nuo anksčiau aptartų vadinamųjų GU-AG intronų. Šie intronai 5 splaisingo srityje turi dinukleotidą AU, o 3 splaisingo srityje AC (6.27 pav., a). Tokių intronų skėlimas vyksta panašiai kaip ir GU-AG sekas turinčių intronų. Įdomu, kad AU-AC intronų splaisinge daly pav. Splaisingui reikšmingos konservatyvios sekos pre-irnr. Konservatyviosios sekos žinduolių ir mielių pre-irnr intronuose. Konservatyviausi nukleotidai pabraukti (a); konservatyviosios splaisingo sekos kai kuriuose eukariotų genuose (b) 333

334 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA vauja vadinamoji alternatyvioji splaisosoma, kurios sudėtis skiriasi nuo GU-AG intronų splaisinge dalyvaujančių splaisosomų sudėties. Alternatyviojoje splaisosomoje nustatytos kitokios snrnr (angl. small nucleolar RNA) molekulės U11 ir U12, kurių nėra GU-AG intronų skėlime dalyvaujančioje splaisosomoje (vadinamojoje U2 splaisosomoje). Antroji svarbi splaisingo cis veiksnių grupė yra reguliacinės sekos egzonuose ir intronuose splaisingo stiprikliai ir slopikliai (angl. splicing enhancers and silencers). Jie yra svarbūs alternatyviojo splaisingo (angl. alternative splicing) reguliatoriai. Prie splaisingo stipriklių ir slopiklių jungiasi splaisingo veiksniai. Jie valdo alternatyviojo splaisingo vyksmus Splaisingo reakcijos Eksperimentais, atliktais su in vitro susintetintais pre-irnr substratais, nustatyta, kad intronai yra skeliami iš pre-irnr, o likę egzonai jungiami vykstant dviems trans esterinimo reakcijoms. Pirmojoje trans esterinimo reakcijoje konservatyvaus A nukleotido, esančio šakojimosi taško sekoje, 2 hidroksigrupės deguonies atomas atakuoja fosfatą 5 splaisingo srityje. I egzonas skeliamas, o 5 gale esantis G nukleotidas jungiamas prie A nukleotido 2, 5 fosfodiesteriniu ryšiu. Susidaro introno lasas (angl. lariat) (6.28 pav.). Kitoje trans esterinimo reakcijoje I egzono gale esančio nukleotido 3 hidroksigrupės deguonies atomas atakuoja fosfatą 3 splaisingo srityje. Laso intronas skeliamas, o abu egzonai sujungiami (6.28 pav.). Splaisingui vykti būtina splaisosoma megadaltonų molekulinės masės sudėtingas baltymų, mažųjų branduolio RNR snrnr ir splaisingo veiksnių kompleksas. Splaisosoma tiksliai ir veiksmingai vykdo intronų kirpimo ir egzonų sujungimo reakcijas pav. Pre-iRNR splaisingo trans esterinimo reakcijų, kurias vykdo splaisosoma, schema 334

335 VI. RNR brendimas Splaisosomos struktūra Pavienės splaisosomos, ultracentrifuguojamos druskų tankio gradiente, sedimentuoja kaip 40 60S dalelės m. atliktos vienos splaisosomos 20 Å skyros krioelektroninės mikroskopijos vaizdai liudija, kad splaisosomą sudaro 2 dalys ir ertmė (tunelis) tarp jų (6.29 pav., a). Splaisosoma yra šiek tiek pailgos globulės formos. Didžiausia splaisosomos komponentų (snrnp) koncentracija didžiajame subvienete. Dydžiu splaisosomos panašios į ribosomas. Žinduolių ląstelių branduolių tyrimai atskleidė, kad splaisosomos gali būti organizuotos į dar didesnius kompleksus. Išgrynintos iš branduolių splaisosomos sedimentuoja kaip 200S dalelės. Tokios dalelės pavadintos lnrnp (angl. large nuclear ribonucleic particles) (6.29 pav., b). Elektroninės mikroskopijos metodu nustatyta, kad jos gali būti sudarytos iš keturių vienodų struktūrų. Toks kompleksas pavadintas suprasplaisosoma (angl. supraspliceosome). Manoma, kad suprasplaisosomoje vienu metu galėtų vykti kelių intronų iškirpimas. U2, arba GU-AG, splaisosomą sudaro penkios snrnp dalelės (angl. small nucleolar ribonucleic particles) U1, U2 ir U4-U6 ir U5. Pagrindiniai snrnp dalelių komponentai yra: z U1, U2, U4-U6 ir U5 snrnr molekulės (U pavadinimuose yra dėl U nukleotidų gausos, o numeracija atitinka atradimo eiliškumą). U4 ir U6 snrnr molekulės tam tikrose srityse yra komplementarios viena kitai ir in vivo sudaro vieną snrnp dalelę (6.31 pav.). Kitos snrnp turi po vieną snrnr molekulę. snrnr nukleotidų sekos skiriasi tarp rūšių, bet jų antrinės struktūros yra konservatyvios. U6 snrnr nukleotidų sekos yra panašios žmoguje ir mielėse. U6 snrnr genas transkribuojamas RNR III polimerazės. Molekulė turi kitaip modifikuotą 5 galą nei kitos snrnr. Ši RNR po transkripcijos lieka branduolyje, o visos kitos snrnr keliauja į citozolį, kur yra modifikuojamos (montuojasi į splaisosomos snrnp daleles). Kaip minėta, U6 su U4 snrnp sudaro vieną dalelę, kuri vėliau susijungia su U5 snrnp dalele pav. Splaisosomos struktūra. Splaisosomos erdvinė struktūra, nustatyta krioelektroninės mikroskopijos metodu (a) (Molecular Cell, v.15, p.833, 2004); suprasplaisosomos struktūros modelis. Raudonai pažymėti egzonai (b) (Structure, v.16, p.1605, 2008) 335

336 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA z Sm baltymai šerdiniai splaisosomos baltymai. Kiekvienoje snrnp dalelėje, išskyrus U6, yra vienodas septynių Sm baltymų rinkinys: B / B, D3, D2, D1, E, F ir G. Sm baltymai atlieka svarbias funkcijas splaisingo valdyme jie yra branduolio pernašos signalai, nukreipiantys splaisosomos snrnp daleles į splaisingo vietas. Jie taip pat palaiko splaisosomos dalelių integralumą. Sm baltymų dydis svyruoja tarp 9 29 kda. Jie tam tikra tvarka prisijungia prie konservatyvios viengrandinės nukleotidų sekos RAU 4-6 GR snrnr molekulėse. U6 snrnr turi kitokį Sm baltymų rinkinį (LSm). zbe šerdinių Sm baltymų, kiekviena snrnp dalelė dar turi kiekvienai būdingų savitųjų baltymų. Pvz., U1 snrnp dalelė turi tris savitus baltymus: U1-A, U1 70 kda ir U1-C (6.30 pav.). Splaisosomą sudarančios snrnp dalelės iš viso turi apie 40 baltymų (6.31 pav.). Manoma, kad kai kurie splaisosomos baltymai tiesiogiai dalyvauja katalizės reakcijose, kiti atlieka struktūrizavimo funkciją arba yra reikalingi splaisosomos susimontavimui. Splaisinge dalyvauja ir daug kitų baltymų splaisingo veiksnių, kurie atlieka įvairias funkcijas. Splaisingo veiksniai skirstomi į dvi grupes: z SR baltymai. SR baltymai yra labai konservatyvūs stuburiniuose, bestuburiuose, taip pat jų rasta augaluose. Mielėse nustatyti tik kai kurių SR baltymų analogai. SR baltymų C galo RS domene (R argininas, S serinas) gausu serino ir arginino aminorūgščių. Domeną dažniausiai sudaro SR arba RS tvarka išsidėstę dipeptidai. Serino aminorūgštys fosforilinamos įvairiais ląstelės ciklo tarpsniais. Nuo fosforilinimo priklauso SR baltymų giminingumas RNR ir sąveika su kitais baltymais. Kiekvieno tipo ląstelės sintetina skirtingą SR baltymų rinkinį. SR baltymai N galu sąveikauja su pre-irnr. N gale yra sąveikos su RNR motyvas (motyvai) RRM (angl. RNA recognition motif), kurį sudaro aminorūgščių. SR baltymai atrankiai jungiasi prie splaisingo stipriklių savitųjų sekų, esančių egzonuose ir intronuose. Baltymai yra svarbūs alternatyviojo splaisingo, irnr išnašos iš branduolio, irnr ardymo, transliacijos reguliatoriai. z Heterologinis branduolio ribonukleoproteinas, hnrnp (angl. heterologous nuclear ribonucleoprotein). Tai yra įvairūs baltymai, prisijungiantys prie pre-irnr per transkripciją arba po transkripcijos ir darantys įtaką splaisingo eigai. hnrnp baltymams taip pat būdingas RRM motyvas pav. U1 splaisosmos snrnp dalelės erdvinė struktūra. snrnr struktūros elementai (stiebai), Sm baltymai, dalelei saviti baltymai (U1 70 kda, U1-A, U1-C) pažymėti (G. Karp. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments, fifth edition, 2008) 336

337 VI. RNR brendimas Splaisingo komponentus koduoja didelė dalis eukariotų genomo. Pvz., mielėse splaisingo komponentus koduoja daugiau nei 100 įvairių genų, tai sudaro apie 2 % mielių genomo, nors intronus turinčių genų dalis mielėse yra labai nedidelė. Splaisosomos erdvinė struktūra ir komponentų sudėtis splaisingo metu kinta. Ties preirnr, kuri turi intronų, splaisosoma susimontuoja tam tikra tvarka. Jeigu intronai yra nedidelio dydžio (~ nt), splaisosoma susimontuoja išilgai introno. Jeigu intronai yra dideli (> 250 nt), kaip, pvz., yra žinduoliuose, splaisosomos komponentai pirmiausiai jungiasi ties egzonais Splaisosomos susimontavimas ties pre-irnr Kaip susimontuoja funkcionali splaisosoma, kurios kataliziniuose centruose gali vykti preirnr intronų skėlimas ir egzonų sujungimas? Vienas pagrindinių šio proceso bruožų tas, kad splaisosomos komponentai sąveikauja tarpusavyje ir su pre-irnr tam tikra tvarka: susidarant vieno tipo ryšiams, kiti suardomi. Pirmame etape susidaro ankstyvasis E kompleksas (angl. early complex). U1 snrnp dalelė prisijungia prie pre-irnr 5 splaisingo srityje (6.32 pav.). Šiame etape pre-irnr atpažįstama kaip substratas būsimoms splaisingo reakcijoms. U1 snrnp dalelės snrnr molekulė sąveikauja su komplementaria GU seka introne ir aplink jį. U1 snrnp prisijungimui ATP nereikia. Aukštesniuosiuose eukariotuose šią sąveiką stabilizuoja SR baltymai ir U1 snrnp dalelės baltymai. Pvz., pirmajame splaisosomos montavimosi etape prie introno šakojimosi taško sekos ir poli pav. Splaisosomos snrnp dalelių sudėtis (Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2011, 3:a003707) 337

338 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA pirimidinų ruožo prisijungia SF1/BBP ir pagalbinis U2AF veiksnys. U2AF veiksnį sudaro du subvienetai (65 kda ir 35 kda baltymai). SF1/BBP sąveikauja su 65 kda baltymu, o 35 kda baltymas jungiasi prie AG dinukleotido 3 splaisingo srityje (6.32 pav.). Tokiu būdu nustatomos 3 ir 5 splaisingo sritys. Mielių intronuose, taip pat nedideliuose daugialąsčių organizmų intronuose šiame etape introno 5 ir 3 galai priartėja vienas prie kito. Kitame etape introne prie šakojimosi taško sekos prisijungia U2 snrnp dalelė. Prisijungimui reikia ATP, kaip ir visiems tolesniems vyksmams. Dėl komplementarios sąveikos tarp U2 snrnr ir introno šakojimosi taško sekos susidaro RNR-RNR dupleksas (6.32 pav.). Šiame duplekse šakojimosi taško sekoje esantis nesuporuotas A nukleotidas yra išstumiamas iš duplekso. Taigi, komplementari sąveika tarp U2 snrnr ir pre-irnr šakojimosi taško sekos lemia tai, kad A nukleotido ribozės 2 hidroksigrupės deguonies atomas tampa nukleofilu pirmojoje trans esterinimo reakcijoje. U2 snrnp sąveikauja su U1 snrnp. Prisijungus U2 snrnp dalelei, E kompleksas virsta A kompleksu (6.32 pav.). Anksčiau aprašyti įvykiai buvo nustatyti tyrinėjant splaisingą mielėse. Daugialąsčių organizmų genuose egzonai dažniausiai yra trumpi, o intronai daug ilgesni, todėl U1 snrnp ir U2 snrnp dalelės prisijungia iš abiejų egzonų pusių. Tai vadinamasis egzonų nustatymo (angl. exon definition) procesas. Toliau į A kompleksą įsijungia dar viena snrnp dalelė. Ji sudaryta iš U4-U6 snrnp ir U5 snr- NP dalelių (6.33 pav.). Susidaro splaisingo B kompleksas. U4-U6 snrnp dalelėje U4 ir U6 snrnr molekulės tarpusavyje sudaro RNR-RNR dupleksą. Pvz., mielėse šį dupleksą sudaro net 24 nukleotidų poros pav. Splaisosomos E ir A kompleksų susidarymas 338

339 VI. RNR brendimas Tada splaisosomos B komplekse įvyksta struktūrinių pokyčių, kurių metu susidaro RNR-RNR sąveikų tinklas, užtikrinantis tolesnes katalizines introno skėlimo ir egzonų sujungimo reakcijas. Veikiant DExD/H helikazėms (jų veikimui reikia ATP), pirmiausiai nuo 3 splaisingo srities disocijuoja U1 snrnp dalelė. Tada suardomas U4-U6 snrnr molekulių dupleksas, ir U6 snrnr sudaro dupleksą su U2 snrnr (6.33 pav., a, b), o U4 snrnp dalelė disocijuoja iš splaisosomos. Splaisosomos B kompleksas virsta kataliziškai aktyviu B* kompleksu, kuriame gali vykti pirmoji trans esterinimo reakcija. Išstumtojo A nukleotido 2 hidroksigrupės deguonies atomas atakuoja fosfatą 5 splaisingo srityje. Intronas ties 5 splaisingo sritimi skeliamas, susidaro laso struktūra. I egzono 3 gale lieka hidroksigrupė (6.28 pav.). Įvykus pirmai trans esterinimo reakcijai, splaisosomos B* kompleksas virsta C kompleksu. Prieš antrąją trans esterinimo reakciją C komplekse vėl vyksta nuo ATP priklausomi struktūriniai persitvarkymai. C komplekse egzono 3 hidroksigrupė išsidėsto arti 3 splaisingo srities. Reakcijai vykti labai svarbi sąveika tarp konservatyvios U5 snrnr kilpos ir egzonų sekų 5 ir 3 splaisingo srityse (6.33 pav., a b). Sąveika tarp U5 snrnr ir 5 egzono išsilaiko abiejų reakcijų metu. U5 snrnr kilpa laiko 5 egzono splaisingo tarpinį produktą po pirmos trans esterinimo reakcijos ir 6.33 pav. Splaisosomos B ir B* kompleksų susidarymas. Splaisosomos A, B, B* kompleksų montavimosi schema (a) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 15, p. 108, 2014); sąveikos tarp U snrnr molekulių ir pre-irnr splaisosomos B ir B* kompleksuose (b) (Cell, v. 136, p. 701, 2009) 339

340 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA padeda išdėstyti 5 ir 3 egzonus antrajai trans esterinimo reakcijai. Tai, kad U5 snrnr kilpoje yra keli U nukleotidai, galintys sudaryti ne Votsono-Kriko nukleotidų poras, liudija, kad splaisingo metu kilpa gali laikyti abu egzonus. U5 snrnr, greičiausiai, tiesiogiai nedalyvauja katalizėje, nes dalis jos sekų in vitro nėra svarbios. Įvykus antrajai trans esterinimo reakcijai, susidaro laso struktūros intronas, egzonai sujungiami (6.28 pav.). Tada nuo irnr disocijuoja U2, U5 ir U6 snrnp dalelės. Šiuose vyksmuose dalyvauja įvairios RNR helikazės. Pasibaigus splaisingo reakcijoms, irnr turi pasišalinti iš splaisosomos ir pereiti į citozolį. Splaisosomoje vėl įvyksta pertvarka, suardomi katalizinių reakcijų metu sudaryti RNR-RNR ryšiai ir atstatomi tarpmolekuliniai ryšiai, buvę iki susimontuojant splaisosomai. Splaisosomos struktūrai ir funkcijoms svarbūs dvivalenčiai metalo jonai (Mg 2+ ). Jie tiesiogiai dalyvauja katalizinėse reakcijose ir yra reikalingi RNR molekulių struktūrai palaikyti Splaisosomos katalizinis centras Remiantis vidumolekulinių struktūrų, kurios susidaro pre-irnr molekulėje splaisingo metu splaisosomoje ir savaime išsikerpant II tipo intronams, taip pat cheminių reakcijų abiejų procesų metu tyrimų duomenimis, manoma, kad pre-irnr splaisingą katalizuoja RNR, nors splaisosomos sudėtyje yra didesnis kiekis baltymų nei RNR. U2 ir U6 snrnr molekulės sąveikauja tarpusavyje ir su pre-irnr. Jos sudaro aktyviojo centro pamatą splaisosomoje. Nustatyta, kad U2 ir U6 RNR molekulių fragmentai in vitro gali sudaryti komplementarią sąveiką ir įgyti struktūrą, panašią į tą, kurią abi molekulės sudaro kataliziškai aktyvioje splaisosomoje. Kai reakcijos mišinyje yra nedidelis oligonukleotidas, turintis nukleotidų seką, panašią į šakojimosi taško seką introne (angl. branch oligo), vyksta lėta reakcija, panaši į pirmąją trans esterinimo reakciją splaisosomoje. Reakcijoje susidaro laso struktūra tarp U6 ir oligonukleotido pav. II grupės savaime išsikerpančio introno V domeno ir splaisosomos U6 snrnr aktyvieji centrai ir katalizinių reakcijų schemos. M metalo jonai; žvaigždutės nukleotidų fosfato grupių deguonies atomai, su kuriais yra koordinuoti metalo jonai (Nature, v. 503, p. 201, 2013) 340

341 VI. RNR brendimas U6 snrnr yra viena konservatyviausių snrnr, tiek savo nukleotidų seka, tiek dydžiu. Mutacijos šioje RNR, pvz., vienintelio deguonies atomo pakeitimas sieros atomu fosfodiesteriniame ryšyje U6 snrnr molekulės centre, visiškai stabdo splaisingą. U6 RNR molekulė prijungia Mg 2+ jonus, šie išsidėsto konservatyvioje stiebo-kilpos struktūroje (angl. intramolecular stem loop, ISL). Šis U6 snrnr struktūros elementas labai panašus į II grupės savaime išsikerpančių intronų V domeno struktūrą (6.34 pav.). Manoma, kad metalo jonai tiesiogiai dalyvauja splaisingo reakcijose arba aktyvindami 2 hidroksigrupės deguonies atomą, arba stabilizuodami nueinančiąją grupę (angl. leaving group). Netoli splaisosomos katalizinio centro esantys baltymai taip pat svarbūs katalizei. Eksperimentais parodyta, kad U5 snrnp dalelės Prp8 baltymas yra netoli splaisosomos katalizinio centro, kurį formuoja snrnr molekulės. Baltymo domenų struktūra panaši į kai kurių II grupės savaime išsikerpančių intronų koduojamos atvirkštinės transkriptazės ir II tipo restrikcijos endonukleazės domenus. Tai dar labiau sustiprina prielaidą, kad branduolio splaisingas ir II grupės savaime išsikerpančių intronų splaisingas yra bendros kilmės. Pasirenkant skėlimo vietas svarbų vaidmenį atlieka baltymai. Didžioji dauguma daugialąsčių organizmų ląstelių pre-irnr intronų turi splaisingo sričių, pasižyminčių nedideliu konservatyvumu. Manoma, kad splaisingo vietų atpažinimą šiose RNR lemia ne tiek konservatyvios sritys, kiek egzonai (~ 200 nt). Egzonuose yra reguliacinių elementų, vadinamųjų egzoninių splaisingo stipriklių, ESE (angl. exonic splicing enhancers), bei egzoninių splaisingo slopiklių, ESS (angl. exonic splicing silencers) (6.35 pav.). Jie prijungia splaisingo veiksnius, pvz., SR baltymus ar hnrnp, taip pat įjungia į splaisosomą jos komponentus. Toks splaisingo vietų atpažinimas yra būdingas tiek konstitutyviai, tiek alternatyviai (t. y pasirinktinai) kerpamiems egzonams. Intronuose taip pat yra reguliacinių splaisingo sričių introninių splaisingo stipriklių, ISE (angl. intronic splicing enhancers), bei introninių splaisingo slopiklių, ISS (angl. intronic splicing silencers) (6.35 pav.) pav. Splaisingo valdymo schema. Rodyklės žymi aktyvinančius komponentus, raudona linija buku galu slopinančius komponentus (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012) 341

