CanAg PSA EIA. Prod. No. 340-10. Μέθοδος Ενζυμικού ανοσοπροσδιορισμού

CanAg PSA EIA Prod. No. 340-10 Οδηγίες χρήσης Μέθοδος Ενζυμικού ανοσοπροσδιορισμού 2009-02 Για 96 προσδιορισμούς ΣΚΟΠΟΣ ΧΡΗΣΗΣ Το PSA EIA kit της CanAg αποσκοπεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του καρκινικού αντιγόνου PSA σε ανθρώπινο ορό. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Το PSA είναι μια μονή αλυσίδα γλυκοπρωτείνης σερίνης προτεάσης, μοριακού βάρους 32 kda, με ειδικότητα παρόμοια με της χυμοτρυψίνης, η οποία παράγεται απο το εκκριτικό επιθήλιο του αδένα του προστάτη (1). Σε φυσιολογικές συνθήκες το PSA εκκρίνεται στο σπερματικό υγρό και ρυθμίζει την διάσπαση σπερματικών προτεινών καθώς επίσης την ρευστοποίηση σπερματικών πηγμάτων (2). Σε φυσιολογικές καταστάσεις το PSA βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα στο αίμα. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις του PSA στον ορό υποδηλώνουν την ύπαρξη κάποιας παθολογικής κατάστασης του προστάτη, όπως, καλοήθη υπερπλασία του προστάτη και καρκίνο του προστάτη. Ο προσδιορισμός του PSA χρησιμοποιήται ευρέως στην ανίχνευση και παρακολούθηση ασθενών με καρκίνο του προστάτη και θεωρήται ο καλύτερος ορολογικός δείκτης για τον καρκίνο του προστάτη (3, 8). Το PSA σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με διαφορετικές αντιπροτεάσεις. Το κυρίαρχο μέρος του PSA σε ορούς ασθενών συναντάται σε μορφή συμπλοκου με την 1 -antichymotrypsin (PSA-ACT) (4). Ωστόσο, υπάρχουν μεγάλες διαφορές μεταξύ του free PSA και του PSA-ACT complex σε διαφορετικά άτομα. Μελέτες έχουν δείξει ότι η αναλογία του free PSA είναι μεγαλύτερη σε περιπτώσεις καλοήθους αθένειας του προστάτη σε σύγκριση με περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη (5). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην μέθοδο της CanAg PSA EIA, έχουν προσεχτικά δοκιμαστεί και επιλεχθεί έτσι ώστε να δίνουν την ίδια μοριακή αντίδραση τόσο για το free PSA όσο και για το PSA-ACT complex (7). Συνεπώς η CanAg PSA EIA ανιχνεύει και προσδιορίζει μια διαπιστωμένα ολική ( total ) PSA, ανεξάρτητα απο τις επι μέρους ατομικές αυξομειώσεις της free και της ACT-complexed PSA. 1

ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η CanAg PSAΕΙΑ είναι μια μή-ανταγωνιστική μέθοδος σταθεράς φάσης βασισμένη στην τεχνική direct sandwich. Οι βαθμονομητές / δείγματα αναφοράς, οι μάρτυρες και τα δείγματα των ασθενών, επωάζονται με βιοτυνιλυωμένο αντι- PSA μονοκλωνικό αντίσωμα και με horseradish peroxidase (HRP) labelled anti-psa monoclonal antibody μέσα σε σειρές από μικροπηγές επικαλυμένες με Στρεπταβιδίνη. Το PSA που εμπεριέχεται στους βαθμονομητές / μάρτυρες/ δείγματα, ασθενών αποροφάται στις αντίστοιχες μικροπηγές από το βιοτυνιλυωμενο Αντι- PSA MAb κατά την διάρκεια της επώασης. Στη συνέχεια, οι μικροπηγές πλένονται, (αφού πρώτα επωαστούν με σεσυμασμένο HRP αντι- PSA MAb). Μετά το πλύσιμο, το αντιδραστήριο Υπόστρωμα / Χρωμογόνο ( υπεροξείδιο του υδρογόνου και 3, 3, 5, 5 τετρα-μεθύλιο του βενζινιδίου) προστίθεται σε κάθε μικροπηγή και η ανάλογη ενζυμική αντίδραση λαμβάνει χώρα. Κατά την διάρκεια της ενζυμικής αντίδρασης ενα μπλέ χρώμα δημιουργείται σε παρουσία αντιγόνου. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη με την ποσότητα του PSA στα δείγματα. Η ένταση του χρώματος προσδιορίζεται σε σπεκτρο-φωτόμετρο μικροπλάκας στα 620 nm ( ή εναλλακτικά στα 405nm μετά την προσθήκη του διαλυματος παύσης). Καμπύλες αναφοράς / Βαθμονόμησης δημιουργούνται για καθε μέθοδο αποτυπόνωντας τις τιμές απορόφησης έναντι των τιμών συγκέντρωσης για κάθε δείγμα αναφοράς. Στην συνέχεια, οι συγκεντρώσεις του PSA στα εξεταστέα δείγματα υπολογίζονται απο την καμπύλη αναφοράς. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Κάθε CanAg PSA ΕΙΑ κιτ περιέχει ανιδραστήρια για 96 εξετάσεις. Η ημερομηνία λήξης του κιτ αναγράφεται στο εξωτερικό της συσκευασίας του. Μην χρησιμοποιήτε το κιτ μετά το πέρας της ημερομηνίας λήξης. Μην αναμιγνύετε αντιδραστήρια απο διαφορετικά κιτ. Αποθήκευση του κιτ στους +2 - +8 ºC. Οχι στην κατάψυξη. Τα ανοιγμένα / χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια παραμένουν σταθερά σύμφωνα με τον κάτωθι πίνακα εφ όσον δεν έχουν επιμολυνθεί, και έχουν φυλαχθεί στα προτότυπα φιαλίδια σύμφωνα με τις οδηγίες χρήσης. Επιστρέψτε τα χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια στους 2-8 C αμέσως μετα την χρήση τους. Αντιδραστήριο Ποσότητα Αποθήκευση και σταθερότητα μετα την πρώτη χρήση Μικροπλάκα στρεπταβιδίνης 1 Μικροπλάκα 2-8 ºC εως την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης 12 x 8 αποσπαζόμενες πηγές επικαλυμένες με στρεπταβιδίνη. Αφού ανοιχτούν, επιστρέψτε αμέσως τα αχρησιμοποίητα strips πηγές στην συσκευασία αλουμινίου και επανασφραγήστε την προσεχτικά έτσι ώστε να διατηρούνται άνυδρα. 2

