Proteomika ir augalų biotechnologijos. Dr. A. Ražanskienė Biotechnologijos institutas

Transcript

1 Proteomika ir augalų biotechnologijos Dr. A. Ražanskienė Biotechnologijos institutas

2 Bendra proteomikos sąvoka Proteomika tai sisteminė visų ląstelės ar audinio baltymų analizė tam tikru laiko momentu. Idealiu atveju ši analizė turi tuo pat metu charakterizuoti visus ląstelėje esančius baltymus bei nustatyti jų sąveikas. Charakterizuoti reiškia nustatyti baltymų sekas, tų baltymų lokalizaciją ląstelėje, jų postransliacines modifikacijas ir splaisingo variantus.

3 Bendra proteomikos eksperimentų schema: Mėginio paruošimas Baltymų frakcionavimas Baltymų identifikavimas Baltymų funkcinė analizė Šiuolaikiniai proteominiai metodai apima: Dvikryptę baltymų elektroforezę (2-DE) Vaizdo analizę Baltymų mikrosekvenavimą Masių spektrometriją

4 Augalinių mėginių ruošimas Kadangi augalai yra diferencijuoti organizmai, dauguma specializuotų funkcijų vykdoma tik tam tikruose audiniuose ir ląstelėse. Taigi augalinės medžiagos pasirinkimą nulems tai, kokią proteomą norima analizuoti. Augalai nėra patogi medžiaga baltymų skyrimui 2-DE. Baltymų kiekis sąlyginai mažas, didelę ląstelės dalį užima vakuolė, kuri pripildyta junginių, neigiamai veikiančių baltymų skyrimą ir frakcionavimą. Antriniai metabolitai: (fenilpropanoidai (pav. ligninas), terpenoidai (pav. giberelinas), flavonoidai (pav. pigmentai,) alkaloidai (pav. morfinas)), taip pat aliejiniai junginiai, kompleksiniai angliavandeniai, druskos visa tai trukdo analizei. Ląstelės sienelė yra kitas didelis trukdis, nes turi būti suardyta mechaniškai arba fermentų pagalba; abiem atvejais tai padidina mėginio užterštumą jos nuolaužomis. Šie reiškiniai lemia, kad sukurta daug skirtingų metodų baltymų skyrimui ir tirpinimui, ir kiekvieno skirtingo mėginio ruošimo atveju dažnai tenka taikyti keleto jų kombinacijas.

5 Augalinių mėginių ruošimas Pomidoro šaknų palyginamoji 2-DE analizė, naudojant skirtingus ekstrakcijos metodus I ir II geliams buvo naudotos dvi skirtingos variacijos vienos metodikos su TCA/Acetonu, III geliui naudotas fenolis. Gelių migravimo sąlygos identiškos.

6 Baltymų frakcionavimas 2D-PAGE dvikryptė elektroforezė Pirmiausia baltymai išfrakcionuojami ph gradiente pagal jų krūvį (first dimension isoelectric focusing (IEF)). Tam dažnai naudojami imobilizuoti ph gradientai (IPG) Po to baltymai išfrakcionuojami pagal molekulinę masę (second-dimension polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)) Gelis dažomas Coomassie, sidabro nitratu arba fluorescuojančiais dažais. 1D-PAGE vienkryptė elektroforezė Labiau negu 2D-PAGE tinka sunkiems baltymams: hidrofobiniams arba bazinio krūvio. Tačiau ir šiuo atveju patartina mėginį prieš elektroforezę išfrakcionuoti. BN-PAGE blue native elektroforezė Coomassie Blue G-250 (kuris rišasi su baltymais ir suteikia jiems neigiamą krūvį) pagalba baltymų kompleksai išskiriami pirmos krypties natyvioje elektroforezėje (BN-PAGE), o antros krypties denatūruojančioje elektroforezėje (SDS-PAGE) išsiskiria individualūs polipeptidai. Taip išaiškinami baltymų kompleksai (pav. mitochondrijos kvėpavimo grandinė ir chloroplasto fotosintezės kompleksas) Tiesioginė mėginio analizė MS tiesioginis baltymų identifikavimas iš suskaldyto proteaze mėginio. LC-MS/MS arba LC/LC-MS/MS (MudPIT Multidimentional Protein Identification Technology) mėginys prieš MS yra frakcionuojamas ir koncentruojamas

