ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΝΤΟΠΑΜΙΝΕΡΓΙΚΗΣ ΕΚΦΥΛΙΣΗΣ ΣΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ NMDA ΣΤΟ ΡΑΒΔΩΤΟ ΣΩΜΑ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΜΥΟΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΣΠΟΥΔΩΝ: ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΝΤΟΠΑΜΙΝΕΡΓΙΚΗΣ ΕΚΦΥΛΙΣΗΣ ΣΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ NMDA ΣΤΟ ΡΑΒΔΩΤΟ ΣΩΜΑ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΜΥΟΣ Μεταπτυχιακή φοιτήτρια: Κουτσοκέρα Μαρία ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΑΤΡΑ, 2006

2 Περιεχόμενα Σελ. 1. Τα βασικά γάγγλια 1.1. Γενικά 4 1.2. Κυτταρική σύσταση του ραβδωτού 5 1.3. Οι λειτουργίες των βασικών γαγγλίων 6 1.4. Συνδέσεις των βασικών γαγγλίων 7 2. Η νόσος του Parkinson 2.1. Γενικά 12 2.2. Μεταβολή του μοντέλου του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων στη νόσο του Parkinson 15 3. Ο μυς weaver 3.1. Γενικά 17 3.2. Γενετική της μετάλλαξης weaver 17 3.3. Λειτουργική επίδραση της μετάλλαξης weaver 21 3.3.1. Βασικά γάγγλια 21 3.3.2. Κυτταρικός θάνατος στην παρεγκεφαλίδα των μυών weaver 25 3.3.3. Κυτταρικός θάνατος στους όρχεις των μυών weaver 29 3.3.4. Μορφολογικές και λειτουργικές ανωμαλίες στον ιππόκαμπο και στον αμφιβληστροειδή 30 3.4. Φαινότυπος των ομοζυγωτών μυών weaver 31 4. Υποδοχείς NMDA 4.1. Γενικά 33 4.2. Υπότυποι του υποδοχέα NMDA 34 4.3. Φυσιολογικοί ρόλοι του υποδοχέα NMDA 38 5. Φωσφορυλίωση πρωτεϊνών 5.1. Γενικά 40 5.2. Επίδραση της φωσφορυλίωσης στον υποδοχέα NMDA και ειδικότερα στην υπομονάδα NR2B 43 6. Σκοπός της εργασίας 48 7. Βασικές αρχές της ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και αποτύπωσης σε μεμβράνη (SDS-PAGE και Western blotting) 7.1 Εισαγωγή 49 7.1.1. Βασικές αρχές της ηλεκτροφόρησης 50 7.1.2. Κατεύθυνση και συχνότητα κίνησης των φορτισμένων μορίων στο ηλεκτρικό πεδίο 51 7.1.3. Ηλεκτροφόρηση ζώνης πηκτές 53 7.1.4. Συνεχή ή ασυνεχή (πολυφασικά) συστήματα 56

3 7.1.5. Αποδιατακτικά ή μη αποδιατακτικά συστήματα 59 7.2. Αποτύπωση σε μεμβράνη 61 7.2.1. Βασικές αρχές της μεταφοράς με τη βοήθεια ηλεκτρικού ρεύματος 62 7.2.2. Τύποι μεταφοράς με ηλεκτρικό ρεύμα 64 7.2.3. Επιλογή μεμβράνης 64 7.2.4. Επιλογή διαλύματος για την μεταφορά 65 8. Πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε στην παρούσα διατριβή 8.1. Εισαγωγή 67 8.2. Πειραματόζωα και απομόνωση του ιστού 68 8.3. Προετοιμασία του ιστού και μέτρηση πρωτεΐνης 68 8.4. Διαχωρισμός των πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) 69 8.5. Αποτύπωση σε μεμβράνη των διαχωρισμένων πρωτεϊνών 69 8.6. Επώαση της μεμβράνης με ειδικό αντίσωμα 70 8.7. Εμφάνιση του σήματος σε φιλμ και ποσοτικοποίηση των ζωνών 70 8.8. Επώαση της μεμβράνης με αντίσωμα κατά της τουμπουλίνης 71 8.9. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων 71 9. Αποτελέσματα της μελέτης των πρωτεϊνικών επιπέδων της υπομονάδας NR2B (ε2) του υποδοχέα NMDA και της φωσφορυλιωμένης μορφής της στη ser1303 στο ραβδωτό σώμα μυών με ντοπαμινεργική ανεπάρκεια 73 10. Συζήτηση των αποτελεσμάτων 10.1. Αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεϊνης NR2B του υποδοχέα NMDA στο ραβδωτό σώμα μυών με ντοπαμινεργική ανεπάρκεια 79 10.2. Αλλαγές στη φωσφορυλίωση στη ser1303 της υπομονάδας NR2B του υποδοχέα NMDA στο ραβδωτό σώμα μυών με ντοπαμινεργική ανεπάρκεια 85 10.3. Επίδραση των παρατηρούμενων αλλαγών στη συναπτική πλαστικότητα του ραβδωτού 90 Βιβλιογραφία 93

4 1. Τα βασικά γάγγλια 1.1. Γενικά Ο όρος βασικά γάγγλια (ή βασικοί πυρήνες) αποδίδεται σε μορφολογικώς ευκρινείς μάζες φαιάς ουσίας στο εσωτερικό κάθε εγκεφαλικού ημισφαιρίου. Αρχικά, ο όρος αυτός αναφερόταν στους πυρήνες που προέρχονται από τον τελικό εγκέφαλο, δηλαδή στο ραβδωτό σώμα, στον αμυγδαλοειδή πυρήνα και το προτείχισμα. Ο αμυγδαλοειδής πυρήνας και το προτείχισμα δεν αναμειγνύονται στον έλεγχο των κινήσεων ούτε συνδέονται με το ραβδωτό σώμα. Στην εποχή μας, ο όρος βασικά γάγγλια αναφέρεται σε δύο επιπλέον δομές, τον υποθαλάμιο πυρήνα που βρίσκεται στον διεγκέφαλο και την μέλαινα ουσία που βρίσκεται στον μεσεγκέφαλο. Παρόλο που αυτοί οι δύο πυρήνες δεν εντοπίζονται στον τελικό εγκέφαλο συνδέονται ανατομικά και λειτουργικά με το ραβδωτό σώμα. Το ραβδωτό σώμα (corpus striatum) κείται επί τα εκτός του θαλάμου και δια της πορείας της δέσμης των νευρικών ινών που απαρτίζουν την έσω κάψα, υποδιαιρείται σε δύο πυρήνες, τον κερκοφόρο πυρήνα (caudate nucleus) και τον φακοειδή πυρήνα (lenticular nucleus). Ο φακοειδής πυρήνας, με ένα καθέτως φερόμενο πέταλο λευκή ουσίας, υποδιαιρείται σε ένα έξω μεγαλύτερο και σκουρότερο τμήμα, το κέλυφος (putamen), και σε ένα έσω, μικρότερο και ανοιχτότερης χροιάς τμήμα, την ωχρά σφαίρα (globus pallidus). Το κέλυφος και ο κερκοφόρος πυρήνας αναφέρονται μαζί ως νεοραβδωτό ή, απλά, ραβδωτό. Η ωχρά σφαίρα χωρίζεται σε δύο μοίρες, την έξω (globus pallidus external, GPe) και την έσω (globus pallidus internal, GPi). Η μέλαινα ουσία είναι ένας μεγάλος κινητικός πυρήνας μεταξύ της καλύπτρας και της βάσης του εγκεφαλικού σκέλους και εκτείνεται σε όλο το μήκος του μέσου εγκεφάλου. Ο πυρήνας αποτελείται από μέσου μεγέθους πολύπολους νευρώνες, που έχουν έγκλειστα κοκκία μελανίνης στο κυτταρόπλασμά τους. Χωρίζεται σε δύο μοίρες, την συμπαγή και την δικτυωτή μοίρα (substantia nigra pars compacta, SNc και substantia nigra pars reticulata, SNr). Τέλος, στον όρο βασικά γάγγλια θα μπορούσαμε να συμπεριλάβουμε δύο ακόμα πυρήνες, τον επικλινή πυρήνα (nucleus accumbens) και τον οσφρητικό λοβό (olfactory tubercule), που βρίσκονται

