Εργαστήριο 4ο: «Ανοσοαποτύπωμα πρωτεϊνών κατά Western»

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ, «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ», Μάθημα: Κυτταρική Βιολογία - Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Ακαδημαϊκό Έτος 2011 2012 Τμήμα Βιολογίας - Τομέας Βιολογίας Κυττάρου& Βιοφυσικής Πέμπτη 7 Απριλίου 2011 Εργαστήριο 4ο: «Ανοσοαποτύπωμα πρωτεϊνών κατά Western» Δρ. Μαριάννα Χ. Αντωνέλου, Αδαμαντία Φ. Φραγκοπούλου, Υποψήφια Διδάκτωρ, Ισιδώρα Σ. Παπασιδέρη, Αναπλ. Καθηγήτρια, Λουκάς Χ. Μαργαρίτης, Καθηγητής 1. Γενικά Η ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνικών δειγμάτων μπορεί να δώσει πληροφορίες σχετικά με τα μοριακά βάρη, τα ισοηλεκτρικά σημεία, τις αλληλεπιδράσεις και άλλες φυσικές ιδιότητες ή ακόμα και την ποσοτική εκπροσώπηση ορισμένων πρωτεϊνών ή πρωτεϊνικών ζωνών, όχι όμως και την ταυτοποίησή τους. Συγκεκριμένες πρωτεΐνες μπορούν να ανιχνευθούν και να ταυτοποιηθούν μετά το διαχωρισμό τους με ηλεκτροφόρηση μίας ή δύο διαστάσεων, στην περίπτωση που υπάρχουν διαθέσιμα αντισώματα έναντι αυτών των πρωτεϊνών. Γι αυτό το σκοπό έχουν αναπτυχθεί διάφορες μεθοδολογίες. Ωστόσο, η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη είναι αυτή του ανοσοαποτυπώματος (ή μεταφοράς) κατά Western. Το ανοσοαποτύπωμα (ή ανοσοστύπωμα) των πρωτεϊνών είναι μία αναλυτική μέθοδος που περιλαμβάνει τη μεταφορά των πρωτεϊνών που έχουν διαχωριστεί ηλεκτροφορητικά από το πήκτωμα σε ένα λεπτό και μεμβρανώδες υλικό στήριξης και την ανίχνευσή τους με μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα. Yπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα ανοσοαποτύπωσης πχ. ανοσοαποτύπωμα κηλίδας (dot blot) και δυσδιάστατη ανοσοαποτύπωση (2D blot), αλλά το γνωστότερο είναι το κλασσικό ανοσοαποτύπωμα Western (Western blotting). 2. Αποτύπωμα Η διαδικασία μεταφοράς των πρωτεϊνών από το πήκτωμα στη μεμβράνη καλείται «αποτύπωμα» ή «στύπωμα» και παρόλο που μπορεί να επιτευχθεί με απλή ροή του διαλύτη συνήθως γίνεται ηλεκτροφορητικά, γιατί έτσι είναι πιο γρήγορη και πιο ευαίσθητη. Η μεταφορά δηλαδή, ακολουθεί την ίδια βασική αρχή με την ηλεκτροφόρηση μόνο που αυτή τη φορά το ρεύμα εφαρμόζεται σε γωνία 90 ο ως προς το πήκτωμα προκειμένου να μεταναστεύσουν οι πρωτεΐνες από το πήκτωμα στη μεμβράνη. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα του αποτυπώματος είναι ότι οι πρωτεΐνες είναι περισσότερο προσβάσιμες στα αντισώματα όταν βρίσκονται στην επιφάνεια του φίλτρου παρά στο πήκτωμα. Επίσης, οι χρόνοι χρώσης/αποχρωματισμού αλλά και οι χρόνοι επώασης με τα υπόλοιπα αντιδραστήρια είναι πολύ πιο σύντομοι στις περιπτώσεις πρωτεϊνών προσδεμένων σε μεμβράνες, καθώς εδώ οι αντιδράσεις είναι επιφανειακές. Επιπρόσθετα, μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά από αποτύπωμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για περισσότερες της μιας ανοσοανιχνεύσεις, αφού ξηραθεί και αποθηκευτεί. Τέλος, οι μεμβράνες είναι πιο εύχρηστες και πιο ανθεκτικές σε σχέση με τα πηκτώματα. 