Διδάσκων: Καθηγητής Εμμανουήλ Μ. Παπαμιχαήλ

Τίτλος Μαθήματος: Ενζυμολογία Ενότητα: Μηχανισμοί Διδάσκων: Καθηγητής Εμμανουήλ Μ. Παπαμιχαήλ Τμήμα: Χημείας

134 5. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ 5.1 Αρτοποιία Ο άρτος αποτελεί τη βάση της διατροφής πολλών Λαών συμπεριλαμβανομένου και του Ελληνικού. Όμως και για διάφορες αιτίες, η πρώτη ύλη της παραγωγής του το άλευρο των δημητριακών και κυρίως του σίτου, δεν περιέχει τις αναγκαίες ποσότητες των απαραίτητων ενζύμων όπως είναι οι πρωτεάσες (ομάδα EC 3.4.) και οι α-αμυλάσες ή β-αμυλάσες (υποομάδα EC 3.2.1). Έτσι τα ένζυμα αυτά προστίθενται από τον αρτοποιό, κυρίως με τη μορφή της ζύμης αρτοποιίας ή με τη μορφή καθαρών παρασκευασμάτων, κατά τη διάρκεια της αρτοποίησης. Οι πρωτεάσες υδρολύουν τόσο εσωτερικούς (ενδοπεπτιδάσες) όσο και εξωτερικούς (εξωπεπτιδάσες) πεπτιδικούς δεσμούς των πρωτεϊνών του αλεύρου (και του ζυμαριού) γνωστών με το κοινό όνομα γλουτένη. Έτσι, επιτυγχάνεται τόσο η τροποποίηση των μηχανικών ιδιοτήτων του ζυμαριού όσο και η απελευθέρωση αμινοξέων και μικρών πεπτιδίων. Τα τελευταία αποτελούν, κυρίως, θρεπτικό υλικό των μικροοργανισμών της ζύμης. Με την αύξηση της θερμοκρασίας κατά το ψήσιμο επιταχύνεται η δράση των αμυλασών, που είχε αρχίσει αμέσως μετά την προσθήκη της ζύμης είτε και των ενζυμικών παρασκευασμάτων. Οι αμυλάσες υδρολύουν τους πολυσακχαρίτες προς διαλυτά σάκχαρα, που αποτελούν και αυτά θρεπτικό υλικό των μικροοργανισμών της ζύμης. Πρωτεόλυση και γλυκόλυση, λοιπόν, συντείνουν στην παραγωγή CO 2 λόγω της αυξημένης δραστηριότητας των μικροοργανισμών της ζύμης και επιπλέον, έχουν ως συνέπεια την διόγκωση του ζυμαριού, που αποτελεί σημαντικό στοιχείο της ποιότητας του άρτου.

