COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2

COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 48 Tests P/N: 04861817 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: 03502295 001 ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0, για χρήση με το Σύστημα High Pure (HPS) είναι μία in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση των γονότυπων RNA 1 έως 6 του ιού της Ηπατίτιδας C (HCV) σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα, χρησιμοποιώντας το High Pure System Viral Nucleic Acid Kit για χειροκίνητη προετοιμασία του δείγματος και τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. Η εξέταση προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα και άλλους εργαστηριακούς δείκτες ως βοήθημα στην εκτίμηση της ιολογικής ανταπόκρισης στην αντιιική θεραπεία όπως μετρήθηκε από τις μεταβολές στα επίπεδα HCV RNA ορού ή πλάσματος. Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι οι αρχικές αλλαγές στα επίπεδα HCV RNA στον ορό και στο πλάσμα μπορούν να αποτελέσουν ένδειξη για μακροπρόθεσμη απόκριση σε θεραπεία με ιντερφερόνη 1. Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 δεν προορίζεται για χρήση ως τεστ ελέγχου (screening test) για την παρουσία HCV στο αίμα ή σε παράγωγα αίματος ή ως διαγνωστική εξέταση για την επιβεβαίωση της παρουσίας μόλυνσης HCV. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Ο ιός της ηπατίτιδας C θεωρείται ο βασικός αιτιολογικός παράγοντας που είναι υπεύθυνος για το 90-95% των περιπτώσεων ηπατίτιδας μη-a και μη-b μετά τη μετάγγιση 2-4. Ο HCV είναι ένας ιός με θετικής κατεύθυνσης μονόκλωνο RNA με ένα γονιδίωμα περίπου 10.000 νουκλεοτιδίων που κωδικοποιεί για 3000 αμινοξέα. Ως ιός που μεταδίδεται με το αίμα, ο HCV μπορεί να μεταδοθεί με το αίμα και τα παράγωγα αίματος. Η ευρεία εφαρμογή μέτρων διαγνωστικού ελέγχου του HCV στο αίμα έχει μειώσει αισθητά τον κίνδυνο της ηπατίτιδας που σχετίζεται με τη μετάγγιση αίματος. Ησυχνότητα εμφάνισης της μόλυνσης HCV είναι υψηλότερη σε σχέση με την ενδοφλέβια χρήση ναρκωτικών και σε μικρότερο βαθμό με άλλες διαδερμικές εκθέσεις 4. Η παγκόσμια επικράτηση της μόλυνσης HCV, όπως προσδιορίστηκε από την ανοσοορολογία, κυμαίνεται από 1,0% στην Ευρώπη έως 5,3% στην Αφρική 5. Η παρουσία των αντισωμάτων anti-hcv σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί με HCV οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοορολογικών αναλύσεων που είναι ειδικές για αυτά τα αντισώματα. Η παρουσία των αντισωμάτων anti-hcv, ωστόσο, είναι μια μέτρηση για προηγηθείσα έκθεση σε μόλυνση HCV, αλλά δεν μπορεί να θεωρηθεί ένδειξη για τρέχουσα μόλυνση. Επιπλέον, δεν είναι διαθέσιμη ούτε η άμεση ανίχνευση με μεθόδους ιικής καλλιέργειας. Η μέτρηση των επιπέδων αλανίνης αμινοτρανσφεράσης (ALT) θεωρείται υποκατάστατος δείκτης της μόλυνσης HCV, αλλά δεν αποτελεί άμεση μέτρηση της ιαιμίας. Ο βαθμός αύξησης της ALT δεν μπορεί να συσχετιστεί άμεσα με το επίπεδο της μόλυνσης HCV. Στην πραγματικότητα, αύξηση της ALT παρατηρείται λόγω πολλών άλλων αιτιών φλεγμονής του ήπατος εκτός από την ιική ηπατίτιδα. Αντίθετα, η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση του HCV RNA με ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος με Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) παρέχει μια μέτρηση ενεργής ιαιμίας 6-8. Με τη χρήση της PCR είναι δυνατή η ανίχνευση ιαιμίας HCV πριν από την ανοσολογική ορομετατροπή 9-10 καθώς και η ανίχνευση των μεταβολών στο ιικό φορτίο σε ασθενείς με χρόνια μόλυνση HCV ασθενείς και θετικά αντισώματα που υποβάλλονται σε θεραπεία με ιντερφερόνη 1. 04873505052-04EL 1

ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 βασίζεται σε τρεις κύριες διαδικασίες: (1) χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων για την εκχύλιση του HCV RNA, (2) αυτοματοποιημένη αντίστροφη μεταγραφή του RNA στόχου για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cdna), (3) ενίσχυση PCR του cdna στόχου με χρήση ειδικών για το HCV συμπληρωματικών εκκινητών και ταυτόχρονη ανίχνευση διπλά επισημασμένων με φθορίζουσα χρωστική διασπώμενων ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών που επιτρέπουν την ποσοτικοποίηση του ενισχυμένου προϊόντος HCV στόχου (amplicon). Το αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος περιέχει ζεύγη εκκινητών και ιχνηθετών ειδικών για το HCV RNA και το RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNΑ εκτελείται με ειδικούς για το στόχο και για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένους ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες που επιτρέπουν την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) HCV και του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Η ποσοτικοποίηση του ιικού HCV RNA εκτελείται με τη χρήση του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV είναι μια μη μολυσματική σύνθεση Armored RNA που περιέχει τις αλληλουχίες HCV με τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με το HCV RNA στόχο και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV από τον κλώνο (amplicon) στόχο του HCV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV ενσωματώνεται σε κάθε μεμονωμένο δείγμα και ορό ελέγχου σε ένα γνωστό αριθμό αντιγράφων και μεταφέρεται μέσω της προετοιμασίας δείγματος, της αντίστροφης μεταγραφής, της ενίσχυσης PCR και της ανίχνευσης μαζί με το HCV στόχο. Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής υπολογίζει τον τίτλο HCV RNA στα δείγματα εξέτασης συγκρίνοντας το σήμα HCV με το σήμα του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV αντισταθμίζει τα αποτελέσματα της αναστολής και ελέγχει τη διαδικασία προετοιμασίας και ενίσχυσης, ώστε να είναι δυνατή η ακριβής ποσοτικοποίηση του HCV RNA σε κάθε δείγμα. Επιλογή Στόχου Η επιλογή της αλληλουχίας RNA στόχου για το HCV εξαρτάται από τον εντοπισμό των περιοχών εντός του γονιδιώματος HCV που επιδεικνύουν μέγιστο βαθμό διατήρησης αλληλουχίας μεταξύ των διάφορων γονότυπων HCV 11,12. Η 5'-μη κωδικεύουσα περιοχή του γονιδιώματος HCV έχει επιδείξει μέγιστη διατήρηση των αλληλουχιών RNA μεταξύ των γνωστών γονότυπων HCV 13. Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 χρησιμοποιεί αντίστροφη μεταγραφή και εκκινητές ενίσχυσης PCR που καθορίζουν μια αλληλουχία εντός της υψηλής διατήρησης περιοχής της 5'-μη κωδικεύουσας περιοχής του γονιδιώματος HCV. Προετοιμασία Δείγματος Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 επεξεργάζεται τα δείγματα πλάσματος EDTA και ορού και απομονώνει το HCV RNA μέσω γενικής χειροκίνητης προετοιμασίας δείγματος με βάση τη δέσμευση του νουκλεϊκού οξέος σε ίνες υάλου. Πραγματοποιείται λύση των σωματιδίων του ιού HCV μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει τα νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο HCV RNA από RNases σε πλάσμα και ορό. Σε κάθε δείγμα εισάγεται ένας γνωστός αριθμός μορίων RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV μαζί με το αντιδραστήριο λύσης. Στη συνέχεια, προστίθεται ισοπροπανόλη στο μίγμα λύσης, το οποίο στη συνέχεια υποβάλλεται σε φυγοκέντριση μέσω στήλης με ένθετο φίλτρο από ίνες υάλου. Κατά τη φυγοκέντριση, το HCV RNA και το RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV δεσμεύονται στην επιφάνεια του φίλτρου από ίνες υάλου. Οι μη δεσμευμένες ουσίες, όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με τη φυγοκέντριση. Τα νουκλεϊκά οξέα που έχουν προσροφηθεί εκπλένονται και εκλούονται με υδατικό διάλυμα. Τα αναλώσιμα επιτρέπουν την παράλληλη επεξεργασία 12 δειγμάτων ή πολλαπλασίων αυτών. Το δείγμα που έχει υποβληθεί σε επεξεργασία και περιέχει HCV RNA και RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV προστίθεται στο μίγμα ενίσχυσης/ ανίχνευσης. Το HCV RNA στόχος και το RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV υποβάλλονται, στη συνέχεια, σε ενίσχυση και ανίχνευση στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή με χρήση των αντιδραστηρίων ενίσχυσης και ανίχνευσης που παρέχονται στο κιτ Εξέτασης. 2 04873505052-04EL

