Εργαστηριακή μεθοδολογία διερευνήσεως λοιμώξεων ανδρών/γυναικών που επηρεάζουν την αναπαραγωγή Σταυρούλα Μπάκα Σταυρούλα Μπάκα Αν. Καθηγήτρια Αρεταίειο Νοσοκομείο
Ανησυχητικά στοιχεία της Ελληνικής Στατιστικής Υπηρεσίας (Υφαντόπουλος Ι, 2013) Για το 2011: 106.777 γεννήσεις και 110.729 θάνατοι Ο «δείκτης γονιμότητας» είναι ο αριθμός των παιδιών που γεννά μια γυναίκα κατά την διάρκεια της ζωής της. Για να είναι ομαλή η αναπαραγωγή του ανθρώπινου είδους, ο «δείκτης γονιμότητας» πρέπει να είναι >2,1. Στην Ελλάδα ο «δείκτης γονιμότητας» είναι 1,39 στο γενικό πληθυσμό και <1 για τις Ελληνίδες, κατατάσσοντας την Ελλάδα στην 199 η θέση επί 220 χωρών. ιαπιστώθηκε αύξηση του ποσοστού των παλίνδρομων κυήσεων από 2% στο 4% τα τελευταία δύο χρόνια. 2
Λοιμώξεις και αναπαραγωγή Έχουν ένα ευρύ φάσμα επιδράσεων στην αναπαραγωγή. γή Συνέπειες: μετά από μήνες ή χρόνια είναι δυνατόν να διακόψουν την αναπαραγωγή σχεδόν σε οποιοδήποτε στάδιο - ανάπτυξη ωαρίων και σπέρματος - βιωσιμότητα ωαρίων και σπέρματος - εμβρυογένεση και ανάπτυξη του εμβρύου - τελική επιβίωση του νεογέννητου 3
Ο ρόλος των λοιμώξεων Οι διάφορες λοιμώξεις και κυρίως τα Σεξουαλικώς Μεταδιδόμενα Νοσήματα (ΣΜΝ) απασχολούν ιδιαιτέρως τους επαγγελματίες υγείας ανά τον κόσμο, καθώς πολλά από αυτά μπορούν εύκολα να προληφθούν ή να θεραπευθούν. Πολλές αποτελούν την κύρια αιτία αναστρέψιμης υπογονιμότητας. Αυτές οι λοιμώξεις μπορεί να οφείλονται σε βακτήρια, ιούς, πρωτόζωα. 4
Peeling & Embree, Can J Infect Dis Med Microbiol 2005; Pellati, EJOGRB, 2008 Βακτήρια Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Ureaplasma urealyticum Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium Στρεπτόκοκκοι Β ομάδας Treponema pallidum Ιούς Ιός του απλού έρπητα Ιός της ερυθράς Ιός της ηπατίτιδας Β Ιός της ηπατίτιδας C Ιός της παρωτίτιδας CMV HIV Ιός Parvo B19 Πρωτόζωα Toxoplasma gondii 5
Φυσιολογική χλωρίδα του γεννητικού συστήματος Η φυσιολογική χλωρίδα έχει μεγάλη σημασία για τη διαγνωστική προσέγγιση των γυναικολογικών λοιμώξεων μιας και μπορεί να είναι η πηγή των υπευθύνων μικροοργανισμών ή να ανταγωνίζεται με εξωγενή λοιμογόνα αίτια. Ως Φ.Χ. ονομάζουμε το σύνολο των μικροοργανισμών που αποικίζουν τον κόλπο, το κατώτερο τμήμα του τραχήλου της μήτρας και τα εξωτερικά γεννητικά όργανα της γυναίκας χωρίς να προκαλέσουν νόσο. Το υπόλοιπο γεννητικό σύστημα είναι στείρο μικροβίων. Η Φ.Χ. βρίσκεται σε δυναμική ισορροπία και διαφέρει φρ από τη γέννηση η ως την εμμηνόπαυση. 6
7
8
Χλαμύδια - είναι υποχρεωτικώς ενδοκυττάρια βακτήρια - περιέχουν DNA και RNA - είναι ευαίσθητα σε συγκεκριμένα ΑΒ - δεν χρωματίζονται κατά Gram - πολλαπλασιάζονται με διχοτόμηση Είδος Ορότυποι Λοιμώξη Chlamydophila psittaci Πολλοί Ψιττάκωση Chlamydophila pneumoniae TWAR (Taiwan acute respiratory) Λοιμώξεις αναπνευστικού συστήματος Chlamydia trachomatis* A, B, Ba, C D, E, F, G, H, I, J, K L1, L2, L3 Τράχωμα Λοιμώξεις γεννητικού συστήματος και επιπεφυκίτιδα Αφροδίσιο λεμφοκοκκίωμα * βάσει των πρωτεϊνών ϊώ της εξωτερικής μεμβράνης διαχωρίζονται σε 15 οροτύπους 9
Κλινικές εκδηλώσεις των λοιμώξεων από C. trachomatis Άνδρες Γυναίκες Παιδιά Ουρηθρίτιδα Μετα-γονοκοκκική ουρηθρίτιδα Επιδιδυμίτιδα Προστατίτιδα Πρωκτίτιδα Επιπεφυκίτιδα Φαρυγγίτιδα Αφροδίσιο λεμφοκοκκίωμα Σύνδρομο Reiter Αρθρίτιδα Βαρθολινίτιδα Βλεννοπυώδη τραχηλίτιδα Ενδομητρίτιδα Σαλπιγγιτίδα Πυελική φλεγμονώδη νόσο Περιηπατίτιδα (Σ. Fitz-Hugh-Curtis) Ουρηθρίτιδα Οξύ ουρηθρικό σύνδρομο Αφροδίσιο λεμφοκοκκίωμα Επιπεφυκίτιδα Φαρυγγίτιδα Υπογονιμότητα Έκτοπη κύηση Πρόωρος τοκετός Πρόωρη ρήξη των υμένων Αρθρίτιδα Επιπεφυκίτιδα Πνευμονία Ασυμπτωματική φορεία (φάρυγγσς) Ασυμπτωματική φορεία (γαστρεντερικό) Μέση ωτίτιδα Τράχωμα 10
Ανησυχία προκαλούν οι επιπτώσεις στη γυναίκα: PID, σαλπιγγίτις, υπογονιμότητα, έκτοπη κύηση, χρόνιο πυελικό άλγος Εγκυμοσύνη: πρόωρος τοκετός πρόωρη ρήξη των υμένων ελλιποβαρή νεογνά νεογνικός θάνατος 11
