2 ο Πανελλήνιο Συνέδριο «Σύγχρονες ιατροφικές Προκλήσεις για την Ασφάλεια και Ποιότητα των Τροφίµων Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων, Τµήµα Χηµείας, Σχολή Θετικών Επιστηµών-Πανεπιστήµιο Wageningen, Department of Agrotechnology and Food Sciences ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΟΡΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ LISTERIA MONOCYTOGENES ΣΕ ΚΟΤΟΠΟΥΛΟ ΣΟΥΒΛΑΚΙ ΜΕ ΠΙΠΕΡΙΑ Γιατράκου Bασιλική, Ντζιµάνη Aθηνά, Mejia Sosa Zeus, Zwietering Marcel,, και Σαββαΐδης Ιωάννης.
Εισαγωγή Η διασφάλιση της ποιότητας των τροφίµων αποτελεί ένα θέµα εξαιρετικής ικής σηµασίας για την δηµόσια υγεία, εφόσον σύµφωνα µε τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας [1] το 30% των κατοίκων των πόλεων υποφέρουν από µια τουλάχιστον τροφοδηλητηρίαση ετησίως [1]. Σύµφωνα µε τον Ευρωπαϊκό Οργανισµό Ασφάλειας Τροφίµων (EFSA( EFSA) ) [2],[ η Σαλµονέλωση και η Λιστερίωση κατέχουν την δεύτερη και πέµπτη θέση αντίστοιχα, στην κατάταξη των δέκα πιο συχνά εµφανιζόµενων ασθενειών ειών τροφικής προέλευσης. Η.Π.Α. :2500 άτοµα εµφανίζουν την κλινική νόσο ετησίως, από τα οποία τα 500 καταλήγουν [3] Ευρώπη: η συχνότητα εµφάνισης της Λιστερίωσης είναι 0,3 κρούσµατα ανά 10.000 άτοµα, µε τα περισσότερα να καταγράφονται στη ανία, το Βέλγιο, Β την Φιλανδία, τη Γερµανία και την Ολλανδία [2].[ Ελλάδα: Σύµφωνα µε το ΚΕ.ΕΛ.Π.ΝΟ καταγράφονται 0,3 κρούσµατα ανά 1.000.000 πληθυσµού, ετησίως [4]. Το συνολικό ποσοστό θνησιµότητας από Λιστερίωση κυµαίνεται µεταξύ 20-30%, 0%, και αφορά κυρίως τους ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς [5].
Listeria monocytogenes Xαρακτηριστικά γνωρίσµατα: 1.Gram Gram-θετικό ραβδόµορφο βακτήριο 2. Βήτα (beta)( beta)-αιµολυτικό, µη σπορογόνο βακτήριο 3.. Χαρακτηριστική κίνηση κατά την ανάπτυξη σε υγρό θρεπτικό υλικό και θερµοκρασία 20-25 25 ο C (tumbling motility),, κινείται µε τη βοήθεια βλεφαρίδων (actin( jet motility) Ανάπτυξη και Επιβίωση: Αναπτύσσεται σε ευρέα όρια θερµοκρασίας -1,5-45 ο C και ph 4,4-9,4! Πηγές: 1. Φύση (χώµα, σκόνη, νερό) 2. Τρόφιµα (µαλακά τυριά, παγωτά, προϊόντα κρέατος, ανάµεικτες σαλάτες νωπών λαχανικών, ωµά θαλασσινά, γεύµατα έτοιµα προς κατανάλωση) Ασθένειες: Λιστερίωση! Προκαλεί σοβαρή κλινική εικόνα στα νεογνά, στους ηλικιωµένους και στους ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς Συµπτώµατα: πυρετός, µυαλγίες, ναυτία ή διάρροια Επέκταση στο νευρικό σύστηµα: Κεφαλαλγία, δυσκαµψία αυχένα, Σύγχυση, σπασµοί
Χαρακτηριστικά του προϊόντος: Το Σουβλάκι κοτόπουλο µε πιπεριά είναι ένα προϊόν που έχει απήχηση στο καταναλωτικό κοινό γιατί: Είναι υγιεινό Έχει χαµηλά λιπαρά αλλά υψηλή πρωτεϊνική αξία Είναι εύπεπτο Είναι έτοιµο προς µαγείρεµα, εφόσον δεν απαιτεί καµία άλλη προετοιµασία (Ready-to to-cook) Cook). Η διαδικασία παραγωγής του γίνεται µε χειρωνακτικό τρόπο που περιλαµβάνει το πέρασµα µικρών τεµαχίων κοτόπουλου, µαζί µε τεµάχια πράσινης πιπεριάς σε ένα ξυλάκι, µε τελικό βάρος 100 ± 25 gr. Ωστόσο, η έλλειψη κατάλληλων µέτρων κατά την προετοιµασία του προϊόντος µπορεί να οδηγήσει στην επιµόλυνση του µε παθογόνα βακτήρια!