Αντίστροφη Μεταγραφή και Ενίσχυση PCR Αντίστροφη Μεταγραφή Η αντίστροφη μεταγραφή, η αντίδραση ενίσχυσης PCR και οι αντιδράσεις ανίχνευσης εκτελούνται με το θερμοσταθερό ανασυνδυασμένο ένζυμο Thermus specie Z05 DNA Πολυμεράσης (Z05). Παρουσία μαγγανίου (Mn 2+ ) και με τις κατάλληλες συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος, το Z05 παρουσιάζει δραστηριότητα αντίστροφης τρανσκριπτάσης καθώς και DNA πολυμεράσης 14,15. Έτσι, είναι δυνατή η πραγματοποίηση της αντίστροφης μεταγραφής, της ενίσχυσης PCR και της ανίχνευσης στο ίδιο μίγμα αντίδρασης. Τα επεξεργασμένα δείγματα προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (K-tubes), στα οποία πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση PCR. Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται, ώστε ο αντινοηματικός εκκινητής να μπορεί να υβριδιστεί ειδικά με το RNA στόχο του HCV και το RNΑ του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps) καθώς και τριφωσφορικής δεοξυαδενοσίνης, δεοξυγουανοσίνης, δεοξυκυτιδίνης και δεοξυουριδίνης, η πολυμεράση Z05 επεκτείνει τον υβριδισμένο εκκινητή σχηματίζοντας έναν κλώνο DΝA (cdna) συμπληρωματικό προς το RNA στόχο. Ενίσχυση Στόχου Μετά την αντίστροφη μεταγραφή του RNA στόχου του HCV και του RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV, το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται για την αποδιάταξη του υβριδίου RNA:cDNA και την έκθεση των αλληλουχιών στόχου του εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι νοηματικοί εκκινητές υβριδίζονται ειδικά με τον κλώνο cdna, το Z05 επεκτείνει τον εκκινητή, και συντίθεται ένας δεύτερος κλώνος DNA. Έτσι, ολοκληρώνεται ο πρώτος κύκλος της PCR και δημιουργείται ένα δίκλωνο αντίγραφο DNA της περιοχής στόχου του HCV RNA και του RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται και πάλι για το διαχωρισμό του προκύπτοντος δίκλωνου DNA και την έκθεση των αλληλουχιών στόχου εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA στόχο. Το Z05, παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος dntps, επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος των προτύπων στόχων για να δημιουργηθεί ένα μόριο δίκλωνου DNA που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους προορίζεται για το διπλασιασμό του DNA κλώνου (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στην περιοχή του γονιδιώματος HCV μεταξύ των εκκινητών. Δεν ενισχύεται ολόκληρο το γονιδίωμα HCV. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται με το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη Ν γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη 16, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του RNA στόχου. Επίσης, οποιοδήποτε μη ειδικό προϊόν που σχηματίζεται μετά την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος από μαγγάνιο καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase βελτιώνοντας, συνεπώς, την ευαισθησία και την ειδικότητα. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα της δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από 55 C, δηλαδή, σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης, και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon)-στόχο που σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. 04873505052-04EL 3

Ανίχνευση Προϊόντων PCR σε ένα COBAS TaqMan Test Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR) 17,18. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών του αναφορέα που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ειδικά για το HCV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV ολιγονουκλεοτίδια με χρωστική αναφορέα (reporter)και παρεμποδιστή (quencher). Στο COBAS TaqMan HCV Test, v2.0, οι ιχνηθέτες HCV και Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV επισημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα (reporter). Όταν οι διπλά επισημασμένοι με φθορίζουσα χρωστική ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, ο φθορισμός αναφορέα καταστέλλεται από την εγγύτητα της χρωστικής παρεμποδιστή, λόγω των φαινομένων μεταφοράς ενέργειας τύπου Fφrster. Στη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε μια αλληλουχία στόχο και διασπάται από την 5' 3' δραστηριότητα νουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher), δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα (reporter) αυξάνεται. Η ενίσχυση του HCV RNA και του RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV μετρούνται ανεξάρτητα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα (reporter), επιτρέποντας την ξεχωριστή ταυτοποίηση του HCV RNA και του RNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Η ένταση των σημάτων σχετίζεται με την ποσότητα του υλικού εκκίνησης κατά την έναρξη της PCR. Βασικά Στοιχεία Ποσοτικοποίησης του COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 παρέχει ακριβή ποσοτικά αποτελέσματα σε ένα ιδιαίτερα ευρύ δυναμικό εύρος, εφόσον η παρακολούθηση του κλώνου (amplicon) διεξάγεται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Όσο υψηλότερος είναι ο τίτλος HCV ενός δείγματος, τόσο συντομότερα ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) του ιχνηθέτη HCV υπερβαίνει το αρχικό επίπεδο φθορισμού (βλέπε Εικόνα 1). Εφόσον το ποσοστό RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS) HCV είναι σταθερό σε όλα τα δείγματα, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) του ιχνηθέτη του HCV QS θα πρέπει να εμφανίζεται στον ίδιο κύκλο για όλα τα δείγματα (βλέπε Εικόνα 2). Στις περιπτώσεις στις οποίες η ενίσχυση και η ανίχνευση του Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS) επηρεάζεται από αναστολή ή ανεπαρκή ανάκτηση του δείγματος, θα καθυστερήσει η εμφάνιση του φθορισμού, με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η ανάλογη προσαρμογή του υπολογισμένου τίτλου του RNA στόχου του HCV. Η εμφάνιση του συγκεκριμένου σήματος φθορισμού αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή κατωφλίου (Ct). Η τιμή Ct ορίζεται ως ο κλασματικός αριθμός κύκλων όπου ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) υπερβαίνει την προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου (Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού) και ορίζει την έναρξη της φάσης εκθετικής αύξησης του σήματος αυτού (βλέπε Σχήμα 3). Μια υψηλότερη τιμή Ct υποδεικνύει χαμηλότερο τίτλο αρχικού RNA στόχου του HCV. Η διπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 1 Ct για το RNA στόχο του HCV, ενώ δεκαπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 3,3 Ct. Στο σχήμα 1 φαίνονται οι καμπύλες αύξησης στόχου για μια σειρά αραιώσεων ιού που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του ιού, οι καμπύλες αύξησης μετατοπίζονται σε προηγούμενους κύκλους. Για το λόγο αυτό, η τέρμα αριστερή καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο υψηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου, ενώ η τέρμα δεξιά καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο χαμηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου. 4 04873505052-04EL