3. Υλικά πρόσδεσης πρωτεϊνών Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα υλικά στήριξης είναι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, νάιλον ή PVDF, στην επιφάνεια των οποίων προσδένονται και ακινητοποιούνται οι πρωτεΐνες με τη σειρά που διαχωρίστηκαν στο πήκτωμα. Πιο συχνά επιλέγεται μεμβράνη νιτροκυτταρίνης καθώς δίνει αρκετά καλά αποτελέσματα στη μεταφορά (80-100 μg/cm 2 ) και ανοσοαποτύπωση. Ο τρόπος πρόσδεσης των πρωτεϊνών στις μεμβράνες νιτροκυτταρίνης δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά σίγουρα είναι μη-ομοιοπολικός και πιθανότατα περιλαμβάνει υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Εκτός από τις μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, χρησιμοποιούνται και διάφορες νάιλον μεμβράνες οι οποίες είναι πιο ανθεκτικές σε σχέση με τη νιτροκυτταρίνη, έχουν μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης πρωτεϊνών και προτιμώνται 1

σε περιπτώσεις ανάλυσης πρωτεϊνών χαμηλού ΜΒ (που προσδένονται ασθενώς σε νιτροκυτταρίνη) ή σε περιπτώσεις πολλαπλών κύκλων ανοσοεντόπισης στην ίδια μεμβράνη. Ορισμένες είναι φορτισμένες θετικά (πχ. Zetaprobe, Bio-Rad, 480 μg/cm 2 ) και είναι ιδιαίτερα αποδοτικές για ανάλυση βασικών (δηλαδή όχι όξινων) πρωτεϊνών και για μεταφορά πηκτωμάτων SDS-PAGE που περιέχουν αρνητικά φορτισμένα σύμπλοκα SDS-πολυπεπτιδίων. Παρόλα αυτά, οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης παραμένουν η πρώτη επιλογή στα ανοσοαποτυπώματα, καθώς λόγω της χαμηλότερης συγγένειάς τους για τις πρωτεΐνες σε σχέση με τις νάιλον μεμβράνες, χαρακτηρίζονται συνήθως και από χαμηλότερη μη-ειδική πρόσδεση αντισωμάτων, δηλαδή «θόρυβο». Υπάρχουν τέλος διαθέσιμες στην αγορά μηφορτισμένες νάιλον μεμβράνες (πχ. Hybond N, Amersham) οι οποίες προσφέρουν καλύτερη πρόσδεση βασικών πρωτεϊνών και χαμηλότερο θόρυβο σε σχέση με τις φορτισμένες. Ωστόσο, ένα γενικό μειονέκτημα των νάιλον μεμβρανών είναι η απουσία κάποιας απλής γενικής διαδικασίας χρώσης, σε αντίθεση με τη νιτροκυτταρίνη. Οι μεμβράνες PVDF (polyvinyldifluoride) εισήχθηκαν από τη Millipore Corp. το 1985. Σε σύγκριση με τη νιτροκυτταρίνη, οι μεμβράνες PVDF συγκρατούν αποτελεσματικότερα τις πρωτεΐνες σε συγκεκριμένες «σκληρές» συνθήκες, πχ. παρουσία οργανικών διαλυτών ή σε ιδιαίτερα υψηλά/χαμηλά ph. Η μεγαλύτερη μηχανική ανθεκτικότητα των μεμβρανών PVDF επίσης, τις καθιστά πλεονεκτικότερες σε περιπτώσεις μεμβρανικού stripping και επανανοσοεντόπισης (βλ. παρακάτω). Είναι υδρόφοβες και σε αντίθεση με τις νάιλον μεμβράνες είναι συμβατές με τις κοινές πρωτεϊνικές χρωστικές και τις κοινές μεθόδους ανοσοεντόπισης. 4. Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer buffer) Το ph του ρυθμιστικού διαλύματος επιλογής καθορίζει το σωστό προσανατολισμό των ηλεκτροδίων για την επαφή πηκτώματος/νιτροκυτταρίνης. Έτσι, όταν αποτυπώνονται πηκτώματα SDS-PAGE, συνήθως σε ουδέτερα ή ελαφρώς αλκαλικά ρυθμιστικά διαλύματα μεταφοράς, τα πολυπεπτίδια συμπεριφέρνονται ως ανιόντα και η νιτροκυτταρίνη μεταφοράς πρέπει να βρίσκεται στην ανοδική πλευρά του πηκτώματος. Το διάλυμα μεταφοράς συνήθως περιέχει SDS και μεθανόλη. Το SDS αυξάνει την ικανότητα μεταφοράς αλλά μειώνει την πρόσδεση πρωτεϊνών στη νιτροκυτταρίνη. H μεθανόλη χρησιμοποιείται γιατί ελαχιστοποιεί το