9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΣΥΝΘΕΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚοΥ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΤΩΝ ΓΟΝΑΔΩΝ ΤΟΥ ΑΧΙΝΟΥ ΚΑΤΑ ΤΗ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ Σάββα Μ., Ματσιώρη Σ., Μποζιάρης Ι.Σ. Τμήμα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, boziaris@uth.gr Περίληψη Ο προσδιορισμός της σύνθεσης του αρχικού μικροβιακού πληθυσμού και του πληθυσμού στο σημείο αλλοίωσης σε επίπεδο γένους ή οικογένειας, καθώς και ο ρυθμός αύξησης του συνολικού μικροβιακού πληθυσμού πραγματοποιήθηκε για γονάδες αχινού συντηρημένες σε θερμοκρασίες ψύξης και περιβάλλοντος. Η αρχική χλωρίδα αποτελείται, κυρίως από βάκιλλους Gram θετικούς του γένους Bacillus αλλά και από Gram αρνητικούς ψυχρότροφους μικροοργανισμούς. Το επίπεδο μικροβιακού πληθυσμού στο σημείο αλλοίωσης φθάνει τους 7 λογαρίθμους σε 24 και 60 ώρες για τις γονάδες που αποθηκεύθηκαν στους 20 και τους 5 ο C αντίστοιχα Η σύνθεση της μικροχλωρίδας αλλοίωσης εξαρτάται κυρίως από την θερμοκρασία συντήρησης με αποτέλεσμα αυτή να κυριαρχείται από Gram αρνητικούς ψυχρότροφους και Gram αρνητικούς της οικογένειας Enterobacteriaceae για τις γονάδες που αποθηκεύθηκαν στους 5 και τους 20 ο C αντίστοιχα. Η μελέτη της μικροβιολογίας συντήρησης των ευπαθών προιόντων είναι πολύ σημαντική για την κατανόηση των μηχανισμών αλλοίωσης με σκοπό την εφαρμογή των κατάλληλων στρατηγικών για την αύξηση του εμπορικού χρόνου ζωής. Λέξεις κλειδιά: μικροβιακός πληθυσμός, αλλοίωση, συντήρηση, αχινός. MICROBIAL ASSOCIATION OF SEA URCHIN ROE STORED AT VARIOUS TEMPERATURES Savva M., Matsiori S., Boziaris I.S. Department of Ichthyology and Aquatic Environment, University of Thessaly, boziaris@uth.gr Abstract The initial microbial flora, the growth rate and the microbial spoilage association of sea urchin gonads stored at 5 and 20 o C were studied. Initial microbial flora consists mainly of Gram positives of genus Bacillus and Gram negative psychrotrophs. The microbial population reached the spoilage level of 7 logs after 24 and 60 hours storage at 20 and 5 o C respectively. The microbial spoilage association is depended mainly on storage temperature. The dominant spoilage microorganisms of sea urchin gonads stored at 5 and 20 o C were Gram negative psychrotrophs and Gram negatives of Enterobacteriaceae family respectively. The study of microbial spoilage of perishable products is very important in order to understand the spoilage mechanisms and apply the appropriate practices for better product preservation. Keywords: microbial spoilage association, sea urchin. 1. Εισαγωγή O αχινός αποτελεί τροφή υψηλής διατροφικής αξίας (Kato & Schroeter 1985; de la Cruz-Garcia et al., 2000). Κυρίως διακινείται νωπός ενώ μικρότερες ποσότητες ως κατεψυγμένος, βρασμένος και κατεψυγμένος, κονσερβοποιημένος και παστός (Kato & Schroeter 1985; Bledsoe et al., 2003). Ο αχινός είναι ευαλλοίωτο προϊόν με μικρό χρόνο ζωής, κυρίως λόγω μικροβιακής δράσης και αυτόλυσης (Ashie et al., 1996; Gram & Huss 1996; Pineiro-Sotelo et al., 2002). Η αλλοίωση των αλιευμάτων και των προϊόντων τους είναι συνήθως πολύπλοκο φαινόμενο. Η αλλοίωση μπορεί να προέλθει από μικροβιακή δράση, χημικές αντιδράσεις και από δράση των ενδογενών ενζύμων του αλιεύματος (αυτόλυση). Στα νωπά προϊόντα, όπως είναι και οι γονάδες του αχινού, η αλλοίωση οφείλεται κυρίως σε μικροβιακή ή καλύτερα βακτηριακή δραστηριότητα (Gram & Huss 1996). Η μελέτη των μηχανισμών αλλοίωσης με σκοπό την εφαρμογή πρακτικών για την αύξηση του -751-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ χρόνου ζωής αυτών των προϊόντων έχει μεγάλο εμπορικό ενδιαφέρον (Ashie et al., 1996). Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι ο προσδιορισμός των μικροοργανισμών που συνεισφέρουν στο μηχανισμό αλλοίωσης των γονάδων του αχινού με σκοπό την εφαρμογή στρατηγικών για την αύξηση του χρόνου ζωής του προϊόντος. 2. Μεθοδολογία Πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της αρχικής και της τελικής μικροχλωρίδας σε επίπεδο γένους ή οικογένειας των γονάδων του αχινού συντηρημένου υπό ψύξη και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Επιπλέον, έγινε καταγραφή των μεταβολών του πληθυσμού των μικροοργανισμών καθώς και της μεταβολής του ρη των γονάδων σε σχέση με το χρόνο συντήρησης του προϊόντος. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν αχινοί (Paracentrotus lividus Lamarck 1816) οι οποίοι αλιεύθηκαν, το Νοέμβριο του 2007, από τον Παγασητικό κόλπο και μεταφέρθηκαν άμεσα στο εργαστήριο. Το εξωτερικό κέλυφος των αχινών θραύτηκε με προσοχή και οι γονάδες αφαιρέθηκαν προσεκτικά και τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένα τρυβλία. Τα μισά από αυτά αποθηκεύθηκαν στους 5 ο C και τα υπόλοιπα στους 20 ο C. Σε τακτά χρονικά διαστήματα λαμβάνονταν υπό ασηπτικές συνθήκες 1g γονάδων, εις διπλούν ακολουθούσε ομογενοποίηση και διαδοχικές αραιώσεις σε 9 ml αποστειρωμένου ισοτονικού πεπτονούχου ύδατος. Για την καταμέτρηση του ολικού μικροβιακού πληθυσμού χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης σε Tryptone Soy Agar (TSA) και επώαση των τρυβλίων στους 25 ο C για 48h. Το ρη των γονάδων θεωρήθηκε κατά σύμβαση ίσο με το ρη της πρώτης δεκαδικής αραίωση και το οποίο μετρούνταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα με χρήση πεχάμετρου. Τρυβλία από την έναρξη του πειράματος συντήρησης (μηδενική ημέρα) και τρυβλία 2 και 3 ημερών από τα δείγματα που αποθηκεύθηκαν στους 5 ο C και τους 20 ο C αντίστοιχα επιλέχθηκαν με βάση τον αριθμό αποικιών (αριθμός αποικιών από 30 έως 300). Οι αποικίες καταμετρούνταν και καταγράφονταν τα μορφολογικά τους στοιχεία. Στη συνέχεια ομαδοποιούνταν, με βάση την μορφολογία τους, και από κάθε ομάδα επιλέγονταν 1 με 3 αποικίες και μεταφέρονταν υπό ασηπτικές συνθήκες με τη μέθοδο της γραμμωτής ράβδωσης (streaking) σε τρυβλία με Tryptone Soy Agar. Τα εμβολιασμένα με την παραπάνω μέθοδο τρυβλία επωάστηκαν για 72h στους 25 ο C και κατόπιν πραγματοποιήθηκαν οι κάτωθι δοκιμές, για κάθε αποικία: Α. Χρώση Gram, σχήμα του μικροβιακού κυττάρου (κόκκος, βάκιλος κτλ) και παρουσία σπορίων (Harrigan & McCance, 1976). Β. Δοκιμή της οξειδάσης (Harrigan & McCance, 1976). Γ. Δοκιμή της καταλάσης (Harrigan & McCance, 1976). Δ. Δοκιμή αερόβιου και αναερόβιου μεταβολισμού της γλυκόζης σε Hugh and Leifson medium (Hugh & Leifson, 1953). Ε. Ικανότητα κίνησης (Harrigan & McCance, 1976). Ζ. Μετατροπή του οξειδίου της τριμεθυλαμίνης σε τριμεθυλαμίνη και παραγωγή υδρόθειου, σύμφωνα με Gram et al., (1987). Η ταξινόμηση των αποικιών σε γένος ή οικογένεια