Σχήμα 1 45,00 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Υψηλότερος Τίτλος Χαμηλότερος Τίτλος 0 10 20 30 40 50 60 Αριθμός Κύκλου Στο σχήμα 2 φαίνονται οι καμπύλες αύξησης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης για δείγματα ιικής σειράς αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Η ποσότητα του Προτύπου Ποσοτικοποίησης που προστίθεται σε κάθε δείγμα είναι σταθερή για κάθε αντίδραση. Η τιμή Ct του Προτύπου Ποσοτικοποίησης είναι ίδια, ανεξάρτητα από τον ιικό τίτλο. Σχήμα 2 12,00 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 Παρόμοιες τιμές Ct για το HCV QS ανεξάρτητα από τον τίτλο HCV Χαμηλότερος Τίτλος Υψηλότερος Τίτλος 0,00 0 10 20 30 40 50 60 Το σχήμα 3 παρέχει ένα παράδειγμα του τρόπου ομαλοποίησης των τιμών φθορισμού κάθε κύκλου για κάθε καμπύλη ανάπτυξης. Ο κλασματικός αριθμός κύκλων (Ct) υπολογίζεται στο σημείο τομής του σήματος φθορισμού με το Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού. Σχήμα 3 2,80 Αριθμός Κύκλου Ομαλοποιημένος Φθορισμός 2,60 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού Τιμή Ct = 17,4 8 10 12 14 16 18 20 22 Αριθμός Κύκλου 04873505052-04EL 5

ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ HCV RNA Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 ποσοτικοποιεί το ιικό RNA του HCV χρησιμοποιώντας μια δεύτερη αλληλουχία στόχου (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV) που προστίθεται σε κάθε δείγμα εξέτασης σε γνωστή συγκέντρωση. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV είναι μια μη μολυσματική σύνθεση Armored RNA που περιέχει τμήματα αλληλουχιών HCV με περιοχές δέσμευσης εκκινητή ίδιες ακριβώς με αυτές της αλληλουχίας στόχου HCV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV δημιουργεί επίσης ένα προϊόν ενίσχυσης με ίδιο μήκος και ίδια σύνθεση βάσεων με το RNA στόχο του HCV. Η περιοχή δέσμευσης του ιχνηθέτη ανίχνευσης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV έχει τροποποιηθεί για τη διαφοροποίηση του κλώνου (amplicon) του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV από τον κλώνο (amplicon) στόχο του HCV. Κατά τη διάρκεια της φάσης υβριδισμού της PCR στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τα δείγματα εκτίθενται σε φως και διεγείρονται από φιλτραρισμένο φως, ενώ τα δεδομένα εκπομπής φθορισμού συλλέγονται φιλτραρισμένα για κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, οι τιμές κάθε δείγματος διορθώνονται για τυχόν διακυμάνσεις που προκύπτουν από το όργανο. Αυτές οι τιμές φθορισμού αποστέλλονται από το όργανο στο AMPLILINK λογισμικό και αποθηκεύονται σε βάση δεδομένων. Εκτελούνται προέλεγχοι για να προσδιορίσουν εάν τα δεδομένα του HCV RNΑ και του RNΑ του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV αντιπροσωπεύουν έγκυρα σετ και το σύστημα δημιουργεί ενδείξεις όταν τα δεδομένα βρίσκονται εκτός των προκαθορισμένων ορίων. Αφού ολοκληρωθούν επιτυχώς όλοι οι προέλεγχοι, γίνεται επεξεργασία των τιμών φθορισμού για τη δημιουργία κρίσιμων τιμών κατωφλίου (Ct) για το HCV RNA και το RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Οι ειδικές για την παρτίδα σταθερές βαθμονόμησης που παρέχονται με το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της τιμής τίτλου για τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου με βάση τις κρίσιμες τιμές κατωφλίου (Ct) του HCV RNA και RNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HCV. Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 προτυποποιείται με βάση το Δεύτερο Διεθνές Πρότυπο του ΠΟΥ για αναλύσεις NAT (εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος) για HCV RNA (Κωδικός NIBSC 96/798) 19 και τα αποτελέσματα των τίτλων εκφράζονται σε Διεθνείς Μονάδες (IU/mL). ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Εξετάσεις (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης) Tris 52% Γουανιδίνη-HCl < 1% Ουρία 20% Triton X-100 Xn 52% (w/w) Γουανιδίνη-HCl + Επιβλαβές CAR (RNA, λυοφιλοποιημένο) PK (Πρωτεϊνάση K, λυοφιλοποιημένο) 99% Πρωτεϊνάση K, λυοφιλοποιημένο Xn 99% Πρωτεϊνάση K, λυοφιλοποιημένο + Επιβλαβές IRB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα) Tris 65% Γουανιδίνη-HCl Xn 65% (w/w) Γουανιδίνη-HCl + Επιβλαβές 2 x 2 mg 2 x 100 mg 1 x 33 ml 6 04873505052-04EL

