ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY)

ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY) Αναστασία Δέτση Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ 1

Φασματοσκοπία: Η μελέτη της μοριακής δομής μέσω της απορρόφησης, εκπομπής και σκέδασης του φωτός. Φως: η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία κάθε είδους (ορατό, υπεριώδες, υπέρυθρο, ραδιοκύματα). Ανάλογα με τη συχνότητα ή το μήκος κύματος της ακτινοβολίας έχουμε διαφορετικού τύπου αλληλεπιδράσεις με την ύλη (τα μόρια). g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 10 0 10 2 wavelength (l, cm) Το μήκος κύματος και η συχνότητα είναι αντιστρόφως ανάλογα επομένως υψηλές συχνότητες σημαίνουν χαμηλότερο μήκος κύματος

Σχέση μεταξύ ενέργειας και συχνότητας: DE = h n Ανάλογα με τη συχνότητα και το μήκος κύματος προκύπτουν διαφορετικές αλληλεπιδράσεις ύλης-φωτός: Ακτίνες γ/ακτίνες X ηλεκτρόνια εσωτερικών στιβάδων, πυρήνας UV/Vis δεσμικά ηλεκτρόνια (ηλεκτρόνια σθένους) IR μήκος δεσμού/γωνιακές/περιστροφικές δονήσεις l NMR πυρηνικό spin E

ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΤΟ NMR; Ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός είναι μια μορφή φασματοσκοπίας απορρόφησης όπου, κάτω από κατάλληλες συνθήκες, το δείγμα απορροφά ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε συχνότητες χαρακτηριστικές για αυτό. Η απορρόφηση είναι συνάρτηση του παρατηρούμενου πυρήνα. Τελικά, ένα φάσμα NMR είναι ένα διάγραμμα των κορυφών απορρόφησης σε συνάρτηση με τη συχνότητα.

Εφαρμογές της Φασματοσκοπίας NMR Ταυτοποίηση δομής οργανικών ενώσεων Χημεία Φυσικών προϊόντων Συνθετική οργανική χημεία Μελέτη δυναμικών φαινομένων Χημική κινητική Χημική ισορροπία Προσδιορισμός τρισδιάστατης δομής Πρωτεΐνες DNA, RNA σύμπλοκα πρωτεΐνη/dna, πρωτεΐνη/rna Πολυσακχαρίτες Σχεδιασμός φαρμάκων Σχέση δομής-δραστικότητας Πολυμερή, συμπολυμερή και πολυμερικά μίγματα Σύσταση και δομή Συμβατότητα Δυναμική Ιατρική Μαγνητική Τομογραφία (MRI) Μεταβολομική Προσδιορισμός μικρών μορίων σε βιολογικά υγρά 5

Χημεία (φασματοσκοπία NMR) ΟΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΟΨΕΙΣ ΤΟΥ NMR Ιατρική (Μαγνητική τομογραφία-τομογραφία NMR) Επιστήμη Υλικών (φασματοσκοπία και τομογραφία NMR) Πετρελαιοβιομηχανία (τεχνική χαλάρωσης spin NMR)

ΒΡΑΒΕΙΑ NOBEL ΓΙΑ ΤΟ NMR Kurt Wüthrich, 1938. Nobel Prize for Chemistry 2002 Felix Bloch, 1905-1983. Nobel Prize for Physics 1952 Richard R. Ernst, 1933. Nobel Prize for Chemistry 1991 Edward Mills Purcell, 1912-1997. Nobel Prize for Physics 1952 Sir Peter Mansfield, 1933. Nobel Prize for Medicine 2003 Paul Lauterbur, 1929-2007 Nobel Prize for Medicine 2003 7

Σύγκριση μεθόδων Μοριακής Φασματοσκοπίας Comparison of Methods of Molecular Spectroscopy. H O O CH 2 CH 3 trans-ethyl crotonate H 3 C H Φασματοσκοπία UV-visible spectroscopy: ορατού-υπεριώδους (UV-Vis): Απορρόφηση 208 nm:, unsaturated στα 208nm: α,β-ακόρεστο acid or ester οξύ ή εστέρας O OR Φασματοσκοπία IR spectroscopy (n): υπερύθρου (IR): 3050 cm-1 : C=C-H 2980-2910 cm-1 : alkyl groups: CH 3, CH 2 1710 cm-1 :, unsaturated acid or ester. 1660 cm-1 : C=C NMR Φασματοσκοπία spectroscopy πυρηνικού ( ): μαγνητικού συντονισμού (NMR): 6.90 (dq) H C 19 H 3 C 1.94 (dd) 145 123 O 178 60 15 C O CH 2 CH 3 C 4.14 (q) H 5.80 (dq) 1.35 (t) 8