Αντιδραστήριο Ποσότητα Αποθήκευση και σταθερότητα μετα την πρώτη χρήση Βαθμονομητές PSA 6 φιαλίδια 2 8 C εως την αναγραφόμενη ημερομηνία 0 g/l 1 x 0.75 ml 1 g/l 1 x 0.75 ml 2 g/l 1 x 0.75 ml 10 g/l 1 x 0.75 ml 30 g/l 1 x 0.75 ml 60 g/l 1 x 0.75 ml Το αντιγόνο PSA είναι ενα Tris-HCl buffered διάλυμα (άλατος), που περιέχει λευκωματίνη βοειδούς ορού, μια δραστική κίτρινη χρώση και 0.01 % methyl-isothiazolone (MIT) ως συντηρητικό. Ετοιμο προς χρήση. Μάρτυρες PSA 2 φιαλίδια 2 8 C εως την αναγραφόμενη ημερομηνία 1 x 0.75 ml 1 x 0.75 ml Το ανθρώπινο PSA είναι ενα Tris-HCl buffered διάλυμα (άλατος), που περιέχει λευκωματίνη βοειδούς ορού, και 0.01 % methyl-isothiazolone (MIT) ως συντηρητικό. Ετοιμο προς χρήση. Biotin Anti-PSA 1 x 15 ml 2 8 C εως την αναγραφόμενη ημερομηνία Βιοτυνιλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα Biotin Anti-PSA (απο ποντίκι), περίπου 1 µg/ml. Περιέχει phosphate buffered διάλυμα (ph 7.2), παρουσία λευκωματίνης βοειδούς ορού και ανοσοσφαιρινων και 0.01% methylisothiazolone (MIT) ως συντηρητικό. Ετοιμο προς χρήση. 3

Αντιδραστήριο Ποσότητα Αποθήκευση και σταθερότητα μετα την πρώτη χρήση Ανιχνευτής(Tracer), 1 x 0.75 ml 2-8 ºC εως την αναγραφόμενη HRP Anti-PSA ημερομηνία λήξης Διάλυμα stock μονοκλωνικού αντισώματος HRP Anti- PSA απο ποντίκι, περίπου 20 µg/ml. Περιέχει συντηριτικά.απαιτείται πρόσμιξη με Biotin Anti-PSA πριν την χρήση του. Υπόστρωμα TMB HRP 1 x 12 ml 2-8 ºC εως την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης Ετοιμο προς χρήση. Περιέχει buffered υπεροξείδιο του υδρογόνου και 3, 3', 5, 5' τετρα-μέθυλ-βενζιδίνη (TMB). Διάλυμα Παύσης 1 x 15 ml 2-8 ºC εως την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης Ετοιμο προς χρήση. Περιέχει 0.12 M υδροχλωρικού οξέως Διάλυμα Πλύσεως 1 x 50 ml 2-8 ºC εως την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης Απαιτείται αραίωση με νερό Χ25 πρίν την χρήση του. Ενα Tris-HCl buffered διάλυμα με Tween 20. Περιέχει Germall II ως συντηρητικό. 4