WASH (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης) Tris NaCl (προσθέστε 50 ml Αιθανόλη και 30 ml απιονισμένο νερό) ELB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης) RS (Σετ Υποδοχέων High Pure System Viral Nucleic Acid) Υποδοχέας Λύσης Υποδοχέας Σωληναρίων Φίλτρου με Υποδοχέα Απορριμμάτων Υποδοχέας Έκλουσης Κάλυμμα Υποδοχέα Λαβίδα WR (Υποδοχέας Απορριμμάτων High Pure System Viral Nucleic Acid) COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου HCV QS (COBAS TaqMan Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου EDTA < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) < 0,001% Σύνθεση Armored RNA που περιέχει ένα ένθετο με αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητή HCV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη (μη μολυσματικό RNA σε φαγοκύτταρα MS2) Χρωστική ύλη αμαράνθης 0,1% Συντηρητικό Proclin 300 Xi Το Proclin περιέχει ένα μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο- 2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-Μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. HCV H(+)C, v2.0 [Ορός ελέγχου (+) Υψηλής Συγκέντρωσης HCV, v2.0] < 0,001% Σύνθεση Armored RNA που περιέχει αλληλουχίες HCV (μη μολυσματικό RNA σε φαγοκύτταρα MS2) Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρόν σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό Proclin 300 Xi Το Proclin περιέχει ένα μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο- 2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-Μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 x το καθένα 8 x το καθένα 48 Εξετάσεις 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml 04873505052-04EL 7

HCV L(+)C, v2.0 [Ορός ελέγχου (+) Χαμηλής Συγκέντρωσης HCV, v2.0] < 0,001% Σύνθεση Armored RNA που περιέχει αλληλουχίες HCV (μη μολυσματικό RNA σε φαγοκύτταρα MS2) Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρόν σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό Proclin 300 Xi Το Proclin περιέχει ένα μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο- 2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-Μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρόν σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό Proclin 300 Xi Το Proclin περιέχει ένα μίγμα (3:1) 5-Χλωρο-2-μεθυλο- 2H-ισοθειαζολ-3-όνης και 2-Μεθυλο-2H-ισοθειαζολ-3-όνης + Ερεθιστικό R43: Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση σε επαφή µε το δέρμα. Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης HCV MMX (COBAS TaqMan HCV Κύριο Μίγμα) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Υδροξείδιο του καλίου Οξικό κάλιο < 20% Διμεθυλοσουλφοξείδιο Γλυκερόλη < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp <0,001% Νοηματικοί και αντινοηματικοί ανιχνευτές στην 5'-μη κωδικεύουσα περιοχή του HCV <0,001% Ειδικοί για το HCV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV ολιγονουκλεοσιδικοί ιχνηθέτες με φθορίζουσα επισήμανση < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράσης (μικροβιακό) <0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,09% Αζίδιο του νατρίου CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan Διάλυμα Μαγγανίου) < 1,2% Οξικό μαγγάνιο Παγόμορφο οξικό οξύ 0,09% Αζίδιο του νατρίου 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 2 x 24 Εξετάσεις 2 x 1,4 ml 2 x 24 Εξετάσεις 2 x 1,0 ml 8 04873505052-04EL

ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Αυτή η εξέταση δεν προορίζεται για χρήση ως τεστ ελέγχου (screening test) για την παρουσία HCV στο αίμα και σε προϊόντα του αίματος ή ως διαγνωστική εξέταση για την επιβεβαίωση της παρουσίας μόλυνσης HCV. C. Οι τιμές που καθορίζονται για τους συντελεστές βαθμονόμησης είναι ειδικές για κάθε παρτίδα και για το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 για χρήση με το Σύστημα High Pure. Οι τιμές αυτές ενδέχεται να μην ισχύουν όταν χρησιμοποιούνται με εναλλακτικές μεθόδους προετοιμασίας δείγματος. D. Η παρούσα εξέταση προορίζεται μόνο για χρήση με ανθρώπινο πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA και ανθρώπινο ορό. E. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. F. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και κιτ αντιδραστηρίων. G. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και ριβονουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δείγματος από τις φιάλες αντιδραστηρίων. H. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μίας χρήσης με ακροφύσια ελεύθερα από RNase. I. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. J. Μη συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ. K. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. L. Μη χρησιμοποιείτε ένα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης του. M. Διατίθενται Δελτία Δεδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. N. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται σύμφωνα με τις ασφαλείς εργαστηριακές πρακτικές, όπως αυτές περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 και στο Έγγραφο CLSI M29-A3 21. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. Σημείωση: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά του εμπορίου περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Η αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγει διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. O. ΠΡΟΣΟΧΗ: Τα CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 και HCV H(+)C, v2.0 περιέχουν Ανθρώπινο Πλάσμα που προέρχεται από ανθρώπινο αίμα. Το υλικό προέλευσης έχει ελεγχθεί και έχει βρεθεί ότι δεν αντιδρά υπό την παρουσία αντιγόνου επιφανείας ηπατίτιδας Β (HBsAg), αντισωμάτων HIV-1/2 και HCV και HIV p24 αντιγόνου. Η εξέταση του αρνητικού ανθρώπινου πλάσματος με τις μεθόδους PCR δεν έδειξε ανιχνεύσιμο HIV-1 RNA, HCV RNA ή HBV DNA. Καμία γνωστή μέθοδος εξέτασης δεν διασφαλίζει απόλυτα ότι τα παράγωγα που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα δεν μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτόν, όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται δυνάμει μολυσματικά. Τα CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 και HCV H(+)C, v2.0 θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους θα πρέπει να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές πρακτικές όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 21. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. 04873505052-04EL 9

P. Τα HCV MMX και CTM Mn 2+ περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Όταν απορρίπτετε διαλύματα που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφύγετε το σχηματισμό αζιδίου. Q. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δείγματος A. Αποθηκεύστε τα Αντιδραστήρια High Pure System Viral Nucleic Acid στους 15-25 C αμέσως μετά την παραλαβή τους. B. Αποθηκεύστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης (ELB) και το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/ Δέσμευσης (LYS) στους 15-25 C. Μετά το άνοιγμα, αποθηκεύστε τα ELB και LYS στους 15-25 C. Τα ανοικτά ELB και LYS πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 28 ημερών ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. C. Μετά την προσθήκη Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (ELB) για την ανασύσταση του RNA Μεταφοράς και της Πρωτεϊνάσης K, αποθηκεύστε το ανασυσταμένο RNA Μεταφοράς (CAR) και την ανασυσταμένη Πρωτεϊνάση K (PK) που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί σε θερμοκρασία -15 έως -25 C. Μετά την ανασύσταση, το RNA Μεταφοράς και η Πρωτεϊνάση K πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 28 ημερών ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. D. Μετά την προσθήκη αιθανόλης στο Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα και την προσθήκη αιθανόλης και νερού στο Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης, αποθηκεύστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα (IRB) και το Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης (WASH) στους 15-25 C. Αυτά τα Διαλύματα Εργασίας παραμένουν σταθερά για 28 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. E. Το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης [Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης με RNA Μεταφοράς, Πρωτεϊνάση K και HCV QS] πρέπει να χρησιμοποιηθούν αμέσως μετά την προετοιμασία. Τυχόν πλεονάζουσες ποσότητες πρέπει να απορρίπτονται. Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. B. Αποθηκεύστε τα HCV MMX, CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0 HCV QS και CTM Mn 2+ στους 2-8 C. Όταν δεν έχουν χρησιμοποιηθεί, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Όταν ανοίξετε τα HCV MMX, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS και CTM Mn 2+ για να αφαιρέσετε ένα κλάσμα για μια παρτίδα μεγέθους 12 δειγμάτων, αποθηκεύστε την υπόλοιπη ποσότητα στους 2-8 C. Μετά το άνοιγμα, τα HCV MMX, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS και CTM Mn 2+ παραμένουν σταθερά στους 2 έως 8 C για 28 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης τους, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα CTM ( ) C που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. C. Το Κύριο Μίγμα Εργασίας (που προετοιμάζεται με την προσθήκη CTM Mn 2+ στο HCV MMX) πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C σε σκοτεινό χώρο. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν προετοιμαστεί πρέπει να προστίθενται εντός 1 ώρας από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας. D. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία παραμένουν σταθερά έως και 3 ώρες στους 20-30 C, έως και 24 ώρες στους 2-8 C ή κατεψυγμένα στους -20 έως και για 1 εβδομάδα. E. Η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 2 ωρών από την προσθήκη των επεξεργασμένων δειγμάτων και ορών ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας. 10 04873505052-04EL

ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δείγματος A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001) LYS (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης) CAR (RNA Μεταφοράς) PK (Πρωτεϊνάση K) IRB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα) WASH (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης) ELB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης) RS (Σετ Υποδοχέων High Pure System Viral Nucleic Acid) WR (Υποδοχέας Απορριμμάτων High Pure System Viral Nucleic Acid) Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης B. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) HCV QS (COBAS TaqMan Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HCV) HCV H(+)C, v2.0 [Ορός ελέγχου (+) Υψηλής Συγκέντρωσης HCV, v2.0] HCV L(+)C, v2.0 [Ορός ελέγχου (+) Χαμηλής Συγκέντρωσης HCV, v2.0] CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] HCV MMX (COBAS TaqMan HCV Κύριο Μίγμα) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan Διάλυμα Μαγγανίου) ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανα και Λογισμικό COBAS TaqMan 48 Αναλυτής AMPLILINK λογισμικό Σταθμός δεδομένων για το AMPLILINK λογισμικό Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο Πωματιστής K-tube 04873505052-04EL 11

Υλικά μίας χρήσης Κιβώτιο των 12 x 96 K-tube Απαιτήσεις Φυγόκεντρου Επιτραπέζια φυγόκεντρος Sigma 4-15C ή αντίστοιχη φυγόκεντρος μικροπλάκας με απόδοση φυγόκεντρου δύναμης 4600 x g Περιστρεφόμενος ρότορας φυγόκεντρου Sigma P/N: 11118 (περιλαμβάνει 2 κάδους P/N: 13218 και 2 συγκρατητές πλάκας P/N: 17978) ή αντίστοιχα. ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Ισοπροπανόλη (> 99%) πληροί τις προδιαγραφές ACS ή ανώτερες Αιθανόλη (96-100%) πληροί τις προδιαγραφές ACS ή ανώτερες Απιονισμένο Νερό Ρυθμιζόμενες Συσκευές Πιπέτας*: (χωρητικότητα 250 µl και 1000 µl) με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης ελεύθερα από RNase Βοήθημα Πιπέτας: Drummond (P/N: 4-000-100) ή αντίστοιχο Υδατόλουτρο ρυθμισμένο στους 50 C (± 2 C) Μονάδα Ξηρής Θερμότητας ρυθμισμένη στους 70 C (± 2 C) Αποστειρωμένες ορολογικές πιπέτες μίας χρήσης: 5, 10 και 25 ml Αποστειρωμένα κωνικά σωληνάρια πολυπροπυλενίου, 15 ml και 50 ml: Corning (P/N: 430052 και P/N: 430290) ή αντίστοιχα Αποστειρωμένα σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 2,0 ml: Sarstedt (P/N: 72.693.005) ή αντίστοιχα Αναδευτήρας τύπου Vortex Υποδοχείς Σωληναρίων Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Βαθμονομημένα Θερμόμετρα για Υδατόλουτρο και Μονάδα Ξηρής Θερμότητας * Οι συσκευές πιπέτας πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ελεύθερα από RNase ακροφύσια, με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου προδιαγράφεται, για να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Σημείωση: Όλα τα δείγματα πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να είναι ανάλογος. A. Συλλογή Δείγματος Το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 προορίζεται αποκλειστικά για χρήση με δείγματα πλάσματος ή ορού. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε Σωληνάρια Διαχωρισμού Ορού BD SST ή σε αποστειρωμένα σωληνάρια με τη χρήση αντιπηκτικού EDTA (μοβ πώμα). Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για διάστημα 6 ωρών το μέγιστο. Για το διαχωρισμό του ορού ή του πλάσματος από το ολικό αίμα εντός 6 ωρών από τη συλλογή, ακολουθήστε τις οδηγίες του κατασκευαστή των σωληναρίων. Μεταφέρετε τον ορό ή το πλάσμα σε αποστειρωμένο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. Στα σχήματα 4 και 5 απεικονίζονται τα δεδομένα από αυτές τις μελέτες συλλογής δείγματος. Οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν με χρήση του COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, έκδοση 2.0 (v2.0). 12 04873505052-04EL

Σχήμα 4 Σταθερότητα HCV σε Ολικό Αίμα, Σωληνάρια SST (Ορός) Μέσος Όρος Αποτελεσμάτων HCV RNA Log 10 HCV RNA (IU/mL) Αριθμός Δείγματος < 1 ώρα 2-8C 6 ώρες 2-8C 24 ώρες 2-8C 48 ώρες 2-8C 72 ώρες 2-8C < 1 ώρα 20-25C 6 ώρες 20-25C 24 ώρες 20-25C 48 ώρες 20-25C 72 ώρες 20-25C Σχήμα 5 Σταθερότητα HCV σε Ολικό Αίμα, Σωληνάρια EDTA (Πλάσμα EDTA) Μέσος Όρος Αποτελεσμάτων HCV RNA Log 10 HCV RNA (IU/mL) Αριθμός Δείγματος < 1 ώρα 2-8C 6 ώρες 2-8C 24 ώρες 2-8C 48 ώρες 2-8C 72 ώρες 2-8C < 1 ώρα 20-25C 6 ώρες 20-25C 24 ώρες 20-25C 48 ώρες 20-25C 72 ώρες 20-25C B. Μεταφορά Δειγμάτων Η μεταφορά του ολικού αίματος, του ορού ή του πλάσματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν στη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 22. Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C και να υποβάλλεται επεξεργασία εντός 6 ωρών από τη συλλογή. Το πλάσμα ή ο ορός πρέπει να μεταφέρονται σε θερμοκρασία 2-8 C ή κατεψυγμένα σε θερμοκρασία -20 C έως -80 C. C. Αποθήκευση Δειγμάτων Τα δείγματα ορού ή πλάσματος μπορείτε να τα αποθηκεύσετε στους 2-8 C έως και για 3 ημέρες ή να τα καταψύξετε στους -70 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Συνιστάται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των 800-900 µl σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό πώμα (όπως τα Sarstedt P/N: 72.694.006). Στα σχήματα 6 και 7 απεικονίζονται τα δεδομένα από αυτές τις μελέτες αποθήκευσης δειγμάτων. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες χρησιμοποιώντας το COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, v2.0. 04873505052-04EL 13