342 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Splaisingo kompleksų lokalizacija branduolyje Tyrimais nustatyta, kad didžioji dalis splaisingo komponentų sutelkti branduolio dėmėse (angl. speckles) ir Kajalo kūneliuose, kurie pasklidę po branduolį, išskyrus branduolėlį (6.36 pav., a b). Žinduolių branduolys turi dėmių ir 1 5 Kajalo kūnelius. Fluorescencinės in situ hibridizacijos metodu nustatyta, kad pre-irnr molekulės ir subrendusios irnr yra sutelktos dėmių kraštuose. Branduolio dėmių struktūros sutampa su branduolio sritimis, kurios yra vadinamos interchromatino granulių telkiniais ir perichromatino fibrilių tinklu. In situ hibridizacijos eksperimentai atskleidė, kad brandinama ir pernešama iš branduolio į citozolį pre-irnr juda šiomis struktūromis. Nustatyta, kad splaisosomos komponentai pradeda montuotis ties pre-irnr, kai molekulės 3 galas dar nėra susintetintas, o intronų iškirpimas prasideda dar nepasibaigus transkripcijai. Aktyviai transkribuojamų genų vietose vyksta ir transkriptų splaisingas Alternatyvusis splaisingas Vienas didžiausių praėjusio amžiaus antrosios pusės molekulinės biologijos atradimų yra alternatyviojo splaisingo (angl. alternative splicing) atradimas. Genuose, turinčiuose daugiau nei vieną introną, su intronais pasirinktinai gali būti iškerpami ir egzonai. Fenomenas pirmą kartą pastebėtas 1977 m. tiriant adenoviruso pre-irnr transkriptų brendimą, o vėliau 1981 m. rastas tiriant ląstelių pre-irnr. Didžiosios dalies aukštesniųjų eukariotų pre-irnr intronų iškirpimas ir egzonų sujungimas vyksta ne vienu, bet keliais būdais. Įvairios to paties geno transkripto subrendusios formos (irnr izoformos) gali būti sintetinamos skirtinguose to paties organizmo audiniuose bei skirtingais vystymosi tarpsniais. Aukštesniuosiuose eukariotuose alternatyvusis splaisingas vyksta > 90 % genų, kurie turi intronų, pre-irnr. Alternatyvusis splaisingas yra eukariotų transkriptomų ir proteomų įvairovės priežastis. Manoma, kad, pvz., žmogaus genome apie baltymų gali būti susintetinama iš įvairių alternatyviojo splaisingo keliu susintetintų irnr, kurias koduoja ~ genų pav. Ląstelių branduolių sritys, kuriose sutelkti kai kurie splaisingo komponentai. HeLa ląstelių branduolių dėmės, vaizdintos imunofluorescencine analize su antikūnais prieš splaisingo veiksnį SC35 (a) (Cold Spring Harb Perspect Biol, 2011, 3:a000646); Kajalo kūneliai pelės ląstelių branduoliuose, vaizdinti imunofluorescencine analize su žaliai fluorescuojančiais antikūnais prieš p80/koilino baltymus (b) ( 342

343 VI. RNR brendimas Žmogaus ir pelės tyrimai liudija, kad alternatyvusis splaisingas yra susijęs su nesenu egzonų įgijimu ar praradimu genuose. Siūlomi keli galimi alternatyviojo splaisingo kilmės mechanizmai: egzonų maišymo (angl. exon shuffling), intronų sekų egzonizacijos ir konstitutyvių egzonų virtimo alternatyviais mechanizmai. Alternatyvusis splaisingas gali vykti keliais, eukariotuose nevienodai paplitusiais būdais (6.37 pav.). Egzono šalinimo (angl. exon skipping) atveju iš pre-irnr pašalinamas egzonas kartu su jį ribojančiais intronais. Tokiu būdu vyksta apie 40 % splaisingo įvykių aukštesniuosiuose eukariotuose. Alternatyvios 5 ar 3 splaisingo srities pasirinkimo atveju splaisingas vyksta pasirenkant vieną ar kitą skėlimo vietą pre-irnr 5 ar 3 gale egzonuose. Dar vienas alternatyviojo splaisingo būdas yra introno išlaikymas (angl. intron retention), kai intronas paliekamas subrendusioje irnr. Šiuo būdu alternatyvusis splaisingas stuburiniuoe ir bestuburiuose vyksta retai (~ 5 % splaisingo įvykių), tačiau jis vyrauja augalų, grybų, pirmuonių ląstelėse. Gana reti yra kiti alternatyviojo splaisingo būdai: nesuderinamų egzonų (angl. mutually exclusive exons), alternatyvių promotorių (angl. alternative promoters) ir alternatyvių poli (A) sričių (angl. alternative polyadenylation) naudojimo būdai. Vienas ypatingesnių alternatyvaus splaisingo atvejų nustatytas drozofilos DSCAM gene (angl. Downs syndrome cell adhesion molecule), koduojančiame membranos receptorių. DSCAM baltymai reikalingi neuronų tarpląsteliniams ryšiams susidaryti ir imuninės sistemos funkcionavimui. Drozofilos genas turi 115 egzonų; iš jų 95 kerpami alternatyviai. Teoriškai gali susidaryti geno transkripto variantų! Alternatyvusis splaisingas vyksta nesuderinamų egzonų būdu: keturiuose geno egzonų telkiniuose pasirinktinai paliekamas tik vienas egzonas, kiti pašalinami iš pre-irnr (6.38 pav.). Geno 4-ame, 6-ame, 9-ame ir 17-ame telkiniuose yra atitinkamai 12, 48, 33 ir 2 egzonai. 4, 6 ir 9 telkiniai koduoja baltymų imunoglobulinų domenus pav. Alternatyviojo splaisingo būdai eukariotuose. Plona linija žymi intronus, dėžutės egzonus (Nature Reviews Genetics, v. 11, p. 345, 2010) 343

344 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6.38 pav. Drosophila melanogaster DSCAM geno pre-irnr alternatyvusis splaisingas nesuderinamų egzonų būdu ( irnr kokybės kontrolė Didžioji dalis eukariotų ląstelės baltymų yra sintetinami kaip matricas naudojant irnr, patyrusias daugelį anksčiau aptartų brendimo vyksmų. Brendimo procesai yra dalis vadinamojo irnr kokybės kontrolės, QC (angl. quality control), proceso, kuris vyksta iki pat transliacijos pradžios ir net transliacijos metu. Transkriptai, kurie nepereina kurio nors brendimo etapo, yra suardomi nukleazių ar kitu būdu išvengia transliacijos. Subrendusios irnr pernešamos iš branduolio į citozolį. irnr pernašos procesas taip pat yra vienas iš irnr kokybės kontrolės etapų, kurio metu tikrinama, ar irnr yra perėjusi brendimo procesus ir ar gali dalyvauti transliacijoje RNR redagavimas Iki 9 praėjusio amžiaus dešimtmečio manyta, kad informacija apie eukariotų baltymus užkoduota introninės-egzoninės struktūros eukariotų genome. Tačiau buvo nustatyta, kad į parazitinių pirmuonių tripanosomų Trypanosoma brucei ir Crithidia fasciculata mitochondrijų citochromo c oksidazės pre-irnr, kurią koduoja cox2 genas, po transkripcijos įterpiami ir pašalinami uridino nukleotidai. Šį biologinį fenomeną mokslininkai pavadino redagavimu (angl. editing). Vėliau paaiškėjo, kad transkriptuose tokių modifikacijų gali būti dar įvairesnių ir jos vyksta visų rūšių RNR molekulėse įvairiuose eukariotuose. Šiandien žinoma, kad redagavimo fenomenas būdingas visų gyvybės domenų organizmams: eukariotams, archėjoms, bakterijoms. Jis nustatytas įvairiuose eukariotuose nuo vienaląsčių iki žmogaus. Dažniausiai redaguojamos irnr molekulės, rečiau trnr ir rrnr molekulės. Redagavimas yra pre-rnr brendimo dalis. RNR redagavimas tai per transkripciją arba po transkripcijos vykstantys RNR transkripto nukleotidų sekos keitimai, kuriais keičiamas RNR užkoduotos biologinės informacijos turinys. 344

345 VI. RNR brendimas Redagavimo tipai Eukariotuose RNR redaguojamos vykstant skirtingoms biocheminėms reakcijoms. 6.2 lentelėje pateikti RNR redagavimo tipai ir kai kurių jų charakteristikos. Redaguojant RNR nukleotidų pakeitimo (konversijos) būdu fosfodiesteriniai ryšiai nesuardomi, modifikuojami RNR esantys nukleotidai. Redaguojant RNR įterpimų (insercijų) ar pašalinimų (delecijų) būdu yra sudaromi arba suardomi fosfodiesteriniai ryšiai. Tolesniuose poskyriuose šie tipai aptariami išsamiau Nukleotido pakeitimas Redagavimas nukleotidų keitimo (konversijos) būdu dažniausiai vyksta augalų ląstelių organelių (mitochondrijų) transkriptuose, taip pat branduolio irnr transkriptuose, tačiau pasitai- 6.2 lentelė. Eukariotų RNR redagavimo tipai Redagavimo tipas Organizmas Molekulė Mechanizmas Nukleotidų įterpimai (insercijos) arba pašalinimai (delecijos) U nukleotidai Kinetoplastidės* (mitochondrijos) irnr Grandinės skėlimas / sujungimas C nukleotidų įterpimas U, UA, AA, CU, GU, GC įterpimas G įterpimas A įterpimas Naujo nukleotido įterpimas vietoje pašalintojo C A, A G, U G, U A Physarum polycephalum* (mitochondrijos) Paramiksovirusai Ebola virusas Acanthamoeba castellanii Grybai (mitochondrijos) irnr, trnr, rrnr irnr, trnr, rrnr irnr irnr trnr???? Iškirpimas / prijungimas Egzonukleazė / nukleotidiltransferazė (?) Nukleotidų pakeitimai (konversijos) C U Aukštesnieji augalai (mitochondrijos, irnr, trnr, rrnr Deamininimas chloroplastai) Physarum polycephalum irnr? Žinduoliai irnr Deamininimas U C Žinduoliai irnr? Aukštesnieji augalai irnr? A I Žinduoliai irnr Deamininimas Žmogaus hepatito delta virusas G A Pelė irnr? U A Žmogus irnr? * Kinetoplastidės pirmuonys, priklausantys Euglenozoa tipui. ** Grybo Physarum polycephalum RNR molekulių redagavimas yra sudėtingiausias iš visų organizmų, kuriuose šis reiškinys buvo tyrinėtas, jam būdingos įvairių tipų reakcijos. 345

346 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA ko ir vienaląsčių, grybų, augalų ir gyvūnų trnr molekulėse. Yra žinomos tokios RNR redagavimo metu vykstančios nukleotidų modifikacijos: z citidino pakeitimas uridinu (C U); z adenozino pakeitimas inozinu (A I); z uridino pakeitimas citidinu (U C); z guanino pakeitimas adeninu ir uridino pakeitimas adeninu (G A ir U A). A I ir C U pakeitimai dažniausiai yra deamininimo (6.39 pav., a, b), o U C amininimo reakcijų pasekmė. Citidino pakeitimas uridinu pirmą kartą buvo nustatytas stuburinių irnr, kuri koduoja baltymą apolipoproteiną B, ApoB. Žmogaus ApoB baltymas yra labai didelis sudarytas iš aminorūgščių, jo molekulinė masė yra 512 kda. Baltymą koduojanti DNR sritis sudaro 43 kb, joje yra net 29 egzonai! ApoB baltymas yra vienas pagrindinių apolipoproteinų mažo tankio lipoproteinuose (angl. low density lipoprotein, LDL), kurie prijungia cholesterolį. ApoB funkcionuoja kaip ligandas ląstelių receptoriams atpažįstant LDL taip cholesterolis patenka į ląsteles. Dėl padidėjusios ApoB koncentracijos kraujagyslėse formuojasi aterosklerozinės plokštelės. 512 kda ApoB baltymas sintetinamas kepenų ląstelėse. Jis sekretuojamas į kraujo plazmą ir ten prijungia lipidus. Žarnyno ląstelėse apob transkripte dėl deamininimo glutamino kodonas CAA pakeičiamas STOP kodonu UAA. Todėl žarnyne sintetinamas daug mažesnis 250 kda ApoB baltymas. Mažesnis baltymas reikalingas riebalų rūgščių prijungimui ir rezorbcijai plonojoje žarnoje. Apolipoproteiną B koduojančios irnr redagavimo mechanizmas yra sudėtingas. Kodono pakeitimui vykti reikia reguliacinių nukleotidų sekų (6.40 pav., a), esančių aplink deamininamą heterociklinę bazę, taip pat baltymų komplekso editosomos (angl. editosome). Editosomos sudėtyje yra citidino deaminazė, APOBEC-1 (angl. apob mrna editing enzyme catalytic subunit 1). Šis dimerinis baltymas, kartu su pagalbiniais baltymais, atlieka citidino deamininimą. Milžiniška pav. Adenozino ir citidino deamininimo reakcijos ( chapter-27-slides-flash-cards/) 346

347 VI. RNR brendimas me (14 kb) apob geno transkripte šis citozinas, esantis pozicijoje 27-ame egzone, yra labai tiksliai redaguojamas. Mutagenezės metodu nustatyta, kad redagavimui reikia trans veikiančių sekų, kurios yra išsidėsčiusios netoli redaguojamo nukleotido. Viena jų tai 11 nukleotidų ilgio tvirtinamoji seka (angl. mooring sequence), kurią nuo redaguojamo nukleotido skiria maždaug 4 nukleotidų seka (angl. spacer). Dar dvi redagavimui svarbios irnr molekulės sritys yra vadinamieji 3 ir 5 efektyvumo elementai. Tvirtinamoji seka ir 3 efektyvumo elementas sudaro dvigrandinį stiebą (6.39 pav., b). Jame redaguojamas irnr citozinas išsidėsto taip, kad patenka į APOBEC-1 aktyvųjį centrą. APOBEC-1 išdėstymui būtinas komplementacijos veiksnys ACF. Kitas žinomas nukleotidų pakeitimo būdas redaguojant RNR yra adenozino pakeitimas inozinu (6.39 pav., b). Jis vyksta ląstelių irnr, trnr molekulėse, taip pat virusų transkriptuose (pvz., paramiksovirusuose). Inozinas sudaro porą su citidinu, kuri yra panaši į G-C porą, todėl I gali būti atpažįstamas kaip G. Taigi adenozino pakeitimas inozinu galėtų pakeisti kodoną ir daryti įtaką transliacijai arba splaisingui. Vis dėlto dažniausiai keitimas vyksta netransliuojamose preirnr dalyse 5 ir 3 galuose, introniniuose Alu (90 % keitimų) arba LINE (10 % keitimų) tipo retrotranspozonų elementuose. Pirmą kartą pre-irnr adenozino pakeitimas inozinu buvo nustatytas žinduolių smegenų ląstelių transkripte, kuris koduoja neuronų AMPA receptoriaus subvienetą GluR B. Neuronų AMPA (angl. alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate) receptorių iš viso sudaro 4 subvienetai (GluR A D). Receptorius reguliuoja neuronų laidumą Ca 2+ ir kitiems jonams. Visuose GluR B pre-irnr transkriptuose A yra keičiamas I. Dėl tokio redagavimo glutamino Q kodonas (CAG) pakeičiamas arginino R kodonu (CIG). Redaguojama sritis yra baltymo 2-ame membraną perveriančiame domene. Pelėse, kurios turi šią modifikaciją vykdančio fermento adenozino deaminazės ADAR2 geno mutaciją, glur B transkripto redagavimas nevyksta. Pasekmės yra letalios: ląstelių laidumas Ca 2+ padidėja, gyvūnams yra būdinga epilepsija, jie neišgyvena kelių savaičių pav. Nukleotidų pakeitimas (konversija) redaguojant pre-irnr. Citidino deaminimas į uridiną APOB pre-irnr, dalyvaujant editosomai (a); adenozino pakeitimas inozinu pre-irnr, dalyvaujant adenozino deaminazei ADAR (b) (Nature Reviews Genetics, v. 2, p. 869, 2001) 347

348 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Žinduoliuose adenozino keitimą inozinu vykdo dviejų baltymų šeimų adenozino deaminazės ADAR (angl. adenosine deaminases that act on RNA ) ir ADAT (angl. adenosine deaminases that act on trna), kurios pasirenkamos priklausomai nuo to, kurios rūšies RNR molekulės redaguojamos. Reakcijai vykti svarbios ne sritys, išsidėsčiusios apie deamininamą adenoziną, bet antrinė pre-rnr struktūra dupleksas (6.40 pav., b). Dupleksas susidaro tarp redaguojamos srities ir jai komplementarios srities, kuri yra išsidėsčiusi už jos esančiame introne. ADAR adenozino deaminazės atpažįsta tokį RNR dupleksą. Iškelta hipotezė, kad deamininama adenozino heterociklinė bazė iš duplekso yra išsukama (angl. flipping) į išorę. Šiandien žinoma, kad adenozino deamininimas yra dažnas brendimo įvykis eukariotų transkriptomoje. Deamininimo įvykiai itin dažni aukštesniųjų eukariotų smegenų ląstelių transkriptuose. Pvz., ištyrus žmogaus, šimpanzės ir Rezus makakos smegenėlių audinio ląstelėse sintetinamų irnr deamininimą, paaiškėjo, kad žmogaus pre-irnr redaguojamos keletą kartų dažniau nei beždžionių. Uridino pakeitimas citidinu redaguojant RNR yra rečiau aptinkamas, tačiau kai kurių žemesniųjų augalų chloroplastų ir mitochondrijų transkriptuose jis yra dažnas Nukleotidų sekų įterpimas arba pašalinimas RNR redagavimas įterpiant arba pašalinant nukleotidų sekas vyksta pirmuonių, grybų, kirmėlių mitochondrijų RNR, taip pat minus RNR grandinę turinčių virusų transkriptuose (pvz., paramiksovirusuose). Tokio tipo pre-irnr modifikacijos pirmą kartą buvo aptiktos parazitiniuose pirmuonyse. Tripanosomos vienintelės mitochondrijos DNR (kinetoplasto DNR) sudaryta iš daugelio tūkstančių DNR žiedų, sujungtų į katenanus. Tokią DNR sudaro maksi žiedai (15 25 kb) ir mini žiedai (0,9 2,5 kb). Mini žiedų yra , o maksi žiedų Maksi žiedas koduoja 2 rrnr genus ir 17 baltymų. Tyrinėjant maksi žiedų DNR buvo pastebėta, kad joje trūksta kai kurių labai svarbių mitochondrijų baltymų. Baltymus koduojančiuose genuose trūko START kodonų, rasta skaitymo rėmelio poslinkio mutacijų. Nustačius mitochodrijos DNR genų transkriptų sekas, buvo rasti skaitymo rėmeliai, koduojantys trūkstamus baltymus. Paaiškėjo, kad irnr buvo įterpta daug papildomų nukleotidų, kurių nebuvo DNR. Fenomenas pirmą kartą nustatytas 1987 m. tiriant tripanosomos citochromo c oksidazės II subvienetą koduojančią irnr joje buvo įterpti 34 uridino nukleotidai, nekoduojami DNR. Kituose mitochondrijų genų transkriptuose įterpti U nukloeotidai sudarė net pusę visos nukleotidų sekos. Tokie genai, kurių DNR sekoje neįmanoma nustatyti koduojamo baltymo, dar vadinami kriptogenais (angl. cryptogenes). Šiandien žinoma, kad 12 iš 17-os maksi žieduose koduojamų baltymų pre-irnr yra redaguojamos. Dažniausiai yra įterpiami U nukleotidai, rečiau vyksta U pašalinimas. Netrukus buvo nustatytas mechanizmas, kuriuo vyksta redagavimas įterpiant arba pašalinant U nukleotidus. Jame dalyvauja nt ilgio RNR molekulės RNR gidai, grnr (angl. guide RNAs, grnas), koduojamos mitochondrijų mini žieduose. Kiekvienas žiedas koduoja 2 5 grnr. RNR gidų (grnr) 5 gale yra 5 15 nt ilgio inkaro seka (angl. anchor), komplementari redaguojamos pre-irnr 3 galui (6.41 pav., a b). grnr 3 gale turi poli (U) seką. Susidarius pre-irnr- 348

