Παλεπηζηήκην Παηξώλ. Σκήκα Βηνινγίαο Σνκέαο Γελεηηθήο, Βηνινγίαο Κπηηάξνπ θαη Αλάπηπμεο

Παλεπηζηήκην Παηξώλ Σκήκα Βηνινγίαο Σνκέαο Γελεηηθήο, Βηνινγίαο Κπηηάξνπ θαη Αλάπηπμεο «Κηλεηηθέο αχμεζεο θαη κειέηε ιηπηδίσλ κηθξνθπθψλ (Nannochloropsis oculata θαη Chlorella sp.) θαη ηνπ ηξνρνδψνπ Brachionus plicatilis». ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΠΟΤΓΧΝ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΟ ΓΗΠΛΧΜΑ ΔΗΓΗΚΔΤΖ ΣΖ ΒΗΟΛΟΓΗΚΖ ΣΔΥΝΟΛΟΓΗΑ Μαξία Μπίξθνπ Βηνιφγνο Πάηξα, Ινχληνο 2011

Δπηβιέπσλ Καζεγεηήο Γεψξγηνο Αγγειήο Καζεγεηήο, Σκήκα Βηνινγίαο Σα κέιε ηεο Σξηκεινχο Δμεηαζηηθήο Δπηηξνπήο Γεψξγηνο Αγγειήο Γεσξγία ηεθάλνπ εξαθείκ Παπαληθνιάνπ Καζεγεηήο Σκήκα Βηνινγίαο, Παλεπηζηήκην Παηξψλ Καζεγήηξηα Σκήκα Βηνινγίαο Παλεπηζηήκην Παηξψλ Δπ. Καζεγεηήο Σκήκα Δπηζηήκεο θαη Σερλνινγίαο Σξνθίκσλ, Γεσπνληθφ Παλεπηζηήκην Αζελψλ 2

Η έγθξηζε ηεο δηαηξηβήο γηα ηελ απφθηεζε Μεηαπηπρηαθνχ Γηπιψκαηνο Δηδίθεπζεο απφ ην ηκήκα Βηνινγίαο ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Παηξψλ δελ ππνδειψλεη ηελ απνδνρή ησλ γλσκψλ ηνπ ζπγγξαθέα. 3

ΔΤΥΑΡΗΣΗΔ Η παξνχζα εξεπλεηηθή εξγαζία πξαγκαηνπνηήζεθε ζην εξγαζηήξην Μηθξνβηνινγίαο ηνπ ηκήκαηνο Βηνινγίαο, ηνπ νπνίνπ επηζηεκνληθφο ππεχζπλνο είλαη ν θ. Γ. Αγγειήο. Θα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηνλ επηβιέπνληα θαζεγεηή κνπ θ. Γ. Αγγειή γηα ηελ αλάζεζε ηνπ ζέκαηνο, ηε βνήζεηα θαη ηηο πνιχηηκεο ζπκβνπιέο πνπ κνπ πξνζέθεξε θαζψο θαη ηελ εκπηζηνζχλε πνπ κνπ έδεημε. Δπίζεο ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηελ θα Γ. ηεθάλνπ θαη ηνλ θ.. Παπαληθνιάνπ πνπ δέρηεθαλ λα ζπκκεηέρνπλ ζηελ επηηξνπή. Έλα κεγάιν επραξηζηψ ζα ήζεια λα πσ ζηελ ππνςήθηα δηδάθηνξα ηνπ εξγαζηεξίνπ καο θα Α. Μαθξή γηα ηε βνήζεηα θαη ηηο ζπκβνπιέο ηεο. Αθφκα, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηελ θα. Μπέιινπ, κεηαπηπρηαθή θνηηήηξηα ηνπ εξγαζηεξίνπ, ηελ θα Α. Μνπζηφγηαλλε θαη ηνλ θ. Κ. Μίρν, πξνπηπρηαθνχο θνηηεηέο ηνπ εξγαζηεξίνπ γηα ηελ άςνγε ζπλεξγαζία θαη ππνκνλή πνπ έδεημαλ θαηά ηε δηάξθεηα ησλ πεηξακάησλ. Δπραξηζηψ ζα ήζεια επίζεο λα πσ θαη ζηα παιαηφηεξα κέιε ηνπ εξγαζηεξίνπ θ. Α. Γηαλλφπνπιν θαη θ. Κ. Παπαηξέρα γηα ηελ άςνγε ζπλεξγαζία. Ιδηαίηεξα ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηελ εηαηξία Plagton A.E θαη ηνλ θ. Γ. Μπφθα γηα ηε ζπλεξγαζία θαη ηε βνήζεηα πνπ κνπ πξνζέθεξαλ θαηά ηε δηάξθεηα ησλ επηζθέςεσλ κνπ ζηελ εηαηξία γηα ηε δηεμαγσγή ησλ πεηξακάησλ. Σν κεγαιχηεξν επραξηζηψ ζα ήζεια λα ην πσ ζηελ νηθνγέλεηά κνπ πνπ είλαη δίπια κνπ φια απηά ηα ρξφληα θαη κε ζηεξίδεη εζηθά θαη νηθνλνκηθά. Σέινο ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηνπο θίινπο κνπ γηα ηε ζηήξημε θαη βνήζεηα πνπ κνπ πξνζέθεξαλ θαη κνπ πξνζθέξνπλ φηαλ ηνπο ρξεηάδνκαη. 4

ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ειίδα Πεξίιεςε 7 Abstract 9 1. Δηζαγσγή 10 1.1 πζηήκαηα θαιιηεξγεηψλ κηθξνθπθψλ 12 1.1.1 Ρφινο ησλ κηθξνθπθψλ ζηελ ηξνθηθή αιπζίδα 14 1.2 Βηνζχλζεζε ιηπηδίσλ ζηα κηθξνθχθε 15 1.3 πζηεκαηηθή θαηάηαμε ησλ Nannochloropsis oculata 21 θαη Chlorella sp. 1.4 Σξνρφδσα 22 1.5 πζηήκαηα θαιιηέξγεηαο ηξνρνδψσλ 22 1.6 Βηνζχλζεζε ιηπηδίσλ ζηα ηξνρφδσα 23 1.6.1 Σξνρφδσα θαη ξφινο ηνπο ζηελ ηξνθηθή αιπζίδα 24 1.7 θνπφο ηεο εξεπλεηηθήο εξγαζίαο 26 2. Τιηθά- Μέζνδνη 27 2.1 Βηνινγηθφ πιηθφ θαη ζπλζήθεο θαιιηέξγεηαο 27 2.2 Πξνζδηνξηζκφο βηνκάδαο ηνπ Nannochloropsis oculata 27 θαη Chlorella sp. 2.3 Πξνζδηνξηζκφο βηνκάδαο ηνπ Brachionus plicatilis 28 2.4 Αλάιπζε ιηπηδίσλ 28 2.4.1 Δθρχιηζε ιηπηδίσλ 28 5

2.4.2 Δθπιπζε ιηπηδίσλ 29 2.4.3 Κιαζκάησζε ιηπηδίσλ 29 2.4.4 Μεζπιεζηεξνπνίεζε 29 2.4.5 Αλάιπζε κεζπιεζηέξσλ ζε αέξην ρξσκαηνγξάθν GC 30 3. Απνηειέζκαηα 31 3.1 Κηλεηηθέο κηθξνθπθψλ 31 3.1.1 Κηλεηηθέο αχμεζεο ηνπ Chlorella sp. 31 3.1.2 Κηλεηηθή αχμεζεο ηνπ Nannochloropsis oculata 33 3.1.3 Κηλεηηθή αχμεζεο κεηθηήο θαιιηέξγεηαο κηθξνθπθψλ 33 3.2 Μειέηε ιηπηδίσλ κηθξνθπθψλ 34 3.2.1 Μειέηε ιηπηδίσλ ηνπ Chlorella sp. 34 3.2.2 Μειέηε ιηπηδίσλ ηνπ Nannochloropsis oculata 38 3.2.3 Μειέηε ιηπηδίσλ κεηθηήο θαιιηέξγεηαο 40 3.3 Μειέηε ιηπηδίσλ ηνπ ηξνρνδψνπ Brachionus plicatilis 42 4. πδήηεζε 5. πκπεξάζκαηα 61 67 6. Βηβιηνγξαθία 69 6