πραγματοποιήθηκε προσεγγιστικά, λαμβάνοντας υπόψη τα ανωτέρω φαινοτυπικά τεστ, κυρίως κατά Cowan (1993), αλλά και κατά Dainty et al. (1979), καθώς και τη δοκιμή της μετατροπή του οξειδίου της τριμεθυλαμίνης σε τριμεθυλαμίνη και παραγωγή υδρόθειου, για τον προσδιορισμό της Shewanella putrefaciens, σύμφωνα με Gram et al. (1987). Επιπλέων, τα Gram αρνητικά τα οποία χαρακτηρίστηκαν ως Aeromonas/Vibrio διαχωρίσθηκαν με το string test (Keast & Riley, 1997). -752-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ 3. Αποτελέσματα Η μεταβολές του μικροβιακού πληθυσμού σε σχέση με το χρόνο συντήρησης στις θερμοκρασίες των 20 ο C και των 5 ο C παρουσιάζονται στην Εικόνα 1α και β αντίστοιχα. (α) (β) Εικ. 1: Μεταβολή και καμπύλη ανάπτυξης του ολικού μικροβιακού πληθυσμού των γονάδων του αχινού αποθηκευμένου στους 20 ο C (α) και τους 5 ο C (β). Το βέλος υποδεικνύει το επίπεδο αλλοίωσης, δηλαδή το μέγεθος του μικροβιακού πληθυσμού στο σημείο της οργανοληπτικής απόρριψης του προϊόντος. Ο αρχικός μικροβιακός πληθυσμός των γονάδων στην αρχή του πειράματος αποθήκευσης ήταν της τάξεως του 10 4 cfu/g. Από τα Διαγράμματα 1 και 2 γίνεται σαφές ότι η αποθήκευση σε χαμηλή θερμοκρασία καθυστερεί τη μικροβιακή ανάπτυξη και κατά συνέπεια και την ποιοτική υποβάθμιση των γονάδων ως εδώδιμο προϊόν. Πράγματι, σε συντήρηση στους 20 ο C, ο συνολικός μικροβιακός πληθυσμός ξεπέρασε του 7 λογάριθμους σε λιγότερο από 24 ώρες, όπου και το προϊόν έπαψε να είναι ελκυστικό για κατανάλωση λόγο της ανάπτυξης ανεπιθύμητων οσμών. Στους 5 ο C, ο χρόνος ζωής του προϊόντος υπολογίστηκε περί τις 60 ώρες με το επίπεδο αλλοίωσης (μέγεθος συνολικού μικροβιακού πληθυσμού στο σημείο απόρριψης του προϊόντος) να είναι περί τους 7 λογάριθμους. Οι κινητικές παράμετροι των παραπάνω μεταχειρίσεων υπολογίσθηκαν με προσαρμογή των δεδομένων χρησιμοποιώντας την εξίσωση Baranyi (Baranyi et al., 1993) Όπως αναμενόταν, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης αυξάνεται ενώ αυξάνεται η θερμοκρασία, (0.175 στους 20 ο C και 0.087 τους 5 ο C,) ενώ μειώνεται η διάρκεια της φάσης προσαρμογής, καθώς είναι περίπου 19 ώρες στους 5 ο C, ενώ μηδενίζεται στους 20 ο C (Πίν. 1). Το αρχικό ρη των γονάδων ήταν ουδέτερο με τιμή πολύ κοντά στο 7. Η μεταβολή του ρη των γονάδων ήταν ταχύτερη κατά την αποθήκευση στις υψηλές παρά στις χαμηλές θερμοκρασίες. Το ρη ανέβηκε σε τιμές πάνω από 7 έπειτα από 48 και 72 ώρες αποθήκευσης στους 20 o C και 5 o C αντίστοιχα. -753-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Πίνακας 1: Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, διάρκεια φάσης προσαρμογής και μέγιστος πληθυσμός της ολικής μικροβιακής χλωρίδας σε ΤSA των γονάδων του αχινού αποθηκευμένων στους 5 ο C και στους 20 ο C. ------------------------------------------------------------------------------------- ειδικός διάρκεια μέγιστος θερμοκ. ρυθμός φάσης πληθυσμός τυπικό αποθήκ. ανάπτυξης προσαρμογής (log cfu/g) σφάλμα (ώρες 1 ) (ώρες) προσαρμογής ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20 ο C 0.175 0.0 8.81 0.87 ------------------------------------------------------------------------------------- 5 ο C 0.087 18.7 8.06 0.40 ------------------------------------------------------------------------------------- Τα γένη των μικροοργανισμών που ανιχνεύθηκαν ως κυρίαρχη