5 κοιλιακά του ραβδωτού σώματος και δεν χωρίζονται από αυτό με σαφή όρια. Οι πυρήνες αυτοί αναφέρονται, επίσης, ως κοιλιακό ραβδωτό (ventral striatum) και δεν φαίνεται να εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων. (Baehr M. and Frotcher M., 2005) Εικόνα 1. Στεφανιαίες τομές ανθρώπινου εγκεφάλου. Με μπλε απεικονίζεται το ραβδωτό (κερκοφόρος πυρήνας και κέλυφος), με κόκκινο η μέλαινα ουσία, με κίτρινο ο υποθαλάμιος πυρήνας και με πράσινο η ωχρά σφαίρα (έσω και έξω μοίρα). 1.2. Κυτταρική σύσταση του ραβδωτού Το 90-95% των κυττάρων του ραβδωτού σώματος είναι οι μεσαίου μεγέθους ακανθωτοί νευρώνες. Το κυτταρικό σώμα των νευρώνων αυτών είναι μεσαίου μεγέθους, με διάμετρο 12-15μm. Ο πυρήνας τους είναι λείος, μεγάλος, κεντρικά τοποθετημένος και περιβάλλεται από μία λεπτή στιβάδα κυτταροπλάσματος. Οι εγγύς δενδρίτες τους έχουν λεία όψη, ενώ οι πιο απομακρυσμένοι είναι ακανθώδεις. Οι νευρώνες αυτοί αποτελούν τους νευρώνες προβολής του ραβδωτού σώματος. Ο κύριος νευροδιαβιβαστής που ανευρίσκεται σε αυτούς τους νευρώνες είναι το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA). Οι άξονες αυτών των νευρώνων προβολής σχηματίζουν παράπλευρους κλάδους που επιστρέφουν στον ίδιο τον νευρώνα ή καταλήγουν σε άλλους νευρώνες προβολής ή σε άλλους ενδονευρώνες. Έτσι σχηματίζεται ένα κύκλωμα αντίδρομης αναστολής το οποίο ρυθμίζει το σήμα εξόδου που διοχετεύουν οι νευρώνες προβολής έξω από το ραβδωτό σώμα.

6 Οι μεσαίου μεγέθους ακανθωτοί νευρώνες ανάλογα με τον υπότυπο ντοπαμινεργικού υποδοχέα που φέρουν χωρίζονται σε δύο υποπληθυσμούς. Οι μισοί, περίπου, φέρουν τους D 1 υποδοχείς και εκφράζουν, επίσης, τα πεπτίδια ουσία P και δυνορφίνη. Οι υπόλοιποι μισοί φέρουν τους D 2 υποδοχείς και εκφράζουν το πεπτίδιο εγκεφαλίνη. Οι πιο σημαντικές είσοδοι που δέχονται οι μεσαίου μεγέθους ακανθωτοί νευρώνες είναι η γλουταμινεργική (διεγερτική) είσοδος από τον φλοιό, που συνήθως καταλήγει στην κεφαλή των δενδριτικών ακανθών και η ντοπαμινεργική (διεγερτική ή ανασταλτική) είσοδος από την συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας, που συνήθως καταλήγει στον κορμό των δενδριτικών ακανθών. Επίσης, δέχονται ανασταλτικές GABAεργικές εισόδους από τους ενδονευρώνες του ραβδωτού, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την ορθόδρομη αναστολή και από παράπλευρους κλάδους των ίδιων των νευραξόνων. (Kawaguchi et al., 1995, Parent and Hazrati, 1995). Οι ενδονευρώνες που αποτελούν το υπόλοιπο 5-10% των νευρώνων του ραβδωτού χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες: (1) τους μεγάλους χολινεργικούς ενδονευρώνες που ταυτοποιούνται από την παρουσία της τρανσεφεράσης της ακετυλοχολίνης, (2) τους GABAεργικούς ενδονευρώνες που περιέχουν τη ασβεστιοδεσμευτική πρωτείνη παρβαλβουμίνη, (3) τους GABAεργικούς ενδονευρώνες που περιέχουν τη ασβεστιοδεσμευτική πρωτείνη καλρετινίνη και (4) τους GABAεργικούς ενδονευρώνες που περιέχουν σωματοστατίνη, NADPH-διαφοράση και συνθετάση του νιτρικού οξέως. Όλοι αυτοί οι ενδονευρώνες χαρακτηρίζονται από την απουσία ακανθών στους δενδρίτες τους. (Kawaguchi et al., 1995). 1.3. Οι λειτουργίες των βασικών γαγγλίων Οι βασικοί πυρήνες παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της στάσης και των εκουσίων κινήσεων. Η καταστροφή του κινητικού φλοιού των ημισφαιρίων αποστερεί τον πάσχοντα από την ικανότητα εκτέλεσης λεπτών, επιδέξιων κινήσεων των άνω και κάτω άκρων του αντίθετου ημιμορίου του σώματος. Παρά ταύτα, το άτομο είναι ακόμη ικανό να εκτελεί αδρές μαζικές κινήσεις των αντιθέτων άκρων. Εάν καταστραφεί και το ραβδωτό σώμα καταργούνται και αυτές οι υπολειπόμενες κινήσεις του αντίθετου ημιμορίου. Η

