Ιατρική των Μεταγγίσεων

ΤΟΜΟΣ 2 - ΤΕΥΧΟΣ 1 ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ - ΜΑΡΤΙΟΣ 2011 ISSN: 1792-7110 Διευθυντής Σύνταξης: Καθηγητής Φώτης Ν. Μπερής Συνεκδότες: Καθηγήτρια Ελένη A. Παπαδάκη, Καθηγητής Κωνσταντίνος Τσαταλάς Ιατρική των Μεταγγίσεων Λουκάς Δαδιώτηs, MD Guest Editor HELLENIC SOCIETY OF HAEMATOLOGY ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ

ix The Journal of the Hellenic Society of HEMATOLOGY HELLENIC SOCIETY OF HAEMATOLOGY Περιοδική Έκδοση της Ελληνικής Αιματολογικης Εταιρείας ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ BOARD OF THE HELLENIC SOCIETY OF HAEMATOLOGY ΔΙΟΙΚΗΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΗΣ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗΣ ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ President: Vice Presidents: General Secretary: Executive Secretary: Treasurer: Members: Nikolaos Charchalakis Dimitrios Karakassis Ioanna Sakellari Elisabeth Grouzi Ioannis Kakkas Panagiotis Panagiotidis Georgios Vassilopoulos Konstantinos Tsatalas Panagiotis Tsaftaridis Panagiotis Tsirigotis Πρόεδρος: Αντιπρόεδροι: Γεν. Γραμματέας: Ειδ. Γραμματέας: Ταμίας: Μέλη: Νικόλαος Χαρχαλάκης Δημήτριος Καρακάσης Ιωάννα Σακελλάρη Ελισάβετ Γρουζή Ιωάννης Κάκκας Παναγιώτης Παναγιωτίδης Γεώργιος Βασιλόπουλος Κωνσταντίνος Τσαταλάς Παναγιώτης Τσαφταρίδης Παναγιώτης Τσιριγώτης EDITOR Photis N. Beris Professor of Haematology Medical School Geneva University, Switzerland Modile: +41 79 957 5461 e-mail: photis.beris@unilabs.com Co-editors Helen A. Papadaki Professor of Haematology University of Crete School of Medicine Head of Dept of Haematology University Hospital of Heraklion, Crete Τel.: +30 2810 394629 Fax.: +30 2810 394632 e-mail: epapadak@med.uoc.gr Konstantinos Tsatalas Professor of Haematology University Haematology Clinic University General Hospital of Alexandroupolis E-mail: ktsatala@med.duth.gr PAST Co-editors Nicolaos C. Zoumbos ΕΚΔΟΤΗΣ Φώτης Ν. Μπερής Καθηγητής Αιματολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Γενεύης Κινητό: +41 79 957 5461 e-mail: photis.beris@unilabs.com Συν-Εκδoτες Ελένη A. Παπαδάκη Καθηγήτρια Αιματολογίας Επικεφαλής Αιματολογικού Τμήματος Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου Κρήτης Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Κρήτης Τηλ.: 2810 394629 Fax.: 2810 394632 e-mail: epapadak@med.uoc.gr Κωνσταντίνος Τσαταλάς Καθηγητής Αιματολογίας Πανεπιστημιακή Αιματολογική Κλινική Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Αλεξανδρούπολης E-mail: ktsatala@med.duth.gr ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΙ Συν-Εκδoτες Νικόλαος Κ. Ζούμπος ΙΔΙΟΚΤΗΤΗΣ: Ελληνική Αιματολογική Εταιρεία, Κηφισίας 27, 115 23 Αθήνα, Τηλ.: 210 7211806 ΓΡΑΦΕΙΟ ΕΚΔΟΣΗΣ - ΔΙΑΦΗΜΙΣΤΙΚΕΣ ΚΑΤΑΧΩΡΗΣΕΙΣ: Vita Congress - Β. Βουραζέρης, Παπαδιαμαντοπούλου 4 & Βασ. Σοφίας, 11528 Αθήνα, Τηλ.: 210.72.54.360, Fax: 210.72.54.363, E-mail: info@vitacongress.gr, http://www.vitacongress.gr Εκτυπωση: ΤΕΧΝΟΓΡΑΜΜΑmed, Λ. Μεσογείων 380, 153 41 Αγία Παρασκευή, Τηλ.: +30210.6000643, Fax: +30 210 6002295, E-mail: techn@hol.gr

x Vol. 2, No 1 January - March 2011 MEDICINE OF TRANSFUSIONS Guest editor: Loukas Dadiotis CONTENTS Introduction... 13 Loukas Dadiotis 1. Blood group genotyping... 14 Maria Ganidou 2. Red cell storage lesion... 22 Marianna Antonelou, Issidora Papassideri, Konstantinos Stamoulis 3. The bacterial contamination of blood components... 34 Vassiliki Danilatou, Ekaterini Sfiridaki 4. Trali Syndrome and post Transfusion Purpura: Serious underestimated adverse events of blood transfusion... 44 Kallistheni Farmaki 5. Pathogen inactivation: Positive and negative aspects... 55 Anthi Gafou, Niki Vgontza 6. Therapeutic management of massive bleeding - An update... 76 Elias S. Kyriakou, Oreanthi Τravlou, Elissavet J. Grouzi 7. Intrauterine and Neonatal Transfusion... 90 Chryssoula Alepi 8. Tranfusion in transplanted patients... 99 Stylianos Saridakis, Panagiota Koutsogianni 9. Artificial oxygen carriers: Goals and difficulties...110 Athina Mougiou, Μarina Karakantza 10. Emerging inn ovative techniques for the detection of blood-transmissible agents: An Industrial Property document based estimation of blood-testing prospect...120 Vassilis Spyropoulos Cover page: S-59 Mηχανισμός δράσης by Anthi Gafou Niki Vgontza (see Pathogen inactivation (reduction): pros and cons, page 58)

xi Τόμος 2, Τεύχος 1 Ιανουάριος - Μάρτιος 2011 Ιατρική των Μεταγγίσεων Guest editor: Λουκάς Δαδιώτηs ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή... 13 Λουκάς Δαδιώτηs 1. Μοριακή τυποποίηση των ομάδων αίματος... 14 Μαρία Γκανίδου 2. Βλάβες συντήρησης ερυθρών αιμοσφαιρίων... 22 Μαριάννα Αντωνέλου, Ισιδώρα Παπασιδέρη, Κωνσταντίνος Σταμούλης 3. Βακτηριδιακή επιμόλυνση παραγώγων αίματος... 34 Βασιλική Δανηλάτου, Αικατερίνη Σφυριδάκη 4. Σύνδρομο Trali και μετά Μετάγγιση Πορφύρα: Σοβαρές υποεκτιμημένες ανεπιθύμητες αντιδράσεις μετάγγισης αίματος και παραγώγων... 44 Καλλισθένη Φαρμάκη 5. Αδρανοποίηση παθογόνων στα ασταθή παράγωγα αίματος Υπέρ και κατά... 55 Ανθή Γάφου, Νίκη Βγόντζα 6. Σύγχρονη αντιμετώπιση μείζονος αιμορραγίας... 76 Ηλίας Σ. Κυριάκου, Ωραιάνθη Τραυλού, Ελισάβετ I. Γρουζή 7. Ενδομήτρια και νεογνική μετάγγιση... 90 Χρυσούλα Αλέπη 8. Μεταγγισιοθεραπεία των μεταμοσχεύσεων... 99 Στυλιανός Σαριδάκης, Παναγιώτα Κουτσογιάννη 9. Τεχνητοί μεταφορείς οξυγόνου στη μεταγγισιοθεραπεία: Στόχοι και σκόπελοι...110 Αθηνά Μούγιου, Μαρίνα Καρακάντζα 10. Αναδυόμενες σμικρυσμένες τεχνικές στην ανίχνευση μεταδιδομένων με τη μετάγγιση παραγόντων. Μια εκτίμηση στην πορεία τους βασισμένη στην ανασκόπηση σχετικών τίτλων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας...120 Βασίλης Σπυρόπουλος Εικόνα εξωφύλλου: S-59 Mηχανισμός δράσης από Ανθή Γάφου, Νίκη Βγόντζα (βλέπε Αδρανοποίηση παθογόνων στα ασταθή παράγωγα αίματος Υπέρ και κατά, σελ. 58)

xii ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΑ ΤΕΥΧΗ Έτος 2011 Ιούλιος Θέμα Guest editors Σεπτέμβριος Θέμα Guest editors Νοέμβριος Θέμα Έτος 2012 Μάρτιος Θέμα Guest editor Ιούλιος Θέμα Guest editor Σεπτέμβριος Θέμα Guest editor Νοέμβριος Θέμα Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα Νόρα-Αθηνά Βύνιου, Αργύρης Συμεωνίδης Θαλασσαιμίες και Αιμοσφαιρινοπάθειες Νικόλαος Ανάγνου, Εμμανουήλ Καναβάκης Περιλήψεις 22ου Ετήσιου Πανελληνίου Αιματολογικού Συνεδρίου Μυελοϋπερπλαστικά σύνδρομα Παναγιώτης Παναγιωτίδης Αναιμία Μιχάλης Βουλγαρέλης Νόσος Hodgkin Θεόδωρος Βασιλακόπουλος Περιλήψεις 23ου Ετήσιου Πανελληνίου Αιματολογικού Συνεδρίου

Εισαγωγή Αγαπητοί Συνάδελφοι, Με χαρά σας παρουσιάζουμε το παρόν τεύχος του περιοδικού μας που είναι αφιερωμένο στην Ιατρική των Μεταγγίσεων. Θέλουμε εδώ να εκφράσουμε την ικανοποίησή μας γιατί η Διεύθυνση Σύνταξης του περιοδικού επέλεξε, τόσο κοντά στην έναρξη έκδοσής του με την καινούρια του μορφή, τη συγκεκριμένη ενότητα, η οποία αφορά όχι μόνο τους συναδέλφους που ασχολούνται με την Αιμοδοσία αλλά και όλους όσους κάνουν χρήση των υπηρεσιών αυτής. Στην επιλογή των θεμάτων λάβαμε μέριμνα να αναπτυχθούν θέματα ευρύτερου ενδιαφέροντος, τα οποία εξελίσσονται τα τελευταία έτη συνεχώς αλλά και αναγκαστήκαμε να παραλείψουμε θέματα εξίσου σημαντικά, τα οποία όμως θεωρήσαμε πιο κλασσικά. Η Μοριακή Βιολογία στην Αιμοδοσία έχει δημιουργήσει νέες προοπτικές αλλά αγωνίζεται να βρει το δρόμο της στην αιμοδοσιολογική καθημερινότητα. Οι βλάβες συντήρησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων έχουν αρχίσει να αναδεικνύονται, όμως σαφείς οδηγίες για το χειρισμό τους δεν υπάρχουν. Η βακτηριδιακή επιμόλυνση των παραγώγων αίματος αναγνωρίζεται πλέον ως σημαντικός κίνδυνος στην Ιατρική των μεταγγίσεων και έχει πυροδοτήσει έντονη έρευνα για την πρόληψη, την έγκαιρη διάγνωση και την αδρανοποίηση των παθογόνων στα παράγωγα του αίματος. Το σύνδρομο TRALI, σπάνιο και επικίνδυνο και η μετά τη μετάγγιση πορφύρα, σπανιότερο και ασαφούς παθογένεσης σύνδρομο, έχουν προκαλέσει το ερευνητικό και το κλινικό ενδιαφέρον των χρηστών των προϊόντων του αίματος. Η αδρανοποίηση των παθογόνων που μεταδίδονται με τη μετάγγιση έχει διανύσει αρκετό δρόμο, όμως δεν έχει καταφέρει να δώσει λυσιτελείς απαντήσεις προς την κατεύθυνση της ασφάλειας της μετάγγισης. Στη συνέχεια η ανάπτυξη τριών θεμάτων με εξειδικευμένο κλινικό αντικείμενο όπως η αντιμετώπιση της μείζονος αιμορραγίας, η ενδομητρική και νεογνική μετάγγιση και η μεταγγισιοθεραπεία των μεταμοσχεύσεων θα επικαιροποιήσει τις γνώσεις των συναδέλφων που δεν έχουν την ευκαιρία να τα αντιμετωπίζουν στην καθημερινότητά τους. Τα υποκατάστατα των ερυθρών αιμοσφαιρίων, ελπίδα και προσμονή όλων μας, δεν έχουν καταφέρει ακόμα να βρουν κάποια κλινική εφαρμογή. Τέλος οι σμικρυσμένες τεχνικές στην ανίχνευση μεταδιδομένων με τη μετάγγιση παραγόντων, μας υπόσχονται λύσεις και εργαλεία σε έναν πόλεμο που θα συνεχίζεται κλιμακούμενος, τόσο σε πλήθος παραγόντων για ανίχνευση, όσο και σε κόστος. Με την ελπίδα ότι όλη η Αιματολογική οικογένεια θα βρει ενδιαφέροντα τα θέματα που επιλέξαμε και τα οποία άξιοι επιστήμονες, που τους ευχαριστούμε θερμά γι αυτό, ανέπτυξαν σας παραδίδουμε αυτό το τεύχος. Ελπίζουμε ιδιαίτερα να βρουν ενδιαφέρον το σύνολο του τεύχους οι ειδικευόμενοι συνάδελφοι και να βοηθηθούν στην προσπάθειά τους για απόκτηση αιματολογικής γνώσης και για επιτυχία στις εξετάσεις. Haema 2011; 2(1): 13 Λουκάς Δαδιώτης 13

