Μικροβιολογία Τροφίμων Παπαδοπούλου Όλγα

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Μικροβιολογία Τροφίμων Παπαδοπούλου Όλγα olga_papadopoulou@aua.gr olga_papadopoulou@outlook.com

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ

Φυσιολογία και πολλαπλασιασμός βακτηρίων: Τα βακτήρια (μονοκύτταροι μ/ο) πολλαπλασιάζονται με διχοτόμηση. Σε μικρό χρονικό διάστημα έχουμε παραγωγή μεγάλου αριθμού μ/ο Ο χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ δύο διαιρέσεων ονομάζεται «χρόνος γενεάς» (mean generation time) Διαφορετικός χ.γ. ανά είδος βακτηρίων

Η μικρoβιακή αvάπτυξη είvαι μια αυτoκαταλυτική διαδικασία η οποία απαιτεί την παρουσία ενός τουλάχιστον ζωντανού κυττάρου για να συμβεί. Όταν το μέσο ανάπτυξης είναι πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά και δεν υπάρχουν περιοριστικοί παράγοντες, οι μικροοργανισμοί θα πολλαπλασιάζονται και θα αυξάνουν σε αριθμό, ενώ ο ρυθμός ανάπτυξης θα αυξάνει όσο θα αυξάνει η βιομάζα όπoυ, dx/dt είvαι o ρυθμός της μεταβoλής της βιoμάζας, x o συνολικός αριθμός τωv κυττάρωv σε κάθε χρονική στιγμή t, και μ είvαι μια σταθερά γvωστή ως ειδικός ρυθμός αvάπτυξης.

x ln x e t = όπου, x o ο αριθμός των κυττάρων τη χρονική στιγμή o t=0 και x ο συνολικός αριθμός των κυττάρων σε κάθε x x o χρονική στιγμή t. από την οποία μπορούμε να υπολογίσουμε το χρόνο = t μιας γενεάς τ (generation time) θέτοντας ως x=2x o. Επομένως x= x 2 o t Η εκθετική φάση ανάπτυξης μπορεί να περιγραφεί συναρτήσει του χρόνου γενεάς Εκφράζοντας το μετρούμενο μικροβιακό πληθυσμό σε λογαριθμική κλίμακα (logn) και σχεδιάζοντας τη γραφική παράσταση του logn συναρτήσει του χρόνου, λαμβάνουμε μια καμπύλη σιγμοειδούς μορφής

Log N Στατική φάση ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μ Εκθετική φάση Φάση θανάτου Φάση προσαρμογής Χρόνος Τυπική σιγμοειδής καμπύλη ανάπτυξης μικροοργανισμού

H καμπύλη που περιγράφει την ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού, μπορεί να χωριστεί σε τρεις φάσεις: Στη φάση προσαρμογής (lag phase), Στην εκθετική φάση (exponential phase) και Στη στατική φάση (stationary phase). Με την περαιτέρω συσσώρευση τοξικών μεταβολιτών τα κύτταρα μπορεί να οδηγηθούν στο θάνατο (φάση θανάτου, death phase).

Πηγή: Jay et al., Modern Food Microbiology, 7 th edition.

Τυπική καμπύλη αύξησης βακητριακού κυττάρου Στατική φάση Εκθετική φάση αύξησης Φάση προσαρμογής

Πηγή: Bhunia et al. 2013. Fundamental Food Microbiology, 5 th edition.

Αύξηση των βακτηρίων

Τα βακτήρια συνεχίζουν να αυξάνονται και να διαιρούνται διπλασιάζοντας τον αριθμό τους κάθε λεπτό. Έτσι, στις 11:02 είναι 4 και στις 11:03 είναι 8.

Τα βακτήρια συνεχίζουν να διπλασιάζουν τον αριθμό τους κάθε λεπτό. Έστω ότι στις 12:00 η φιάλη έχει γεμίσει μέχρι επάνω.

Ερώτηση: Σε ποιο χρόνο η φιάλη ήταν μέχρι τη μέση γεμάτη με βακτήρια;

Ας υποθέσουμε ότι χρησιμοποιούμε 3 άλλες φιάλες λίγο πριν τις 12:00. Σε πόση ώρα θα γεμίσουν; 3 ώρες 30 min 15 min 2 min 1 min

Κινητικές παράμετροι μικροβιακής ανάπτυξης Χρόνος γενεάς ή διπλασιασμού (t d ) x t = x t / 0 2 t d ln x t = ln x + ln 2 o t t d t d = ln ln 2 t x ln t x o t d 0,3 t = log x log x t o Eίναι ο χρόνος που χρειάζεται για να διπλασιαστεί ο πληθυσμός ενός μικροοργανισμού