7 ωχρά σφαίρα παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο των αξονικών και των γυροειδών κινήσεων του σώματος και της θέσης των κεντρικών (εγγύς) τμημάτων των άκρων. Η δραστηριότητα στους νευρώνες της ωχράς σφαίρας αυξάνεται προτού αρχίσουν οι ενεργητικές κινήσεις των περιφερικών (άπω) μερών των άκρων. Αυτή η σημαντική λειτουργία συμβάλλει στην κατάλληλη στάση του κορμού και των άκρων για την ιδανικότερη μυϊκή λειτουργία, προτού ακόμη ο κινητικός φλοιός ενεργοποιήσει τις εκάστοτε κινήσεις των χεριών και των ποδιών. Γενικά, τα βασικά γάγγλια είναι υπεύθυνα για τον έλεγχο της προόδου της κίνησης, για την μεταφορά και τροποποίηση της πληροφορίας από τον νεοφλοιό στις κινητικές περιοχές (ιδιαίτερα στην προκινητική και κινητική συμπληρωματική περιοχή), για την αυτόματη εκτέλεση (έναρξη, έλεγχος, παύση) μαθημένων κινήσεων. Επίσης, τα βασικά γάγγλια είναι υπεύθυνα για την τροποποίηση της δραστηριότητας του μεταιχμιακού συστήματος καθώς και των γνωσιακών λειτουργιών εμπλέκοντας την προμετωπιαία συνειρμική περιοχή. Συνήθη κλινικά σύνδρομα λόγω παθήσεων των βασικών γαγγλίων είναι η χορεία (χορεία του Huntington), η αθέτωση, ο ημιβαλλισμός, η όψιμη δυσκινησία, το σύνδρομο Tourette και η νόσος του Parkinson. (Middleton and Strick, 2000, Baehr M. and Frotcher M., 2005). 1.4. Συνδέσεις των βασικών γαγγλίων Τα βασικά γάγγλια δέχονται προσαγωγούς ίνες από τον φλοιό, τον μεσεγκέφαλο και τον θάλαμο. Ο κύριος πυρήνας εισόδου είναι το ραβδωτό. Οι πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων είναι, κυρίως, η έξω μοίρα της ωχράς σφαίρας και η δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας. Οι απαγωγοί ίνες αυτών των πυρήνων καταλήγουν στον φλοιό μέσω του θαλάμου. Σχηματίζεται, συνεπώς, ένα κλειστό κύκλωμα μεταξύ του φλοιού, των βασικών γαγγλίων και του θαλάμου. Εφόσον ο φλοιός επιβάλλλει μια λειτουργική οργάνωση στα βασικά γάγγλια, μελέτες που σχετίζονται με την επεξεργασία της φλοιϊκής πληροφορίας μέσα από αυτές τις υποφλοιώδεις περιοχές μπορεί να μας προσφέρουν σημαντικά στοιχεία για τον ρόλο αυτών των περιοχών. Τα υπάρχοντα νευροανατομικά και ηλεκτροφυσιολογικά στοιχεία οδηγούν στην

8 διατύπωση δύο θεωριών σχετικά με τον τρόπο επεξεργασίας της πληροφορίας από τα βασικά γάγγλια. (Parent and Hazrati, 1995). Σύμφωνα με την θεωρία της «παράλληλης επεξεργασίας», διαφορετικοί τύποι πληροφορίας από τον φλοιό υφίστανται επεξεργασία από το κύκλωμα φλοιός-βασικά γάγγλια-θάλαμος-φλοιός αρκετά ανεξάρτητα μέσω πολλαπλών, παράλληλων, διαχωρισμένων κυκλωμάτων. Έχουν ταυτοποιηθεί περίπου πέντε τέτοια παράλληλα κυκλώματα: κινητικό, οπτικοκινητικό, orbitofrontal, dorsolateral προμετωπιαίο, lateral orbitofrontal, anterior cingulate. Καθένα από αυτά τα κυκλώματα φαίνεται να λαμβάνει εισόδους από ξεχωριστές φλοιϊκές περιοχές, να διασχίζει ειδικά τμήματα των βασικών γαγγλίων και του θαλάμου και να προβάλει ξανά πίσω στην περιοχή του φλοιού που παρέχει είσοδο στο κύκλωμα, σχηματίζοντας με αυτό τον τρόπο ένα μερικώς κλειστό κύκλωμα. (Parent and Hazrati, 1995). Αντίθετα, η θεωρία της «συγχώνευσης της πληροφορίας» υποστηρίζει την ύπαρξη απόλυτης συγχώνευσης της φλοιϊκής πληροφορίας μέσω του κυκλώματος φλοιός- βασικά γάγγλια-θάλαμος-φλοιός. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, η συγχώνευση θα μπορούσε να ξεκινάει στο επίπεδο του ραβδωτού με την ανάμειξη των άκρων των νευραξόνων που προέρχονται από διακριτές και λειτουργικά διαφορετικές φλοιϊκές περιοχές και να ενισχύεται ακόμα περισσότερο από την «συγχώνευση της υποδοχής» στο επίπεδο της ωχράς σφαίρας και της μέλαινας ουσίας. Αυτή η θεωρία δίνει έμφαση στην δραστική αντίθεση ανάμεσα στην τρισδιάστατη γεωμετρία των προβαλλόντων νευραξόνων και των υποδεκτικών δενδριτών στο σύμπλοκο ραβδωτού-ωχράς σφαίρας-μέλαινας ουσίας. Η ευρεία δενδριτική διακλάδωση των νευρώνων της ωχράς σφαίρας και της μέλαινας ουσίας, προσανατολισμένες κατά δεξιά γωνία στις αδιακλάδωτες εισερχόμενες νευρικές ίνες του ραβδωτού θα μπορούσε να οδηγήσει στην σύγκληση της πληροφορίας από απόμακρες λειτουργικά περιοχές του ραβδωτού σε πολλούς νευρώνες και, κατά επέκταση, στη σύγκληση της υποδοχής. (Parent and Hazrati, 1995).

9 Εικόνα 2. Στην εικόνα απεικονίζονται τα δύο μοντέλα επεξεργασίας της φλοιϊκής πληροφορίας καθώς ρέει μέσω των βασικών γαγγλίων. Α. Η υπόθεση της «παράλληλης επεξεργασίας» προτείνει ότι η πληροφορία από διαφορετικές φλοιϊκές περιοχές (A-D) παραμένει σχετικά καλά διαχωρισμένη διότι επεξεργάζεται από πολλαπλά, παράλληλα κανάλια στα βασικά γάγγλια (Α -D ) προτού καταλήξει στην φλοιϊκή περιοχή από όπου ξεκίνησε μέσω μίας στάσης στον θάλαμο. Β. Αντίθετα, η υπόθεση της «συγχώνευσης της πληροφορίας» προτείνει ότι η πληροφορία από διαφορετικές περιοχές (A-D) συγχωνεύεται μαζικά στο επίπεδο των βασικών γαγγλίων έτσι ώστε η πληροφορία (Ε) που προβάλλεται πίσω στον φλοιό είναι μία σύνθετη μείξη ποικίλων λειτουργικών υποπεριοχών. Νεότερα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι η επεξεργασία της πληροφορίας στο κύκλωμα φλοιός- βασικά γάγγλια-θάλαμος-φλοιός είναι πιο πολύπλοκη από ότι υποστηρίζουν τα δύο αυτά μοντέλα. Το κινητικό κύκλωμα είναι αυτό που εμπλέκεται περισσότερο στην παθοφυσιολογία των κινητικών διαταραχών και η οργάνωσή του θα συζητηθεί στη συνέχεια. Οι κινητικές φλοιϊκές περιοχές προβάλλουν με σωματοτοπικό τρόπο στο οπισθιο-πλάγιο τμήμα του κελύφους μέσω διεγερτικών, γλουταμινεργικών συναπτικών συνδέσεων με τους μεσαίους ακανθωτούς νευρώνες που περιέχουν GABA. Αυτοί οι νευρώνες δίνουν γένεση σε δύο μονοπάτια που συνδέουν το ραβδωτό με τους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων, κυρίως την έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας και την δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας. Οι νευρώνες που σχηματίζουν την «άμεση οδό»