ΠΔΡΗΛΖΦΖ ηελ παξνχζα εξεπλεηηθή εξγαζία κειεηήζεθε ε ζχζηαζε ζε ιηπαξά νμέα ησλ ιηπηδίσλ (νιηθψλ, θσζθνιηπηδίσλ, γιπθνιηπηδίσλ θαη ζθηγγνιηπηδίσλ, νπδεηέξσλ) ησλ κηθξνθπθψλ Nannochloropsis oculata θαη Chlorella sp. θαη κεηθηψλ θαιιηεξγεηψλ ησλ αλσηέξσ ζηειερψλ θαζψο επίζεο θαη ηξνρνδψσλ ηνπ είδνπο Brachionus plicatilis θαιιηεξγνχκελσλ ζε βηναληηδξαζηήξεο κεγάιεο θιίκαθαο ππφ δηαθνξεηηθέο ζπλζήθεο αχμεζεο. Η θαιιηέξγεηα ησλ κηθξνθπθψλ πξαγκαηνπνηήζεθε ζε βηναληηδξαζηήξεο βηνκεραληθήο θιίκαθαο 300 L, ν θσηηζκφο ήηαλ ζπλερήο θαη ε ζεξκνθξαζία παξέκελε ζηαζεξή ζηνπο 28±3 ν C θαηά ηελ πεξίνδν ηεο άλνημεο θαη ζηνπο 22±3 ν C θαηά ηελ πεξίνδν ηνπ θζηλνπψξνπ θαη ηνπ ρεηκψλα. Σν Chlorella sp., ζπλέζεζε ιηπίδηα πινχζηα ζε α-ιηλνιεληθφ θαη παικηηηθφ νμχ, ελψ ζηα ιηπίδηα ηνπ Nannochloropsis oculata ηα ππεξέρνληα ιηπαξά νμέα ήηαλ ηα νμέα παικηηηθφ, εηθνζηπεληαλντθφ (EPA) θαη παικηηειατθφ. Μεηά απφ θιαζκάησζε ησλ ιηπηδίσλ ηνπ Chlorella sp. βξέζεθε φηη ην θιάζκα ησλ νπδέηεξσλ ιηπηδίσλ (NL) ήηαλ ην ζεκαληηθφηεξν πνζνηηθά, ζε φιεο ηηο θάζεηο αχμεζεο. ηηο πξψηεο θάζεηο αχμεζεο ηα θσζθνιηπίδηα (P) ππεξείραλ ησλ γιπθν- θαη ζθηγγν- ιηπηδίσλ (G+S) ελψ θαζψο ε θαιιηέξγεηα εμειηζζφηαλ ηα πνζνζηά ησλ P κεησλφηαλ πξνο φθεινο ησλ G+S. Σέινο, ζηε κεηθηή θαιιηέξγεηα φπνπ επηθξαηέο ζηέιερνο ήηαλ ην Nannochloropsis oculata ηα ιηπαξά νμέα κε ηα πςειφηεξα πνζνζηά ήηαλ ηα νμέα παικηηηθφ, παικηηειατθφ θαη EPA. Μεηαμχ ησλ ιηπηδηαθψλ θιαζκάησλ ε αλαινγία ησλ NL ήηαλ ζεκαληηθά πςειφηεξε, αθνινπζνχζε εθείλε ησλ G+S θαη ηέινο ησλ P. Σα ηξνρφδσα θαιιηεξγήζεθαλ ζε βηναληηδξαζηήξεο βηνκεραληθήο θιίκαθαο 2,500 L. Γηα ηε δηαηξνθή ηνπο ρξεζηκνπνηήζεθαλ θαιιηέξγεηεο κηθξνθπθψλ (Nannochloropsis oculata, Chlorella sp.), δχκε αξηνπνηίαο θαη δηάθνξα εκπινπηηζηηθά πεξηέρνληα ζε πςειά πνζνζηά EPA θαη εηθνζηδπεμαλντθφ (DHA). Η αλάιπζε ησλ ιηπηδίσλ ησλ ηξνρνδψσλ έδεημε φηη ε ζχζηαζε ηνπο ζε ιηπαξά νμέα εμαξηάηαη απφ ηελ ηξνθή ηελ νπνία θαηαλαιψλνπλ. Γηαηξνθή κε θαιιηέξγεηεο κηθξνθπθψλ είρε σο απνηέιεζκα ηε ζχλζεζε ιηπηδίσλ πνπ πεξηείραλ ζε ζεκαληηθά 7

πνζνζηά EPA. Μεηαμχ ησλ ιηπηδηαθψλ θιαζκάησλ, ε αλαινγία ησλ NL ήηαλ ζεκαληηθά πςειφηεξε, αθνινπζνχζε ησλ P θαη ηέινο ησλ G+S. Με ηε ρξήζε εκπινπηηζηηθψλ ηα ιηπίδηα ησλ ηξνρνδψσλ πνπ ζπζζσξεχηεθαλ ήηαλ πινχζηα ζε EPA θαη DHA.Σν ιηπηδηαθφ θιάζκα κε ηα πςειφηεξα πνζνζηά ήηαλ ην θιάζκα ησλ NL, αθνινπζνχζε ην θιάζκα ησλ P ελψ απηφ ησλ G+S εκθαλίζηεθε ζε ζεκαληηθά ρακειφηεξα πνζνζηά. 8

ABSTRACT In this MSc thesis, fatty acids composition of lipids (total, phospholipids, glyco- and sphingolipids, neutral) synthesized by Nannochloropsis oculata, Chlorella sp. and mixed cultures of the above mentioned microalgae as well as by the rotifer Brachionus plicatilis, cultivated in industrial scale bioreactors under several growth conditions, were studied. Microalgae were cultivated in industrial scale bioreactors 300 L, under full sunlight and artificial light during night-time and at a constant temperature, 28±3 ν C at sprint and 22 ±3 ν C at autumn and winter. In Chlorella sp. the most abundant fatty acids were α- linolenic and palmitic acids, whereas in Nannochloropsis oculata palmitic, eicosapentaenoic (EPA) and palmitoleic acids were predominant. Neutral lipids (NL) fraction was found in higher proportions. Among polar lipids Phospholipids (P) fraction was higher at the initial growth steps while Glyco- plus Sphingolipids (G+S) fraction predominates as growth proceeded. In the mixed culture, where Nannochloropsis oculata was the dominant strain palmitic, palmitoleic and EPA were the major fatty acids. NL was the major fraction followed by G+S and P. Rotifers were cultivated in 2,500 L tanks. Rotifers fed with microalgae s culture (Nannochloropsis oculata, Chlorella sp.), baker s yeast and artificial diets with high level of EPA and docosahexaenoic acids (DHA). Rotifers fatty acid composition depended on the fatty acid composition of the feed. Rotifers fed microalgae cultures were rich in EPA, while when artificial diets were used, lipids rich in EPA and DHA were accumulated. Among lipid fractions, the proportion of NL was the highest, followed by P and G+S. 9