Κινητικές παράμετροι μικροβιακής ανάπτυξης Χρόνος γενεάς ή διπλασιασμού (t d ) - Άσκηση Ο πληθυσμός ενός βακτηρίου είναι 10 4 κύτταρα/ml και μέσα σε χρόνο 120 min αυξάνει σε 10 6 κύτταρα/ml. Ποιός είναι ο χρόνος διπλασιασμού; GT = log 0,3 t N log t N 0 = 0,3 120 6 4 = 18 min

Κινητικές παράμετροι μικροβιακής ανάπτυξης Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μ) N t = N 0 e ( t t 0 ) = 2,303 (log ( t t N t 0 log N ) 0 ) Nt: ο πληθυσμός σε χρόνο t μ: ειδικός ρυθμός αύξησης (h -1 ) N 0 : ο αρχικός πληθυσμός σε χρόνο t 0

Κινητικές παράμετροι μικροβιακής ανάπτυξης Σχέση μεταξύ t d και μ = ln(2) t d = ln Nt t ln t 0 N 0 = 0,693 t d

Άσκηση Ένα δείγμα κρέατος έχει αρχικό πληθυσμό 10 5 CFU/g (Gram αρνητικά ψυχρότροφα βακτήρια). Ο ειδικός ρυθμός αύξησης στους 5 C είναι 0.2. Υπολογίστε σε πόσες ώρες θα φτάσει ο πληθυσμός σε 10 7 td. CFU/g? Υπολογίστε την τιμή = 2,303 (log ( t t N t 0 log N ) 0 ) = 0,693 t d N 0 = 10 5 N t = 10 7 μ = 0.2 Τ 0 = 0 Τ = 23h t d =3.45

https://www.combase.cc/index.php/en/ ComBase: περιγραφή & πρόβλεψη πώς οι μικροοργανισμοί επιβιώνουν και αναπτύσσονται κάτω από μια ποικιλία συνθηκών που σχετίζονται με τα τρόφιμα

Προσδιορισμός κινητικών παραμέτρων κατά την βακτηριακή αύξηση

Προσδιορισμός κινητικών παραμέτρων κατά την επιβίωση των βακτηρίων

ΕΝΔΟΓΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΕΞΩΓΕΝΕΙΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΥΞΗΣΗ Mossel & Ingram: ιδέα ότι τα τρόφιμα αποτελούν οικοσύστηματα (ecosystems). Η ιδέα αυτή αποτέλεσε τον πρωτεύοντα άξονα για την ανάπτυξη της Μικροβιολογίας Τροφίμων. Τα οικοσυστήματα αποτελούνται από το περιβάλλον και τους οργανισμούς που ζουν μέσα σε αυτά

Η μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των χημικών, φυσικών, και δομικών πλευρών μιας βιοθέσης (niche) και της σύνθεσης (composition) του ειδικού μικροβιακού πληθυσμού που βρίσκεται σε αυτή (την βιοθέση) απασχολεί την μικροβιολογία τροφίμων. Τα τρόφιμα μπορεί να είναι ετερογενή σε μικρομετρική κλίμακα. Η ετερογενής σύνθεση σε ότι αφορά το μικροβιακό πληθυσμό, οι σχετιζόμενες βαθμιδώσεις σε ph, σε οξυγόνο και σε διαθέσιμες πρώτες ύλες, αποτελούν τους κύριους οικολογικούς παράγοντες που επηρεάζουν την αδρανοποίηση, επιβίωση και ανάπτυξη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα.

Τέσσερις είναι οι κατηγορίες των παραγόντων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα ενδογενείς παράγοντες εξωγενείς παράγοντες σχέσεις μεταξύ των μικροοργανισμών στα τρόφιμα (imlicit factors) παράγοντες της παραγωγικής διαδικασίας

Πηγή: Jay et al., Modern Food Microbiology, 7 th edition. Η γνώση των παραγόντων που ευνοούν ή περιορίζουν την αύξηση των μικροοργανισμών είναι σημαντική για την κατανόηση των αρχών που διέπουν την αλλοίωση και συντήρηση των τροφίμων

Παράγοντες που επηρεάζουν την αύξηση των μικροοργανισμών στα τρόφιμα Εξωτερικοί θερμοκρασία Ατμόσφαιρα (κενό, παρουσία άλλων αερίων) a w μικροβιακός πληθυσμός Εσωτερικοί δομή E h σύσταση ph μερική πίεση σχετική υγρασία

Οι ενδογενείς (εσωτερικοί) παράγοντες (intrinsic factors), που περιγράφουν τις φυσικοχημικές ιδιότητες των τροφίμων. 1. ph και ρυθμιστική ικανότητα του τροφίμου (ph and buffering capacity) 2. ενεργότητα νερού (water activity, a w ) 3. δυναμικό οξειδοαναγωγής (redox potential, E h ) 4. θρεπτικά συστατικά (nutrients) 5. αντιμικροβιακά συστατικά (antimicrobial constituents) 6. βιολογικές δομές (antimicrobial structures)

Οι εξωγενείς (εξωτερικοί - περιβαλλοντικοί) παράγοντες (extrinsic factors), που περιγράφουν τις εξωτερικές συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των τροφίμων. 1. θερμοκρασία (temperature) 2. σχετική υγρασία (relative humidity) 3. παρουσία και συγκέντρωση αερίων στο περιβάλλον (gaseous atmospheres) Οι συνδυαστικοί παράγοντες (implicit factors), που σχετίζονται με τις ιδιότητες των ίδιων των μικροοργανισμών και τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις (π.χ. συνέργεια και ανταγωνισμός), όπως αυτές καθορίζονται από το περιβάλλον μέσα στο οποίο βρίσκονται κατά την διάρκεια της ανάπτυξής τους.