Aνασκόπηση Μοριακή τυποποίηση των ομάδων αίματος Μαρία Γκανίδου Περίληψη: Η κλασσική μέθοδος προσδιορισμού των αντιγόνων των ομάδων αίματος και των αντισωμάτων είναι η αιμοσυγκόλληση, που έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για δεκαετίες. Η ανάπτυξη των τεχνικών μοριακής βιολογίας και η δυνατότητα της κλωνοποίησης γονιδίων, απομόνωσης DNA και εκτέλεσης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης εμπλούτισαν τις γνώσεις μας σχετικά με τα αντιγόνα που εκφράζουν τις ομάδες αίματος και βοήθησαν στην καλύτερη ταξινόμηση τους κατά συστήματα. Η ευρύτερη χρήση της μοριακής τυποποίησης των ομάδων αίματος εξαρτάται από το κατά πόσο διασφαλίζει την πλήρη συμβατότητα μεταξύ δότη και δέκτη κατά τη μετάγγιση ερυθρών και πόσο συμβάλλει στη βελτίωση της ποιότητας των μεταγγίσεων, συγκρινόμενη με τις καθιερωμένες μεθόδους αιμοσυγκόλλησης. Μέθοδος επιλογής τυποποίησης των αντιγόνων ΑΒΟ παραμένει η αιμοσυγκόλληση, διότι λόγω της δομής των αντίστοιχων γονιδίων, του μεγάλου αριθμού SNPs που παρουσιάζουν και ότι το προϊόν του γονιδίου είναι ενδιάμεσο προϊόν και όχι το τελικό αντιγόνο, καθιστούν το αποτέλεσμα του μοριακού ελέγχου επισφαλές και πιθανόν επικίνδυνο όταν αφορά μετάγγιση ερυθρών. Η μελέτη των γονιδίων αυτών γίνεται σε ερευνητικά κέντρα με κύριο στόχο τη μελέτη των υποομάδων Α και Β. Η διερεύνηση του γονιδίου RH οδήγησε στην τυποποίηση των διαφόρων ποικιλιών των πρωτεϊνών RHD και RHCE, στη μελέτη της αντιγονικότητας των πολυμορφισμών και στην παρασκευή αντίστοιχων αντιορών για εργαστηριακή χρήση. Εφαρμόζεται σε πολλά εργαστήρια στα πλαίσια διερεύνησης της αλλοανοσοποίησης μετά μετάγγιση και κατά τη διερεύνηση της πιθανότητας ανάπτυξης αιμολυτικής νόσου εμβρύου κατά τις πρώτες εβδομάδες της κύησης. Η μελέτη των γονιδίων των υπολοίπων ομάδων αίματος, που κατά κανόνα φέρουν μικρό αριθμό SNPs, υπερτερεί έναντι της αιμοσυγκόλλησης κυρίως όταν το αντίστοιχο αντιγόνο εκφράζεται με μικρό αριθμό αντιγράφων ή είναι σπάνιο. Οι ασθενείς στους οποίους εφαρμόζονται οι τεχνικές αυτές είναι όσοι φέρουν πολλαπλά ή σπάνια αλλοαντισώματα και αυτοί που παρουσιάζουν πανσυγκολλήσεις λόγω αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας. Ο μαζικός έλεγχος ασθενών και δοτών αίματος, παρά την ανάπτυξη της αντίστοιχης τεχνολογίας, προς το παρόν κρίνεται οικονομικά ασύμφορος. Haema 2011; 2(1): 14-21 Copyright EAE Εισαγωγή Στην επιφάνεια των ανθρώπινων ερυθροκυττάρων έχουν περιγραφεί περισσότερα από 300 κληρονομούμενα αντιγόνα ομάδων αίματος. 1,2 Τα 270 εξ αυτών έχουν ταξινομηθεί σε 30 διαφορετικά συστήματα ομάδων αίματος και άλλα 38 αντιγόνα, που δεν πληρούν τις προϋποθέσεις ένταξης σε κάποιο σύστημα ομάδων αίματος, κατατάσσονται σε συλλογές και σειρές υψηλής ή χαμηλής συχνότητας. Κάθε σύστημα αποτελείται από 1 έως Διευθύντρια ΕΣΥ, Αιματολόγος, Νοσοκομειακή Υπηρεσία Αιμοδοσίας, ΓΝΘ Γ. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ Διεύθυνση αλληλογραφίας: Μαρία Γκανίδου, Κωφίδου 5Β, 55236 Πανόραμα Θεσσαλονίκης, e-mail: marant@otenet.gr 50 αντιγόνα. Τα περισσότερα από τα αντιγόνα αυτά τυποποιήθηκαν με τη χρήση ανθρώπινων ορών που περιείχαν τα αντίστοιχα αντισώματα, χρησιμοποιώντας τεχνικές έμμεσης ή άμεσης αιμοσυγκόλλησης. Η δυνατότητα παρασκευής μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των αντιγόνων των ομάδων αίματος άλλαξε δραστικά την ικανότητα ανίχνευσης αντιγόνων, κυρίως αυτών που εκφράζονται με μικρό αριθμό αντιγράφων. Έτσι δόθηκε, μεταξύ άλλων, η δυνατότητα ανίχνευσης των ασθενών D αντιγόνων με άμεση αιμοσυγκόλληση, και όχι με έμμεση αιμοσυγκόλληση και χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων, που είχε ως αποτέλεσμα την κατάργηση του όρου D u. Ορισμένα από τα αντιγόνα παρουσιάζουν πολυμορφισμούς σε κάποιες πληθυσμιακές ομάδες με συνέπεια την αλλοανοσο-

Μοριακή τυποποίηση των ομάδων αίματος 15 ποίηση μετά μετάγγιση και τη δημιουργία αιμολυτικών αντιδράσεων ή αιμολυτικής νόσου εμβρύου και νεογνού σε περιπτώσεις ασυμβατότητος μεταξύ μητέρας και εμβρύου. Η κλασσική μέθοδος προσδιορισμού των αντιγόνων των ομάδων αίματος και των αντισωμάτων είναι μέθοδος απλή, χαμηλού κόστους, ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις των περισσοτέρων ασθενών, αλλά περιέχει μεγάλο βαθμό υποκειμενικότητας και αρκετούς περιορισμούς (Πίνακας 1). Η δυνατότητα κλωνοποίησης των γονιδίων, απομόνωσης DNA και εκτέλεσης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αλλάζει εντελώς τον τρόπο καθορισμού των ομάδων αίματος- μπορούμε να προβλέψουμε την παρουσία ή απουσία ενός αντιγόνου των ομάδων αίματος και να παρακάμψουμε τους περιορισμούς που συνδέονται με τις τεχνικές αιμοσυγκόλλησης. 3-5 Η αξιοπιστία της μοριακής τυποποίησης των ομάδων αίματος έχει εδραιωθεί τις τελευταίες δύο δεκαετίες με μελέτες που συνδέουν τον γονότυπο με τον αντίστοιχο φαινότυπο των ερυθρών. Η αξιολόγηση και ταξινόμηση των ευρημάτων αποτελεί αντικείμενο ειδικής επιτροπής της ISBT, της Committee on Terminology for Red Blood Cell Surface Antigens, η οποία ανά διετία δημοσιοποιεί τα νέα δεδομένα (Πίνακας 2). Είναι γνωστή η δομή των γονιδίων που κωδικοποιούν τα 29 συστήματα, ενώ η μελέτη του γονιδίου που κωδικοποιεί το σύστημα P είναι σε εξέλιξη. 6 Τα μόρια που αποτελούν τις ομάδες αίματος εκφράζουν τους πολυμορφισμούς τους με αλλαγές σε πολυσακχαριτικά τμήματα ή τμήματα αμινοξέων. Τα πολυσακχαριτικά αντιγόνα στα οποία ανήκουν οι ομάδες ABO, P, Lewis, H, I, Globoside, αποτελούν έμμεσα προϊόντα γονιδίων. Δημιουργούνται πάνω σε πρόδρομες μορφές γλυκοπρωτεϊνών ή γλυκολιπιδίων, επί των οποίων προστίθεται το ανάλογο μόριο σακχάρου από την ειδική γλυκοζυλοτρασφεράση, η οποία και αποτελεί το άμεσο προϊόν του γονιδίου. Τα αντιγόνα των υπολοίπων 24 συστημάτων εκφράζονται Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά αιμοσυγκόλλησης και μοριακών τεχνικών προσδιορισμού του φαινότυπου ερυθρών αιμοσφαιρίων Αιμοσυγκόλληση Αξία Μέθοδος αναφοράς για τη διαπίστωση της παρουσίας ή απουσίας ερυθροκυτταρικών αντιγόνων, η οποία χρησιμοποιείται με ασφάλεια επί πολλά χρόνια Απλή, γρήγορη, απαιτεί απλό εξοπλισμό και, όταν εκτελείται σωστά, έχει ειδικότητα και ευαισθησία που είναι αποδεκτές στην πλειονότητα των περιπτώσεων Ανιχνεύει διπλούς πληθυσμούς ερυθροκυττάρων Αντιδραστήρια Παράγονται από ανοσοποιημένους ασθενείς/δότες (πολυκλωνικά και μονοκλωνικά) ή από ανοσοποιημένα ποντίκια (μονοκλωνικά) Η πρώτη ύλη είναι δυνητικά μολυσματική Πολλά αντισώματα δεν είναι εμπορικά διαθέσιμα και η ειδικότητά τους χαρακτηρίζεται (συνήθως εν μέρει) από τους χρήστες και κάποια είναι σε περιορισμένη ποσότητα, ασθενή, ή μη διαθέσιμα Περιορισμοί Είναι μια υποκειμενική εξέταση Απαιτεί χρήση αξιόπιστων αντιορών Χρονοβόρα εξέταση όταν πρόκειται να εξεταστεί μεγάλος αριθμός δοτών ή ασθενών για μεγάλο αριθμό αντιγόνων Υποδεικνύει έμμεσα, αν ένα έμβρυο είναι πιθανόν να παρουσιάσει αιμολυτική νόσο Δύσκολος ο προσδιορισμός φαινοτύπου σε πρόσφατα μεταγγισμένο ασθενή Δύσκολος ο προσδιορισμός φαινοτύπου σε ερυθρά που φέρου IgG Δύσκολος ο διαχωρισμός αλλοαντισώματος από αυτοαντίσωμα σε αντιγονο-θετικούς ασθενείς Μοριακή τεχνική Αξία Μπορεί να αυτοματοποιηθεί Μπορεί να είναι μεγάλης παραγωγικότητας, επειδή πολλοί δείκτες είναι δυνατόν να εξεταστούν στο ίδιο δείγμα Με τη χρήση κατάλληλου λογισμικού τα αποτελέσματα ερμηνεύονται και μεταφέρονται στη βάση δεδομένων του ασθενή ή δότη Αντιδραστήρια Δεν απαιτεί ειδικά αντιδραστήρια, επιπλέον τα αντιδραστήρια μπορούν άμεσα να αποκτηθούν Περιορισμοί Υποδεικνύει, προβλέπει τον τύπο του αντιγόνου: συνιστάται η επιβεβαίωση με αιμοσυγκόλληση Η εκτέλεση της τεχνικής απαιτεί αρκετές ώρες Το αποτέλεσμα δυνατόν να μη συμφωνεί με αυτό της αιμοσυγκόλλησης Το αποτέλεσμα από σωματικά κύτταρα είναι δυνατόν να είναι διαφορετικό από το αποτέλεσμα από δείγμα αίματος Πολλοί γονότυποι μπορεί να αντιστοιχούν στο ίδιο φαινότυπο Είναι πολύ πιθανό ότι δεν είναι γνωστά όλα τα αλληλόμορφα γονίδια σε κάθε πληθυσμιακή ομάδα Η μοριακή τεχνικής δεν έχει εγκριθεί για ευρεία χρήση, ως η μόνη μέθοδος στην οποία θα βασιστούν αποφάσεις σχετικά με τη θεραπεία ασθενών