1. ΔΗΑΓΧΓΖ Η θαιιηέξγεηα καθξν- θαη κηθξν-θπθψλ παγθνζκίσο απνηειεί ζεκαληηθή νηθνλνκηθή δξαζηεξηφηεηα (Borowitzka et al., 1997). Σα κηθξνθχθε είλαη κηα κεγάιε θαη δηαθξηηή νκάδα επθαξπσηηθψλ θσηνζπλζεηηθψλ νξγαληζκψλ κε απιή θπηηαξηθή δνκή, ηα νπνία απαληψληαη ηφζν ζε κνλνθχηηαξεο φζν θαη ζε πνιπθχηηαξεο κνξθέο. πλαληψληαη νπνπδήπνηε ζπλππάξρνπλ λεξφ θαη θσο θαη έρνπλ ηελ ηθαλφηεηα λα δεζκεχνπλ δηνμείδην ηνπ άλζξαθα θαη λα κεηαηξέπνπλ ηελ ειηαθή ελέξγεηα ζε ρεκηθή (Deng et al., 2009). Σα κηθξνθχθε απνηεινχλ ζεκαληηθή πεγή ζξεπηηθψλ ζπζηαηηθψλ θαη γηα ην ιφγν απηφ θαιιηεξγνχληαη θαη ρξεζηκνπνηνχληαη σο πξφζζεην ηξνθψλ ζηελ εθηξνθή πνιιψλ πδξφβησλ δψσλ, θαη θπξίσο πξνλπκθψλ θαη γφλσλ ησλ δηζχξσλ θαη νξγαληζκψλ φπσο ηα ηξνρφδσα, ηα νπνία ζηε ζπλέρεηα ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηελ εθηξνθή ησλ πξνλπκθψλ ησλ ςαξηψλ θαη ησλ θαξθηλνεηδψλ. Η ζπνπδαηφηεηα ησλ κηθξνθπθψλ ζηηο πδαηνθαιιηέξγεηεο είλαη κεγάιε θαζψο απνηεινχλ ηε θπζηθή ηξνθή ησλ ηξνρνδψσλ (Borowitzka et al., 1997). Μεξηθά εμ απηψλ παξάγνπλ θαξνηελνεηδή (β- θαξνηέλην, αζηαμαλζίλε) πνπ έρνπλ αληηνμεηδσηηθέο δξάζεηο, ελψ ε αζηαμαλζίλε αμηνπνηείηαη σο πξφζζεην ζε ηρζπνηξνθέο κε ζθνπφ ηε ρξψζε ησλ κπψλ ησλ ςαξηψλ (Pulz & Gross, 2004). Πέξα φκσο απφ ηελ αμηνπνίεζε ηνπο ζηηο πδαηνθαιιηέξγεηεο ηα κηθξνθχθε έρνπλ θαη άιιεο ρξήζεηο. Υξεζηκνπνηνχληαη ζηε δηαηξνθή αλζξψπσλ θαη παξαγσγηθψλ δψσλ, ζηελ βηνκεραλία θαιιπληηθψλ θαζψο θαη ζηελ παξαγσγή βηνθαπζίκσλ (Spolaore et al., 2006). Η θαιιηέξγεηα ησλ κηθξνθπθψλ επεξεάδεηαη απφ δηάθνξνπο παξάγνληεο νη θξηζηκφηεξνη ησλ νπνίσλ είλαη ην θσο θαη ε ζεξκνθξαζία. Η αιαηφηεηα απνηειεί έλαλ αθφκα παξάγνληα, δεδνκέλνπ φηη νη αιιαγέο ηεο έρνπλ σο απνηέιεζκα λα πξνθαιείηαη ζηα θχηηαξα ησλ κηθξνθπθψλ σζκσηηθή θαη ηνληηθή θαηαπφλεζε φπσο επίζεο θαη ηξνπνπνίεζε ηεο εθιεθηηθήο πεξαηφηεηαο ηεο κεκβξάλεο κε απνηέιεζκα ηε κεηαβνιή ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ ηφλησλ ζηα θχηηαξα. Δπηπξφζζεηα νη θαιιηέξγεηεο επεξεάδνληαη απφ ηε ζπγθέληξσζε ησλ ζξεπηηθψλ ζπζηαηηθψλ πνπ ππάξρνπλ ζην κέζν θαιιηέξγεηαο, ην ph, ηνπ νπνίνπ νη κεηαβνιέο είηε πξνθαινχλ ρεκηθή κεηαβνιή ζην κέζν θαιιηέξγεηαο είηε πξνθαινχλ κεηαβνιηθέο αιιαγέο ζηα 10

θχηηαξα (Azov, 1982), ηελ αλάδεπζε κέζσ ηεο νπνίαο επηηπγράλεηαη νκνηφκνξθε θαηαλνκή ησλ θπηηάξσλ θαη ησλ κεηαβνιηηψλ ηεο θαιιηέξγεηαο φπσο επίζεο θαη κεηαθνξά ησλ αεξίσλ κεηαμχ ηεο αέξηαο θαη πγξήο θάζεο (Eriksen, 2008), ηε ζπγθέληξσζε ηνπ O 2 θαη ηνπ CO 2 θαη απφ δηάθνξνπο βηνηηθνχο παξάγνληεο φπσο νη κνιχλζεηο απφ άιιεο θαηεγνξίεο κηθξννξγαληζκψλ θαη ν αληαγσληζκφο κε άιια είδε κηθξνθπθψλ (Mata et al., 2010). Οη θαιιηέξγεηεο ησλ κηθξνθπθψλ δηαθξίλνληαη ζε απηνηξνθηθέο, εηεξνηξνθηθέο, κημνηξνθηθέο θαη θσην-εηεξνηξνθηθέο. Απηνηξνθηθέο ραξαθηεξίδνληαη νη θαιιηέξγεηεο ζηηο νπνίεο ηε κνλαδηθή πεγή ελέξγεηαο απνηειεί ην ειηαθφ θσο ελψ εηεξνηξνθηθέο απηέο ζηηο νπνίεο ηελ πεγή ελέξγεηαο θαη άλζξαθα ζπληζηνχλ νξγαληθά ζπζηαηηθά. Οη θαιιηέξγεηεο, ζηηο νπνίεο ε θσηνζχλζεζε είλαη ε θχξηα νδφο παξαγσγήο ελέξγεηαο, κνινλφηη θάπνηα νξγαληθά ζπζηαηηθά είλαη απαξαίηεηα γηα ηελ νκαιή αχμεζε, ραξαθηεξίδνληαη σο κημνηξνθηθέο. Μηα αθφκε θαηεγνξία θαιιηέξγεηαο είλαη ε ακθηηξνθηθή, ζηελ νπνία αλάινγα κε ηηο πεξηβαιινληηθέο ζπλζήθεο, έρνπκε ελαιιαγή απφ απηνηξνθηθή ζε εηεξνηξνθηθή αχμεζε θαη αληίζηξνθα. Σέινο, νη θαιιηέξγεηεο ζηηο νπνίεο ην θσο απαηηείηαη γηα ηελ αμηνπνίεζε ησλ νξγαληθψλ ζπζηαηηθψλ σο πεγή άλζξαθα ραξαθηεξίδνληαη θσηνεηεξνηξνθηθέο (Mata et al., 2010). Έλα απφ ηα ραξαθηεξηζηηθά ησλ κηθξνθπθψλ πνπ ηα θαζηζηά ζεκαληηθά είλαη ε ηθαλφηεηά ηνπο λα βηνζπλζέηνπλ πνιπαθφξεζηα ιηπαξά νμέα κεηαμχ ησλ νπνίσλ εηθνζηπεληαλντθφ νμχ (eicosapentaenoic acid EPA) θαη εηθνζηδπεμαλντθφ νμχ (docosahexaenoic - DHA). Σα EPA θαη DHA αλήθνπλ ζηελ νηθνγέλεηα ησλ σ-3 ιηπαξψλ νμέσλ. Σα σ-3 ιηπαξά νμέα είλαη πνιχ ζεκαληηθά θαζψο έρνπλ θιηληθέο θαη θαξκαθεπηηθέο εθαξκνγέο θαη έρεη απνδεηρζεί φηη έρνπλ ζεηηθή επίδξαζε ζηελ πξφιεςε θαξδηαγγεηαθψλ λνζεκάησλ, δηαθφξσλ ηχπσλ θαξθίλνπ, Αιζράηκεξ, ζρηδνθξέλεηαο θαη άιισλ αζζελεηψλ (Mata et al., 2010). Σν EPA απνηειεί πξφδνκν κφξην ησλ εηθνζαλνεηδψλ ηα νπνία είλαη πξφδξνκα νξκνλψλ πνπ πεξηιακβάλνπλ ηηο πξνζηαγιαλδίλεο, ηα ιεπθνηξηέληα θαη ηηο ζξνκβνμάλεο. Φαίλεηαη πσο νη πξνιεπηηθέο θαη ζεξαπεπηηθέο ηδηφηεηεο απηνχ ηνπ ιηπαξνχ νμένο νθείινληαη ζε αιιαγέο πνπ επηθέξεη ζηα εηθνζαλνεηδή ηνπ αίκαηνο (Baipai & Baipai, 1992). Σν DHA απνηειεί θχξην δνκηθφ ζπζηαηηθφ ηεο θαηάο νπζίαο ηνπ εγθεθάινπ θαη ηνπ ακθηβιεζηξνεηδνχο ρηηψλα ησλ καηηψλ θαη έλα ζεκαληηθφ 11