7 Baltymų frakcionavimas. Kiekybinis įvertinimas Gelių dažai. Augalų ekstraktuose skirtingų baltymų koncentracijos gali skirtis kartų. Lyginant proteomą skirtingomis sąlygomis svarbu ne tik kokybinės, bet ir kiekybinės baltymų variacijos. Todėl svarbu pasirinkti ne tik jautrų dažymo metodą, bet ir dažą su plačiu dinaminiu diapazonu. Koloidinis Coomassie. Detekcijos riba 5-10 ng. + nebrangus, suderinamas su MS - mažas jautrumas Sidabro nitratas. Detekcijos riba 0,5-2 ng. + jautrus - nesuderinamas su MS Fluorescuojantys dažai (SYPRO Ruby, Red ir Orange) + jautrumas prilygsta AgNO3, suderinami su MS - brangūs; gelių vizualizacijai reikalinga brangi įranga CyDye dažai. Fluorescencinio žymėjimo metodas 2D-DIGE (2D Fluorescence DIfference Gel Electrophoresis). Šiuo metodu abu analizuojami mėginiai pažymimi dviem skirtingomis CyDye žymėmis ir netgi galima naudoti trečią žymę pažymėti migravimo kontrolę. Visi trys mėginiai sumaišomi ir analizuojami IEF 2D- PAGE. Gautas gelis analizuojamas naudojant fluorescencinį skanerį su skirtingais filtrais. Tokiu būdu išvengiama problemų, susijusių su nevienoda migracija ir skanuoti vaizdai tiksliai persidengia.

8 2D-DIGE (2D Fluorescence DIfference Gel Electrophoresis) Šalčiu paveiktų Arabidopsis thaliana daigelių proteominė analizė: Cy3- kontroliniai augalai Cy5- šalčiu paveikti augalai Cy2 standartas (Cy2+Cy5)

9 Baltymų identifikavimas. MS - Masių spektrometrija MALDI (Matrix-Assisted LASER Desorbtion/Ionization). Plačiausiai naudojamas šis metodas, susietas su Time-Of-Flight masių spektrometru (MALDI-TOF). Geriausiai tinka iš gelio išskirtiems baltymams, kai analizuojamas nesudėtingas mėginys (3-4 baltymai). Šis metodas naudoja absoliučią kiekvieno peptido masę sudaryti baltymo peptidų pirštų atspaudams (PMF, peptide mass fingerprint) MALDI gautas mėginys gali būti toliau analizuojamas MS/MS ESI (ElectroSpray Ionization) peptidų tirpalas purškiamas ir paverčiamas garais, naudojant įtampą ir džiovinančias dujas. Į masių spektrometrą patenka pavieniai jonai. Pirmiausia sudaromas pradinis jonų masių sąrašas, po to pasirinkti jonai fragmentuojami tolesniai MS/MS analizei.

10 Proteominė post-transliacinių modifikacijų analizė Fosforilinimas In vivo žymėjimas P 32 Pro-Q diamond - specifinis fosforilintiems baltymams dažas IMAC (Immobilized metal affinity chromatography) su Fe 3+, Ga 3+ arba ZrO 2+ jonais, rišančiais fosfopeptidus. Glikozilinimas. N glikozilinimas (asparaginas) O glikozilinimas (Ser/Thr) GPI-AP (glycosylphosphatidyl-inositol anchored proteins). Inkaras prijungiamas prie subrendusio baltymo C galo ω taikinio. Naudojami lektinai, konkavalinas A, HILIC (Hydrophilic interaction liquid chromatography). GPI inkarui nustatyti naudojama GPI specifinė fosfolipazė C. Farnezilinimas. (Prie cisteino prijungiama C15 prenilo grupė). TAS - tagging-via-substrate. Ląstelės auginamos su azido farnezil difosfatu, po to azido-farnezilintiems baltymams išgaudyti naudojamas biotinilintas fosfino reagentas. N-galo modifikacijos. COFRADIC (combined fractional diagonal chromatography) dvi paeiliui identiškomis sąlygomis vykdomos chromatografijos, tarp kurių baltymai modifikuojami taip, kad pasirinkti (modifikuoti) peptidai užsilaikytų ir būtų atskirti nuo likusių, nemodifikuotų, peptidų.