16 Μ. Γκανίδου Πίνακας 2. Χρωμοσωμικές θέσεις και γονίδια που καθορίζουν τις ομάδες αίματος ISBT Ομάδα αίματος Όνομα γονιδίου Αριθμός αντιγόνων Χρωμόσωμα 001 ABO ABO 4 9q34.2 002 MNS GYPA, GYPB,GYPE 46 4q31.21 003 P1PK P1PK 2 22q11.2-qter 004 Rh RHD,RHCE 59 1p36.11 005 Lutheran, LU BCAM 22 19q13.32 006 Kell KEL 35 7q34 007 Lewis, LE FUT3 6 19p13.3 008 Duffy, Fy DARC 5 1q23.2 009 Kidd, JK SLC14A1 3 18q12.3 010 Diego, DI SLC4A1 22 17q21.31 011 Cartwright, YT ACHE 2 17q22.1 012 XG XG,CD99 2 Xp22.33 013 Scianna, SC ERMAP 7 1p34.2 014 Dombrock, DO ART4 7 12p12.3 015 Colton CO AQP1 4 7p14.3 016 Landsteiner-Wiener, LW ICAM-4 3 19p13.2 017 Chido-Rodgers CH/RG C4A,C4B 9 6p21.3 018 H FUT1 1 19q13.33 019 Kx XK 1 Xp21.1 020 Gerbich, GE GE 12 2q14.3 021 Cromer, Cr DAF,CD55 16 1q32.2 022 Knops, Kn CR1 9 1q32.2 023 Indian, IN CD44 4 11p13 024 OK BSG 3 19p13.3 025 Raph CD151 1 11p15.5 026 John Milton Hagen,JMH SEMA7A 6 15q24.1 027 I GCNT2 1 6p24.2 028 Globoside,GLOB B3GALT3,B3GALNT1 1 3q26.1 029 Gill, GI AQP3 1 9p13.3 030 RHAG RHAG 3 6p21 πάνω σε πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες και οι πολυμορφισμοί τους εξαρτώνται από την αλληλουχία των αμινοξέων, που καθορίζονται άμεσα από τα γονίδια. Βασικά υπάρχουν δηλαδή δύο είδη γονιδίων των ομάδων αίματος: αυτά που κωδικοποιούν άμεσα την αλληλουχία των αμινοξέων των πολυπεπτιδικών δομών, και αυτά που κωδικοποιούν τις γλυκοζυλοτρανσφεράσες οι οποίες προκαλούν τη βιοσύνθεση των αντιγόνων. Πρέπει να τονιστεί ότι και στις δύο περιπτώσεις οι μοριακές μέθοδοι δεν ανιχνεύουν άμεσα την παρουσία αντιγόνων στην επιφάνεια του ερυθρού αιμοσφαιρίου, ένα μειονέκτημα που πολλές φορές μετατρέπεται σε πλεονέκτημα, σε συνδυασμό με τις παραδοσιακές τεχνικές (Πίνακας 1). Μοριακοί μηχανισμοί που τροποποιούν την έκφραση των ερυθροκυτταρικών αντιγόνων Η πρόβλεψη των ερυθροκυτταρικών αντιγόνων με DNA-τεχνικές είναι εύκολη και εφικτή όταν το αντιγόνο κωδικοποιείται από συνηθισμένο ή φυσιολογικό αλληλόμορφο. Η συσχέτιση αυτή είναι περισσότερο πολύπλοκη, όταν πρόκειται για μη συνηθισμένο, σπάνιο ή πρωτοδιαπιστωμένο αλληλόμορφο. Έχουν καταγραφεί πολύ περισσότερα αλληλόμορφα απ οτι φαινότυποι. Σε περίπου 300 αντιγόνα αντιστοιχούν 34 γονιδιακοί τόποι, αλλά περισσότερα από 1000 αλληλόμορφα. Οι συχνό-

Μοριακή τυποποίηση των ομάδων αίματος 17 τεροι μηχανισμοί που οδηγούν στον πολυμορφισμό των ερυθροκυτταρικών αντιγόνων είναι οι εξείς 7 : 1)Μονήρεις νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs). Οι περισσότεροι πολυμορφισμοί των ομάδων αίματος προκύπτουν από ένα ή περισσότερους SNPs που κωδικοποιούν αντικαταστάσεις αμινοξέων των γλυκοζυλοτρανσφερασών ή των πρωτεϊνών, πχ G838A οδηγεί σε Asp280Asn και πολυμορφισμό Jk a /Jk b. Επίσης κάποιοι SNPs δεν προκαλούν αλλαγή αμινοξέων, αλλά τροποποιούν την αντιγονική έκφραση μέσω εναλλακτικής συρραφής του RNA. 2) Απαλοιφή γονιδίου. Η έλλειψη του γονιδίου RHD είναι η συχνότερη αιτία του D-αρνητικού φαινοτύπου. 3)Διαγονιδιακοί ανασυνδυασμοί. Η ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ γειτονικών ομολόγων γονιδίων οδηγεί στην παραγωγή υβριδικών πρωτεϊνών, όπως συμβαίνει με τις ομάδες Rh και MNS, και δημιουργεί ιδιαίτερες ποικιλίες. 4)Αδρανοποιητικές μεταλλάξεις. Κάποιες μεταλλάξεις οδηγούν σε παραγωγή μικρής ποσότητας ή σε μη παραγωγή πρωτεΐνης. Τέτοιες μεταλλάξεις είναι αυτές που αλλάζουν το πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου και συνήθως καταλήγουν σε κωδικόνιο διακοπής, αυτές που αφορούν ιντρόνια και επιδρούν στη συρραφή του RNA με αποτέλεσμα την απώλεια ενός ή περισσοτέρων εξονίων, αυτές που κωδικοποιούν αλλαγές αμινοξέων που δεν είναι συμβατές με ενζυμική δραστικότητα ή προκαλούν τεράστιες αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης επι της κυτταρικής μεμβράνης. 5) Μεταγραφικοί παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων, με ειδικότητα ιστών. Μεταλλάξεις των γονιδίων των μεταγραφικών παραγόντων των ερυθρών EKLF και GATA1 προκαλούν διαταραχές έκφρασης των ομάδων Lutheran, Indian, Knops και P1PK. 8 Μοριακή τυποποίηση των αντιγόνων των ομάδων αίματος Μοριακή τυποποίηση των ΑΒΟ αντιγόνων Το σύστημα ΑΒΟ είναι το περισσότερο κλινικά σημαντικό διότι αντισώματα έναντι των Α των Β ή και των δύο αντιγόνων, υπάρχουν φυσικά στον ορό των ατόμων τα οποία εκφράζουν στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων Β, Α ή Ο αντιγόνα. Η αλληλουχία των αμινοξέων του ΑΒΟ γονιδίου, η δομή του και κάποιες συχνές ποικιλίες καθορίστηκαν στις αρχές τις δεκαετίας 1990. 9,10,11 Ο ΑΒΟ φαινότυπος καθορίζεται από την έκφραση ενός γονιδίου στο χρωμόσωμα 9, το οποίο κωδικοποιεί την παραγωγή γλυκοζυλτρανσφεράσης. Τα αντιγόνα Α,Β και οι ποικιλίες τους προκύπτουν από την μεταφορά Ν-ακετυλο- D-γαλακτοζαμίνης ή D-γαλακτόζης ή και των δύο, σε ολιγοσακχαριδικές δομές που βρίσκονται σε γλυκοπρωτεΐνες ή γλυκολιπίδια της επιφανείας των ερυθρών. Ο φαινότυπος Ο προκύπτει όταν το γονίδιο γλυκοζυλτρανσφεράσης είναι ανενεργό. Τα αλληλόμορφα που κωδικοποιούν τις πρωταρχικές (wild-type) γλυκοζυλτρανσφεράσες Α και Β διαφέρουν κατά 8 νουκλεοτίδια, με καθοριστικούς τους πολυμορφισμούς 266 και κυρίως 268. Το γονίδιο της γλυκοζυλτρανσφεράσης Α θεωρείται ότι αποτελείται από την αρχική νουκλεοτιδική αλληλουχία και με αυτό συγκρίνονται όλοι οι πολυμορφισμοί. Οι μέχρι τώρα μελέτες έχουν αποκαλύψει περισσότερα από 250 αλληλόμορφα που κωδικοποιούν τα φυσιολογικά Α,Β και Ο αντιγόνα, τις ποικιλίες Α, Β και cis-ab. Επιπλέον διαπιστώνεται ότι η παραγόμενη τρανσφεράση δεν είναι πάντα η υποδεικνυόμενη, βάσει της δομής του γονιδίου, αλλά παρουσιάζει ελαττωμένη ενζυμική δράση ή είναι ανενεργής. 12 Το γεγονός ότι η ομάδα Ο προκύπτει από αδρανοποίηση του γονιδίου δημιουργεί βασικό πρόβλημα σχεδιασμού DNA-τεχνικών για το ΑΒΟ σύστημα, διότι μεταλλάξεις μπορεί να υπάρχουν σε πολλά σημεία της κωδικοποιούσας περιοχής του γονιδίου. Το πλέον συνηθισμένο Ο αλληλόμορφο (Ο01) διαφέρει από το Α101 λόγω της απαλοιφής G στη θέση 261 που προκαλεί αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης και οδηγεί στην παραγωγή ανενεργού ενζύμου. Το αλληλόμορφο Ο02 διαφέρει από το Α101 λόγω 6 SNP, με σημαντικότερο τον πολυμορφισμό G802A που οδηγεί σε αντικατάσταση Gly268Arg και παραγωγή ανενεργού ενζύμου. Το αλληλόμορφο Ο03 έχει επιπλέον G στη θέση 804, που προκαλεί αλλαγή στη 269 θέση της δραστικής περιοχής του ενζύμου. Το αλληλόμορφο Ο04 έχει επιπλέον G στη θέση 88, που προκαλεί την παραγωγή ανενεργού πρωτεΐνης 56 αμινοξέων. Τα αλληλόμορφα Ο05 και Ο06 παρουσιάζουν τις αντικαταστάσεις C322T και G542A, αντίστοιχα, τα οποία προκαλούν παραγωγή ανενεργών πρωτεϊνών 107 και 181 αμινοξέων. Το γεγονός λοιπόν ότι τα Ο αλληλόμορφα προκύπτουν από αλλαγές σε υπόβαθρο Α αλληλομόρφου, επιβάλει να περιληφθεί το σύνολο των Ο αλληλομόρφων σε κάθε DNA-τεχνική τυποποίησης, ώστε να μην υπάρχει ο κίνδυνος ένας φαινότυπος Ο να καθοριστεί ως φαινότυπος Α. Η λάθος τυποποίηση ενός ασθενή Ο ως Α και ακόλουθη μετάγγιση με Α ερυθρά, θα ήταν καταστροφική λόγω των φυσικών αντισωμάτων αντι-α και της επακόλουθης αιμόλυσης των μεταγγιζόμενων ερυθρών. 13,14 Η DNA-τυποποίηση των ΑΒΟ αντιγόνων, μέχρι σήμερα τουλάχιστον, εκτελείται σε μεμονωμένα κέντρα, με ερευνητικό κυρίως ενδιαφέρον και παράλληλη μελέτη της δραστικότητας των παραγομένων ενζύμων. Εξετάζονται κυρίως δείγματα που παρουσιάζουν συγκολλήσεις μικτού πεδίου, ασυμφωνία αντιγόνων και αντισωμάτων ή ασθενείς συγκολλήσεις με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η μελέτη της μοριακής βάσης των ΑΒΟ αλληλομόρφων σε διαφορετικές πληθυσμιακές ομάδες, θα μπορούσε να βοηθήσει σε μελλοντική ασφαλή εφαρμογή των μεθόδων μοριακής βιολογίας, λαμβάνοντας πάντα υπόψη την πιθανότητα νέων μεταλλάξεων.