ζπζηαηηθφ ηνπ θαξδηαθνχ ηζηνχ. Η πξφζιεςε ηνπ είλαη ζεκαληηθή γηα ηε ζσζηή αλάπηπμε ηνπ εγθεθάινπ θαη ησλ νθζαικψλ ζηα βξέθε θαη βνεζά ψζηε λα εμαζθαιίδεηαη ε ζσζηή θαξδηαγγεηαθή ιεηηνπξγία (Ward &Singh, 2005). 1.1 πζηήκαηα θαιιηέξγεηαο κηθξνθπθώλ Ληκλνζάιαζζεο θαη πνηάκηα απνηεινχζαλ παιαηφηεξα ηνπο ρψξνπο θαιιηέξγεηαο κεγάινπ φγθνπ κηθξνθπθψλ (Xu et al., 2009). Παξφηη νη θαιιηέξγεηεο απηέο είραλ πνιχ κηθξφ θφζηνο, εγθαηαιείθζεθαλ ιφγσ ηεο κεησκέλεο παξαγσγηθφηεηαο θαη ηεο ρακειήο πνηφηεηαο ησλ πξντφλησλ πνπ πξνέθππηαλ, ηφζν βηνινγηθά φζν θαη ηνμηθνινγηθά. Βηναληηδξαζηήξεο βηνκεραληθήο θιίκαθαο ζηνπο νπνίνπο ηα κηθξνθχθε θαιιηεξγνχληαη κε δηάθνξνπο ηξφπνπο ρξεζηκνπνηνχληαη πιένλ γηα ηηο θαιιηέξγεηεο βηνκεραληθήο θιίκαθαο (Lee, 2001). Οη βηναληηδξαζηήξεο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηελ θαιιηέξγεηα κηθξνθπθψλ ζπρλά δηαθέξνπλ απφ απηνχο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηελ θαιιηέξγεηα άιισλ κηθξννξγαληζκψλ (Eriksen, 2008). Γηα ηελ θαιιηέξγεηα κηθξνθπθψλ ρξεζηκνπνηνχληαη βηναληηδξαζηήξεο νη νπνίνη δίλνπλ ηε δπλαηφηεηα ειέγρνπ ηεο έληαζεο ηνπ θσηφο θαη ηεο θσην-πεξηφδνπ. Δπίζεο δίλνπλ ηε δπλαηφηεηα ηεο δεκηνπξγίαο ακηγνχο θαιιηέξγεηαο (Scott et al., 2010). Ο ζπλεζέζηεξνο ηξφπνο θαιιηέξγεηαο κηθξνθπθψλ ζηε βηνκεραλία είλαη νη θιεηζηέο θαιιηέξγεηεο ζηηο νπνίεο γίλεηαη εκβνιηαζκφο ησλ θαιιηεξγεηψλ κε θαιιηέξγεηεο πνπ αλαπηχζζνληαη ζε κηθξφηεξε θιίκαθα. Έλαο ηξφπνο θαιιηέξγεηαο πνπ θεξδίδεη έδαθνο ηα ηειεπηαία ρξφληα είλαη νη εκη-ζπλερείο θαιιηέξγεηεο, νη νπνίεο βαζίδνληαη ζηε ρξήζε βηναληηδξαζηήξσλ πνιπαηζπιελίνπ κηαο ρξήζεο (disposable) θαη ζηελ απνκάθξπλζε θαζεκεξηλά φγθνπ θαιιηέξγεηαο ν νπνίνο αληηθαζίζηαηαη απφ θξέζθν ζξεπηηθφ πιηθφ. Σέινο, έλαο πην απηνκαηνπνηεκέλνο ηξφπνο θαιιηέξγεηαο ησλ κηθξνθπθψλ είλαη νη ζπλερείο θαιιηέξγεηεο ζηηο νπνίεο νη ζπλζήθεο είλαη απζηεξά ειεγρφκελεο (James & Khars, 1990). Έλαο ηππηθφο βηναληηδξαζηήξαο απνηειείηαη απφ ηξία κέξε, ηελ πγξή θάζε, ηελ νπνία ζπληζηά ην ζξεπηηθφ κέζν, ηε ζηεξεά θάζε, ηελ νπνία ζπληζηνχλ ηα θχηηαξα ηεο θαιιηέξγεηαο θαη ηελ αέξηα θάζε. πρλά ην θσο αλαθέξεηαη σο ηέηαξηε θάζε ησλ βηναληηδξαζηήξσλ. Οη δηαθνξεηηθέο απαηηήζεηο ησλ θπηηάξσλ, σο πξνο ηηο ζπλζήθεο θαιιηέξγεηαο θαη ε αμία ησλ πξντφλησλ πνπ παξάγνληαη είρε σο 12

απνηέιεζκα ηελ αλάπηπμε δηαθφξσλ ηχπσλ βηναληηδξαζηήξσλ φπσο νη ζσιελνεηδήο, θαη επίπεδνη βηναληηδξαζηήξεο, νη αεξναλαδεπφκελνη (airlift and bubble column) θαη νη πιήξνπο αλακείμεσο (stirred tank), (Posten, 2009). Οη ζσιελνεηδήο βηναληηδξαζηήξεο ρξεζηκνπνηνχληαη γηα κεγάιεο θιίκαθαο ζπλερείο, ακηγείο θαιιηέξγεηεο κηθξνθπθψλ. Οη επίπεδνη βηναληηδξαζηήξεο ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ζπλερείο ή θιεηζηέο θαιιηέξγεηεο. Λφγσ ζρήκαηνο έρνπλ σο πιενλέθηεκα κεγαιχηεξε επηθάλεηα ηνπο λα έξρεηαη ζε επαθή κε ηηο αθηίλεο ηνπ ήιηνπ. Ιδηαίηεξν ελδηαθέξνλ παξνπζηάδνπλ νη αεξναλαδεπφκελνη βηναληηδξαζηήξεο, ζηνπο νπνίνπο ε εκθχζεζε αέξα εμαζθαιίδεη ηελ νκνηνγελή αλάδεπζε ησλ θπηηάξσλ ζε φιε ηελ έθηαζε ηνπ αληηδξαζηήξα. Μηα αθφκα θαηεγνξία βηναληηδξαζηήξσλ είλαη νη πιήξνπο αλακείμεσο, νη νπνίνη αλαπηχρζεθαλ κε ζθνπφ ηελ θαιιηέξγεηα κηθξνθπθψλ απηνηξνθηθά ρξεζηκνπνηψληαο θπξίσο ηερλεηέο πεγέο θσηηζκνχ θαζψο ρξεζηκνπνηνχληαη ζε βηνκεραληθήο θαη εξγαζηεξηαθήο θιίκαθαο θαιιηέξγεηεο (Xu et al., 2009). Σέινο, αλαθέξνπκε ηνπο βηναληηδξαζηήξεο πνιπαηζπιελίνπ κηαο ρξήζεο, νη νπνίνη είλαη βηναληηδξαζηήξεο ρακεινχ θφζηνπο θαη ρξεζηκνπνηνχληαη γηα θιεηζηέο θαιιηέξγεηεο (Εικόνα 1.1), (Scott et al., 2010). Δηθόλα 1.1: Βηναληηδξαζηήξεο πνιπαηζπιελίνπ κηαο ρξήζεο, 300 L. Plagton S.A., Μχηηθαο Αηησιναθαξλαλίαο. 13