Συχνότητα λοιμώξεων/100.000 κατοίκους (ΗΠΑ, 2005) Ηλικία Άνδρες Γυναίκες 10-14 11,1 125,3 15-19 505,2 2796,0 20-24 804,7 2691,1 25-29 447,4 1080,4 30-3434 204,1 384,6 35-39 110,7 160,4 40-4444 60,5 64,3 45-54 25,4 23,2 55-64 84 8,4 63 6,3 65+ 2,7 2,3 Σύνολο 161,6 498,2 Μία μόνο σεξουαλική επαφή αρκεί για να μεταδοθούν τα χλαμύδια στο 20 50% των περιπτώσεων. 12
είγματα Γυναίκα: κύτταρα από τον ενδοτράχηλο (μετά από την απομάκρυνση κολπικών εκκρίσεων και βλέννης = πιθανός αναστολέας της PCR) κυτταρολογική βούρτσα ή στυλεό λό από dacron, rayon ή αλγινικό ασβέστιο με πλαστικές ή μη αλουμινένιες συρμάτινες λαβές), με περιστροφικές κινήσεις για 3-5 ή ούρα από πρώτη πρωινή ούρηση. Άδ Άνδρας: : ούρα πρώτης πρωινής ούρησης ή ουρηθρικό επίχρισμα με στυλεό λό 2 4εκ. μέσα στην ουρήθρα. είγματα για μοριακές τεχνικές: Μετά τη λήψη, ο στυλεός τοποθετείται σε 1 ml υλικό μεταφοράς (STM) και μετά από έντονη περιστροφή για 20 και πίεση στα τοιχώματα του σωληναρίου, απορρίπτεται. Τα δείγματα πρέπει να επεξεργαστούν μέσα σε 10 μέρες από την συλλογή τους και φυλάσσονται στους 18-25 C. 13
Ορολογικές μέθοδοι εν συστήνεται η χρησιμοποίηση ορολογικών δοκιμασιών διότι: Σε κάποια άτομα η ανοσιακή απάντηση ενδέχεται να καθυστερήσει ή και να απουσιάζει μετά από χλαμυδιακή λοίμωξη Αυξημένοι τίτλοι αντισωμάτων έχουν παρατηρηθεί σε άτομα χωρίς εμφανή σημεία λοίμωξης Τα αντισώματα μπορεί να παραμείνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά από θεραπεία Η μέτρηση αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε επιδημιολογικές μελέτες για τον υπολογισμό της έκθεσης ενός πληθυσμού σε χλαμύδια. 14
Ορολογικές μέθοδοι Συνήθως χρησιμοποιούνται 2 μέθοδοι: Σύνδεση συμπληρώματος: μέθοδος εκλογής για τη διάγνωση του αφροδίσιου λεμφοκοκκιώματος (LGV) με 1 δείγμα ορού Τίτλος > 64: ενδεικτικό LGV Τίτλος 16: ενδεικτικό προηγούμενης έκθεσης σε Ct Μικροανοσοφθορισμός: : μέθοδος εκλογής για τις λοιμώξεις του γεννητικού συστήματος 15
Μέθοδοι ανίχνευσης χλαμυδιακού αντιγόνου - ανοσοενζυμική μέθοδος: χρησιμοποιούνται είτε μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά Ab για την ανίχνευση του χλαμυδιακού LPS που είναι πιο διαλυτό από το MOMP. Αποτέλεσμα σε λίγες ώρες και ελέγχονται πολλά δείγματα συγχρόνως. Πρόβλημα: ψευδώς θετικά λόγω ομοιότητας με LPS άλλων μικροβίων! Λύση: χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων! Ειδικότητα: 77 95% Ευαισθησία: 43-72% (Stephens et al, Infect Dis Obstet Gynecol, 2011) 16
Μέθοδοι ανίχνευσης χλαμυδιακού αντιγόνου - άμεσος ανοσοφθορισμός: 98-99% ειδικότητα, 75-85% ευαισθησία Είναι μια γρήγορη μέθοδο, η οποία χρησιμοποιεί μονοκλωνικά Ab έναντι: MOMP: καλύτερο διότι είναι ομοιόμορφα διανεμημένο στην επιφάνεια του Ct LPS: δύσκολο στην αξιολόγηση καθώς το LPS δεν ανευρίσκεται ομοιόμορφα στην επιφάνεια του Ct 17
Μοριακές μέθοδοι DNA probe: υβριδισμός των νουκλεϊκών οξέων: 98-99% ειδικότητα, 85% ευαισθησία Χρησιμοποιούνται ευρέως όπως η PACE 2 (Gen-Probe, San Diego, CA): ελέγχει εκτός από Ct και N. gonorrhoeae χρησιμοποιεί τον υβριδισμό DNA-RNA σε μια προσπάθεια αύξησης της ευαισθησίας με την εντόπιση του χλαμυδιακού RNA 18
Μοριακές μέθοδοι (Gaydos et al, STD, 2008/Domeika et al, JEADV, 2009) NAAT (Nucleic acid amplification tests): τεχνική ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος βασίζονται στην αναγνώριση συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων (DNA ή RNA) τα οποία, με τη βοήθεια συγκεκριμένων ενζύμων, πολλαπλασιάζονται και ανιχνεύονται με διάφορες τεχνικές. 98-99% ειδικότητα, 90-99% ευαισθησία PCR Amplicor (Roche Molecular Systems, USA) Transcription-mediated amplification AMP-CT (Gen-Probe, USA) Transcription-mediated t d amplification APTIMA Combo 2 (Gen-Probe,USA) Strand displacement amplification Probe Tec (BD Diagnostic Systems, USA) Real time PCR: Cobas Taqman 48, Lightcycler, Abbott m2000, Nuclisens EasyQ Analyser 19