18 Μ. Γκανίδου Μοριακή τυποποίηση των Rh αντιγόνων Τα αντιγόνα του συστήματος Rh εκφράζονται σε δύο πολυπεπτίδια της επιφανείας των ερυθροκυττάρων (RHD και RHCE) που κωδικοποιούνται από δύο γειτονικά και ιδιαιτέρως ομόλογα γονίδια του χρωμοσώματος 1. 15,16 Το αντιγόνο D θεωρείται το περισσότερο πολύπλοκο από τα ερυθροκυτταρικά αντιγόνα. Ο αρνητικός φαινότυπος σε Ευρωπαϊκής προέλευσης πληθυσμούς, οφείλεται σε έλλειψη του αντίστοιχου γονιδίου που οδηγεί σε πλήρη έλλειψη του πολυπεπτιδίου D στην επιφάνεια των ερυθρών. Η απαλοιφή αυτή του γονιδίου RHD προκαλεί ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ των δύο Rhesus boxes που το πλαισιώνουν, και προκείπτει ένα υβριδικό Rhesus box. 17 Η ανίχνευση του υβριδικού Rhesus box, με τεχνική RFLP και κυρίως με ποσοτική PCR, δίνει τη δυνατότητα προσδιορισμού ετεροζυγωτίας ως προς το αντιγόνο D. 18 Ο αρνητικός φαινότυπος σε άτομα Αφρικανικής προέλευσης μπορεί να προκύπτει από πλήρη απαλοιφή του γονιδίου, αλλά συχνότερα είναι αποτέλεσμα τροποποιημένου γονιδίου. Το συχνότερο απ αυτά είναι το ψευδογονίδιο RHD (RHDψ) που οδηγεί σε κωδικόνιο διακοπής και απουσία της RhD πρωτείνης. Ένα δεύτερο είναι το υβριδικό γονίδιο RH(D-CE-D), το οποίο δεν εκφράζει RhD πρωτείνη, αλλά τροποποιημένα αντιγόνα C, e μαζί με c και VS αντιγόνα. 19,20 Κάθε άτομο που φέρει γονίδιο D με κάποια μοριακή βλάβη η οποία επηρεάζει την αλληλουχία αμινοξέων του πολυπεπτιδίου, δυνατόν να παρουσιάζει μη τυπικό D αντιγόνο, ειδικά όταν η εξέταση των ερυθροκυττάρων γίνεται με τη χρήση μονοκλωνικών αντιορών, οι οποίοι στρεφόμενοι εκλεκτικά έναντι ειδικών επιτόπων, δεν αντιδρούν με τα ερυθρά που φέρουν διαφοροποιημένες πεπτιδικές περιοχές. Οι έρευνες των τελευταίων 20 περίπου ετών με μελέτη των ατόμων που εμφανίζουν ασθενή ή παραλλαγμένη έκφραση των αντιγόνων του D, C, E, c, και e μας έχουν δώσει εκτεταμένους καταλόγους των γενετικών ποικιλιών των γονιδίων σε διάφορες φυλετικές ομάδες. Η DNA-τυποποίηση των Rh αντιγόνων είναι η ιδανική μέθοδος επίλυσης προβλημάτων που σχετίζονται με την έκφραση των αντιγόνων αυτών. Η σημασία καθορισμού αν ένας ασθενής ή δότης έχει μία ιδιαίτερη ποικιλία έκφρασης D εξαρτάται από την πιθανότητα παραγωγής κλινικά σημαντικού αντι-d αντισώματος. Οι ποικιλίες έκφρασης D συχνά διακρίνονται σε παραλλαγές D (D variants) και ασθενή D (D weak), αν και περισσότερο χρήσιμος θα ήταν ο διαχωρισμός σε αυτές που προκαλούν ή όχι την παραγωγή αντισωμάτων. 21,22,23 Λίγες κατηγορίες D παρουσιάζουν συχνότητα μεγαλύτερη από 1-2/1000 στο παγκόσμιο γενικό πληθυσμό. Στον ευρωπαϊκό πληθυσμό η παραλλαγή DVI είναι αυτή που παρουσιάζει κλινική σημασία, η οποία μπορεί εύκολα να ανιχνευτεί και με ορολογική μέθοδο. Αντιγόνα παραλλαγών D είναι περισσότερο συχνά σε άτομα αφρικανικής καταγωγής, και είναι κυρίως τριών τύπων: DIVa, DAU, ασθενή D τύπου 4, DIIIa, και DAR. Να σημειωθεί ότι ο τύπος DAR, παρότι χαρακτηρίζεται από μοριακές βλάβες που δεν υποδεικνύουν δομική αλλαγή του επιφανειακού τμήματος της πρωτεΐνης, παρουσιάζει όμως αλλοανοσοποίηση μετά επαφή με ερυθρά που φέρουν το αρχέγονοπλήρες αντιγόνο. 9-11 Στους καυκάσιους, οι ποικιλίες του e αντιγόνου συνδέονται με αντικατάσταση Trp16Cys που κωδικοποιείται από 48G>C του γονιδίου RHCE. Ελαττωμένη έκφραση του αντιγόνου e στους αφρικανούς, που συνήθως συνδέεται με απώλεια του hr s αντιγόνου, είναι αποτέλεσμα διαφορετικών μοριακών αλλαγών που έχουν ως κοινή την αντικατάσταση Met238Val. Η ορολογική τυποποίηση αντιγόνων που σχετίζονται με ελαττωμένη έκφραση του e αντιγόνου, παρουσιάζει ιδιαίτερα προβλήματα κυρίως λόγω της έλλειψης αντίστοιχων ορών. Η χρήση των μοριακών τεχνικών σε τέτοιους ασθενείς συμβάλει στο να εντοπισθούν οι ασθενείς που πιθανόν να παράγουν αντίσωμα τύπου αντι-e, αλλά και ανευρεθούν οι ανάλογοι αιμοδότες. 24 Το σοβαρότερο πρόβλημα που συνδέεται με το αντιγόνο Rh είναι η αιμολυτική νόσος εμβρύου και νεογνού που προκαλείται από αντι-d αντίσωμα. Εδραιωμένη προφυλακτική θεραπεία αποτελεί η χορήγηση πολυκλωνικής αντι-d ανοσοσφαιρίνης, προϊόν εξαιρετικά ασφαλές, αλλά ως προϊόν ανθρώπινης προέλευσης δυνατόν να συνοδευτεί από επιπλοκές, επιπλέον λόγω αυξανόμενης χρήσης διαφαίνεται μελλοντική έλλειψη του προϊόντος. Η πολυτιμότερη εφαρμογή των γνώσεων σχετικά με το γονίδιο που κωδικοποιεί το πολυπεπτίδιο Rh αποτελεί η εισαγωγή διαγνωστικών εξετάσεων ώστε να καθοριστεί αν D-αρνητική γυναίκα κυοφορεί έμβρυο με αρνητικό ή θετικό φαινότυπο D. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε εμβρυικό DNA που λήφθηκε μετά αμνιοπαρακέντηση από μητέρες ήδη ανοσοποιημένες, αλλά λόγω των κινδύνων της αμνιοπαρακέντησης δεν εφαρμόστηκε σε μεγάλη κλίμακα. Η γνώση ότι αρκετή ποσότητα εμβρυικού DNA μπορεί να απομονωθεί από δείγμα αίματος της μητέρας, οδήγησε την ευρύτερη εφαρμογή του προσδιορισμού της ομάδος RhD του εμβρύου κατά τη διάρκεια της κυήσεως, σε ανοσοποιημένες εγκυμονούσες, και σήμερα είναι εξέταση ρουτίνας σε αρκετές χώρες. Λογική επέκταση της εξέτασης αποτελεί η εφαρμογή της σε όλες τις D-αρνητικές εγκυμονούσες, ώστε αντι-d ανοσοσφαιρίνη να χορηγείται μόνο όταν το έμβρυο είναι D-θετικό. 25-27 Προβλήματα που σχετίζονται με τη τεχνική είναι η απομόνωση του εμβρυικού DNA, ο αριθμός και το είδος των SNPs που θα πρέπει να εξετάζονται ώστε η σχέση κόστους/οφέλους να είναι αποδεκτή. Η αιμολυτική νόσος εμβρύου και νεογνού από άλλα αντισώματα είναι λιγότερο συχνή, αλλά η βαρύτητα των περιστατικών οδήγησε στην ανάπτυξη αντίστοιχων DNA τεχνικών σχετικά με τα αντιγόνα c και Κ.

Μοριακή τυποποίηση των ομάδων αίματος 19 Μοριακή τυποποίηση των υπολοίπων ερυθροκυτταρικών αντιγόνων Τα προβλήματα που παρουσιάζονται κατά τη DNA τυποποίηση των πολύπλοκων γονιδίων ΑΒΟ και Rh αντιγόνων δεν εντοπίζονται κατά τη εφαρμογή της μεθόδου στον προσδιορισμό των πολυμορφικών αντιγόνων των άλλων ομάδων αίματος, διότι συνήθως οι πολυμορφισμοί αυτοί είναι αποτέλεσμα ενός SNP. Έχουν κλωνοποιηθεί σχεδόν όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν τα πολυμορφικά αντιγόνα και έχουν καταγραφεί οι SNPs που είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή πολυμορφικών αντιγόνων που σχετίζονται με κλινικά σημαντικά αντισώματα. Η ανίχνευση μονήρων SNP εφαρμόζεται στην ανίχνευση S/s, K/k, Kp a /Kp b, Js a /Js b, Do a /Do b, Hy+/Hy-, Jo(a+)/Jo(a-), Yt a /Yt b, Co a /Co b, Di a /Di b, Sc1/Sc2, LW a /LW b. Η ανίχνευση πολλαπλών SNP είναι πολλές φορές απαραίτητη στη μελέτη των Fy a /Fy b, GATA, Fy x, M/N. Αντίθετα, είναι δύσκολο ή αδύνατο να διερευνηθούν όλοι οι φαινότυποι που υποδεικνύονται από ιδιαίτερα μεγάλο αριθμό SNPs (π.χ. McLeod, διότι σχεδόν το κάθε Kx-αρνητικό αντιγόνο έχει διαφορετική μοριακή βάση) ή φαινότυποι που είναι αποτέλεσμα υβριδικών γονιδίων (σύστημα MNS). Εφαρμογή των μοριακών τεχνικών στην ποιοτική διασφάλιση των αντιδραστηρίων Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην ανίχνευση και τυποποίηση ερυθροκυτταρικών αντισωμάτων είναι επιλεγμένα ώστε να ανιχνεύουν όλους τους συχνούς πολυμορφισμούς των αντιγόνων και τα αντιγόνα υψηλής και χαμηλής συχνότητας, όταν είναι διαθέσιμοι οι αντίστοιχοι αντιοροί. Τα αντιδραστήρια τυποποίησης των συχνών πολυμορφισμών πρέπει να έχουν εγκριθεί (FDA-licensed ή CE-marked) και τα κριτήρια σχετικά με την αντιγονική έκφραση των ερυθρών που χρησιμοποιούνται κατά την ανίχνευση αντισωμάτων καθορίζονται από την υπεύθυνη αρχή κάθε χώρας, συνήθως χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ διαφόρων χωρών. Σε πολλές Ευρωπαϊκές χώρες απαιτείται τα αντιγόνα D, C, c, E, e, Fy a, Jk a και S να αντιπροσωπεύονται σε διπλή δόση επί των ερυθροκυτταρικών αντιδραστηρίων τυποποίησης και ανίχνευσης αντισωμάτων. Επίσης πρέπει τα ερυθρά να φέρουν τα αντιγόνα K, k, Fy b, Jk b, και s, όχι απαραίτητα σε διπλή δόση. Λόγω των περιορισμών που συνοδεύουν τη χρήση των ειδικών αντιορών, η εφαρμογή μοριακών τεχνικών στην τυποποίηση και παραγωγή των αντιδραστηρίων παρέχει τη δυνατότητα βελτίωσης της ποιότητας αυτών. 28,29 Περιορισμοί της μοριακής τυποποίηση των αντιγόνων ομάδων αίματος Η εξέταση των αντιγόνων των ομάδων αίματος με DNA-μεθόδους έχει τεχνικούς, ιατρικούς και γενετικούς περιορισμούς. Όπως σε κάθε εργαστηριακή μέθοδο μπορούν να υπάρξουν πολλά τεχνικά λάθη. Οι ιατρικοί περιορισμοί σχετίζονται με πρόσφατες μεταγγίσεις, με μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και με φυσικό Πίνακας 3. Εφαρμογές των μοριακών τεχνικών στο καθορισμό φαινοτύπου ερυθροκυττάρων Ασθενών Εξακρίβωση αν ένα έμβρυο είναι πιθανό να αναπτύξει αιμολυτική νόσο Όταν ένας αντιορός είναι ασθενής ή μη διαθέσιμος (πχ αντι-doa, -Dob, -Jsa, -V/VS) Σε ασθενή που μεταγγίστηκε πρόσφατα και παρουσιάζει πολλαπλά αντισώματα, ώστε να επιλεγούν τα κατάλληλα ερυθρά για προσρόφηση Να διαχωριστεί ένα αυτοαντισώμα από ένα αλλοαντίσωμα ( πχ αντι-e, αντι-kpa) Να τυποποιηθεί το αλλοαντίσωμα όταν ένας ασθενής παράγει αντισώματα έναντι δικού του αντιγόνου, όταν πρόκειται για ποικιλίες του αντιγόνου (π.χ. αντι-d σε D-θετικούς, αντι- e σε e-θετικούς) Όταν τα ερυθροκύτταρα καλύπτονται με ανοσοσφαιρίνη (άμεση Coombs θετική) Σε αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων Να εξακριβωθεί η ύπαρξη ασθενώς εκφρασμένων αντιγόνων, όπου κατά κανόνα δεν προκαλείται ανοσοποίηση, άρα ο ασθενής μπορεί να μεταγγιστεί με ερυθρά που φέρουν το αντιγόνο Να βρεθεί η μοριακή βάση των ασυνήθιστων ορολογικών αποτελεσμάτων, κυρίως σχετικά με τις ποικιλίες Rh Δοτών Μαζικό έλεγχο ώστε να δημιουργηθούν αντιγονο-αρνητικά αποθέματα αίματος Ανεύρεση δοτών που στερούνται αντιγόνων μεγάλης συχνότητας Επίλυση προβλημάτων ασυμφωνίας σχετικά με τα αντιγόνα A, B, D, C και e Ανεύρεση και καθορισμός των γονιδίων που προκαλούν την παραγωγή ασθενών αντιγόνων Τυποποίηση δοτών από τους οποίους παράγονται αντιδραστήρια ελέγχου και τυποποίησης αντισωμάτων

