ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009 ΤΕΥΧΟΣ 49 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ

ΕΦΗΜΕΡΙΔΕΣ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ Χ + 7 ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009 ΤΕΥΧΟΣ 49 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΚΩΔ. 4283 ΠΛΗΡΩΜΕΝΟ ΤΕΛΟΣ Ταχ. Γραφείο Κ Ε Μ Π Α Θ Αριθμός Άδειας 5207/07 ΕΚΔΟΤΩΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Αλωπεκής 47-106 76 Αθήνα - τηλ.: 210 3645751 www.eekx-kb.gr

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 Περιεχόμενα 4 Βραβείο Nobel Ιατρικής 2008 9 HPV και καρκίνος: Nobel Ιατρικής 2008 12 Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. Το επιστημονικό υπόβαθρο του Nobel Χημείας 2008 15 Ορθολογιστική παρουσίαση αποτελεσμάτων δοκιμών με βάση την αβεβαιότητα των μετρήσεων 17 Προσδιορισμός ενδοκυττάριου, επιφανειακού και διαλυτού TNFα με κυτταρομετρία ροής 22 Συνέδρια 2009 Διοικητικό Συμβούλιο Πρόεδρος: Κ. Ψαρρά Αντιπρόεδρος: Α. Σταθάκη-Φερδερίγου Γ. Γραμματέας: Φ. Καράμπαμπα Αν. Γεν. Γραμματέας: Α. Χαλιάσος Ταμίας: Ε. Μπότουλα Μέλη: Α. Διακουμή-Σπυροπούλου, Χ. Κρούπης ιδιοκτήτης: ΈΈΚΧ-ΚΒ Αλωπεκής 47-106 76 Αθήνα Τηλ.: 210 3645751 - Fax: 210 3645392 Διευθύντρια Σύνταξης Κ. Ψαρρά Νοταρά 39, 106 83 Αθήνα E-mail: stcps@hol.gr Έπιτροπή Σύνταξης Μ. Βικεντίου, Μ. Γαροφαλάκη, Α. Γρηγοράτου, Ε. Κώνστα, Κ. Κωνσταντινάκου, Β. Λόη, Ν. Παπαγεωργάκης Έκδότης Σταμάτης Σταματόπουλος Focus on Health ΕΠΕ Δημιουργικός Σχεδιασμός Multimedia Trend ΕΠΕ Έπιμέλεια - Παραγωγή Focus on Health ΕΠΕ Ιωάννου Γενναδίου 16, 11521 Αθήνα, Τηλ.: 210-7223046, Fax: 210-7223220 E-mail: info@focusonhealth.gr Κωδικός Διεύθυνσης Εποπτείας ΜΜΕ: 4283 Editorial Αγαπητοί συνάδελφοι, Πηγαίνοντας µια βόλτα στην εξοχή ή και στους δρόµους της πόλης, που µυρίζει άνοιξη αισθάνεσαι ότι κάτι µπορεί να γίνει ότι υπάρχει ελπίδα! Ωστόσο, µην επαναπαύεστε, διότι όσον αφορά τις επιθέσεις που συνεχίζουµε να υφιστάµεθα σαν κλινικοί χηµικοί, είµαστε µερικές φορές σαν τον Αθηναίο Σοφάνη, που όταν πολεµούσε στη µάχη των Πλαταιών κατά των Περσών, φορούσε στο πόδι του µια αλυσίδα µε µια άγκυρα σιδερένια για να µην µπορεί να υποχωρήσει ούτε πόντο από τις θέσεις του. Όταν όµως έπρεπε να επιτεθεί, είχε και την άγκυρα µαζί του (τάδε έφη Ηρόδοτος, ο πατήρ της ιστορίας). εν υποχωρούµε ούτε πόντο αλλά η επίθεση για βελτίωση των θέσεων, η άνοιξη, η ανάσταση Το τεύχος αυτό είναι αφιερωµένο στα βραβεία Nobel Ιατρικής και Χηµείας, που απονεµήθηκαν το εκέµβρη του 2008. Γιατί; Πρώτο, διότι όλοι σε ένα Nobel δεν ελπίζουµε πάντοτε; (οµολογείστε ότι κάποτε είπατε µεταξύ αστείου και σοβαρού ). εύτερο, διότι τo φετινό Nobel ιατρικής για τους HIV και HPV έδειξε την επικαιρότητα του τελευταίου σεµιναρίου συνεχιζόµενης εκπαίδευσης της ΕΕΚΧ- ΚΒ, που δεν παρακολουθήσατε Τρίτο και κύριο, η ιστορία αυτών των ανακαλύψεων δείχνει το δρόµο της ελπίδας, δείχνει πόσοι άνθρωποι βάζουν το λιθαράκι τους για κάτι κι ας βραβεύονται λίγοι, δείχνει τη δύναµη της επιµονής, της πίστης, της σοβαρής δουλειάς και οι φωτογραφίες τους, οι ρυτίδες τους χωρίς «το χέρι του γέρου φωτογράφου να του στρώνει τις ρυτίδες που έχουν αφήσει στο πρόσωπό του όλα τα πετεινά του ουρανού» (Γ. Σεφέρης). ιαβάστε επίσης µε προσοχή το άρθρο του καθ. Μ. Κουππάρη για τα σηµαντικά ψηφία και µην τα χρησιµοποιείτε ανεξέλεγκτα, διαβάστε και για τον TNF και µε πόσους διαφορετικούς τρόπους προσδιορίζεται µε την κυτταροµετρία ροής! Πεζή προσγειωµένη πραγµατικότητα, αλλά µόνο έτσι έχουµε δικαίωµα στο όνειρο Ετοιµάστε, συνάδελφοι, τις εργασίες σας για το 8 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χηµείας, που θα γίνει στην όµορφη Πάτρα! Όπως είπαµε ούτε πόντο υποχώρηση και τα σεµινάρια, τα συνέδριά µας, η συνεργασία µας είναι ευκαιρία να το δείχνουµε. Με φιλικούς χαιρετισµούς Κατερίνα Ψαρρά 3

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Βραβείο Nobel Ιατρικής 2008 Προσαρμογή-Μετάφραση Κειμένων: Μυροφόρα Βικεντίου Χημικός MSc Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής Συγχαρητήρια στους Luc Montagnier και Françoise Barré-Sinoussi, των διακεκριμένων επιστημόνων του Ερευνητικού Ιδρύματος Pasteur, οι οποίοι έλαβαν στις 7 Δεκεμβρίου 2008, το βραβείο Nobel Ιατρικής για την ανακάλυψη του ιού HIV, το 1983! Το βραβείο μοιράστηκαν με τον Harald zur Hausen, από τη Γερμανία, ο οποίος ανακάλυψε τη σχέση του ιού του θηλώματος του ανθρώπου (Human Papilloma Virus, HPV) και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Είναι γνωστό ότι νέες επιδημίες σχετίζονται με λοιμογόνους παράγοντες, όπως είναι οι ιοί και τα βακτήρια. Ο HIV είναι ένας ρετροϊός, δηλαδή ιός που για την αναπαραγωγή του χρησιμεύει το ιικό ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase, RT) του RNA. Η παθογένεια της HIV λοίμωξης επιτελείται με περίπλοκους μηχανισμούς που έχουν ως αποτέλεσμα την προοδευτική έκπτωση της λειτουργικότητας του ανοσιακού συστήματος. Το κύριο χαρακτηριστικό της HIV-1 λοίμωξης είναι η σταδιακή ποσοτική και ποιοτική έκπτωση των CD4+ T βοηθητικών λεμφοκυττάρων (Σχήμα 1). Η μόλυνση μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους όπως μέσω της σεξουαλικής επαφής, με μόλυνση του αίματος από μολυσμένο αίμα (μετάγγιση, τραυματισμός), περιγεννητικά με τον θηλασμό αλλά και με κάθετη μετάδοση από την έγκυο στο κύημα. Σχήμα 1. Η παθογένεια του ιού HIV. Το 1983 οι δύο ερευνητές, Luc Montagnier και Françoise Barré-Sinoussi, κατάφεραν να απομονώσουν και να ταυτοποιήσουν τον ιό που μάστιζε και μαστίζει, μέχρι σήμερα, την ανθρωπότητα (Σχήμα 2). Στόχος της έρευνάς τους ήταν (και είναι) η απομόνωση του ιικού στελέχους από τον ασθενή και η εργαστηριακή διερεύνηση του ιού με σκοπό την ανάπτυξη θεραπείας κατά του HIV. Έρευνα του ιού HIV: από την κλίνη στον πάγκο και πάλι στην κλίνη 1983 Ταυτοποίηση των αντιγόνων του HIV-1 Τροπισμός και κυτταροπαθογένεια του HIV-1 Χαρακτηρισμός της RT (Reverse Transcriptase) Κλωνοποίηση και Αλληλουχία του HIV-1 Ανάπτυξη διαγνωστικών Τεστ Πρόληψη μετάδοσης με το αίμα Πρόληψη μετάδοσης με σεξουαλική επαφή Παρακολούθηση των CD4+T λεμφοκυττάρων Ανάπτυξη του πρώτου αντιιικού φαρμάκου AZT ως θεραπεία AZT ως πρόληψη HAART Ιικό φορτίο και ARV ανθεκτικότητα Σχήμα 2. 1983-έτος ανακάλυψης του ιού HIV. Τα σημαντικότερα στάδια της ανακάλυψης και διερεύνησής του (μέρος από την παρουσίαση της Δρ. Barre-Sinoussi κατά την απονομή). Αξίζει να αναφερθούν λίγα στοιχεία της ζωής και του έργου των δύο επιστημόνων Luc Montagnier: Ο Luc Montagnier γεννήθηκε στην πόλη Chabris της Γαλλίας, το 1932. Ήταν το μοναχοπαίδι του Antoine Montagnier και της Marianne Rousselet. Από τα δεκατέσσερά του έτη είχε ασχοληθεί με πειράματα νιτρογλυκερίνης στο εργαστήριο που διατηρούσε ο πατέρας του. Η επιθυμία του να ασχοληθεί με την ιατρική παρακινήθηκε από το χρόνιο νόσημα και το θάνατο του παππού του από καρκίνο του παχέος εντέρου. Ο Montagnier σπούδασε στο Κολλέγιο de Châtellerault, και στη συνέχεια στο Πανεπιστήμιο Poitiers, όπου έλαβε το πτυχίο του στις φυσικές επιστήμες, το 1953. Συνέχισε τις σπουδές του στο Poitiers και στη συνέχεια στο Πανεπιστήμιο του Παρισιού, το 1955, έλαβε την άδεια «licence ès sciences». Δίδαξε, ως βοηθός, στο Τμήμα Επιστημών του Παρισιού, στη Sorbonne, και το 1960 έλαβε το διδακτορικό του στην Ιατρική. Το 1960, διορίστηκε ως ερευνητής στο Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας (Centre National de la Recherche Scientifique, C.N.R.S.), και στη συνέχεια πήγε στο Λονδίνο για έρευνα στο Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας (Medical Research Council), στο Carshalton. 4