11 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas Biocheminiai metodai baltymų tarpusavio sąveikai nustatyti Chromatografija. Sacharozės gradiento ultrafiltracija Natyvi elektroforezė Imunoprecipitacija

12 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas biocheminiais metodais Chromatografija. Paremta dydžių skirtumais, nes baltymų kompleksai didesni už pavienius baltymus. Pvz. Gel-filtracija. Paprastai dar kombinuojama su chromatografijos kolona, kur baltymai frakcionuojami pagal krūvį arba hidrofobiškumą. Afininė chromatografija. Plastocyanin-, ferredoxin-, cytochrome C- arba thioredoxin- afininė chromatografija.

13 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas biocheminiais metodais Natyvi elektroforezė. Paprastai naudojama schema: Natyvi pirmos krypties elektroforezė baltymų kompleksams atskirti. Blue-native/SDS-PAGE baltymai pirma paveikiami anijoniniu dažu Coomassie mėliu, kuris susiriša su baltymais ir suteikia jiems neigiamą krūvį. Antros krypties denatūruojanti elektroforezė atskirti baltymų kompleksų subvienetams.

14 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas biocheminiais metodais Sacharozės gradiento ultrafiltracija. Šiuo metodu buvo augaluose buvo išgryninti fotosistemos, oksidacinio fosforilinimo sistemos kompleksai ir labilūs kvėpavimo superkompleksai.

15 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas genetiniais metodais Mielių dviejų hibridų sistema Mielių trijų hibridų sistema Mielių vieno hibrido sistema Split-ubiquitin (nuskelto ubikvitino) sistema Bimolekulinė fluorescencijos komplementacija Forster io rezonenso energijos perdavimas (FRET) Inkarų prikabinimas baltymų kompleksams išgryninti

16 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas genetiniais metodais Mielių dviejų hibridų sistema Tipinėje dviejų hibridų sistemoje hibridinis baltymas sudarytas iš DNR surišančio domeno ir tiriamo baltymo ( jauko ) naudojamas pagauti grobiui, kuris randasi kažkur baltymų bibliotekoje, kurioje visi baltymai sulieti su transkripcijos aktyvatoriaus domenu. Kai grobis užkimba ant jauko, įvyksta reporterinio geno transkripcija.

17 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas genetiniais metodais Mielių trijų hibridų sistema Naudojama trinariams baltymų kompleksams, kai pav. baltymui X tam kad galėtų sąveikautu su baltymu Y dar reikalingas baltymo Z tarpininkavimas. Mielių vieno hibrido sistema Naudojama transkripcijos faktorių paieškai. Šiuo atveju jaukas yra promotorius, prie kurio jungiasi transkripcijos faktoriai, kuriuos norima nustatyti.

18 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas genetiniais metodais Mielių hibridų sistemos turi trūkumų, nes netinka daugumai DNR surišančių baltymų, transkripcijos aktyvatorių bei represorių, taip pat baltymams, kurių brendimui reikalingi citoplazminiai faktoriai. Netinka smarkiai hidrofobiškiems baltymams.visiems šiems atvejams gali būti naudojama nukirpto ubikvitino sistema. Split-ubiquitin (nuskelto ubikvitino) sistema. C-galinės ubikvitino dalies koduojanti seka sulieta su reporteriniu genu (hadhfr) ir baltymu Y. N-galinė ubikvitino dalis sulieta su kdnr biblioteka. Atranka vykdoma mielių ląstelėse, turinčiose ubikvitin-specifines proteazes, kurios atpažįsta tik sveiką ubikvitiną. Kai baltymai X ir Y sąveikauja, susiformuoja tarsi natyvus ubikvitinas, kuris nukerpamas. Ar tai įvyko, sprendžiama pagal hadhfr dydžio skirtumą, darant Western blotą su antikūnais prieš haemagliutininą. Ši sistema veikia ir citozolyje, ir plazminėje membranoje.