φούσκωμα του πηκτώματος κατά τη διάρκεια του αποτυπώματος και αυξάνει την ικανότητα πρόσδεσης των πρωτεϊνών στη νιτροκυτταρίνη, αλλά δυσκολεύει την απομάκρυνση των πρωτεϊνών από το πήκτωμα. Το κύριο πρόβλημα που προκαλείται κατά τη μεταφορά είναι ότι οι μεγαλομοριακές πρωτεΐνες εκλύονται από το πήκτωμα πιο αργά σε σχέση με αυτές μικρότερου ΜΒ. Αυτό σημαίνει ότι το πρωτεϊνικό πρότυπο που θα αποτυπωθεί στη νιτροκυτταρίνη μετά τη μεταφορά πιθανόν να τροποποιείται ανάλογα με τις πρωτεΐνες που μεταφέρονται. 5. Μετά τη μεταφορά: Χρώση μεμβρανών νιτροκυτταρίνης και πηκτώματος Μετά την ολοκλήρωση της μεταφοράς το πήκτωμα βάφεται με κοινές πρωτεϊνικές χρωστικές, πχ. Coomassie Blue R-250, για να διαπιστωθεί πόσο επιτυχής ήταν η μεταφορά των πρωτεϊνών. Η νιτροκυτταρίνη μπορεί να βαφεί με τις περισσότερες από τις κοινές πρωτεϊνικές χρωστικές που χρησιμοποιούνται για τα πηκτώματα πολυακρυλαμίδης, πχ. Coomassie Blue R-250, Amido Black ή Fastgeen. Η χρώση της προφανώς πρέπει να είναι αντιστρεπτή και σύντομα να αποχρωματιστεί γιατί θα ακολουθήσει η ανοσοεντόπιση. Συνήθως δεν χρησιμοποιείται η Coomassie Blue γιατί δίνει πολύ μεγάλο «θόρυβο». Επίσης, καλό είναι να αποφεύγονται αυτές οι χρώσεις πριν την ανοσοεντόπιση για αρκετούς λόγους: 1. δεν είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες (χρειάζεται > 0.5 μg πρωτεΐνης για να δώσουν σήμα) 2. δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε νάιλον μεμβράνες λόγω μεγάλου θορύβου. 3. τα αλκοολικά διαλύματα που συνήθως χρησιμοποιούνται για τον αποχρωματισμό προκαλούν συρρίκνωση στη μεμβράνη καθιστώντας δύσκολη την ακόλουθη σύγκρισή της κατά αντιπαράθεση με το πήκτωμα, είτε με τη μεμβράνη μετά την ανοσοεντόπιση. Άλλες χρωστικές είναι η indian ink (80 ng πρωτεΐνης στη μεμβράνη), η χρώση αργύρου (silver staining) και ο κολλοειδής χρυσός (ικανότητα ανίχνευσης~1-5 ng πρωτεΐνης στη μεμβράνη), ο οποίος όμως είναι πολύ ακριβός για πειράματα ρουτίνας. Εναλλακτικά, για να επιβεβαιωθεί η επιτυχής μεταφορά των πρωτεϊνών στη νιτροκυτταρίνη, χρησιμοποιούνται έγχρωμοι μάρτυρες ΜΒ οι οποίοι είναι ορατοί τόσο κατά τη μετακίνησή τους στο πήκτωμα της ηλεκτροφόρησης, όσο και στη μεμβράνη της νιτροκυτταρίνης μετά τη μεταφορά. Παράλληλα, βοηθούν και στην κατά προσέγγιση εντόπιση των πρωτεϊνών ενδιαφέροντος στη νιτροκυτταρίνη, συγκρίνοντάς τους με την 2

έγχρωμη κλίμακα των ΜΒ. Στις περισσότερες περιπτώσεις, μετά τη λήξη της μεταφοράς και της ανοσοεντόπισης, η μεμβράνη βάφεται με δμ. χρωστικής Ponceau S. Η βαμμένη μεμβράνη σαρώνεται και αποθηκεύεται ως αρχείο εικόνας των ολικών πρωτεϊνών που μεταφέρθηκαν. 6. Ανοσοεντόπιση πρωτεϊνών στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Από τη στιγμή που οι πρωτεΐνες έχουν προσδεθεί στην επιφάνεια της νιτροκυτταρίνης, μπορεί να ξεκινήσει η διαδικασία της ανοσολογικής ανίχνευσης (Immunostaining, immunoblotting). H τελευταία μπορεί να εφαρμοστεί τόσο σε αποδιαταγμένα πολυπεπτίδια (που διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE) όσο και σε μη-αποδιαταγμένες πρωτεΐνες (native proteins). Καθώς η ταυτοποίηση βασίζεται στην ειδική πρόσδεση αντισωμάτων σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες ή αντιγόνα, είναι πολύ σημαντική η ελαχιστοποίηση της μη-ειδικής σύνδεσης των αντισωμάτων στη μεμβράνη. Όσον αφορά στις μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, οι μη-ειδικές θέσεις πρόσδεσης καλύπτονται (με blocking solution) σχετικά εύκολα με επώαση της μεμβράνης σε διάλυμα αλβουμίνης ορού βοός (1%-5% δμ. bovine serum albumin, BSA) ή σε άπαχο αποξηραμένο γάλα (3%-5% non-fat dry milk, NFDM). Στα νάιλον φίλτρα αυτή η διαδικασία είναι πιο δύσκολη, καθώς χρειάζονται μεγάλη ποσότητα, έως και 10% BSA, για να καλυφθούν. Το πρωτογενές αντίσωμα στοχεύει στην πρωτεΐνη-στόχο. Διαλύεται συνήθως στο blocking solution ή σε κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα (πχ. PBS) που περιέχει ουδέτερη πρωτεΐνη (BSA, NFDM) και κάποιο απορρυπαντικό (πχ. Tween-20). Η αραίωσή του είναι τέτοια ώστε να μην προσδένεται σε άλλες πρωτεΐνες που υπάρχουν στη μεμβράνη. Αυτό έχει ελεγχθεί πειραματικά πριν από την εφαρμογή οποιουδήποτε πειράματος ανοσοεντόπισης (συνήθως με ανάλυση αποτυπώματος κηλίδας, βλ. παρακάτω). Γενικά, υψηλές συγκεντρώσεις ιχνηθετών, μεγάλοι χρόνοι επώασης και υψηλές θερμοκρασίες αυξάνουν το θόρυβο του πειράματος. Οι περισσότερες πρωτεΐνες που διαχωρίζονται σε SDS πηκτώματα πολυακρυλαμίδης ή που μεταφέρονται με transfer buffers που περιέχουν SDS, φαίνεται να διατηρούν σε σημαντικό βαθμό τη δομική ακεραιότητα των επιτόπων τους ώστε να αναγνωρίζονται από ειδικά πολυκλωνικά αντισώματα. Στην περίπτωση των μονοκλωνικών αντισωμάτων, αν οι μοναδικοί επίτοποι είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι στην αποδιάταξη, τότε δεν δίνουν σήμα. Αφού ξεπλυθεί καλά η μεμβράνη ώστε να απομακρυνθεί το μη-προσδεμένο αντίσωμα και να διασπαστούν οι ασθενείς μη-ειδικές αλληλεπιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος (Tween- 20, ασθενές μη-ιοντικό απορρυπαντικό), η μεμβράνη επωάζεται με το δευτερογενές αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει το πρωτογενές, και συγκεκριμένα την Fc σταθερή περιοχή του, η οποία είναι χαρακτηριστική και ειδική του ζώου στο οποίο παρασκευάστηκε το αντίσωμα. Συνήθως το δευτερογενές αντίσωμα είναι ομοιοπολικά συζευγμένο με ένα ένζυμο (horseradish peroxidase, HRP ή alkaline phosphatase, AP). 7. Εμφάνιση σήματος Η ποσότητα του μη-προσδεμένου δευτερογενούς αντισώματος απομακρύνεται με καλό ξέπλυμα της μεμβράνης και η μεμβράνη επωάζεται με το υπόστρωμα του ενζύμου. Τα συζευγμένα με το δευτερογενές αντίσωμα ένζυμα μετατρέπουν το άχρωμο διαλυτό υπόστρωμά τους σε έγχρωμο ίζημα, το οποίο σημαίνει στη νιτροκυτταρίνη τις θέσεις που κατέχει το δευτερεύων αντίσωμα. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα υπεροξειδάσης είναι η 3,3 -diaminobenzidine (DAB), η οποία είναι πιο ευαίσθητη σε σχέση με άλλα υποστρώματα της υπεροξειδάσης (4-chloro-1-naphthol και 3-amino-9- ethylcarbazole), αλλά πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή γιατί είναι ισχυρό καρκινογόνο. Η μέθοδος είναι γρήγορη και ευαίσθητη καθώς μπορεί να ανιχνεύσει 100-500 pg πρωτεΐνης, αλλά το προϊόν της χρωματικής αντίδρασης προοδευτικά φθίνει με την έκθεση της μεμβράνης στο φως. Το