349 VI. RNR brendimas grnr dupleksui, lieka nesuporuotų RNR sričių, kurios atpažįstamos kaip redagavimo vietos. Viena grnr gali nustatyti 1 10 redagavimo vietų. Redagavimas vyksta dalyvaujant ~ 20S dydžio baltymų kompleksui editosomai, kurioje, manoma, galėtų būti iki 20 baltymų (6.41 pav., a b). Editosomą prie redaguojamų vietų nukreipia grnr molekulės. Pirmasis redagavimo įvykis yra taikinio pre-irnr skėlimas ties pirmuoju nesuporuotu nukleotidu prieš pre-irnr-grnr dupleksą. RNR skelia endonukleazė. Tada įterpiami arba šalinami U nukleotidai. U įterpia galinė uridililtransferazė, TUTazė (angl. terminal uridilyltransferase) (6.41 pav., a). Sintezė vyksta nuo skeltos pre-irnr 3 galo. Matrica sintezei yra grnr. Prijungus nukleotidus, plyšį sujungia redagavimo RNR ligazė. U nukleotidus šalina U atranki 3 5 egzoribonukleazė, ExoUazė (angl. U-specific 3 5 exoribonuclease), tada plyšį sujungia taip pat redagavimo RNR ligazė (6.41 pav., b). Vienas didžiausių redagavimo privalumų yra galimybė įvairiu laipsniu keisti konkrečią RNR molekulę. Individualaus geno transkripto molekulių redagavimo laipsnis ląstelėje gali svyruo pav. U nukleotidų įterpimas (a) ir šalinimas (b) pre-irnr, dalyvaujant editosomai. REN endonukleazė, REX egzonukleazė, REL redagavimo RNR ligazė, RET galinė uridililtransferazė (TUTazė), MP mitochondrijų baltymai. Viršuje editosomos struktūrinės shemos (Research in Microbiology, v. 162, 2011) 349

350 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA ti nuo kelių iki 100 %. Pvz., skirtingų smegenų sričių ląstelėse serotonino receptoriaus 5-HT 2C transkripto molekulių redagavimo laipsnis skiriasi. Įvykus RNR nukleotidų sekų pakeitimams sukuriami nauji transliacijos pradžios, pabaigos kodonai, nauji atvirieji skaitymo rėmeliai (žr. skyrių Baltymų biosintezė ). Tokiu būdu modifikuojama irnr koduojamo baltymo aminorūgščių seka ir keičiasi sintetinamo baltymo savybės. Pvz., nustačius Arabidopsis thaliana genomo seką, paaiškėjo, kad organelių (mitochodrijų, chloroplastų) irnr molekulėse apie 456 citidinų pakeičiami į uridinus. 441 pakeitimas įvyksta atviruosiuose skaitymo rėmeliuose, kiti intronuose bei savitose trnr sekose. Pakeitimai irnr koduojamuose atviruosiuose skaitymo rėmeliuose lemia Arabidopsis thaliana mitochondrijų baltymų hidrofobiškumą. 350

351 VI. RNR brendimas ANALITINIAI KLAUSIMAI IR UŽDAVINIAI: 1. Jūs gavote užduotį apibūdinti in vitro susintetinto RNR transkripto, kuriame yra intronas, brendimą. Kaip Jūs nustatysite: a) ar šis intronas išsikerpa savaime? b) jeigu intronas išsikerpa savaime, kuriai I ar II savaime išsikerpančių intronų grupei jis priklauso? 2. Jūs nustatėte, kad tas pats genas koduoja ilgesnį baltymą embriono ląstelėse, trumpesnį suaugusio žmogaus ląstelėse. Kaip eksperimentiškai patikrinsite, ar geno sutrumpėjimas yra alternatyviojo splaisingo ar redagavimo rezultatas? 3. Atrasta nauja grupė intronų, kurių splaisinge dalyvauja alternatyvioji splaisosoma. Splaisosomos sudėtyje yra U110, U120 ir U140 snrnp. Atliktas eksperimentas, kuriuo siekta nustatyti splaisosomos susimontavimo ties substratu eigą. Pre-iRNR buvo imobilizuota ant agarozės dalelių ir inkubuota su išgrynintomis splaisosomos dalelėmis. Tam tikrais laiko momentais imti mėginiai ir atlikta Northern analizė su radioaktyviais zondais, savitais pre-irnr ir splaisosomos U RNR molekulėms. Tyrimų duomenys pateikti paveiksle. Atsakykite: a) kokia tvarka montuojasi splaisosoma? b) ar vyksta pre-irnr splaisingas? 4. Nustačius organizmo Nanoarcheum equitans genomą paaiškėjo, kad jame trūksta kai kurias trnr koduojančių genų, nors šias trnr archėja turi. Paaiškinkite šį fenomeną. 5. Kaip Jūs įsitikinsite, kad eukariotų irnr turi kepurės struktūrą molekulės 5 gale? 351

352 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 6. In vitro buvo susintetinta C. elegans geno X pre-irnr su kepure ir be kepurės. Abi molekulės turėjo įtrauktą radioaktyvią žymę (P 32 izotopą). Buvo tirtas šių molekulių brendimas in vitro naudojant ląstelių branduolių ekstraktą. Po inkubavimo RNR molekulės išskirstytos elektroforeze poliakrilamido gelyje pagal jų dydį. Apie jų santykinį kiekį spręsta pagal radioaktyvios žymės kiekį. Lentelėje toliau pateikti tyrimo rezultatai ( + atitinka radioaktyvios žymės kiekį). Pasiūlykite hipotezę, remdamiesi šiais rezultatais. Pre-iRNR irnr, kurioje įvykęs splaisingas irnr su poli (A) Pre-RNR be kepurės Pre-iRNR su kepure Jūs klonavote eukariotinio organizmo geną, tačiau išsami DNR sekos analizė atskleidė, kad gene trūksta egzono, kurį turi homologiški genai kituose organizmuose. Pasiūlykite hipotezę, kuri paaiškintų tokį faktą. 8. Eukariotinės DNR fragmentas, koduojantis geną X, hibridizuotas su jo irnr. Hibridizacijos rezultatai, pateikti paveiksle, vaizdinti elektronine mikroskopija. Atsakykite: a) kuri linija, storoji ar plonoji, atitinka irnr? b) kaip atrodytų eksperimento rezultatai, jeigu su DNR būtų hibridizuota pre-irnr? 9. Jūs tyrinėjate β talazemiją ligą, kuria sergant negaminamas baltymas β globinas. Jūs nustatėte, kad žmonių, sergančių šia liga, β globino geną koduojanti DNR yra tokio pat ilgio kaip ir sveikų žmonių, tačiau irnr yra keliais šimtais nukleotidų ilgesnė. Atlikę β globino geno DNR sekoskaitą nustatėte, kad sergančių žmonių gene yra vieno nukleotido pakeitimas pirmajame introne. Remdamiesi gautais rezultatais, paaiškinkite, kodėl sergančių žmonių ląstelėse negaminamas β globino baltymas? 10. Jūs tyrinėjate introną turinčios pre-irnr splaisingą. Kokius eksperimentus atliksite, norėdami įsitikinti, ar intronas iškerpamas kaip linijinė molekulė ar kaip laso pavidalo uždara molekulė? 352

353 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Dauguma organizmo genų koduoja baltymus. Ląstelėje transkripcijos metu susintetintos ir subrendusios irnr molekulės veikia kaip matricos baltymų biosintezėje transliacijoje. irnr nukleotidų sekoje talpinama informacija apie baltymo aminorūgščių seką. Transliacija yra paskutinis biologinės informacijos perdavimo iš DNR etapas. Nuo irnr priklausomas baltymo sintezės procesas yra transliacija. Informacija iš DNR į RNR molekulę perduodama sintetinant RNR molekulę nukleotidų komplementarumo principu (kaip matricą naudojant vieną DNR grandinę), o genetinės informacijos perdavimo iš irnr į baltymą, t. y. transliacijos, procesas yra sudėtingesnis ir vyksta kitaip. Keturių skirtingų irnr nukleotidų sekos perrašymas į dvidešimt skirtingų aminorūgščių seką transliacijos metu vyksta pagal tam tikras taisykles genetinį kodą. Kodą m. nustatė Maršalas Nirenbergas (Marchal Nirenberg) ir Henrikas Matėjus (H. Matthaei) Genetinis kodas ir jo savybės Informacija, esanti irnr nukleotidų sekoje, ribosomoje skaitoma nuosekliai po tris nukleotidus nuo pradžios iki galo. Trijų nukleotidų seka irnr molekulėje (pvz., AUA, AUG ir t. t.) lemia tam tikros aminorūgšties įjungimą į sintetinamą baltymą. Toks nukleotidų trejetas yra vadinamas kodonu. Tačiau nukleotidų trejetų kodonų kombinacijų yra daugiau (4 x 4 x 4 = 64) nei baltymuose yra skirtingų aminorūgščių (20) (7.1 pav., a). Aiškinantis genetinį kodą buvo nustatyta, kad kai kurias aminorūgštis koduoja kelios nukleotidų trejetų kombinacijos (pvz., šešios kombinacijos koduoja aminorūgštį argininą), o tam tikros kombinacijos iš viso nekoduoja aminorūgščių. Pastarieji, terminacijos, arba STOP, kodonai (angl. nonsense codons) veikia kaip transliacijos terminacijos signalai (7.1 pav., a). Pažvelgus į genetinį kodą matyti, kad daugeliu atvejų pakanka dviejų nukleotidų atrinkti tam tikrą aminorūgštį. (DNR) nukleotidų seka yra kopijuojama į irnr, kuri funkcionuoja kaip tarpininkas transliuojant nukleotidų seką į baltymo aminorūgščių seką pagal genetinio kodo taisykles. Kodonas yra nuoseklus nukleotidų trejetas irnr molekulėje, kuris lemia tam tikrą aminorūgštį arba yra transliacijos baigties (terminacijos) signalas. 353

354 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Supratimas, kad nukleotidų trejetai koduoja informaciją apie aminorūgštis, buvo vienas didžiausių molekulinės biologijos atradimų praėjusio amžiaus 7 dešimtmečio pusėje. Dviejų tipų eksperimentai padėjo m. išaiškinti E. coli genetinį kodą. Pirmojo tipo eksperimentą panaudodami neląstelinę baltymų sintezės sistemą (angl. cell free system) atliko M. Nirenbergas ir H. Matėjus. Jie naudojo E. coli ląstelių ekstraktus, kuriuose buvo visi komponentai, reikalingi baltymų biosintezei (ribosomos, ATP, radioaktyvią žymę turinčios aminorūgštys), išskyrus RNR. Baltymų biosintezė sistemoje vyko, į ekstraktus pripylus cheminiu būdu susintetintos RNR, kurios nukleotidų seka buvo žinoma, todėl nustačius susintetinto peptido aminorūgščių seką, buvo galima nustatyti, kurią aminorūgštį kuris nukleotidų trejetas koduoja. Pirmiausiai kaip matrica sintezei buvo naudotas homopolimeras uridilo rūgštis, poli (U) (5 UUU UUU3 ). Buvo sintetinamas polipeptidas polifenilalaninas, nes RNR 5 UUU3 nukleotidų trejetas koduoja aminorūgštį fenilalaniną. Panaudojus adenilo rūgštį, poli (A) (5 AAA...AAA3 ), ribosomose buvo sintetinamas polilizinas (5 AAA3 nukleotidų trejetas koduoja aminorūgštį liziną). Tuo metu, kai buvo atliekami eksperimentai, dar nebuvo ištobulėję RNR sekoskaitos metodai, todėl nebuvo galima tiksliai nustatyti susintetintų RNR heteropolimerų, sudarytų iš įvairių nukleotidų, sekos, tačiau ir tokie RNR heteropolimerai buvo naudojami eksperimentams. Nustačius individualių nukleotidų, naudojamų RNR sintezei, stechiometrinį kiekį, buvo statistiškai apskaičiuojamas galimų kodonų pasiskirstymas. Naudojant cheminiu būdu susintetintus RNR homo- ir heteropolimerus, buvo išaiškinta, kurias aminorūgštis koduoja maždaug pusė visų nukleotidų trejetų. Likę kodonai buvo išaiškinti, kai buvo išmokta kryptingai sintetinti RNR. Deja, viso genetinio kodo pirmojo tipo eksperimentais išaiškinti nepavyko nebuvo įmanoma pasiekti, kad atsitiktinai ar kryptingos sintezės būdu susintetintos RNR turėtų visas įmanomas kodonų kombinacijas. M. Nirenbergas ir Filipas Lederis (Philip Leder) panaudojo kitą nukleotidų trejetų jungimo eksperimentą (angl. triplet binding assay). Jie nustatė, kad ribosomos prijungia RNR nukleotidų trejetą tik tada, kai dalyvauja atitinkama trnr molekulė su prijungta aminorūgštimi. Taigi, genetinį kodą iki galo išaiškinti buvo galima tik susintetinus visų įmanomų kombinacijų trejetus ir kiekvieną jų ištyrus su skirtingomis aminoacil-trnr. Šiuo metodu nebuvo įmanoma nustatyti, kurie nukleotidų trejetai koduoja terminacijos (STOP) kodonus. Sidnis Breneris (Sydney Brenner) su kolegomis juos išaiškino, nustatę T4 bakteriofago supresorines mutacijas mutacijas, kurios lėmė terminacijos kodonų kaip aminorūgštį koduojančių trejetų atpažinimą. Transkripto irnr nukleotidų seka ribosomoje gali būti skaitoma trejopai, t. y. atvirasis skaitymo rėmelis (angl. reading frame), arba kodonų sekų, gali būti trys skirtingi variantai priklausomai nuo to, kuris nukleotidas bus pasirinktas skaityti pirmuoju. Pirmasis nukleotidas skaitymo rėmelyje nulemia ir tolesnius skaitomus nukleotidų trejetus, kurie transliuojami į aminorūgštis (7.2 pav.). Nukleotidų trejetai, koduojantys skaitymo rėmelį, nepersikloja, t. y. vienas nukleotidų trejetas koduoja vieną aminorūgštį, toliau už jo einantis kitą, ir t. t. (7.2 pav.). Taigi genetinis kodas yra nesanklotinis. Tačiau genome yra sanklotinių genų, t. y. tokių genų, kurių nukleotidų sekoje yra koduojamas kitas genas. Tokiu atveju abiejų genų koduojami atvirieji skaitymo rėmeliai turi savo atskirus pradžios ir terminacijos kodonus. Sanklotinių genų yra bakteriofagų, mitochodrijų genomuose. Būdinga, kad tik vienas skaitymo rėmelis konkrečioje nukleotidų sekoje koduoja baltymą. Transliacijos iniciaci- Atvirasis skaitymo rėmelis yra nepersiklojančių nukleotidų trejetų seka, koduojanti polipeptidą (be įterptų terminacijos kodonų). 354

355 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) jos metu prokariotuose ir eukariotuose skaitymo rėmelyje tam tikru būdu yra nustatomas pirmasis iniciacijos kodonas. Šis kodonas dažniausiai yra ATG (AUG) nukleotidų trejetas ir koduoja aminorūgštį metioniną. Rečiau aptinkamas GUG iniciacijos kodonas. Skaitymo rėmelis prasideda iniciacijos kodonu ir baigiasi terminacijos kodonu. Skaitymo rėmelis, kuriame įsiterpę terminacijos kodonų, yra blokuotasis. Jeigu nukleotidų sekoje visi trys galimi skaitymo rėmeliai yra blokuotieji, tokia nukleotidų seka nekoduoja baltymo. Genetinis kodas yra universalus, t. y. visuose organizmuose tie patys irnr kodonai koduoja tas pačias aminorūgštis ir transliacijos baigties signalus. Dėl tokio universalumo bakterijos gali sintetinti įterpto, pvz., žmogaus insulino, geno koduojamą baltymą. Kodo universalumas liudija apie jo ankstyvą evoliucinę kilmę. F. Krikas pavadino genetinį kodą užsišaldymu (angl. frozen accident) ir iškėlė mintį, kad jis kilo iš bendro protėvio. Tačiau gamtoje aptikta nukrypimų nuo universalaus genetinio kodo (7.1 pav., b). Ląstelių organelių DNR genuose, pvz., mitochodrijose, rasta 16 nukrypimų nuo genetinio kodo, daž- 7.1 pav. Universalus genetinis kodas (a) ir nukrypimai nuo jo mitochondrijų genome (b) 355

356 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA niausiai STOP kodonuose. Jie vieninteliai nekoduoja aminorūgščių, todėl ir yra tinkami perkodavimui. UGA vienintelis daugiareikšmis kodonas visų gyvybės domenų organizmuose. Kai kurie baigties kodonai perprogramuoti taip, kad koduotų netipiškas aminorūgštis. Alternatyvių genetinių kodų, turinčių nedidelių nukrypimų nuo universalaus genetinio kodo, jau nustatyta daugiau nei dešimt (pvz., pirmuonyse Tetrahymena, Euplotes, bakterijoje Mycoplasma, grybe Candida ir kt.). Mitochondrijos turi individualias savo palyginti nedidelio genomo transkripcijos ir baltymų biosintezės sistemas, kurios nepriklauso nuo visos ląstelės transkripcijos ir transliacijos sistemų. Taigi, atsiradusius nukrypimus nuo universalaus genetinio kodo galima paaiškinti mitochondrijų autonomiškumu. Mitochondrijos turi mažiau skirtingų trnr nei ląstelė 22. Mitochondrijų 4 iš 64 kodonų turi kitokią prasmę negu universalaus kodo kodonai (7.1 pav., b). Nukrypimas nuo universalaus genetinio kodo aptiktas ir žmogui patogeniniame grybe Candida albicans. Šiame organizme CUG kodonas transliuojamas į seriną, nors kituose organizmuose koduoja leuciną. Nuokrypis nuo universalaus genetinio kodo yra ir vadinamasis perkodavimo (angl. recoding) fenomenas. Perkodavimas dažniausiai vyksta transliacijos elongacijos ir terminacijos etapuose. Vykstant transliacijos elongacijai, perkodavimas pasireiškia programuotu skaitymo rėmelio perstūmimu (+1 / 1) arba kodono peršokimu (angl. ribosome hopping) transliuojant irnr. Vykstant transliacijos terminacijai perkodavimas pasireiškia ties irnr STOP kodonais įjungiant kurią nors aminorūgštį ir taip toliau tęsiant baltymo sintezę. Reikia pastebėti, kad perkodavimo procesas baltymų biosintezės metu konkuruoja su transliacija, kuri vyksta pagal universalaus genetinio kodo taisykles ir tik dalies irnr transliacija vyksta perkoduojant. Perkodavimas nustatytas bakterijose, archėjose, eukariotuose ir virusuose. Įdomūs yra transliacijos baigties metu vykstantys perkodavimo atvejai. Aptarsime juos išsamiau. Standartinis genetinis kodas transliuojamas į baltymus panaudojant 20 aminorūgščių. Tačiau bakterijos, archėjos ir eukariotai turi 21-ąją aminorūgštį, kuri gali būti įjungiama į polipeptidinę grandinę vykstant perkodavimui. Ši aminorūgštis yra selenocisteinas, Sec (U). Ji yra svarbi įvairių fermentų aktyvumui. 7.2 pav. Trys galimi skaitymo rėmeliai irnr 356