20 Μ. Γκανίδου χιμαιρισμό. Συνεπώς, όταν εφαρμόζονται οι ανάλογες μοριακές τεχνικές, είναι απαραίτητη η γνώση του ιατρικού ιστορικού. Πολλά γενετικά συμβάματα δυνατόν να προκαλέσουν ασυμφωνία αποτελεσμάτων μεταξύ αιμοσυγκόλλησης και DNA μεθόδων- ο γονότυπος δεν είναι φαινότυπος. Συνιστάται η επιβεβαίωση με αιμοσυγκόλληση, όταν υποδεικνύεται αρνητικό αντιγόνο από την εξέταση DNA, εφόσον είναι διαθέσιμος ο αντίστοιχος αντιορός. Από πρακτική άποψη, δεν μπορούν να αναλυθούν όλοι οι πολυμορφισμοί όλων των αντιγόνων: π.χ. όταν πρόκειται για μεγάλο αριθμό αλληλομόρφων που κωδικοποιούν τον ίδιο φαινότυπο (ΑΒΟ, Rh και οι μηδενικοί φαινότυποι πολλών ομάδων αίματος), όταν πρόκειται για υβριδικά γονίδια (Rh και MNS) ή όταν δεν είναι ακόμη γνωστή η μοριακή βάση του αντιγόνου (Vel, Lan, Jr a ) Μεγάλος αριθμός αλληλομόρφων συνδέεται με σιωπηρά γονίδια, και πρέπει πάντα να λαμβάνεται υπόψη όταν μελετώνται οι σχετικοί φαινότυποι, πχ GATA box και FY*265 (Fy x ) όταν μελετάται φαινότυπος FYA/FYB, η παρουσία ψευδογονιδίου RHD όταν μελετάται φαινότυπος RHD. Ενώ η νουκλεοτιδική αλλαγή στη θέση 33 του GATA-1 είναι η βάση του Fy(a-b-) φαινοτύπου στους αφρικανούς, στους καυκάσιους ο ίδιος φαινότυπος είναι ιδιαίτερα σπάνιος και συνδέεται με σιωπηρά FYA* και FYB* που είναι αποτέλεσμα τουλάχιστον 4 διαφορετικών μοριακών αλλαγών. 30,31 Αν και έχει αναλυθεί η μοριακή βάση των περισσότερων αντιγόνων, σε πολλές περιπτώσεις αυτό περιορίζεται σε σχετικά μικρό αριθμό ατόμων με γνωστή την αντιγονική έκφραση. Παρότι οι πληροφορίες αυτές χρησιμοποιούνται για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της DNΑ-τυποποίησης, στην πραγματικότητα απαιτείται πολύ μεγαλύτερος αριθμός εξετασθέντων από διαφορετικές φυλετικές ομάδες ώστε να τεκμηριωθεί με ασφάλεια η συσχέτιση μεταξύ φαινοτύπου και γονοτύπου. Μέχρι να υπάρξουν σχετικά δεδομένα, πρέπει να αποφεύγονται κλινικές αποφάσεις που να βασίζονται μόνο σε δεδομένα της DNA τυποποίησης. 32 Η μοριακή προσέγγιση και επίλυση προβλημάτων που σχετίζονται με κλινικές καταστάσεις, απαιτεί ένα ευρύτατο πεδίο γνώσεων και δεξιοτήτων: γνώση και ικανότητα επίλυσης των προβλημάτων των μοριακών τεχνικών, της μοριακής βάσης των αντιγόνων, της έκφρασης των αντιγόνων και των διαφόρων ποικιλιών αυτών, ικανότητα στην ερμηνεία των PCR-αποτελεσμάτων, άριστη γνώση των τεχνικών αιμοσυγκόλλησης και κυρίως γνώση της κλινικής σημασίας των ερυθροκυτταρικών αντισωμάτων. Blood group genotyping by Maria Gkanidou Hospital Transfusion Service, General Hospital G. Papanikolaou, Thessaloniki, Greece ABSTRACT: Hemagglutination is a standard method to determine the blood group antigens that has been widely used with success during the last decades. The development of molecular biology techniques and the ability of gene cloning, DNA extraction and the application of polymerase chain reaction have enriched our knowledge in regards of the blood group antigens and facilitated their classification. The wide use of the molecular determination of the blood groups depends on one hand, upon its ability to guarantee the full compatibility between the donor and the recipient during blood transfusion and on the other hand, upon its contribution in the improvement of the quality of transfusions, compared with the established hemagglutination methods. Hemagglutination is still considered as the standard method for the determination of ABO antigens. The molecular determination of the ABO antigens is not considered either reliable or safe because of the particular structure of the corresponding genes, of the high number of the SNPs and finally because of the fact that the relevant gene product represents an intermediate product and not the ultimate antigen. The latter method is applied only for research and it is mainly focused on the study of the A and B subgroups.the investigation of the RH genes lead to the determination of the various types of the RHD and RHCE proteins, to the study of the antigenity of the polymorphisms and finally, to the production of the relevant antibodies for laboratory use. This method is applied in several laboratories for the study of post-transfusion alloimmunization and for the investigation of the risk to develop hemolytic disease of the fetus during the initial weeks of pregnancy. The study of the genes of the rest of the blood groups that bare a small number of SNPs with this method is superior over hemagglutination, especially when the corresponding antigen is expressed with a small number of copies or it is relatively rare. Those techniques are applied in patients that carry multiple or rare alloantibodies and in those who develop pan-agglutination due to autoimmune hemolytic anemia. The high-throughput genotyping of donors and patients for a large panel of blood group antigens is currently considered as non cost-effective.

Μοριακή τυποποίηση των ομάδων αίματος 21 Βιβλιογραφία 1. Daniels G, van der Schoot CE, Olsson ML. Report of the Second International Workshop on Molecular Blood Group Genotyping. Vox Sang. 2007; 93:83 88. 2. Daniels G, Castilho L, Flegel WA, et al. International Society of Blood Transfusion Committee on Terminology for Red Cell Surface Antigens: Macao Report. Vox Sang. 2009; 96: 153 156. 3. ReidME, McManusK, Zelinski T. Chromosome location of genes encoding human blood groups. Transf Med Rev. 1998; 12:151-161. 4. Lögdberg L, Reid ME, Miller JL. Cloning and genetic characterization of blood group carrier molecules and antigens. Transf Med Rev. 2002; 16:1-10. 5. Lögdberg L, Reid ME, Zelinski T. Human Blood Group Genes 2010: Chromosomal Locations and Cloning Strategies Revisited Transf Med Rev. 2011; 25:36-46. 6. Thuresson Β. Westman JS, Olsson ML Identification of a novel A4GALT exon reveals the genetic basis of the P1/ P2 histo-blood groups. Blood. 2011; 117:678-687. 7. Daniels G. The molecular definition of red cell antigens Vox Sang. 2010; 5:300-302. 8. Singleton BK, Burton NM, Green C, Brady RL, Anstee DJ. Mutations in EKLF/KLF1 form the molecular basis of the rare blood group In (Lu) phenotype. Blood. 2008; 112:2081-2088. 9. Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, et al. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP- GalNAc:Fuc-a1-2Gala1-3GalNActransferase (histobloodgroupatransferase) mrna. J Biol Chem. 1990; 265:1146-1151, 10. Yamamoto F, McNeil lpd, Hakomori S. Genomic organization of human histo-blood group ABO genes. Glycobiology. 1995; 5:51-58. 11. Yamamoto F, Clausen H, WhiteT, et al. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature. 1990; 345:229-233. 12. What Difference 2 Nucleotides Make: A Short Review of ABO Genetics. Transf Med Rev. 2005; 19:200-209. 13. Hosseini-Maaf B, Hellberg A, Chester MA, Olsson ML. An extensive polymarase chain reaction allele-specific polymorphism strategy of clinical ABO blod group genotyping that avoids potential errors caused by null, subgroup, and hybrid alleles. Transfusion. 2007; 47:2110-2125. 14. Yazer MH, Hosseini-Maaf B, Olsson ML. Blood grouping discrepancies between ABO genotype and phenotype caused by O alleles. Curr Opin Hematol. 2008; 15:618-624. 15. Flegel WA. Molecular genetics of RH and its clinical application. Transfus Clin Biol. 2006; 13:4-12. 16. Westhoff CM. The structure and function of the Rh antigen complex. Semin Hematol. 2007; 44:42 50. 17. Wagner FF, Flegel WA. RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood. 2000; 95:3662-8. 18. Grootkerk-Tax MG, Maaskant-van Wijk PA, van Drunen J et al. The highly variable RH locus in non white persons hampers RHD zygosity determination but yields more insight into RH-related evolutionary events. Transfusion. 2005; 45:327-37. 19. Singleton BK, Green CA, Avent ND, et al.the presence of an RHD pseudogene containing a 37 base pair duplication and a nonsense mutation in Africans with the RhD-negative blood group phenotype. Blood. 2000; 95:12-8. 20. Daniels GL, Faas BH, Green CA, et al. The VS and V blood group polymorphisms in Africans: a serologic and molecular analysis. Transfusion. 1998; 38:951-8. 21. Flegel WA. How I manage donors and patients with a weak D phenotype. Curr Opin Hematol. 2006; 13:476-483. 22. Westhoff CM. Molecular genotyping of RH: what (not) to do? Transfusion 2007; 47:1337-1339. 23. Daniels GL, Poole G, Poole J. Partial D and weak D: can they be distinguished? Transfus Med. 2007; 17:145-146. 24. Pham BN, Peyrard T, Juszczak G et al. Heterogeneous molecular background of the weak C, VS+, hrb-, HrBphenotype in black persons. Transfusion. 2009; 49:495-504. 25. Rouillac-Le Sciellour C, Pouillandre P, Gillot R, et al. Large-Scale Pre-Diagnosis Study of Fetal RHD Genotyping by PCR on Plasma DNA from RhD-Negative Pregnant Women. Mol Diagn. 2004; 8:23-31. 26. Daniels GL, Finning K, Martin P et al. Fetal blood group typing Present and future. Ann NY Acad Sci. 2006; 1075:88-95 27. Rouillac-Le Siellour C, Sérazin V, Brossard Y, et al. Noninvasive fetal RHD genotyping from maternal plasma. Transfus Clin Biol. 2007; 14:572-577. 28. Storry JR, Olsson ML, Reid ME. Application of DNA analysis to thee quality assurance of reagent red blood cells. Transfusion 2007; 47:73S-78S. 29. Kappler-Gratias S, Peyrard T, Beolet M, et al. Blood group genotyping by high-throughput DNA analysis applied to 356 reagent red cell samples. Transfusion. 2011; 51:36-42. 30. Tournamille C, Colin Y, Cartron JP et al. Disruption of a GATA motif in the Duffy gene promoter abolishes erythroid gene expression in Duffy negative individuals. Nat Genet. 1995; 10:224-228. 31. Castilho L.The value of DNA analysis for antigens in the Duffy blood group system. Tranfusion. 2007; 47(suppl):28S- 31S. 32. Anstee DJ Red cell genotyping and the future of pretransfusion testing. Blood. 2009; 114:248 256.

Aνασκόπηση Βλάβες συντήρησης ερυθρών αιμοσφαιρίων Μαριάννα Αντωνέλου, 1 Ισιδώρα Παπασιδέρη, 1 Κωνσταντίνος Σταμούλης 2 Περίληψη: Κάθε χρόνο μεταγγίζονται εκατομμύρια μονάδες αίματος και παραγώγων του, έχοντας σαν συνέπεια πολλές ζωές να επηρεάζονται από την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια των μεταγγίσεων. Τα τρία κύρια ασταθή προϊόντα αίματος, που χρησιμοποιούνται ευρέως στην καθημερινή πρακτική είναι τα συμπυκνωμένα ερυθρά, τα αιμοπετάλια και το φρέσκο κατεψυγμένο πλάσμα, προϊόντα τα οποία αποθηκεύονται/συντηρούνται ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των επιμέρους συστατικών τους. Ωστόσο κατά τη διάρκεια της συντήρησης παρατηρούνται διάφορες τροποποιήσεις ή και αποικοδόμηση μέρους των συστατικών τους, ευρύτερα γνωστές ως βλάβες συντήρησης. Πιο συγκεκριμένα, η αποθήκευση των συμπυκνωμένων ερυθρών σε διάφορα αντιπηκτικά-συντηρητικά/προσθετικά διαλύματα στους 4 o C, επιφέρει μία σειρά από αναστρέψιμες και μη- αλλαγές που αποδίδονται με τον όρο «αποθηκευτική βλάβη ερυθρών» (Red Cell Storage Lesion, RCSL). Τα ερυθροκύτταρα προοδευτικά χάνουν ποσοστό της δομικής ακεραιότητας και λειτουργικής τους επάρκειας: αλλάζουν σχήμα, χάνουν μεμβρανική επιφάνεια και ενέργεια. Οι ασκοί των συμπυκνωμένων ερυθρών περιέχουν υγιή, αλλά ελαφρώς τροποποιημένα κύτταρα, κύτταρα και κυστίδια που εκθέτουν στην επιφάνειά τους μοριακά σήματα φαγοκυττάρωσης, βιοδραστικά μόρια όπως Κ +, λιπίδια και ελεύθερη Hb και τέλος, μεμβρανικές επιφάνειες με προ-θρομβωτικό και προ-φλεγμονώδες δυναμικό. Οι βιοχημικές, δομικές και λειτουργικές τροποποιήσεις της RCSL αναπτύσσονται γύρω από έναν πυρήνα μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης, τα οποία αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, όπως για παράδειγμα αυτά της γήρανσης/κυτταρικού θανάτου και της ρυθμιζόμενης κυτταρικής απόκρισης σε συνθήκες ενδογενούς ή εξωγενούς στρες. Ενώ ο οργανισμός διαθέτει μηχανισμούς για την αποτελεσματική εκκαθάριση των παθολογικών ή δυνητικά επικίνδυνων κυττάρων και των προϊόντων κυτταρικής αποικοδόμησης, αυτά τα συστατικά απλώς συσσωρεύονται στον ασκό κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης και μεταγγίζονται ταυτόχρονα στο δέκτη. Σύμφωνα με τις συστάσεις του Συμβουλίου της Ευρώπης για την αποθήκευση αίματος προς μετάγγιση, ο έλεγχος ποιότητας βασίζεται σε δύο κυρίως κριτήρια: την αιμόλυση εντός του ασκού (μικρότερη του 0.8% στη λήξη της αποθηκευτικής περιόδου) και στην επιβίωση in vivo των μεταγγιζόμενων ερυθρών (επιβίωση/ανάκτηση 24 ώρες μετά τη μετάγγιση >75%). Η πληρέστερη κατανόηση της RCSL θα συνδράμει στη διαλεύκανση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ομοιόσταση των ερυθρών και το θάνατό τους και το αντίστροφο: η πρόοδος στη βασική έρευνα θα επισπεύσει τον καλύτερο προσδιορισμό της RCSL. Οι δύο αυτές κατευθύνσεις σε συνδυασμό με καλά σχεδιασμένες κλινικές δοκιμές μπορούν να εξασφαλίσουν κατάλληλες παρεμβάσεις στη διαδικασία μετάγγισης ώστε να αποφευχθεί τόσο η πρόωρη εκκαθάριση των μεταγγιζόμενων κυττάρων, όσο και οι ανεπιθύμητες αλληλεπιδράσεις τους στο δέκτη. Έχουν δημοσιευθεί διάφορες κλινικές μελέτες που εστίασαν στις αρνητικές κλινικές συνέπειες (νοσηρότητα/θνησιμότητα) της μετάγγισης «πολυκαιρισμένων» ασκών συμπυκνωμένων ερυθρών σε αντιδιαστολή με «φρέσκους» ασκούς, ο σχεδιασμός όμως και η εκτέλεσή τους αντιμετωπίστηκαν με έντονο σκεπτικισμό από την ερευνητική κοινότητα. Ήπιες και μέχρι σήμερα απροσδιόριστες διαφορές στη φυσιολογία του δότη φαίνεται να επιδρούν στην χρονο-εξαρτώμενη εξέλιξη της RCSL. Επιπρόσθετα, η μετάγγιση μπορεί να έχει διαφορετικές ανοσοτροποποιητικές/φλεγμονώδεις αντιδράσεις στο δέκτη, ανάλογα με την κλινική/φυσιολογική κατάσταση του τελευταίου. Σήμερα έχουν σχεδιαστεί τρεις ευρείας κλίμακας τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες σε διαφορετικούς πληθυσμούς: οι ABLE (Age of Blood Evaluation), ARIPI (Age of Red Blood Cells in Premature Infants) και RECESS (Red Cell 1 Παν/μιο Αθήνας, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής 2 Νοσοκομειακή Υπηρεσία Αιμοδοσίας, Γ.Ν. Νίκαιας Πειραιά «Άγιος Παντελεήμων» Διεύθυνση Αλληλογραφίας: Μαριάννα Αντωνέλου, e-mail: manton@biol. uoa.gr, Παν/μιο Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, ΤΚ 15784, Αθήνα