Γονόκοκκος (Neisseria gonorrhoeae) Η N. gonorrhoeae είναι ένα Gram (-) διπλόκοκκος που αρχικά μολύνει το ουρογεννητικό επιθήλιο. Άνδρες: ουρήθρα Γυναίκες: τράχηλος + ουρήθρα Μία μόνο σεξουαλική επαφή αρκεί για να μεταδοθεί η γονόρροια σε ποσοστό 50 70%. Στις γυναίκες με γονοκοκκική λοίμωξη του κατώτερου γεννητικού συστήματος, το 50 80% είναι ασυμπτωματικές. 20
Κλινικό δείγμα Η συλλογή του ουρηθρικού εκκρίματος γίνεται με προσοχή, μετά από καθαρισμό με φυσιολογικό ορό,, με στυλεό (Προσοχή: ρ βαμβακοφόροι στυλεοί είναι τοξικοί,, μεταφορά σε Stuart, t δωματίου, ΌΧΙ ψυγείο). Όταν δεν υπάρχει ουρηθρικό έκκριμα συστήνεται η λήψη ουρηθρικού επιχρίσματος με λεπτό στυλεό από βάθος 2 εκ. στην ουρήθρα με περιστροφικές κινήσεις για την συλλογή επιθηλιακών κυττάρων. Η λήψη τραχηλικού επιχρίσματος γίνεται με κυτταρολογική βούρτσα ή στυλεού από τον ενδοτράχηλο, ούτως ώστε να συλλέξουμε κύτταρα. Μεταφορά: σε υλικό τύπου Stuart όπου διατηρείται για 6-12 ώρες σε t δωματίου. Σε περίπτωση που δεν είναι δυνατή η γρήγορη μεταφορά άμεση κ/α σε κατάλληλα θρεπτικά υλικά και επώαση για 24 h πριν τη μεταφορά. 21
Μικροβιολογική διάγνωση Gram χρώση (+): ανεύρεση πολυμορφοπύρηνων μέσα στα οποία διαφαίνονται Gram αρνητικοί διπλόκοκκοι είναι χαρακτηριστική για λοίμωξη με N. gonorrhoeae σε συμπτωματικούς ασθενείς. Gram χρώση (+): () διαγνωστική στο 95% των περιπτώσεων στο ουρηθρικό ρ έκκριμα ρμ Gram χρώση (+): διαγνωστική σε < 50 % των περιπτώσεων στο τραχηλικό επίχρισμα. Αντιθέτως, μια αρνητική Gram χρώση δεν είναι αρκετή για να αποκλείσουμε τη λοίμωξη. Καλλιέργεια: σε τροποποιημένο Thayer-Martin με βανκομυκίνη, κολιστίνη και νυστατίνη. Τα τρυβλία επωάζονται στους 35-37 C για 72 ώρες σε 5-7% CO 2.! Οι γονόκοκκοι δεν μπορούν να καλλιεργηθούν από την ουρήθρα για περίπου 40 ώρες, μέχρι που αρχίζει το έκκριμα. Το ουρηθρικό επιθήλιο αποτελεί ένα προστατευτικό περιβάλλον όπου επιβιώνουν βώ και πολλαπλασιάζονται. 22
Μικροβιολογική διάγνωση Άλλες εξετάσεις: ανίχνευση γονοκοκκικού αντιγόνου με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) ανίχνευση μικροβιακού DNA με DNA-ανιχνευτές (DNA-υβριδισμός): ενδοτραχηλικό επίχρισμα NAATs (nucleic acid amplification tests): αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR): ενδοτραχηλικό επίχρισμα, κολπικό επίχρισμα, ούρα. 23
Μυκοπλάσματα πολύ μικρά βακτηρίδια (0,3 x 0,7μm) διαθέτουν κυτταρική μεμβράνη, δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμα «Gram μηδέν» Ureaplasma urealyticum: μη γονοκοκκική ουρηθρίτιδα, επιδιδυμίτιδα, ορχίτιδα, PID Mycoplasma hominis: μη ειδική κολπίτιδα, πυελική φλεγμονώδη νόσο (PID) M. genitalium: μη γονοκοκκική ουρηθρίτιδα στους άνδρες M. fermentans M. spermatophilum: στα σπέρματα ανδρών με υπογονιμότητα επηρεάζει την κινητικότητα και μορφολογία των σπερματοζωαρίων. Μετάδοση είναι μέλη της ΦΧ της γυναίκας με σεξουαλική επαφή κάθετα από τη μητέρα, τόσο ενδομήτρια, όσο και στη γέννα έχουν συνδυαστεί με την HIV λοίμωξη 24
Μυκοπλάσματα Εργαστηριακή διάγνωση Η λήψη κολπικών, τραχηλικών και ουρηθρικών δειγμάτων: πάντα με πλαστικό στυλεό και τοποθέτηση σε υλικό μεταφοράς και συντήρησης (1 ml Hanks) αφήνοντας το στυλεό μέσα στο σωληνάριο. Το ίδιο με σπέρμα, προστατικό υγρό και ίζημα ούρων. Συντήρηση δειγμάτων: μέχρι 48 h στους 2-8 C. Καλλιέργεια μόνο για Uu και Mh σε 2 είδη θρεπτικών υλικών: στερεό: DNA-PPLO άγαρ για την κ/α του Mh ή Α7 Mh και Uu (37 C, 5-10% CO 2, 48 h) υγρό: στο υλικό Hanks, μετά τον εμβολιασμό του άγαρ, προσθέτουμε ισόποση ποσότητα (800 μl ζωμός ουρίας - ορός ίππου, ουρία, αντιβιοτικά τβοτ και Phenol Red αλλαγή αγή του ph) και επωάζονται αεροβίως για 24-48 h στους 37 C. Για το Uu τα υλικά πρέπει να περιέχουν ουρία και για το Mh, αργινίνη. Οι αποικίες του Uu είναι μικρές και μαύρες, ενώ του Mh «σαν αυγά μάτια» Υπάρχουν στο εμπόριο έτοιμα κιτ Μοριακές τεχνικές: PCR 25
