Κοινωφελές Ίδρυμα Ιωάννη Σ. Λάτση

Κοινωφελές Ίδρυμα Ιωάννη Σ. Λάτση ΜΕΛΕΤΕΣ 2010 Ο ΡΌΛΟΣ ΤΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΉΣ ΦΌΡΤΙΣΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΌΡΩΣΗΣ: Σχεδιασμός μοντέλου μηχανικής διέγερσης οστεοβλαστικών κυττάρων για την διερεύνηση θεραπευτικών εφαρμογών Επιστημονικός Υπεύθυνος: Ευθυμία Κ. Μπάσδρα Αν. Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής, ΕΚΠΑ 1

ΤΕΛΙΚΟ ΚΕΙΜΕΝΟ ΜΕΛΕΤΗΣ Η οστεοπόρωση αποτελεί την πιο συχνή μεταβολική νόσο των οστών με σοβαρές κοινωνικές, οικονομικές επιπτώσεις και υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Χαρακτηρίζεται από ελάττωση της οστικής μάζας, διαταραχή της μικροαρχιτεκτονικής του οστού, μειωμένη αντοχή και αυξημένη συχνότητα καταγμάτων. Η οστική απώλεια οφείλεται σε υπερβολική δραστηριότητα των οστεοκλαστών (κύτταρα αποδόμησης του οστού) και μειωμένη δραστηριότητα των οστεοβλαστών (κύτταρα παραγωγής οστού). Η οστεοβλαστική δραστηριότητα μπορεί να προαχθεί με τη μηχανική διέγερση των οστεοβλαστών. Η δράση αυτή μπορεί να έχει πρωταρχική σημασία τόσο για την πρόληψη όσο και για την θεραπεία της οστεοπόρωσης μέσω συστηματικής άσκησης και είναι σκόπιμο να κατοχυρωθεί επιστημονικά. Το αντικείμενο της παρούσας μελέτης ήταν ο σχεδιασμός ενός in vitro μοντέλου μηχανοδιέγερσης οστεοβλαστών για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην οστεοπόρωση. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν: 1) Απομόνωση και καλλιέργεια προοστεοβλαστικών κυττάρων, 2) Εφαρμογή μηχανικής τάσης στα κύτταρα αυτά, 3) Αναγνώριση των θέσεων πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στον υποκινητή του γονιδίου οστεοβλαστικής διαφοροποίησης Runx2 και 4) Ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης του NF-κB στον υποκινητή του γονιδίου Runx2. 1) Απομόνωση και καλλιέργεια προ-οστεοβλαστικών κυττάρων Τα προ-οστεοβλαστικά κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τον σχεδιασμό του μοντέλου, απομονώθηκαν από ιστούς του περιοδοντικού συνδέσμου (PDL), οι οποίοι ελήφθησαν από τη ρίζα υγειών δοντιών εξαχθέντων για λόγους ορθοδοντικής θεραπείας από δότες ηλικίας μεταξύ 20 και 30 χρονών. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν περαιτέρω σε θρεπτικό υλικό Dulbecco s Modified Eagle το οποίο εμπεριείχε ορό FBS (10%), μη βασικά αμινοξέα και αντιβιοτικά (1% πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη). Οι καλλιέργειες συντηρούνταν στους 37 ο C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO 2. Όταν τα κύτταρα έφτασαν σε πληρότητα (Εικ. 1), μεταφέρθηκαν σε ειδικά καλλιεργητικά τρυβλία Petriperm Lumox Dish σε αναλογία 1:4. 2

Εικ. 1. Κύτταρα του περιοδοντικού συνδέσμου σε πληρότητα Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν μεταξύ του 5 και του 8 σταδίου ζωής (passage) των κυττάρων έχοντας προηγουμένως επιβεβαιωθεί ο οστεοβλαστικός τους χαρακτήρας (έλεγχος παραγωγής αλκαλικής φωσφατάσης, παραγωγή εναβεστιωμένων δομών in vitro). 1.1. Επιβεβαίωση οστεοβλαστικού χαρακτήρα των κυττάρων με τη μέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης ( ALP) Το οστεογενετικό δυναμικό των συγκεκριμένων κυττάρων χαρακτηρίζεται από τα επίπεδα της αλκαλικής φωσφατάσης, τα οποία επιτρέπουν και τον ακριβή διαχωρισμό μεταξύ των κυττάρων PDL και των ινοβλαστών των ούλων (gingival). Στα κύτταρα του περιοδοντικού συνδέσμου η δραστηριότητα της αλκαλικής φωσφατάσης εντοπίστηκε έπειτα από 5 ημέρες καλλιέργειας. Στην παρακάτω εικόνα εμφανίζεται η ισχυρή χρώση της αλκαλικής φωσφατάσης με τη διαδικασία που προαναφέρθηκε. Παρατηρείται χρώση σε ποσοστό κυττάρων άνω του 85% (Εικ.2). 3