Γηα ην θσηηζκφ ησλ βηναληηδξαζηήξσλ βηνκεραληθήο θιίκαθαο ρξεζηκνπνηείηαη είηε ην ειηαθφ θσο είηε θζνξίδνπζεο ή άιινπ ηχπνπο ιάκπεο. Απφ ηνπο δηάθνξνπο ηχπνπο βηναληηδξαζηήξσλ πνπ έρνπλ αλαπηπρζεί, απηνί πνπ έρνπλ επηθξαηήζεη είλαη νη βηναληηδξαζηήξεο ζηνπο νπνίνπο πξαγκαηνπνηνχληαη ζπλερείο θαιιηέξγεηεο κηθξνθπθψλ. Ωζηφζν, ηηο ηειεπηαίεο δεθαεηίεο ιφγσ ηεο πξνφδνπ πνπ έρεη γίλεη ζηε βηνηερλνινγία, κε ζθνπφ ηε καδηθή παξαγσγή κηθξνθπθψλ, δηάθνξνη ηχπνη ζπζηεκάησλ θαιιηέξγεηαο φπσο νη ζσιελνεηδήο θαη νη επίπεδνη αληηδξαζηήξεο ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηεο κεγάιεο θιίκαθαο, θιεηζηέο θαιιηέξγεηεο. 1.1.1 Ρόλορ ηων μικποθςκών ζηην ηποθική αλςζίδα Η ζέζε ησλ κηθξνθπθψλ ζηελ ηξνθηθή αιπζίδα θαη ν ξφινο ηνπο ζηηο πδαηνθαιιηέξγεηεο, είλαη νη ιφγνη γηα ηνπο νπνίνπο ην ελδηαθέξνλ ηεο βηνηερλνινγίαο επηθεληξψζεθε ζηελ αλάπηπμε λέσλ ζπζηεκάησλ θαιιηέξγεηαο κε ζθνπφ ηε καδηθή παξαγσγή κηθξνθπθψλ. Σα κηθξνθχθε δηαδξακαηίδνπλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηηο πδαηνθαιιηέξγεηεο θαζψο απνηεινχλ κέζν εκπινπηηζκνχ ηνπ δσνπιαγθηφλ ην νπνίν ρξεζηκνπνηείηαη σο πξψηε ηξνθή ησλ πξνλπκθψλ ησλ ςαξηψλ. Πέξα απφ ηηο πξσηεΐλεο θαη ηελ ελέξγεηα πνπ κεηαθέξνληαη κέζσ ηεο ηξνθηθήο αιπζίδαο, απφ ηα κηθξνθχθε κεηαθέξνληαη ζηηο πξνλχκθεο θαη δηάθνξεο βηηακίλεο, ρξσζηηθέο, πνιπαθφξεζηα ιηπαξά νμέα θαη ζηεξφιεο (Brown, 2002). Δπηπιένλ ηα κηθξνθχθε θαηαλαιψλνληαη άκεζα απφ ηα ςάξηα, ζηα αξρηθά πξνλπκθηθά ηνπο ζηάδηα, θαη θαη απηφ ηνλ ηξφπν ηα ζξεπηηθά ηνπο ζπζηαηηθά κεηαθέξνληαη απεπζείαο ζε απηά (Reitan et al., 1997). Με ηελ πξνζζήθε θαιιηέξγεηαο κηθξνθπθψλ ζηηο δεμακελέο ησλ ςαξηψλ ε παξαγσγή ησλ ςαξηψλ απμάλεηαη. Παξφιν πνπ ν κεραληζκφο δξάζεο πνπ νδεγεί ζε απηή ηελ αχμεζε είλαη άγλσζηνο, έρνπλ αλαπηπρζεί δηάθνξεο ζεσξίεο πνπ πξνζπαζνχλ λα εξκελεχζνπλ απηφ ην θαηλφκελν. χκθσλα κε ηηο ζεσξίεο απηέο απηφ κπνξεί λα νθείιεηαη ζηνλ πεξηνξηζκφ ηνπ θσηφο πνπ θηάλεη ζηηο πξνλχκθεο, ζηελ δηαηήξεζε ηεο ζξεπηηθήο πνηφηεηαο ηνπ δσνπιαγθηφλ, ιφγσ ηεο ζπλερνχο παξνπζίαο ησλ κηθξνθπθψλ, ζηελ έθθξηζε δηαθφξσλ βηηακηλψλ ή άιισλ παξαγφλησλ αχμεζεο απφ ηα κηθξνθχθε θαη ζηελ πξνβηνηηθή επίδξαζε ησλ κηθξνθπθψλ ζηα ςάξηα. Σν 14

πηζαλφηεξν είλαη φηη ν κεραληζκφο είλαη ζπλδπαζκφο φισλ ησλ παξαπάλσ (Brown, 2002). 1.2 Βηνζύλζεζε ιηπηδίωλ ζηα κηθξνθύθε Η βηνκεραληθή παξαγσγή κηθξνβηαθψλ ιηπηδίσλ, γλσζηά θαη σο Single Cell Oils (SCO), θαηέζηε δπλαηή ηελ ηειεπηαία δεθαεηία (Harwood & Gushina, 2009). Οη κηθξννξγαληζκνί απνηεινχλ κηα ξεαιηζηηθή, ελαιιαθηηθή ιχζε γηα ηελ παξαγσγή ιηπηδίσλ ησλ νπνίσλ ε δνκή παξνπζηάδεη ηδηαίηεξν ελδηαθέξνλ, επεηδή κνηάδεη κε ηε δνκή δηάθνξσλ «εμσηηθψλ» ιηπηδίσλ φπσο π.ρ ηνπ θαθάν, ηεο θάιαηλαο θιπ (Αγγειήο, 2007). Σα ιηπίδηα πνπ ζπληίζεληαη απφ ηνπο κηθξννξγαληζκνχο απνηεινχλ είηε δνκηθά ζπζηαηηθά, είηε απνζεθεπηηθά κφξηα ησλ θπηηάξσλ (Behrens & Kyle, 1996). Ωο ειαηνγφλα ραξαθηεξίδνληαη ηα κηθξνθχθε ηα νπνία ζπζζσξεχνπλ ιηπίδηα ζε πνζνζηφ κεγαιχηεξν ηνπ 20-25% ηεο θπηηαξηθήο ηνπο κάδαο. Η πεξηεθηηθφηεηα ησλ κηθξνθπθψλ ζε ιηπίδηα θπκαίλεηαη απφ 1 έσο 70% ηεο θπηηαξηθήο ηνπο κάδαο θαη ζε νξηζκέλα είδε κπνξεί λα θηάζεη ην 90% ηεο μεξήο βηνκάδαο ηνπο (Mata et al., 2010). Όπσο ζηα θπηά, έηζη θαη ζηα κηθξνθχθε ηα ιηπίδηα ζπζζσξεχνληαη θπξίσο ππφ κνξθή ηξηγιπθεξηδίσλ (Ratledge, 2004). Η βηνζχλζεζε ησλ ιηπηδίσλ φπσο ζε φινπο ηνπο κηθξννξγαληζκνχο έηζη θαη ζηα κηθξνθχθε επηηπγράλεηαη φηαλ ε θαιιηέξγεηα ηνπο γίλεηαη ζε ζξεπηηθφ κέζν ην νπνίν είλαη πεξηνξηζηηθφ σο πξνο έλαλ παξάγνληα. Ο παξάγνληαο ν νπνίνο απνηειεί ζπλήζσο ηνλ πεξηνξηζηηθφ παξάγνληα γηα ηελ αχμεζε είλαη ην άδσην. Τπφ ζπλζήθεο έιιεηςεο αδψηνπ ην πνζνζηφ ησλ ιηπηδίσλ πνπ ζπζζσξεχεηαη απμάλεηαη ζεκαληηθά (Hsieh & Wu, 2009). Μεηά ηελ εμάληιεζε ηνπ πεξηνξηζηηθνχ παξάγνληα ε αθνκνίσζε ηνπ άλζξαθα ζπλερίδεηαη, φκσο ν άλζξαθαο πνπ αθνκνηψλεηαη ρξεζηκνπνηείηαη κε ζθνπφ ηε βηνζχλζεζε ιηπηδίσλ (Ratledge, 2004). Η βηνζχλζεζε ησλ πνιπαθφξεζησλ ιηπαξψλ νμέσλ (PUFA ) είηε αεξφβηα είηε αλαεξφβηα πεξηιακβάλεη έλδπκα ηα νπνία είλαη ζπλδεδεκέλα ζηε κεκβξάλε ησλ θπηηάξσλ (Certik & Shimizu, 1999). Σα έλδπκα απηά εηζάγνπλ ηνπο δηπινχο δεζκνχο θαη νλνκάδνληαη απνθνξεζκάζεο (desaturases), (Harwood, 1994). Οη απνθνξεζκάζεο 15