Η φασματοσκοπία NMR παρέχει πολύ περισσότερες πληροφορίες για τη δομή του μορίου από ό,τι οι φασματοσκοπίες UV-vis και IR. H 3 C H CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 HO UV-visible, l max : ring olefin χοληστερόλη IR, n: stretch, bend, rocking: -OH, -CH 3, -CH 2 -, CH-, and fingerprint pattern

1 H NMR NMR: 1 H: 46 άτομα Η 13 C: 27 άτομα C. 13 C NMR HO HO CH 2 CH CH 2 CH 2 CH 3 CH C C Διαμόρφωση: H CH 2 CH CH 2 CH CH 2 H 3 C CH 3 C CH CH CH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 H H CH CH 3 C 3 3 H H H H CH CH 3 CH 3 Χημική μετατόπιση, d, και ολοκλήρωση CH 3 CH 3 Σύζευξη 1 H- 1 H και NOE

1976-85: Η αρχή του NMR βιομορίων 1984. Τα σήματα NMR των βιομορίων (πρωτεϊνες και νουκλεϊκά οξέα) συνήθως αλληλοεπικαλύπτονται. Το 1984 έγινε για πρώτη φορά αποτίμηση του φάσματος μιας πρωτεϊνης 57 αμινοξέων. Αν και ήταν μικρή πρωτεϊνη αυτή η αποτίμηση έδειξε τη δυνατότητα να χρησιμοποιείται το NMR ως εναλλακτική τεχνική αντί της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ για την ταυτοποίηση της δομής πρωτεϊνών σε διάλυμα.

1976-85: Η αρχή του NMR βιομορίων In vivo NMR : Πραγματοποιήθηκαν μελέτες μεταβολισμού σε πειραματόζωα χρησιμοποιώντας τα σήματα του 31 P που υπάρχει σε ενδοκυττάρια μόρια όπως το ΑΤΡ, ΑDP, φωσφοκρεατίνη και άλλους φωσφορικούς εστέρες. Χρησιμοποιώντας μόρια εμπλουτισμένα με 13 C ή επισημασμένα με 19 F, έγινε δυνατή η μελέτη μεταβολισμού φαρμάκων σε ενζυματικές διαταραχές. NH 2 O - N N O - O - O - H CH O O O 3 OH Pg P P N O N HO N N O O O P C CH2 O NH CO 2 H ATP HO OH φωσφοκρεατίνη

1976-85: Η αρχή του NMR βιομορίων Στα τέλη του 1970, αναπτύχθηκε η Μαγνητική Τομογραφία (Magnetic Resonance Imaging (MRI) ως διακριτή και πολλά υποσχόμενη εφαρμογή του NMR. Η μαγνητική τομογραφία στηρίζεται στην ανάλυση των μορίων νερού που υπάρχουν στους οργανισμούς. Τα σήματα αυτά επεξεργάζονται και παρέχουν εικόνες. Η μαγνητική τομογραφία αποτελεί σήμερα μία από τις σημαντικότερες μη επεμβατικές τεχνικές στην ιατρική. Το 2003 οι πρωτοπόροι της μαγνητικής τομογραφίας, Paul Lauterbur και Peter Mansfield τιμήθηκαν με το βραβείο Nobel Ιατρικής και Φυσιολογίας. Paul Lauterbur Peter Mansfield

1986-σήμερα: ανάπτυξη τεχνολογίας και μεθοδολογιών Η αλματώδης ανάπτυξη των υπολογιστών και της τεχνολογίας ηλεκτρομαγνητών (μέχρι 1 GHz) έχει οδηγήσει σε επέκταση των μεγεθών των πρωτεϊνών που μπορούν να αναλυθούν. Νέες εφαρμογές αναπτύσσονται συνεχώς (τρόφιμα, υλικά, πολυμερή κλπ)

1986-σήμερα: ανάπτυξη τεχνολογίας και μεθοδολογιών Το NMR αποτελεί σήμερα, μαζί με τη Φασματομετρία Μάζας, η κύρια τεχνική στο πεδίο της Πρωτεομικής. RIKEN NMR Park Yokohama, Japan.