Εικ 2. Χρώση των PDL κυττάρων με ALP Η πιο πάνω χρώση αποδεικνύει τις οστεοβλαστικές ιδιότητες των κυττάρων του περιοδοντικού συνδέσμου. 1.2. Επιβεβαίωση του φαινομένου της επιμετάλλωσης ( mineralization) Ένα ακόμα χαρακτηριστικό των κυττάρων του περιοδοντικού συνδέσμου, είναι και η ικανότητά τους να δημιουργούν οζίδια επιμετάλλωσης (mineralization nodules). Στα συγκεκριμένα κύτταρα της μελέτης μας εμφανίστηκαν περιοχές εναπόθεσης μετάλλων έπειτα από καλλιέργεια 3 εβδομάδων. Μετά την ακόλουθη χρώση με Von Kossa, αυτές οι εναποθέσεις μετάλλων ήταν ορατές σαν άμορφα καφέ-μαύρα ιζήματα (Εικ.3.). Η αντίδραση με τη χρώση αυτή είναι ένδειξη της ύπαρξης φωσφορικού ασβεστίου. Εφόσον ο υδροξυαπατίτης, που αποτελεί παράγωγο του φωσφορικού ασβεστίου, είναι βασικό συστατικό των ασβεστοποιημένων ιστών, η μέθοδος αυτή αποδεικνύεται πολύ ευαίσθητη και αποτελεσματική για την απόδειξη της παρουσίας της μεταλλικής φάσης. Τα ιζήματα αυτά διακρίνονταν σε περιοχές με μεγάλη συγκέντρωση κυττάρων και εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. 4

Εικ. 3. Χρώση Von Kossa σε κύτταρα PDL μετά από 3 εβδομάδες καλλιέργειας 2) Εφαρμογή μηχανικής τάσης στα προ-οστεοβλαστικά κύτταρα Στα ειδικά τριβλία Petriperm Lumox Dish των 50mm διανεμήθηκαν περίπου 4x10 5 κύτταρα και καλλιεργήθηκαν μέχρι να φτάσουν σε πληρότητα 90%. Στη συνέχεια το θρεπτικό αντικαταστήθηκε σε Dulbecco s modified Eagle το οποίο περιείχε 0.1% FBS ώστε τα κύτταρα να παραμείνουν αδρανή. Μετά από 24 ώρες οι καλλιέργειες των PDL κυττάρων υποβλήθηκαν σε διαρκή διάταση (stretching) με τη χρήση εδικής συσκευής. Η βάση των ειδικών αυτών τρυβλίων αποτελείται από μια ελαστική, υδρόφιλη και διαπερατή από αέρια μεμβράνη πολυτετραφθοροαιθυλενίου, η οποία μπορεί να διαταθεί. Η διάταση επιτυγχάνεται όταν το τρυβλίο με την ελαστική βάση του τεθεί επάνω σε μια σφαιροειδή κυρτή επιφάνεια από πλεξιγκλάς και ένα βαρίδιο συγκεκριμένου βάρους τοποθετηθεί στο κάλυμμα του τρυβλίου όπως απεικονίζεται στην Εικ. 4. Με αυτόν τον τρόπο τα προσκολλημένα κύτταρα στην ελαστική βάση του τρυβλίου διατείνονται επίσης. 5

Εικ. 4. Τρόπος εφαρμογής της μηχανικής τάσης στα κύτταρα PDL Το ποσοστό της εφαρμοσμένης τάσης ποικίλει ανάλογα με την κυρτότητα της επιφάνειας και μπορεί να υπολογιστεί σαν ποσοστό τάσης σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: Αν r είναι η ακτίνα της σφαίρας, d η ακτίνα του σφαιρικού καλύμματος (σταθερή) και h το ύψος του σφαιρικού καλύμματος, τότε (r - h) 2 + d 2 = r 2, και τότε r = h/2 + d2/2h. Ποσοστό της τάσης = [εμβαδό της νέας επιφάνειας εμβαδό της πρωτότυπης επιφάνειας]/[εμβαδό πρωτότυπης επιφάνειας], ή (2rh - d2)/d 2. Η φόρμα που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας περιλαμβάνει κυρτότητα η οποία μπορεί να παράξει διάταση της τάξεως του 2.5%. Αφού προστέθηκε στα τρυβλία καινούργιο θρεπτικό (DMEM με 10%FBS), στη συνέχεια υπέστησαν μηχανική διάταση (ποσοστό τάσης 2.5%) για συγκεκριμένες χρονικές περιόδους με την τοποθέτηση ενός βαριδίου από ανοξείδωτο χάλυβα στην επιφάνεια του καλύμματος του τρυβλίου. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε για τέσσερις διαφορετικές χρονικές περιόδους των 6, 12, 24 και 48 ωρών, χρησιμοποιώντας 6 τρυβλία Petriperm για κάθε χρονική περίοδο. Ταυτόχρονα καλλιέργειες κυττάρων που δεν υπέστησαν τάση (unstretched) χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρες (control). Στη συνέχεια απομονώθηκε το κυτοσολικό και πυρηνικό περιεχόμενο των κυττάρων που υπέστησαν μηχανική τάση για τη διερεύνηση μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται 6

στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Συγκεκριμένα μελετήθηκε ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB ως προς την αλληλεπίδραση του με το κομβικό ρυθμιστή της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης, τον μεταγραφικό παράγοντα Runx2. 3) Αναγνώριση των θέσεων πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στον υποκινητή του γονιδίου οστεοβλαστικής διαφοροποίησης Runx2 Η ύπαρξη των θέσεων πρόσδεσης του NF-κB στον υποκινητή του Runx2 γονιδίου διερευνήθηκε αρχικά με τη χρήση του αναλυτικού λογισμικού Genomatix-sequence analysis software (Genomatix Software GmbH 1998-2008) με το λειτουργικό πρόγραμμα Matinspector, το οποίο εντόπισε τέσσερις συνολικά θέσεις πρόσδεσης (Εικ.5) για τον NF-κB/c-Rel, εκ των οποίων οι τρεις τοποθετούνται κοντά στο 5-UTR, στην λειτουργική περιοχή του υποκινητή (600 bp). Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν ως διερευνητές είναι οι εξής: Η αλληλουχία του NF-κB/c-Rel (wild-type), 5 -gagcaagggggaaaagccacagtggtaggc- 3 (κορυφαίος κλώνος), η οποία προέρχεται από την περιοχή -131 έως -119 του υποκινητή του ανθρώπινου γονιδίου runx2 και περιέχει το μοτίβο gggaaaagccaca του NF-κB/c-Rel. Η αλληλουχία που περιέχει το δεύτερο NF-κB/c-Rel μοτίβο 5- tggatgccaggaaaggccttaccacaagcc-3 (-189-177) και η τρίτη νουκλεοτιδική αλληλουχία που περιέχει το τρίτο NF-κB/c-Rel μοτίβο 5-gagtagaaaggaaagccctaactgcagag-3 (-324-312) ανάμεσα στην αλληλουχία του υποκινητή του Runx2 γονιδίου. 7

NF-kB/c-Rel NF-kB/c-Rel -131-119 NF-kB/c-Rel -1977-1965 -324-312 NF-kB/c-Rel -189-177 Major Transcription start Runx2 promoter Runx2 promoter 1 AP-1-2964 -2954 AP-1-1149 -1139 AP-1-569 -559 AP-1-231 -221 Runt/Cbfa1-79 -65 Runt/Cbfa1-130 -116 Εικ. 5. Θέσεις του NF-κB στον υποκινητή P1 του γονιδίου runx2. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε η πυρηνική μετατόπιση του μεταγραφικού παράγοντα με την τεχνική του ανoσοστυπώματος κατά Western. 3.1 Επιβεβαίωση της πυρηνικής μετατόπισης του μεταγραφικού παράγοντα NF -κb/c-rel H επιβεβαίωση της πυρηνικής μετατόπισης του μεταγραφικού παράγοντα πραγματοποιήθηκε με την τεχνική του ανoσοστυπώματος κατά Western και ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Με τoν ίδιο τρόπο, ανιχνεύτηκε και η έκφραση της πρωτεΐνης ακτίνης στα πειραματικά δείγματα, η οποία χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να ποσοτικοποιηθούν τα ευρήματα. Στις Εικόνες 6 και 7 παρουσιάζονται οι ζώνες αμαύρωσης που εμφανίστηκαν στο φωτογραφικό film κατά την ECL, οι οποίες αντιστοιχούν στον c-rel, αφού η προκείμενη μεμβράνη είχε επωασθεί με αντίσωμα ειδικό για τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. 8