απνηεινχληαη απφ ηξεηο δηαθνξεηηθέο πξσηεΐλεο, ηε NAD(P)H αλαγσγάζε ηνπ θπηνρξψκαηνο b5, ην θπηφρξσκα b5 θαη ηελ ηειηθή, επαίζζεηε ζην θπάλην, απνθνξεζκάζε(εικόνα1.2.1). Δηθόλα. 1.2.1: Αεξφβην ζχζηεκα απνθνξεζκψλ γηα ηε βηνζχλζεζε ησλ αθφξεζησλ ιηπαξψλ νμέσλ ζηνπο κηθξννξγαληζκνχο. (Certik & Shimizu, 1999, ηξνπνπνηεκέλν). Τπάξρνπλ ηξεηο ηχπνη απνθνξεζκαζψλ, ε αθπιν-coa απνθνξεζκάζε, ε αθπιν-acp απνθνξεζκάζε θαη ε απνθνξεζκάζε ησλ ιηπαξψλ νμέσλ. Γεληθά ην ζηεαξπιν-coa ή ην ζηεαξπιν-acp είλαη ηα ππνζηξψκαηα ζηα νπνία γίλεηαη ε εηζαγσγή ηνπ πξψηνπ δηπινχ δεζκνχ ψζηε λα ζρεκαηηζηεί ην νιενυιν-coa ή ην νιενυιν-acp, αληίζηνηρα. Οη επαθφινπζνη απνθνξεζκνί πξαγκαηνπνηνχληαη ζην ελδνπιαζκαηηθφ δίθηπν, φπνπ ηα ιηπαξά νμέα είλαη πξνζδεκέλα ζηα θσζθνιηπίδηα (θαη εηδηθφηεξα ζηε θσζθαηηδπινρνιίλε). Ωζηφζν, πέξα απφ ηελ θχξηα κεηαβνιηθή νδφ κε ηνπο απνθνξεζκνχο, ζην ελδνπιαζκαηηθφ δίθηπν πξαγκαηνπνηείηαη θαη άκεζε κεηαηξνπή ησλ ιηπαξψλ αθπιν-coa ζηα αληίζηνηρα PUFAs (Certik & Shimizu, 1999). 16

Καηά ηελ αεξφβηα κεηαβνιηθή νδφ ν πξψηνο δηπιφο δεζκφο εηζάγεηαη ζηε ζέζε 9 ησλ θνξεζκέλσλ ιηπαξψλ νμέσλ κε ηε δξάζε ηεο Γ 9 απνθνξεζκάζεο. Καη απηφλ ηνλ ηξφπν πξνθχπηνπλ ην παικηηειατθφ θαη ειατθφ νμχ ηα νπνία είλαη ηα πην θνηλά κνλναθφξεζηα ιηπαξά νμέα. Σν ειατθφ νμχ ζηε ζπλέρεηα κε ηε δξάζε ηεο απνθνξεζκάζεο Γ 12 κεηαηξέπεηαη ζε ιηλειατθφ νμχ ην νπνίν είλαη δπλαηφ λα κεηαηξαπεί, κε ηε δξάζε ηεο Γ 15 απνθνξεζκάζεο, ζε α-ιηλνιεληθφ νμχ. Σν ειατθφ, ιηλειατθφ θαη α-ιηλνιεληθφ είλαη ηξία ιηπαξά νμέα ηα νπνία απνηεινχλ ηα βαζηθά ιηπαξά νμέα απφ ηα νπνία πξνθχπηνπλ κε δηαδνρηθέο εηζαγσγέο δηπιψλ δεζκψλ θαη επηκεθχλζεηο, ηα ιηπαξά νμέα ησλ νηθνγελεηψλ σ-3, σ-6 θαη σ-9. Σα ιηπαξά νμέα ηεο σ-9 νηθνγέλεηαο πξνθχπηνπλ απφ απνθνξεζκνχο (Γ 6, Γ 5 ) θαη επηκήθπλζε ηεο αιεηθαηηθήο αιπζίδαο ηνπ ειατθνχ νμένο. Η σ-6 νηθνγέλεηα ησλ ιηπαξψλ νμέσλ πξνθχπηεη ζπλήζσο κεηά απφ απνθνξεζκνχο (Γ 6, Γ 5, Γ 4 ) θαη επηκεθχλζεηο ηεο αιεηθαηηθήο αιπζίδαο ηνπ ιηλειατθνχ νμένο. Σέινο, ηα ιηπαξά νμέα ηεο σ-3 νηθνγέλεηαο πξνθχπηνπλ απφ δχν κεηαβνιηθέο νδνχο, κηα κεηαβνιηθή νδφ εμαξηψκελε απφ ηε ζεξκνθξαζία θαη κία αλεμάξηεηε απφ απηή. ηε κεηαβνιηθή νδφ πνπ δελ εμαξηάηαη απφ ηε ζεξκνθξαζία ην αξαρηδνληθφ νμχ κεηαβνιίδεηαη κέζσ ηνπ σ-3 κνλνπαηηνχ ζε EPA, εηθνζηδπνπεληαλντθφ (DPA-σ3) θαη DHA. ηε δεχηεξε κεηαβνιηθή νδφ ε νπνία εμαξηάηαη απφ ηε ζεξκνθξαζία, ε βηνζχλζεζε ησλ ιηπαξψλ νμέσλ ηεο σ-3 νηθνγέλεηαο πεξηιακβάλεη ηε κεηαηξνπή ησλ ιηπαξψλ νμέσλ ηεο νηθνγέλεηαο σ-6 ζηα αληίζηνηρα ηεο σ-3. Γχν έλδπκα πνπ πηζαλψο εκπιέθνληαη ζηε δηαδηθαζία απηή είλαη νη Γ15 θαη Γ17 απνθνξεζκάζεο. Δηδηθφηεξα, αλαθέξεηαη ε βηνζχλζεζε ηνπ EPA, ην νπνίν είλαη έλα σ-3 πνιπαθφξεζην ιηπαξφ νμχ πνπ απνηειείηαη απφ είθνζη άηνκα άλζξαθα κε πέληε δηπινχο δεζκνχο. Οη δηπινί δεζκνί ηνπνζεηνχληαη έηζη ψζηε ν ηειεπηαίνο λα απέρεη ηξία άηνκα άλζξαθα απφ ην κεζπιηθφ ή σκέγα άθξν ηεο αιεηθαηηθήο αιπζίδαο, θαη γη απηφ αλαθέξεηαη σο σ-3 ιηπαξφ νμχ (Milledge, 2011). Τπάξρνπλ δχν κεηαβνιηθέο νδνί ζχλζεζεο ηνπ EPA, ε σ-3 θαη σ-6. Καη ζηηο δχν κεηαβνιηθέο νδνχο ε πνξεία μεθηλά απφ ην παικηηηθφ νμχ θαη είλαη θνηλή κέρξη ην ιηλειατθφ νμχ. ηελ σ-6 κεηαβνιηθή νδφ δξα ε Γ 6 απνθνξεζκάζε θαη απφ ην ιηλειατθφ πξνθχπηεη ην α-ιηλνιεληθφ ελψ ζηελ σ-3 κεηαβνιηθή νδφ δξα ε Γ 15 απνθνξεζκάζε θαη πξνθχπηεη ην γ-ιηλνιεληθφ. Απφ ην ζεκείν απηφ θαη κε ηε δξάζε ησλ θαηάιιεισλ απνθνξεζκαζψλ θαη ελδχκσλ επηκήθπλζεο, ηειηθά πξνθχπηεη ην 17