σύστημα ανίχνευσης που βασίζεται στην αλκαλική φωσφατάση (alkaline phosphatase, AP) και στα υποστρώματά της 5-bromo-4-chloro-3 indolyl phosphate (BCIP) και nitroblue tetrazolium (NBT), είναι πιο ευαίσθητο σε σχέση με αυτό της υπεροξειδάσης (μπορεί να ανιχνεύσει 10-50 pg πρωτεΐνης στη μεμβράνη) και το σήμα είναι ανθεκτικό στο φως. Αντί για δευτερογενή αντισώματα (IgGs) μπορεί εναλλακτικά να χρησιμοποιηθεί πρωτεΐνη Α από Staphylococcus aureus. Ωστόσο, αυτή η πρωτεΐνη δεν αναγνωρίζει τα IgGs όλων των ειδών και γενικά θεωρείται λιγότερο ευαίσθητη (10-50 φορές) στην ανίχνευση πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη σε σχέση με τα αντισώματα, γιατί δεν έχει πολυσθενή 3

πρόσδεση. Τέλος, ειδικά για δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με HRP, η ανίχνευση μπορεί να γίνει με το σύστημα ECL (Εnhanced ChemiLuminescence) που βασίζεται στη χημειοφωταύγεια. Η φωταύγεια είναι εκπομπή φωτός ως αποτέλεσμα της έκλυσης ενέργειας από ένα διεγερμένο υπόστρωμα. Στη χημειοφωταύγεια, αυτή η διέγερση προκαλείται από μία χημική αντίδραση. H luminol (diacylhydrazide) οξειδώνεται παρουσία HRP/Η2Ο2 παρουσία χημικών ενισχυτών (φαινόλες) σε αλκαλικές συνθήκες και διεγείρεται. Επιστρέφοντας στην κατάσταση ηρεμίας παράγει φως (μήκος κύματος 428 nm) το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί καθώς «προσβάλει» φωτοευαίσθητα φιλμ αυτοραδιογραφίας ύστερα από σύντομη έκθεση. Το σήμα λαμβάνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα και παραμένει μόνιμα αποτυπωμένο στο υπό έκθεση φιλμ. Πρόκειται για χαρακτηριστικές σκουρόχρωμες ζωνώσεις που αντιστοιχούν στις ζώνες της πρωτεΐνης που αντέδρασε με το αντίσωμα. Η ευαισθησία ανίχνευσης της μεθόδου ECL είναι περίπου 10 φορές μεγαλύτερη σε σχέση με τη χρωματική αντίδραση. 8. Πολλαπλές, διαδοχικές ανοσοανιχνεύσεις (ιχνηθετήσεις, probing) στη μεμβράνη Είναι δυνατό, υπό συγκεκριμένες προϋποθέσεις, μία μεμβράνη μετά την πρώτη αντίδραση ανοσοεντόπισης και την καταγραφή του σήματος να επαναχρησιμοποιηθεί για ένα νέο κύκλο αντιδράσεων, πχ. για μία διαφορετική πρωτεΐνη που πιθανόν βρίσκεται στο ίδιο δείγμα. Αυτό επιφέρει όχι μόνο σημαντική οικονομία χρόνου, αλλά και δυνατότητα άμεσης σύγκρισης των σημάτων για πολλές πρωτεΐνες-στόχους, αφού αυτές βρίσκονται στο ίδιο αποτύπωμα. Απαραίτητη προϋπόθεση για το νέο κύκλο ανοσοεντόπισης είναι η αποκόλληση (stripping) των προηγούμενων ιχνηθετών που τοποθετήθηκαν στη μεμβράνη κατά τον πρώτο κύκλο. Συνήθως αυτό επιτυγχάνεται υπό θέρμανση και με παράγοντες όπως είναι το SDS, η μερκαπτοαιθανόλη και η ουρία. Δυστυχώς, όλοι αυτοί οι παράγοντες έχουν τόσο ισχυρή δράση ώστε εκτός από τους ιχνηθέτες, μπορεί να αποκολλήσουν το ίδιο αποτελεσματικά και τις πρωτεΐνες του δείγματος από τη μεμβράνη. Γι αυτό οι διαδοχικοί κύκλοι ανοσοεντόπισης σε μία μεμβράνη συνήθως είναι περιορισμένοι. Αυτό βέβαια εξαρτάται και από το υλικό της μεμβράνης, τη φύση των ιχνηθετών, την ένταση του stripping buffer που θα χρειαστεί για επώαση, την ποσότητα της πρωτεΐνης-στόχου στο δείγμα κ.