0 6h 12h 24h NFκB p65 65kD Πυρηνικό εκχύλισμα εκχύλισμα NFκB c-rel 75kD Ολικό εκχύλισμα Εικ. 6. Ανοσοαποτύπωση της μηχανικής διέγερσης των κυττάρων του περιοδοντικού συνδέσμου για 6, 12 και 24 ώρες. Στην Εικόνα 6 παρουσιάζεται η επαγωγή του διμερούς συμπλόκου crel/p65 σε PDL κύτταρα που έχουν υποστεί τάση. Η ανάλυση των πυρηνικών και κυτταρικών εκχυλισμάτων με την μέθοδο Western blot, έδειξε μια αύξηση στην έκφραση των επιπέδων της p65, σε συμφωνία με τη διάρκεια της εφαρμογής του μηχανικού ερεθίσματος. Παρατηρήθηκε επίσης, αύξηση των επιπέδων του c-rel στις 6 και στις 12 ώρες σε μηχανικής διέγερσης σε ολικά εκχυλίσματα. Στις 24 ώρες η ζώνη του c-rel φθάνει στα μικρότερα επίπεδα ανίχνευσης της ανοσοανάλυσης. Ταυτόχρονα εξετάστηκε και η ενεργοποίηση του c-rel έπειτα από μηχανική διέγερση σε κυτταροπλασματικό εκχύλισμα των PDL κυττάρων σαν επιβεβαίωση του παραπάνω πειράματος (Εικ. 7). 9

A c-rel (75kD) B C 6 12 24 48 Actin (42kD) C 6 12 24 48 Εικ. 7 Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western με χρήση αντισωμάτων έναντι της πρωτεΐνης NFκB/c-Rel σε δείγματα κυττάρων μαρτύρων (unstretched) και κυττάρων που έχουν υποστεί μηχανική διέγερση για 6, 12, 24 και 48 ώρες Β. έκφραση της πρωτεΐνης ακτίνης στα ίδια δείγματα. Τα ευρήματα υποδεικνύον ότι με την εφαρμογή μηχανικής δύναμης για 6 και 12 ώρες γίνεται εμφανής η ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB/cRel και η μετατόπισή του στον πυρήνα των κυττάρων. Στην εικόνα φαίνεται η μείωση στην ποσότητα της κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης c-rel (75kD) στις 6 και 12 ώρες εφαρμογής μηχανικής τάσης με την τεχνική Western blot. 4) Ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης του NF-κB στον υποκινητή του γονιδίου Runx2 Ακολούθησε η μελέτη της προσδετικής ικανότητας του NF-κB στο Runx2 με τη μοριακή τεχνική ανάλυσης της αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA). 10

4.1 Μέθοδος μετατόπισης της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας της πρωτεΐνης NF-κB/c- Rel Στην Εικόνα 8 που ακολουθεί, ανθρώπινα κύτταρα περιοδοντικού συνδέσμου διεγέρθηκαν μηχανικά για 6, 12, 24, 48 ώρες. Κύτταρα που δεν υπέστησαν μηχανική διέγερση χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες της ενεργοποίησης του NF-κΒ. Η ένταση των επαρμάτων στο φιλμ της αυτοραδιογραφίας υπολογίστηκε με ειδικό πρόγραμμα ποσοτικοποίησης για τη σύγκριση της επαγωγής μεταξύ των διαφορετικών τρόπων διέγερσης. 0 12 24 48 (h) 6 c-rel σύμπλεγμα Εικ. 8. Η εφαρμογή μηχανικής τάσης στα hpdl κύτταρα επάγει την προσδετική ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα c-rel (υπομονάδα του NF-κB) στο DNA. Η μηχανική τάση εφαρμόστηκε στα PDL κύτταρα στις ενδεικνυόμενες χρονικές στιγμές. Απομονώθηκαν τα πυρηνικά εκχυλίσματα, από τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ίσες ποσότητες (10μg) στις οποίες αναλύθηκε η προσδετική στο DNA δραστηριότητα του ΝF-κB/c-rel με την τεχνική της EMSA, χρησιμοποιώντας μια βιοτινιλυομένη αλληλουχία που περιέχει την ανθρώπινη c-rel αλληλουχία ως ανιχνευτή. Η στήλη 0 αναφέρεται σε 11