357 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Seleno baltymų rasta visų gyvybės domenų organizmuose, tačiau kai kurie jų neturi, pvz., grybai ir aukštesnieji augalai. Rasta daugiau nei 100 genų, koduojančių baltymus su Sec. Selenocisteinas dažniausias oksidacijos-redukcijos fermentuose, pvz., oksidoreduktazėse. Fermentai svarbūs reaktingų deguonies formų ROS (angl. reactive oxygen species) išaktyvinimui. Selenocisteinas reikalingas oksidoreduktazių katalizinėms funkcijoms. Manoma, kad selenolinė (SeH) grupė selenocisteine (kurios pk = 5,2) yra reaktingesnė nei tiolinė SH grupė cisteine (kurios pk = 8,3). Selenocisteino sintezė prasideda prie selenocisteinui savitos trnr prijungiant serino aminorūgštį. Ją prijungia serinui savita aminoacil-trnr sintetazė (apie aminorūgščių prijungimą prie trnr žr poskyryje). Tada, dalyvaujant fermentui selenocisteino sintazei, serinas verčiamas selenocisteinu. Selenocisteinui savitos trnr antikodonas yra ACU komplementarus vienam iš STOP kodonų UGA (7.1 pav., a). Tam, kad vykstant UGA kodono transliacijai kodoną atpažintų ne savitas terminacijos veiksnys, o selenocisteino trnr, t. y. tam, kad įvyktų perkodavimas ir būtų įjungtas selenocisteinas, dar reikia savitojo transliacijos elongacijos veiksnio ir antrinės irnr struktūros netoli UGA kodono (angl. selenocysteine insertion sequence, SECIS). Pvz., bakterijose elongacijos veiksnys SelB prisijungia prie SECIS srities irnr iš karto už UGA nukleotidų trejeto ir prie trnr Sel (7.3 pav.). Eukariotuose tokiame perkodavime dar dalyvauja baltymas SBP2, o SECIS sritis yra išsidėsčiusi netransliuojamoje 3 irnr dalyje. Kitas transliacijos terminacijos metu vykstančio perkodavimo atvejis nustatytas bakterijose ir archėjose. Pvz., Methanosarcina genties archėjos priklauso vadinamųjų metanogeninių organizmų grupei ir klesti esant metanogeninių substratų mono-, di-, trimetilaminų. Substratams skaidyti reikia metiltransferazių. Nustatyta, kad visų iki šiol žinomų metanogeno metilaminometiltransferazių genų koduojamame skaitymo rėmelyje esantys UAG (amber) kodonai lemia ne transliacijos terminaciją, o aminorūgšties L-pirolizino, Pyl (7.4 pav., a), įjungimą į baltymą. Tai buvo išaiškinta tik nustačius monoaminometiltransferazės erdvinę struktūrą ir aptikus L-piroliziną fermento aktyviajame centre (7.4 pav., b). L-pirolizino įjungimo efektyvumas ties šiuo kodonu transliuojant metiltransferazių irnr siekia 97 %. Methanosarcina barkeri nustatyta pirolizinui savita netipiškos erdvinės struktūros 7.3 pav. Perkodavimas vykstant transliacijai. S serinas, CS selenocisteinas (Pagal B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin et. al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014) 357

358 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 7.4 pav. L-pirolizino struktūra (a) ir išsidėstymas (L-pirolizinas O202) (b) archėjos Methanocarcina barkeri monoaminometiltransfrazės aktyviajame centre ( microbiology.osu.edu/faculty/ krzycki-joseph) trnr Pyl (jos antikodonas yra 3 AUC5, ji yra supresorinė trnr) ir genas, koduojantis savitą aminoacil-trnr sintetazę. Taigi pirolizinas galėtų būti laikomas 22-ąja aminorūgštimi, įjungiama į baltymų sudėtį transliacijos metu. Pirolizino jungimas į archėjų baltymus yra genetinio kodo plėtimo ortogonaliuoju būdu pavyzdys. Į E. coli įterpus Methanosarcina barkeri trnr Pyl ir jai savitąją aminoacil-trnr sintetazę, šie komponentai veikė kaip ortogonalioji pora: E. coli trnr-aminoacil sintetazės neacilino šios poros trnr, o poros trnr aminoacil-sintetazė neacilino kitų trnr, tik savo poros Pernašos RNR molekulės (trnr) baltymų biosintezės tarpininkai Kodonai, esantys irnr molekulėje, tiesiogiai neatpažįsta aminorūgščių, kurias jie koduoja. Transliacijos procesui reikia, kaip minėta, trnr molekulių. trnr molekulės yra adaptoriai, kurių vienas struktūrinis elementas antikodonas sąveikauja su irnr kodonu (7.5 pav.), o kitas elementas akceptorinis stiebas turi kovalentiniu ryšiu prijungtą aminorūgštį. II skyriuje aptarėme trnr molekulių struktūrines ypatybes. Molekulės atrankią sąveiką su irnr kodonu lemia ne aminorūgštis, prijungta prie trnr molekulės, bet trnr antikodonas. Genetinį kodą sudaro 64 kodonų kombinacijos. Individualią aminorūgštį gali koduoti kelios skirtingos nukleotidų kombinacijos. Tik triptofaną ir metioniną koduoja atitinkamai AUG ir UGG trejetai; kitas aminorūgštis koduoja du, trys ir daugiau skirtingų nukleotidų trejetų. Keli kodonai, koduojantys tą pačią aminorūgštį, vadinami sinonimais. Taigi turėtų egzistuoti ir panašus skaičius individualių trnr, kurių antikodonai komplementarūs irnr kodonams. Ilgainiui paaiškėjo, kad individualios trnr atpažįsta daugiau nei vieną kodoną. Tam tikros aminorūgštys prijungiamos tik prie vienos rūšies trnr molekulių (turinčių vienodą antikodoną). Tačiau ląstelėje kai kurios tos pačios aminorūgštys prijungiamos prie daugiau nei vienos trnr, kurių antikodonai yra skirtingi. Tokios irnr vadinamos izoakceptorinėmis trnr ir jų yra mažiausiai

359 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Kai kurių trnr antikodonai sudaro tikslias Votsono-Kriko nukleotidų poras tik su pirmaisiais dviem irnr kodono nukleotidais. Trečiasis nukleotidas tiksliai kodono ir antikodono sąveikai nėra toks svarbus, todėl šioje pozicijoje sąveika gali susidaryti ir tarp nekomplementarių nukleotidų (7.5 pav.). Šis fenomenas vadinamas nevienareikšme sąveika (angl. wobble svyruoti ). Nevienareikšmės sąveikos hipotezę dar 1966 m. iškėlė F. Krikas. Dėl nevienareikšmės sąveikos ta pati trnr molekulė gali sąveikauti savo antikodonu su komplementariu irnr kodonu ir su keliais irnr nukleotidų trejetais, besiskiriančiais paskutiniu trejeto nukleotidu (3 gale). Tarp kodono ir antikodono nukleotidų trečiojoje pozicijoje susidaro vandeniliniai ryšiai, tačiau ne Votsono-Kriko tipo sąveika. Nevienareikšmė sąveika tai trnr molekulės antikodono trečiojo nukleotido (5 gale) heterociklinės bazės gebėjimas sudaryti vandenilinius ryšius su irnr kodono ne visiškai komplementaraus nukleotido heterocikline baze (3 gale). Egzistuoja tam tikrų struktūrinių apribojimų nevienareikšmei sąveikai (7.5 pav., a), kurią toleruoja ribosoma. Pvz., atstumas tarp sąveikaujančių nukleotidų ribozių turi būti panašus į atstumą tarp ribozių standartinėse Votsono-Kriko porose. Todėl purino ir purino (išskyrus I ir A porą) bei pirimidino ir pirimidino sąveikos nėra toleruojamos. 7.5 pav. Nevienareikšmė sąveika tarp irnr kodonų ir trnr antikodonų. Nevienareikšmės sąveikos bendroji schema. I inozinas (a); nevienareikšmės sąveikos pavyzdžiai tarp fenilalanil-trnr bei leuciltrnr ir skirtingų kodonų (b) (B. Alberts, A., Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter. The Molecular Biology of the Cell, fifth edition, 2007) 359

360 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Ne visiškai komplementaria kodono ir antikodono sąveika galima paaiškinti, kodėl tą pačią aminorūgštį koduojantys nukleotidų trejetai skiriasi tik vienu nukleotidu. Bakterijose 20 aminorūgščių koduoja 61 kodonas. Jeigu būtų griežtai paisoma nevienareikšmės sąveikos, ląstelėje užtektų 31 skirtingus antikodonus turinčios trnr, prie kurių gali būti prijungiamos aminorūgštys. Iš tiesų skirtingų trnr ląstelėje yra daugiau. Tikslus individualių trnr molekulių skaičius organizmuose skiriasi. Pvz., žmogaus ląstelėje yra 497 trnr genai, kurie koduojatik 48 individualias trnr, besiskiriančias savo antikodonais. Bakterija Mycoplasma genitalium turi tik 36 genus, koduojančius trnr, kurios atpažįsta 33 skirtingus kodonus Aminorūgščių aktyvinimas. Aminoacil-tRNR sintetazės Aminorūgštis prie trnr molekulių 3 galo kovalentiniu ryšiu jungia fermentai. Jie atrankiai atpažįsta ir prijungia tas aminorūgštis, kurias koduoja su trnr molekulės antikodonu sąveikaujantis irnr kodonas. Šie fermentai yra aminoacil-trnr sintetazės. trnr, prie kurių yra prijungtos aminorūgštys, vadinamos aminoacilintomis trnr aminoacil-trnr. Aminorūgšties prijungimas yra pirmasis biologinės informacijos iškodavimo etapas. Daugumoje ląstelių skirtingas aminorūgštis prie trnr prijungia skirtingos aminoacil-trnr sintetazės. Pvz., gliciną prie visų trnr, kurių antikodonas sąveikauja su gliciną koduojančiais kodonais irnr molekulėje, prijungia glicinui savita aminoacil-trnr sintetazė ir t. t. E. coli bakterija turi 21 skirtingą aminoacil-trnr sintetazę. Kiekvieną skirtingą aminorūgštį prie trnr prijungia skirtinga aminoacil-trnr sintetazė, išskyrus liziną, kurį prijungia dvi skirtingos aminoaciltrnr sintetazės. Tačiau daugelis bakterijų turi mažiau nei 20 skirtingo atrankumo aminoacil-trnr sintetazių. Todėl viena sintetazė neretai prijungia aminorūgštį prie jai savitos trnr molekulės ir taip pat prie kitos trnr molekulės. Pastaroji aminorūgštis vėliau modifikuojama taip, kad atitiktų antikodoną trnr, prie kurios yra prijungta. Manoma, kad aminoacil-trnr sintetazių sąveikos su trnr atrankumą lemia trnr molekulės struktūros ypatybės. Čia svarbus vaidmuo tenka 73 trnr nukleotidui. Pvz., trnr, turinčios šioje pozicijoje A nukleotidą, prijungia hidrofobines aminorūgštis, o molekulės, turinčios G, prijungia polines aminorūgštis. Mutagenezės būdu pakeitus nukleotidą, keičiasi ir trnr atrankumas. Aminoacil-tRNR sintetazės prijungia aminorūgštį prie trnr akceptorinio stiebo 3 galo (5 CCA3 ). Įvairių trnr molekulių erdvinės struktūros nepaprastai panašios, tačiau šiek tiek skiriasi molekulės vietų, su kuriomis sąveikauja aminoacil-trnr sintetazės (pvz., antikodoninės kilpos, D kilpos ir akceptorinio stiebo bei 3 galo), erdvinis išsidėstymas. Aminorūgščių jungimui prie trnr naudojama energija, kuri gaunama hidrolizuojant ATP (7.6 pav.). Aminoacil-tRNR sintetazės turi aminorūgšties, trnr ir ATP prijungimo sritis. Pirmajame aminorūgšties jungimo etape aminorūgštis aktyvinama prijungiant prie jos AMP. Susidaro aminoaciladenilatas (aminoacil-amp). Toliau prie fermento prisijungia trnr molekulė, ir aminorūgštis perkeliama nuo AMP prie trnr 3 galo (7.6 pav.). 360

361 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Tarp aminorūgšties karboksigrupės ir trnr ribozės 3 OH grupės susidaro daug energijos turintis esterinis ryšys, todėl ir sakoma, kad aminorūgštis yra aktyvinama. Šio ryšio hidrolizės energija vėliau naudojama ribosomoje jungiant aminorūgštį prie sintetinamos polipeptidinės grandinės. Aminoacil-tRNR sintetazės pagal aminorūgščių sekų ir struktūros panašumą skirstomos į dvi klases I ir II. Abiejų klasių fermentams būdingi trys struktūriniai ir funkciniai skirtumai: zi klasės sintetazių aktyvųjį (ATP prijungimo) centrą sudaro penkios lygiagrečios β struktūros, o II klasės šešios; zantikodono prijungimo sritį I klasės fermentuose sudaro tik β struktūros, o II klasės sintetazėse β struktūros ir α spiralės; z I klasės fermentai pasiekia trnr akceptorinį stiebą iš mažojo griovio pusės, o II klasės fermentai iš didžiojo. I klasės aminoacil-trnr sintetazės aminoacilina trnr galinio adenozino 3 OH grupę, o II klasės fermentai 2 OH grupę. Aminoacil-tRNR sintetazės būna monomerinės, dimerinės, kartais tetramerinės struktūros baltymai, jų dydis svyruoja nuo 40 iki 110 kda. Daugelio ami- 7.6 pav. Aminorūgšties prijungimas prie trnr dalyvaujant aminoacil-trnr sintetazei (a d) 361

362 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA noacil-trnr sintetazių erdvinė struktūra nustatyta. Bakterijų fermentai skiriasi nuo mielių ir aukštesniųjų eukariotų fermentų. Eukariotuose kelios aminoacil-trnr sintetazės gali sudaryti kompleksą. Tikslų aminoacil-trnr sintetazės veikimą prijungiant reikalingą aminorūgštį prie trnr 3 galo užtikrina keli mechanizmai. Pirmiausiai fermentas suranda reikalingą aminorūgštį tarp kitų aminorūgščių: tam tikrai aminoacil-trnr sintetazei jai savita aminorūgštis giminingiausia ji geriausiai tinka fermento prijungimo srities kišenėje (angl. pocket). Didesnės aminorūgštys nebetelpa kišenėje ir nėra jungiamos (7.6 pav.). Tačiau atskirti aminorūgštis, kurių struktūros labai panašios, pvz., izoleuciną nuo valino, tokiu būdu sunku, todėl yra dar vienas aminorūgšties atrankumą aminoacil-trnr sintetazei užtikrinantis mechanizmas. Kai prie aminorūgšties kovalentiškai prijungiamas AMP ir susidaro aminoacil-adenilatas, prie fermento prisijungia trnr. trnr molekulė stumia aminorūgštį į kitą fermento sritį redagavimo sritį (angl. editing site). Joje, kitaip nei pirmojoje, savita fermentui aminorūgštis netelpa, tačiau į ją patenka struktūriškai panašios nesavitos aminorūgštys. Joms patekus į redagavimo sritį, vyksta ryšio tarp aminorūgšties ir AMP hidrolizė, ir aminorūgštys disocijuoja nuo fermento. Jeigu iki tol jau buvo susidaręs ryšys tarp aminorūgšties ir trnr, toks ryšys taip pat skeliamas. Tokiu būdu vyksta savotiškas klaidų taisymo procesas. Toks hidrolitinis redagavimas labai padidina aminorūgščių jungimo prie savitų trnr tikslumą padaroma tik 1 klaida ~ aminorūgščių jungimų Supresorinės trnr Pernašos RNR yra būdingas supresijos fenomenas. Įvykus mutacijai baltymą koduojančiame gene, baltymas tampa nefunkcionalus, nes mutaciją turinčio kodono irnr molekulėje neatpažįsta jam savita aminoacil-trnr. Įvykus trnr koduojančiame gene antrajai supresorinei mutacijai, trnr molekulė (supresorinė trnr) įgyja savybę atpažinti mutaciją turintį irnr kodoną, ir funkcionalus baltymas gali būti sintetinamas. Priklausomai nuo pirminės mutacijos prigimties irnr išskiriami vadinamieji nonsense ir missense supresoriai. Supresorinės mutacijos tai mutacijos, dėl kurių panaikinami kitų mutacijų sukelti efektai. Normaliose ląstelėse nonsense mutacijos (iš viso tokių žinomos 3) atpažįstamos kaip baltymų biosintezės STOP kodonai (kodonus atpažįsta baltymų biosintezės paleidimo veiksniai (angl. release factors)). Tačiau įvykus supresorinėms mutacijoms trnr gene, aminoacil-trnr atpažįsta transliacijos STOP kodonus kaip aminorūgštis koduojančius nukleotidų trejetus ir į sintetinamą baltymą įjungiama aminorūgštis. Supresorinė trnr gali turėti prijungtą aminorūgštį, kurią irnr kodavo iki mutacijos (sintetinamas baltymas nesikeičia), tačiau gali turėti ir kitą aminorūgštį (sintetinamas baltymas pasikeičia). Pvz., E. coli nustatytos 6 mutavusios supresorinės trnr, kurios atpažįsta UAG STOP kodonus (amber klasės supresorinės trnr). Visų amber klasės supresorininių trnr antikodone yra mutacija (CUA), dėl kurios jos atpažįsta tik STOP kodoną. Taigi, supresijos atveju baltymo sintezė vyksta už terminacijos kodono (angl. readthrough) ir sintetinamas ilgesnis baltymas. Supresorinės trnr konkuruoja dėl STOP kodonų irnr moleku- 362