10 προβάλλουν απευθείας στους πυρήνες εξόδου τους οποίους αναστέλλουν, φέρουν τους D 1 υποδοχείς και, επιπλέον, εκφράζουν τα πεπτίδια ουσία P και δυνορφίνη. Οι νευρώνες του ραβδωτού που σχηματίζουν την «έμμεση οδό», συνδέουν το ραβδωτό με τους πυρήνες εξόδου μέσω της έξω μοίρας της ωχράς σφαίρας και του υποθαλάμιου πυρήνα. Περιέχουν τους D 2 υποδοχείς της ντοπαμίνης καθώς και το πεπτίδιο εγκεφαλίνη. Οι νευρώνες που προβάλλουν από το ραβδωτό στην έξω μοίρα της ωχράς σφαίρας και από εκεί στον υποθαλάμιο πυρήνα είναι ανασταλτικές, GABA-εργικές ίνες. Οι νευρώνες που προέρχονται από τον υποθαλάμιο πυρήνα χρησιμοποιούν το γλουταμινικό ως νευροδιαβιβαστή και ενεργοποιούν την έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας και τη δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας. Η διέγερση των νευρώνων της έμμεσης οδού οδηγεί σε αναστολή της έξω μοίρας της ωχράς σφαίρας, μερική αναστολή του υποθαλάμιου πυρήνα και διέγερση της έσω μοίρας της ωχράς σφαίρας και της δικτυωτής μοίρας της μέλαινας ουσίας. Η διέγερση, επομένως, των πυρήνων εξόδου των βασικών γαγγλίων επηρεάζεται από τη διεγερτική είσοδο από την έμμεση οδό και την ανασταλτική είσοδο από την άμεση οδό. Η διέγερση των πυρήνων εξόδου οδηγεί σε αναστολή του εγκεφαλικού στελέχους και των θαλαμο-φλοιϊκών περιοχών που εμπλέκονται στην κίνηση. Το μοντέλο αυτό υποστηρίζεται από πειράματα σε πιθήκους που δείχνουν ότι η διευκόλυνση της κίνησης σχετίζεται με διακοπή της νευρωνικής δραστηριότητας στους νευρώνες της έσω μοίρας της ωχράς σφαίρας και της δικτυωτής μοίρας της μέλαινας ουσίας και ότι η διέγερση των νευρώνων της άμεσης και της έμμεσης οδού διευκολύνουν και καταστέλλουν την κινητική δραστηριότητα, αντίστοιχα. Επομένως, η άμεση και η έμμεση οδός έχουν αντίθετη επίδραση στη λειτουργία των πυρήνων εξόδου. Το μοντέλο προτείνει ότι η ντοπαμίνη τροποποιεί την γλουταμινεργική επίδραση στους φλοιοραβδωτούς νευρώνες ασκώντας μια διπλή επίδραση στους ραβδωτούς νευρώνες: διεγείροντας τους νευρώνες που εκφράζουν τους D 1 υποδοχείς στην άμεση οδό και αναστέλλοντας τους νευρώνες της έμμεσης οδού που εκφράζουν τους D 2 υποδοχείς (Obeso et al., 2000 2 ).

11 Εικόνα 3. Τα κύρια νευρωνικά κυκλώματα των βασικών γαγγλίων. Οι διεγερτικές προβολές απεικονίζονται με πράσινα βέλη. Οι ανασταλτικές προβολές απεικονίζονται με κόκκινα, πορτοκαλί ή κίτρινα βέλη. Οι νευρώνες της 5 ης στοιβάδας του εγκεφαλικού φλοιού παρέχουν διεγερτικές, γλουταμινεργικές προβολές στο ραβδωτό (φλοιοραβδωτή οδός, cortiostriatal pathway). Το ραβδωτό αποτελείται από δύο πληθυσμούς μεσαίων ακανθωτών νευρώνων. Οι νευρώνες της άμεσης οδού (κόκκινο) φέρουν D 1 υποδοχείς και προβάλλουν απευθείας στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων, την έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας (GPi) και την δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας (SNr). Οι νευρώνες της έμμεσης οδού (κίτρινο) φέρουν D 2 υποδοχείς και προβάλλουν έμμεσα στους πυρήνες εξόδου μέσω της έξω μοίρας της ωχράς σφαίρας (GPe). H GPe παρέχει ανασταλτικούς νευρώνες στην GPi και στην SNr, που δεν απεικονίζονται στο σχήμα. Η GPe παρέχει ανασταλτικούς νευρώνες στον υποθαλάμιο πυρήνα (STN). Ο STN δέχεται νευρωνική είσοδο κατευθείαν από το φλοιό μέσω της υπεράμεσης οδού (hyperdirect pathway) και παρέχει διεγερτικούς νευρώνες στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων. Η GPi και η SNr παρέχουν ανασταλτικούς νευρώνες στην μεσοραχιαία (mediodorsal, MD), στην μεσοκοιλιακή (ventromedial, VM) και στην κοιλιοπλάγια (ventrolateral, VL) περιοχές του θαλάμου, οι οποίες προβάλλουν στον προμετωπιαίο, προκινητικό και κινητικό φλοιό μέσω της θαλαμοφλοιϊκής οδού (thalamocortical pathway). Οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες στην μεσαία καλυπτρική περιοχή (VTA) και στην συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας (SNc) δίνουν γένεση σε ντοπαμινεργικές προβολές στο ραβδωτό (DA,μπλε βέλη).

12 2. Η νόσος του Parkinson 2.1. Γενικά Η νόσος του Parkinson είναι μια νευροεκφυλιστική διαταραχή με μέση ηλικία έναρξης τα 60 χρόνια και επίπτωση που αυξάνεται συνεχώς (Hughes et al., 1993). Τα κύρια κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου του Parkinson περιγράφονται στον πίνακα 1. Παθοφυσιολογικά, η νόσος του Parkinson χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων (περίπου 5% απώλεια νευρώνων κάθε χρόνο) της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας, οι οποίοι προβάλλουν στο ραβδωτό σώμα μέσω της μελαινοραβδωτής οδού. Ιστολογικά, παρατηρείται ενδοκυττάρια συσσωμάτωση ινωδών πρωτεϊνών, γνωστών ως σωμάτια του Lewy (Blum et al., 2001). Οι παρατηρούμενες αλλαγές είναι πιο έκδηλες στην πλάγιοκοιλιακή περιοχή της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας. Νευροεκφυλιστικές αλλαγές παρατηρούνται, επίσης, σε εγκεφαλικές περιοχές όπως ο υπομέλας τόπος, o βασικός πυρήνας του Meynert, o pedunculopontine (PPN), o εγκεφαλικός φλοιός και ο νωτιαίος μυελός (Obeso et al., 2000 1 ). Βιοχημικά, το σημείο κατατεθέν της νόσου του Parkinson είναι η μείωση των επιπέδων ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα κυρίως στην οπισθιοπλάγια περιοχή του κερκοφόρου πυρήνα, την περιοχή δηλαδή που νευρώνεται από την πλαγιο-κοιλιακή περιοχή της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας. Επιπλέον, αλλαγές παρατηρούνται στο σεροτονινεργικό, στο χολινεργικό και στο νοραδρενεργικό νευροδιαβιβαστικό σύστημα. Τα κλινικά συμπτώματα εμφανίζονται όταν η μείωση των νευρώνων της μέλαινας ουσίας είναι 40-60%, συνοδευόμενη από μείωση των επιπέδων ντοπαμίνης σε ποσοστό περίπου 60-70% στο ραβδωτό σώμα. Αρχικά, η νευροεκφυλιστική διαδικασία περιορίζεται κυρίως στις ντοπαμινεργικές ίνες που νευρώνουν την οπισθιο-πλάγια περιοχή του κερκοφόρου πυρήνα και, συνεπώς, οι κλινικές εκδηλώσεις είναι πρωταρχικώς κινητικές. Καθώς η νόσος εξελίσσεται, η απώλεια ντοπαμίνης επεκτείνεται για να συμπεριλάβει ολόκληρο το ραβδωτό, περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού, το στέλεχος και τον νωτιαίο μυελό. (Obeso et al., 2000 1 ).