Βλάβες συντήρησης ερυθρών αιμοσφαιρίων 23 Storage Duration Study) σε Καναδά και ΗΠΑ, οι οποίες αναμένεται να δώσουν απαντήσεις σε κρίσιμα ερωτήματα της ιατρικής των μεταγγίσεων. Haema 2011; 2(1): 22-33 Copyright EAE Εισαγωγή Η πρώτη επιτυχής προσπάθεια συντήρησης και αποθήκευσης αίματος ξεκίνησε το 1915 από τους Rous και Turner με την ανακάλυψη των κιτρικών ως αντιπηκτικές ουσίες. 1 Αυτοί κατάφεραν να συντηρήσουν ερυθρά για τέσσερεις εβδομάδες σε διάλυμα με κιτρικά ως αντιπηκτικά και γλυκόζη ως θρεπτική ουσία, όμως δεν μπόρεσαν να διασφαλίσουν τη αποστείρωση του διαλύματος σε υψηλές θερμοκρασίες αφού παρατήρησαν καραμελοποίηση της γλυκόζης. Μόλις το 1943 οι Loutit και Mollison απέδειξαν ότι μειώνοντας το ph του διαλύματος στο 5 η γλυκόζη παρέμενε σταθερή σε θερμοκρασίες άνω των 100 o C, επιτρέποντας έτσι την αποστείρωση του διαλύματος στην αρχική φιάλη. 2 Με αυτόν τον τρόπο δημιουργήθηκε το πρώτο διάλυμα - ACD (acid citrate dextrose) - για την συντήρηση/αποθήκευση του αίματος. Το ACD επέτρεψε την συντήρηση του αίματος για 3 εβδομάδες με δυνατότητα ανάκτησης των ερυθρών κατά 70%, μετρώμενη ως η 24-ωρη in vivo επιβίωση ερυθρών σημασμένων με 51 Cr. Από τότε μέχρι σήμερα έγινε κατανοητό ότι τα ερυθρά κατά την συντήρηση/αποθήκευση χάνουν φωσφορικά και καταβολίζουν αδενίνη. 3 Επιπλέον κατά τη διάρκεια της συντήρησης τα ερυθρά αιμολύονται, γεγονός που μπορεί να αποφευχθεί ή τουλάχιστον να μειωθεί προθέτοντας σάκχαρα όπως η μανιτόλη, η οποία σταθεροποιεί τις μεμβράνες. Προσθέτοντας όλες αυτές τις ουσίες στα διαλύματα συντήρησης/αποθήκευσης γίνεται εφικτή η συντήρηση του αίματος για μεγαλύτερο διάστημα με βελτιωμένη ανάκτηση και μικρότερο βαθμό αιμόλυσης. Άλλες αιμοδοσιακές πρακτικές οδήγησαν στην ακόμα μεγαλύτερη μείωση της παρατηρούμενης αιμόλυσης και κατά συνέπεια στην καλύτερη συντήρηση των ερυθρών. Για παράδειγμα η αποθήκευση του αίματος σε πλαστικούς ασκούς κατασκευασμένους από polyvinyl chloride (PVC) πλαστικοποιημένο με diethylhexylphtalate (DEHP) μείωσε τον βαθμό της αιμόλυσης κατά 4 φορές, 4 ενώ η λευκαφαίρεση παρατηρήθηκε ότι μειώνει ακόμη κατά 2 φορές το ποσοστό της παρατηρούμενης αιμόλυσης. 5 Όταν όλα αυτά συνδυάζονται, όπως συμβαίνει στα σύγχρονα συστήματα αποθήκευσης/συντήρησης αίματος, επιτυγχάνεται αποθήκευση για 6 εβδομάδες με 84% 24- ωρη in vivo ανάκτηση και 0,4% αιμόλυση. 6 Οι σύγχρονες απαιτήσεις ποιότητας για τα προσθετικά/συντηρητικά διαλύματα είναι σχεδόν κοινές για τις ΗΠΑ και την ΕΕ και αναφέρονται στις σχετικές συστάσεις του Συμβουλίου της Ευρώπης, 7 βασιζόμενες κυρίως σε δύο παραμέτρους: στα επίπεδα της αιμόλυσης (κάτω από 0,8% στο τέλος της περιόδου αποθήκευσης) και στον ρυθμό επιβίωσης των μεταγγιζόμενων κυττάρων (πάνω από 75% 24-ώρες μετά τη μετάγγιση). Και οι δύο αυτοί παράμετροι όμως, επηρεάζονται πολύ από τη σημαντικά διαφορετική βιολογική ποικιλία μεταξύ των αιμοδοτών, με δεδομένο ότι αίμα από μερίδα αιμοδοτών ανέχεται τις συνθήκες αποθήκευσης καλύτερα από αυτό άλλων αιμοδοτών. 8 Είναι πλέον κοινό μυστικό, ότι οι δύο αυτοί ευρέως αποδεκτοί παράμετροι, δεν αντικατοπτρίζουν τις σημαντικές αλλαγές τουλάχιστον σε μοριακό επίπεδο, που εμφανίζονται στα ερυθρά κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Tο πρόβλημα Μέχρι σήμερα αρκετές μελέτες κατέδειξαν συσχέτιση μεταξύ του χρόνου ζωής των μεταγγιζόμενων προϊόντων αίματος, ιδιαίτερα των συμπυκνωμένων ερυθρών και της κλινικής έκβασης των ασθενών, όπως αυτή εκδηλώνεται με αύξηση των ημερών νοσηλείας, μετεγχειρητικές λοιμώξεις, παράταση χρόνου μηχανικής αναπνοής, έκπτωση πολλαπλών οργάνων, και αυξημένη θνησιμότητα. Δύο μηχανισμοί μπορεί να εξηγήσουν αυτή την επιβλαβή έκβαση, εφόσον γίνει αποδεκτή η σχέση αιτίας-αποτέλεσμα μεταξύ του χρόνου ζωής του μεταγγιζόμενου προϊόντος και της νοσηρότητας-θνησιμότητας, και αυτό διότι η όλη θεωρία παραμένει υποθετική αφού δεν έχει αποδειχτεί ακόμη η αιτιολογική συσχέτιση. Ένας υποθετικός μηχανισμός είναι αυτός που προτείνει ότι η αποθηκευτική βλάβη των ερυθρών που παρατηρείται κατά την συντήρηση του αίματος ευθύνεται για τις ανοσοτροποποιητικές και φλεγμονώδεις επιπλοκές των μεταγγιζόμενων ασθενών, περιλαμβανομένης και της ενίοτε παρατηρούμενης τροποποιημένης αγγειορυθμιστικής δυνατότητας. Η δεύτερη υπόθεση, η οποία μπορεί να συνυπάρχει με την πρώτη, προτείνει ότι προδιαθεσικοί παράγοντες σε συγκεκριμένους ασθενείς μπορεί να ευθύνονται για τις παθολογικές συνέπειες της μετάγγισης συντηρημένων ερυθρών. Η μείωση του χρόνου αποθήκευσης των ερυθρών, ως ενδεχόμενη απάντηση στην παρατηρούμενη αποθηκευτική βλάβη, αναμένεται να έχει σημαντικές επιπτώσεις στη διαθεσιμότητα του αίματος και στην εφοδιαστική αλυσίδα στο σύνολο της. Οι υπηρεσίες αιμοδοσίας θα πρέπει να τροποποιήσουν τις πρακτικές προσέλκυσης και διατήρησης των εθελοντών αιμοδοτών έτσι ώστε να εξασφαλίσουν μια σταθερή παροχή «φρέσκου» αίματος αλλά και να αναπτύξουν διαδικασίες και μεθόδους αποθήκευσης

24 Μ. Αντωνέλου et al που θα αποτρέπουν ή θα καθυστερούν την εμφάνιση της αποθηκευτικής βλάβης. Πολλές από τις μέχρι σήμερα σχετικές μελέτες, είναι μελέτες παρατήρησης και χαρακτηρίζονται από έλλειψη στάθμισης, μικρό δείγμα καθώς και από αδυναμία γενίκευσης των ευρημάτων (μέχρι σήμερα οι τυχαιοποιημένες μελέτες [ΤΜ] είναι πολύ λίγες). Ιδιαίτερα, η συχνά παρατηρούμενη ανομοιογένεια στα βασικά χαρακτηριστικά των υπό σύγκριση ομάδων επιβάλει τη διόρθωση για συνυπάρχοντες παράγοντες (σχετιζόμενους τόσο με την έκβαση όσο και με την κυρίως μελετώμενη παράμετρο). Για παράδειγμα, «ο αριθμός» των μεταγγιζόμενων προϊόντων, ο οποίος έχει άμεση σχέση με την βαρύτητα του υποκείμενου νοσήματος καθώς και με την πιθανότητα μετάγγισης «παλαιότερων» ερυθρών, αποτελεί έναν από τους κυριότερους συνυπάρχοντες παράγοντες σε όλες της μελέτες που ασχολούνται με τον χρόνο συντήρησης των ερυθρών. Αρκετές μελέτες θεωρούν ότι η μετάγγιση «παλαιότερου» αίματος σχετίζεται με αυξημένη νοσηρότητα/θνησιμότητα ενώ άλλες δεν αποδεικνύουν συσχέτιση ή και ακόμη το αντίθετο. 9 Μπορεί κανείς με ασφάλεια να ισχυριστεί ότι προς το παρόν σχέση αιτίας-αποτελέσματος δεν έχει αποδειχθεί και άρα υπάρχει ουσιαστική αβεβαιότητα για το εάν η μετάγγιση «φρέσκων» προϊόντων αίματος είναι περισσότερο, λιγότερο ή εξίσου ασφαλής με την μετάγγιση «παλαιότερων» μονάδων αίματος. Αυτό το γεγονός από μόνο του αναδεικνύει την άμεση ανάγκη σχεδιασμού τυχαιοποιημένων κλινικών μελετών αφού οι συνέπειες τόσο για τους ασθενείς όσο και για τις διαδικασίες της αιμοδοσίας θα είναι ιδιαίτερα σημαντικές. Όμως αν και τέτοιες μελέτες παρέχουν τις ισχυρότερες αποδείξεις, για την ενδεχόμενη επίπτωση της διάρκειας αποθήκευσης των μεταγγιζόμενων ερυθρών στην νοσηρότητα/θνησιμότητα, θεωρούνται ιδιαίτερα χρονοβόρες, δύσκολο να σχεδιαστούν και ιδιαίτερα αυξημένου κόστους. Τρεις μεγάλες τυχαιοποιημένες μελέτες έχουν ήδη σχεδιαστεί και είναι υπό εξέλιξη σε τρεις διαφορετικούς πληθυσμούς, υποδηλώνοντας έτσι το διεθνές επιστημονικό ενδιαφέρον. (1) Η μελέτη ABLE (Age of Blood Evaluation) 10 αφορά σε 2500 νοσηλευόμενους ασθενείς στον Καναδά, σε περισσότερες από 25 μονάδες εντατικής θεραπείας, τυχαιοποιημένους, εφόσον χρήζουν μετάγγισης, να μεταγγίζονται είτε με ερυθρά με χρόνο συντήρησης μικρότερο των 8 ημερών είτε με ερυθρά ανεξαρτήτως χρόνου συντήρησης (από 2-42 ημερών) με κύρια έκβαση την θνησιμότητα στις 90 ημέρες ανεξαρτήτως αιτιολογίας. (2) Η μελέτη ARIPI (Age of Red Blood Cells in Premature Infants), 11 σχεδιάζει να τυχαιοποιήσει 450 πρόωρα νεογνά (1250g) να μεταγγισθούν είτε με ερυθρά 8 ημερών είτε με ερυθρά 2-42 ημερών με κύρια έκβαση την θνησιμότητα στις 90 ημέρες ανεξαρτήτως αιτιολογίας και την εμφάνιση οργανικής ανεπάρκειας. (3) Τέλος, η μελέτη RECESS (Red Cell Storage Duration Study) 12 σχεδιάζει να τυχαιοποιήσει 1800 καρδιοχειρουργικούς ασθενείς, από 15 κέντρα σε όλη την επικράτεια των ΗΠΑ, να μεταγγισθούν, εφόσον χρήζουν μετάγγισης, είτε με ερυθρά με χρόνο συντήρησης κάτω των 10 ημερών είτε με ερυθρά άνω των 21 ημερών. Οι ασθενείς που πρόκειται να μεταγγισθούν με ερυθρά άνω των 21 ημερών σχεδιάζεται να μεταγγίζονται με μονάδες από το υπάρχον απόθεμα της αιμοδοσίας, αποδεσμεύοντας κάθε φορά πρώτα την παλαιότερη μονάδα. Παρά το γεγονός ότι τα αποτελέσματα αυτών των μελετών θα γνωστοποιηθούν μετά από μερικά χρόνια, αναμένεται να διαλευκάνουν εάν η αποθηκευτική βλάβη των ερυθρών έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις. Αποθηκευτική βλάβη ερυθρών Με τον όρο «αποθηκευτική βλάβη ερυθρών» (Red cell storage lesion, RCSL), αποδίδεται το σύνολο των αλλαγών στη λειτουργικότητα, δομική ακεραιότητα και σύσταση που υφίστανται τα ερυθροκύτταρα κατά την αποθήκευσή τους σε διαλύματα συντήρησης με σκοπό την ακόλουθη μετάγγισή τους. Οι καταγεγραμμένες μέχρι σήμερα αλλαγές αφορούν στις μηχανικές ιδιότητες, το μεταβολισμό και σχήμα των κυττάρων, την απώλεια και αναδιαμόρφωση της μεμβράνης και τη μείωση της δραστηριότητας κρίσιμων ενζυμικών και άλλων πρωτεϊνικών συστημάτων. Ως αποτέλεσμα επέρχεται ο σταδιακός μετασχηματισμός των φυσιολογικών ερυθροκυττάρων σε μία ειδική κατηγορία, τα αποθηκευμένα ερυθρά. Καθώς είναι πλέον γνωστό ότι η RCSL έχει αρνητική επίδραση στην επιβίωση, λειτουργικότητα και πολυποίκιλη «δραστικότητα» των συντηρημένων κυττάρων μετά τη μετάγγιση, η κατανόηση των επιμέρους παραμέτρων της συνιστά το επίκεντρο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας, με σκοπό όχι μόνο την επιμήκυνση της διάρκειας αποθήκευσης αλλά κυρίως την καλύτερη ποιότητα των μεταγγιζόμενων ερυθρών ως κρίσιμο παράγοντα βελτιστοποίησης της ασφάλειας και αποτελεσματικότητας των μεταγγίσεων. Η σύνθεση των επιμέρους κυτταρικών αλλαγών που ομαδοποιούνται στον όρο RCSL σε ευρύτερα πλαίσια αλληλεπιδράσεων, στοιχειοθετούν κυτταρικά μονοπάτια και φαινόμενα όπως η σηματοδότηση κυτταρικής γήρανσης και θανάτου και η κυτταρική απόκριση σε συνθήκες αυξημένου ενδογενούς ή εξωγενούς στρες. Η επίδραση της αποθήκευσης, με τις εκάστοτε συνθήκες στις οποίες επιτυγχάνεται, σε αυτούς τους μηχανισμούς, προϋποθέτει καλή γνώση της φυσιολογίας του ερυθροκυττάρου στην in vivo κατάσταση. Οφείλουμε να ομολογήσουμε