Ενδείξεις αστάθειας Το Υπόστρωμα-TMB HRP πρέπει να είναι άχρωμο ή ελαφρώς μπλέ. Ενα έντονο μπλέ χρώμα υποδηλώνει πιθανή επιμόλυνση του αντιδραστηρίου και δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Για in vitro διαγνωσική χρήση Για επαγγελµατική χρήση, µόνο Παρακαλούμαι όπως επικαλεστείτε τις οδηγίες ασφαλούς λειτουγίας των εργαστηρίων του Τμήματος Υγείας και Ανθρωπινων Υπηρεσιών των Η.Π.Α.(U.S. Department of Health and Human Services) (Bethesda, Md., USA) αριθμός έκδοσης (CDC) 88 8395, ή οποιοδήποτε άλλο κατά τόπους σχετικό Εθνικό κανονισμό. Μεταχειριστήτε όλα τα δείγματα ως μολυσμένα. Ακολουθείστε τις κατά τόπου οδηγίες για απομάκρυνση άχρηστου υλικού. Προσοχή Ολα τα υλικά που χρησιµοποιούται για την παρασκευή αντιδραστηρίων ανθρώπινης προέλευσης έχουν εξετασθεί και έχουν ßρεθεί αρνητικά για HIV-1/2 Αντίσωµα (Ab), HCV Αντίσωµα (Ab) και Ηπατίτιδας B Αντιγόνο Επιφανειας (Hepatitis B Surface Antigen) (HBsAg). Εφ όσον δεν υπάρχει µέθοδος ικανή να αποκλείσει απόλυτα την παρουσία αιµατολογικών / µολυσµατικών ασθενειών, ο τρόπος µεταχείρισης και η αποµάκρυνση αντιδραστηρίων ανθρώπινης προέλευσης αυτού του συγκεκριµένου προίοντος, πρέπει να είναι ίδιος µε αυτόν που ακολουθείται για µολυσµένα δείγµατα. ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Η μέθοδος CanAg PSAEIA εφαρμόζεται σε ορό. Συλλέξτε το αίμα με φλεβοκέντηση και διαχωρίστε τον ορό σύμφωνα με τις γνωστές διαδικασίες. Τα δείγματα μπορούν να φυλαχθούν στους 2 8 C για 48 ώρες. Για μακρύτερη περίοδο συντήρησης, αποθηκεύστε στους -20 C. Αποφύγετε την αποθήκευση των δειγμάτων σε self-defrosting καταψύκτη, καθώς επίσης την επαναλαμβανόμενη ψύξη-απόψυξη των δειγμάτων πριν την ανάλυση. Μετα την βραδεία απόψυξη των δειγμάτων κατά την διάρκεια της νύχτας στους 2 8 C τα δείγματα επαναφέρονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν την ανάλυση. Αυξημένα επίπεδα PSA παρατηρούνται κατόπιν μεθόδευσης και χειρισμού του προστάτη (manipulation of the prostate). Επομένως, προτείνεται η συλλογή αίματος πρίν από την δακτυλική ορθική εξέταση (digital rectal examination). Κατόπιν εγχείρησης του προστάτη, βιοψίας με βελόνα ή εκτομή της ουρήθρας (transurethral resection), προτείνεται η αναμονή > 6 εβδομάδων πριν απο την συλλογή αίματος για την εξέταση του PSA (8). Πρέπει να δωθεί ιδιαίτερη προσοχή στο ότι η θεραπεία του BPH με Finasteride μειώνει τα επίπεδα του PSA (8). 5

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Απαραίτητα υλικά που δεν παρέχει το kit 1. Αναδευτήρας Μικροπλάκας Η ανάδευση πρέπει να είναι μέτρια προς έντονη. Διαμηκης ανάδευση κατά προσέγγιση 200 κρούσεις/min, ταλαντώσεις 700 900/min. 2. Πλυστικό Μικροπλάκας Αυτόματο πλυστικό μικροπλάκας ικανό να εκτελεί 1,3 και 6 κύκλους πλύσεως, ή ημί-αυτόματο πλυστικό μικροπλάκας συνδεδεμένο σε αντλία κενού και σε αναροφητήρα υγρών για κατακράτηση αποροφηθέντωναναροφηθέντων υγρών. Σε περίπτωση που δεν χρησιμοποιήται ενα άλλο αυτόματο πλυστικό σύστημα, προτείνεται το Πλυστικό Nunc Immuno-8. 3. Σπεκτροφωτόμετρο Μικροπλάκας Με μήκος κύμματος 620 nm και/ή 405 nm, και φάσμα απορόφησης απο 0 εως 3.0. 4. Πιπέτες ακριβειας Με αντικαταστήσιμα (μιας χρήσης) πλαστικά ρύγχοι για διανομή μικροποσοτητων. Μια οκτακάναλη ( 8- channel pipette) ή επαναληπτική πιπέτα με αντικαταστήσιμα (μιας χρήσης) πλαστικά ρύγχοι για διανομή 100 µl είναι χρήσιμη αλλά όχι απαραίτητη. Πιπέτες για διανομή όγκων-ποσοτήτων σε χιλιοστόλιτρα (ml). 5. Απεσταγμένο ή απεϊονισμένο νερό Για την προ-αραίωση των διαλυμάτων πλύσης. ΔΙΑΔΙΚΑΣΤΙΚΕΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ 1. Απαιτείται λεπτομερής κατανόηση των οδηγιων χρήσεως της συγκεκριμένης συσκευασίας για την σωστή εφαρμογή της μεθόδου CanAg PSA EIA kit. Τα αντιδραστήρια που προμηθεύονται με το kit αποσκοπούν στην χρήση μιας άρτιας μονάδας. Μην αναμιγνύετε πανομοιότυπα αντιδραστήρια απο kits με διαφορετικά lot numbers. Μην κάνετε χρήση του kit μετά το πέρας της ημερομηνίας λήξης που αναγράφεται στο εξωτερικό της συσκευασίας του. 2. Τα αντιδραστήρια πρέπει να έχουν θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) πρίν την χρήση τους. Απαιτείται εφαρμογή της μεθόδου σε θερμοκρασίες μεταξύ 20 25 C για την εξασφάλιση ακριβών αποτελεσμάτων. Απαιτείται ήπια και σχολαστική ανάδευση των κατεψυγμένων ορών μετά την απόψυξή τους. 3. Πριν την διανομή των δειγμάτων αναφοράς/βαθμονομητών και δειγμάτων ασθενών στις μικροπηγές, προτείνεται η σύμανση-αρίθμηση των strips για την ευκολότερη αναγνώριση των δειγμάτων κατά την διάρκεια και μετά το πέρας της ανάλυσης. 4. Απαιτείται σχολαστική πλύση των strips. Βεβαιωθήτε ότι η κάθε πηγή είναι εντελώς γεμάτη, ότι η αναρόφηση των πηγών μεταξύ και μετά τις πλύσεις είναι πλήρης και ότι οι πηγές είναι άδειες. Σε 6