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 Η ομάδα έρευνας στο Carshalton διερευνούσε το ριβονουκλεϊνικό οξύ (ribonucleic acid, RNA). Οι Montagnier και F.K. Sanders, διερεύνησαν το RNA και ανακάλυψαν ιό με διπλής έλικας RNA που προέκυπτε από το διπλασιασμό του μονόκλωνου RNA. Το διπλής έλικας RNA μπορούσε να μεταφέρει τη γενετική του πληροφορία στο DNA, επιτρέποντας στον ιό να κωδικοποιήσει τον εαυτό του στο γενετικό υλικό του ξενιστή. Η ανακάλυψη αυτή αποτέλεσε σημαντικό επίτευγμα για την κατανόηση των ιών. Από το 1963 μέχρι το 1965, ο Montagnier εργάστηκε ως ερευνητής στο Ινστιτούτο Ιολογίας στη Γλασκόβη, στη Σκωτία. Συνεργάστηκε με τον Ian MacPherson, που ανακάλυψε, το 1964, ότι το agar αποτελούσε εξαιρετικό υπόστρωμα για την καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων. Η τεχνική τους έγινε πρότυπη σε εργαστήρια που διερευνούν ογκογονίδια και τροποποιήσεις-μεταλλάξεις κυττάρων. Ο ίδιος ο Montagnier χρησιμοποίησε τη νέα τεχνική για τη διερεύνηση καρκίνων που προκαλούνται από ιούς, ενώ το 1965 επέστρεψε στη Γαλλία. Από το 1965 μέχρι το 1972, ο Montagnier εργάστηκε ως διευθυντής εργαστηρίου στο Ινστιτούτο Ραδίου (που στη συνέχεια επονομάστηκε σε Ινστιτούτο Curie), στο Orsay. Το 1972, ίδρυσε και διήυθυνε το Τμήμα Ιικής Ογκολογίας, του Ινστιτούτου Pasteur. Υποκινούμενος από τα ευρήματά του στο Carshalton και με την πίστη ότι κάποιοι καρκίνοι προκαλούνται από ιούς, τον καιρό εκείνο το επιστημονικό του ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στους ρετροϊούς ως δυναμική αιτία που προκαλεί τον καρκίνο. Οι ρετροϊοί έχουν το ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση. Ο Montagnier τεκμηρίωσε ότι η ανάστροφη μεταγραφάση μεταγράφει τις γενετικές πληροφορίες του ιού, από το ιικό RNA στο DNA, επιτρέποντας τα γονίδια του ιού να εγκατασταθούν μόνιμα στα κύτταρα του ξενιστή. Μετά την εγκατάσταση ο ιός ξεκινά να πολλαπλασιάζεται αλλά μόνο με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ξενιστή, οδηγώντας σε κακοήθεις όγκους. Το AIDS (σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας), μία επιδημία με τραγικές συνέπειες, που εμφανίστηκε στις αρχές του 1980, χαρακτηρίστηκε αρχικά, γύρω στο 1982. Το κύριο χαρακτηριστικό του ιού είναι η αποδυνάμωση του ανοσοποιητικού συστήματος λόγω του οποίου ο οργανισμός, φυσιολογικά, προστατεύεται από μεγάλο αριθμό νοσημάτων. Το AIDS στην τελική του φάση είναι θανατηφόρο. Μέχρι το 1993, περισσότεροι από 3 εκατομμύρια άνθρωποι ανέπτυξαν AIDS. Ο Montagnier πίστεψε ότι ο ρετροϊός μπορεί να είναι υπεύθυνος για το AIDS. Ερευνητές επισήμαναν ότι η προ-aids κατάσταση (Σχήμα 3) περιλάμβανε επίμονη διόγκωση των λεμφαδένων, που ονομαζόταν λεμφαδενοπάθεια. Λαμβάνοντας καλλιέργεια ιστών από λεμφαδένες ασθενούς με AIDS, το 1983, ο Montagnier και δύο συνεργάτες του, Françoise Barré-Sinoussi και Jean-Claude Chermann, διερεύνησαν και ανακάλυψαν την ανάστροφη μεταγραφάση, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα ρετροϊού. Ο ιός που απομονώθηκε ονομάστηκε LAV (lymphadenopathy-associated virus, ιός παρουσία λεμφαδενοπάθειας). Αργότερα, μετά από διεθνή συμφωνία, ο ιός επονομάστηκε HIV (human immunodeficiency virus, ιός ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου). Μετά την απομόνωση του ιού, ήταν πλέον εφικτή η ανάπτυξη δοκιμασίας αντισωμάτων έναντι του ιού (τεστ HIV). Επίσης, ο Montagnier και η ομάδα του, ανακάλυψαν ότι ο ιός HIV επιτίθεται στα CD4 κύτταρα, τα οποία έχουν σημαίνουσα θέση και δράση στο ανοσιακό σύστημα. Ο ιός HIV-2, που είναι όμοιος, αλλά όχι ταυτόσημος με τον HIV, ανακαλύφθηκε από τον Montagnier και τους συνεργάτες του, τον Απρίλιο του 1986. Ο Montagnier, στο Ινστιτούτο Pasteur στο Παρίσι, αφιέρωσε την καριέρα του στην έρευνα των ιών. Ίσως να είναι ευρύτερα γνωστός για την ανακάλυψη του HIV, ο οποίος ταυτοποιήθηκε ως η αιτία που προκαλεί το AIDS. Ωστόσο, 20 έτη πριν από την έναρξη της επιδημίας του AIDS, ο Montagnier έκανε αρκετές σημαντικές ανακαλύψεις που αφορούν στη φύση των ιών. Η συνεισφορά του θεωρείται μέγιστη όσον αφορά την κατανόηση του μηχανισμού πώς οι ιοί μπορούν να τροποποιήσουν, να αλλάξουν τη γενετική πληροφορία των ξενιστών ενώ επικεντρώθηκε στην έρευνα του καρκίνου. Η έρευνά του που αφορούσε στην ιντερφερόνη (έναν από τους μηχανισμούς άμυνας του οργανισμού ενάντια στους ιούς), επίσης άνοιξε δρόμους για θεραπεία από ασθένειες που προκαλούνται από ιούς. Σήμερα, η έρευνα του Montagnier εστιάζεται στη διερεύνηση των πρωτεϊνών του περιβλήματος του ιού που συνδέονται με τα Τ κύτταρα, τη μελέτη του εμβολίου και κατ επέκταση στη μελέτη θεραπείας του AIDS. Ο Montagnier παντρεύτηκε τη Dorothea Ackerman, το 1961. Απέκτησαν τρία παιδιά, τους Jean-Luc, Anne-Marie, και Francine. Έχει περιγράψει τον εαυτό του ως «επιθετικό» ερευνητή που περνά τον περισσότερο χρόνο του μεταξύ εργαστηρίου και ταξιδεύοντας για επιστημονικές συναντήσεις. Απολαμβάνει την κολύμβηση και την κλασική μουσική, και αγαπά να παίζει πιάνο και ιδιαίτερα σονάτες του Mozart. Francoise Barré-Sinoussi: Η Barré-Sinoussi γεννήθηκε το 1947 στο Παρίσι. Εργάζεται στο Ινστιτούτο Pasteur, από τις αρχές του 1970. Η έρευνά της γρήγορα εστιάστηκε στους ρετροϊούς. Η γνώση της στο συγκεκριμένο πεδίο την οδήγησε στην ανακάλυψη του ιού του AIDS, το 1983, μαζί με τον Δρ. Montagnier. Η ανακάλυψη αυτή υπέδειξε την επιτακτική ανάγκη ανάπτυξης διαγνωστικών δοκιμασιών με σκοπό τον έλεγχο του νοσήματος. Η έρευνά 5

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ της εστιάζεται στην επίδραση της φυσικής άμυνας του ξενιστή στον έλεγχο του HIV/AIDS όπως και στη μετάδοση του ιού από τη μητέρα στο παιδί. Έχει συμμετάσχει σε πάνω από 200 επιστημονικές εργασίες, σε πάνω από 250 διεθνή συνέδρια, και έχει εκπαιδεύσει πολλούς νεαρούς ερευνητές. Η Barré-Sinoussi έχει συμβάλλει σε αρκετές επιστημονικές επιτροπές, στο Ινστιτούτο Pasteur, όπως επίσης και σε άλλους οργανισμούς κατά του AIDS, όπως είναι η Εθνική Επιτροπή για την Έρευνα του AIDS της Γαλλίας (National Agency for AIDS Research in France). Επίσης έχει εμπλακεί σε διεθνές επίπεδο, ως σύμβουλος του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO) και UNAIDS-HIV. Από το 1980, η Barré-Sinoussi έχει ξεκινήσει συνεργασίες με αναπτυσσόμενες χώρες. Εργάζεται σταθερά για την καθιέρωση μόνιμης σύνδεσης βασικής και κλινικής έρευνας με σκοπό τη βελτίωση στα πεδία πρόληψης, κλινικής φροντίδας και θεραπείας. Η Francoise Barré-Sinoussi, είναι καθηγήτρια διακεκριμένης τάξης (exceptional class) στο Ινστιτούτο Pasteur και υπεύθυνη-διευθύντρια Έρευνας του Inserm. Ηγείται του Τμήματος ρύθμισης ρετροϊικών λοιμώξεων του Ινστιτούτου Pasteur. Είναι, επίσης, πρόεδρος του Επιστημονικού συμβουλίου του ANRS και διευθύνει την έρευνά του, στη νοτιοανατολική Ασία. Η Francoise Barré-Sinoussi συνεργάστηκε με μεγάλο αριθμό επιστημόνων από χώρες που έχουν επηρεαστεί στο μεγαλύτερο βαθμό από το HIV/AIDS, μέσω του Διεθνούς Δικτύου των Ινστιτούτων Pasteur. Η δουλειά της απέφερε 216 πρωτότυπες δημοσιεύσεις σε διεθνή περιοδικά, περισσότερα από 250 άρθρα σε διεθνή συνέδρια και 17 πατενταρισμένες εφαρμογές. Η Francoise Barré-Sinoussi έλαβε μεγάλο αριθμό βραβείων ενώ σημαντική θεωρήθηκε η μνεία του André Syrota (Γενικός Διευθυντής του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας και Ιατρικής Έρευνας), για τη διάκρισή της και την επιστημονική και ανθρωπιστική μάχη ενάντια στον HIV/AIDS, ο οποίος χαρακτήρισε την επιστήμονα ως «πρέσβειρα της βιοϊατρικής έρευνας στη Γαλλία». Οδηγός στην καριέρα της Francoise Barré-Sinoussi είναι οι αξίες του Louis Pasteur, τις οποίες υιοθέτησε και εφάρμοσε συνδυάζοντας την έρευνα με την υγεία του κοινωνικού συνόλου και τη διδασκαλία. Σε άρθρα διεθνών εφημερίδων επισημαίνεται ότι το βραβείο Nobel έχει δοθεί μόνο στους Montagnier και Barré-Sinoussi, ενώ δεν αναφέρεται ο Αμερικανός ερευνητής Robert Gallo (ο Αμερικανός ερευνητής που θεωρήθηκε ότι ανακάλυψε τον ιό του AIDS, μαζί με τους άλλους δύο). Ο λόγος έγκειται στο γεγονός ότι ο Gallo, στο εργαστήριό του, στο NIH, ισχυρίστηκε ότι ο ίδιος ανακάλυψε έναν ιό στους ασθενείς με AIDS. Αργότερα, η ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας του ιού απεκάλυψε ότι και στις δύο περιπτώσεις αυτό που είχε ανακαλυφθεί ήταν ο ιός του Montagnier, που είχε αναμείξει με τις δικές του καλλιέργειες. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι ο HIV που απομονωνόταν διέφερε 6-20% από ασθενή σε ασθενή (λόγω της ικανότητας του ιού να μεταλλάσσεται). Αντίθετα, ο ιός που απομόνωσε ο Gallo ήταν σε ποσοστό μικρότερο από 2% διαφορετικός από τον ιό που απομόνωσε ο Montagnier, οδηγώντας στην υποψία ότι και οι δύο ιοί προέρχονταν από την ίδια πηγή. Η υποψία αυτή ενισχύθηκε από το γεγονός ότι τα εργαστήρια αντάλλαξαν δείγματα στις αρχές της δεκαετίας του 80. Το 1993 η έρευνα του Γραφείου Ηθικής της Έρευνας (Office of Research Integrity) επιβεβαίωσε ότι ο Gallo «ανακάλυψε» τον ιό που του είχε στείλει ο Montagnier. Το αν ήταν ή όχι ενήμερος ο Gallo γι αυτό, το 1983, δεν μπορεί να αποδειχθεί. Παρόλα αυτά, η επιτροπή Nobel αναγνώρισε μόνο το έργο-την ανακάλυψη των δύο Γάλλων ερευνητών. Λίγα στοιχεία από τις ομιλίες των δύο διακεκριμένων επιστημόνων κατά την απονομή του βραβείου Nobel, στις 7 Δεκεμβρίου 2008 Είκοσι πέντε έτη έρευνας του AIDS. Μαθήματα και προοπτικές για θεραπεία και εμβόλιο («Twenty five years of research on AIDS Lessons and prospects for cure and Vaccine») Luc Montagnier M.D. Σταθμοί-ορόσημο στην Έρευνα του AIDS 1981 Ταυτοποιήθηκε η νόσος στις ΗΠΑ 1983 Απομονώθηκε για πρώτη φορά ο ιός HIV 1984 Επιβεβαίωση του HIV ως ο αιτιολογικού παράγοντα που προκαλεί το AIDS και βιολογικός και μοριακός χαρακτηρισμός 1985 Ανάπτυξη των πρώτων τεστ αίματος για την εξάλειψη τον περιορισμό της μετάδοσης του ιού από τον HIV, μέσω της μετάγγισης αίματος 1986 Απομόνωση του ιού HIV-2 1987 Η πρώτη χρήση του AZT ως του πρώτου αντιρετροϊκού φαρμάκου 1991 Η απόπτωση ως μηχανισμός κυτταρικού θανάτου στο AIDS 1995 Μείωση (ρυθμού) της περιγεννητικής μετάδοσης του ιού με τη χορήγηση του AZT 1995 Υψηλός ρυθμός διπλασιασμού του ιού κατά τη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης της λοίμωξης 1996 Ταυτοποίηση των κύριων συνυποδοχέων του HIV 1996-97 Γενίκευση της χρήσης του HAART στις ανεπτυγμένες χώρες 6