Οι παράγοντες της παραγωγικής διαδικασίας (processing factors) ενός τροφίμου, που ανάλογα με το είδος τους επηρεάζουν είτε τις ενδογενείς, είτε τις εξωγενείς ιδιότητες ενός τροφίμου. 1. Τεμαχισμός (slicing) 2. Πλύσιμο (washing) 3. Συσκευασία (packing) 4. Ακτινοβόληση (irradiation) 5. Παστερίωση (pasteurization) ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Πλύση Ψύξη κατάψυξη Παστερίωση Κονσερβοποίηση Ξήρανση Αλάτισμα Οξίνιση Ακτινοβόληση Συσκευασία σε κενό ή τροποποιημένες ατμόσφαιρες Προσθήκη αντιμικροβιακών ουσιών Υπερηψηλή πίεση Καταστροφή των βλαστικών μορφών Αναστολή της ανάπτυξης των αλλοιογόνων μικροοργανισμών Αναστολή της ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών

ΕΝΔΟΓΕΝΕΙΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΥΞΗΣΗ μικροβιακός πληθυσμός a w E h Εσωτερικοί σύσταση δομή ph

Τι αφορούν και ποιοι είναι οι Ενδογενείς (intrinsic) παράγοντες ΤΡΟΦΙΜΟ ph

ph και ρυθμιστική ικανότητα του τροφίμου Το ph, μετρούμενο με ηλεκτρόδιο υάλου, είναι ίσο με τον αρνητικό λογάριθμο της ενεργότητας ιόντων υδρογόνου. Η ενεργότητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης και η σταθερά αναλογίας, ο συντελεστής ενεργότητας, προσεγγίζει τη μονάδα καθώς το διάλυμα γίνεται πιο αραιό. Έτσι: ph = log (a H ) = log 1/ (a H ) log 1/[H + ] όπου, (a H ) είναι η ενεργότητα ιόντων υδρογόνου και [H + ] η συγκέντρωση ιόντων υδρογόνου Η ανάπτυξη και ο μεταβολισμός των μικροοργανισμών συνδέεται άμεσα με την οξύτητα ή αλκαλικότητα του περιβάλλοντος στο οποίο αναπτύσσονται καθώς από αυτό εξαρτάται η σταθερότητα και η δραστηριότητα μακρομορίων, όπως τα ένζυμα και οι πρωτεΐνες. Τα βακτήρια αυξάνονται γρηγορότερα σε εύρος ph 6.0-8.0, οι ζύμες σε ph 4.5-6.0 και οι μύκητες σε ph 3.5-4.0

Τιμές ph διαφόρων προϊόντων 1 4 7 10

Τιμές ph διαφόρων τροφίμων Πηγή: Jay et al., Modern Food Microbiology, 7 th edition.

Σχετικός ρυθμός ανάπτυξης (growth rate) των μυκήτων ( _.._ ), ζυμών ( - - - ), ζυμωτικών βακτηρίων (... ), και αερόβιων βακτηρίων ( ).

Τιμές ph μερικών φρέσκων φρούτων και λαχανικών Προϊόν ph Προϊόν ph Σπαράγγια 5.7-6.1 Πατάτες 5.3-5.6 Φασόλια 4.6-6.5 Κολοκύθι 4.8-5.2 Ζαχαρότευτλο 4.2-4.4 Σπανάκι 5.5-6.0 Μπρόκολλο 6.5 Ντομάτες 4.2-4.3 Λαχαν. Βρυξελλών 6.3 Μήλα 2.9-3.3 Λάχανο 5.4-6.0 Μπανάνες 4.5-4.7 Καρότα 4.9-5.2 Σύκα 4.6 Κουνουπίδι 5.6 Γκρέϊπφρουτ 3 Σέλινο 5.7-6.0 Λεμόνια 1.8-2.0 Καλαμπόκι 7.3 Πεπόνια 6.3-6.7 Μελιτζάνα 4.5 Πορτοκάλια 3.6-4.3 Μαρούλι 6 Δαμάσκηνα 2.8-4.6 Ελιές 3.6-3.8 Καρπούζια 5.2-5.6 Κρεμμύδια 5.3-5.8 Σταφύλια 3.4-4.5 Δυόσμος 5.7-6.0