135 5.2 Οινοπνευματοποιία (οίνος, ζύθος) Όπως και στη περίπτωση της αρτοποιίας έτσι και εδώ παρατηρούνται δράσεις πρωτεασών και αμυλασών. Οι πρώτες ύλες, χυμός σταφυλιών (γλεύκος) και ζυθογλεύκος δεν είναι ιδιαίτερα πλούσιες στα απαραίτητα ένζυμα γι αυτό και προστίθενται με τη μορφή ειδικών ζυμών είτε και καθαρών παρασκευασμάτων. Στην περίπτωση της οινοπνευματοποιίας είναι απαραίτητη και η παρουσία και δράση της β-1,4 γλυκανάσης (κυτταρινάσης EC 3.2.1.4). Η περιεκτικότητα των γλευκών σε πρωτεΐνες είναι περιορισμένη. Αντίθετα, είναι σχετικά αυξημένη η περιεκτικότητα σε πολύ- ή ολιγοσακχαρίτες. Η δράση των πρωτεασών και της κυτταρινάσης προηγείται των κύριων δράσεων των αμυλασών αφού πρέπει να υδρολυθούν κυτταρικά τοιχώματα. Έτσι, τα γλεύκη εμπλουτίζονται συνέχεια σε θρεπτικά υλικά για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών των ζυμών, σε μονοσακχαρίτες (κυρίως γλυκόζη είτε φρουκτόζη είτε και μαλτόζη) αλλά και σε υλικά που θα εμπλουτίσουν την εμφάνιση και τις εν γένει οργανοληπτικές ιδιότητες των έτοιμων προϊόντων. Το τελευταίο στάδιο είναι αυτό της αλκοολικής ζύμωσης. Κατά τη διάρκειά του η γλυκόζη και η μαλτόζη μετατρέπονται σε αιθανόλη, με τη συνδυασμένη δράση πολλών ενζύμων. Αν υποθέσουμε ότι ξεκινάμε με γλυκόζη, αυτή αμέσως θα μετατραπεί σε 6-φωσφορική γλυκόζη (με ΑΤΡ και Εξοκινάση - EC 2.7.1.1). Η 6- φωσφορική γλυκόζη μετατρέπεται σε 6-φωσφορική φρουκτόζη (ισομεράση - EC 5.3.1.9) με την ενδομοριακή μεταφορά δύο υδρογόνων, ξανά φωσφορυλιώνεται προς 1,6-διφωσφορική φρουκτόζη (φωσφοφρουκτοκινάση EC 2.7.1.11) και διασπάται προς φωσφορική διυδροξυακετόνη και φωσφορική γλυκεριναλδεΰδη (αλδολάση EC 4.1.2.β). Η κετόζη μετατρέπεται προς γλυκεριναλδεΰδη (ισομεράση - EC 5.3.1.1) και αυτή προς ένα σύμπλοκο 3-φωσφο-γλυκερινικού οξέος-ενζύμου (αφυδρογονάση EC 1.2.1.12), το οποίο με φωσφορικό οξύ

136 μετατρέπεται προς τον αντίστοιχο μικτό ανυδρίτη (το ίδιο ένζυμο). Ο μικτός ανυδρίτης υδρολύεται με ADP προς το αντίστοιχο 3-φωσφο-γλυκερινικό οξύ (κινάση EC 2.7.2.3) και αυτό μετατρέπεται στο ισομερές του 3-φωσφογλυκερινικό οξύ (τρανσφεράση EC 2.7.5.3). Το τελευταίο, μετατρέπεται σε φωσφοενολο-πυροσταφυλικό οξύ και μετά σε πυροσταφυλικό οξύ (λυάση EC 4.2.1.11 και κινάση EC 2.7.1.40). Το πυροσταφυλικό οξύ ανάγεται, τελικά, προς αιθανόλη (αποκαρβοξυλάση EC 4.1.1.1). 5.3 Παρασκευή γαλακτοκομικών προϊόντων, πρωτεϊνών και αμινοξέων Η παρασκευή των τυριών, κυρίως, αλλά και των άλλων γαλακτοκομικών προϊόντων είναι μια διαδικασία γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων. Πέρα από τις επιμέρους ειδικότερες διεργασίες, που οδηγούν στην παρασκευή εξειδικευμένων προϊόντων σε γεύση και ποιότητα, η παρασκευή των τυριών συντελείται στη βάση της δράσης των ενζύμων ρεννίνη (EC 3.4.4.3), πεψίνη (EC 3.4.4.1) και λιπάση (EC 3.1.1.3). Η ρεννίνη, κατά το πρώτο στάδιο της πήξης του γάλακτος, υδρολύει την κ- καζεΐνη μεταξύ Phe-105 Met-106, ενώ η πεψίνη υδρολύει περαιτέρω την καζεΐνη και αλλοιώνει τη γεύση του τυριού με την απελευθέρωση μικρών πεπτιδίων και γι αυτό η δράση της είναι ανεπιθύμητη. Η λιπάση δρα κατά το δεύτερο στάδιο της πήξης του τυριού όπου στο πρωτεϊνικό πήγμα έχουν εγκλωβιστεί τα λιπαρά συστατικά του γάλακτος. Εκεί υδρολύει τα τριγλυκερίδια προς διγλυκερίδια και λιπαρά οξέα, τα οποία κατά την ωρίμανση του τυριού του προσδίδουν τις επιθυμητές ιδιότητες της γεύσης και του αρώματος. Το κύριο υπόλειμμα της τυροκομίας είναι το τυρόγαλα, ένα προϊόν πλούσιο σε β-λακτόζη. Η λακτόζη, η οποία είναι δισακχαρίτης β-d-γαλακτόζης- β-dγλυκόζης (διαμέσου ενός β-1,4 γλυκοζιτικού δεσμού) χρησιμοποιείται ή ως