περίπτωση που εχει παραμείνει υγρασία, αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και κτυπήστετην προσεκτικά σε αποροφητικό χαρτί. Αυτόματο πλυστικό strip: Ακολουθήστε τις οδηγίες συντήρησης του κατασκευαστή και εκτελέστε τον απαιτούμενο αριθμό κύκλων πλύσης πριν και μετά απο κάθε επώαση. Το διάλυμα πλύσης δεν πρέπει να μένει στην συσκευή αναρόφησης /πλύσης για μεγάλα χρονικά διαστήματα, καθ ότι οι βελόνες του μπορεί να φράξουν, έχοντας έτσι μειωμένη λειτουργική ικανότητα 5. Η χρήση του κρίνεται σκόπιμη απαραίτητη σε υπερευαίσθητες μετρήσεις, μόνον. Παρακαλούμε όπως κοιτάξτε την Επιλογή 2 στην σελίδα 8 για περισσότερες πληροφορίες 6. Το Υπότρωμα-TMB HRP είναι ευαίσθητο στην επιμόλυνση. Για την βέλτιστη σταθερότητα του TMB HRP-Substrate, μεταφέρτε απο το φιαλίδιο την απαιτούμενη ποσότητα σε ένα καθαρό αντικαταστήσιμο (μιας χρήσης) πλαστικό δοχείο απόθεσης, έτσι ώστε να αποφευχθεί η επιμόλυνση του αντιδραστηρίου. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιήτε καθαρά πλαστικά ρύγχοι (pipette tips) μιας χρήσης. 7. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιήτε καθαρά πλαστικά ρύγχοι (pipette tips) μιας χρήσης όταν χειρίζεστε δείγματα και αντιδραστήρια. Αποφύγετε συνεχόμενα λάθη (carry-over), κρατώντας το ρύγχος της πιπέτας λίγο πιο πάνω από την πηγή και αποφεύγοντας την επαφή με το πλαστικό strip ή με την επιφάνεια του υγρού. Η σωστή εφαρμογή και λειτουργία της πιπέτας έχει ιδιαίτερη σημασία οταν χειρίζεστε το διάλυμα TMB HRP-Substrate. Προπαρασκευή αντιδραστηρίων Σταθερότητα προπαρασκευασμένων αντιδραστηρίων Διάλυμα Πλύσης 2 εβδομάδες στους 2 25 C σε σφραγισμένη συσκευασία Μεταφέρτε τα 50 ml του αναραίωτου διαλύματος Πλύσης σε ένα καθαρό δοχείο και αραιώστε το Χ25 προσθέτωντας 1200 ml απεσταγμένου νερού (buffered Wash Solution). Διάλυμα Ανιχνευτού (Tracer working solution) 3 εβδομάδες στους 2 8 C σε σφραγισμένη συσκευασία Προπαρασκευάστε την απαιτούμενη ποσότητα του of Antibody Solution αναμιγνύοντας 50 µl του Tracer, HRP-Anti PSA με 1 ml Biotin Anti-PSA ανα strip (see table below and the Protocol Sheet). 7