19 Baltymų tarpusavio sąveikos nustatymas genetiniais metodais Bimolekulinė fluorescencijos komplementacija Panašu į split-ubiquitin sistemą, tik naudojamas fluorescuojantis baltymas (pvz. GFP), kuris susijungia iš dviejų dalių, kai sąveikauja X ir Y baltymai. Leidžia matyti baltymų sąveiką ląstelėje in vivo. Forster io rezonanso energijos perdavimas (FRET) Nustatyti komplekso formavimuisi tarp baltymų, vienas iš jų suliejamas su donoru, o antras su akceptoriumi (pav. pora CFP(cian fluorecent protein) ir YFP (yelow fluorescent protein)). Transformavus augalus, baltymų sąveika gali būti stebima skirtingose vystymosi stadijose naudojant konfokalinę mikroskopiją. Inkarų prikabinimas baltymų kompleksams išgryninti His6, STREP, FLAG ir t.t.

20 Duomenų analizė Proteominių studijų sėkmė priklauso nuo dviejų aspektų: ar prieinamos tiriamo augalo kokybiškai nustatytos sekos ir gautų duomenų (PMF (peptide mass fingerprints) ar MS/MS) formato. PMF (peptide mass fingerprints). Kadangi šiuo metodu nenustatomos peptidų sekos, labai svarbu gautų masių tikslumas ir duomenų bazėse randamų sekų prieinamumas, t.y. ar nustatytas tiriamo augalo genomas. Jei nėra sekvenavimo duomenų, tenka lyginti su kitomis rūšimis ir duomenys tampa nelabai patikimi.

21 Duomenų analizė Nesant genominių duomenų, galima naudotis EST (Expressed Sequence Tags) programų duomenimis. Institute for Genomic Research (TIGR) suteikia galimybę naudotis daugiau nei 30 augalų rūšių EST duomenų bazėmis. Jei tiriamam augalui nėra nei genomo, nei EST duomenų, vienintelė išeitis yra naudoti MS/MS metodą.

22 Duomenų analizė. Augalų proteomikos duomenų bazės

23 Šiuolaikinės augalų proteomikos ribos Mėginyje, paruoštame iš viso audinio ar ląstelės, gali būti iki skirtingų baltymų Standartinis 2D-PAGE gelis išskiria iki baltymų dėmelių. Tik apie 500 iš šių dėmelių yra pakankamai didelės, kad būtų galima jas išskirti ir identifikuoti MS. Rezultatas : ištiriama tik 5% visų ląstelėje esančių baltymų. Tiesioginė baltymų analizė iš lizato, naudojant MudPIT efektyvesnė, bet net ir naudojant šį metodą ryžių proteomai nustatyti, buvo identifikuota tik 2000 ryžių baltymų. Kita problema labai plačios baltymų kiekio variacijos. Iš žalių audinių išskirtuose mėginiuose didžiausią baltymų dalį sudaro RuBisCO, dauguma kitų baltymų yra pagrindiniai metabolizmo fermentai ir struktūriniai baltymai. Todėl netgi tiriant atsako į stresą ar hormonus proteomas, stebimos tik šių baltymų kiekio variacijos, o įvairūs transkripcijos faktoriai lieka už detekcijos ribų.

24 Subląstelinė analizė Ląstelių frakcionavimas, organoidų atskyrimas sumažina mėginių kompleksiškumą, o taip pat padeda išskirti baltymus, kurie lokalizuoti kartu ir gali tarpusavyje sąveikauti.

25 Arabidopsis thaliana proteomikos projektas

26 Struktūrinė proteomika Arabidopsis thaliana proteomikos projektas CESG (The Center for Eukaryotic Structural Genomics, (Wisconsin)) įsteigtas vystyti masiniams baltymų struktūrų nustatymo metodams. Buvo pasirinktas Arabidopsis thaliana, nes projekto pradžios metu tai buvo didžiausias nustatytas eukariotinis genomas. Sintetinti baltymams CESG naudojo du būdus. Pirmiausia naudojant pusiau automatinius klonavimo metodus, 2200 Arabidopsis ORF buvo suklonuota į Gateway entry vektorius. Po to klonuoti ORF buvo ekspresuojami E. coli vektoriuose Paraleliai ORF buvo ekspresuojami kviečių daigų ekstrakto beląstelinėje sistemoje.