EPA (Guschina & Harwood, 2006). Φαίλεηαη πσο ε κεηαβνιηθή νδφο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηε βηνζχλζεζε ηνπ EPA ζηα κηθξνθχθε είλαη ε σ-6, δεδνκέλνπ φηη ηα ιηπαξά νμέα πνπ ζπκκεηέρνπλ ζε απηή είλαη ηα θχξηα ιηπαξά νμέα ηεο βηνζχλζεζεο ηνπ EPA. Ωζηφζν, ε χπαξμε ζε ρακειά πνζνζηά ησλ σ-3 ιηπαξψλ νμέσλ, C18:3σ3 θαη C20:4σ-3, απνδεηθλχεη ηελ χπαξμε ηεο σ-3 κεηαβνιηθήο νδνχ, ε νπνία φκσο παξνπζηάδεη κηθξφηεξε ελεξγφηεηα (Khozin-Goldberg et al., 2002, Leonard et.al., 2004). Η σ-3 κεηαβνιηθή νδφο είλαη ε θχξηα νδφο πνπ ρξεζηκνπνηνχλ νη αλψηεξνη επθαξπσηηθνί νξγαληζκνί γηα ηε βηνζχλζεζε ηνπ EPA (Leonard et.al., 2004). ηελ Εικόνα 1.2.3 θαίλεηαη ε πνξεία βηνζχλζεζεο ηνπ EPA. 18

Δηθόλα 1.2.3: Οη δπν κεηαβνιηθέο νδνί βηνζχλζεζεο ηνπ ΔΡΑ. (Wen &Chen 2003,ηξνπνπνηεκέλν). Μεηά ηελ βηνζχλζεζε ησλ πνιπαθφξεζησλ ιηπαξψλ νμέσλ απηά κεηαθέξνληαη κέζσ αληηδξάζεσλ δηεζηεξνπνίεζεο ζε άιια θπηηαξηθά ιηπίδηα. Πνιινί κηθξννξγαληζκνί ζπζζσξεχνπλ κεγάιεο πνζφηεηεο PUFAs ππφ κνξθή ηξηγιπθεξηδίσλ ηα νπνία ζπληίζεληαη απφ ηελ 3-θσζθνξηθή γιπθεξφιε θαη ην αθπιν- CoA κέζσ κηαο δηαδηθαζίαο, ζηελ νπνία ζπκκεηέρνπλ δηάθνξα έλδπκα (Certik & Shimizu, 1999). Αλαιπηηθφηεξα ε πνξεία βηνζχλζεζεο ησλ ηξηγιπθεξηδίσλ απεηθνλίδεηαη ζηελ Εικόνα 1.2.2 (Radakovits et al., 2010). 19

Δηθόλα 1.2.2: Απινπνηεκέλε επηζθφπεζε ησλ κεηαβνιηηψλ θαη αληηπξνζσπεπηηθέο κεηαβνιηθέο νδνί ηεο βηνζχλζεζεο ιηπηδίσλ ζηα κηθξνθχθε. Με καχξν θαίλνληαη νη κεηαβνιηθέο νδνί θαη κε θφθθηλν ηα έλδπκα. Σα ειεχζεξα ιηπαξά νμέα ζπληίζεληαη ζηνπο ρισξνπιάζηεο, ελψ ηα ηξηγιπθεξίδηα κπνξεί λα ζπζζσξεχνληαη ζην ελδνπιαζκαηηθφ δίθηπν. ACCase: θαξβνμπιάζε ηνπ αθέηπιν-ζπλελδχκνπ Α, ACP: αθπιν-κεηαθέξνπζα πξσηεΐλε, CoA: ζπλέλδπκν Α, DAGAT: αθπινηξαλζθεξάζε ηεο δηαθπινγιπθεξφιεο, DHAP: θσζθνξηθή δηυδξνμπαθεηφλε, ENR: ελνιηθή-acp αλαγσγάζε, FAT: αθπιν-acp ζεηνεζηεξάζε, G3PDH: απνθνξεζκάζε ηεο 3-θσζθνξηθήο γιπθεξφιεο, GPAT: αθπινηξαλζθεξάζε ηεο 3-θσζθνξηθήο γιπθεξφιεο, HD: αθπδαηάζε ηεο 3-πδξνμπιαθπιν- ACP, KAR: αλαγσγάζε ηεο 3-θεηνάθπιν-ACP, KAS: ζπλζεηάζε ηεο 3-θεηνάθπιν-ACP, LPAAT, αθπινηξαλζθεξάζε ηνπ ιπζν-θσζθαηηδηθνχ νμένο, LPAT: αθπινηξαλζθεξάζε ηεο ιπζν-θσζθαηηδνρνιίλεο, MAT: ηξαλζαθπιάζε ηεο κειφλπιν-coa:acp, PDH, ζχκπινθν 20

ηεο ππξνζηαθπιηθήο αθπδξνγνλάζεο, TAG: ηξηγιπθεξίδηα (Radakovits et al., 2010, ηξνπνπνηεκέλν). Σα ιηπίδηα ησλ κηθξνθπθψλ ραξαθηεξίδνληαη απφ ηελ χπαξμε αζπλήζηζησλ ιηπαξψλ νμέσλ. Δπηπιένλ, ραξαθηεξίδνληαη απφ ηελ χπαξμε ιηπαξψλ νμέσλ κεγάιεο αιεηθαηηθήο αιπζίδαο (>18C) θαη PUFAs. Η παξνπζία, ζε πνζνζηφ πάλσ απφ 20 % ιηπαξψλ νμέσλ φπσο ην EPA, ην AA θαη ην DHA, θαζηζηά ηα κηθξνθχθε πνιχ ζεκαληηθά, θαη απηφ ιφγν ηνπ ξφινπ ηνπο ζηελ ηξνθηθή αιπζίδα (Harwood & Gushina, 2009). Ωο γλσζηφλ ππάξρνπλ κεγάιεο δηαθνξέο ζηε ζχζηαζε ζε ιηπαξά νμέα ησλ ιηπηδίσλ πνπ ζπζζσξεχνληαη ζηα δηάθνξα είδε κηθξνθπθψλ, δεδνκέλνπ φηη είλαη «εηδηθή» γηα ην θάζε είδνο θαη επεξεάδεηαη απφ ηηο ζπλζήθεο θαιιηέξγεηαο θαη απφ θπζηθνχο παξάγνληεο. Δίλαη γεληθά απνδεθηφ φηη ηα κηθξνθχθε πξνζαξκφδνληαη ζηηο λέεο πεξηβαιινληηθέο ζπλζήθεο θαη απηφ αληηθαηνπηξίδεηαη ζηελ πνηθηιία πνπ παξνπζηάδεη ην πξφηππν ησλ ιηπηδίσλ ηνπο θαη ζηελ ηθαλφηεηά ηνπο λα ζπλζέηνπλ αζπλήζηζηεο ελψζεηο (Guschina & Harwood, 2006). Η ζεξκνθξαζία απνηειεί έλαλ απφ ηνπο θπξηφηεξνπο παξάγνληεο πνπ επεξεάδνπλ ηε ζχζηαζε ησλ κηθξνθπθψλ ζε ιηπαξά νμέα. Γεληθά, ζα κπνξνχζακε λα πνχκε φηη ε αθνξεζηφηεηα ησλ ιηπαξψλ νμέσλ απμάλεη κε ηελ πηψζε ηεο ζεξκνθξαζίαο θαη απηφ θαίλεηαη πσο είλαη έλαο κεραληζκφο ν νπνίνο εμαζθαιίδεη ηε δηαηήξεζε ηεο ξεπζηφηεηαο ησλ κεκβξαλψλ ησλ κηθξνθπθψλ (Harwood & Guschina, 2009). 1.3 πζηεκαηηθή θαηάηαμε Nannochloropsis oculata θαη Chlorella sp. Σα δχν ζηειέρε κηθξνθπθψλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ζηελ παξνχζα εξγαζία αλήθνπλ ζηελ επηθξάηεηα ησλ Eukaryota. Δηδηθφηεξα ην Nannochloropsis oculata ηαμηλνκείηαη ζηελ ηάμε ησλ Eustigmatales θαη ζηελ νηθνγέλεηα ησλ Eustigmatophyceae (Barsanti & Gualtieri, Droop et al., 2004) ελψ ην Chlorella sp.θαηαηάζζεηαη ζηελ ηάμε ησλ Chlorallales θαη ζηελ νηθνγέλεηα ησλ Chlorophyceae (PubMed, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). 21