Τιμές ph γαλακτοκομικών, κρέατος, πουλερικών, αυγών και ψαριών Προϊόν ph Προϊόν ph Βούτυρο 6.1-6.4 Κοτόπουλο 6.2-6.4 Βούτυρο γάλακτος 4.5 Ψάρια 6.6-6.8 Γάλα 6.3-6.5 Μύδια 6.5 Κρέμα 6.5 Καβούρια 7 Τυρί 4.9-5.9 Στρείδια 4.8-6.3 Ασπράδι αυγού 8.5-9.0 Τόνος 5.2-6.1 Βοδινό κρέας 5.1-6.2 Γαρίδα 6.8-7.0 Ζαμπόν 5.9-6.1 Σολομός 6.1-6.3 Μοσχάρι 6

Επίδραση του ph στην μικροβιακή αύξηση Το ph στο εσωτερικό των κυττάρων είναι περίπου 7,0 με εξαίρεση π.χ. τα κύτταρα των ζυμών όπου η τιμή του ph είναι 5.8 Οι κυτταρικές μεμβράνες είναι αδιαπέρατες στα ιόντα Η+ και ΟΗ-, ενώ ταυτόχρονα έχουν μηχανισμούς για την αποβολή των ιόντων Η+ Οι μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται από διαφορετικές τιμές ph για ανάπτυξη: optimum maximum minimum Βακτήρια 6.0-8.0 9.0 4.5 Μύκητες 3.5-4.0 8.0-11.0 1.5-3.5 Ζύμες 4.5-6.0 8.0-8.5 1.5-3.5 Εξαίρεση στα βακτήρια είναι τα οξυγαλακτικά και οξικά βακτήρια που αναπτύσσονται σε άριστη τιμή ph 5,0-6,0

Επίδραση του ph στην μικροβιακή αύξηση Όταν οι μικροοργανισμοί βρίσκονται σε τιμές ph εκτός της άριστης τιμής αλλά εντός του εύρους ανάπτυξης (growth range) τότε τα ιόντα Η+ και ΟΗεπιδρούν στα εξωτερικά τμήματα του κυτταρικού τοιχώματος, αλλά δεν επηρεάζουν το εσωτερικό ph. Τιμές ph πάνω και κάτω από τη βέλτιστη (optimum) τιμή για ανάπτυξη επιδρούν σε: Στα ένζυμα (περμεάσες) που καθορίζουν την απορρόφηση θρεπτικών στοιχείων μέσω της κυτταρικής μεμβράνης Την παραγωγή εξωκυτταρικών ενζύμων και τη δραστικότητά τους Τον μηχανισμό παραγωγής ΑΤΡ στα βακτήρια Οταν το μικροβιακό κύτταρο εκτίθεται σε ακραίες τιμές ph τότε καταστρέφεται η κυτταρική μεμβράνη και τα ιόντα Η+ και ΟΗ- εισέρχονται στο κύτταρο και προκαλούν αποδόμηση των ενζύμων και νουκλεϊκών οξέων

Μηχανισμός δράσης των οξέων στο κύτταρο κυτταρόπλασμα ουδέτερο περιβάλλον Κυτ. μεμβράνη εξωκυτταρικός χώρος (Οξινο) H + + R - RΗ RΗ (ασθενές οξύ) Δράση ασθενούς οξέος (αδιάστατη μορφή) PMF = Δψ - 0.06 ΔpH

Διάχυση διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης Εσωτερικό lipid Ποια μόρια δεν εισέρχονται απευθείας; NH 3 salt Πολικά μόρια H 2 O Ιόντα (φορτισμένα) Άλατα, NH 3 Εξωτερικό sugar H 2 O Μεγάλα μόρια Άμυλο, πρωτείνες

Επίδραση του ph στους μικροοργανισμούς (Mode of action) + HA H + A Η σταθερά ισσοροπίας αυτής της διαδικασίας, K a, ορίζεται από το λόγο: K a = H A + HA ph = pk + log a A HA Η εξίσωση αυτή περιγράφει τη σχέση μεταξύ του ph ενός διαλύματος, της σταθεράς διάστασης και του βαθμού διάστασης ενός ασθενούς οξέος. Όταν το ph του διαλύματος εξισωθεί με τη σταθερά pk a, τότε ο λόγος [Αˉ] / [ΗΑ] = 1, δηλαδή το μισό οξύ βρίσκεται σε αδιάστατη μορφή. Για την ίδια τιμή ph η αντιμικροβιακή δραστηριότητα ακολουθεί την εξής σειρά: οξικό οξύ>γαλακτικό οξύ >κιτρικό οξύ.