27 Arabidopsis thaliana proteomikos projekto schema ORF buvo ekspresuoti E. coli vektoriuose su inkarais baltymo amino galuose, padedančiais vizualizuoti ir išgryninti rekombinantinius baltymus. Naudojama autoindukcinė terpė inkorporuoti arba selenometioninui (X-ray difrakcinei analizei) arba 15 N ir 15 N+ 13 C (NMR (nuclear magnetic resonance analizei).

28 Arabidopsis thaliana proteomikos projekto schema ORF ekspresija kviečių daigų ekstrakto beląstelinėje sistemoje. Baltymų produkcijos ir skriningo etapai robotizuoti Per 4 metus išgryninta virš 300 baltymų (po daugiau nei 10mg kiekvieno). Baltymai skirti X-ray kristalografijai buvo automatizuotai išbandyti 192 kristalizacijos sąlygomis.

29 Arabidopsis thaliana proteomikos projektas. CESG išsprendė 47 Arabidopsio baltymų struktūras. 14 baltymų struktūros išspręstos NMR spektroskopija, 31 X-ray kristalografija ir 2 abiem metodais. Iki šiol priimami individualūs laboratorijų užsakymai spręsti baltymų struktūroms.

30 Augalų proteomika biotechnologijai Išpręsti pasaulyje opėjančiai maisto problemai augalų biotechnologija neišvengiama: Šiame šimtmetyje grūdų derlius turėtų būti padidintas 50%, kad išmaitinti augančią populiaciją Didėjantis druskingumas gresia smarkiai sumažėsiančiais dirbamos žemės plotais

31 Ryžių proteomikos projektas Ryžiai svarbus ir patogus objektas, nes: Ryžiai sudaro 23% pasaulyje suvartojamų kalorijų Patogus objektas genomas mažesnis, negu kitų javų (389Mb). Ryžių genomas nustatytas.

32 Ryžių proteomikos projektas Ryžių proteominė analizė Baltymai išskirti iš 23 ryžių audinių ir ir subląstelinių frakcijų. Visų mėginių proteominė analizė daryta pagal vienodą metodiką, todėl rezultatai tarpusavyje sulyginami. Identifikuota baltymai ir nustatyta 5676 baltymų amino r. seka. Panaudojant projekto duomenis, sukurta ryžių proteomos duomenų bazė (Rice Proteome Database), laisvai prieinama internete.

33 Ryžių proteomikos projekto metodika 2D-PAGE. Išskirti iš skirtingų mėginių baltymai išfrakcionuoti izoelektrinio fokusavimo geliuose (IEF) ph riboms ir linijiniuose imobilizuotuose ph gradientuose ph reikšmėms , po to išfrakcionuoti SDS-PAGE. Po dažymo Coomassie, vaizdai analizuoti Image-Master 2D programa. N galo a.r. sekoms Edmano sekvenavimo būdu gauti, baltymai buvo pernešami ant PVDF membranos ir detektuojami Coomassie dažymu. Vidinės amino r. sekos buvo gaunamos sekvenuojant peptidus, suskaldytus S. aureus V8 proteaze. Dėmės ir juostos išpjautos iš membranos ir sekvenuojamos dujinės fazės baltymų sekvenatoriumi. Masių spektrometrijai dėmės išpjautos iš gelio, baltymai suskaldyti tripsinu. Tripsininiai peptidai išskirti iš gelio ir jų masės nustatytos MALDI-TOF MS.

34 Ryžių proteomos duomenų bazė. Proteominė ryžių audinių analizė.

35 Ryžių proteomos duomenų bazė. Proteominė subląstelinė analizė.

36 Ryžių lapo lakšto baltymai, identifikuoti baltymų sekvenavimo ir MS būdu Ryžių augalų ūgis yra svarbus parametras augalo tvirtam laikymuisi žemėje ir derlingumui. Kadangi už augalo ūgį ryžiuose atsakingas lapo lakštas, augalo ūgis priklauso nuo jo augimo. Deja, lapo augimo reguliacijos mechanizmas nėra išaiškintas. 2D-PAGE profiliai rodo, kad lapo lakšte ekspresuojami calreticulinas ir calmodulino reguliuojamas baltymas. Abu šie baltymai dalyvauja kalcio signalo perdavime ir leidžia spėti, kad kalcis yra svarbus lapo augimui. Calreticulin a Bowman Birk protein inhibitora G-box binding factor 4a,Glutathione-dependent dehydroascorbate reductase 1 PET122 protein precursora Cu,Zn-SOD 1a ATP synthase subunits region ORF 5a,605 ribosomal protein Major capsid protein L1a \WSI18 protein ( C97454 rice callus cdna clonea Phospholipase A2a \Hypothetical protein Thaumatin-like protein precursora \Rice cdna partial sequence Cu,Zn-SOD 2a Cu,Zn-SOD 2a Cu,Zn-SOD 2a Cu,Zn-SODa Hypothetical proteina Glycine cleavage system H protein precursora,hypothetical protein Calmodulin-related proteina,hypothetical protein (\ Hypothetical 17.3-kDa protein a RuBisCO SSUa Mannose-binding rice lectin a SalT gene producta Mannose-binding rice lectin a