Στρεπτόκοκκοι Β ομάδας Streptococcus agalactiae = Gram + κόκκος, ομάδα Β κατά Lancefield Εξαιρετικό ενδιαφέρον κατά την κύηση διότι προκαλεί λοιμώξεις τόσο στη μητέρα όσο και στο νεογνό. Προκαλεί: τραχηλίτιδα, πυελική φλεγμονώδη νόσο, αμνιονίτιδα, επιλόχεια ενδομητρίτιδα, μετεκτρωτική λοίμωξη, ουρολοίμωξη. Λόγω της πιθανής μετάδοσης στο νεογνό είναι απαραίτητος ο έλεγχος για φορεία (κόλπο και ορθό): 35 37 εβδομάδες κύησης. ης Εάν απομονωθεί συνιστάται αντιβιοπροφύλαξη. 26
Στρεπτόκοκκοι Β ομάδας Μικροβιολογική διάγνωση Τα κλινικά δείγματα μεταφέρονται σε υλικό Amies (για 4 μέρες στους 22-35 C), ενοφθάλμιση σε ζωμό Todd-Hewitt (με γενταμυκίνη ή κολιστίνη και ναλιδιξικό οξύ), επώαση στους 35 C για 18-24h και ανακαλλιέργεια σε αιματούχο άγαρ (35 C για 24-48h). Gram χρώση: Gram + κόκκοι σε στρεπτούς Καλλιέργεια κολπικού και ορθικού επιχρίσματος (απλά υλικά): β-αιμολυτικές αποικίες Ορολογικές δοκιμασίες Μοριακές τεχνικές: γρήγορη ανίχνευση την ίδια μέρα Αιμοκαλλιέργεια 27
Σύφιλη Η αφροδίσια σύφιλη προκαλείται από το Treponema pallidum υποείδος pallidum (ελικοειδές λ αναερόβιο βακτήριο με μέτριο μέγεθος, οξύαιχμα άκρα, δεν καλλιεργείται in vitro). Μετάδοση με τη σεξουαλική επαφή στο 90% των περιπτώσεων μέσω του πλακούντα στο έμβρυο (συγγενής σύφιλη) Συχνότητα μετάδοσης: πρώτου σταδίου: 70 100% πρώιμη λανθάνουσα: 40% όψιμη λανθάνουσα: 10% Οδηγεί σε αποβολή, ενδομήτριος θάνατος στο πρώτο τρίμηνο, περιγεννητικό θάνατο του εμβρύου, πρόωρο τοκετό και λιποβαρή νεογνά. 28
Μικροβιολογική διάγνωση Άμεσος ανοσοφθορισμός: το εξίδρωμα που λαμβάνεται από την ύποπτη βλάβη τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα, χρωματίζεται με ειδικό αντιτρεπονηματικό αντίσωμα συνδεδεμένο με φθοριοσκεϊνη τα τρεπονήματα φθορίζουν και αναγνωρίζονται εύκολα από τη μορφολογία (ευαισθησία της μεθόδου = 90 %) Μοριακές τεχνικές: PCR και κυρίως Multiplex PCR για ταυτόχρονη διάγνωση HSV 1 και 2, Τ. pallidum και H. ducreyi. 29
Μικροβιολογική διάγνωση Ορολογικές εξετάσεις: Οι οροαντιδράσεις αποτελούν τις κύριες διαγνωστικές εξετάσεις για όλα σχεδόν τα στάδια, με εξαίρεση ένα οροαρνητικό παράθυρο διάρκειας 30-35 ημερών από τη στιγμή της μόλυνσης. ιακρίνονται σε 2 κατηγορίες: α) μη τρεπονηματικές δοκιμασίες = δοκιμασίες διαλογής β) τρεπονηματικές δοκιμασίες = επιβεβαιωτικές δοκιμασίες Σύφιλη πρώτου σταδίου - οι ορολογικές εξετάσεις θετικοποιούνται 1 4 εβδ μετά την εμφάνιση του έλκους Σύφιλη δεύτερου σταδίου - όλες οι ορολογικές δοκιμασίες είναι θετικές 30
α) μη τρεπονηματικές δοκιμασίες (Peeling and Ye, 2004 / Herremans et al, 2010) = δοκιμασίες διαλογής (screening tests): ανιχνεύουν IgM και IgG αντισώματα που παράγονται έναντι λιποειδών = προϊόντα καταστροφής των ιστών από το Τ. pallidum - VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) Ευαισθησία: 78-100% Ειδικότητα: 98% - RPR (Rapid Plasma Reagin) Ευαισθησία: 86-100% Ειδικότητα: 93-98% 31
β) τρεπονηματικές δοκιμασίες (Peeling and Ye, 2004 / Herremans et al, 2010) = επιβεβαιωτικές δοκιμασίες: χρονοβόρες, δαπανηρές και τεχνικά δύσκολες - FTA (Fluorescent Treponemal Antibody = φθορίζοντα τρεπονηματικά αντισώματα): παραμένει θετική για έτη ακόμα και μετά τη θεραπεία Ευαισθησία: 70-100% Ειδικότητα: 94-100% - MHA/TPHA (Microhemagglutination = παθητική αιμοσυγκόλληση ευαισθητοποιημένων ερυθροκυττάρων έναντι του T.p.) Ευαισθησία: 85-100% Ειδικότητα: 98-100% -TPI(Treponema pallidum immobilization = δοκιμασία ακινητοποίησης η ης του μικροοργανισμού από τα Abs του ασθενούς): μόνο σε ερευνητικά εργαστήρια 32
Ιοί του απλού έρπητα (Herpes Simplex viruses HSV-1 και HSV-2) Ο ιός του απλού έρπητα προκαλεί λοίμωξη των γεννητικών οργάνων. Η μετάδοση του ιού διαμέσου του πλακούντα στην αρχή της κύησης είναι σπάνια, αλλά καταλήγει σε εμβρυϊκό θάνατο ή βαριά εμβρυοπάθεια. Η παρουσία του στο σπέρμα σχετίστηκε με μειωμένη συγκέντρωση και κινητικότητα των σπερματοζωαρίων. (Pellati et al, Eur J Obstet t Gynecol 140: 3-11, 2008) Η πρωτογενής λοίμωξη είναι ασυμπτωματική στο περίπου ⅓ των περιπτώσεων. 33