Μικροβιολογικοί κίνδυνοι του προϊόντος κατά την παραγωγή Μικροβιολογικός κίνδυνος Bacillus cereus Salmonella Esherichia coli Listeria monocytogenes Campylobacter Arcobacter Shigella Yersinia enterocolitica Vibrio Κοτόπουλο Πιπεριά Πολύ υψηλή πιθανότητα εµφάνισης Υψηλή πιθανότητα εµφάνισης Μέτρια πιθανότητα εµφάνισης Μικρή πιθανότητα εµφάνισης
Σκοπός της εργασίας Στην παρούσα µελέτη εκτιµήθηκε η πορεία της ανάπτυξης του παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes Scott A WT τόσο στο ολόκληρο προϊόν (κοτόπουλο σουβλάκι µε πιπεριά) ) όσο και στα επιµέρους συστατικά του (κοτόπουλο, πιπεριά) κατά την συντήρηση του υπό ψύξη (4 o C) ) για διάστηµα 8 ηµερών. Παράλληλα, εξετάστηκε και η µεταβολή της αυτόχθονης µικροχλωρίδας και στις τρεις µεταχειρίσεις: Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (Ο.Μ.Χ.) Ψευδοµονάδες Γαλακτικά βακτήρια Εντεροβακτήρια Ζύµες-Μύκητες Οι δειγµατοληψίες έγιναν αµέσως µετά τον ενοφθαλµισµό των δειγµάτων (0η ηµέρα) και µετά από 2,4,6,8 ηµέρες συντήρησης υπό ψύξη.
Υλικά και Μέθοδοι Οεµβολιασµός του προϊόντος µε Listeria monocytogenes Scot A WT έγινε ως εξής: 10 gr κοτόπουλο Μεταχείριση 1 0.1 ml 0.1 ml 10 gr πιπεριά Μεταχείριση 2 10 5 CFU/mL Listeria monocytogenes 0.1 ml 5grκοτόπουλο + 5 gr πιπεριά Μεταχείριση 3
Υλικά και Μέθοδοι L. monocytogenes Ο.Μ.Χ. Ζύµες-Μύκητες Ψευδοµονάδες Εντεροβακτήρια Γαλακτικά Agar Ottaviani Agosti (ALOA) Plate Count Agar (PCA) Rose Bengal Chloramphenicol agar (RBC) Cetrimide Fucidin Cephaloridine agar (CFC) Violet Red Bile Glucose agar (VRBGA) de Man Rogosa Sharpe agar (MRS Οι τρεις µεταχειρίσεις, µε το ενοφθαλµισµένο στέλεχος, διατηρήθηκαν εντός ψυγείου (4 ± 0.5 ºC)
L o g C F U /g 7 6 5 4 3 2 1 0 Πορεία ανάπτυξης της Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 κοµµάτια κοτόπουλου µίγµα κοτόπουλου και πιπεριάς Xρόνος συντήρησης (ηµέρες) πιπεριά Αρχική συγκέντρωση εµβολίου Από την 0η-8 η ηµέρα παρατηρήθηκε αύξηση του πληθυσµού της Listeria monocytogenes σε όλες τις µεταχειρίσεις η οποία ωστόσο δεν ήταν στατιστικά σηµαντική. Η αύξηση του πληθυσµού στο ολόκληρο προϊόν (κοτόπουλο+πιπεριά( ήταν της τάξης των 0,21 log CFU/g ενώ η αύξηση στη πιπεριά κυµάνθηκε στα ίδια επίπεδα (0,20 log CFU/g) O πληθυσµός του βακτηρίου στο κοτόπουλο εµφάνισε την µεγαλύτερη αύξηση από τις άλλες µεταχειρίσεις (0,6 log CFU/g) H L. monocytogenes Scott A που εµβολιάστηκε: σε νωπό κοτόπουλο αυξήθηκε κατά 0.68 log CFU/g την 5 η ηµέρα συντήρησης [6] σε άπαχα λουκάνικα από κρέας κοτόπουλου αυξήθηκε κατά 1,5 log CFU/g µετά από 14 ηµέρες συντήρησης υπό ψύξη [7].