13 Πίνακας 1: Κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου του Parkinson (Obeso JA et al., 2000 1 ) Κινητικές εκδηλώσεις: Τα κύρια χαρακτηριστικά της νόσου του Parkinson είναι ο τρόμος ηρεμίας, η ακινησία/βραδυκινησία και η δυσκαμψία. Συνήθως εμφανίζονται ασύμμετρα, επηρεάζοντας αρχικώς ένα τμήμα του σώματος ή ένα ημιμόριο. Η μειωμένη έκφραση του προσώπου, το μειωμένο ανοιγοκλείσιμο των βλεφάρων και η υποφωνία μπορεί να είναι, επίσης, αρχικές εκδηλώσεις. Η εξάπλωση των κλινικών εκδηλώσεων στα δύο άκρα και στους αξονικούς μύες συνήθως συμβαίνει 3-5 χρόνια μετά την διάγνωση και συνήθως υποδηλώνει επέκταση της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας. Διαταραχές της θέσης και του βαδίσματος εκδηλώνονται μετά από αυτό το ενδιάμεσο στάδιο και μπορεί να είναι η αιτία μεγάλης ανικανότητας. Τρόμος ηρεμίας: Ο τρόμος στη νόσο του Parkinson είναι τυπικά τρόμος ηρεμίας και εξαφανίζεται όταν εκτελείται μια εκούσια κίνηση. Η ηλεκτρομυογραφική καταγραφή δείχνει ρυθμικές εκφορτίσεις συχνότητας 4-6Hz με εναλλακτική ενεργοποίηση των αγωνιστών και ανταγωνιστικών μυϊκών ομάδων. Οι απομακρυσμένες αρθρώσεις των άκρων επηρεάζονται εκλεκτικά. Ο τρόμος μπορεί να είναι διακοπτόμενος και αυξάνεται με το stress ή με χειρισμούς που απαιτούν συγκέντρωση όπως η αρίθμηση λέξεων. Παρόλο που ο τρόμος προσδιορίζει την παρκινσονική κατάσταση είναι περισσότερο μια πηγή αμηχανίας παρά ανικανότητας για τους περισσότερους ασθενείς. Δυσκαμψία: Η δυσκαμψία είναι μια παθητική αύξηση του μυϊκού τόνου των εκτεινόντων και καμπτήρων μυϊκών ομάδων που επεκτείνεται σε όλο το εύρος της κίνησης. Αυτό κλινικά εκφράζεται ως δυσκαμψία των μυϊκών ομάδων οφειλόμενη στην αδυναμία απόκτησης πλήρους μυϊκής χαλάρωσης. Το πιο τυπικό κλινικό χαρακτηριστικό είναι η αυξημένη αντίσταση στην παθητική κίνηση των αρθρώσεων που συχνά σχετίζεται με το σημείο οδοντωτού τροχού. Η ταυτόχρονη εκούσια κίνηση άλλων σημείων του σώματος μπορεί να προκαλέσει αύξηση στη δυσκαμψία (σημείο του Froment). Ακινησία: Ακινησία σημαίνει απουσία κίνησης, αλλά στη νόσο του Parkinson συνήθως αναφέρεται σε μια βραδύτητα στην εκτέλεση κινήσεων (βραδυκινησία) ή σε μια δυσκολία στην έναρξη αυθόρμητων κινήσεων (υποκινησία). Στη νόσο του Parkinson υπάρχει μια μείωση στη συχνότητα και στο εύρος των κινήσεων. Αυτόματες κινήσεις όπως το άνοιγμα και το κλείσιμο των ματιών, η ταλάντευση των άνω άκρων ή το εύρος του διασκελισμού κατά τη βάδιση καθώς και πιο περίπλοκες εκούσιες κινήσεις όπως το γράψιμο, η κατάποση, το βούρτσισμα των δοντιών μπορεί να επηρεαστούν. Αστάθεια θέσεως και διαταραχή βαδίσματος: Αυτές οι ανωμαλίες λαμβάνουν χώρα σε ένα πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου όταν επηρεάζονται τα αντανακλαστικά όρθιας θέσης. Αυτό σχετίζεται με απώλεια της ισορροπίας και πτώση. Το παρκινσονικό βάδισμα χαρακτηρίζεται από κάμψη του κορμού και μειωμένο κούνημα των χεριών, πιο έντονο από την πιο επηρεασμένη πλευρά του σώματος. Το μήκος του δρασκελισμού μειώνεται, τα γόνατα κάμπτονται και αναπτύσσεται ένας τύπος βαδίσματος όπου ο ασθενής σέρνει τα βήματά του. Καθώς η νόσος προχωράει, εμφανίζεται το πάγωμα. Αρχικά, αυτό περιλαμβάνει δισταγμό κατά την έναρξη των κινήσεων κατά τον οποίο οι ασθενείς παγώνουν όταν προσπαθούν να αρχίσουν να βαδίζουν, όταν γυρνάνε ή όταν περνάνε μέσα από στενά μέρη. Μια ενδιαφέρουσα πλευρά του παγώματος είναι ότι μπορεί να ξεπεραστεί με αισθητικά τεχνάσματα, όπως το να περάσει ο ασθενής πάνω από μία γραμμή του πατώματος ή χρησιμοποιώντας διαφορετική στρατηγική στον τρόπο του βαδίσματος, όπως το να παρελαύνουν. Μη-κινητικά χαρακτηριστικά: Τα γνωσιακά ελλείμματα είναι τα πιο σημαντικά από τα κλινικά χαρακτηριστικά που εμφανίζονται με την πάροδο του χρόνου. Η άνοια απαντάται στο 30% των ασθενών με νόσο του Parkinson, ειδικά σε ηλικίες άνω των 70 ετών. Βλάβες στις εκτελεστικές και οπτικο-χωρικές λειτουργίες, συνοδευόμενες από παραισθήσεις, παρατηρούνται συχνά. Οι παραισθήσεις συνήθως αναπτύσσονται ως παρενέργεια της θεραπείας. Γενικευμένη σύγχυση, αποπροσανατολισμός, υπνηλία, διάσπαση της προσοχής, δυσκολίες στην εύρεση λέξεων και απώλεια ανώτερων νοητικών λειτουργιών είναι πιθανό να παρατηρηθούν. Η κατάθλιψη μπορεί να εμφανιστεί σε κάθε στάδιο της νόσου. Δυσλειτουργίες του αυτόνομου, όπως ακράτεια ούρων, σεξουαλική δυσλειτουργία, ορθοστατική υπόταση, εφίδρωση και δυσκοιλιότητα καθώς και αισθητικά συμπτώματα όπως πόνος, αιμωδίες και αίσθημα καύσου, επίσης απαντώνται συχνά.