ά. Για παράδειγμα οι μεμβράνες PVDF, όπως προαναφέρθηκε, είναι πιο αποδοτικές και ανθεκτικές σε σχέση με τη νιτροκυτταρίνη σε επαναλαμβανόμενα strippings. Ερώτηση: Πώς θα σχεδιάζατε ένα πείραμα ανοσοανίχνευσης στην ίδια μεμβράνη τριών διαφορετικών πρωτεϊνών οι οποίες βρίσκονται σε διαφορετικές ποσότητες στο δείγμα? 9. Ανοσοαποτύπωμα κηλίδας (Dot blot) Το ανοσοαποτύπωμα κηλίδας γενικά είναι μία τεχνική που αντικαθιστά είτε το northern blot, είτε το Southern blot είτε το western blot. Στο ανοσοαποτύπωμα κηλίδας τα προς ανίχνευση βιομόρια (πρωτεΐνες στην περίπτωση του western blotting) δεν διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση αλλά αντίθετα, ποσότητα ενός μείγματος βιομορίων (που πιθανόν περιέχει ένα μόριο προς ανίχνευση) εφαρμόζεται απευθείας πάνω στη μεμβράνη και προσροφάται σε αυτήν σχηματίζοντας μία κηλίδα. Ακολούθως εφαρμόζεται το πρωτόκολλο ανίχνευσης με αντισώματα (ή με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές στο northern και στο Southern), όπως στο κλασσικό western. Η τεχνική αυτή προσφέρει σημαντική οικονομία χρόνου, καθώς δεν απαιτούνται τα στάδια της ηλεκτροφόρησης και της μεταφοράς. Χρησιμοποιείται για να επιβεβαιωθεί ή όχι η παρουσία μιας πρωτεΐνης σε ένα μείγμα πρωτεϊνών και για να βρεθούν οι κατάλληλες αραιώσεις των αντισωμάτων που απαιτούνται για την ανίχνευσή της. Φυσικά, δεν δίνει καμία πληροφορία για τα μεγέθη των μορίων, τις διαφορετικές ισομορφές κλπ, καθώς όλα βρίσκονται και σημαίνονται στην ίδια κηλίδα. 10. Ποσοτικό ανοσοαποτύπωμα (Quantitative immunoblotting analysis) Όπως ακριβώς συμβαίνει και στην ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών, έτσι και στο ανοσοαποτύπωμα μπορεί να εξαχθεί όχι μόνο ποιοτική αλλά και ποσοτική πληροφορία, πχ. σε τι ποσοστό εκφράζεται μία πρωτεΐνη κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ή ύστερα από επίδραση εξωγενών κυτταρικών ερεθισμάτων ή σε μία ασθένεια. Για να απαντηθούν τέτοιου είδους ερωτήματα απαιτείται πυκνομέτρηση των επιμέρους ζωνών ή κηλίδων της μεμβράνης με λογισμικά πυκνομετρικής σάρωσης και επεξεργασίας εικόνας. Αφού σαρωθεί η μεμβράνη που φέρει το σήμα της ανοσοεντόπισης και αποθηκευτεί ως αρχείο κατάλληλης μορφής, 4

επεξεργάζεται με τη βοήθεια λογισμικών πυκνομέτρησης τα οποία ποσοτικοποιούν κάθε ζώνη ενδιαφέροντος. Το πρόγραμμα της πυκνομετρικής σάρωσης συλλέγει διάφορες πληροφορίες όπως την απόσταση της ζώνης από την αρχή της μεμβράνης, το εμβαδόν της ζώνης και το άθροισμα της έντασης (φωτεινότητας) όλων των εικονοστοιχείων (pixels) που περιλαμβάνονται σε αυτή, όπου η ελάχιστη τιμή είναι μηδέν και αντιπροσωπεύει το λευκό, η μέγιστη είναι 255 και αντιπροσωπεύει το μαύρο και οι ενδιάμεσες τιμές όλες τις διαβαθμίσεις του γκρίζου. Ορίζεται επίσης το επίπεδο background, το οποίο αφαιρείται αναλογικά από κάθε μέτρηση. Η πυκνομέτρηση εκφράζεται είτε γραφικά σε άξονες ΧΥ (όπου Χ η απόσταση και Υ η ένταση του αντίστοιχου εικονοστοιχείου κατά μήκος της πυκνομετρικής γραμμής σάρωσης) είτε αριθμητικά ύστερα από περιγραφή των ορίων της ζώνης. Επειδή τουλάχιστον ένα ποσοστό της ποικιλότητας της έντασης μιας ζώνης ανάμεσα σε διαφορετικά δείγματα οφείλεται σε πειραματικούς χειρισμούς (πχ. ισοφόρτωση των δειγμάτων στο πήκτωμα) κι όχι σε διαφορά