κύτταρα που δεν έχουν υποστεί τάση αλλά έχουν καλλιεργηθεί υπό τις ίδιες συνθήκες με τα κύτταρα που έχουν υποστεί τάση για το μέγιστο της εφαρμογής (48 ώρες). Η πυρηνική μετατόπιση του μεταγραφικού παράγοντα c-rel επιβεβαιώνεται και κατά την απομόνωση κυτοπλασματικών πρωτεϊνών, στις οποίες φαίνεται το αντίστροφο αποτέλεσμα με την δοκιμασία αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. 0 6 12 24 48 (h) c-rel σύμπλεγμα Εικ. 9. Η μηχανική τάση εφαρμόστηκε στα PDL κύτταρα στις ενδεικνυόμενες χρονικές στιγμές. Απομονώθηκαν τα κυτοπλασματικά εκχυλίσματα, από τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ίσες ποσότητες (10μg) στις οποίες αναλύθηκε η προσδετική στο DNA δραστηριότητα του ΝF-κB/c-rel με την τεχνική της EMSA, χρησιμοποιώντας μια βιοτινιλυομένη αλληλουχία που περιέχει την ανθρώπινη c-rel αλληλουχία ως ανιχνευτή. Η στήλη 0 αναφέρεται σε κύτταρα που δεν έχουν υποστεί τάση αλλά έχουν καλλιεργηθεί υπό τις ίδιες συνθήκες με τα κύτταρα που έχουν υποστεί τάση για το μέγιστο της εφαρμογής (48 ώρες). 12

Η σύγκριση αυτή έδειξε ότι η άσκηση μηχανικής δύναμης ενεργοποιεί τη μετανάστευση του NF-κΒ από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και την επακόλουθη δέσμευσή του στην αλληλουχία του DNA που αναγνωρίζει. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ έπειτα από μηχανική διέγερση 6 ωρών είναι περίπου 65% μεγαλύτερη από την απουσία μηχανικής διέγερσης. Μετά το πέρας των 6 ωρών, η επαγωγή του NF-kB επανέρχεται σταδιακά στα επίπεδα των μαρτύρων. Για την επιβεβαίωση της ειδικότητας της αντίδρασης πραγματοποιήθηκε ανταγωνιστική αντίδραση με μη σημασμένο και μη ειδικό ανιχνευτή. Τα αποτελέσματα φαίνονται στην Εικόνα 10. 13

Εικ. 10. Πείραμα ανταγωνιστικής δραστηριότητας με την παρουσία 10, 25 και 50 φορές μεγαλύτερη συγκέντρωση μη σημασμένου c-rel ανιχνευτή (στήλες 3-5) και πυρηνικά εκχυλίσματα από hpdl κύτταρα που έχουν υποστεί τάση για 48 ώρες. Στις στήλες 6-8 έχει χρησιμοποιηθεί μη σημασμένος ανιχνευτής της πρωτεΐνης EBNA με 10, 25 και 50 φορές μεγαλύτερη συγκέντρωση καθώς και πυρηνικά εκχυλίσματα hpdl κυττάρων που έχουν υποστεί τάση για 48 ώρες. Η στήλη 1 και 9 περιέχουν ελεύθερο DNA ανιχνευτή. Για να ταυτοποιήσουμε τo σύμπλεγμα του NF-κB/c-Rel κατά την ενεργοποίησή του μετά από μηχανική διέγερση χρησιμοποιήσαμε ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του c- Rel (sc-71x). Έτσι, ανθρώπινα κύτταρα περιοδοντικού συνδέσμου διεγέρθηκαν για 6 ώρες. Πυρηνικά εκχυλίσματα που απομονώσαμε από αυτά τα κύτταρα, επωάσθηκαν με anti-crel για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν πραγματοποιήθηκε η αντίδραση με την σημασμένη με βιοτίνη αλληλουχία του DNA που αναγνωρίζει ο NFκΒ (Εικ. 11.). Σύμπλεγμα c-rel 14

hpdl stretch 6h (1) (2) _ anti-c-rel anti-sp-1 _ + _ + _ + + Σύμπλεγμα c-rel 1 2 3 4 5 6 7 Εικ. 11. Υπερμετατόπιση (supershift) της EMSA που πραγματοποιήθηκε με πυρηνικά εκχυλίσματα hpdl κυττάρων που έχουν υποστεί τάση για 6 ώρες και στα οποία έχει προστεθεί αντι-c-rel και αντι-sp1 αντίσωμα (στήλες 2-6). Το σύμπλοκο πρωτεΐνηςαντισώματος-ανιχνευτή (στήλη 3, 5) προέρχεται από την επώαση του πυρηνικού εκχυλίσματος και του αντισώματος c-rel (1) και Sp-1 αντίστοιχα και την έπειτα προσθήκη του ανιχνευτή ενώ στις στήλες 4 και 6 έχει επωαστεί πρώτα το σύμπλοκο πυρηνικού εκχυλίσματος-ανιχνευτή και έπειτα προστέθηκε το αντίσωμα c-rel (2) και Sp-1. 15