Μέσος Όρος Αποτελεσμάτων HCV RNA Log 10 HCV RNA (IU/mL) Σχήμα 6 Σταθερότητα HCV σε Ορό Αριθμός Δείγματος < 1 ώρα 2-8C 72 ώρες 2-8C 120 ώρες 2-8C 168 ώρες 2-8C 240 ώρες 2-8C < 1 ώρα 20-25C 72 ώρες 20-25C 120 ώρες 20-25C 168 ώρες 20-25C 240 ώρες 20-25C Σχήμα 7 Σταθερότητα HCV σε Πλάσμα EDTA Μέσος Όρος Αποτελεσμάτων HCV RNA Log 10 HCV RNA (IU/mL) Αριθμός Δείγματος < 1 ώρα 2-8C 72 ώρες 2-8C 120 ώρες 2-8C 168 ώρες 2-8C 240 ώρες 2-8C < 1 ώρα 20-25C 72 ώρες 20-25C 120 ώρες 20-25C 168 ώρες 20-25C 240 ώρες 20-25C Τα δείγματα πλάσματος και ορού μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και τρεις φορές χωρίς απώλεια HCV RNA. Ο πίνακας 1 περιλαμβάνει τα δεδομένα από αυτές τις μελέτες ψύξης/απόψυξης που πραγματοποιήθηκαν με χρήση του COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, v2.0. 14 04873505052-04EL

Τύπος Δείγματος Πίνακας 1 Διαφορές Log 10 στις συγκεντρώσεις HCV για Ψύξη και Απόψυξη Ορού και Πλάσματος EDTA από τον Κύκλο 0 για 5 Κύκλους Σταθερότητα Αρ. Δείγματος Κύκλος Ψύξης/Απόψυξης Κύκλος 0 Κύκλος 1 Κύκλος 2 Κύκλος 3 Κύκλος 4 Κύκλος 5 1 0,00-0,052 0,238 0,179-0,670-0,277 2 0,00 0,293 0,228-0,206-0,338 0,175 Ορός 3 0,00-0,270-0,023-0,430 0,008-0,229 4 0,00 0,071-0,516-0,295-0,564-0,670 5 0,00 0,342-0,031-0,344-0,436-0,277 Μέση Τιμή Ορού 0,00 0,077-0,021-0,239-0,400-0,246 Πλάσμα EDTA Μέση Τιμή Πλάσματος EDTA 11 0,00-0,006 0,043-0,143-0,159-0,140 12 0,00-0,329-0,375-0,234-0,642-0,265 13 0,00-0,056-0,248-0,371-0,395-0,142 14 0,00 0,186-0,066-0,034-0,241-0,084 15 0,00-0,120-0,111-0,055 0,250-0,217 0,00-0,065-0,151-0,167-0,237-0,170 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Σημείωση: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, την εκτύπωση αποτελεσμάτων και την ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 και (1) στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή (2) στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο. Σημείωση: Όλα τα αντιδραστήρια ενίσχυσης και ανίχνευσης πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Απομακρύνετέ τα από το χώρο αποθήκευσης στους 2-8 C τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τη χρήση. Σημείωση: Αφήστε τα δείγματα ορού και πλάσματος σε θερμοκρασία δωματίου για 15-30 λεπτά πριν από τη χρήση. Σημείωση: Όπου προδιαγράφεται, χρησιμοποιείτε συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή μόλυνσης. Αριθμός Aναλύσεων: Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια αρκετά για τέσσερις αναλύσεις 12 εξετάσεων, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν ξεχωριστά ή ταυτόχρονα. Σε κάθε ανάλυση εξέτασης έως και 24 δειγμάτων και ορών ελέγχου πρέπει να συμπεριλαμβάνεται ένα αντίγραφο των CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 και HCV H(+)C, v2.0 (βλ. ενότητα «Ποιοτικός Έλεγχος»). Τα Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης είναι συσκευασμένα σε φιάλες δύο χρήσεων για 24 εξετάσεις. Για την αποτελεσματικότερη χρήση των αντιδραστηρίων, τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να υφίστανται επεξεργασία σε παρτίδες, ο αριθμός των οποίων πρέπει να είναι πολλαπλάσιο του 12. Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση: Εάν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα ορού ή πλάσματος, αφήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου έως την πλήρη απόψυξή τους και στροβιλίστε τα για 5-10 δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση. 04873505052-04EL 15

Σημείωση: Αφήστε τα αντιδραστήρια να περιέλθουν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν συνεχίσετε. Προθερμάνετε τη Μονάδα(ες) Θέρμανσης σε θερμοκρασία 70 C (± 2 C) και το υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 50 C (± 2 C) πριν ξεκινήσετε τις αντιδράσεις καθαρισμού. A. Προετοιμασία Αντιδραστηρίου Σημείωση: Προετοιμάστε το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης μόνο εφόσον όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 15-30 λεπτά. 1. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα εκτελώντας έγχυση 20 ml αιθανόλης 96-100% στο Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα (IRB). Αναμίξτε αναστρέφοντας το διάλυμα 5-10 φορές. Αυτή η ποσότητα ανασυσταμένου Ρυθμιστικού Διαλύματος Αφαίρεσης Αναστολέα επαρκεί για 48 εξετάσεις. 2. Προετοιμάστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης εκτελώντας έγχυση 50 ml αιθανόλης 96-100% και 30 ml απιονισμένου νερού στο Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης (WASH). Αναμίξτε αναστρέφοντας το διάλυμα 5-10 φορές. Αυτή η ποσότητα ανασυσταμένου Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης επαρκεί για 48 εξετάσεις. 3. Προθερμάνετε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης (ELB) στους 70 C (± 2 C) σε ένα σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 2,0 ml με βιδωτό πώμα. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε πολλά σωληνάρια. Ο όγκος έκλουσης ανά δείγμα είναι 75 µl. Προθερμάνετε τον όγκο που αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα σύμφωνα με τον αριθμό των εξετάσεων. Αριθμός Αντιγράφων Αντιδραστήριο 12 24 Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης (ml) 2,0 4,0 4. Εκτελέστε έγχυση του όγκου ισοπροπανόλης που αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα σύμφωνα με τον αριθμό των εξετάσεων σε ένα καθαρό και αποστειρωμένο σωληνάριο. Αριθμός Αντιγράφων Αντιδραστήριο 12 24 Ισοπροπανόλη (ml) 5,0 10,0 5. Εκτελέστε έγχυση 0,5 ml του Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (ELB) στο RNA Μεταφοράς (CAR). Τοποθετήστε ξανά το πώμα, αναστρέψτε το φιαλίδιο και στροβιλίστε μέχρι να διαλυθεί πλήρως το RNA Μεταφοράς. Το ανασυσταμένο RNA Μεταφοράς επαρκεί για 24 εξετάσεις. Ο όγκος του ανασυσταμένου RNA Μεταφοράς που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μπορεί να αποθηκευτεί στους -15 έως -25 C μέχρι και 28 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. 6. Εκτελέστε έγχυση 5,0 ml του Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (ELB) στην Πρωτεϊνάση Κ (PK). Τοποθετήστε ξανά το πώμα, αναστρέψτε το φιαλίδιο και στροβιλίστε μέχρι να διαλυθεί πλήρως η Πρωτεϊνάση Κ. Η ανασυσταμένη Πρωτεϊνάση Κ επαρκεί για 24 εξετάσεις. Ο όγκος της ανασυσταμένης Πρωτεϊνάσης Κ που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μπορεί να αποθηκευτεί στους -15 έως -25 C μέχρι και 28 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. 16 04873505052-04EL