No. of Tracer, HRP Anti-PSA Biotin Anti-PSA Strips (µl) (ml) 1 50 1 2 100 2 3 150 3 4 200 4 5 250 5 6 300 6 7 350 7 8 400 8 9 450 9 10 500 10 11 550 11 12 600 12 Απαιτείται η χρήση καθαρού πλαστικού ή υάλινου κυλίνδρου για την προετοιμασία του Διαλύματος (Antibody Solution) Εναλλακτικά: Μεταφέρτε το περιεχόμενο του Ανιχνευτή (Tracer), HRP Anti- PSA μέσα στο φιαλίδιο του Biotin Anti-PSA και αναδεύστε ελαφρά. Βεβαιωθείτε ότι όλο το περιεχόμενο του Ανιχνευτή (Tracer), έχει μεταφερθεί στο φιαλίδιο του Biotin Anti-PSA. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Διάλυμα Ανιχνευτή (Antibody Solution) παραμένει σταθερό για 3 εβδομάδες στους 2 8 C. Μην προπαρασκευάσετε περισσότερη ποσότητα Διαλύματος Ανιχνευτή απο την αναγκαία και βεβαιωθείτε για την σωστή του αποθήκευση. Μεθοδολογία Κάντε την κάθε μέτρηση εις διπλούν για τους βαθμονομητές και για τα δείγματα ασθενών. Απαιτείται καμπύλη αναφοράς βαθμονόμησης για κάθε ανάλυση - μέτρηση. Ολα τα αντιδραστήρια και δείγματα πρέπει να έχουν θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) πρίν την χρήση τους. 1. Αρχίστε με την προπαρασκευή των Διαλυμάτων Πλύσης και Ανιχνευτή. Απαιτείται η χρήση καθαρών δοχείων. Ακολουθείστε προσεκτικά τις οδηγίες χρήσης. 2. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό μικροπηγών strips στο αντίστοιχο πλαίσιο. (Επιστρέψτε άμεσα τα υπόλοιπα strips στην συσκευασία τους (απο αλουμίνιο με αφυγραντική ουσία) και επανασφραγίστε προσεκτικά). Πλύνετε το κάθε strip μα φορά με το Διάλυμα Πλύσης. Μην πλύνετε περισσότερα strips απο όσα μπορείτε να χειριστήτε σε 30 min. 3. 25 µl των Βαθμονομητών του PSA (CAL 0, 2,10, 30, 60), των μαρτύρων του PSA (C ) και των δειγμάτων προς εξέταση (άγνωστα-unk) διανέμονται στις πηγές των strip σύμφωνα με το κάτωθι πλάνο: 8

A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 etc Cal Cal Unk2 0 60 Cal Cal etc 0 60 Cal C1 2 Cal C1 2 Cal C2 10 Cal C2 10 Cal Unk1 30 Cal Unk1 30 4. 100 µl του βιοτυνιολυωμενου (Biotin) Anti-PSA προστίθονται σε κάθε πηγή χρησιμοποιώντας μια πιπέτα ακριβείας των 100 µl (ή μια 8-κάναλη πιπέτα ακιβείας των 100 µl). Αποφύγετε συνεχόμενα λάθη (carryover), κρατώντας το ρύγχος της πιπέτας λίγο πιο πάνω από την πηγή και αποφεύγοντας την επαφή με το πλαστικό strip ή με την επιφάνεια του υγρού. 5. Ακολουθεί επώαση της μικροπλάκας για 1 ώρα (± 10 min) σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) με σταθερή ανάδευση σε έναν αναδευτήρα μικροπλάκας. 6. Μετά την πρώτη επώαση ακολουθεί αναρόφηση και πλύση του κάθε strip 6 φορές, σύμφωνα με τις Διαδικαστικές Σημειώσεις, παράγραφος 4. 7. 100 µl του TMB HRP-Substrate προστίθονται σε κάθε πηγή, ακολουθώντας την ίδια διαδικασία με την παράγραφο 4. Η προσθήκη του TMB HRP-Substrate πρέπει να γίνεται το δυνατό συντομότερο έτσι ώστε η διαφορά χρόνου μεταξύ της πρώτης και τελευταίας προσθήκης να μην ξεπερνά τα 5 min. 8. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά (± 5 min) σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) με σταθερή ανάδευση. 9. Αμέσως μετά μετρήστε την απορόφηση στα 620 nm σε ενα σπεκτροφωτόμετρο μικροπλάκας. Εναλλακτική Νο1 Εάν το εργαστήριο δεν έχει πρόσβαση σε σπεκτροφωτόμετρο μικροπλάκας με δυνατότητα μέτρησης στα 620 nm, η απορόφηση μπορεί να προσδιοριστεί όπως περιγράφεται κάτωθι: 100 µl Διαλύματος Παύσης προστίθονται, αναμιγνύονται και μέσα σε 15 min μετρείται η απορόφηση στα 405 nm σε ενα σπεκτροφωτόμετρο μικροπλάκας. Εναλλακτική Νο2 Για την υπερευαίσθητη μέτρηση του PSA στην μικρή κλίμακα (0-10 µg/l), κρίνεται απαραίτητη η χρήση του (1 µg/l) στην καμπύλη βαθμονόμησης. Στην συνέχεια κρίνεται απαραίτητη η αφαίρεση των δύο υψηλότερων βαθμονομητών (30 and 60 µg/l). Οι μετρήσεις απορρόφησης θα πρέπει να εκτελούνται σύμφωνα με την εναλλακτική Νο.1, αλλά μετρώντας στα 450 nm. 9