των δειγμάτων, είναι απαραίτητη η επεξεργασία εσωτερικών μαρτύρων του πειράματος. Συνήθως ως μάρτυρας χρησιμοποιείται μία άλλη πρωτεΐνη των δειγμάτων η οποία βρίσκεται σε μεγάλο ποσοστό σε αυτά και ανιχνεύεται με τον ίδιο τρόπο σε σχέση με την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος. Έτσι, οι συγκρίσεις διαφορετικών δειγμάτων δεν γίνονται οριζόντια [πρωτεΐνη Α στο δείγμα 1 (Α-1) σε σχέση με την πρωτεΐνη Α στο δείγμα 2 (Α-2)] αλλά κάθετα και οριζόντια [δηλαδή λόγος (Α-1/Β-1) σε σχέση με (Α- 2/Β-2)]. Τα αποτελέσματα επεξεργάζονται με προγράμματα στατιστικής ανάλυσης. Συνήθως κάθε δείγμα προς εξέταση συγκρίνεται με μία ομάδα μαρτύρων. Η τιμή του δείγματος θεωρείται αποκλίνουσα ποσοτικά σε σχέση με τους μάρτυρες αν βρίσκεται εκτός του εύρους τιμών: Μέσος όρος τιμών μαρτύρων ± Τυπική απόκλιση ομάδας. 11. Βιβλιογραφία Η πρώτη δημοσίευση που περιέγραψε τη χρήση ηλεκτροφόρησης για τη μεταφορά πρωτεϊνών από πήκτωμα σε μεμβράνη. Towbin H., Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(9):4350-4. Η πρώτη δημοσίευση που χρησιμοποιεί τον όρο «Western blot. Burnette WN. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981;112(2):195-203. 12. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 12.1. ΜΕΤΑΦΟΡΑ (Ηλεκτροστύπωμα, electroblotting) Σε όλη τη διαδικασία, καλό είναι να χρησιμοποιούνται πλαστικά γάντια προκειμένου να αποφευχθεί η επιμόλυνση του πηκτώματος ή των χαρτιών με τις πρωτεΐνες του δέρματος. Κόβεται ένα κομμάτι νιτροκυτταρίνης κατά μισό εκατοστό περιμετρικά μεγαλύτερο του πηκτώματος της ηλεκτροφόρησης (πχ. πήκτωμα 5x8 cm, νιτροκυτταρίνη 5.5x8.5 cm). Σημειώνεται ελαφρά στη μία γωνία με μολύβι και τοποθετείται στην επιφάνεια απεσταγμένου νερού σε ένα καθαρό τρυβλίο. Κόβονται 10-12 χαρτιά Whatmann 3MM, κατά μισό εκατοστό περιμετρικά μεγαλύτερα της νιτροκυτταρίνης και τοποθετούνται εντός δοχείου με Transfer buffer μέχρι να διαποτιστούν πλήρως (περίπου 30 ). Στρώνονται με τη μορφή sandwich κατά σειρά στη συσκευή ημίξηρου αποτυπώματος: α) 5-6 χαρτιά Whatmann 3MM ποτισμένα στο Transfer buffer,, β) η νιτροκυτταρίνη, γ) το πήκτωμα της ηλεκτροφόρησης κομμένο στη μία γωνία για να ταυτοποιηθεί ο προσανατολισμός (σειρά) των δειγμάτων και δ) 5-6 χαρτιά Whatmann 3MM. Κάθε στοιχείο του τοποθετείται στην επίστρωση ισιώνεται με τη βοήθεια μιας πιπέτας για να απεγκλωβιστούν τυχόν εγκλωβισμένες φυσαλίδες. Αφού ολοκληρωθεί ο σχηματισμός του sandwich μεταφοράς, καλύπτεται προσεκτικά και κάθετα με το πάνω μέρος της συσκευής. Το σύστημα ηλεκτροφορείται σε σταθερή τάση 20V για 30 έως 2 ώρες (40 min). 5

Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς Το ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer buffer) συνήθως είναι χαμηλής ιοντικής ισχύος αλλά η ακριβής σύνθεσή του ποικίλει ανάλογα με τη φύση του πηκτώματος και των πρωτεϊνών που αναλύονται. Ένα τυπικό διάλυμα έχει ως εξής: Transfer buffer: Tris 50 mm Glycine 40 mm SDS 0.04% Methanol 20%, ph ουδέτερο έως ελαφρά αλκαλικό (~ 8.3) 12.2. ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ Εξισορρόπηση της νιτροκυτταρίνης σε διάλυμα PBS για.... 5 min. Κάλυψη των μη-ειδικών θέσεων πρόσδεσης της νιτροκυτταρίνης με Blocking solution (5% NFDM, σε PBS-T)........... 