Στην Εικόνα 11, φαίνεται ότι στα κύτταρα που επωάσθηκαν με anti-c-rel πριν από την προσθήκη του ανιχνευτή, η ένταση της ζώνης-επάρματος του NF-κΒ ήταν μειωμένη κατά 75% σε σύγκριση με το θετικό μάρτυρα (στήλη 2) στον οποίο δεν έχει προστεθεί αντίσωμα. Αντίθετα, στα κύτταρα που επωάσθηκαν με anti-c-rel μετά από την προσθήκη του ανιχνευτή, η ένταση της ζώνης του επάρματος δεν εμφάνισε ιδιαίτερη μείωση. Το αποτέλεσμα της στήλης 3 υποδεικνύει ότι το μέλος που συνιστά τον NF-κΒ στο σύστημά μας είναι ο c-rel. Επομένως ο NF-κB αποτελεί ένα μεταγραφικό παράγοντα, του οποίου η δράση πιθανό να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου Runx2 έπειτα από μηχανική διέγερση. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η εφαρμογή μηχανικής τάσης (6-48 ώρες) στα προοστεοβλαστικά κύτταρα του περιοδοντικού συνδέσμου επάγει την προσδετική ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα c-rel (υπομονάδα του NF-κB) στο DNA υποδεικνύοντας ότι ο NF-κB αποτελεί ένα μεταγραφικό παράγοντα, του οποίου η δράση πιθανό να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου Runx2 έπειτα από μηχανική διέγερση. Η εμπλοκή του φλεγμονώδους παράγοντα NF-κB στην ρύθμιση της έκφρασης του οστεοειδικού γονιδίου Runx2 και ο μοριακός μηχανισμός αυτής της επίδρασης, ανοίγει νέες προοπτικές για την κατανόηση του φαινομένου της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης και συνεπώς της οστικής αναδόμησης- μετά από φυσικά ερεθίσματα όπως αυτό του μηχανικού στρες, η δυσλειτουργία του οποίου ευθύνεται για πολλές οστικές παθοφυσιολογίες όπως η οστεοπόρωση, η επούλωση καταγμάτων, η αποκατάσταση οστικών ελλειμμάτων κ.α. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΠΡΟΕΚΤΑΣΕΙΣ Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε ευρήματα σύμφωνα με τα οποία ο βασικός ρυθμιστής της διαδικασίας της φλεγμονής, ο NF-κB, αποτελεί μόριο κλειδί της μηχανικής διέγερσης σε hpdl-οστεοβλαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά είναι διαρκώς εκτεθειμένα σε μηχανικές πιέσεις στο φυσικό τους περιβάλλον και μπορούν να διαφοροποιηθούν, με σκοπό να συμμετάσχουν ενεργά στην αποκατάσταση του περιοδοντικού συνδέσμου (PDL) και την ανάπλαση του περιβάλλοντος οστού. Δείξαμε ότι από ένα φυσικό σήμα όπως η άσκηση μηχανικής διέγερσης, παρατηρείται μετατόπιση 16