Βλάβες συντήρησης ερυθρών αιμοσφαιρίων 25 ωστόσο πως η δυναμική του συστήματος της αποθήκευσης ex vivo είναι τόσο μεγάλη που η προηγούμενη διαπίστωση έχει εν μέρει αντιστραφεί στην πράξη, καθώς το αποθηκευμένο ερυθρό χρησιμοποιείται δεκαετίες τώρα ως πρότυπο σύστημα μελέτης των μηχανισμών κυτταρικής σηματοδότησης. 13 Ο ασκός συμπυκνωμένων ερυθρών συνιστά ωστόσο ένα in vitro σύστημα μελέτης και οι πληροφορίες που παρέχει οφείλουν να συνδυαστούν με ευρείας κλίμακας και σωστά σχεδιασμένες κλινικές μελέτες στους δέκτες της μετάγγισης, προκειμένου να επανέλθει ο κύκλος έρευνας στο κύριο σημείο του ενδιαφέροντος: το αποθηκευμένο ερυθροκύτταρο in vivo. Στην πράξη, το κλείσιμο αυτού του κύκλου αποδεικνύεται μία όχι και τόσο εύκολη υπόθεση. Η διεθνής βιβλιογραφία προσφέρει μία σειρά από ενδιαφέροντα άρθρα ανασκόπησης σχετικά με την αποθηκευτική βλάβη. 14-17 Η κατανόηση των αλλαγών που συμβαίνουν στα ερυθροκύτταρα και στο κυτταρικό περιβάλλον κατά την αποθήκευση θα βοηθήσει όχι μόνο στο σχεδιασμό καλύτερων συστημάτων συντήρησης αλλά και στο σχεδιασμό μοντέλων μελέτης των μετα-μεταγγισιακών ανεπαρκειών και επιπτώσεων. Στη συνέχεια θα αναφερθούν συνοπτικά οι σημαντικότερες συνιστώσες της RCSL, με έμφαση στο σύνθετο πλέγμα των αλληλεπιδράσεών τους σε κυτταρικό επίπεδο, τα υποκείμενα ερεθίσματα και τον τρόπο με τον οποίο σχετίζονται δυνητικά με αναγνωρίσιμες συνέπειες στην κλινική εικόνα του δέκτη της μετάγγισης. Αλλαγές στο μεταβολισμό των κυττάρων Η διαδικασία της γλυκόλυσης συνιστά τη μοναδική πηγή ενέργειας στο ερυθροκύτταρο γι αυτό η διατήρησή της στις συνθήκες αποθήκευσης υπήρξε εξαρχής κύριος στόχος της επιστήμης της συντήρησης. Από τη διάσπαση της γλυκόζης παράγεται ενέργεια στη μορφή του ΑΤΡ καθώς και NADH. Το κόστος που πληρώνει το κύτταρο για αυτό το κέρδος είναι η παραγωγή πρωτονίων, οι κύριοι ένοχοι για την παρατηρούμενη σταδιακή πτώση του ph του διαλύματος συντήρησης και των ερυθρών (οξέωση). Τα παραγόμενα πρωτόνια διαμέσου αναστολής βασικών γλυκολυτικών ενζύμων, μειώνουν το ρυθμό της γλυκόλυσης (άρα και τις παραγόμενες ποσότητες ΑΤΡ και NADH) και παρεμποδίζουν μονοπάτια που εξασφαλίζουν ικανές ποσότητες NADPH και ανηγμένης γλουταθειόνης στα κύτταρα. Οι συνέπειες αυτών των διαδικασιών είναι αλυσιδωτές. Μία ομάδα μεμβρανικών αντλιών και ενζύμων που βασίζουν τη λειτουργία τους στην κατανάλωση ATP σταδιακά υπολειτουργούν. Η αντλία ασβεστίου, η αντλία Κ + /Να + και η αμινοφωσφολιπιδική μετατοπάση είναι ορισμένες πρωτεΐνες, η ελαττωματική ενεργότητα των οποίων συσχετίζεται με αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου, απώλεια Κ + και κατάρρευση της ασύμμετρης κατανομής των φωσφολιπιδίων στη μεμβράνη, με αποτέλεσμα την εξωκυττάρια έκθεση φωσφατιδυλοσερίνης (PS) που είναι σήμα-θανάτου. Επίσης, η μειωμένη παραγωγή NADH οδηγεί άμεσα σε μειωμένη ενεργότητα του ενζύμου αναγωγάση της μεθαιμοσφαιρίνης, με αποτέλεσμα τη σταδιακή αύξηση της μεθαιμοσφαιρίνης στα ερυθροκύτταρα καθώς προάγεται ο χρόνος αποθήκευσης. Παρόλα αυτά η μείωση του ΑΤΡ είναι αναστρέψιμη μεταβολή καθώς αποκαθίσταται σύντομα μετά τη μετάγγιση στην κυκλοφορία του δέκτη. Έτσι η συμβολή της έλλειψης του ΑΤΡ στην RCSL και πολύ περισσότερο στην επιβίωση των κυττάρων in vivo έχει αμφισβητηθεί έντονα. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις προαναφερόμενες αλλαγές είναι κυτταρικά σήματα διάφορων ενδοκυττάριων μονοπατιών. Κατά συνέπεια, η ενεργειακή υποβάθμιση των ερυθρών κατά την αποθήκευση συσχετίζεται πρωτογενώς ή δευτερογενώς με μία σειρά από βιοφυσικές αλλοιώσεις αναστρέψιμες ή μη, όπως είναι η αλλαγή σχήματος, η σταθερότητα της μεμβράνης, η δυνατότητα ελαστικής παραμόρφωσης, η ερυθροφαγοκυττάρωση, η κυστιδιοποίηση και τα ρεολογικά χαρακτηριστικά. Οι ίδιες αλλαγές θέτουν επίσης τη βάση για την εμφάνιση προ-οξειδωτικού ενδοκυττάριου περιβάλλοντος στα αποθηκευμένα κύτταρα, το οποίο επίσης σχετίζεται δυνητικά με μη-αναστρέψιμες μεταβολές. Σε χαμηλά επίπεδα ΑΤΡ αλλάζει η ομοιόσταση του ασβεστίου στα κύτταρα προκαλώντας μη-αναστρέψιμες μεταβολές όπως είναι η έκφραση PS και η αποβολή μεμβρανικών κυστιδίων. 16 Πράγματι, με την πρόοδο της αποθήκευσης τα κύτταρα γίνονται περισσότερο δύσκαμπτα και προσκολλώνται πιο εύκολα στα ενδοθήλια των αγγείων. Έτσι παρότι η συγκέντρωση του ΑΤΡ επανέρχεται σε φυσιολογικά επίπεδα μετά τη μετάγγιση, η μακροχρόνια έλλειψή του έχει ήδη οδηγήσει σε μη-αναστρέψιμες βλάβες στα κύτταρα οι οποίες έχουν δυσμενείς κλινικές επιδράσεις. Η μεγάλη αύξηση του εξωκυττάριου Κ +, για παράδειγμα, σε μονάδες αίματος κοντά στο όριο λήξης (λόγω αναστολής της αντλίας Κ + /Να + και μη επαναφοράς του Κ + στα ερυθρά) έχει στο παρελθόν συσχετιστεί με αρρυθμίες σε μεταγγιζόμενους ασθενείς και αιφνίδιο θάνατο. 18 Στη μεταγγισιακή πρακτική αυτό το πρόβλημα αντιμετωπίζεται επί του παρόντος με χρήση «φρέσκων» ή «πλυμένων» ερυθρών. Τέλος, είναι γνωστό ότι σε ορισμένες περιπτώσεις η μετάγγιση ερυθρών συσχετίζεται με ανεπαρκή οξυγόνωση ιστών και ισχαιμικά επεισόδια. 15 Στην κυκλοφορία η αγγειοδιαστολή ελέγχεται από το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) που παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και επάγεται από τα ερυθρά. Περιοχές χαμηλής οξυγόνωσης γίνονται αισθητές από την Hb και εντός δευτερολέπτων παράγονται κατάλληλα επίπεδα ΝΟ και επάγεται τοπική αγγειοδιαστολή προκειμένου να αποκατασταθεί η ροή του αίματος στο μέτρο των μεταβολικών απαιτήσεων. Θεωρείται πως η S-nitrosothiol-Hb (SNO-Hb, που αποτελείται από ΝΟ συνδεδεμένο στη θειομάδα της κυστεΐ-