αρχική μικροχλωρίδα των γονάδων του αχινού εικονίζονται στον Πίνακα 2. Ο αρχικός μικροβιακός πληθυσμός κυριαρχείται από βακίλλους, Gram θετικούς κυρίως του γένους Bacillus, αλλά και από Gram αρνητικούς ψυχρότροφους όπως αυτοί των γενών Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter και Alcaligens. Gram θετικοί κόκκοι του γένους Micrococcus, απαντώνται σε μικρότερο ποσοστό. Πίνακας 2: Σύνθεση της αρχική μικροχλωρίδας των γονάδων του αχινού. Γένος αριθ. αποικιών σχήμα χρώση Gram κίνηση καταλάση οξειδάση μεταβολή γλυκόζης ΤΜΑΟ/ Η 2 S % επί του πληθυσμού στο τρυβλίο Micrococcus 3 κοκκοι + - + + Ο β - / - 9 Bacillus 19 βακιλλοι + +/- α + +/- α F γ - / - 54 Acinetobacter 5 βακιλλοι - - + - O - / - 14 Moraxella 5 βακιλλοι - - + + - δ - / - 14 Pseudomonas 1 βακιλλοι - + + + Ο - / - 3 Alcaligens 2 βακιλλοι - + + - - δ - / - 6 α: διαφορετική αντίδραση από τις αποικίες που δοκιμάστηκαν β: οξειδωτικός μεταβολισμός γ: ζυμωτικός μεταβολισμός δ: δεν υπήρξε μεταβολή Η σύνθεση της μικροχλωρίδας των γονάδων του αχινού αποθηκευμένου σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 ο C) στο τέλος του εμπορικού χρόνου ζωής του παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Ο μικροβιακός πληθυσμός αλλοίωσης κυριαρχείται από βακίλλους Gram αρνητικούς της οικογένειας Enterobacteriaceae αλλά και θετικούς του γένους Bacillus και Micrococcus. Σε μικρότερα ποσοστά απαντώνται μικρόκοκκοι, αλλά και Gram αρνητικοί βάκιλλοι του γένους Aeromonas. Πίνακας 3: Σύνθεση του μικροβιακού πληθυσμού των γονάδων του αχινού σε συντήρηση στους 20 o C στο τέλος του εμπορικού χρόνου ζωής. Γένος αριθ. αποικιών σχήμα χρώση Gram κίνηση καταλάση οξειδά-ση μεταβολή γλυκόζης ΤΜΑΟ/ Η 2 S % επί του πληθυσμού στο τρυβλίο Aeromonas * 8 βακιλλοι - + + + F + / + 14.5 Enterobacteriaceae 20 βακιλλοι - + - F + / + 36.5 Bacillus 15 βακιλλοι + +/- α + +/- α F/O α - / - 27 Micrococcus 12 κοκκοι + - + + - - / - 22 α: διαφορετική αντίδραση από τις αποικίες που δοκιμάσθηκαν * διαχωρισμός από το γένος Vibrio με το string test (Keast and Riley 1997) -754-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Η μικροχλωρίδα αλλοίωσης των γονάδων του αχινού συντηρημένου υπό ψύξη (5 ο C) αποτελείται εξολοκλήρου από Gram αρνητικούς ψυχρότροφους βακίλλους των γενών Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter και Alcaligens (Πίν. 4). Πίνακας 4: Σύνθεση του μικροβιακού πληθυσμού των γονάδων του αχινού σε συντήρηση στους 5 o C στο τέλος του εμπορικού χρόνου ζωής. Γένος αριθ. αποικιών σχήμα χρώση Gram κίνηση καταλάση οξειδάση μεταβολή γλυκόζης ΤΜΑΟ/ Η 2 S % επί του πληθυσμού στο τρυβλίο Acinetobacter 34 βακιλλοι - - + - Ο - / - 25.5 Moraxella 50 βακιλλοι - - + + - α - / - 37.5 Pseudomonas 25 βακιλλοι - + + + Ο - / - 19 Alcaligens 24 βακιλλοι - + + - - α - / - 18 α: δεν υπήρξε μεταβολή 4. Συμπεράσματα - Συζήτηση Η μικροβιακή δραστηριότητα είναι ο κύριος λόγος υποβάθμισης της ποιότητας των αλιευμάτων και των προϊόντων τους (Gram & Huss 1996). Οι μικροοργανισμοί ενώ αρχικά είναι σε χαμηλό επίπεδο πολλαπλασιάζονται και παράγουν μεταβολίτες οι οποίοι επιδρούν αρνητικά στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος. Για να καθίσταται ένα προϊόν μη αποδεκτό για κατανάλωση θα πρέπει οι μεταβολίτες να παραχθούν σε επαρκείς ποσότητες και αυτό συμβαίνει μόνο