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 Οι τέσσερις μηχανισμοί για τη μεταβλητότητα του HIV 1 Λάθη κατά την αντίστροφη μεταγραφή (Errors of Reverse Transcription) HIV/AIDS: the state of th epidemic at the end of 2007 2 Γενετικός ανασυνδυασμός (Genetic Recombination) 3 Ατελής ουδετεροποίηση από το Vif της δραστηριότητας του γονιδίου APOBEC3G (Incomplete Neutralization by Vif of the activity of the APOBEC3G cellular gene) 4 Οξειδωτικό στρες (Oxidative Stress) Εικοσιπέντε έτη μετά την ανακάλυψη του HIV/AIDS δεν υπάρχει θεραπεία, δεν υπάρχει εμβόλιο αλλά υπάρχει ελπίδα για θεραπεία μέσω εμβολίου! 33 million people [30.3-36.1 million] were living with HIV. 2.7 million [2.2-3.2 million] new causes of HIV infection. 2 million [1.8-2.3 million] AIDS-related deaths last year. Στρατηγική για ανάπτυξη νέου εμβολίου 1 Δείχνει αποδοτικότητα ως θεραπευτικό συμπλήρωμα (Show efficacy as therapeutic complement) 2 Προσαρμόζεται στην παρεμπόδιση της μετάδοσης μέσω βλεννογόνου (mucosal transmission) 3 Δοκιμασία για τη διατύπωση ως προληπτικό εμβόλιο [Test the best formulation as preventive vaccine (phase3)] HIV: Η ανακάλυψη του ιού άνοιξε δρόμους για νέα επιστημονικά επιτεύγματα και βελτίωση στην υγεία, σε παγκόσμιο επίπεδο («HIV: a discovery opening the road to novel scientific achievements and global health improvement») Françoise Barré-Sinoussi Viral RN A/ml plasma CD4 + counts CD8 + DR + CD38 + Natural History of HIV infection Immunological setpoint (before Viral setpoint seroconversion) (6 months p.i.) primary infection chronic infection AIDS Viral Reserviors Chronic Immune Activation Σχήμα 3. Η φυσική πορεία της HIV λοίμωξης. generalized T cell activation viremia blood CD4 + Intestinal CCR5 + CD4 + T memory cells Σχήμα 4. Τα επιδημιολογικά στοιχεία του έτους 2007. Μοντέλα κατανόησης της προστασίας ενάντια στον HIV/AIDS 1. Ανθεκτικότητα στη λοίμωξη - εκτιθέμενοι μη μολυσμένοι 2. Έλεγχος της HIV λοίμωξης - ελεγκτές HIV 3. Έλεγχος της HIV παθογένεσης - μη παθογόνο SIV μοντέλο. Θεραπευτική πρόοδος και προκλήσεις Θεραπεία ARV: τα πλεονεκτήματα επιβίωσης είναι τεράστια ΑΛΛΑ υπάρχουν οικονομικοί περιορισμοί στη μακροχρόνια commitment διάρκεια ζωής Επιπλοκές (ανθεκτικότητα στα φάρμακα, μεταβολικές διαταραχές ) - Έρευνα για ΘΕΡΑΠΕΙΑ της λοίμωξης HIV. Θεραπεία και εμβόλια: Επιστημονικές προκλήσεις Γενετική μεταβλητότητα του HIV - υπεκφυγή του ιού από το ανοσιακό σύστημα Πρώιμη εδραίωση - εγκατάσταση αποθεμάτων ιού Μετάδοση από κύτταρο σε κύτταρο Συσχέτιση της προστασίας είναι ακόμη ακαθόριστηαπροσδιόριστη Ο HIV μολύνει, αποδιοργανώνει και/ή εξαλείφει τα κύτταρα (key players)-κλειδιά του ανοσιακού συστήματος Γρήγορη ένταξη δυσλειτουργίας των ανοσιακών αποκρίσεων Περιορισμοί του ζωικού μοντέλου. 7

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Η έρευνα του HIV/AIDS 25 χρόνια μετά Επιτακτική ανάγκη: Φροντίδα, θεραπεία και πρόληψη Προτεραιότητες για μελλοντική έρευνα-διερεύνηση: 1. Αρχικά γεγονότα κατά τη διάρκεια της οξείας φάσης της λοίμωξης (ενεργοποίηση ανοσιακού συστήματος, φυσική και ειδική ανοσιακή απόκριση, crosstalk επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων ανοσιακού συστήματος, μηχανισμοί και συσχετίσεις προστασίας, ρόλος της γενετικής του ξενιστή) 2. Αποθέματα HIV (μηχανισμοί εγκατάστασης και επιμονής-εμμονής, μείωση-κένωση αποθεμάτων) 3. Αλληλεπίδραση μεταξύ ιικών παραγόντων και κυτταρικών συνεργατών 4. Συλλοιμώξεις. Νέες προσεγγίσεις θεραπείας και εμβολίων Νέοι στόχοι sirna; Περιορισμοί μικροβιακής αντιμετάθεσης; Θεραπευτικό εμβόλιο; Έρευνα εμβολίου: Ελπίδα και πρόοδος Αλλαγή από τις συμβατικές στις νέες στρατηγικές HIV στη μετά-σταδιου εποχή Καλύτερη κατανόηση των αρχικών γεγονότων της HIV λοίμωξης Καλύτερη κατανόηση της βασικής ανοσολογίας της HIV λοίμωξης Διεθνή πρακτικά για την προώθηση συνεργασίας. Ο Δρ. Montagnier έκλεισε την ομιλία του με τη φράση: «Οι προοπτικές της Ιατρικής του 21 ου αιώνα είναι: περισσότερη πρόληψη απ ό,τι θεραπεία». Ευχόμαστε να είναι στόχος όλων τόσο στη θεωρία όσο και στην πράξη! Βιβλιογραφία-Πηγές 1. http://nobelprize.org/index.html 2. http://www.aidsorigins.com/ 3. ο Χατζοπούλου Δήμητρα, 9 Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης ΕΕΚΧ-ΚΒ, Ιογενείς λοιμώξεις-aids, Αθήνα 24/01/09, σελ. 68-79. 4. http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2008/ montagnier-lecture.html 5. http://everydayscience.org/2009/02/francoise-barre-sinoussivirologist1947-07-30/ 6. http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2008/ barre-sinoussi-lecture.html 7. http://www.faqs.org/forum/ 8. http://www.witi.com/ 8

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 HPV και καρκίνος: Nobel Ιατρικής 2008 Λάμπρος Δημητρακόπουλος Χημικός, Μεταπτυχιακός φοιτητής Ειδίκευσης στην Κλινική Χημεία, Τμήμα Χημείας, Παν/μίου Αθηνών Από τις 23 έως και τις 25 Ιανουαρίου πραγματοποιήθηκε με επιτυχία στην Αθήνα το 8 ο Πανελλήνιο Κυτταρολογικό Συνέδριο, που διοργάνωσε η Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Kυτταρολογίας. Το συνέδριο αυτό συνέπεσε με τη συμπλήρωση 125 ετών από τη γέννηση του Γεώργιου Ν. Παπανικολάου, ο οποίος θεωρείται ο Πατέρας της ειδικότητας της κυτταρολογίας. Ο Παπανικολάου έβαλε τα θεμέλια της πρόληψης και έδωσε ελπίδα ζωής σε εκατομμύρια γυναίκες σε όλο τον κόσμο με την κυτταρολογική εξέταση «Παπανικολάου», το γνωστό Pap Test. Την εναρκτήρια τελετή του συνεδρίου, τίμησε με την παρουσία του και ήταν ο κύριος ομιλητής ο Γερμανός Καθηγητής Harald zur Hausen. Ο zur Hausen έιναι επίτιμος Καθηγητής στο Γερμανικό Κέντρο Έρευνας Καρκίνου στη Χαϊδελβέργη, στο οποίο διατέλεσε πρόεδρος επί σειρά ετών. Το 2008 τιμήθηκε με το βραβείο Nobel Ιατρικής-Φυσιολογίας για τη μετά από έρευνες συσχέτιση του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων HPV με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Μοιράστηκε το βραβείο με τον Luc Montagner και τη Françoise Barré-Sinoussi, που τιμήθηκαν με τη σειρά τους για την ανακάλυψη του ιού HIV. Επίσης, έχει βραβευθεί από την Αμερικανική Εταιρεία Έρευνας Καρκίνου (AACR). Κατά την ομιλία του, αρχικά αναφέρθηκε στους κυριότερους ιούς και βακτήρια που έχει αποδειχθεί ότι έχουν ογκογόνο δράση. Συγκεκριμένα, οι ιοί της ηπατίτιδας σχετίζονται με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ), το ελικοβακτηρίδιο με καρκίνο στομάχου, ένας τύπος ιού του έρπητα (Kaposi s sarcoma-associated herpes virus) με σαρκώματα Kaposi και λεμφώματα και ο ιός Epstein-Barr (EBV) με ορισμένα είδη λεμφωμάτων και καρκίνο του φάρυγγα. Στη συνέχεια, η ομιλία του επικεντρώθηκε στον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV), ο οποίος έχει συσχετισθεί με καρκίνο δέρματος, πρωκτού, στόματος και φάρυγγα, εκτός του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, ο επιπολασμός του οποίου οδήγησε στην προσπάθεια ανάπτυξης προληπτικού εμβολίου έναντι του ιού, προσπάθεια που στέφθηκε με απόλυτη επιτυχία. Στη συνέχεια σε μία ιστορική αναδρομή παρατηρούμε αναφορές σε κονδυλώματα στο δέρμα και στην περιοχή των γεννητικών οργάνων ήδη από την εποχή των αρχαίων Ελλήνων και των Ρωμαίων. Θεωρούνταν μολυσματικές και τις εκλάμβαναν ως αποτέλεσμα έντονης σεξουαλικής δραστηριότητας. Μία μελέτη στη μεταναγεννησιακή Ιταλία έδειξε υψηλή συχνότητα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας σε παντρεμένες γυναίκες, χήρες και σε εκδιδόμενες γυναίκες, σε αντίθεση με την εξαιρετικά χαμηλή συχνότητα σε παρθένες και καλόγριες. Παρά την έντονη ανάπτυξη της βακτηριολογίας στα χρόνια που ακολούθησαν, έπρεπε να φτάσουμε στο τέλος της δεκαετίας του 60 του προηγούμενου αιώνα για να ληφθούν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα όσον αφορά τη συσχέτιση του καρκίνου με τη σεξουαλική συμπεριφορά, παρότι στις αρχές του αιώνα επιβεβαιώθηκε η μολυσματική φύση των κονδυλωμάτων και επιβεβαιώθηκε ότι οφείλονται σε κάποιον ιικό παράγοντα, ο οποίος παρατηρήθηκε στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο για πρώτη φορά το 1949. Η ογκογόνος δράση ιών θηλωμάτων επιβεβαιώθηκε σε κουνέλια πριν ακόμα εστιαστεί η έρευνα στους ιούς των ανθρώπινων θηλωμάτων. Το 1965 για πρώτη φορά περιγράφηκε το δίκλωνο κυκλικό DNA του HPV και ο Zur Hausen το 1974 με μελέτες υβριδισμού in vitro ιικού RNA και DNA από βιοψίες δέρματος, κονδυλωμάτων και καρκίνου του τραχήλου της μήτρας επιβεβαίωσε τη μεγάλη ετερογένεια του ιού. Στη συνέχεια, η έρευνα εστίασε στη συσχέτιση των κονδυλωμάτων, που οφείλονταν στον HPV και στην ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, υπόθεση που ενισχύθηκε σε μεγάλο βαθμό από αποτυχημένες προσπάθειες για να συσχετισθεί η εμφάνιση του καρκίνου με τον ιό του απλού έρπητα τύπου 2. Το 1982, τρεις εργασίες κατέδειξαν την παρουσία διαφορετικών υποτύπων του ιού σε βιοψίες κονδυλωμάτων και καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Υβριδοποιήσεις στυπωμάτων κατά Southern επέτρεψαν την ταυτοποίηση ενός ακόμα υποτύπου του ιού, έως ότου το 1984 απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν από βιοψίες καρκίνου του τραχήλου καθώς και από καρκινικές κυτταρικές σειρές που προήλθαν από τον τράχηλο της μήτρας (π.χ. HeLa), οι υπότυποι 16 και 18 του ιού οι οποίοι, απ ό,τι γνωρίζουμε σήμερα, αποτελούν τους πλέον επικίνδυνους για καρκινογένεση. Από το 1985 και έπειτα η έρευνα κατέδειξε τις πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 του ιού ως κύριες υπεύθυνες για εμπλοκή στα μονοπάτια καρκινογένεσης γεγονός που επιβεβαιώθηκε το 1993 από πειράματα σε διαγονιδιακά ζώα. Η μόλυνση με τον HPV αποτελεί το πλέον σύνηθες σεξουαλικώς μεταδιδόμενο νόσημα και υπολογίζεται ότι το 9