του NF-κB στον πυρήνα που συνοδεύεται και από αύξηση της ικανότητας πρόσδεσής του στο DNA-στόχο του (τον υποκινητή του γονιδίου Runx2). Τα πειράματα μας επιβεβαίωσαν καταρχήν την πυρηνική αυτή μετατόπιση του NF-κB έπειτα από μηχανική διέγερση αλλά επιπλέον και τη χρονική σύμπτωση της επαγωγής του παράγοντα αυτού με τον Runx2. Πράγματι ο NF-κB αλλά και ο Runx2 επάγονται στις 6 ώρες της άσκησης μηχανικής δύναμης, και στη συνέχεια επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα των μαρτύρων. Σύμφωνα, λοιπόν, με την ιδιότητα των οστών να αποκρίνονται στην επαναλαμβανόμενη μηχανική τάση οστεογενετικά, η 6ωρη επαναλαμβανόμενη άσκηση μηχανικής τάσης θα μπορούσε να προκαλέσει τη διαρκή αύξηση της οστικής πυκνότητας έτσι ώστε να αποφευχθεί η οστική απώλεια που οδηγεί σε πολλές παθήσεις που σχετίζονται με το μεταβολισμό των οστών. Η επαγωγή αυτή του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB μετά από μηχανική διέγερση επιβάλλει τη διερεύνηση του σηματοδοτικού μονοπατιού μέσω του οποίου πραγματοποιήθηκε αυτή η επαγωγή. Ένας, λοιπόν, μελλοντικός πειραματικός σχεδιασμός είναι και η ανίχνευση του μονοπατιού αυτού που σαν κύριους υποψηφίους έχει τις ΙΚΚ κινάσες αλλά και τις ΜΑP κινάσες. Έχει αποδειχθεί πως η ενεργοποίηση του NF-κB προκαλείται και από τις δύο αυτές ομάδες κινασών σε διαφορετικό ποσοστό. Επιπρόσθετα όμως υπάρχουν ενδείξεις ότι στην ενεργοποίηση του NF-κB συμμετέχουν και η συγκέντρωση ασβεστίου [Ca 2+ ] μέσω της λειτουργίας των καναλιών ασβεστίου που ενεργοποιούνται από τη μηχανική τάση (Stretch-Activated channels). Ωστόσο η ενεργοποίηση του NF-κΒ έπειτα από μηχανική διέγερση δεν έχει διερευνηθεί εκτενώς και άρα το ποσοστό επιρροής των κινασών και των μεμβρανικών καναλιών είναι άγνωστο μέχρι στιγμής. Η επίδραση αυτή της μηχανικής διέγερσης στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση και επομένως και στην επικοινωνία των οστικών κυττάρων θα μπορούσε να ενέχει τον NFκB αλλά και τον Runx2 σαν μόρια ελέγχου και του RANKL, ο οποίος όπως αναφέρθηκε αποτελεί σύνδεσμο επικοινωνίας οστεοβλαστών-οστεοκλαστών. Παρ όλο που η απευθείας επίδραση του Runx2 στον υποκινητή του RANKL έχει αποδυναμωθεί πειραματικά, δε μπορούμε να αποκλείσουμε κάποια έμμεση επίδραση είτε μέσω 17

αναδιάταξης της χρωματινικής δομής μετά την άσκηση της μηχανικής δύναμης, ή μέσω της ενεργοποίησης κάποιου άλλου μορίου που επιδρά στον RANKL. Από την άλλη, η επίδραση του NF-κB στον υποκινητή του RANKL δεν έχει ερευνηθεί πειραματικά και ίσως αυτός να αποτελεί έναν από τους παράγοντες μέσω των οποίων πραγματοποιείται αυτή η επικοινωνία. Άλλωστε, η εν λόγω επικοινωνία αποτελεί και τον βασικό παράγοντα δημιουργίας των διαφόρων ασθενειών των οστών. Οι ασθένειες των οστών προέρχονται από το δυναμικό συνδυασμό της αυξημένης οστεοκλαστικής οστικής αναρρόφησης και της μειωμένης οστεοβλαστικής αναδόμησης του οστού, οι οποίες ως επί το πλείστον προέρχονται είτε από γενετικές ανωμαλίες ή από παρεκκλίνουσα μηχανοδιέγερση. Για το λόγο αυτό, η αυξημένη δραστικότητα των οστεοβλαστών έπειτα από μηχανική διέγερση έχει εμφανή και σημαντική εφαρμογή στη θεραπευτική αγωγή των ασθενειών των οστών. Η οστεοπόρωση, η πιο κοινή ασθένεια των οστών έχει σαν αποτέλεσμα την παρέκκλιση της μηχανομεταγωγής μεταξύ οστεοβλαστών και οστεοκλαστών και η κλινική εικόνα περιλαμβάνει μείωση της οστικής πυκνότητας, λέπτυνση του οστικού ιστού και αυξημένη ευαισθησία στα κατάγματα. Ανάλογη οστική απώλεια είναι δυνατό να προκαλείται από μείωση μηχανικού φορτίου λόγω παρατεταμένης ανάπαυσης ή λόγω έκθεσης σε μικροβαρύτητα. Σήμερα, η φαρμακολογική θεραπεία της οστεοπόρωσης περιλαμβάνει τη χορήγηση διφωσφωνικών, επιλεγμένους τροποποιητές των υποδοχέων των οιστρογόνων, καλσιτονίνης και ανάλογα της παραθυρεοειδούς ορμόνης. Η οστική απώλεια σε αυτή την κατάσταση μπορεί να μειωθεί ή να ανατραπεί με τη μηχανική διέγερση των οστεοβλαστών. Είναι δυνατό να επιτευχθεί σημαντική αύξηση των οστικών μετάλλων με ενδυναμωτικές ασκήσεις σε άτομα με καθιερωμένη οστεοπόρωση, ενώ μια νέα φυσική θεραπεία που συνδυάζει τη χρήση μιας συσκευής που καλείται spinal weighted kypho-orthosis (WKO) μια συσκευή με προσάρτηση ενός ελαφρού βάρους- και εξειδικευμένες ασκήσεις έκτασης της ράχης, έχουν θετικά αποτελέσματα στη μείωση της οσφυαλγίας, βελτιώνοντας τη στάση του σώματος και μειώνοντας τον κίνδυνο των πτώσεων σε γυναίκες με οστεοπόρωση που έχουν επιπλέον κύρτωση της σπονδυλικής στήλης. Επιπρόσθετα, η φυσική άσκηση μπορεί να εμποδίσει τη μείωση της οστικής πυκνότητας κατά την περίοδο μετά την εμμηνόπαυση ή κατά τη γήρανση. 18