Μηχανισμός δράσης των οξέων στο κύτταρο πλασματική μεμβράνη Δράση ασθενούς οξέος (αδιάστατη μορφή)

Μεταφορά Η + μέσω αντλίας πρωτονίων ATP + EXTRACELLULAR FLUID + H + H + H + Αντλία πρωτονίων Διαμεμβρανική πρωτεΐνη + H + H + Κυτταρόπλασμα + H +

Τρόποι διάχυσης μέσω της κυτταρικής μεμβράνης Απλή διάχυση Διευκολυνόμενη διάχυση Ενεργή μεταφορά ATP

Τιμές pka των κυριότερων οξέων και ποσοστό (%) αδιάστατου οξέος σε σχέση με το ph Συντηρητικό pka ph 3.5 4.5 5.0 Οξικό 4.75 95% 63% 35% Κιτρικό 3.14 30% 4.1% 1.3% Γαλακτικό 3,86 15% 1.7% 0.5% Τρυγικό 2.98 23% 2.9% 0.9% Βενζοϊκό 4.19 83% 33% 13% Προπιονικό 4.87 96% 70% 43% Σορβικό 4.75 95% 65% 37%

ΑΣΚΗΣΗ Σε ένα τρόφιμο με σχετικό χαμηλό ph (π.χ. 4.5) για να παρεμποδίσετε έναν παθογόνο μικροοργανισμό μπορείτε να χρησιμοποιήσετε λεμόνι ή ξύδι. Ποιο από τα δύο θα επιλέξετε; Ποσοστό αδιάστατου οξέως (α%): 1 a% = 1+ 10 ph pk a Λεμόνι (κιτρικό οξύ) pka = 3.14 Αδιάστατο 4% Ξύδι (οξικό οξύ) pka = 4.75 Αδιάστατο 64%

Ταξινόμηση των τροφίμων με βάση το ph Οξινα τρόφιμα: ph 4,5. Δεν επιβιώνουν οι παθογόνοι μικροοργανισμοί. Η παστερίωση είναι ικανοποιητική στην περίπτωση των όξινων τροφίμων. Για ph 4,5, χρειάζεται αποστείρωση για την καταστροφή των παθογόνων μικροοργανισμών.

Πηγή: Bhunia et al. 2013. Fundamental Food Microbiology, 5 th edition.

ΑΣΚΗΣΗ

Τεχνολογική και πρακτική σημασία του ph Το ευνοϊκότερο (optimum) εύρος ανάπτυξης των μικροοργανισμών βρίσκεται μεταξύ 2-3 μονάδων ph. Η έκθεση μικροοργανισμών εκτός αυτών των ορίων επηρεάζει την ανάπτυξη και την επιβίωσή τους (κύτταρα εκτιθέμενα σε ph εκτός των ορίων ανάπτυξης στην πραγματικότητα ανενεργοποιούνται) Οι μύκητες και οι ζύμες παρουσιάζουν μεγαλύτερο εύρος αντοχής σε ph όταν συγκρίνονται με τα βακτήρια (η ρύθμιση του ph στα τρόφιμα είναι πιο αποτελεσματική στον έλεγχο των βακτηρίων σε σύγκριση με τις ζύμες και τους μύκητες) Βακτήρια που μπορούν να ζυμώνουν δείχνουν μια μεγαλύτερη αντοχή σε χαμηλότερα επίπεδα ph από το ευνοϊκότερο. Αντίθετα, η αντοχή αυτή δεν ισχύει για υψηλότερες τιμές (από του ευνοϊκότερου) ph. Επίσης, τα βακτήρια που ζυμώνουν φαίνεται ότι είναι ανθεκτικότερα σε χαμηλότερο ph από ότι τα βακτήρια που διαθέτουν αερόβια αναπνοή (με την εξαίρεση του γένους Acetobacter)

Ερώτηση? Ποιο τρόφιμο αλλοιώνεται γρηγορότερα το κρέας ή το ψάρι; Το ph του μυϊκού ιστού είναι 5,5-5,6 σε κατάσταση νεκρικής ακαμψίας (post rigor) ενώ στο ψάρι είναι 6,2-6,5. Το γεγονός αυτό συμβάλει στη διατήρηση του κρέατος για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Επίσης, ο κυριότερος αλλοιωγόνος μικροοργανισμός των ψαριών, η Shewanella (πρώην Alteromonas), που είναι ευαίσθητη σε χαμηλό ph, δεν έχει αναφερθεί στο κρέας (ph < 6,0).