ΠΥΡΗΝΙΚΟ SPIN To spin (ιδιοστροφορμή) είναι θεμελιώδης ιδιότητα στη φύση, όπως το ηλεκτρικό φορτίο και η μάζα. Τα πρωτόνια, τα ηλεκτρόνια και τα νετρόνια έχουν spin. Κάθε ένα από αυτά τα σωματίδια, όταν είναι ανεξάρτητο (μη συζευγμένο), έχει spin = ½. Άτομο δευτερίου: 2 Η spin 1 πρωτόνιο +1/2 1 νετρόνιο +1/2 1 ηλεκτρόνιο +1/2 συνολικό πυρηνικό spin = +1 συνολικό ηλεκτρονιακό spin = +1/2 Τιμές κβαντικού αριθμού πυρηνικού spin: Ι = ½ x n (n =1,2,3, 6) Πυρηνικό spin εμφανίζουν τα άτομα των οποίων οι πυρήνες διαθέτουν μη συζευγμένα πρωτόνια ή/και νετρόνια, δηλαδή: άτομα με περιττό αριθμό πρωτονίων ή/και περιττό αριθμό νετρονίων π.χ. 1 1 H, 13 6 C, 15 7 N 16

ΟΙ ΠΥΡΗΝΕΣ ΜΕ SPIN ΣΥΜΠΕΡΙΦΕΡΟΝΤΑΙ ΩΣ ΜΙΚΡΟΙ Η περιστροφή του θετικά φορτισμένου πυρήνα δημιουργεί την πυρηνική μαγνητική ροπή, μ, που είναι ανάλογη του κβαντικού αριθμού πυρηνικού spin, Ι. ΜΑΓΝΗΤΕΣ m = g I(I + 1) Η σταθερά αναλογίας γ (σε T -1 s -1 ) λέγεται γυρομαγνητικός λόγος και είναι χαρακτηριστική για τον πυρήνα κάθε ισοτόπου κάθε στοιχείου. Οσο μεγαλύτερος είναι ο γυρομαγνητικός λόγος ενός πυρήνα, τόσο πιο εύκολα ανιχνεύεται στο ΝΜR. Για το 1 Η γ=2.675 Τ -1 s -1 Για τον 13 C γ=0.6728 Τ -1 s -1 Η ευαισθησία είναι ανάλογη του γ 3. Επομένως, ο πυρήνας 1 Η είναι 64 φορές πιο ευαίσθητος από τον 13 C 17

Η σχετική ευαισθησία των πυρήνων ( 1 H, 13 C, 15 N, κλπ) εξαρτάται από Το γυρομαγνητικό λόγο (γ) Ευαισθησία Τη φυσική αφθονία του ισοτόπου Φυσική αφθονία 1 Η: 100% Φυσική αφθονία 13 C: 1.1% Παράδειγμα: φάσματα 1 Η και 13 C της καφεϊνης Φάσμα 1 H NMR 8 scans ~12 secs Φάσμα 13 C NMR 8 scans ~12 secs Φάσμα 13 C NMR 10,000 scans ~4.2 hours

ΟΙ ΠΥΡΗΝΕΣ ΜΕ SPIN ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΥΝ ΜΕ ΤΟ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟ ΠΕΔΙΟ Όταν τοποθετηθούν μέσα σε ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, Bο, οι πυρήνες αποκτούν συγκεκριμένους προσανατολισμούς. Για πυρήνες με κβαντικό αριθμό πυρηνικού spin ½ μόνο δύο προσανατολισμοί είναι πιθανοί: παράλληλος και αντιπαράλληλος με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Οι δύο αυτοί προσανατολισμοί δεν έχουν την ίδια ενέργεια, συνεπώς δεν είναι εξίσου πιθανοί. Ο παράλληλος προσανατολισμός είναι λίγο χαμηλότερης ενέργειας και έχει μεγαλύτερο πληθυσμό πυρήνων. Β ο Χωρίς την επίδραση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου Υπό την επίδραση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου 19