14 Παρόλο που η αιτιολογία της νόσου του Parkinson δεν είναι γνωστή, περιβαλλοντικοί ή γενετικοί παράγοντες μπορεί να συνεισφέρουν στην παθογένεση της. Η ιδέα της περιβαλλοντικής συμμετοχής προήλθε από την ανακάλυψη της τοξίνης 1-μεθυλο-4-φαινυλο-1,2,3,6-τετραυδροπυριδίνη ή MPTP, η οποία προκαλεί εκλεκτικά θάνατο των νευρώνων της μέλαινας ουσίας αναπαράγοντας τα συμπτώματα της νόσου του Parkinson. Αν και αυτή η τοξίνη δεν ανευρίσκεται στις περιπτώσεις με νόσο του Parkinson, είναι πιθανό να επιδρούν άλλοι περιβαλλοντικοί παράγοντες όταν υπάρχει επιρρεπές υπόστρωμα. Η ανάλυση οικογενειών με επικρατή κληρονομικότητα της νόσου και η μελέτη διδύμων υποστηρίζουν την ιδέα της γενετικής συμμετοχής στην αιτιολογία της νόσου του Parkinson. Σε μερικές οικογένειες έχουν βρεθεί μεταλλάξεις σε γονίδια, όπως τα γονίδια πάρκιν και α- συνουκλεϊνη. Παρόλα αυτά, η πλειοψηφία των περιπτώσεων με νόσο του Parkinson έχει σποραδικό χαρακτήρα εμφάνισης χωρίς οικογενειακό ιστορικό της νόσου. (Blum et al., 2001). Η πιο διαδεδομένη θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου του Parkinson είναι η χορήγηση μιας πρόδρομης ουσίας της ντοπαμίνης, της L-dopa ή λεβοντόπα, η οποία προσλαμβανόμενη από τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες που δεν έχουν εκφυλιστεί μετατρέπεται, μέσω του ενζύμου αποκαρβοξυλάση της ντοπαμίνης, σε ντοπαμίνη. Η εμφάνιση της λεβοντόπα στα τέλη της δεκαετίας του 60 αντιπροσώπευσε μια μεγάλη αλλαγή στη θεραπεία της νόσου του Parkinson, παρέχοντας μεγάλα κλινικά οφέλη σε όλους τους ασθενείς και μειώνοντας τη θνησιμότητα. Σύντομα, όμως, έγινε φανερό ότι η χρήση της λεβοντόπα δεν είναι άμοιρη παρενεργειών. Μετά από 10-15 χρόνια χρήσης της λεβοντόπα παρατηρείται ανάπτυξη κινητικών επιπλοκών, όπως διακυμάνσεις στην κινητική απάντηση, δυσκινησίες και ακούσιες κινήσεις. Νευροψυχιατρικές επιπλοκές αναπτύσσονται στο 40% των ασθενών και συμπεριλαμβάνουν νυχτερινή σύγχυση, ζωντανά όνειρα, παραισθήσεις και ντελίριο. Ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών, περίπου 30%, τελικά αναπτύσσουν άνοια. Επιπρόσθετα, η ίδια η πρόοδος της νόσου σχετίζεται με την ανάπτυξη νέων χαρακτηριστικών, όπως δυσλειτουργία του αυτόνομου, ακινησία και αστάθεια, που δεν ελέγχονται από την λεβοντόπα και αντανακλούν εκφύλιση των μη ντοπαμινεργικών συστημάτων. Ο μηχανισμός που ευθύνεται για την ανάπτυξη αυτών των χαρακτηριστικών δεν είναι γνωστός. Μία υπόθεση είναι

15 ότι μπορεί να οφείλονται στη διεγερσιτοξικότητα του γλουταμινικού στις εγκεφαλικές δομές που νευρώνονται από τον υποθαλάμιο πυρήνα, ο οποίος χρησιμοποιεί γλουταμινικό ως νευροδιαβιβαστή και είναι υπερδραστήριος στη νόσο του Parkinson. Μία άλλη υπόθεση είναι ότι μπορεί να οφείλονται στην απελευθέρωση ελεύθερων ριζών μέσω του οξειδωτικού μεταβολισμού της λεβοντόπα. (Obeso et al., 2000 1 ). 2.2. Μεταβολή του μοντέλου του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων στη νόσο του Parkinson Η νόσος του Parkinson χαρακτηρίζεται από τη σταδιακή, προοδευτική εκφύλιση των νευρώνων της ντοπαμινεργικής οδού. Σύμφωνα με το μοντέλο λειτουργίας του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων, το κύριο παθοφυσιολογικό χαρακτηριστικό της παρκινσονικής κατάστασης είναι η αυξημένη νευρωνική δραστηριότητα στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων (GPi/SNr), η οποία οδηγεί σε μαζική αναστολή των θαλαμοφλοιϊκών κινητικών συστημάτων καθώς και των κινητικών συστημάτων του εγκεφαλικού στελέχους. Το μοντέλο προβλέπει ότι η μειωμένη δραστηριοποίηση των ντοπαμινικών υποδοχέων, που προκαλείται από την ανεπάρκεια ντοπαμίνης, έχει ως αποτέλεσμα την μειωμένη αναστολή των νευρώνων της έμμεσης οδού και την μειωμένη διέγερση των νευρώνων της άμεσης οδού. Μειωμένη αναστολή των νευρώνων της έμμεσης οδού οδηγεί σε μαζική αναστολή των νευρώνων της έξω μοίρας της ωχράς σφαίρας, μειωμένη αναστολή του υποθαλάμιου πυρήνα και αυξημένη διέγερση της έσω μοίρας της ωχράς σφαίρας και της δικτυωτής μοίρας της μέλαινας ουσίας, ενώ η μειωμένη ενεργοποίηση της άμεσης οδού προκαλεί μείωση της ανασταλτικής επίδρασης στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων. Το καθαρό αποτέλεσμα είναι μια μαζική ενεργοποίηση των πυρήνων εξόδου των βασικών γαγγλίων, οι οποίοι με τη σειρά τους αναστέλλουν τα κινητικά συστήματα, οδηγώντας στα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου του Parkinson. Το μοντέλο αυτό εξηγεί την ευεργετική επίδραση που έχει η βλάβη της έσω μοίρας της ωχράς σφαίρας και του υποθαλάμιου πυρήνα στην αντιμετώπιση των παρκινσονικών συμπτωμάτων η οποία οδηγεί σε μειωμένη