Ορια διακύμανσης της Μέτρησης Η μέθοδος PSA EIA της CanAg προσδιορίζει συγκεντρώσεις μεταξύ 0.1 και 60 µg/l. Στην περίπτωση που αναμένονται συγκεντρώσεις του PSA μεγαλύτερες απο τα όρια διακύμανσης της μεθόδου, προτείνεται η προαραίωση των δειγμάτων με ανθρώπινο (αρσενικού φύλου) φυσιολογικό ορό. Σημείωση: Τα επίπεδα της ενδογενούς συγκέντρωσης του PSA στον φυσιολογικό ορό που χρησιμοποιείται για προαραίωση πρέπει να είναι γνωστά. (βλέπε Υπολογισμός αποτελεσμάτων ) Ποιοτικός Ελεγχος Προτείνεται η χρήση τών PSA Μαρτύρων 1 και 2 για την αξιολόγηση της μεθόδου. Το όριο διακύμανσης των αναμενώμενων τιμών αναγράφεται στις ετικέτες των φιαλιδιων. Στην περίπτωση που οι τιμές αποκλίνουν απο τα όρια διακύμανσης, προτείνεται επανέλεγχος των αντιδραστηρίων, των χαρακτηριστικών μέτρησης και επανάληψη της μεθόδου. Επίσης προτείνεται η παρασκευή δεξαμενής ορού απο το κάθε εργαστήριο, σε διαφορετικά επίπεδα ως ποιοτικοί μάρτυρες, για την καθημερινή εξασφάλιση ποιότητας των αποτελεσμάτων. Δείγματα Αναφοράς Σαν πρότυπο δείγμα αναφοράς μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο 1 ος Διεθνής Βαθμονομητής 96/670. Οι συγκεντρώσεις των βαθμονομητών και των μαρτύρων της CanAg PSA EIA προσδιορίστηκαν έναντι ενός συνόλου απο εσωτερικά προπαρασκευασμένα πρότυπα δείγματα αναφοράς συμβατά με τον 1 ο Διεθνή βαθμονομητή. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Στην περίπτωση που χρησιμοποιήται φασματοφωτόμετρο με ενσωματωμένο υπολογιστή, επικαλεστείτε τις οδηγίες χρήσης του για την δημιουργία βάσης δεδομένων και προγράμματισμού σύμφωνα με τις τιμές συγκέντρωσης που αναγράφονται σε κάθε βαθμονομητή PSA. Για τον αυτόματο υπολογισμό των αποτελεσμάτων του PSA, προτείνεται η χρήση των κάτωθι /εξής μεθόδων: Κυβική πολυώνυμη πράξη υπολογισμού καμπύλης (Cubic spline curve fit method). Στην καμπύλη αυτή είναι απαραίτητη η παρουσία του Βαθμονομητή 0 με την τιμή 0 µg/l. Πολυώνυμη πράξη υπολογισμού ομαλής καμπύλης (Spline smoothed curve fit method). Ο Βαθμονομητής 0 χρησιμοποιήται ως τυφλό δείγμα (plate blank). Αξιολόγηση με παρεισαγωγή σημείων.στην καμπύλη αυτή είναι απαραίτητη η παρουσία του Βαθμονομητή 0 με την τιμή 0 µg/l. Δευτεροβάθμια πράξη υπολογισμού καμπύλης (Quadratic curve fit method). Στην καμπύλη αυτή είναι απαραίτητη η παρουσία του Βαθμονομητή 0 με την τιμή 0 µg/l. Σημείωση: Μεθοδοι αξιολόγησης όπως η Τετραπαραμετρική (4 Parametric) ή η Ευθύγραμμη απόκλιση εξαρτημένης στατιστικής μεταβλητής (Linear regression), δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Για ημί-αυτόματη αξιολόγηση, η δημιουργία Καμπύλης Αναφοράς γίνεται με την αποτύπωση των τιμών απορόφησης (A) για κάθε βαθμονομητή του PSA έναντι των αντίστοιχων συγκεντρώσεων του PSA (σε µg/l),(βλέπε κάτωθι σχήμα). Στην συνέχεια οι άγνωστες συγκεντρώσεις του PSAκαταγράφονται απο την καμπύλη αναφοράς/βαθμονόμησης, χρησιμοποιώντας την μέση τιμή απορόφησης για κάθε δείγμα ασθενούς του PSA. 10

Παράδειγμα αποτελεσμάτων Specimen Calibrator Mean abs PSA values value (A) (µg/l) 0 µg/l 0.036 2 µg/l 0.174 10 µg/l 0.705 30 µg/l 1.807 60 µg/l 2.864 Specimen A 0.453 6.1 Specimen B 1.739 28.6 Παράδειγμα, μην χρησιμοποιήτε την καμπύλη αυτή για αξιολόγηση αποτελεσμάτων. Υπολογισμός αποτελεσμάτων με αραιωμένα δείγματα Δείγματα στα οποία βρέθηκαν επίπεδα PSA μεγαλύτερα του 60 µg/l, κρίνεται απαραίτητη η αραίωσή τους 1/10 με ανθρώπινο φυσιολογικό ορό για την εξασφάλιση ακριβών αποτελεσμάτων. Σημείωση: Τα επίπεδα της ενδογενούς συγκέντρωσης του PSA στον φυσιολογικό ορό που χρησιμοποιείται για προαραίωση πρέπει να είναι γνωστά. 11