Εργαστηριακή διάγνωση Κλινικό δείγμα: ξέσματα από τον πυθμένα του έλκους και υγρό από τις φυσαλίδες Αί Ανίχνευση αντιγόνων του ιού: εμφανίζει ευαισθησίες από 35 93%. ELISA προτιμάται για τη διάγνωση λοίμωξης του γεννητικού συστήματος Άμεσος ανοσοφθορισμός ξεχωρίζει HSV από VZV (ευαισθησία θ ί 31-80%) PCR: εξαιρετική ευαισθησία και ειδικότητα 34
Εργαστηριακή διάγνωση Ορολογικός έλεγχος: (ELISA, συγκολλητινοαντίδραση Latex) Περιορισμένη διαγνωστική αξία καθώς στην οξεία φάση χρειάζονται 1-2 εβδομάδες μέχρι την εμφάνιση των αντισωμάτων. Μετά από 2 3 μήνες, αντισώματα ανευρίσκονται στο 70% των ασθενών. Ουσιαστικά, ο ορολογικός έλεγχος βοηθά μόνο στην αναδρομική επιβεβαίωση της ερπητικής πρωτολοίμωξης, χωρίς να διαχωρίζει μεταξύ HSV-1 ή HSV-2. Ευαισθησία και ειδικότητα αντισωμάτων: - HSV-1: >90% - HSV-2: 80 95% 35
Ηπατίτιδα Β Ο ιός HBV μεταδίδεται αιματογενώς, με τη σεξουαλική επαφή και κατά την περιγεννητική περίοδο από τη μητέρα στο νεογνό. Περίοδος επώασης: 15 1,5-6 μήνες Μικροβιολογική διάγνωση: βασίζεται στον έλεγχο διαφόρων ορολογικών δεικτών: - HBsAg - αντι-hbs - αντι-hbc IgM - HBeAg 36
Ηπατίτιδα Β - Μικροβιολογική διάγνωση - HBsAg (θετικοποιείται 3-5 εβδομάδες πριν την εμφάνιση των συμπτωμάτων) υποδηλώνει ενεργό οξεία ξί ή χρόνια λοίμωξη. - αντι-hbs: προστατευτικά αντισώματα (μετά από λοίμωξη ή εμβολιασμό), μ εμφανίζονται όταν εξαφανίζεται το HBsAg - αντι-hbc IgM: σε υψηλούς τίτλους = οξεία λοίμωξη - HBeAg ανιχνεύεται στην οξεία λοίμωξη και σχετίζεται με τη μολυσματικότητα του ασθενούς. - Ταυτόχρονη απουσία HBsAg και αντι-hbc IgM αντισωμάτων = αποκλείουν τη λοίμωξη - Η ανίχνευση του νουκλεϊνικού οξέος του ιού (HBV-DNA) = ο πιο ευαίσθητος δείκτης συνεχιζόμενου χζ πολλαπλασιασμού του ιού σε άτομα υψηλής μολυσματικότητας. 37
Ηπατίτιδα C Έχει μεγαλύτερο επιπολασμό συγκριτικά με την ηπατίτιδα Β. Επιπολασμός σε εθελοντές αιμοδότες: 0,2 2 % Επιπολασμός σε χρήστες IVD: > 80 % Μικροβιολογική διάγνωση: - ανίχνευση IgM αντι-hcv με EIA - μοριακές τεχνικές (RT-PCR): ιδιαίτερη διαγνωστική αξία στην πρώιμη διάγνωση της οξείας λοίμωξης 38
HPV (Human Papillomavirus) Οι ιοί Papilloma είναι DNA ιοί με εικοσάεδρη συμμετρία και διάμετρο 52 55 nm. Αποτελούν μία οικογένεια με πάνω από 180 γονότυπους οι οποίοι μολύνουν τα επιθηλιακά κύτταρα. > 90% των HPV λοιμώξεων οφείλονται στους γονότυπους 6 και 11, χαμηλού κινδύνου. Γονότυποι υψηλού κινδύνου (99,7% καρκίνο τραχήλου της μήτρας): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, κ. α. Το HPV 16 και 18 = 70% των CA τραχήλου της μήτρας. Μπορούν να συνυπάρχουν περισσότεροι γονότυποι στον ίδιο ασθενή. Χρειάζεται πάντα τη βοήθεια ενός κυττάρου ξενιστή. Μετά τη μόλυνση ακολουθεί μια περίοδος επώασης 4 μηνών (1 20 μήνες). Περίπου το 90% των ατόμων είναι ασυμπτωματικοί! 39
HPV (Human Papillomavirus) Εργαστηριακή διάγνωση: με μοριακές τεχνικές καθώς δεν καλλιεργούνται εύκολα και οι ορολογικές τεχνικές δεν είναι αξιόπιστες PCR (σε ενδοτραχηλικά κύτταρα που φυλλάσονται σε διάλυμα PreservCyt - φιαλίδιο ThinPrep liquid Pap ο στυλεός ή η κυτταρολογική βούρτσα απορρίπτονται, δεν παραμένουν στο διάλυμα). Τα δείγματα φυλλάσονται σε t δωματίου για 3 εβδομάδες ή 2-8 C για 12 εβδομάδες. 40
HIV Η γονιμότητα HIV (+) γυναικών είναι σημαντικά μειωμένη (16-26%), με χαμηλά ποσοστά εγκυμοσυνών υ και αυξημένα α ποσοστά αποβολών και ενδομήτριων θανάτων. Στον άνδρα: μειωμένη συγκέντρωση σπερματοζωαρίων και αυξημένο ποσοστό ανώμαλων μορφών. Υπάρχει συνέργεια μεταξύ βακτηριακών και ιογενών ΣΜΝ. Η παρουσία βακτηρίων διευκολύνει την μετάδοση του HIV. Η ανοσοκαταστολή που προκαλεί το HIV χειροτερεύει την πορεία άλλων ΣΜΝ. 41