16 δραστηριοποίηση της δικτυωτής μοίρας της μέλαινας ουσίας και της έσω μοίρας της ωχράς σφαίρας. Πράγματι, ο υψηλής συχνότητας ερεθισμός (deep brain stimulation) αυτών των περιοχών παρέχει δραματικό όφελος στους ασθενείς με νόσο του Parkinson, αποκαθιστώντας την θαλαμο-φλοιώδη δραστηριότητα. (Obeso JA et al., 2000 2 ) Εικόνα 4: Σχηματική αναπαράσταση του κλασσικού μοντέλου των βασικών γαγγλίων Απεικονίζονται η φυσιολογική (a), η παρκινσονική (b) και η δυσκινητική (c) κατάσταση. Τα μπλε βέλη αντιπροσωπεύουν τις ανασταλτικές προβολές ενώ τα κόκκινα βέλη τις διεγερτικές. Το πάχος του βέλους υποδεικνύει τον βαθμό της ενεργοποίησης της κάθε προβολής. Το ραβδωτό επικοινωνεί με τους πυρήνες εξόδου στην έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας (GPi) και της δικτυωτής μοίρας της μέλαινας ουσίας (SNr) μέσω της άμεσης οδού, ενώ με την έξω μοίρα της ωχράς σφαίρας (GPe) και τον υποθαλάμιο πυρήνα (STN) μέσω της έμμεσης οδού. Η ντοπαμίνη αναστέλλει την νευρωνική δραστηριότητα στην έμμεση οδό και την διεγείρει στην άμεση. (b) Στην παρκινσονική κατάσταση, η ανεπάρκεια ντοπαμίνης οδηγεί σε αναστολή των νευρώνων του ραβδωτού που φέρουν τους D2 υποδοχείς στην έμμεση οδό, οδηγώντας στην αναστολή της GPe και του STN. Η προκύπτουσα υπερδραστηριότητα των νευρώνων του STN οδηγεί σε υπερδιέγερση των GPi/SNr και αναστολή των θαλαμο-φλοιϊκών και των κινητικών κέντρων του στελέχους με αποτέλεσμα τον παρκινσονισμό. (c) Η δυσκινησία που προκαλεί η L-dopa χαρακτηρίζεται από μειωμένη δραστηριότητα του STN, που με το κλασσικό μοντέλο αποδίδεται σε αναστολή των ραβδωτο- GPe νευρώνων μέσω της ντοπαμίνης, με αποτέλεσμα αναστολή του STN και μειωμένη ενεργοποίηση των GPi/SNr. Το καθαρό αποτέλεσμα είναι η μειωμένη αναστολή των θαλαμο-φλοιϊκών νευρώνων με υπερβολική ενεργοποίηση των κινητικών κέντρων του φλοιού με αποτέλεσμα δυσκινησία.

17 3. Μυς weaver 3.1. Γενικά Ο μεταλλαγμένος μυς weaver χαρακτηρίζεται από μία προοδευτική, γενετικά επαγόμενη εκφύλιση των κυττάρων της μελαινοραβδωτής ντοπαμινεργικής οδού. Μπορεί, δηλαδή, να θεωρηθεί ως ένα παθοφυσιολογικό αντίγραφο του παρκινσονισμού. Ο μυς weaver αποτελεί ένα πολύτιμο πειραματικό μοντέλο για την διαλεύκανση των μηχανισμών που ευθύνονται για την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων καθώς και ένα πολύτιμο εργαλείο για την έρευνα πάνω στην επιβίωση και ανάπτυξη μοσχευμάτων εμβρυϊκών ντοπαμινεργικών κυττάρων στο χρόνια απονευρωμένο ραβδωτό σώμα (Triarhou 2002). Η μετάλλαξη weaver (wv) επιδρά επίσης πάνω στην επιβίωση, ανάπτυξη και οργάνωση των κυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού και του ιπποκάμπου, καθώς και στην μετανάστευση των κυττάρων της παρεγκεφαλίδας. Ειδικά, η βλάβη στην παρεγκεφαλίδα αποτελεί πολύτιμο πρότυπο μελέτης των μηχανισμών επέκτασης των νευριτών, νευρωνικής μετανάστευσης και αναδιοργάνωσης των συναπτικών κυκλωμάτων (Triarhou 2002). Πολλές ανθρώπινες νόσοι χαρακτηρίζονται από γενετικά καθορισμένη εκφύλιση των μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών νευρώνων, όπως οι οικογενείς μορφές της νόσου του Parkinson, η ελαιογεφυροπαρεγκεφαλιδική ατροφία, ή η ατροφία των κοκκοειδών κυττάρων της παρεγκεφαλίδας τύπου Νόρμαν. Συνεπώς, το πειραματικό μοντέλο weaver αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για την μελέτη της σύνδεσης μεταξύ των μηχανισμών εκφύλισης των ντοπαμινεργικών νευρώνων, με αυτούς που ευθύνονται για τις παρεγκεφαλιδικές ατροφίες (Triarhou 2002). 3.2. Γενετική της μετάλλαξης weaver H μετάλλαξη weaver προέκυψε με αυθόρμητο τρόπο το 1961 σε μία αποικία μυών του στελέχους C57BL/6J. Στην αρχή θεωρήθηκε ως αυτοσωματική υπολειπόμενη, καθώς μόνο οι ομοζυγώτες μύες για το

18 μεταλλαγμένο αλληλόμορφο (wv/wv), εκδήλωναν νευρολογικά συμπτώματα κινητικής δυσλειτουργίας (Sidman et al. 1965). Στη συνέχεια, όμως, παρατηρήθηκαν κυτταροαρχιτεκτονικές ανωμαλίες στην παρεγκεφαλίδα των ετεροζυγωτών (wv/+) μυών, οι οποίες ήταν μικρότερου βαθμού από αυτές των ομοζυγωτών και, έτσι, η μετάλλαξη χαρακτηρίστηκε ως ατελώς επικρατής ή ημιεπικρατής (Sotelo 1980, Smeyne and Goldowitz 1990). Το αλληλόμορφο wv χαρτογραφήθηκε στο απομακρυσμένο άκρο του χρωμοσώματος 16 του μυός, σε απόσταση 60 centimograns από το κεντρομερίδιο. Μέσα στην ίδια κοντινή περιοχή, χαρτογραφήθηκαν οι γενετικοί τόποι της υπεροξειδικής δισμουτάσης (Sod-1), του ομόλογου στα θηλαστικά πρωτοογκογονιδίου που προκαλεί λευχαιμία στα πτηνά (Ets-2) και του γονίδιου που κωδικοποιεί το πρόδρομο μόριο της β-αμυλοειδούς πρωτείνης (βapp). Τα τρία αυτά γονίδια καταλαμβάνουν μια περιοχή 3.2 cm κοντά στο wv. Τα τρία παραπάνω γονίδια έχουν χαρτογραφηθεί μαζί στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 21, η περιοχή του τελομέρους του οποίου είναι σε μεγάλο βαθμό ομόλογη με αυτήν του χρωμοσώματος 16 του μυός και φυλογενετικά συντηρημένη (Triarhou 2002). Μελέτες γονιδίων τα οποία βρίσκονται στο χρωμόσωμα 16 κοντά στο γενετικό τόπο wv (μεταξύ των οποίων και της βapp) έχουν δείξει, ότι η έκφραση τους δεν επηρεάζεται από την παρουσία του γειτονικού μεταλλαγμένου γονιδίου wv (Sola 1993). H μετάλλαξη wv χαρακτηρίζεται ως μετάλλαξη με λάθος νόημα (missense mutation) και οδηγεί σε αντικατάσταση γουανίνης από αδενίνη (G A) στο νουκλεοτίδιο 953 του γονιδίου GIRK2, που κωδικοποιεί έναν δίαυλο Κ + εσωτερικής ανόρθωσης, ο οποίος συνδέεται με G-πρωτείνες. Σε επίπεδο πρωτεΐνης, τo αποτέλεσμα της μετάλλαξης είναι η αντικατάσταση ενός αμινοξέος γλυκίνης από σερίνη στην θέση 156 (εικόνα 5) (Patil et al., 1995). Οι δίαυλοι GIRK είναι ιοντικοί δίαυλοι εκλεκτικοί στο K +, οι οποίοι συνδέονται με G- πρωτείνες. Ανήκουν στην υπεροικογένεια των διαύλων Κ + εσωτερικής ανόρθωσης Kir (Doupnik et al., 1995). Oι δίαυλοι αυτοί ενεργοποιούνται από μία πληθώρα υποδοχέων νευροδιαβιβαστών, που συνδέονται με G-πρωτείνες, όπως αδρενεργικούς, μουσκαρινικούς, χολινεργικούς, πουρινεργικούς, ντοπαμινεργικούς, σεροτονινεργικούς,