Η ύπαρξη της πιπεριάς περιόρισε τον βαθµό ανάπτυξης της Listeria monocytogenes στο ολόκληρο προϊόν: Η πιπεριά είναι φυσική πηγή αντιοξειδωτικών τα οποία µπορούν να δράσουν και ως φυσικοί αντιµικροβιακοί παράγοντες Βιταµίνη C Bιταµίνη Α Βιταµίνες του συµπλέγµατος Β Καψαϊκινοείδή Η αυτόχθονη µικροχλωρίδα της φρέσκιας πιπεριάς παίζει σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της ασφάλειας και υγιεινής [8], [9], [10]. Απαρτίζεται κυρίως από Ψευδοµονάδες, τα Γαλακτικά βακτήρια και οι Ζύµες-Μύκητες Φαινόµενα ανταγωνισµού µεταξύ µικροοργανισµών αλλοίωσης και παθογόνων µικροοργανισµών Παράγουν ενώσεις (µεταβολίτες) που έχουν σηµαντική επίδραση ενάντια της ανάπτυξης των βακτηρίων Υπερτερούν στην εκµετάλλευση των θρεπτικών συστατικών Σιδεροφόρα που σχηµατίζουν χηλικά σύµπλοκα µε το σίδηρο Βακτηριοσίνες µε αντιµικροβιακή δράση
Μεταβολή της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας 12 10 L o g c f u / g 8 6 4 2 0 Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Χρόνος συντήρησης (ηµέρες) κοτόπουλο πιπεριά µίγµα κοτόπουλου και πιπεριάς (σουβλάκι) Η ΟΜΧ, ξεκινώντας από αρχικό πληθυσµό 6 log CFU/g, έφτασε τους 10 log CFU/g,, σηµειώνοντας σηµαντική αύξηση και στις τρεις περιπτώσεις Η ανάπτυξη της ΟΜΧ σε υψηλά επίπεδα είναι πιθανό να συντέλεσε στην βραδεία και µικρή ανάπτυξη του ενοφθαλµισµένου µικροοργανισµού Ένα προϊόν µε υψηλή αρχική µικροχλωρίδα (5-6 log CFU/g) ) είναι λιγότερο πιθανό να επιτρέψει τον πολλαπλασιασµό χαµηλών πληθυσµών παθογόνου από ένα τρόφιµο µε αρχική ΟΜΧ < 3 log CFU/g [11]
Μεταβολή των Ψευδοµονάδων L o g C F U /g 10 8 6 4 2 0 Ψευδοµονάδες 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Χρόνος συντήρησης (ηµέρες) κοτόπουλο πιπεριά µίγµα κοτόπουλου και πιπεριάς (σουβλάκι) Οι Ψευδοµονάδες,, ξεκινώντας από αρχικό πληθυσµό 5 log CFU/g κατέληξαν σε 9,75-9,7 9,76 log CFU/g για τις µεταχειρίσεις 1,3 και στους 9,23 log CFU/g για την µεταχείριση 2 (πιπεριά) Ο υψηλός πληθυσµός Ψευδοµονάδων στις τρεις περιπτώσεις είναι πολύ πιθανό να περιόρισε τον πολλαπλασιασµό της L.monocytogenes φαινόµενα ανταγωνισµού Η παραπάνω άποψη φαίνεται να συµφωνεί µε τα αποτελέσµατα της µελέτης των Neumeyer et al.. [12[ 12] ] και των Pin & Baranyi [13], όπου αναφέρεται η κυριαρχία των Pseudomonas spp., σε εµβολιασµένο και µη τρόφιµο, αλλά και σε µοντέλο τροφίµου (θρεπτικός ζωµός), κατά την συντήρησή τους αερόβια και υπό ψύξη.