HIV Συνήθως χρησιμοποιούνται οι ορολογικές εξετάσεις (ευαισθησία και ειδικότητα >99 %) 3-12 εβδ μετά τη μόλυνση (συνήθως 4-6 εβδ): - ΕLISΑ - ανοσοφθορισμός Επίσης χρησιμοποιούνται: - ανίχνευση της p24 πρωτεΐνης του ιού με ELISA χρήσιμη τις πρώτες 3 εβδομάδες όταν δεν ανιχνεύονται τα αντισώματα - μοριακές τεχνικές: RT-PCR 42
Παρβοϊός B19 Η λοίμωξη («Πέμπτη νόσος») εμφανίζει ήπια κλινική εικόνα με πυρετό, μυαλγία, αδιαθεσία και τυπικό εξάνθημα 1-3 εβδομάδες μετά. Είναι συχνή στα παιδιά. Στην εγκυμοσύνη μπορεί να προκαλέσει σοβαρές επιπλοκές στο έμβρυο (ύδρωπας, αποβολή και ενδομήτριος θάνατος). Μετά την έναρξη των κλινικών συμπτωμάτων ανιχνεύονται IgM αντισώματα στο αίμα που παραμένουν για περίπου 3 μήνες. Συνήθως χρησιμοποιείται η μέθοδος ELISA. (Tolfvenstam et al, Clin Diagn Lab Immunol 3:147-150, 1996) 43
Παρωτίτιδα Ήπια, αυτοπεριοριζόμενη λοίμωξη της παιδικής και εφηβικής ηλικίας. Επιδιδυμορχίτιδα: αρκετά συχνή (20-30 %) επιπλοκή στείρωση ιάγνωση: - RT-PCR: ανίχνευση του RNA του ιού - Άμεσος ανοσοφθορισμός - Ορολογική διάγνωση: IgM & IgG με ELISA και έμμεσος ανοσοφθορισμός 44
Κυτταρομεγαλοϊός (CMV) ή ερπητοϊός 5 του ανθρώπου Ο CMV είναι ένας DNA ιός, πολύ διαδεδομένος στη φύση, με εκπληκτική ικανότητα να παρασιτεί στους ανθρώπους. Όταν ο CMV μολύνει ένα κύτταρο, το μέγεθος του κυττάρου αυξάνει (κυτταρομεγαλοϊός) και δημιουργούνται χαρακτηριστικά έγκλειστα, γνωστά ως «μάτια της κουκουβάγιας». Αποβάλλεται σε διάφορα βιολογικά υγρά (κολπικές εκκρίσεις, σπέρμα, μητρικό γάλα, ούρα, σίελο, δάκρυα, αίμα) και είναι λοιμογόνος για μεγάλα χρονικά διαστήματα. 45
Η λοίμωξη από CMV είναι η συχνότερη ιογενής συγγενής λοίμωξη στον άνθρωπο. Ο ιός ενοχοποιήθηκε και για υπογονιμότητα, επανειλημμένες αποβολές και πρόωρο τοκετό. Όσο νωρίτερα στην εγκυμοσύνη εμφανιστεί η λοίμωξη, τόσο χειρότερη θα είναι η έκβαση για το έμβρυο,, και η εγκυμοσύνη τελειώνει με αποβολή του εμβρύου ή με πρόωρο τοκετό. 46
Οι περισσότερες λοιμώξεις είναι ασυμπτωματικές ακόμα και στην οξεία φάση. Η απομόνωση του CMV στον ορό, η ανίχνευσή του με μοριακές τεχνικές (PCR), η ανίχνευση του pp-65 αντιγόνου και η κυτταροκαλλιέργεια αποτελούν μεθόδους ελέγχου της ιαιμίας και θεωρούνται καλύτεροι δείκτες για την διάγνωση της λοίμωξης. Ωστόσο, οι παραπάνω μέθοδοι : είναι τεχνικά πολύπλοκες είναι χρονοβόρες δεν ξεχωρίζουν: πρωτολοίμωξη ή ενεργοποίηση παλαιότερης λοίμωξης (Lazzarotto et al, 2004) 47
Οι ορολογικές δοκιμασίες (ανοσοενζυμικές και έμμεσος ανοσοφθορισμός) έχουν εξαιρετική σημασία για τη διάγνωση. Anti-CMV IgG IgG / IgM r Avidity CMV -Avidity Am mount of An ntibody o Anti-CMV IgM Primary infection Anti-CMV IgM Secondary Infection/ Reactivation Time of infection First CMV-M and G positive bleeds CMV-M positive (Secondary infection/reactivation) time 48
CMV: Απουσία Λοίμωξης CMV IgG CMV IgG CMV IgM Ερμηνεία Avidity Ασθενής 1 - - N/A Μη πρόσφατη/παλαιά Λοίμωξη* *δεν αποκλείει πολύ πρόσφατη λοίμωξη ή επαφή με τον ιό 49
CMV: Παλαιά Λοίμωξη CMV IgG CMV IgG CMV IgM Ερμηνεία Avidity Ασθενής 2 + - N/A Μη πρόσφατη Λοίμωξη 50
CMV: Ερμηνεία Θετικών IgG/IgM χωρίς avidity CMV IgG CMV IgG CMV IgM Ερμηνεία Avidity Ασθενής 3 + + Ασθενής 4 + + N/A N/A Πρώϊμη Λοίμωξη ή Επανενεργοποίηση; Πρώϊμη Λοίμωξη ή Επανενεργοποίηση;???? 51
Ο προσδιορισμός των anti-cmv IgG avidity πριν την 16η -18η εβδομάδα κυήσεως θα εντοπίσει όλες τις γυναίκες με συγγενή λοίμωξη του εμβρύου/νεογνού και έχει ευαισθησία 100 %. CMV IgG CMV IgG CMV IgM Ερμηνεία Avidity Ασθενής 3 + + Low Πρωτολοίμωξη Ασθενής 4 + + High Επανενεργοποίηση Patient 3 Patient 4 52
Ερυθρά (Rubella ή German measles) Είναι μια ήπια νόσος σε παιδιά και ενήλικες. Ωστόσο, έχει καταστροφικές συνέπειες όταν αφορά μόλυνση του εμβρύου τις πρώτες εβδομάδες της κύησης. Ο ιός της ερυθράς είναι RNA ιός, με μόνο ξενιστή τον άνθρωπο. Αν μία έγκυος γυναίκα προσβληθεί από ερυθρά στο πρώτο τρίμηνο της κύησης, υπάρχει περίπου 80-85 % κίνδυνος συγγενών ανωμαλιών, κατάσταση που ονομάζεται σύνδρομο συγγενούς ερυθράς (Best, 2007). 53