26 Μ. Αντωνέλου et al νης β-93 της Hb) εμπλέκεται στην παραγωγή ΝΟ. Καθώς η συγκέντρωση της SNO-Hb μειώνεται τάχιστα μετά την αποθήκευση φρέσκου αίματος και δεν αποκαθίσταται με διαλύματα αναζωογόνησης ή in vivo, 17 θεωρήθηκε ως μία «σιωπηλή» παράμετρος της RCSL. Άμεση συνέπεια είναι η παθολογική βιο-ενεργότητα ΝΟ και η ελαττωματική αγγειοδιασταλτική ανταπόκριση των αποθηκευμένων ερυθρών στην υποξία. 19 Ωστόσο άλλες μελέτες έδειξαν πως η SNO-Hb δεν είναι απαραίτητη για την εξαρτώμενη από τα ερυθροκύτταρα αγγειοδιαστολή καθώς στα τελευταία λειτουργεί ένα εναλλακτικό σύστημα παραγωγής ΝΟ, το οποίο δεν επηρεάζεται από την αποθήκευση. 16 Εικόνα 1. Ηλεκτρονιογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης που δείχνει τον εχινοκυτταρικό μετασχηματισμό των αποθηκευμένων ερυθροκυττάρων. Πρόκειται για δείγμα μη-λευκαφαιρεμένου ασκού συμπυκνωμένων ερυθρών ύστερα από 26 ημέρες αποθήκευσης σε πρόσθετο διάλυμα SAGM (CPD-SAGM). Με βέλη εντοπίζονται διάφορα στάδια εχινοκυττάρων. Λευκή γραμμή: 10μm. Απώλεια φυσιολογικού σχήματος και κυτταρικής επιφάνειας Τα ερυθροκύτταρα του ανθρώπου και άλλων θηλαστικών χαρακτηρίζονται από περίσσεια κυτταρικής επιφάνειας σε σχέση με τον όγκο τους. Αυτό «κατοχυρώθηκε» εξελικτικά για δύο κυρίως λόγους. Ο πρώτος είναι γιατί η μεμβράνη συνιστά το μοναδικό δομικό συστατικό των ερυθρών και κατ ανάγκη φιλοξενεί όλες τις διαδικασίες που σχετίζονται με την επιβίωση και το θάνατό τους, την επικοινωνία, την ανταλλαγή υλικών και πληροφορίας και κυρίως τη λειτουργικότητά τους που είναι η ανταλλαγή των αερίων της αναπνοής. Ο δεύτερος λόγος, είναι γιατί αυτή η περίσσεια εξασφαλίζει στα κύτταρα εκπληκτικές μηχανικές ιδιότητες, όπως είναι η σταθερότητα και η ικανότητα ελαστικής παραμόρφωσης, δηλαδή η αναστρέψιμη συμπίεση και αλλαγή σχήματος όταν διέρχονται από το ενδοθήλιο του σπλήνα ή τα τριχοειδή. Το φυσιολογικό σχήμα του αμφίκοιλου δίσκου που προκύπτει από περίσσεια κυτταρικής επιφάνειας δηλώνει φυσιολογική κυτταρική μηχανική. Έτσι δεν είναι τυχαίο ότι σε διάφορες αναιμίες αλλοιώνεται χαρακτηριστικά το σχήμα των κυττάρων σε συνάρτηση με τον κλινικό φαινότυπο. Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης τα ερυθρά υφίστανται έναν αργό αλλά σταδιακό μετασχηματισμό τύπου εχινοκυττάρωσης σε περισσότερο «φυσαλιδωτά» σχήματα (Εικόνα 1). 15 Αυτή αλλαγή είναι ενδεικτική της απώλειας κυτταρικής επιφάνειας με τη μορφή εξωκυστιδίων, κυρίως από τα νεαρότερα κύτταρα του ασκού. 20 Τα πρώτα στάδια εχινοκυτταρικού μετασχηματισμού χαρακτηρίζονται από μικρή απώλεια επιφάνειας και είναι αναστρέψιμα, μπορούν να επανέλθουν δηλαδή στο φυσιολογικό σχήμα όταν απομακρυνθούν οι εχινοκυτταρο-γενετικοί παράγοντες. Τέτοιοι παράγοντες είναι τα χαμηλά επίπεδα ph και ΑΤΡ και η αύξηση της συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου ασβεστίου. Οι σχετιζόμενες με την αποθήκευση αλλαγές του σχήματος των κυττάρων έχουν συνδεθεί με αλλαγές στη ρεολογία τους και το ιξώδες του αίματος. 21 Παρά την απώλεια επιφάνειας, κατά την αναζωογόνηση (rejuvenation) των αποθηκευμένων ερυθρών σε περιβάλλον θρεπτικών υλικών και ουδέτερο ph, αποκαθίσταται εν μέρει το φυσιολογικό σχήμα και τα ρεολογικά χαρακτηριστικά, παράλληλα με τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΑΤΡ, 2,3-DPG, Νa +, K + και Ca ++. 22 Ωστόσο προς το τέλος της ζωής των ερυθρών in vitro, όπου τα επίπεδα ΑΤΡ έχουν μειωθεί δραματικά, σχηματίζονται σφαιρο-εχινοκύτταρα, το τελικό δηλαδή στάδιο του εχινοκυτταρικού μετασχηματισμού, το οποίο είναι μη-αναστρέψιμο. Η απώλεια μεμβράνης διαμέσου κυστιδιοποίησης είναι κομμάτι της φυσιολογίας των ερυθροκυττάρων. Υφίσταται αρχικά κατά την ωρίμανσή τους από ΔΕΚ σε ώριμα κύτταρα, 20 συνεχίζει προοδευτικά κατά τη γήρανση των κυττάρων 23 και σε ορισμένες περιπτώσεις (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) σηματοδοτεί το θάνατό τους. Η σχετιζόμενη με την αποθήκευση αποβολή μεμβρανικών κυστιδίων από τις άκρες των εχινοκυτταρικών προεκβολών των ερυθρών, 24 είναι μία διαδικασία που βασίζεται στις λιπιδικές σχεδίες της μεμβράνης, 25 συμβαίνει σε περιοχές που έχουν ανεπαρκή υποστήριξη από το σκελετό 20 και αυξάνεται σημαντικά με τη διάρκεια της αποθήκευσης στον ασκό. 25-27 Πρόκειται φυσικά για μηαναστρέψιμη μεταβολή, καθώς τα ερυθροκύτταρα δε (γνωρίζουμε να) διαθέτουν μηχανισμό για την αποκατάσταση της χαμένης μεμβρανικής επιφάνειας. Το αποτέλεσμα είναι να αλλοιώνεται η γεωμετρία και η μηχανική των κυττάρων, καθώς γίνονται σφαιρικά και δύσκαμπτα, με μειωμένη ικανότητα παραμόρφωσης, γεγονός που επιδρά δραστικά στην επιβίωσή τους μετά τη μετάγγιση. 28 Πράγματι, συνθήκες αποθήκευσης που εξασφαλίζουν αυξημένη επιβίωση των ερυθροκυττάρων in vivo, σχε-

Βλάβες συντήρησης ερυθρών αιμοσφαιρίων 27 τίζονται με μειωμένη παραγωγή κυστιδίων στον ασκό. 29 Η ανάλυση της σύστασης των κυστιδίων ωστόσο, αποκαλύπτει και μια αντίθετη, θετική συμβολή της κυστιδιοποίησης στην επιβίωση των ερυθρών που στερούνται επιδιορθωτικών μηχανισμών. Παρότι ο πληθυσμός τους δεν είναι ομοιογενής, τα κυστίδια περιέχουν αντιγόνα και δείκτες κυτταρικής γήρανσης, οξειδωμένα λιπίδια, οξειδωμένες/αποδιαταγμένες πρωτεΐνες και PS, παθολογικά δηλαδή και εν δυνάμει δραστικά από άποψη σηματοδότησης συστατικά, τα οποία θα μπορούσαν να οδηγήσουν τα μητρικά κύτταρα σε πρόωρη εκκαθάριση από την κυκλοφορία. 26,30 Η κυστιδιοποίηση αρχικά λειτουργεί ευεργετικά, απαλλάσσοντας τα κύτταρα από παθολογικά ή επικίνδυνα τμήματα της μεμβράνης μέχρι το σημείο που η απώλεια κυτταρικής επιφάνειας είναι τόσο μεγάλη που επικρατεί τελικά το αρνητικό ισοζύγιο, οδηγώντας σε εκκαθάριση τα δύσκαμπτα μητρικά κύτταρα. Ένα εξίσου σημαντικό συμπέρασμα που προέκυψε από την ανάλυση της σύστασης των κυστιδίων ήταν πως η μελέτη τους συνιστά έναν έμμεσο τρόπο υπολογισμού της βλάβης που έχουν υποστεί τα μητρικά κύτταρα κατά την αποθήκευση, δηλαδή είναι ένας βιοδείκτης της RCSL. Τα κυστίδια έχουν προ-φλεγμονώδεις και προθρομβωτικές ιδιότητες κυρίως διότι εκθέτουν στην επιφάνειά τους αρνητικά φορτισμένα λιπίδια. 20,25,27 Αναμένεται επίσης να επιδρούν στο ανοσολογικό σύστημα του δέκτη καθώς ενεργοποιούν το κλασσικό μονοπάτι του συμπληρώματος. Ιn vivo, απομακρύνονται πολύ σύντομα μετά την παραγωγή τους από μακροφάγα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος. 31 Φυσικά, στο κλειστό σύστημα του ασκού απουσιάζουν οι φυσιολογικοί μηχανισμοί εκκαθάρισης όχι μόνο των κυστιδίων αλλά και άλλων κυτταρικών «αποβλήτων» τα οποία είναι βιοδραστικά και συσσωρεύονται σταδιακά στο διάλυμα. Η μακρόχρονη συνύπαρξη κυστιδίων-κυττάρων παραγωγής τους, αντιπροσωπεύει μία πρόσθετη καινοτομία του συστήματος αποθήκευσης κυττάρων ex vivo, οι συνέπειες της οποίας στα μεταγγιζόμενα κύτταρα είναι ολοκληρωτικά άγνωστες. Ωστόσο, λόγω του πλήθους των δεικτών φαγοκυττάρωσης που φέρουν, η μετάγγιση μεγάλης ποσότητας κυστιδίων θα μπορούσε να «υπερθερμάνει» τους μηχανισμούς εκκαθάρισης που διαθέτει ο δέκτης και να αναστρέψει την ισορροπία των προ- και αντι-φλεγμονωδών παραγόντων. 32 Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις ότι ερυθροκυτταρικά κυστίδια μπορούν να προσροφηθούν από άλλα κύτταρα μεταφέροντας σήματα θανάτου σε αυτά. 27 Καθώς η παραγωγή κυστιδίων αυξάνεται ιδιαίτερα προς το τέλος της αποθηκευτικής περιόδου, όπου το ΑΤΡ βρίσκεται σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα, η μετάγγιση ερυθρών κοντά στο όριο λήξης τους αναμένεται να σχετίζεται με περισσότερες φλεγμονώδεις και θρομβωτικές αντιδράσεις στο δέκτη. Παρότι υπάρχουν κλινικές μελέτες που αποδεικνύουν αυτή τη συσχέτιση, η αξιοπιστία τους δέχθηκε έντονη κριτική. 16 Ωστόσο θεωρείται σίγουρο ότι ο σχεδιασμός των μελλοντικών διαλυμάτων συντήρησης ερυθρών θα πρέπει να εξασφαλίζει υψηλότερα επίπεδα ΑΤΡ προς το τέλος της περιόδου αποθήκευσης. 16 Βιωσιμότητα και αιμόλυση: ποικιλομορφία στο επίπεδο του δότη Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης συσσωρεύεται βαθμιαία στο διάλυμα του ασκού ελεύθερη Hb, Hb εγκλεισμένη σε ερυθροκυτταρικά μικροκυστίδια καθώς και Hb που ελευθερώνεται από δομικά αλλοιωμένα μικροκυστίδια. 14,26 Η ελεύθερη αιμοσφαιρίνη λειτουργεί ως επικίνδυνη πηγή ROS και κυτταροκινών στην κυκλοφορία. Η αιμόλυση στον ασκό συνιστά κλινικό πρόβλημα κυρίως στην περίπτωση πολυμεταγγιζόμενων ασθενών ή σε πάσχοντες με αιμολυτική αναιμία και προκαλεί αντιδράσεις που μοιάζουν με μετα-μεταγγισιακή αιμολυτική αντίδραση. Η αιμόλυση που παρατηρείται σε ασκούς κοντά στο όριο λήξης τους έχει συσχετιστεί με οξεία νεφρική ανεπάρκεια και αιφνίδιο θάνατο του δέκτη από υπερκαλιαιμία. 16 Ο ρυθμός της αιμόλυσης εξαρτάται όχι μόνο από το διάλυμα συντήρησης-αποθήκευσης, τη διάρκεια της αποθήκευσης και την ύπαρξη ή όχι λευκαφαίρεσης αλλά και από (ελάχιστα κατανοητές) ιδιαιτερότητες του δότη. Επιπρόσθετα, τα ερυθροκύτταρα ορισμένων δοτών είναι πιο επιρρεπή στην αιμόλυση κατά τη διάρκεια της λευκαφαίρεσης, σε σχέση με άλλους. Το 40% αυτών των ατόμων είναι ετερόζυγοι φορείς δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Για τους υπόλοιπους ακόμα δεν έχει βρεθεί ο παράγοντας που τα καθιστά επιδεκτικότερα στην αιμόλυση. 14 Υπάρχουν επίσης δότες των οποίων τα ερυθρά «αντιδρούν καλά» στην αποθήκευση εμφανίζοντας υψηλή βιωσιμότητα στο τέλος της αποθηκευτικής περιόδου, σε σχέση με άλλους των οποίων η κυτταρική βιωσιμότητα μετά από πανομοιότυπη σε διάρκεια και συνθήκες αποθήκευση είναι πολύ χαμηλή. Η ικανότητα ταυτοποίησης δοτών αίματος «κατάλληλου για αποθήκευση» είναι κρίσιμη σε περιπτώσεις ασθενών με β-μεσογειακή ή δρεπανοκυτταρική αναιμία. Σε αυτές τις περιπτώσεις οι επαναλαμβανόμενες μεταγγίσεις αίματος από «μη-κατάλληλους» από άποψη αποθήκευσης δότες επιβαρύνουν τους ασθενείς με το σίδηρο όλων των κυττάρων αλλά μόνο ένα ποσοστό χρήσιμων και λειτουργικών κυττάρων. Επί του παρόντος, αυτό το πρόβλημα αντιμετωπίζεται στην πράξη με μετάγγιση «φρέσκων» ερυθρών, αλλά καθώς οι ανάγκες αυξάνονται, προβάλλεται ως επιτακτική η ανάγκη αποκάλυψης νέων βιοδεικτών οι οποίοι θα βοηθήσουν στην επιλογή κατάλληλου ασκού ανά περίπτωση. Από την άλλη πλευρά, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά τη μετάγγιση εξαρτάται και από το ανοσολογικό σύστημα του δέκτη. 33 Τα αποτελέσματα πρόσφατων μελετών που χρησιμοποιούν δευτερεύοντα αντιγόνα ομάδων αίματος και συγκρίνουν την επιβίωση διαφόρων προϊόντων σε ένα και μόνο δέκτη,