Μεταβολή των Γαλακτικών βακτηρίων Log CFU/g 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Γαλακτικά βακτήρια 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Χρόνος συντήρησης (ηµέρες) κοτόπουλο πιπεριά µίγµα κοτόπουλου και πιπεριάς (σουβλάκι) Τα Γαλακτικά βακτήρια ακολούθησαν την ίδια τάση στις µεταχειρίσεις 1 και 3, παρουσιάζοντας αύξηση από τον αρχικό τους πληθυσµό (4.1 και 3.7, αντίστοιχα) σε τελικό πληθυσµό της τάξης των 8.0 log CFU/g,, την 8η ηµέρα συντήρησης. Στην περίπτωση της πιπεριάς,, τα Γαλακτικά βακτήρια, ξεκινώντας από 3.0 log CFU/g την 0η ηµέρα, παρουσίασαν µείωση από την 4η έως την 6η ηµέρα συντήρησης, καταλήγοντας ωστόσο στον ίδιο πληθυσµό µε τις άλλες µεταχειρίσεις την 8η ηµέρα συντήρησης. Σε παρόµοια έρευνα που έγινε σε λουκάνικα κοτόπουλου εµβολιασµένα µε L. monocytogenes [14] η υψηλή µικροχλωρίδα αλλοίωσης απαρτιζόταν κυρίως από: Γαλακτικά βακτήρια Ψευδοµονάδες Ανταγωνισµός µε L. monocytogenes
Ζύµες-Μύκητες και Εντεροβακτήρια Log CFU/g 8 7 6 5 4 3 2 1 0 κοτόπουλο πιπεριά µίγµα κοτόπουλου και πιπεριάς (σουβλάκι) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Χρόνος συντήρησης (ηµέρες) Οι πορείες ανάπτυξης των Ζυµών- Μυκήτων και των Εντεροβακτηρίων, παρουσίασαν του µικρότερους τελικούς πληθυσµούς από τα υπόλοιπα είδη βακτηρίων που εξετάστηκαν, και στις τρεις µεταχειρίσεις Συγκεκριµένα, οι Ζύµες-Μύκητες ξεκινώντας από 3,37 log CFU/g (µεταχείριση 1) και 4.4 (µεταχειρίσεις 2,3) κατέληξαν σε 5.4, 6.2 και 5.9 log CFU/g,, αντίστοιχα. Log CFU/g 7 6 5 4 3 2 Τα Εντεροβακτήρια κυµάνθηκαν από αρχικούς πληθυσµούς 4.0-5.5 log CFU/g σε τελικούς πληθυσµούς περίπου 6.0 log CFU/g,, την 8η ηµέρα συντήρησης. 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Χρόνος συντήρησης (ηµέρες)
Συµπεράσµατα Η πορεία ανάπτυξης της L. monocytogenes ακολούθησε αργό και σταθερό ρυθµό και στις τρεις µεταχειρίσεις. Συγκεκριµένα, στην περίπτωση της πιπεριάς αλλά και του µίγµατος πιπεριάς + κοτόπουλου,, που αποτελούν το συνολικό προϊόν, παρουσίασε τη µικρότερη αύξηση, υποδεικνύοντας ότι η πιπεριά εν µέρει κατάφερε να αναχαιτίσει την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Από όλα τα είδη µικροοργανισµών που εξετάστηκαν, οι Ψευδοµονάδες κυµάνθηκαν στα υψηλότερα επίπεδα ενώ τα Εντεροβακτήρια και οι Ζύµες- Μύκητες στα χαµηλότερα. Επίσης, η αυτόχθονη φυσική µικροχλωρίδα του προϊόντος έδρασε ανταγωνιστικά µε την L. monocytogenes,, διατηρώντας τον πληθυσµό του παθογόνου βακτηρίου λίγο µεγαλύτερο από τον αρχικά ενοφθαλµισµένο, ο, και στις τρεις µεταχειρίσεις. Ο τελικός πληθυσµός της Listeria monocytogenes δεν ήταν υψηλός ώστε να θεωρηθεί επικίνδυνη για την ασφάλεια του τροφίµου