Ο ιός της ερυθράς Ο ιός ανιχνεύεται περίπου 7 μέρες πριν το εξάνθημα, όταν ξεκινά η ιαιμία,, μχρ μέχρι και 7-12 μέρες μρςμετά την εμφάνιση του εξανθήματος. Αυτό σημαίνει ότι ο ασθενής είναι μολυσματικός για πάνω από 2 εβδομάδες. Ωστόσο, μελέτες έδειξαν ότι ο ιός απομονώνεται από ρινοφάρυγγα, ΕΝΥ και ούρα για 23 μήνες. 54
Είναι σημαντικό να εντοπιστούν οι γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας χωρίς ανοσία στην ερυθρά. Συνήθως χρησιμοποιούνται ορολογικές εξετάσεις. Η ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό γίνεται με διάφορες εργαστηριακές δοκιμασίες (ELISA, έμμεσος ανοσοφθορισμός, αναστολή αιμοσυγκόλλησης και παθητική αιμοσυγκόλληση). 55
Έλεγχος αντισωμάτων Όταν υπάρχει υποψία ερυθράς σε κύηση κάτω των 16 εβδομάδων, ο προσδιορισμός των IgM και IgG στον ορό είναι ένας εύκολος τρόπος να αποκλειστεί ή να επιβεβαιωθεί η λοίμωξη, καθώς η γυναίκα αντιμετωπίζει την πιθανότητα διακοπής της κύησης. <12 εβδομάδες: διακοπή της κύησης 12-18 εβδομάδες: ο κίνδυνος μειώνεται >18 εβδομάδες: ο κίνδυνος είναι σχεδόν ανύπαρκτος 56
Τοξόπλασμα Toxoplasma gondii = υποχρεωτικά ενδοκυττάριο πρωτόζωο. Συνήθως η τοξοπλάσμωση είναι ασυμπτωματική και η διάγνωση βασίζεται κυρίως στα αποτελέσματα των ορολογικών εξετάσεων. Ο επιπολασμός των αντισωμάτων έναντι του τοξοπλάσματος κυμαίνεται μεταξύ 5 έως 95% του πληθυσμού και > 500 εκατομμύρια άνθρωποι είναι μολυσμένοι από τοξόπλασμα σε όλον τον κόσμο. 57
Η συχνότητα προσβολής του εμβρύου σχετίζεται με το στάδιο της κύησης κατά τη νόσηση της μητέρας. Ο κίνδυνος μόλυνσης του εμβρύου αυξάνεται με την πρόοδο της κύησης: - 15% για το πρώτο τρίμηνο - 30% για το δεύτερο τρίμηνο - 60% για το τρίτο τρίμηνο Οι επιπτώσεις της λοίμωξης σε έγκυες ασθενείς είναι πολλαπλές: αυτόματες αποβολές, πρόωρους τοκετούς ή διάφορες ανωμαλίες του εμβρύου. 58
Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Τα T. gondii-igg g αντισώματα παράγονται καθ όλη την διάρκεια της ζωής μετά από την λοίμωξη. Η ανίχνευση σε κάποιο δείγμα, σε οποιονδήποτε τίτλο, αποδεικνύει ότι η μόλυνση έχει αποκτηθεί κάποια στιγμή στο παρελθόν. Anti-Toxo IgG tive response Relat 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years time 59
Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Τα αντισώματα IgM ανιχνεύονται σε άτομα με πρόσφατη λοίμωξη, ενώ μπορεί να παραμείνουν για ένα έτος ή περισσότερο. Anti-Toxo IgG tive response Relat Anti-Toxo IgM 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years time 60
IgG avidity τεστ: ξεχωρίζουμε μία παλαιά από μία πρόσφατη λοίμωξη. Πρόσφατη λοίμωξη: αντισώματα με χαμηλό avidity (δεσμευτική ικανότητα) Παλαιά λοίμωξη: αντισώματα με υψηλή δεσμευτική ικανότητα Το IgG avidity τεστ είναι πολύ χρήσιμη δοκιμασία, κυρίως όταν έχουμε στη διάθεσή μας μόνο ένα δείγμα ορού. Anti-Toxo IgG Toxo IgG Avidity tive response Relat Anti-Toxo IgM 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years time 61
Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Υψηλού avidity IgG αντισώματα αναπτύσσονται περίπου 4 μήνες μετά τη λοίμωξη. Η παρουσία υψηλού avidity IgG φανερώνει ότι η λοίμωξη εκδηλώθηκε >4μήνες νωρίτερα. Έτσι, σε μία έγκυο στον πρώτο τρίμηνο, ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα των IgΜ, όταν υπάρχουν υψηλού avidity IgG, το έμβρυο δεν κινδυνεύει από συγγενή τοξοπλάσμωση. Anti-Toxo IgG Toxo IgG Avidity tive response Relat Anti-Toxo IgM 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years time 62
Το avidity τεστ δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί ποτέ μόνο του για την διάγνωση, αλλά πάντα σε συνδυασμό με τα IgΜ και IgG. Toxo IgG, IgM testing G- M- G+ M- G+ M+ G- M+ Μέτρα προφύλαξης Παλαιά λοίμωξη Toxo IgG avidity test Πρόσφατη (οξεία) λοίμωξη Επανάληψη κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης Δεν χρειάζονται άλλες εξετάσεις Υψηλό avidity Χαμηλό avidity Επανεξέταση μετά από 2-3 εβδομάδες Λοίμωξη >4 μήνες πριν Επανεξέταση μετά από 3 εβδομάδες Source: Congenital Diseases Learning Guide 63