137 υπόστρωμα ζύμωσης για παραγωγή αιθανόλης ή υδρολύεται ενζυμικά για παραγωγή μίγματος γαλακτόζης και γλυκόζης. Το μίγμα αυτό είναι αρκετά γλυκό, σε σχέση με τη σακχαρόζη και πολύ πιο διαλυτό από την ίδια τη λακτόζη. Η παραγωγή πρωτεϊνών και αμινοξέων συνίσταται στη παραλαβή και επεξεργασία πρωτεϊνών από φυτικές πηγές ή από καλλιέργειες βακτηρίων ή μυκήτων. Η προσπάθεια εντοπίζεται πρώτα στην απομόνωση των πρωτεϊνών από τη φυσική τους πηγή και κατόπιν ο καθαρισμός τους και η μείωση του μοριακού τους βάρους, έτσι ώστε να αποκτήσουν μεγαλύτερη διαλυτότητα ή να γίνουν πιο εύπεπτες ή να ανασταλεί πιθανή πικρή γεύση τους. Όλες αυτές οι διεργασίες δεν είναι, όπως γίνεται εύκολα κατανοητό, να γίνουν με καθαρά χημικό τρόπο επειδή οδηγούν σε επικίνδυνα για την υγεία παραπροϊόντα. Γίνονται, λοιπόν, με τη χρήση πρωτεασών, ανάλογα με τη περίπτωση. Έτσι, μπορεί να οδηγηθούμε σε μερική υδρόλυση (πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους) ή ολική (αμινοξέα). Βέβαια, η τέτοια παραγωγή πρωτεϊνών ή αμινοξέων δεν είναι απαραίτητο να σχετίζεται με τη παραγωγή τροφίμων και προϊόντων που προορίζονται για διάφορες χρήσεις π.χ. το διαχωρισμό των μορφών D και L των αμινοξέων ή την απαρχής σύνθεση της μιας από τις δύο ισομερείς μορφές κλπ. 5.4 Αναλυτικές και φαρμακευτικές εφαρμογές των ενζύμων Το ζήτημα των αναλυτικών εφαρμογών των ενζύμων έχει ήδη θιγεί, στα πλαίσια αυτών των σημειώσεων, όταν περιγράφονταν οι μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού της ενζυμικής δραστικότητας. Σε γενικές γραμμές, είτε προσδιορίζεται η ίδια η δραστικότητα ενός ενζύμου σ ένα δείγμα ή κάποιο ένζυμο χρησιμοποιείται ως αναλυτικό αντιδραστήριο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενός άλλου συστατικού του υπό ανάλυση δείγματος.