Ε ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΣ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΣ m (μαγνητικός κβαντικός αριθμός) -1/2 αντιπαράλληλα με το μαγνητικό πεδίο (β) ΔΕ = hν +1/2 παράλληλα με το μαγνητικό πεδίο (α) Βο Αν Ν α ο αριθμός των πυρήνων που βρίσκονται στη χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση (α) και Ν β ο αριθμός των πυρήνων που βρίσκονται στην υψηλότερη ενεργειακή κατάσταση (β) τότε ισχύει: N N b a = e ΔΕ k T B Όπου k B η σταθερά Boltzmann και Τ η απόλυτη θερμοκρασία Για τα πρωτόνια η ενεργειακή διαφορά ΔΕ είναι πολύ μικρή σε σύγκριση με τη μέση κινητική ενέργεια των πυρήνων k B T, επομένως οι πληθυσμοί των δύο καταστάσεων είναι περίπου ίσοι. Η περίσσεια πυρήνων στη χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση είναι της τάξης των ppm. 20

Ε ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΣ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΣ -1/2 αντιπαράλληλα με το μαγνητικό πεδίο ΔΕ = hν +1/2 παράλληλα με το μαγνητικό πεδίο Βο Συνθήκη Συντονισμού : n = g 2 B ν = συχνότητα Larmor γ = γυρομαγνητικός λόγος Βο = ισχύς εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου Για το πρωτόνιο ( 1 Η) : ν = 60-900 ΜΗz (στη φασματοσκοπία NMR) ν = 15-80 MHz (στη μαγνητική τομογραφία) 21

ΠΩΣ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ Ο ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΣ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΣ Μέθοδος με χρήση παλμού: το δείγμα ακτινοβολείται με ισχυρή ραδιοσυχνότητα οπότε όλοι οι πυρήνες διεγείρονται ταυτόχρονα. Ο παλμός παράγεται με το άνοιγμα μιας γεννήτριας ραδιοσυχνοτήτων συγκεκριμένης συχνότητας ν 1 για μικρό χρονικό διάστημα, τ Ρ. Τότε παράγεται μια ομάδα ραδιοσυχνοτήτων συμμετρικών της ν 1, με πλάτος περίπου 1/τ Ρ. Με κατάλληλη επιλογή του χρόνου μπορούν να διεγερθούν όλοι οι πυρήνες ταυτόχρονα. τ Ρ τρ : συνήθως μs t 0 t 1 t 22

ΠΩΣ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ Ο ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΣ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΣ Ζ Mο: μακροσκοπική μαγνήτιση (προκύπτει από το διανυσματικό άθροισμα των z-συνιστωσών των πυρηνικών μαγνητικών ροπών των πυρήνων σε ένα υγρό δείγμα) 23

ΠΩΣ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ Ο ΠΥΡΗΝΙΚΟΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΣ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΣ Μέθοδος με χρήση παλμού (συνέχεια) Κατά την ακτινοβόληση η αρχική μαγνήτιση Μο διαταράσσεται και αποκλίνει κατά μήκος του άξονα y, όπου ανιχνεύεται το σήμα. Όταν διακοπεί η ακτινοβόληση, οι πυρήνες επανέρχονται στην αρχική τους κατάσταση και η μαγνήτιση αποσβένυται ή φθίνει. Αυτή η απόσβεση εξαρτάται από το χρόνο ο οποίος είναι διαφορετικός για κάθε πυρήνα του μορίου. Μετασχηματισμός Fourier Ελεύθερη επαγόμενη απόσβεση (Free Induction Decay): φάσμα συνάρτησης χρόνου Φάσμα NMR: φάσμα συνάρτησης συχνότητας 24

Το πρώτο φάσμα 1 Η NMR (1951) Φάσμα 1 H NMR της αιθανόλης (40 MHz). (φωτογραφία από παλμογράφο που χρησιμοποιήθηκε ως καταγραφέας). CH 3 CH 2 OH 25

ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ Οι συχνότητες συντονισμού των πυρήνων του ίδιου στοιχείου μέσα σε ένα μόριο επηρεάζονται με χαρακτηριστικό τρόπο από το χημικό τους περιβάλλον, δηλαδή από την ηλεκτρονιακή πυκνότητα που τα περιβάλλει και το είδος των ατόμων με τα οποία συνδέονται. Αποτέλεσμα: η ένταση του μαγνητικού πεδίου που αισθάνεται ο πυρήνας, Β πραγματικό, να είναι πάντα μικρότερη από αυτή του εφαρμοζόμενου εξωτερικά μαγνητικού πεδίου (στα διαμαγνητικά μόρια). Β πραγματικό = Β ο σβ ο = Β ο (1-σ) σ : σταθερά προάσπισης Συνθήκη Συντονισμού : n = g 2 (1 ) B 26

ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ - Χημικά ισοδύναμοι πυρήνες Πυρήνες που έχουν το ίδιο χημικό περιβάλλον ονομάζονται χημικά ισοδύναμοι CH 3 -CH 2 -CH 2 -Br CH 3 ΟCH 3 Χημικά ισοδύναμα πρωτόνια (α ομάδα) Χημικά ισοδύναμα πρωτόνια (β ομάδα) Χημικά ισοδύναμα πρωτόνια (γ ομάδα) Χημικά ισοδύναμα πρωτόνια Οι χημικά μη ισοδύναμοι πυρήνες συντονίζονται σε διαφορετικές συχνότητες και δίνουν διαφορετικά σήματα στο φάσμα NMR. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται χημική μετατόπιση. Συνθήκη Συντονισμού : n = g 2 (1 ) B 27

CH 3 CH 2 OH Φάσμα NMR της αιθανόλης 28

ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ - Κλίμακα δ ένωση αναφοράς : (ΤΜS) τετραμεθυλοσιλάνιο H 3 C CH 3 Si CH3 (συχνότητα συντονισμού ΤΜS = 0 Hz) CH 3 Η χημική μετατόπιση εκφράζεται ως η διαφορά της συχνότητας συντονισμού του δείγματος (Ηz) από τη συχνότητα συντονισμού μιας ένωσης αναφοράς (Hz) προς τη συχνότητα λειτουργίας του οργάνου (ΜHz). Η τιμή που προκύπτει δίνεται σε ppm και συμβολίζεται με το γράμμα δ: = ν εξεταζόμεν ου ν οργάνου πυρήνα (MHz) (Hz) χ 10 6 Η κλίμακα δ είναι ανεξάρτητη του εξωτερικά εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου. 29

ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ - Κλίμακα δ αύξηση μαγνητικού πεδίου, Βο Συντονισμός σε χαμηλό πεδίο (υψηλή συχνότητα) αποπροστατευμένοι πυρήνες Συντονισμός σε υψηλό πεδίο (χαμηλή συχνότητα) προστατευμένοι πυρήνες αύξηση συχνότητας συντονισμού, ν 30

ΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΕΙΣ ΤΩΝ ΚΥΡΙΟΤΕΡΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΟΜΑΔΩΝ ΣΤΟ ΦΑΣΜΑ 1 Η NMR 31

ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΣΗΜΑΤΩΝ Το εμβαδό κάθε σήματος στο φάσμα 1 Η NMR είναι ανάλογο με τον αριθμό των πρωτονίων που έδωσαν το σήμα. Η ολοκλήρωση των σημάτων αντιστοιχεί στο σχετικό αριθμό πρωτονίων που είναι υπεύθυνα για την εμφάνιση του κάθε σήματος. 32

ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΣΗΜΑΤΩΝ CH 3 CH 2 OH 2 4 6 Φάσμα NMR της αιθανόλης 33

Παράδειγμα: 1 H NMR φάσμα του 1,1-διχλωροαιθανίου CH 3 CHCl 2 CH 3 - -CH- 34

ΣΥΖΕΥΞΗ SPIN-SPIN Η σύζευξη spin-spin είναι αποτέλεσμα της επίδρασης του μαγνητικού πεδίου των γειτονικών, χημικά μη ισοδύναμων με τον παρατηρούμενο, πυρήνων (με μη μηδενικό πυρηνικό spin) στο πεδίο που αισθάνεται ο παρατηρούμενος πυρήνας. Παράδειγμα: CH 3 CHCl 2 επίδραση των πρωτονίων της ομάδας CH 3 στο πρωτόνιο CHεπίδραση του πρωτονίου CH- στα πρωτόνια της ομάδας CH 3 Βο Βο τετραπλή κορυφή διπλή κορυφή 35