Έλεγχος αντισωμάτων σε όλες τις γυναίκες πριν την εγκυμοσύνη! 64
Τριχομοναδική αιδιοκολπίτιδα Προκαλείται από το πρωτόζωο Trichomonas vaginalis. Μεταδίδεται με σεξουαλική επαφή και συνυπάρχει με HIV, χλαμύδια, γονόρροια. - άμεση μικροσκοπική εξέταση του νωπού παρασκευάσματος κολπικών εκκρίσεων σε φυσιολογικό ορό (σε 30 ): μορφολογία + κίνηση + παρουσία πολυμορφοπυρήνων -ph > 4,7 - δοκιμασία απελευθέρωσης αμινών με ΚΟΗ 10% = θετική - χρώσεις: Giemsa, πορτοκαλί της ακριδίνης, Leishman, PAS, Fontana - ανίχνευση τριχομοναδικών ρχ Ag με μονοκλωνικά Abs και φθορίζουσα χρωστική - κ/α σε υγρό θρεπτικό υλικό Diamond, 37 C, αεροβίως, 4 μέρες Στους άνδρες: ίζημα ούρων για νωπό και κ/α 65
Μυκητιακή κολπίτιδα Παρά τα σημαντικά θεραπευτικά επιτεύγματα, παραμένει ένα παγκόσμιο πρόβλημα που επηρεάζει όλα τα κοινωνικά στρώματα χωρίς διακρίσεις. Candida albicans: 85 95% 89% 80,2% C. glabrata: 3 5% 79% 7,9% 73% 7,3% C. parapsilosis 1,7% 1,6% C. tropicalis 1,4% 1,0% C. krusei, κ.ά. < 1% < 1% Vermitsky J, Self M, Chadwick S et al, J Clin Microbiol, 2008; 46:1501-3 Grigoriou i O, Baka S, Kouskouni E, Eur J Obstet t Gynecol RB, 2006;126:121-5 121 Κλινικά, οι κολπίτιδες που προκαλούνται από τα albicans ή non-albicans είδη δεν διαφέρουν μεταξύ τους. Ωστόσο, τα non-albicans είδη είναι πιο ανθεκτικά και είναι πιο δύσκολα στη θεραπεία. Συχνά τα non albicans είδη προκαλούν υποτροπιάζουσες λοιμώξεις. 66
Μυκητιακή κολπίτιδα Μικροβιολογική διάγνωση άμεσο νωπό άμεσο ξηρό Gram χρώση καλλιέργεια σε Sabouraud dextrose agar, 37 ο C, 24 48h, λευκές αποικίες 67
Μη ειδική κολπίτιδα (Bacterial vaginosis) Είναι η συνηθέστερη αιδιοκολπίτιδα. Χαρακτηρίζεται από: - δύσοσμη κολπική έκκριση (παραγωγή πολυαμινών από το μεταβολισμό των βακτηρίων) ) - ήπια φλεγμονή - συνήθως όχι πολυμορφοπύρηνα ρ - γαλακτοβακίλλων - αναερόβια (Bacteroides, Prevotella, Mobiluncus, Peptosteptococcus), p Gardnerella vaginalis και Mycoplasma hominis. 68
Μη ειδική κολπίτιδα Μικροβιολογική διάγνωση Κριτήρια Amsel: Χρειάζονται 3 από τα ακόλουθα 4: λεπτό, γκριζόασπρο έκκριμα ph του κόλπου 4,5 οσμή «ψαρίλας» στο κολπικό έκκριμα μετά από προσθήκη ΚΟΗ 10% παραγωγή πτητικών αμινών «clue cells» σε νωπό παρασκεύασμα (Amsel et al: Am J Med, 1983) 69
Κριτήρια Nugent (Nugent, J Clin Microbiol, 1991) Gram χρώση hpf=x1000 Αριθμός Βαθμός Αριθμός Βαθμός Αριθμός Βαθμός γαλακτοβακίλλων Gardnerella + Mobiluncus Prevotella >30/hpf 0 >30/hpf 4 >30/hpf 4 5-30/hpf 1 5-30/hpf 3 5-30/hpf 3 2-4/hpf 2 2-4/hpf 2 2-4/hpf 2 1-2/hpf 3 1-2/hpf 1 1-2/hpf 1 0/hpf 4 0/hpf 0 0/hpf 0 Αποτέλεσμα: 0-3: φυσιολογικό 4-6: ενδιάμεσο: πιθανή διάγνωση BV να αξιολογηθεί μαζί με κλινικά στοιχεία 6: παθολογικό: BV 70
Κριτήρια Hay/Ison (Hay and Ison, Sex Transm Infect, 2002) Gram χρώση Grade I: φυσιολογικό (επικράτηση των γαλακτοβακίλλων) Grade II: ενδιάμεσο (μικτή ανάπτυξη γαλακτοβακίλλων με άλλα είδη μικροβίων να αξιολογηθεί μαζί με κλινικά στοιχεία ή/και επανάληψη) Grade III: παθολογικό (απουσία ή ελάχιστοι γαλακτοβάκιλλοι + αυξημένο αριθμό G. vaginalis και άλλων ειδών μικροβίων) = BV 71
Προστατίτιδα Παραμένει ένα μεγάλο πρόβλημα των ουρολόγων: δύσκολη κλινική οντότητα. Στην κλασική του μονογραφία ο Stamey, το 1980, έγραψε ότι το 50% των ενηλίκων ανδρών θα εμφανίσουν συμπτώματα προστατίτιδας κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Σίγουρα παθογόνα Δυνητικά παθογόνα Εντεροβακτηριακά (κυρίως E. coli) Pseudomonas aeruginosa Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Cryptococcus neoformans (σε ασθενείς HIV θετικοί) Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus Κοαγκουλάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι Μυκοπλάσματα Αναερόβια Candida spp και άλλοι μύκητες Trichomonas vaginalis Ιοί 72