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ 70% των σεξουαλικώς ενεργών γυναικών θα μολυνθούν σε κάποια στιγμή της ζωής τους. Έχουν απομονωθεί περισσότεροι από 100 υπότυποι του ιού, τουλάχιστον 40 εκ των οποίων μολύνουν τα επιθηλιακά κύτταρα και κατατάσσονται σε υψηλού κινδύνου, πιθανώς υψηλού κινδύνου και σε χαμηλού κινδύνου. Οι υπότυποι υψηλού κινδύνου σχετίζονται με το 90% των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Μόλυνση με κάποιον από αυτούς τους υπότυπους (16, 18 και 31), προκαλεί αρχικά ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία του τραχήλου (CIN) που μετά από χρόνια οδηγεί σε καρκίνο. Κάθε χρόνο διαγιγνώσκονται 500.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου και η θνησιμότητα αγγίζει το ένα τρίτο αυτών, καθιστώντας τον δεύτερο καρκίνο σε θνησιμότητα όσον αφορά τις γυναίκες. Πρώιμη διάγνωση μέσω του Pap Test οδηγεί σε μείωση του επιπολασμού σε ανεπτυγμένες χώρες τα τελευταία χρόνια, σε αντίθεση με τις αναπτυσσόμενες χώρες και χώρες όπου ολοένα και μειώνεται η ηλικία της πρώτης σεξουαλικής επαφής των νεαρών κοριτσιών, όπως στην Ιαπωνία. Οι HPV είναι μικροί ιοί, δεν διαθέτουν ιικό φάκελο και περιέχουν ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA μήκους 8.000 ζευγών βάσεων περίπου. Το γονιδίωμα περιέχει μία ανοδικά ρυθμιστική περιοχή (URR) και οκτώ ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που αντιστοιχούν σε έξι γονίδια που εκφράζονται άμεσα με την είσοδο του ιού στο κύτταρο (E1, E2, E4, E5, E6, E7), και σε δύο γονίδια που εκφράζονται έπειτα από κάποιο χρονικό διάστημα (L1, L2). Τα μεν πρώτα συμμετέχουν στην αντιγραφή του ιού, ενώ τα δεύτερα κωδικεύουν τις πρωτεΐνες του καψιδίου του ιού. Τα παραπάνω φαίνονται στην Εικόνα 1. Ο ιός έχει τη δυνατότητα να εμποδίζει τους αμυντικούς φραγμούς του οργανισμού, αλλά παρόλα αυτά, στις περισσότερες μολύνσεις με HPV τα τραύματα που προκαλούνται από τον ιό υποχωρούν σε ένα χρόνο περίπου, διότι καταπολεμούνται αποτελεσματικά από το ανοσοποιητικό σύστημα. Όμως, ένα μέρος των μολυσμένων κυττάρων μπορεί να διαφύγουν και έτσι να παραμείνει η μόλυνση για χρόνια ή ακόμα και για δεκαετίες. Συνεπώς, καθίσταται σαφές ότι η HPV μόλυνση είναι απαραίτητη αλλά όχι αρκετή για την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου. Οι πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 των υποτύπων υψηλού κινδύνου του ιού προκαλούν υποέκφραση γονιδίων στα οποία αποκρίνεται η ιντερφερόνη, η οποία με τη σειρά της παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Συνεπώς, τα μολυσμένα κύτταρα δεν καταστρέφονται και η χρόνια μόλυνση που ακολουθεί αυξάνει τον κίνδυνο για την ανάπτυξη κακοήθειας. Η μεταγραφή των γονιδίων των πρωτεϊνών Ε6 και Ε7 ρυθμίζεται αυστηρά από τον παράγοντα μεταγραφής Ε2 και συνεπώς, η έκφρασή τους σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα είναι δύσκολα ανιχνεύσιμη. Το ίδιο συμβαίνει και σε CIN χαμηλής διαφοροποίησης, σε αντίθεση με CIN υψηλής διαφοροποίησης και σε καρκινικά κύτταρα, όπου παρατηρούνται υψηλά επίπεδα έκφρασης των δύο πρωτεϊνών. Σε αυτή την περίπτωση το DNA του ιού πολύ συχνά ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του κυττάρου-ξενιστή. Ο μοριακός μηχανισμός της ενσωμάτωσης έχει μελετηθεί σε πολύ μικρό βαθμό, όμως μία πιθανή θέση ενσωμάτωσης είναι το χρωμόσωμα 8p24 κοντά στον γενετικό τόπο του γονιδίου του c-myc. Η ενσωμάτωση αυτή οδηγεί στην απενεργοποίηση του παράγοντα Ε2. Η απενεργοποίηση του παράγοντα Ε2 πριν την καταστροφή των μολυσμένων κυττάρων από το ανοσοποιητικό σύστημα, έχει σαν αποτέλεσμα την υπερέκφραση των Ε6 και Ε7 και κατά συνέπεια τον καρκινικό μετασχηματισμό τους, πορεία που αναστρέφεται με επανέκφραση του Ε2. Η υπερέκφραση των Ε6 και Ε7 θεωρείται το καθοριστικό στάδιο στην πολυσταδιακή πορεία της καρκινογένεσης, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 2. Εικόνα 1. Ο υπότυπος 16 του HPV. Εικόνα 2. Η επαγόμενη καρκινογένεση από τον HPV. Όπως φαίνεται και στην εικόνα, οι πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 ευνοούν τον καρκινικό μετασχηματισμό επιτελώντας διάφορες λειτουργίες όπως η ενεργοποίηση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (htert), η οποία συνδέεται άμεσα με κυτταρική αθανασία, η απενεργοποίηση του 10