Τι αφορούν και ποιοι είναι οι Ενδογενείς (intrinsic) παράγοντες a w ΤΡΟΦΙΜΟ

Τι είναι η Ενεργότητα Νερού (a w ) Μια από τις πιο παλιές μεθόδους συντήρησης των τροφίμων είναι η ξήρανση Η συντήρηση των τροφίμων με ξήρανση είναι άμεσο επακόλουθο της απομάκρυνσης ή δέσμευσης της υγρασίας χωρίς την οποία οι μικροοργανισμοί δεν μπορούν να αναπτυχθούν Η διαθεσιμότητα του νερού για μικροβιακή αύξηση χαρακτηρίζεται από τον όρο «ενεργότητα ύδατος» (water activity)

Τι είναι η Ενεργότητα Νερού (a w ) Ως ενεργότητα νερού ορίζεται η παράμετρος που εκφράζει την ποσότητα νερού στο τρόφιμο που είναι διαθέσιμη για τις ανάγκες αύξησης των μικροοργανισμών. Το κυτταρόπλασμα είναι ένα υδατικό περιβάλλον στο οποίο εκτελούνται όλες οι μεταβολικές διεργασίες του κυττάρου. Μέσω της κυτταρικής μεμβράνης μορίων νερού με το περιβάλλον γίνεται συνεχής ανταλλαγή

Ενεργότητα νερού (a w ) To νερό είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Το μικροβιακό κύτταρο περιέχει πάνω από 75% νερό. Οι λανθάνουσες μορφές (π.χ. σπόρια) έχουν 15% με σκοπό τον περιορισμό της. Η παρουσία του νερού στο περιβάλλον δεν σημαίνει απαραίτητα ότι αυτό είναι διαθέσιμο για μικροβιακή ανάπτυξη. Το νερό δεσμεύεται από: Παρουσία διαλυμένων ουσιών (solutes) (π.χ. αλάτι, σάκχαρα) Προσθήκη υδρόφιλων ουσιών (water-binding) (π.χ. πηκτίνες) Κατά την ψύξη του νερού (freezing)

Δέσμευση του νερού από την παρουσία διαλυμένων ουσιών (π.χ. αλάτι) Ελεύθερο μόριο νερού Αέρας Νερό

Δέσμευση του νερού από την παρουσία διαλυμένων ουσιών (π.χ. αλάτι) Μόριο ύδατος δεσμευμένο Αέρας Νερό _ Μικρότερη τιμή ενεργότητας ύδατος + + + +

Ορισμός ενεργότητας νερού (a w ) α w = p/ p o p = πίεση ατμών του διαλύματος p o = πίεση ατμών του διαλύτη σχέση με σχετική υγρασία: RH = 100 x α w νερό α w = 1 α w < 0.61 δεν υπάρχει μικροβιακή αύξηση

Ορισμός ενεργότητας νερού (a w )

Χαρακτηριστικές τιμές a w για τους μικροοργανισμούς Η ενεργότητα ύδατος των νωπών τροφίμων είναι > 0,99 Τα περισσότερα αλλοιωγόνα βακτήρια δεν αυξάνονται σε τιμές < 0,91 Οι μύκητες μπορεί να αυξηθούν σε ενεργότητα ύδατος μέχρι 0,80 Το παθογόνο βακτήριο Staphylococcus aureus αυξάνεται και μέχρι 0,86 Το βακτήριο Clostridium botulinum δεν αυξάνεται κάτω από 0,94 Οι ζύμες και οι μύκητες αναπτύσσονται σε μεγαλύτερο εύρος ενεργότητας νερού σε σχέση με τα βακτήρια Σε ορισμένη θερμοκρασία, η ικανότητα των μικροοργανισμών για αύξηση μειώνεται όσο μειώνεται η ενεργότητα ύδατος Η περιοχή της ενεργότητας ύδατος στην οποία σημειώνεται αύξηση είναι ευρύτερη όσο η θερμοκρασία είναι ιδανική για αύξηση Η παρουσία θρεπτικών συστατικών αυξάνει το εύρος της ενεργότητας ύδατος που επιβιώνουν οι μικροοργανισμοί

Ενεργότητα ύδατος (a w ) Οι τεχνικές συντήρησης που βασίζονται στην αφυδάτωση, συμπύκνωση και κατάψυξη σκοπό έχουν να καταστήσουν το νερό μη διαθέσιμο από τους μικροοργανισμούς. ΑΣΚΗΣΗ: Προσδιορίστε την ενεργότητα ύδατος διαλύματος που περιέχει 200 γραμ NaCl σε 100 ml νερό. w a w m w = W + m M w = το βάρος του διαλύτη W = το βάρος της διαλυμένης ουσίας m = το μοριακό βάρος του διαλύτη Μ = το μοριακό βάρος της διαλυμένης ουσίας

Ενεργότητα νερού (aw) a w = 100 100 18 200 + 18 58.442 = 0.62 Σε αυτή την τιμή ενεργότητας νερού λίγοι μικροοργανισμοί μπορεί να αναπτυχθούν. Είναι όμως αυτό σωστό ; Ας πάρουμε σαν παράδειγμα μία μαρμελάδα με 66 γρ. σακχαρόζη στα 100 γρ. Σύμφωνα με τα παραπάνω η ενεργότητα νερού είναι 0.90. Στην πραγματικότητα όμως είναι 0.80. Που οφείλεται η διαφορά; Η διαφορά οφείλεται στην παρουσία πηκτίνης στην μαρμελάδα, η οποία απορροφά σημαντική ποσότητα νερού και μειώνει ακόμη περισσότερο την τιμή της ενεργότητας νερού.