Η συγκέντρωση του PSA στο αναραίωτο δείγμα υπολογίζεται ως εξής : Dilution 1/10: 10 x ([PSA] Diluted sample -(0.9x [PSA] Normal male serum )) ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Τα επίπεδα του PSA δεν είναι ικανά να καταδείξουν με απόλυτη βεβαιώτητα την παρουσία ή απουσία κακοήθους ασθένειας και ως εκ τούτου η εξέταση του PSA δεν πρέπει να χρησιμοποιήται μεμονομένα στην διάγνωση του καρκίνου. Τα αποτελέσματα της εξέτασης πρέπει να αξιολογούνται σε συνάρτηση με άλλες διαγνωστικές μεθόδους και διαδικασίες και κατά συνέπεια ο εργαστηριακός έλεγχος του PSA δεν είναι ικανός να αντικαταστήσει τεκμηριωμένες κλινικές εξετάσεις. Οι βαθμονομητές της CanAg PSA EIA δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται σε μελέτες ανάκτησης (recovery studies) του PSA. Σε τέτοιες περιπτώσεις προτείνεται η χρήση εξαιρετικά υψηλών δειγμάτων ασθενών. Αντισώματα έναντι των αντιδραστηρίων (human anti-mouse antibody (HAMA) ή ετερόφυλλα αντισώματα), μπορούν περιστασιακά να αναπτυχθούν στο δείγμα του ασθενούς και να παρέμβουν στην ανάλυση, παρά την παρουσία δεσμευτικών παραγόντων στα buffer. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ Υγιής άτομα (αρσενικού φύλου) έχουν φυσιολογικές τιμές PSA κάτω απο 4 µg/l. Ωστόσο, καθώς τα επίπεδα του PSA αυξάνονται με την ηλικία, προτείνεται η χρήση μιας κλίμακας σύμφωνα με την ηλικία, έτσι ώστε να αυξηθεί η ευαισθησία στα νεαρά άτομα και αντίστοιχα η ειδικότητα στα άτομα μεγαλύτερης ηλικίας (6, 8). Προτείνεται το κάθε εργαστήριο να ορίσει τις δικές του φυσιολογικές τιμές σύμφωνα με τους κατά τόπους περιβαλοντολογικούς παράγοντες, όπως η δίαιτα, το κλίμα, οι συνθήκες διαβίωσης, η επιλογή ασθενών, κτλ. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Δοσολογία (Dose-response) και στατιστικά χαρακτηριστικά Μια χαρακτηριστική καμπύλη αναφοράς σε συνδυασμό με στατιστικά χαρακτηριστικά της μεθόδου PSA EIA kit της CanAg παρουσιάζονται παρακάτω. Τα στατιστικά χαρακτηριστικά είναι αποτέλεσμα τυχαίας διανομής βαθμονομητών σε πηγές μικροπλάκας, n = 10. 12

Ακρίβεια Ο ορισμός της απόλυτης ακρίβειας έγινε σύμφωνα με το NCCLS οδηγία EP5-A (9) χρησιμοποιώντας τέσσερα επίπεδα δεξαμενής κατεψυγμένου ανθρωπινου ορού και με την προσθήκη PSA και με την χρήση έξι διαφορετικών συνδυασμών των ανιδραστηρίων της μεθόδου CanAg PSA EIA. Εγινε τυχαία διανομή εις διπλούν του κάθε δείγματος (n=2/ανάλυση) και ακολούθησε ανάλυση δύο φορές την ημέρα για 20 ημέρες. Sample Replicates Mean g/l) Within-run SD ( g/l) Within-run CV % Between-day SD ( g/l) Between-day CV % PSA 1 80 1.42 0.04 2.7 0.03 2.2 PSA 2 80 5.92 0.13 2.2 0.06 1.0 PSA 3 80 14.2 0.35 2.5 0.12 0.8 PSA 4 80 39.2 0.60 1.5 0.60 1.5 Ορια Ανίχνευσης Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου PSA EIA της CanAg ορίστηκε σε < 0.1 g/l, σύμφωνα με την συγκέντρωση που ανταποκρίνεται στην μέση τιμή της απορόφησης του βαθμονομητή 0 του PSA σύν 2 σταθερές απόκλισης σε συνάρτηση με τον κάτωθι τύπο: 2 x SD CAL 0 OD CAL 2 - OD CAL 0 x 2 g/l 13