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 και η επακόλουθη υποέκφραση του Notch1, η αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη p600 και η αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες, που διαθέτουν κάποιο μοτίβο PDZ. Επίσης, υπάρχουν και άλλες λειτουργίες τους με τις οποίες συμβάλλουν στην καρκινογένεση, στις οποίες εμπλέκονται οιστρογόνα και γονίδια που αποκρίνονται σε οιστρογόνα, όπως είναι το ογκοκατασταλτικό γονίδιο BRCA1. Μελέτες που αφορούσαν ένα συνθετικό γονίδιο για την πρωτεΐνη Ε7 (ποντίκια που είχαν εμβολιαστεί με πλασμίδια που εξέφραζαν το συνθετικό αυτό γονίδιο, παράγοντας πολύ μεγαλύτερες ποσότητες αντισωμάτων για την Ε7 σε σχέση με ποντίκια στα οποία είχε εμβολιαστεί το γονίδιο αγρίου τύπου) οδήγησαν στην ανάπτυξη του προληπτικού εμβολίου. Ένα εμβόλιο που καλύπτει τους υποτύπους 6, 11, 16 και 18 (Gardasil, Merck) και ένα που καλύπτει τους υποτύπους 16 και 18 (Cervarix, GlaxoSmithKline). Αναφορές από κλινικές δοκιμές φάσης III, έχουν καταδείξει την αποτελεσματικότητα των εμβολίων όσον αφορά την πρόληψη της μόλυνσης καθώς και της κακοήθους εξαλλαγής. Τα δύο αυτά εμβόλια πήραν έγκριση από το FDA τον Ιούνιο του 2006. Παρότι αυτά τα εμβόλια αναμένεται να προφυλάσσουν έναντι του καρκίνου του τραχήλου σε ποσοστό 70%, ο εμβολιασμός δεν αναμένεται να είναι αποτελεσματικός σε γυναίκες που έχουν ήδη μολυνθεί από τον ιό, ενώ ο χρόνος που το εμβόλιο προσφέρει την προστατευτική του δράση δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόμα. Ο zur Hausen αναγνώρισε το μεγάλο κόστος του εμβολίου ως ένα σημαντικό μειονέκτημα και έθεσε ως επόμενους στόχους τη μείωση της τιμής του εμβολίου και την προσβασιμότητά του στις αναπτυσσόμενες χώρες, που άλλωστε το έχουν και μεγαλύτερη ανάγκη. Επιπλέον, αναφέρθηκε στον επαναπροσδιορισμό της ηλικίας των γυναικών που πρέπει να εμβολιάζονται επεκτείνοντας την ηλικία αυτή μέχρι και τα 22 έτη. Τέλος, υπογράμμισε ότι σε καμία περίπτωση δεν θα πρέπει να υπάρξει άκρατος εφησυχασμός από την πλευρά των νεαρών γυναικών που θα μπορούσε να οδηγήσει σε επικίνδυνες σεξουαλικές συμπεριφορές. Και φυσικά τίποτα δεν τελειώνει εδώ, καθώς μελέτες για την ανάπτυξη νέων μεθόδων προφύλαξης έναντι του ιού, στοχεύουν στην πρωτεΐνη Ε2, η έκφραση της οποίας σταματά την πορεία της καρκινογένεσης και ξαναθέτει τα κύτταρα στη φυσιολογική πορεία της γήρανσης επανενεργοποιώντας ανενεργά ογκοκατασταλτικά μονοπάτια. Και ενώ θα πρέπει να περιμένουμε 20-30 χρόνια για να επιβεβαιωθεί η δραστικότητα του εμβολίου έως ότου οι κοπέλες 12-13, χρόνων που έχουν ήδη εμβολιαστεί, φθάσουν στην τέταρτη δεκαετία της ζωής τους όπου εμφανίζεται ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας σε πολύ μεγάλο ποσοστό, ο Harald zur Hausen έχει ήδη κερδίσει τον απόλυτο σεβασμό όλων των άμεσα και έμμεσα εμπλεκόμενων. Στις αρχές τις δεκαετίας του 80 πήγε «κόντρα στο τρέχον δόγμα της εποχής», όπως αναφέρεται και στην ανακοίνωση του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, που απονέμει το Νόμπελ Ιατρικής. Τότε κανείς δεν πίστευε ότι κάποιος ιός θα μπορούσε να προκαλεί καρκίνο και όλοι θεωρούσαν τους περιβαλλοντικούς παράγοντες και τη γενετική προδιάθεση ως αποκλειστικούς υπεύθυνους για την καρκινογένεση. Και οι λίγοι που παρέμειναν δύσπιστοι ως προς την ογκογόνο δράση των ιών, και πεισματικά θεωρούσαν ως μεμονωμένη περίπτωση τον HPV και τη συσχέτισή του με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, θα πρέπει να έχουν αναθεωρήσει την άποψή τους όταν μόλις πέρυσι ο zur Hausen κατάφερε να συσχετίσει ειδικά τον MC-Polyomavirus με το καρκίνωμα των κυττάρων Merkel, που είναι ένας σπάνιος καρκίνος με νευροενδοκρινή αιτιολογία. Πλέον, δεν έχουμε παρά να παρακολουθούμε με ενδιαφέρον τις εξελίξεις για να δούμε πόσα ακόμα μέλη θα προστεθούν στην ήδη πολυμελή οικογένεια των ογκοϊών... Βιβλιογραφία Harald zur Hausen (Γερμανία, 1936). Ιατρός ιολόγος, παντρεμένος επίσης με την ιολόγο Ethel-Michelle de Villiers με την οποία ανακάλυψαν μαζί τον HPV6 στο γεννητικό σύστημα. Υπέστη στην αρχή μεγάλη κριτική από τους συναδέλφους του, όταν υποστήριξε ότι οι ιοί μπορεί να έχουν καρκινογόνο δράση. Εργάζεται στο Γερμανικό Κέντρο Έρευνας για τον καρκίνο. 1. T. Yugawa, T. Kiyono. Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Reviews in Medical Virology. (2009). 2. H. zur Hausen. Papillomaviruses in the causation of human cancers-a brief historical account. Virology. (2008). 3. Z. Chustecka. Nobel-winning discovery of HPV-Cervical cancer link already having an impact on Medicine. Medscape Medical news (2008). 4. A. K. Lie, G. Kristensen. Human Papillomavirus E6/E7 mrna testing as a predictive marker for cervical carcinoma. Expert reviews of Molecular Diagnostics, 8(4): 405-415 (2008). 5. H. zur Hausen. Novel human polyomaviruses-re-emergence of a well known virus family as possible human carcinogens. International Journal of Cancer, 123, 247-250 (2008). 6. E. de Villiers, C. Fauquet, T. R. Broker, H. Bernard, H. zur Hausen. Classification of papillomaviruses. Virology, 324, 17-27 (2004). 7. A. Cid-Arregui, V. Juarez, H. zur Hausen. A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies. Jounal of Virology, Vol. 77, No. 8 p. 4928-4937 (2003). 8. H. zur Hausen. Perspectives of contemporary papillomavirus research. Vaccine. 24S3 S3/iii-S3/iv (2006). 11

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη Το επιστημονικό υπόβαθρο του Nobel Χημείας 2008 Κλεοπάτρα Δάγλα Χημικός, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια ειδίκευσης Κλινικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Παν/μίου Αθηνών Το Νοbel Χημείας για το 2008 απονεμήθηκε στους Osamu Shimomura, Martin Chalfie και Roger Y. Tsien για την ανακάλυψη και ανάπτυξη της Πράσινης Φθορίζουσας Πρωτεΐνης (green fluorecent protein - GFP). Κατά τον 20 αιώνα τέθηκαν τα θεμέλια της βιοχημείας, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για να εξερευνηθούν οι βασικές αρχές των αναβολικών και καταβολικών μονοπατιών στους ζωντανούς οργανισμούς. Ακόμα κατανοήθηκε η λειτουργία των ενζύμων και βρέθηκαν οι δομές των πρωτεϊνών. Στο δεύτερο μισό του αιώνα αναδείχθηκε η μοντέρνα γονιδιωματική, που με τη βοήθεια της βιοπληροφορικής είχε μεγάλες επιπτώσεις στην ιατρική, τη φαρμακολογία και την οικολογία. Ωστόσο, ούτε η βιοχημική ούτε η γενετική επανάσταση δεν παρείχαν τα πειραματικά εργαλεία, που θα επέτρεπαν την ποσοτική και πειραματικά σωστά καθορισμένη παρακολούθηση σε μοριακό επίπεδο των ενδοκυττάριων διαδικασιών που καθορίζουν τη δυναμική συμπεριφορά όλων των ζωντανών συστημάτων. Στις αρχές του 21 ου αιώνα γινόμαστε μάρτυρες μίας ραγδαίας ανάπτυξης τέτοιων εργαλείων, που βασίζονται στην GFP από τη μέδουσα Aequorea victoria, τους συγγενείς της από άλλα είδη και τις γενετικά κατασκευασμένες παραλλαγές της, που αποτελούν μέλη της οικογένειας των GFP πρωτεϊνών. Αυτές οι πρωτεΐνες, που μοιάζουν με την GFP, επιτρέπουν την παρακολούθηση στο χώρο και το χρόνο ενός αυξανόμενου αριθμού φαινομένων σε ζωντανά κύτταρα και οργανισμούς, όπως η έκφραση γονιδίων, και η εντόπιση των πρωτεϊνών, είναι δε εφικτό να έχουμε απεικονίσεις με ανάλυση μεγαλύτερη από το όριο διάθλασης. Ακόμη, αισθητήρες που μετρούν το ph, διάφορες συγκεντρώσεις και άλλα ουσιαστικά χαρακτηριστικά του εσωτερικού των ζωντανών κυττάρων έχουν κατασκευαστεί από τις πρωτεΐνες, που μοιάζουν με την GFP. Η τεχνική επανάσταση, που ήταν αποτέλεσμα της ανακάλυψης της GFP συνδέεται με μία θαυμαστή ιδιότητα του υπεύθυνου για τον φθορισμό της χρωμοφόρου. Αυτό το χρωμοφόρο σχηματίζεται αυθόρμητα από ένα τριπεπτιδικό μοτίβο στην αρχική δομή της GFP, ώστε ο φθορισμός του να ανάβει «αυτόματα» σε κάθε οργανισμό, όπου εκφράζεται. Με άλλα λόγια, η ωρίμανση του χρωμοφόρου, που βασίζεται στο τριπεπτίδιο της GFP απαιτεί μόνο οξυγόνο και δεν εξαρτάται από την παρουσία ενζύμων ή άλλων βοηθητικών παραγόντων. Η GFP και οι συγγενείς παραλλαγές της παρέχουν καθολικές γενετικές ετικέτες, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να καταστεί ορατός απεριόριστος αριθμός χωροχρονικών διαδικασιών στα ζωντανά κύτταρα. Εικόνα 1. Η τεταρτοταγής δομή της GFP, όπου φαίνεται το κυλινδρικό της σχήμα με την α-έλικα, η οποία περιλαμβάνει το χρωμοφόρο, να εξέχει σαν κλωστή από τον κύλινδρο (Brejc et al., 1997). Η GFP είναι γενικά μη τοξική και εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε διαφορετικούς οργανισμούς με μικρές επιπτώσεις στη φυσιολογία τους (Chalfie et al., 1994). Επίσης, όταν το γονίδιο της GFP συνδέεται με το γονίδιο μίας πρωτεΐνης που θέλουμε να μελετήσουμε σε κάποιον οργανισμό που μας ενδιαφέρει, η εκφραζόμενη πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει διατηρεί τη δραστικότητα της και, ομοίως διατηρεί τον φθορισμό της η GFP, ώστε η θέση, η κίνηση και οι άλλες δραστηριότητες της πρωτεΐνης που μελετάται να μπορούν να παρακολουθούνται βλέποντας στο μικροσκόπιο τον φθορισμό της GFP (Wang και Hazelrigg, 1994). Αν ληφθούν όλα αυτά υπ όψιν, οι αξιοσημείωτες και αναπάντεχες ιδιότητες της GFP, που προέρχεται από την Aequorea victoria είναι ουσιώδεις για τη χρησιμότητά της σε μελέτες σε μοριακό επίπεδο των δυναμικών διαδικασιών σε ζωντανά κύτταρα. Οι ιδιότητες της GFP που ξεχωρίζουν είναι (i) η φωτεινότητα του μορίου, (ii) η φωτοσταθερότητά του, (iii) η ύπαρξη μορίων που μοιάζουν με την GFP, τα οποία έχουν διαφορετικά φάσματα διέγερσης και εκπομπής σε όλη την περιοχή του ορατού, (iv) η γρήγορη και αποτελεσματική αναδίπλωση της πρωτεΐνης στον ενδοκυττάριο χώρο, (v) η γρήγορη ωρίμανση του χρωμοφόρου επόμενο της αναδίπλωσης της πρωτεΐνης και (vi) η μονομερής διαμόρφωση των μορίων που μοιάζουν με την GFP, ώστε να διευκολύνεται η σύνδεσή τους με τις πρωτεΐνες που μας ενδιαφέρουν. 12