ΣΥΖΕΥΞΗ SPIN-SPIN ΠΟΛΛΑΠΛΟΤΗΤΑ ΚΟΡΥΦΗΣ Πολλαπλότητα κορυφής = 2nI+1 n = αριθμός γειτονικών, χημικά μη ισοδύναμων με τον εξεταζόμενο, πυρήνων που αλληλεπιδρούν με τον εξεταζόμενο Ι = κβαντικός αριθμός πυρηνικού spin Για το πρωτόνιο όπου Ι = +1/2 η σχέση απλοποιείται ως εξής: Πολλαπλότητα κορυφής = n + 1 Πολλαπλότητα κορυφής Χαρακτηρισμός Σχετικές εντάσεις κορυφών 1 Απλή / Singlet (s) 1 2 Διπλή / Doublet (d) 1 1 3 Τριπλή / Triplet (t) 1 2 1 4 Τετραπλή / Quartet (q) 1 3 3 1 >6 Πολλαπλή / Multiplet (m) 36

singlet doublet triplet quartet pentet 1:1 1:2:1 1:3:3:1 1:4:6:4:1 37

ΣΥΖΕΥΞΗ SPIN-SPIN - ΣΤΑΘΕΡΑ ΣΥΖΕΥΞΗΣ J Η απόσταση μεταξύ των επιμέρους κορυφών σε μια πολλαπλή κορυφή ονομάζεται σταθερά σύζευξης, J (σε μονάδες συχνότητας Ηz). Η σταθερά σύζευξης είναι μέτρο της αλληλεπίδρασης δύο πυρήνων και η τιμή της δεν εξαρτάται από το εξωτερικά εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο. a b v 2 v 1 Επειδή η σχάση που παρατηρείται οφείλεται στην αλληλεπίδραση των πρωτονίων (a) και (b), οι σταθερές σύζευξης που υπολογίζονται θα είναι ίσες, δηλαδή CH 3 CHCl 2 J a = v 2 -v 1 J a = J b v 5 v 4 J b = v 4 -v 3 = v 6 -v 3 v 3 v 6 38

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΕΝΑ ΦΑΣΜΑ 1 H ΝΜR 1. Ο αριθμός των σημάτων υποδεικνύει τον αριθμό των ομάδων χημικά ισοδύναμων πρωτονίων του μορίου. 2. Η χημική μετατόπιση ενός σήματος υποδεικνύει το είδος των πρωτονίων (π.χ. αλειφατικά, αρωματικά, αλλυλικά κλπ), δηλαδή το χημικό περιβάλλον τους. 3. Η ολοκλήρωση των σημάτων δείχνει τη σχετική αναλογία πρωτονίων που είναι υπεύθυνα για την εμφάνιση του κάθε σήματος. 4. Η πολλαπλότητα του σήματος (Ν+1) δείχνει τον αριθμό των γειτονικών, χημικά μη ισοδύναμων πρωτονίων (Ν). 5. Οι σταθερές σύζευξης J ταυτοποιούν τα πρωτόνια που συζεύγνυνται. 39

ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ 13 C NMR Ο 13 C έχει πολύ μικρή φυσική αφθονία (1.1%), με αποτέλεσμα ο πυρήνας να είναι 400 φορές λιγότερο ευαίσθητος στην παρατήρησή του με NMR. Εξαιτίας της χαμηλής φυσικής αφθονίας, δεν παρατηρείται σύζευξη μεταξύ 13 C- 13 C. Τα συνηθισμένα φάσματα 13 C NMR λαμβάνονται με πλήρη αποσύζευξη (για να μην εμφανίζεται η σύζευξη μεταξύ 1 Η- 13 C), οπότε στα φάσματα αυτά υπάρχουν μόνο απλές κορυφές. Ο αριθμός των κορυφών δείχνει τον αριθμό των ομάδων χημικά ισοδύναμων ατόμων C. To εύρος χημικών μετατοπίσεων του 13 C είναι 0-200 ppm. Οι χημικές μετατοπίσεις επηρεάζονται από τους ίδιους παράγοντες όπως και στο φάσμα 1 Η NMR. 40

ΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΕΙΣ ΤΩΝ ΚΥΡΙΟΤΕΡΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΟΜΑΔΩΝ ΣΤΟ ΦΑΣΜΑ 13 C NMR 41

ΣΧΗΜΑΤΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΦΑΣΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ NMR Β ο δείγμα πομπός ραδιοσυχνοτήτων δέκτης ραδιοσυχνοτήτων φάσμα 42

ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΜΕΡΗ ΕΝΟΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΦΑΣΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ NMR Ηλεκτρονικός υπολογιστής: ελέγχει το φασματογράφο και αποτελεί βασικό εργαλείο για τη λήψη και την επεξεργασία των φασμάτων. Κονσόλα ελέγχου: περιέχει ψηφιακά κυκλώματα, κυκλώματα ραδιοσυχνοτήτων, ενισχυτές και άλλα ηλεκτρονικά εξαρτήματα. Μαγνήτης: μαγνήτης με τη μορφή σωληνοειδούς που περιέχει υπεραγώγιμο υλικό (π.χ. Κράμα Nb-Ti).Η μαγνήτιση είναι μόνιμη και επιτυγχάνεται με τη διατήρηση του υλικού σε περιβάλλον υγρού ηλίου (4Κ ή -269 o C). Probe (αισθητήρας): τοποθετείται στο κέντρο του μαγνήτη και περιλαμβάνει τα απαραίτητα συντονιζόμενα κυκλώματα για την εκπομπή υψίσυχνων παλμών προς το δείγμα ώστε να διεγερθούν οι παρατηρούμενοι πυρήνες και να γίνει λήψη της κυματομορφής αποδιέγερσης. 43

ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΜΕΡΗ ΕΝΟΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΦΑΣΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ NMR: ΜΑΓΝΗΤΗΣ 44

Προετοιμασία του δείγματος για τη λήψη φάσματος NMR (σε διάλυμα) 1. Ζυγίζονται 5-10mg του δείγματος σε ξηρό και καθαρό φιαλίδιο 2. Το δείγμα διαλυτοποιείται σε 0.5-0.7mL δευτεριωμένου διαλύτη 3. Το διάλυμα μεταφέρεται σε ξηρό και καθαρό σωληνάκι NMR

Γιατί χρησιμοποιείται δευτεριωμένος διαλύτης? (α) Γιατί το όργανο χρησιμοποιεί το σήμα του δευτερίου του διαλύτη ως αναφορά για να κλειδώνει (να σταθεροποιεί) τη συχνότητα λειτουργίας καθόλη τη διάρκεια λήψης του φάσματος (β) Γιατί τα πρωτόνια του διαλύτη (αν δεν είναι δευτεριωμένος) θα δώσουν ισχυρά σήματα και θα επικαλύψουν τα σήματα της εξεταζόμενης ουσίας. Συνήθεις δευτεριωμένοι διαλύτες Chloroform CDCl 3 Deuterium oxide D 2 O Dimethyl sulfoxide (CD 3 ) 2 SO (DMSO-d 6 ) Methanol CD 3 OD

Παράδειγμα: 1 H NMR φάσμα του μεθυλοβρωμιδίου CH 3 Br CH 3 - Ένα είδος πρωτονίων (χημικά ισοδύναμα) ένα σήμα σε δ 2.7ppm. Ελαφρά αποπροστατευμένα Η λόγω της παρουσίας του ηλεκτραρνητικού Br. TMS 47

Παράδειγμα: 1 H NMR φάσμα του αιθανικού μεθυλεστέρα CH 3 COOCH 3 CH 3 - Δύο ομάδες χημικά μη ισοδύναμων πρωτονίων πρωτονίων δύο σήματα στο φάσμα (δ 3.7 και 2.1 ppm). Το σήμα στο χαμηλότερο πεδίο (υψηλότερη συχνότητα) οφείλεται στο συντονισμό των πρωτονίων της ομάδας -ΟCH 3, αφού η παρουσία του ηλεκτραρνητικού ατόμου Ο τα αποπροστατεύει. Η ολοκλήρωση των κορυφών είναι 1:1, αφού υπάρχουν 3Η από κάθε είδος. -OCH 3 48