Ανάκτηση (Recovery) Εγινε προπαρασκευή δειγμάτων ορού (Spiked serum samples), με την προσθήκη διαφορετικών ποσοτητων ανθρώπινου αντιγόνου PSA σε φυσιολογικά δείγματα ορού. Η ανάκτηση του αντιγόνου διακυμάνθυκε στο +10% της αναμενόμενης τιμής. Σημείωση: Μελέτες ανάκτησης δεν πρέπει να γίνονται με τους βαθμονομητές του συγκεκριμένου Κιτ. Φαινόμενο Προζώνης Δεν παρατηρήθηκε φαινόμενο προζώνης σε δείγματα με συγκεντρώσεις μέχρι και 23000 µg/l. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Σε δείγματα με υψηλές συγκεντρώσεις το χρώμα του υποστρώματος αλλάζει απο μπλέ σε πράσινο (και σε εξαιρετικά υψηλά δείγματα σε κίτρινο). Αυτό οδηγεί σε ψευδώς χαμηλές αποροφήσεις στα 620 nm, και σε εξαιρετικές περιπτώσεις η απορόφηση μπορεί να μετρηθεί μέσα στα όρια διακύμανσης της καμπύλης αναφοράς/βαθμονόμησης και να καταγραφεί ως φαινόμενο προζώνης. Γραμμικότητα Εγινε ανάλυση σε προαραιωμένα δείγματα ασθενών με ανθρώπινο φυσιολογικό ορό. Οι τιμές τους διακυμάνθυκαν στο +10% της αναμενόμενης τιμής. Ειδικότητα Τα συγκεκριμένα μονοκλωνικά αντισώματα PSA10 και PSA66, απομονώνουν τούς δυο ανεξάρτητους επίτοπους στο PSA-ACT complex και στο free PSA. Ο συγκεκριμένος συνδυασμός αντισωμάτων παρέχει μια ισομοριακή αντίδραση για το free PSA κα το PSA-ACT complex (7). Εφαρμόστηκε η οδηγία EP7-P του NCCLS (10) για τον προσδιορισμό πιθανών παρεμβολών. Δοκιμάστηκαν οι κάτωθι ουσίες σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις και δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες αντιδράσεις με την μέθοδο. Λιπαιμία (Intralipid ) Χολερυθρίνη, αδέσμευτη Αιμοσφαιρίνη Συγκέντρωση χωρίς σημαντική (± 10%) παρεμβολή 10 mg/ml 0.6 mg/ml 5 mg/ml Σύγκριση Μεθόδων Εγινε συγκριτική μελέτη της μεθόδου CanAg PSA EIA (Prod. No. 340-10) με την two-step CanAg PSA EIA (300-10). Μετρήθηκαν τριακόσια οχτώ δείγματα ανθρώπινου ορού με τιμές από 0 εως 53µg/L και οι ανάλογες αναλύσεις γραμμικότητας έδειξαν τα κάτωθι: [PSA] Prod. No. 340-10 = 0.92 x [PSA] Prod. No. 300-10 0.036 r =1.00 14

ΕΓΓΡΑΦΗ ΕΓΓΥΗΣΗ Η παρουσίαση και απόδοση των δεδομένων έγινε σύμφωνα με την προτεινόμενη μεθοδολογία. Οποιαδήποτε αλλαγή ή παραποίηση της προτεινόμενης από την Fujirebio Diagnostics μεθοδολογίας μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα, εις την οποία περιπτωση η Fujirebio Diagnostics αποποιήται όλων των εγγυήσεων, γραπτών ή προφορικών (implied or statutory),συμπεριλαμβανομενης και της εγγύησης για εμπορευματοποίηση και καταλληλότητα χρήσης. 15

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM (1979). Purification of a human prostate specific antigen. Invest Urol 17: 159 163. 2. Lilja H. (1985). A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Invest 76: 1899 1903. 3. Oesterling JE (1991). Prostate specific antigen: A critical assessment of the most useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate. J Urology 145: 907 923. 4. Lilja H., Christensson A., Dahlén U., Matikainen M-T, Nilsson O., Pettersson K., Lövgren T. (1991). Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with 1 -antichymotrypsin. Clin Chem 37: 1618 1625. 5. Christensson A., Björk T., Nilsson O., Dahlén U., Matikainen M-T., Cockett ATK, Abrahamsson PA, Lilja H. (1993). Serum prostate specific antigen complexed to 1 -antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. J Urology 150: 100 105. 6. Oesterling JE., Cooner WH., Jacobsen SJ., Guess HA., Lieber MM. (1993). The influence of patient age on the serum prostate specific antigen concentration: An important clinical observation. Urol Clin North Am 20: 671 80, 1993a. 7. Nilsson O., Peter A. Andersson I., Nilsson K., Grundström B., and Karlsson B. (1997) Antigenic determinants of prostatespecific antigen (PSA) and development of assays specific for different forms of PSA. Br J Cancer 75(6): 789 797. 8. P Price C., Allard J., Davies G., Dawnay A., J Duffy M., France M., Mandarino G., Milford Ward A., Patel B., Sibley P. and Sturgeon C. Pre-and post-analytical factors that may influence use of serum prostate specific antigen and its isoforms in a screening programme for prostate cancer. Ann Clin Biochem 2001; 38: 188 216. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A (1999). 10. National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation Protocols for Interference Testing, Evaluation protocol Number 7, Vol. 6, No 13, August (1986) 16

CanAg είναι σήμα κατατεθέν της Fujirebio Diagnostics AB Fujirebio Diagnostics AB Elof Lindälvs gata 13 PO Box 121 32 SE-402 42 Göteborg Sweden Phone + 46 31-85 70 30 Fax + 46 31-85 70 40 info@fdab.com www.fdab.com CanAg PSA EIA Prod. No 340-10 GR, 2009-02. F5704, r3 17