363 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) lėje su paleidimo veiksniais. Supresorinės trnr, supresuojančios nonsense tipo mutacijas, tam tikra prasme valdo transliacijos terminacijos veiksmingumą. Dėl missense mutacijų kodonas, koduojantis vienokią aminorūgštį, keičiamas kodonu, koduojančiu kitą aminorūgštį: gali būti įjungiama iki mutacijos koduota aminorūgštis arba kita aminorūgštis, dėl kurios baltymo funkcija išlieka tokia, kokia pasižymėjo baltymas iki mutacijos Ribosomų struktūra ir funkcijos Baltymų biosintezė yra vienas sudėtingiausių procesų gamtoje. Kaip ir DNR bei RNR sintezė, baltymų sintezė vyksta nuo matricos irnr. Baltymų sintezės procesą galima suskirstyti į šiuos etapus: ziniciacijos; z elongacijos (ilginimo); z terminacijos (baigties). Baltymų biosintezė ribosomose vyksta trimis etapais: iniciacijos, elongacijos ir terminacijos. Kaip ir DNR bei RNR, baltymus sintetina sudėtingas ribonukleoproteininis kompleksas. Jį sudaro ribosomos, baltymai transliacijos veiksniai, irnr ir aminoacil-trnr molekulės. Tačiau ribosomos skiriasi nuo replisomos ir transkripcijos kompleksų tuo, kad net du trečdalius jų masės sudaro ne baltymai, bet rrnr molekulės. Ribosominės RNR aktyviai dalyvauja daugelyje transliacijos etapų ir užtikrina svarbiausią ribosomos funkciją peptidinio ryšio susidarymą. Todėl prieš pradėdami nagrinėti baltymų biosintezės vyksmus, trumpai aptarsime ribosomų struktūrines ir funkcines ypatybes. Ribosomos yra evoliuciškai labai senos, daugiau nei Ribosomos tai ribonukleoproteinai, kurių du trečdalius masės sudaro rrnr. prieš 3 milijardus metų atsiradusios, sudėtingos molekulinės mašinos, sudarytos iš rrnr ir baltymų. Ribosomas pirmą kartą ~ 1950 m. aptiko Džordžas E. Paladis (George E. Palade), todėl jos pirmiausiai buvo pavadintos Paladžio dalelėmis. Buvo pastebėta, kad žinduolių ląstelėse yra daugybė dalelių, sudarytų iš rrnr ir baltymų. Jose pirmiausiai telkėsi radioaktyvios aminorūgštys. Po kurio laiko radioaktyvi žymė jau buvo aptinkama visame citozolyje. Buvo nustatyta, kad ribosomose vyksta baltymų biosintezė genetinė informacija, esanti irnr molekulės nukleotidų sekoje, transliuojama į aminorūgščių seką (peptidą ar baltymą). Substratai šiose reakcijose yra trnr molekulės, turinčios antikodoną viename gale ir prijungtą aminorūgštį kitame. Baltymų biosintezės metu trnr molekulės sąveikauja su ribosoma. Vykstant transliacijai irnr kodono nukleotidų heterociklinės bazės sąveikauja su atitinkamos trnr antikodono heterociklinėmis bazėmis. Aminorūgščių jungimas į polipeptidinę grandinę vyksta ribosomos peptidiltransferaziniame centre, PTC (angl. peptidyltransferase centre), kuris yra didžiajame ribosomos subvienete. Baltymų biosintezei reikia transliacijos veiksnių, kurie veikia iniciacijos, elongacijos ir terminacijos etapuose. 363

364 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Panašiai kaip ir kiti fermentai, katalizuojantys polimerizacijos reakcijas, ribosomos užtikrina, kad visi reakcijoje dalyvaujantys komponentai (dvi aktyvintos aminorūgštys ir jų antikodonus atitinkantys kodonai irnr molekulėje) būtų tiksliai išdėstyti ir galėtų susidaryti peptidinis ryšys (angl. peptide bond). Tačiau tuo ribosomos vaidmuo neapsiriboja. Ji pati, kaip minėta, aktyviai dalyvauja transliacijoje atlikdama šias funkcijas: z tiksliai išdėsto irnr vykstant transliacijos iniciacijai; z dalyvauja nustatant iniciacijos kodoną; z dalyvauja peptidinio ryšio sudaryme; z valdo transliacijos tikslumą (kodono ir antikodono sąveika); z dalyvauja transliacijos terminacijoje ir atpalaiduojant polipeptidinę grandinę. Prokariotų ir eukariotų ribosomos, taip pat eukariotų organelių ribosomos yra sudarytos iš dviejų didžiojo ir mažojo subvienetų, o šie yra sudaryti iš ribosominių baltymų ir ribosominių RNR (7.7 pav.). Ribosoma disocijuoja į atskirus subvienetus in vitro, sumažinus Mg 2+ jonų koncentraciją. Ribosomų dydis apibūdinamas jų sedimentacijos greičio vienetais Svedbergais, S. E. coli 70S ribosomos bendra molekulinė masė yra apie 2,5 MDa. E. coli ląstelė turi apie ribosomų, o daugelis didelių eukariotinių ląstelių turi apie kelis šimtus tūkstančių ribosomų. Eukariotų ribosomos molekulinė masė viršija 4 Mda. 7.7 pav. Prokariotų ir eukariotų ribosomų sudėtis 364

365 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Ultracentrifugavimo metodą ~ 1920 m. sukūrė Teodoras Svedbergas (Theodor Svedberg). Svedbergo vienetais matuojamas dalelių sedimentacijos greitis jas ultracentrifuguojant sacharozės tankio gradiente. Vienas svedbergas lygus s. Eukariotų, archėjų, bakterijų ribosomos šiek tiek skiriasi savo forma, baltymų rinkiniu ir rrnr molekulių rūšimis. Organelių ribosomose didesnę dalį masės sudaro ne rrnr, bet baltymai. Ribosomų pavidalą daugiausia lemia rrnr molekulių erdvinės struktūros. Ribosominiai baltymai išsidėstę tose ribosomos vietose, kurios sąveikauja su aplinka, taip pat dviejų subvienetų sąlyčio kraštuose. Ribosomos subvienetai sukuria aplinką transliacijai. Mažasis ribosomos subvienetas svarbus transliacijos iniciacijai. Jis prijungia transliacijos matricą irnr ir tiksliai išdėsto pirmuosius transliuojamus irnr kodonus ribosomoje. Mažasis ribosomos subvienetas užtikrina tikslią sąveiką tarp irnr molekulės kodonų ir trnr molekulės antikodonų, t. y. atlieka iškodavimo funkciją (angl. decoding). Ši funkcija lemia sintezės tikslumą. Mažasis ribosomos subvienetas taip pat dalyvauja irnr ir trnr molekulių perstūmime (angl. translocation) transliacijos metu. Didysis ribosomos subvienetas užtikrina peptidinio ryšio susidarymą transliacijos metu. Didžiajame subvienete yra kanalas, kuriuo susintetintas polipeptidas išeina iš ribosomos. Didžiajame subvienete yra transliacijos veiksnių G baltymų (GTP ir GDP surišančių baltymų) prijungimo sritis. Šie veiksniai veikia įvairiuose baltymų biosintezės etapuose Ribosomos struktūros tyrimai Ribosomų struktūros tyrimai buvo pradėti daugiau kaip prieš 30 metų. Nuo to laiko nuolat tobulėjo ribosomos ir jos subvienetų kristalizavimo technika ir kristalų analizės skyra. Tyrimus vainikavo 2009 m. Nobelio chemijos premija, kuri buvo skirta Adai E. Jonat (Ada E. Yonath), Venkatramanui Ramakrišnanui (Venkatraman Ramakrishnan) ir Tomui A. Steicui (Thomas A. Steitz). Ribosomos struktūros tyrimus ypač paspartino krioelektroninė mikroskopija, krio-em. Šiuo metodu galima per keletą sekundžių užšaldyti ribosomas ir gauti įvairių būsenų ribosomų vaizdus. Ribosomų analizę šiuo metodu kol kas riboja elektroninės mikroskopijos skyros galimybės (~ 20 Å). Kitas ribosomų struktūros tyrimo būdas ribosomų kristalizavimas ir jų kristalų rentgenostruktūrinė analizė. Ribosomų kristalografinę analizę apsunkina tai, kad šios makromolekulės yra labai didelės ir sudarytos iš daugelio komponentų. Ribosomos dalelės neturi vidinės simetrijos, keičia savo konformaciją ir yra labai jautrios spinduliuotės, kuri naudojama tokiuose tyrimuose, poveikiui m. buvo gauta labai svarbių duomenų apie ribosomų struktūrą, tiriant jas rentgenostruktūrinės analizės ir krio-em analizės metodais (7.1 lentelė). Tai pavyko padaryti A. Jonat vadovaujamai tyrėjų grupei, gavusiai tvirtų ribosomų kristalus. Ribosomos buvo išskirtos iš bakterijų bei archėjų, gyvenančių ekstremaliomis sąlygomis, pvz., aukštos temperatūros, didelės radiacijos sąlygomis, didelės koncentracijos druskų tirpaluose, todėl tokių ribosomų kristalai buvo palyginti atsparūs ardančiam rengeno spindulių poveikiui tyrimo metu. 365

366 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 7.1 lentelė. Svarbiausi ribosomų struktūros tyrimų etapai Metai Organizmas Skyra, Ǻ (metodas) Ribosoma / subvienetas Nuoroda 1999 Thermus thermophilus 4,5 (rentgeno) 30S PNAS, v. 96, p , 1999 Thermus thermophilus 3,3 (rentgeno) 30S Cell, v. 102, p. 615, Haloarcula marismortui 2,8 (rentgeno) 50S Science, v. 11, p. 878, 2000 Escherichia coli 11,5 (krio) 70S Cell, v. 100, p. 537, 2000 Saccharomyces cerevisiae 15,0 (krio) 80S Cell, v. 107, p. 373, 2001 Thermus thermophilus 5,5 (rentgeno) 70S-iRNR-tRNR kompleksas Science, v. 292, p. 868, Deinococcus radiodurans 3,1 (rentgeno) 50S Cell, v. 107, p. 679, Escherichia coli 3,5 (rentgeno) 70S Science, v. 310, p. 827, Thermus thermophilus 2,8 (rentgeno) 70S-iRNR-tRNR kompleksas Science, v. 313, p. 1935, Nobelio chemijos premija už ribosomos tyrimus 7.8 pav. Bakterijos Thermus thermophilus ribosomos didžiojo subvieneto erdvinė struktūra, nustatyta krioelektroninės mikroskopijos ir rentgenostruktūrinės analizės metodais (The Journal of Biology, v. 8, p. 8, 2009) 366

367 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) 7.9 pav. Bakterijų ribosomos subvienetų kontaktai. Kairėje ir viduryje kontūru apvestos 30S ir 50S subvienetų sąlyčio sritys ribosomos viduje, dešinėje 70S ribosomos struktūra (Science, v. 285, p. 2095, 1999) Šie labai svarbūs ribosomų struktūros analizės rezultatai atskleidė atominę didžiulio molekulinio komplekso struktūrą (7.8 pav.). Buvo nustatytos tikslios ribosominių RNR bei ribosominių baltymų ir baltymų biosintezėje dalyvaujančių trnr bei irnr padėtys ir jų tarpusavio sąveika ribosomoje. Nustatyta ertmė tarp abiejų subvienetų, kurioje išsidėsto irnr ir aminoacil-trnr. Parodyta, kad ribosomos subvienetai tarpusavyje sąveikauja palyginti mažai. Pvz., bakterijos ribosomoje yra tik apie 12 tiltelių, kurie jungia vieną ribosomos subvienetą su kitu (7.9 pav.). Palyginti nedidelis kontaktų tarp ribosomos subvienetų skaičius paaiškina, kodėl ribosomos subvienetai lengvai disocijuoja, o pati ribosoma keičia savo konformaciją įvairių transliacijos etapų metu. Daugelyje nustatytų sąveikų tarp ribosomos subvienetų dalyvauja rrnr molekulės. Čia svarbus vaidmuo tenka 16S rrnr. 16S rrnr molekulės antrinėje struktūroje 3 gale yra vadinamasis priešpaskutinysis segtukas (angl. penultimate stem), kurį sudaro nukleotidai. Ši struktūra sudaro vadinamąją RNR 44 spiralę. Spiralė išsidėsčiusi vertikaliai 30S ribosomos subvieneto (jo vidinėje pusėje), ji sąveikauja su didžiojo ribosomos subvieneto 23S rrnr. trnr molekulių judėjimas ribosomoje yra siejamas su kontaktų tarp ribosomos subvienetų pokyčiais. Ribosomos subvienetų sąlyčio paviršiuje dažniausiai yra RNR molekulės. Nustatytos tikslios ribosomos sričių (angl. sites), kur išsidėsto trnr ir vyksta peptido (baltymo) sintezė, padėtys. A ir P srityse trnr molekulės išsidėsčiusios beveik lygiagrečiai viena kitai, o E centre pasisukusios šonu (7.10 pav.). 367

368 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 7.10 pav. trnr molekulių padėtys Thermus thermophilus ribosomos A, P ir E srityse (Science, v. 292, p. 893, 2001) A, P ir E sritis formuoja abu ribosomos subvienetai. 30S subvienete esančias trnr ir irnr jungimo sritis, kur trnr antikodonai sąveikauja su irnr kodonais, sudaro išskirtinai 16S rrnr molekulės struktūriniai elementai. Vienintelis baltymas, esantis arti iškodavimo centro, yra S Ribosominės RNR Nustačius rrnr nukleotidų sekas, buvo pasiūlytos rrnr molekulių antrinės struktūros (žr skyrių). Kaip parodė vėlesnė rentgenostruktūrinė ribosomų analizė, jos buvo gana tikslios. Didelės skyros rentgenostruktūrine analize nustatyta, kad rrnr molekulėje yra daugiau tretinės struktūros elementų, nei anksčiau manyta. Būdingas rrnr erdvinės struktūros elementas yra A minorinis motyvas. Motyvuose esantys konservatyvūs rrnr nukleotidai liudija apie jų funkcinę svarbą. Šeši 23S rrnr domenai su 5S rrnr susimontuoja į kompaktišką struktūrą (2.32 pav., a c), kurioje rrnr molekulės sudaro apie 100 spiralės pavidalo stiebų. Verta pastebėti, kad beveik visos 23S rrnr molekulės sritys, kurios sąveikauja su trnr molekulių ribosomos A, P ir E sritimis arba yra šalia jų, yra V domene (2.32 pav.). 5S rrnr molekulė ribosomoje išsidėsto ties centriniu kyšuliu (angl. central protuberance, PC) didžiajame ribosomos subvienete (7.9 ir 2.32 pav.). 5S rrnr nėra kai kurių grybų, stuburinių ir pirmuonių mitochondrijų ribosomose. Palyginti su 23S RNR, 16S rrnr molekulė yra ne tokia kompaktiška. Joje išskiriami trys dideli ir vienas mažas domenas, kurie susilanksto į erdvinę struktūrą nepriklausomai. Tuo tarpu 23S rrnr formuoja vieną bendrą struktūrą. Tai turi reikšmės ribosomos subvienetų funkcijoms: mažasis subvienetas, kur vyksta informacijos, esančios irnr, iškodavimas, yra judresnis, o didysis subvienetas, kur vyksta peptidinio ryšio susidarymas, yra mažiau judrus. Trys didieji 16S rrnr domenai atitinka molekulės struktūrinius elementus: 5 domenas sudaro ribosomos mažojo subvieneto kūną (angl. body, B), centrinis domenas platformą (angl. platform, P), o 3 didysis domenas galvą (angl. head, H) (7.9 ir 2.31 pav.). Archėjų ribosomos panašios į bakterijų, tik jose yra daugiau baltymų. Eukariotų ribosomų didžiojo subvieneto sudėtyje yra dar viena 5,8S rrnr molekulė, o didžiųjų rrnr (18S ir 28S) molekulėse įsiterpusių nukleotidų sekų (angl. expansion segments). 5,8S yra kilusi iš didžiosios rrnr. Eukariotų ribosomos dar turi papildomų baltymų. Taigi sudėtingesniuose organizmuose ribosomos yra didesnės. Ribosominės RNR yra labai konservatyvios molekulės; remiantis jų sekomis, nustatoma rūšies tapatybė. 368

369 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Ribosominiai baltymai Ribosominių RNR griaučius ribosomoje uždengia ribosominiai baltymai. Ne visų organizmų ribosominiai baltymai yra visiškai vienodi. Pvz., apie trečdalį archėjos H. marismortui 50S subvieneto baltymų neturi homologiškų baltymų E. coli 50S subvienete (7.11 pav., a). Daugelio baltymų, ypač didžiojo ribosomos subvieneto, struktūrą sudaro globulės formos domenai, išsidėstę ribosomos paviršiuje, ir nestruktūrizuotos dalys pirštai, kurie yra įsiterpę į rrnr molekules (7.11 pav., b). Daugelis baltymų ribosomoje sąveikauja su rrnr struktūriniais elementais. Pvz., trečdalis 23S rrnr nukleotidų sąveikauja Van der Valso sąveika su baltymų aminorūgščių liekanomis. Ribosominiai baltymai stabilizuoja rrnr tretinę struktūrą, taip pat padeda prijungti transliacijos veiksnius. Tai, manoma, pagrindinės jų funkcijos ribosomoje Funkciniai centrai ribosomoje Ribosomos yra sudėtingi baltymų-rnr kompleksai, kuriuose baltymų biosintezės metu laikoma irnr, dvi aminoacil-trnr molekulės, transliacijos veiksniai. Kur išsidėsto visos šios molekulės? Viena trnr molekulė, prie kurios prijungtas sintetinamas polipeptidas peptidil-trnr, yra išsidėsčiusi ribosomos P srityje (angl. peptidyl-p site). Kita trnr molekulė, prie kurios prijungta aminorūgštis aminoacil-trnr, yra išsidėsčiusi ribosomos A srityje (angl. aminoacyl-a site) (7.12 pav.) pav. Ribosomų baltymai gyvybės domenuose. Veno diagrama, iliustruojanti ribosomos mažojo ir didžiojo suvienetų baltymų pasiskirstymą eukariuotuose (E), archėjose (A) ir bakterijose (B). Pirmasis skaitmuo skliausteliuose mažojo subvieneto baltymų skaičius, antrasis didžiojo. Skaitmenys apskritimų susikirtimuose žymi bendrų baltymų skaičių (a) (Nucleic Acids Research, v. 30, p. 5382, 2002); eukariotų ribosomos didžiojo ir mažojo subvienetų baltymų pavyzdžiai (b) ( Eukaryotic_Small_Ribosomal_Subunit_(40S)) 369

370 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Ribosomos A ir P srityse išsidėsčiusių trnr molekulių antikodonai sąveikauja su irnr kodonais, esančiais ribosomos 30S subvienete (ši vieta vadinama iškodavimo centru), o prie trnr prijungtos aminorūgštys išsidėsto 50S subvienete. trnr Ribosomose yra trys trnr surišimo sritys A, P ir E. molekulių kūnai išsidėsto ertmėje tarp subvienetų (7.12 pav.). A ir P srityse esančios trnr molekulės yra pasisukusios viena kitos atžvilgiu, todėl prie jų prijungtos aminorūgštys 50S subvienete suartėja. Ši ribosomos vieta vadinama peptidiltransferaziniu centru, PTC (angl. peptidyltranferase center). Joje vyksta peptidinio ryšio susidarymas. Peptidiltransferazinį centrą, galima sakyti, formuoja A ir P sritys. Rentgenostruktūrine analize nustatyta, kad ir irnr molekulė 30S ribosomos subvienete išsidėsto plyšyje (7.13 pav.). Deacilinta trnr išeina iš ribosomos per E sritį (angl. exit-e site). Nustatyta, kad E srityje trnr molekulės sąveika su irnr nėra tokia stipri kaip A ir P srityse. Silpnesnė sąveika, greičiausiai, lemia trnr molekulės disociaciją nuo ribosomos. Susintetintas polipeptidas juda ~ 100 Ǻ ilgio ir ~ Ǻ skersmens išėjimo tuneliu, esančiu ribosomos 50S subvieneto užpakalinėje dalyje (7.12 pav.). Tunelis prasideda ties ta didžiojo subvieneto vieta, kur vyksta peptidinio ryšio susidarymas. Tunelį sudaro 23S rrnr, taip pat kai kurie baltymai, pvz., L2 ir L14. Tunelis baigiasi baltymų žiedais, kurie sąveikauja su baltymais šaperonais arba ląstelės sekrecinio aparato komponentais. Visuose transliacijos etapuose dalyvauja baltyminiai veiksniai. Energija, kurios reikia transliacijai, gaunama hidrolizuojant didžiaenergį junginį GTP. Nors prokariotų ir eukariotų ribosomų struktūros labai panašios, tarp jų yra daug funkcinių transliacijos skirtumų, ypač transliacijos iniciacijos etape (eukariotuose jis žymiai sudėtingesnis), taip pat elongacijos etape ir ribosomos sąveikoje su antibiotikais pav. Ribosomos funkciniai centrai (Science, v. 285, p. 2100, 1999) 370