138 Η λογική των μεθόδων αυτών στηρίζεται, κυρίως, στο γεγονός ότι οι τιμές της ειδικής δραστικότητας ορισμένων ενζύμων στα βιολογικά υγρά (αίμα, ούρα κλπ.), μετρούμενες με συγκεκριμένη μέθοδο, ευρίσκονται μεταξύ ορίων τα οποία καλούνται φυσιολογικές τιμές ή τιμές αναφοράς. Μια δεύτερη λογική στηρίζεται στη προσθήκη ενζυμικών παρασκευασμάτων συγκεκριμένης ειδικής δραστικότητας σε βιολογικά υγρά, με τις οποίες μετρούνται οι συγκεντρώσεις κάποιων ουσιών σ αυτά. Οι μετρούμενες τιμές της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας στη μία ή στην άλλη περίπτωση αποτελούν ένδειξη ύπαρξης ή εξέλιξης ορισμένων ασθενειών είτε ακόμη και διαγνωστικό εργαλείο για την τυχόν μελλοντική εκδήλωση μιας ασθένειας. Ας δούμε μερικά παραδείγματα τέτοιων εφαρμογών. Πρόκειται για προσδιορισμούς των ειδικών δραστικοτήτων ορισμένων ενζύμων στον ορό του αίματος, ή για προσδιορισμούς των ειδικών δραστικοτήτων ενζύμων, που προστίθενται στο μίγμα της αντίδρασης σε καθαρή κατάσταση και τα οποία θα χρησιμοποιήσουν ως υπόστρωμα κάποια συστατικά του ορού του αίματος, για διαγνωστικούς σκοπούς. 1. Προσδιορισμός ειδικής δραστικότητας της αμινοτρανσφεράση της L-αλανίνης (EC 2.6.1.2) οποίος γίνεται με σύζευξη της δράσης του ενζύμου γαλακτική αφυδρογονάση (EC 1.1.1.27) σε προϊόν της κύριας αντίδρασης. L-Ala + α-κετογλουταρικό οξύ EC 2.6.1.2 L-Glu + πυροσταφυλικό οξύ πυροσταφυλικό οξύ + NADH + H + EC 1.1.1.27 L-γαλακτικό οξύ + NAD +

139 2. Προσδιορισμός ειδικής δραστικότητας της αμινοτρανσφεράση του L- ασπαρτικού οξέος (EC 2.6.1.1) ο οποίος γίνεται με σύζευξη της δράσης του ενζύμου μηλική αφυδρογονάση (EC 1.1.1.37) σε προϊόν της κύριας αντίδρασης. EC 2.6.1.1 L-Asp + α-κετογλουταρικό οξύ L-Glu + οξαλοξικό οξύ οξαλοξικό οξύ + NADH + H + EC 1.1.1.37 L-μηλικό οξύ + NAD + 3. Προσδιορισμός ειδικής δραστικότητας της κινάση της κρεατίνης (EC 2.7.3.2) ο οποίος γίνεται με σύζευξη της δράσης των ενζύμων πυροσταφυλική κινάση (EC 2.7.1.40) και γαλακτική αφυδρογονάση (EC 1.1.1.27) σε προϊόντα της κύριας και της δευτερεύουσας αντίδρασης, αντίστοιχα. κρεατίνη + ATP EC 2.7.3.2 φωσφορική κρεατίνη + ADP φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ + ADP EC 2.7.1.40 πυροσταφυλικό οξύ + ATP πυροσταφυλικό οξύ + NADH + H + EC 1.1.1.27 L-γαλακτικό οξύ + NAD + 5.5 Ενζυμικοί Βιοαισθητήρες Συστηματικά, θα μπορούσαμε να ενσωματώσουμε το μέρος αυτό στις μεθόδους ποσοτικού προσδιορισμού της ενζυμικής δραστικότητας. Όμως για λόγους καθαρά διδακτικούς το εξετάζουμε εδώ με όπλο την εμπειρία των προηγουμένων γνώσεων. Ως συστατικό ενός Ενζυμικού Βιοαισθητήρα (ΕΒ) θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί κάθε ακινητοποιημένο ένζυμο. Πράγματι, αρκετές φορές ακινητοποιούμε ένζυμα για να τα χρησιμοποιήσουμε σε Βιοαισθητήρες. Κάθε τέτοιος βιοαισθητήρας συνίσταται από δύο διακριτά τμήματα, (α) το