όταν οι μικροοργανισμοί φθάνουν ένα ορισμένο μέγεθος πληθυσμού (επίπεδο αλλοίωσης). Το επίπεδο αλλοίωσης εξαρτάται από το είδος των μικροοργανισμών και αυτό με τι σειρά τους εξαρτάται από το προϊόν και τις συνθήκες αποθήκευσής του (Huis in t Veld, 1996). Η άνοδος του ρη είναι πολύ πιθανό να οφείλεται στην πρωτεολυτική δράση των διαφόρων αλλοιογόνων μικροοργανισμών με την επακόλουθη παραγωγή βασικών παραπροϊόντων (Dainty 1996). Παρόλο αυτά σημαντική αλλαγή συμβαίνει αρκετά αργότερα από τη χρονική στιγμή απόρριψης του προϊόντος και κατά συνέπεια δεν μπορεί η μεταβολή του ρη να αποτελέσει φυσικοχημικό δείκτη αλλοίωσης του προϊόντος. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι υπό κανονικές συνθήκες η ενδογενής χλωρίδα των αλιευμάτων από εύκρατα κλίματα κυριαρχείται από Gram αρνητικούς βακίλους που κατά κανόνα ανήκουν στα γένη, Pseudomonas, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio και Aeromonas καθώς και Gram θετικούς οργανισμούς όπως Bacillus, Micrococcus, Lactobacillus, και Clostridium, ενώ γενικότερα η αναλογία των Gram αρνητικών και Gram θετικών βακτηρίων ποικίλει αλλά γενικά τα κατά Gram θετικά βακτήρια κυμαίνονται από 0-30% της συνολικής χλωρίδας (ICMSF, 2000; Huss, 1995). Τα αποτελέσματά μας δεν απέχουν σημαντικά από αυτά που έχουν ήδη αναφερθεί στην βιβλιογραφία. Βρέθηκαν Gram αρνητικοί βακίλοι που ανήκουν στα γένη, Pseudomonas, Moraxella, κτλ καθώς και Gram θετικά βακτήρια όπως Bacillus, Micrococcus, αλλά σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% της συνολικής μικροβιακής χλωρίδας, σε σχέση με το 0-30% της βιβλιογραφίας. Δε βρέθηκε στην αρχική μικροχλωρίδα ή στη χλωρίδα αλλοίωση υπό ψύξη Shewanella putrefaciens, όπως συμβαίνει με τους ιχθύες (Gram et al., 1987; Gram & Huss 1996; Papadopoulos et al., 2003). Εξάλλου, η σύνθεση της φυσικής μικροχλωρίδας των αλιευμάτων εξαρτάται πάρα πολύ από το περιβάλλον αλίευσης (ICMSF, 2000; Huss, 1995). Τα αποτελέσματά μας, αν και αφορούν γονάδες αχινού, συμπίπτουν με τα αποτελέσματα και τις διαπιστώσεις άλλων ερευνητών σχετικά με την αλλοίωση των αλιευμάτων γενικότερα. Πράγματι, έχει διαπιστωθεί από πολλούς ερευνητές ότι η αποθήκευση των νωπών αλιευμάτων σε ψύξη μετά -755-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ την αλίευσή τους, παρέχει ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την ανάπτυξη ψυχρότροφου μικροβιακού πληθυσμού ο οποίος τελικά θα είναι και ο επικρατών πληθυσμός στο πέρας του χρόνου ζωής του προιόντος. Αντίθετα, σε αλιεύματα που αποθηκεύθηκαν και τελικά αλλοιώθηκαν σε υψηλότερες θερμοκρασίες η χλωρίδα στο τέλος του χρόνου ζωής τους κυριαρχείται από μεσόφιλα βακτήρια των γενών Vibrio, Aeromonas και της οικογένειας Enterobacteriaceae (Gram et al., 1987; Gram et al., 1990; Huss, 1995; ICMSF, 2000). Οι γονάδες του αχινού αποτελούν εξαιρετικά ευαλλοίωτο προϊόν, με μικρό εμπορικό χρόνο ζωής ακόμη και σε συντήρηση υπό ψύξη. Για την αύξηση του εμπορικού χρόνου ζωής θα πρέπει να δοκιμαστεί η εφαρμογή της τεχνολογίας εμποδίων (Leistner & Gorris, 1995) με τη μορφή της συσκευασίας τροποποιημένων ατμοσφαιρών καθώς και άλλων εμποδίων όπως το χαμηλότερο ρη, η προσθήκη φυσικών αντιμικροβιακών κτλ. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Ashie, I.N., Smith, J.P. & Simpson, B.K. 1996. Spoilage and shelf-life extension of fresh fish and shellfish. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 36: 87-121. Baranyi, J., Roberts, T.A. & McClure, P. 1993. A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology 10: 43 59. Bledsoe, G. E., Bledsoe, C. D. & Rasco, B. 2003. Caviars and Fish Roe Products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43: 317-356. Cowan S. 1993. Cowan and Steel s manual for the identification of medical bacteria, 3 nd ed. Cambridge University Press, London, United Kingdom. Dainty, R. H. 1996. Chemical/biochemical detection of spoilage. International Journal of Food Microbiology 33:19-33. Dainty, R.H., Shaw, B.G., Hardinger, C. D. & Michanie S. 1979. The spoilage of vacuum-packed beef by cold tolerant bacteria. In: Cold tolerant microbes in spoilage and the environment (edited by Russel A.D & Fuller R.) Academic press pp 83-110. De la Cruz-Garcia, C., Lopez-Hernandez, J., Gonzalez-Castro, M.J., Rodriguez-Bernaldo De Quiros, A.I. & Simal-Lozano, J. 2000. Protein, amino acid and fatty acid contents in raw and canned sea urchin (Paracentrotus lividus) harvested in Galicia (NW Spain). Journal of the Science of Food and Agriculture 80: 1189-1192. Gram, L., Trolle, G., & Huss, H. H. 1987. Detection of spoilage bacteria from fish stored at low (0 o C) and high (20 o C) temperatures. International Journal of Food Microbiology 4: 65-72. Gram, L., Wedell-Neergaard, C. & Huss, H. H. 1990. The bacteriology of fresh and spoiling Lake Victoria Nile perch (Lates niloticus). International Journal of Food Microbiology 10: 303-316. Gram, L. & Huss, H.H. 1996. Microbiological spoilage of fish and fish products. International Journal of Food Microbiology 33: 121-137. Harrigan, W. F. & McCance, M. E. 1976. Laboratory methods in food and dairy microbiology. Academic Press. London. Hugh, R., and Leifson, E. 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria. Journal of Bacteriology 66: 24-26. Huis in t Veld, J. H. J.,1996. Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview. International Journal of Food Microbiology 33: 1-18. Huss, H. H. 1995. Quality and Quality Changes in Fresh Fish. FAO Fisheries Technological Paper 348, FAO, Rome, Italy. ICMSF, 2000. Microorganisms in Foods. Vol 6. Microbial Ecology of Food Commodities. Fish and Fish products pp 130-189, Blackie Academic & Professional, London. Kato, S. & Schroeter, S.C. 1985 Biology of the red sea urchin, Strongylocentrotus franciscanis, and its fishery in California. Marine Fineries Review 47: 1-20. Keast, A. & Riley, T.V. 1997. Identification of Vibrio spp. with the string test. Letters in Applied Microbiology 25: 106-108. Leistner, L., & Gorris, L.G.M. 1995. Food preservation by hurdle technology. Trends in Food Science and Technology 6: 41-46. Papadopoulos, V., Chouliara, I., Badeka, V., Savvaidis, I.N., & Kontominas, M.G. 2003. Effect of gutting on microbiological, chemical, and sensory properties of aquacultured sea bass (Dicentrarchus labrax) stored in ice. Food Microbiology 20: 411-420. Pineiro-Sotelo, M., Rodrıguez-Bernaldo de Quiros, A., Lopez-Hernandez, J. & Simal-Lozano, J. 2002. Determination of purine bases in sea urchin (Paracentortus lividus) gonads by high-performance liquid chromatography. Food Chemistry 79:113 117. -756-