37 Proteomikos panaudojimas funkcinei įvairių poveikių analizei Streso poveikio analizė: Šalčio Sausros Druskingumo Ozono Grybinių patogenų Virusų Hormonų poveikio analizė Giberelino Brazinosteroidų Žasmoninės rūgšties Auksino Streso atsako kelių žinojimas ypač aktualus biotechnologijai. Dauguma sukurtų ir šiuo metu kuriamų transgeninių augalų turi padidintą atsparumą kuriam nors stresiniam faktoriui.

38 Proteomikos panaudojimas funkcinei šalčio streso analizei Arabidopsis thaliana daigai buvo stresuojami šalčiu. Baltymai frakcionuojami 2D- DIGE metodu. Nustatyta 22 dėmės, kurių intensyvumas bent dukart pasikeitė nuo poveikio šalčiu. 13 baltymų buvo identifikuota MALDI-TOF arba ESI-MS/MS

39 Proteomikos panaudojimas funkcinei šalčio streso analizei 4 iš nustatytų baltymų buvo jau anksčiau aprašyti kaip indukuojami šalčio. Tai patvirtina proteominių metodų efektyvumą, bet... Transkriptominiais metodais nustatyta, kad šaltis indukuoja kelis šimtus genų. Nors ir nesitikima visiško duomenų atitikimo, vis dėlto aišku, kad norint pasiekti transkriptominių metodų jautrumą, proteominiai metodai turi būti tobulinami ir baltymai kaip galima daugiau frakcionuojami pagal subląstelinę lokalizaciją, ph gradientuose ir t.t. Putative RNA-binding protein CP29 (Arabidopsis thaliana) At2g37220 Glycine-rich protein (Arabidopsis thaliana) 60S ribosomal protein (Arabidopsis thaliana) At2g27710 Putative major latex protein (Arabidopsis thaliana) Rieske protein (petc) (Arabidopsis thaliana) At4g03280 Putative S-adenosylmethionine synthase (Arabidopsis thaliana) At3g17390 Putative 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase (Arabidopsis thaliana) At1g09780 Putative 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase (Arabidopsis thaliana) At1g09780 Dehydrin (ERD 10) (Arabidopsis thaliana) At1g20450 Dehydrin (ERD 10 (Arabidopsis thaliana) At1g20450 Dehydrin (ERD 10) (Arabidopsis thaliana) At1g20450 Low-temperature-induced protein 78 (Arabidopsis thaliana) Hypothetical protein (Arabidopsis thaliana) b-1,3-glucanase 2 (Arabidopsis thaliana) At3g57260

40 Proteomikos panaudojimas funkcinei brazinosteroidų poveikio analizei Brazinosteroidai yra natūralūs augalų steroidai, pagal savo struktūrą panašūs į vabzdžių ir gyvūnų steroidinius hormonus. Egzogeninis brazinosteroidų poveikis augaluose sukelia įvairius atsakus: ląstelių proliferaciją, organų išlinkimą ir t.t. Manoma, kad BR veikia augalų augimą, reguliuodami genų ekspresiją, tačiau iki šiol identifikuota tik keletas jų reguliuojamų genų. BR sukelti genų ekspresijos pokyčiai ryžių daiguose buvo tirti paraleliai proteominiais metodais ir DNR mikrogardelių metodu, naudojant identišką modelinę sistemą (1M BR).