1.4 Σξνρόδωα Σα ηξνρφδσα είλαη κηθξνί πιαγθηνληθνί νξγαληζκνί νη νπνίνη αλήθνπλ ζην θχιν Rotifera. Σα είδε ησλ ηξνρνδψσλ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηηο πδαηνθαιιηέξγεηεο αλήθνπλ ζην γέλνο Brachionus. ηηο θαιιηέξγεηεο πνπ γίλνληαη ζε ζαιαζζηλφ λεξφ ρξεζηκνπνηείηαη ην είδνο Brachionus plicatilis, δεδνκέλνπ φηη ηα ηξνρφδσα απηνχ ηνπ είδνπο παξνπζηάδνπλ αληνρή ζηηο ζπλζήθεο πνπ επηθξαηνχλ ζην ζαιαζζηλφ πεξηβάιινλ. Σα ηξνρφδσα ραξαθηεξίδνληαη απφ κεγάιε ηθαλφηεηα πιεζπζκηαθήο αχμεζεο, φηαλ βξεζνχλ ζε θαηάιιειεο πεξηβαιινληηθέο ζπλζήθεο, θάηη πνπ ζπκβαίλεη ηελ άλνημε θαη ην θζηλφπσξν (Κιαδάο, 2006). Σα ηξνρφδσα παξέρνληαη σο ηξνθή ζηηο πξνλχκθεο ησλ ςαξηψλ, θαηά ηα αξρηθά ζηάδηα δσήο ηνπο, κεηά ηελ εθθφιαςή ηνπο απφ ηα απγά. Σα ηξνρφδσα επηιέγνληαη ιφγσ ηεο δηαζεζηκφηεηαο ηνπο ζε κεγάιεο πνζφηεηεο, ηνπ κεγέζνπο ηνπο πνπ είλαη ηφζν, φζν ην άλνηγκα ηνπ ζηφκαηνο ησλ πξνλπκθψλ ησλ ςαξηψλ (Lubzens et al., 2001), ηεο πεξηνξηζκέλεο κεηαηφπηζεο θαη ηεο αδηάθνπεο θίλεζεο ηνπο πνπ εμππεξεηεί ηηο πξνλχκθεο νη νπνίεο παξνπζηάδνπλ πεξηνξηζκέλε θνιπκβεηηθή ηθαλφηεηα θαη πεξηνξηζκέλε αληίιεςε ηνπ ρψξνπ (Κιαδάο, 2006). Λφγσ ηεο πςειήο ζξεπηηθήο ηνπο αμίαο, ηα ηξνρφδσα είλαη πνιχ ζεκαληηθά γηα ηελ επηβίσζε θαη ηελ αλάπηπμε ησλ κηθξψλ ςαξηψλ (Lie et al., 2001). Η βηνζχλζεζε ησλ ιηπηδίσλ ησλ ηξνρνδψσλ εμαξηάηαη ζε κεγάιν βαζκφ απφ ηελ ηξνθή ηελ νπνία θαηαλαιψλνπλ, ππνδεηθλχνληαο φηη ηα ιηπαξά νμέα αθνχ απειεπζεξσζνχλ, κέζσ πδξφιπζεο ησλ ηξηγιπθεξηδίσλ ζην έληεξν, απνξξνθψληαη, ζηε ζπλέρεηα θαηαβνιίδνληαη θαη ηέινο ελζσκαηψλνληαη ζην κφξην ησλ θσζθνιηπηδίσλ (Lubzen s et al., 1985). Γηα ηε δηαηξνθή ησλ ηξνρνδψσλ κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ δηάθνξεο θαηεγνξίεο ηξνθψλ φπσο θαιιηέξγεηεο κηθξνθπθψλ, δχκε αξηνπνηίαο θαη δηάθνξα εκπινπηηζηηθά (Lie et al., 1997). 1.5 πζηήκαηα θαιιηέξγεηαο ηξνρνδώωλ Οη θαιιηέξγεηεο ησλ ηξνρνδψσλ πξαγκαηνπνηνχληαη ζε βηναληηδξαζηήξεο βηνκεραληθήο θιίκαθαο ησλ νπνίσλ ν φγθνο θηάλεη κέρξη θαη ηα 300,000 L, ((Lubzen s et al., 1985). ηελ Εικόνα 1.5.1 απεηθνλίδεηαη βηναληηδξαζηήξαο βηνκεραληθήο θιίκαθαο 2,500 L. 22

Δηθόλα 1.5.1: Καιιηέξγεηα Brachionus plicatilis ζε βηναληηδξαζηήξα βηνκεραληθήο θιίκαθαο 2,500 L. Plagton S.A, Μχηηθαο Αηη/ληαο. Γεληθά, κπνξνχκε λα δηαθξίλνπκε ηξείο θχξηνπο ηξφπνπο θαιιηέξγεηαο ησλ ηξνρνδψσλ: ηηο θιεηζηέο θαιιηέξγεηεο, ηηο εκη-ζπλερήο θαιιηέξγεηεο θαη ηηο ζπλερείο θαιιηέξγεηεο (ρεκεηνζηαηηθνχ ηχπνπ). ηηο θιεηζηέο θαιιηέξγεηεο, ηα ηξνρφδσα θαιιηεξγνχληαη ζε ρακειή ππθλφηεηα θαη ζπιιέγνληαη αθνχ θαηαλαισζνχλ φια ηα κηθξνθχθε ηα νπνία απνηεινχλ ηελ ηξνθή ηνπο. Οη εκη-ζπλερείο θαιιηέξγεηεο, είλαη έλα ζχζηεκα θαιιηέξγεηαο ην νπνίν βαζίδεηαη ζε πεξηνδηθή (ζρεδφλ θαζεκεξηλή) απνκάθξπλζε πνζφηεηαο ηξνρνδψσλ θαη αληηθαηάζηαζε κε θξέζθν ζξεπηηθφ πιηθφ. Σέινο, αλαθέξνληαη νη ζπλερείο θαιιηέξγεηεο νη νπνίεο βαζίδνληαη ζε ρεκεηνζηαηηθά κνληέια κηθξννξγαληζκψλ φπνπ νη ζπλζήθεο θαιιηέξγεηεο (ζεξκνθξαζία, ph, παξνρή νμπγφλνπ θαη ππθλφηεηα θαιιηεξγνχκελσλ νξγαληζκψλ) ειέγρνληαη πιήξσο (Lubzen s et al., 1985). 1.6 Βηνζύλζεζε ιηπηδίωλ ζηα ηξνρόδωα Η βηνζχλζεζε ησλ ιηπηδίσλ ησλ ηξνρνδψσλ εμαξηάηαη ζε πνιχ κεγάιν βαζκφ απφ ηελ ηξνθή ηελ νπνία θαηαλαιψλνπλ (Rainuzzo et al., 1994, Oie et al., 1994). Φαίλεηαη πσο κεηά ηηο 24 h ην πνζνζηφ ησλ ιηπηδίσλ πνπ ζπζζσξεχεηαη ζηα ηξνρφδσα παξακέλεη ζηαζεξφ θαη δελ κεηαβάιιεηαη, νπνηαδήπνηε θαηεγνξία ηξνθήο 23