Ενεργότητα νερού (aw) Προσοχή: Τρόφιμα με χαμηλή αλατοπεριεκτικότητα είναι δυνατόν να χαρακτηρίζονται από χαμηλή τιμή ενεργότητας νερού. Στο αλατισμένο βούτυρο, που περιέχει 2-3% NaCl, η αναμενόμενη τιμή ενεργότητας νερού κυμαίνεται μεταξύ 0.993-0.989. Το τρόφιμο όμως αυτό είναι γαλάκτωμα νερού σε έλαιο και συνεπώς το NaCl ως πολική ουσία θα βρίσκεται διαλυμένο στην υδατική φάση, δίνοντας συγκέντρωση NaCl περίπου 18%. Συνεπώς η πραγματική τιμή ενεργότητας νερού, όσον αφορά την μικροβιακή αύξηση στην υδατική φάση είναι 0.86.

Επίδραση του a w στους μικροοργανισμούς Το νερό μεταφέρεται από και προς το μικροβιακό κύτταρο διαμέσου της ημιπερατής κυτταρικής μεμβράνης, μέσω του φαινομένου της όσμωσης. Το νερό μεταφέρεται από το αραιότερο προς το πυκνότερο μέσο. Εάν η συγκέντρωση των διαλυμένων ουσιών στο περιβάλλον αυξηθεί τότε το νερό μετακινείται από το εσωτερικό του κυττάρου στο μέσον εναιώρησης (ή τρόφιμο) Το υπερωσμωτικό σοκ οδηγεί σε απώλεια νερού από το κυτταρόπλασμα (συρρίκνωση κυττάρου). Τα κύτταρα αποκρίνονται μέσω της συσσώρευσης διαλυτών ουσιών στο κυτταρόπλασμα, με σκοπό την επανάκτηση του νερού και αποκατάσταση του όγκου τους. Σαν αποτέλεσμα το μικροβιακό κύτταρο συρρικνώνεται εάν η οσμωτική πίεση υπερβεί την οσμω-ρυθμιστική του ικανότητα, με αποτέλεσμα τη μείωση της μεταβολικής δραστηριότητας.

Επίδραση του a w στους μικροοργανισμούς Το γενικό αποτέλεσμα της ελάττωσης της a w κάτω από την ιδανική τιμή είναι η επιμήκυνση του χρόνου προσαρμογής και η ελάττωση του ρυθμού αύξησης και της συγκέντρωσης του τελικού μικροβιακού πληθυσμού. Αν τα κύτταρα καταφέρουν να ελέγξουν την απώλεια νερού, η σύσταση του κυτταροπλάσματος μπορεί να μην είναι πλέον ευνοϊκή για τη διεξαγωγή των βιοχημικών αντιδράσεων, επάγοντας μεταβολικές διαταραχές που δημιουργούν μεγαλύτερο στρες στο κύτταρο. Η επίδραση της χαμηλής a w στις διατροφικές απαιτήσεις των μικροοργανισμών είναι πολύ σημαντική (οι λειτουργίες των μικροοργανισμών που απαιτούν ένα υδατικό μέσο, σταδιακά σταματούν). Εκτός από την επίδραση στα θρεπτικά συστατικά, η χαμηλή a w επιδρά στη λειτουργικότητα της κυτταρικής μεμβράνης

(0.85% salt)

Ελάχιστες τιμές a w για την αύξηση ομάδων μικροοργανισμών Ομάδα μικροοργανισμών -------------------------------------------------------------- Gram αρνητικά βακτήρια 0.97 Gram θετικά βακτήρια 0.90 Ζύμες 0.88 Μύκητες 0.80 Αλόφιλα βακτήρια 0.75 Ξηρόφιλοι μύκητες 0.61 α w

Ταξινόμηση μικροοργανισμών με βάση την τιμή του a w Ξηρόφιλοι (Xerophiles): Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται μύκητες και ιδιαίτερα μία κατηγορία μυκήτων που μπορεί να αλλοιώσει αποξηραμένα και παστά τρόφιμα, κύριος εκπρόσωπος των οποίων είναι ο Xeromyces bisporus. Δεν αναπτύσσονται σε τιμές a w 0.85-0.90 > 0.96 και το άριστο εύρος είναι από Αλόφιλοι (Halophiles): Στην κατηγορία αυτή ανήκουν μικροοργανισμοί που χρειάζονται ιόντα νατρίου στο περιβάλλον για την ανάπτυξή τους. Διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: - Μέτρια αλόφιλους (moderate halophiles): αναπτύσσονται σε συγκεντρώσεις άλατος μέχρι 10%, π.χ. Vibrio parahaemolyticus αναπτύσσεται σε εύρος 1-8%, με άριστη τιμή 2-4% - Εξαιρετικά αλόφιλους (extreme halophiles): Τυπικό παράδειγμα είναι το Halobacterium salinarum που προκαλεί αλλοίωση στα παστά ψάρια. Αναπτύσσεται σε συγκεντρώσεις άλατος 12-36% (aw 0.928-0.76), με άριστη τιμή 25% NaCl (aw 0.80)