41 Proteomikos panaudojimas funkcinei brazinosteroidų poveikio analizei

42 Proteomikos panaudojimas funkcinei brazinosteroidų poveikio analizei Proteominio eksperimento ir kdnr mikrogardelės duomenys visiškai nepersidengia. Kodėl? Kai kurių baltymų kiekis per mažas, kad būtų galima juos detektuoti Coomassie dažymu 2D- PAGE? Eksperimentui naudota kdnr mikrogardelė apėmė 1265 genus, kas atitinka tik 4% visų ryžiuose prognozuojamų genų. Proteominiame eksperimente nustatyti baltymai nepapuolė įšią gardelę?

43 Proteomikos panaudojimas funkcinei analizei ir pritaikymas biotechnologijoje Atlikta nemažai palyginamosios proteomikos eksperimentų šalčio, sausros, atsparumo patogenams ir pan. atsakams tirti. Šių eksperimentų duomenys akumuliuojami ir nustatytų baltymų sąrašai ilgėja. Vis dėlto, kol kas šie eksperimentai dėl duomenų trūkumo dažnai lieka aprašomojo pobūdžio ir jų indėlis į augalų biotechnologiją kol kas nelabai apčiuopiamas, tačiau neabejotinai prognozuojamas.

44 Physcomitrella patens proteomika

45 Physcomitrella patens proteomika Physcomitrella patens patogus modelinis augalas: Genomo seka nustatinėjama Gali būti auginama bioreaktoriuje, taigi sąlygos idealiai atkartojamos Pasižymi nebūdinga aukštesniesiems augalams homologine rekombinacija, todėl yra puikus objektas genų/baltymų funkcijų nustatymui Naudojama biotechnologijoje heterologinių, tame tarpe glikozilintų baltymų ekspresijai. Sukurtos transgeninės samanos su humanizuotu glikozilinimu.

46 Physcomitrella patens proteomika Standartiniais proteominiais metodais, 2D-PAGE identifikuota apie 300 P. patens baltymų, 15% funkcija nežinoma. Vykdomi subląsteliniai proteominiai tyrimai. Signalinių kelių tyrimams, detektuoti baltymų fosforilinimui ir defosforilinimui sukurta fosfoproteomikos metodika, kuria identifikuota 250 samanų fosfopeptidų: C18 atvirkštinės fazės chromatografija Imobilizuota Fe3 metalo afininė chromatografija(imac), kapiliarinė electroforezė, LC-MS/MS MALDI-TOF-MS,

47

48 Kanapės proteomika

49 Kanapės proteomika Tikslas: nustatyti kanabinoidų sintezėje dalyvaujančius baltymus. Baltymai buvo ekstrahuojami iš liaukų, žiedų ir lapų, nes kanabinoidų kiekis šiuose organuose skiriasi ir net nežinoma, ar sintezė vyksta visur, ar tik liaukose, iš kurių kanabinoidai transportuojami į kitus audinius. Nors kanapės genomas nenustatytas ir nėra EST duomenų, buvo pasirinktas PMF (Peptide Mass Fingerprints) metodas ir duomenys lyginti su visomis žinomomis augalų sekomis. Lyginant lapų ir žiedų proteomas, nebuvo rasta nei vieno baltymo, kuris galėtų potencialiai dalyvauti kanabinoidų biosintezėje. Lyginant liaukų ir žiedų proteomas, kažkodėl nebuvo aptikti net ir jau žinomi kanabinoidų sintezės kelio baltymai. Autorių išvados: neturint genomo sekos MALDI-TOF metodas baltymų identifikavimui netinka, o taip pat tikėtina, kad kanabinoidų biosintezės baltymai ekspresuojami pernelyg silpnai, kad juos butų galima pamatyti 2D- E.

50 Augalų proteomika maisto technologijai Kviečiuose proteominiai metodai panaudoti nustatyti tirpiems putas formuojantiems baltymams. Tokie baltymai reikalingi stabilizuoti burbuliukams tešloje ir padidina duonos purumą. Buvo nustatyta, kad tešlos tirpalo putos yra praturtintos α-amilazės inhibitoriais, kurie greičiausiai ir yra didžiausią paviršiaus aktyvumą turintys baltymai.

51 Augalų proteomika maisto technologijai

52 Augalų proteomikos perspektyvos Pasaulyje randamos augalų rūšys...