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 Εικόνα 2. Χημική αντίδραση του στιγμιαίου σχηματισμού του χρωμοφόρου GFP από το μοτίβο Ser65-Tyr66-Gly67 στη εγγενή διαμόρφωση της πρωτεΐνης παρουσία μοριακού οξυγόνου (Tsien, 1998). Ο συνδυασμός ανάμεσα στην καταλληλότητα των πρωτεϊνών που μοιάζουν με την GFP ως στοχευόμενες ενδοκυτταρικές γενετικές ετικέτες, τη ραγδαία ανάπτυξη απεικονιστικών τεχνικών και την ανάλυση δεδομένων έχει δώσει ώθηση στη χρήση της GFP στις βιολογικές επιστήμες. Βιοφυσικές μέθοδοι βασιζόμενες στον φθορισμό που έχουν αναπτυχθεί παλαιότερα όπως οι FRET, FCS, FCCS και FRAP χρησιμοποιούνται πλέον εκτενώς για την παρακολούθηση των ενδοκυτταρικών συμβάντων από σήματα που παρέχονται από τον φθορισμό των πρωτεϊνών, που μοιάζουν με την GFP. Επιπλέον, έχουν προκύψει η απεικόνιση του χρόνου ζωής του φθορισμού (FLIM), η υψηλής διακριτικότητας μικροσκοπία εντοπισμού της φωτοδιέγερσης (PALM) και άλλες μέθοδοι υψηλής διακριτικότητας που βασίζονται στην GFP. Πράγματι, καμία άλλη πρόσφατη ανακάλυψη δεν έχει τόσο μεγάλη επίπτωση στη διεξαγωγή και ερμηνεία των πειραμάτων στις βιολογικές επιστήμες, όπως αποδεικνύεται από την εμφάνιση πάνω από 20.000 δημοσιεύσεων που περιλαμβάνουν την GFP από το 1992. Η πιο κοινή χρήση της GFP είναι η παρακολούθηση της θέσης, της κίνησης και των χημικών αντιδράσεων, που περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που εκφράζονται συνδεδεμένες με την GFP. Μία άλλη εφαρμογή είναι η παρακολούθηση της χρονικής έκφρασης των γονιδίων σε μοριακές μηχανές όπως είναι η flagella, που επιτρέπει το χημειοτακτικό κολύμπι των βακτηρίων. Μέσω της έκφρασης πλήρους μεγέθους πρωτεϊνών επισημασμένων με GFP από τις ενδογενείς χρωμοσωμικές τους τοποθεσίες σε φυσιολογικά επίπεδα, έχει γίνει εφικτό να παρακολουθείται η ενδοκυττάρια τοποθεσία και συγκέντρωση του φάσματος των πρωτεϊνών ολόκληρου του πρωτεασώματος διαφορετικών οργανισμών. Ένα ακόμα παράθυρο για τη λεπτομερή μελέτη των κινητικών φαινομένων στα κύτταρα παρέχεται από τη μικροσκοπία ενός κυττάρου, με χρήση ενός μορίου που βασίζεται στον φθορισμό της GFP. Ένας μεγάλος αριθμός τεχνικών βασισμένων στην GFP έχουν χρησιμοποιηθεί για να μελετηθεί η ενδοκυττάρια κίνηση. Ακόμα, η GFP έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη οργανιδίων, που είναι συνδεδεμένα με τη μεμβράνη, και μία σημαντική ανακάλυψη είναι ότι πολλά από αυτά ανταλλάσσουν συνεχώς πρωτεϊνικά συστατικά μεταξύ τους. Στον τομέα της πυρηνικής αρχιτεκτονικής, μελέτες βασισμένες στην GFP έχουν αποκαλύψει ότι οι πυρηνικές δομές που σχηματίζονται ανάμεσα στις διάφορες φάσεις, είναι ταυτόχρονα δυναμικές και αυτο-οργανούμενες. Πρωτεΐνες συνδεδεμένες με την GFP έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για να κατασκευαστούν αισθητήρες ενδοκυττάριων παραμέτρων, όπως το ph, το Ca 2+ ή οι συγκεντρώσεις διαφόρων μεταβολιτών. Τέλος, οι παραπάνω πρωτεΐνες έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την απεικόνιση κυττάρων και ιστών σε πολυκύτταρους οργανισμούς και έχουν εξελιχθεί σε ένα πολύ σημαντικό πειραματικό εργαλείο για τη νευροβιολογία. Η GFP και οι ερευνητές που βραβεύθηκαν με το Nobel χημείας για την ανακάλυψή της Τα παρακάτω λόγια από τους Shimomoura et al. (1962) συνοψίζουν τα ευρήματα και τις ιδέες τους σχετικά με την GFP, στα πρώτα χρόνια μετά την ανακάλυψη της GFP από την ομάδα αυτού του ερευνητή: A protein giving solutions that are slightly greenish in sunlight though only yellowish under tungsten lights, and exhibiting a very bright, greenish fluorescence in the ultraviolet of a Mineralite, has also been isolated from squeezates (i.e. extracted by squeezing out the light-emitting cells of Aequorea victoria). No indications of luminescent reaction of this substance could be detected. Studies of the emission spectra of both this protein and aequorin are in progress. και it is reasonable to suppose that the greenish quality (i.e. of Aequorea bioluminescence) result from a light-filtering effect and fluorescence of the green protein which is highly concentrated in the photogenic cells (of Aequorea). Περιληπτικά, ο Shimomura συνέβαλε ουσιαστικά στην ανακάλυψη της GFP, τον καθαρισμό της και τον χαρακτηρισμό των φυσικοχημικών της ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένων και των φασμάτων διέγερσης και εκπομπής του φθορισμού της κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Απέδειξε, μαζί με τους συνεργάτες του, ότι η GFP μπορεί να είναι ο δέκτης στο φαινόμενο FRET όταν δότης είναι η ακουορίνη, που εξηγεί γιατί η Aequorea victoria εκπέμπει πράσινο και όχι μπλε φως. Τέλος, σωστά όρισε ότι το λειτουργικό τμήμα του χρωμοφόρου είναι ενσωματωμένο μέσα στην πεπτιδική αλυσίδα της GFP. Χωρίς την πρωτοπόρα ερευνά του, κυρίως με κλασικές μεθόδους καθαρισμού των πρωτεϊνών και φασματοσκοπίας, είναι πιθανό ότι η επανάσταση που έφερε η GFP θα καθυστερούσε δεκαετίες ή ακόμα θα είχε παραμείνει ένα από τα κρυμμένα μυστικά του Ειρηνικού Ωκεανού. 13

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Αφού προσπάθησαν να κλωνοποιήσουν το πλαίσιο ανοικτής ανάγνωσης της GFP ο Prasher και οι συν. έγραψαν: These (cloning) results will enable us to construct an expression vector for the preparation of non-fluorescent apogfp. Since no information is yet available regarding the biosynthesis of the chromophore, a recombinant form of this protein will be a valuable reagent with which to examine the biochemistry of chromophore formation in this unique class of proteins and the mechanism of energy transfer between aequorin and GFP. O Code και οι συνεργάτες του προσπαθώντας να βρουν το λειτουργικό πυρήνα του χρωμοφόρου έγραψαν: The posttranslational events required for chromophore formation are not yet understood. It is very unlikely that the chromophore forms spontaneously, but its formation probably requires some enzymatic machinery. Ο Martin Chalfie, ο οποίος έκανε το μεταδιδακτορικό του δίπλα στον Sidney Brenner στο Cambridge, όταν συνδέθηκε με το πανεπιστήμιο της Columbia πήρε τον κλώνο του γονιδίου της GFP (gfp) από τον Prasher το 1992 και το εξέφρασε στο βακτήριο E. coli την ίδια χρονιά. Η πρωτεΐνη GFP επέδειξε έναν έντονο, πράσινο φθορισμό σε αυτόν τον ετερογενή οργανισμό, προτείνοντας ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν ένας ευπροσάρμοστος γενετικός δείκτης σε όλους τους οργανισμούς. Το 1994 έγραψε: chromophore formation is not species specific and occurs either through the use of ubiquitous cellular components or by autocatalysis. Συνοψίζοντας, ο Martin Chalfie, με έναν κλώνο του GFP που απέκτησε από τον Douglas Prasher, ήταν ο πρώτος που έδειξε ότι η GFP στη φθορίζουσα μορφή της μπορεί να εκφράζεται και στο E. coli και στον C. elegans xωρίς την προσθήκη ετερόλογων βοηθητικών παραγόντων. Αυτά τα αποτελέσματα αποτέλεσαν σημαντική ανακάλυψη γιατί έδειξαν ότι η GFP είναι εφικτό να χρησιμοποιηθεί σαν καθολικός γενετικός δείκτης, και έτσι άνοιξαν την πόρτα σε ένα σύμπαν πειραματικών πιθανοτήτων για ποσοτικές μελέτες δυναμικών διαδικασιών σε ζωντανά κύτταρα από τις οποίες επωφελούμαστε σήμερα. Ο Tsien και οι συνεργάτες του είπαν ότι η πληροφορία από το φθορίζον χρωμοφόρο της GFP προκύπτει μεταμεταφραστικά με μόνο βοηθητικό παράγοντα το μοριακό οξυγόνο. Εφόσον το μοριακό οξυγόνο είναι πανταχού παρόν σε όλα τα αερόβια ζωντανά κύτταρα, η ανακάλυψή τους εξηγούσε γιατί η GFP φθόριζε αβίαστα σε κάθε οργανισμό που είχε μέχρι τότε εκφρασθεί και πρότεινε ότι το ίδιο θα ήταν γεγονός για κάθε αερόβιο ζωντανό οργανισμό στον οποίο θα γινόταν προσπάθεια να εκφρασθεί η GFP. Πρότειναν επίσης τον χημικό μηχανισμό για τον σχηματισμό του χρωμοφόρου. Συνοπτικά, ο Roger Tsien έχει συνεισφέρει δημιουργικά στην κατανόηση των χημικών αντιδράσεων που προκαλούν τον φθορισμό της GFP και των άλλων μελών της οικογένειάς της. Έχει προσφέρει εκτενώς στην ανάπτυξη παραλλαγών της GFP με εκπομπή φθορισμού σε όλο το ορατό φάσμα, με αυξημένη ένταση και φωτοσταθερότητα και βελτιωμένες ιδιότητες αναδίπλωσης μαζί με γρήγορη ωρίμανση των χρωμοφόρων τους. Η έρευνα του Roger Tsien είναι θεμελιώδης για την ανάπτυξη της GFP και των πρωτεϊνών που μοιάζουν με την GFP στους ιδιαίτερα αποδοτικούς γενετικούς δείκτες που σήμερα αποτελούν ένα καθολικό «κουτί εργαλείων» για τη μελέτη δυναμικών διαδικασιών σε όλα τα ζωντανά συστήματα. Είναι φανερό ότι όλοι οι βραβευθέντες συνέβαλαν σημαντικά στην ανακάλυψη της εκπληκτικής αυτής «πράσινης» πρωτεΐνης και ότι πολλά έχουμε ακόμη να ακούσουμε για αυτή στο μέλλον. Είναι επίσης φανερό ότι σε κάθε σημαντική ανακάλυψη συνεισφέρουν πολλοί γνωστοί και μη, βάζοντας ο καθένας το λιθαράκι του στην εξέλιξη της διαδικασίας. Osamu Shimomura (Κυότο Ιαπωνίας 1928), οργανικός χημικός. Σε ηλικία 16 ετών τυφλώθηκε από την ατομική βόμβα στο Ναγκασάκι. Παντρεμένος επίσης με οργανική χημικό, συνεργάτιδά του στην έρευνα. Εργάζεται στη Βοστόνη, ΗΠΑ. Martin Chalfie, νευροβιολόγος, (ΗΠΑ 1947). Το πρώτο του πτυχίο ήταν στα Μαθηματικά, σπούδασε επίσης νομικά, θέατρο, υπήρξε πρωταθλητής κολύμβησης, έκανε ποικιλία επαγγελμάτων. Παντρεμένος επίσης με ερευνήτρια που ασχολήθηκε με την GFP. Εργάζεται στο Πανεπιστήμιο Columbia. Roger Y. Tsien, (Νέα Υόρκη, Η.Π.Α. 1952). Απόγονος βασιλικής οικογένειας της Κίνας, με πολλούς εξαιρετικούς μηχανικούς στην οικογένειά του. Με βασικά πτυχία στη φυσική και τη χημεία και μεταπτυχιακό στη φυσιολογία, θεωρεί τον εαυτό του μοριακό μηχανικό. Εργάζεται στο San Diego και μεταξύ άλλων προωθεί την εκπαίδευση ελπιδοφόρων φοιτητών με το San Diego Science Festival. 14