Η στρατηγικές εφαρμογής της μηχανοδιέγερσης στους οστεοβλάστες αποδεικνύονται ωφέλιμες και στην επούλωση των οστικών καταγμάτων. Τα αποτελέσματα της άσκησης φορτίου εξαρτώνται σημαντικά από τον ρυθμό, τον τρόπο και το μέγεθος του φορτίου, καθώς επίσης και από το μέγεθος του χάσματος του κατάγματος. Οι οστεοβλάστες και τα οστεοκύτταρα αποκρίνονται διαφορετικά στα ποικίλα μηχανικά περιβάλλοντα και συνεπώς, η άκαμπτη μονιμοποίηση των καταγμάτων συνεπάγεται στην άμεση οστική κατασκευή και την οστική γεφύρωση του χάσματος του κατάγματος, ενώ η εύκαμπτη μονιμοποίηση μπορεί να συνεπάγεται σε έμμεση επούλωση που χαρακτηρίζεται από τη δημιουργία περιοστεϊκών όζων και ενδοχόνδρινη οστική κατασκευή. Η εφαρμογή κυκλικών συμπιεστικών μετατοπίσεων είναι δυνατό να ενδυναμώνει την επούλωση μέσω αυξημένης κατασκευής όζων και γρηγορότερης οστεοποίησης. Όμως, η περιπλοκότητα των μηχανισμών για την οστεοβλαστική διαφοροποίηση και τις αλληλεπιδράσεις με τα οστεοκύτταρα και τους οστεοκλάστες, υποδεικνύουν και την ανολοκλήρωτη αποκωδικοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών. Συνεπώς, υπάρχει πληθώρα μορίων των οποίων η δράση πρέπει να ταυτοποιηθεί και να ερμηνευτεί. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα οστεοκύτταρα αισθάνονται τα διαφορετικά χαρακτηριστικά του μηχανικού ερεθίσματος και τα μεταβιβάζουν στους οστεοβλάστες παραμένουν άγνωστοι, όπως και οι μηχανισμοί με τους οποίους οι οστεοβλάστες συντονίζουν την ενεργοποίηση συγκεκριμένων σηματοδοτικών μονοπατιών. Για το λόγο αυτό απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση της μοριακής βάσης της μηχανομεταγωγής στη φυσιολογία του οστού ώστε να εκτιμηθεί η θεραπευτική στρατηγική που πρέπει να ακολουθηθεί και να αποφευχθούν οι τυχόν παρενέργειες που παρουσιάζονται με τη χρήση των φαρμακευτικών σκευασμάτων. Τα ευρήματα της μελέτης θα δημοσιευτούν σε διεθνές επιστημονικό περιοδικό το 2011, ενώ έχουν παρουσιαστεί στα ακόλουθα συνέδρια: 1. German Academy of Sciences Leopoldina symposium, Königswinter-Bonn, Germany, 2010. Προφορική ανακοίνωση με τίτλο: The periodontal ligament under mechanical strain: cellular and molecular insights 19

2. Craniofacial Conference, Ankara, Turkey 2010. Προφορική ανακοίνωση με τίτλο: Μηχανική διέγερση και κρανιοσκοπική αναμόρφωση. Επίσης, το Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας οργάνωσε μια ημερίδα με τίτλο: «ΟΣΤΕΟΠΌΡΩΣΗ: Ο ΡΌΛΟΣ ΤΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΉΣ ΦΌΡΤΙΣΗΣ» για τους φοιτητές της Ιατρικής σχολής επισημαίνοντας το ρόλο της άσκησης στη πιθανή βελτίωση της συνολικής υγείας των ασθενών με οστεοπόρωση. Επιπλέον, σχεδιάστηκε ένα ενημερωτικό φυλλάδιο σχετικά με την οστεοπόρωση και το ρόλο της συστηματικής άσκησης στην αντιμετώπιση της νόσου για την ευρύτερη διασπορά εξηγήσεων και οδηγιών στο ευρύ κοινό. Ο Επιστημονικός Υπεύθυνος Ευθυμία Μπάσδρα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής, ΕΚΠΑ 20