140 ακινητοποιημένο ένζυμο και (β) το ηλεκτρονικό του τμήμα, ενώ η λειτουργία του βασίζεται σε δύο ηλεκτρόδια. Το ακινητοποιημένο ένζυμο καταλύει τη κατάλληλη αντίδραση λαβαίνοντας μέρος σ αυτήν, όπως έχουμε ήδη περιγράψει όταν αναφερθήκαμε στο αντίστοιχο κεφάλαιο, ενώ το ηλεκτρονικό τμήμα του βιοαισθητήρα αντιλαμβάνεται και καταγράφει τη μεταβολή κάποιας παραμέτρου του όλου συστήματος. Οι ενζυμικοί βιοαισθητήρες (ΕΒ) μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλές φορές και συνεχώς και θεωρούνται ως αξιόπιστες και εκλεκτικές αναλυτικές διατάξεις. Μπορούμε να διακρίνουμε τους ΕΒ ανάλογα με τη φύση της παραμέτρου που αντιλαμβάνονται και μετρούν, σε ηλεκτροχημικούς (αμπερομετρικούς, ποτενσιομετρικούς, αγωγιμομετρικούς), σε οπτικούς (μεμβράνης, οπτικής ίνας) και σε πιεζοηλεκτρικούς. Οι αμπερομετρικοί ΕΒ μετρούν τη μεταβολή της έντασης του ηλεκτρικού ρεύματος, το οποίο διατρέχει το κύκλωμα όταν εφαρμόζεται σταθερή ηλεκτρική τάση στα άκρα των ηλεκτροδίων τους, κατά τη εξέλιξη π.χ. μιας οξειδοαναγωγικής αντίδρασης. Ως παράδειγμα θα μπορούσαμε να αναφέρουμε το συνδυασμό ακινητοποιημένης οξειδάσης της γλυκόζης και ηλεκτροδίου οξυγόνου. Οι ποτενσιομετρικοί ΕΒ βασίζονται στην τεχνολογία των τρανζίστορς φαινομένου πεδίου (FET), τα οποία μπορούν και μετρούν μεταβολές της συσσώρευσης ηλεκτρικού φορτίου στη επιφάνειά τους. Με κατάλληλη ακινητοποίηση ενζύμων στην επιφάνεια των FET επιτυγχάνονται μεταβολές των ηλεκτρικών φορτίων λόγω της εξέλιξης της ενζυμικής αντίδρασης. Ως παράδειγμα θα αναφέρουμε τον ΕΒ της πενικιλινάσης για τη μέτρηση της συγκέντρωσης πενικιλίνης. Οι αγωγιμομετρικοί ΕΒ μπορούν να μετρούν διαφορές αγωγιμότητας ενός διαλύματος ή άλλου συστήματος διασποράς, που οφείλονται σε μεταβολές της συγκέντρωσης ιόντων. Ως παράδειγμα ας είναι ο ΕΒ της ουρίας.

141 Οι οπτικοί ΕΒ βασίζονται σε διαφορετικούς τρόπους ανίχνευσης της ενζυμικής δραστικότητας. Συνήθως ακινητοποιούμε στη μεμβράνη του βιοαισθητήρα το ένζυμο και ένα άλλο κατάλληλο αντιδραστήριο όπως π.χ. ένα δείκτη ph. Με την πρόοδο της ενζυμικής αντίδρασης μεταβάλλεται και η τιμή ph του ενζυμικού μικροπεριβάλλοντος με αποτέλεσμα τη μεταβολή του μήκους κύματος της μέγιστης απορρόφησης του συστήματος. Η τελευταία μεταβολή μετρείται με κατάλληλη φασματοφωτομετρική διάταξη. Η χρήση οπτικών ινών βοηθά ακριβώς αυτή τη τελευταία διαδικασία. Ως παράδειγμα θα αναφέρουμε τον ΕΒ του γαλακτικού οξέος. 5.6 Εφαρμογές Ενζύμων σε μη ενζυμικές Αναλύσεις Οι μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού της ενζυμικής δραστικότητας με τη χρήση ηλεκτροδίων και οι ενζυμικές ανοσομέθοδοι, που αναφέρθηκαν στο αντίστοιχο κεφάλαιο αποτελούν το καλύτερο παράδειγμα εφαρμογής των ενζύμων σε μη ενζυμικές αναλύσεις.

Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Τέλος Ενότητας

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους. Σημειώματα Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκων: Καθηγητής Εμμανουήλ Μ. Παπαμιχαήλ. «Ενζυμολογία. Μηχανισμοί». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1243. Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/.