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 Ορθολογιστική παρουσίαση αποτελεσμάτων δοκιμών με βάση την αβεβαιότητα των μετρήσεων Μιχαήλ Α. Κουππάρης Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Παν/μίου Αθηνών Η έκθεση αποτελεσμάτων δοκιμών πρέπει να περιλαμβάνει μια ορθολογιστική παρουσίαση των αποτελεσμάτων των αναλύσεων/δοκιμών με βάση την αβεβαιότητα των μεθόδων που χρησιμοποιούνται. Σύμφωνα με τα πρότυπα διαπίστευσης ISO 17025 και ISO 15189: «τα αποτελέσματα πρέπει να εκτίθενται με ακρίβεια, με σαφήνεια, χωρίς αμφιβολίες, και με αντικειμενικότητα». Ένα σύνηθες πρόβλημα κατά τη γραφή των αποτελεσμάτων είναι με πόσα ψηφία πρέπει να γραφεί ένα αποτέλεσμα. Σε περιπτώσεις αποτελεσμάτων που δίνονται από αυτόματους αναλυτές και η ανάλυση γίνεται εις απλούν δεν υπάρχει δυσκολία, γιατί συνήθως το λογισμικό του αναλυτή έχει προγραμματισθεί να παρέχει το αποτέλεσμα με τον ορθό αριθμό ψηφίων. Η δυσκολία αρχίζει όταν γίνονται παραπάνω από μία ανάλυση και πρέπει να δοθεί το αποτέλεσμα ως μέσος όρος n μετρήσεων ή το αποτέλεσμα υπολογίζεται χρησιμοποιώντας διάφορες εξισώσεις που συσχετίζουν το τελικό αποτέλεσμα με πειραματικές μετρήσεις (υπολογιστικός προσδιορισμός παραμέτρων, αραιώσεις, χρήση καμπυλών βαθμονόμησης). Σε κάθε περίπτωση, κατά τη γραφή ενός αποτελέσματος λαμβάνονται υπόψη οι εξής κανόνες: Το αποτέλεσμα δεν πρέπει να έχει μικρότερη αβεβαιότητα από το πλέον αβέβαιο πειραματικό δεδομένο το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του. Το αποτέλεσμα μίας μεθόδου πρέπει να γράφεται με τόσα ψηφία, όσα καθορίζονται από την αβεβαιότητα (Uncertainty, U) της μεθόδου, όπως αυτή υπολογίζεται με βάση την τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας (reproducibility standard deviation, SD R ) και είναι συνήθως U = 2 x SD R (για στάθμη εμπιστοσύνης 95%). Η τυπική απόκλιση είναι μέτρο της απόλυτης αβεβαιότητας και έχει μονάδες της αντίστοιχης παραμέτρου, ενώ η %σχετική απόκλιση, %RSD ή %CV είναι μέτρο της σχετικής αβεβαιότητας και δεν έχει μονάδες. Για να εφαρμοσθούν οι παραπάνω κανόνες πρέπει να γίνει κατανοητή η έννοια των σημαντικών ψηφίων (significant figures) των πειραματικών αριθμών. Σημαντικά ψηφία ενός πειραματικού αριθμού είναι αυτά τα οποία στερούνται αβεβαιότητας συν το πρώτο αβέβαιο ψηφίο. Τα μηδενικά ψηφία πριν από μη μηδενικό ψηφίο δεν θεωρούνται σημαντικά, ενώ τα μηδενικά ψηφία μεταξύ μη μηδενικών ψηφίων ή στο τέλος του αριθμού, θεωρούνται σημαντικά ψηφία. Για κάθε πειραματικό αριθμό θεωρείται ότι το τελευταίο ψηφίο του είναι αβέβαιο κατά ±1 μονάδα, εκτός εάν είναι γνωστή η SD των μετρήσεων, οπότε η αβεβαιότητα του αριθμού είναι ±SD. Παραδείγματα σημαντικών ψηφίων αποτελεσμάτων που δίνει ένας αυτόματος αναλυτής: 0,015 mg/dl: Θεωρείται αβεβαιότητα μέτρησης ±0,001 mg/dl, οπότε έχουμε 1 βέβαιο (τα αρχικά μηδενικά δεν είναι σημαντικά) + 1 αβέβαιο = 2 σημαντικά ψηφία. 1,00 mg/dl: Θεωρείται αβεβαιότητα μέτρησης ±0,01 mg/dl, οπότε έχουμε 2 βέβαια (τα μηδενικά στο τέλος είναι σημαντικά) + 1 αβέβαιο = 3 σημαντικά ψηφία. 204 mg/dl: θεωρείται αβεβαιότητα μέτρησης ±1 mg/dl, οπότε έχουμε 2 βέβαια (το ενδιάμεσο μηδενικό είναι σημαντικό) + 1 αβέβαιο = 3 σημαντικά ψηφία. 2,32 10 6 κύτταρα: θεωρείται αβεβαιότητα μέτρησης ±0,01 10 6 κύτταρα, οπότε έχουμε 2 βέβαια + 1 αβέβαιο = 3 σημαντικά ψηφία. Όταν είναι γνωστή η τυπική απόκλιση ή η αβεβαιότητα της μεθόδου, τότε αυτή καθορίζει την αβεβαιότητα του αριθμού. Έχουμε συμφωνήσει η τυπική απόκλιση SD, η σχετική τυπική απόκλιση CV και η αβεβαιότητα U, να γράφεται με 2 σημαντικά ψηφία. 15

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Παραδείγματα γραφής υπολογιστικών αποτελεσμάτων με γνωστή τυπική απόκλιση (SD) ή απόλυτη αβεβαιότητα (U): 14,45678 mg/dl και SD = 0,12 mg/dl. Γράφεται: 14,46 mg/dl. 0,015678 mg/dl και U = 0,0023 mg/dl. Γράφεται: 0,0157 mg/dl 1567 mg/dl και SD = 23 mg /dl. Γράφεται: 1567 2,456789 10 6 κύτταρα και SD = 0,13 10 6 κύτταρα. Γράφεται: 2,46 10 6 κύτταρα. Επομένως, ο αριθμός γράφεται έτσι, ώστε να έχει τόσα δεκαδικά όσα έχει η τυπική απόκλιση ή η απόλυτη αβεβαιότητα, η οποία γράφεται πάντοτε με 2 σημαντικά ψηφία. Κατά τη διαγραφή των μη σημαντικών ψηφίων εφαρμόζονται οι κανόνες στρογγυλοποίησης. Παραδείγματα γραφής υπολογιστικών αποτελεσμάτων με γνωστή σχετική τυπική απόκλιση (%CV) ή σχετική αβεβαιότητα (%U): 14,45678 mg/dl και %CV = 0,83. Υπολογίζεται η SD = 14,45678 (0,83/100) = 0,12 mg/dl και γράφεται ως: 14,46 mg/dl. 0,015678 mg/dl και %U = 15. Υπολογίζεται η τυπική αβεβαιότητα U = 0,015678 (15/100) = 0,0024 mg/dl και γράφεται ως 0,0157 mg/dl. 1567 mg/dl και %CV = 1,5. Υπολογίζεται SD = 1567 (1,5/100) = 24 mg/dl και γράφεται ως 1567 mg/dl. 2,456789 x 10 6 κύτταρα και %CV = 5,3. Υπολογίζεται η SD = 2,456789 10 6 x (5,3/100) = 0,13 10 6 και γράφεται ως 2,46 10 6 κύτταρα. Σχόλιο της σύνταξης Εννοείται ότι οι κλινικοί χημικοί ξεχωρίζουν χρησιμοποιώντας με σωστό τρόπο τα σημαντικά ψηφία!!! Και όχι μόνο... 8 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΣΥΝΕ ΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Πάτρα 2-4 Οκτωβρίου 2009 Συνεδριακό Κέντρο Πανεπιστημίου Πατρών Θα χορηγηθούν Μόρια Συνεχιζόμενης Ιατρικής Εκπαίδευσης σύμφωνα με τα κριτήρια της EACCME-UEMS Πρώτη Ανακοίνωση http://www.eekx-kb.gr/8thcongress EEKX-KB Ελληνική Εταιρία Κλινικής Χημείας - Κλινικής Βιοχημείας Σημαντικές Ημερομηνίες Προθεσμία Υποβολής Περιλήψεων Εργασιών 17 ιουλίου 2009 Απαντήσεις Αποδοχής Εργασιών 31 αυγούστου 2009 Τελευταία Προθεσμία Μειωμένης Εγγραφής 10 Σεπτεμβρίου 2009 Ημερομηνίες Τέλεσης Συνεδρίου 2-4 οκτωβρίου 2009 Ώρες Συνεδριάσεων 09:00-20:00 Παρακαλούνται όλοι να υποβάλουν την περίληψη της εργασίας τους και στα αγγλικά ώστε να δημοσιευθεί σε τεύχος του περιοδικού Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) το οποίο είναι και επίσημο περιοδικό της ΕΕΚΧ-ΚΒ. Οργάνωση: 090421_01_EEKX-KB_1stAnnoun_D2.indd 1 5/13/09 9:35:48 AM 16

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 Προσδιορισμός ενδοκυττάριου, επιφανειακού και διαλυτού TNFα με κυτταρομετρία ροής Αλεξάνδρα Θεοδωρίδου Χημικός MSc Βιοχημείας Εισαγωγή Ο TNFα (Tumor Necrosis Factor-a) είναι μία πρωτεΐνη που παράγεται ύστερα από λοίμωξη ή ανοσολογική βλάβη επηρεάζοντας πολλαπλές αντιδράσεις. Οι ιδιότητες του TNFα εκτείνονται πέρα από την πολύ καλά χαρακτηρισμένη φλεγμονώδη δράση του και περιλαμβάνουν την επαγωγή της κυτταρικής διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού και του θανάτου. Η πολυπλοκότητα των αντιδράσεων που προκαλούνται από τον TNFα σχετίζονται εν μέρει με τις διαφορετικές βιοδραστηριότητες της διαλυτής και της διαμεμβρανικής μορφής του, καθώς και με τη διαφορετική λειτουργία των υποδοχέων του. Ο TNFα, παράγεται από ένα μετάγραφο με ασυνήθιστα μεγάλου μήκους και μη τυπική, αρχική αλληλουχία σε πολλούς και διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, π.χ. μακροφάγα, μονοκύτταρα, Τ, Β και ΝΚ κύτταρα. Κατά τη διέγερση του κυττάρου, το μόριο ευρίσκεται ως διαμεμβρανικός προ-tnfα, μοριακού βάρους 26 kd, αποθηκευμένος στο σύμπλεγμα Golgi. Περαιτέρω διέγερση του κυττάρου οδηγεί σε μεταφορά του μορίου στην κυτταρική μεμβράνη και στη διευθέτησή του σε σταθερά ομοτριμερή, τα οποία συνιστούν τον μεμβρανικό TNFα (memtnf). Από αυτές, τις ενσωματωμένες στη μεμβράνη μορφές, απελευθερώνεται η διαλυτή ομοτριμερής κυτοκίνη (stnf) με πρωτεολυτική διάσπαση από το μετατρεπτικό ένζυμο του TNFα (TNFα converting enzyme -TACE). Ο προ-tnfα (μοριακού βάρους 26 kd), ο μεμβρανικός TNFα και ο διαλυτός TNFα (μοριακού βάρους 51 kd) είναι βιολογικά δραστικά μόρια, ικανά να ενεργοποιούν τους δύο γνωστούς, μεμβρανικούς TNF υποδοχείς (TNF-R1 και TNF-R2), όπως φαίνεται στο σχήμα 1. Ενεργοποίηση λεμφοκυττάρων με PMA+Ιονομυκίνη και παραγωγή TNFα H ενεργοποίηση των Τ κυττάρων, μέσω μεμβρανικών υποδοχέων, σχετίζεται με την υδρόλυση των μεμβρανικών φωσφοϊνοσιτιδίων και την παραγωγή των δεύτερων μηνυμάτων ΙP 3 (1,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη) και DAG (διακυλογλυκερόλη). Η ΙP 3 επάγει την κινητοποίηση του ασβεστίου από τις ενδοκυττάριες αποθήκες προς το κυτταρόπλασμα, οδηγώντας σε αύξηση του [Ca 2+ ]. H DAG επάγει τη μετατόπιση της PKC από το κυτοσόλιο προς την πλασματική μεμβράνη και την ενεργοποίησή της, η οποία πραγματοποιείται μόνον παρουσία φωσφατιδυλοσερίνης και Ca 2+. Η PKC είναι μία κινάση σερίνης/θρεονίνης, η οποία φωσφορυλιώνει έναν μεγάλο αριθμό κυτταρικών πρωτεϊνών, αλλά συνεισφέρει και στην ενεργοποίηση της μεταγραφής ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων, συμπεριλαμβανομένου και του TNFα. Η ιονομυκίνη είναι ένα ιονοφόρο ασβεστίου το οποίο επάγει την αύξηση του κυτταροπλασματικού ασβεστίου μέσω της ικανότητάς του να δεσμεύει ιόντα Ca 2+, τόσο από τον εξωκυττάριο χώρο όσο και από τις ενδοκυττάριες αποθήκες και να τα μεταφέρει διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών προς το κυτταρόπλασμα (Σχήμα 2). Η αύξηση του [Ca 2+ ] συνεισφέρει στην ενεργοποίηση της PKC και στην επακόλουθη μεταγραφή γονιδίων. Ένας άλλος ενεργοποιητής της PKC είναι το PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate). Ο συγκεκριμένος εστέρας μιμείται την κυτταρική DAG ως δεύτερο μήνυμα, αλλά ως συνθετική ένωση, δεν μεταβολίζεται ταχέως. Η συνεχόμενη ενεργοποίηση της PKC από το PMA παρεμβαίνει στη φυσιολογική ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και στη μεταγραφή γονιδίων. Ωστόσο, για τη βέλτιστη ενεργοποίηση της PKC απαιτείται συνεργία του PMA και της ιονομυκίνης, δεδομένου ότι το κυτοσολικό ασβέστιο διευκολύνει την ενεργοποίηση της PKC. Σχήμα 1. Μεμβρανική και διαλυτή μορφή του TNFα (memtnf και stnf). (α) (β) Σχήμα 2. Δομή της ιονομυκίνης (α) και του PMA (β). 17