1h. Επώαση με διάλυμα πρωτογενούς αντισώματος (anti-human RBC band 3 in mouse) διαλυτοποιημένο σε blocking solution.... 1h. Ξέπλυμα της νιτροκυτταρίνης με δμ. PBS-T (0.1% Tween-20 σε PBS). 3 x 10 min. Επώαση με διάλυμα δευτερογενούς αντισώματος ομοιοπολικά συζευγμένου με υπεροξειδάση (anti-mouse IgG HRΡ-conjugated), σε blocking solution...... 1h. Ξέπλυμα της νιτροκυτταρίνης με δμ. PBS-T ή TBS-T (0.1% Tween-20 σε PBS ή TBS). 3 x 10 min. 12.3. ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΜΑ ΚΗΛΙΔΑΣ (Dot blotting, χρόνοι προσαρμοσμένοι στις ανάγκες της άσκησης) Ποσότητα μίγματος πρωτεϊνών έχει προσροφηθεί σε ένα μικρό κομμάτι νιτροκυτταρίνης που έχετε μέσα στα τρυβλία που παραλαμβάνετε. Ο όγκος για τα διαλύματα των διαδοχικών επωάσεων είναι 2-2.5ml ανά τρυβλίο. Από τη στιγμή που θα ξεκινήσετε τη διαδικασία της ανοσοανίχνευσης (στάδιο εξισορρόπησης) η νιτροκυτταρίνη δεν πρέπει να στεγνώσει μέχρι το στάδιο της εμφάνισης του σήματος. Εξισορρόπηση της νιτροκυτταρίνης σε διάλυμα PBS (ή TBS) για.. 5 min. Κάλυψη των μη-ειδικών θέσεων πρόσδεσης της νιτροκυτταρίνης με Blocking solution (5% NFDM, σε PBS-T ή TBS-T)........ 20 min. Επώαση με διάλυμα πρωτογενούς αντισώματος (anti-human RBC band 3 in mouse, 1:30.000) διαλυτοποιημένο σε blocking solution....30 min. Ξέπλυμα της νιτροκυτταρίνης με δμ. PBS-T ή TBS-T (0.1% Tween-20 σε PBS ή TBS)......... 3 x 5 min. Επώαση με διάλυμα δευτερογενούς αντισώματος ομοιοπολικά συζευγμένου με υπεροξειδάση (anti-mouse IgG HRΡ-conjugated, 1:10.000), σε blocking solution......30 min. Ξέπλυμα της νιτροκυτταρίνης με δμ. PBS-T ή TBS-T (0.1% Tween-20 σε PBS ή TBS).3 x 5 min. Διαλύματα ανοσοεντόπισης σε νιτροκυτταρίνη PBS: 80 mm Na2HPO4 20 mm NaH2PO4 2H2O 100 mm NaCl, ph 7.5 TBS: 20 mm Tris-base 137 mm NaCl, ph 7.6 PBS-T: 0.1% Tween-20 σε PBS Blocking solution: 3-10% NFDM (ή 3-5% BSA) σε PBS-Τ (ή TBS-T) 6

12.4. ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΣΗΜΑΤΟΣ 12.4.1. Μέθοδος Χρωμογόνου Επώαση της νιτροκυτταρίνης με TBS...5 min Πλύσιμο με Tris-HCl 50 mm, ph 7.6... 2 x 3 min Eμφάνιση με δμ. εμφάνισης DAB/H 2 O 2 (φρέσκο) μέχρι να εμφανιστούν οι ζώνες. Διακοπή της αντίδρασης της υπεροξειδάσης με κρύο νερό. Δμ. εμφάνισης DAB/H 2 O 2 : 10 ml Tris-HCl ph7.6 10 μl δμ. H 2 O 2 30% (0.03% τελική συγκέντρωση) 6 mg DAB (0.06% κβ/κό τελική συγκέντρωση) Εναλλακτικά, 1 ταμπλέτα (SIGMA FAST) Η2Ο2 και μία DAB σε όγκο 5 ml απεσταγμένο νερό. 12.4.2. Μέθοδος ECL H νιτροκυτταρίνη επωάζεται για 1min σε μείγμα αντιδραστηρίων χημειοφωταύγειας Α και Β (1+1ml/νιτροκυτταρίνη). Αφού αφαιρεθούν οι περίσσειες των αντιδραστηρίων χημειοφωταύγειας τοποθετείται σε λεπτή, διάφανη μεμβράνη και σε κασέτα έκθεσης. Πάνω σε αυτήν εφαρμόζεται ένα ισομεγέθες κομμάτι X-ray film και κλείνεται η κασέτα για χρόνους έκθεσης από 30sec έως 60min. Στη συνέχεια, το film τοποθετείται σε διάλυμα εμφανιστή (D- 19 1:1) μέχρι να εμφανιστούν οι ζώνες. Ξεπλένεται σε λεκανάκι με νερό και στερεώνει σε διάλυμα fixer για 20min. Τέλος ξεπλένεται σε τρεχούμενο νερό βρύσης για 30min και στεγνώνει στον αέρα. 7