7. Προετοιμάστε το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης όπως περιγράφεται παρακάτω, εκτελώντας έγχυση των όγκων που αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα, ανάλογα με τον αριθμό δειγμάτων και των ορών ελέγχου που πρόκειται να υποβληθούν σε επεξεργασία: Αριθμός Αντιγράφων Αντιδραστήρια 12 24 Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/ Δέσμευσης (ml) 7,0 14,0 RNA Μεταφοράς (µl) 140 280 HCV QS (µl) 56 112 Πρωτεϊνάση K (ml) 1,4 2,8 Σημείωση: Ο όγκος του HCV QS είναι ειδικός για το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0. Σημείωση: Εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί κατεψυγμένο RNA Μεταφοράς ή Πρωτεϊνάση Κ, αποψύξτε το σε θερμοκρασία δωματίου και αναστρέψτε το πολλές φορές πριν από τη χρήση. Προσθέστε τον ενδεικνυόμενο όγκο Ρυθμιστικού Διαλύματος Λύσης/Δέσμευσης σε ένα καθαρό και αποστειρωμένο σωληνάριο 50 ml. Προσθέστε τον ενδεικνυόμενο όγκο ανασυσταμένου RNA Μεταφοράς στο σωληνάριο που περιέχει το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης. Στροβιλίστε το HCV QS για 3-5 δευτερόλεπτα και προσθέστε τον ενδεικνυόμενο όγκο HCV QS στο σωληνάριο που περιέχει το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης και το ανασυσταμένο RNA Μεταφοράς. Πωματίστε το σωληνάριο και αναμίξτε αναστρέφοντας 10-15 φορές. ΜΗΝ στροβιλίζετε - με το στροβιλισμό θα σχηματιστούν φυσαλίδες στο διάλυμα. Προσθέστε τον ενδεικνυόμενο όγκο ανασυσταμένης Πρωτεϊνάσης Κ στο σωληνάριο που περιέχει το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης. Πωματίστε το σωληνάριο και αναμίξτε αναστρέφοντας 10-15 φορές. ΜΗΝ στροβιλίζετε - με το στροβιλισμό θα σχηματιστούν φυσαλίδες στο διάλυμα. Ξεκινήστε τη διοχέτευση του Διαλύματος Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης αμέσως μετά την προσθήκη και την ανάμιξη της Πρωτεϊνάσης Κ με το Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης/Δέσμευσης. Ο όγκος του ανασυσταμένου Ρυθμιστικού Διαλύματος Λύσης/Δέσμευσης (LYS) που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μπορεί να αποθηκευτεί στους 15-25 C μέχρι και 28 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Το Διάλυμα Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. B. Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση: Για τη διαδικασία αυτή συνιστάται η χρήση των ρυθμιζόμενων συσκευών πιπέτας με ακροφύσια ανθεκτικά στα αερολύματα. Σημείωση: Στα βήματα 19 και 22 μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια επαναληπτική αποστειρωμένη πιπέτα με κατάλληλο μέγεθος αποστειρωμένων ακροφυσίων τύπου combi-tip. Ωστόσο, θα πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή για να αποφευχθεί το πιτσίλισμα αντιδραστηρίων και η επιμόλυνση. 1. Εκτελέστε έγχυση 625 µl Διαλύματος Εργασίας Λύσης/Δέσμευσης σε κάθε βύθισμα του Υποδοχέα Λύσης (I, διαφανής). Πιέστε τα καπάκια προς τα κάτω στη θέση κάλυψης. 2. Ανοίγοντας ένα βύθισμα κάθε φορά, εκτελέστε έγχυση 500 µl δείγματος ή ορού ελέγχου στο κατάλληλο βύθισμα. Μετά την προσθήκη κάθε δείγματος ή ορού ελέγχου, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω μέχρι να ασφαλίσει ο μηχανισμός κλεισίματος και να σφραγίσει καλά το βύθισμα. 3. Μετά την προσθήκη όλων των δειγμάτων και των ορών ελέγχου, αναμίξτε με στροβιλισμό το γεμάτο Υποδοχέα Λύσης για 10 περίπου δευτερόλεπτα. Ελέγξτε οπτικά αν έχουν στροβιλιστεί και αναμιχθεί καλά όλα τα βυθίσματα. 4. Επωάστε τον Υποδοχέα Λύσης σε υδατόλουτρο προθερμασμένο στους 50 C (± 2 C) για 10 λεπτά. Βυθίστε τον Υποδοχέα Λύσης σε υδατόλουτρο με βάθος νερού περίπου 5-7 cm. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Λύσης από το υδατόλουτρο και στεγνώστε τον. 04873505052-04EL 17