Ταξινόμηση μικροοργανισμών με βάση την τιμή του a w Αλοανθεκτικοί (Halotolerant or haloduric): Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις άλατος χωρίς όμως να χαρακτηρίζονται από ειδικές απαιτήσεις άλατος. Τυπικό παράδειγμα είναι ο Staphylococcus aureus που μπορεί να αναπτυχθεί μέχρι 20% NaCl (a w 0.83) με άριστο εύρος 0.5-4%, μπορεί όμως και να αναπτυχθεί απουσία άλατος.

Ταξινόμηση μικροοργανισμών με βάση την τιμή του a w Οσμώφιλες ζύμες (Osmophilic yeasts): Ο όρος αναφέρεται σε ζύμες που αναπτύσσονται σε υψηλές συγκεντρώσεις ζάχαρης. Κύριος εκπρόσωπος είναι η ζύμη Saccharomyces rouxii (Zygosaccharomyces rouxii) που αναπτύσσεται σε συγκεντρώσεις ζάχαρης 70% και άνω (a w 0.62), και όχι μικρότερες από 20% (a w 0.986) Οσμωανθεκτικές ζύμες (Osmotolerant): Στην κατηγορία αυτή υπάγονται ζύμες που αναπτύσσονται σε συγκεντρώσεις ζάχαρης μέχρι 60% με κύριο εκπρόσωπο τον Saccharomyces cerevisiae.

Η χαμηλή a w στη συντήρηση των τροφίμων H συμπύκνωση - ξήρανση ή η προσθήκη μεγάλων ποσοτήτων οσμωτικά ενεργών ουσιών όπως αλατιού και ζάχαρης ελαττώνουν την a w και χρησιμοποιούνται από παλιά ως τρόποι συντήρησης στα τρόφιμα

Η χαμηλή a w στη συντήρηση των τροφίμων

Ελάχιστες τιμές ενεργότητας νερού a w για την ανάπτυξη μ/ο σε διάφορες ομάδες τροφίμων Ομάδες μικροοργανισμών Τιμές ενεργότητας νερού (a w ) Τα περισσότερα αλλοιογόνα βακτήρια Οι περισσότερες αλλοιογόνες ζύμες Οι περισσότεροι αλλοιογόνοι μύκητες 0,90 0,88 0,80 Αλόφιλα βακτήρια 0,75 Ξηρόφιλοι μύκητες 0,61 Οσμόφιλες ζύμες 0,61

Αλλοίωση τροφίμων και a w Τρόφιμα υψηλής υγρασίας (a w 0.99-0.95): Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τα φρούτα, τα λαχανικά, τα πουλερικά, το κρέας, το γάλα, τα αυγά, οι χυμοί φρούτων, το ανάλατο βούτυρο, τα φρέσκα τυριά, τα ελαφρά αλατισμένα τρόφιμα. Η αλλοίωση προκαλείται από τα αρνητικά κατά gram βακτήρια, τους μύκητες και τις ζύμες. Τρόφιμα υψηλής υγρασίας (a w 0.95-0.90): Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τρόφιμα που συντηρούνται με μερική αποξήρανση, ή με την προσθήκη άλατος ή ζάχαρης, όπως το ψωμί, τα ζυμούμενα αλλαντικά, το ζαμπόν, το μπέικον, το αλατισμένο βούτυρο. Η αλλοίωση προκαλείται από θετικά κατά gram βακτήρια, ζύμες και μύκητες. Μέσης υγρασίας τρόφιμα (aw 0.90-0.61): Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τρόφιμα που συντηρούνται με ξήρανση, με την προσθήκη μεγάλων ποσοτήτων άλατος ή ζάχαρης, όπως τα τυριά με ωρίμανση, συμπυκνωμένοι χυμοί φρούτων, αποξηραμένα φρούτα, παστά, μαρμελάδες. Η αλλοίωση προκαλείται από ζύμες, μύκητες, ξηρόφιλους μύκητες, αλόφιλα βακτήρια, οσμώφιλες ζύμες

Αλλοίωση τροφίμων και a w Τρόφιμα χαμηλής υγρασίας (a w < 0.61): Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τρόφιμα που υπόκεινται σε παρατεταμένη ξήρανση, όπως σοκολάτα, αποξηραμένες σούπες, μέλι, αλεύρι, μακαρόνια, μπισκότα, αφυδατωμένο γάλα, αφυδατωμένα λαχανικά, ζάχαρη, κλπ. Τα τρόφιμα αυτά είναι μικροβιολογικά σταθερά και αλλοιώνονται μόνο όταν ενυδατωθούν κατά την παραμονή τους σε αυξημένο περιβάλλον υγρασίας.