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται τρεις διαφορετικές μέθοδοι, προσδιορισμού TNFα με κυτταρομετρία ροής καθώς και η σύγκριση μεταξύ τους. Προσδιορισμός TNFα με κυτταρομετρία ροής Στο πλαίσιο της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε η μελέτη της παραγωγής TNFα από τα CD4+ λεμφοκύτταρα. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ολικό αίμα αραιωμένο με RPMI σε αναλογία 1:1. Η μελέτη της έκφρασης TNFα από τα CD4+ λεμφοκύτταρα πραγματοποιήθηκε με δύο τρόπους: 1) Προσδιορισμός ενδοκυττάριου TNFα σε CD4+ λεμφοκύτταρα Η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων πραγματοποιείται με PMA και ιονομυκίνη παρουσία του αναστολέα έκκρισης BFA (Brefeldin A). Με τη συγκεκριμένη μέθοδο ο TNFα εγκλωβίζεται στο εσωτερικό του κυττάρου. Το BFA είναι μία λακτόνη η οποία συντίθεται από το παλμιτικό οξύ (C16) από ποικιλία μυκήτων (Σχήμα 3). Παρόλο που αρχικά απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε ως αντιικός παράγοντας, η χρησιμότητα του BFA για τους κυτταρικούς βιολόγους αναγνωρίστηκε με τη διαπίστωση ότι σε κύτταρα τα οποία επεξεργάζονταν με BFA, υπήρχε αναστολή της έκκρισης των πρωτεϊνών. Η παρεμπόδιση του μονοπατιού έκκρισης πραγματοποιείται σε ένα διαμέρισμα πριν το σύμπλεγμα Golgi (pre-golgi compartment), όπως φάνηκε με μελέτες μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. (α) (β) Σχήμα 4. Χαρακτηριστικά στικτογράμματα για τον προσδιορισμό ενδοκυττάριου TNFα σε CD4+ λεμφοκύτταρα, πριν (α) και μετά (β) από ενεργοποίηση του δείγματος με PMA+I. Σχήμα 3. Δομή του BFA. Η ενεργοποίηση των κυττάρων, παρουσία BFA, επιτρέπει την «παγίδευση» των κυτοκινών, μεταξύ των οποίων και του TNFα, στο εσωτερικό των κυττάρων. Μετά το πέρας της επώασης, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν TNFα προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής (πρόγραμμα CellQuest κυτταρομετρητή ροής BD FACSCalibur, της εταιρείας BD Biosciences) (Σχήμα 4) και με τη χρήση ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος έναντι του ενδοκυττάριου TNFα, μετά από ενδοκυττάρια χρώση. 2) Προσδιορισμός επιφανειακού TNFα σε CD4+ λεμφοκύτταρα Η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων πραγματοποιείται με PMA και ιονομυκίνη παρουσία αναστολέα του μετατρεπτικού ενζύμου του TNFα (TACE, TNFα converting enzyme), παρεμποδίζοντας την αποκοπή του από την κυτταρική μεμβράνη και τη μετατροπή του από μεμβρανικό TNFα σε διαλυτό TNFα. Με τη συγκεκριμένη μέθοδο ο TNFα παραμένει δεσμευμένος στην επιφάνεια του κυττάρου. Ο διαλυτός TNFα, ο οποίος συνιστά τα 2/3 του C-τελικού άκρου του μεμβρανικού TNFα, απελευθερώνεται στον εξωκυττάριο χώρο με περιορισμένη πρωτεόλυση του δεσμού Ala-76 Val-77. Το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την ανωτέρω πρωτεολυτική διάσπαση είναι το μετατρεπτικό ένζυμο του TNFα (TACE). Το TACE είναι μία διαμεμβρανική μεταλλοπρωτεϊνάση, και συγκεκριμένα μία ενδοπεπτιδάση η οποία φέρει στο ενεργό της κέντρο ένα ιόν ψευδαργύρου και αποτελείται από ένα εξωκυττάριο τμήμα, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και μία ενδοκυττάρια C-τελική ουρά. Το εξωκυττάριο τμήμα συνίσταται από μία Ν-τελική, καταλυτική περιοχή (η οποία φέρει το ιόν Zn), 259 καταλοίπων, μία περιοχή δισιντεγκρίνης και μία περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη (Cys) (Σχήμα 5). 18

ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2009, ΤΕΥΧΟΣ 49 (α) Σχήμα 5. Σχηματικό μοντέλο του συμπλέγματος TNFα TACE. Η ενεργοποίηση των κυττάρων, παρουσία αναστολέα του TACE, επιτρέπει την «παγίδευση» του TNFα, και όχι των υπολοίπων κυτοκινών, στη μεμβράνη των κυττάρων. Μετά το πέρας της επώασης, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν TNFα προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής (πρόγραμμα CellQuest κυτταρομετρητή ροής BD FACSCalibur) και με τη χρήση ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος έναντι του επιφανειακού TNFα, μετά από επιφανειακή χρώση (Σχήμα 6). Και οι δύο μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα σε μη διεγερμένο δείγμα (Unstimulated sample, US) και σε ενεργοποιημένο δείγμα (Activated sample, AS). Παράλληλα με τη μέτρηση του TNFα γίνεται και η μέτρηση κατάλληλου ισοτυπικού δείγματος αναφοράς, οπότε το αποτέλεσμα της απόκρισης των κυττάρων (σε ποσοστό %TNFα+ κυττάρων) είναι: Απόκριση = (AS - AIC) - (US - UIC) AS = activated sample AIC = activated isotype control US = unstimulated sample UIC = unstimulated isotype control 3) Προσδιορισμός διαλυτού TNFα Παράλληλα με τις ανωτέρω δύο μεθόδους, πραγματοποιήθηκε μέτρηση της ποσότητας του TNFα που εκκρίνεται από τα κύτταρα (διαλυτού TNFα) μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων με PMA και ιονομυκίνη απουσία αναστολέα. Μετά από κατάλληλη επώαση του δείγματος με τα αντιδραστήρια, ακολουθεί φυγοκέντρηση και επώαση του υπερκείμενου με φθορίζοντα σφαιρίδια που φέρουν συνδεδεμένο κατάλληλο μονοκλωνικό (β) Σχήμα 6. Χαρακτηριστικά στικτογράμματα για τον προσδιορισμό επιφανειακού TNFα σε CD4+ λεμφοκύτταρα, πριν (α) και μετά (β) από ενεργοποίηση του δείγματος με PMA+I. αντίσωμα (Σχήμα 7). Χρησιμοποιείται μείγμα φθοριζόντων σφαιριδίων, τα οποία εκπέμπουν στην ερυθρή περιοχή του φάσματος, για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό έξι διαφορετικών κυτοκινών, μεταξύ των οποίων και του TNFα. Για κάθε προσδιοριζόμενη κυτοκίνη χρησιμοποιούνται σφαιρίδια συγκεκριμένης έντασης φθορισμού τα οποία διαθέτουν ομοιοπολικά συνδεδεμένο το αντίστοιχο μονοκλωνικό αντίσωμα. Στη συνέχεια, η κυτοκίνη συνδέεται με δεύτερο μονοκλωνικό αντίσωμα το οποίο φέρει φυκοερυθρίνη, οπότε σχηματίζεται σύμπλεγμα τύπου «σάντουιτς». Τέλος, το δείγμα εισάγεται στον κυτταρομετρητή ροής (FCAPArray Software κυτταρομετρητή ροής BD FACSArray) όπου με τη βοήθεια των παραμέτρων σκέδασης (FS/SS) οριοθετείται το πλήθος των σφαιριδίων και στη συνέχεια μετράται ο φθορισμός των σφαιριδίων (διαχωρισμός κυτοκινών) σε συνάρτηση με τον φθορισμό των φερόντων μονοκλωνικών αντισωμάτων 19

ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ ΕΠΩΑΣΗ ΈΚΠΛΥΣΗ Σχήμα 7. Διαδικασία για τον σχηματισμό σάντουιτς κατά την κυτταρομετρική δοκιμασία με σφαιρίδια (Cytometric Bead Array, CBA). (συγκέντρωση κάθε κυτοκίνης) (Σχήμα 8). Η μέτρηση πραγματοποιείται σε μη διεγερμένο δείγμα και σε ενεργοποιημένο δείγμα. Τέλος, με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης για κάθε αναλύτη, προσδιορίζεται η συγκέντρωση αυτού στο δείγμα. Συσχετίσεις μεταξύ των τριών μεθόδων προσδιορισμού TNFα Παρατηρήθηκαν οι ακόλουθες στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις κατά Pearson (Ν=12): Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού των CD4+ λεμφοκυττάρων που εκφράζουν ενδοκυττάριο TNFα και του διαλυτού TNFα που παράγεται, μετά από ενεργοποίηση με PMA+I (R=0,918, p<0,0001) (Σχήμα 9). ενδοκυττάριος TNFα σε CD4+ λεμφοκύτταρα (%) διαλυτός TNFα, μετά από ενεργοποίηση με PMA=I (pg/ml) Σχήμα 9. Θετική συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού των CD4+ λεμφοκυττάρων που εκφράζουν ενδοκυττάριο TNFα και του διαλυτού TNFα που παράγεται, μετά από ενεργοποίηση με PMA+I, στους φυσιολογικούς μάρτυρες. Σχήμα 8. Χαρακτηριστικά στικτογράμματα και ιστογράμματα για τον προσδιορισμό διαλυτών κυτοκινών πριν (α) και μετά (β) από ενεργοποίηση του δείγματος με PMA+I. Ο TNFα αντιστοιχεί στη δεύτερη κορυφή των ιστογραμμάτων 20