19 υποδοχείς οπιοειδών και τους υποδοχείς GABA B. Oι GIRK ενεργοποιούνται επίσης και από το ενδοκυττάριο Na +. Θεωρείται ότι η ενεργοποίηση των διαύλων GIRK γίνεται μέσω απ ευθείας σύνδεσης τους με το διμερές βγ των G-πρωτεϊνών (Gβγ). Το κλείσιμο (gating), όμως, των διαύλων GIRK ρυθμίζεται από την υπομονάδα G ai. Παράγοντες όπως η μεμβρανική διφωσφορική φωσφατυδιλοινοσιτόλη (PIP2), τοπικά μεμβρανοδιαπερατά αναισθητικά, ή η αιθανόλη μπορεί να επιδρούν και να ρυθμίζουν την παραπάνω ενεργοποίηση από τις G-πρωτείνες (Harkins and Fox, 2002, Peleg et al., 2002). Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση της υπομονάδας GIRK2. Η μαύρη χάντρα υποδεικνύει την περιοχή όπου συμβαίνει η υποκατάσταση γλυκίνης από σερίνη στην μετάλλαξη weaver. Υπάρχουν τουλάχιστον 7 μέλη στην οικογένεια των διαύλων GIRK (GIRK1-7ή Κir 3.1-7). Οι δίαυλοι GIRK θεωρείται ότι είναι ετεροτετραμερή αποτελούμενοι από 2 έως 4 διαφορετικές υπομονάδες αν και η στοιχειομετρία τους δεν είναι επακριβώς γνωστή. Οι λειτουργικές ιδιότητες του διαύλου, όπως η ιοντική εκλεκτικότητα και η εξάρτηση από τις G-πρωτείνες, εξαρτώνται όχι μόνο από την σύστασή του, αλλά και από την θέση της κάθε μιας υπομονάδας μέσα στο τετραμερές σύμπλοκο. Κάθε υπομονάδα έχει δύο περιοχές που διαπερνούν την μεμβράνη (Μ1 και Μ2), οι οποίες είναι ομόλογες με τους διαμεμβρανικούς τομείς S5 και S6 των τασοελεγχόμενων διαύλων K +, ενώ τόσο το αμινοτελικό όσο και το καρβοξυτελικό της άκρο βρίσκονται στην κυτταροπλασματική πλευρά της μεμβράνης. H γλυκίνη στην θέση 156, που αντικαθίσταται από σερίνη στους μύες weaver, είναι το πρώτο στην σειρά αμινοξύ του μοτίβου γλυκίνη-τυροσίνη-γλυκίνη, το οποίο είναι συντηρημένο μεταξύ των διαφόρων διαύλων Κ + εσωτερικής ανόρθωσης, καθώς και των τασοελεγχόμενων διαύλων ασβεστίου και βρίσκεται στην

20 περιοχή H5 του ιοντικού πόρου του διαύλου. Μεταλλάξεις σε αυτήν την συντηρημένη περιοχή είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την εκλεκτικότητα του διαύλου στα διάφορα ιόντα (Doupnik et al., 1995, Harkins and Fox, 2002, Patil et al., 1995). Ο ρόλος των διαύλων GIRK είναι σημαντικός, καθώς σταθεροποιούν το δυναμικό ηρεμίας του κυττάρου κοντά στο δυναμικό ισορροπίας του Κ +, καθιστώντας έτσι τα κύτταρα λιγότερο διεγέρσιμα και προστατεύοντάς τα από φαινόμενα διεγερτικής τοξικότητας. Οι GIRK εισάγουν μέσα στο κύτταρο Κ +, ενώ δεν ευνοείται η έξοδός του από το κύτταρο εξ αιτίας της ύπαρξης ιόντων Mg 2+ και πολυαμινών στον ιοντικό του πόρο. Η αγωγιμότητα του διαύλου αυξάνεται μετά από υπερπόλωση του κυττάρου (Lopatin et al. 1995, Doupnik et al., 1995, Harkins and Fox, 2002). Στα θηλαστικά απαντώνται μόνο οι υπομονάδες GIRK 1-4, εκ των οποίων μόνο οι 1-3 εκφράζονται στον εγκέφαλο. Η GIRK3 εκφράζεται αποκλειστικά στον εγκέφαλο, η GIRK2 στον εγκέφαλο και στους όρχεις, ενώ η GIRK1 σε διάφορους ιστούς. Στον εγκέφαλο, υπάρχει αλληλοεπικάλυψη της έκφρασης των υπομονάδων GIRK1-3 στις διάφορες περιοχές. Συγκεκριμένα, και οι τρεις υπομονάδες εκφράζονται στα κοκκοειδή κύτταρα της παρεγκεφαλίδας, σε όλο τον εγκεφαλικό φλοιό, στον ιππόκαμπο, στην αμυγδαλή, στους γεφυρικούς πυρήνες, στον οσφρητικό λοβό, καθώς και στα αναπτυσσόμενα κύτταρα Purkinje. Στην αρχή της ανάπτυξης, στην μέλαινα ουσία ανευρίσκονται οι υπομονάδες GIRK2 και GIRK3, ενώ στον ενήλικο μυ η μόνη υπομονάδα που εκφράζεται είναι η GIRK2. Η υπομονάδα GIRK2 απουσιάζει από τους διαύλους GIRK που βρίσκονται στο ραβδωτό σώμα και στον θάλαμο. Η GIRK2 συγκροτεί είτε ομομερείς, είτε ετερομερείς διαύλους με τις άλλες δύο υπομονάδες (Patil et al., 1995, Hess, 1996). Ο κυτταρικός θάνατος που παρατηρείται στους μύες weaver μπορεί να αποτέλεσμα διεγερσιτοξικότητας. Συγκεκριμένα, ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες στα ωοκύτταρα του Xenopus έδειξαν ότι, σε αντίθεση με τους διαύλους GIRK2 των φυσιολογικών μυών, οι μεταλλαγμένοι ομομερείς δίαυλοι weaver GIRK2 χάνουν την εκλεκτικότητά τους ως προς το Κ +, οδηγώντας στην συνεχή παραγωγή ρευμάτων Na +, ενώ οι ετεροπολυμερείς δίαυλοι weaver GIRK2 με GIRK1, οδηγούν στην δημιουργία διαύλων με μειωμένο ιοντικό ρεύμα Κ + (Slesinger et al. 1996). Επιπλέον, η παραπάνω μετάλλαξη οδηγεί σε μη