371 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) 7.4. Baltymų biosintezė prokariotuose Transliacijos iniciacija Dar 1960 m. buvo parodyta, kad baltymai sintetinami pradedant jų N galu ir baigiant C galu. Matrica irnr yra skaitoma 5 3 kryptimi. Prokariotuose transkripcija ir transliacija dažniausiai vyksta vienu metu, o eukariotų ląstelėse šie procesai yra atskirti erdvėje: transkripcija vyksta branduolyje, o transliacija citozolyje. Iniciacijos procesas vyksta prieš susidarant peptidiniam ryšiui tarp pirmųjų dviejų aminorūgščių. Ribosoma prijungia irnr molekulę ir pirmąją aminoacil-trnr. Iniciacijos etapas yra palyginti lėtas ir dažniausiai nulemia baltymų biosintezės greitį. Iniciacijos etapui būtini: z irnr, kuri bus transliuojama; z 30S ir 50S ribosomos subvienetai; Met z speciali iniciatorinė trnr (ini-trnr arba formil-met-trnr f ); z baltymai iniciacijos veiksniai (IF-1, IF-2, IF-3); z GTP pav. irnr molekulės išsidėstymas 30S ribosomos subvienete. Viršuje irnr struktūrinė schema, kurioje pažymėtos irnr ir ribosomos sąveikos vietos; apačioje ribosomos 30S subvieneto kartu su irnr paviršius, esantis ribosomos vidinėje pusėje (Cell, v. 106, p. 233, 2001) 371

372 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Iniciacijos pradžia linkstama laikyti momentą, kai prie mažojo ribosomos subvieneto (30S) prisijungia transliacijos iniciacijos IF-3 veiksnys. Toliau IF-3 ir 30S kompleksas prijungia irnr molekulę, iniciatorinę aminoacil-trnr ir transliacijos iniciacijos veiksnius IF-1 ir IF-2. Tada prie komplekso prisijungia 50S subvienetas, ir ribosoma paruošiama elongacijos etapui. Taigi, iniciacijos procese dalyvauja ne visa ribosoma, bet atskiri jos subvienetai. Iniciacijos etapas reikalingas tam, kad, dar neprasidėjus sintezei, būtų tiksliai nustatytas irnr iniciacijos (START) kodonas. Tai yra labai svarbi ribosomos funkcija, nuo kurios priklauso būsimos aminorūgščių seka ir sintezės eiga: perstūmus skaitymo rėmelį nors per vieną nukleotidą, susinte pav. Baltymų biosintezės pagrindiniai etapai 372

373 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) tinto polipeptido aminorūgščių seka bus visiškai kita arba sintezė bus stabdoma jame įsiterpusių terminacijos kodonų. Daugelyje irnr molekulių pirmas transliuojamas kodonas yra AUG, kuris koduoja aminorūgštį metioniną (Met). Prieš šį kodoną yra netransliuojama irnr sritis. AUG kodonų yra ir skaitymo rėmelio viduryje, tačiau jie nėra iniciacijos kodonai. Ląstelėje sintetinant baltymus turi egzistuoti būdas Prokariotuose iniciacijos kodonas nustatomas sąveikaujant mažajam ribosomos 30S subvienetui su irnr molekule. atskirti, kuris iš kodonų yra iniciacijos kodonas (koduojantis pirmą aminorūgštį sintetinamo baltymo molekulėje), o kuris įprastas Met aminorūgštį koduojantis nukleotidų trejetas. Bakterijų 30S ribosomos subvienetas atrankiai prisijungia prie irnr molekulės 5 gale esančios savitos A ir G nukleotidų turinčios srities. Ši sritis yra ribosomų prijungimo sritis, RBS (angl. ribosome binding site). Ji dar vadinama Šaino-Dalgarno sritimi, SD (angl. Shine-Dalgarno; pavadinimas kilęs iš atradėjų pavardžių). SD sritis yra labai arti iniciacijos kodono irnr molekulėje vidutiniškai už 7 nukleotidų (7.15 pav.). Eukariotų irnr molekulės tokios srities neturi, juose iniciacijos kodonas irnr nustatomas kitu būdu. Šaino-Dalgarno sritis komplementari daug pirimidino nukleotidų turinčiam 16S rrnr (kuri yra 30S ribosomos subvienete) molekulės 3 galui. Dėl šios sąveikos irnr prisijungia prie 30S subvieneto tokiu būdu, kad iniciacijos kodonas irnr molekulėje išdėstomas ribosomos P srityje (7.13 pav.). SD srities dažniausiai irnr molekulėse yra prieš iniciacijos kodoną, bet ne prieš AUG kodonus skaitymo rėmelio viduryje, todėl iniciacijos kodonas pirmiausiai ir išdėstomas ribosomos P srityje transliacijos iniciacijos metu. Ne tik AUG kodonas gali būti iniciacijos kodonu. Pvz., E. coli vietoje AUG dažnai naudojamas ir kitas GUG kodonas. Jis pasitaiko apie 8 % iniciacijos kodonų, o archėjose yra dar dažnesnis. Abu kodonus atpažįsta ta pati iniciatorinė aminoacil-trnr. Įdomu, kad AUG kodonas koduoja metioniną būdamas ir START kodonu, ir vidiniu kodonu skaitymo rėmelyje. GUG, būdamas iniciacijos kodonu, lemia metionino įjungimą, o būdamas skaitymo rėmelio sudėtyje valino įjungimą, kurį ir koduoja (prijungia valil-trnr Val ). Kai kuriais retais atvejais ir kiti kodonai gali būti naudojami kaip iniciacijos, pvz., AUU. Kodėl gi čia neveikia genetinis kodas? Kodono-antikodono sąveika ribosomos P srityje, kur iniciacijos metu prijungiama iniciatorinė trnr, nėra lemiama jos prijungimui pav. Prokariotų irnr molekulės Šaino- Dalgarno srities sąveika su 16S rrnr molekulės komplementaria sritimi 3 gale 373

374 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Svarbesnį vaidmenį vaidina iniciatorinės trnr molekulės struktūra: trnr molekulė sąveikauja su 16S rrnr mažajame ribosomos subvienete ir todėl iniciatorinė trnr prijungiama tik P srityje. Bakterijose yra dvi metionil-trnr Met molekulių rūšys, kurios atpažįsta AUG kodoną. Viena trnr molekulių rūšis atpažįsta tik iniciacijos kodonus tai iniciatorinė trnr (ini-trnr). Kita metionil-trnr Met rūšis atpažįsta tik vidinius AUG kodonus. Šios dvi trnr molekulių rūšys skiriasi savo nukleotidų seka, bet aminorūgštį prie jų jungia ta pati aminoacil-trnr-sintetazė. Kai kuriuose prokariotuose (pvz., E. coli) iniciatorinė trnr yra N-formilmetionil-tRNR, f-met-trnr f Met. Molekulė turi struktūrinių ypatybių, kuriomis skiriasi nuo kitų metionil-trnr Met molekulių. Viena tokių sąvybių yra formilgrupė metionino aminorūgštyje. Ją prie metioniltrnr f Met prijungia formiltransferazė ir taip susidaro N-formilmetionil-tRNR f Met (7.16 pav., a). Tokioje aminoacil-trnr Met-NH 2 -COH ryšys primena peptidinį ryšį. Taigi prijungta fmet aminorūgštis panaši į mažą peptidinę grandinę. Transliacijos iniciacijos IF-2 veiksnys sąveikauja su ini-trnr, kuri turi formilgrupę metionino liekanoje. Kaip formiltransferazė atskiria savo substratą iniciatorinę metionil-trnr f Met nuo kitos rūšies metionil-trnr Met? Iniciatorinės metionil-trnr molekulės skiriasi savo nukleotidų seka ir antrine struktūra. Joms būdinga: z nesuporuoti C1 ir A72 nukleotidai akceptoriniame stiebe (7.16 pav., b); z A11-U24 nukleotidų pora D stiebe; z trys komplementarios G-C nukleotidų poros antikodoniniame stiebe. Met Pastaroji struktūrinė ypatybė užtikrina formilmetionil-trnr f molekulės prijungimą ribosomos P srityje, kur 16S rrnr A1339 ir G1338 heterociklinės bazės sudaro A minorinius motyvus su trnr G-C poromis ir padėtyse pav. N-formilmetionil-tRNR sintezė (a) ir iniciatorinės trnr f Met struktūra (b) ( 374

375 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Bakterijose ir mitochondrijose metionino formilgrupę pašalina savitas fermentas deformilazė. Peptidinės grandinės Ngale lieka įprasta NH 2 grupė. Apie pusė susintetintų baltymų turi tokį N galą. Kituose baltymuose metionio aminorūgštį pašalina aminopeptidazė. Modifikacija įvyksta greitai, ribosomai susintetinus vos 15 aminorūgčių liekanų polipeptidą. Eukariotuose prie iniciatorinės trnr prijungtas metioninas neformilinamas. Tokia trnr vadinama trnr i Met. 30S subvienetas pats negali inicijuoti transliacijos proceso. Tam reikia baltyminių veiksnių iniciacijos veiksnių, IF (angl. initiation factors). Prokariotuose yra trys iniciacijos veiksniai: IF-1, IF-2 ir IF-3. IF-3 veiksnys citozolyje prisijungia prie laisvų 30S subvienetų ir tokiu būdu jiems neleidžia per anksti susijungti su 50S subvienetu į 70S ribosomas. IF-3 gali prisijungti 30S subvieneto E srityje. IF-3 veikia ir kaip tikslumo (angl. fidelity) veiksnys destabilizuoja neiniciatorinių trnr sąveiką su ribosomos P sritimi. IF-3 dar pasižymi ir tuo, kad lemia deacilintų trnr disociaciją iš 30S subvieneto transliacijos terminacijos metu. Tokiu būdu išlaisvinami 30S subvienetai kitam iniciacijos ciklui. IF-1 veiksnys prisijungia 30S subvieneto A srityje (7.17 pav.). Manoma, kad tokiu būdu šis veiksnys neleidžia per anksti A srityje prisijungti aminoacil-trnr. IF-2 veiksnys (kartu su GTP) užtikrina labai svarbią sąveiką iniciatorinės trnr prijungimą 30S subvieneto P srityje (7.17 pav.). IF-2 sudaro kompleksą su iniciatorine trnr ir tokiu būdu neleidžia kitoms aminoacil-trnr dalyvauti iniciacijoje. Tuo tarpu elongacijos etape veikiantis veiksnys EF-Tu, atvirkščiai, nesąveikauja su iniciatorine trnr. IF-2 veiksnys yra nuo ribosomos priklausoma GTPazė. GTP hidrolizė vyksta, kai prie 30S subvieneto jungiasi 50S subvienetas. Tuo pat metu disocijuoja visi trys iniciacijos veiksniai (7.18 pav.). Susidarius 30S iniciacijos kompleksui, prie jo prisijungia didysis 50S ribosomos subvienetas. Tuo pat metu GTP, prisijungęs prie IF-2 veiksnio, hidrolizuojamas iki GDP ir P i. Hidrolizė vyksta dėl IF-2 veiksnio GTPazinio aktyvumo. GDP pakeitus į GTP, IF-2 vėl gali dalyvauti iniciacijos kompleksų susidaryme. Įvykus hidrolizei visi iniciacijos veiksniai disocijuoja iš ribosomos (7.18 pav.). GTP hidrolizė sukelia konformacinius pokyčius, dėl jų ribosoma gali vykdyti sintezės reakcijas, o ribosomos A sritis priimti aminoacilintą trnr pav. Prokariotų transliacijos veiksnių sąveika su ribosomos mažuoju subvienetu. Vietoje IF-2 parodytas eukariotų analogas. IF-3-N ir IF-3-C IF-3 veiksnio N ir C galiniai domenai (Cell, v. 108, p. 557, 2002) 375

376 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Transliacijos elongacija Elongacijos metu vyksta visų peptidinių ryšių nuo pirmojo iki paskutiniojo sintezė. Ribosoma lieka prijungusi irnr molekulę ir transliuoja irnr nukleotidų seką į aminorūgščių seką. Šie vyksmai vadinami elongacijos ciklu.tik dvi trnr molekulės sąveikauja su irnr ir ribosomos kompleksu vienu metu: za srityje esanti aminoacil-trnr molekulė: mažajame ribosomos subvienete jos antikodonas sąveikauja su atitinkamu irnr molekulės kodonu, o didžiajame yra aminorūgštis; zp srityje esanti peptidil-trnr su sintetinama polipeptidine grandine (angl. nascent polypeptide chain): elongacijos metu ši polipeptidinė grandinė nuo trnr P srityje perkeliama ant aminoacil-trnr, esančios A srityje. Peptidinio ryšio susidarymas vyksta kovalentiškai prijungus peptidil-α karboksigrupę prie α aminogrupės aminoacil-trnr molekulėje. Baltymo sintezei vykti reikia: z irnr, 70S ribosomos, peptidil-trnr komplekso; z aminoacil-trnr molekulės; z transliacijos elongacijos veiksnių; z GTP pav. Transliacijos iniciacija bakterijose 376

377 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Pasibaigus transliacijos iniciacijos etapui, tolimesnis irnr molekulės kodonas už iniciacijos kodono, esančio P srityje, yra orientuojamas ribosomoje taip, kad galėtų prijungti kitą aminoacil-trnr, kurios antikodonas sudaro komplementarią sąveiką su kitu irnr kodonu. Ši aminoacil-trnr užima ribosomos A sritį (šioje srityje tinka visos aminoacil-trnr, išskyrus iniciatorinę trnr dėl jau minėtos ypatingos molekulės struktūros) Elongacijos ciklas Vykstant polipeptido sintezei, kiekviena nauja aminorūgštis jungiama per elongacijos ciklą. Elongacijos ciklo pagrindiniai žingsniai yra šie: z aminoacil-trnr išdėstymas ribosomos A srityje; z peptidinio ryšio susidarymas; z viena aminorūgštimi pailgėjusios peptidil-trnr perkėlimas iš A srities į P sritį taip, kad srityje liktų laisva vieta kitai aminoacil-trnr; šis procesas vadinamas perstūmimu pav. Transliacijos elongacijos ciklas prokariotuose 377

378 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Perstūmimas (angl. translocation) yra susijęs su trnr ir irnr molekulių judėjimu ribosomos A, P ir E srityse. irnr molekulė ribosomos atžvilgiu pasistumia per vieną jos kodoną. Translokacijos metu ir pati ribosoma keičia savo konformaciją. Kiekvieno elongacijos ciklo metu polipeptidinė grandinė P srityje pailgėja viena aminorūgštimi. Vykstant pirmajam elongacijos ciklo žingsniui, ribosomos A srityje išdėstoma aminoaciltrnr, kurios antikodonas atitinka irnr molekulėje esantį kodoną (7.19 pav.). Bakterijose aminoacil-trnr jungimui ribosomos A srityje reikia baltymo elongacijos EF-Tu veiksnio. Elongacijos veiksniai, EF (angl. elongation factors), vaidina svarbų vaidmenį polipeptidinės grandinės sintezėje. Bakterijose jų yra dideli kiekiai. Pvz., EF-Tu baltymai E. coli sudaro ~ 5 % viso baltymų kiekio. EF-Tu yra monomerinė GTPazė. Prijungus GTP, EF-Tu ir GTP kompleksas prijungia aminoacil-trnr. Toks trinaris kompleksas tinkamas išsidėstyti ribosomos A srityje. Kompleksas prisijungia A srityje tik tuomet, kai P srityje yra arba iniciatorinė trnr molekulė (tik įvykus iniciacijai), arba trnr molekulė su augančia peptidine grandine peptidil-trnr (peptido sintezės metu). EF-Tu, GTP ir aminoacil-trnr komplekso susidarymas yra termodinamiškai palankus, todėl dauguma aminoacil-trnr ląstelėje yra tokiuose kompleksuose. Tik formilmetionil-trnr f Met nesudaro komplekso dėl savo akceptorinio stiebo ypatingos antrinės struktūros. Kai formilmetionil-trnr f Met, EF-Tu ir GTP kompleksas pakliūva į ribosomos A sritį ir susidaro komplementari sąveika tarp kodono ir antikodono, įvyksta ribosomos konformacijos pokyčių. Šie pokyčiai sukelia GTP hidrolizę iki GDP pasireiškia nuo ribosomos priklausomas EF-Tu GTPazinis aktyvumas. Kodėl tiksli kodono-antikodono sąveika ribosomoje sukelia GTP hidrolizę, dar nėra suprasta. Kad ji įvyktų, reikia, kad signalas apie komplementarią sąveiką iškodavimo vietoje būtų perduotas iš ribosomos 30S subvieneto į 50S subvienetą, kur yra EF-Tu veiksnio GTPazinio domeno prisijungimo vieta (7.19 pav.). Šis signalas turi būti perduodamas ir per trnr molekulę, nes GTP hidrolizė vyksta tik esant intaktinei trnr. Sintetinama polipeptidinė grandinė yra perkeliama nuo peptidil-trnr, kuri yra P srityje, prie aminoacil-trnr, kuri yra A srityje. Tuo metu, kai įvyksta GTP hidrolizė, EF-Tu veiksnys ribosomos A srityje paleidžia aminoacil-trnr molekulės 3 galą su aminorūgštimi, ir šis sukdamasis (angl. swing out) išsidėsto ribosomos didžiojo subvieneto peptidiltransferaziniame centre. Toliau vyksta peptidinio ryšio susidarymas. Susidarius peptidiniam ryšiui, deacilinta (be aminorūgšties) trnr lieka ribosomos P srityje, o peptidil-trnr, pailgėjusi viena aminorūgštimi, A srityje. Taigi susidarant peptidiniam ryšiui, ne aminorūgštis prijungiama prie polipeptidinės grandinės ir perkeliama nuo aminoacil-trnr prie peptidil-trnr, bet atvirkščiai peptidinė grandinė nuo peptidil-trnr perkeliama ant aminoacil-trnr. EF-Tu disocijuoja iš ribosomos EF-Tu ir GDP komplekso sudėtyje (7.19 pav.). Disocijavęs toks kompleksas negali prijungti kitos aminoacil-trnr, kol GDP nepakeičiamas GTP. Šią reakciją katalizuoja dar vienas elongacijos veiksnys EF-Ts. Taigi, kiekvienos aminoacil-trnr molekulės prijungimui ribosomos A srityje yra suskaldoma viena GTP molekulė. 378

379 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Iškodavimas Kaip ribosomoje nustatomos aminoacil-trnr molekulės (komplekse su EF-Tu ir GTP), kurių antikodonai yra komplementarūs irnr molekulės kodonams? Jeigu aminoacil-trnr molekulės antikodonas atitinka irnr kodoną, aminoacil-trnr molekulė laikosi ribosomos A srityje iš dalies dėl Votsono-Kriko sąveikos tarp komplementarių heterociklinių bazių. Tai yra pirminė atranka (angl. initial selection). Tačiau skirtumas tarp komplementarios sąveikos ir ne visiškai komplementarios sąveikos palyginti nedidelis. Jo nepakanka užtikrinti didelį transliacijos tikslumą (viena klaida įjungtų aminorūgščių). Pvz., netipiškos bazių poros GU (pirmoje kodono ir antikodono pozicijoje) laisvoji energija panaši į AU poros, tačiau ribosoma atskiria tokią netipišką porą nuo Votsono-Kriko bazių poros. Taigi, turėtų egzistuoti kiti didelį transliacijos tikslumą užtikrinantys būdai. Dar 1964 m. buvo pasiūlyta, kad ribosoma gali tiksliai nustatyti, ar kodono ir antikodono erdvinė geometrija atitinka komplementarią kodono ir antikodono sąveiką ar ne. Vėliau paaiškėjo, kad tokia iškodavimo funkcija pasižymi mažasis ribosomos subvienetas. Komplementari sąveika tarp pirmųjų dviejų kodono ir antikodono heterociklinių bazių sukelia konformacinių pokyčių artimiausioje aplinkoje 30S subvienete. Atlikus struktūrinius tyrimus parodyta, kad 16S rrnr (E. coli) G530, A1492 ir A1493 nukleotidų konformacija priklauso nuo mažojo griovio, kuris susidaro tarp pirmųjų dviejų irnr kodono ir aminoacil-trnr antikodono nukleotidų, struktūros (7.20 pav., a d) pav. Bakterijų ribosomos iškodavimo centro 30S subvienete struktūra. Centras tuščias (a); centre prisijungęs paromomicinas (b); centre yra irnr kodonas ir jam komplementarus trnr antikodonas (c); centre yra irnr kodonas ir jam nekomplementarus trnr antikodonas bei paromomicinas (PAR) (Science, v. 292, p. 900, 2001) 379