Βιβλιογραφία 1) WHO,, 2002. Food safety and foodborne illness. World Health Organization Fact sheet 237, revised January ary 2002. Geneva. 2) European Food Safety Authority (EFSA), 2005. Zoonoses in the European Union. ISSN:1977-0499.Available from: http://www.efsa.europa.eu/efsa/report/efsa_zoonoses_2005_brochure_en.pd www.efsa.europa.eu/efsa/report/efsa_zoonoses_2005_brochure_en.pdf 3) Αmerican Academy of Pediatrics. Listeria monocytogenes infections (Listeriosis( Listeriosis). In: Pickering LK, ed Red BookQ 2003. Report of the Committee on Infectious Diseases, 26th ed, Elk E Grove Village, IL: American Academy of Pediatrics, 2003Q405-407. 407. 4) Kέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσηµάτων, Υπουργείο Υγείας και Κοινωνικής Αλληλεγγύης, 2007. Λιστερίωση: Ερωτήσεις και απαντήσεις για το κοινό. 5) Wareing P., Fernandes R., 2007. Micro-Facts, the working companion for food microbiologists, sixth edition. Surry, United Kingdom. Leatherhead Food International LTD. ISBN: 978-1-905224 905224-43-2. 6) Wimpfheimer L., Altman N.S. and Hotchkiss J.H., 1990. Growth of Listeria monocytogenes Scott A, serotype 4 and competitive spoilage organisms in raw chicken packaged under modified atmosphere and in air. International Journal of Food Microbiology,, 11, pp. 205-214. 214. 7) Mytle,, N., Anderson, G.L., Doyle M.P. and Smith M.A., 2006. Antimicrobial activity of clove (Syzgium( aromaticum) oil in ihibiting Listeria monocytogenes in chicken frankfurters. Food control,, 17, pp. 102-107. 107. 8) Nguyen-the, C., and Carlin, F., 1994. The microbiology of minimally processed fresh fruit and vegetables. es. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,, 34, pp. 371-401. 9) Liao,, C.H. and Felt W.T., 2001. Analysis of native microflora and selection of strains antagonistic to human pathogens on fresh produce. Journal of Food Protection,, 64, pp. 1110-1115. 1115. 10) Parish, M. L., Beuchat,, l. R., Suslow,, T.V., Harris, L. J., Garrett, E. H., Farbe,, J. N., 2003. Methods to reduce/eliminate pathogens from fresh and fresh-cut produce. Comprehensive Reviews of Food Science and Food Safety,, 2, pp. 161-173. 173. 11) Jay J.M., 1997. Do background microorganisms play a role in the safety of fresh foods? Trends in Food Science and Technology,, 8, 421-424. 424. 12) Neumeyer,, K., Ross, T., Thompson, G. T. and McMeekin T.A. (1997). Validation of a predictive model describing the effects of temperature and water activity on the growth of psychotropic p pseudomonads.. International Journal of Food Microbiology,, 38, pp. 55-63. 13) Pin C. and Baranyi J., 1998. Predictive models as means to quantify the interactions of spoilage organisms. International Journal of Food Microbiology,, 41, pp. 59-72. 14) Radin D., Niebuhr S.E. and Dickson J.S. (2006). Impact of the population of spoilage microflora on the growth of Listeria monocytogenes on Frankfurters. Journal of Food Protection,, 69, pp. 679-681. 681.
Σας Ευχαριστώ!