5. Φυγοκεντρίστε τον Υποδοχέα Λύσης για 10-20 δευτερόλεπτα στη ρυθμισμένη ταχύτητα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Η φυγόκεντρος ενδέχεται να μη φτάσει τη ρυθμισμένη ταχύτητα. 6. Ανοίγοντας ένα βύθισμα κάθε φορά, εκτελέστε έγχυση 250 µl ισοπροπανόλης σε κάθε βύθισμα. Μετά από κάθε προσθήκη, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω μέχρι να ασφαλίσει ο μηχανισμός κλεισίματος και να σφραγίσει καλά το βύθισμα. Σημείωση: Ο όγκος της ισοπροπανόλης είναι ειδικός για το COBAS TaqMan HCV Test, v2.0. 7. Αναμίξτε τα δείγματα αναστρέφοντας τον υποδοχέα τρεις φορές και στροβιλίζοντας στη συνέχεια τον υποδοχέα για 10 περίπου δευτερόλεπτα. Ελέγξτε οπτικά αν έχουν στροβιλιστεί και αναμιχθεί καλά όλα τα βυθίσματα. 8. Φυγοκεντρίστε τον Υποδοχέα Λύσης για 10-20 δευτερόλεπτα στη ρυθμισμένη ταχύτητα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. Η φυγόκεντρος ενδέχεται να μη φτάσει τη ρυθμισμένη ταχύτητα. 9. Ανοίγοντας ένα βύθισμα κάθε φορά, μεταφέρετε 750 µl δείγματος ή μίγματος ορού ελέγχου στα αντίστοιχα βυθίσματα του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου (II, κίτρινο χρώμα) με τον Υποδοχέα Απορριμμάτων (λευκό χρώμα). Μετά την προσθήκη κάθε δείγματος ή μίγματος ορού ελέγχου, πιέστε το καπάκι προς τα κάτω μέχρι να ασφαλίσει ο μηχανισμός κλεισίματος και να σφραγίσει καλά το βύθισμα. 10. Μετά την προσθήκη όλων των δειγμάτων ή των ορών ελέγχου, φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. 11. Ανοίγοντας ένα βύθισμα κάθε φορά, μεταφέρετε το υπόλοιπο δείγμα ή μίγμα ορού ελέγχου στα αντίστοιχα βυθίσματα του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Μετά την προσθήκη κάθε δείγματος ή μίγματος ορού ελέγχου, κλείστε καλά το καπάκι του βυθίσματος. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Λύσης κατάλληλα. 12. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. 13. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Απορριμμάτων πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Απορριμμάτων. Αντικαταστήστε τον με ένα νέο Υποδοχέα Απορριμμάτων και ασφαλίστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Απορριμμάτων. 14. Ανοίξτε όλα τα καπάκια του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου με τη Λαβίδα και εκτελέστε έγχυση 400 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Αφαίρεσης Αναστολέα (IRB) στα τοιχώματα κάθε βυθίσματος. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα των βυθισμάτων. Μετά την προσθήκη του Ρυθμιστικού Διαλύματος Αφαίρεσης Αναστολέα σε όλα τα βυθίσματα, κλείστε καλά τα καπάκια. 15. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. 16. Ανοίξτε όλα τα καπάκια με τη Λαβίδα και εκτελέστε έγχυση 700 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης (WASH) στα τοιχώματα κάθε βυθίσματος. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα των βυθισμάτων. Μετά την προσθήκη του Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε όλα τα βυθίσματα, κλείστε καλά τα καπάκια. 17. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 2 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. 18. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Απορριμμάτων πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Απορριμμάτων. Αντικαταστήστε τον με ένα νέο Υποδοχέα Απορριμμάτων και ασφαλίστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Απορριμμάτων. 19. Ανοίξτε όλα τα καπάκια με τη Λαβίδα και εκτελέστε έγχυση 700 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης στα τοιχώματα κάθε βυθίσματος. Μην αγγίζετε τα τοιχώματα των βυθισμάτων. Μετά την προσθήκη του Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε όλα τα βυθίσματα, κλείστε καλά τα καπάκια. 18

20. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 3 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. 21. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Απορριμμάτων πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Τοποθετήστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Έκλουσης (IIIA, μπλε χρώμα) και ασφαλίστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου στον Υποδοχέα Έκλουσης. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Απορριμμάτων κατάλληλα. 22. Ανοίξτε όλα τα καπάκια με τη Λαβίδα και εκτελέστε έγχυση 75 µl του προθερμασμένου Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (ELB) στο κέντρο κάθε φίλτρου χωρίς να αγγίξετε το φίλτρο. Σημείωση: Μην προσθέτετε Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης με έγχυση στο τοίχωμα του βυθίσματος. Μετά την προσθήκη του Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης σε όλα τα βυθίσματα, κλείστε καλά τα καπάκια. Μετά την προσθήκη του Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης, επωάστε τον Υποδοχέα Έκλουσης σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 3 λεπτά. 23. Φυγοκεντρίστε το συγκρότημα Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου για 3 λεπτά στα 4600 x g στη φυγόκεντρο μικροπλάκας. 24. Αφαιρέστε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου από τον Υποδοχέα Έκλουσης πατώντας και τους δύο συνδέσμους ασφάλισης στην άνω πλευρά του Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου. Απορρίψτε τον Υποδοχέα Σωληναρίων Φίλτρου κατάλληλα. 25. Τοποθετήστε το Κάλυμμα Υποδοχέα (IIIB, μπλε χρώμα) στον Υποδοχέα Έκλουσης (IIIA, μπλε). Πιέστε σταθερά προς τα κάτω και ασφαλίστε τους συνδέσμους στον Υποδοχέα Έκλουσης. Κλείστε όλα τα καπάκια. 26. Τα επεξεργασμένα δείγματα και οροί ελέγχου χρησιμοποιούνται απευθείας για PCR. Χρησιμοποιήστε 50 µl από τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου για ενίσχυση. Προσθέστε τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας εντός 3 ωρών από την ολοκλήρωση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των ορών έλεγχου. Εάν τα επεξεργασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εντός 3 ωρών από την προετοιμασία, τα επεξεργασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου μπορούν να αποθηκευτούν στους 2-8 C έως και για 24 ώρες στον καλυμμένο Υποδοχέα Έκλουσης ή κατεψυγμένα στους -20 C έως και για 1 εβδομάδα σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό καπάκι (όπως τα Sarstedt P/N: 72.694.006). Ενισχύστε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποστεί επεξεργασία μέσα σε 2 ώρες από την προσθήκη των δειγμάτων και των ορών ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας. Αντίστροφη Μεταγραφή, Ενίσχυση και Ανίχνευση Σημείωση: Τα K-carriers και ο συγκρατητής K-carrier πρέπει να καθαρίζονται με ένα πανί που δεν αφήνει χνούδι εμποτισμένο με διάλυμα ισοπροπανόλης 70%. C. Προετοιμασία Αντιδραστηρίου Σημείωση: Το COBAS TaqMan HCV Κύριο Μίγμα Εργασίας (HCV MMX), «Κύριο Μίγμα Εργασίας» (Working MMX) και το MMX Εργασίας καθώς και τα επεξεργασμένα δείγματα και ορούς ελέγχου είναι ευαίσθητα στο φως. Προστατέψτε τα αντιδραστήρια αυτά από το φως. Σημείωση: Το COBAS TaqMan HCV Κύριο Μίγμα (HCV MMX) και το COBAS TaqMan Διάλυμα Μαγγανίου (CTM Mn 2+ ) πρέπει να παραμείνουν σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας. Σημείωση: Προετοιμάστε το MMX Εργασίας μετά την ολοκλήρωση της Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου. Σημείωση: Το MMX Εργασίας πρέπει να χρησιμοποιηθεί εντός 1 ώρας από την προετοιμασία. Σημείωση: Μόλις τα επεξεργασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου προστεθούν στο MMX Εργασίας, η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 2 ωρών. 1. Αφήστε σε θερμοκρασία δωματίου ένα φιαλίδιο HCV MMX και ένα φιαλίδιο CTM Mn 2+ για τουλάχιστον 30 λεπτά. 04873505052-04EL 19