380 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA 16S rrnr reikšmė iškodavimui ir molekulinis mechanizmas paaiškėjo atlikus ribosomos, prie kurios prisijungęs antibiotikas paromomicinas, rentgenostruktūrinę analizę. Paromomicinas prisijungia prie 30S subvieneto 16S rrnr 44 spiralės (angl. helix 44) vidinės kilpos. Antibiotiko prisijungimas sumažina transliacijos tikslumą, t. y. įjungiamos ne tos aminorūgštys, kurias koduoja irnr. Struktūriniai tyrimai parodė, kad prisijungęs paromomicinas sukelia E. coli 16S rrnr konformacijos pokyčius 16S rrnr A1492 ir A1493 heterociklinės bazės išsukamos (7.20 pav., b). Toks pat A heterociklinių bazių išsukimas įvyksta iškodavimo centre, kai aminoacil-trnr antikodonas yra komplementarus irnr kodonui (7.20 pav., c). A1492 ir A1493 sudaro vandenilinius ryšius su pirmąja bei antrąja kodono ir antikodono nukleotidų poromis. Su trečiąja pora sąveika yra silpnesnė. Tai paaiškina, kodėl ribosomoje toleruojamas nekomplementarumas tarp trečiojo irnr kodono nukleotido ir trnr antikodono nukleotido. Sudarant ryšius tarp ribosomos 16S rrnr bei kodono ir antikodono dalyvauja ir G530 heterociklinė bazė. Esant visiškai komplementariai kodono ir antikodono sąveikai G530 glikozidinio ryšio konfigūracija pasikeičia: iš sin virsta anti (7.20 pav., c). Taigi, paromomicinas sukelia konformacinius pokyčius ribosomoje, kurie imituoja kodono atitikimo antikodonui būseną baltymų biosintezės metu. Visų anksčiau minėtų 16S rrnr nukleotidų mutacijos yra letalios E. coli. Struktūrinis kodono ir antikodono sąveikos atpažinimas ribosomoje yra labai svarbus sintezės tikslumui. Ne mažiau svarbus šiame procese yra ir transliacijos veiksnys EF-Tu. Aminoacil-tRNR į ribosomą pakliūva komplekso su EF-Tu ir GTP sudėtyje. Susidarius tiksliai kodono ir antikodono sąveikai, anksčiau aptarti struktūriniai pokyčiai ribosomos 30S subvieneto 16S rrnr molekulėje sukelia GTP hidrolizę ir EF-Tu veiksnio disociaciją iš ribosomos. GTP hidrolizė vyksta ribosomos 50S subvienete, kuriame prijungiamas EF-Tu veiksnio GTPazinis domenas. Taigi, signalas iš 30S subvieneto apie kodono-antikodono sąveiką turi būti per ribosomą perduotas į 50S subvienetą. Kaip perduodamas signalas dar nėra suprasta. Manoma, kad šiame procese svarbų vaidmenį galėtų atlikti trnr molekulė. Įvykus GTP hidrolizei ir atsipalaidavus EF-Tu, aminoacil-trnr, esanti A srityje, pasisuka į peptidiltransferazės centro pusę ir išdėstoma (angl. accommodation) arti peptidil-trnr (7.19 pav.). Didžiajame subvienete taip pat vyksta erdviniai pokyčiai, dėl kurių peptidil-trnr išdėstoma peptidinio ryšio sudarymui. trnr molekulių 5 CCA3 galai sudaro Votsono-Kriko poras su 23S rrnr kilpų konservatyviais nukleotidais Peptidinio ryšio susidarymas Kitas elongacijos žingsnis yra peptidinio ryšio susidarymas. Aktyvumas, dėl kurio susidaro peptidinis ryšys, yra vadinamas peptidiltransferaziniu aktyvumu. Peptidiltransferaziniu aktyvumu pasižymi didžiojo ribosomos subvieneto sritis, kurią sudaro konservatyvūs rrnr elementai. Peptidinio ryšio susidarymas yra pagrindinė cheminė reakcija baltymų biosintezės metu. Šiai reakcijai tiesiogiai nereikia energijos (pvz., ATP). Aminoacil-tRNR yra išdėstoma ribosomos A srityje taip, kad jos aminorūgšties aminogrupė (nukleofilas) gali atakuoti esterio tarp trnr molekulės ir polipeptidinės grandinės karbonilgrupės C atomą (7.21 pav.). Vyksta esterinio ryšio aminolizė. Svarbu pastebėti: kai A sritis 380

381 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) nėra užimta aminoacil-trnr, aplinkoje esančios vandens molekulės gali hidrolizuoti esterinį ryšį tarp trnr ir peptido (P centre). Tyrimais parodyta, kad 23S rrnr struktūros komponentai trukdo prieiti vandens molekulėms prie peptidil-trnr. Peptidinio ryšio susidarymo mechanizmas buvo nustatytas panaudojant kitą antibiotiką puromiciną. Puromicinas stabdo baltymų biosintezę. Šis junginys savo struktūra labai panašus į aminorūgšties, prijungtos prie trnr molekulės 3 gale esančio adenozino, struktūrą. Skirtumas tik tas, kad puromicino molekulėje yra ne deguonies atomas, jungiantis aminorūgštį su trnr, bet azoto atomas (7.22 pav.) pav. Peptidinio ryšio susidarymas ribosomoje 7.22 pav. Puromicino (a) ir aminorūgšties (b), prijungtų prie aminoacil-trnr, struktūros 381

382 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Kai puromicinas pakliūva į ribosomą, A srityje jis atpažįstamas kaip aminoacil-trnr, ir kitame elongacijos ciklo žingsnyje susidaro peptidinis ryšys: polipeptidas iš ribosomos P srities perkeliamas ir jungiamas prie puromicino NH 2 grupės. Susidaro peptidilpuromicinas. Taigi, ši reakcija imituoja pirmojo peptidinio ryšio ribosomoje susidarymą. Peptidilpuromicinas greitai disocijuoja iš ribosomos, o tolesnė sintezė stabdoma. Antibiotikai yra mažos (~ Da molekulinės masės) molekulės, kurios veikia bakterijas ir grybus bakteriostatiškai (slopina augimą) arba bakteriocidiškai (sukelia žūtį). Daugelis antibiotikų stabdo bakterijų ribosomose vykstančią transliaciją (7.2 lentelė). Vieni antibiotikai prisijungia prie ribosomos, kiti prie transliacijos veiksnių ir slopina jų funkcijas. Antibiotikų taikiniai ribosomose yra funkciškai svarbūs jos centrai: pvz., peptidiltransferazinis centras, G veiksnių surišimo centras, peptido išėjimo tunelis didžiajame ribosomos subvienete. Pastaraisiais metais struktūrine ribosomų analize išaiškintas daugelio antibiotikų veikimo mechanizmas. 7.2 lentelė. Kai kurie baltymų biosintezės slopikliai Baltymų biosintezės slopiklis Organizmas Veikimas Iniciacijos etapas Kasugamicinas Prokariotai Met Stabdo f-met-trnr f prisijungimą Streptomicinas Prokariotai Neleidžia susidaryti iniciacijos kompleksui Elongacijos etapas: aminoacil-trnr prijungimas Tetraciklinas Prokariotai Stabdo aminoacil-trnr prisijungimą ribosomos A srityje Streptomicinas Prokariotai Lemia netikslų iškodavimą (prijungiama neteisinga aminorūgštis) Elongacijos etapas: peptidinio ryšio susidarymas Sparsomicinas Prokariotai Slopina peptidiltransferazinį aktyvumą Chloramfenikolas Prokariotai Slopina peptidiltransferazinį aktyvumą Eritromicinas Prokariotai Slopina peptidiltransferazinį aktyvumą Cikloheksimidas Eukariotai Slopina peptidil-trnr perstūmimą Elongacijos etapas: perstūmimas Fusidinė rūgštis Prokariotai, eukariotai Stabdo EF-G ir GDP disociaciją iš ribosomos Tiostreptonas Prokariotai Stabdo EF-Tu ir EF-G GTPazinį aktyvumą, kurį stimuliuoja ribosoma Difterijos toksinas Eukariotai Išaktyvina eef2 veiksnį, jį ADP-ribozilindamas Priešlaikinė terminacija Puromicinas Prokariotai, eukariotai Aminoacil-tRNR analogas, kuris stabdo tolesnę peptidinės grandinės sintezę Ribosomos peptidiltransferazinis aktyvumas Gan ilgą laiką egzistavo hipotezė, kad 50S ribosomos subvienete esanti 23S rrnr molekulė gali katalizuoti peptidiltransferazinę reakciją. Pašalinus K peptidaze ir detergentu (natrio dode- 382

383 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) 7.23 pav. Peptidinio ryšio susidarymas archėjos Haloarcula marismortui ribosomos 50S subvienete (a) ir hipotetinis reakcijos mechanizmas (b) (Molecular Cell, v. 26, p. 311, 2007) cilsulfatu) iš 50S ribosomos subvieneto beveik visus (80 %) baltymus, likusi 23S rrnr molekulė sugebėdavo tiesa, labai neveiksmingai katalizuoti peptidinio ryšio susidarymą tarp substratų, kurių buvo reakcijos mišinyje. Pastarąjį dešimtmetį gauta archėjos Haloarcula marismortui ir bakterijos Deinococcus radiodurans ribosomų 50S subvieneto ir kai kurių cheminiu būdu susintetintų ribosomos substratų bei produktų analogų kristalai ir atlikta jų rentgenostruktūrinė analizė. Pavyko nustatyti tarpinio reakcijos produkto analogo vadinamojo Jaruso slopiklio 1 (angl. Yarus inhibitor), prisijungusio ribosomos didžiajame subvienete, erdvinę struktūrą. Jaruso slopiklis yra C-C-dA-fosforoamido puromicinas. Jis prisijungia prie ribosomos A ir P sričių ir stabdo baltymų biosintezę. Buvo nustatyta, kad toje 50S subvieneto vietoje, kur ribosomoje turėtų vykti peptidinio ryšio susidarymas, aplink reakcijoje dalyvaujančias aminorūgštis 18 Å atstumu nėra jokių baltymų, vien tik 23S rrnr molekulės atomai. Tomas Steicas su bendradarbiais, remdamiesi šiais duomenimis, pasiūlė ribosomos peptidiltransferazinio centro modelį (7.23 pav., a). Pagal šį modelį, substratų trnr molekulių 3 galai 50S subvieneto A ir P srityse yra tiksliai išdėstomi jiems sąveikaujant su 23S rrnr konservatyviosiomis A ir P kilpomis. Labai svarbi katalizei yra ir peptidil-trnr 2 OH grupė ji dalyvauja greitinant protonų judėjimą (angl. shuttle) reakcijos metu. Manoma, kad 2 OH grupė gauna protoną iš NH 2 grupės, ir vėliau atiduoda protoną nueinančiosios trnr molekulės 3 OH grupei (7.23 pav., b). Taigi, remiantis šiais eksperimentais, galima manyti, kad nors rrnr galbūt tiesiogiai ir nedalyvauja katalizuojant peptidiltransferazinę reakciją, tačiau ji atlieka nepaprastai svarbų struktūrinį vaidmenį, suartindama ir tiksliai išdėstydama reakcijoje peptidiltransferaziniame centre dalyvaujančius substratus. 1 Junginio pavadinimas kilęs nuo jį susintetinusio Maiklo Jaruso (Michael Yarus) pavardės. 383

384 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Peptidiltransferazinė reakcija vyksta panašiu greičiu tiek esant 50S ribosomos subvienetui, tiek pilnos struktūros 70S ribosomai. Substratų išsidėstymas abiem atvejais taip pat yra panašus. Susidarius peptidiniam ryšiui ribosomoje vyksta šie procesai: z deacilinta trnr pašalinama iš ribosomos P srities; z peptidil-trnr, pailgėjusi viena aminorūgštimi, perkeliama iš A srities į P sritį; z irnr pasistumia tiksliai per vieną kodoną į priekį ribosomos atžvilgiu, kad kitas kodonas išsidėstytų A srityje. Susidarius peptidiniam ryšiui, ribosomos 30S subvienetas pasisuka 50S subvieneto atžvilgiu, todėl trnr molekulės išsidėsto tarp P ir E bei A ir P sričių atsiduria tarpinėse padėtyse (angl. hybrid state). Tokiose padėtyse esančių trnr antikodonai atsiduria vienoje ribosomos srityje, o akceptoriniai stiebai kitoje (7.24 pav.). Tai vyksta dar iki prisijungiant transliacijos EF-G veiksniui Perstūmimas Deacilinta trnr iki kito elongacijos ciklo pradžios turi būti pašalinta iš ribosomos, o peptidiltrnr perkelta iš A srities į P sritį, kartu persistumiant irnr molekulei ribosomos atžvilgiu tiksliai per vieną kodoną. Šis žingsnis yra paskutinis elongacijos cikle ir vadinamas perstūmimu. Perstūmime dalyvauja kitas elongacijos veiksnys nuo ribosomos priklausoma EF-G GTPazė. Kaip ir EF-Tu veiksnys, EF-G veiksnys prijungia GTP. Prisijungus EF-G ir GTP kompleksui prie ribosomos, vyksta GTP hidrolizė. Ribosomos didžiojo subvieneto trnr molekulių antikodonai juda 30S subvienete: deacilintos trnr antikodonas į E sritį, o peptidil-trnr antikodonas į P sritį (7.24 pav.) pav. Perstūmimas ribosomoje dalyvaujant EF-G veiksniui. Peptidinio ryšio susidarymas (a); ribosomos 30S subvienetas pasisuka, trnr molekulės užima tarpines padėtis (b); EF-G veiksnio prisijungimas ir GTP hidrolizė (c); ribosoma grįžta į pirminę padėtį, EF-G disocijuoja (d, e); 30S subvieneto padėties kitimas ribosomoje per elongacijos ciklą (f) (Nature, v. 461, p. 1234, 2009) 384

385 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) 30S subvienetas pasisuka 50S subvieneto atžvilgiu apie 6. Tada disocijuoja EF-G. Taigi per elongacijos ciklą ribosomos 30S suvienetas juda 50S subvieneto atžvilgiu lyg strektė (angl. ratchet). Ilgai manyta, kad nuo EF-G priklausomos GTP hidrolizės reikia būtent perstūmimui. Tačiau pakeitus GTP nehidrolizuojamu jo analogu, ribosomoje vyko vienas perstūmimo žingsnis, tiesa, lėčiau nei įprastai. Tai paliudijo, kad perstūmimo procesui GTP hidrolizės nereikia. Manoma, kad GTP hidrolizė reikalinga EF-G disociacijai iš ribosomos. EF-Tu ir EF-G veiksniai konkuruoja tarpusavyje dėl prisijungimo tame pačiame ribosomos GTPazės centre. EF-G bei EF-Tu su GTP ir aminoacil-trnr kompleksų erdvinės struktūros yra labai panašios. EF-G disociacija tuoj po GTP hidrolizės būtina, kad galėtų prasidėti kitas elongacijos ciklas, kurio pirmame žingsnyje reikia EF-Tu. Kiekvienai į polipeptidinę grandinę įjungtai naujai aminorūgščiai yra hidrolizuojama po dvi GTP molekules: viena prisijungus aminoacil-trnr molekulei, o kita perstūmimo metu. Dar du ATP fosfoanhidridiniai ryšiai suskaldomi prijungiant aminorūgštį prie trnr (aktyvinant trnr). Tokiu būdu vienam elongacijos ciklui įvykti ir prijungti vieną aminorūgštį prie polipeptidinės grandinės suskaldomi iš viso keturi fosfoanhidridiniai ryšiai. Elongacijos veiksniai EF-G ir EF-Tu yra G baltymai, jų sąveika su ribosoma yra susijusi su GTP prijungimu ir hidrolize. Kaip ir dauguma G baltymų, šie veiksniai patys pasižymi nedideliu GTPaziniu aktyvumu. EF veiksnių GTPazinį aktyvumą stimuliuoja ribosomos didžiojo 50S subvieneto sritis vadinamasis GTPazės centras (angl. GTPase center). Šioje srityje GTPazinių veiksnių aktyvumui stimuliuoti svarbi sąveika tarp ribosomos baltymo L11 ir konservatyvios 23S rrnr nukleotidų srities tarp nt. Pastarasis rrnr ir baltymo kompleksas yra vienas geriausiai ištirtų. Šį kompleksą atpažįsta tiazoliniai antibiotikai tiostreptonas ir mikrokocinas. Tiostreptonas negrįžtamai prisijungia prie šios srities ir stabdo GTP hidrolizę, kurią vykdo EF-G. Mikrokocinas prisijungia prie to paties komplekso ir stimuliuoja GTP hidrolizę. Dar vienas antibiotikas viomicinas nestabdo GTP hidrolizės, bet stabdo tuoj po hidrolizės vykstantį perstūmimą. Fusidinė rūgštis nestabdo GTP hidrolizės ir perstūmimo, tačiau neleidžia atsipalaiduoti EF-G ir GDP. Anksčiau aptarėme polipeptidinės grandinės sintezės ypatumus bakterijose. Eukariotinėje ląstelėje esminiai per transliaciją vykstantys procesai yra panašūs, tačiau transliacijos veiksnių yra daug daugiau, o transliacijos iniciacijos etapas kur kas sudėtingesnis. Reikia pastebėti, kad archėjose transliacijos elongacijos etapas šiek tiek skiriasi nuo prokariotų ir eukariotų, nes deacilintos trnr atsipalaidavimui iš ribosomos E srities reikia ne GTP, bet ATP hidrolizės, kurią vykdo aef3 veiksnys (žr. 7.3 lentelę) Transliacijos terminacija Peptido sintezė vyksta tol, kol ribosoma nepasiekia terminacijos kodono irnr molekulėje. Kai susidaro peptidinis ryšys, peptidil-trnr yra perkeliama iš ribosomos A srities į P sritį. Kai A srityje atsiduria irnr molekulės STOP kodonas (UGA, UAG arba UAA), jį tikrina EF-Tu, GTP ir aminoacil-trnr kompleksas, tačiau nesėkmingai, nes trūksta aminoacil-rnr, kurios kodonas būtų komplementarus vienam iš terminacijos kodonų (išskyrus jau aptartas supresorines trnr ir selenocisteino trnr). Šiuos kodonus atpažįsta ir prie jų prisijungia terminacijos veiksniai, kitaip paleidimo veiksniai, RF (angl. release factors) (7.25 pav.). 385

386 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Prokariotų ir eukariotų paleidimo veiksniai skirstomi į I ir II klases: z I klasės paleidimo veiksniai prisijungia prie STOP kodonų irnr; z II klasės paleidimo veiksniai pašalina I klasės paleidimo veiksnius. Bakterijose I klasės paleidimo veiksniai yra du: RF-1 ir RF-2. UAA (ochre) STOP kodoną atpažįsta abu veiksniai, UAG (amber) kodoną RF-1 veiksnys, UGA (opal) kodoną RF-2 veiksnys. Eukariotuose vienas paleidimo veiksnys erf1 atpažįsta visus šiuos STOP kodonus. Prokariotų ir eukariotų paleidimo veiksnių struktūra primena aminoacil-trnr molekulių struktūrą (7.26 pav.). RF-1 veiksnys turi aminorūgščių motyvą tripeptidą PXT (P prolinas, T treoninas, X bet kuri aminorūgštis), o RF-2 veiksnys tripeptidą SPF (S serinas, F fenilalaninas). Rentgenos pav. Transliacijos terminacijos bakterijose schema 386

387 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) truktūrine analize parodyta, kad RF-2 veiksnio SPF motyvas yra ribosomoje arti STOP kodono (7.27 pav., b). Kita RF-2 veiksnio sritis, kurioje yra tripeptidas GGQ, yra arti peptidiltransferazės centro. Siūloma, kad paleidimo veiksnio motyvų, esančių arti STOP kodono, aminorūgštys sąveikauja su pirmaisiais dviem kodono nukleotidais. I klasės paleidimo veiksniai keičia A srityje iškodavimo centre esančių 16S rrnr heterociklinių bazių G530, A1492 ir A1493 (E. coli) konformaciją. Heterociklinių bazių pokyčiai yra kitokie nei tie, kurie vyksta susidarant komple pav. Prokariotų ir eukariotų kai kurių transliacijos veiksnių erdvinės struktūros. Baltymų domenai, pasižymintys panašumu į trnr, parodyti (Cell, v. 108, p. 557, 2002) 7.27 pav. Transliacijos terminacija bakterijose. Peptidiltransferazinės ir terminacijos reakcijų palyginimas (a); paleidimo RF-2 veiksnio išsidėstymas ribosomoje. Parodyti baltymo GGQ ir SPF motyvai (b) (Nature, v. 454, p. 852, 2008) 387

388 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA mentariai kodono ir antikodono sąveikai iškodavimo metu. Kai ribosomos A srityje susidaro 70S ribosomos ir RF-1 arba 70S ribosomos ir RF-2 kompleksas, hidrolizuojamas esteris, esantis peptidil-trnr molekulėje, ir atsipalaiduoja susintetintas polipeptidas. Iš tikrųjų vyksta peptidinio ryšio sudarymas ne su kita aminorūgštimi, bet su vandens molekule (7.27 pav., b). Hidrolizei yra svarbus tripeptidas GGQ, esantis abiejų paleidimo veiksnių sudėtyje (7.26 pav., a). Tuoj po hidrolizės RF-1 arba RF-2 veiksnys atpalaiduojami iš ribosomos. Atpalaidavimui reikia RF-3 paleidimo veiksnio, kuris yra GTPazė. RF-3 prisijungia prie ribosomos su GDP. Tada GDP keičiamas į GTP, disocijuoja RF-1 arba RF-2 veiksnys, vyksta GTP hidrolizė, ir RF-3 paleidžiamas iš ribosomos (7.25 pav.). Ribosoma lieka komplekse su irnr ir deacilinta trnr P srityje. Šis kompleksas išardomas taip: prisijungus paleidimo veiksniui RRF ir EF-G elongacijos veiksniui, atsipalaiduoja 50S ribosomos subvienetas. Tam reikia GTP hidrolizės. IF-3 veiksnio reikia atpalaiduoti deacilintą trnr iš P srities. Atpažindama STOP kodonus ribosoma daro labai mažai klaidų. Priešlaikinių polipeptido hidrolizių ties prasminiais, o ne STOP kodonais, t. y. klaidų, pasitaiko ne dažniau kaip viena per įvykių. Tokį didelį tikslumą, manoma, lemia labai tiksli RF veiksnių ir RNR sąveika. Transliacijos tikslumas yra Kadangi daugelis baltymų sintetinami dideliais kiekiais, tokiu dažniu padaromos klaidos neturi įtakos ląstelės fenotipui. Ribosomai sintetinant baltymus įvyksta dviejų tipų klaidos. Pirmojo tipo transliacijos klaidos tai rėmelio poslinkis (angl. frameshift), kai ribosoma peršoka irnr per vieną nukleotidą. Tokio tipo klaidos vyksta maždaug 10 5 dažnumu. Antrojo tipo transliacijos klaidos įvyksta, kai ribosomai toleruojant nekomplementarią kodono ir antikodono sąveiką įjungiama neteisinga aminorūgštis. Tokio tipo klaidos vyksta maždaug 5 x 10 4 dažnumu. Šito tipo klaidų dažnis priklauso nuo ribosomos struktūros ir greičio. Nors aminoacil-trnr ir paleidimo veiksnių atranka yra labai tiksli, klaidų transliacijos metu vis dėlto pasitaiko. Jų padaugėja, kai trūksta maisto medžiagų, streso sąlygomis. Iškelta hipotezė, kad ribosoma galėtų jausti įjungtą neteisingą aminorūgštį, nes, įjungus tokią aminorūgštį ir įvykus peptidil-trnr perstūmimui į ribosomos P sritį, kitõs aminoacil-trnr ir paleidimo veiksnio atrankos tikslumas gana smarkiai sumažėja. Todėl ribosoma ima daryti daugiau klaidų, greičiau įvyksta priešlaikinė terminacija pasitelkus RF-1 veiksnį, ir susintetinamas pakitęs polipeptidas. Toks polipeptidas, greičiausiai, suardomas peptidazių, o ribosoma gali dalyvauti naujame transliacijos cikle. Tokioje savitoje terminacijoje dalyvauja ir RF-3 paleidimo veiksnys Baltymų biosintezė eukariotuose Dauguma baltymų biosintezės proceso eukariotuose bruožų panašūs į baltymų biosintezės prokariotuose, tačiau kai kurie įvykiai vyksta kitaip. Be to, transliacijoje dalyvauja daugiau baltyminių veiksnių. Eukariotų irnr molekulės yra monocistroniniai (vieno geno) transkriptai ir yra gerokai ilgesnės, nei jų koduojami polipeptidai. Vidutinis eukariotų irnr ilgis sudaro apie nukleotidų. irnr molekulės turi kepurę 5 gale ir poli (A) seką 3 gale. Netransliuojamą irnr seką 5 gale sudaro ~ 100 nukleotidų, o 3 gale net iki nukleotidų. 388

389 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) Eukariotų irnr transliacija prasideda iniciacija, kai iš 40S ir 60S subvienetų susimontuoja 80S ribosoma, kurioje iniciatorinė trnr (Met-iRNR i Met ) išdėstoma ribosomos P srityje ties irnr iniciacijos kodonu. Eukariotų irnr molekulės neturi sekų, panašių į prokariotų Šaino-Dalgarno sritis, kurios padeda tiksliai išdėstyti iniciacijos kodoną ribosomos P srityje. Per eukariotinių irnr molekulių transliaciją svarbų vaidmenį nustatant iniciacijos kodoną vaidina per brendimą modifikuoti irnr molekulių galai kepurės struktūra 5 gale ir poli (A) struktūra 3 gale. Pirmoji struktūra, kurią atpažįsta eukariotų transliacijos komponentai, yra kepurės struktūra, kurią turi visos eukariotų branduolio irnr ir dauguma eukariotų virusų irnr. Išsamiau aptarsime iniciacijos procesą eukariotuose Transliacijos iniciacija 80S ribosomai susimontuoti transliacijos inciacijos metu, kaip ir prokariotuose, reikia baltymų iniciacijos veiksnių. Eukariotai turi žymiai daugiau transliacijos iniciacijos veiksnių nei archėjos ir prokariotai šiuo metu jų skaičiuojama daugiau nei dešimt (7.3 lentelė). 7.3 lentelė. Transliacijos iniciacijos veiksniai prokariotuose, eukariotuose ir archėjose Eukariotų veiksniai Prokariotų veiksniai Archėjų veiksniai Funkcijos ir savybės eif1 IF-3 a-eif1 Užtikrina AUG kodono atpažinimo tikslumą eif1a IF-1 a-eif1a Met Stimuliuoja Met-tRNR i prijungimą prie 40S subvieneto eif2 a-eif2 Met Prijungia Met-tRNR i prie 40S subvieneto, GTPazė α Reguliuojamas fosforilinimu β Met Prijungia Met-tRNR i γ Met Prijungia GTP, Met-tRNR i eif2b eif2 veiksnio guanino nukleotidų pakeitimo veiksnys α Reguliuojamas fosforilinimu β Prijungia GTP γ Prijungia ATP δ Prijungia ATP ε Reguliuojamas fosforilinimu eif3 Met Lemia Met-tRNR i ir irnr prijungimą prie 40S subvieneto eif4a a-eif4a DEAD dėžutę turinti helikazė eif4b Lemia eif4a aktyvumą eif4e Prie kepurės prisijungiantis baltymas eif4f Prie kepurės prisijungiantis kompleksas, kurį sudaro eif 4A, 4E ir 4G veiksniai eif4g Baltymas tarpininkas, sąveikaujantis su daugeliu kitų baltymų eif4h Veiksnys, panašus į eif4b eif5 Dalyvauja atpažįstant AUG ir lemia eif2 GTPazinį aktyvumą eif5b IF-2 a-eif5b Met Subvienetų susijungimas, prokariotuose prijungia f-met-trnr f 389

390 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA Iniciatorinė trnr eukariotuose yra trnr i Met. Ji atskiriama nuo trnr Met dėl tam tam tikrų struktūrinių skirtumų. Pvz., mielių trnr i Met turi savitą tretinę struktūrą ir modifikuojama fosforilinant nukleotido, esančio 64 padėtyje, ribozės 2 OH grupę. Iniciacijos procesą sudaro šie etapai: Met z Pirmajame iniciacijos etape montuojantis iniciacijos kompleksui Met-tRNR i molekules prie mažojo 40S ribosomos subvieneto prijungia iniciacijos veiksnys eif2, kuris yra GTP Met prijungiantis baltymas. Susidaro stabilus trinaris eif2, GTP ir Met-tRNR i kompleksas (7.28 pav.). Kompleksas kartu su iniciacijos veiksniu eif3 prisijungia prie mažojo 40S ribosomos subvieneto, sudarydami 43S dydžio iniciacijos kompleksą. Taigi, kitaip nei prokariotų transliacijos iniciacijos metu, trinario komplekso prisijungimui prie ribosomos 40S subvieneto irnr molekulės nereikia pav. Transliacijos iniciacijos įvykiai eukariotuose 390

391 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) z Toliau 43S iniciacijos kompleksas prisijungia prie irnr molekulės 5 gale esančios kepurės struktūros (m 7 GpppN). Kad irnr kepurė būtų atpažinta, reikia, kad prie jos prisijungtų transliacijos veiksnys eif4f. Veiksnį sudaro trys baltymai: prie kepurės prisijungiantis baltymas eif4e; pastolių baltymas eif4g, kurio funkcija yra sujungti kitus komplekso baltymus; nuo RNR priklausoma helikazė eif4a (turinti DEAD dėžutę ir išskirianti RNR struktūras 5 gale). Nėra aišku, ar eif4f susimontuoja iki prisijungiant irnr ar baltymai atskirai jungiasi prie irnr 5 galo. Prie irnr 5 galo dar jungiasi eif4b veiksnys, kuris stimuliuoja eif4a helikazę. Poli (A) struktūra, esanti irnr 3 gale, skatina iniciacijos komplekso ties 3 galu susidarymą. Tam reikia PABP baltymo, kuris atrankiai prisijungia prie 3 galo. PABP sąveikauja su eif4g. irnr sudaro uždarą kilpą (7.28 pav.). Tokios struktūros funkcinė reikšmė dar nėra gerai suprasta. Transliacijos eif4e veiksnys tiesiogiai prisijungia prie kepurės struktūros irnr molekulėje ir, sąveikaudamas su eif4g veiksnio N galu, pritraukia prie irnr eif4f kompleksą. Komplekso komponentas veiksnys eif4a, kartu su veiksniais eif4b ir eif4h, kurie gali prisijungti prie RNR, manoma, veikia kaip helikazė ir išardo antrines struktūras, susidarančias netoli irnr 5 galo. Veiksnio eif4e aktyvumą stimuliuoja fosforilinimas. eif4e veiksnį fosforilina eif4f baltymų kinazė. Taigi, eif4e veiksnys yra transliacijos iniciacijos valdymo taikinys. Toks pats taikinys yra ir eif4g veiksnys, kuris gali būti suardytas (pvz., virusinės infekcijos metu). Kepurė 5 gale yra molekulinis žymuo, kurį atpažįsta eukariotų transliacijos iniciacijoje dalyvaujantys veiksniai. irnr, kuriose kepurė buvo pašalinta, in vitro nėra veiksmingai transliuojamos (organelių irnr transliacijai kepurės nereikia). Virusų irnr molekulės taip pat turi modifikuotą 5 galą, tačiau ne visos. zkitame etape 43S kompleksas juda išilgai irnr srities, vadinamos netransliuojamąja sritimi, UTR (angl. untranslated region), kol suranda ATG kodoną (daugelyje irnr jis būna pirmasis ATG kodonas už kepurės struktūros 43S komplekso kelyje). Manoma, kad ribosoma skenuoja irnr. Šiam procesui reikia ATP hidrolizės. Procese dalyvauja veiksniai eif1 ir eif1a (7.28 pav.). Suradus kodoną, susidaro komplementari sąveika tarp iniciatorinės trnr antikodono ir iniciacijos kodono. Tačiau vien komplementarios sąveikos nepakanka, kad ribosoma sustotų ties iniciacijos kodonu. Svarbi yra irnr molekulės sritis, esanti aplink iniciacijos kodoną, dar vadinama Kozak sritimi 2. Trys prieš iniciacijos kompleksą esantys purino nukleotidai ir G nukleotidas iš karto už jo (NNNPuNNAUGG, kur N bet kuris nukleotidas, Pu purinas) padidina transliacijos veiksmingumą ~ 10 kartų. Kas atsitinka, jeigu ribosoma, skenuodama ilgą netransliuojamąją irnr sritį (tokių pasitaiko neretai), sutinka AUG kodoną, kuris nėra iniciacijos kodonas? Yra du galimi veikimo būdai. Pirmu atveju, kadangi nukleotidai, supantys AUG kodoną, nėra tinkami stabdyti 43S kompleksą, jis juda tolyn. Antru atveju, ribosoma gali pradėti transliaciją, bet sustoti priėjusi tikrąjį iniciacijos kodoną ir pradėti sintezę iš naujo. 2 Srities pavadinimas kilęs nuo Merilinos Kozak (Marilyn Kozak) vardo. 391

392 MOLEKULINĖ BIOLOGIJA z Priėjęs iniciacijos kodoną ir ties juo prisijungęs, mažasis ribosomos subvienetas kartu su iniciacijos veiksniais sudaro 48S iniciacijos kompleksą. Iniciacijos veiksniai turi būti pašalinti prieš susimontuojant 40S, irnr ir Met-tRNR i kompleksui su 60S ribosomos subvienetu. Iniciacijos veiksniams disocijuoti ir 60S ribosomos subvienetui prijungti reikia GTP hidrolizės. Pakeitus GTP nehidrolizuojamu GTP analogu, iniciacija stabdoma susidarius 48S iniciacijos kompleksui. GTP, prisijungusio prie eif2 veiksnio, hidrolizę aktyvina eif5 veiksnys, atrankiai sąveikaujantis su eif2 ir eif3 veiksniais. eif5 stipriai prisijungia prie eif2, tačiau indukuoja GTP hidrolizę tik tada, kai eif2 yra prisijungęs prie 40S subvieneto. Įvykus GTP hidrolizei, eif2-gdp kompleksas disocijuoja. Manoma, kad GTP hidrolizė įvyksta tuojau pat, kai 48S preiniciacijos kompleksas, skenuodamas irnr, randa iniciacijos kodoną, ir susidaro kodono-antikodono sąveika. Tokiu būdu eukariotuose iniciacijos metu yra hidrolizuojamos dvi GTP molekulės: viena eif2 veiksnio, o kita eif5b. Prokariotuose iniciacijos metu IF-2 veiksnys hidrolizuoja vieną GTP molekulę. Eukariotų irnr 5 ir 3 galų struktūros kepurė ir poli (A) kartu stimuliuoja transliacijos veiksmingumą. Transliaciją eukariotuose valdo daugelis veiksnių. Pvz., hormonai ją stimuliuoja, o įvairios stresinės sąlygos, pvz., badavimas, temperatūrinis šokas, oksidacinis šokas, stabdo baltymų biosintezę. Transliacijos iniciacija valdoma, kaip minėta, ir fosforilinant kai kuriuos transkripcijos veiksnius. Susijungus didžiajam ir mažajam ribosomos subvienetams, iniciacijos veiksnys eif5b hidrolizuoja GTP ir yra paleidžiamas nuo 80S ribosomos IRES sritys ir jų ypatumai Daugelio eukariotų transliacijos iniciacija vyksta transliacijos preiniciacijos kompleksui (43S) skenuojant irnr. Tačiau egzistuoja ir kitokių transliacijos iniciacijos būdų. Jie 1988 m. aptikti tiriant pikorna virusų irnr transliaciją, vėliau nustatyti ir ląstelių irnr. 43S preiniciacijos kompleksas iš karto jungiasi prie irnr molekulės srities IRES (angl. internal ribosome entry site), kuri yra netoli iniciacijos kodono AUG (7.29 pav.). Vykstant transliacijos iniciacijai šiuo būdu nėra svarbi irnr kepurės struktūra 5 gale ir 3 galo struktūra. IRES sritys irnr sudaro savitą antrinę struktūrą, prie kurios jungiasi transliacijos preiniciacijos kompleksas. Mutacijos net vieno nukleotido pakaitos daro didelę įtaką sričių akty pav. Nuo IRES priklausoma transliacijos iniciacija 392

393 VII. BALTYMŲ BIOSINTEZĖ (TRANSLIACIJA) vumui smarkiai didina arba mažina gebėjimą inicijuoti transliaciją. IRES sričių atpažinimui ir jungimuisi prie jų reikia savitų veiksnių ITAF ų (angl. IRES trans-acting factors) (7.29 pav.). IRES sritys nustatomos tik pagal jų funkcionavimą numatyti IRES sritis irnr yra gana sudėtinga, jos nepasižymi konservatyvumu (išskyrus giminingų virusų irnr). Pagal tai, kokiu mechanizmu IRES sritys įtraukia ribosomą, išskiriamos kelios jų grupės. Ypatingą IRES sritį turi hepatito C viruso irnr. Ties ja iš karto prisijungia 40S ribosomos subvienetas, jungimuisi nereikia jokių iniciacijos veiksnių. Iniciacija vyksta kitaip nei kitų eukariotų irnr Poliribosomos Daugelio baltymų sintezė vidutiniškai trunka nuo kelių sekundžių iki kelių minučių. Bet netgi šiuo labai trumpu tarpsniu ties viena irnr molekule vyksta daug transliacijos iniciacijos įvykių. Tuoj po to, kai pirmoji ribosoma palieka iniciacijos kodoną, ties irnr 5 galu prisijungia kita. Pasitelkus vaizdinimo metodus transliuojamos irnr molekulės matomos kaip poliribosomos dideli irnr ir ribosomų kompleksai, kuriuose ribosomos išsidėsčiusios maždaug kas 80 irnr nukleotidų (7.30 pav.). Poliribosomose sintetinama žymiai daugiau baltymo molekulių. Tiek eukariotuose, tiek prokariotuose baltymų biosintezė vyksta poliribosomose. Bakterijose baltymų biosintezė įvyksta dar greičiau, nes ribosomos jungiasi ties irnr 5 galu, dar nepasibaigus jo transkripcijai. Eukariotuose transliacijos veiksmingumo problema sprendžiama kitaip: irnr molekulės 3 ir 5 galai, kaip minėta, yra priartinami vienas prie kito sąveikaujant su jais savitiesiems baltymams, tarp kurių yra ir transliacijos veiksniai. Taigi, irnr transliaciją ribosoma baigia arti 5 galo, ir čia gali vykti transliacijos reiniciacija pav. Transliacijos eukariotų poliribosomose schema (a) ir elektronine mikroskopija gautas poliribosomų vaizdas (b) (B. Alberts, A., Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter. The Molecular Biology of the Cell, fifth edition, 2007) 393